JP2022527854A - 小脳顆粒細胞前駆細胞(GCP)のin vitro培養のための安定な系、前記細胞のin vitro培養のための安定な方法、およびin vitro培養のための前記系または方法の使用。 - Google Patents
小脳顆粒細胞前駆細胞(GCP)のin vitro培養のための安定な系、前記細胞のin vitro培養のための安定な方法、およびin vitro培養のための前記系または方法の使用。 Download PDFInfo
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- C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system
Abstract
本発明は、培養支持体、哺乳類GCP細胞、および少なくともSAG(smoothenedのアゴニスト)およびEGF(上皮成長因子)を含む培養培地、を含む小脳顆粒細胞前駆細胞(顆粒細胞前駆細胞、GCP)の培養のためのin vitroの系、およびGCP細胞のin vitro培養のための方法、および、小脳顆粒の病態生理学の研究のためのin vitroモデルの生成のための上記培養系または培養方法の使用、または損傷もしくは神経変性に起因する小脳疾患に対する遺伝子療法および細胞療法アプローチにおける使用のための上記培養系もしくは培養方法の使用、に関する。
Description
発明の技術分野
本発明は、
以下を含む小脳顆粒細胞前駆細胞(GCP)のin vitro培養系に関する:
培養培地、
哺乳類のGCP細胞、および
少なくともSAG(smoothenedのアゴニスト)およびEGF(上皮成長因子)を含む培養培地;
以下の工程を含むGCP細胞のin vitro培養のための方法に関する:
(a)哺乳類の小脳からGCP細胞を単離する工程
(b)工程(a)で得たGCP細胞を、少なくともSAGおよびEGFを含む培養培地中に置く工程
(c)GCP細胞を富化(enrichment)する、および/または希釈によって増殖させる工程;および
小脳顆粒細胞の病態生理学の研究のためのin vitroモデルの生成のための該培養系または培養方法の使用、または損傷もしくは神経変性に起因する小脳疾患に対する遺伝子療法および細胞療法アプローチにおける該培養系または培養方法の使用に関する。
本発明は、
以下を含む小脳顆粒細胞前駆細胞(GCP)のin vitro培養系に関する:
培養培地、
哺乳類のGCP細胞、および
少なくともSAG(smoothenedのアゴニスト)およびEGF(上皮成長因子)を含む培養培地;
以下の工程を含むGCP細胞のin vitro培養のための方法に関する:
(a)哺乳類の小脳からGCP細胞を単離する工程
(b)工程(a)で得たGCP細胞を、少なくともSAGおよびEGFを含む培養培地中に置く工程
(c)GCP細胞を富化(enrichment)する、および/または希釈によって増殖させる工程;および
小脳顆粒細胞の病態生理学の研究のためのin vitroモデルの生成のための該培養系または培養方法の使用、または損傷もしくは神経変性に起因する小脳疾患に対する遺伝子療法および細胞療法アプローチにおける該培養系または培養方法の使用に関する。
先行技術
小脳はバランス、姿勢、随意運動の維持のための器官である。この器官は、自身の細胞の形成に重要な2つの脳室帯(Germinal zone);脳室帯(Ventricular zone、VZ)および菱脳唇(Rhombic Lip、RL)に区切られている。
小脳はバランス、姿勢、随意運動の維持のための器官である。この器官は、自身の細胞の形成に重要な2つの脳室帯(Germinal zone);脳室帯(Ventricular zone、VZ)および菱脳唇(Rhombic Lip、RL)に区切られている。
プルキンエ細胞、ゴルジ細胞、および深部核の神経細胞は、脳室帯(VZ)から生成される。
小脳顆粒細胞前駆細胞(GCP)は菱脳唇(RL)から生成される。
マウスの発生(胚形成期E10前後)およびヒトの発生過程では、GCP細胞層は急激な増殖段階に入り、小脳原基表面の接線方向に沿って移動し(E15の段階)、および小脳全体を覆う外顆粒層(またはEGL)と呼ばれる層を形成する。この層は生後最大10日目まで拡大し、続いてGCPは成熟顆粒細胞への分化を開始し、プルキンエ細胞層を通過しながら移動して内顆粒層(IGL)を形成する。
