JP2022532579A

JP2022532579A - 常在する自然の微生物叢を復元させることにより、固有の脂肪酸組成を有するミルクおよび乳製品のサプリメントを製造する方法

Info

Publication number: JP2022532579A
Application number: JP2021566555A
Authority: JP
Inventors: ラバス，ミロスラヴ
Original assignee: ラバス，ミロスラヴ
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2022-07-15
Also published as: WO2020231347A3; WO2020231347A2; EP3738438A1; CN113923993A; IL287712A; AU2019446032A1; US20220225626A1; ZA202108042B; MX2021013890A; BR112021022081A2; SG11202112400XA; KR20220008310A; SK502019A3

Abstract

常在する自然の微生物叢を復元させることにより、固有の脂肪酸組成を有するミルクおよび乳製品サプリメントを製造する方法で、特定の地理的領域の牛、ヤギ、または羊のミルクから固有の脂肪酸組成を識別して分離することで、それを得ることができ、また、通常のミルク製造および処理のプロセスで殺菌により存在しなくなる自然の常在微生物叢を得ることができ、ここで、自然の微生物叢は、飲用ミルクに加えられる、またはミルクに加えられるもしくはミルクの産地に典型的な自然の微生物叢を含む乳飲料の調製のためにインスタントの形態で保存され、一方で、東および中央スロバキアの地域では、これらの有益な微生物であるエンテロコッカス・フェカリスＳＰｌ、エンテロコッカス・フェカリスＣｃｊ、エンテロコッカス・ヒラエＫｌｋ、ラクトバチルス・プランタラムＳＰ、ラクトバチルス・プランタラムＡＮ、ラクトバチルス・パラカセイＴＤ、ラクトバチルス・カテナフォルミスＳＢ、およびクルイベロマイセス・マルシアヌスＳＢが識別され、分離され、脂肪酸の最適な比率は０．８１％のω－３α－リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ３）、２．１５％のω－６リノール酸（Ｃ１８：２ｎ６ｃ）、０．２２％のアラキジン酸（２０：０）、および０．１１％のベヘン酸（２２：０）である。

Description

本発明は概して、食品産業、すなわち、飲用ミルク、または乳製品のサプリメントおよび飲料の製造に関する。

本発明は、異なる技術分野に関連する３つの複雑で革新的なアプローチを生み出す。
（１）東および中央スロバキアの山岳領域にある野生の牧草地の飼料に基づいた、バランスの取れた食物組成を有する、動物の管理されたケア：有機農業の原則を遵守している農場で生産された、保存料を含まない地元の牧草飼料；
２）原産地に典型的な民族的に常在微生物叢の定義された一定の比率で配合し、有機農業の原則を遵守する農場で生産されたミルクの元の固有な脂肪酸プロファイルおよび化学組成と組み合わせた、民族的調製による新しい乳製品の製造、または機能的な新世代の乳製品の調製のための新しいプロセス；
３）健康に有益な効果の証拠－腸内微生物叢、および代謝物（短鎖脂肪酸）とＳＩｇＡ（分泌型免疫グロブリンＡ）の調節により、非伝染性疾患の主要なトリガとなる炎症（低悪性度）を予防する。

現在、飲用ミルクは主に牛乳から作られており、これを「飲用ミルク」と呼ぶ。

飲用ミルクは、人間の健全な成長に必要な生物学的に活性な栄養素の源であり、それは次のようなものである：
－子供の年齢での体作りと人間の成長のための栄養と構成材料、
－生体へのエネルギー供給を確保する物質、
－ミネラル、ビタミン、ホルモン、および酵素、
－体内で合成できない必須元素。

飲用ミルクは、乳脂肪、乳糖－ラクトース、乳タンパク質、およびミネラルが含まれており、中でもカルシウムが最も重要である。飲用ミルクの大部分は、牛の生乳を乳化処理して製造され、それは、清澄化、遠心分離、加熱処理（低温殺菌）、均質化、冷却、および包装などの一連の技術的プロセスである。飲用ミルクの製造にどのような技術的プロセスおよび方法が用いられているかによって、異なる市場タイプが区別される。

乳牛だけが、乳腺の肺胞を通じて微生物を含まないミルクを生産する。ミルクは乳房の中ですでに汚染されているため（一次汚染）、非病原性の微生物叢が生理的に存在すると考えられ得る。

ミルク中のこれらの微生物の中で最も重要な分は、球形態および棒状形態に代表される中温性乳酸発酵菌である。これらは、ホモ発酵型（乳糖を乳酸に発酵させる）とヘテロ発酵型（乳酸以外、乳糖を酪酸およびエタノールなどの他の成分に発酵させる）に分けられる。特に有用なのは、Ｓ．ラクティスホモ酵素菌を有するストレプトコッカス属と、Ｌ．クレモリスおよびＬ．デキストラニカムヘテロ酵素菌を有するロイコノストック属である。乳酸発酵菌の棒状形態は、ラクトバチルス属にまとまる。ホモ酵素菌の中からはＬ．ラクティス、Ｌ．ブルガリクス、Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．カゼイ、およびＬ．デルブルエッキイーが、ヘテロ酵素菌の中からはＬ．ファーメンタムおよびＬ．ブレビスが重要である。

