JP2022522151A

JP2022522151A - 新規なラクトバチルスサケイｃｖｌ－００１菌株又はその培養液を含む骨疾患又は代謝性疾患改善、予防又は治療用組成物

Info

Publication number: JP2022522151A
Application number: JP2021549784A
Authority: JP
Inventors: ジョンファン・パク; チュヒー・チェ; ドヒョン・チョン
Original assignee: インダストリーファウンデーションオブチョンナムナショナルユニバーシティー
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2020-02-24
Publication date: 2022-04-14
Also published as: WO2020175869A3; CN113840908A; EP3932416A2; EP3932416A4; SG11202109231WA; WO2020175869A2; US20220135935A1

Abstract

本発明は、新規なラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株及びその分離方法に関するものであり、前記菌株は、キムチから分離できる乳酸菌であるので、これを効果的に生菌剤又は食品添加剤として用いることができる。また、本発明は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）又はその培養液を含む骨疾患又は代謝性疾患改善、予防又は治療用組成物に関するものであり、キムチから分離したラクトバチルスサケイ菌株とその培養液が破骨細胞分化抑制、骨多孔症疾患改善、脂肪細胞分化抑制及び体重増加抑制の効果を奏するので、これを効果的に骨多孔症又は肥満疾患の改善、予防又は治療に用いることができる。
【選択図】図１ｂ

Description

本発明は、科学技術情報通信部の支援下で課題番号２０１８Ｒ１Ａ２Ｂ３００４１４３によってなされたものであり、該課題の研究管理専門機関は韓国研究財団、研究事業名は「中堅研究者支援事業」、研究課題名は「病原体感染に対するＮｏｄ２媒介細胞／組織特異的防御システム研究」、主管機関はジョンナム大学校産学協力団、研究期間は２０１８．０３．０１～２０２２．０２．２８である。

本特許出願は、２０１９年２月２６日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０１９－００２２６７０号及び第１０－２０１９－００２２６７１号、並びに２０２０年２月３日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０２０－００１２７６３号に対して優先権を主張し、これらの特許出願の開示事項は本明細書に参照によって組み込まれる。

本発明は、新規なラクトバチルスサケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）ＣＶＬ－００１菌株及びその分離方法に関し、より詳細には、キムチから分離して同定した新規なラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株に関する。

また、本発明は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株又はその培養液を含む骨疾患又は代謝性疾患改善、予防又は治療用組成物に関し、より詳細には、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託された新規なラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株又はその培養液を含む組成物の骨疾患又は代謝性疾患の改善、予防又は治療効果に関する。

キムチのような伝統発酵食品に豊富に存在する乳酸菌は、人体の消化系に共生しながら繊維質及び複合タンパク質を分解して重要な栄養成分にする役割を担当し、腸内ｐＨを酸性に維持させて大腸菌やクロストリジウム（Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐ．）のような有害菌の繁殖を抑制し、下痢と便泌を改善する他に、ビタミン合成、血中コレステロール低下などの役割も担う。特に、乳酸菌は、腸の粘膜及び上皮細胞に強く結合できる特性があり、整腸作用に大きく役立つ。

また、乳酸菌は、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の増殖を促進して大食細胞の腸内有害細菌に対する認知能力、殺菌能力を強化させ、免疫関連物質の分泌を促進して免疫増強効果を示すことが知られている（非特許文献１～２）。

ラクトバチルス属の微生物は、同型又は異型発酵をする乳酸桿菌であり、乳製品や野菜の発酵過程でしばしば見られる菌である。近年、ラクトバチルス属の微生物を生菌剤、食品添加剤などとして開発しようとする研究が活発に行われている。

最近では、健康及び疾病の両方のために腸内微生物（ｇｕｔｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ；以下、ＧＭ）の重要性が集中的に研究されてきた。ＧＭは、総括的に、ヒトゲノムに比べて１５０倍も多い遺伝子を含有する膨大な量のバクテリアで構成される。これは、出生時に得られるものであり、区別される実在（ｄｉｓｔｉｎｃｔｅｎｔｉｔｙ）であるにも拘わらず、明確に、ヒトゲノムと共に共進化し、種々の方式でその宿主と疎通し影響を及ぼす多細胞生物と見なすことができる。

ＧＭの構成は、食物及び抗生体治療のような多数の環境的要因によって調節される。腸内微生物によって生産された分子は、有益でも有害でもあり得、腸内の内分泌細胞、腸神経系、腸透過性及び免疫システムに影響を及ぼすことが知られている。揺らいでいる微生物構成は、クローン病、潰瘍性大膓炎、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、糖尿、食物アレルギー、湿疹及び喘息の他に肥満及び代謝症候群も含め、腸内外で様々な炎症条件につながるものとされてきた。

更年期の女性には種々の閉経症候が見られるが、特に、エストロゲンの減少によって骨からカルシウムが抜け、骨の質量が減少して穴が多くなるため、骨損失の増加などにより骨多孔症疾患の発病率が増加する。閉経期以降の後期変化はその症状が現れるまで多少時間がかかることがあり、問題を自覚し難い場合が多い。保健福祉部国民健康統計値では、３０歳以上において骨多孔症有病率が男性は１％、女性は９％と、女性の有病率が男性に比して９倍も高いことが報告された。

骨多孔症に起因する骨折は、主な健康問題を構成し、健康管理システムにおいて膨大な経済的負担を招く。骨多孔症による骨折の危険は西洋で高く（女性で約５０％及び男性で約２０％）、骨折は、顕著な致死率及び罹患率につながる。皮質骨（ｃｏｒｔｉｃａｌｂｏｎｅ）は身体において骨の約８０％を構成し、多くの研究は、皮質骨が骨強度の主要決定因子であり、よって、骨折敏感性の主要決定因子であることを示した。６５歳以降の骨損失は、海綿質骨ではなく皮質骨での損失に主として起因する（非特許文献３）。

骨格は、骨形成骨芽細胞（ＯＢｓ）及び骨吸収破骨細胞（ＯＣＬｓ）によってリモデルリングされる。大食細胞コロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）は、ＯＣＬｓ前駆細胞の増殖及び生存を増加させるだけでなく、ＯＣＬにおいて核因子－κＢ（ＲＡＮＫ）のレセプター活性剤の発現を上方調節する。これは、ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）がバインディングし、ＯＣＬ形成を導くシグナリングカスケードを開始させる。ＲＡＮＫＬの影響は、ＲＡＮＫＬに対する誘引レセプターであるオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）によって阻害されることがある。

また、近年、高速の経済成長と食生活の西欧化と共に遺伝的、環境的要因などによる肥満及び糖尿などの代謝性疾患が増加しつつある。これを予防及び治療できる物質に関する研究が進行している中、最近では様々な機能性食品の開発が要求されている。

