JP2022525275A - ヘテロ多量体タンパク質及びその使用法 - Google Patents

ヘテロ多量体タンパク質及びその使用法 Download PDF

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Abstract

本出願は、アミノ酸位置３５４で野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を有する第１の抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）含有ポリペプチド、及び／またはアミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電したアミノ酸残基との置換を含む第２のＣＨ３含有ポリペプチドを含む二重特異性抗体などのヘテロ多量体タンパク質を提供する。ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸及びベクター、医薬組成物、調製方法、及びヘテロ多量体タンパク質を使用する治療方法も提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月２８日に出願された米国特許仮出願第６２／８２５，７２６号の優先権を主張するものであり、その内容全体は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７９２７０２０００２４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２０年３月２４日、サイズ：３２ＫＢ）。
発明の分野
本出願は、二重特異性抗体のようなヘテロ多量体タンパク質、組成物、調製法及び使用法に関する。
ハイブリッドハイブリドーマで２つの異なるＩｇＧ分子を共発現させることにより二重特異性抗体を産生する古典的な方法は、重鎖と軽鎖の最大１０の可能な組み合わせをもたらす。これによって収率が損なわれ、精製の課題が強いられる。これらの課題を克服するために、ヘテロ二量体形成を促進するさまざまな二重特異性抗体フォーマットが開発されている。多くの公知のフォーマットは、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）モジュール、または操作されたリンカーに依存して抗原結合構成要素のアセンブリを所望の構成に強制する同様の構造を採用している。しかし、これらの二重特異性抗体フォーマットの多くは、凝集する傾向、生成の困難さ、短い血清半減期、及び免疫原性の可能性など、天然抗体と比較して不利な特性に悩まされている。
いくつかの二重特異性抗体デザインが、天然の抗体、すなわち、２つの軽鎖と２つの重鎖からなる抗体の形式で開発されている。例えば、重鎖Ｆｃ－Ｆｃの接合部分は、別個の重鎖が共発現されるとき、それらの別個の重鎖からのヘテロ二量体の形成を積極的に促進するために、ノブイントゥホール（ＫＩＨ）残基、ジスルフィド結合を形成するシステイン、または反対の静電荷を有する残基などの相互作用するアミノ酸対で操作され得る。ただし、古典的なＫＩＨ戦略は、依然として、著しいホモ二量体の形成、及び二重特異性抗体の低収量をもたらす。
本明細書において参照される全ての公開物、特許、特許出願、及び公開された特許出願の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、Ｆｃ含有ヘテロ二量体タンパク質、多重特異性抗体及び多重特異性イムノアドヘシンなどのヘテロ多量体タンパク質、それらの調製方法、ならびに使用方法を提供する。
本出願の一態様は、第１の重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチド、を含むヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体）タンパク質を提供し、この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電したアミノ酸との置換を含み、ここで、このアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ、Ｓ３５４Ｆ及びＳ３５４Ｗからなる群より選択される置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインはＳ３５４Ｙを含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、第１のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４の置換のための代償的置換（例えば、Ｙ３４９での置換）を含まない。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＱ３４７Ｄからなる群より選択される置換を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインはＱ３４７Ｅを含む。
上記のヘテロ多量体タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、ノブイントゥホール（ＫＩＨ）残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、ノブイントゥホール残基は、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７Ｔである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＳ３５４Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ｔ及びＱ３４７Ｅを含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ｔ及びＳ３５４Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＱ３４７Ｅを含む。
上記のヘテロ多量体タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは抗体重鎖であり、及び／または第２のポリペプチドは抗体重鎖である。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、１つ以上の抗体軽鎖を含む。
上記のヘテロ多量体タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体である。
上記のヘテロ多量体タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、以下を含む。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１の重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、第２のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の軽鎖：第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）、及び第２のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とは会合して第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１の標的及び第２の標的は同じエピトープである。いくつかの実施形態では、第１の標的及び第２の標的は、同じ抗原の異なるエピトープである。いくつかの実施形態では、第１の標的及び第２の標的は異なる抗原である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は腫瘍抗原と特異的に結合し、第２の抗原結合部位はＣＤ３と特異的に結合するか、または第１の抗原結合部位はＣＤ３と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は腫瘍抗原と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、ＣＤ２０と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＣＤ３と特異的に結合するか、または第１の抗原結合部位は、ＣＤ３と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＣＤ２０と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、ＨＥＲ２と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＣＤ３に特異的と結合するか、または第１の抗原結合部位は、ＣＤ３と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＨＥＲ２と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、以下を含む。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ３）、第３のＣＨ１、ＶＨ１、第１のＣＨ１、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の軽鎖：第３の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）、第３のＣＬ、ＶＬ１、及び第１のＣＬ。ここで、ＶＨ３とＶＬ３とは会合して、第３の標的に特異的に結合する第３の抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位及び第３の抗原結合部位は、同じ抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位及び第３の抗原結合部位は、ＨＥＲ２に特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＣＤ３に特異的に結合する。
上記のヘテロ多量体タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、以下を含む。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨ、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第２のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、第１のＶＨＨは第２の標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位はＣＤ３に特異的に結合し、第１のＶＨＨは腫瘍抗原に特異的に結合するか、または第１の抗原結合部位は腫瘍抗原に特異的に結合し、第１のＶＨＨはＣＤ３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＶＨＨは、ＢＣＭＡに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、第２のＶＨＨ、第１のＶＨＨ、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメインを含み、ここでこの第２のＶＨＨは第３の標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＶＨＨ及び第２のＶＨＨは、同じ抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＶＨＨ及び第２のＶＨＨは、ＢＣＭＡに特異的に結合する。
上記のヘテロ多量体タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、イムノアドヘシンまたは抗体－イムノアドヘシンキメラである。
本出願の別の態様は、抗体ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを提供し、ここで、このＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４での野生型ＣＨ３ドメインに対して、かさ高い疎水性アミノ酸との置換、及び／またはアミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して、負に荷電したアミノ酸との置換を含み、ここでこのポリペプチドは、野生型ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドと比較してホモ二量体を形成する能力が低下している。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ、Ｓ３５４Ｆ及びＳ３５４Ｗからなる群より選択される置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインはＳ３５４Ｙを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＱ３４７Ｄからなる群より選択される置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６ＹまたはＳ４０７Ｔなどのノブイントゥホール残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体重鎖を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号１～４のいずれか１つのＣＨ３ドメインを含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態では、上記のポリペプチドのいずれか１つによるポリペプチドを含む抗体（例えば、二重特異性抗体）が提供される。
本出願の別の態様は、第１の標的及び第２の標的に特異的に結合するヘテロ多量体タンパク質を生成する方法を提供し、この方法は、（ａ）第１の標的に特異的に結合する第１の結合ドメイン及び第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチドを提供すること、及び（ｂ）第２の標的に特異的に結合する第２の結合ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを提供すること、を含み、ここで、（ｉ）第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対して、かさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電したアミノ酸との置換を含むか、または（ｉｉ）第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して、負に荷電したアミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインのアミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、他方のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、その他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインのアミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、他方のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、その他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１または第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ、Ｓ３５４Ｆ及びＳ３５４Ｗからなる群より選択される置換を含む。いくつかの実施形態では、第１または第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙを含む。いくつかの実施形態では、第１または第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＱ３４７Ｄからなる群より選択される置換を含む。いくつかの実施形態では、第１または第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅを含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＳ３５４Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ｔ及びＱ３４７Ｅを含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ｔ及びＳ３５４Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＱ３４７Ｅを含む。
いくつかの実施形態では、上記の方法のいずれか１つを使用して調製されたヘテロ多量体タンパク質が提供される。
本出願の一態様は、上記のヘテロ多量体タンパク質のいずれか１つによるヘテロ多量体タンパク質または上記のポリペプチドのいずれか１つによるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を提供する。いくつかの実施形態では、上記の核酸のいずれか１つによる１つ以上の核酸を含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、上記の核酸のいずれか１つによる１つ以上の核酸、または上記のベクターのいずれか１つによるベクターを含む宿主細胞が提供される。
本出願の一態様は、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体またはヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体）タンパク質を調製するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１つ以上の核酸またはベクターの発現を可能にする条件下で、上記の宿主細胞のいずれか１つによって宿主細胞を培養すること、及び（ｂ）宿主細胞培養物から多重特異性抗体またはヘテロ多量体タンパク質を回収すること、を含む。
本出願の別の態様は、上記のヘテロ多量体タンパク質のいずれか１つによるヘテロ多量体タンパク質または上記の抗体のいずれか１つによる抗体、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、上記の医薬組成物のいずれか１つに従った有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む方法が提供される。
上記のヘテロ多量体タンパク質（例えば、二重特異性抗体）のいずれか１つを含むか、または上記の方法のいずれか１つに有用なキット及び製造品も提供される。
２つの二重特異性抗体構築物の概略構造を示している。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体構築物の第１の重鎖は、第２の重鎖の天然残基（例えば、Ｋ３６０）とイオン結合を形成する、Ｑ３４７Ｅなどの操作された残基を有し、第２の重鎖は、第１の重鎖の天然の残基（例えば、Ｙ３４９）と疎水性相互作用を形成するＳ３５４Ｙなどの操作された残基を有する。左側の構築物（Ｓ１）には共通の軽鎖があり、右側の構築物（Ｓ２）には２つの異なる軽鎖がある。本明細書に記載の操作されたイオン結合及び疎水性相互作用は、ヘテロ二量体形成を促進するために、従来のノブイントゥホール（ＫＩＨ）変異と組み合わせられ得る。 抗体中の２つの重鎖のＣＨ３－ＣＨ３接合部分の結晶構造の部分図を示している。第１の重鎖のＳ３５４（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けによる図のＳ３７５）は、第２の重鎖の残基といかなる接触も形成しない。 第１の重鎖にＳ３５４Ｙ変異（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けによる図のＹ３７５）を有するヘテロ二量体ＦｃのＣＨ３－ＣＨ３接合部分のモデル化された結晶構造の部分図を示す。Ｓ３５４Ｙは、第２の重鎖のＹ３４９（すなわち、Ｋａｂａｔの番号付けによる図ではＹ３７０）と疎水性相互作用を形成する。 第１の重鎖にＱ３４７Ｅ変異（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けによる図のＥ３６８）を有するヘテロ二量体ＦｃのＣＨ３－ＣＨ３接合部分のモデル化された結晶構造の部分図を示す。Ｑ３４７Ｅは、第２の重鎖のＫ３６０（すなわち、Ｋａｂａｔの番号付けによる図ではＫ３８３）とイオン結合を形成する。Ｑ３４７は、Ｋ３６０と非常に弱い水素結合を形成する場合と形成しない場合がある。 ＣＤ２０／ＣＤ３二重特異性抗体の産生及び品質管理のための概略ワークフローを示している。 ＭｏｎｏＱ精製後のＭｏｎｏＱカラムでのＣＤ２０／ＣＤ３抗体のクロマトグラムを示している。Ｖ２は、ＫＩＨ（すなわち、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７Ｔ）残基を有する共通の軽鎖二重特異性抗体である。Ｖ４ｂは、Ｖ２と同じＫＩＨ残基に加えて、２つの重鎖にそれぞれＱ３４７Ｅ及びＳ３５４Ｙ変異を有する共通の軽鎖二重特異性抗体である。 プロテインＡ精製後のＭｏｎｏＱカラム上のＣＤ２０／ＣＤ３ Ｖ４ｂ二重特異性抗体のクロマトグラムを示している。 ＭｏｎｏＱ精製画分のＳＤＳゲル及びタンパク質濃度を示している。 ＭｏｎｏＱ精製画分のＴ細胞活性化アッセイの結果を示している。 精製されたＣＤ２０／ＣＤ３ Ｖ４ｂ二重特異性抗体の還元条件下でのキャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）の結果を示す。 精製されたＣＤ２０／ＣＤ３ Ｖ４ｂ二重特異性抗体についての非還元条件下でのＣＥ－ＳＤＳの結果を示す。 精製されたＣＤ２０／ＣＤ３ Ｖ４ｂ二重特異性抗体についての示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）及び静的光散乱（ＳＬＳ）の結果を示す。 プロテインＡ精製後のＭｏｎｏＱカラム上のＣＤ２０／ＣＤ３ Ｖ４ｂ二重特異性抗体の４つのバッチのクロマトグラムを示している。 様々な種からのＩｇＧ定常領域配列の配列アラインメントを示す：ヒトＩｇＧ１（配列番号５）、ヒトＩｇＧ２（配列番号６）、ヒトＩｇＧ３（配列番号７）、ヒトＩｇＧ４（配列番号８）、マウスＩｇＧ１（配列番号９）、マウスＩｇＧ２ａ（配列番号１０）、マウスＩｇＧ３（配列番号１１）、ラットＩｇＧ１（配列番号１２）、ラットＩｇＧ２ａ（配列番号１３）、ウサギＩｇＧ（配列番号１４）、ウシＩｇＧ１（配列番号１５）、ウシＩｇＧ２（配列番号１６）、ネコＩｇＧ（配列番号１７）、及びイヌＩｇＧ（配列番号１８）。アミノ酸残基３４７、３４９、３５４、及び３６０は、複数の種にわたって、ＩｇＧ分子でよく保存されている。 １つの抗Ｈｅｒ２ Ｆａｂ、１つの抗ＣＤ３ Ｆａｂ、及び１つのＦｃドメインを含むＨｅｒ２－Ｂ３／ＣＤ３二重特異性抗体の概略図を示す。 陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によるＨｅｒ２－Ｂ３／ＣＤ３二重特異性抗体の精製を示している。保持時間がｘ軸に分単位で示され、相対的なタンパク質存在量が、ｙ軸にミリ吸光度単位（ｍＡＵ）で示される。個々のピーク画分にラベルが付けられている（すなわち、Ａ１～Ａ１５及びＢ１５～Ｂ６）。 図９に示されるような、ＣＥＸによって精製されたＨｅｒ２－Ｂ３／ＣＤ３二重特異性抗体の画分のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を示す。レーン１～８は、Ａ１～Ａ８とラベル付けされたメインピークの画分を示し、レーン９及び１０は、Ａ１４とＢ７とラベル付けされた小さなピークの第２と第３の画分を示し、レーン１１は、プロテインＡ精製後のＨｅｒ２－Ｂ３／ＣＤ３二重特異性抗体を示す。レーンＭはタンパク質マーカーのラダーを示し、タンパク質マーカーのキロダルトン（ＫＤ）単位の質量が右側に示されている。 ２つの抗Ｈｅｒ２ Ｆａｂ、１つの抗ＣＤ３ Ｆａｂ、及び１つのＦｃドメインを含む、Ｈｅｒ２－Ｂ３－Ｖ３／ＣＤ３二重特異性抗体の概略図を示す。 Ｈｅｒ２－Ｂ３－Ｖ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＣＥＸ精製を示している。試料はプロテインＡカラムで事前に精製した。保持時間がｘ軸に分単位で示され、相対的なタンパク質存在量が、ｙ軸にミリ吸光度単位（ｍＡＵ）で示される。個々のピークフラクションにラベルが付けられている。 ＣＥＸ精製後のＨｅｒ２－Ｂ３－Ｖ３／ＣＤ３二重特異性抗体の画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。レーン１は、上清で発現したＨｅｒ２－Ｂ３－Ｖ３／ＣＤ３を示している。レーン２～６は、還元されていない精製画分Ａ３～Ａ７（図１２を参照）を示している。レーン７～１１は、還元された精製画分Ａ３～Ａ７（図１２を参照）を示している。レーンＭは、タンパク質マーカーのラダーを示し、これらのタンパク質マーカーのキロダルトン（ＫＤ）単位の質量を左側に示している。アセンブルされたＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体（「Ｈｅｒ２／ＣＤ３ＢｓＡｂ」）の位置、及び個々の構成要素（すなわち、２つのＦａｂ「Ｈｅｒ２（２Ｆａｂ）ＨＣ」を有する抗Ｈｅｒ２重鎖、抗ＣＤ３重鎖「ＣＤ３ ＨＣ」、及び軽鎖「共通ＬＣ」）が右側に示されている。 ＢＣＭＡ－Ｆｃ／ＣＤ３二重特異性抗体の概略図を示す。左側はＢＣＭＡ－３Ｅ５／ＣＤ３であり、これは１つのＢＣＭＡ－３Ｅ５ ＶＨＨドメイン、１つのＣＤ３ Ｆａｂ、及び１つのＦｃドメインで構成されている。右側はＢＣＭＡ－３Ｅ１Ｂ２／ＣＤ３であり、これは２つのＢＣＭＡ ＶＨＨドメイン（３Ｅ１及び３Ｂ２）、１つのＣＤ３Ｆａｂドメイン及び１つのＦｃドメインを含む。 プロテインＡで精製されたＢＣＭＡ－３Ｅ１Ｂ２／ＣＤ３及びＢＣＭＡ－３Ｅ５／ＣＤ３のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。レーン１は、ＢＣＭＡ－３Ｅ１Ｂ２／ＣＤ３（非還元）を示し、レーン２は、ＢＣＭＡ－３Ｅ５／ＣＤ３（非還元）を示し、レーン３は、ＢＣＭＡ－３Ｅ１Ｂ２／ＣＤ３（還元）を示し、レーン４は、ＢＣＭＡ－３Ｅ５／ＣＤ３（還元）を示している。レーンＭは、タンパク質マーカーのラダーを示し、これらのタンパク質マーカーのキロダルトン（ＫＤ）単位の質量を左側に示している。ＢＣＭＡ－Ｆｃ／ＣＤ３二重特異性抗体の構成要素の位置は右側に示している。 Ｆｃ領域に操作されたイオン結合及び疎水性相互作用を有する、多重特異性抗体構築物の概略構造を示している。二重特異性抗体フォーマットが上段に示され、三重特異性及び四特異性抗体フォーマットが下段に示されている。示されているように、楕円形の構造はラマＶＨＨライブラリーから取得される。