この点に関して、GCP細胞の増殖、移動および分化過程は小脳の適切な発達および機能に必須であり、およびそれらを制御する分子経路における欠陥は種々の疾患の原因となることに注目すべきである(https://medline.plus.gov/cerebellardisorders.htmlを参照)。この点に関して、発達過程の障害(例えば、毛細血管拡張性運動失調症、ジュベール症候群、ダンディー・ウォーカー症候群)、神経変性疾患(例えば脊髄小脳変性症)および腫瘍性形質転換(例えば髄芽腫)などが報告されている。
GCPの増殖、移動、分化を促す分子経路については、文献から数え切れないほどの研究が知られているが、これらの経路はまだ完全には解明されていない。
これはまた、病態生理学的な特徴を完全に保存しながら、制御経路を研究できる適切なin vitro研究モデルが無いことにも起因している。
GCP細胞の増殖を誘導する基本的な経路の1つは、ソニックヘッジホッグ(Shh)経路であり、その制御の消失は、ヒトおよびマウス両者のモデルにおいて、髄芽腫(しばしばGCP細胞の絶え間ない増殖に起因する小児がん)の発生に関連するほどである。
周知技術では、Shh経路に依存的な髄芽種の細胞モデルがGCP細胞およびその経路の分子メカニズムの研究モデルとして用いられてきたが、しかしこれらのモデルで用いられてきた通常の細胞培養条件は、実際にはShh経路を抑制するために、前述のモデルは、その元となる病理だけでなくGCP細胞の生理を代表する事にも全く適さないことに留意すべきである。
周知技術において広く知られたin vitroのGCP細胞研究モデルは、合成Shhペプチドまたは化学経路アゴニスト、例えばSAG(Smoothenedアゴニスト)によって凝集させられ、およびそれらによって刺激されるマウスのGCP細胞(P7マウスから採取)の一過性培養物によって構成される。
しかし、これらの培養物は自発的に、数日以内に(典型的には5-6日)に増殖しない顆粒細胞へと分化するため、よって経時的に非常に安定というわけではない。
本発明者らによる未発表の研究では、マウスのGCP細胞(P7マウスから採取)をSAGで刺激した後に、ニューロスフェアの形態でより長く維持し得る事を示しているが、しかしこの条件であっても長期間安定な細胞培養を保証するものではない。
よって、短期間および特に長期間における、GCP細胞培養の安定性は当分野における大きな問題である。
これによって、GCP細胞またはShh経路を研究する研究者たちは、実験動物を犠牲にして新しく培養を行わなければならず、実験のばらつきや、研究の時間および費用に影響を与えている。
これまで、上皮成長因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)に富んだ無血清培地中のGCP細胞培養が知られている。これらの培養物は経時的に安定的であるが、GCPに典型的な生理学的経路(例えばShh経路)を発現せず、および分化実験において、それらは神経細胞成分よりもグリア細胞成分の割合が高い混合細胞集団を構成する。
FGFがShh経路を阻害する事および小脳顆粒細胞前駆細胞の生育を制限することは実際に知られていた。
したがって、このやり方で取得された培養物は遺伝子的/生化学的な発現パターンにおいてGCP細胞とは著しく異なっており、およびこの系は非神経細胞集団にひどく汚染されている。
したがって、これらの培養物は信頼性が低く、および再現性も高くない。
よって、前述のin vitro培養方法および研究モデルは、一般的に用いられているとは言え、GCP細胞を適切に代表するものではない。
したがって、これまで当分野では、同時に安定であり、信頼性があり、再現性があり、調整が容易であり、およびGCP細胞の富化または増殖を容易にするだけでなく、非常に長期間にわたる経時的なGCP細胞の維持を可能にし、および最適な遺伝子および生化学的発現を得ることができる、GCP細胞のin vitro培養のための系または方法は知られていない。
したがって、上記の周知技術の欠点の全てを克服したGCP細胞のin vitro培養のための系および方法が必要とされている。
発明の概要