搾乳時およびミルク処理時に生じるミルク、ならびに十分に冷却されていないミルクの保管の二次汚染が、ミルク中の微生物の最大の割合を占める。搾乳時の汚染は、乳房内の生理的感染の１０倍以上になると言われており、ミルク処理はさらに複数の感染を引き起こす。厩舎の一般的な汚れに由来するミルクの汚染は深刻である。これらの微生物の活動は、健康上の欠陥だけでなく、ミルクの技術的な処理にも現れる。ミルクの好ましくない微生物叢は、しばしば存在するエシェリヒア属およびエンテロバクター属の腸内細菌（エシェリヒア・コリ、エンテロバクター・アエロゲネス）、次いで酪酸発酵細菌（クロストリジウム・ブチリカムなど）、タンパク質分解細菌（バチルス・サブチリス、Ｂ・マイコイデス）によって形成される。また、様々な酵母および酵母微生物（サッカロミケス属、カンジダなど）およびその他の微生物が存在することもあり得る。今日の近代的な冷蔵技術では、ミルクを抽出して処理するプロセスでこれらの群の中で最も重要なのは、低いミルクの保存温度、すなわち約５℃でも増殖され得る好冷微生物を含む。これらは低温殺菌によって容易に破壊され得るが、それらはリパーゼおよびプロテアーゼ酵素を産生し、乳製品の味の欠陥、ミルク成分の分裂の原因となり得、低温殺菌後もそれらの活性を維持するものである。好冷微生物の最も重要な属としては、例えば、シュードモナス属、アルカリゲネス属、フラボバクテリウム属、ラクトバシラス属、ストレプトコッカス・スタフィロコッカス、マイクロコッカス属などが挙げられる。

搾乳直後のミルクには、１ミリリットルあたり数百から数千の微生物が含まれており、そのうちの９０％は外部由来のものである。特に細菌が多く、酵母および糸状菌は少ないが、病原性微生物もしばしば多く含まれており、そのためにミルクの低温殺菌が導入されている。

ミルクは、完璧で最も自然な飲み物である。それには、最も貴重な動物性タンパク質、消化しやすい脂肪、そして様々な重要なミネラルが含まれている。また、必須アミノ酸、ビタミン、乳糖、そして人体の栄養および発育に欠かせない多くの微量元素が含まれており、新陳代謝を正常に働かせ、人の健康を守っている。ミルクの栄養面での汎用性は、成人が１リットルのミルクから得られる生命維持に必要な物質の１日の総消費量の割合からもわかる。それは、タンパク質が４０％、脂肪が３２％、糖分が１２％、特にカルシウムが２０％まで、リンが６７％、ビタミンＡが３０％、ビタミンＢ１が２５％、ビタミンＢ２が７０％までである。

近代的で化学物質が過剰に使用された長寿命の食品を食べている人々のために、人々の免疫力を強化しながら消化管内の微生物バランスを確立するのに役立つ、本来の常在微生物叢を富化したミルクを消費することの正当性が高まっている。

先行技術の観点からは、現在、技術的手順を順次行うことで、飲用ミルクを製造することが必須となっている：
１）清澄化、
２）遠心分離、
３）熱処理（低温殺菌）、
４）均質化、
５）冷却および包装。

本発明の革新性は、飲用ミルクの製造プロセスに以下の３）および５）を強調した新たなステップ（技術プロセス）を導入することにある：
１）清澄化、
２）遠心分離、
３）選択された微生物の分離、
４）熱処理（低温殺菌）、
５）ミルクの濃縮、すなわちポイント３で分離した微生物を低温殺菌ミルクに戻す、
６）均質化、
７）冷却および包装。

上記の点３）および５）が以下に述べる本発明の主題となる。

飲用牛乳の製造に加えて、他の乳製品のパウダー飲料、または他の乳製品のサプリメントで、健康に良い細菌を別にパウダー形態にして含むようなものは、先行技術では知られていない。

現在のパウダー乳飲料は、すべて殺菌後のミルクを原料としているため、ミルクに含まれる本来の善玉菌をすべて含んでいるわけではない。本発明の革新性は、殺菌前のそのミルクから自然の健康に良い菌を分離することで、殺菌によるダメージから菌を守り、その後、パウダーにして食品業界での様々な用途に使用したり、またはそれらをミルクに戻してこれらの健康に良い菌を富化したミルクを製造し、そして販売および消費することにある。

本発明の第２の革新的な特徴は、特定の地域の有機農業から得られたミルクに含まれる有益な微生物および脂肪酸を識別することにある。具体的には、東および中央スロバキアの山岳領域を対象としているが、このようなミルク製造のプロセスは、世界のどの地域でも同様に実施され得る。

健康に良いとされる微生物を識別して分離し、我々はそれらを人工的に再現することで、低温殺菌後のミルクに戻し得る。同時に、我々は、特定の地域の人々に適したミルク中のこれらの微生物の正確かつ適切な比率についての情報を得ることができる。健康に良い脂肪酸を識別することで、特定の地域の人々に適したミルク中のこれらの脂肪酸の正確かつ適切な比率についての情報を得ることができる。