（発明の詳細な説明）
本出願は、ノブイントゥホール（ＫＩＨ）残基と組み合わせてヘテロダイマー形成を促進し得る、新規の操作されたイオン結合及び／または疎水性相互作用を有する抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）ドメインを含むヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体）タンパク質を提供する。ヘテロ多量体タンパク質を調製及び使用する方法がさらに提供される。本明細書に記載の調製方法は、２つの異なるＣＨ３含有ポリペプチドが共発現される場合に、ヘテロ二量体形成を増強し、ホモダイマー形成を妨げるのに有用である。本明細書に記載のＣＨ３ベースのヘテロ多量体タンパク質戦略は、二重特異性抗体及び二重特異性イムノアドヘシンなどの全てのＦｃ含有ヘテロ多量体タンパク質に適用可能である。
従って、本出願の一態様は、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質を提供し、この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換（例えば、Ｓ３５４Ｙ）を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電したアミノ酸との置換（例えば、Ｑ３４７Ｅ）を含み、ここでアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。
組成物（医薬組成物など）、調製方法、治療方法、キット及び製造品も提供される。
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「ヘテロ多量体」または「ヘテロ多量体タンパク質」は、少なくとも第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む分子であり、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列が第１のポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸残基だけ異なる。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体は、少なくとも２つの異なるリガンドまたは結合部位に対して結合特異性を有する。ヘテロ多量体は、第１及び第２のポリペプチドによって形成される「ヘテロ二量体」を含んでもよいし、または第１及び第２のポリペプチドに加えてポリペプチドが存在する高次の三次構造を形成してもよい。
本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」は、目的の分子（例えば、抗原、リガンド、受容体、基質または阻害剤）への特異的結合に関与するポリペプチドの任意の領域を含む。例示的な結合ドメインには、抗体可変ドメイン、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、及び酵素ドメインが含まれる。
本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、または「に特異的」であるという用語は、生体分子を含む異種分子集団の存在下で標的の存在を決定する、標的と抗体との間の結合などの測定可能及び再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（これはエピトープであり得る）を特異的に認識する抗体とは、他の標的への結合よりも高い親和性で、結合力で、より容易に、及び／またはより長い持続時間この標的と結合する抗体である。いくつかの実施形態では、抗原を特異的に認識する抗体は、他の標的に対する結合親和性の少なくとも約１０倍である結合親和性で、抗原の１つ以上の抗原決定基と反応する。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、全長抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。「抗体」という用語には、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する、全長４本鎖抗体または全長重鎖のみ抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び一本鎖分子）、ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）が含まれる。本明細書において企図される抗体としては、重鎖のみの抗体等の単一ドメイン抗体が挙げられる。
全長４本鎖抗体は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、抗原結合に関与している。両方の鎖の可変領域は、一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度に可変なループを含む（ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ）を含む。本明細書に開示される抗体及び抗原結合フラグメントのＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの方法によって定義または識別され得る（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ １９９７；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８５；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８９；Ｋａｂａｔ １９８７；Ｋａｂａｔ １９９１）。重鎖または軽鎖の３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる隣接ストレッチの間に挿入され、このＦＲはＣＤＲよりも高度に保存されており、超可変ループをサポートする足場を形成する。重鎖と軽鎖の定常領域は抗原結合に関与していないが、さまざまなエフェクター機能を示す。抗体は、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り当てられる。抗体の５つの主要なクラスまたはアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、それぞれα、δ、ε、γ、及びμ重鎖の存在を特徴としている。主要な抗体クラスのいくつかは、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）、またはＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分類される。
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と称され得る。これらのドメインは、通常、（同じクラスの他の抗体と比較して）抗体の最も可変的な部分であり、抗原結合部位を含む。ラクダ科種からの重鎖のみ抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、これは、「ＶＨＨ」と称される。このため、ＶＨＨは、ＶＨの特殊なタイプである。
「重鎖のみ抗体」または「ＨＣＡｂ」という用語は、重鎖を含むが、４鎖抗体に通常見出される軽鎖を欠いている、機能的抗体を指す。ラクダ科動物（ラクダ、ラマ、またはアルパカ等）は、ＨＣＡｂを産生することが知られている。
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という用語は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、単一の抗原結合ポリペプチドを指す。ｓｄＡｂは、単独で、対応するＣＤＲ含有ポリペプチドと対合せずに、抗原に結合することができる。場合によっては、単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物のＨＣＡｂから操作され、それらの重鎖可変ドメインは、本明細書では「ＶＨＨ」（重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン）と呼ばれる。ラクダ科ｓｄＡｂは、最小の公知の抗原結合抗体フラグメントのうちの１つである（例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－８（１９９３）、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７４：１６８－７３（１９９５）、Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ－Ｇｈａｓｓａｂｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ），８：１０１３－２６（２０１３）を参照のこと）。基本的なＶＨＨは、Ｎ末端からＣ末端まで、以下の構造、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を有し、ここでは、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、相補性決定領域１～３を指す。
本明細書で使用される「抗原結合フラグメント」という用語は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖダイマー（二価ダイアボディ）、単一ドメイン抗体（ＶＨＨなど）、及び１つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部、または抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含む抗体フラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、親抗体または親抗体フラグメント（例えば、親ｓｃＦｖ）が結合するのと同じ抗原に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、１つ以上の異なるヒト抗体からのフレームワーク領域に移植された特定のヒト抗体由来の１つ以上のＣＤＲを含み得る。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、及び残りの「Ｆｃ」フラグメント（容易に結晶化する能力を反映する表記）が作成された。Ｆａｂ断片は、Ｌ鎖全体に加えて、Ｈ鎖の可変ドメイン（ＶＨ）、及び１本の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関しては一価であり、すなわち、それは単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、単一の大きいＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られ、これは、異なる抗原結合活性を有する２つのＦａｂフラグメントがジスルフィド結合したものにほぼ相当し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体のヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む幾つかの追加の残基を有する点でＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を保有するＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生されたものであった。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングも公知である。
「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含有する可変ドメインである免疫グロブリンの他の部分と比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（集合的に、ＣＨ）、ならびに軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含む。
任意の哺乳類種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明らかに異なるタイプのうちの１つに割り当てられ得る。
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは、１つの重鎖可変領域ドメイン及び１つの軽鎖可変領域ドメインが緊密に非共有結合的に会合した二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みにより、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、抗体に抗原結合特異性を付与する、６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識してそれと結合する能力を有する。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「一本鎖Ｆｖ」は、ＶＨ及びＶＬ抗体ドメインが連結された単一ポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能となることが好ましい。ｓｃＦｖの概説については、ＰｌｕｃｋｔｈｕｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照のこと。
「ダイアボディ」という用語は、ＶＨとＶＬドメインとの間の短いリンカー（約５～１０）残基）により、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間の対形成が達成され、これにより、二価のフラグメント、すなわち、２つの抗原結合部位を有するフラグメントが得られるように、ｓＦｖフラグメント（前の段落を参照のこと）を構築することによって調製される小さな抗体フラグメントを指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する、２つの「交差」ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第ＷＯ９３／１１１６１号、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）に詳細に記載されている。
「特異性」という用語は、抗原の特定のエピトープに対する抗原結合タンパク質の選択的認識を指す。例えば、自然抗体は、単一特異性である。本明細書で使用される「多重特異性」という用語は、抗原結合タンパク質がポリエピトープ特異性を有する（すなわち、２つ、３つ、またはそれ以上の抗原結合部位を有することは、１つの生体分子上の２つ、３つ、もしくはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または ２つ、３つ、もしくはそれ以上の異なる生体分子上のエピトープに特異的に結合することができることを意味する。本明細書中で使用する「二重特異性」とは、抗原結合タンパク質が２つの異なる抗原結合特異性を有することを示す。別途示されない限り、二重特異性抗体によって結合される抗原が列記される順序は無作為である。
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、一方で鎖（複数可）の残りの部分は、本発明の生物学的活性を示す限り、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列、ならびにそのような抗体のフラグメントと同一または相同である抗体を指す。（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１－６８５５（１９８４）を参照）。
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト抗体に由来する配列を最小限含有するキメラ抗体である。ヒト化抗体は、大部分がヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域（ＨＶＲ）由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置き換えられている。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照のこと。
「多重特異性抗体」とは、少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープに対する結合特異性を有する分子である。「多重特異性抗体」とは、２つの異なる抗原またはエピトープに結合する二重特異性抗体（「ＢｓＡｂ」）、及び三重特異性抗体などの２つを超える特異性を有する抗体を包含する。
本明細書で使用される場合、「イムノアドヘシン」という用語は、異種タンパク質の結合ドメイン（「接着」、例えば、受容体、リガンドまたは酵素）を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせる抗体様分子を指す。構造的に、イムノアドヘシンは、抗体の抗原結合部位以外の所望の結合特異性を有するアドヘシンアミノ酸配列、及び免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合を含む。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得られ得る。
本明細書で使用される場合、「多重特異性イムノアドヘシン」という表現は、少なくとも２つの結合特異性を有する（すなわち、２つ以上のアドヘシン結合ドメインを組み合わせる）イムノアドヘシンを指す。多重特異性イムノアドヘシンは、例えば、ＷＯ８９／０２９２２、欧州特許第３１４，３１７号、及び米国特許第号５，１１６，９６４号に開示されているように、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロ四量体としてアセンブルされ得る。いくつかの実施形態では、多重特異性イムノアドヘシンは二重特異性である。
「抗体イムノアドヘシンキメラ」は、抗体の少なくとも１つの結合ドメインを少なくとも１つのイムノアドヘシンと組み合わせる分子を含む。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ１ドメイン」（「Ｈ１」ドメインの「Ｃ１」とも呼ばれる）は、通常、約アミノ酸１１８から約アミノ酸２１５（ＥＵ番号付けシステム）に及ぶ。
「ヒンジ領域」とは、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０への伸長として定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ－Ｓ結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に入れることによってＩｇＧ１配列と整列し得る。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｈ２」ドメインの「Ｃ２」とも呼ばれる）は、通常、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０に及ぶ。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合されないという点で特有である。むしろ、２つのＮ結合分岐状炭水化物鎖がインタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に介在する。炭水化物がドメイン－ドメイン対合の代替を提供し、ＣＨ２ドメインを安定させるのに役立ち得ることが推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５）。
「ＣＨ３ドメイン」（「Ｃ２」または「Ｈ３」ドメインとも呼ばれる）は、Ｆｃ領域の残基Ｃ末端からＣＨ２ドメインまで（すなわち、抗体配列の約アミノ酸残基３４１からＣ末端まで、通常はＩｇＧのアミノ酸残基４４６または４４７）のストレッチを含む。
「ノブイントゥホール」または「ＫＩＨ」という用語は、ＣＨ３ドメイン内の操作されたアミノ酸残基の対を指し、これは、相補的な立体修飾により第２のＣＨ３ドメインのそれぞれの接触面に優先的に結合される第１のＣＨ３ドメインの接触表面の立体的修飾をもたらす。そのような立体的修飾は、主に、異なるアミノ酸残基及び側鎖に起因し、例えば、「ノブイントゥホール」二量体を形成するための相補的である「ノブ」または「ホール」構造を生成する。例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ、Ｊ．Ｂ．、Ｌ．Ｇ．Ｐｒｅｓｔａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）．“‘Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９（７）：６１７－２１、Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｒｉｄｇｗａｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）．“Ｓｔａｂｌｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ．” Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７０（１）：２６－３５、Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，Ｚ．Ｚｈｕ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）．“Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ．” Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６（７）：６７７－８１、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．（２００１）．“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎ．”Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１－２）：７－１５、及び米国特許第５，７３１，１６８号及び同第７，１８３，０７６号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
「単離された」ヘテロ多量体とは、その天然の細胞培養環境の成分から同定されたか、分離されたか、及び／または回収されたヘテロ多量体を意味する。その自然環境の汚染成分は、ヘテロ多量体の診断的または治療的使用を妨げる材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性または非タンパク性溶質を含み得る。本発明のヘテロ多量体は、一般に、実質的に均一になるまで精製される。「実質的に均質」、「実質的に均質な形態」及び「実質的に均質」という表現は、製品が望ましくないポリペプチドの組み合わせ（例えば、ホモ多量体）に由来する副産物を実質的に欠いていることを示すために使用される。純度で表すと、実質的な均一性とは、副生成物の量が約１０％、５％、１％、０．５％以下を超えないことを意味し、パーセンテージは重量によるものである。
本明細書で使用される「単離された核酸」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成起源の核酸、またはそれらのいくつかの組み合わせを意味することを意図し、その起源のために「単離された核酸」は、（１）「単離された核酸」が自然界に見出されるポリヌクレオチドの全部または一部に伴わないか、（２）自然界に連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているか、または（３）より大きな配列の一部として、自然には存在しない。
特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重したバージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という表現はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンでイントロン（複数可）を含み得る程度までイントロンを含んでもよい。
「作動可能に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結であって、異種核酸配列の発現をもたらす連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、同じリーディングフレームにおいて、隣接しており、かつ必要な場合、２つのタンパク質コード領域を繋げるためのものである。
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」とは、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、以下、疾患に起因する１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の弱化、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防または遅延）、疾患の蔓延の予防または遅延、疾患の再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善、疾患の寛解（部分的または全体的）の提供、疾患の治療に必要な１つ以上の他の薬剤の用量の低減、疾患の進行の遅延、生活の質の向上もしくは改善、体重の増加、及び／または生存期間の延長のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法は、治療のこれらの態様のうち任意の１つ以上を企図する。