驚くべきことに、当分野で知られたGCP細胞のin vitro培養のための系および/または方法の欠点を全て克服した、GCP細胞のin vitro培養のための系および方法が見出された。
驚くべきことに、当分野で知られたGCP細胞のin vitro培養のための系および/または方法の欠点を全て克服した、GCP細胞のin vitro培養のための系および方法が見出された。
特に、本発明のGCP細胞のin vitro培養のための系および方法は、単純であり、信頼性があり、容易に再現可能であり、および極めて安定である(経時的に、しかしまた得られるGCP細胞培養物の遺伝子的/生化学的な発現プロファイルに関しては、新鮮なGCP細胞培養物のそれと非常に類似しており、およびまたそれらの凍結および解凍の可能性に関しても、それらの特性を変化させない保存方法である)。
よって、本発明の第1の目的は、小脳顆粒細胞前駆細胞(GCP)の培養のためのin vitroの系であって、以下を含む:
培養培地、
哺乳類GCP細胞、および
少なくともSAG(Smoothenedアゴニスト)およびEGF(上皮成長因子)を含む培養培地。
培養培地、
哺乳類GCP細胞、および
少なくともSAG(Smoothenedアゴニスト)およびEGF(上皮成長因子)を含む培養培地。
本発明の第2の目的は、GCP細胞のin vitro培養のための方法であって、以下の工程を含む:
(a)哺乳類の小脳からGCP細胞を単離する工程
(b)工程(a)で得た個々のGCP細胞を少なくともSAGおよびEGFを含む培養培地中に置く工程
(c)GCP細胞を富化する、および/または希釈によって増殖させる工程、
(a)哺乳類の小脳からGCP細胞を単離する工程
(b)工程(a)で得た個々のGCP細胞を少なくともSAGおよびEGFを含む培養培地中に置く工程
(c)GCP細胞を富化する、および/または希釈によって増殖させる工程、
本発明のその他の目的は、小脳顆粒細胞の病態生理学の研究、好ましくは小脳顆粒細胞に影響を与える機能不全または病理の研究のための、in vitroモデルを生成するためのin vitro培養系または培養方法の使用である。
本発明のその他の目的は、損傷または神経変性に起因する小脳疾患への遺伝子および細胞療法アプローチにおいて使用するためのin vitro培養のための培養系または培養方法である。
全ての本発明の目的は、特許請求の範囲においてさらによく定義されており、従属項は本発明の好ましい実施形態を記載しており、およびこの記載の不可欠な部分を形成している。
図面の簡単な説明
図1は、本発明の目的であるGCP細胞のin vitro培養のための方法を図示したものである。
本発明の詳細な説明
本発明の第1の目的は、請求項1に記載のGCP細胞のin vitro培養系である。
本発明の第1の目的は、請求項1に記載のGCP細胞のin vitro培養系である。
本発明において、GCP細胞(顆粒細胞前駆細胞)という用語は小脳顆粒細胞前駆細胞を意味する。
本発明における「培養培地」という用語は、好ましくは細胞培養に適したポリスチレンフラスコなどの固体培地を意味する。
本発明における哺乳類のGCP細胞とは、通常の哺乳動物(ヒトを含む)、または組み換え哺乳動物(ヒトを除く)の小脳に由来するGCP細胞であることを意味する。好ましくは本発明における系および方法のGCP細胞はげっ歯類のGCP細胞であり、好ましくは非組み換えマウス細胞であり、好ましくは生後7日目(P7)に採取した脳から得られたものである。本発明における系および方法は好ましくは以下のマウス系統を用いる:CD1、C57BI/6および129。
本発明の系および方法におけるGCP細胞は、ヒトの胚に由来するGCP細胞ではない。
本発明のGCP細胞は、典型的には基質接着無しで、および典型的にはニューロスフェア(NSとも呼ばれる)として培養される。
本発明の培養培地は少なくともSAG(Smoothenedアゴニスト)およびEGF(上皮成長因子)を含む。
本発明の培養培地において、SAGは典型的には100nMから1μMの濃度範囲であり、好ましくは200nMの濃度であって、一方EGFは典型的には200nMから1μMの濃度範囲であり、好ましくは1μMの濃度である。本発明の培地は、SAG以外、およびEGF以外の成分を含んでいてもよく、および特に、DMEM-F12(すなわちダルベッコ改変イーグル培地/Nutrient Mixture F-12)、グルコース、ビタミンAフリーB27、インスリン、NALC(すなわち、N-アセチル-L-システイン)、ヘパリン、および少なくとも1つの抗生物質から選択された少なくとも1つの追加の成分を含んでいてよい。