肥満は全世界的に有病率が増えており、肥満による代謝関連合併症によって肥満治療への関心が高まっている。現在、用いられている肥満治療剤は、飽満感を誘導して食欲を抑制させたり脂肪の吸収を低下させたりして体重減少を誘導する。飽満感は、ノルエピネフリン或いはセロトニンの神経接合部においてこのような神経伝達物質の濃度を増加させることによって誘発することもあり、セロトニン受容体やアドレナリン性受容剤を刺激して誘発することもある。

しかしながら、肥満治療のために開発されている薬物は、効果に比べて副作用が深刻なため、抗肥満効果に優れながらも副作用は少ない素材の新しい作用機序を有する物質の開発が切実に望まれている。

Ｇａｂｒｉｅｌａｐｅｒｉｄｇｏｎｅｔａｌ．ＪｏｆｆｏｏｄＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ５３：４０４－４１１，１９９０Ｋａｔｓｕｍａｓａｓａｔｏｅｔａｌ．，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．，３２（７）：６８９－６９８，１９９８Ｌａｎｃｅｔ，２０１０，Ｍａｙ１５；３７５（９７２７）：１７２９－３６

そこで、本発明者らは、韓国全域から収集したキムチ試料から、分離及び同定により新規なラクトバチルスサケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）菌株を分離し、キムチから分離したラクトバチルスサケイ菌株とその培養液が、破骨細胞分化抑制、骨多孔症疾患改善、脂肪細胞分化抑制及び体重増加抑制効果を示すことを確認した。

そこで、本発明の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を提供することである。

本発明の他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の培養液を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、キムチ抽出物を培養する培養段階を含む、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の分離方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、骨疾患又は代謝性疾患の改善、予防又は治療活性を有する受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、骨疾患又は代謝性疾患の改善、予防又は治療活性を有する受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の培養液を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の培養液を含む骨疾患又は代謝性疾患予防又は治療用薬学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の培養液を含む骨疾患又は代謝性疾患改善用食品組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の骨疾患又は代謝性疾患改善、予防及び治療用途に関する。

本発明は、新規なラクトバチルスサケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）ＣＶＬ－００１菌株、その分離方法、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株又はその培養液を含む骨疾患又は代謝性疾患改善、予防又は治療用組成物に関する。

本発明者らは、キムチ抽出物を培養して菌株を分離し、これから、グラム陽性であり且つカタラーゼ陰性である菌株を選別してラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を分離し、該菌株又はその培養液が破骨細胞の分化を抑制させ、骨疾患を治療する効果があることを確認し、これを、高脂肪食餌で肥満誘導したマウスに経口投与した結果、体重増加が抑制され、血糖数値が減少することを観察した。

本発明は、新規なラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株及びその分離方法に関し、前記菌株はキムチから分離できる乳酸菌であるので、これを効果的に生菌剤又は食品添加剤として用いることができる。

また、本発明は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）又はその培養液を含む、骨疾患又は代謝性疾患改善、予防又は治療用組成物に関し、キムチから分離したラクトバチルスサケイ菌株とその培養液が破骨細胞分化抑制、骨多孔症疾患改善、脂肪細胞分化抑制及び体重増加抑制の効果を奏するので、これを効果的に骨多孔症又は肥満疾患の改善、予防又は治療に用いることができる。

ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）菌株培養液の破骨細胞分化抑制効果を示す写真である。ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液の破骨細胞分化抑制効果を示すグラフである。ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液の破骨細胞分化誘導タンパク質のリン酸化抑制効果を示すウェスタンブロッティング結果写真である。ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液の破骨細胞分化誘導遺伝子の発現抑制効果を示すグラフである。骨多孔症を誘導したマウスモデルにおいてラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株及びその培養液による骨密度増加効果を示すグラフである。ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１培養液の脂肪細胞分化に対する抑制効果を示すグラフである。高脂肪食餌実験群におけるラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株による体重抑制効果を示す経時グラフである。高脂肪食餌実験群におけるラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株による副睾丸脂肪重さ減少効果を実験群によって示すグラフである。高脂肪食餌実験群におけるラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液による体重抑制効果を示す経時グラフである。高脂肪食餌実験群におけるラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液による副睾丸脂肪重さ減少効果を実験群によって示すグラフである。高脂肪食餌実験群におけるラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液による糖負荷検査における血糖降下効果を実験群によって示すグラフである。高脂肪食餌実験群におけるラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株による糖負荷検査における血糖降下効果を実験群によって示すグラフである。高脂肪食餌実験群におけるラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液によるインスリン負荷検査における血糖降下効果を実験群によって示すグラフである。高脂肪食餌実験群におけるラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株によるインスリン負荷検査における血糖降下効果を実験群によって示すグラフである。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明の一態様は、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株である。

前記菌株は、配列番号１で表示される１６ＳｒＲＮＡ配列を有するものであってよい。

本発明の他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の培養液である。

本発明のさらに他の態様は、キムチ抽出物を培養する培養段階を含む、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の分離方法である。

前記キムチ抽出物は、キムチを摩砕して濾過したキムチ摩砕液でよく、例えば、前記キムチ摩砕液に水を添加して希釈したキムチ液でよいが、これに限定されるものではない。

前記培養段階は、キムチ抽出物を培養する第１培養段階；及び、前記第１培養段階で分離した菌株を培養する第２培養段階であってよい。

前記第１培養段階は、乳酸菌の鑑別のために０．５～２％の炭酸カルシウム又は０．００４～０．００６％のブロモクレゾールパープル（ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌｐｕｒｐｌｅ）が添加された培地で行われてよく、例えば、炭酸カルシウムが添加された培地で行われてよいが、これに限定されない。

前記第１培養段階は、２０～３２℃で３６～６０時間行われてよく、例えば、３０℃で４８時間行われてよいが、これに限定されない。その後、透明環を形成した菌株を分離し、それに対して第２培養段階を適用することができる。

前記第２培養段階は、分離された菌株から乳酸菌を選別して培養する段階であってよい。具体的に、前記分離された菌株のうち、グラム陽性であり且つカタラーゼ陰性であるものを乳酸菌として選別して培養する段階であってよい。

前記第２培養段階は、２０～３２℃で１２～３６時間行われてよく、例えば、３０℃で２４時間行われてよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の態様は、骨疾患の改善、予防又は治療活性を有する受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株である。前記菌株は、キムチから分離されたものでよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の態様は、骨疾患の改善、予防又は治療活性を有する受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の培養液である。

本発明のさらに他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株又はその培養液を含む、骨疾患予防又は治療用薬学的組成物である。