本明細書に開示される抗体または組成物の「有効量」とは、具体的に述べられた目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、経験的に、そして述べられた目的に関連する既知の方法によって決定され得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」または「薬理学的に適合性がある」とは、生物学的または別様に望ましくないものではない材料を意味し、例えば、その材料は、重大な望ましくない生物学的影響も、それが含まれる組成物の他の成分のいずれかとの有害な仕方での相互作用も引き起こすことなく、患者に投与される医薬組成物に組み込まれ得る。薬学的に許容される担体または賦形剤は、好ましくは、毒物学的及び製造試験の必要な基準を満たしている、ならびに／または米国食品医薬品局によって作成された不活性成分ガイドに含まれている。
本明細書に記載の本発明の実施形態は、「からなる」及び／または「本質的にからなる」実施形態を含むことが理解される。
本明細書において「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変動を含む（かつ記述する）。例えば、「約Ｘ」を言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
本明細書で使用される場合、ある値またはパラメータ「ではない」への言及は、一般に、ある値またはパラメータ「以外」を意味及び記述する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。
ＩＩ．ヘテロ多量体タンパク質
本出願は、第１の抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体タンパク質などのヘテロ多量体タンパク質を提供し、この第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、操作された疎水性相互作用及び静電相互作用を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインはさらに、ノブイントゥホール（「ＫＩＨ」）残基を含む。ヘテロ多量体タンパク質の例示的な構造としては、ヘテロ二量体（例えば、二重特異性イムノアドヘシン）、ヘテロ三量体（例えば、抗体－イムノアドヘシンキメラ）、ヘテロ四量体（例えば、二重特異性抗体）、及びさらなるオリゴマー構造が挙げられる。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、共通の軽鎖抗体または２つの異なる軽鎖を有する抗体などの二重特異性抗体である。例えば、図１を参照されたい。
いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）が提供され、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、第２のＣＨ３ドメインの天然アミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する、操作されたアミノ酸残基を含み、第２のＣＨ３ドメインは、第１のＣＨ３ドメインの天然アミノ酸残基とイオン結合を形成する、操作されたアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）が提供され、この第１のＣＨ３ドメインは、第２のＣＨ３ドメインの第１の天然のアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する第１の操作されたアミノ酸残基、及び第２のＣＨ３ドメインの第２の天然のアミノ酸残基とイオン結合を形成する第２の操作されたアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインはさらに、ＫＩＨ残基を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）を提供し、この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電したアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）を提供し、この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換、及び／またはアミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電したアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸は、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）である。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）である。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインのアミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、他方のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、その他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインのアミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、他方のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、その他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメイン、マウスＣＨ３ドメイン、ラットＣＨ３ドメイン、ラクダＣＨ３ドメイン、またはウサギＣＨ３ドメインである。図７は、様々な種由来のＩｇＧ分子のＦｃ領域の配列の配列アラインメントを示している。
いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）を提供し、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４とかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７の負に荷電したアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）を提供し、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４のかさ高い疎水性アミノ酸との置換、及び／またはＱ３４７の負に荷電したアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、１つのＣＨ３ドメインのアミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、他方のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、その他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインのアミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、他方のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、その他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。
いくつかの実施形態では、第１のヒトＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のヒトＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含む、ヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）を提供し、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅを含み、このアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインはさらに、ＫＩＨ残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。
本明細書に記載のＣＨ３ドメインのアミノ酸位置３５４及び３４７における野生型ＣＨ３ドメインに対する置換は、ノブ－イントゥホール（「ＫＩＨ」）変異を含むヘテロ二量体形成を促進し得る、ＣＨ３ドメインにおける任意の公知の変異及び／または操作された残基と組み合わされてもよい。例えば、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７Ｔを含む、アミノ酸位置３５４及び３４７での置換と互換性のある任意のＫＩＨ残基を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、ＣＨ３ドメインにＫＩＨ残基を含まない。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基、及び／または静電相互作用を形成する操作された残基などの、ヘテロ二量体形成を促進する追加の非ＫＩＨ変異を含む。例えば、米国特許第８，５９２，５６２号を参照のこと。
いくつかの実施形態では、第１のヒトＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のヒトＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含む、ヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）を提供し、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＴ３６６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＹ４０７Ｔを含み、このアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。
いくつかの実施形態では、第１のヒトＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のヒトＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含む、ヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）を提供し、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ４０７Ｔを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含み、このアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。
第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドと会合される任意のポリペプチドである。第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、ＣＨ３－ＣＨ３接合部位を含む接合部分で互いに相互作用する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドのそれぞれは、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメインまたは酵素ドメイン）及び抗体定常ドメイン（またはその一部）例としては、ＣＨ２、ＣＨ１、ヒンジ及びＣＬドメインなどの１つ以上の追加のドメインを含み得る。例示的な第１及び第２のポリペプチドとしては、抗体重鎖ポリペプチド、抗体定常ドメインを異種ポリペプチドの結合ドメインと組み合わせたキメラ（すなわち、イムノアドヘシン、例えば受容体－Ｆｃ融合ポリペプチド、リガンド－Ｆｃ融合ポリペプチド）、及び抗体可変ドメインポリペプチド（例えば、ダイアボディ、二重特異性マキシボディ、または二重特異性ペプチボディ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドはそれぞれ、ヒトＩｇＧなどのＩｇＧのＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドはそれぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域を含む。ＩｇＧ分子の野生型Ｆｃ領域の例示的な配列を図７に示す。例示的な変異体Ｆｃ配列を表１に示す。当業者は、ＩｇＧ分子の様々なドメインに対応する正確なアミノ酸の理解が異なる場合がある。したがって、本明細書に概説されるドメインのＮ末端またはＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸でさえも延長または短縮され得る。また、ＩｇＧのアミノ酸位置を指定するための公知の番号付けスキームが複数あることに注意のこと、これは、本特許出願で使用されているＥＵの番号付けスキームとは異なる場合がある。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ重鎖の定常領域に由来する。
いくつかの実施形態では、配列番号１のＣＨ３ドメイン（例えば、アミノ酸１１６～２１７）を含む第１のポリペプチド、及び配列番号２のＣＨ３ドメイン（例えば、アミノ酸１１６～２１７）を含む第２のポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３のＣＨ３ドメイン（例えば、アミノ酸１１６～２１７）を含む第１のポリペプチド、及び配列番号４のＣＨ３ドメイン（例えば、アミノ酸１１６～２１７）を含む第２のポリペプチドを含む、ヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）が提供される。
Figure 2022525275000002
Figure 2022525275000003
本発明の例示的な実施形態としては、限定するものではないが、抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、単一特異性多価抗体、二重特異性マキシボディ（すなわち、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質）、モノボディ（すなわち、Ｆａｂ－Ｆｃ）、ペプチボディ（すなわち、一価、二価、一特異性、及び二重特異性ペプチボディを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ分子の１つのアームに融合した１つのペプチド）、イムノアドヘシン、抗体－イムノアドヘシンキメラ、受容体－Ｆｃ融合タンパク質、及びリガンド－Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体などの抗体である。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、１つ以上の抗体軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、共通軽鎖抗体、すなわち、２つの同一の軽鎖を含む二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、共通の可変軽鎖抗体、すなわち、同じ軽鎖可変領域を有する２つの軽鎖を含む二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、同一の軽鎖可変領域を有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、同じ親抗体に由来する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、２つの異なる軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、２つの異なる抗体由来の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、ラムダ軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、カッパ軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、ラムダ軽鎖及びカッパ軽鎖を含む。共通の可変軽鎖抗体を含む共通軽鎖抗体は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第８６４２７４５Ｂ２号、及び米国特許出願公開第２０１６／０３１９０３６Ａ１号（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。任意の公知の共通可変軽鎖戦略を、本明細書に記載のＣＨ３ベースのヘテロ二量体化戦略と組み合わせて使用して、多重特異性抗体を提供してもよい。
いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、第１の抗原と結合する第１の抗原結合フラグメント、及び第２の抗原と結合する第２の抗原結合フラグメントを含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体などの抗体である。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、第１の抗原と結合する第１及び第２の抗原結合フラグメント、ならびに第２の抗原と結合する第３の抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、腫瘍抗原と結合する第１及び第２の抗原結合フラグメント、ならびに第２の抗原（ＣＤ３など）と結合する第３の抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、腫瘍抗原に対して比較的低い親和性を有する腫瘍抗原結合領域を含み、その結果、それは、腫瘍抗原の密度がより低い健康な細胞に対してはるかに弱く結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメント、第２の抗原結合フラグメント、及び／または第３の抗原結合フラグメントは、Ｆａｂである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメント、第２の抗原結合フラグメント、及び／または第３の抗原結合フラグメントは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメント、第２の抗原結合フラグメント、及び／または第３の抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、２つのＦａｂドメインを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、３つのＦａｂドメインを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、２つのＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、３つのＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、１つのＦａｂドメイン及び１つのＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、２つのＦａｂドメイン及び１つのＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、１つのＦａｂドメイン及び２つのＶＨＨドメインを含む。本明細書に記載の多重特異性抗体の例示的な構造を図１６に示す。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１の重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、第２のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の軽鎖：第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）、及び第２のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とは会合して第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメイン、マウスＣＨ３ドメイン、ラットＣＨ３ドメイン、ラクダＣＨ３ドメイン、またはウサギＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、異なるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：ＶＨ１ドメイン、第１のＣＨ１ドメイン、第１のＣＨ２ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の軽鎖：ＶＬ１ドメイン、及び第１のＣＬドメイン、（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：ＶＨ２ドメイン、第２のＣＨ１ドメイン、第２のＣＨ２ドメイン、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の軽鎖：ＶＬ２ドメイン、及び第２のＣＬドメイン。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とは会合して第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、かさ高い疎水性アミノ酸によるＳ３５４の置換を含む、及び／またはこの第２のＣＨ３ドメインは、負に荷電したアミノ酸によるＱ３４７の置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、異なるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：ＶＨ１ドメイン、第１のＣＨ１ドメイン、第１のＣＨ２ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の軽鎖：ＶＬ１ドメイン、及び第１のＣＬドメイン、（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：ＶＨ２ドメイン、第２のＣＨ１ドメイン、第２のＣＨ２ドメイン、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の軽鎖：ＶＬ２ドメイン、及び第２のＣＬドメイン。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とは会合して第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｔ及びＴ３６６Ｙを含み、ならびにこの第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＹ４０７Ｔを含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位はＣＤ３と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は腫瘍抗原に特異的と結合するか、または第１の抗原結合部位はＣＤ３と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は腫瘍抗原と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、ＣＤ２０と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＣＤ３に特異的と結合するか、または第１の抗原結合部位は、ＣＤ３と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＣＤ２０と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、ＨＥＲ２と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＣＤ３と特異的に結合するか、または第１の抗原結合部位は、ＣＤ３と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＨＥＲ２と特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：ＶＨ１ドメイン、第１のＣＨ１ドメイン、第１のＣＨ２ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の軽鎖：ＶＬ１ドメイン、及び第１のＣＬドメイン、（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：ＶＨ２ドメイン、第２のＣＨ１ドメイン、第２のＣＨ２ドメイン、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の軽鎖：ＶＬ２ドメイン、及び第２のＣＬドメイン。