JP2022521905A - ペントース糖およびヘキソース糖のための分解経路 - Google Patents

ペントース糖およびヘキソース糖のための分解経路 Download PDF

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Abstract

本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖からの、モノエチレングリコール（MEG）またはグリコール酸（GA）、またはMEGおよび1つもしくは複数の同時生成物の生合成において有用な組換え微生物に関する。組換え微生物を使用して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、MEG（またはGA）、またはMEG（またはGA）および1つもしくは複数の同時生成物を生成する方法も提供され、組換え微生物、ならびに/または生成物MEG（またはGA）、またはMEGおよび1つもしくは複数の同時生成物を含む組成物も提供される。TIFF2022521905000093.tif121168

Description

関連出願の相互参照
本願は、2019年2月20日に出願された「DEGRADATION PATHWAY FOR PENTOSE AND HEXOSE SUGAR」という名称の米国特許仮出願第62/808,258号に対する優先権を主張し、該出願の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖からモノエチレングリコールまたはモノエチレングリコールと1つまたは複数の同時生成物との生合成に有用な組換え微生物に関する。加えて本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖からのグリコール酸またはグリコール酸と1つもしくは複数の同時生成物との生合成に有用な組換え微生物に関する。本願はさらに、組換え微生物を使用して1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖からモノエチレングリコールまたはモノエチレングリコールと1つもしくは複数の同時生成物とを生成する方法、ならびに組換え微生物を使用して1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖からグリコール酸またはグリコール酸と1つもしくは複数の同時生成物とを生成する方法に関する。本願はさらに、これらの化合物および/または組換え微生物のうちの1つまたは複数を含む組成物に関する。
配列表に関する陳述
本願に付随する配列表は、紙のコピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、これによって参照により本明細書中に組み入れられる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、BRSK-004_02WO_ST25.txtである。テキストファイルは、約641KBであり、2020年2月18日に作成されて、EFS-Webを介して電子的に提出されている。
背景
現在、多数の化学化合物が石油化学製品に由来する。モノエチレングリコール（MEG）、グリコール酸、アセトン、イソプロパノール（IPA）、プロペン、セリン、グリシン、モノエタノールアミン、およびエチレンジアミンなどの化合物は、ポリエチレンテレフタレート（PET）樹脂（MEGから）、プラスチックであるポリプロピレン（プロペンから）、ポリグリコール酸および他の生体適合性コポリマー（グリコール酸から）ならびにポリウレタン繊維（エチレンジアミンから）のような生成物の生成における原材料として価値がある。アルケン（例えば、エチレン、プロピレン、種々のブテン、およびペンテンなど）は、プラスチック工業、燃料に、および化学工業の他の分野で使用されている。例えば、イソブテンは、燃料添加剤、ゴムおよびゴム添加剤、ならびに特殊化学薬品を含む多種多様な生成物を製造するためのプラットフォーム化学薬品として広く使用されている、小型高反応性分子である。
しかし現在、化合物は、気候変動の一因となる化石燃料を起源とする前駆物質から生成される。MEGの生成のための、環境によりやさしいプロセスを開発するために、研究者らは、MEGを生成するように微生物の生合成経路を操作している。しかし、これらの経路は実行が大変であり、生成物の収量低下、酸化還元バランスおよび過剰のバイオマス形成が、克服すべきいくつかの大きな障害である。
従って、工業的および薬学的応用に有用なMEGおよび他の化学化合物の生成のための改良された生合成経路の必要性が存在する。
開示の概要
本開示は、ペントースリン酸アルドラーゼによって触媒されるただ1つの新たな反応を導入することによって、天然の立証されている反応を主に活用して、多様なC5糖およびC6糖を、炭素の損失なしに、広く使用可能な重要中間体グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドへ変換することを可能にする。
いくつかの態様において、本開示の酵素反応は、ペントースリン酸経路に流入することができるグルコース、キシロース、または様々なその他の糖からの、高収率のMEG（またはグリコール酸）またはMEG（またはGA）および1つもしくは複数の同時生成物の生成を可能にする。他の態様において、本開示の酵素反応は、対応するモノマーへ容易に分解され得る多様な糖オリゴマーからの、高収率のMEG（またはグリコール酸）またはMEG（またはGA）および同時生成物の生成を可能にする。さらなる態様において、本開示の酵素反応は、C5糖および/またはC6糖のモノマーおよび/またはオリゴマーの混合物からの、高収率のMEG（またはグリコール酸）またはMEG（またはGA）と同時生成物との生成を可能にする。
いくつかの態様において、本発明の方法は、他のグルコースベースのMEG（またはグリコール酸）生成法と比較して、以下の問題を解決するかまたは低下させる：ATPの不足；NADHの大過剰；低い全体生成物収量ポテンシャル。さらなる態様において、本発明の方法は、他のグルコースベースのMEGまたはグリコール酸の生成法と比較して、MEGまたはグリコール酸の同じ高い収率での、D-グルコース、D-キシロース、および/もしくは様々なその他の糖、または混合物の利用を可能にする。
いくつかの態様において、本発明の方法は、他のD-キシロースベースのMEG（またはグリコール酸）の生成法、ならびに他のD-キシロースベースのMEGおよび同時生成物の生成法と比較して、以下の課題および問題を解決する：キシロースに依存した過程（入手可能性/購入の限界、高い価格または低い純度、D-グルコースより遅く、効率の低い取り込み）；D-キシロース利用のグルコースによって誘導される阻害。さらなる態様において、本法は、他のD-キシロースベースのMEG（またはグリコール酸）生成法、ならびに他のD-キシロースベースのMEGおよび同時生成物の生成法と比較して、MEGまたはグリコール酸、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との同じ高い収率での、D-グルコース、D-キシロース、および/もしくは様々な他の糖、または混合物の利用をさらに可能にする。
1つの態様において、本開示は、ペントースリン酸中間体を介して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、D-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成する1つまたは複数の生化学的経路を含む組換え微生物を提供する。
いくつかの態様において、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸であり、ここで、酵素は、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼ活性、またはD-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する。
いくつかの態様において、リブロキナーゼ酵素が、D-リブロースのD-リブロース-5-リン酸へのリン酸化を触媒する。いくつかの態様において、リブロキナーゼ酵素は、大腸菌（E.coli）AraBによってコードされる。いくつかの態様において、リブロキナーゼ酵素は、大腸菌由来のAraB（SEQ ID NO:288）に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、リボキナーゼ酵素が、D-リボースのD-リボース-5-リン酸へのリン酸化を触媒する。いくつかの態様において、リボキナーゼ酵素は、大腸菌rbsKによってコードされる。いくつかの態様において、リブロキナーゼ酵素は、大腸菌由来のrbsK（SEQ ID NO:290）に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、キシルロキナーゼ酵素が、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸へのリン酸化を触媒する。いくつかの態様において、リボキナーゼ酵素は、T.マリティマ（maritima）XuKによってコードされる。いくつかの態様において、リブロキナーゼ酵素は、T.マリティマ由来のXuK（SEQ ID NO:291）に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
1つの態様において、組換え微生物は、モノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を生成する。別の態様において、1つまたは複数の同時生成物は、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン、またはそれらの組み合わせより選択される。さらなる態様において、1つまたは複数の生成物は、モノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される。
従って、1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖をロスの無い変換においてペントースリン酸中間体へ変換する活性を有する少なくとも1つの酵素を含み、ペントースリン酸中間体をグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）へ変換するペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素を含む、1つまたは複数の生化学的経路を含む組換え微生物に関する。
1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖をロスの無い変換においてD-リボース-5-リン酸中間体へ変換する活性を有する少なくとも1つの酵素を含み、D-リボース-5-リン酸中間体をグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）へ変換するD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ（DERA）活性を有する少なくとも1つの酵素を含む、1つまたは複数の生化学的経路を含む組換え微生物に関する。
いくつかの態様において、組換え微生物は、トランスケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現およびペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、組換え微生物は、トランスケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現およびD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ（DERA）活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtktAに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtktAである。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtktBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtktBである。別の態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:148および150からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、tktAまたはその相同体である。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、tktBまたはその相同体である。さらなる態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:147および149からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のdeoCに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のdeoCである。
いくつかの態様において、B.カルドリチカス（Caldolyticus）ペントースリン酸アルドラーゼは、
Figure 2022521905000002
に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、B.カルドリチカスペントースリン酸アルドラーゼは、
Figure 2022521905000003
に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含むcDNA最適化配列によってコードされる。
いくつかの態様において、大腸菌ペントースリン酸アルドラーゼは、
Figure 2022521905000004
に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
いくつかの態様において、B.カルドリチカスペントースリン酸アルドラーゼは、
Figure 2022521905000005
に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
いくつかの態様において、B.カルドリチカスペントースリン酸アルドラーゼは、変異C37N変異を含み、
Figure 2022521905000006
に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、B.カルドリチカスペントースリン酸アルドラーゼは、変異C37N変異を含み、
Figure 2022521905000007
に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
いくつかの態様において、組換え微生物は、トランスアルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来talAまたはtalBと少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来talAである。他の態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来talBである。別の態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：152および154からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：151および153からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、組換え微生物は、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来rpeと少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来rpeである。別の態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：158に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：157に示される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、組換え微生物は、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来rpiAと少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来rpiAである。他の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来rpiBと少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来rpiBである。別の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：156に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：155に示される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性、およびD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性から選択される活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む組換え微生物は、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼおよびホスホグリセリン酸ムターゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素における欠失または減少した活性をさらに含む。いくつかの態様において、内在性グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ酵素はgapAであり、ホスホグリセリン酸キナーゼはpgkであり、ホスホグリセリン酸ムターゼはgpmAまたはgpmMである。
いくつかの態様において、組換え微生物は、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）BDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）xfp、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）xpkAおよびビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）xfpからなる群より選択されるフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素と少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・デンティウムBDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクティスxfp、ラクトバチルス・パラプランタルムxpkAおよびビフィドバクテリウム・ブレベxfpからなる群より選択される。別の態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：212、214、216および218からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：211、213、215および217からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、組換え微生物は、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）ptaより選択されるリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリクムptaより選択される。別の態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：220および222より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：219および221より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性、およびD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む組換え微生物は、内在性6-ホスホフルクトキナーゼ酵素の活性の欠失または減少をさらに含む。いくつかの態様において、内在性6-ホスホフルクトキナーゼ酵素は、pfkAおよび/またはpfkBである。
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、D-キシロースを含み、組換え微生物は、キシロースイソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現およびキシルロース5-キナーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現をさらに含む。いくつかの態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素は、大腸菌またはピロミセス属（Pyromyces）の種に由来するxylAに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌xylAおよびピロミセス属の種のxylAより選択される。さらに別の態様において、キシロースイソメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:95および144より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、キシロースイソメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:93、94、および143からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、キシルロース5-キナーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素は、大腸菌由来のxylBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、キシルロース5-キナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌xylBである。別の態様において、D-キシルロース5-キナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:146に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、D-キシルロース5-キナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:145に記載の核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、D-フルクトースを含み、組換え微生物は、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現をさらに含む。1つの態様において、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する少なくとも1つの酵素は、大腸菌由来のfbpに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素は、大腸菌fbpである。いくつかの態様において、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素は、D-フルクトース1,6-ビスリン酸をD-フルクトース6-リン酸へ変換する。他の態様において、D-フルクトースは、組換え微生物の内在性酵素によってフルクトース1,6-ビスリン酸へ変換される。
前記組換え微生物のいずれかのいくつかの態様において、組換え微生物は、グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性の欠失または減少をさらに含む。さらなる態様において、グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼはzwfであり、6-ホスホグルコノラクトナーゼはpglであり、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはgndである。
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得る。他の態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、モノマー、オリゴマー、またはそれらの組み合わせから構成される。
いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性および/またはフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現、ならびにD-リボース5-リン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い変換、ならびにその後のD-リボース-5-リン酸のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換を可能にする。
いくつかの態様において、組換え微生物は、C2経路におけるグリコールアルデヒドの変換および1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して、MEGまたはグリコール酸（GA）を生成する。いくつかの態様において、MEGは、C2経路におけるグリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの還元によって生成される。他の態様において、GAは、C2経路におけるグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの酸化によって生成される。
いくつかの態様において、MEGまたはGAの生成のための少なくとも1つの酵素は、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、グリセリン酸デカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、およびグリオキシル酸レダクターゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択される。
いくつかの態様において、組換え微生物は、C2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通じてMEGを生成し、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通じて1つまたは複数の同時生成物を生成する。他の態様において、1つまたは複数の同時生成物は、アセトン、イソプロパノール、プロペン、イソブテンおよび1つまたは複数のセリン経路化合物より選択される。いくつかの好ましい態様において、1つまたは複数のセリン経路化合物は、セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）およびエチレンジアミン（EDA）より選択される。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通じた1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチルCoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性、およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、アセトンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通じた1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチルCoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、イソプロパノールを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通じた1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチルCoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性、およびデヒドラターゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、プロペンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通じた1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチルCoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）シンターゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼ活性、メチルグルタコニルCoAヒドラターゼ活性、メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼ活性、メチルクロトニルCoAヒドラターゼ活性、3-ヒドロキシイソバレリルCoAチオエステラーゼ活性、3HIVキナーゼ活性、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性、および3HIVデカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、イソブテンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通じた1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、およびグリセリン酸2-キナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、L-セリンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通じた1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性、グリシン開裂系に関連する活性、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性、アラニントランスアミナーゼ活性、NAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、グリシンを含む。別の態様において、グリシン開裂系に関連する活性は、グリシンデカルボキシラーゼ（Pタンパク質）、アミノメチルトランスフェラーゼ（Tタンパク質）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Lタンパク質）、およびHタンパク質より選択される酵素またはタンパク質を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通じた1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、トランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、およびエタノールアミンアンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、モノエタノールアミン（MEA）を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通じた1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、セリンデヒドロゲナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、アルデヒドオキシダーゼ活性、N-アセチルトランスフェラーゼまたはO-アセチルトランスフェラーゼ活性、N-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性、トランスアミナーゼ活性、デアセチラーゼ活性、セリンアミナーゼ活性、および2,3-ジアミノプロパン酸アンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、エチレンジアミン（EDA）を含む。
上記の組換え微生物のいずれかのいくつかの態様において、組換え微生物は、グリコールアルデヒドレダクターゼ、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはそれらの組み合わせにおける活性を減少または欠失させるための1つまたは複数の改変をさらに含む。
一態様において、C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部は、C2経路において還元当量源として使用される。別の態様において、C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部は、ATPを生成するために使用される。
一態様において、過剰のバイオマス形成は最小限にされ、MEG（もしくはGA）またはMEG（もしくはグリコール酸）と1つもしくは複数の同時生成物との生成は最大限にされる。
別の局面において、本願は、前記態様のいずれかの組換え微生物を使用して、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成する方法であって、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物が生成されるまで、炭素源を供給する1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖を含有する培養培地において組換え微生物を培養する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、組換え微生物は、モノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を同時生成する。さらなる態様において、1つまたは複数の同時生成物は、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン（EDA）、またはそれらの組み合わせより選択される。さらなる態様において、1つまたは複数の生成物は、モノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される。
さらに別の局面において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体への変換のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；D-リボース-5-リン酸中間体のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；C2経路におけるグリコールアルデヒドからの1つまたは複数の生成物の生成のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；ならびに1つまたは複数のC3経路におけるG3Pからの1つまたは複数の生成物の生成のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；ならびに組換え微生物を、1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積するよう、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖を含有する培養培地において培養する工程を含む、D-リボース-5-リン酸中間体を介して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積する組換え微生物を作製する方法を提供する。いくつかの態様において、組換え微生物は、モノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を同時生成する。さらなる態様において、1つまたは複数の同時生成物は、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン（EDA）、またはそれらの組み合わせより選択される。さらなる態様において、1つまたは複数の生成物は、モノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される。
本開示の例示的な態様は、図面において例示される。
（図１）図1は、ペントースまたはヘキソースの分解経路を例示する。記号
Figure 2022521905000008
は、酵素がダウンレギュレートされるかまたは不活化される/消失させられる可能性があること、即ち、それぞれの遺伝子が減少させられるかまたは欠失させられる可能性があることを意味する。
（図２）図2は、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ（Fpk）およびリン酸アセチルトランスフェラーゼ（pta）を含むペントースまたはヘキソースの分解経路のバリエーションを例示する。記号
Figure 2022521905000009
は、酵素がダウンレギュレートされるかまたは不活化される/消失させられる可能性があること、即ち、それぞれの遺伝子が減少させられるかまたは欠失させられる可能性があることを意味する。
（図３）図3は、様々な糖のグリコールアルデヒドおよびグリセルアルデヒド3-リン酸へのロスの無い転換を例示する。
（図４）図4は、ペントースリン酸（D-リボース5-リン酸、D-リブロース5-リン酸、およびD-キシルロース5-リン酸）を介した、高収率のMEGおよび可能性のある同時生成の経路を例示する。
（図５）図5は、ペントースリン酸（D-リボース5-リン酸、D-リブロース5-リン酸、およびD-キシルロース5-リン酸）を介した高収率グリコール酸経路を示す。
（図６）図6は、MEGおよびSer、Gly、MEA、EDAの同時生成経路の概要を例示する。
（図７）図7は、発表されているEDA生成経路を例示する。WO2014/049382より。反応F：L-セリンアミナーゼを介した直接L-セリンアミノ化。反応G：2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニアリアーゼを介した直接ピルビン酸アミノ化。
（図８）図8は、変異が強調されている、大腸菌およびB.カルドリチカスに由来するDERAのアライメントを示す図である。
（図９）図9は、ペントースキナーゼ活性を測定するためのアッセイの反応を示すスキームである。
（図１０）図10は、ペントース基質に対する組換えrbsK酵素のミカエリスメンテン曲線のプロットである。初速度が基質濃度の関数としてプロットされる。
（図１１）図11は、ペントース基質に対する組換えキシルロキナーゼ酵素のミカエリスメンテン曲線のプロットである。初速度が基質濃度の関数としてプロットされる。
（図１２）図12は、ペントース基質に対する組換えAraB酵素のミカエリスメンテン曲線のプロットである。初速度が基質濃度の関数としてプロットされる。
（図１３）図13は、天然基質、2-デオキシ-リボース-5Pを使用した、組換えDERA活性を測定するためのアッセイの反応を示すスキームである。
（図１４）図14は、ペントース基質からの組換えDERA活性を測定するためのアッセイの反応を示すスキームである。
（図１５）図15は、天然基質、デオキシ-リボース-5Pを使用した、市販の大腸菌由来DERA酵素のミカエリスメンテン曲線のプロットである。初速度が基質濃度の関数としてプロットされる。
（図１６）図16は、天然基質、デオキシ-リボース-5Pを使用した、組換え大腸菌由来の野生型DERA酵素のミカエリスメンテン曲線のプロットである。初速度が基質濃度の関数としてプロットされる。
（図１７）図17は、天然基質、デオキシ-リボース-5Pを使用した、組換えB.カルドリチカス由来の野生型DERA酵素のミカエリスメンテン曲線のプロットである。初速度が基質濃度の関数としてプロットされる。
（図１８）図18は、天然基質、デオキシ-リボース-5Pを使用した、組換え大腸菌由来のC47N変異型DERA酵素バリアントのミカエリスメンテン曲線のプロットである。初速度が基質濃度の関数としてプロットされる。
（図１９）図19は、天然基質、デオキシ-リボース-5Pを使用した、組換え大腸菌由来のC47N変異型DERA酵素バリアントのミカエリスメンテン曲線のプロットである。初速度が基質濃度の関数としてプロットされる。
（図２０）図20は、天然基質、デオキシ-リボース-5Pを使用した、組換え大腸菌由来のK201N変異型DERA酵素バリアントのミカエリスメンテン曲線のプロットである。初速度が基質濃度の関数としてプロットされる。
（図２１）図21は、グリコールアルデヒド基質を使用した、aldA活性を測定するためのアッセイの反応を示すスキームである。
（図２２）図22は、グリコールアルデヒドを基質として使用した、aldAのミカエリスメンテン曲線のプロットである。初速度が基質濃度の関数としてプロットされる。
（図２３）図23は、ペントースからのグリコール酸生成を測定するためのアッセイの反応を示すスキームである。
（図２４）図24は、DERAタンパク質を発現し、キシロースによって増殖するMG1655-ΔtktA-ΔtktB株を使用した、DERA活性のスキームである。
（図２５）図25は、キシロース最小培地において増殖する大腸菌株の増殖曲線のプロットである。
詳細な説明
定義
以下の定義および略語が、本開示の解釈のために使用されるべきである。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、そうでないことを前後関係が明白に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「酵素」への言及には、複数のそのような酵素が含まれ、「微生物」への言及には、1種類または複数種類の微生物への言及が含まれ、他も同様である。
本明細書において使用されるように、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有している（contains）」、「含有している（containing）」という用語、またはそれらの他の語尾変化は、非排他的な包含をカバーするものとする。要素のリストを含む組成物、混合物、過程、方法、物体、または装置は、必ずしも、それらの要素のみに限定されず、明示的にリストされていない、またはそのような組成物、混合物、過程、方法、物体、もしくは装置に固有でない他の要素を含んでいてもよい。さらに、反対のことが明示されない限り、「または」とは、包括的な「または」をさし、排他的な「または」をさすのではない。
「約」および「およそ」という用語は、数値を修飾するために本明細書において使用されるように、その明示的な値の周りの近い範囲を示す。「X」が値である場合、「約X」または「およそX」は、0.9X～1.1Xの値、または、いくつかの態様において、0.95X～1.05Xの値を示すであろう。「約X」または「およそX」への言及は、具体的には、値X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、および1.05Xを少なくとも示す。従って、「約X」および「およそX」とは、例えば、「0.98X」の、特許請求の範囲の限定のための記載サポートを教示し提供するものとする。
本明細書において使用されるように、「微生物の」、「微生物（microbial organism）」、および「微生物（microorganism）」という用語には、古細菌、細菌、または真核生物のドメインに含まれる微視的な細胞として存在する任意の生物が含まれ、後者には、酵母および糸状菌、原虫、藻類、または高等原生生物が含まれる。従って、その用語には、微視的なサイズを有する原核細胞もしくは真核細胞、または原核生物もしくは真核生物が包含されるものとし、全ての種の細菌、古細菌、および真正細菌が含まれ、酵母および真菌のような真核微生物も含まれる。化学物質の生成のために培養され得る任意の種の細胞培養物も含まれる。
本明細書中に記載されるように、いくつかの態様において、組換え微生物は、原核微生物である。いくつかの態様において、原核微生物は、細菌である。「細菌」または「真正細菌」とは、原核生物のドメインをさす。細菌には、以下のような少なくとも11の別個の群が含まれる：（１）次の2つの主要な亜群が存在するグラム陽性（グラム+）菌：(1)高G+C群（放線菌（Actinomycetes）、マイコバクテリア（Mycobacteria）、ミクロコッカス（Micrococcus）他）、(2)低G+C群（バチルス（Bacillus）、クロストリジウム（Clostridia）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ブドウ球菌（Staphylococci）、連鎖球菌（Streptococci）、マイコプラズマ（Mycoplasmas））；（２）プロテオバクテリア（Proteobacteria）、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性菌（大部分の「一般的な」グラム陰性菌を含む）；（３）シアノバクテリア（Cyanobacteria）、例えば、酸素発生型光栄養生物；（４）スピロヘータ（Spirochetes）および近縁種；（５）プランクトマイセス（Planctomyces）；（６）バクテロイデス（Bacteroides）、フラボバクテリア（Flavobacteria）；（７）クラミジア（Chlamydia）；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光栄養生物も）；（１０）放射線抵抗性ミクロコッカスおよび近縁種；（１１）サーモトガ（Thermotoga）およびサーモシホ・サーモフィレス（Thermosipho thermophiles）。
「グラム陰性菌」には、球菌、非腸内桿菌、および腸内桿菌が含まれる。グラム陰性菌の属には、例えば、ナイセリア（Neisseria）、スピリルム（Spirillum）、パスツレラ（Pasteurella）、ブルセラ（Brucella）、エルシニア（Yersinia）、フランシセラ（Francisella）、ヘモフィルス（Haemophilus）、ボルデテラ（Bordetella）、エシェリキア（Escherichia）、サルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、クレブシエラ（Klebsiella）、プロテウス（Proteus）、ビブリオ（Vibrio）、シュードモナス（Pseudomonas）、バクテロイデス（Bacteroides）、アセトバクタ-（Acetobacter）、アエロバクター（Aerobacter）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アゾトバクター（Azotobacter）、スピリルム（Spirilla）、セラチア（Serratia）、ビブリオ（Vibrio）、リゾビウム（Rhizobium）、クラミジア（Chlamydia）、リケッチア（Rickettsia）、トレポネーマ（Treponema）、およびフソバクテリウム（Fusobacterium）が含まれる。
「グラム陽性菌」には、球菌、非胞子形成桿菌、および胞子形成桿菌が含まれる。グラム陽性菌の属には、例えば、アクチノマイセス（Actinomyces）、バチルス、クロストリジウム（Clostridium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、エリシペロスリクス（Erysipelothrix）、ラクトバチルス、リステリア（Listeria）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ミキソコッカス（Myxococcus）、ノカルジア（Nocardia）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、およびストレプトマイセス（Streptomyces）が含まれる。
「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、内在性酵素を発現するかもしくは過剰発現するよう遺伝学的に改変された微生物、ベクターに含まれるもの、組み込み構築物に含まれるもののような異種酵素を発現するよう遺伝学的に改変された微生物、または内在性遺伝子の発現の変化を有する微生物をさす。「変化」とは、発現、レベル、または活性が、変化の非存在下で観察されるものより大きくまたは小さくなるよう、遺伝子の発現、または1つもしくは複数のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットをコードするRNA分子もしくは等しいRNA分子のレベル、または1つもしくは複数のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットの活性が、アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされることを意味する。例えば、「変化する」という用語は、「阻害する」を意味することができるが、「変化する」という単語の使用は、この定義に限定されない。「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、特定の組換え微生物のみならず、そのような微生物の子孫または可能性のある子孫もさすことが理解される。変異または環境的影響のいずれかによって、ある特定の改変が、後続世代において起こり得るため、そのような子孫は、実際、親細胞と同一でない場合もあるが、それでも、本明細書において使用されるその用語の範囲内に含まれる。
遺伝子配列に関する「発現」という用語は、遺伝子の転写をさし、適宜、得られたmRNA転写物のタンパク質への翻訳もさす。従って、前後関係から明らかであるように、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム配列の転写および翻訳に起因する。宿主細胞における所望の産物の発現のレベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量または選択された配列によってコードされた所望の産物の量のいずれかに基づき決定され得る。例えば、選択された配列から転写されたmRNAは、qRT-PCRまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量化され得る（Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照すること）。選択された配列によってコードされたタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ELISAによって、タンパク質の生物学的活性についてアッセイすることによって、またはタンパク質を認識しそれに結合する抗体を使用したウエスタンブロットもしくはラジオイムノアッセイのようなそのような活性に依存しないアッセイを利用することによって定量化され得る。Sambrook et al.,1989（前記）を参照すること。
「ポリヌクレオチド」という用語は、「核酸」という用語と交換可能に本明細書において使用され、任意の長さの一本鎖または二本鎖のセンスまたはアンチセンスのデオキシリボ核酸（DNA）を含み、適宜、siRNAを含む任意の長さの一本鎖または二本鎖のセンスまたはアンチセンスのリボ核酸（RNA）も含むが、これらに限定されるわけではない、ヌクレオチド、ヌクレオシド、またはそれらの類似体を含む、2個以上の単量体から構成された有機ポリマーをさす。「ヌクレオチド」という用語は、プリン塩基またはピリミジン塩基およびリン酸基に接合されたリボース糖またはデオキシリボース糖からなり、核酸の基本的な構造単位である数個の化合物のうちのいずれかをさす。「ヌクレオシド」という用語は、デオキシリボースまたはリボースと化合したプリン塩基またはピリミジン塩基からなり、特に、核酸に見出される（グアノシンまたはアデノシンとしての）化合物をさす。「ヌクレオチド類似体」または「ヌクレオシド類似体」という用語は、それぞれ、1個または複数個の個々の原子が異なる原子または異なる官能基に交換されたヌクレオチドまたはヌクレオシドをさす。従って、ポリヌクレオチドという用語には、任意の長さの核酸、DNA、RNA、それらの類似体および断片が含まれる。3ヌクレオチド以上のポリヌクレオチドは、ヌクレオチドオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドとも呼ばれる。
本明細書中に記載されたポリヌクレオチドには、「遺伝子」が含まれ、本明細書中に記載された核酸分子には、「ベクター」または「プラスミド」が含まれることが理解される。従って、「構造遺伝子」とも呼ばれる「遺伝子」という用語は、1つまたは複数のタンパク質または酵素の全部または一部を含み、例えば、遺伝子が発現される条件を決定するプロモーター配列のような制御性（非転写）DNA配列を含んでいてもよい、アミノ酸の特定の配列をコードするポリヌクレオチドをさす。遺伝子の転写される領域には、コード配列のみならず、イントロン、5'非翻訳領域（UTR）、および3'-UTRを含む非翻訳領域も含まれ得る。
「酵素」という用語は、本明細書において使用されるように、1つまたは複数の化学的または生化学的な反応を触媒するかまたは促進する任意の物質をさし、一般的には、完全にまたは部分的にポリペプチドから構成された酵素を含むが、ポリヌクレオチドを含む異なる分子から構成された酵素も含み得る。
本明細書において使用されるように、「天然に存在しない」という用語は、本開示の微生物または酵素活性に関して使用される時、言及された種の野生型株を含む言及された種の天然に存在する株に通常見出されない少なくとも1つの遺伝的変化を、微生物または酵素が有することを意味するものとする。遺伝的変化には、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能核酸を導入する改変、その他の核酸付加、核酸欠失、および/または微生物の遺伝材料のその他の機能的破壊が含まれる。そのような改変には、例えば、言及された種についての、異種ポリペプチド、相同ポリペプチド、または異種ポリペプチドおよび相同ポリペプチドの両方についての、コード領域およびその機能性断片が含まれる。さらなる改変には、例えば、改変が遺伝子またはオペロンの発現を変化させる非コード制御領域が含まれる。例示的な天然に存在しない微生物または酵素活性には、前記のヒドロキシル化活性が含まれる。
「外来性」という用語は、様々な分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素等に関して本明細書において使用されるように、自然界の所定の酵母、細菌、生物、微生物、または細胞において、通常または天然には見出されずかつ/または生成されない分子をさす。
他方、「内在性」または「ネイティブ」という用語は、様々な分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素等に関して本明細書において使用されるように、自然界の所定の酵母、細菌、生物、微生物、または細胞において、通常または天然に見出されかつ/または生成される分子をさす。
「異種」という用語は、改変された宿主細胞に関して本明細書において使用されるように、以下の少なくとも一つに当てはまる様々な分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素等をさす：（a）分子が、宿主細胞に対して外来（「外来性」）である（即ち、天然に見出されない）；（b）分子が、所定の宿主微生物もしくは宿主細胞において天然に見出される（例えば、「内在性」である）が、細胞内で非天然の位置においてもしくは非天然の量で生成される；および/または（c）分子が、内在性のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列と、ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列が異なっており、そのため、内在性に見出される内在性のヌクレオチドもしくはアミノ酸と、ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列が異なる分子が、細胞内で非天然の（例えば、天然に見出されるより大きい）量で産生される。
「相同体」という用語は、第1の科または種の最初の酵素または遺伝子に関して本明細書において使用されるように、機能的分析、構造的分析、またはゲノム分析によって、第1の科または種の最初の酵素または遺伝子に相当する第2の科または種の酵素または遺伝子であると決定された第2の科または種の別個の酵素または遺伝子をさす。相同体は、最もしばしば、機能、構造、またはゲノムの類似性を有する。酵素または遺伝子の相同体を、遺伝子プローブおよびPCRを使用して容易にクローニングすることができる技術が、公知である。クローニングされた配列の相同体としての同一性は、機能的アッセイを使用して、かつ/または遺伝子のゲノムマッピングによって、確認され得る。
遺伝子によってコードされたアミノ酸配列が、第2の遺伝子のものと類似のアミノ酸配列を有する場合、そのタンパク質は、第2のタンパク質との「相同性」を有するかまたは第2のタンパク質と「相同」である。あるいは、2つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合、そのタンパク質は、第2のタンパク質との相同性を有する。従って、「相同タンパク質」という用語は、2つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味するものとする。ある特定の場合において、2つのタンパク質の間の相同性は、進化によって関連しているその共通の祖先を示す。「相同配列」または「相同体」という用語は、機能的に関連していると考えられているか、信じられているか、または公知である。機能的関係は、（a）配列同一性の程度、および/または（b）同一もしくは類似の生物学的機能を含むが、これらに限定されるわけではない、多数の方式のうちのいずれかで示され得る。好ましくは、（a）および（b）の両方が示される。配列同一性の程度は、変動し得るが、一つの態様において、（当技術分野において公知の標準的な配列アライメントプログラムを使用した時）少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも98.5％、または少なくとも約99％、または少なくとも99.5％、または少なくとも99.8％、または少なくとも99.9％である。相同性は、Current Protocols in Molecular Biology（F.M.Ausubel et al., eds.,1987)Supplement 30,section 7.718,Table 7.71に記述されたもののような当技術分野において容易に入手可能なソフトウェアプログラムを使用して決定され得る。いくつかのアライメントプログラムは、MacVector（Oxford Molecular Ltd,Oxford,U.K.）およびALIGN Plus（Scientific and Educational Software, Pennsylvania）である。他の非限定的なアライメントプログラムには、Sequencher（Gene Codes, Ann Arbor, Michigan）、AlignX、およびVector NTI（Invitrogen, Carlsbad,CA）が含まれる。類似の生物学的機能には、以下のものが含まれ得るが、これらに限定されるわけではない：同一または類似の酵素反応を触媒すること；基質もしくは補助因子に対して同一もしくは類似の選択性を有すること；同一もしくは類似の安定性を有すること；様々な発酵条件（温度、pH等）に対して同一もしくは類似の耐性を有すること；および/または様々な代謝基質、生成物、副生成物、中間体等に対して同一もしくは類似の耐性を有すること。生物学的機能の類似性の程度は、変動し得るが、一つの態様において、所定の生物学的機能を決定するための当業者に公知の1つまたは複数のアッセイによって、少なくとも1％、少なくとも2％、少なくとも3％、少なくとも4％、少なくとも5％、少なくとも6％、少なくとも7％、少なくとも8％、少なくとも9％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも98.5％、または少なくとも約99％、または少なくとも99.5％、または少なくとも99.8％、または少なくとも99.9％である。