後述するように、これらの情報は、ミルクまたは乳飲料の製造プロセスにおいて、より人間に適した食品を製造することを可能にする貴重なものである。現在、この傾向は様々なタイプの機能性食品の製造および普及に現れてる。

機能性食品とは、これらの食品の消費者に好ましい効果をもたらす製品として一般的に知られる。

多くの場合、それらは現在、自然の有機製品にプレバイオティクスおよびプロバイオティクスを加えることにより製造される。

機能性食品とは、新しい成分またはさらなるこれらの既存の成分を加えることで別の機能を得る食品のことである。機能性富化食品への需要の高まりと、健康およびフィットネスへの消費者の意識の高まりとにより、機能性食品の需要が高まると予想される。機能性食品の需要が高まっており、健康およびフィットネスへの消費者の意識の高まり、子供の人口の増加、ライフスタイルパターンの変化、都市化の拡大は、市場の成長をさらに促進する。（参照文献１）

機能性食品は、ヨーロッパの法律ではまだ定義されていない。それらは一般的に通常の食事の一部として消費され、健康を改善したりまたは病気のリスクを減らしたりする可能性のある生物学的に活性な成分を含む食品であると考えられている（参照文献２）。

完璧な食品のレシピはない。しかし、入手可能な知識から、我々は、新しい栄養的、技術的、感覚的、および健康的特性に加えて、新しいタイプの食品の調製が、消費者とその微生物への栄養素の利用可能性を確実にするはずであると結論付け得る。栄養素のバイオアベイラビリティを各個人、特に我々の強力なシンビオントの特定のニーズに適合させる組成および処理技術を決定することは、パーソナライズされた栄養素の新時代に入る出発点になるであろう（参照文献３）。

参照文献１－３

参照文献１
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｑｕｏｒａ．ｃｏｍ／Ｗｈａｔ－ａｒｅ－ｔｈｅ－ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ－ｆｏｏｄｓ

参照文献２
ｈｔｔｐｓ：／／ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｊｒｃ／ｅｎ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｅｕｒ－ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－ａｎｄ－ｔｅｃｈｎｉｃａｌ－ｒｅｓｅａｒｃｈ－ｒｅｐｏｒｔｓ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ－ｆｏｏｄ－ｅｕｒｏｐｅａｎ－ｕｎｉｏｎ
ＳｅｒａｆｉｎｉＭ，ＳｔａｎｚｉｏｎｅＡ，ＦｏｄｄａｉＳ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｏｏｄｓ：ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｕｓｅａｎｄＥｕｒｏｐｅａｎｌｅｇｉｓｌａｔｉｏｎ．ＩｎｔＪＦｏｏｄＳｃｉＮｕｔｒ．２０１２Ｍａｒ；６３Ｓｕｐｐｌ１：７－９．ｄｏｉ：１０．３１０９／０９６３７４８６．２０１１．６３７４８８．Ｅｐｕｂ２０１１Ｎｏｖ２８

参照文献３
ＥｒｃｏｌｉｎｉＤ．，ＦｏｇｌｉａｎｏＶ．ＦｏｏｄＤｅｓｉｇｎＴｏＦｅｅｄＴｈｅＨｕｍａｎＧｕｔＭｉｃｒｏｂｉｏｔａ．ＪＡｇｒｉｃＦｏｏｄＣｈｅｍ．２０１８Ａｐｒ１８；６６（１５）：３７５４－３７５８．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊａｆｃ．８ｂ００４５６．Ｅｐｕｂ２０１８Ａｐｒ５．

現在、ミルクと乳製品は、（参照文献４－７）についてすでに発表されている情報に基づいて、新しい潜在的機能性食品として知られている：

抗酸化作用
参照文献４：ＫｈａｎＩＴ，ＮａｄｅｅｍＭ，ＩｍｒａｎＭ，ＵｌｌａｈＲ，ＡｊｍａｌＭ，ＪａｓｐａｌＭＨ．ＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＭｉｌｋａｎｄｄａｉｒｙｐｒｏｄｕｃｔｓ：ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｆｃｕｒｒｅｎｔｋｎｏｗｌｅｄｇｅ．ＬｉｐｉｄｓＨｅａｌｔｈＤｉｓ．２０１９；１８（１）：４１．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ２０１９Ｆｅｂ４．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９４４－０１９－０９６９－８

宿主［ラット］腸内微生物叢を調節する潜在的能力
参照文献５：ＲｅｔｔｅｄａｌＥＡ，ＡｌｔｅｒｍａｎｎＥ，ＲｏｙＮＣａｎｄＤａｌｚｉｅｌＪＥ（２０１９）ＴｈｅＥｆｆｅｃｔｓｏｆＵｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄａｎｄＦｅｒｍｅｎｔｅｄＣｏｗａｎｄＳｈｅｅｐＭｉｌｋｏｎｔｈｅＧｕｔＭｉｃｒｏｂｉｏｔａ，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：４５８．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１９．００４５８