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とは会合して第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｔ及びＹ４０７Ｔを含み、ならびにこの第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位はＣＤ３と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は腫瘍抗原と特異的に結合するか、または第１の抗原結合部位はＣＤ３と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は腫瘍抗原と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、ＣＤ２０と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＣＤ３と特異的に結合するか、または第１の抗原結合部位は、ＣＤ３と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＣＤ２０と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、ＨＥＲ２と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＣＤ３と特異的に結合するか、または第１の抗原結合部位は、ＣＤ３と特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＨＥＲ２と特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨ１ドメイン（ＶＨＨ１）、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び第１のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここで、ＶＨＨ１は第１の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ２は、第２の標的に特異的に結合し、ここでこの第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４で野性型ＣＨ３ドメインに対してかさ高いアミノ酸残基との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７で野性型ＣＨ３ドメインに対して、負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメイン、マウスＣＨ３ドメイン、ラットＣＨ３ドメイン、ラクダＣＨ３ドメイン、またはウサギＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び第１のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここで、ＶＨＨ１は第１の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ２は、第２の標的に特異的に結合し、ここでこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４のかさ高いアミノ酸残基との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７の負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び第１のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここで、ＶＨＨ１は第１の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ２は、第２の標的に特異的に結合し、ここでこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＴ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７及びＹ４０７Ｔを含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び第１のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここで、ＶＨＨ１は第１の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ２は、第２の標的に特異的に結合し、ここでこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ４０７Ｔを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：ＶＨＨドメイン、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨＨドメインは第２の標的に特異的に結合し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電されたアミノ酸との置換を含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電されたアミノ酸との置換を含むか、またはこの第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸の置換を含む、及び／またはこの第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメイン、マウスＣＨ３ドメイン、ラットＣＨ３ドメイン、ラクダＣＨ３ドメイン、またはウサギＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：ＶＨＨドメイン、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨＨドメインは第２の標的に特異的に結合し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４のかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７の負に荷電されたアミノ酸との置換を含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４のかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／またはこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７の負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：ＶＨＨドメイン、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨＨドメインは第２の標的に特異的に結合し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＴ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＹ４０７Ｔを含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＴ３６６Ｙを含み、第１のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＹ４０７Ｔを含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＨＨは腫瘍抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的に結合し、第１の抗原結合部位はＣＤ３に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：ＶＨＨドメイン、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨＨドメインは第２の標的に特異的に結合し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ４０７Ｔを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ４０７Ｔを含み、第１のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＨＨは腫瘍抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的に結合し、第１の抗原結合部位はＣＤ３に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、第２のＣＨ１、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、第１のＣＬ、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）、及び第２のＣＬ、（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ３）、第３のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の軽鎖：第３の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ３）、及び第３のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とは会合して第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３とは会合して第３の標的に特異的に結合する第３の抗原結合部位を形成し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電されたアミノ酸の置換を含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／またはこの第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電されたアミノ酸の置換を含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメイン、マウスＣＨ３ドメイン、ラットＣＨ３ドメイン、ラクダＣＨ３ドメイン、またはウサギＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＬ１、ＶＬ２及び／またはＶＬ３は、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ１、ＶＬ２及びＶＬ３は、異なるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、第２のＣＨ１、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、第１のＣＬ、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）、及び第２のＣＬ、（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ３）、第３のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の軽鎖：第３の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ３）、及び第３のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とは会合して第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３とは会合して第３の標的に特異的に結合する第３の抗原結合部位を形成し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４のかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７の負に荷電されたアミノ酸との置換を含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４のかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／またはこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７の負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＬ１、ＶＬ２及び／またはＶＬ３は、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ１、ＶＬ２及びＶＬ３は、異なるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、第２のＣＨ１、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、第１のＣＬ、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）、及び第２のＣＬ、（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ３）、第３のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の軽鎖：第３の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ３）、及び第３のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とは会合して第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３とは会合して第３の標的に特異的に結合する第３の抗原結合部位を形成し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＴ３６６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＹ４０７Ｔを含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＴ３６６Ｙを含み、ならびにこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＹ４０７Ｔを含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＬ１、ＶＬ２及び／またはＶＬ３は、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ１、ＶＬ２及びＶＬ３は、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位及び第２の抗原結合部位は、腫瘍抗原（例えば、ＨＥＲ２）と特異的に結合し、第３の抗原結合部位は、ＣＤ３と特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、第２のＣＨ１、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、第１のＣＬ、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）、及び第２のＣＬ、（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ３）、第３のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の軽鎖：第３の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ３）、及び第３のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とは会合して第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３とは会合して第３の標的に特異的に結合する第３の抗原結合部位を形成し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ４０７Ｔを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ４０７Ｔを含み、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＬ１、ＶＬ２及び／またはＶＬ３は、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ１、ＶＬ２及びＶＬ３は、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位及び第２の抗原結合部位は、腫瘍抗原（例えば、ＨＥＲ２）と特異的に結合し、第３の抗原結合部位は、ＣＤ３と特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第３のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ３）、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここでＶＨＨ１は、第１の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ２は第２の標的に特異的に結合しＶＨＨ３は、第３の標的に特異的に結合し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電されたアミノ酸の置換を含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／またはこの第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメイン、マウスＣＨ３ドメイン、ラットＣＨ３ドメイン、ラクダＣＨ３ドメイン、またはウサギＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第３のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ３）、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここでＶＨＨ１は、第１の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ２は第２の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ３は、第３の標的に特異的に結合し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４のかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７の負に荷電されたアミノ酸との置換を含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４のかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／またはこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７の負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第３のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ３）、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここで、ＶＨＨ１は第１の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ２は、第２の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ３は第３の標的に特異的に結合し、ここでこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＴ３６６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＹ４０７Ｔを含むか、またはこの第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＴ３６６Ｙを含み、ならびに第１のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＹ４０７Ｔを含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第３のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ３）、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここで、ＶＨＨ１は第１の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ２は、第２の標的に特異的に結合し；ＶＨＨ３は第３の標的に特異的に結合し、ここでこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ４０７Ｔを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含むか、またはこの第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ４０７Ｔを含み、第１のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨＨ１は第２の標的に特異的に結合し、及びＶＨＨ２は第３の標的に特異的に結合し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電されたアミノ酸の置換を含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／またはこの第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメイン、マウスＣＨ３ドメイン、ラットＣＨ３ドメイン、ラクダＣＨ３ドメイン、またはウサギＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、この多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第１のＣＨ２及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨＨ１は、第２の標的に特異的に結合し、及びＶＨＨ２は第３の標的に特異的に結合し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４のかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７の負に荷電されたアミノ酸との置換を含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４のかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／またはこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７の負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨＨ１は、第２の標的に特異的に結合し、及びＶＨＨ２は第３の標的に特異的に結合し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ３６６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＹ４０７Ｔを含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＴ３６６Ｙを含み、第１のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＹ４０７Ｔを含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、この多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＨＨ１及びＶＨＨ２は、腫瘍抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的に結合し、第１の抗原結合部位は、ＣＤ３に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨＨ１は、第２の標的に特異的に結合し、及びＶＨＨ２は第３の標的に特異的に結合し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ４０７Ｔを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含むか、またはここで、この第２のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ４０７Ｔを含み、第１のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＨＨ１及びＶＨＨ２は、腫瘍抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的に結合し、第１の抗原結合部位は、ＣＤ３に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性または四重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第３のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ３）、第４のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ４）、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここで、ＶＨＨ１は第１の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ２は、第２の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ３は第３の標的に特異的に結合し、及びＶＨＨ４は第４の標的に特異的に結合し、ここでこの第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４で野性型ＣＨ３ドメインに対してかさ高いアミノ酸残基との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７で野性型ＣＨ３ドメインに対して、