前記骨疾患は、骨多孔症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、骨転移癌（ｂｏｎｅｍｅｔａｓｔａｔｉｃｃａｎｃｅｒ）、骨軟化症（ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ）、佝僂病、線維性骨炎、無形成骨疾患、代謝性骨疾患及び歯周疾患からなる群から選ばれるものであってよく、例えば、骨多孔症でよいが、これに限定されるものではない。

前記培養液は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を培養し、菌株を除去して得られた培養上清液、その濃縮物、その分画物又はその凍結乾燥物であってよい。

前記培養液は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を１２時間～３０時間、１２時間～２４時間、１８時間～３０時間又は１８時間～２４時間、例えば、２２時間～２６時間培養して得たものでよいが、これに限定されない。培養時間は、２４時間を基点にし、それ以上培養することが、培養時間依存的に破骨細胞分化抑制活性に対して顕著な相乗効果を示すわけではない。

前記ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の培養のためにはアルファＭＥＭ培地を用いることができる。

具体的に、ＢＭＥ（ＢａｓａｌＭｅｄｉａＥａｇｌｅ）培地は、細胞成長に必要な必須栄養分及び無機塩類とビタミン類に対する研究の結果から得られたもので、現在広く使用されているＭＥＭとＤＭＥＭの基本組成となる培地であり、ＭＥＭ（ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉａＥａｇｌｅ）培地は、ＢＭＥに比べてアミノ酸の濃度がより高く、ＣＯ_２／ＮａＨＣＯ_３の緩衝作用のためにアール塩（Ｅａｒｌｅ’ｓｓａｌｔｓ）を含んでいる。細胞種類によって、非必須アミノ酸がさらに添加された培地とアール塩の代わりにハンク塩（Ｈａｎｋ’ｓｓａｌｔｓ）が含まれた培地を使用することもできる。アルファＭＥＭ（ＭＥＭ，Ａｌｐｈａｍｏｄｉｆｉｃｉａｔｉｏｎ）は、アミノ酸、ビタミンなどがさらに添加されており、動物細胞のＤＮＡ形質転換に有用である。

前記組成物は、培養液を５０～４００、５０～３５０、５０～３００、５０～２５０、１００～４００、１００～３５０、１００～３００、１００～２５０、１５０～４００、１５０～３５０、１５０～３００、１５０～２５０、１８０～４００、１８０～３５０又は１８０～３００ｕｌ／ｍｌ、例えば、１８０～２５０ｕｌ／ｍｌの濃度で含むことができるが、これに限定されるものではない。

前記培養液は、ｐＨ６．５～８．５、６．５～８．０、６．５～７．５、７．０～８．５又は７．０～８．０、例えば、ｐＨ７．０～７．５であってよいが、これに限定されない。

培養液では乳酸菌が育ちながら乳酸などの代謝体を生産して酸性化されることがあるが、これは、細胞培養に適切でないｐＨ範囲に該当する。このような点に基づき、細胞培養において最適のｐＨ値は７．４である。

前記骨疾患の予防及び治療は、破骨細胞分化の抑制によって達成されてよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株又はその培養液を含む、代謝性疾患予防又は治療用薬学的組成物である。

前記代謝性疾患は、肥満、糖尿、高血圧、高脂血症、心血管疾患及び高インスリン血症からなる群から選ばれる１種以上でよい。

前記薬学的組成物は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株が５×１０^５～５×１０^１２ＣＦＵ／ｍｌ、５×１０^６～５×１０^１１ＣＦＵ／ｍｌ又は５×１０^７～５×１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ、例えば、５×１０^８～５×１０^９ＣＦＵ／ｍｌの濃度であってよいが、これに限定されない。

前記培養液は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を１２時間～３０時間、１２時間～２４時間、１８時間～３０時間又は１８時間～２４時間、例えば、２２時間～２６時間培養して得たものでよいが、これに限定されない。培養時間は２４時間を基点にし、それ以上培養することが、培養時間依存的に体重増加抑制又は血糖数値減少の効果に対して顕著な相乗効果を示すわけではない。

培養液では乳酸菌が育ちながら乳酸などの代謝体を生産して酸性化されることがあるが、これは細胞培養に適切でないｐＨ範囲に該当する。このような点に基づき、細胞培養において最適のｐＨ値は７．４である。

本発明の薬学的組成物は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液の薬学的有効量及び／又は薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物として用いられてよい。

本明細書において用語“薬学的有効量”は、上述したラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液の効能又は活性を達成するのに十分な量を意味する。

本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。本発明の薬学的組成物は、これらの成分の他にも、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。

本発明に係る薬学的組成物は、ヒトを含む哺乳動物に様々な経路で投与されてよい。投与方式は、一般に用いられるいずれの方式であってもよく、例えば、経口、皮膚、静脈、筋肉、皮下などの経路で投与されてよく、好ましくは、経口で投与されてよい。

本発明の薬学的組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。

本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造されてもよく又は多回容量容器内に内入させて製造されてもよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又はゲル（例えば、ハイドロゲル）の形態であってよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

本発明のさらに他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株又はその培養液を含む骨疾患改善用食品組成物である。

前記骨疾患は、骨多孔症、骨転移癌、骨軟化症、佝僂病、線維性骨炎、無形成骨疾患、代謝性骨疾患及び歯周疾患からなる群から選ばれるものでよく、例えば、骨多孔症であってよいが、これに限定されない。

前記培養液は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を１２時間～３６時間、１２時間～３０時間、１２時間～２４時間、１８時間～３６時間、１８時間～３０時間又は１８時間～２４時間、例えば、２２時間～２６時間培養して得たものでよいが、これに限定されない。

前記組成物は、培養液を２０～４００、２０～３５０、２０～３００、２０～２５０、５０～４００、５０～３５０、５０～３００、５０～２５０、１００～４００、１００～３５０、１００～３００、１００～２５０、１５０～４００、１５０～３５０、１５０～３００、１５０～２５０、１８０～４００、１８０～３５０又は１８０～３００ｕｌ／ｍｌ、例えば、１８０～２５０ｕｌ／ｍｌの濃度で含むものでよいが、これに限定されない。

前記骨疾患改善は、破骨細胞分化抑制によって達成されてよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株又はその培養液を含む代謝性疾患改善用健康機能食品組成物である。

前記代謝性疾患は、肥満、糖尿、高血圧、高脂血症、心血管疾患及び高インスリン血症からなる群から選ばれる１種以上であってよい。

前記健康機能食品組成物は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株が５×１０^５～５×１０^１２ＣＦＵ／ｍｌ、５×１０^６～５×１０^１１ＣＦＵ／ｍｌ又は５×１０^７～５×１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ、例えば、５×１０^８～５×１０^９ＣＦＵ／ｍｌの濃度であってよいが、これに限定されない。