「バリアント」という用語は、本明細書中に記載された任意のポリペプチドまたは酵素をさす。バリアントには、多量体の1つまたは複数の成分、個々の成分を含む多量体、複数の個々の成分を含む多量体（例えば、参照分子の多量体）、化学的分解生成物、および生物学的分解生成物も包含される。具体的な非限定的な態様において、酵素は、参照酵素をコードするポリペプチド配列の任意の部分における変化によって、参照酵素に対して「バリアント」であり得る。参照酵素のバリアントは、参照酵素の調製物の酵素活性を測定するために使用された標準的なアッセイにおいて、少なくとも10％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも105％、少なくとも110％、少なくとも120％、少なくとも130％、またはそれ以上の酵素活性を有していてよい。いくつかの態様において、バリアントとは、本開示の全長のまたはプロセシングを受けていない酵素との少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドもさすことができる。いくつかの態様において、バリアントとは、本開示の成熟型のまたはプロセシングを受けた酵素との少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドもさすことができる。
「シグナル配列」という用語は、本明細書において使用されるように、細胞内の位置へ、または細胞外環境へ、ペプチドおよびポリペプチドをターゲティングするアミノ酸配列をさす。シグナル配列は、典型的には、ポリペプチドのN末端部分にあり、典型的には、酵素的に除去される。シグナル配列を有するポリペプチドは、全長でありかつ/またはプロセシングを受けていないと呼ばれる。シグナル配列が除去されたポリペプチドは、成熟型でありかつ/またはプロセシングを受けていると呼ばれる。
「生産力」という用語は、本明細書において使用されるように、生合成経路からの生成物の収率をさす。一つの態様において、生産力は、出発化合物の重量当たりの最終生成物の重量パーセントとして表され得る。
「熱力学的最大収率」という用語は、本明細書において使用されるように、原料と比較した生成物のエネルギー値に基づく、グルコースのような所定の原料の発酵から入手される生成物の最大収率をさす。例えば、光、水素ガスまたはメタンまたは電気のような付加的なエネルギー源を使用しない、通常の発酵において、生成物は、原料より多くのエネルギーを含有し得ない。熱力学的最大収率とは、原料からの全てのエネルギーおよび質量が生成物へ変換される生成物収率を意味する。この収率は、計算可能であり、具体的な経路に依存しない。生成物への特定の経路が、熱力学的最大収率より低い収率を有する場合、それは質量を失っており、生成物へのより効率的な経路によって改善され得るか、または該経路に置き換えられ得る可能性が最も高い。
「酸化還元バランスがとれている」という用語は、それらが消費するのと同量の酸化還元補助因子を全体として生成する1セットの反応をさす。酸化還元補助因子のバランスがとれているかまたはほぼとれているよう、代謝経路を設計し、生物を操作することによって、一般的には、所望の化合物のより効率的なより高い収率での生成がもたらされる。酸化還元反応は、一方が酸化反応であり、他方が還元反応である、同時に起こる2つの半反応として常に共に起こる。酸化還元過程においては、還元体が酸化体に電子を移す。従って、反応中、還元体または還元剤は、電子を失い酸化され、酸化体または酸化剤は、電子を獲得し還元される。一つの態様において、酸化還元反応は、生物系において起こる。生物学的エネルギーは、酸化還元反応によって、保管され、放出される場合が多い。光合成は、二酸化炭素の糖への還元および水の分子状酸素への酸化を含む。逆反応である呼吸は、糖を酸化して二酸化炭素および水を生成する。中間段階として、還元された炭素化合物が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）を還元するために使用され、次いで、それが、アデノシン三リン酸（ATP）の合成を駆動し、酸素の還元によって維持される、プロトン勾配の作出に寄与する。酸化還元状態という用語は、細胞または器官のような生物系におけるGSH/GSSG、NAD+/NADH、およびNADP+/NADPHのバランスを記載するためにしばしば使用される。酸化還元状態は、相互変換がこれらの比に依存する、代謝物のいくつかのセット（例えば、ラクテートおよびピルベート、βヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸）のバランスに反映される。異常な酸化還元状態は、低酸素、ショック、および敗血症のような多様な有害な状況において発生し得る。
「C2経路」、「C2分枝経路」、「C2生化学的経路」、または「C2ストリーム」という用語は、本明細書において使用されるように、MEGがグリコールアルデヒドを介して生成され得る生化学的経路をさす。
本明細書において使用される用語「C3経路」、「C3分岐経路」、「C3生化学経路」または「C3ストリーム」は、ピルビン酸、アセチルCoAまたはジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）を介してMEGならびに/またはアセトン、イソプロパノール、プロペン、イソブテンおよび/もしくはセリン経路化合物などの1つもしくは複数の同時生成物を生成できる生化学経路をさす。
「C5糖」および「ペントース糖」という用語は、交換可能に使用され、5個の炭素原子から構成される糖分子をさす。同様に、「C6糖」および「ヘキソース糖」という用語は、交換可能に使用され、6個の炭素原子から構成される糖分子をさす。糖は、モノマー、オリゴマー、またはそれらの組み合わせであり得る。さらなる例示的な態様において、糖は、グルコースまたはそのグルコースのオリゴマーである。他の態様において、グルコースのオリゴマーは、フルクトース、スクロース、デンプン、セロビオース、マルトース、ラクトース、およびセルロースより選択される。さらなる態様において、糖は、D-キシロース、D-ガラクトース、D-マンノース、D-アラビノース、L-アラビノース、D-フルクトース、またはそれらの組み合わせを含む。
導入
本開示は、ペントースリン酸アルドラーゼによって触媒されるただ1つの新たな反応を導入することによって、天然の立証されている反応を主に活用して、多様なC5（ペントース）糖およびC6（ヘキソース）糖から、炭素の損失なしに、広範に使用可能な重要中間体、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドに到達することを可能にする。いくつかの態様において、ヘキソースは、D-アロース、D-アルトロース、D-グルコース、D-マンノース、D-グロース、D-イドース、D-ガラクトース、D-タロース、D-タグトース（tagtose）、D-ソルボース、D-フルクトース、D-プシコース、および当技術分野において公知のその他のヘキソースより選択され得る。いくつかの態様において、ペントースは、D-キシロース、D-リボース、D-アラビノース、D-リキソース、D-キシルロース、D-リブロース、および当技術分野において公知のその他のペントースより選択され得る。いくつかの態様において、ヘキソースおよびペントースは、本明細書に開示されるヘキソースおよびペントースのいずれかの左旋性または右旋性の鏡像異性体より選択され得る。
本開示の記載された酵素反応は、例えば、ペントースリン酸経路に流入することができるグルコース、キシロース、もしくは様々なその他の糖、または前記モノマーに容易に分解され得る多様な糖オリゴマー、またはそれらの混合物からの、高収率のMEG（またはグリコール酸）またはMEG（またはGA）および同時生成物の生成を可能にする。
他のグルコースベースのMEG（またはグリコール酸）の生成法と比較して、本発明の方法は、以下の問題を解決するかまたは低下させる：ATPの不足；NADHの大過剰；低い全体生成物収量ポテンシャル。他のグルコースベースのMEGまたはグリコール酸の生成法と比較して、本発明の方法は、同じ高い収率でのD-グルコース、D-キシロース、および/もしくは様々なその他の糖、または混合物の利用をさらに可能にする。
他のD-キシロースベースのMEG（またはグリコール酸）の生成法、ならびに他のD-キシロースベースのMEGおよび同時生成物の生成法と比較して、本発明の方法は、以下の課題および問題を解決する：キシロースに依存する過程（入手可能性/購入の限界、高い価格または低い純度、D-グルコースより遅く、効率の低い取り込み）；D-キシロース利用のグルコースによって誘導される阻害。他のD-キシロースベースのMEG（またはグリコール酸）の生成法、ならびに他のD-キシロースベースのMEGおよび同時生成物の生成法と比較して、本発明の方法は、同じ高い収率でのD-グルコース、D-キシロース、および/もしくは様々なその他の糖、または混合物の利用をさらに可能にする。
グルコースを供給原料として使用する現在公知のMEG（またはグリコール酸）の生成法は、全て、低い収量ポテンシャルを有する。これは、グルコースがMEGに分解される際の生化学の固有の欠点であり、提唱された経路および公知の経路の全てについて、生成されるMEG（またはグリコール酸）1分子当たり1個の脱炭酸が起こる。しかしながら、1 MEG当たり1個という脱炭酸は、過剰であるため、レドックスニュートラル（redox-neutral）を達成することができず、従って、最適な収率を達成することができない。
本開示は、従来記載されていないペントースリン酸アルドラーゼ反応（アルドラーゼは、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼ活性、またはD-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する）を確立することによって、ペントースリン酸経路、ならびに/またはD-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、およびD-キシルロース-5-リン酸を含むその重要なペントースリン酸中間体を介して、ペントースまたはヘキソースを分解し、重要前駆物質であるグリコールアルデヒドおよびグリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）を生成する全く新しい手法を記載する（図1）。ペントースリン酸経路への流入に依って、この変換は、ヘキソースからでも、炭素を失うことなく達成される。従って、本開示は、高い収率での、様々なG3Pまたはグリコールアルデヒド誘導体の、ヘキソースおよび/またはペントースに基づく生成を可能にする。
ペントースリン酸経路への非酸化的流入の利用
この技術は、非酸化ペントースリン酸経路を介した、グルコースのペントースリン酸中間体へのロスの無い変換と共に使用され得る。ここで、ペントースリン酸中間体には、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸が含まれる。大腸菌由来のtktAまたはtktBによってコードされるようなトランスケトラーゼが、解糖中間体、D-フルクトース6-リン酸およびD-グリセルアルデヒド3-リン酸を、D-キシルロース5-リン酸およびD-エリトロース4-リン酸へ転換するため、ペントースリン酸経路への非酸化的流入として使用される。D-エリトロース4-リン酸および別のD-フルクトース6-リン酸は、（大腸菌由来のtalAまたはtalBのような）トランスアルドラーゼによってさらに処理され、次いで、トランスケトラーゼによって、D-リボース5-リン酸およびD-キシルロース5-リン酸へ処理される。D-キシルロース5-リン酸分子は、D-リブロース5-リン酸3-エピメラーゼ（rpe）およびD-リボース5-リン酸イソメラーゼ（rpi）によってD-リボース5-リン酸へ容易に転換され得る（図1）。
最終的な式は、以下の通りである：
2.5 D-グルコース + 2.5 ATP + 0.5 リン酸 → 3 D-リボース5-リン酸 + 2.5 ADP
D-キシロースが炭素源として使用される場合には、単純な異性化（大腸菌におけるxylA）および活性化（大腸菌におけるxylB、キシルロース5-キナーゼ）が、D-キシルロース5-リン酸を生成し、それが、rpeおよびrpiの作用を通してD-リボース5-リン酸へ転換され得る。これは、既に、大腸菌のような多くの生物におけるキシロース利用の天然ルートである。
最終的な式は、以下の通りである：
2 D-キシロース + 2 ATP → 2 D-リボース5-リン酸 + 2 ADP
ペントースリン酸経路への非酸化的流入に向かうフラックスの最適化
1炭素の損失を回避するためには、大腸菌における一般的な経路である6-ホスホD-グルコノ-1,5-ラクトンを介したペントースリン酸経路への酸化的流入およびD-リブロース5-リン酸への酸化的脱炭酸は、利用されるべきでない。適切な反応、即ち、グルコース6-リン酸1-デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼのうちの少なくとも1つまたは複数を、原因遺伝子（大腸菌においては：zwf、pgl、gnd）のうちの1つまたは複数を欠失させるかまたは抑制することによって、阻害することが有利である。
ペントースリン酸経路への代替的な非酸化的流入の利用
あるいは、特定のD-フルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ（Fpk）およびリン酸アセチルトランスフェラーゼ（PTA）を、ペントースリン酸経路へのロスの無い流入として使用し、D-フルクトース6-リン酸から、1個のD-エリトロース4-リン酸および1個のアセチル-CoAを作成することができる。D-エリトロース4-リン酸およびさらなるD-フルクトース6-リン酸は、前記のように、2個のD-リボース5-リン酸へ処理される（図2）。
最終的な式は、以下の通りである：
2 D-グルコース + 2 ATP + 1 CoA → 2 D-リボース5-リン酸 + 1 アセチル-CoA + 2 ADP
解糖下流反応のダウンレギュレーション
解糖の上方部分は、2.5個のD-グルコースまたはD-フルクトースを、重要中間体、2×D-フルクトース6-リン酸および1×D-グリセルアルデヒド3-リン酸へ転換するために必要である。解糖の下方部分、即ち、D-グリセルアルデヒド3-リン酸の1，3-ビスホスホD-グリセリン酸への酸化的リン酸化、ならびにその後の3-ホスホ-D-グリセリン酸および2-ホスホ-D-グリセリン酸への変換を通るさらなるフラックスを低下させるかまたは排除するため、大腸菌において、それぞれ、gapA、pgkおよびgpmA/gpmMによってコードされる、D-グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、およびホスホグリセリン酸ムターゼの活性を減少させることができる。
Fpkを介したペントースリン酸経路への代替的な流入が利用される場合には、D-グリセルアルデヒド3-リン酸は必要とされず、適切な6-ホスホフルクトキナーゼ活性（大腸菌において、遺伝子pfkAおよび/またはpfkB）を減少させるかまたは欠失させることができる。
さらなる糖の利用
例えば、スクロースインベルターゼもしくはセロビオースインポーターおよびセロビオースヒドロラーゼの発現を介して、デンプンもしくはスクロースもしくはセルロースもしくはマルトース、またはグルコースもしくはキシロースのようなC5糖もしくはC6糖のオリゴマーを消費する能力、またはペントースリン酸経路を介して分解され得る任意のその他の糖を消費する能力を、生物が有するか、または付与された場合、それは、本開示の重要中間体、D-リボース5-リン酸を生成することができ、従って、同様に、同じ程度に、本開示の組成物および方法を利用し、同じ利益を与えることを可能にする。例えば、L-アラビノースまたはD-アラビノースは、両方とも、大腸菌において、炭素の損失なしに、既知の分解経路を介して、それぞれ、ペントースリン酸経路中間体D-キシルロース5-リン酸またはD-リブロース5-リン酸へ天然に処理され得る（図3）。次いで、これらは、rpeおよびrpiによって媒介される活性を介して、D-リボース5-リン酸へ容易に変換され得る。D-マンノースまたはD-ガラクトースも、例えば、大腸菌において、ペントースリン酸経路流入分子、D-フルクトース6-リン酸へ天然に分解される。
大腸菌において、D-フルクトースは、D-フルクトース6-リン酸を介して分解されるのではなく、D-フルクトース1-リン酸およびD-フルクトース1,6-ビスリン酸を介して分解される。しかしながら、内在性フルクトース1,6-ビスホスファターゼの単純な過剰発現は、D-フルクトース6-リン酸をもたらし、従って、D-フルクトース、またはスクロースのようなD-フルクトースを与えるオリゴマーによる、本発明の利用を可能にするであろう。
反応生成物の可能性のある利用可能性
G3Pは、解糖の初期の重要中間体であり、従って、アセトン、2-プロパノール、プロペン、イソブテン、モノエチレングリコール（MEG）、グリコール酸（GA）、およびセリン経路化合物のような、グルコースから派生し得る化学物質の大半の合成のために使用され得る。セリン経路化合物には、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、およびエチレンジアミン（EDA）が含まれ得る。グリコールアルデヒドは、還元を介してMEGへ、または酸化を介してGAへ、容易に変換され得る（図4および図5）。
大部分の生物が、グリコールアルデヒドをグリオキシル酸へ天然に酸化し、さらに、それを（タルトロン酸セミアルデヒドを介して）一般的な中間体、オキサロ酢酸、リンゴ酸、または2-ホスホグリセリン酸へ変換することもできる。これらの中間体は、バイオマスまたは多様な化学化合物へ変化させられ得る。例えば、MEG生成を改善するため、これらの反応を回避すべきである場合、適切な遺伝子の活性を低下させるかまたは欠失させることによって、それらを減少させるかまたは排除することができる。
MEGの高収率生成
この技術は、同じコア分解経路を利用して、グルコースもしくはキシロースから、または両方の糖の混合物からでも、MEGを生成するための、新しい有利な高収率の経路を可能にする（図4）。
グルコースがMEG生成のために利用される場合、従来記載されている全ての方法が、解糖を介した3-ホスホグリセリン酸への分解、およびL-セリン経路反応を介したMEGへのさらなる分解を教示している。しかしながら、この3炭素化合物は、1 MEG当たり1個のCO2を失って、1個の2炭素化合物（MEG）へ分解され、このことは、全ての記載されている経路バリエーションに当てはまる。過剰のCO2生成は、還元当量（NADH）の過剰生成を伴い、収量ポテンシャルの有意な損失をもたらす（熱力学的最大収量ポテンシャル0.82g_MEGに対して、糖1g当たりわずか0.69g_MEG）：
1 D-グルコース → 2 MEG + 2 CO2 + 2 NADH、y = 0.69g/g
発酵的MEG生成は、その全体が本明細書に組み入れられるWO2010/076324（またはUS2011/0294178；Metabolic Explorer）に記載されている。この出願は、中間体、ヒドロキシピルビン酸への、さらには、エチレングリコールへの、セリン生合成ベースの経路を含む、2-ケト酸脱炭酸および還元を介したジオール生成を示唆した。しかしながら、グルコース → MEG変換についての熱力学的最大収率は0.82g/gであるが、開示された経路は、0.69 g_MEG/g_グルコースという低下した総収量ポテンシャルを有する。また、この経路は、酸化還元平衡でなく、消費されるグルコース1モル当たり2モルというNADHの大過剰を有し、その全てが、細胞が生存可能であるために、再酸化される必要がある。好気的発酵において、このNADHは、ATPを生成するために使用され得るが、これは、大過剰（2 NADH → 6 ATP）であり、その生成段階において過剰のバイオマス形成をもたらし、従って、生成物の形成および収率の低下をもたらす。
従って、WO2010/076324に開示された発酵的MEG生成経路は、ATPの不足（1 MEG当たり-1 ATP）、NADHの過剰（1 MEG当たり+1 NADH）、低い収量ポテンシャル（ymax = 0.69g_MEG/g_グルコース）を有し、高い効率/生産性では証明されていない、課題のある経路である。
WO2011/1303785A1（またはUS2011/0312049；Genomatica）の開示は、ヒドロキシピルビン酸を介してグルコースからMEGを生成するための、WO2010/076324に類似したアプローチを提唱しているが、別の関連した重要中間体、グリセリン酸またはエタノールアミンによる経路バリエーションにも言及している。
WO2011/1303785A1の開示は、ATPの不足を除き、WO2010/076324と同じ欠点を有する。ATPは、利用される酵素に依って、1 MEG当たり+0または+1であり得る。
本開示は、D-グルコースをD-リボース5-リン酸へ転換するために非酸化的ペントースリン酸経路が使用される場合、0.827g/gというD-グルコースからのレドックスニュートラルなMEG収率を可能にする（図4）。
5/6 D-グルコースまたは1 D-キシロース → 2 MEG + 1 CO2 + 0 NADH、y = 0.827g/g
D-キシロースの使用に変えると、他の最近の開示は、0.827g/gという収率を有する、D-キシロースからMEGへの経路を証明した。
リブロース-1-リン酸を介したキシロースからのMEGの証明された発酵的生成（WO2013/126721）は、熱力学的最大収率に等しい高い収量ポテンシャル（0.82g_MEG/g_キシロース）を有する。それは、並行して活性である2つの異なる経路、（グリコールアルデヒドを介した）2炭素ストリームおよび（ジヒドロキシアセトンリン酸を介した）3炭素ストリームを介して、MEGを生成する。C2ストリームは、実施するのが容易であるが、C3ストリームは、代謝工学を介して高い効率で実施することが困難である。C3ストリームは、WO2010/076324またはWO2011/130378に提示された経路を利用する。
キシロース搬入は典型的にATPに駆動されると仮定すると、プロセス全体は少なくともATP中立性（ATP neutral）である。従って、細胞の増殖および維持に必要な余分なATPをいくらか得るために、キシロース、従って収量がいくらか失われる。
しかし、キシロースの取り込みは、大部分の微生物の好ましい炭素源であるグルコースほど効率的でも迅速でもない。また、培地中のグルコースの存在は、通常、キシロースなどの他の糖の利用を阻害する。より効率的なプロセスのためには、この選好的消費をもたらす生物制御を中断する必要があり、その株は、キシロースの選好または糖の同時消費に向けて適応する必要がある。
しかし、大きな課題は、キシロースを入手可能できれいな原料として得ることである。純粋な化学物質としてのキシロースは高価であり、バルク量で入手不可能である。ヘミセルロース加水分解物の状態のキシロースは大量に入手可能であり、グルコースよりも潜在的に低コストであるが、多くの不純物および発酵を阻害する物質を伴う。
従って、キシロースからのMEG（またはグリコール酸）の発酵生成（WO2013/126721）は、キシロースを原料として使用すること（入手性、価格、純度、グルコースによるキシロース利用の阻害）、および高い効率/生産性で実証されていないC3経路を使用することに関する課題を提起している。そのうえ、+0 ATP（またはグリセリン酸キナーゼを使用しない場合、-1 ATP）というATP不足があり、これは細胞の維持に不十分である。
キシロースからキシルロース-1-リン酸を介したMEGのさらに実証された発酵生成（Alkim et al., Microb Cell Fact (2015) 14:127）は、WO2013/126721によって記載されたルートと非常に類似している。これは、同じく高い潜在収量（0.82g/g）を有し、DHAPを介したMEG生成のためにC3ストリームを実行することが困難であり、ATP不足および原料の課題を有する。
キシロースからキシロン酸を介したMEGの別の実証された発酵生成（WO2013/119020）は、WO2013/126721によって記載されるルートと類似性を共有する。これは、主要な中間体としてグリコールアルデヒドおよびピルビン酸を生成し、グリコールアルデヒドからのMEG生成を0.41g/gの潜在収量で可能にする。これはフラックスのわずか半分で達成されるので、高い相対収量に相当する。しかし、WO2013/119020などに残りのピルビン酸をMEGに変換する経路は提示されていない。現在、ピルビン酸をMEGに変換するための現実的で効率的な経路は知られていない。同時生成物としてのピルビン酸自体により、酸化還元中立（redox neutral）（+0 NADH）なプロセス全体が可能になるであろうが、一方、ピルビン酸は経済的に興味がもたれる生成物ではなく、プロセスに1 ATP（おそらく、ピルビン酸搬出のため、さらに約2 ATP）が不足するであろう。従って、理想的には、余分なATPを送達する、ピルビン酸から誘導された経済的に関心がもたれる同時生成物が高い収量で必要である。従って、キシロースからキシロン酸を介したMEGの発酵生成（WO2013/119020）は、キシロースを原料として使用すること（入手性、価格、純度、グルコースによるキシロースの利用阻害）、MEGの低い絶対収量、ATP不足（同時生成物に依存、ピルビン酸では-1～-3 ATPの可能性もある）、ピルビン酸から誘導された同時生成物が高い潜在収量および余分なATPと共に必要なことに関する課題を提起している。
本開示は、D-キシロースからの高収率のMEG生成のためのさらなる解決策を提示する。しかしながら、以前の解決策とは異なり、この解決策は、同じコア分解経路を使用して、D-グルコースからの高収率のMEG生成も可能にする。
MEGおよびDHAPから派生する化合物の高収率同時生成
本開示は、還元当量を必要とするMEGと、アセトン、2-プロパノール、プロペン、イソブテン、および/またはセリン経路化合物のような、生合成経路が還元当量を生成する化合物との同時生成のための有利な高収率経路も可能にする。いくつかの態様において、セリン経路化合物は、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、および/またはエチレンジアミン（EDA）を含む。MEGと他の化合物との相乗的な同時生成は、以前に記載されているが（その全体が本明細書に各々組み入れられる米国出願第62/305,814号、米国出願第62/430,742号、および米国出願第62/406,684号を参照すること）、この解決策は、D-キシロースの利用を可能にするのみならず、D-グルコース、およびD-グルコースとD-キシロースとの混合物の利用も可能にし、同じ高い収率および相乗的な同時生成の利点を有する。
グリコール酸（GA）の高収率生成
D-グルコースからGAへの記載されている経路も、3-ホスホグリセリン酸およびL-セリン経路反応を通して、またはグリオキシル酸シャントを介して、進行する。いずれのケースにおいても、1グリコール酸当たり1個のCO2が失われ、これは、やはり過剰であり、熱力学的最大収量ポテンシャル（1.7g/g）よりはるかに低い、わずか0.84g/gという最大収率をもたらす：
1 D-グルコース → 2 GA + 2 CO2 + 6 NADH、y = 0.84g/g
GAの生成のための改善された収率を有する新しい経路が記載されている（WO2016079440、WO2013126721、WO2013119020）。しかしながら、それらは、現在、製品として容易に入手可能ではない、D-キシロースが炭素源として使用される場合にのみ有効である：
1 D-キシロース → 2 GA + 1 CO2 + 4 NADH、y = 1.01g/g
本開示の組成物および方法を使用すれば、（非酸化ペントースリン酸経路による）D-グルコースからの収率が、有意に増加する。それは、同じ収率で、D-キシロースによっても有効である（図5）：
5/6 D-グルコースまたは1 D-キシロース → 2 GA + 1 CO2 + 4 NADH、y = 1.01g/g
D-グルコースまたはD-キシロースを使用した本開示の経路に対して、D-グルコースまたはD-キシロースを使用した標準的な経路を介したMEG（またはグリコール酸、GA）の生成について、以下の化学量論が与えられる。
MEGまたはGAの生成のための（WO2010/076324またはWO2011/130378A1に開示されているような）標準的なD-グルコース経路に関連した化学量論：
1 D-グルコース → 2 GA + 6 NADH + 0 ATP；y = 0.844g/g、または
1 D-グルコース → 2 MEG + 4 NADH + 0 ATP；y = 0.689g/g
MEGまたはGAの生成のためのD-グルコースを使用した本開示の経路に関連した化学量論：
2.5 D-グルコース + 2.5 ATP + 0.5 リン酸 → 3 R5P → 3 GA + 3 DHAP + 3 NADH → 6 GA + 12 NADH + 3 ATP
1 D-グルコース → 2.4 GA + 4.8 NADH + 1.2 ATP；y = 1.01g/g、または
1 D-グルコース → 2.4 MEG + 0 NADH + 1.2 ATP、y = 0.827g/g
MEGまたはGAの生成のための（WO2013/126721またはAlkim et al., Microb Cell Fact(2015)14:127に開示された経路のような）標準的なD-キシロース経路に関連した化学量論：
1 D-キシロース → 2 GA + 4 NADH - 1 ATP＊；y = 1.01g/g、または
1 D-キシロース → 2 MEG + 0 NADH - 1 ATP＊；y = 0.827g/g
＊XylFGH活性キシロースインポーターの代わりにXylEシンポーターが使用される場合には、およそ-0.1 ATP
MEGまたはGAの生成のためのD-キシロースを使用した本開示の経路に関連した化学量論：
1 D-キシロース + 2 ATP → D-キシルロース5-P → D-リボース5-P → GA + 1 NADH + DHAP → 2 GA + 4 NADH + 1 ATP
1 D-キシロース → 2 GA + 4 NADH - 1 ATP＊；y = 1.01g/g、または
1 D-キシロース → 2 MEG + 0 NADH - 1 ATP＊；y = 0.827g/g
＊XylFGH活性キシロースインポーターの代わりにXylEシンポーターが使用される場合には、およそ-0.1 ATP
モノエチレングリコール（MEG）
モノエチレングリコール（MEG）は、産業的適用のための重要な原材料である。MEGの主な用途は、ポリエチレンテレフタレート（PET）樹脂、フィルム、および繊維の製造である。さらに、MEGは、不凍液、冷却水、航空機の防氷装置および除氷装置、ならびに溶媒の生成において重要である。MEGは、エタン-1,2-ジオールとしても公知である。
エチレングリコールは、例えば、自動車および液冷コンピュータにおいて、対流熱伝達媒体としても使用される。
高い沸点および水に対する親和性のため、エチレングリコールは、有用な乾燥剤である。エチレングリコールは、遠隔ガス田からガス処理施設まで天然ガスを運搬する長い多相パイプラインにおいて天然ガスクラスレート（水和物）の形成を阻害するために広く使用されている。エチレングリコールは、天然ガスから回収され、水および無機塩を除去する精製処理の後に阻害剤として再使用され得る。
エチレングリコールのマイナーな用途には、コンデンサーの製造における用途、1,4-ジオキサンの製造における化学的中間体としての用途、およびパソコンのための液冷系における腐食を防止するための添加剤としての用途が含まれる。エチレングリコールは、いくつかのワクチンの製造においても；靴ずみ、インク、および色素の微量成分としても；森のための腐敗および真菌処理としても；生物学的標本のための保存剤としても、使用される。
グリコール酸
グリコール酸は、染料およびなめし剤として繊維工業に、香味料および保存料として食品加工に、ならびにスキンケア剤として製薬工業に使用される。これは、接着剤およびプラスチック中にも使用される。グリコール酸は、しばしば、フロー特性を改善し、光沢を付与するためにインクおよびペンキ用の乳化ポリマー、溶媒および添加剤中に含まれる。これは、タイル床の摩擦係数を増加させるための表面処理製品中に使用される。
皮膚を透過するその優れた能力により、グリコール酸は、皮膚の外観および肌理を改善するためのスキンケア製品に応用される。これは、皮膚科医が行うケミカルピールとして20～70％の濃度で、または家庭用キットとして10から20％の間のより低い濃度で使用することができる。濃度に加えて、pHもまた溶液中のグリコール酸の効力を決定することに大きな役割を果たす。
グリコール酸は、様々な方法で合成することができる。主なアプローチは、その低いコストから、ホルムアルデヒドと合成ガスとの触媒反応（ホルムアルデヒドのカルボニル化）を使用する。これはまた、クロロ酢酸と水酸化ナトリウムとの反応に続く再酸性化によって調製される。あまり使用されていない他の方法は、シュウ酸の水素化、およびホルムアルデヒドに由来するシアノヒドリンの加水分解を含む。今日のグリコール酸の一部はギ酸不含である。グリコール酸は、サトウキビ、テンサイ、パイナップル、カンタループおよび未熟のブドウなどの天然供給源から単離することができる。
グリコール酸は、有機合成に、酸化-還元、エステル化および長鎖重合を含む一連の反応で有用な中間体である。これは、ポリグリコール酸および他の生体適合性コポリマー（例えばPLGA）の調製にモノマーとして使用される。商業的には、重要な誘導体には、容易に蒸留可能なメチルエステル（CAS# 96-35-5）およびエチルエステル（CAS# 623-50-7）が含まれる。ブチルエステルは、一部のワニスの成分であって、不揮発性であり、良好な溶解特性を有するので望ましい。
アセトン
（プロパノンとしても公知である）アセトンは、式(CH3)2COを有する有機化合物である。それは、無色、揮発性、可燃性の液体であり、最も単純なケトンである。
アセトンは、水と混和性であり、典型的には、実験室における洗浄のための重要な溶媒として役立つ。主として、溶媒として使用するため、そしてメタクリル酸メチルおよびビスフェノールAの生成のため、670万トン超が世界中で生成されている。それは、有機化学における一般的なビルディングブロックである。アセトンの周知の家庭用の用途は、除光液の活性成分としての用途、およびペンキ希釈剤としての用途である。
イソプロパノール
イソプロパノールとも呼ばれるイソプロピルアルコール（IUPAC名2-プロパノール）は、化学式C3H8OまたはC3H7OHまたはCH3CHOHCH3を有する化合物である。それは、強い臭いを有する無色の可燃性の化学的化合物である。それは、(CH3)2CHOHとして時に示される、2個の他の炭素原子にアルコール炭素原子が付着した二級アルコールの最も単純な例である。それは、プロパノールの構造異性体である。それは、多様な産業用および家庭用の用途を有する。
プロピレンまたはメチルエチレンとしても公知のプロペンは、化学式C3H6を有する不飽和有機化合物である。それは、1個の二重結合を有し、アルケンクラスの炭化水素の2番目に単純なメンバーである。
プロペンは、化石燃料（石油、天然ガス）から生成され、はるかに少ない程度に、石炭から生成される。プロペンは、油精製および天然ガス処理の副生成物である。
イソブテン
イソブテン（イソブチレンまたは2-メチルプロペンとしても知られる）は、工業的に重要な炭化水素である。これは、ブチレン（ブテン）の4つの異性体の1つである4炭素分岐アルケン（オレフィン）である。標準的な温度および圧力で、これは無色の可燃性気体である。
イソブテンは、多様な生成物の生成における中間体として使用される。これは、ガソリン含酸素剤であるメチルtert-ブチルエーテル（MTBE）およびエチルtert-ブチルエーテル（ETBE）の製造において、それぞれメタノールおよびエタノールと反応される。ブタンを用いたアルキル化は、別の燃料添加剤であるイソオクタンを生成する。イソブテンはまた、メタクロレインの生成にも使用される。イソブテンの重合は、ブチルゴム（ポリイソブテン）を生成する。ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）およびブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）などの抗酸化物は、イソブテンを使用するフェノールのフリーデル-クラフツアルキル化によって生成される。
ポリマーおよび化学等級イソブテンは、典型的には第三級ブチルアルコールの脱水またはイソブタンの触媒的脱水素によって得られる。ガソリン含酸素剤、MTBEおよびETBEは、一般的にメタノールまたはエタノールを、オレフィンストリーム分解装置または精製所からのブテンストリーム中に含有されるイソブテンと反応させることによって生成される。残りのブテンからエーテルを分離する方が簡単であるので、イソブテンは反応前に単離されない。
セリン経路化合物
MEG（またはグリコール酸）と同時生成され得る化合物には、セリン経路化合物、例えば、セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）およびエチレンジアミン（EDA）が含まれる。
セリンは、人体で合成することができる可欠アミノ酸である。高度に水溶性であるので、セリンは医薬－化粧品工業のローション中に保湿剤として応用されている。さらに、セリンは、プラスチック、洗剤、栄養補助食品および多種多様な他の製品などの他の化学物質に変換することができるので、化学工業にセリンの巨大な市場がある。実際にセリンは、石油工業由来の化学物質に取って代わる30種のもっとも有望な生物学的物質の1つであると指摘されている。
セリンのα-脱炭酸は、除草剤工業、織物工業、金属工業、洗剤工業、プラスチック工業、およびパーソナルケア製品工業における中間体として年間数十万トンに達する生産量で使用される工業用品であるエタノールアミンをもたらす（Scott, E. et al. (2007) Biomass in the manufacture of industrial products-the use of proteins and amino acids. Appl Microbiol Biotechnol. 75(4): 751-762）。
最も単純なアミノ酸であるグリシンは、医薬および工業応用に貴重である。グリシンは、ペットフードおよび動物飼料に添加剤として含まれる。ヒトに関して、グリシンは甘味料/調味料（taste enhancer）として販売されている。ある種の栄養補助食品およびプロテイン飲料はグリシンを含有する。ある種の医薬製剤は、薬物の胃吸収を改善するためにグリシンを含む。グリシンは、制酸薬、鎮痛薬、制汗薬、化粧品、およびトイレタリー中の緩衝剤として役立つ。スポンジゴム製品、肥料および金属錯化剤の生成のように、種々雑多な製品がグリシンまたはその誘導体を使用している。グリシンはまた、多種多様な化学生成物の合成における中間体としても貴重である。グリシンは、除草剤グリホセートの製造に使用される。グリシンをシュウ酸に変換することができ、シュウ酸は、織物およびパルプ工業ならびに廃水処理における漂白剤として使用されている。グリシンはまた、実験研究、例えばゲル電気泳動にも広く使用されている。
エチレンジアミン（EDA）（1,2-ジアミノエタン、C2H4(NH2)2）は、多くの工業用化学物質の生成のために大量に使用される。これは、カルボン酸（脂肪酸を含む）、ニトリル、アルコール（高温で）、アルキル化剤、二硫化炭素、ならびにアルデヒドおよびケトンと共に誘導体を形成する。2つのアミンを有するというその二官能性のせいで、これは、イミダゾリジンのような複素環を容易に形成する。エチレンジアミンの最も顕著な誘導体は、エチレンジアミンから、シアン化物およびホルムアルデヒドを伴うストレッカー合成を介して誘導されるキレート剤EDTAである。ヒドロキシエチルエチレンジアミンは、別の商業的に重要なキレート剤である。一部の抗ヒスタミン剤を含む数多くの生物活性化合物および薬物がN-CH2-CH2-N結合を含有する。エチレンビスジチオカルバメートの塩は、ブランド名Maneb、Mancozeb、Zineb、およびMetiramで商業的に重要な殺真菌薬である。一部のイミダゾリン含有殺真菌薬はエチレンジアミンに由来する。エチレンジアミンは、一般的な気管支拡張薬アミノフィリン中の成分であり、そこでエチレンジアミンは活性成分テオフィリンを可溶化するために役立つ。エチレンジアミンはまた、皮膚科用製剤中にも使用されている。薬学的賦形剤として使用される場合、経口投与後のかなりの初回通過効果のせいでそのバイオアベイラビリティーは約0.34である。20％未満が尿排泄により消失する。エチレンジアミンは、2つのアミン基を含有するので、様々なポリマーに広く使用される前駆物質である。ホルムアルデヒドに由来する縮合物は可塑剤である。これは、ポリウレタン繊維の生成に広く使用されている。PAMAMクラスのデンドリマーはエチレンジアミンに由来する。漂白活性化剤テトラアセチルエチレンジアミンはエチレンジアミンから発生する。誘導体N,N-エチレンビス（ステアラミド）（EBS）は、商業的に重要な離型剤ならびにガソリンおよびモーターオイル中の界面活性剤である。
エチレンジアミンはまた、アルブミンおよびカゼインなどのタンパク質を可溶化するための溶媒、ある種の電気めっき浴、ペンキおよび冷却材中の防錆剤、カラー写真現像用の化学物質、結合剤、接着剤、衣類用柔軟剤、エポキシ用の硬化剤、ならびに染料として使用される。二ヨウ化水素酸エチレンジアミン（EDDI）はヨウ素源として動物飼料に添加される。
酵素
MEGもしくはグリコール酸、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との本明細書に開示される生合成経路に使用され得る例示的な酵素を表1に記載する。
（表１）
Figure 2022521905000010
Figure 2022521905000011
Figure 2022521905000012
Figure 2022521905000013
Figure 2022521905000014
Figure 2022521905000015
Figure 2022521905000016
Figure 2022521905000017
Figure 2022521905000018
Figure 2022521905000019
Figure 2022521905000020
Figure 2022521905000021
Figure 2022521905000022
Figure 2022521905000023
Figure 2022521905000024
Figure 2022521905000025
Figure 2022521905000026
グリコールアルデヒドレダクターゼ（EC 1.1.1.77）
本開示は、以下の可逆反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000027
グリコールアルデヒドレダクターゼは、ラクトアルデヒドレダクターゼ、プロパンジオールオキシドレダクターゼ、(R)[もしくは(S)]-プロパン-1,2-ジオール:NAD+オキシドレダクターゼ、またはL-1,2-プロパンジオールオキシドレダクターゼとしても公知であり得る。
従って、いくつかの態様において、本開示は、エチレングリコール分解経路、グリコールの代謝および分解のスーパーパスウェイ、嫌気的L-ラクトアルデヒド分解経路、ならびに/またはフコースおよびラムノースの分解のスーパーパスウェイにおいて役割を果たす酵素を提供する。一つの態様において、酵素は、補助因子としてFe2+を使用し得る。
L-1,2-プロパンジオールオキシドレダクターゼは、鉄依存性III群デヒドロゲナーゼである。それは、L-フコースおよびL-ラムノースの両方の異化経路の生成物、L-ラクトアルデヒドを、L-1,2-プロパンジオールへ嫌気的に還元し、次いで、それは細胞から排出される。
酵素の結晶構造が解析され、金属、補助因子、および基質の結合部位が位置し得るドメインスワッピングによる二量体（domain-swapped dimer）が示されている。1個のアスパラギン酸残基および3個の保存されたヒスチジン残基が、Fe2+結合および酵素活性のために必要とされる。
インビトロで、酵素は、高濃度のNAD+によって不活化され、Fe3+およびアスコビル酸またはFe2+およびH2O2の混合物によって効率的に再活性化され得る。保存されたHis277残基の金属によって触媒される酸化は、不活化の原因となることが提唱されている。
FucOの発現は、β酸化サイクルの操作された1回転の逆転を可能にする。FucO活性は、操作された株において、イソブチルアルデヒドのイソブタノールへの変換に寄与する。
具体的な態様において、酵素は、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、fucO遺伝子によってコードされる。
一つの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、大腸菌および出芽酵母より選択される微生物から入手される1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。もう一つの態様において、1つまたは複数の核酸分子は、gldA、GRE2、GRE3、yqhD、ydjG、fucO、yafB（dkgB）、および/もしくはyqhE（dkgA）、またはそれらの相同体より選択される。もう一つの態様において、1つまたは複数の核酸分子は、yqhDである。いくつかの態様において、yqhDは、G149E変異を含む。さらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、SEQ ID NO:13、15、17、20、23、25、28、30、および32からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに、さらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、SEQ ID NO:12、14、16、18、19、21、22、24、26、27、29、および31からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、グリコール酸を生成する組換え微生物は、グリコールアルデヒドのモノエチレングリコール（MEG）への変換を防止し、その代わりに、グリコールアルデヒドのグリコール酸（GA）への変換に向かって反応をシャントするため、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異を含む。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来である。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、fucO遺伝子またはその相同体によってコードされる。
アルデヒドレダクターゼ
多数のアルデヒドレダクターゼが、グリコールアルデヒドをMEGへ変換するために使用され得る。
NADPH依存性アルデヒドレダクターゼ（YqhD）は、以下の反応を触媒することができる：
Figure 2022521905000028
YqhDは、グリオキサール解毒に関与することができ、かつ/または脂質過酸化に対するグルタチオン非依存性応答の一部である、NADPH依存性アルデヒドレダクターゼである。
様々なアルコール、アルデヒド、アミノ酸、糖、およびαヒドロキシ酸が、YqhDの基質として試験されたことが報告されている。精製されたタンパク質のみが、C(3)より長いアルコールを好み、NADP依存性アルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すが、Km値はミリモル範囲であり、そのことから、それらが生理学的基質ではないことが示唆される。対照的に、YqhDは、プロパンアルデヒド、アセトアルデヒド、およびブタンアルデヒド、ならびにアクロレインおよびマロンジアルデヒドのような基質で短鎖アルデヒドレダクターゼ活性を示す。代謝的に操作された株において、フェニルアセトアルデヒドおよび4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドは、内在性アルデヒドレダクターゼYqhD、YjgB、およびYahKによって、2-フェニルエタノールおよび2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノールへ還元される。
YqhDの過剰発現は、細胞の1,3-プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を増加させる。1,3-プロパンジオールの産業的生成のため、YqhDを発現するよう大腸菌が操作されている。YqhD活性は、イソブタノール、1,2-プロパンジオール、1,2,4-ブタントリオール、およびアセトールの生成にも同様に寄与する。yqhDの変異は、β酸化サイクルの操作された1回転の逆転によるブタノールの生成を可能にする。
YqhDは、フルフラールレダクターゼ活性を有し、リグノセルロースバイオマスからアルコールを生成する代謝的に操作された株において、NADPHの枯渇による増殖阻害を引き起こすようである。
YqhDの結晶構造は、2Åの解像度で解析された。YqhDは、二量体の非対称二量体であり、活性部位はZn2+イオンを含有している。NADPH補助因子は、ニコチンアミド環の5位および6位においてヒドロキシル基によって修飾される。
yqhDの過剰発現は、過酸化水素、パラコート、クロム酸、およびテルル酸カリウムのような活性酸素発生化合物に対する増加した耐性をもたらす。yqhD欠失変異株は、これらの化合物およびグリオキサールに対する増加した感受性を示し、脂質過酸化において作成される反応性アルデヒドの増加したレベルを含有している。反対に、yqhD欠失は、増加したフルフラール耐性をもたらす。
具体的な態様において、NADPH依存性アルデヒドレダクターゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、NADPH依存性アルデヒドレダクターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、NADPH依存性アルデヒドレダクターゼは、yqhD遺伝子によってコードされる。
多機能性メチルグリオキサールレダクターゼ（DkgA）は、以下の反応を触媒することができる：
Figure 2022521905000029
DkgA（YqhE）は、アルド・ケトレダクターゼ（AKR）ファミリーに属し、メチルグリオキサールレダクターゼ活性およびβケトエステルレダクターゼ活性を有することが示されている。
dkgAは、大腸菌における2つの25DKGレダクターゼのうちの1つである、2,5-ジケト-D-グルコン酸レダクターゼ（25DKGR）Aをコードすることが報告されている。酵素は、好ましい電子ドナーとしてNADPHを使用し、ケトグルコン酸代謝に関与していると考えられる。2,5-ジケト-D-グルコン酸に対する酵素の比活性は、メチルグリオキサールに対する活性よりほぼ1000倍低いことが報告されている。
NADPHに対する低いKmのため、DkgAによるフランの還元は、NADPHプールを枯渇させ、それによって、細胞の生合成を制限することができる。アルデヒドレダクターゼの広範な調査は、DkgAが、代謝工学の所望のアルデヒド最終生成物の分解に寄与する数種類の内在性アルデヒドレダクターゼのうちの1つであることを示した。
DkgAの結晶構造は、2.16Åの解像度で解析された。
具体的な態様において、多機能性メチルグリオキサールレダクターゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、多機能性メチルグリオキサールレダクターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、多機能性メチルグリオキサールレダクターゼは、dkgA遺伝子によってコードされる。
多機能性メチルグリオキサールレダクターゼ（DkgB）は、以下の反応を触媒することができる：
Figure 2022521905000030
DkgB（YafB）は、アルド・ケトレダクターゼ（AKR）サブファミリー3Fのメンバーである。DkgBは、2,5-ジケト-D-グルコン酸レダクターゼ活性、メチルグリオキサールレダクターゼ活性、および4-ニトロベンズアルデヒドレダクターゼ活性を有することが示された。
dkgBは、大腸菌における2つの25DKGレダクターゼのうちの1つである、2,5-ジケト-D-グルコン酸レダクターゼ（25DKGR）Bをコードすることが報告されている。酵素は、好ましい電子ドナーとしてNADPHを使用し、ケトグルコン酸代謝に関与すると考えられている。しかしながら、2,5-ジケト-D-グルコン酸に対する酵素の比活性は、メチルグリオキサールに対する活性よりほぼ1000倍低いことが報告されている。
具体的な態様において、多機能性メチルグリオキサールレダクターゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、多機能性メチルグリオキサールレダクターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、多機能性メチルグリオキサールレダクターゼは、dkgB遺伝子によってコードされる。
メチルグリオキサールレダクターゼ（YeaE）は、以下の反応を触媒することができる：
Figure 2022521905000031
YeaEは、メチルグリオキサールレダクターゼ活性を有することが示されている。
YeaEのサブユニット構造は決定されていないが、アルド・ケトレダクターゼDkgA（YqhE）およびDkgB（YafB）とのアミノ酸配列類似性は、それが単量体であることを示唆する。
具体的な態様において、メチルグリオキサールレダクターゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、メチルグリオキサールレダクターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、メチルグリオキサールレダクターゼは、yeaE遺伝子によってコードされる。
L-グリセルアルデヒド3-リン酸レダクターゼ（yghZ）は、以下の反応を触媒することができる：
Figure 2022521905000032
YghZは、L-グリセルアルデヒド3-リン酸（L-GAP）レダクターゼである。酵素は、低い速度でメチルグリオキサールを解毒することもできる。YghZは、AKR14（アルド・ケトレダクターゼ14）タンパク質ファミリーを定義する。
L-GAPは、天然の代謝物でなく、大腸菌に対して毒性である。L-GAPは、大腸菌K-12のグリセロール-3-リン酸輸送系およびヘキソースリン酸輸送系の両方の基質である。YghZの生理学的役割は、GAPの非酵素的ラセミ化または未知の細胞過程によって形成され得るL-GAPの解毒であると仮定されている。
大腸菌酵素の結晶構造は、決定されており、四量体であることが示唆されている。しかしながら、他の者は、ゲルろ過および電子顕微鏡研究に基づき、タンパク質が八量体を形成することを見出している。
具体的な態様において、L-グリセルアルデヒド3-リン酸レダクターゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、L-グリセルアルデヒド3-リン酸レダクターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、L-グリセルアルデヒド3-リン酸レダクターゼは、yghZ遺伝子によってコードされる。
L-1,2-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ/グリセロールデヒドロゲナーゼ（GldA）は、以下の反応を触媒することができる：
Figure 2022521905000033
GldA酵素の生理学的機能は、長い間、不明であった。酵素は、グリセロールデヒドロゲナーゼおよびD-1-アミノ-2-プロパノール：NAD+オキシドレダクターゼとして無関係に単離された。当時、D-1-アミノ-2-プロパノールは、ビタミンB12の生合成の中間体であると考えられおり、大腸菌は新たにビタミンB12を合成することができないが、この化合物の合成を触媒する酵素が求められた。その後、GldAは両方の活性を担うことが見出された。
GldAの主なインビボの役割は、グリセロールへの変換によるジヒドロキシアセトンの除去であることが最近提唱された。しかしながら、グリセロールの発酵における二重の役割も最近確立された。大腸菌におけるグリセロール異化は、2つの異なる経路によって達成され得る。グリセロールおよびグリセロホスホジエステルの分解経路は、終末電子アクセプターの存在を必要とし、グリセロールをグリセロール-3-リン酸へリン酸化するGlp系のATP依存性キナーゼを利用する。しかしながら、キナーゼの不活化およびグリセロールでの増殖についての選択によって、NAD+関連デヒドロゲナーゼGldAが、グリセロール発酵を支持し得ることが見出された。最近、GldAは、ジヒドロキシアセトンを生成するグリセロールデヒドロゲナーゼとしても、アセトールから1,2-プロパンジオールを生成することによってNAD+を再生させる1,2-プロパンジオールデヒドロゲナーゼとしても、グリセロール発酵に関与していることが示された。
酵素は、2つの触媒活性形態、8サブユニットの大きい形態および2サブユニットの小さい形態で見出される。大きい形態が、主要な種であるようである。
具体的な態様において、L-1,2-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ/グリセロールデヒドロゲナーゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、L-1,2-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ/グリセロールデヒドロゲナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、L-1,2-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ/グリセロールデヒドロゲナーゼは、gldA遺伝子によってコードされる。
出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）に由来するNADPH依存性メチルグリオキサールレダクターゼ（GRE2）は、以下の反応を触媒することができる：
Figure 2022521905000034
Gre2は、補助因子としてNADPHを使用して、脂肪族および芳香族のケトン、ジケトン、およびアルデヒドを含む広範囲の基質の立体選択的な還元を触媒する多用途の酵素である。
出芽酵母に由来するGre2の結晶構造は、アポ型については2.00Å、NADPH複合体化型については2.40Åの解像度で解析されている。Gre2は、同種二量体を形成し、そのサブユニットは、各々、N末端ロスマンフォールドドメインおよび基質認識に関与する可変性のC末端ドメインを含有している。補助因子NADPHとの結合時に誘導される適合は、2個のドメインを相互に向かってシフトさせ、基質によりよく適合するドメイン間間隙を生成する。部位特異的変異誘発および酵素活性分析と組み合わせられた計算的シミュレーションは、触媒作用のためのストリンジェントな基質立体選択性を決定する、可能性のある基質結合ポケットの特徴決定を可能にした。
Gre2は、グリオキサラーゼI GLO1によるMGの解毒の代わりに、細胞傷害性化合物メチルグリオキサール（MG）の(S)-ラクトアルデヒドへの不可逆的還元を触媒する。MGは、ジヒドロキシアセトンリン酸から解糖のバイパスを介して合成され、細胞周期制御およびストレス適応において役割を果たすと信じられている。GRE2は、イソバレルアルデヒドのイソアミルアルコールへの還元も触媒する。酵素は、細胞がフィラメント形成によって応答するシグナル、イソバレルアルデヒドのレベルをモジュレートすることによって、イソアミルアルコールによって誘導されるフィラメント形成を抑制するよう機能する。GRE2は、エルゴステロール代謝にも関与している。
具体的な態様において、NADPH依存性メチルグリオキサールレダクターゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、NADPH依存性メチルグリオキサールレダクターゼは、出芽酵母に由来する。いくつかの態様において、NADPH依存性メチルグリオキサールレダクターゼは、GRE2遺伝子によってコードされる。
チオラーゼ/アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.9）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000035
チオラーゼ/アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼはまた、アセチルCoA-C-アセチルトランスフェラーゼ、アセトアセチルCoAチオラーゼ、アセチルCoA：アセチルCoA C-アセチルトランスフェラーゼまたはチオラーゼIIとしても知られる場合がある。
従って、いくつかの態様において、本開示は、（アセチルCoAへの）アセト酢酸分解に役割を果たす酵素を提供する。一態様において、この酵素の阻害剤は、アセトアセチルCoAであり得る。