本発明において、抗生物質は典型的にはペニシリンおよび/またはストレプトマイシンを意味する。本発明の好ましい態様では、ここで用いられる培地は、SAG、EGF、DMEM-F12(すなわちダルベッコ改変イーグル培地/Nutrient Mixture F-12)、グルコース、ビタミンAフリーB27サプリメント、インスリン、NALC(すなわち、N-アセチル-L-システイン)、ヘパリン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む。
本発明の好ましい態様では、DMEM-F12はここで用いられる培養培地の主な成分であり;ここに、典型的には3mg/mlの濃度のグルコース;典型的には1Xの終濃度で用いられるビタミンAフリーB27サプリメント(50Xの濃度と比較。実際に、このB27はThermofischer社から購入したコード12587010のものであり、最終溶液中で50倍に希釈される);典型的には50μg/mlの濃度のインスリン;典型的には60g/mlの濃度のNALC;典型的には2μg/mlの濃度のヘパリン;抗生物質に関して、典型的には100ユニット/mlの濃度のペニシリンおよび典型的には0.1mg/mlの濃度のストレプトマイシンが添加される。
本発明のin vitro培養系における哺乳類GCP細胞は、拡大させ、増殖(proliferate)を駆動させ、または生育および/または増殖(propagate)させることができ、および典型的にはスフェロイドの形態(ニューロスフェア、NS)であり、および以下に記載するin vitro培養方法によると、新鮮なGCP細胞培養物と同様の遺伝子的/生化学的な発現プロファイルを維持しながら、クローン原性アッセイおよび継続的な希釈アッセイから測定可能な、無限の増殖および自己新生状態に維持される。上記のように、この系および方法(以下で説明する)によってin vitroで取得されたGCP細胞は、高い寛容性を持って脳に再移植され得る、かつ劣化の兆候を示すことなく容易に凍結および解凍し得るため、その市場性が促進される。
本発明の系および方法における哺乳類 GCP細胞はニューロスフェアを形成し、その形態またはコンフルエンスの程度を、透過型および/または走査型光顕微鏡で観察し得る。
本発明のin vitro培養系はまた、Atho1、Gli1、N-Mycなどの特異的な哺乳類GCP細胞マーカーを、ウェスタンブロット法、定量RT-PCR法、および免疫蛍光法によって定性的および定量的にアッセイする事を可能にする。
GCP細胞のin vitro培養のための方法は、請求項5の対象である。
前述の方法において、「GCP細胞」は、上記に定義した哺乳類GCP細胞を意味する;「培養支持体」および「培養培地」という用語についても同様であり、これらはin vitro培養系において上記と同じ意味を持つ。
本発明のin vitro培養方法において、哺乳類の小脳からGCP細胞を単離する工程(a)は、哺乳類の小脳を、ハンクス平衡生理食塩水溶液(HBSS)、グルコース、DNase、および少なくとも1つの抗生物質を含み得る緩衝液系中で破砕する事を含み得る。
「抗生物質」は好ましくは上記の1つ以上の抗生物質を意味する(ペニシリンおよび/またはストレプトマイシン)。
好ましくは、HBSS緩衝系において、グルコースは典型的には終濃度5mg/mlで添加され、ペニシリンは典型的には100ユニット/mlの濃度で添加され、ストレプトマイシンは典型的には0.1mg/mlの濃度で添加される。上記の溶液中で、血清ピペットを用いて粗いトリチュレーションを行った後、脳を1,300rpm(-190xg)で5分間遠心分離する。こうして得られたペレットを、1.3U/mlの濃度のDNaseを添加した同様の緩衝液系(HBSS、グルコースおよび抗生物質)中に再懸濁し、少なくとも5分間はパスツールピペットを通過させて分離を促進しつつ室温で30分間置いた。1,300rpm(-190xg)で5分間の2回目の遠心分離の後、得られたGCP細胞を最終培地に再懸濁し、カウントした。