人間の免疫機能に対する部分的に調査された効果
参照文献６：ＰｅｒｄｉｊｋＯ，ｖａｎＳｐｌｕｎｔｅｒＭ，ＳａｖｅｌｋｏｕｌＨＦＪ，ＢｒｕｇｍａｎＳ，ｖａｎＮｅｅｒｖｅｎＲＪＪ．Ｃｏｗ’ｓＭｉｌｋａｎｄＩｍｍｕｎｅＦｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＴｒａｃｔ：ＰｏｔｅｎｔｉａｌＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ．ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ．２０１８；９：１４３．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ２０１８Ｆｅｂ１２．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．００１４３

エネルギー指標としての脂肪酸含有量
参照文献７：Ａｒｃｈ．Ａｎｉｍ．Ｂｒｅｅｄ．，６０，２０５－２１２，２０１７ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．５１９４／ａａｂ－６０－２０５－２０１７，ＭｉｌｋｆａｔｔｙａｃｉｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｓａｎｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆｅｎｅｒｇｙｓｔａｔｕｓｉｎＨｏｌｓｔｅｉｎｄａｉｒｙｃｏｗｓ；ＬａｎａＶｒａｎｋｏｖｉｃ’，ＪａｓｎａＡｌａｄｒｏｖｉｃ，ＤａｒｉａＯｃｔｅｎｊａｋ，ＤｕｓａｎｋａＢｉｊｅｌｉｃ，ＬｕｋａＣｖｅｔｎｉｃ’，ａｎｄＺｖｏｎｋｏＳｔｏｊｅｖｉｃ

脂肪酸の組成は、動物飼料および動物の良好な生活条件の結果であることも知られている。参照文献８：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｇａｌａｃ．ｃｏｍ／ａｂｏｕｔ／ｎｅｗｓ／１５４－ｆａｔｔｙ－ａｃｉｄｓ－ｉｎ－ｆｅｅｄｉｎｇ－ｐｒｏｇｒａｍｍｅｓ－ｆｏｒ－ｄａｉｒｙ－ｃｏｗｓ

以前の研究は、観察研究、前向き研究、およびメタ分析研究の一部として、食品中の脂肪および血漿脂肪酸の組成がインスリン抵抗性およびメタボリックシンドロームの発症に寄与すると推測している。

参照文献９：
ＬｅｅＹＳ，ＣｈｏＹ；ＳｈｉｎＭＪ．ＤｉｅｔａｒｙＶｅｒｙＬｏｎｇＣｈａｉｎＳａｔｕｒａｔｅｄＦａｔｔｙＡｃｉｄｓａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｃＦａｃｔｏｒｓ：ＦｉｎｄｉｎｇｓｆｒｏｍｔｈｅＫｏｒｅａＮａｔｉｏｎａｌＨｅａｌｔｈａｎｄＮｕｔｒｉｔｉｏｎＥｘａｍｉｎａｔｉｏｎＳｕｒｖｅｙ２０１３．ＣｌｉｎＮｕｔｒＲｅｓ．２０１５；４（３）：１８２－１８９．ｄｏｉ：１０．７７６２／ｃｎｒ．２０１５．４．３．１８２．

我々は、検出および識別された脂肪酸の特定の組み合わせと、ミルク由来の地域に典型的な自然の常在微生物の特定の比率とを特徴とする新しい機能性乳製品を提案する。このように決定された脂肪酸および常在微生物の組み合わせは、長寿命の新鮮なミルクの自然防腐剤のように相互作用する。

-同時に、それらは、下流の乳製品の栄養状態を整え、修正された低温殺菌プロセス（温度を５６℃に下げたもの）の後の保存プロセスと、ミルクの中で相乗的に成長する常在微生物の添加とともに－結果番号１、それらは、ステップ番号４の前、すなわちミルクの熱処理（低温殺菌）の前に実施されなければならない、ミルクの製造プロセスに新たなステップ（ステップＮｏ．３－選択された微生物の分離）を追加することからなる、新しい乳製品製造プロセスを作り出す。その後、新たなステップＮｏ．５）として、ステップＮｏ．３）で分離された微生物を低温殺菌ミルクに戻す、ミルク富化が加えられる。これらのステップは、常在微生物と一緒に行われるため、相乗的な成長を提供する。
-結果番号２：他の潜在的に病原性のある微生物の繁殖を防ぎ、新鮮な生の状態で冷蔵庫で１０日間ミルクフレッシュを保存して、後にサワーミルク／サワー乳製品に変化させる。
-結果番号３：活性化したミルクおよび乳製品の腸内細菌叢への有益な効果は、バクテロイデス属（主にＢ．フラジリスとＢ．テタイオタオミクロン）、パラバクテロイデス属（Ｐ－ディスタソニス）、コリンセラ属、デスルフォビブリオ属、ロゼブリア属（Ｒ．イヌリニボランス、Ｒ，インテスティナリス）、ユーバクテリウム属（Ｅ．ハリー）のレベルの増加である。
-結果番号４：実験用マウス（ＢＡＬＢ／ｃ線状マウス、すなわち白色マウスの血統）の腸内で発見されたように、腸内代謝物プロファイルに対する活性化されたミルクおよび乳製品の有益な効果、すなわち、ブチレートおよびプロピオネートの産生増加およびアセテートの減少との組み合わせによる短鎖脂肪酸の調節は、腸内細菌の健全な組み合わせの調節をもたらす。
-結果番号５：新しい機能性乳製品（次世代の機能性食品）は、脂肪酸の原始的で健康的な組成に近い組成を特徴とし、これは、長鎖脂肪酸だけでなく、ω－３脂肪酸およびω－６脂肪酸の一定の固有の比率によって定義される。東および中央スロバキアに関連する我々の次世代の典型的な民族的機能性食品の脂肪酸は、以下の脂肪酸組成：０．８１％のω－３ｃ－リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ３）、２．１５％のω－６リノレン酸（Ｃ１８：２ｎ６ｃ）（短鎖脂肪酸）、および０．２２％のアラキジン酸（２０：０）、および０．１１％のベヘン酸（２２：０）（超長鎖脂肪酸）を有し、メタボリックシンドロームのリスクに対する保護効果が検出される。
-結果番号６：腸管内容物（糞便中１５０ｍｇ／ｇまで）中のＳＩｇＡ（分泌型免疫グロビンＡ）産生を増加させることによる局所粘膜免疫反応の調節。
-結果番号７：上記の手順で識別され、ミルクから分離された有用なエンテロコッカス・ヒラエおよびラクトバチルス・パラカセイ株の組成物は、肥満および心血管疾患に関連する日和見腸球菌に取って代わるものである。