特定の態様において、この酵素は、アセチルCoAをアセトアセチルCoAに変換する。一態様において、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、クロストリジウム属の種（Clostridium sp.）、バチルス属の種（Bacillus sp.）、大腸菌、サッカロミセス属の種（Saccharomyces sp.）およびマリノバクター属の種（Marinobacter sp.）からなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリクム、クロストリジウム・サーモサッカロリティクム（Clostridium thermosaccharolyticum）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエおよびマリノバクター・ヒドロカルボノクラスチクス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）からなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、1つまたは複数の核酸分子は、thlA、atoBおよび/もしくはERG10、またはそれらのホモログである。さらなる態様において、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、SEQ ID NO：35、37および40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、SEQ ID NO：33、34、36、38および39からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼ（EC 2.8.3.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000036
アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼは、酢酸：アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはアセトアセチルCoAトランスフェラーゼとしても公知であり得る。
従って、いくつかの態様において、本開示は、（アセチルCoAへの）アセト酢酸分解において役割を果たす酵素を提供する。一態様において、この酵素の阻害剤には、アセチルCoAおよび補酵素Aが含まれ得る。
短鎖脂肪酸（C3～C6）での大腸菌の増殖は、それぞれのチオエステルへの酸の活性化を必要とする。この活性化は、アセトアセチルCoAトランスフェラーゼによって触媒される。その反応は、共有結合性の酵素-CoAを含む2つの半反応において起こる。酵素は、反応中に2個の検出可能なコンフォメーション変化を受ける。反応はピンポン機構によって進行する可能性が高いと考えられる。酵素は、多様な短鎖アシルCoA基質およびカルボン酸基質を利用することができるが、直鎖状の基質および3-ケト基質で最大活性を示す。
具体的な態様において、酵素は、アセトアセチルCoAをアセト酢酸へ変換する。いくつかの態様において、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼは、クロストリジウム属の複数種（Clostridium spp.）に由来する。いくつかの態様において、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリクムに由来する。いくつかの態様において、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼは、atoA遺伝子およびatoD遺伝子によってコードされる。別の態様において、アセトアセチルCoAトランスフェラーゼのサブユニット組成は、[(AtoA)2][(AtoD)2]であり、(AtoA)2がβ複合体であり、(AtoD)2がα複合体である。一態様において、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼは、融合したアセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼ：αサブユニット/βサブユニットである。別の態様において、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼは、ydiF遺伝子によってコードされる。
酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ（EC 3.1.2.11）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000037
アセトアセチルCoAヒドロラーゼは、アセトアセチル補酵素Aヒドロラーゼ、アセトアセチルCoAデアシラーゼ、またはアセトアセチル補酵素Aデアシラーゼとしても公知であり得る。
この酵素は、ヒドロラーゼのファミリー、具体的には、チオエステル結合に作用するものに属している。
具体的な態様において、酵素は、アセトアセチルCoAをアセト酢酸へ変換する。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼは、クロストリジウム属の種に由来する。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリクムに由来する。もう一つの態様において、アセトアセチルCoAヒドロラーゼは、ctfA（サブユニットA）遺伝子および/またはctfB（サブユニットB）遺伝子によってコードされる。
さらなる態様において、アセチルCoA: アセト酢酸CoAトランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼは、SEQ ID NO:43、46、97、99、101、および103からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに、さらなる態様において、アセチルCoA: アセト酢酸CoAトランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼは、SEQ ID NO:41、42、44、45、96、98、100、および102からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
アセト酢酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.4）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
アセト酢酸＋H+→アセトン＋CO2
アセト酢酸デカルボキシラーゼは、ADC、AADC、またはアセト酢酸カルボキシリアーゼとしても公知であり得る。
従って、いくつかの態様において、本開示は、イソプロパノール生合成、ピルビン酸のアセトンへの発酵、クロストリジウム・アセトブチリクムの酸生成発酵およびソルベント生成発酵のスーパーパスウェイ、ならびに/またはクロストリジウム・アセトブチリクムのソルベント生成発酵のスーパーパスウェイにおいて役割を果たす酵素を提供する。
アセト酢酸デカルボキシラーゼ（ADC）は、クロストリジウム・アセトブチリクムにおけるソルベント生成において重要な役割を果たす。増殖の酸生成期においては、酸が蓄積し、ソルベント生成への代謝シフトを引き起こす。この期においては、酸が、再同化され、代謝され、アセトン、ブタノール、およびエタノールが生成される。
酵素の予備精製および結晶化は、リジン残基が活性部位に関与することを明らかにした。酵素は、単一の型のサブユニットの12コピーから構成される大きい複合体である。
クロストリジウム・アセトブチリクムATCC 824の酵素が精製され、それをコードするadc遺伝子がクローニングされている。関連株クロストリジウム・アセトブチリクムDSM 792からも酵素が精製され、遺伝子がクローニングされ配列決定されている。脱カルボキシル反応は、シッフ塩基中間体の形成によって進行する。
ADCは、CoAトランスフェラーゼ反応をアセト酢酸形成の方向に効果的に引き寄せる、酸取り込みにおいて重要な酵素である。
具体的な態様において、酵素は、アセト酢酸をアセトンへ変換する。一つの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、クロストリジウム属の種、バチルス属の種、クロモバクテリウム属の種、およびシュードモナス属の種からなる群より選択される微生物から入手される1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。もう一つの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリクム、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム・セルロリティカム、バチルス・ポリミキサ、クロモバクテリウム・ビオラセウム、およびシュードモナス・プチダからなる群より選択される微生物から入手される1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、adcまたはその相同体である。さらなる態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、SEQ ID NO:49および52からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらにもう一つの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、SEQ ID NO:47、48、50、および51からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
アルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.-）
本開示は、一級アルコールまたは二級アルコールの、それぞれ、アルデヒドまたはケトンへの可逆的酸化を触媒することができる酵素を記載する。一つの態様において、酵素は、二級アルコールデヒドロゲナーゼ（S-ADH）であり、アセトンのようなケトンの、2-プロパノール（イソプロパノール）のような二級アルコールへの還元を触媒する。
いくつかの態様において、S-ADHは、バークホルデリア属の種に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、バークホルデリア属種AIU 652に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、アルカリゲネス属の種に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、アルカリゲネス・ユートロファスに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、クロストリジウム属の種に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、クロストリジウム・ラグスダレイに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、クロストリジウム・ベイジェリンキイに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、サーモアナエロバクター属の種に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、サーモアナエロバクター・ブロッキイに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、サーモアナエロバクター・エタノリカス（クロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム）に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、adhB遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、S-ADHは、トリパノソーマ、フィトモナス属の種に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、ロドコッカス属の種に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、ロドコッカス・ルーバーに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、メタノバクテリウム・パルストレに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、メタン生成古細菌メタノゲニウム・リミナタンスに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、寄生性原生生物エントアメーバ・ヒストリティカ、（EhAdh1）に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、寄生性原生動物トリトリコモナス・フィータスに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、ヒト寄生虫トリコモナス・バギナリスに由来する。
いくつかの態様において、S-ADHは、相同性から予測され、サーモアナエロバクター・マスラニイ、ミクロコッカス・ルテウス、ノカルディオプシス・アルバ、マイコバクテリウム・ハッシアカム、ヘリコバクター・スイス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・オルトプシローシス、カンジダ・メタプシローシス、グロスマンニア・クラビゲラ、およびシェフェルソミセス・スチピチスに由来し得る。
いくつかの態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム属の種由来のアルコールデヒドロゲナーゼと少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する。他の態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム・ベイジェリンキイadhおよびクロストリジウム・カルボキシジボランスadhより選択されるアルコールデヒドロゲナーゼである。さらなる態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、SEQ ID NO：138および140からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、SEQ ID NO：136、137、および139からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
デヒドラターゼ（EC 4.2.1.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000038
D-キシロースイソメラーゼ（EC 5.3.1.5）
本開示は、以下の可逆反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000039
D-キシロースイソメラーゼは、キシロースイソメラーゼまたはD-キシロースケトールイソメラーゼとしても公知であり得る。
従って、いくつかの態様において、本開示は、キシロース分解において役割を果たす酵素を提供する。
キシロースイソメラーゼは、D-キシロースの異化における最初の反応を触媒する。
2個の保存されたヒスチジン残基H101およびH271が、触媒作用のために必須であることが示された。2個の保存されたトリプトファン残基W49およびW188の蛍光は、キシロースの結合において消光され、W49が触媒作用のために必須であることが示された。Mg2+、Mn2+、またはCo2+の存在は、熱変性から酵素を保護する。
サブユニット組成は、実験的に確立されていない。
具体的な態様において、酵素は、D-キシロースをD-キシルロースへ変換する。一つの態様において、組換え微生物は、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する内在性または外来性のキシロースイソメラーゼをさらに含む。一つの態様において、キシロースイソメラーゼは、外来性である。もう一つの態様において、キシロースイソメラーゼは、ピロマイセス（Pyromyces）属の種または大腸菌から入手される1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。もう一つの態様において、キシロースイソメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、xylAまたはその相同体である。さらにもう一つの態様において、キシロースイソメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:95および144より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、キシロースイソメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:93、94および143からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、MEGまたはGA、または任意でMEGもしくはGAおよび1つまたは複数の同時生成物を生成する組換え微生物は、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を防止し、代わりに、D-キシロースのD-キシロン酸への変換に反応を向けるため、D-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子に欠失、挿入、または機能喪失型変異を含む。
D-キシルロース5-キナーゼ/キシルロキナーゼ
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
D-キシルロース＋ATP→D-キシルロース5-リン酸＋ADP＋H+（EC 2.7.1.17）
ATP＋1-デオキシ-D-キシルロース→1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸＋ADP＋H+（EC 2.7.1.-）
D-キシルロース5-キナーゼは、キシルロースキナーゼまたはキシルロキナーゼとしても公知であり得る。
キシルロキナーゼは、キシロース分解経路の第2段階、D-キシルロースのリン酸化を触媒して、ペントースリン酸経路の中間体、D-キシルロース-5-リン酸を生成する。
基質の非存在下で、キシルロキナーゼは、弱いATPアーゼ活性を有する。キシルロキナーゼは、1-デオキシ-D-キシルロースのリン酸化も触媒することができる。これは、テルペノイド、チアミン、およびピリドキサールの生合成において使用するための1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸の生成のための可能性のあるサルベージ経路を可能にするであろう。1-デオキシ-D-キシルロースのリン酸化の速度は、D-キシルロースのリン酸化の速度より32倍低い。
細菌酵素の動力学的機序が研究されており、主に秩序のある反応機序が示唆された。酵素は、基質およびATPの結合時に有意なコンフォメーション変化を受ける。2個の保存されたアスパラギン酸残基D6およびD233が、触媒活性のために必須であることが見出され、触媒機序が提唱された。
細菌キシルロキナーゼのアポ型およびD-キシルロース結合型の結晶構造は、それぞれ、2.7Åおよび2.1Åの解像度で決定されている。
具体的な態様において、酵素は、D-キシルロースをD-キシルロース-5-リン酸へ変換する。いくつかの態様において、D-キシルロース5-キナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、D-キシルロース5-キナーゼは、xylB遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、D-キシルロース5-キナーゼは、出芽酵母に由来する。いくつかの態様において、D-キシルロース5-キナーゼは、XKS1遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、D-キシルロース5-キナーゼは、ピキア・スチピチス（Pichia stipitis）に由来する。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、XYL3遺伝子によってコードされる。
いくつかの態様において、D-キシルロース5-キナーゼは、大腸菌由来xylBと少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。さらなる態様において、D-キシルロース5-キナーゼは、大腸菌由来xylBと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。なおさらなる態様において、D-キシルロース5-キナーゼは、大腸菌由来xylBと少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、D-キシルロース5-キナーゼは大腸菌由来xylBである。
一態様において、D-キシルロース5-キナーゼは、大腸菌から得られた1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-キシルロース5-キナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、xylBまたはそのホモログである。別の態様において、D-キシルロース5-キナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：146に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、D-キシルロース5-キナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：145に示される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、リブロキナーゼ酵素が、D-リブロースのD-リブロース-5-リン酸へのリン酸化を触媒する。いくつかの態様において、リブロキナーゼ酵素は、大腸菌AraBによってコードされる。いくつかの態様において、リブロキナーゼ酵素は、大腸菌由来のAraB（SEQ ID NO:288）に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、リボキナーゼ酵素が、D-リボースのD-リボース-5-リン酸へのリン酸化を触媒する。いくつかの態様において、リボキナーゼ酵素は、大腸菌rbsKによってコードされる。いくつかの態様において、リブロキナーゼ酵素は、大腸菌由来のrbsK（SEQ ID NO:290）に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、キシルロキナーゼ酵素が、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸へのリン酸化を触媒する。いくつかの態様において、リボキナーゼ酵素は、T.マリティマXuKによってコードされる。いくつかの態様において、リブロキナーゼ酵素は、T.マリティマ由来のXuK（SEQ ID NO:291）に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（1.2.1.21）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000040
この酵素は、オキシドレダクターゼ、具体的には、NAD+またはNADP+をアクセプターとして、ドナーのアルデヒド基またはオキソ基に作用するもののファミリーに属する。この酵素は、グリオキシル酸およびジカルボン酸の代謝に関与する。
グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、グリコールアルデヒド:NAD+オキシドレダクターゼまたはグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼとしても公知であり得る。
大腸菌において、アルデヒドデヒドロゲナーゼA（AldA）は、小さいαヒドロキシアルデヒド基質に対する比較的広い基質特異性を有する酵素である。従って、それは、いくつかの代謝経路において利用される。
L-フコースおよびL-ラムノースは、平行な経路を通して代謝されるが、対応するアルドラーゼ反応の後に収束して、同一の生成物：ジヒドロキシ-アセトンリン酸およびL-ラクトアルデヒドを与える。好気的に、アルデヒドデヒドロゲナーゼAは、L-ラクトアルデヒドをL-ラクテートへ酸化する。
同一の酵素を利用する平行な経路において、D-アラビノースおよびL-キシロースは、ジヒドロキシ-アセトンリン酸およびグリコールアルデヒドへ代謝され、それが、アルデヒドデヒドロゲナーゼAによってグリコール酸へ酸化される。
単独の酵素、三元複合体、および二元複合体の結晶構造が解析されている。
アルデヒドデヒドロゲナーゼAは、好気条件下でのみ存在し、フコース、ラムノース、またはグルタミン酸の存在によって最も高度に誘導される。酵素は、ラクトアルデヒドの酸化から、プロパンジオールオキシドレダクターゼによる還元へシフトするためのスイッチとして機能し得るNADHによって阻害される。AldAは、グルコース制限への短期順応においてアップレギュレートされる。
配列類似性に基づき、AldAは、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼであると予測された。
aldA発現の制御は、調査されている。遺伝子は、異化産物抑制、ArcAを介した嫌気条件下での抑制、および炭素源による誘導によって制御される。
具体的な態様において、酵素は、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、aldA遺伝子によってコードされる。
いくつかの態様において、MEGもしくはグリコール酸、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成する組換え微生物は、グリコールアルデヒドからのグリコール酸の生成を妨げ、代わりに、グリコールアルデヒドからMEGへの変換に向けて反応を切り換えるために、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼの欠失、破壊、変異、および/またはその活性の低下は部分的であり、ここで、グリコール酸の量がまだ生成される。
他の態様において、グリコール酸を生成している組換え微生物は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1種類の核酸分子を含む、またはそれを発現する。
乳酸デヒドロゲナーゼ（1.1.1.28）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
(R)-乳酸 + NAD+ ← ピルビン酸 + NADH + H+
乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）は、動物、植物、および原核生物のようなほぼ全ての生細胞に見出される酵素である。LDHは、NADHからNAD+へおよびその逆の変換と同様に、乳酸からピルビン酸へおよびその逆の変換を触媒する。デヒドロゲナーゼは、ある分子からもう一つの分子へヒドリドを移す酵素である。
LDHは4つの別個の酵素クラスに存在する。最も一般的なものは、NAD(P)依存性L-乳酸デヒドロゲナーゼである。他のLDHは、D-乳酸に作用し、かつ/またはチトクロムc：D-乳酸デヒドロゲナーゼ（チトクロム）およびL-乳酸デヒドロゲナーゼ（チトクロム）に対して依存性である。
LDHは、血球および心筋のような身体組織に広範に見出されるため、医学的に重要である。それは、組織傷害において放出されるため、一般的な損傷および心不全のような疾患のマーカーである。
乳酸デヒドロゲナーゼは、ラクテートデヒドロゲナーゼ、(R)-乳酸：NAD+オキシドレダクターゼ、またはD-乳酸デヒドロゲナーゼ（発酵的）としても公知であり得る。
大腸菌において、乳酸デヒドロゲナーゼ（LdhA）は、D-乳酸の生成に特異的な可溶性NAD関連乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）である。LdhAは、ホモ四量体であり、より高いpH条件の下で正のホモトロピック協同性を示す。
大腸菌は、2つの他の乳酸デヒドロゲナーゼ：D-乳酸デヒドロゲナーゼおよびL-乳酸デヒドロゲナーゼを含有している。いずれも、ラクテートでの好気増殖のために必要とされる膜結合型フラボタンパク質である。
LdhAは、好気条件下で存在するが、大腸菌が、酸性pHにおいて嫌気条件下で多様な糖により増殖する時に誘導される。嫌気性呼吸に関与する遺伝子の大部分と異なり、ldhAは、Fnrによって活性化されず、むしろ、ArcAB系ならびに炭水化物代謝の調節に関与する数種類の遺伝子（csrABおよびmlc）が、発現を制御するようである。ldhAの発現は、転写制御因子ArcAによって負の影響を受ける。ldhAはσ32レギュロンに属する。
ldhA遺伝子は、しばしば、代謝工学における変異の標的となり、それは、望ましくない発酵副産物の生成を排除するためである場合が最も多いが、D-乳酸を特異的に生成するためでもあり得る。
具体的な態様において、酵素は、ピルビン酸を乳酸へ変換する。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、ldhA遺伝子によってコードされる。
いくつかの態様において、MEGもしくはGA、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成する組換え微生物は、ピルベートからのラクテートの生成を妨げ、代わりに、1つまたは複数の同時生成物の生成に向けて反応を切り替えるために、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（EC 1.6.1.1.）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000041
可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼは、NAD(P)＋トランスヒドロゲナーゼ（B-特異的）、STH、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、またはトランスヒドロゲナーゼとしても公知であり得る。
大腸菌は、可溶性および膜結合型の両方のピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを含有する。可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼは、sthAまたはudhA遺伝子生成物であり；その主要な生理学的役割は、NADPHの再酸化であるように見える。膜結合型プロトン輸送性トランスヒドロゲナーゼはpntAB遺伝子産物であり、PntABはNADPHの主な供給源である。
UdhAは、非共有結合型FADを含有し、7または8つの単量体からなる形態で存在する。UdhA（SthA）の中等度の過剰発現は、ホスホグルコースイソメラーゼ変異体の最大増殖速度を増加させ、pgi sthA二重変異体は生存不可能である。これらの表現型は、UdhAが過剰のNADPH形成の条件下で細胞の酸化還元バランスを回復する能力が原因であり得る。sthAにおける変異は、グルコース最少培地での増殖にpgi変異株が適応する間に出現する。sthAの転写は、グリセロールでの増殖によってダウンレギュレーションされる。
いくつかの態様において、トランスヒドロゲナーゼの発現は、NADPH依存性アルコールデヒドロゲナーゼの活性を増加させ、アセトンから2-プロパノールへの変換の改善をもたらすことができる。一態様において、可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼは、大腸菌から得られた1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様において、可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、udhAまたはそのホモログである。いくつかの態様において、可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：142に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：141に示される核酸配列によってコードされる。
ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼ（EC 2.3.3.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000042
ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼは、(S)-3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAアセトアセチルCoA-リアーゼ（CoAアセチル化）、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAシンセターゼ、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素Aシンターゼ、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素Aシンセターゼ、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAシンターゼ、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素Aシンターゼ、β-ヒドロキシ-β-メチルグルタリルCoAシンターゼ、HMG-CoAシンターゼ、アセトアセチル補酵素Aトランスアセターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aシンターゼ、およびヒドロキシメチルグルタリル補酵素A縮合酵素としても公知であり得る。
ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼは、コレステロールの前駆体(R)-メバロン酸の合成初期段階である、アセチルCoAとアセトアセチルCoAとを縮合させて(S)-3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAを形成することを触媒する。
酵素は、4つの段階に分割できる複合反応を触媒する。第一の段階は、酵素アセチルCoA二元複合体の形成に続く、CoAチオエステルから酵素のシステイン残基へのアセチル基の転移を伴い、チオエステルアシル-酵素中間体を形成する。次の段階で、今回還元されたCoAが解離し、第二の基質、アセトアセチルCoAが酵素と結合する。第三の段階は、アセチルシステインのメチルからプロトンの除去によるカルバニオンの形成を伴う。次いで、活性化されたアセチルシステインが、アセトアセチルCoAリガンドのγ-炭素とのクライゼン様縮合を受け、酵素とのチオエステル結合を保ちながらHMG-CoAを形成する。最終段階は、この結合の加水分解を含み、遊離HMG-CoAをもたらす。
ホモ・サピエンスからのHMGCS1遺伝子が、クローニングされ、配列決定されている（Russ AP et al. (1992) Amplification and direct sequencing of a cDNA encoding human cytosolic 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase. Biochim Biophys Acta 1132(3): 329-31）。この遺伝子は大腸菌に発現され、組換えタンパク質が精製され、特徴付けられた（Rokosz LL et al. (1994) Human cytoplasmic 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthase: expression, purification, and characterization of recombinant wild-type and Cys129 mutant enzymes. Arch Biochem Biophys 312(1): 1-13）。この酵素は、120kDaのホモ二量体である。触媒作用は、共有結合的アセチル-酵素中間体の形成によって進行する。速度論データは、2つの基質（アセチルCoAおよびアセトアセチルCoA）が同じ部位への結合を競合することを示唆している。
一態様において、ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼは、3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）シンターゼ活性を有することができ、以下の反応を触媒することができる：
Figure 2022521905000043
一態様において、3HIVシンターゼは、ハツカネズミ属の種（Mus sp.）、サッカロミセス属の種、ラクトバチルス属の種（Lactobacillus sp.）およびポラロモナス属の種（Polaromonas sp.）より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様において、3HIVシンターゼは、マウス、サッカロミセス・セレビシエ、ラクトバシラス・クリスパタスおよびポラロモナス・ナフタレニボランスより選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、3HIVシンターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、Hmgcs1、ERG13、PksGおよび/もしくはPnap_0477、またはそれらのホモログより選択される。さらなる態様において、3HIVシンターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：105、107、109および111からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様において、3HIVシンターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：104、106、108および110からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、hmgSまたはそのホモログである。さらなる態様において、ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：123に示されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様において、ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：122に示される核酸配列によってコードされる。
メチルグルタコニルCoAヒドラターゼ（EC 4.2.1.18）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000044
この酵素は、ロイシン分解経路における3-メチルグルタコニルCoAから(S)-3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAへの水のシン付加を触媒する。細菌酵素は、シュードモナス・プチダで特徴付けられている。この酵素は、その活性部位にグルタミル残基を2つでなく、1つだけ有し、結果として異なる反応機構をもたらすことが、哺乳動物酵素と異なる。これらの酵素は、クロトナーゼスーパーファミリーのメンバーであり（Wong BJ and Gerlt JA (2004) Evolution of function in the crotonase superfamily: (3S)-methylglutaconyl-CoA hydratase from Pseudomonas putida. Biochemistry 43(16): 4646-4654）、（Hamed RB et al. (2008) Mechanisms and structures of crotonase superfamily enzymes--how nature controls enolate and oxyanion reactivity. Cell Mol Life Sci 65(16): 2507-2527）に総説されている。
組換え酵素が大腸菌において発現され、精製され、特徴付けられた。10-Hisタグ付きポリペプチドの見かけの分子量は、ESI-MSによって32.251kDaであると決定された。その後、酵素の特徴付けの前に10-Hisタグが除去された（Wong and Gerlt 2004）。
一態様において、メチルグルタコニルCoAヒドラターゼは、シュードモナス属の種（Pseudomonas sp.）から得られた1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様において、メチルグルタコニルCoAヒドラターゼは、シュードモナス・プチダから得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、メチルグルタコニルCoAヒドラターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、liuCまたはそのホモログである。さらなる態様において、メチルグルタコニルCoAヒドラターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：125に示されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様において、メチルグルタコニルCoAヒドラターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：124に示される核酸配列によってコードされる。
メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼ（EC 6.4.1.4）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000045
酵素活性は、3-メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼ複合体に関連する。この酵素は、シュードモナス・エルギノーサPAO1のL-ロイシン（およびイソ吉草酸）分解経路に関与するビオチン含有ビオチン依存性カルボキシラーゼである。この経路はまた、非環式テルペン利用経路（シトロネロール分解経路およびcis-ゲナニルCoA分解経路）の最終段階でもある。この酵素は、シトロネロールまたはシトロネレート増殖細胞において発現されず、イソバレレート増殖細胞において発現される。遺伝子liuBおよびliuDは、3-メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼの2種のサブユニットをコードする。これらのサブユニットは、この生物のliuRABCDE遺伝子クラスター中にコードされる（Hoschle B et al. (2005) Methylcrotonyl-CoA and geranyl-CoA carboxylases are involved in leucine/isovalerate utilization (Liu) and acyclic terpene utilization (Atu), and are encoded by liuB/liuD and atuC/atuF, in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology 151(Pt 11): 3649-3656; Forster-Fromme K and Jendrossek D (2010). Catabolism of citronellol and related acyclic terpenoids in pseudomonads. Appl Microbiol Biotechnol 87(3): 859-869）。
この酵素は、アビジンアフィニティークロマトグラフィーによって細胞抽出物から精製され、SDS-ゲルで単離されたサブユニットが、トリプシンフィンガープリント分析およびESI-MSに供され、それらの対応する遺伝子の同定が可能になった（Hoschle et al. 2005）。
シュードモナス・シトロネロリス（Pseudomonas citronellolis）の3-メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼが、より初期の研究で特徴付けられた（Hector ML and Fall RR (1976) Multiple acyl-coenzyme A carboxylases in Pseudomonas citronellolis. Biochemistry 15(16): 3465-3472; Fall RR and Hector ML (1977) Acyl-coenzyme A carboxylases. Homologous 3-methylcrotonyl-CoA and geranyl-CoA carboxylases from Pseudomonas citronellolis. Biochemistry 16(18): 4000-4005; Fall RR (1981) 3-Methylcrotonyl-CoA and geranyl-CoA carboxylases from Pseudomonas citronellolis. Methods Enzymol 71 Pt C: 791-799）。
一態様において、メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼは、シュードモナス属の種から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様において、メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼは、シュードモナス・エルギノーサから得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、liuBおよび/もしくはliuD、またはそれらのホモログより選択される。さらなる態様において、メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：127および129より選択されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様において、メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：126および128より選択される核酸配列によってコードされる。
メチルクロトニルCoAヒドラターゼ（EC 4.2.1.17）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000046
例示的な酵素は3-ケトアシルCoAチオラーゼである。これは、β-酸化サイクルを介する脂肪酸分解に関与する。これは、基質に対して広い鎖長特異性を有するが、中鎖基質でその最高の活性を示す。これは、多酵素複合体の一部分であり、fadA遺伝子によってコードされる（Yang SY et al (1990) Nucleotide sequence of the fadA gene. Primary structure of 3-ketoacyl-coenzyme A thiolase from Escherichia coli and the structural organization of the fadAB operon. J Biol Chem 265(18): 10424-10429; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7024730Binstock JF and Schulz H (1981) Fatty acid oxidation complex from Escherichia coli. Methods Enzymol 71 Pt C:403-11）。
3-ケトアシルCoAチオラーゼは、アセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼ、β-ケトチオラーゼ、アセチルCoAアシルトランスフェラーゼおよびアシルCoA：アセチルCoA C-アシルトランスフェラーゼとしても公知であり得る。
別の例示的な酵素はエノイルCoAヒドラターゼである。アルファサブユニットは、それに関連する4つの酵素活性を有する。これは、多酵素複合体の一部分である。活性のうち2つ、エノイルCoAヒドラターゼ（EC 4.2.1.17）および3-OHアシルCoAエピメラーゼ（EC 5.1.2.3）は、同じN末端活性部位によって実行される（Yang SY and Elzinga M (1993) Association of both enoyl coenzyme A hydratase and 3-hydroxyacyl coenzyme A epimerase with an active site in the amino-terminal domain of the multifunctional fatty acid oxidation protein from Escherichia coli. J Biol Chem 268(9): 6588-6592）。
一態様において、メチルクロトニルCoAヒドラターゼは3-ケトアシルCoAチオラーゼである。別の態様において、メチルクロトニルCoAヒドラターゼは、大腸菌から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、メチルクロトニルCoAヒドラターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、fadAまたはそのホモログである。さらなる態様において、メチルクロトニルCoAヒドラターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：131に示されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様において、メチルクロトニルCoAヒドラターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：130に示される核酸配列によってコードされる。
一態様において、メチルクロトニルCoAヒドラターゼはエノイルCoAヒドラターゼである。別の態様において、メチルクロトニルCoAヒドラターゼは、大腸菌から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、メチルクロトニルCoAヒドラターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、fadBまたはそのホモログである。さらなる態様において、メチルクロトニルCoAヒドラターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：133に示されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様において、メチルクロトニルCoAヒドラターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：132に示される核酸配列によってコードされる。
3-ヒドロキシ-イソバレリルCoAチオエステラーゼ（EC 3.1.2.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000047
例示的なアシルCoAチオエステラーゼはTesBである。チオエステラーゼII（TesB）は、大腸菌に存在するいくつかのチオエステラーゼのうちの1つである。酵素は、比較的広い基質特異性を有し、中鎖および長鎖アシルCoA基質を切断し；試験された基質の最高のものは3,5-テトラデカジエノイルCoAであった（Nie L et al. (2008) A novel paradigm of fatty acid beta-oxidation exemplified by the thioesterase-dependent partial degradation of conjugated linoleic acid that fully supports growth of Escherichia coli. Biochemistry 47(36): 9618-9626）。チオエステラーゼIIは、唯一の炭素源としてのオレエートまたは共役リノール酸での増殖を支援するチオエステラーゼの1つである（Nie et al. 2008）。
酵素の結晶構造は、分解能1.9Åで解析されている。D204残基が活性部位中にあると予測され、その重要性は、変異体の動態解析によって確認された（Li J et al. (2000) Crystal structure of the Escherichia coli thioesterase II, a homolog of the human Nef binding enzyme. Nat Struct Biol 7(7): 555-559）。
tesBを欠如または過剰生成している株は、明らかな欠損を有するわけではない（Narasimhan ML et al. (1986) Genetic and biochemical characterization of an Escherichia coli K-12 mutant deficient in acyl-coenzyme A thioesterase II. J Bacteriol 165(3): 911-917; Naggert J et al. (1991) Cloning, sequencing, and characterization of Escherichia coli thioesterase II. J Biol Chem 266(17): 11044-11050）。TesBの過剰生成は、グリセロール飢餓時に蓄積する長鎖アシル-ACP分子による脂肪酸の合成阻害を緩和する（Jiang P and Cronan JE (1994) Inhibition of fatty acid synthesis in Escherichia coli in the absence of phospholipid synthesis and release of inhibition by thioesterase action. J Bacteriol 176(10): 2814-2821）。
一態様において、3-ヒドロキシ-イソバレリルCoAチオエステラーゼは、大腸菌から得られた1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、3-ヒドロキシ-イソバレリルCoAチオエステラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、tesBまたはそのホモログである。さらなる態様において、3-ヒドロキシ-イソバレリルCoAチオエステラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：135に示されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様において、3-ヒドロキシ-イソバレリルCoAチオエステラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：134に示される核酸配列によってコードされる。
メバロン酸-3-キナーゼ（EC 2.7.1.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000048
メバロン酸-3-キナーゼは、(R)-MVA 3-ホスホトランスフェラーゼまたは3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）キナーゼとしても公知であり得る。
サーモプラズマ・アシドフィルム由来のこの酵素のサブユニット構造は、報告されていない。
好熱性古細菌サーモプラズマ・アシドフィルム由来メバロン酸-3-キナーゼは、古細菌に見出されたメバロン酸経路のバリアントに関係すると考えられる（Azami Y et al. (2014) (R)-Mevalonate 3-Phosphate Is an intermediate of the Mevalonate Pathway in Thermoplasma acidophilum. J Biol Chem 289(23): 15957-15967; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24914732 Vinokur JM et al. (2014) Evidence of a Novel Mevalonate Pathway in Archaea. Biochemistry 53(25): 4161-4168）。
組換えHisタグ付き酵素が、大腸菌において発現され、精製および特徴付けられた。それとジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとの相同性にかかわらず、それはデカルボキシラーゼ活性を示さなかった（Azami et al. 2014; Vinokur et al. 2014）。この酵素は、弱いホスホメバロン酸キナーゼ活性を示し、少量の(R)-メバロン酸二リン酸を生成した（Azami et al. 2014）。これは、メバロン酸-5-キナーゼ活性を有しなかった（Vinokur et al. 2014）。
一態様において、3HIVキナーゼは、サーモプラズマ属の種（Thermoplasma sp.）およびピクロフィルス属の種（Picrophilus sp.）からなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様において、3HIVキナーゼは、サーモプラズマ・アシドフィルムおよびピクロフィルス・トリダス（Picrophilus torridus）からなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、3HIVキナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、TA1305および/もしくはPTO1356、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、TA1305は、L200E変異を含む。さらなる態様において、3HIV-キナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：113、115および117からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様において、3HIVキナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：112、114および116からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
(R)-メバロン酸二リン酸 + ATP → イソペンテニル二リン酸 + CO2 + ADP + リン酸
3-ホスホノオキシイソ吉草酸 → CO2 + イソブテン
3-ヒドロキシイソ吉草酸 → CO2 + イソブテン
メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼは、ピロホスホメバロネートデカルボキシラーゼ、メバロン酸-5-ピロリン酸デカルボキシラーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、5-ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、メバロン酸5-二リン酸デカルボキシラーゼ、およびATP：(R)-5-ジホスホメバロン酸カルボキシリアーゼ（脱水）、3-ホスホノオキシイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、3-ヒドロキシイソ吉草酸-3-リン酸デカルボキシラーゼ、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ、3-ヒドロキシイソ吉草酸デカルボキシラーゼおよび3HIVデカルボキシラーゼとしても公知であり得る。
この酵素は、ATP依存性脱炭酸を通じてメバロン酸5-二リン酸（MVAPP）をイソペンテニル二リン酸（IPP）に変換する。この酵素の2種の基質は、ATPおよびメバロン酸5-二リン酸であり、一方、その4種類の生成物は、ADP、リン酸、イソペンテニル二リン酸、およびCO2である。
メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼは、メバロン酸経路における最終段階を触媒する。メバロン酸経路は、酢酸からのイソプレノイドの生合成を担う。この経路は、ステロールであるイソプレノイド、例えばコレステロール、および非ステロールであるイソプレノイド、例えばドリコール、ヘムA、tRNAイソペンテニルトランスフェラーゼ、およびユビキノンを合成することによって複数の細胞過程に主要な役割を果たす。この酵素は、リアーゼのファミリー、具体的には炭素-炭素結合を切断するカルボキシリアーゼに属する。
メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼは、2種類の基質：ATPおよびメバロン酸5-二リン酸を認識し、それらと結合する。結合後、酵素は、2つの主段階に分けることができる3つの反応を行う。第一に、リン酸化が起こる。これは、反応性中間体を創出し、第二段階で反応性中間体は協調した脱リン酸および脱炭酸を受ける。