続いて、本発明のin vitro培養方法における工程b)において、工程a)で得られたGCP細胞は、培養培地中に置かれ、または播かれ、および培養培地中に典型的には10,000から30,000細胞/cm2の範囲、好ましくは、16.000細胞/cm2に希釈されている。
本発明のin vitroの方法における培養培地は、好ましくはDMEM-F12、グルコース、ビタミンAフリーB27、インスリン、NALC、ヘパリン、少なくとも1つの抗生物質、SAGおよびEGFである。
本発明のin vitro培養方法における工程c)、GCP細胞を富化する、および/または希釈によって増殖させる工程、は典型的には37℃の温度で、5%CO2の存在下で行われる。このGCPスフェロイド細胞は無期限に富化および/または増殖し得る。工程c)におけるGCP細胞はまた、典型的にはタンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素(Accutase登録商標として市販されている)を含む溶液用いて定期的に解離され、典型的には少なくとも週に2回解離される。Accutase登録商標処置に続いて、細胞は典型的には遠心分離され、それらの維持/培養培地に再懸濁され、必要に応じて1:2または1:3希釈で希釈され得る。
本発明の1つの目的は、小脳顆粒細胞の病態生理学の研究、好ましくは、小脳顆粒細胞に影響を与える機能不全または病理の研究のためのin vitro細胞モデルを生成するために、前述のin vitro培養のための培養系または方法を使用することである。
この目的に沿って、該in vitro培養系または方法は、可能な限り生理に近い状況、しかし細胞の観点からは自律的な(cell autonomous)状況で、GCPの発達、変性、および形質転換をもたらす機構を調査するにあたって再現性のある、および代表的な細胞モデルを、提供/生成するために有用であるだろう。
分化後にはまた、この細胞モデルは小脳顆粒細胞の病態生理学的な特徴(シナプスの形成、神経伝達、など)を研究するための有用なツールとなり得る。
本発明のin vitro培養方法はまた、小脳の変性疾患のマウスモデル由来の細胞株を含むGCP細胞株の作成に適用し得、これらの疾患の研究への価値のある援助をもたらす。
本発明のin vitro培養系または方法はまた、通常の増殖または分化した顆粒細胞および非増殖性の顆粒細胞と比較して、旧薬および新薬の腫瘍性顆粒細胞に対する毒性を比べるための一次細胞コントロールモデルを提供するのに有用であり、in vivoの研究の前にin vitro処置の望まない効果を推定する事ができる。
特に好ましい態様では、本発明のin vitro培養系または方法は、小脳顆粒細胞に影響を与える機能不全または疾患のin vitroモデルの生成に用いられ得る。
別の特に好ましい態様では、本発明のin vitro培養系または方法はまた、小脳顆粒細胞に対して作用し得る薬剤または物質のスクリーニングのための方法において用いられ得る。
本発明の1つの目的は、損傷または神経変性に起因する脳疾患に対する遺伝子療法および細胞療法アプローチにおいて使用するための上記に記載のin vitro培養のための系または方法である。
これに関して、損傷または神経変性に起因する小脳疾患は、典型的には、毛細血管拡張性運動失調症、ナイミーヘン症候群、ジュベール症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、脊髄小脳変性症、または小脳のその他の疾患に関する。
本発明の培養系および方法は、富化後に、適切な発達期または成体の哺乳類の小脳に再移植し得るGCP細胞の培養物を調製する事を可能にする。このようなGCP細胞は、疾患を患う個体由来GCPの遺伝子的欠損を遺伝子移植または遺伝子編集することによるin vitroでの修正後、本発明のin vitro培養方法を参照したin vitro富化、およびその後の小脳への再移植において、遺伝子工学的応用を見出す。
上記の系およびin vitroの方法は、以下に記載の非限定的な実施例を参照してより詳細に説明される。
実施例1
本発明のin vitro培養のための方法