負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメイン、マウスＣＨ３ドメイン、ラットＣＨ３ドメイン、ラクダＣＨ３ドメイン、またはウサギＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性または四重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第３のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ３）、第４のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ４）、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここで、ＶＨＨ１は第１の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ２は、第２の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ３は第３の標的に特異的に結合し、及びＶＨＨ４は第４の標的に特異的に結合し、ここでこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４のかさ高いアミノ酸残基との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７の負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性または四重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第３のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ３）、第４のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ４）、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここで、ＶＨＨ１は第１の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ２は、第２の標的に特異的に結合し；ＶＨＨ３は第３の標的に特異的に結合し、及びＶＨＨ４は第４の標的に特異的に結合し、ここでこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＴ３６６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＹ４０７Ｔを含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、この多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性または四重特異性）抗体が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１）、第２のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ２）、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：第３のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ３）、第４のＶＨＨドメイン（ＶＨＨ４）、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここで、ＶＨＨ１は第１の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ２は、第２の標的に特異的に結合し、ＶＨＨ３は第３の標的に特異的に結合し、及びＶＨＨ４は第４の標的に特異的に結合し、ここでこの第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ４０７Ｔを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
本明細書に記載の第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインのいずれか１つを含む多重特異性抗体も提供される。いくつかの実施形態では、本出願は、腫瘍抗原に特異的に結合する第１の抗原結合フラグメント、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合フラグメント、及び本明細書に記載の変異Ｆｃ領域のいずれか１つを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージヤー（ＢｉＴＥ）分子を提供する。いくつかの実施形態では、本出願は、腫瘍抗原に特異的に結合する第１の抗原結合フラグメント及び第２の抗原結合フラグメント、ＣＤ３に特異的に結合する第３の抗原結合フラグメント、及び本明細書に記載の変異体Ｆｃ領域のいずれか１つを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子を提供する。いくつかの実施形態では、本出願は、ＣＤ２０及びＣＤ３に特異的に結合する多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本出願は、ＨＥＲ２及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本出願は、ＣＤ３及びＢＣＭＡに特異的に結合する多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体を提供する。例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４４７７８または国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５３１１に記載されている抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ３抗原結合フラグメントを含めて、任意の適切な抗原結合フラグメントを、本明細書に記載の多重特異性抗体に使用してもよい。
いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、ヘテロ多量体イムノアドヘシンである。イムノアドヘシンは抗体様分子であり、細胞表面受容体などのタンパク質の結合ドメイン、またはリガンド（「アドヘシン」）を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせる。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の貴重な化学的及び生物学的特性の多くを保有し得る。イムノアドヘシンは、適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結された所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築され得るので、目的の結合特異性が、全てがヒトの構成要素を使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、二重特異性イムノアドヘシンなどの多重特異性イムノアドヘシンであり、すなわち、このイムノアドヘシンの２つのアームは、異なる特異性を有する。
いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、抗体イムノアドヘシンキメラである。これらの分子は、イムノアドヘシンの結合領域と抗体の結合ドメインを組み合わせたものである。例示的な抗体－イムノアドヘシンキメラは、例えば、Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：４７２３－４７２７（１９９１）及びＣｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４２６８（１９９４）に記載されている。
いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、または酵素ドメインなどの、抗体フラグメントではない１つ以上の結合ドメインを含むイムノアドヘシンまたは抗体イムノアドヘシンキメラである。本明細書で使用される「リガンド結合ドメイン」という用語は、少なくとも定性的なリガンド結合能力、及び好ましくは対応する天然受容体の生物学的活性を保持する、任意の天然細胞表面受容体またはその任意の領域もしくは誘導体を指す。いくつかの実施形態では、受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーに相同である細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチドに由来する。他の典型的な受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーではないが、それでもこの定義に具体的に包含されており、サイトカインの受容体、チロシンキナーゼ活性を有する受容体（受容体チロシンキナーゼ）、ヘマトポエチン及び神経成長因子受容体スーパーファミリーのメンバー、ならびに細胞接着分子、例えば、（Ｅ－、Ｌ－及びＰ－）セレクチンである。
「受容体結合ドメイン」という用語は、細胞接着分子を含む受容体の任意の天然リガンド、または少なくとも定性的な受容体結合能力、及び好ましくは対応する天然のリガンドの生物学的活性を保持するそのような天然リガンドの任意の領域もしくは誘導体を指す。この定義は、とりわけ、上記の受容体のリガンドからの結合配列を具体的に含む。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）イムノアドヘシンが提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１のポリペプチド：第１の標的に特異的と結合する第１の結合ドメイン、第１のＣＨ２ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２のポリペプチド：第２の標的に特異的と結合する第２の結合ドメイン、第２のＣＨ２ドメイン、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４で野性型ＣＨ３ドメインに対してかさ高いアミノ酸残基との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７で野性型ＣＨ３ドメインに対して、負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメイン、マウスＣＨ３ドメイン、ラットＣＨ３ドメイン、ラクダＣＨ３ドメイン、またはウサギＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、受容体結合ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、リガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態では、この第１の結合ドメインは、受容体結合ドメインであり、及び第２の結合ドメインは、リガンド結合ドメインであるか、または第１の結合ドメインは、リガンド結合ドメインであり、及び第２の結合ドメインは、受容体結合ドメインである。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）イムノアドヘシンが提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１のポリペプチド：第１の標的と特異的に結合する第１の結合ドメイン、第１のＣＨ２ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２のポリペプチド：第２の標的と特異的に結合する第２の結合ドメイン、第２のＣＨ２ドメイン、及び第２のＣＨ３ドメイン。ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４のかさ高いアミノ酸残基との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７で、負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、受容体結合ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、リガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態では、この第１の結合ドメインは、受容体結合ドメインであり、及び第２の結合ドメインは、リガンド結合ドメインであるか、または第１の結合ドメインは、リガンド結合ドメインであり、及び第２の結合ドメインは、受容体結合ドメインである。
いくつかの実施形態では、以下を含む多重特異性（例えば、二重特異性）イムノアドヘシンが提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１のポリペプチド：第１の標的と特異的に結合する第１の結合ドメイン、第１のＣＨ２ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２のポリペプチド：第２の標的と特異的に結合する第２の結合ドメイン、第２のＣＨ２ドメイン、及び第２のＣＨ３ドメイン、ここで：（ｉ）第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＴ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＹ４０７Ｔを含むか、または（ｉｉ）第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ及びＹ４０７Ｔを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＴ３６６Ｙを含み、及びここでこのアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｙは、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインのＱ３４７Ｅは、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９の置換、例えば、Ｙ３４９Ｓを含まない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３は、野生型ヒトＣＨ３ドメインに対して他の変異を含まない。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、受容体結合ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、リガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態では、この第１の結合ドメインは、受容体結合ドメインであり、及び第２の結合ドメインは、リガンド結合ドメインであるか、または第１の結合ドメインは、リガンド結合ドメインであり、及び第２の結合ドメインは、受容体結合ドメインである。
本明細書に記載の多重特異性抗体及び多重特異性イムノアドヘシンは、エピトープ、抗原または標的分子の任意の適切な組み合わせに特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、第１の標的、第２の標的、第３の標的、及び第４の標的は同じエピトープである。いくつかの実施形態では、第１の標的、第２の標的、第３の標的、及び／または第４の標的は同じ抗原の異なるエピトープである。いくつかの実施形態では、第１の標的、第２の標的、第３の標的、及び第４の標的は異なる抗原である。いくつかの実施形態では、第１の標的、第２の標的、第３の標的、及び第４の標的は異なる標的分子である。
いくつかの実施形態では、第１の標的、第２の標的、第３の標的、及び／または第４の標的は細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、第１の標的、第２の標的、第３の標的、及び／または第４の標的は腫瘍抗原である。腫瘍抗原は、腫瘍細胞によって産生される、免疫応答、具体的には、Ｔ細胞媒介免疫応答を誘発し得るタンパク質である。本発明の標的された抗原の選択は、治療される特定の種類のがんに依存するであろう。例示的な腫瘍抗原としては、例えば、神経膠腫関連抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、スルビビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ならびにメソテリンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃に対する標的抗原としての機能を果たし得る多数のタンパク質を発現する。これらの分子としては、組織特異的抗原、例えば、黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、及びｇｐ１００、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２等の形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）等のがん胎児抗原である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３７等のＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは、腫瘍細胞に特有であり、体内の他の細胞には生じない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に特有ではなく、代わりに、抗原に対する免疫学的寛容の状態を誘導することができない条件下で正常細胞でも発現する。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟であり、応答することができない場合に胎児発育中に正常細胞で発現する抗原である場合もあるし、またはそれらは、通常非常に低レベルで正常細胞上に存在する抗原であり得るが、はるかにより高いレベルで、腫瘍細胞で発現する。
ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例としては、以下、分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ １００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、及び腫瘍特異的多系列抗原、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｌ５；過剰発現胚抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現癌遺伝子及び変異腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ；染色体転座に起因する特有の腫瘍抗原、例えば、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ及びヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７が挙げられる。他の大型タンパク質に基づく抗原としては、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼サイクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが挙げられる。
いくつかの実施形態では、第１の標的、第２の標的、第３の標的及び／または第４の標的は、刺激性免疫チェックポイント分子または抑制性免疫チェックポイント分子などの免疫チェックポイント分子である。例示的な刺激性免疫チェックポイント分子としては、限定するものではないが、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＨＶＥＭ、及びＴＣＲ（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）が挙げられる。例示的な阻害性免疫チェックポイント分子としては、限定するものではないが、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、Ａ２ａ受容体、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＰＤ－１、ＩＤＯ、ＣＤ４７、及びそれらのリガンド、例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＨＶＥＭ、Ｂ７－Ｈ４、ＮＫＴＲ－２１８、及びＳＩＲＰ－アルファ受容体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、第１の標的、第２の標的、第３の標的及び／または第４の標的は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージまたはナチュラルキラー細胞などの免疫エフェクター細胞上の抗原である。いくつかの実施形態では、第１の標的、第２の標的、第３の標的、または第４の標的はＣＤ３である。いくつかの実施形態では、第１の標的はＣＤ３であり、第２の標的は腫瘍抗原であるか、または第１の標的は腫瘍抗原であり、第２の標的はＣＤ３である。いくつかの実施形態では、第１の標的はＣＤ３であり、第２の標的及び第３の標的は腫瘍抗原である。
本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質のいずれか１つの個々のポリペプチドも提供される。
いくつかの実施形態では、抗体ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドが提供され、ここで、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４との野生型ＣＨ３ドメインに対するかさ高い疎水性アミノ酸との置換及び／またはアミノ酸位置３４７での野生型ＣＨ３ドメインに対する負に荷電したアミノ酸との置換を含み、ここで、このポリペプチドは、野生型ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドと比較してホモ二量体を形成する能力が低下している。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸は、Ｙ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸は、ＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメイン、マウスＣＨ３ドメイン、ラットＣＨ３ドメイン、ラクダのＣＨ３ドメイン、またはウサギのＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６ＹまたはＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体重鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ヒト抗体ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドが提供され、このＣＨ３ドメインは、かさ高い疎水性アミノ酸でのＳ３５４の置換、及び／または負に荷電されたアミノ酸でのＱ３４７の置換を含み、このポリペプチドは、野性型ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドに比較してホモ二量体を形成する能力が低下している。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｙ、Ｓ３５４Ｆ及びＳ３５４Ｗからなる群より選択される置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｑ３４７Ｅ及びＱ３４７Ｄからなる群より選択される置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６ＹまたはＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体重鎖を含む。
上記のヘテロ多量体タンパク質またはポリペプチドのいずれか１つのバリアントまたは誘導体もまた本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるヘテロ二量体タンパク質（例えば、多重特異性抗体）のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、ヘテロ多量体タンパク質の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ヘテロ多量体タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、ヘテロ多量体タンパク質をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾としては、例えば、ヘテロ二量体タンパク質のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを作製して、最終構築物に到達してもよいが、但し、その最終構築物が、所望の特性、例えば、抗原結合性を保有することを条件とする。
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有するヘテロ多量体タンパク質バリアントが提供される。置換型突然変異誘発に対する目的の部位には、多重特異性抗体のＣＤＲ及びＦＲが含まれる。アミノ酸置換が目的の多重特異性抗体中に導入され、産物が、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、及び切断、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについて、スクリーニングされてもよい。
保存的置換を、以下の表２に示す。
Figure 2022525275000004
アミノ酸は、次の共通の側鎖特性に従って異なるクラスに分類されてもよい。