一態様において、反応3-ホスホノオキシイソ吉草酸 → CO2 + イソブテンを触媒する酵素は、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼである。別の態様において、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼは、ストレプトコッカス属の種（Streptococcus sp.）から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、微生物は、ストレプトコッカス・ミティスおよび/またはストレプトコッカス・ゴルドニイより選択される。いくつかの態様において、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：119および121より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：118および120より選択される核酸配列によってコードされる。
一態様において、反応3-ヒドロキシイソ吉草酸 → CO2 + イソブテンを触媒する酵素は3HIVデカルボキシラーゼである。別の態様において、3HIVデカルボキシラーゼは、ストレプトコッカス属の種、サーモプラズマ属の種およびピクロフィルス属の種からなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様において、3HIVデカルボキシラーゼは、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、サーモプラズマ・アシドフィルムおよびピクロフィルス・トリダスからなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、3HIVデカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、mvaD、TA1305および/もしくはPTO1356、またはそれらのホモログを含む。さらなる態様において、3HIVデカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：113、117および121からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様において、3HIVデカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：112、116および120からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
トランスケトラーゼ（EC 2.2.1.1）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000049
トランスケトラーゼは、グリコールアルデヒドトランスフェラーゼとしても公知であり得る。
トランスケトラーゼは、いくつかのドナー基質とアクセプター基質との間のケトール基の可逆転移を触媒する。この主要な酵素は、解糖とペントースリン酸経路との間の可逆的な連結である。この酵素は、ペントース糖の異化、D-リボース5-リン酸の形成、ならびに芳香族アミノ酸およびPLPの前駆体であるD-エリトロース4-リン酸の提供に関与する。大腸菌は、2種のトランスケトラーゼアイソザイム、TktAおよびTktBを含有する。TktAは、主要なトランスケトラーゼ活性を担う。
中心炭素の代謝におけるその機能に加えて、トランスケトラーゼは、染色体の構造に予想外の役割も有するように見え、tktA変異体は染色体のトポロジーに影響する。
ドナー基質およびアクセプター基質と複合体化したTktAの結晶構造が解析されており、トランスケトラーゼの反応機構および作用様式を解明している。量子力学/分子力学方法を用いたトランスケトラーゼ活性の計算モデルが提唱されており、チアミン二リン酸活性化についての新しいルートを規定している。トランスケトラーゼI（TktA）はホモ二量体性である。TktAの野生型および活性部位変異体の尿素変性経路が研究されており、トランスケトラーゼの構造、安定性、集合および活性に対する温度およびpHの影響が決定されている。TktAのアクセプター特異性が研究されている。
TktAの存在量は、SOS誘導物質および変異原、7-メトキシ-2-ニトロナフト[2,1-b]フラン（R7000）によって影響される。tktAは、静止期への流入の間に負の制御がされる。RpoSによる影響は、間接的である可能性があり、それ自体がRpoSによって直接制御される中間体制御因子によって媒介される場合がある。
トランスケトラーゼII（TktB）のサブユニット構造は、明確には決定されていない。TktBの過剰生成は、tktA変異体の表現型を抑制する。tktBの発現は、フェニルアラニンの存在下のtyrR変異体で増加される。tktBの発現は、静止期で増加され、RpoSおよびppGppによって正の制御をされる。TktBタンパク質のレベルは、浸透圧ストレス中に好気的条件下で増加するが、嫌気的増殖条件下で増加しない。TktBは、デグラドソームと会合されるように見え、炭素代謝を複製と結び付ける場合がある。
tktAおよびtktBの発現は相補的であり、増殖の間、ほぼ一定レベルのトランスケトラーゼ発現をもたらす。
いくつかの態様において、トランスケトラーゼは、大腸菌由来tktAと少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。さらなる態様において、トランスケトラーゼは、大腸菌由来tktAと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。なおさらなる態様において、トランスケトラーゼは、大腸菌由来tktAと少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、トランスケトラーゼは大腸菌由来tktAである。いくつかの態様において、トランスケトラーゼは、大腸菌由来tktBと少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。さらなる態様において、トランスケトラーゼは、大腸菌由来tktBと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。なおさらなる態様において、トランスケトラーゼは、大腸菌由来tktBと少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、トランスケトラーゼは大腸菌由来tktBである。
いくつかの態様において、トランスケトラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、tktAまたはそのホモログである。いくつかの態様において、トランスケトラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、tktBまたはそのホモログである。別の態様において、トランスケトラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：148および150からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、トランスケトラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：147および149からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
トランスアルドラーゼ（EC 2.2.1.2）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000050
トランスアルドラーゼは、ジヒドロキシアセトントランスフェラーゼ；ジヒドロキシアセトンシンターゼ；ホルムアルデヒドトランスケトラーゼとしても公知であり得る。
トランスアルドラーゼBは、ペントースリン酸経路の非酸化的分岐の酵素である。トランスケトラーゼと共に、トランスアルドラーゼは、ペントースリン酸経路と解糖との間の可逆的連鎖を創出する。これは、グリセルアルデヒド-3-リン酸およびセドヘプツロース-7-リン酸からフルクトース-6-リン酸およびエリトロース-4-リン酸への相互変換を触媒する。この反応およびペントースリン酸経路を通る炭素フラックスの可逆性は、実験的および理論的の両方で取り組まれている。
大腸菌におけるtalAおよびtalBによってコードされる2つの密接に関係するトランスアルドラーゼがある。トランスアルドラーゼBだけが生化学的に特徴付けられている。TalBは、溶液中および結晶構造で二量体である。R300残基の変異は、触媒活性単量体の形成をもたらす。触媒的に重要な活性部位残基は、部位特異的変異誘発によって同定されている。
トランスアルドラーゼBの結晶構造が決定され、活性部位にシッフ塩基中間体の存在を確認し、提唱された反応機構をもたらしている。
talBヌル変異体は、グルコースを炭素源として有する最少培地で増殖欠損を有しない。
いくつかの態様において、トランスアルドラーゼは、大腸菌由来talAまたはtalBと少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。さらなる態様において、トランスアルドラーゼは、大腸菌由来talAまたはtalBと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。なおさらなる態様において、トランスアルドラーゼは、大腸菌由来talAまたはtalBと少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、トランスアルドラーゼは大腸菌由来talAである。なおさらなる態様において、トランスアルドラーゼは大腸菌由来talBである。
いくつかの態様において、トランスアルドラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、talAまたはそのホモログである。いくつかの態様において、トランスアルドラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、talBまたはそのホモログである。別の態様において、トランスアルドラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：152および154からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、トランスアルドラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：151および153からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
リボース-5-リン酸イソメラーゼ（EC 5.3.1.6）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000051
リボース-5-リン酸イソメラーゼは、ホスホペントースイソメラーゼ；ホスホリボイソメラーゼ；リボースリン酸イソメラーゼ；5-ホスホリボースイソメラーゼ；D-リボース5-リン酸イソメラーゼ；D-リボース-5-リン酸ケトール-イソメラーゼとしても公知であり得る。
大腸菌には、2つの物理的および遺伝的に別個のリボース-5-リン酸イソメラーゼが存在する。構成的リボース-5-リン酸イソメラーゼA（rpiA）は通常、細胞におけるリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性の99％超を占め、ペントースリン酸経路（非酸化的分岐）において機能する。誘導性リボース-5-リン酸イソメラーゼB（rpiB）は、その発現が誘導された場合、rpiAの機能の代わりをすることができる。2つの酵素の間に配列類似性はない。
rpiAの結晶構造が解析されており、活性部位残基および酸-塩基触媒機構が予測された。rpiA変異体は、増殖のためにリボースを必要とする。
いくつかの態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼは、大腸菌由来rpiAと少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。さらなる態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼは、大腸菌由来rpiAと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。なおさらなる態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼは、大腸菌由来rpiAと少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼは、大腸菌由来rpiAである。
いくつかの態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、rpiAまたはそのホモログである。別の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：156に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：155に示される核酸配列によってコードされる。
リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ（EC 5.1.3.1）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000052
リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼは、リブロース-リン酸3-エピメラーゼ；ホスホリブロースエピメラーゼ；エリトロース-4-リン酸イソメラーゼ；ホスホケトペントース3-エピメラーゼ；キシルロースリン酸3-エピメラーゼ；ホスホケトペントースエピメラーゼ；D-リブロースリン酸-3-エピメラーゼ；D-リブロース5-リン酸エピメラーゼ；D-リブロース-5-P 3-エピメラーゼ；D-キシルロース-5-リン酸3-エピメラーゼ；ペントース-5-リン酸3-エピメラーゼとしても公知であり得る。
リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ（Rpe）は、ペントースリン酸経路の非酸化的分岐の酵素である。
Rpeは、活性に二価鉄を必要とし、フェントン化学反応が原因のH2O2による損傷に対して脆弱である。Mn2+、Co2+およびZn2+で様々な程度にFe2+の代わりをすることができ、これらの代替陽イオンを含有するRpeはH2O2に脆弱ではない。マンガン輸送体の誘導は、H2O2損傷からRpeを保護することができる。
いくつかの態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼは、大腸菌由来rpeと少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。さらなる態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼは、大腸菌由来rpeと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。なおさらなる態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼは、大腸菌由来rpeと少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼは、大腸菌由来rpeである。
いくつかの態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、rpeまたはそのホモログである。別の態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：158に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：157に示される核酸配列によってコードされる。
フルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ（Fpk、EC 4.1.2.22）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000053
β-D-フルクトフラノース6-リン酸がD-エリトロース4-リン酸およびアセチルリン酸に変換されるホスホケトラーゼ反応は、ビフィドバクテリウムシャントにおける主要な反応の1つである。ビフィドバクテリウムに2つの別個のF6P-ホスホケトラーゼ酵素が存在する証拠がある。一方はF6P単独に特異的であるのに対し、他方は、F6PおよびD-キシルロース5-リン酸の両方を利用することができ（EC:4.1.2.9）、これはビフィドバクテリウムシャントの後期に出現する反応である。ビフィドバクテリウム・アニマリス・ラクティスで本来発見されたxfp遺伝子によってコードされる酵素は、二重特異性の酵素である。ホスホケトラーゼは、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc nesenteroides）（LEUM_1961）からも精製されている。
いくつかの態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・デンティウムBDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクティスxfp、ラクトバチルス・パラプランタルムxpkAおよびビフィドバクテリウム・ブレベxfpからなる群より選択されるフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素と少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・デンティウムBDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクティスxfp、ラクトバチルス・パラプランタルムxpkAおよびビフィドバクテリウム・ブレベxfpからなる群より選択される。別の態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：212、214、216および218からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：211、213、215および217からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
リン酸アセチルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.8）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000054
リン酸アセチルトランスフェラーゼ（Pta）は、酢酸の代謝における一段階であるアセチルCoAとアセチルリン酸との間の可逆的変換を触媒する。ピルビン酸およびホスホエノールピルビン酸の両方は、アセチルリン酸合成の方向でこの酵素を活性化し、アセチルCoA合成の方向でこの酵素を阻害する。アセチルCoA I経路からの酢酸形成は、酢酸へのフラックスを低下させ、商業的に所望の最終生成物の生成を増加するための代謝工学の標的であった。これはまた、代謝モデリングおよびフラックスバランス解析などのシステム生物学のアプローチを使用して研究されている。
Ptaは3つのドメインから構成され、C末端ドメインだけがリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性に必要とされる。N末端ドメインは、天然の四次構造の安定化および代謝制御に関与する。
Ptaは、アセチルCoAおよびプロピオニルCoAの両方を利用することができ得る。ack pta二重変異体は、L-トレオニンからのプロピオン酸の低下したレベルを有し、この酵素がL-トレオニンをプロピオン酸に代謝する嫌気的経路の一部であることを示唆している。pta変異体は、酢酸を唯一の炭素源として増殖しない。pta変異体およびpta ackA変異体の両方は、グルコース飢餓から生存する能力に欠陥がある。pta変異体の増殖欠損は、アセチルCoAフラックスの撹乱が原因であるように見える。pta変異体は、微好気性条件下でグルコースを炭素源として増殖した場合に多量のラクテートを生成する。代謝、酵素活性および遺伝子発現に対するpta変異の作用は、近年、徹底的に研究されている。pta変異体およびrecBC変異体は、合成的に増殖阻害されている。
Ptaのレベルは、アセテートでの増殖によって低pH条件下で減少する。ptaは、CreBCレギュロンに属する。FNRは、pta発現にわずかにプラスの作用を有する。pta-ackAの増殖速度依存性発現パターンが測定された。
この酵素をコードするptaは、クロストリジウム・アセトブチリクムからクローニングされ、配列決定され、大腸菌において発現されている。この遺伝子は、第二の段階を触媒する酵素、酢酸キナーゼをコードするackA遺伝子に隣接する。サブクローンを保有する大腸菌およびクロストリジウム・アセトブチリクム由来の細胞抽出物に行われた酵素活性アッセイは、上昇した活性を示した。酵素は、生物が溶媒形成段階に達した場合に比活性の減少を示す。
リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素またはリン酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子はまた、大腸菌（eutD、pta）、ロセオバリウス・ヌビンヒベンス（Roseovarius nubinhibens）ISM、クロストリジウム・クライベリ（Clostridium kluyveri）、クラミドモナス・レインハルドティ（Chlamydomonas reinhardtii）（PAT2）、ダシトリカ・ルミナンチウム（Dasytricha ruminantium）、ペロバクター・アセチレニクス（Pelobacter acetylenicus）、ゴッチャルキア・アシズリチ（Gottschalkia acidurici）、ラクトバチルス・サンフランシセンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）NKNIS、ユーバクテリウム・オキシドレズセンス（Eubacterium oxidoreducens）G41、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）M129、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）、メタノサルシナ・サーモフィル（Methanosarcina thermophile）、クロストリジウム・プロピオニクム（Clostridium propionicum）およびフソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）からも同定または測定されている。
いくつかの態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリクムptaより選択されるリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリクムptaより選択される。別の態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：220および222より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：219および221より選択される核酸配列によってコードされる。
グルコース-6-リン酸 1-デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.49）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000055
グルコース-6-リン酸1-デヒドロゲナーゼは、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（NADP+）；NADP-グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ；中間発酵素；D-グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ；グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ（NADP）；NADP依存性グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ；6-ホスホグルコースデヒドロゲナーゼ；エントナー-ドュドロフ酵素；G6PDH；GPD；グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼとしても公知であり得る。
グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PDH）は、ペントースリン酸経路の第一の酵素であり、同化に必要なNADPHの大部分を提供する。
大腸菌G6PDHは、NAD+よりもNADP+に強い選好性を示す。分子シミュレーション、部位特異的変異体の動態特徴付けおよび系統発生解析を使用してこの選好性の構造基盤が研究された。
中心炭素の代謝経路を通過する代謝フラックスは、GC-MSおよび13C標識および2D NMR分光法を使用して測定された。異なる増殖条件下のこれらの経路の制御は、酵素発現および活性のレベルで測定された。
天然NADPH生成酵素に代わるNADH生成グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの使用は、その他の点で野生型の細胞の増殖速度を低下させるのに対し、Δpgi変異体の増殖速度を増加させる。これは、G6PDHによるNADHの生成が、インビボで有益であるか、それとも有害であるかが、上部のエムデン-マイヤーホフ経路の作動に依存することを示唆している。
中心炭素の代謝におけるその役割に加えて、G6PDHは、MazEF媒介細胞死のための「細胞外デス因子」（EDF）として作用するアミノ酸配列Asn-Asn-Trp-Asn-Asn（NNWNN）を有する直鎖ペプチド源であることが見出された。このペプチドは、毒素MazFおよびChpBKのエンドリボヌクレアーゼ活性を増加させることによって作用する。ストレス条件下のEDF生成は、MazFにより特異的ACA部位でzwf mRNAが切断されて、リーダーを有しない短縮mRNAを発生することが原因である。MazF切断部位に関するEDFコード領域の位置が重要であり、トランス翻訳系が必要とされる。
zwfは、撹乱時の発現移行パターンがそれらの対応するフラックス値と相関する遺伝子である、もっとも一貫してフラックスと共役する遺伝子の1つである。zwfの発現は、転写レベルで増殖速度により制御される。G6PDH活性は、迅速増殖細胞の方が大きく、炭素制限増殖条件と比較して窒素制限増殖条件下で大きい。zwfは、スーパーオキシドストレスに応答するSoxRSレギュロンの一部分である。追加的な制御因子は、zwfの転写を活性化することが示されている。亜テルル酸塩への曝露は、zwfの転写を活性化し、それによりNADPHの合成を増加させる。
zwfヌル変異は、増殖速度にあまり影響しない。しかし、中心炭素の代謝および代謝フラックスが変化する。pgi zwf二重変異体は、グルコースを唯一の炭素原として増殖しない。グルコースの存在下で、これは、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼI活性を阻害するグルコース-6-リン酸を高レベル蓄積する。zwfの欠失は、大腸菌JM109の有機溶媒耐性を低下させる。
いくつかの態様において、MEGもしくはグリコール酸、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成する組換え微生物は、ペントースリン酸経路の酸化的分岐を経由するグルコース-6-リン酸のフラックスを妨げ、代わりに、グルコース-6-リン酸をペントースリン酸経路の非酸化的分岐を経由して切り替えるために、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含んで、D-リボース-5-リン酸中間体を生成する。
6-ホスホグルコノラクトナーゼ（EC 3.1.1.31）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
6-ホスホD-グルコノ-1,5-ラクトン + H2O → D-グルコン酸6-リン酸 + H+
6-ホスホグルコノラクトナーゼは、ホスホグルコノラクトナーゼ；6-PGLとしても公知であり得る。
6-ホスホグルコノラクトナーゼは、酸化的ペントースリン酸経路の酵素である。
pgl変異株は、グルコースを唯一の炭素原として野生型よりもごくわずかに遅く増殖する。グルコースでの増殖は、6-ホスホD-グルコノ-1,5-ラクトンの非酵素的加水分解、またはグルコノラクトンの脱リン酸および搬出、グルコン酸への加水分解、続いてグルコン酸の再搬入およびリン酸化を伴うバイパス経路が原因であり得る。マルトース培地で増殖した場合、Pgl活性を欠如する株はヨウ素処理後に青変する。pgl欠失株の表現型は、シュードモナス・プチダ由来pgl遺伝子の発現によって補完されることができるが、これら2つの遺伝子の間に検出可能な類似性はない。
リボフラビンの生成のための大腸菌の代謝操作のための戦略は、リボフラビン力価の増加をもたらすpglの過剰発現を含んでいた。
pglは、大腸菌B株BL21で欠失しているが、K-12株MG1655に存在するゲノム領域の一部分である。
いくつかの態様において、MEGもしくはグリコール酸、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成する組換え微生物は、ペントースリン酸経路の酸化的分岐を経由するグルコース-6-リン酸のフラックスを妨げ、代わりに、グルコース-6-リン酸を、ペントースリン酸経路の非酸化的分岐を経由して切り換えるために、6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含んで、D-リボース-5-リン酸中間体を生成する。
6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸（EC 1.1.1.44）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
D-グルコン酸6-リン酸 + NADP+ → D-リブロース5-リン酸 + CO2 + NADPH
6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（NADP＋依存性、脱炭酸）；ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ；6-ホスホグルコニックデヒドロゲナーゼ；6-ホスホグルコニックカルボキシラーゼ；6-ホスホ-D-グルコン酸デヒドロゲナーゼ；グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼとしても公知であり得る。
6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは、ペントースリン酸経路の酸化的分岐の酵素である。
基質化合物および補助基質化合物と複合体化したこの酵素の3つの結晶構造が解析されている。NADP+の結合は、酵素にコンフォメーション変化を誘導し得る。触媒機構が提唱されている。
gndは、おそらく株間伝播および組換えを原因とする、大腸菌集団内で高度に多形性の遺伝子である。これは、gndがO抗原構造を決定するrfb領域に近接する結果であり得る。
6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの発現は、増殖速度により制御される。Gndレベルにおける増殖速度依存性増加の大部分は、より高いmRNAレベルをもたらす転写の増加が原因である。転写後制御は、gnd mRNAのコドン67と78との間に二次構造エレメントを必要とする。この領域は、mRNA二次構造への翻訳開始領域の隔離によって機能し、従って翻訳開始の効率を低下させる場合がある。しかし、この制御機構のエフェクターは、見たところまだ同定されていない。truA（hisT）変異体は、転写後制御によってGnd発現の増殖速度依存性増加を低下させる。酸性条件下での増殖は、gndの発現をアップレギュレーションする。gndは、撹乱時の発現移行パターンがそれらの対応するフラックス値と相関する遺伝子である、もっとも一貫してフラックスと共役する遺伝子（FCG）の1つである。
ある種の増殖条件は、gndの転写増加および酵素活性の増加をもたらすプロモーター領域における欠失変異を選択した。edd gnd二重変異体は、グルコネートで増殖できない。gndにおけるヌル変異は、増殖速度をあまり変更しない。しかし、細胞代謝および代謝フラックスは変化し、スクシネートの生成はグルコースまたはグリセロールでの増殖中に増加する。gnd欠失変異体は、グリセロールでの嫌気的増殖中に野生型と比較してエタノールおよびH2生成の強化を示し、一方、重度に操作された別の株では、gndの過剰発現が、エタノールおよびH2の生成を増加させる。
いくつかの態様において、MEGもしくはグリコール酸、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成する組換え微生物は、ペントースリン酸経路の酸化的分岐を経由するグルコース-6-リン酸のフラックスを妨げ、代わりに、グルコース-6-リン酸を、ペントースリン酸経路の非酸化的分岐を経由して切り換えるために、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含んで、D-リボース-5-リン酸中間体を生成する。
グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、リン酸化（EC 1.2.1.12）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000056
グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼは、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（リン酸化）；トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ；デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸；ホスホグリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ；3-ホスホグリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ；NAD+依存性グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ；グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（NAD+）；グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（NAD+）；NADH-グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ；グリセルアルデヒド-3-P-デヒドロゲナーゼとしても公知であり得る。
グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼAは、大腸菌における解糖および糖新生の間にNAD+およびリン酸の存在下でD-グリセルアルデヒド-3-リン酸から1,3-ビスホスホ-D-グリセリン酸への可逆的酸化的リン酸化を触媒する。この酵素はまた、多数の他の生物にも見出され、その特性が広く研究されている。
大腸菌は、gapAおよびepd（gapB）によってコードされる2つのグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）活性を有する点で珍しい。しかし、gapAによってコードされる酵素は、高効率的リン酸化グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ活性および低いリン酸化エリトロース-4-リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、一方で、epdによってコードされる酵素は、効率的な非リン酸化エリトロース-4-リン酸デヒドロゲナーゼ活性および非常に低いリン酸化グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。
GapAタンパク質は、好熱性細菌酵素および一般的な原核生物酵素よりも真核生物配列に類似する配列を有する。gapA生成物は解糖に必要とされるのに対し、epd生成物は必要とされない。両方の酵素は、ピリドキサール5'-リン酸（PLP）の生成に関与し得る。
大腸菌K-10由来gapA変異体の初期研究は、解糖におけるその役割を意味づけ、その触媒特性のいくつかを実証した。gapA変異体は、増殖欠損を示し、高塩培地によって救出される凝集表現型および溶解表現型の増加も示す。
gapA遺伝子発現の制御が研究されている。fkpA、gapA、およびhslT遺伝子の制御は、慢性熱ストレスの条件下での進化によって影響される。
大腸菌配列は、すべてのGAPDHで保存されており、かつNAD+結合または触媒機構に関与すると仮定されているいくつかのアミノ酸を含有する。
NAD+存在下の野生型酵素の結晶構造は、分解能1.80Åで決定されており、他のGAPDHの結晶構造と類似していた。N313T変異体の結晶構造は、分解能2.17Åでも決定された。NAD+と結合した、および結合していない、ならびにヘミアセタール中間体状態の、いくつかの他の大腸菌GAPDH結晶構造が報告されている。
NAD+補因子の立体特異性を担う分子要因が、部位特異的変異誘発を用いて研究されている。この酵素は、プロ-S水素の転移を触媒し、NAD(H)とニコチンアミドのシン配向で結合するB特異的デヒドロゲナーゼである。変性した大腸菌GAPDHの、シャペロンタンパク質であるTigトリガー因子の存在下での再フォールディングが研究されている。
ADP-リボシル化GAPDHは、一部の真菌およびグラム陽性病原体ならびに病原性大腸菌株における分泌型ビルレンス因子である。非病原性大腸菌はGAPDHを分泌しない。証拠は、大腸菌GAPDHがDNA修復にも関与することを示唆している。
末端対形成アンチセンスRNAを誘導的に発現している一連のベクターが、宿主大腸菌K-12 MG1655における中心的炭素代謝をサイレンシングするために構築された。gapAを93％の効力でサイレンシングしたベクターは、重度の増殖阻害を引き起こした。温度変化により操作大腸菌gapAの発現を制御することが解糖をコントロールすると実証された。
いくつかの態様において、MEGまたはグリコール酸、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成する組換え微生物は、グリセルアルデヒド3-リン酸の1,3-ビスホスホ-D-グリセリン酸への変換を防止し、その代わりに、トランスケトラーゼによって（フルクトース-6-リン酸のエリトロース-4-リン酸への同時変換と共に）グリセルアルデヒド3-リン酸がキシルロース-5-リン酸へ変換されることを可能にするため、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異を含む。キシルロース-5-リン酸は、非酸化的ペントースリン酸経路の中間体、D-リボース5-リン酸へさらに変換され得、D-リボース5-リン酸は、D-リボース5-リン酸アルドラーゼによって、MEGまたはグリコール酸、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生成のための中間体、グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）へ変換され得る。
ペントースリン酸アルドラーゼ
ペントースリン酸アルドラーゼは、ペントースリン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸およびグリコールアルデヒドへ変換する可逆的なアルドール反応を触媒する。いくつかの態様において、ペントースリン酸アルドラーゼは、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ（DERA）、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼ、またはD-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼである。
いくつかの態様において、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼが、D-リボース-5-リン酸のアセトアルデヒドおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸への変換を触媒する。
いくつかの態様において、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼが、D-リブロース-5-リン酸のグリコールアルデヒドおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸への変換を触媒する。
いくつかの態様において、D-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼが、D-キシルロース-5-リン酸のグリコールアルデヒドおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸への変換を触媒する。
いくつかの態様において、ペントースリン酸アルドラーゼは、大腸菌由来である。いくつかの態様において、ペントースリン酸アルドラーゼは、バチルス（Bacillus）カルドリチカス由来である。
いくつかの態様において、大腸菌ペントースリン酸アルドラーゼは、
Figure 2022521905000057
を含む核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、大腸菌ペントースリン酸アルドラーゼは、
Figure 2022521905000058
を含むアミノ酸配列である。
いくつかの態様において、大腸菌ペントースリン酸アルドラーゼは、C47N変異を含み、
Figure 2022521905000059
を含む核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、B.カルドリチカスペントースリン酸アルドラーゼは、
Figure 2022521905000060
に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、B.カルドリチカスペントースリン酸アルドラーゼは、
Figure 2022521905000061
に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含むcDNA最適化配列によってコードされる。
いくつかの態様において、大腸菌ペントースリン酸アルドラーゼは、
Figure 2022521905000062
に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
いくつかの態様において、大腸菌ペントースリン酸アルドラーゼは、C47N変異を含み、
Figure 2022521905000063
を含むアミノ酸配列である。
いくつかの態様において、B.カルドリチカスペントースリン酸アルドラーゼは、
Figure 2022521905000064
に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
いくつかの態様において、B.カルドリチカスペントースリン酸アルドラーゼは、変異C37N変異を含み、
Figure 2022521905000065
に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、B.カルドリチカスペントースリン酸アルドラーゼは、変異C37N変異を含み、
Figure 2022521905000066
に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
6-ホスホフルクトキナーゼ（EC2.7.1.11）
ホスホフルクトキナーゼ（Pfk）は、解糖中のC1炭素におけるフルクトース-6-リン酸のリン酸化を触媒する。大腸菌は、配列類似性を共有しない2つのPfkアイソザイム、Pfk-1（pfkA）およびPfk-2（pfkB）を含有する。野生型大腸菌に存在するホスホフルクトキナーゼ活性の90％超が、Pfk-1に起因し得る。
PfkAは、フルクトース-6-リン酸のリン酸化を触媒し、解糖経路を制御する重要酵素である。この酵素は、インビボで逆反応を触媒することができない。この酵素は、基質フルクトース-6-リン酸との協同的速度論を示すが、他の基質ATPではそうでない。最近、PfkAは、セドヘプツロースビスリン酸バイパスの一部として、セドヘプツロース-7-リン酸のリン酸化も触媒することが示された。PfkAの結晶構造は、活性化剤および阻害剤の存在下および非存在下で解析されている。配列類似性に基づき、PfkAはNAD+キナーゼであると予測された。
PfkBは、糖キナーゼのリボキナーゼファミリーのメンバーである。PfkBは、PfkAとは異なり、フルクトース-6-リン酸との協同的相互作用、PEPによる阻害、またはADPによる活性化を示さない。MgATP2-が、酵素の真の基質である。PfkBは、タガトース-6-リン酸も基質として使用することができる。この反応は、ガラクチトール異化経路の一部である。MgATPによって阻害された四量体形態のPfkBの結晶構造は、1.98Åの分解能で解析されている。この構造の、フルクトース-6-リン酸との複合体内のPfkBの結晶構造との比較は、フルクトース-6-リン酸結合とMgATP結合との間の負の関係を示唆する。
いくつかの態様において、MEGまたはグリコール酸または、MEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成する組換え微生物は、フルクトース-6-リン酸の1,6-ビスリン酸への変換を防止し、その代わりに、フルクトース-6-リン酸が、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼによって、エリトロース-4-リン酸およびアセチル-リン酸へ変換され、D-リボース5-リン酸中間体をさらに生成するための、ペントースリン酸経路の非酸化的ブランチのための、より多くのエリトロース-4-リン酸を提供することを可能にするため、6-ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異を含む。D-リボース5-リン酸中間体は、D-リボース5-リン酸アルドラーゼによって、MEGまたはグリコール酸、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生成のために必要とされる中間体、グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）へ変換され得る。いくつかの態様において、6-ホスホフルクトキナーゼは、PfkAおよび/またはPfkBである。
ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ、2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、2-ケト酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000067
ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼは、ヒドロキシピルビン酸カルボキシリアーゼとしても公知であり得る。
2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ；アルファ-ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ；アルファ-ケトグルタリックデカルボキシラーゼ；プレ-2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ；2-オキソグルタル酸カルボキシリアーゼとしても公知であり得る。
大腸菌SucAは、2-オキソグルタル酸（2-ケトグルタル酸）からNADHの生成を伴うスクシニルCoAおよびCO2への変換を触媒する2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ多酵素複合体（OGDHC）の2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を担う。
OGDHCは、2-オキソ酸デヒドロゲナーゼファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーは、3種類の酵素成分：2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ（E1）、リポアミドアシルトランスフェラーゼ（E2）およびリポアミドデヒドロゲナーゼ（E3）の複数のコピーを含有する。大部分のグラム陽性細菌において、およびミトコンドリアにおいて、E1成分は、2つのサブユニットから構成されるヘテロ二量体であるのに対し、大部分（であるが、すべてではない）のグラム陰性細菌において、これは、1種類のサブユニットからできている。両方の場合で、E1成分の複数のコピーがE3成分の複数のコピーと一緒に八面体対称性の24個のサブユニット、または二十面体対称性の60個のサブユニットのE2コア周囲に集合される（どの複合体および種であるかに依存）。大腸菌において、E3成分は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびグリシン切断多酵素複合体と共有される。E1およびE2は、2-オキソグルタル酸およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体とわずかに異なり、それらを区別するために（o)および（p)と名付けられる。
大腸菌OGDHCは、12ユニットのE1(o)成分、sucAによってコードされるチアミン要求性2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、24ユニットのE2(o)成分、sucBによってコードされるジヒドロリポイルトランススクシニラーゼ、および2ユニットのE3成分、lpdによってコードされるリポアミドデヒドロゲナーゼを含有する。24個のE2(o)ユニットは、複合体の八面体コアを形成する。E2(o)ユニットは、リポイルリシンならびにE1(o)およびE3サブユニットの二量体に対する結合部位を含有する。電子クライオトモグラフィーは、それらがE2コアに柔軟に繋留されることを示した。
OGDHC反応サイクルの間、2-オキソグルタル酸は、SucA、チアミン二リン酸補因子含有酵素によって結合され、脱炭酸される。N末端の77個の残基を欠如する切断型アポ形態のSucAの結晶構造が、分解能2.6Åで決定されている。チアミン二リン酸およびMg2+を有するホロ形態の構造が、分解能3.5Åで決定された。切断型はデカルボキシラーゼ活性を保持したが、E2(o)と集合してOGDH複合体になることはなかった。データはまた、AMP結合部位の存在も示唆した。OGDHC中に酸素依存性チアミンフリーラジカルが実証され、それは、O2との副反応によって発生した。
His260およびHis298の飽和変異誘発によって調製された操作SucAの研究は、His260が基質認識のために必要とされるが、His298は類似のサイズの疎水性残基によって置き換えることができたことを示唆した。データはまた、E2(o)が特異性に役割を有することも示唆した。
初期の研究でsucA遺伝子がクローニングおよび配列決定され、sucABCDの制御が研究された。sucABおよびsucCD遺伝子は相互に不可欠であることが示され、どちらか一方のペアがスクシニルCoAを生成するために十分であったが、sucABおよびsucCDの同時欠失は生存不可能であった。
α-ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼは、3-メチル-2-オキソブタン酸からイソブタナールへの脱炭酸を触媒する。酵素は、3-メチル-2-オキソブタン酸に高度に特異的であるが、他の分岐鎖2-ケト酸とも活性を示す（4-メチル-2-オキソペンタン酸は22.7％の相対活性；(S)-3-メチル-2-オキソペンタン酸は16.7％、2-オキソ-3-フェニルプロパン酸は7.1％および4-(メチルチオ)-2-オキソブタン酸は5.8％）。
この酵素は、配列決定およびクローニングされているkivd遺伝子によってコードされるホモ四量体である。推定されるタンパク質配列は、ipd遺伝子（この遺伝子は、IS983エレメントの挿入によってL439位で中断されている）によってコードされるL.ラクティスIL1403株タンパク質と98.6％の同一性を共有する（その最初の438個のアミノ酸にわたり）。kivd遺伝子は、L.ラクティスMG1363株およびSK11株の配列決定されたゲノム中のいかなる遺伝子ともいかなる相同性を有しない。
156個の乳酸細菌株（ラクトコッカス、ラクトバチルス、ロイコノストック）を試験するKivd活性の研究は、L.ラクティス株だけが活性を保有し、ラクトコッカス株の中であっても、45株中7株だけが活性を有したことを示した。
L.ラクティスB1157株由来の分岐鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼとしての相同タンパク質が記載されている。そのタンパク質は、Kivdと89.8％の同一性を示し、2-ケト-イソ吉草酸に対する選好性も有する。
いくつかの態様において、2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素または2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、ヒドロキシピルビン酸をグリコールアルデヒドに変換する。いくつかの態様において、ヒドロキシピルビン酸をグリコールアルデヒドに変換する酵素は、KivdまたはSucAと少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素はKivdである。いくつかの態様において、2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素はSucAである。
いくつかの態様において、2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、sucAまたはそのホモログである。いくつかの態様において、2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Kivdまたはそのホモログである。別の態様において、2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素または2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：224および226より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素または2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：223および225より選択される核酸配列によってコードされる。
2-オキソグルタル酸レダクターゼ、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000068
3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ；PHGDH（遺伝子名）；D-3-ホスホグリセリン酸：NAD+オキシドレダクターゼ；アルファ-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ；3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ；D-3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ；グリセリン酸3-リン酸デヒドロゲナーゼ；グリセリン酸-1,3-リン酸デヒドロゲナーゼ；ホスホグリセリン酸オキシドレダクターゼ；ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ；SerA；3-ホスホグリセリン酸：NAD+ 2-オキシドレダクターゼ；SerA 3PGデヒドロゲナーゼ；3PHPレダクターゼとしても公知であり得る。
3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、L-セリンの生合成における最初の関与した段階を触媒する。この酵素は、協同性を示すアロステリック最終生成物阻害によって制御される。セリンによる阻害は、主として触媒速度の低下を通じて作用し、基質のKmに小さな効果だけを有し；従って、SerAは、V型アロステリック酵素として分類される。
セリンによるアロステリック阻害および協同阻害の基盤が広く研究されている。ホモ四量体中の4つのセリン結合部位のうち2つの占有は、活性の85％阻害をもたらす。セリンのさらなる結合は、負の協同性を示す。リン酸は、セリンの結合に対する部位間の協同効果を低下させることができ、その効果は、主に、内因的に結合したNADHの存在が原因であった。Trp139Gly変異は、セリンの結合とアロステリック阻害との協同性を失ったホモ二量体酵素をもたらす。エフェクター結合部位内の残基、サブユニット間の制御界面、および柔軟なヒンジ領域の部位特異的変異誘発は、隣接ドメインの運動が酵素活性の阻害に関与するモデルを支持している。過渡速度論解析は、触媒活性の阻害の協同性がセリン結合によるコンフォメーション変化に起因することを示した。制御ドメインのない酵素は、セリンによってもはや阻害されないが、他の動態パラメーターは同じままである。雑種四量体は、アロステリック阻害機構へのさらなる洞察を提供した。
部位特異的変異誘発は、基質の結合および触媒作用の一因となる活性部位内の残基の同定を可能にした。基質とヌクレオチド結合ドメインとの間のヒンジ領域における変異は、酵素のkcatに影響し、ある種の変異がセリン結合と触媒的阻害とを脱共役させる。
大規模な部位特異的変異誘発および構造研究が、アロステリック制御と、協同性と、触媒活性との相互作用の詳細な見解に寄与した。触媒経路へのさらなる洞察が、ストップトフロー動態解析によって提供され、この解析は、両方の触媒方向における律速段階が酵素のコンフォメーション変化であることを示した。セリンの結合が、酵素と、補酵素と、基質と、エフェクターとの間のデッドエンド四元複合体の形成をもたらし、エフェクターが基質結合に続くコンフォメーション変化を消失させるように見える。
この酵素は、α-ケトグルタル酸レダクターゼ活性も有し、2-ヒドロキシグルタル酸を生成することが示されている。この反応の代謝的役割はまだ知られていないものの、これは、セリン生合成の制御、および特に嫌気生活の間にNADHをNAD+に戻すリサイクルに役割を果たす場合があると考えられている。
野生型酵素および様々な変異体の結晶構造が解析されている。この構造は、ホモ四量体の各サブユニットが3つの異なるドメイン、ヌクレオチド結合ドメイン、基質結合ドメイン、および制御/セリン結合ドメインからなることを示した。
serAは、グリセロール最少培地での増殖に不可欠であり；増殖欠損は、セリンの添加によって救済することができる。
いくつかの態様において、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素または2-オキソグルタル酸レダクターゼ活性を有する酵素であることができる。いくつかの態様において、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素、または2-オキソグルタル酸レダクターゼ活性を有する酵素は、グリセリン酸3-リン酸から3-ホスホヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する。いくつかの態様において、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素、または2-オキソグルタル酸レダクターゼ活性を有する酵素は、serAと少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素、または2-オキソグルタル酸レダクターゼ活性を有する酵素はserAである。
いくつかの態様において、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、serAまたはそのホモログである。別の態様において、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素、または2-オキソグルタル酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：228に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素、または2-オキソグルタル酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：227に示される核酸配列によってコードされる。