本発明の食品組成物を食品添加物として使用する場合、前記食品組成物をそのまま添加したり或いは他の食品又は食品成分と共に使用されてよく、通常の方法によって適宜使用され得る。一般に、食品又は飲料の製造時に、本発明の食品組成物は原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加されてよい。

前記食品の種類に特に制限はない。前記物質を添加できる食品の例には、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常の意味の食品をいずれも含む。

前記飲料は、種々の香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有できる。上述した天然炭水化物は、葡萄糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのような天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、当業者の選択によって適宜決定されてよい。

上記の他にも、本発明の食品組成物は、種々の栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有できる。その他に、本発明の食品組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有できる。このような成分は独立して又は組み合わせて使用することができる。このような添加剤の比率も、当業者によって適宜選択されてよい。

本発明は、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託された、骨疾患又は代謝性疾患改善、予防又は治療活性を有するラクトバチルスサケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）ＣＶＬ－００１菌株に関する。

以下、本発明を、下記の実施例によってより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。

本明細書全体に通じて、特定物質の濃度を表すために用いられる“％”は、特に断りのない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。

実施例１．菌株の分離
韓国全域から作り立ての白菜キムチを収集し、収集されたキムチは６±０．５℃で０週から５週まで保存しながら乳酸菌分離のためのキムチ試料として使用した。前記キムチ５００ｇをハンドブレンダー（ｈａｎｄｂｌｅｎｄｅｒ，ＨａｎｉｌＣｏ，Ｋｏｒｅａ）で摩砕し、これを滅菌ガーゼで濾過したキムチ液に滅菌水を追加し、１０^１倍～１０^７倍の倍率に順次希釈した。最終的には１０^７倍に希釈されたキムチ液塗抹培地を分離した。

希釈したキムチ液を、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３）が２％添加されているＭＲＳ（ＤｉｆｃｏＣｏ．，Ｆｒａｎｃｅ）培地に塗抹し、３０℃で４８時間培養した後、透明環を形成した菌株を分離した。前記分離された菌株に対してグラム染色（Ｇｒａｍｓｔｒａｉｎｋｉｔ，ＢＤＣｏ．，ＵＳＡ）とカタラーゼテスト（ＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘＣｏ．，Ｆｒａｎｃｅ）を行い、グラム陽性であり且つカタラーゼ陰性である集落を乳酸菌として暫定的に確認した。

前記分離された乳酸菌株は、ＭＲＳ液体培地に接種した後、３０℃で２４時間培養し、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を２５％（ｖ／ｖ）となるように添加してグリセロールストック（ｓｔｏｃｋ）を作り、－７０℃で保管しつつ使用した。

実施例２：乳酸菌株の同定
最終選ばれた乳酸菌ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）は、１６ＳｒＲＮＡ塩基配列分析によって同定を行った。分離菌株は、純粋分離した後、ＭＲＳプレート（ｐｌａｔｅ）状態で冷蔵宅配便を用いてソルゼント社（デジョン所在）に依頼し、２７Ｆ（５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’）と１４９２Ｒ（５’－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’）のユニバーサルプライマーセット（ｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒｓｅｔ）を用いて１６ＳｒＲＮＡ塩基配列分析を行った。

前記分離菌株ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１の１６ＳｒＲＮＡコーディング塩基配列として合計１，４３９ｂｐの塩基配列を決定し、その結果を表１に示した。

前記行った塩基配列に基づき、塩基配列の相同性検査は、登録された情報（ＧｅｎｅＢａｎｋｄａｔａｂａｓｅ）を対象にブラストプログラム（Ｂｌａｓｔｐｒｏｇｒａｍ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｈｉ．ｇｏｖ）によって実行した。その結果、ラクトバチルスサケイＬＺ２１７（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉＬＺ２１７）と９９％の相同性を示し、ラクトバチルスサケイＬＺ２１７と最終同定した。

上記の結果、すなわち、形態学的特性、糖代謝能及び１６ＳｒＲＮＡ塩基配列分析の結果、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）生成能及びキムチ液内生存率（優点率）に優れたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株は、ラクトバチルスサケイＬＺ２１７として同定された。

その結果、分離菌株をラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１と命名し、韓国生命工学研究院生物資源センター（大韓民国チョルラプク－ト、チョンウブ－シ、シンジョン－ドン８２３）に寄託した。

実施例３：ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液の製造
細胞に処理するための培養液を製造するために、アルファＭＥＭ培地にラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１を２４時間培養し、遠心分離後に上清液を分離してｐＨ７．４に調整した。

実施例４：ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液の破骨細胞分化に対する抑制評価
マウス大食細胞を１２ウェルプレート（ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に２×１０^５／ウェルの密度で２４時間培養し、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ；以下、ＦＢＳ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ；以下、ＰＳ）、大食細胞コロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ；以下、Ｍ－ＣＳＦ）添加の培地に交替した後、培養液（５０，１００，２００ｕｌ／ｍｌ）を２時間処理した。その後、ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａ－Β ｌｉｇａｎｄ）を１００ｎｇ／ｍｌ処理して２４時間反応させ、上のような方法で６日間分化させた。

その後、破骨細胞の細胞化学的標識酵素である酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ（Ｔａｒｔｒａｔｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；以下、ＴＲＡＰ）に発色性基質を添加して核を染色し、核が３個以上に多核化した細胞を観察しイメージ化させた。

大食細胞にＲＡＮＫＬを処理すれば、ＲＡＮＫに結合し、ＴＲＡＰ陽性細胞に分化する。ＴＲＡＰ陽性細胞をＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ－αのような炎症因子で刺激すれば細胞同士が融合し、多核型ＴＲＡＰ陽性細胞に分化する。

図１ａ、図１ｂ及び表２から確認できるように、大食細胞にＲＡＮＫＬを処理した時に破骨細胞への分化が増加し、培養液処理によって破骨細胞の数が顕著に濃度依存的に減少したことを確認した。このことから、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１培養液が破骨細胞への分化を抑制させることが確認できた。

実施例５：ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液の破骨細胞分化誘導タンパク質発現に対する抑制評価
マウス大食細胞にＲＡＮＫＬ及び培養液を処理したとき、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ）及びＮＦ－κＢ信号機序を確認しようとした。マウス大食細胞を１２ウェルプレートに４×１０^５／ウェルの密度で２４時間培養した。ＦＢＳ、１％ＰＳ、Ｍ－ＣＳＦ添加の培地に交替し後、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株培養液（１００ｕｌ／ｍｌ）を２時間処理した。その後、ＲＡＮＫＬを１００ｎｇ／ｍｌ処理し、０分、５分、１５分及び３０分間反応させた。