ａ．疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ。
ｂ．中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ。
ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ。
ｅ．鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ。
ｆ．芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちのあるメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が、多重特異性抗体が抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的変化（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＣＤＲにおいて行われてもよい。かかる変化は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外側にあってもよい。
突然変異誘発のために標的とされ得る抗体の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５により記載されている「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ等の荷電残基）のうちのある残基または基を特定し、中性または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えて、抗体の抗原との相互作用が影響を受けるか否かを決定する。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の場所に導入されてもよい。あるいは、またはさらに、抗原－抗体複合体の結晶構造を特定して、抗体と抗原との間の接触点を識別してもよい。かかる接触残基及び隣接する残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、または排除されてもよい。バリアントをスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するか否かを決定してもよい。
アミノ酸配列挿入としては、１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲である、アミノ末端及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一のまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有するヘテロ多量体タンパク質が挙げられる。ヘテロ多量体タンパク質の他の挿入型バリアントとしては、ヘテロ多量体タンパク質の血清半減期を増加させる、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドに対するヘテロ多量体タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端への融合が挙げられる。
ヘテロ多量体タンパク質バリアントには、アミノ末端リーダー伸長も含まれる。例えば、アミノ末端リーダー配列の１つ以上のアミノ酸残基が、抗体の任意の１つ以上の重鎖または軽鎖のアミノ末端に存在する。
ヘテロ多量体タンパク質の共有結合修飾もまた、本発明の範囲内に含まれる。ヘテロ多量体タンパク質の共有結合修飾は、ヘテロ多量体タンパク質の標的アミノ酸残基またはそのフラグメントを、選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、分子に導入し得る。ヘテロ多量体タンパク質の別のタイプの共有結合修飾は、ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンを変更することを含む。例えば、元のヘテロ多量体タンパク質に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させてもよく、及び／または元のヘテロ多量体タンパク質に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を加えてもよい。ヘテロ多量体タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、１つ以上のＮ－結合型グリコシル化部位を含むようにアミノ酸配列を変更することによって都合よく達成される。変更は、１つ以上のセリンまたはスレオニン残基を元のヘテロ多量体タンパク質配列（Ｏ－結合型グリコシル化部位の場合）に追加または置換することによっても行ってもよい。例えば、ヘテロ多量体タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、事前に選択された塩基でヘテロ多量体タンパク質をコードするＤＮＡを変異させることによって、ＤＮＡレベルでの変化を通じて変更され得る。ヘテロ多量体タンパク質上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによるものである。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，，ｐｐ．２５９－３０６（１９８１）に記載されている。ヘテロ多量体タンパク質に存在する炭水化物部分の除去は、化学的に達成されても、または酵素的に達成されてもよい。
ヘテロ多量体タンパク質の別のタイプの共有結合修飾は、ヘテロ多量体タンパク質を様々な非タンパク質性部分の１つに連結することを含む。ヘテロ多量体タンパク質の誘導体化に適した部分としては、限定するものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分枝状であってもまたは非分枝状であってもよい。ヘテロ多量体タンパク質に結合するポリマーの数は変化する可能性があり、複数のポリマーが結合している場合、それらは同じ分子であっても、または異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／またはタイプは、改善されるべきヘテロ多量体タンパク質の特定の特性または機能、定義された条件下での治療などでヘテロ多量体タンパク質誘導体が使用されるか否かを含むがこれらに限定されない考慮事項に基づいて決定され得る。
ＩＩＩ．調製方法
本出願はまた、多重特異性抗体またはイムノアドヘシンなどのヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体）タンパク質を調製する方法も提供する。ヘテロ多量体タンパク質またはそのポリペプチドを調製するための核酸、ベクター、及び宿主細胞も提供される。
本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質は、以下及び実施例に記載されるものを含む、当技術分野における任意の既知の方法を使用して調製してもよい。そのような方法は、ポリペプチドが細胞によって共発現されるように、第１及び第２のＣＨ３含有ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み得る。ある特定の実施形態では、第１及び第２のＣＨ３を含有するポリペプチドをコードする核酸は、例えば、約１：１、１：１、２、２：１、１：３、３：１、１：４、４：１、１：５、５：１、１：６、６：１、１：７、７：１、１：８、８：１、１：９、９：１、１：１０、または１０：１（モル：モル）のいずれか１つについての比率で宿主細胞に提供される。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、１つ以上の抗体軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、細胞によって共発現される第１の重鎖、第２の重鎖、及び共通の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、共通の軽鎖をコードする核酸及び第１または第２の重鎖をコードする核酸は、少なくとも約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１のいずれか１つの比率で宿主細胞に提供される。いくつかの実施形態では、第１の重鎖をコードする核酸、第２の重鎖をコードする核酸、及び共通の軽鎖をコードする核酸は、約１：１：５の比率で宿主細胞に提供される。核酸の比率を変えることにより、ホモ二量体分子に対してヘテロ二量体分子の産生を増加させ得ることが企図される。
いくつかの実施形態では、第１の標的及び第２の標的に特異的に結合するヘテロ多量体タンパク質を生成する方法が提供され、この方法は以下を含む。（ａ）第１の標的に特異的に結合する第１の結合ドメイン及び第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチドを提供することと、（ｂ）第２の標的に特異的に結合する第２の結合ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを提供すること。ここで、（ｉ）第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対して、かさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電したアミノ酸との置換を含むか、または（ｉｉ）第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して、負に荷電したアミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４の置換は、Ｓ３５４Ｙである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の置換は、Ｑ３４７Ｅである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６ＹまたはＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。
いくつかの実施形態では、以下を含む第１及び第２の標的に特異的に結合する、多重特異性抗体を生成する方法が提供される。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖を提供すること：ＶＨ１、第１のＣＨ１、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１軽鎖を提供すること：ＶＬ１及びＣＬ、（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖を提供すること：ＶＨ２、第２のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の軽鎖を提供すること：ＶＬ２及び第２のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、及びＶＨ２とＶＬ２とは会合して第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、ここで、（ｉ）この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電されたアミノ酸の置換を含むか、または（ｉｉ）この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電されたアミノ酸との置換を含む、及び／またはこの第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含み、ここでこのアミノ酸残基の番号付けはＥＵの番号付けに基づいている。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４の置換は、Ｓ３５４Ｙである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の置換は、Ｑ３４７Ｅである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６ＹまたはＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、異なるアミノ酸配列を有する。
核酸
本出願はさらに、本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質（多重特異性抗体など）の１つ以上のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。
オリゴヌクレオチド媒介変異誘発を使用して、第１または第２のポリペプチドをコードするＤＮＡの置換バリアントを調製してもよい。この技術は、Ａｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ，２：１８３（１９８３）によって記載されているように、当技術分野で周知である。手短に言えば、第１または第２のポリペプチドＤＮＡが、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型にハイブリダイズすることによって変更され、ここで、鋳型は、ヘテロ多量体の未改変または天然ＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはバクテリオファージの一本鎖形態である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、鋳型の第２の相補鎖全体を合成し、これにより、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込み、ヘテロ多量体ＤＮＡの選択された変更をコードする。カセット変異誘発を、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）に記載されているように、目的のＤＮＡの領域を、相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって生成された合成変異フラグメントで置き換えることによって実行され得る。ＰＣＲ変異誘発も、第１または第２のポリペプチドＤＮＡのバリアントを作成するのに適している。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヘテロ多量体タンパク質の第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヘテロ多量体タンパク質の第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、多重特異性抗体の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、多重特異性抗体の重鎖及び軽鎖（複数可）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸分子は、第１の重鎖をコードする第１のポリヌクレオチドを含み、第２の核酸分子は、第２の重鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを含み、第３の核酸分子は、共通の軽鎖をコードする第３のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、異なる核酸分子は、異なるプロモーターに作動可能に連結されている。
追加のプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。通常、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近、いくつかのプロモーターが開始部位の下流にも機能エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であり、その結果、エレメントが互いに反転または移動したときにプロモーター機能が維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐまで増やしてもよい。
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、限定するものではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、鳥類白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定するものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターを含む他の構成的プロモーター配列も使用され得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として企図されている。誘導性プロモーターの使用は、ポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができる分子スイッチを提供し、このスイッチは、そのような発現が望まれる場合、それは作動可能に連結されるか、または発現が望まれない場合、発現がオフにされる。誘導性プロモーターの例としては、限定するものではないが、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチド及び／またはヘテロ多量体タンパク質の軽鎖（複数可）をコードするポリペプチドは、翻訳されると、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチド及び／または軽鎖（複数可）のＮ末端に位置するリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。リーダー配列は、天然の重鎖もしくは軽鎖リーダー配列であってもよいし、または別の異種リーダー配列であってもよい。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質をコードする核酸（または核酸のセット）は、ペプチドタグ（例えば、タンパク質精製タグ、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ）をコードする核酸配列をさらに含み得る。
本出願はまた、これらの核酸配列に対するバリアントを含む。例えば、バリアントは、少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
核酸分子は、当技術分野における従来の組換えＤＮＡ技術を使用して構築してもよい。いくつかの実施形態では、核酸分子は、選択した宿主細胞での発現に適した発現ベクターである。
ベクター
本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質（多重特異性抗体など）のいずれか１つの第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び／または軽鎖（複数可）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。そのようなベクターとして、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列、及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、２つの別個のポリペプチドとしてベクターから発現される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、単一のポリペプチドの部分として発現される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、第１の重鎖をコードする第１のポリヌクレオチド配列、第２の重鎖をコードする第２のポリヌクレオチド配列、及び共通の軽鎖をコードする第３のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖（複数可）は、別個のポリペプチドとしてベクターから発現される。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖（複数可）は、単一のポリペプチドの部分として発現される。
いくつかの実施形態では、第１のベクターは、第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、第２のベクターは、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターは、同様の量（同様のモル量または同様の質量量など）で宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、５：１から１：５の間のモル比または質量比の第１のベクター及び第２のベクターのが宿主細胞にトランスフェクトされる。
核酸は、いくつかの種類のベクターにクローニングされ得る。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングされ得る。特に注目すべきベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、限定するものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能なマーカーを含む（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許第６，３２６，１９３号を参照のこと）。
ポリペプチドをコードする核酸（複数可）によるヘテロ多量体タンパク質の発現は、核酸が、例えば、プロモーター及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、５’及び３’調節エレメントに作動可能に連結されるように、核酸を適切な発現ベクターに挿入することによって達成され得る。ベクターは、真核生物の宿主細胞における複製及び組み込みに適している場合がある。典型的なクローニング及び発現ベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及びプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＨＯもしくはＣＨＯ由来細胞における、またはＮＳＯ細胞におけるポリペプチドの発現のために最適化されたベクターを選択する。例示的なそのようなベクターは、例えば、Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｄｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：８８０－８８９（２００４）に記載されている。
ポリペプチドまたはその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染される細胞の集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含み得る。他の態様では、選択可能なマーカーは、別個のＤＮＡ片上に運ばれ、そして同時トランスフェクション手順において使用され得る。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子はいずれも適切な制御配列と隣接して、宿主細胞での発現を可能にし得る。有用な選択可能なマーカーとしては、例えば、ネオ（ｎｅｏ）などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、及び調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくは組織に存在せず、それによって発現されることもなく、発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により明らかになるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリ性ホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が挙げられ得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。好適な発現系が周知であり、既知の技法を使用して調製されてもよいし、または購入されてもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物がプロモーターとして識別される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動型転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用され得る。
宿主細胞
本出願は、本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質（多重特異性抗体など）、核酸分子、またはベクターのいずれか１つを含む単離された宿主細胞を提供する。
本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質（多重特異性抗体など）は、細菌細胞などの原核細胞において、または、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞などの真核細胞において発現され得る。そのような発現は、例えば、当技術分野で公知の手順に従って実施してもよい。ポリペプチドを発現させるために使用され得る例示的な真核細胞として、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞；２９３－６Ｅ細胞を含む２９３細胞；ＣＨＯ－Ｓ、ＤＧ４４．Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞、及びＦＵＴ８ ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞；ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）；及びＮＳＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適切な非哺乳類宿主細胞として、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）及び酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ；またはＫ．ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、特定の真核生物宿主細胞は、抗体の重鎖及び／または軽鎖に所望の翻訳後修飾を行うその能力に基づいて選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、２９３細胞で産生される同じポリペプチドよりも高レベルのシアル化を有するポリペプチドを産生する。