3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、セリンアミノトランスフェラーゼ、L-セリントランスアミナーゼ（EC 2.6.1.52）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000069
3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼは、ホスホセリントランスアミナーゼ；PSAT；ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ；ヒドロキシピルビン酸ホスフェート-グルタミン酸トランスアミナーゼ；L-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ；ホスホヒドロキシピルビン酸トランスアミナーゼ；ホスホヒドロキシピルビン酸-グルタミン酸トランスアミナーゼ；3-O-ホスホ-L-セリン：2-オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ；SerC；PdxC；3PHPトランスアミナーゼとしても公知であり得る。
serCによってコードされる酵素、ホスホセリン/ホスホヒドロキシトレオニンアミノトランスフェラーゼは、異なる基質を使用することによってセリンおよびピリドキシンの両方の生合成において機能する。ピリドキサール5'-リン酸は、両方の酵素の活性のための補因子であり、それが自己触媒的に作用してそれ自体の生合成を刺激できることを示唆している。
アミノトランスフェラーゼ酵素の間の重複性および基質特異性の寛容性が研究されている。非リン酸化基質で活性を観察することができなかったが；しかし、3-ヒドロキシピルビン酸は、SerCの酵素活性のアッセイのための基質として使用することができた。加えて、遺伝学的実験は、SerCがマイナーなアラニントランスアミナーゼであることを示した。
2種の酵素、ArgDおよびSerCの通常の活性は、スクシニルジアミノピメリン酸（SDAP）およびリシン生合成のために十分であり；第三の酵素、AstCは、SDAPの生合成に十分であるが、単独では細胞のリシン要求性を満たすことができない。GabTおよびPuuEを含む追加的な酵素は、SDAPの生合成に寄与することができ得る。プラスミドからのargD、astC、serC、aspC、gabT、hisC、ilvE、patA、puuE、またはtyrBの発現は、最少培地での三重ΔargD serC astC変異体の増殖を可能にする。
非連結型の酵素および基質類似体α-メチル-L-グルタミン酸と複合体化した酵素の結晶構造が解析されており、分子反応機構が提唱された。
serCは、グリセロール最少培地での増殖に不可欠であり；増殖欠陥は、セリンおよびピリドキソール/ピリドキシンの添加によって救済することができる。
いくつかの態様において、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、L-セリントランスアミナーゼ活性を有する酵素またはセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素であることができる。いくつかの態様において、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素、L-セリントランスアミナーゼ活性を有する酵素またはセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、L-セリンからヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する。いくつかの態様において、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素、L-セリントランスアミナーゼ活性を有する酵素またはセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、serCと少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素、L-セリントランスアミナーゼ活性を有する酵素またはセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素はserCである。
いくつかの態様において、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、serCまたはそのホモログである。別の態様において、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素、L-セリントランスアミナーゼ活性を有する酵素、またはセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：230に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素、L-セリントランスアミナーゼ活性を有する酵素またはセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：229に示される核酸配列によってコードされる。
3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸 + H2O → ヒドロキシピルビン酸 + リン酸
YeaB（NudL）は、Nudixファミリーのヒドロラーゼに属するが、CoAピロホスホヒドロラーゼ活性を有すると予測された。
yeaB（nudL）は、pgsA変異体のflhDC転写のリプレッションの多コピー抑制因子として単離された。この抑制は、nudLを過剰発現する細胞におけるσS発現の低下が原因であり得る。
yeaB（nudL）はまた、pdxB欠失株のPLP栄養要求性の多コピー抑制因子として単離された。NudLは、ピリドキサール5'-リン酸生合成I経路の中間体である、PdxBの下流の4-ホスホ-ヒドロキシ-L-トレオニンを生成する偶然発見された代謝経路の一部分であることが見出された。この経路は、セリン生合成からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸の進路を変える。Kcatが5.7×10-5であって、NudLは、3-ホスホヒドロキシピルビン酸からヒドロキシピルビン酸への変換の非効率的な触媒であるが、その活性は、PLPの生成に十分であるように見える。
いくつかの態様において、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素は、yeaBと少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素はyeaBである。
いくつかの態様において、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、yeaBまたはそのホモログである。別の態様において、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：232に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：231に示される核酸配列によってコードされる。
ホスホセリンホスファターゼ（EC 3.1.3.3）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
3-ホスホ-L-セリン + H2O → L-セリン + リン酸
ホスホセリンホスファターゼは、セリン生合成における最終段階を触媒する。この酵素は、ハロ酸デハロゲナーゼ（HAD）様ヒドロラーゼのスーパーファミリーに属する。酵素研究は、本来、大腸菌由来W株の部分精製された酵素を使用して行われ；精製酵素のアッセイは、酵素のHADスーパーファミリーの研究の一部分として行われた。
serBは、グリセロール最少培地での増殖に不可欠であり、増殖欠損は、セリンの添加によって救済することができる。Gph、HisBおよびYtjCは、条件付きΔserB表現型の複数コピー抑制因子として同定された。定向進化実験は、これらの抑制因子の適応度および酵素活性を増加させた変異を同定した。
いくつかの態様において、ホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素は、serBと少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素はserBである。
いくつかの態様において、ホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、serBまたはそのホモログである。別の態様において、ホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：234に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：233に示される核酸配列によってコードされる。
セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（EC 2.6.1.51）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000070
セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼは、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼとしても公知であり得る。
ペルオキシソームのセリン--ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（AGXT1）およびミトコンドリアに局在するアラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ2（AGXT2）は、両方ともアラニンをアミノドナーとして使用してグリオキシル酸からグリシンへの変換を触媒する。AGXT2とは異なり、AGXT1は、不斉ジメチルアルギニン（ADMA）をアミノドナーして利用することができない。
ペルオキシソームのセリン--ピルビン酸アミノトランスフェラーゼは、ホモ二量体から構成されるピリドキサールリン酸依存性肝臓特異的酵素である。ペルオキシソーム中のその位置は、適当な酵素活性に重大である。C末端のペルオキシソーム標的化配列（PTS1）が、ペルオキシソームへの移行のために必要である。
肝臓ペルオキシソームの非存在につながるセリン--ピルビン酸アミノトランスフェラーゼの機能障害または誤標的化は、グリオキシル酸をサイトゾルに逃避させ、サイトゾルでこれはシュウ酸およびグリコール酸にさらに代謝される。シュウ酸は、ヒトではさらに代謝できず、腎臓および尿路における不溶性シュウ酸カルシウムの形成をもたらす。AGXT1遺伝子における変異は、不適当なペルオキシソーム標的化をもたらし、不可逆的な腎損傷を招く常染色体劣性代謝障害である原発性高シュウ酸尿症1型を引き起こす。原発性高シュウ酸尿症1型患者の3分の1は、肝臓ペルオキシソーム酵素がミトコンドリアに誤標的化される独特なタンパク質ソーティング欠損を有する。
いくつかの態様において、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、ホモ・サピエンスAGXT1と少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素はホモ・サピエンスAGXT1である。
いくつかの態様において、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、AGXT1またはそのホモログである。いくつかの態様において、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：244に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、セリン-ピルビン酸アミノトランセラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：243に示される核酸配列によってコードされる。
セリンデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.65）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
3-O-sn-ホスファチジル-L-セリン+ H+ → L-1-ホスファチジルエタノールアミン+ CO2
セリンデカルボキシラーゼは、ホスファチジルセリンデカルボキシラーゼ；PSデカルボキシラーゼ；ホスファチジル-L-セリンカルボキシ-リアーゼとしても公知であり得る。
ホスファチジルセリンデカルボキシラーゼは、共有結合したピルボイル補欠分子族を使用する酵素の小クラスの1つである。ピルボイル基は、基質のアミノ基と共にシッフ塩基を形成し、次いで脱炭酸を促進するために電子シンクとして役立てることによってピリドキサールリン酸補因子と同様に作用すると考えられている。
これらの酵素の4種、ヒスチジンデカルボキシラーゼ（E.C. 4.1.1.22）、ホスファチジルセリンデカルボキシラーゼ、アスパラギン酸1-デカルボキシラーゼ、およびS-アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼは、重要な生体アミンを形成するデカルボキシラーゼである。これらの酵素のすべては、アミド結合を介してαサブユニットのアミノ末端に結合したピルボイル補欠分子族を有することが公知である。この群の2つの他の酵素は、D-プロリンレダクターゼおよびグリシンレダクターゼ（E.C. 1.21.4.2）である。
ピルボイル含有酵素は、セリノリシス（serinolysis）と呼ばれる自己成熟切断によって翻訳後プロセシングされるチモーゲンとして発現される。このプロセスにおいて、セリン残基からピルボイル基が形成され、前駆タンパク質を2つの部分に分割し、それらの部分がαサブユニットおよびβサブユニットになる。いくつかの場合では、追加的なサブユニットが関与し得る。
この酵素は、ピルビン酸補欠分子族がより小さなサブユニットと会合している点で、非同一のサブユニットから構成される他のピルボイル依存性デカルボキシラーゼと異なる。この酵素は、未知数のヘテロ二量体の多量体である。
いくつかの態様において、セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、L-セリンからエタノールアミンへの変換を触媒する。
いくつかの態様において、セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、シロイヌナズナSDCと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、シロイヌナズナSDCである。
いくつかの態様において、セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SDCまたはそのホモログである。いくつかの態様において、セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：236に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：235に示される核酸配列によってコードされる。
エタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）（EC 1.4.3.8）、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼ（EC 2.6.1.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
エタノールアミン + 酸素 + H2O → アンモニア + 過酸化水素 + グリコールアルデヒド
エタノールアミン + 2-オキソグルタル酸 → グリコールアルデヒド + L-グルタミン酸
エタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）は、エタノールアミンオキシダーゼとしても公知であり得る。この酵素は、オキシドレダクターゼのファミリー、具体的には酸素をアクセプターとしてドナーのCH-NH2基に作用するものに属する。
いくつかの態様において、エタノールアミンオキシダーゼまたはエタノールアミンアミノトランスフェラーゼは、エタノールアミンからグリコールアルデヒドへの変換を触媒する。
いくつかの態様において、エタノールアミンオキシダーゼ活性を有する酵素は、大腸菌tynAと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、エタノールアミンオキシダーゼ活性を有する酵素は大腸菌tynAである。
いくつかの態様において、エタノールアミンオキシダーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、tynAまたはそのホモログである。いくつかの態様において、エタノールアミンオキシダーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：238に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、エタノールアミンオキシダーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：237に示される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌alaAと少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は大腸菌alaAである。
いくつかの態様において、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、alaAまたはそのホモログである。いくつかの態様において、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：240に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：239に示される核酸配列によってコードされる。
ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（EC 1.1.1.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000071
ヒドロキシピルビン酸レダクターゼは、ベータ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ；NADH：ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ；D-グリセリン酸デヒドロゲナーゼとしても公知であり得る。
ヒドロキシピルビン酸レダクターゼは、高等植物、藻類、哺乳動物の組織および細菌に見出される酵素である。大部分の場合、これは、ヒドロキシピルビン酸をグリセリン酸に変換すると仮定されている。しかし、大部分の酵素はまた、グリオキシル酸からグリコール酸への還元を行う。
セリンサイクルメチロトローフにおいて、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼは、炭素の同化に主要な役割を果たす。これは、セリンサイクルの主要段階であるヒドロキシピルビン酸からグリセリン酸への変換を触媒するが、グリオキシル酸およびグリコール酸の相互変換によりC2化合物の代謝にも重要な役割を果たす。
いくつかの態様において、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼは、グリセリン酸からヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する。
いくつかの態様において、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌ghrBと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素は大腸菌ghrBである。
いくつかの態様において、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、ghrBまたはそのホモログである。いくつかの態様において、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：242に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：241からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
グリセリン酸デカルボキシラーゼ
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
D-グリセリン酸+ H+ → エチレングリコール + CO2
いくつかの態様において、グリセリン酸デカルボキシラーゼは、グリセリン酸からエチレングリコールへの変換を触媒する。
3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ（EC 3.1.3.38）または2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ（EC 3.1.3.20）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
3-ホスホ-D-グリセリン酸 + H2O → D-グリセリン酸 + リン酸
2-ホスホ-D-グリセリン酸 + H2O → D-グリセリン酸 + リン酸
3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼは、D-3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ；3-PGAホスファターゼとしても公知であり得る。2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼは、D-2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ；2-PGAホスファターゼとしても公知であり得る。これらの酵素は、ヒドロラーゼのファミリー、具体的にはリン酸モノエステル結合に作用するものに属する。
いくつかの態様において、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素または2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素は、大腸菌phoAと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素または2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素は大腸菌phoAである。
いくつかの態様において、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素または2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、phoAまたはそのホモログである。いくつかの態様において、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素または2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：246に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素または2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：245に示される核酸配列によってコードされる。
グリセリン酸キナーゼ（EC 2.7.1.31）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000072
グリセリン酸キナーゼは、グリセリン酸3-キナーゼ；グリセリン酸キナーゼ（リン酸化）（不明瞭（ambiguous））；D-グリセリン酸3-キナーゼ；D-グリセリン酸キナーゼ（不明瞭）；グリセリン酸-キナーゼ（不明瞭）；GK（不明瞭）；D-グリセリン酸キナーゼ（不明瞭）；ATP:(R)-グリセリン酸3-ホスホトランスフェラーゼとしても公知であり得る。
この酵素は、トランスフェラーゼのファミリー、具体的にはアルコール基をアクセプターとしてリン含有基を転移するもの（ホスホトランスフェラーゼ）に属する。この酵素は、3つの代謝経路：セリン/グリシン/トレオニン代謝、グリセロ脂質代謝、およびグリオキシル酸-ジカルボン酸代謝に関与する。
いくつかの態様において、グリセリン酸キナーゼ活性を有する酵素は、3-ホスホグリセリン酸からグリセリン酸への変換を触媒する。他の態様において、グリセリン酸キナーゼ活性を有する酵素は、2-ホスホグリセリン酸からグリセリン酸への変換を触媒する。
いくつかの態様において、グリセリン酸キナーゼ活性を有する酵素はグリセリン酸3-キナーゼである。いくつかの態様において、グリセリン酸3-キナーゼ活性を有する酵素は、シロイヌナズナGLYKと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、グリセリン酸3-キナーゼはシロイヌナズナGLYKである。
いくつかの態様において、グリセリン酸3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、GLYKまたはそのホモログである。いくつかの態様において、グリセリン酸3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：248に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、グリセリン酸3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：247に示される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、グリセリン酸キナーゼ活性を有する酵素は、グリセリン酸2-キナーゼ活性を有する酵素である。いくつかの態様において、グリセリン酸2-キナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌glxKと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、グリセリン酸2-キナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌garKと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、グリセリン酸2-キナーゼ活性を有する酵素は大腸菌glxKである。いくつかの態様において、グリセリン酸2-キナーゼは大腸菌garKである。
いくつかの態様において、グリセリン酸2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、glxKまたはそのホモログである。いくつかの態様において、グリセリン酸2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、garKまたはそのホモログである。いくつかの態様において、グリセリン酸2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：250および252より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、グリセリン酸2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：249および251より選択される核酸配列によってコードされる。
一炭素基を転移するトランスフェラーゼ（EC 2.1.2.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000073
ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼおよび関連トランスフェラーゼなどのトランスフェラーゼが使用され得る。ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼおよび関連トランスフェラーゼの例は、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ、グリシンホルムイミドイルトランスフェラーゼ、グルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ、D-アラニン2-ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、デオキシシチジル酸5-ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、メチオニル-tRNAホルミルトランスフェラーゼ、アミノメチルトランスフェラーゼ、3-メチル-2-オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼおよびUDP-4-アミノ-4-デオキシ-L-アラビノースホルミルトランスフェラーゼを含む。
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（EC 2.1.2.1）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
Figure 2022521905000074
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（GlyA）は、セリンをグリシンに変換し、メチル基をテトラヒドロ葉酸に転移し、従って、5,10-メチレン-テトラヒドロ葉酸（M-THF）を形成する。M-THFは、細胞中のC1ユニットの主な供給源であるので、GlyAはプリン、チミジン、メチオニン、コリンおよび脂質の生合成における主要な酵素になる。
この酵素はまた、5,10-メテニルTHFから5-ホルミルTHFへの加水分解および3-ヒドロキシアミノ酸（L-トレオニン、アロトレオニン、3-フェニルセリン）からグリシンおよびアルデヒドへの可逆切断を含むいくつかの副反応を触媒する。D-アラニンは、ピリドキサールリン酸補欠分子族と反応してピリドキサミンリン酸を形成することによってこの酵素を不活性化する。
酵素の保存された領域内のThr226残基は、基質識別に関与するように見える。His228残基は、反応特異性の決定に役割を果たす。Lys229は、触媒的役割を果たすようには見えない。Arg363は、アミノ酸基質のカルボキシル基に対する結合部位であるように見える。Tyr65のヒドロキシル基は、閉鎖型から開放型コンフォメーションへの活性部位の変換に関与する場合がある。Tyr55およびArg235の両方が、トランスアルジミネーション反応に必要である。
酵素の再フォールディングに関する研究は、ピリドキサール5'-リン酸（PLP）だけがフォールディング経路の最後に二量体性アポ酵素に結合することを示している。PLP付加の機構がさらに研究されている。高濃度のPLPで、PLPの第二の分子はLys346で結合することができる。保存された疎水性接触域はPLP結合部位の安定性に関与する。Tyr55は、PLP補因子の正しい位置決めに必要とされる。
野生型および変異型セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの結晶構造が解析されている。
glyA変異体は、グリシンを唯一の窒素源として使用することができない。glyA変異体はグリシンについて栄養要求性であり；glyAは、グリセロール最少培地での増殖に不可欠であることがその後示された。
glyA mRNA内の構造遺伝子から3'の配列が、mRNAの安定性に必要とされる。
いくつかの態様において、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌glyAと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0A825に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、遺伝子ID 947022に示される核酸配列によってコードされる。
ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.46およびEC 1.2.1.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
ホルムアルデヒド + NAD+ + H2O → ギ酸 + NADH + 2 H+
ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼは、NAD連結型ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、NAD依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはホルムアルデヒド：NAD+オキシドレダクターゼとしても公知であり得る。
動物、植物および細菌に見出される大部分のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼは、クラスIIIアルコールデヒドロゲナーゼ群と呼ばれる群に属し、活性のためにグルタチオンの添加を必要とする。実際のところ、これらの酵素についての真の基質は、ホルムアルデヒドではなく、ホルムアルデヒドおよびグルタチオンから非酵素的に形成されるS-ヒドロキシメチルグルタチオンであることが示された。
それらの酵素とは異なり、シュードモナス・プチダから単離された酵素は、グルタチオンの添加なしにホルムアルデヒドからギ酸への不可逆的酸化を触媒する。その基質はホルムアルデヒドであるので、本質的にこれは「本物の」ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼである。他のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼのように、P.プチダFDHは亜鉛含有金属酵素である。これはまた、電子アクセプターとしてNAD+も必要とする。しかし、クラスIIIアルコールデヒドロゲナーゼ群に属する酵素と異なり、これは4-メチルピラゾールに感受性である。一態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼはシュードモナス・プチダ由来である。いくつかの態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼは、P.プチダfdhAと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、GenBankアクセッションBAA04743.1に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、GenBankアクセッションD21201.1に示される核酸配列によってコードされる。
工業的に重要な放線菌、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032において、遺伝子fadHによってコードされるマイコチオール依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびより低い程度に遺伝子aldによってコードされるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）という2種の酵素が、有毒なホルムアルデヒドの分解に寄与することを証拠が示唆している。これらの酵素の両方を欠如する変異体は、ホルムアルデヒド含有培地中で増殖できなかった。バニリン酸の酸化が細胞内ホルムアルデヒドを生成するので、この変異体は、バニリン酸含有培地中でも増殖しなかった。土壌細菌がその生息地でホルムアルデヒドと遭遇する場合、またはバニリン酸などの環境化合物の代謝の間にホルムアルデヒドが発生する場合、ホルムアルデヒドの解毒が必要である。FadHによって生成されるギ酸は、遺伝子fdhFによってコードされるギ酸デヒドロゲナーゼによってCO2にさらに酸化されることができる。
ald変異体は、野生型と比較してホルムアルデヒド分解の約30％の低下を示した。染色体ald遺伝子の不活性化は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の欠如およびこの生物がエタノールで増殖するまたはエタノールを利用する能力の欠如を招き、エタノールから酢酸への二段階酸化を示唆している。遺伝子aldの発現は、転写制御因子RamAに依存し、一方で、RamBは発現にわずかにマイナスの効果を有する。一態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼは、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13032由来である。いくつかの態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼは、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13032 aldと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID Q8NLZ0に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、遺伝子ID 1020739に示される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼは、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）alkHと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。
サッカロミセス・セレビシエにおいて、2つのタンデムリピート遺伝子ALD2およびALD3は、アルデヒドデヒドロゲナーゼの2つの細胞質ストレス誘導性アイソフォームをコードする。これらのアイソフォームの発現は、一般的ストレス転写因子Msn2およびMsn4に依存するが、HOG MAPキナーゼ経路に依存しない。両方の形態は、NADP+よりもずっと効率的に補因子NAD+を使用することができ、いかなる陽イオンによっても活性化されない。ALD3は、浸透圧ショック、熱ショック、グルコース枯渇、酸化ストレスを含む多様なストレスおよび薬物によって誘導され、ALD2は浸透圧ストレスおよびグルコース枯渇だけによって誘導される。
いくつかの態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼは、サッカロミセス・セレビシエALD2と少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼは、サッカロミセス・セレビシエALD3と少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P47771およびUniProt ID P54114より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、遺伝子ID 855206および遺伝子ID 855205より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、ホモ・サピエンスALDH3A2と少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、ホモ・サピエンスALDH9A1と少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P51648およびUniProt ID P49189より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、遺伝子ID 224および遺伝子ID 223より選択される核酸配列によってコードされる。
ギ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
ギ酸 + 酸化型電子アクセプター + H+ → CO2 + 還元型電子アクセプター
ギ酸 + H+ → CO2 + H2（複合体により触媒される）
ギ酸 + 酸化型ヒドロゲナーゼ3 → CO2 + 還元型ヒドロゲナーゼ3
ギ酸デヒドロゲナーゼ-Hは、大腸菌における膜結合ギ酸デヒドロゲナーゼの3つのイソ酵素の1つである。すべては、生物の嫌気的代謝において機能性である。
ギ酸デヒドロゲナーゼ-H（FDH-H）は、ヒドロゲナーゼ-3と一緒に細胞質中に位置し、FDH-Hは、ギ酸-水素リアーゼ複合体を形成する。この酵素は酸素感受性であり、セレンを、FdhFオープンリーディングフレーム中のUGA終止コドンのフレーム内の位置に共翻訳的に組み入れられたセレノシステインとして含有する。FDH-Hの結晶構造は、分解能2.3Åで解析されており、[4Fe-4S]クラスターの存在、セレノシステインによるMo補因子の配位、および阻害剤である硝酸塩に対する結合部位の位置を確認している。fdhFの発現は、ギ酸および外部電子アクセプターの非存在によって誘導され、硝酸塩、亜硝酸塩、トリメチルアミンN-オキシド、および酸素によってリプレッションされる。ギ酸は、酸素ではなく、硝酸塩によるリプレッションを克服することができる。DNAジャイレースの阻害は、fdhFの発現を強化する。
fdnGHIは、硝酸塩およびトリメチルアミンN-オキシドなどの嫌気的呼吸基質の還元のためのキノンプールに電子を供与する、ギ酸から二酸化炭素への酸化を触媒する呼吸酵素、である膜結合型ギ酸デヒドロゲナーゼN（FDH-N）をコードする。FDH-Nは、錯体鉄-イオウ-モリブデン酵素（CISM）ファミリーのメンバーである。FDH-Nによるギ酸の酸化は起電性であり（H+/e- = 1）；ペリプラズム中のギ酸の酸化は、内膜の細胞質面でのメナキノン還元を伴う。ギ酸デヒドロゲナーゼ-Nの発現は、それぞれNarLおよびFnrによって媒介される硝酸塩および嫌気生活によって誘導される。精製されたFDH-Nは、α（FdnG）、β（FdnH）およびγ（FdnI）と称される3種類のサブユニットを含有する。1.6Åで分解された結晶構造は、この部分複合体が、さらに組織化されて、内膜のペリプラズム面方向に位置するαおよびβサブユニットならびに細胞質方向に位置するγサブユニットを有する生理的に関連する三量体になることを示している。電子は、αサブユニット中のギ酸酸化部位から膜を通過してγサブユニット中のメナキノン還元部位に伝達される。水素イオンは、細胞質からメナキノン還元部位で取り込まれる。
fdoGHIは、ギ酸から二酸化炭素への酸化を触媒し、硝酸塩の還元のための膜可溶性キノンプールに電子を供与する呼吸モリブデン酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼO（FDH-O）をコードする。FDH-Oおよび硝酸レダクターゼZは、細胞が好気的条件から嫌気的条件に移行する場合に活性な、ギ酸から硝酸への電子輸送経路に関与する。この経路は、メナキノンまたはユビキノンのいずれかと共に機能する。FDH-Oは、構成的に発現されるように見え；ギ酸デヒドロゲナーゼN（FDH-N）とは異なり、これは、FnrによってもNarLによっても制御されない。FDH-Oの発現は、好気的条件下で増加され；嫌気的条件下で、硝酸塩は発現をわずかに刺激し；汎制御因子H-NSおよびCRPは、FDH-O発現の制御に役割を果たす場合がある。FDH-Oは、細胞が嫌気生活に迅速に適応する能力に寄与する場合があるのに対し、FDH-Nのレベルはまだ不十分である。FDH-Oは、α（FdoG）、β（FdoH）およびγ（FdoI）サブユニットからなるヘテロ三量体複合体であり、これは、嫌気的に発現されたFDH-Nと広い配列類似性および免疫特性を共有する。
カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）ギ酸デヒドロゲナーゼFDH1は、ギ酸の解毒を媒介するNAD依存性酵素であって、Cu2+、Hg、p-クロロ第二水銀安息香酸、シアン化物、アジド、チオシアン酸およびシアン酸によって強く阻害される。シアン化物の阻害は、可逆であり、ギ酸と競合する。タンパク質の発現は、メタノールによって誘導され、グルコースによってリプレッションされる。このギ酸デヒドロゲナーゼによって触媒される酵素反応はNADHを再生することができるので、これは、NADH要求性操作経路を最適化するために大腸菌にクローニングされている。
工業的に重要な放線菌コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13032において、証拠は、ギ酸デヒドロゲナーゼがギ酸からCO2への酸化を触媒することを示唆している。ギ酸および有毒ホルムアルデヒドの両方は、環境中に存在し、この土壌細菌によってホルムアルデヒドの酸化を介してギ酸へと異化されることができる。これは、FadHおよびAldを介して達成することができる。次いで、ギ酸はFdhFによってCO2に変換される。FdhFは、有酸素条件下で活性なモリブデン補因子依存性ギ酸デヒドロゲナーゼであり、ストレス応答に関与すると推測された。FdhFによって使用される正確な電子アクセプターは定義されていない。遺伝子fdhFは、変異体解析によってギ酸デヒドロゲナーゼ活性のために必要とされると示された関連遺伝子fdhDおよびcg0617を含有する遺伝子クラスターの一部である。コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13032の増殖は、ギ酸の存在下である程度阻害され、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠如する株は、阻害の増加を示す。放射性トレーサー実験は、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13032がグルコースおよび13C-ギ酸塩と共に増殖された場合に、それが13C-二酸化炭素に代謝されたことを示した。fdhF欠失変異体は、ギ酸を代謝できなかった。増殖研究はまた、Mo2+の要求性も実証した。タンパク質配列分析は、FdhFが膜内在性タンパク質でなく、サイトゾル関連または膜結合型のいずれかである可能性が高いことを示唆した。推定上のオルソログが、多種多様な他の土壌細菌から同定されている。
カプリアビダス・オキサラティクス（Cupriavidus oxalaticus）がギ酸塩を主な炭素源およびエネルギー源として増殖される場合、NAD+依存性ギ酸デヒドロゲナーゼは、NADHおよびCO2を発生する主な酵素である。後者は、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ反応に入る。この酵素は、ギ酸塩と共に増殖された細胞から均一になるまで精製されている。酵素は、2つのFMN（フラビンモノヌクレオチド）、18～25個の非ヘム鉄原子および15～20個の酸不安定性スルフィドを含有する複合フラボタンパク質である。比活性は42ユニット/mgであった。この酵素は、その天然基質であるギ酸に特異的であるが、メチルビオロゲン、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、ニトロブルーテトラゾリウム塩、FMN、FAD、リボフラビン、および酸素を含む複数の非生理学的電子アクセプターを受容することができる。この酵素が反対方向の反応も触媒できることが示されている。しかし、採用された条件下でこの酵素は、CO2還元よりも約30倍速いギ酸の酸化を触媒した。
ゴッチャルキア・アシズリチ由来のNAD+依存性ギ酸デヒドロゲナーゼは可逆反応を触媒する。この酵素は、ギ酸からCO2への酸化を触媒する一方で、後者からギ酸への還元も触媒し、次いでギ酸は酢酸に変換される。この酵素は、部分的に精製されており、酸素および光に非常に敏感な大きな酵素複合体（分子量は少なくとも200kDa）であることが見出されている。この酵素は、L-セレノシステインを含有する。酵素の粗調製物は、フェレドキシンを経由するギ酸酸化の間にNAD還元と共役することができた。人工電子アクセプターであるメチルビオロゲンがNADの代わりに使用された場合、フェレドキシンは必要とされなかった。シアン化物はこの酵素を90％阻害した。細胞抽出物中の基礎ギ酸酸化活性は0.85μmol/min/mgタンパク質であったが、タングステン酸塩および亜セレン酸塩を添加すると12倍増加した。興味深いことに、関連生物クロストリジウム・シリンドロスポルム（Clostridium cylindrosporum）由来の酵素は、類似の亜セレン酸塩要求性を有するものの、この酵素に拮抗作用を有するタングステン酸塩よりもむしろモリブデン酸塩を必要とする。
メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）由来のタングステン含有NAD+依存性ギ酸デヒドロゲナーゼは、鉄-硫黄クラスター、FMNおよびタングステンを含有するヘテロ二量体である。好気性細菌中からタングステン含有酵素を見出すことはいくらか珍しいが、いくつかの他の例が見出されている。より小さなβサブユニットは、融合タンパク質であるように見え、そのN末端ドメインはNueE様サブユニットに関係し、そのC末端ドメインは、公知のNADH-ユビキノンオキシドレダクターゼのNuoF様サブユニットと関係した。
2つの異なる形態のギ酸デヒドロゲナーゼFDHは、メチロシヌス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）OB3bから2つのグループによって独立して精製されており、2つのタンパク質が異なる特性を有することが見出された。このタンパク質は、見かけのα2β2配置の2種類のサブユニットから構成され、合計サイズは315kDaである。これは、非ヘム鉄およびスルフィドを含有し、他の金属を含有せず、FMNを必要とするように見える。
モラクセラ属の種（Moraxella sp.）のNAD+依存性ギ酸デヒドロゲナーゼfdhは、補欠分子族を有しない相対的に単純な二量体タンパク質である。
いくつかの態様において、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌fdhF（chlF、FDH-H）、大腸菌FDH-N、大腸菌FDH-O、カンジダ・ボイジニFDH1、コリネバクテリウム・グルタミクムfdhF、カプリアビダス・オキサラティクスNAD+依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ、ゴッチャルキア・アシズリチNAD+依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ、メチロバクテリウム・エキストロクエンスFdh1、メチロシヌス・トリコスポリウムのギ酸デヒドロゲナーゼ、およびモラクセラ属の種のNAD+依存性ギ酸デヒドロゲナーゼfdhからなる群より選択されるギ酸デヒドロゲナーゼと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ギ酸デヒドロゲナーゼまたはギ酸デヒドロゲナーゼサブユニットをコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P07658、UniProt ID P0AEK7、UniProt ID P0AAJ3、UniProt ID P24183、UniProt ID P32176、UniProt ID P0AAJ5、UniProt ID P0AEL0、UniProt ID O13437、UniProt ID Q8NSY6、UniProt ID Q8KTI7、UniProt ID Q8KTI8、およびUniProt ID O08375より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ギ酸デヒドロゲナーゼまたはギ酸デヒドロゲナーゼサブユニットをコードする1つまたは複数の核酸分子は、遺伝子ID 948584、遺伝子ID 946038、遺伝子ID 948794、遺伝子ID 946035、遺伝子ID 948394、遺伝子ID 948395、遺伝子ID 948383、GenBankアクセッションAJ011046.2、遺伝子ID 1021531、GenBankアクセッションAF489516、およびGenBankアクセッションY13245.1より選択される核酸配列によってコードされる。
グリシン開裂系
グリシン開裂系は、4種類のタンパク質：3種類の酵素および担体タンパク質から構成される。動物において、この系は、ミトコンドリア内膜と緩く結合している。これらの酵素は、i）Pタンパク質（ピリドキサールリン酸含有タンパク質）またはグリシンデヒドロゲナーゼ（脱炭酸）（EC1.4.4.2）、ii）Tタンパク質またはアミノメチルトランスフェラーゼ（EC2.1.2.10）、およびiii）Lタンパク質またはジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（EC1.8.1.4）である。担体タンパク質は、Hタンパク質（リポ酸含有タンパク質）と呼ばれる。
グリシン切断反応は、以下の可逆反応を触媒する：
Figure 2022521905000075
この系は、3つの部分反応に分割される。反応は完全に可逆的であり、グリシン切断およびグリシン合成の両方において、リポ酸に結合したHタンパク質アミノメチル部分は中間体に相当し、続いてこの中間体は、Tタンパク質の作用によってメチレン-テトラヒドロ葉酸（M-THF）およびアンモニアに分解されるか、またはそれらから形成されることができる。可能性があることに、この反応は、重大な中間状態としてPタンパク質、グリシンのアミノメチル部分およびHタンパク質の三元複合体を含み得る。
Pタンパク質によって触媒される反応
グリシン分解の最初の部分反応は、Pタンパク質（グリシンデカルボキシラーゼ）によって触媒される脱炭酸である。Hタンパク質は、補助基質として役立つ。グリシン切断反応のもっとも特徴的な特性の1つは、Pタンパク質がピリドキサールリン酸依存性アミノ酸デカルボキシラーゼのクラスに属するはずであるとはいえ、Pタンパク質がグリシンの脱炭酸を顕著に触媒するためにHタンパク質を必要とすることである。この反応は、グリシンのカルボキシル炭素が二酸化炭素に変換される連続ランダム機構を介して進行する。残りのグリシン分子は、Hタンパク質に結び付いたリポエート中のジスルフィドの還元的切断によって形成されるスルフヒドリル基の1つに転移される。
Pタンパク質、約200kDaのピリドキサールリン酸含有タンパク質は、ホモ二量体か、またはヘテロ二量体の二量体かのいずれかである。前者は、サブユニット1つあたり1分子のピリドキサールリン酸を有し、後者は、βサブユニットへの二量体1つあたり1分子の補因子を有する。ピリドキサール補因子は、特定のリシン残基に結び付いている。ピリドキサール補因子は、活性部位ポケットと非共有結合的に相互作用する。T.サーモフィルス（T. thermophilus）Pタンパク質の活性部位は、溶媒に面した広い入口を有するチャネルによって分子表面に接続される。チャネル周囲の分子表面は、いくつかの正荷電したアミノ酸残基から構成され、それらの残基は、Hタンパク質との複合体形成に関与している可能性がある。
いくつかの態様において、グリシンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌gcvPと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、グリシンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P33195に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、グリシンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、遺伝子ID 947394に示される核酸配列によってコードされる。
Tタンパク質によって触媒される反応
Hタンパク質と結び付いたグリシンの脱炭酸部分は、Tタンパク質（アミノメチルトランスフェラーゼ）によって触媒されるさらなる分解に供される。反応はTHFを必要とし、アンモニア、M-THF、および還元型リポ酸を有するHタンパク質を産生する。THFの非存在下で、M-THFの代わりにホルムアルデヒドが生成されるが、その反応速度は、THFの存在下で測定される速度の0.05％未満である。逆反応において、Tタンパク質は、M-THF、アンモニア、および還元型リポ酸を有するHタンパク質から順序Ter Bi機構（ordered Ter Bi mechanism）を介したHタンパク質結合型アミノメチルリポ酸中間体の形成を触媒し、ここでHタンパク質は、結合する最初の基質であり、続いてM-THFおよびアンモニアが結合する。生成物放出の順序は、THFおよびメチルアミンを負荷されたHタンパク質である。
Tタンパク質は、約40kDaの単量体であり、Hタンパク質と共に1：1複合体を形成する。大腸菌タンパク質を採用している架橋研究は、Hタンパク質とTタンパク質との相互作用がTタンパク質のコンフォメーション変化を引き起こすことを明らかにした。Tタンパク質のLys-288とHタンパク質のAsp-43との間の分子間接触が見出された。Tタンパク質のN末端領域は、Hタンパク質との相互作用のため、およびTタンパク質をコンパクトな形態に保つために不可欠である。ヒトTタンパク質の遊離形態の結晶構造およびM-THFの類似体、N5-メチル-テトラヒドロ葉酸と結合した結晶構造が、解析されている。全体的な構造は、THF補因子が結合される中心腔を有し、プテリジン環が疎水性ポケットに深く埋まり、グルタミル基がC末端側表面に向いた、三つ葉のクローバー葉構造からなる。この構造は、テルモトガ・マリティマ（Termotoga naritima）、大腸菌、およびパイロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）OT3由来細菌Tタンパク質の構造と類似している。ヒトTタンパク質の構造分析および変異分析は、インバリアントAsp-101が葉酸基質のN10原子の求核性を増加させることによって触媒作用の開始に主要な役割を果たす場合があることを示した。
葉酸の結合に関与する残基が、架橋および部位特異的変異誘発によって同定されている。GvcTのN末端領域は、GvcTの適当なコンフォメーションに重要であり、Hタンパク質との相互作用を可能にする。
いくつかの態様において、アミノメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌gcvTと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、アミノメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P27248に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、アミノメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、遺伝子ID 947390に示される核酸配列によってコードされる。
Lタンパク質によって触媒される反応
グリシン切断反応の最終段階は、Lタンパク質によって触媒される、Hタンパク質に結び付いた還元リポ酸の再酸化である。Lタンパク質は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ、または2-オキソ酸（ピルビン酸、2-オキソグルタル酸、および分岐鎖2-オキソ酸）デヒドロゲナーゼ多酵素複合体のE3タンパク質成分として周知である。これは、最終的アクセプター、NADへの電子伝達を触媒する。
エンドウマメLタンパク質およびHタンパク質を採用した実験は、ジヒドロリポイルHタンパク質の酸化がapoHタンパク質またはオクタノイル化Hタンパク質などの構造関連類似体の存在によって影響されなかったことを示した。Lタンパク質とHタンパク質との間の構造相互作用は、酸化反応に可欠であり得る。
反応動態が研究されており、改変されたピンポン機構を示唆している。部位特異的変異誘発を使用して、FAD補因子の酸化還元電位に影響する酸化還元活性ジスルフィドおよび荷電残基が同定され、特徴付けされた。FAD補因子の挿入は、二量体化および完全活性のために不可欠である。
lpdヌル変異体は、好気的条件下でより多くのピルビン酸およびL-グルタミン酸を生成する。代謝フラックス分析は、エントナー-ドゥドロフ経路Iおよびグリオキシル酸シャントが活性化されることを示している。別のジヒドロリポ酸デヒドロゲナーゼ活性が、大腸菌lpd変異体から検出されており；従って、アイソザイムが存在し得る。
大腸菌におけるlpd遺伝子の変異は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体をNADH阻害に低感受性にし、嫌気性増殖中に活性にする。NADH阻害に対する酵素の感受性を低下させたGlu354でのアミノ酸置換は、NADHの運動を制限することによって作用すると提唱された。
lpdのサプレッサー変異は、チオレドキシンおよびグルタチオン/グルタレドキシン還元経路の両方を欠如する酸化還元欠損変異体の増殖を保つことが示されている。サプレッサー変異はLpd活性を低下させ、ジヒドロリポアミドの蓄積をもたらし、次いでそれがグルタレドキシンの還元を介して電子供与体として働くこともできる。Lpdの再酸化はTCAサイクルの機能を保った。