培地を除去し、タンパク質溶解バッファ（Ｐｒｏｔｅｉｎｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）を用いてタンパク質を抽出した後に定量し、３０ｕｇのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ｇｅｌ）で分離した。タンパク質をメンブレイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移した後、１次、２次抗体（ｐ－ｊｎｋ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，＃９２５１Ｓ）、ｐ－ｐ３８（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９２１１Ｓ）、ｐ－ＥＲＫ（ｓａｎｔａｃｒｕｚ，ｓｃ－７３８３）、Ｉｋｂａｌｐｈａ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９２４２Ｓ）、ｐ－ｐ６５（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０３１Ｓ））を順次に処理し、キット（ＢＩＯ－ＲＡＤ，ＥＣＬｓｏｌｕｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ）で発現すると機械（Ｃｈｅｍｉｄｏｃ）で測定した。

ＲＡＮＫＬは、ＲＡＮＫに結合してＴＲＡＦ６を通じてＭＡＰＫ及びＮＦ－κＢタンパク質発現を増加させ、種々の転写因子の増加を誘導することにより、破骨細胞の分化を促進させる。したがって、これらの機序に対してラクトバチルスサケイ培養液が破骨細胞分化を抑制させるかどうかを確認するために、ＭＡＰＫタンパク質であるＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）をウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）で確認した。

その結果、ＲＡＮＫＬの処理によって５分目及び１５分目にＭＡＰＫタンパク質のリン酸化が増加し、培養液処理によってＪＮＫ、Ｐ３８及びＥＲＫのリン酸化が減少したことを確認した。また、ＩｋＢアルファ（ａｌｐｈａ）の分解は抑制され、ｐ６５のリン酸化も抑制された。

図２から確認できるように、ラクトバチルスサケイ培養液は、ＪＮＫ、Ｐ３８及びＥＲＫのリン酸化を抑制することによって破骨細胞への分化を抑制するということが確認された。

実施例６：ラクトバチルスサケイ培養液の破骨細胞分化誘導遺伝子発現に対する抑制評価
ラクトバチルスサケイ培養液をマウス大食細胞に処理し、破骨細胞分化機序関連遺伝子であるＴＲＡＰ、ＤＣ－ＳＴＡＭＰ、カテプシンＫ、ＮＦＡＴｃ１に対する遺伝子発現（ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を実時間（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲで確認した。骨髄由来大食細胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ；以下、ＢＭＤＭｓ）を、１２ウェルプレートに１×１０^５／ウェルの密度で２４時間培養した。無ＦＢＳの１％ＰＳのみ添加された培地を１時間処理した後、ラクトバチルスサケイ培養液１００ｕｌ／ｍｌを２時間処理した。その後、ＲＡＮＫＬを処理して２４時間反応させた。上のような方法で３日間分化させた後、トリゾール（ＴＲＩｚｏｌ）溶液を用いて細胞内ＲＮＡを分離し、ＲＮＡ定量値に基づいてＲＴプレミックス（ｐｒｅｍｉｘ）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡは、プライマーを用いて実時間ＰＣＲで増幅させた。

使用されたプライマーは、マウスＴＲＡＰ、ＤＣ－ＳＴＡＭＰ、カテプシンＫ、ＮＦＡＴｃ１であり、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）遺伝子であるＧＡＰＤＨと比較して相対的な量を比較した。

大食細胞にＲＡＮＫＬを処理すればＲＡＮＫに結合し、ＴＲＡＰ陽性である多核化した破骨細胞に分化する。また、破骨細胞に分化する上で重要な転写因子であるＮＦＡＴｃ１を活性化させ、破骨細胞分化機序（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与するＴＲＡＰ、カテプシンＫ、ＤＣ－ＳＴＡＭＰの発現を増加させる。

図３及び表３から確認できるように、ＲＡＮＫＬ処理によって増加したＴＲＡＰ、ＤＣ－ＳＴＡＭＰ、カテプシンＫ、ＮＦＡＴｃ１の発現が、ラクトバチルスサケイ培養液処理によって減少することを確認した。このことから、転写因子であるＮＦＡＴｃ１の活性を減少させ、これによって破骨細胞分化機序関連遺伝子であるＴＲＡＰ、ＤＣ－ＳＴＡＭＰ、カテプシンＫの発現が減少し、破骨細胞への分化を抑制させることが確認できた。

実施例７：マウスの卵巣摘出手術を用いた骨多孔症動物モデル誘導
マウスＣ５７ＢＬ／６雌（７週齢）を使用し、２２±２℃及び相対湿度５０±１０％、１２時間明暗周期に設定された環境でプラスチックケージに飼育した。マウスの卵巣切除前に同一環境で約１週程度、飼育条件に適応させた。

ｚｏｌｅｔｉｌ（登録商標）とｌｕｍｐｕｎ（登録商標）を筋肉注射して麻酔した後、卵巣手術部位を除毛し消毒した。１ｃｍ程度の皮膚を切開し、他の臓器に損傷が加えられないように注意し、子宮に沿って卵巣を確認して縫合用の糸で卵巣を結紮した後、両側の卵巣を全て切除した。卵巣切除後に各臓器を腹腔内に再位置させた後、縫合用糸で縫合した。１０日以後から８週間治療物質を投与した。

乳酸菌投与群の製造：ラクトバチルスサケイは前培養及び本培養させた後、１×１０^７、１×１０^８及び１×１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍｌで計算して経口投与した。

培養液投与群の製造：ラクトバチルスサケイは、前培養及び本培養させた後、１×１０^７、１×１０^８及び１×１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍｌで計算した。そして、ＭＲＳ培地に１０倍希釈して２４時間３０℃で培養した。その後、遠心分離機を用いて菌を沈めた後、培養液である上清液を収集してｐＨ７．４にし、２００ｕｌ経口投与した。

実験群は、下記のように設定した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス；８０匹
（１）卵巣非切除対照群（ｓｈａｍ）、１０匹、ＭＲＳ培地（対照群）投与
（２）卵巣非切除対照群、１０匹、培養液投与
（３）卵巣非切除対照群、１０匹、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）１×１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍｌ投与
（４）卵巣切除実験群（ＯＶＸ）、１０匹、ＭＲＳ培地投与
（５）卵巣切除実験群、１０匹、培養液（１／４希釈）投与
（６）卵巣切除実験群、１０匹、培養液（１／２希釈）投与
（７）卵巣切除実験群、１０匹、培養液（原液）投与
（８）卵巣切除実験群、１０匹、乳酸菌１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ投与
（９）卵巣切除実験群、１０匹、乳酸菌１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ投与
（１０）卵巣切除実験群、１０匹、乳酸菌１×１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍｌ投与

実施例８：ラクトバチルスサケイ乳酸菌及びその培養液投与に対する骨多孔症誘導マウスの骨密度評価
骨密度測定は、以前の単純放射線写真撮影法やコンピュータ断層撮影法に比べて高解像度の映像資料を提供するマイクロＣＴ（ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｄｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）を利用した。