生後7日(P7)のマウスから外科的に切除した後、小脳をHBSS、グルコースおよび抗生物質、およびDNase(上記に定義した濃度で)を含む緩衝液中で機械的に破砕し、およびこのようにして得られた個々の細胞をカウントし、およびDMEM-F12、グルコース、ビタミンAフリーB27、インスリン、NALC、ヘパリン、抗生物質(上記に定義した濃度)およびSAG(200nM)およびEGF(1μM)から構成された培地に16000細胞/cm2に希釈して播種した。この培地では、定期的にAccutase登録商標を用いて定期的にスフェアを分離させ(週に2、3回)、および希釈によって増殖させる(過剰な成長と、栄養不足や低酸素による死を防ぐため)ことで、細胞を無期限に富化および維持し得る。反応条件は上記の通り。本発明のin vitro培養方法を図1に示す。
本発明のin vitro培養のための方法
生後7日(P7)のマウスから外科的に切除した後、小脳をHBSS、グルコースおよび抗生物質、およびDNase(上記に定義した濃度で)を含む緩衝液中で機械的に破砕し、およびこのようにして得られた個々の細胞をカウントし、およびDMEM-F12、グルコース、ビタミンAフリーB27、インスリン、NALC、ヘパリン、抗生物質(上記に定義した濃度)およびSAG(200nM)およびEGF(1μM)から構成された培地に16000細胞/cm2に希釈して播種した。この培地では、定期的にAccutase登録商標を用いて定期的にスフェアを分離させ(週に2、3回)、および希釈によって増殖させる(過剰な成長と、栄養不足や低酸素による死を防ぐため)ことで、細胞を無期限に富化および維持し得る。反応条件は上記の通り。本発明のin vitro培養方法を図1に示す。
結果
GCP細胞では、SAGがShh経路の高い発現を維持し(培養後の異なる時点におけるGli1およびN-MYCタンパク質の発現によって観察)、一方でEGFがその無限の増殖力を確保することが観察されている。加えて、幹細胞マーカーの発現の解析は、SAGに加えてEGFを投与することで、SAGを添加して凝集または浮遊させたGCP細胞の一過性培養物における場合よりも、GCP細胞においてより高い発現量のSOX2転写因子およびネスチンタンパク質が有利に誘導され、GCP細胞の経時的な安定性維持能力に著しい影響を与えることを示した。本発明者らの結果がGCP細胞の維持と決定におけるSAGおよびEGFの相乗効果に密接に関連していることに留意すべきである。実際に、EGFが存在するのみでは、GCPに典型的なマーカーを発現しない別の種類の細胞集団が単離されることになる(図4)。一方で、SAG単独の存在では、図8にも示されるように、培養物の長期の生存は保証されない。本発明のin vitro培養方法を用いて安定化した細胞株において行った分化実験では、大部分の細胞は特異的な神経細胞マーカーであるβ3チューブリンの発現がポジティブであり、本発明者らの培養物がグリア細胞成分ではなく神経細胞成分で強く富化されることが実証された。
GCP細胞では、SAGがShh経路の高い発現を維持し(培養後の異なる時点におけるGli1およびN-MYCタンパク質の発現によって観察)、一方でEGFがその無限の増殖力を確保することが観察されている。加えて、幹細胞マーカーの発現の解析は、SAGに加えてEGFを投与することで、SAGを添加して凝集または浮遊させたGCP細胞の一過性培養物における場合よりも、GCP細胞においてより高い発現量のSOX2転写因子およびネスチンタンパク質が有利に誘導され、GCP細胞の経時的な安定性維持能力に著しい影響を与えることを示した。本発明者らの結果がGCP細胞の維持と決定におけるSAGおよびEGFの相乗効果に密接に関連していることに留意すべきである。実際に、EGFが存在するのみでは、GCPに典型的なマーカーを発現しない別の種類の細胞集団が単離されることになる(図4)。一方で、SAG単独の存在では、図8にも示されるように、培養物の長期の生存は保証されない。本発明のin vitro培養方法を用いて安定化した細胞株において行った分化実験では、大部分の細胞は特異的な神経細胞マーカーであるβ3チューブリンの発現がポジティブであり、本発明者らの培養物がグリア細胞成分ではなく神経細胞成分で強く富化されることが実証された。
Claims (13)
- 培養培地、
哺乳類の小脳顆粒細胞前駆細胞(GCP)、ならびに
少なくともSAG(smoothenedのアゴニスト)およびEGF(上皮成長因子)を含む培養培地、