lpdは、差次的コドン適応を示し、偏性嫌気性菌と比較して酸素耐性嫌気性菌において差次的翻訳効率シグネチャーをもたらす。従って、これは酸化ストレス応答に役割を果たすと予測された。lpd欠失変異体は、他のストレスに対してではなく、過酸化水素曝露に対して特異的に、野生型よりも高い感受性であることが示された。
いくつかの態様において、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌lpd（lpdA、E3サブユニット）と少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0A9P0に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、遺伝子ID 944854に示される核酸配列によってコードされる。
Hタンパク質
Hタンパク質は、約14kDaの単量体性熱安定タンパク質である。脊椎動物Hタンパク質は、125個のアミノ酸残基から構成され、リポ酸は、Lys-59に共有結合される。エンドウ葉リポイル化Hタンパク質（131残基）のX線結晶構造は、このタンパク質の表面にリポイルリシンが局在したことを明らかにした。上述のように、Hタンパク質のリポイルリシン腕は、グリシン開裂系の成分の活性部位間で反応中間体および還元等価物をシャトルする。この機構は、2-オキソ酸デヒドロゲナーゼ複合体に見られるものと類似している。
Hタンパク質のリポイル化および2-オキソ酸デヒドロゲナーゼ複合体のアシルトランスフェラーゼ（E2）成分は、大腸菌におけるリポ酸タンパク質リガーゼA（LplA）によって触媒される。この酵素は、リポ酸およびATPからのリポイル-AMPの形成およびリポイル-AMPからHタンパク質およびE2成分へのリポイル部分の転移の両方を触媒する。X線結晶学研究は、LplAが大型N末端ドメインおよび小型C末端ドメインからなり、2つのドメインの間の界面に基質結合ポケットを有することを示した。
哺乳動物において、リポイル化はミトコンドリア内の事象である。リポ酸は、GTPを高エネルギー化合物として採用してリポ酸活性化酵素によって最初にリポイル-GMPに活性化される。リポ酸活性化酵素は、異物代謝性中鎖脂肪酸CoAリガーゼ-IIIとして既知の、まさにそのタンパク質である。次いで、リポ酸は、リポイルトランスフェラーゼの作用によってリポイル-GMPからアポタンパク質に転移される。
大腸菌におけるgcvH遺伝子によってコードされるHタンパク質は、グリシンのメチルアミン基をPタンパク質からTタンパク質へとシャトルするときに還元され、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼによって再酸化される、リポイルタンパク質である。GcvHは、gcv複合体の3種の酵素についての基質として機能する。
残基61～65は、これらの残基の保存およびエンドウ（Pisum sativum）タンパク質のリポ酸結合部位へのそれらの対応に基づき、（リシンでの）リポイル改変を含有すると予測される。
GcvHとGcvTとの間の相互作用が検討されている。これら2つのタンパク質の相互作用は、葉酸結合部位を形成するために必要であり得る。葉酸結合部位に葉酸のポリグルタミル領域が結合し、プテリジン環を露出する。GcvTのN末端は、おそらくコンフォメーション変化を媒介することによってGcvHとの相互作用のために重要であり、GcvHの残基D43は、GcvH-GcvT複合体中でGcvTの近位である。
いくつかの態様において、Hタンパク質は、大腸菌gcvHと少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、Hタンパク質をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0A6T9に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、Hタンパク質をコードする1つまたは複数の核酸分子は、遺伝子ID 947393に示される核酸配列によってコードされる。
グリコール酸デヒドロゲナーゼまたはグリコール酸オキシダーゼ（EC 1.1.99.14）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を説明する：
グリコール酸＋酸化された電子受容体→グリオキシル酸＋還元された電子受容体
グリコール酸デヒドロゲナーゼはまた、グリコール酸オキシダーゼ、グリコール酸オキシドレダクターゼおよびグリコール酸（受容体）2-オキシドレダクターゼとしても公知であり得る。
グリコール酸オキシダーゼは、グリコール酸の単独炭素源としての利用における最初の工程を触媒する。該酵素は、膜結合型であり得る。大腸菌 ATCC11775（血清型O1:K1:H7）から細胞質膜結合型グリコール酸オキシドレダクターゼ活性が単離されており、膜画分においてのみGlcFサブユニットそれ自体を検出することができた。生理学的電子受容体は知られていない。多コピープラスミドからglcDEFを発現する大腸菌系統の粗抽出物は、グリコール酸オキシダーゼ活性を含有する。glcD、glcEまたはglcFのいずれかの挿入変異体は、この活性を無効にするが、このことは、3つの遺伝子産物すべてがグリコール酸オキシダーゼ複合体のサブユニットであることを示唆している。glcDEFGBオペロンの発現は、グリコール酸による成長によって誘導される。
シロイヌナズナにおける推定グリコール酸オキシダーゼは、1単量体当たり1個のFADに結合し、葉、茎、花および根において発現される、ミトコンドリアホモ二量体タンパク質である。酵素活性は、シアン化物イオンによって阻害される。該酵素は、D-乳酸からピルビン酸への酸化を立体特異的に触媒し、メチルグリオキサールおよびD-乳酸の解毒を媒介する。
いくつかの態様では、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌のグリコール酸デヒドロゲナーゼGLCおよびシロイヌナズナのグリコール酸デヒドロゲナーゼから選択されるグリコール酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、グリコール酸デヒドロゲナーゼまたはグリコール酸デヒドロゲナーゼサブユニットをコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0AEP9、UniProt ID P52073、UniProt ID P52074、およびUniProt ID Q94AX4から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、グリコール酸デヒドロゲナーゼまたはグリコール酸デヒドロゲナーゼサブユニットをコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 947353、Gene ID 2847718、Gene ID 2847717、およびGenBankアクセッションY13245.1から選択される核酸配列によってコードされる。
アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（EC 2.6.1.44）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を説明する：
Figure 2022521905000076
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼサブユニットは、グリシン合成に使用される3つの異なる酵素の1つである。この酵素をコードするAGX1遺伝子が、ノックアウト系統で酵素比活性を比較することによって特定された。グリシン合成に関与する他の酵素を欠いたバックグラウンドに置いたとき、AGX1の変異は、完全なグリシン栄養要求性をもたらした。該酵素は、その後、精製および特徴付けられた。補因子としてピリドキサール5'-リン酸を含有する該酵素は、約80kDaのホモ二量体であり、L-アラニンおよびグリオキシル酸に高特異的である。
ミトコンドリアに局在化したホモサピエンスのアラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ2（AGXT2）およびペルオキシソームのセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（AGXT1、上記参照）は共に、アラニンをアミノドナーとして使用してグリオキシル酸からグリシンへの変換を触媒する。しかしながら、AGXT2はまた、不斉ジメチルアルギニン（ADMA）をアミノドナーとして利用して、α-ケト-δ-（NN-ジメチルグアニジノ）吉草酸（DMGV）の形成を導くこともできるが、AGXT1はできない。ADMAは、一酸化窒素（NO）シンターゼの強力な内因性阻害剤である。ADMAレベルはまた、ADMAをシトルリンおよびジメチルアミンに加水分解する細胞質ゾルのジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（DDAH）によって制御される。上昇したADMAレベルは、糖尿病、高血圧、うっ血性心不全およびアテローム性動脈硬化に関連する。AGXT2は、腎臓において主に発現されるピリドキサールリン酸依存性酵素であり、その活性は、腎臓が血圧を調節する１つのメカニズムである。
シロイヌナズナでは、4つのアミノトランスフェラーゼ活性を有するアラニントランスアミナーゼが特定されている。AOAT1（GGAT1）は、ペルオキシソームに局在化している。ノックアウト植物は、低下した、AOAT、GPAT（グルタミン酸：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ）、AGAT（アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ）およびGGAT（グルタミン酸:グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ）活性を有する。GGATおよびAGAT活性が最も激しく低下した。これらは、AOAT1が光呼吸に主に関与していることを示している。同様に、ペルオキシソームに局在していると予測されるAOAT2（GGAT2）も光呼吸に関与している可能性が高い。組換えタンパク質のインビトロアッセイは、GGAT1およびGGAT2が、4つのアミノトランスフェラーゼ活性、すなわち、GGAT、AGAT、GPATおよびAOATを有することを示した。2つの組換えタンパク質は、アミノ酸基質であるグルタミン酸およびアラニン、ならびにオキソ酸基質であるグリオキシル酸、ピルビン酸および2-オキソグルタル酸に対して極めてよく似たKm値を呈した。
いくつかの態様では、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、サッカロミセス・セレビシエのAGX1、ホモサピエンスのAGXT2、シロイヌナズナのAOAT1およびシロイヌナズナのAOAT2から選択されるアラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P43567、UniProt ID Q9BYV1、UniProt ID Q9LR30およびUniProt ID Q9S7E9から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 850514、Gene ID 64902、TAIRアクセッションAT1G23310およびTAIRアクセッションAT1G70580から選択される核酸配列によってコードされる。
アラニントランスアミナーゼ（EC 2.6.1.2）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を説明する：
Figure 2022521905000077
いくつかの態様では、アラニントランスアミナーゼは、グルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼである。AlaAは、大腸菌における3つの主要なアラニン合成トランスアミナーゼの1つである。AlaAおよびAlaCは合わせて、細胞におけるグルタミン酸－ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）活性の90％を占める。AlaAの結晶構造は、2.11Åの分解能で解明されている。構造は、フォールドタイプIアミノトランスフェラーゼに特有の対称のα2ホモ二量体を示す。alaA欠失系統は、成長欠陥を有していないが、alaA avtA二重変異体は、寒天プレート上に小さなコロニーを形成する。alaA avtA alaC三重変異体は、液体培地中で低成長表現型を有する。二重変異体および三重変異体の欠陥は、アラニンの添加によって救済することができる。適応性および競合成長実験を異なる成長条件下で実施した。特に、酸素制限条件下、最少培地中のΔalaA系統の倍加時間は、富栄養培地中の成長と比較して増加する。競合成長条件下、ΔalaA変異は、富栄養培地中であっても野生型と比較して不利益をもたらす。alaAは、ストレスの致死効果を低下させる遺伝子のスクリーンにおいて特定された。alaA挿入変異体は、マイトマイシンCおよび他のストレスに対して野生型よりも感受性であり、10％ SDSに対して低感受性である。alaA遺伝子は、リーキー（leaky）なアラニンまたはバリン要求性の変異体として最初に特定された。
AlaBは、大腸菌における3つの主要なアラニン合成トランスアミナーゼの1つである。AlaBは、グルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ反応を触媒して、ピルビン酸とアミノドナーとしてのグルタミン酸からアラニンを生成する。この活性は、粗細胞抽出物においてアッセイされており、AlaBをコードする遺伝子は、プラスミド上で単離されている。多コピープラスミドからのalaBの発現は、ilvE alaA変異体系統の成長欠陥を部分的に抑制する。
AlaCは、大腸菌における3つの主要なアラニン合成トランスアミナーゼの1つである。該酵素のalaAの結晶構造に基づいた相同モデルが作製されている。alaC欠失系統は、成長欠陥を有していないが、alaA avtA alaC三重変異体は、液体培地中で低成長表現型を有する。その欠陥は、アラニンの添加によって救済することができる。適応性および競合成長実験を異なる成長条件下で実施した。特に、酸素制限条件下、最少培地中のΔalaC系統の倍加時間は、富栄養培地中の成長と比較して増加する；alaAおよびavtA変異体の場合と異なり、L-アラニンの添加は、その倍加時間を、DMEM培地中で観察された倍加時間に戻す。競合成長条件下、ΔalaC変異は、富栄養培地中であっても野生型と比較して不利益をもたらす。alaCの発現は、転写調節因子SgrRによって活性化される。したがって、AlaCは、グルコース-リン酸ストレスにおいて役割を果たし得る。しかしながら、alaC欠失変異体は、糖-リン酸ストレスを誘導するα-メチルグルコシドに対して感受性の変化を示さない。
ホモサピエンスでは、アラニンアミノトランスフェラーゼは、L-アラニンと2-オキソグルタル酸との間の可逆的アミノ基転移を触媒してピルビン酸およびL-グルタミン酸を形成する、細胞質酵素である。これらの4つの主要な代謝中間体の相互変換は、この酵素に分解性と生合成の両方の役割を与える。該酵素は、骨格筋および肝臓のアラニン-グルコースサイクル、糖新生、ならびに脳におけるグルタミン酸生成に関与する。アラニンアミノトランスフェラーゼは、腎臓、骨格筋、脂肪組織および心臓において発現される。該酵素には、2つのアイソフォーム：アラニンアミノトランスフェラーゼ1（GPT）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ2（GPT2）がある。ヒトアラニンアミノトランスフェラーゼ1（GPT）は、肝臓から精製された。脂肪組織からの組換えヒトアラニンアミノトランスフェラーゼ2（GPT2）は大腸菌において発現されており、その分子量はSDS-PAGEによって決定された。該酵素は、脂肪組織、筋肉、脳および腎臓において高レベルで、乳房および肝臓においてより低レベルで発現される。
海生環形動物多毛類のタマシキゴカイ（Arenicola marina）（ゴカイ）由来のアラニントランスアミナーゼのサブユニット構造は報告されていない。該酵素は、ゲル濾過クロマトグラフィーによって決定された場合に、見かけの天然分子量91kDaを有する。この生物において該酵素をコードする遺伝子は特定されていない。海生環形動物および軟体動物では、この反応は、低酸素または酸素欠乏期中に作動する嫌気的エネルギー生成経路に関与する。この生物由来のアラニントランスアミナーゼ（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）は、体壁筋から部分的に精製され、特徴付けられている。高いアラニントランスアミナーゼ活性がこの組織で見いだされた。また、特異的で可逆的なL-グルタミン酸依存性L-アラニントランスアミナーゼおよびL-アスパラギン酸トランスアミナーゼ活性がイガイのムラサキイガイ（Mytilus edulis）の組織において実証されている。
シロイヌナズナのトリプトファンアミノトランスフェラーゼTAA1タンパク質は、多くの植物種において植物ホルモンとして作用する生物学的に重要なオーキシンであるインドール-3-ピルビン酸（インドール-3-酢酸（IAA）の前駆体）の形成に関与する。インビトロアッセイは、このピリドキサール5'-リン酸（PLP）依存性アミノトランスフェラーゼが、ピルビン酸または2-オキソグルタル酸のいずれかを補基質として使用して、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-ロイシン、L-アラニン、L-メチオニンおよびL-グルタミンを含む多数の異なるL-アミノ酸に作用することができることを明らかにしている。しかしながら、酵素アッセイ、インシリコドッキング実験および変異体表現型解析はすべて、L-トリプトファンがこの酵素のインビボ基質であることを示唆している。TAA1は、L-トリプトファンおよびピルビン酸を用いて試験したときに0.29mMのKmおよび12.9μM/minのVmaxを有する。ピルビン酸または2-オキソグルタル酸が、この酵素のより生物学的に関連する補基質であるかどうかは不明である。
このタンパク質をコードする遺伝子は、避陰変異体および弱いエチレン低感受性を有する変異体のスクリーンにおいて特定されており、このことは、TAA1媒介経路を通じて合成されるオーキシンが、特定の環境刺激およびホルモン刺激への応答に特に重要であることを示唆している。加えて、適正なオーキシンレベルを必要とする胚発生などの正常な発生過程は、アラビドプシス属植物においてTAA1およびその密接に関連するファミリーメンバー（すなわち、TAR1およびTAR2）の1つまたは複数がノックアウトされたとき、崩壊する。この酵素活性は、16のファミリー間に分布する30の異なる種からの酵素抽出物がトランスアミナーゼ反応のIPAの形成を触媒できることからして、植物界に広く分布していると思われる。藻類の3つの種もこの活性を有する。
シロイヌナズナでは、4つのアミノトランスフェラーゼ活性を有するアラニントランスアミナーゼが特定されている。AOAT1（GGAT1）は、ペルオキシソームに局在化している。ノックアウト植物は、低下した、AOAT、GPAT（グルタミン酸：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ）、AGAT（アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ）およびGGAT（グルタミン酸:グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ）活性を有する。GGATおよびAGAT活性が最も激しく低下した。これらは、AOAT1が光呼吸に主に関与していることを示している。同様に、ペルオキシソームに局在していると予測されるAOAT2（GGAT2）も光呼吸に関与している可能性が高い。組換えタンパク質のインビトロアッセイは、GGAT1およびGGAT2が、4つのアミノトランスフェラーゼ活性、すなわち、GGAT、AGAT、GPATおよびAOATを有することを示した。2つの組換えタンパク質は、アミノ酸基質であるグルタミン酸およびアラニン、ならびにオキソ酸基質であるグリオキシル酸、ピルビン酸および2-オキソグルタル酸に対して極めてよく似たKm値を呈した。
また、カンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）、クロストリジウム・プロピオニクム、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、メガチルサス・マキシマス（Megathyrsus maximus）およびパニカム・ミリアセアム（Panicum miliaceum）に由来するアラニンアミノトランスフェラーゼ活性も記載されている。パニカム・ミリアセアムの推定アラニンアミノトランスフェラーゼは、このNAD-MEタイプC4植物からクローン化され、葉肉と維管束鞘細胞の両方において発現することが見いだされており、その遺伝子発現は光誘発性であった。mRNA蓄積は、両細胞タイプで緑化の間に劇的に増加したが、このことは、C4光合成におけるその予測された役割と一致する。
いくつかの態様では、アラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌のグルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼalaA、大腸菌のグルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼalaB、大腸菌のグルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼalaC、ホモサピエンスのアラニンアミノトランスフェラーゼ1（GPT）、ホモサピエンスのアラニンアミノトランスフェラーゼ2（GPT2）、タマシキゴカイのアラニントランスアミナーゼ、シロイヌナズナのトリプトファンアミノトランスフェラーゼTAA1、シロイヌナズナのAOAT1、シロイヌナズナのAOAT2、カンジダ・マルトーサのアラニンアミノトランスフェラーゼ、クロストリジウム・プロピオニクムのアラニンアミノトランスフェラーゼ、ピロコッカス・フリオサスのアラニンアミノトランスフェラーゼaat、メガチルサス・マキシマスのアラニントランスアミナーゼ、およびパニカム・ミリアセアムのアラニントランスアミナーゼAlaAT-2から選択されるアラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、アラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0A959、UniProt ID P77434、UniProt ID P24298、UniProt ID Q8TD30、UniProt ID Q9S7N2、UniProt ID Q9LR30、UniProt ID Q9S7E9、UniProt ID Q9P9M8、およびUniProt ID P34106から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、アラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 946772、Gene ID 946850、Gene ID 2875、Gene ID 84706、Gene ID 843393、TAIRアクセッションAT1G23310、TAIRアクセッションAT1G70580、GenBankアクセッションAF163769.1およびGenBankアクセッションX69421.1から選択される核酸配列によってコードされる。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4.1.2およびEC 1.4.1.3）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を説明する:
Figure 2022521905000078
いくつかの態様では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、グルタミン酸をアンモニアおよびアルファ-ケトグルタル酸に分解する、サッカロミセス・セレビシエ由来のNAD依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH2）である。GDH2の発現は、窒素異化抑制および細胞内アンモニアレベルに感受性がある。
アラビドプシス属において、それぞれアルファサブユニットおよびベータサブユニットをコードする、2つのNAD依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）遺伝子GDH1およびGDH2がある。異なる比率のアルファサブユニットおよびベータサブユニットから構成されるGDHの7つの六量体アイソフォームが検出されている。異なるアイソフォームは、異なる環境および生理学的条件下で異なる組織に分布している。GDHの酵素活性は、ある程度、転写レベルで制御される。
ペプトニフィラス・アサッカロリチカス（Peptoniphilus asaccharolyticus）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼは、L-グルタミン酸から2-オキソグルタル酸へのNAD依存性の酸化的脱アミノ化を触媒する。反応は、高度に基質特異的である。D-グルタミン酸、D-もしくはL-アスパラギン酸、グルタミンの存在下またはNADPがNADに置き換わったとき、活性は観察されなかった。スクロース密度勾配遠心法を使用して、研究者は、天然酵素の分子量が300～340kDaであると推定したが、このことは、該酵素がホモ六量体であり得ることを示唆している。他の研究者は、一方で、ゲル濾過を使用して天然酵素の分子量がおよそ226kDaであると推定した。L-グルタミン酸およびNAD+のKM値は、それぞれ、1.3mMおよび0.25mMであった。
ハロバクテリウム・サリナルム（Halobacterium salinarum）は、異なる形態が異なる補因子（NADおよびNADP）を利用する、2つ以上の形態のGDHを有すると報告されている生物の1つである。最終的に、該生物が4つの異なるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする4つの遺伝子を有することが示された。これらの遺伝子産物の2つが精製され、生化学的に特徴付けられた。該遺伝子の1つである当初NADP特異的形態をコードすると予測されたgdhA1は、NAD特異的酵素をコードすることが分かった。
ホモサピエンスのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）は、L-グルタミン酸から2-オキソグルタル酸およびアンモニアへの可逆的な酸化的脱アミノ化を触媒する、ホモ六量体のミトコンドリアマトリックス酵素である。哺乳動物のGDHは、これらが補因子としてNADまたはNADPのいずれかを使用できるという点で珍しい酵素である。ヒトは、2つのGDHイソ酵素を発現する。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ1（GLUD1）は、肝臓、脳、膵臓および腎臓において高レベルで発現される。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ2（GLUD2）は、X染色体に関連したイントロンを含まない遺伝子によってコードされ、網膜、精巣および脳において発現される。酵素過剰活性を導くGLUD1の変異は、高インスリン血をもたらす。ADPおよびL-ロイシンのような正のエフェクターならびにGTPのような負のエフェクターによる哺乳動物のGDH活性のアロステリック制御が大規模に研究されている。
枯草菌PCI 219は、NAD(H)およびNADP(H)に対する二重補酵素特異性を有する単一のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）を有する。その分子量は、ゲル濾過によって250,000+/-20,000、スクロース密度勾配におけるゾーン遠心分離によって270,000+/-30,000と推定された。サブユニットサイズは約57,000であったが、このことは、それがホモ四量体であることを示唆している。
cDNAクローンがソラヌム・リコペルシクム（Solanum lycopersicum）の組織から単離された。cDNAは、植物のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）と同一性を共有するタンパク質をコードした。このタンパク質の発現分析は、このタンパク質が、茎、根および葉において発現されるが果実組織には存在しないことを示した。研究はまた、トマトのGDH1の2つのサブユニットが単一の遺伝子によってコードされていることも示した。この酵素は、2-オキソグルタル酸をL-グルタミン酸へ変換する。
また、クロストリジウム・プロピオニクムおよびサーモトガ・マリティマに由来するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性も記載されている。
いくつかの態様では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、サッカロミセス・セレビシエのNAD依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼGDH2、シロイヌナズナのNAD依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼGDH2、シロイヌナズナのNAD依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼGDH1、ペプトニフィラス・アサッカロリチカスのNAD依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼgdhA、ハロバクテリウム・サリナルムのNAD依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼgdhA、サーモトガ・マリティマのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ホモサピエンスのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ1（GLUD1）、ホモサピエンスのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ2（GLUD2）、枯草菌のグルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびソラヌム・リコペルシクムのグルタミン酸デヒドロゲナーゼGDH1から選択されるグルタミン酸デヒドロゲナーゼに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P33327、UniProt ID Q38946、UniProt ID Q38946、UniProt ID P28997、UniProt ID P29051、UniProt ID P00367、UniProt ID P49448およびUniProt ID P93541から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 461927、TAIRアクセッションAT5G07440、TAIRアクセッションAT5G18170、GenBankアクセッションM76403.1、GenBankアクセッションX63837.1、Gene ID 2746、Gene ID 2747およびGenBankアクセッションU48695.1から選択される核酸配列によってコードされる。
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.10）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を説明する：
Figure 2022521905000079
大腸菌mhpFは、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。MhpFは、単量体として活性である；反応の律速段階は、チオエステル交換であるように思われる。MhpFは、工学操作された逆β酸化経路におけるn-ブタノールの合成に関与する。MhpEの発現は、MhpFに翻訳共役され、2つのタンパク質間の相互作用は、MhpEの溶解性に必要であるように思われる。
大腸菌AdhEは、3つのFe2+依存性触媒機能：アルコールデヒドロゲナーゼ、補酵素A依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸ギ酸－リアーゼデアクチバーゼを有する、ホモ多量体タンパク質である。しかしながら、AdhEのピルビン酸ギ酸－リアーゼデアクチバーゼ活性の存在は議論中である。AdhEのホモ多量体構造は、棒状の超微細構造を形成するように20～60のサブユニットがらせん状に配置されているという点で珍しい。発酵条件下、AdhEは、アセチルCoAからアセトアルデヒドへの還元および後者の化合物からエタノールへの還元を触媒する。好気的には、逆方向に、AdhEは、アセトアルデヒドからアセチルCoAへの酸化を触媒することができる。adhEの発現は、転写および翻訳レベルで、かつ、おそらくは翻訳後レベルで調節されるように思われる。adhEの発現は、好気的成長中よりも嫌気的成長中でおよそ10倍高い。大腸菌 B由来AdhEは、初期研究において部分的に精製および特徴付けられた。これはその後、大腸菌Bから均質まで精製され、その補酵素A関連アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が詳細な動態解析に供された。bi-uni-uni-uniピンポン機構が提唱された。ネズミチフス菌（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium）由来のAdhEは、大腸菌のものと70％のアミノ酸配列同一性を示した。これは、大腸菌酵素と比較してアルコール基質に対してより低いKmおよび基質特異性のある程度の違いを有していた。代謝工学分野では、adhEの欠失は、コハク酸、D-乳酸およびポリヒドロキシアルカン酸などの化合物の生成における決定因子である。
クラミドモナス・レインハルドティのADH1は、二重機能のアルコールデヒドロゲナーゼ/アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。これは、酸素欠乏条件下で活性であるように思われ、クラミドモナスにおける2つの異なる嫌気的エタノール生成経路に関与する。
DmpFは、シュードモナス属の種由来のアシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼである。シュードモナス属の種CF600におけるメタ開裂経路の最後の2工程は、4-ヒドロキシ-2-オキソ吉草酸アルドラーゼおよびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化）という酵素による(S)-4-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸からピルビン酸およびアセチルCoAへの変換を伴う。生化学研究は、これらの2つの酵素が二機能性のアルドラーゼ-デヒドロゲナーゼヘテロ二量体を含むことを実証し、アルドラーゼ反応の生成物であるアセトアルデヒドがチャネリング機構を介してデヒドロゲナーゼ活性部位に移送されることを示唆している。このことは、毒性のアセトアルデヒドによる細胞への危険性を最小限に抑える。
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）F1におけるtodI遺伝子産物の存在は、プラスミド構築物のタンパク質発現パターンによって示唆された。todI遺伝子産物の予測されたアミノ酸配列は、他の細菌のアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子産物と非常に高い同一性を示した。
クロストリジウム・アセトブチリクムATCC 824のadhE遺伝子は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性とアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の両方を有する多機能性酵素をコードする。両活性は、ソルベント生成期中のブタン-1-オールおよびエタノールの形成に必要である。adhE遺伝子は、solオペロンの一部であり、pSOL1メガプラスミド上に位置している。クロストリジウム・アセトブチリクムATCC 824におけるプラスミドからの該遺伝子の発現は、NADH依存性ブタノールデヒドロゲナーゼ、NAD依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性上昇、ならびにNADH依存性エタノールデヒドロゲナーゼの小さな増加をもたらした。ブタノールもアセトンも生成しないブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼおよびアセトアセチル-補酵素A：酢酸/酪酸：補酵素A-トランスフェラーゼ活性欠損変異体のadhE遺伝子による補完は、いかなるアセトン形成もいかなる有意なエタノール生成の増加も伴うことなくブタノール形成を回復させたが、このことは、該酵素の主な役割が、ブタノール形成にあり、ブタナールデヒドロゲナーゼ活性（ブタノイルCoAからブタン-1-アールへ変換）とブタノールデヒドロゲナーゼ活性の両方を提供することを示唆している。加えて、該遺伝子の不活化は、ブタノール生成を大幅に低下させ（85％）、このことがこの役割を裏付けている。pSOL1プラスミド由来の別の遺伝子であるadhE2は、ブタノール生成に関与する第2の多機能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼをコードする。しかしながら、その酵素は、アルコール生成条件下でのみ生成され、ソルベント生成条件下では発現されない。ATCC 824系統由来の遺伝子は当初、aadと呼ばれた。
また、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ペロバクター・アセチレニクスおよびシュードモナス・プチダに由来するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性も記載されている。部分的に精製されたロイコノストック・メセンテロイデスのCoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは、それと共に精製されたNAD関連アルコールデヒドロゲナーゼから分離できなかった。該酵素は、NADに特異的であり、NADPを使用できなかった。アセトアルデヒドおよび1-プロパナールが最良の基質であった一方で、該酵素は、ブタン-1-アール（アセトアルデヒドでの活性の31％）およびイソブタナール（14％）も使用できた。
いくつかの態様では、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌mhpF、大腸菌AdhE、クラミドモナス・レインハルドティのADH1、ロイコノストック・メセンテロイデスのCoA依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ペロバクター・アセチレニクスのアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、シュードモナス属の種のdmpF、シュードモナス・プチダのアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼtodI、シュードモナス・プチダのアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼのcmtHおよびクロストリジウム・アセトブチリクムのアルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼAdhEから選択されるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P77580、UniProt P0A9Q7、UniProt ID A8JI07、UniProt ID Q52060、UniProt ID Q51949およびUniProt ID P33744から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 945008、Gene ID 945837、Gene ID 5729132、GenBankアクセッションX60835.1、GenBankアクセッションU09250.1およびGene ID 1116167から選択される核酸配列によってコードされる。
エタノールアミンアンモニアリアーゼ（EC 4.3.1.7）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を説明する：
Figure 2022521905000080
エタノールアミンアンモニア-リアーゼ（EAL）は、外部のビタミンB12の存在下で、大腸菌がエタノールアミンを単独の窒素および炭素源として利用することを可能にする。EALは、その基質によって自然に不活化され、EutAによって再活性化され得る、アデノシルコバラミン依存性酵素である。該酵素は、非K-12系統NCIB 8114で最初に研究された。N末端短縮型であるが活性型の該酵素と補因子および基質との二元複合体および三元複合体の結晶構造が解明されている。該酵素は、（αβ）2二量体の六量体から構成されており、αサブユニットが活性部位を保持し、αサブユニットとβサブユニットとの間の界面にコバラミン補因子が結合している。著者は、過去に記載されているアデノシルコバラミン依存性再配列の機構と一致する反応機構を提唱している。該反応の立体化学的過程が結晶構造に基づいてモデル化されており、該酵素の見かけの立体特異性の欠如を説明している。EALの生成は、異化生成物によって抑制され、エタノールアミンおよびアデノシルコバラミン補因子が同時に存在することによって誘導される。エタノールアミンアンモニア-リアーゼは、α（EutB）およびβ（EutC）という2つのサブユニットを含む。
いくつかの態様では、エタノールアミンアンモニアリアーゼ活性を有する酵素は、エタノールアミンアンモニアリアーゼ活性を有する大腸菌酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、エタノールアミンアンモニアリアーゼサブユニットをコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0AEJ6およびUniProt ID P19636から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、エタノールアミンアンモニアリアーゼサブユニットをコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 946924およびGene ID 946925から選択される核酸配列によってコードされる。
セリンアミナーゼ（EC 2.6.1.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を説明する：
L-セリン＋NH4+ → (S)-2,3-ジアミノプロパン酸
いくつかの態様では、セリンアミナーゼ活性を有する酵素は、セリン-グリオキシル酸トランスアミナーゼであることができる。他の態様では、セリンアミナーゼ活性を有する酵素は、セリン-ピルビン酸トランスアミナーゼ（上記参照）であることができる。
セリン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼは、L-セリンのα-アミノ基のグリオキシル酸への転移を触媒して、グリシンおよびヒドロキシピルビン酸を形成する。セリンサイクルメチル栄養細菌では、この酵素は、2つの重要な役割：一炭素単位のための受容体（グリシン）の形成、および同化経路におけるL-セリンからヒドロキシピルビン酸への変換を果たす。これは、精製される最初の微生物のセリン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼであり、その数年後、その酵素をコードする遺伝子も特定された。
シロイヌナズナのAGT1によってコードされるセリン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼは、ホモ二量体である。精製された組換えタンパク質は、セリン：グリオキシル酸アミノ基転移で最も高い活性を有する。それはまた、アラニン：グリオキシル酸アミノ基転移およびセリン：ピルビン酸アミノ基転移をはるかに低い特異的活性で触媒した。
sgaAは、メチロバクテリウム・エキストロクエンス染色体上のセリン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子であると推定される。クローン化された遺伝子の産物は発現されなかったが、変異補完を使用してその役割が調査された。この遺伝子の変異は、C1化合物で成長する能力を無効にし、その遺伝子断片のクローン化された不活性型による変異体の補完は活性を回復させた。加えて、sgaA配列は、多数のアミノトランスフェラーゼに類似している。
さらなる態様では、セリンアミナーゼ活性を有する酵素は、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素であることができる。いくつかの態様では、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、serC、またはそのホモログである。別の態様では、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素、L-セリントランスアミナーゼ活性を有する酵素またはセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：230に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素、L-セリントランスアミナーゼ活性を有する酵素またはセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：229に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、ホモサピエンスのPSAT1、またはそのホモログである。一態様では、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID Q9Y617に示されるアミノ酸配列を含む。別の態様では、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 29968に示される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様では、セリンアミナーゼ活性を有する酵素は、シロイヌナズナのセリン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼAGT1、ヒホミクロビウム・メチロボルム（Hyphomicrobium methylovorum）GM2のセリン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼsgaAおよびメチロバクテリウム・エキストロクエンスのsgaAに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、セリン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID Q56YA5およびUniProt ID O08374から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、セリン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、TAIRアクセッションAT2G13360、GenBankアクセッションD86125.1およびGenBankアクセッションL27235.1から選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様では、セリンアミナーゼ活性を有する酵素は、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼである。いくつかの態様では、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼは、ホモサピエンスのAGXT1に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼは、ホモサピエンスのAGXT1である。いくつかの態様では、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、AGXT1、またはそのホモログである。いくつかの態様では、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：244に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：243に示される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様では、セリンアミナーゼ活性を有する酵素は、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。いくつかの態様では、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、サッカロミセス・セレビシエのAGX1、ホモサピエンスのAGXT2、シロイヌナズナのAOAT1およびシロイヌナズナのAOAT2から選択されるアラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P43567、UniProt ID Q9BYV1、UniProt ID Q9LR30およびUniProt ID Q9S7E9から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 850514、Gene ID 64902、TAIRアクセッションAT1G23310およびTAIRアクセッションAT1G70580から選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様では、セリンアミナーゼ活性を有する酵素は、アラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素である。いくつかの態様では、アラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌のグルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼalaA、大腸菌のグルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼalaB、大腸菌のグルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼalaC、ホモサピエンスのアラニンアミノトランスフェラーゼ1（GPT）、ホモサピエンスのアラニンアミノトランスフェラーゼ2（GPT2）、タマシキゴカイのアラニントランスアミナーゼ、シロイヌナズナのトリプトファンアミノトランスフェラーゼTAA1、シロイヌナズナのAOAT1、シロイヌナズナのAOAT2、カンジダ・マルトーサのアラニンアミノトランスフェラーゼ、クロストリジウム・プロピオニクムのアラニンアミノトランスフェラーゼ、ピロコッカス・フリオサスのアラニンアミノトランスフェラーゼaat、メガチルサス・マキシマスのアラニントランスアミナーゼ、およびパニカム・ミリアセアムのアラニントランスアミナーゼalaAT-2から選択されるアラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、アラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0A959、UniProt ID P77434、UniProt ID P24298、UniProt ID Q8TD30、UniProt ID Q9S7N2、UniProt ID Q9LR30、UniProt ID Q9S7E9、UniProt ID Q9P9M8、およびUniProt ID P34106から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、アラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 946772、Gene ID 946850、Gene ID 2875、Gene ID 84706、Gene ID 843393、TAIRアクセッションAT1G23310、TAIRアクセッションAT1G70580、GenBankアクセッションAF163769.1およびGenBankアクセッションX69421.1から選択される核酸配列によってコードされる。
2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼ（EC 4.3.1.15）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を説明する：
Figure 2022521905000081
2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼは、立体特異的ではなく、2,3-ジアミノプロピオン酸のDとLの両立体異性体のα,β-脱離を触媒する。該酵素はまた、D-セリンに対して弱い活性を呈し、L-セリン、D-β-Cl-アラニンまたはL-β-Cl-アラニンに対して活性を呈しない。
該酵素は、ホモ二量体であり、ピリドキサール5'-リン酸補欠分子族を含有し、PLP含有酵素のフォールドタイプIIファミリーに属する。アポおよびホロ酵素ならびに該酵素の反応中間体および基質との複合体の結晶構造が解明されている。活性部位残基の変異体の動態特性が分析され、反応機構が提唱された。
いくつかの態様では、2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼ活性を有する酵素は、大腸菌の2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼygeXに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様では、2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼ活性を有する酵素は、大腸菌ygeXである。いくつかの態様では、2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P66899に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 947012に示される核酸配列によってコードされる。
グリオキシル酸シャント
トリカルボン酸サイクルの一種であるグリオキシル酸サイクルは、植物、細菌、原生生物および真菌において生じる同化経路である。グリオキシル酸サイクルは、炭水化物の合成のためのアセチルCoAからコハク酸への変換が中心である。微生物では、グリオキシル酸サイクルは、グルコースなどの複雑な供給源が利用可能でないときに細胞が炭素源として単純炭素化合物を利用するのを可能にする。該サイクルは、一般に、胚発生の初期段階にある線虫類を除き、動物には存在しないと想定される。しかしながら、近年、グリオキシル酸サイクルに関与する重要な酵素であるリンゴ酸シンターゼおよびイソクエン酸リアーゼが一部の動物組織において検出されたことは、細菌および動物における酵素の進化的関係に関する疑問を提起し、非後生動物種の公知のリンゴ酸シンターゼおよびイソクエン酸リアーゼと機能が異なる代替のサイクル酵素を動物がコードすることを示唆している。
グリオキシル酸サイクルは、トリカルボン酸サイクルに関連する8つの酵素のうち5つ：クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼを利用する。2つのサイクルは、グリオキシル酸サイクルにおいて、イソクエン酸が、イソクエン酸リアーゼによってα-ケトグルタル酸の代わりにグリオキシル酸およびコハク酸へと変換されるという点で異なる。これは、TCAサイクルで行われる脱炭酸工程を迂回し、単純炭素化合物がその後のグルコースを含む巨大分子の合成において使用されることが可能となる。グリオキシル酸は、その後、アセチルCoAと結合し、リンゴ酸シンターゼによって触媒されて、リンゴ酸を生成する。リンゴ酸はまた、コハク酸デヒドロゲナーゼおよびフマラーゼの作用によって、コハク酸からと並行して形成される。
脂肪酸は、ベータ酸化を通じて酢酸分子に分解されるので、脂質由来の脂肪酸は、通常、脊椎動物によってエネルギー源として使用される。補酵素Aの活性チオール基に結合したこの酢酸は、クエン酸サイクル（TCAサイクル）に進入し、そこで、二酸化炭素へと完全に酸化される。したがって、この経路は、細胞が脂肪からエネルギーを得ることを可能にする。脂肪由来の酢酸を炭水化物の生合成に利用するために、初期反応がTCAサイクルと同一であるグリオキシル酸サイクルが使用される。
植物、真菌および細菌などの細胞壁含有生物は、セルロース、グルカンおよびキチンなどの複雑な構造の多糖の生合成のために成長中に大量の炭水化物を必要とする。これらの生物では、利用可能な炭水化物の非存在下（例えば、ある特定の微生物環境中または植物の種子発芽中）、グリオキシル酸サイクルは、脂肪酸β-酸化で生成された酢酸を介して脂質からのグルコースの合成を許可する。
グリオキシル酸サイクルは、炭素がCO2の形態で失われるクエン酸サイクルの工程を迂回する。グリオキシル酸サイクルの2つの初期工程は、クエン酸サイクルのものと同一である：酢酸→クエン酸→イソクエン酸。第1のグリオキシル酸サイクル酵素であるイソクエン酸リアーゼによって触媒される次の工程では、イソクエン酸は、コハク酸およびグリオキシル酸（後者は、サイクルにその名称を与える）へと開裂される。グリオキシル酸は、アセチルCoAと縮合して（リンゴ酸シンターゼによって触媒される工程）、リンゴ酸を生成する。リンゴ酸とオキサロ酢酸は共に、ホスホエノールピルビン酸へと変換されることができ、それは、糖新生における第1の酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの生成物である。それゆえ、グリオキシル酸サイクルの最終結果は、脂肪酸からのグルコースの生成である。最初の工程で生成されたコハク酸は、クエン酸サイクルに進入して、最終的にオキサロ酢酸を形成することができる。
組換え微生物を使用したMEG（またはグリコール酸）またはMEG（またはGA）および1つもしくは複数の同時生成物の生合成
前述のように、1つの局面において、本開示は、ペントースリン酸中間体を介して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、D-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成する1つまたは複数の生化学的経路を含む組換え微生物を提供する。1つの態様において、組換え微生物は、モノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を同時生成する。別の態様において、1つまたは複数の同時生成物は、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン、またはそれらの組み合わせより選択される。さらなる態様において、1つまたは複数の生成物は、モノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される。
従って、1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖をロスの無い変換においてペントースリン酸中間体へ変換する活性を有する少なくとも1つの酵素を含み、ペントースリン酸中間体をグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）へ変換するペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素を含む、1つまたは複数の生化学的経路を含む組換え微生物に関する。
いくつかの態様において、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸である。いくつかの態様において、ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素は、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼ活性、またはD-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する。