実験終了後にマウスの脚をホルマリンに固定させた後、テグキョブク先端医療産業振興財団実験動物センターに骨密度分析を依頼した。

卵巣切除されたマウスは、エストロゲン欠乏によって骨密度が減少することが知られている。このため、卵巣切除されたマウス動物モデルは骨多孔症疾患研究に多く用いられている。

図４及び表４から確認できるように、卵巣切除されたマウスグループ（Ｇ４）は、Ｓｈａｍ群に比べて有意に骨密度が減少することが観察された。一方、ラクトバチルスサケイ菌株とその培養液は、濃度依存的に骨密度を増加させることが見られた。特に、培養液原液を投与したグループ（Ｇ７）と高い濃度の菌を投与したグループ（Ｇ１０）において、卵巣を非切除したＳｈａｍ群の骨密度レベルに回復させることが確認された。

実施例９：キムチから分離されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１培養液を用いた脂肪細胞分化抑制効果に対する実験（ｉｎｖｉｔｒｏ）
９－１．ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１培養液の製造
ラクトバチルスサケイ（Ｌａｃｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）ＣＶＬ－００１培養液を製造するために、ＤＭＥＭ培地にラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株１×１０^８ＣＦＵ／ｍｌを２４時間培養し、遠心分離後に上清液を分離し、ｐＨ７．４に調整した。

９－２．未分化した脂肪前駆細胞株３Ｔ３－Ｌ１を用いた脂肪分化
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎｔｙｐｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＵＳＡ）から購入した３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｃｅｌｌ）を、ＤＭＥＭ培地に１０％仔ウシ血清（Ｂｏｖｉｎｅｃａｌｆｓｅｒｕｍ；ＢＣＳ）及び１％ＰＳを添加して継代培養して維持した。プレート（ｐｌａｔｅ）に接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、密度が１００％になった時を－２ｄａｙと指定し、２日間さらに培養しながら培養されたプレート内の全細胞がＧ１細胞周期停止（ａｒｒｅｓｔ）状態になるようにした。

０ｄａｙからＩＢＭＸ（３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ，ＭＤＩ）を添加して分化を始めた。２ｄａｙには、インスリンのみ含まれた培地に交替した。４ｄａｙからは１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）が入っている培地に２日間隔で交替し、分化するまで培養した。

９－３．ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１培養液の脂肪細胞分化に対する抑制評価（ＯｉｌｒｅｄＯｓｔａｉｎｉｎｇ）
脂肪細胞分化は、培地構成成分を仔ウシ血清（Ｂｏｖｉｎｅｃａｌｆｓｅｒｕｍ；ＢＣＳ）ではなくＦＢＳに交替した時から誘導される。３Ｔ３－Ｌ１細胞は、１２ウェルプレート（ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で１０％ＦＢＳ、１％ＰＳが添加された培地と共に接種した。１００％の密度に細胞が育った地点で２日後、０ｄａｙに培養液（１２．５％、２５．０％及び５０．０％）を２時間処理し、脂肪細胞分化誘導物質ＭＤＩを処理した。

培養液は、１×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ濃度のＬ．ｓａｋｅｉをＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ）＋ＦＢＳ（１０％）＋ＰＳ（１％）培地（ｍｅｄｉａ）に２４時間培養して製造し、培養液希釈はＤＭＥＭ培地を用いて行った。

２ｄａｙには、培地を交替しながら培養液（１２．５％、２５．０％及び５０．０％）を２時間処理した後、インスリンを処理した。４ｄａｙには、培地を交替しながら培養液（１２．５％、２５．０％及び５０．０％）を処理した。２日間隔で、分化するまで同一過程を反復した。

分化した脂肪細胞が観察されると、染色のために４％ホルマリンに交替し、１０分間細胞を固定させた。Ｄ．Ｗで２回洗浄し、オイルレッドＯ（ＯｉｌｒｅｄＯ）染色試薬とＤ．Ｗを６：４に混合して入れた後、脂肪細胞を３０分間染色した。Ｄ．Ｗで洗浄後に顕微鏡で観察した後、１００％イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を処理してオイルレッドＯを抽出し、５１０ｎｍの吸光度で測定して分化程度を定量的に分析した。

図５及び表５から確認できるように、３Ｔ３－Ｌ１細胞成長培地にＭＤＩを添加すると、脂肪細胞に分化する。本研究結果では、３Ｔ３－Ｌ１細胞にＭＤＩを処理したときに脂肪細胞への分化が増加し、培養液処理によって濃度依存的に脂肪細胞の数が顕著に減少したことを確認した。

このことから、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１培養液は、脂肪細胞への分化を抑制させることが確認できた。

実施例１０：肥満改善効果の確認のための肥満マウス動物モデルの製造（ｉｎｖｉｖｏ）
１０－１．ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１生菌の製造
マウスに処理するための生菌を製造した。具体的に、固体培地（ＭＲＳａｇａｒ）に２４時間３０℃で培養した後に単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅｃｏｌｏｎｙ）を採取し、液体培地（ＭＲＳｂｒｏｔｈ）で前培養を行った。前培養は５ｍｌ培地（ｍｅｄｉａ）に１５０ｒｐｍ、３０℃条件で２４時間行い、その後、１０倍に希釈して同一条件で３時間本培養を行った。

菌数を合わせるために、吸光度６００ｎｍでＯ．Ｄ値０．６が出るように分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いてＰＢＳに濃度を合わせた。これは、乳酸菌がこの条件で０．８９×１０^９ＣＦＵ／ｍｌだけ存在することを意味する。マウス個体ごとに２００ｕｌずつ（１×１０^８ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ、１×１０^９ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ）投与することを考慮し、３，０００ＲＰＭ、１５分条件で遠心分離を行って生菌培地（ｍｅｄｉａ）を製造した。

１０－２．ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１培養液の製造
本培養が完了したラクトバチルスサケイが入っているＭＲＳ培地を１０倍希釈し、１５０ｒｐｍ、３０℃条件で２４時間培養した。その後、３，０００ＲＰＭ、１５分条件で遠心分離を行って上清液を分離し、ｐＨ７．４に調整した。０．４５ｕｍ膜濾過紙（ｍｅｍｂｒａｎｅｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒ）で濾過した後、４℃で保管した。

１０－３．ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株及び培養液に対する抗肥満実験（ｉｎｖｉｖｏ）
７週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスに生菌（１日単回２００ｕｌ／個体）、培養液（１日単回２００ｕｌ／個体）及び高脂肪食餌（ＨｉｇｈＦａｔｄｉｅｔ）を投与した。その後、２週間隔で体重を測定した。１１週目に血糖検査を行い、１４週目に解剖検査して血液を採取し、臓器の重さを測定した。