要約すると、本出願は、腸内のＳｉｇＡ（分泌型免疫グロブリンＡ）の産生を刺激しながら、消費者の腸内微生物およびそれらの代謝物（短鎖脂肪酸－ブチレート、プロピオネート、ただしアセテートではない）の産生にプラスの効果をもたらす、固有の脂肪酸組成および８つの元の乳製品細菌の常在微生物の微生物混合物を有する新世代乳製品の製造プロセスを提示する。これにより、局所的な免疫反応が得られ、併せてこれらのプロセスにより、心血管疾患、肥満、または２型糖尿病などの非伝染性疾患の原因となる低度の炎症を予防することが可能となる。

我々は、腸内細菌および乳脂肪酸の選択され固定された成分の固有の比率に基づいて製造された新世代の機能性製品を提供し、それは、有用な腸内微生物叢を調節し、それによりそれらの代謝物および局所的な粘膜免疫反応を調節することができる。

提案された方法で製造されたミルクは、自然に得られた長鎖脂肪酸組成と選択された８株の常在細菌の比率との組み合わせによる、新しいタイプの民族的機能性食品である。このような製品は、宿主の腸内細菌叢およびその代謝物、ならびに抗炎症性の局所免疫反応を標的とすることで、非伝染性疾患を予防する能力があることが証明されている（実験用マウスで実証済み）。

乳製品の細菌部分は、バクテロイデス属（主にＢ．フラジリスとＢ．テタイオタオミクロン）、パラバクテロイデス属（Ｐ．ディスタソニス）、コリンセラ属、デスルフォビブリオ属、ロゼブリア属（Ｒ．イヌリニボランス、Ｒ．インテスティナリス）、ユーバクテリウム属（Ｅ．ハリー）細菌のレベルの増加（調節）により、腸内細菌叢に有益な効果をもたらし、その結果、アセテートではなくブチレート、プロピオネートなどの短鎖脂肪酸の生産量が増加する。短鎖脂肪酸は、腸内バリア機能、グルコースホメオスタシス、免疫調節、食欲調節、および肥満に関連する様々な組織特異的メカニズムの範囲を通じて、宿主の健康を直接調節する。

短鎖脂肪酸の最大の影響、および分泌型免疫グロブリンＡが宿主の代謝の健康に及ぼす影響は、上皮バリアを組織して腸内の健全性を維持し、細菌の炎症分子が腸壁を通過するのを防ぐのに重要な役割を果たしていることが証明されている。

以下のタイプの細菌が調査され、東および中央スロバキアの山岳領域のミルクから常在する有益な微生物として識別された。

このような微生物の分離が世界の別の地域で形成されることになる場合、または他のタイプのミルク（すなわち、牛のミルクではなく、ヤギまたは羊のミルク）からの分離によって、研究および分離が行われる地域に特徴的な他の種の有益な常在微生物が分離され得る。

さらに、ミルクの適切な化学組成および固有の脂肪酸プロファイルを確保するために、検出され固定された栄養組成を有する山間地域の飼育および給餌が類似した地域からミルクを得なければならない。

このように、最終的には、得られる分離された微生物の含有量および仕様は、ミルクが得られ、その後、これらの附属書に記載されたプロセスによって処理される、地方および地域に依存する。

当の細菌の回収は以下のように行われる。

ミルクまたは酸味のある乳製品のサンプルは、その場で（局所的に、つまり農場から）異なるミルク生産者から局所的に採取される。我々の特定の場合では、我々は、東および中央スロバキアの山岳領域の農場からサンプルを採取した。しかし、以下の手順は、世界のどの地域でも実行され得る。

ミルクまたは酸味のある乳製品を６０ｍｌとおよび１２０ｍｌの異なる容量の無菌容器に採取し、実験室での分析に必要な量を各農場から少なくとも３リットルずつ採取して１回の分析を行う。