いくつかの態様において、組換え微生物は、トランスケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現およびペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtktAに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtktAである。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtktBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtktBである。別の態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:148および150からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、tktAまたはその相同体である。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、tktBまたはその相同体である。さらなる態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:147および149からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のdeoCに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のdeoCである。
いくつかの態様において、組換え微生物は、トランスアルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtalAまたはtalBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtalAである。他の態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtalBである。別の態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:152および154からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:151および153からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、組換え微生物は、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のrpeに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のrpeである。別の態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:158に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:157に記載の核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、組換え微生物は、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のrpiAに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のrpiAである。他の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のrpiBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のrpiBである。別の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:156に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:155に記載の核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性、およびD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む組換え微生物は、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、およびホスホグリセリン酸ムターゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性の欠失または減少をさらに含む。いくつかの態様において、内在性グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ酵素はgapAであり、ホスホグリセリン酸キナーゼはpgkであり、ホスホグリセリン酸ムターゼはgpmAまたはgpmMである。
いくつかの態様において、組換え微生物は、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Bifidobacterium dentium）BDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクチス（lactis）xfp、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）xpkA、およびビフィドバクテリウム・ブレベ（breve）xfpからなる群より選択されるフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・デンチウムBDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクチスxfp、ラクトバチルス・パラプランタラムxpkA、およびビフィドバクテリウム・ブレベxfpからなる群より選択される。別の態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:212、214、216、および218からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:211、213、215、および217からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、組換え微生物は、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む。いくつかの態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ptaより選択されるリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリカムptaより選択される。別の態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:220および222より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:219および221より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性、およびD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む組換え微生物は、内在性6-ホスホフルクトキナーゼ酵素の活性の欠失または減少をさらに含む。いくつかの態様において、内在性6-ホスホフルクトキナーゼ酵素は、pfkAおよび/またはpfkBである。
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、D-キシロースを含み、組換え微生物は、キシロースイソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現およびキシルロース5-キナーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現をさらに含む。いくつかの態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素は、大腸菌およびピロミセス属の種に由来するxylAに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌xylAおよびピロミセス属の種のxylAより選択される。さらに別の態様において、キシロースイソメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:95および144より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、キシロースイソメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:93、94、および143からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、キシルロース5-キナーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素は、大腸菌由来のxylBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、キシルロース5-キナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌xylBである。別の態様において、D-キシルロース5-キナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:146に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、D-キシルロース5-キナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:145に記載の核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、D-フルクトースを含み、組換え微生物は、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現をさらに含む。1つの態様において、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する少なくとも1つの酵素は、大腸菌由来のfbpに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素は、大腸菌fbpである。いくつかの態様において、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素は、D-フルクトース1,6-ビスリン酸をD-フルクトース6-リン酸へ変換する。他の態様において、D-フルクトースは、組換え微生物の内在性酵素によってフルクトース1,6-ビスリン酸へ変換される。
前記組換え微生物のいずれかのいくつかの態様において、組換え微生物は、グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性の欠失または減少をさらに含む。さらなる態様において、グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼはzwfであり、6-ホスホグルコノラクトナーゼはpglであり、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはgndである。
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得る。他の態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、モノマー、オリゴマー、またはそれらの組み合わせから構成される。
いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性および/またはフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現、ならびにD-リボース5-リン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体への変換、ならびにその後のD-リボース-5-リン酸のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換を可能にする。
いくつかの態様において、組換え微生物は、C2経路におけるグリコールアルデヒドの変換、および1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して、MEGまたはグリコール酸（GA）を生成する。いくつかの態様において、MEGは、C2経路におけるグリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの還元によって生成される。他の態様において、GAは、C2経路におけるグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの酸化によって生成される。
いくつかの態様において、MEGまたはGAの生成のための少なくとも1つの酵素は、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、グリセリン酸デカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、およびグリオキシル酸レダクターゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択される。
いくつかの態様において、組換え微生物は、C2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通してMEGを生成し、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して1つまたは複数の同時生成物を生成する。他の態様において、1つまたは複数の同時生成物は、アセトン、イソプロパノール、プロペン、イソブテン、および1つまたは複数のセリン経路化合物より選択される。いくつかの好ましい態様において、1つまたは複数のセリン経路化合物は、セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、およびエチレンジアミン（EDA）より選択される。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、アセトンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、イソプロパノールを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性、およびデヒドラターゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、プロペンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）シンターゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ活性、メチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ活性、メチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ活性、メチルクロトニル-CoAヒドラターゼ活性、3-ヒドロキシイソバレリル-CoAチオエステラーゼ活性、3HIVキナーゼ活性、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性、および3HIVデカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、イソブテンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、およびグリセリン酸2-キナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、L-セリンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性、グリシン開裂系に関連した活性、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性、アラニントランスアミナーゼ活性、NAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、グリシンを含む。別の態様において、グリシン開裂系に関連した活性は、グリシンデカルボキシラーゼ（Pタンパク質）、アミノメチルトランスフェラーゼ（Tタンパク質）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Lタンパク質）、およびHタンパク質より選択される酵素またはタンパク質を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、トランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、およびエタノールアミンアンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、モノエタノールアミン（MEA）を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、セリンデヒドロゲナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、アルデヒドオキシダーゼ活性、N-アセチルトランスフェラーゼまたはO-アセチルトランスフェラーゼ活性、N-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性、トランスアミナーゼ活性、デアセチラーゼ活性、セリンアミナーゼ活性、および2,3-ジアミノプロパン酸アンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、エチレンジアミン（EDA）を含む。
前記組換え微生物のいずれかのいくつかの態様において、組換え微生物は、グリコールアルデヒドレダクターゼ、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはそれらの組み合わせの活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変をさらに含む。
1つの態様において、C3経路において生成される過剰のNADHの少なくとも一部は、C2経路における還元当量源として使用される。別の態様において、C3経路において生成される過剰のNADHの少なくとも一部は、ATPを生成するために使用される。
1つの態様において、過剰のバイオマス形成が最小化され、MEGまたはグリコール酸または、MEGと1つもしくは複数の同時生成物との生成が最大化される。
ペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース5-リン酸中間体への変換、ならびにその後のD-リボース5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸への変換
本開示において、ペントース糖および/またはヘキソース糖は、非酸化的ペントースリン酸経路の中間体であるペントースリン酸中間体へ変換される。ペントースリン酸中間体、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸は、次いで、グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸を生成するため、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼ活性、またはD-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有するD-ペントースリン酸アルドラーゼの基質として機能し、それらの化合物は、次いで、MEGまたはGA、またはMEGおよび1つもしくは複数の同時生成物へさらに変換され得る。
本開示において、ペントース糖および/またはヘキソース糖は、非酸化的ペントースリン酸経路の中間体であるD-リボース5-リン酸へ変換される。D-リボース5-リン酸中間体は、次いで、グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸を生成するため、D-リボース5-リン酸アルドラーゼの基質として機能し、それらの化合物は、次いで、MEGまたはGA、またはMEGおよび1つもしくは複数の同時生成物へさらに変換され得る。
［A］従って、1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、ペントースリン酸中間体を介して、グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）を生成することができる組換え微生物に関し、ここで、組換え微生物は、以下の（a）～（h）：
（a）D-フルクトース-6-リン酸およびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸の、それぞれ、D-エリトロース-4-リン酸およびD-キシルロース-5-リン酸への可逆的変換を触媒し、かつ/または（b）からのD-グリセルアルデヒド-3-リン酸および（b）からのD-セドヘプツロース-7-リン酸の、それぞれ、ペントースリン酸およびD-キシルロース-5-リン酸への可逆的変換を触媒するトランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）D-フルクトース-6-リン酸および（a）からのD-エリトロース-4-リン酸の、それぞれ、D-グリセルアルデヒド-3-リン酸およびD-セドヘプツロース-7-リン酸への可逆的変換を触媒するトランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）および/または（f）からのD-キシルロース-5-リン酸とD-リブロース-5-リン酸との相互変換を触媒するリブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）からのD-リブロース-5-リン酸とD-リボース-5-リン酸との相互変換を触媒するリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するキシルロース5-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）D-フルクトース1,6-ビスリン酸のD-フルクトース6-リン酸への変換を触媒するフルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（a）および/または（d）からのペントース-5-リン酸のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸への変換を触媒するペントース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し；
組換え微生物は、任意で、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはホスホグリセリン酸キナーゼおよび/またはホスホグリセリン酸ムターゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異をさらに含み；
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得、
グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）が生成される。
［B］従って、1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、D-リボース5-リン酸、リブロース5-リン酸、またはキシルロース5-リン酸中間体を介して、グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）を生成することができる組換え微生物に関し、ここで、組換え微生物は、以下の（a）～（h）：
（a）D-フルクトース-6-リン酸およびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸の、それぞれ、D-エリトロース-4-リン酸およびD-キシルロース-5-リン酸への可逆的変換を触媒し、かつ/または（b）からのD-グリセルアルデヒド-3-リン酸および（b）からのD-セドヘプツロース-7-リン酸の、それぞれ、D-リボース-5-リン酸およびD-キシルロース-5-リン酸への可逆的変換を触媒するトランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）D-フルクトース-6-リン酸および（a）からのD-エリトロース-4-リン酸の、それぞれ、D-グリセルアルデヒド-3-リン酸およびD-セドヘプツロース-7-リン酸への可逆的転換を触媒するトランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）および/または（f）からのD-キシルロース-5-リン酸とD-リブロース-5-リン酸との相互変換を触媒するリブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）からのD-リブロース-5-リン酸とD-リボース-5-リン酸との相互変換を触媒するリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するキシルロース5-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）D-フルクトース1,6-ビスリン酸のD-フルクトース6-リン酸への変換を触媒するフルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（a）および/または（d）からのD-リボース-5-リン酸、リブロース5-リン酸、またはキシルロース5-リン酸の、グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸への変換を触媒するD-リボース5-リン酸アルドラーゼ活性、リブロース5-リン酸アルドラーゼ活性、またはキシルロース5-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し；
組換え微生物は、任意で、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはホスホグリセリン酸キナーゼおよび/またはホスホグリセリン酸ムターゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異をさらに含み；
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得、
グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）が生成される。
［C］別の態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、D-リボース5-リン酸中間体を介して、グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）を生成することができる組換え微生物に関し、ここで、組換え微生物は、以下の（a）～（j）：
（a）D-フルクトース-6-リン酸のD-エリトロース-4-リン酸およびアセチル-リン酸への可逆的変換を触媒するフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からのアセチル-リン酸のアセチル-CoAへの可逆的変換を触媒するリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）D-フルクトース-6-リン酸および（a）からのD-エリトロース-4-リン酸の、それぞれ、D-グリセルアルデヒド-3-リン酸およびD-セドヘプツロース-7-リン酸への可逆的転換を触媒するトランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）からのD-グリセルアルデヒド-3-リン酸および（c）からのD-セドヘプツロース-7-リン酸の、それぞれ、D-リボース-5-リン酸およびD-キシルロース-5-リン酸への可逆的転換を触媒するトランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（d）および/または（h）からのD-キシルロース-5-リン酸とD-リブロース-5-リン酸との相互変換を触媒するリブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（e）からのD-リブロース-5-リン酸とD-リボース-5-リン酸との相互変換を触媒するリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するキシルロース5-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（i）D-フルクトース1,6-ビスリン酸のD-フルクトース6-リン酸への変換を触媒するフルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（j）（d）および/または（f）からのD-リボース-5-リン酸のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸への変換を触媒するD-リボース5-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し；
組換え微生物は、任意で、6-ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異をさらに含み；
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得、
工程（b）において生成されるアセチル-CoAは、グリコール酸、アセトン、イソプロパノール、プロペン、イソブテン、および1つまたは複数のセリン経路化合物より選択される1つまたは複数の同時生成物を生成するために使用され得；
グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）が生成される。
いくつかの態様において、ペントースリン酸経路の酸化ブランチは、ペントースリン酸経路への非酸化的流入に向かう糖のフラックスを最適化するため、欠失させられるかまたは不活化される。
［D］従って、1つの態様において、態様［A］、態様［B］、または態様［C］の組換え微生物は、任意で、
（i）グルコース6-リン酸の6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンへの変換を触媒するグルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異；
（ii）6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンのグルコン酸-6-リン酸への変換を触媒する6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異；および
（iii）グルコン酸-6-リン酸のD-リブロース-5-リン酸への変換を触媒する6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異
からなる群より選択される1つまたは複数の改変をさらに含む。
いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌tktAに対して少なくとも70％の配列同一性を有するか、少なくとも80％の配列同一性を有するか、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、トランスケトラーゼは、大腸菌tktBに対して少なくとも70％の配列同一性を有するか、少なくとも80％の配列同一性を有するか、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、トランスケトラーゼは、大腸菌tktAである。他の態様において、トランスケトラーゼは、大腸菌tktBである。
いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、tktAまたはその相同体である。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、tktBまたはその相同体である。別の態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:148および150からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:147および149からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtalAまたはtalBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtalAである。他の態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtalBである。別の態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:152および154からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:151および153からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
1つの態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌rpiAまたはrpiBに対して少なくとも70％の配列同一性を有するか、少なくとも80％の配列同一性を有するか、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌rpiAである。いくつかの態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌rpiBである。
いくつかの態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、rpiAまたはその相同体である。別の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:156に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:155に記載の核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、rpiBまたはその相同体である。別の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:254に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:253に記載の核酸配列によってコードされる。
1つの態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌rpeに対して少なくとも70％の配列同一性を有するか、少なくとも80％の配列同一性を有するか、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌rpeである。
いくつかの態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、rpeまたはその相同体である。別の態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:158に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:157に記載の核酸配列によってコードされる。
1つの態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・デンチウムBDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクチスxfp、ラクトバチルス・パラプランタラムxpkA、およびビフィドバクテリウム・ブレベxfpからなる群より選択されるフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・デンチウムBDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクチスxfp、ラクトバチルス・パラプランタラムxpkA、およびビフィドバクテリウム・ブレベxfpからなる群より選択される。
いくつかの態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、BDP_1006、xfp、xpkA、またはそれらの相同体より選択される。別の態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:212、214、216、および218からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:211、213、215、および217からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
1つの態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリカムptaより選択されるリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリカムptaより選択される。
いくつかの態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、ptaまたはその相同体である。別の態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:220および222より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:219および221より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼ活性、またはD-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼ活性を含むペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のdeoCに対して少なくとも70％、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のdeoCである。
いくつかの態様において、組換え微生物は、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ活性を有する内在性または外来性の酵素を含む。1つの態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、外来性である。別の態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、ピロミセス属の種から得られた1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。さらなる態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られた1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、xylAまたはその相同体である。さらに別の態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:95および144より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:93、94、および143からなる群より選択される核酸配列を含む。
いくつかの態様において、キシルロース5-キナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のxylBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、キシルロース5-キナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌xylBである。別の態様において、D-キシルロース5-キナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:146に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、D-キシルロース5-キナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:145に記載の核酸配列によってコードされる。
1つの態様において、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のfbpに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素は、大腸菌fbpである。いくつかの態様において、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素は、D-フルクトース1,6-ビスリン酸をD-フルクトース6-リン酸へ変換する。他の態様において、D-フルクトースは、組換え微生物の内在性酵素によってフルクトース1,6-ビスリン酸へ変換される。
MEGまたはグリコール酸またはMEGおよび同時生成物の生成経路
いくつかの態様において、（任意で、態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］から生成されたグリコールアルデヒドおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸中間体は、付加的なMEG（またはグリコール酸）および/または1つもしくは複数の同時生成物を同時生成するため、下記のように、C3経路と共役させられる、公知のMEG（またはグリコール酸）C2生成経路において使用される。
いくつかの態様において、MEGは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換するため、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素を使用するC2経路を介して生成される。別の態様において、グリコール酸（GA）は、グリコールアルデヒドをGAへ酸化するため、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を使用するC2経路を介して生成される。
［E］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、モノエチレングリコール（MEG）を生成することができる組換え微生物に関し、ここで、（任意で、態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、グリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子をさらに発現し、組換え微生物は、任意で、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異をさらに含み、MEGが生成される。
［F］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、グリコール酸（GA）を生成することができる組換え微生物に関し、ここで、（任意で、態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、グリコールアルデヒドのGAへの変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子をさらに発現し、組換え微生物は、任意で、グリコールアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異をさらに含み、GAが生成される。
いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌およびS.セレビシエ（cerevisiae）より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様において、1つまたは複数の核酸分子は、gldA、GRE2、GRE3、yqhD、ydjG、fucO、yafB（dkgB）、および/もしくはyqhE（dkgA）、またはそれらの相同体より選択される。別の態様において、1つまたは複数の核酸分子は、yqhDである。いくつかの態様において、yqhDは、G149E変異を含む。さらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:13、15、17、20、23、25、28、30、および32からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:12、14、16、18、19、21、22、24、26、27、29、および31からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
1つの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のaldA（SEQ ID NO:289）に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌aldAである。
C2経路を介したMEG（またはグリコール酸）およびC3経路を介したMEG（またはグリコール酸）の生成
1つの態様において、MEG（またはグリコール酸）は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い転換、その後のペントースリン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびG3P中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEG（またはグリコール酸）への変換、およびC3経路を介したG3PのMEG（またはグリコール酸）への変換によって、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、生成される。ここで、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸である。
いくつかの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、MEG（またはグリコール酸）を生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEG（またはグリコール酸）の生成のための態様［E］または態様［F］を付加的に有する、（任意で、態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、MEG（またはグリコール酸）の生成のための1つまたは複数のC3生合成経路をさらに含む。MEGの生成のためのC3生合成経路は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO2010/076324（Metabolic Explorer）に記載されている。
いくつかの態様では、MEGの生成のためのC3生合成経路は、3-ホスホヒドロキシピルビン酸前駆体（セリンの前駆体）の転換から開始する3つの酵素反応を含む。最初に、ホスファターゼ活性が、ホスホヒドロキシピルビン酸からヒドロキシピルビン酸への変換を可能にする。次いで、ヒドロキシピルビン酸が2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性によりグリコールアルデヒドへと転換される。最後に、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性がグリコールアルデヒドからエチレングリコールへの変換を可能にする。エチレングリコールの生成のための別の経路は、前駆体としてL-セリンから開始する。最初に、トランスアミナーゼまたはアミノ酸オキシダーゼ活性が、セリンからヒドロキシピルビン酸への変換を可能にする。ヒドロキシピルビン酸をグリコールアルデヒドへ、その後、MEGへ変換する次の2工程は、上述した最初の経路と類似する。
好ましい態様では、本開示は、MEGの生成のための1つまたは複数のC3生合成経路を含む組換え微生物を提供する。いくつかの態様では、組換え微生物、特に細菌は、2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子およびヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つの遺伝子を含有する。これらの遺伝子は、外因性または内因性であることができ、染色体上にまたは染色体外に発現されることができる。
本開示のさらなる態様では、組換え微生物、特に細菌は、中間体3-ホスホグリセリン酸のアベイラビリティーが増加する改変を含む。好ましくは、その増加は、ホスホグリセリン酸ムターゼをコードする遺伝子、特にgpmAおよびpgmMの一方または両方の遺伝子の発現のレベルを減弱化することによって達成される。これは、これらの遺伝子の野生型プロモーターをより弱いプロモーターに置き換えることによって、または対応するメッセンジャーRNAもしくはタンパク質を不安定化するエレメントの使用によって行うことができる。必要とあれば、該遺伝子の完全な減弱化を、対応するDNA配列の欠失によって達成することもできる。
別の態様では、組換え微生物、特に細菌は、セリン生合成経路へのフラックスが刺激される改変を含む。これは、それぞれserAおよびserC遺伝子によってコードされる3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはホスホセリンアミノトランスフェラーゼの発現のレベルを増加させることによって達成することができる。3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはホスホセリンアミノトランスフェラーゼの発現のレベルを増加させることは、serAおよび/またはserC遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することによって、細胞におけるコピー数を増加させることによって、または対応するタンパク質の活性を増加させる変異をserAおよび/またはserC遺伝子に導入することによって成し遂げることができる。serA遺伝子の発現はまた、野生型lrp遺伝子（ロイシン応答性調節性タンパク質をコードする）をlrp変異アレル（lrpタンパク質中のGLU 114 ASP置換に対応するlrp-1アレルなど）に置き換えることによって増加させることができ、その結果、serA遺伝子の転写の構成的活性化が導かれる。
本開示の特定の態様では、フィードバック阻害剤であるセリンへのserAタンパク質の感受性を低下させ、したがってセリンの存在下で活性の増加を許容する変異（フィードバック脱感受性化されたアレル）を、serA遺伝子に導入することができる。脱感受性化されたアレル、すなわち、フィードバック非感受性アレルの例は、EP 0 931 833（Ajinomoto）またはEP 0 620 853（Wacker）に記載されている。
別の態様では、組換え微生物、特に細菌は、ヒドロキシピルビン酸生合成経路へのフラックスが刺激される改変を含む。この結果は、セリントランスアミナーゼまたはセリンオキシダーゼの発現のレベルを増加させることによって（前駆体としてセリンから開始する経路について）、または3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼの発現を増加させることによって達成することができる。セリンオキシダーゼの発現のレベルを増加させることは、R.オパカス（R. opacus）由来のL-アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子を導入および過剰発現させることによって、または対応するタンパク質の活性を増加させる変異を該遺伝子に導入することによって成し遂げることができる。セリントランスアミナーゼの発現の増加は、大腸菌のserC遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することによって、細胞におけるコピー数を増加させることによって、または対応するタンパク質の活性を増加させる変異をserC遺伝子に導入することによって成し遂げることができる。3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼの発現の増加は、大腸菌のyeaB遺伝子またはserB遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することによって、細胞におけるコピー数を増加させることによって、または対応するタンパク質の活性を増加させる変異をyeaB遺伝子またはserB遺伝子に導入することによって成し遂げることができる。3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼの発現の増加はまた、S.セレビシエ（S. cerevisiae）由来の遺伝子GPP2を導入および過剰発現させることによって、または対応するタンパク質の活性を増加させる変異をGPP2遺伝子に導入することによって成し遂げることができる。
本開示のさらなる態様では、組換え微生物、特に細菌は、グリコールアルデヒドからエチレングリコール以外の化合物への変換レベルの減弱化を提供する改変を含む。これは、ヒドロキシトレオニンアルドラーゼ（UaEによってコードされる）またはグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aldA、aldBによってコードされる）のようなグリコールアルデヒド消費酵素のレベルを減弱化することによって達成され得る。これらの遺伝子の減弱化は、天然プロモーターをより低強度プロモーターまたは対応するメッセンジャーRNAもしくはタンパク質を不安定化するエレメントに置き換えることによって行うことができる。必要とあれば、該遺伝子の完全な減弱化を、対応するDNA配列の欠失によって達成することもできる。
本開示のさらなる態様では、グルコースを輸送することが公知であるgalPのようなリンドナー（phosphordonor）としてホスホエノールピルビン酸（PEP）に依拠しない糖輸送系を使用するか、またはより多くのホスホエノールピルビン酸（PEP）を糖－ホスホトランスフェラーゼ系に提供するかによって、糖輸送の効率が増加する。微生物におけるPEPのアベイラビリティーを増加させるために使用してもよい様々な手段が存在する。特に、これは、PEP→ピルビン酸の反応を減弱化するによって成し遂げることができる。優先的には、ピルビン酸キナーゼをコードするpykAおよびpykFの中から選択される少なくとも1つの遺伝子が、前記系統においてこの結果を得るために減弱化される。PEPのアベイラビリティーを増加させる別の方法は、ピルビン酸→PEPの反応を優先させることである。これは、上記反応を触媒するホスホエノールピルビン酸シンターゼの活性を増加させることによって成し遂げることができる。この酵素は、ppsA遺伝子によってコードされる。それゆえ、微生物において、ppsA遺伝子の発現が優先的に増加する。微生物において両方の改変が同時に存在することができる。
本開示のさらなる態様では、組換え微生物、特に細菌は、セリンからエチレングリコール以外の化合物への変換レベルの減弱化を提供する改変を含む。この結果は、セリンデアミナーゼ（sdaA、sdaBおよび/またはtdcGによってコードされる）、セリントランスアセチラーゼ（cysEによってコードされる）、トリプトファンシンターゼ（trpABによってコードされる）またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（glyAによってコードされる）のようなセリン消費酵素のレベルを減弱化することによって達成され得る。これらの遺伝子は、天然プロモーターをより低強度プロモーターまたは対応するメッセンジャーRNAもしくはタンパク質を不安定化するエレメントに置き換えることによって減弱化することができる。必要とあれば、該遺伝子の完全な減弱化を、対応するDNA配列の欠失によって達成することもできる。
本開示のさらなる態様では、組換え微生物、特に細菌は、ヒドロキシピルビン酸からグリコールアルデヒド以外の化合物への変換レベルの減弱化を提供する改変を含む。この結果は、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ghrAによってコードされる）またはヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ（hyiによってコードされる）のようなヒドロキシピルビン酸消費酵素のレベルを減弱化することによって達成され得る。これらの遺伝子は、天然プロモーターをより低強度プロモーターまたは対応するメッセンジャーRNAもしくはタンパク質を不安定化するエレメントに置き換えることによって減弱化することができる。必要とあれば、該遺伝子の完全な減弱化を、対応するDNA配列の欠失によって達成することもできる。
いくつかの態様では、本出願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖からMEG（またはグリコール酸）を生成可能な組換え微生物であって、C2経路におけるMEG（またはグリコール酸）の生成のための、態様［A］から、態様［B］から、または態様［C］からの（および任意で態様［D］を含む）組換え微生物であり、かつ、態様［E］または［F］を追加で有し、MEG（またはグリコール酸）の生成のための1つまたは複数のC3生合成経路をさらに含む、組換え微生物に関する。MEGの生成のためのC3生合成経路は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 2011/130378（Genomatica）に記載されているとおりである。
いくつかの態様では、本開示は、エチレングリコールを生成するのに十分な量で発現されるエチレングリコール経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を有するエチレングリコール経路を含む組換え微生物であって、エチレングリコール経路が、セリンアミノトランスフェラーゼ、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリコールアルデヒドレダクターゼ、セリンデカルボキシラーゼ、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼ、エタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼまたはグリセリン酸デカルボキシラーゼを含む、組換え微生物を提供する。
いくつかの態様では、組換え微生物は、エチレングリコールを生成するのに十分な量で発現されるエチレングリコール経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を有するエチレングリコール経路を含み、エチレングリコール経路は、セリンアミノトランスフェラーゼまたはセリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびグリコールアルデヒドレダクターゼを含む。
いくつかの態様では、組換え微生物は、エチレングリコールを生成するのに十分な量で発現されるエチレングリコール経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を有するエチレングリコール経路を含み、エチレングリコール経路は、セリンアミノトランスフェラーゼまたはセリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、およびグリセリン酸デカルボキシラーゼを含む。
いくつかの態様では、組換え微生物は、エチレングリコールを生成するのに十分な量で発現されるエチレングリコール経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を有するエチレングリコール経路を含み、エチレングリコール経路は、セリンデカルボキシラーゼ、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）、およびグリコールアルデヒドレダクターゼを含む。
いくつかの態様では、本開示は、エチレングリコールを生成するのに十分な量で発現されるエチレングリコール経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を有するエチレングリコール経路を含む組換え微生物であって、エチレングリコール経路が、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリコールアルデヒドレダクターゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、グリセリン酸デカルボキシラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ、およびグリセリン酸キナーゼを含む、組換え微生物を提供する。