菌株利用実験に用いられたグループの情報は、次の通りである。
Ｇ１：対照群（ＣｏｎｔｒｏｌＧｒｏｕｐ、標準食餌（Ｎｏｒｍａｌｄｉｅｔ）給与）ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）経口投与（ｎ＝６）
Ｇ２：対照群Ｌ．ｓａｋｅｉ１０^９経口投与（ｎ＝６）
Ｇ３：高脂肪群（ＨｉｇｈＦａｔＧｒｏｕｐ、高脂肪食餌給与）ＰＢＳ経口投与（ｎ＝８）
Ｇ４：高脂肪群Ｌ．ｓａｋｅｉ１０^８経口投与（ｎ＝８）
Ｇ５：高脂肪群Ｌ．ｓａｋｅｉ１０^９経口投与（ｎ＝８）

培養液利用実験に用いられたグループの情報は、次の通りである。
Ｇ１：対照群（標準食餌給与）ＭＲＳ経口投与（ｎ＝６）
Ｇ２：対照群培養液（原液）経口投与（ｎ＝６）
Ｇ３：高脂肪群（高脂肪食餌給与）ＭＲＳ経口投与（ｎ＝８）
Ｇ４：高脂肪群培養液（１／２希釈）経口投与（ｎ＝８）
Ｇ５：高脂肪群培養液（原液）経口投与（ｎ＝８）

実施例１１：キムチから分離されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株とその培養液を用いた効果に対する実験（ｉｎｖｉｖｏ）
１１－１．ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株又は培養液による体重変化の確認（ｉｎｖｉｖｏ）
６０％の脂肪で構成された高脂肪食餌をマウスに経口投与すると、標準食餌を食べさせたマウスに比べて体重が増加することが知られている。このため、高脂肪食餌で誘導した肥満マウス動物モデルは肥満疾患研究に多く利用されている。

図６から確認できるように、高脂肪食餌を食べさせたグループ（Ｇ３）において、標準食餌を食べさせたグループ（Ｇ１）に比べて有意に体重が増加することが観察された。特に、高脂肪食餌と共にラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を１０^８と１０^９の数で食べさせたグループ（Ｇ４及びＧ５）において、Ｇ３に比べて有意に体重が減少していることが見られた。

図７及び表６から確認できるように、副睾丸脂肪重さも、高脂肪食餌を食べさせたＧ３が標準食餌グループＧ１に比べて有意に増加しており、高脂肪食餌と共に菌株１０^９を食べさせたグループＧ５の副睾丸脂肪の重さが有意に減少していることを確認した。図８から確認できるように、高脂肪食餌を食べさせたグループ（Ｇ３）において標準食餌を食べさせたグループ（Ｇ１）に比べて有意に体重が増加することが観察された。特に、高脂肪食餌と共にラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１培養液原液（Ｇ５）を食べさせたグループにおいて、Ｇ３に比べて有意に体重が減少していることが見られた。一方、培養液の１／２を投与したグループ（Ｇ４）では、高脂肪食餌で誘導した体重増加を抑制させないことが観察された。

図９及び表７から確認できるように、副睾丸脂肪重さも、高脂肪食餌を食べさせたＧ３が標準食餌グループＧ１に比べて有意に増加しており、高脂肪食餌と共に培養液原液を食べさせたグループＧ５の副睾丸脂肪の重さが有意に減少していることを確認した。

１１－２．ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株と培養液投与に対する肥満誘導マウスの空腹時の血糖評価（ＦａｓｔｉｎｇＢｌｏｏｄＳｕｇａｒＴｅｓｔ）
マウスは、実験前日の午後９時から実験当日の午前９時まで１２時間にわたって空腹維持後に血糖検査を行った。高脂肪食餌を食べさせたマウス動物モデルは、空腹時の血糖が非常に高く維持されることが知られている。実験群別条件は、前記２－３と同じ条件で行い、菌株を投与した群と培養液を投与した群をそれぞれ表８及び表９に示した。

表８から確認できるように、本実施例で高脂肪食餌を食べさせたＧ３グループは、標準食餌を食べさせたグループＧ１に比べて空腹時の血糖数値が非常に高く維持されていることが観察された。特に、高脂肪食餌と共に、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株濃度を異ならせて投与したＧ４とＧ５グループにおいて、Ｇ３に比べて血糖数値が減少し、標準食餌餌グループＧ１と類似なレベルとして観察された。

表９から確認できるように、本実施例において高脂肪食餌を食べさせたＧ３グループは、標準食餌を食べさせたグループＧ１に比べて空腹時の血糖数値が非常に高く維持されていることが観察された。特に、高脂肪食餌と共にラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１培養液原液を投与したＧ５グループにおいて、Ｇ３に比べて血糖数値が減少する傾向を示し、標準食餌を食べさせたグループＧ１と類似のレベルとして観察された。

１１－３．ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株と培養液投与に対する肥満誘導マウスの糖負荷検査（ＧｌｕｃｏｓｅＴｏｌｅｒａｎｃｅＴｅｓｔ）
実験群別条件は、前記１０－３と同じ条件で行うが、マウスは実験前日の午後９時から実験当日の午前９時まで１２時間にわたって空腹維持後に次の検査を行った。０．２ｕｍ濾過装置（ｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）で滅菌させた１０％グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）を含有するＰＢＳ溶液を準備し、各個体ごとに２ｍｇ（ｇｌｕｃｏｓｅ／ｇ．ｖｏｌｕｍｅ（ｕｌ）＝体重（ｇ）×２０）ずつ腹腔投与（２７－ｇａｕｇｅｓｔｅｒｉｌｅｎｅｅｄｌｅ）した。マウスをケージに再び入れて血糖数値を０分、３０分、６０分、９０分及び１２０分間隔で測定した。血糖検査は、尾から採血して行い、表１０、表１１、図１０及び図１１に示した。

表１０及び図１０から確認できるように、高脂肪食餌を食べさせたグループ（Ｇ３）において、標準食餌を食べさせたグループ（Ｇ１）に比べて有意に血糖が高く維持されたことが観察された。特に、高脂肪食餌と共にラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１培養液原液（Ｇ５）を食べさせたグループにおいて、Ｇ３に比べて３０分から有意に血糖が減少していることが見られた。一方、培養液の１／２を投与したグループ（Ｇ４）では、高脂肪食餌で誘導した血糖増加を抑制させないことが観察された。

表１１及び図１１から確認できるように、高脂肪食餌を食べさせたグループ（Ｇ３）において標準食餌を食べさせたグループ（Ｇ１）に比べて有意に血糖が高く維持されることが観察された。特に、高脂肪食餌と共にラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を１０^８と１０^９の数で食べさせたグループ（Ｇ４及びＧ５）において、Ｇ３に比べて血糖が減少していることが観察されたが、有意の差は見られなかった。