すべての農場（ファームヤード）の調査は、３回の繰り返しで行われ、ミルクまたは酸味のある乳製品の複数回のサンプリング（各農場で少なくとも３つのサンプル）を行う。

ネイティブ（原液）のミルクを原液のまま別々にＭＲＳ（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｍｅｄｉａｌａｂｓ．ｃｏｍ／ＴＤ／Ｍ６４１．ｐｄｆ）ブロスに加え、有用な微生物を採取する（１０ｍｌのミルクまたは試験済みの酸味のある乳製品（ケフィア）および４０ｍｌのＭＲＳブロス）。ＭＲＳは、「ｄｅＭａｎ，ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅ培地」を表す。

乳酸菌を分離するために：ラクトバシラス属、ラクトコッカス属サンプルを生理食塩水で１０^－１～１０^－９までチューブ（エッペンドルフ）で連続希釈し、ＭＲＳ寒天培地およびブロスに接種した。

他の有用な微生物を分離するために、サンプルは他の異なる選択培養培地（すべての培養培地はＨＩＭＥＤＩＡブランドで作られている）に接種される。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｍｅｄｉａｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｉｎｔｌ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／１００００００２７／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）．

ビフィドバクテリア（ビフィドバクテリウム属株）の分離およびその後のそれらの保存には、半液体のブラウロック寒天培地およびビフィズス寒天培地が使用される。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｍｅｄｉａｌａｂ．ｃｏｍ／ＴＤ／Ｍ１３９６．ｐｄｆ

腸球菌を分離するには、エンテロコッカスおよびそれらに続く培養物、腸球菌寒天培地および胆汁エスカリン寒天培地が使用される；ｈｔｔｐ：／／ｈｉｍｅｄｉａｌａｂｓ．ｃｏｍ／ＴＤ／Ｍ１５８０．ｐｄｆ；

連鎖球菌を確実に成長（分離、培養、再接種）させるためには、連鎖球菌寒天培地が使用される；ｈｔｔｐ：／／ｈｉｍｅｄｉａｌａｂｓ．ｃｏｍ／ＴＤ／Ｍ２４８．ｐｄｆ；

他の有用な微生物および付随する微生物叢を検出するために、採取したすべてのサンプルは、サブロー寒天培地、栄養寒天培地／ブロス、ブドウ球菌寒天培地、亜硫酸ビスマス寒天培地、サルモネラ・シゲラ寒天培地、遠藤またはマッコンキー寒天培地、クロストリジウムブロス／寒天培地、エルシニア寒天培地、炭水化物ベースのブロスなどの培養培地に類似した方法で接種される。

他のすべての未培養または非常に敏感な微生物は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をシーケンスすることによって検出された。

分離されたすべての常在微生物のゲノムシーケンスは、イルミナシーケンスキットとＳｔｒａｉｎＳｅｅｋｅｒプログラムとを使用して実行された。

接種されたサンプルは、１５℃、３７℃、および４５℃のさまざまな温度モードで培養される。

２４時間後、１００μｌの濃縮サンプルがＭＲＳ寒天培地に接種され、嫌気性条件下、３７℃で４８時間インキュベートされる。

さらに、乳製品およびその他の有用な微生物、ならびに付随するすべての微生物を分離および識別するためのテストが実施される。具体的には、次のことを行う：

グラム染色および生化学テスト：カタラーゼ、オキシダーゼ、インドール産生などの日常的なテスト、また、運動研究、異なる温度（１５～３７～４５℃）での生育などの生理的なもの、ショ糖、乳糖、麦芽糖、トレハロース、およびガラクトースの発酵などの糖質的なもの。

このように、乳酸菌の一次識別は、形態を検出するグラム染色、カタラーゼおよびオキシダーゼアッセイ、運動性テスト、インドール産生、１５℃での生育、および糖類発酵（アラビノース、フルクトース、乳糖、マニトール、サリチン、スクロース、およびトレハロース）を含む従来の微生物学的テストを用いて行われる。

確定的に確認された識別は、半自動または自動生化学テストシステム（Ｌａｃｈｅｍａ社製）を用いて行われる。

このプロセスおよび研究では、我々は、以下のようなテストを用いる：
１）ＡＮＡＥＲＯテスト２３
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｒｂａｌａｃｈｅｍａ．ｃｏｍ／ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｓ／ＡＮＡＥＲＯｔｅｓｔ２３＿ＣＺ＿ＳＫ＿ＥＮ＿ＲＵ＿ＰＬ＿Ｒ．
２）ＣＡＮＤＩＤＡ－スクリーン
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｒｂａｌａｃｈｅｍａ．ｃｏｍ／ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｓ／ＣＡＮＤＩＤＡ－Ｓｃｒｅｅｎ＿ＣＺ＿ＳＫ＿ＥＮ＿ＰＬ＿ＲＵ＿Ｅ．ｐｄｆ
３）ＥＮ－ＯＣＣＵＳテスト
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生化学的識別の後、ＭＡＬＤＩプロテオミクスによる識別が行われる。

その後インスタント形態の食物に加えられる、有用微生物の混合物を作るために採取された菌株は、シーケンスが決定される。それらのそれぞれに培養のための添付文書が作成される。同時にそれらの相乗効果が調べられ、確認される。