を含む、GCPのin vitro培養系。 - 該哺乳類のGCP細胞が、げっ歯類の、好ましくは非トランスジェニックマウスの、好ましくは生後7日目(P7)に採取した脳から得られたGCP細胞である、請求項1に記載のin vitro培養系。
- DMEM-F12(すなわち、ダルベッコ改変イーグル培地/Nutrient Mixture F-12)、グルコース、ビタミンAフリーB27サプリメント、インスリン、NALC(すなわち、N-アセチル-L-システイン)、およびヘパリンを含む群より選択された少なくとも1つ以上のその他の成分に加えて、該培養培地が少なくとも1つの抗生物質を含む、請求項1または2に記載のin vitro培養系。
- 該培地がSAG、EGF、DMEM-F12(すなわちダルベッコ改変イーグル培地/Nutrient Mixture F-12)、グルコース、ビタミンAフリーB27サプリメント、インスリン、NALC(すなわち、N-アセチル-L-システイン)、ヘパリン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む、前述の請求項の何れか1項に記載のin vitro培養系。
- (a)哺乳類の小脳からGCP細胞を単離する工程、
(b)工程(a)で得たGCP細胞を少なくともSAGおよびEGFを含む培養培地中に置く工程、
(c)GCP細胞を富化(enrichment)する、および/または希釈によって増殖させる工程、
を含む、GCP細胞のin vitro培養のための方法 - 哺乳類の脳の小脳からGCP細胞を単離する工程(a)が、好ましくはハンクス平衡生理食塩水溶液(HBSS)、グルコース、DNaseおよび少なくとも1種の抗生物質を含む緩衝系において、哺乳類の小脳を破砕することによるものである、請求項5に記載のin vitro培養のための方法。
- 工程(b)の培養培地中のGCP細胞が10,000から30,000細胞/cm2の範囲で希釈されている、好ましくは、16,000細胞/cm2に希釈されている、請求項5または6に記載のin vitro培養のための方法。
- 工程c)におけるGCP細胞を、タンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素を含む溶液で定期的に解離させる、請求項5-7に記載のin vitro培養のための方法。
- 小脳顆粒細胞の病態生理学の研究、好ましくは小脳顆粒細胞に影響を与える機能不全または疾患の研究のためのin vitroモデルの生成のための、請求項1に記載のin vitro培養系および請求項5に記載のin vitro培養方法の使用。
- 小脳の変性疾患のマウスモデルを参照するGCP細胞株を作成するための、請求項5に記載のin vitro培養方法の使用。
- 増殖性または分化性顆粒細胞および非増殖性通常顆粒細胞での比較において、腫瘍性顆粒細胞に対する旧薬および新薬の毒性を比較するための、小脳腫瘍の一次細胞モデルおよびコントロールを提供するための、請求項1に記載の系、または請求項5に記載のin vitro培養のための方法の使用。
- 小脳顆粒細胞に作用し得る薬剤または物質のスクリーニング方法における、請求項1に記載の系または請求項5に記載のin vitro培養のための方法の使用。
- 損傷または神経変性に起因する脳疾患、好ましくは毛細血管拡張性運動失調症、ナイミーヘン症候群、ジュベール症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、脊髄小脳変性症、その他の小脳疾患を含む群から選択された脳疾患に対する遺伝子療法および細胞療法アプローチにおいて使用するための、請求項1に記載のin vitro培養系または請求項5に記載のin vitro培養のための方法。
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IT201900004377 | 2019-03-26 | ||
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- 2020-03-19 EP EP20719216.2A patent/EP3947652A1/en active Pending
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