１１－４．ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株と培養液投与に対する肥満誘導マウスのインスリン負荷検査（ＩｎｓｕｌｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅＴｅｓｔ）
実験群別条件は前記１０－３と同じ条件で行うが、マウスは、実験当日の午前９時から午後１時まで４時間にわたって空腹維持後に次の検査を行った。２ｍｇ／ｍｌインスリン（ＨＣｌを希釈してｐＨ３にしたＤ．Ｗ溶液）を準備し、各個体ごとに１Ｕ（０．０３８４６ｍｇ／ｋｇ．Ｖｏｌｕｍｅ（ｕｌ）＝体重（ｇ）×２０）ずつ腹腔投与（２７－ｇａｕｇｅｓｔｅｒｉｌｅｎｅｅｄｌｅ）した。マウスをケージに再び入れ、血糖数値を０分、３０分、６０分、９０分及び１２０分間隔で測定した。血糖検査は、尾から採血して行った。

表１２及び図１２から確認できるように、高脂肪食餌を食べさせたグループ（Ｇ３）において、標準食餌を食べさせたグループ（Ｇ１）に比べて有意に血糖が高く維持されたことが観察された。特に、高脂肪食餌と共にラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１培養液原液（Ｇ５）を食べさせたグループにおいて、Ｇ３に比べて９０分及び１２０分から有意に血糖が減少されていることが見られた。一方、培養液の１／２を投与したグループ（Ｇ４）ではＧ３に比べて１２０分から有意に血糖が減少されていることが見られた。

表１３及び図１３から確認できるように、高脂肪食餌を食べさせたグループ（Ｇ３）において、標準食餌を食べさせたグループ（Ｇ１）に比べて有意に血糖が高く維持されることが観察された。特に、高脂肪食餌と共にラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を１０^８と１０^９の数で食べさせたグループ（Ｇ４及びＧ５）においてＧ３に比べて血糖が０分以外の全時間帯で有意に減少していることが見られた。

また、本発明は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株又はその培養液を含む、骨疾患改善、予防又は治療用組成物に関し、より詳細には、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託された新規なラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株又はその培養液を含む組成物の骨疾患改善、予防又は治療効果に関する。

１１－２．ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株と培養液投与に対する肥満誘導マウスの空腹時の血糖評価（ＦａｓｔｉｎｇＢｌｏｏｄＳｕｇａｒＴｅｓｔ）
マウスは、実験前日の午後９時から実験当日の午前９時まで１２時間にわたって空腹維持後に血糖検査を行った。高脂肪食餌を食べさせたマウス動物モデルは、空腹時の血糖が非常に高く維持されることが知られている。実験群別条件は、前記１０－３と同じ条件で行い、菌株を投与した群と培養液を投与した群をそれぞれ表８及び表９に示した。

Claims

受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）ＣＶＬ－００１菌株。
前記菌株は、配列番号１で表示される１６ＳｒＲＮＡ配列を有する、請求項１に記載のラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株。
受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）ＣＶＬ－００１菌株の培養液。
前記菌株は、配列番号１で表示される１６ＳｒＲＮＡ配列を有する、請求項３に記載のラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の培養液。
キムチ抽出物を培養する培養段階を含む、受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）ＣＶＬ－００１菌株の分離方法。
前記キムチ抽出物は、キムチを摩砕して濾過したキムチ摩砕液である、請求項５に記載のラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の分離方法。
前記培養段階は、キムチ抽出物を培養する第１培養段階；及び、前記第１培養段階で分離した菌株を培養する第２培養段階を含む、請求項５に記載のラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の分離方法。
前記第１培養段階は、炭酸カルシウムが添加された培地で行われる、請求項７に記載のラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の分離方法。
前記第１培養段階は、２０℃～３２℃で３６時間～６０時間行われる、請求項７に記載のラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の分離方法。
前記第２培養段階は、分離された菌株のうちグラム陽性であるものを選別して培養する段階である、請求項７に記載のラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の分離方法。
前記第２培養段階は、分離された菌株のうちカタラーゼ陰性であるものを選別して培養する段階である、請求項７に記載のラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の分離方法。
前記第２培養段階は、２０℃～３２℃で１２時間～３６時間行われる、請求項７に記載のラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株の分離方法。
受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）ＣＶＬ－００１菌株又はその培養液を含む骨疾患又は代謝性疾患予防又は治療用薬学的組成物。
前記骨疾患は、骨多孔症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、骨転移癌（ｂｏｎｅｍｅｔａｓｔａｔｉｃｃａｎｃｅｒ）、骨軟化症（ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ）、佝僂病、線維性骨炎、無形成骨疾患、代謝性骨疾患及び歯周疾患からなる群から選ばれるものである、請求項１３に記載の薬学的組成物。
前記代謝性疾患は、肥満、糖尿、高血圧、高脂血症、心血管疾患及び高インスリン血症からなる群から選ばれる１種以上である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
前記培養液は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を培養し、菌株を除去して得られた培養上清液、その濃縮物、その分画物又はその凍結乾燥物である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を５×１０^５～５×１０^１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で含む、請求項１３に記載の薬学的組成物。
前記培養液は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を１２時間～３０時間培養して得たものである、請求項１３に記載の薬学的組成物。
前記組成物は、培養液を５０～４００ｕｌ／ｍｌの濃度で含む、請求項１３に記載の薬学的組成物。
前記培養液は、ｐＨ６．５～８．５である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
受託番号ＫＣＴＣ１３８１６ＢＰとして寄託されたラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）菌株又はその培養液を含む骨疾患又は代謝性疾患改善用食品組成物。
前記骨疾患は、骨多孔症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、骨転移癌（ｂｏｎｅｍｅｔａｓｔａｔｉｃｃａｎｃｅｒ）、骨軟化症（ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ）、佝僂病、線維性骨炎、無形成骨疾患、代謝性骨疾患及び歯周疾患からなる群から選ばれるものである、請求項２１に記載の食品組成物。
前記代謝性疾患は、肥満、糖尿、高血圧、高脂血症、心血管疾患及び高インスリン血症からなる群から選ばれる１種以上である、請求項２１に記載の食品組成物。
前記培養液は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を培養し、菌株を除去して得られた培養上清液、その濃縮物、その分画物又はその凍結乾燥物である、請求項２１に記載の食品組成物。
前記培養液は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を１２時間～３０時間培養して得たものである、請求項２１に記載の食品組成物。
前記食品組成物は、ラクトバチルスサケイＣＶＬ－００１菌株を５×１０^５～５×１０^１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で含む、請求項２１に記載の食品組成物。
前記組成物は、培養液を５０～４００ｕｌ／ｍｌの濃度で含む、請求項２１に記載の食品組成物。
前記培養液はｐＨ６．５～８．５である、請求項２１に記載の食品組成物。