様々なｉｎｖｉｔｒｏアッセイを行い、非病原性、無毒性、および無毒素原性、ならび有用な特性の存在を確認するために、さまざまなｉｎｖｉｔｒｏアッセイおよび実験が実施される。

有用な微生物とは、以下のような証明された特性を持つ菌株を含む：
１）それらが非病原性である、
２）それらが無毒性である、
３）それらが毒を生じない、
４）それらがミルクを発酵させて、乳酸、ビタミンなどの有用な代謝物の生成を助けることができる、
５）それらが、病原性および条件付病原性細菌に対する抗菌性および拮抗性のスペクトルを特徴とする、
６）それらが体の免疫反応を刺激することができる、
７）それらがほとんどの抗生物質に対して耐性がない。

それらの分類学および他の特性に従って、付随する微生物叢として分類される他の微生物は、ミルクの品質を衛生的に評価する目的でのみ分析される。

上記に照らして、ミルクから自然の常在微生物叢を得るために必要な以下のステップを簡単に述べることが可能である。

１）牛、ヤギ、または羊から衛生上の必要性に応じてミルクを採取する。
２）微生物をそれぞれの選択培養培地に接種する。
３）すべての微生物の質的および量的な含有量を検査する。
４）播種による網羅的な純粋培養物を分離する。
５）それらの生物学的特性を検査する。
６）それらの無害性を判定する。
７）標準的な手順を適用して分離した菌株を識別する。
８）テストシステムおよびＭＡＬＤＩを用いて識別する。
９）シーケンスする。
１０）凍結乾燥を行う。

上記のようにして得られた細菌の保持（保存）に関する詳細な情報を考慮する。

１）分離されたものは、著者自身の培養物として、ＫｏｓｉｃｅのＬＡＢＡＳ，ｓ．ｒ．ｏ．の敷地内で、１菌株あたり１０本のチューブに入った半固形寒天培地の寒天培地柱の形態で保管されており、それらは、４℃の冷蔵庫で保存されている。
２）培養物は、１５％のグリセロールを含むＭＲＳ保護培養培地でさらに凍結され、－８０℃で保存される。
３）株を凍結乾燥し、アンプルに入れて保存する。東および中央スロバキア地域に典型的に存在する識別された各細菌種、すなわち、エンテロコッカス・フェカリスＳＰ、エンテロコッカス・フェカリスＣｃｊ、エンテロコッカス・ヒラエＫｌｋ、ラクトバチルス・プランタラムＳＰ、ラクトバチルス・プランタラムＡＮ、ラクトバチルス・パラカセイＴＤ、ラクトバチルス・カテナフォルミスＳＢ、およびクルイベロマイセス・マルシアヌスＳＢは、ストレインパスポート（ＳｔｒａｉｎＰａｓｓｐｏｒｔ）と無害証明書とが発行されている。

上記の方法で得られた自然の微生物叢は、低温殺菌後のフレッシュミルクに加えられる。これらの微生物をパウダー形態にして使用する場合は、次いで（上記の方法で得られた）細菌を瞬時に保存することを適用した手順を指定しなければならない。所望の目的を達成するためには、以下のことを行う必要がある。

１）有用な微生物８株のうち１株を含む純粋な（各菌種および条件に適した培養培地にあらかじめ接種した）液体（ブロス）の毎日（１８～２４時間）の培養物を調製する。
２）特定のまたは一般的な栽培によって、それらから、マット上または土手（発酵槽）で同時にいくつかの株（すべての乳酸菌とすべての腸球菌、および別々にクルイベロマイセス・マルシアヌス）を成長させ、各株の濃度を最低１０^９～１０^１１ＣＦＵ／ｍｌにする。
３）１リットル、１０リットルなど、必要な量の液体混合物を作る。
４）凍結乾燥（昇華法により：最初に凍結させた混合物を、保護媒体を加えて時々－４０℃から＋４０℃まで急速に加熱することを含む手順）を行い、有用な微生物の混合物のパウダーを得る。
５）飲み物１リットルあたりの用量が、約１～１０ｇの乾燥した微生物の混合物（１ｇあたりのそれらの量および推奨用量に応じる）となるように、袋に詰める。
６）自然素材を使用した防湿、防水性の高いパッケージにパウダーを詰める。袋は無菌状態で包装される必要がある。

発明の実勢形態の例
本発明、常在する自然の微生物叢を復元させることにより、固有の脂肪酸組成を有するミルクおよび乳製品を製造する方法は、人の健康に有益な飲用ミルクおよびその他の乳製品を生産するために使用されて、有益な微生物が保存され、低温殺菌による損傷から保護されたミルクおよび乳製品を得ることができ、さらに、そのようなミルクまたは乳製品は、ミルク生産地域の人々に最適な特定の脂肪酸比率を含む。

本発明はまた、人の健康を促進する常在微生物叢を得るために使用され得、これはその後パウダー形態で保存される。これは乳製品のサプリメントである。このパウダーは、例えば、これらの有益な物質を失った飲用ミルクにそれを加えて、別の製品として提供され得る。元の微生物を含むパウダーは、標準的な（現在でも）飲用ミルクに、消費直前に加えられよう。