所望の宿主細胞への１つ以上の核酸の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染などを含むがこれらに限定されない任意の方法によって達成され得る。非限定的な例示的な方法が、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に記載されている。核酸は、任意の適切な方法に従って、所望の宿主細胞に一時的または安定的にトランスフェクトしてもよい。
いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、無細胞系で産生される。非限定的な例示的な無細胞系が、例えば、Ｓｉｔａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９８：２２９－４４（２００９）、Ｓｐｉｒｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５３８－４５（２００４）、Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２１：６９５－７１３（２００３）に記載されている。
精製
ヘテロ多量体タンパク質は、標準的な技術を使用して宿主細胞培養物から精製してもよい。ヘテロ多量体タンパク質は、分泌タンパク質として培地から回収してもよいが、分泌シグナルなしで直接産生された場合、宿主細胞溶解物から回収してもよい。ヘテロ多量体タンパク質が膜に結合している場合、適切な界面活性剤溶液を使用してそれを膜から放出してもよい。
ヘテロ多量体タンパク質が、ヒト起源のもの以外の組換え細胞で産生される場合、それは、ヒト起源のタンパク質またはポリペプチドを完全に含まない。しかしながら、ヘテロ多量体タンパク質に関して実質的に均質である調製物を得るために、組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからヘテロ多量体タンパク質を精製することが必要である。第１のステップとして、培養培地または溶解物を通常は遠心分離して粒子状細胞の破片を除去する。
抗体定常ドメインを有するヘテロ多量体タンパク質は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーによって都合よく精製され得る。他の精製技術としては、限定するものではないが、クロマトグラフィー法、例えば、サイズ排除、イオン交換（例えば、ＭｏｎｏＱ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー（例えば、逆相／陰イオン交換、逆相／陽イオン交換、親水性相互作用／陰イオン交換、親水性相互作用／陽イオン交換など）、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、超遠心分離、エタノール沈殿、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿が挙げられる。適切な親和性リガンドとしては、抗体定常領域と結合するリガンドが挙げられる。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、または抗体アフィニティーカラムを使用して、定常領域に結合し、Ｆｃフラグメントを含む抗体を精製してもよい。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、プロテインＡビーズとそれに続くＭｏｎｏＱカラムを使用して精製される。
ＩＶ．使用方法
本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質（例えば、多重特異性抗体）は、治療及び診断に有用であり得る。
本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質、核酸、ベクター、または宿主細胞のいずれか１つを含む組成物（医薬組成物など）も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、１つ以上の薬学的に許容される緩衝液または賦形剤を含む医薬組成物に処方され得る。そのような医薬組成物は、疾患もしくは状態を治療するために、疾患もしくは状態を予防するために、または疾患もしくは状態の症状が進行するのを防止するために、それを必要とする個体に投与され得る。
本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質の医薬組成物は、所望の純度を有するヘテロ多量体タンパク質を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０ ））と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形で得てもよい。許容可能な担体、賦形剤、または安定剤は、レシピエントに対し、採用される投与量及び濃度にて非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。皮下投与のために適合された凍結乾燥製剤がＷＯ９７／０４８０１に記載されている。かかる凍結乾燥製剤は、好適な希釈剤により高タンパク質濃度に再構成されてもよく、この再構成された製剤は、本明細書で画像化されるか、診断されるか、または治療される個体に投与され得る。インビボ投与で使用される薬学的組成物は、滅菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
いくつかの実施形態では、疾患を治療することを、それを必要とする個体において行う方法が提供され、この方法は、有効量のヘテロ多量体タンパク質を個体に投与することを含み、このヘテロ多量体タンパク質は、以下を含む。（ａ）第１の標的に特異的に結合する第１の結合ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、ならびに（ｂ）第２の標的に特異的に結合する第２の結合ドメイン、及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチド。ここで、この第１ＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４で野性型ＣＨ３ドメインに対してかさ高いアミノ酸残基との置換を含む、及び／または第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７で野性型ＣＨ３ドメインに対して、負に荷電されたアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４の置換は、Ｓ３５４Ｙである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の置換は、Ｑ３４７Ｅである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６ＹまたはＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の標的は腫瘍抗原（例えば、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、またはＢＣＭＡ）であり、第２の標的はＣＤ３であるか、または第１の標的は、ＣＤ３であり、第２の標的は、腫瘍抗原（例えば、ＣＤ２０、ＨＥＲ２またはＢＣＭＡ）である。いくつかの実施形態では、疾患はがんである。
いくつかの実施形態では、疾患を治療することを、それを必要とする個体において行う方法が提供され、この方法は、有効量の多重特異性抗体を個体に投与することを含み、この多重特異性抗体は、以下を含む。（ａ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の重鎖：ＶＨ、第１のＣＨ１、第１のＣＨ２、及び第１のＣＨ３ドメイン、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第１の軽鎖：ＶＬ１及びＣＬ、（ｃ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の重鎖：ＶＨ２、第２のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに（ｄ）Ｎ末端からＣ末端まで以下を含む第２の軽鎖：ＶＬ２、及び第２のＣＬ。ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とは会合して第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、ここで、この第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４で野性型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／またはこの第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７で野性型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電したアミノ酸との置換を含み、このアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けに基づく。いくつかの実施形態では、かさ高い疎水性アミノ酸はＹ、ＦまたはＷである。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸はＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４のかさ高い疎水性アミノ酸は、第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基との疎水性相互作用を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４９にかさ高い疎水性残基を含む（例えば、Ｙ３４９）。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の負に荷電したアミノ酸は、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３６０に正に荷電した残基を含む（例えば、Ｋ３６０）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３５４の置換は、Ｓ３５４Ｙである。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置３４７の置換は、Ｑ３４７Ｅである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６ＹまたはＹ４０７ＴなどのＫＩＨ残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及びＶＬ２は、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１の標的は腫瘍抗原（例えば、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、またはＢＣＭＡ）であり、第２の標的はＣＤ３であるか、または第１の標的は、ＣＤ３であり、第２の標的は、腫瘍抗原（例えば、ＣＤ２０、ＨＥＲ２またはＢＣＭＡ）である。いくつかの実施形態では、疾患はがんである。
いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は、診断アッセイにおいて使用される。例えば、ヘテロ多量体タンパク質は、それぞれが検出される試料の異なる免疫原性部分またはエピトープに各々結合し得る、２つの分子の使用を含むサンドイッチアッセイに有用である。サンドイッチアッセイでは、試験試料の分析物は、固体支持体に固定化されたヘテロ多量体タンパク質の第１アームに結合し、その後、ヘテロ多量体タンパク質の第２アームが分析物に結合し、それによって、不溶性の３つの部分からなる複合体を形成する。ヘテロ多量体の第２のアームは、それ自体が検出可能な部分で標識されてもよいし（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定されてもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの種類は、ＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は、酵素である。
Ｖ．キット及び製品
本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質（例えば、多重特異性抗体）のいずれか１つを含むキットを含む、本明細書に記載の調製、診断及び治療の方法のいずれか１つに有用なキットも提供される。
本出願のキットは、適切な包装に入っている。好適な包装としては、限定されるものではないが、バイアル、ボトル、ジャー、軟包装（例えば、密封マイラーまたはプラスチック袋）などが挙げられる。キットは、任意選択で、試薬、緩衝液及び解釈情報等の追加の成分を提供し得る。
したがって、本出願はまた、製品も提供する。この製品は、容器及び容器上、または容器に伴ってラベルまたは添付文書を含み得る。適切な容器には、バイアル（密封されたバイアルなど）、ボトル、ジャー、可塑性の包装などが挙げられる。いくつかの実施形態では、容器は医薬組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、組成物が個人の疾患または状態の診断（リスクの決定を含む）、治療または予防に使用されることを示す。このラベルは、種々の構成要素の再構成及び／または使用の指示を示し得る。医薬組成物を保持する容器は、複数回使用バイアルであってもよく、これは、再構成した製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする。添付文書とは、診断及び／または治療薬の商業用パッケージに通例含まれる、かかる製品の適応症、使用、投薬量、投与、禁忌、及び／またはその使用に関する警告についての情報を含む説明書を指す。さらに、製品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第２の容器をさらに備えてもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザの立場から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
キットまたは製品は、薬局、例えば、病院薬局及び配合薬局での保管及び使用に十分な量でパッケージングされる、薬学的組成物の複数の単位用量及び使用に関する使用説明書を含んでもよい。
以下の実施例は、単に本発明の例示となるよう意図されており、それ故に、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。以下の実施例及び詳細な説明は、限定するものではなく、例証として提供される。
実施例１．ＣＤ２０／ＣＤ３二重特異性抗体の産生、精製及び特徴付け
二重特異性ＣＤ２０／ＣＤ３抗体を、図３のフローチャートに従って調製及び特徴付けた。
第１のフォーマット（図１のＳ１）で、２つの共通の軽鎖ＣＤ２０／ＣＤ３抗体を調製した。Ｖ２ ＣＤ２０／ＣＤ３抗体は、第１の重鎖にＫＩＨ残基Ｔ３６６Ｙを有し、第２の重鎖にＹ４０７Ｔ残基を有する。Ｖ４ｂ ＣＤ２０／ＣＤ３抗体は、第１の重鎖にＴ３３６Ｙ及びＳ３５４Ｙを有し、第２の重鎖にＹ４０７Ｔ及びＱ３４７Ｅを有する。
重鎖及び軽鎖をコードするベクターを、第１の重鎖（Ｈ１）：第２の重鎖（Ｈ２）：共通の軽鎖比が１：１：２または１：１：５で、ｅｘｐｉ２９３細胞またはＣＨＯ細胞に、一過性にトランスフェクトした。宿主細胞を培養し、誘導して二重特異性抗体を分泌させた。二重特異性抗体を含む細胞培養の上清を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、０．４５μｍメンブレンを使用して上清試料をろ過した。
次に、二重特異性抗体を、第１のプロテインＡ精製ステップ及びＭｏｎｏＱステップを含む２ステップクロマトグラフィープロトコルを使用して、上清試料から精製した。プロテインＡ精製ステップでは、ＡＫＴＡ精製システムを、最初に１０カラム容量（ＣＶ）の緩衝液Ａ（ＰＢＳ ｐＨ＝７．４）で平衡状態にした。その上清をプロテインＡ精製カラムに充填し、カラムを緩衝液Ａで１０ＣＶ洗浄した。二重特異性抗体を緩衝液Ｂ（０．１ＭグリシンｐＨ＝２．５）で溶出し、ピーク画分を集めて合わせた。合わせた抗体試料を、ＰＢＳで２回透析した。
ＭｏｎｏＱステップにおいて、抗体試料を、最初に緩衝液Ａ’（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ＝９）に交換した。次に、ＡＫＴＡ精製システムを緩衝液Ａ’で平衡状態にした。抗体試料をＭｏｎｏＱカラムに充填し、続いて緩衝液Ａ’で５ＣＶ洗浄した。二重特異性抗体を、緩衝液Ａ’及び緩衝液Ｂ’（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝９）によって設定された塩勾配を使用して、５０分で０～２５％の緩衝液Ｂ’を使用してＭｏｎｏＱカラムから、０．４ｍｌ／分の流速で溶出させた。ピーク画分を収集して組み合わせた。次に、精製された二重特異性抗体をＰＢＳに緩衝液交換した。
ＭｏｎｏＱカラムからの精製された二重特異性抗体画分を、Ｔ細胞活性化アッセイを使用して確認した。簡単に説明すると、Ｒａｊｉ（ヒトＢリンパ球）及びＪｕｒｋａｔ（ヒトＴリンパ球）細胞をそれぞれ１ｘ１０５細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。希釈した二重特異性抗体試料をプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１７時間インキュベートした。そのプレートを、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１２００ｒｐｍにて５分間１回洗浄した。次にＣＤ６９－ＰＥをプレートに加え、室温で３０分間インキュベートした。その後、そのプレートを、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１２００ｒｐｍにて５分間１回洗浄した。ＣＤ６９ ＋シグナルを、ＢＤ ＣａｌｉｂｕｒプレートリーダーのＦＬ２チャネルのプレートから読み取った。
ＣＤ２０／ＣＤ３二重特異性抗体の３つのバッチの各精製ステップからの発現レベル及び収量を、以下の表３に示す。参照として、リツキシマブを同じ発現系から約１３０ｍｇ／Ｌで発現する。図４は、３つのＣＤ２０／ＣＤ３二重特異性抗体のＭｏｎｏＱ精製ステップからのクロマトグラムを示す。ＦｃへのＳ３５４Ｙ及びＱ３４９Ｅ変異の導入により、二重特異性抗体の全体的な収率が６７．８％（ＫＩＨ変異のみ）から８６．８％（ＫＩＨ＋Ｓ３５４Ｙ及びＱ３４９Ｅ）に改善された。図６に示されるように、Ｖ４ｂ構築物の高収率及び改善されたヘテロ二量体形成速度は、二重特異性抗体調製物の異なるバッチにおいて再現可能であった。
Figure 2022525275000005
Figure 2022525275000006
精製されたＣＤ２０／ＣＤ３ Ｖ４ｂ二重特異性抗体の特徴づけは、高純度（図５Ｂ、５Ｄ、５Ｅ）、Ｔ細胞活性化活性（図５Ｃ）、熱安定性及び凝集に対する耐性（図５Ｆ）を示す。
実施例２．Ｈｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体の産生、精製及び特徴付け
１つの抗Ｈｅｒ２Ｆａｂを含むＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体
１つの抗Ｈｅｒ２ Ｆａｂ、１つの抗ＣＤ３ Ｆａｂ、及び１つのＦｃドメインを含むＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体（「Ｈｅｒ２－Ｂ３／ＣＤ３ ＢｓＡｂ」、図８）を、ｅｘｐｉ２９３細胞の、Ｈｅｒ２－ｂ３ ＨＣ－ｖ４ｂ－ノブ、ＣＤ３－ＨＣ－ｖ４ｂ－ホール、及び共通の軽鎖を発現するプラスミドでの同時トランスフェクションによって調製した。トランスフェクションの９６時間後の発現レベルは１５２μｇ／ｍｌであると確定された。培養上清を回収し、プロテインＡカラムでＩｇＧを精製した。次に、精製した試料を陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＣＥＸ）に充填した。勾配溶出後、二重特異性抗体は、ＣＥＸによって検出されたメインピークとして現れた（図９）。精製された画分を、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によってさらに分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、メインＣＥＸピーク由来の画分の比較的高い純度を示した（図１０）。
２つの抗Ｈｅｒ２Ｆａｂを含むＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体
２つの抗Ｈｅｒ２ Ｆａｂ（「Ｈｅｒ２－Ｂ３－Ｖ３／ＣＤ３」）を含むＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体を調製した（図１１）。
腫瘍細胞に対して高い親和性を有する二重特異性抗体の抗腫瘍抗原アームは、正常なレベルの抗原を発現する健康な非腫瘍細胞をしばしば殺滅し得る。この種の腫瘍外効果を排除するために、腫瘍標的化アームがＦａｂドメインの２つのコピーを有し、その結果、腫瘍抗原に対して二価になる新しいフォーマットの二重特異性抗体を開発した（図１１）。この３ドメイン二重特異性（ＴＤＢ）形式（２：１）では、腫瘍結合領域は腫瘍抗原に対する親和性が比較的低いので、腫瘍抗原密度が低い健康な細胞への結合は弱くなる。
Ｅｘｐｉ ２９３細胞を、Ｈｅｒ２（２ Ｆａｂ）－ＣＨ－ｖ４ｂ－ノブ、ＣＤ３－ＣＨ－ｖ４ｂ－ホール、及び共通の軽鎖ＤＮＡを発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。培養培地を回収し、ＰｒｏｂｅＬｉｆｅを使用してトランスフェクションの９６時間後に１５８μｇ／ｍｌの発現レベルを測定した。二重特異性抗体Ｈｅｒ２－Ｂ３－Ｖ３／ＣＤ３をプロテインＡカラムで精製した。次に、精製された試料を、２回目の精製のために陽イオン交換カラム（ＣＥＸ）に充填した。勾配溶出後、二重特異性抗体は、メインピークとして現れた（図１２）。精製された画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってさらに分析した（図１３）。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、ＣＥＸ精製後にサイズが約２００ｋＤのバンドが１つだけ表示されることを示しており、これは、Ｈｅｒ２－Ｂ３－Ｖ３／ＣＤ３（２つのＨｅｒ２ Ｆａｂを含む）のサイズと一致している。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、二重特異性抗体の３つの鎖を明確に示しており、これらも対応するサイズと一致していた。
実施例３．ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の産生、精製及び特徴付け
ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体を調製した。ラマファージライブラリーからパンニングされた抗ＢＣＭＡのＶＨＨを、ヒトＦｃ－ｖ４ｂ－ノブに連結して、ＢＣＭＡ－Ｆｃ鎖を形成した。ＢＣＭＡ－Ｆｃ鎖は、ＣＤ３－ＨＣ－ｖ４ｂ－ホール及びその軽鎖とともに、新しいＩｇＧ様二重特異性抗体を形成した。２つのＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＩｇＧ様二重特異性抗体の概略図を図１４に示す。図１４の左側は、ＢＣＭＡ－３Ｅ５／ＣＤ３であり、１つのＢＣＭＡ－ＶＨＨ（３Ｅ５）のみを含む。図１４の右側は、ＢＣＭＡ－３Ｅ１Ｂ２／ＣＤ３であり、２つのＢＣＭＡ－ＶＨＨ（３Ｅ１及び３Ｂ２）を含む。
xxxxxx
ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体を調製するために、ｅｘｐｉ ２９３細胞を、ＢＣＭＡ（３Ｅ５）－Ｆｃ－ｖ４ｂ－ノブ（またはＢＣＭＡ（３Ｅ１Ｂ２）－Ｆｃ－ｖ４ｂ－ノブ）、ＣＤ３－ＣＨ－ｖ４ｂ－ホール、及びＣＤ３ＬＣを発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。その培養培地を収集し、ＰｒｏｂｅＬｉｆｅを使用して発現レベルをＢＣＭＡ－３Ｅ５／ＣＤ３では６２ｕｇ／ｍｌ、ＢＣＭＡ－３Ｅ１Ｂ２／ＣＤ３では５４ｕｇ／ｍｌであると決定した。
培養上清を収集し、２つの二重特異性抗体をプロテインＡカラムで精製した。ＳＤＳーＰＡＧＥは、２つのＢＣＭＡ－Ｆｃ／ＣＤ３二重特異性抗体に対して実施した（図１５）。この結果、両方のＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体が首尾よく発現されたこと、及びいくらかのＣＤ３ホモ二量体形成があったことが示された（サイズが約１５０Ｋｄ；図１５を参照のこと）。還元されたＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果において、ＣＤ３－ＶＨ－ｖ４ｂ－ホール、ＢＣＭＡ－Ｆｃ、及び共通の軽鎖が、それらの分子量に基づいて検出された（図１５）。
ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体を精製及び特徴付けるために、さらなる実験を行う。まず、トランスフェクションで３本の鎖を発現する３本のプラスミドの比率を最適化する。３つのプラスミドの比率を最適化すると、二重特異性抗体ヘテロ二量体の割合が増大する。プラスミドの比率が最適化されているため、ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体は、プロテインＡカラム及びＣＥＸによって発現及び精製される。ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価される。