本発明はまた、自然のフレーバーレスミルク飲料であろうとフレーバーミルク飲料（例えば、ココア、バニラ、イチゴなどでフレーバー化されたもの）であろうと、複雑なミルク飲料を調製するために使用され得る。したがって、この場合、分離されて再生産された健康に有益な細菌が乾燥ミルクに加えられ、得られたインスタント飲料は水を加えることによって調製され得る。

本発明は、牛乳だけでなく、ヤギまたは羊のミルクにも同じ条件、同じ手順で適用され得る。

Claims

常在する自然の微生物叢を復元させることにより、固有の脂肪酸組成を有するミルクおよび乳製品サプリメントを製造する方法であって、特定の地理的領域からの牛、ヤギ、または羊のミルクから自然の常在微生物叢を識別して分離することでそれを得ることができ、このような微生物叢は、そのミルクの原産地域の人々が消費するのに最適なものであるが、標準的なミルクの生産および加工の一部である低温殺菌によって定期的に破壊され、したがって、このようにして得られた前記自然の常在微生物叢には、別の株の常在微生物叢が含まれており、これらはその後、工業的に再生産され、低温殺菌後の飲用ミルクに再び加えられる、または前記微生物叢は加工され、インスタントパウダーの形態でベースに結合されることを特徴とする、方法。
常在する自然の微生物叢を復元させることにより、固有の脂肪酸組成を有するミルクおよびミルクサプリメントを製造する方法であって、牛乳から識別および分離されたものとして、東および中央スロバキアの山岳地域で採取された牛乳に典型である以下の自然の常在種：エンテロコッカス・フェカリスＳＰ、エンテロコッカス・フェカリスＣｃｊ、エンテロコッカス・ヒラエＫｌｋ、ラクトバチルス・プランタラムＳＰ、ラクトバチルス・プランタラムＡＮ、ラクトバチルス・パラカセイＴＤ、ラクトバチルス・カテナフォルミスＳＢ、およびクルイベロマイセス・マルシアヌスＳＢ細菌を得ることができ、その後、工業的に再生産、加工され、飲用ミルクに再び加えられる、または、これらの細菌は、その後、工業的に再生産、加工され、東および中央スロバキアの地域の人々が消費するのに最適なインスタントパウダーの形態でベースに結合されることを特徴とする、方法。
常在する自然の微生物叢を復元させることにより、固有の脂肪酸組成を有するミルクおよび乳製品サプリメントを製造する方法であって、牛乳から識別および分離された、東および中央スロバキアの山岳地域で採取された牛乳に典型である、以下の細菌の自然の常在種：２．１０^５ＣＦＵ／ｍｌの量のエンテロコッカス・フェカリスＳＰ、３ｘ１０^５ＣＦＵ／ｍｌのエンテロコッカス・フェカリスＣｃｊ、２ｘ１０^５ＣＦＵ／ｍｌのエンテロコッカス・ヒラエＫｌｋ、２ｘ１０^３ＣＦＵ／ｍｌのラクトバチルス・プランタラムＳＰ、１ｘ１０^２ＣＦＵ／ｍｌのラクトバチルス・プランタラムＡＮ、１ｘ１０^２ＣＦＵ／ｍｌのラクトバチルス・パラカセイＴＤ、４ｘ１０^２ＣＦＵ／ｍｌのラクトバチルス・カテナフォルミＳＥ、および７ｘ１０^２ＣＦＵ／ｍｌのラクトバチルス・カテナフォルミスＳＢを得ることができ、その後、工業的に再生産、加工され、飲用ミルクに再び加えられ、これらの細菌は、その後、工業的に再生産、加工され、東および中央スロバキアの地域の人々が消費するのに最適なインスタントパウダーの形態でベースに結合されることを特徴とする、方法。
常在する自然の微生物叢を復元させることにより、固有の脂肪酸組成を有するミルクおよび乳製品サプリメントを製造する方法であって、特定の地理的領域の牛、羊、またはヤギのミルクから固有の脂肪酸組成を識別して分離することにより、それを得ることができ、このような脂肪酸は、乳生産地域の人々による消費に最適な前記ミルクに使用され、フレッシュミルクとして消費され得、またはこれらの脂肪酸はさらに飲用ミルクに追加的に加えられ得、またはこれらの脂肪酸は加工され、インスタントパウダーの形態でベースに結合され得ることを特徴とする、方法。
常在する自然の微生物叢を復元させることにより、固有の脂肪酸組成を有するミルクおよび乳製品サプリメントを製造する方法であって、東および中央スロバキアの山岳地域で採取された牛乳に典型である、以下の固有の脂肪酸の比率：０．８１％のω－３α－リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ３）が、２．１５％のω－６リノレン酸（Ｃ１８：２ｎ６ｃ）（短鎖脂肪酸）、０．２２％のアラキジン酸（２０：０）、および０．１１％のベヘン酸（２２：０）（超長鎖脂肪酸）を得ることができ、このような脂肪酸は、東および中央スロバキアの地域の人々による消費に最適なミルクに使用され、ここで、それはフレッシュミルクとして消費され得、またはこれらの脂肪酸はさらに飲用ミルクに追加的に加えられ得、またはこれらの脂肪酸は加工され、インスタントパウダーの形態でベースに結合され得ることを特徴とする、方法。