実施例４．Ｆｃ変異を有するＣＤ２０／ＣＤ３二重特異性抗体の産生、精製及び特徴付け
Ｆｃ領域に変異を有するＣＤ２０／ＣＤ３二重特異性抗体を生成した。抗ＣＤ２０重鎖への変異を表４に示す。抗ＣＤ３重鎖への変異を表５に示す。
Figure 2022525275000007
Figure 2022525275000008
Ｆｃ変異を伴う抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ３重鎖の１３の組み合わせ全てを、それらの共通の軽鎖と共に組換え発現した。上清中の抗体の濃度を測定し、これを表６に示す。
Figure 2022525275000009
上記のＦｃ変異の組み合わせを有するＣＤ２０／ＣＤ３二重特異性抗体は、さらなる実験において特徴付けられる。Ｔ細胞活性化に対するＣＤ２０／ＣＤ３二重特異性抗体の活性を評価する。ＣＤ２０／ＣＤ３野生型（Ａ１Ｂ１）と同等またはそれ以上のＴ細胞活性化活性を有するＦｃ変異体の組み合わせを特定し、選択する。
選択されたＣＤ２０／ＣＤ３変異体の組み合わせを、組換え発現し、精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析する。Ａ１Ｂ１と同等またはそれ以上の純度（すなわち、ヘテロ二量体パーセンテージ）を有するＦｃ変異体の組み合わせを特定して、選択する。
選択されたＣＤ２０／ＣＤ３変異体の組み合わせの熱安定性及び凝集能は、以下の実施例５に記載される方法を使用して評価する。熱安定性は、示差走査蛍光光度計及び静的光散乱によって評価する。凝集の可能性は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって評価する。Ａ１Ｂ１と同等またはそれよりも優れた熱安定性、及びＡ１Ｂ１と同等またはそれよりも低い凝集能を有する、変異体の組み合わせを特定して選択する。
実施例５．１：材料及び方法
以下の実施例は、二重特異性抗体を産生及び特徴付けるための材料及び方法を示す。
ＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞をトランスフェクトすることによる二重特異性抗体の組換え発現
ＧＩＢＣＯ（商標）ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２９３トランスフェクションキット（カタログ番号Ａ１４５２４）を使用して、以下に記載されるように、二重特異性抗体を発現させた。
３０ｍＬのトランスフェクションごとに、２５．５ｍＬのＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地中の７．５×１０７個の細胞を使用した。翌日に細胞をトランスフェクトするために、細胞を２．０×１０６生細胞／ｍＬの密度で播種し、１２５ｒｐｍで回転するオービタルシェーカー上で空気中、８％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの日に、細胞の数及び生存率は、自動セルカウンターまたはトリパンブルー色素排除法を使用して決定した。トランスフェクションを進めるには、細胞の生存率が９５％を超えている必要がある。１回のトランスフェクションに必要な細胞数（３０ｍＬのトランスフェクションごとに７．５×１０７細胞）を含む細胞懸濁液の容積を計算した。適切な容積の細胞懸濁液を各滅菌済み使い捨て１２５ｍＬエーレンマイヤーシェーカーフラスコに加え、３０ｍＬのトランスフェクションごとに新鮮な予熱したＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地を加えることで容量を２５．５ｍＬにした。細胞をインキュベーターに戻した。
各３０ｍＬトランスフェクションについて、脂質－ＤＮＡ複合体を以下のように調製した：ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（商標）Ｉ還元血清培地（カタログ番号３１９８５－０６２）中の３０μｇのプラスミドＤＮＡを、総容積１．５ｍＬに希釈し、穏やかに混合した。８０μＬのＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２９３試薬を、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（商標）Ｉ培地で総容積１．５ｍＬに希釈し、穏やかに混合して、室温で５分間インキュベートした。５分間のインキュベーション後、希釈したＤＮＡを、希釈したＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２９３試薬に加えて総容積を３ｍＬにし、穏やかに混合した。ＤＮＡ－ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２９３試薬混合物を、室温で２０～３０分間インキュベートして、ＤＮＡ－ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２９３試薬複合体を形成させた。
ＤＮＡ－ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２９３試薬複合体のインキュベーションが完了した後、３ｍＬのＤＮＡ－ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２９３試薬複合体を、上記で調製した脂質－ＤＮＡ複合体から各シェーカーフラスコに加えた。陰性対照のフラスコに、ＤＮＡ－ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２９３試薬複合体の代わりに３ｍＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ（商標）Ｉ培地を添加した。各フラスコには総容積２８．５ｍＬが含まれていた。細胞を、１２５ｒｐｍで回転するオービタルシェーカー上で、空気中に８％ＣＯ２の加湿雰囲気を備えた３７℃のインキュベーター内でインキュベートした。
トランスフェクションの約１６～１８時間後、１５０μＬのＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー１及び１．５ｍＬのＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー２を、各フラスコに加えた。最終容量は、各１２５ｍＬフラスコで約３０ｍＬであった。トランスフェクションの約７２～９６時間後に培地の回収を開始し、組換えタンパク質の発現をアッセイした。
プロテインＡカラムによる二重特異性抗体の精製
プロテインＡカラムで二重特異性抗体を精製するために、トランスフェクションの７２～９６時間後、発現培地を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次いで、上清を０．４５μｍの膜で濾過した。
ＡＫＴＡ純粋タンパク質精製システムを以下のように使用した。ＡＫＴＡ精製システムのバランスを取り、ポンプＢに緩衝液Ｂ（０．１Ｍグリシン、ｐＨ ＝ ２．５）を充填し、ポンプＡ及び試料ポンプに緩衝液Ａ（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）を充填した。次に、プロテインＡ精製カラム（ＧＥのＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰカラム、カタログ番号：１７０４０２０１または１７０４０３０１）をセットアップし、１０カラム容量（ＣＶ）の緩衝液Ａでバランスを取った。１ｍｌカラムの場合は１ｍｌ／分、５ｍｌカラムの場合は３ｍｌ／分の流速で、上清を試料ポンプを通してカラムにロードした。試料をロードした後、カラムを緩衝液Ａで１０ＣＶ洗浄した。抗体は１００％緩衝液Ｂで溶出し、ピーク画分は１／１０容積の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ＝８で収集した。カラムを５ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄し、次いで１０ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。カラムを４℃で２０％エタノールで満たして保存し、ＡＫＴＡシステムを２０％エタノールで満たして保存した。
溶出されたＡｂの選択されたピーク画分を合わせ、ＰＢＳ中で２回透析した。次に、精製された抗体は、精製の第２のステップの準備ができていた。
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）による二重特異性抗体の２回目の精製
抗体を（ＰＢＳ中で）１：１０に緩衝液１（２０ｍＭ ＮａｘＨ（３－ｘ）ＰＯ４、ｐＨ＝７．４）に希釈した。ＡＫＴＡ精製システムのバランスを取り、ポンプＢに緩衝液２（２０ｍＭ ＮａｘＨ（３－ｘ）ＰＯ４、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）を充填し、ポンプＡ及び試料ポンプに緩衝液１を充填した。ＰＯＲＯＳ（商標）ＧＯＰＵＲＥ（商標）ＨＳ Ｐｒｅ－パックドカラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号：Ａ３６６３７）をセットアップし、緩衝液１でバランスを取った。
希釈された抗体試料は、１．６ｍｌ／分の流速で、試料ポンプを介してカラムにロードし、試料ロード後、５ＣＶの間、緩衝液１で洗浄した。塩勾配溶出では、０～２０％の緩衝液２を１．６ｍｌ／分の流速で４０分で使用した。ピーク画分を収集した（通常は１ｍｌ／バイアル）。カラムを５ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄し、次いで１０ＣＶの緩衝液１で洗浄した。カラムを４℃で２０％エタノールで満たして保存し、ＡＫＴＡシステムを２０％エタノールでバランスをとった。ピーク画分を合わせて、ＰＢＳに透析した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥアッセイ
非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの場合、４倍のローディング緩衝液を試料に加えて、ローディングの準備ができた１倍の試料を達成した。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの場合、８％容積のベータメルカプトエタノールを試料に加え、よく混合し、９５℃で５分間加熱した後、試料をロードする準備を整えた。試料は、プロテインマーカーと一緒にゲルウェルにロードした。試料は２００Ｖで５０分間実行した。ゲルをＩＮＳＴＡＮＴＢＬＵＥ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ溶液で１時間染色した後、水で１回洗浄した。
熱安定性（ＤＳＦ／ＳＬＳ）及び凝集能（ＤＬＳ）アッセイ
精製された二重特異性抗体試料を、分析のためにＵＮｃｌｅシステム（Ｕｎｃａｎｄｅｄ Ｌａｂｓ）に提出した。動的光散乱（ＤＬＳ）は２５℃で測定し、データはＵＮｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して計算及び分析した。示差走査蛍光光度／静的光散乱（ＤＳＦ／ＳＬＳ）アッセイでは、２５℃から９５°までモニタリングしながら１℃／分の温度勾配を実行した。ＵＮｃｌｅは、２６６ｎｍ及び４７３ｎｍでＳＬＳを測定した。Ｔｍ及びＴａｇｇも、ＵＮｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して計算及び分析した。

Claims (44)

  1. 第１の重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質であって、前記第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含む、及び／または前記第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電したアミノ酸との置換を含み、前記アミノ酸残基の番号付けは、ＥＵの番号付けに基づいている、前記ヘテロ多量体タンパク質。
  2. アミノ酸位置３５４の前記かさ高い疎水性アミノ酸が、前記第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基と疎水性相互作用を形成する、請求項１に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  3. 前記第２のＣＨ３ドメインが、チロシン（Ｙ）をアミノ酸位置３４９で含む、請求項１または２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  4. アミノ酸位置３４７の前記負に荷電したアミノ酸が、前記第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基とイオン結合を形成する、請求項１～３のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  5. 前記第１のＣＨ３ドメインが、リジン（Ｋ）をアミノ酸位置３６０で含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  6. 前記第１のＣＨ３ドメイン及び前記第２のＣＨ３ドメインが、ヒトＣＨ３ドメインである、請求項１～５のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  7. 前記第１のＣＨ３ドメインが、Ｓ３５４Ｙ、Ｓ３５４Ｆ及びＳ３５４Ｗからなる群より選択される置換を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  8. 前記第１のＣＨ３ドメインが、Ｓ３５４Ｙを含む、請求項７に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  9. 前記第２のＣＨ３ドメインが、Ｑ３４７Ｅ及びＱ３４７Ｄからなる群より選択される置換を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  10. 前記第２のＣＨ３ドメインが、Ｑ３４７Ｅを含む、請求項９に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  11. 前記第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインがさらに、ノブイントゥホール残基を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  12. 前記ノブイントゥホール残基が、Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７Ｔである、請求項１１に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  13. 前記第１のＣＨ３ドメインが、Ｔ３６６Ｙ及びＳ３５４Ｙを含み、前記第２のＣＨ３ドメインが、Ｙ４０７Ｔ及びＱ３４７Ｅを含む、請求項１２に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  14. 前記第１のポリペプチド及び／または前記第２のポリペプチドが、重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  15. 前記ヘテロ多量体タンパク質が、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む、請求項１４に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  16. 前記ＩｇＧ Ｆｃ領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１５に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  17. 前記第１のポリペプチドが、抗体重鎖であるか、及び／または第２のポリペプチドが抗体重鎖である、請求項１～１６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  18. 前記ヘテロ多量体タンパク質が、１つ以上の抗体軽鎖を含む、請求項１７に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  19. 前記ヘテロ多量体タンパク質が多重特異性抗体である、請求項１８に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  20. 請求項１８または１９に記載のヘテロ多量体タンパク質であって、
    （ａ）前記Ｎ末端から前記Ｃ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第１の重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び第１のＣＨ３ドメイン；
    （ｂ）前記Ｎ末端から前記Ｃ末端まで以下を含む第１の軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；
    （ｃ）前記Ｎ末端から前記Ｃ末端まで以下を含む第２の重鎖：第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、第２のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び第２のＣＨ３ドメイン、ならびに
    （ｄ）前記Ｎ末端から前記Ｃ末端まで以下を含む第２の軽鎖：第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）、及び第２のＣＬ；
    ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、及びＶＨ２とＶＬ２とは会合して第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、前記ヘテロ多量体タンパク質。
  21. ＶＬ１及びＶＬ２が同じアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  22. ＶＬ１及びＶＬ２が異なるアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  23. 前記第１の標的及び前記第２の標的が同じ抗原の異なるエピトープである、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  24. 前記第１の標的及び前記第２の標的が異なる抗原である、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  25. 前記第１の抗原結合部位が腫瘍抗原に特異的に結合し、前記第２の抗原結合部位がＣＤ３に特異的に結合する、請求項２４に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  26. 前記第１の抗原結合部位がＣＤ２０に特異的に結合する、請求項２５に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  27. 前記第１の抗原結合部位がＨＥＲ２に特異的に結合する、請求項２５に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  28. 請求項２０～２７のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質であって：
    （ａ）前記Ｎ末端から前記Ｃ末端まで以下を含む第１の重鎖：第３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ３）、第３のＣＨ１、前記ＶＨ１、前記第１のＣＨ１、前記第１のＣＨ２、及び前記第１のＣＨ３ドメイン；
    （ｂ）前記Ｎ末端から前記Ｃ末端まで以下を含む第１の軽鎖：第３の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）、第３のＣＬ、前記ＶＬ１、及び前記第１のＣＬ；
    ここで、ＶＨ３とＶＬ３とは会合して、第３の標的に特異的に結合する第３の抗原結合部位を形成する、前記ヘテロ多量体タンパク質。
  29. 前記第１の抗原結合部位及び前記第３の抗原結合部位が前記同じ抗原に特異的に結合する、請求項２８に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  30. 前記第１の抗原結合部位及び前記第３の抗原結合部位がＨＥＲ２に特異的に結合し、前記第２の抗原結合部位がＣＤ３に特異的に結合する、請求項２９に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  31. 請求項１８または１９に記載のヘテロ多量体タンパク質であって、
    （ａ）前記Ｎ末端から前記Ｃ末端まで以下を含む第１の重鎖：第１のＶＨＨ、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び前記第１のＣＨ３ドメイン；
    （ｂ）前記Ｎ末端から前記Ｃ末端まで以下を含む第２の重鎖：第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、第２のＣＨ１、第２のＣＨ２、及び前記第２のＣＨ３ドメイン、ならびに
    （ｄ）前記Ｎ末端から前記Ｃ末端まで以下を含む軽鎖：第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、及び第１のＣＬ；
    ここで、ＶＨ１とＶＬ１とは会合して第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、及び前記第１のＶＨＨは第２の標的に特異的に結合する、前記ヘテロ多量体タンパク質。
  32. 前記第１の抗原結合部位がＣＤ３に特異的に結合し、前記第１のＶＨＨが腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項３１に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  33. 前記第ＶＨＨがＢＣＭＡに特異的に結合する、請求項３２に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  34. 前記第１の重鎖が、Ｎ末端からＣ末端まで以下：第２のＶＨＨ、前記第１のＶＨＨ、前記第１のＣＨ２、及び前記第１のＣＨ３ドメインを含み、ここで前記第２のＶＨＨが、第３の標的に特異的に結合する、請求項３１～３３のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  35. 前記第１のＶＨＨ及び第２のＶＨＨが前記同じ抗原に特異的に結合する、請求項３４に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  36. 前記第１のＶＨＨ及び前記第２のＶＨＨがＢＣＭＡ２に特異的に結合する、請求項３５に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  37. 前記ヘテロ多量体タンパク質が、イムノアドヘシンまたは抗体－イムノアドヘシンキメラである、請求項１～１６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体タンパク質。
  38. 請求項１～３７のいずれか１項に記載の前記ヘテロ多量体タンパク質をコードする１つ以上の核酸（複数可）。
  39. 請求項３８に記載の前記１つ以上の核酸（複数可）を含むベクター。
  40. 請求項３８に記載の前記１つ以上の核酸（複数可）または請求項３９に記載の前記ベクターを含む、宿主細胞。
  41. 多重特異性抗体またはヘテロ多量体タンパク質を調製するための方法であって：
    （ａ）前記１つ以上の核酸（複数可）またはベクターの発現を可能にする条件下で請求項４０に記載の前記宿主細胞を培養することと；
    （ｂ）前記宿主細胞培養から前記多重特異性抗体または前記ヘテロ多量体タンパク質を回収すること、を含む、方法。
  42. 請求項１～３７のいずれか１項に記載の前記ヘテロ多量体タンパク質、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  43. 請求項４２に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象を治療するための方法。
  44. 第１の標的及び第２の標的に特異的に結合するヘテロ多量体タンパク質を生成する方法であって：
    （ａ）第１の標的に特異的に結合する第１の結合ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチドを提供することと；
    （ｂ）前記第２の標的に特異的に結合する第２の結合ドメイン、及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを提供することと、を含み；
    ここで：
    （ｉ）前記第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対してかさ高い疎水性アミノ酸との置換を含むか、及び／もしくは第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電したアミノ酸との置換を含むか；または
    （ｉｉ）前記第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３４７の野生型ＣＨ３ドメインに対して負に荷電したアミノ酸との置換を含むか、及び／もしくは前記第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸位置３５４の野生型ＣＨ３ドメインに対して、かさ高い疎水性アミノ酸との置換を含み；
    ここで、前記アミノ酸残基の番号付けは、ＥＵの番号付けに基づいている、前記方法。

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