いくつかの態様では、組換え微生物は、エチレングリコールを生成するのに十分な量で発現されるエチレングリコール経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を有するエチレングリコール経路を含み、エチレングリコール経路は、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびグリコールアルデヒドレダクターゼを含む。
いくつかの態様では、組換え微生物は、エチレングリコールを生成するのに十分な量で発現されるエチレングリコール経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を有するエチレングリコール経路を含み、エチレングリコール経路は、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼまたはグリセリン酸キナーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびグリコールアルデヒドレダクターゼを含む。
いくつかの態様では、組換え微生物は、エチレングリコールを生成するのに十分な量で発現されるエチレングリコール経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を有するエチレングリコール経路を含み、エチレングリコール経路は、グリセリン酸デカルボキシラーゼを含む。
いくつかの態様では、組換え微生物は、エチレングリコールを生成するのに十分な量で発現されるエチレングリコール経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を有するエチレングリコール経路を含み、エチレングリコール経路は、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼまたはグリセリン酸キナーゼおよびグリセリン酸デカルボキシラーゼを含む。
いくつかの態様では、本開示は、エチレングリコール経路を含む組換え微生物であって、セリンをヒドロキシピルビン酸、ヒドロキシピルビン酸をグリコールアルデヒド、グリコールアルデヒドをエチレングリコール、セリンをエタノールアミン、エタノールアミンをグリコールアルデヒド、3-ホスホグリセリン酸をグリセリン酸、グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸、ヒドロキシピルビン酸をグリセリン酸、およびグリセリン酸をエチレングリコールからなる群より選択される基質を生成物へと変換する酵素またはタンパク質をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む、組換え微生物を提供する。当業者は、これらが単なる例示であること、ならびに、所望の生成物を生成するのに適しかつ適切な活性が基質から生成物への変換に利用可能である本明細書に開示される任意の基質-生成物ペアを当業者が本明細書の教示に基づいて容易に決定できることを理解するだろう。したがって、本開示は、酵素またはタンパク質をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含有する組換え微生物であって、そこで該酵素またはタンパク質がエチレングリコール経路の基質および生成物を変換する、組換え微生物を提供する。
エチレングリコール経路を含有する組換え微生物として本明細書に一般に記載されるが、本開示は追加で、エチレングリコール経路の中間体を生成するのに十分な量で発現されるエチレングリコール経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む組換え微生物を提供することが理解される。それゆえ、エチレングリコールを生成するエチレングリコール経路を含有する組換え微生物に加えて、本開示は追加で、エチレングリコール経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む組換え微生物であって、エチレングリコール経路中間体、例えば、ヒドロキシピルビン酸、エタノールアミン、グリコールアルデヒドまたはグリセリン酸を生成する、微生物を提供する。
いくつかの態様では、セリンアミノトランスフェラーゼまたはセリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）は、セリンからヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する。いくつかの態様では、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼは、ヒドロキシピルビン酸からグリコールアルデヒドへの変換を触媒する。いくつかの態様では、グリコールアルデヒドレダクターゼは、グリコールアルデヒドからエチレングリコールへの変換を触媒する。いくつかの態様では、セリンデカルボキシラーゼは、セリンからエタノールアミンへの変換を触媒する。いくつかの態様では、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）は、エタノールアミンからグリコールアルデヒドへの変換を触媒する。いくつかの態様では、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼは、グリセリン酸からヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する。いくつかの態様では、グリセリン酸デカルボキシラーゼは、グリセリン酸からエチレングリコールへの変換を触媒する。いくつかの態様では、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼまたはグリセリン酸キナーゼは、3-ホスホグリセリン酸からグリセリン酸への変換を触媒する。
いくつかの態様において、MEG（またはグリコール酸）は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い転換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびG3P中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEG（またはグリコール酸）への変換、およびC3経路を介したG3P中間体のMEG（またはグリコール酸）への変換から生成される。
［K］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）を生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEG（またはグリコール酸）の生成のための態様［E］または態様［F］を付加的に有する、（任意で、態様［D］を含む）態様［A］または態様［B］または態様［C］からの組換え微生物は、以下の（a）～（h）：
（a）3-ホスホグリセリン酸の3-ホスホヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のホスホ-L-セリンへの変換を触媒するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（b）からのホスホ-L-セリンのL-セリンへの変換を触媒するホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（d）からのL-セリンのヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するL-セリントランスアミナーゼまたはセリンオキシダーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（c）または（e）からのヒドロキシピルビン酸のグリコールアルデヒドへの変換を触媒するヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）からのグリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（f）からのグリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
態様［A］、態様［B］、または態様［C］から生成された中間体G3Pは、組換え微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸へ変換され、MEG（またはグリコール酸）が生成される。
［L］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）を生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEG（またはグリコール酸）の生成のための態様［E］または態様［F］を付加的に有する、（任意で、態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、以下の（a）～（j）：
（a）2-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）3-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素またはグリセリン酸-3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）および/または（b）からのグリセリン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）L-セリンのヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素またはセリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）L-セリンのエタノールアミンへの変換を触媒するL-セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（c）および/または（d）からのヒドロキシピルビン酸のグリコールアルデヒドへの変換を触媒するヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（e）からのエタノールアミンのグリコールアルデヒドへの変換を触媒するエタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（a）および/または（b）からのグリセリン酸のMEGへの変換を触媒するグリセリン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（i）（f）および/または（g）からのグリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（j）（f）および/または（g）からのグリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
態様［A］、態様［B］、または態様［C］から生成された中間体G3Pは、組換え微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸および/または2-ホスホグリセリン酸へ変換され、MEG（またはグリコール酸）が生成される。
いくつかの態様では、2-ケト酸デカルボキシラーゼ、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼまたは2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、ヒドロキシピルビン酸をグリコールアルデヒドへと変換する。いくつかの態様では、ヒドロキシピルビン酸をグリコールアルデヒドへと変換する酵素は、kivd、dxs、またはsucAに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、2-ケト酸デカルボキシラーゼは、ラクトコッカス・ラクチス由来のkivdである。なお別の態様では、2-ケト酸デカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：224に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、2-ケト酸デカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：223に示される核酸配列を含む。いくつかの態様では、2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、大腸菌由来sucAである。なお別の態様では、2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：226に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：225に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼは、グリコールアルデヒドレダクターゼであることができる。いくつかの態様では、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、yqhDまたはFucOに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌およびS.セレビシエから選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様では、1つまたは複数の核酸分子は、gldA、GRE2、GRE3、yqhD、ydjG、fucO、yafB（dkgB）、および/またはyqhE（dkgA）、またはそのホモログから選択される。別の態様では、1つまたは複数の核酸分子は、yqhDである。いくつかの態様では、yqhDは、G149E変異を含む。さらなる態様では、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO：13、15、17、20、23、25、28、30および32からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様では、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO：12、14、16、18、19、21、22、24、26、27、29および31からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様では、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼまたは2-オキソグルタル酸レダクターゼであることができる。いくつかの態様では、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素は、serAに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来serAである。なお別の態様では、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：228に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：227に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼは、L-セリントランスアミナーゼ、セリンアミノトランスフェラーゼまたはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼであることができる。いくつかの態様では、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、serCに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来serCである。なお別の態様では、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：230に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：229に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、ホモサピエンス由来のAGXT1である。なお別の態様では、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：244に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、セリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：243に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素は、yeaB（nudL）に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来yeaB（nudL）である。なお別の態様では、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：232に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、3-ホスホ-ヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：231に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素は、serBに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、ホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来serBである。なお別の態様では、ホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：234に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、ホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：233に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素またはグリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素は、2-ホスホグリセリン酸をグリセリン酸へと変換する。いくつかの態様では、2-ホスホグリセリン酸をグリセリン酸へと変換する酵素は、phoA、glxKまたはgarKに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来phoAである。なお別の態様では、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：246に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：245に示される核酸配列を含む。いくつかの態様では、グリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来glxKである。なお別の態様では、グリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：250に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、グリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：249に示される核酸配列を含む。いくつかの態様では、グリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来garKである。なお別の態様では、グリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：252に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、グリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：251に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素またはグリセリン酸-3-キナーゼ活性を有する酵素は、3-ホスホグリセリン酸をグリセリン酸へと変換する。いくつかの態様では、3-ホスホグリセリン酸をグリセリン酸へと変換する酵素は、phoAまたはGLYKに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来phoAである。なお別の態様では、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：246に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：245に示される核酸配列を含む。いくつかの態様では、グリセリン酸-3-キナーゼ活性を有する酵素は、シロイヌナズナ由来のGLYKである。なお別の態様では、グリセリン酸-3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：248に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、グリセリン酸-3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：247に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素は、グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸へと変換する。いくつかの態様では、グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸へと変換する酵素は、ghrBに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来ghrBである。なお別の態様では、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：242に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：241に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、L-セリンをエタノールアミンへと変換する。いくつかの態様では、L-セリンをエタノールアミンへと変換する酵素は、SDCに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、シロイヌナズナ由来のSDCである。なお別の態様では、セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：236に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：235に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素またはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素は、エタノールアミンをグリコールアルデヒドへと変換する。いくつかの態様では、エタノールアミンをグリコールアルデヒドへと変換する酵素は、alaAまたはtynAに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来alaAである。なお別の態様では、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：240に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：239に示される核酸配列を含む。いくつかの態様では、エタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素は、大腸菌由来tynAである。なお別の態様では、エタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：238に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、エタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：237に示される核酸配列を含む。
別の局面において、MEGは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い転換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、およびC3経路を介したG3P中間体の1つまたは複数の同時生成物への変換から生成される。
C2経路を介したMEG、ならびにC3経路を介したアセトン、イソプロパノール、プロペン、および/またはイソブテンの同時生成
いくつかの態様において、MEGは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い転換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、およびC3経路を介したG3P中間体のアセトンへの変換から生成される。
［M］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、モノエチレングリコール（MEG）およびアセトンを同時生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［E］または態様［F］を付加的に有する、（任意で、態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、以下の（a）～（c）：
（a）アセチル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒するチオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からのアセトアセチル-CoAのアセト酢酸への変換を触媒するアセチル-CoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素または酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；ならびに/または
（c）（b）からのアセト酢酸のアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
態様［A］または態様［B］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通してアセチル-CoAへ変換され、MEG（またはグリコール酸）およびアセトンが同時生成される。
いくつかの態様において、MEGは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い転換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、およびC3経路を介したG3P中間体のイソブテンへの変換から生成される。
［N］いくつかの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、モノエチレングリコール（MEG）およびイソブテンを同時生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を付加的に有する、（任意で、態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、以下の（a）～（d）：
（a）アセチル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒するチオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からのアセトアセチル-CoAのアセト酢酸への変換を触媒するアセチル-CoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素または酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）からのアセト酢酸のアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）からのアセトンおよびアセチル-CoAの3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）への変換を触媒する3-ヒドロキシイソ吉草酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現するか；または
組換え微生物は、以下の（e）～（j）：
（e）アセチル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒するチオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（e）からのアセトアセチル-CoAおよびアセチル-CoAの3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA（HMG-CoA）への変換を触媒するヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）からのHMG-CoAの3-メチルグルタコニル-CoAへの変換を触媒するメチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）からの3-メチルグルタコニル-CoAの3-メチルクロトニル-CoAへの変換を触媒するメチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）からの3-メチルクロトニル-CoAの3-ヒドロキシイソバレリル-CoAへの変換を触媒するメチルクロトニル-CoAヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（j）（i）からの3-ヒドロキシイソバレリル-CoAの3HIVへの変換を触媒する3-ヒドロキシイソバレリル-CoAチオエステラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し；
組換え微生物は、
（a1）（d）または（j）からの3HIVの3HIV-3-リン酸への変換を触媒する3HIVキナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（a2）（a1）からの3HIV-3-リン酸のイソブテンへの変換を触媒する3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b1）（d）または（j）からの3HIVのイソブテンへの変換を触媒する3HIVデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
より選択される（a1）および（a2）および/または（b1）をさらに発現し；
態様［A］、態様［B］、または態様［C］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通してアセチル-CoAへ変換され、MEGおよびイソブテンが同時生成される。
いくつかの態様において、MEGは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い転換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、およびC3経路を介したG3P中間体のイソプロパノールへの変換から生成される。
［O］1つの態様において、（任意で態様［EE］を含む）態様［M］および/または［N］からの組換え微生物は、任意で、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子をさらに発現する。
いくつかの態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム属の種由来のアルコールデヒドロゲナーゼに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有する。他の態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム・ベイジェリンキ（beijerinckii）adhおよびクロストリジウム・カルボキシジボランス（carboxidivorans）adhより選択されるアルコールデヒドロゲナーゼである。さらなる態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、SEQ ID NO:138および140からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、SEQ ID NO:136、137、および139からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、MEGは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い転換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、およびC3経路を介したG3P中間体のプロペンへの変換から生成される。
［P］別の態様では、態様［O］からの（任意で態様［EE］を含む）組換え微生物は、任意で、イソプロパノールからプロペンへの変換を触媒するデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子をさらに含む。
イソブテン同時生成のための上述したいずれかの経路の一態様では、3-ヒドロキシイソ吉草酸シンターゼ活性を有する酵素は、ハツカネズミ属の種、サッカロミセス属の種、ラクトバチルス属の種およびポラロモナス属の種から選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様では、3-ヒドロキシイソ吉草酸シンターゼ活性を有する酵素は、ハツカネズミ（Mus musculus）、サッカロミセス・セレビシエ、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）およびポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）から選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様では、3-ヒドロキシイソ吉草酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Hmgcs1、ERG13、PksGおよび/またはPnap_0477、またはそのホモログから選択される。さらなる態様では、3-ヒドロキシイソ吉草酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：105、107、109および111からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様では、3-ヒドロキシイソ吉草酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：104、106、108および110からなる群より選択される核酸配列を含む。
イソブテン同時生成のための上述したいずれかの経路の一態様では、ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼ活性を有する酵素は、サッカロミセス属の種から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様では、ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼ活性を有する酵素は、サッカロミセス・セレビシエから得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様では、ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、HmgS、またはそのホモログである。さらなる態様では、ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：123に示されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様では、ヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：122に示される核酸配列を含む。
イソブテン同時生成のための上述したいずれかの経路の一態様では、メチルグルタコニルCoAヒドラターゼ活性を有する酵素は、シュードモナス属の種から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様では、メチルグルタコニルCoAヒドラターゼ活性を有する酵素は、シュードモナス・プチダから得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様では、メチルグルタコニルCoAヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、liuC、またはそのホモログである。さらなる態様では、メチルグルタコニルCoAヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：125に示されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様では、メチルグルタコニルCoAヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：124に示される核酸配列を含む。
イソブテン同時生成のための上述したいずれかの経路の一態様では、メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、シュードモナス属の種から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様では、メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、シュードモナス・エルギノーサから得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様では、メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、liuB、および/またはliuD、またはそのホモログである。さらなる態様では、メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：127および129から選択されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様では、メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：126および128から選択される核酸配列を含む。
イソブテン同時生成のための上述したいずれかの経路の一態様では、メチルクロトニルCoAヒドラターゼ活性を有する酵素は、3-ケトアシルCoAチオラーゼである。別の態様では、メチルクロトニルCoAヒドラターゼ活性を有する酵素は、エノイルCoAヒドラターゼである。別の態様では、メチルクロトニルCoAヒドラターゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様では、メチルクロトニルCoAヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、fadA、および/またはfadB、またはそのホモログである。さらなる態様では、メチルクロトニルCoAヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：131および133から選択されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様では、メチルクロトニルCoAヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：130および132から選択される核酸配列を含む。
イソブテン同時生成のための上述したいずれかの経路の一態様では、3-ヒドロキシイソバレリルCoAチオエステラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様では、3-ヒドロキシイソバレリルCoAチオエステラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、tesB、またはそのホモログである。さらなる態様では、3-ヒドロキシイソバレリルCoAチオエステラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：135に示されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様では、3-ヒドロキシイソバレリルCoAチオエステラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：134に示される核酸配列を含む。
イソブテン同時生成のための上述したいずれかの経路の一態様では、3HIVキナーゼ活性を有する酵素は、サーモプラズマ属の種およびピクロフィルス属の種からなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様では、3HIVキナーゼ活性を有する酵素は、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）およびピクロフィルス・トリダスからなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様では、3HIVキナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、TA1305および/またはPTO1356、またはそのホモログである。いくつかの態様では、TA1305は、L200E変異を含む。さらなる態様では、3HIVキナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：113、115および117からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様では、3HIVキナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：112、114および116からなる群より選択される核酸配列を含む。
イソブテン同時生成のための上述したいずれかの経路の一態様では、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、ストレプトコッカス属の種から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様では、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）およびストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）から選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様では、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、smi_1746および/またはmvaD、またはそのホモログを含む。さらなる態様では、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：119および121から選択されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様では、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：118および120から選択される核酸配列を含む。
イソブテン同時生成のための上述したいずれかの経路の一態様では、3HIVデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、ストレプトコッカス属の種、サーモプラズマ属の種およびピクロフィルス属の種からなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様では、3HIVデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、サーモプラズマ・アシドフィラムおよびピクロフィルス・トリダスからなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様では、3HIVデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、mvaD、TA1305および/またはPTO1356、またはそのホモログを含む。さらなる態様では、3HIVデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：113、117および121からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様では、3HIVデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO：112、116および120からなる群より選択される核酸配列を含む。
C2経路を介したMEGおよびC3経路を介した1つまたは複数のセリン経路化合物の同時生成
いくつかの態様では、C2経路を介したMEGの生成は、C3経路を介した1つまたは複数のセリン経路化合物の生成に連結される。一態様では、1つまたは複数のセリン経路化合物は、L-セリン生合成経路に関する。別の態様では、1つまたは複数のセリン経路化合物は、L-セリン（Ser）、グリシン（Gly）、モノエタノールアミン（MEA）、および/またはエチレンジアミン（EDA）である（図6）。
C2経路を介したモノエチレングリコール（MEG）またはグリコール酸の生成
前述のように、供給原料としてグルコースを使用する現在公知のMEG（またはグリコール酸）生成法は、全て、低い収量ポテンシャルを有する。これは、グルコースがMEGへ分解される際の生化学の固有の欠点であり、全ての提唱された経路および公知の経路について、生成されるMEG（またはグリコール酸）1分子当たり1個の脱炭酸が起こる。しかしながら、1 MEG当たり1個という脱炭酸は、過剰であるため、レドックスニュートラルを達成することができず、従って、最適な収率を達成することができない。
本開示においては、MEGを生成するため、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖が、前記のように、収量ポテンシャルを保存する様式で、ペントースリン酸経路への非酸化的流入を介して、ペントースリン酸中間体へ変換される。D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸であるペントースリン酸中間体は、次いで、ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する酵素を介して、グリコールアルデヒドおよびG3Pへ変換される。ここで、アルドラーゼは、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼ活性、またはD-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する。グリコールアルデヒド中間体は、NADHを消費しながら、MEGへ還元される。あるいは、グリコールアルデヒドは、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼによってグリコール酸へ酸化され得る。C3化合物G3Pは、NADHを生成しながら、L-セリン経路化合物Ser、Gly、MEA、またはEDAのうちの1つまたは複数へさらに酸化される。
ATPの必要性を低下させ、収量ポテンシャルを最適化するため、D-キシロースは、好ましくは、1輸送分子当たり1 ATPを利用する大腸菌由来のXylFGHのような能動的ABC型トランスポーターではなく、大腸菌由来のXylEのようなH+/キシロースシンポーター、または受動的なエネルギー非依存的な促進剤によってインポートされる。シンポーターはATPを直接消費しないが、プロトン勾配の分解は、およそ0.1 ATPの利用と等価である。以下の全ての式において、この間接的なATP消費、および細胞維持に必要とされるATPは、考慮されない。
アンモニア（NH3）
アンモニアは、食品および肥料の前駆物質として機能し、薬学的生成物および商業的洗浄生成物の合成のためのビルディングブロックとしても機能する、NH3という式を有する窒素および水素の化合物である。アンモニアは、正の電荷を有する時、アンモニウムカチオンとして存在し、その化学式はNH4 +である。
本開示は、アンモニアまたは類似の化合物が、窒素源として利用されることを教示する。アンモニアまたは類似の化合物が窒素源として使用される時、それは、有機物質、例えば、グルタミン酸に固定される。1つの態様において、2-オキソグルタル酸が一般的にグルタミン酸へ形成される時に、アンモニアが固定され、この過程は1 NADHを消費する。
L-セリン（Ser）の生成
Serは、3-ホスホセリンを介した天然経路またはそのバリエーションによって生成される。1つの態様において、D-リボース5-リン酸アルドラーゼによるD-リボース5-リン酸の変換から生成されたG3Pは、微生物の内在性解糖によって3-ホスホ-D-グリセリン酸（3-ホスホグリセリン酸）へ変換される。3-ホスホグリセリン酸は、D-3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.95）によって3-ホスホヒドロキシピルビン酸へ変換される。3-ホスホヒドロキシピルビン酸は、次いで、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（EC 2.6.1.52）によって3-ホスホセリンへ変換される。3-ホスホセリンは、次いで、ホスホセリンホスファターゼ（EC 3.1.3.3）によってL-セリンへ変換される。
いくつかの態様において、3-ホスホグリセリン酸からL-セリンへの反応は、以下の通りである：
3-ホスホ-D-グリセリン酸 + NAD+ + L-グルタミン酸 + H20 → L-セリン + NADH + 2-オキソグルタル酸 + リン酸
G3Pから3-ホスホヒドロキシピルビン酸までの2 NADHの生成、およびNH3の固定に必要とされる1 NADHを考慮すると、Ser生成は、1 MEG（またはグリコール酸）の等モル同時生成のために必要とされる、正確に1個の過剰のNADHを生成する。
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い変換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のグリコールアルデヒドの還元を介したMEG、およびG3P中間体からの1つまたは複数のC3経路を介したL-セリンの同時生成を使用した、MEGおよびL-セリンの生成は、熱力学的最大収量ポテンシャルに極めて近い。いくつかの態様において、熱力学的収量ポテンシャルは、天然の標準的なC3経路によってグルコースから作成されるL-セリンの生成と比較して、本願において開示された経路を介したMEGおよびL-セリンの同時生成の方が、14％高い。
同時生成：（ペントースまたはヘキソース） + NH3 → MEG + Ser + 0 ATP＊
Y（経路） = （0.371 + 0.629）g/g = 1.00g（MEG + Ser）/g（（ペントースまたはヘキソース） + NH3）、Y(max)（燃焼熱） = 1.044g/gの96％
標準的な経路：グルコース + 2 NH3 → 2 Ser + 2 NADH + 0 ATP
Y（経路） = 0.981g（Ser）/g（（ペントースまたはヘキソース） + 2 NH3）、Y(max)（燃焼熱） = 1.164g/gの84％
＊ペントース、D-キシロースの受動輸送またはH+シンポート輸送を仮定する。H+シンポーターのための間接的なATP消費または細胞維持に必要とされるATPは、考慮されていない。
いくつかの態様において、MEGおよびL-セリンは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い転換、その後のペントースリン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、および1つまたは複数のC3経路を介したG3P中間体のLセリンへの変換から同時生成される。
［Q］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびL-セリンを同時生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を付加的に有する、（任意で、態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、以下の（a）～（h）：
（a）3-ホスホグリセリン酸を3-ホスホヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）3-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）2-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のホスホ-L-セリンへの変換を触媒するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（d）からのホスホ-L-セリンのL-セリンへの変換を触媒するホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（b）および/または（c）からのグリセリン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（e）および/または（g）からのヒドロキシピルビン酸のL-セリンへの変換を触媒するセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
態様［A］、態様［B］、または態様［C］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸および/または2-ホスホグリセリン酸へ変換され、MEGおよびL-セリンが生成される。
グリシン（Gly）の生成
Glyは、例えば、Serを介した天然経路、またはそのバリエーションによって生成される。
1つの態様において、Glyは、Serベースの経路を介して生成される。Serベースの経路においては、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸（M-THF）がTHFから生成され、L-セリンがセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによってグリシンへ変換される。M-THFは、様々な細胞化合物の生合成において、例えば、メチル化反応において利用される。
好ましい態様において、M-THFは、さらなる2 NADHまたは1 NADHおよび1 H2を生成するためにも使用され得る：
Figure 2022521905000082
（EC 2.1.2.-；ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼ、および1炭素基を転移させる関連トランスフェラーゼのようなトランスフェラーゼ）、その後のホルムアルデヒドのギ酸およびNADHへの酸化（EC 1.2.1.46；ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ）、ならびにギ酸のCO2およびNADH（ギ酸デヒドロゲナーゼ、FDH）またはCO2およびH2（ギ酸水素リアーゼ複合体）へのさらなる酸化。
いくつかの態様において、THFのこの再生は、部分的になされた場合、別の異なるグリシン生合成ルートを実行するためにまさに十分なNADHを生成するために使用され得る。1つの態様において、グリシンを直接合成するためにM-THF、NH3、CO2、およびNADHを利用するグリシン開裂系を介したルートが、さらなるグリシンを生成するため、生成された過剰のM-THFを利用するため、セリンベースのグリシン生成と共に使用され得る。
グリシン開裂系（GCV）は、グリシンの可逆的酸化を触媒し、二酸化炭素、アンモニア、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸（M-THF）、および還元されたピリジンヌクレオチドを与える多酵素複合体である：
Figure 2022521905000083
テトラヒドロ葉酸は、メチレン基を形成するため、グリシン開裂中に生成された1炭素単位の受容体として機能する。GCV系は、4つのタンパク質成分、Pタンパク質、Hタンパク質、Tタンパク質、およびLタンパク質からなる。Pタンパク質（EC 1.4.4.2、グリシンデヒドロゲナーゼ（脱炭酸））は、グリシンからのCO2のピリドキサルリン酸依存性の遊離を触媒し、メチルアミン部分を残す。メチルアミン部分は、グリシンの脱炭酸の前にPタンパク質に結合したHタンパク質のリポ酸基に転移する。Tタンパク質（EC 2.1.2.10、アミノメチルトランスフェラーゼ）が、メチルアミン基からのNH3の放出を触媒し、残りのC1単位をTHFに転移させ、5,10-mTHFを形成する。次いで、Lタンパク質（EC 1.8.1.4、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ）が、Hタンパク質のリポ酸成分を酸化し、電子をNAD+に転移させ、NADHを形成する。
同じ酵素のセットは、グリシンを形成するため、逆方向に働く時、グリシンシンターゼとも呼ばれる。嫌気性細菌、クロストリジウム・アシジウリシ（acidiurici）において、グリシン開裂系は、大部分が、グリシン合成の方向に働く。
あるいは、別の態様において、グリシンは、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（EC 2.6.1.44）によるグリオキシル酸のアミノ基転移を介しても生成され得る。サッカロミセス（Saccharomyces）セレビシエのような生物において、この経路は、エタノールまたは酢酸のような非発酵性炭素源での増殖中にのみ発現され、この経路は、任意の微生物において容易に過剰発現され得る。アミノ基供与体アラニンは、グルタミン酸とのアミノ基転移（アラニントランスアミナーゼ、EC 2.6.1.2）によって再生され、そのグルタミン酸は、NADHまたはNADPH依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4.1.2またはEC1.4.1.3）によるアンモニアの固定によって再生される。1つの態様において、このグリシン経路は、中間体L-セリンを回避し、M-THFの生成をもたらすのではなく、NADHのような2個の還元当量を直接生成する。
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い変換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のグリコールアルデヒドの還元を介したMEG、およびG3P中間体からの1つまたは複数のC3経路を介したグリシンの同時生成を使用したMEGおよびグリシンの生成は、熱力学的最大収量ポテンシャルに極めて近い。いくつかの態様において、熱力学的収量ポテンシャルは、天然の標準的なC3経路によってグルコースから作成されるグリシンの生成と比較して、本願に開示された経路を介したMEG（またはグリコール酸）およびグリシンの同時生成の方が、37％高い。
同時生成セリン経路：（ペントースまたはヘキソース） + NH3 + THF → MEG + Gly + M-THF + 0 ATP＊
ギ酸を介したTHF再生およびFDHの使用を仮定した同時生成セリン経路：
（ペントースまたはヘキソース） + NH3 → MEG + Gly + 2 NADH + 0 ATP＊
同時生成グリオキシル酸経路：
（ペントースまたはヘキソース） + NH3 → MEG + Gly + 2NAD(P)H + 0 ATP＊
Y（経路） = （0.371 + 0.449）g/g = 0.820g（MEG + Gly）/g（（ペントースまたはヘキソース） + NH3）、Y(max)（燃焼熱） = 1.013g/gの81％
ギ酸およびFDHを介した部分THF再生 + グリシン開裂系を介したグリシン合成を仮定した同時生成セリン経路：
NADH生成を通した部分THF再生：M-THF → 2/3 M-THF + 1/3 THF + 2/3 NADH
残りのM-THFおよび生成されたNADHのグリシン開裂系のための利用：
2/3 M-THF + 2/3 NADH + 2/3 NH3 + 2/3 CO2 → 2/3 Gly
（ペントースまたはヘキソース） + 5/3 NH3 + 2/3 CO2 → MEG + 5/3 Gly + 0 ATP＊
y（経路） = （0.348 + 0.698）g/g = 1.046g/g、y(max)の97％ = 1.076g/g
標準的な経路：グルコース + 2 NH3 + 2 THF → 2 Gly + 2 M-THF + 2 NADH + 0 ATP
Y（経路） = 0.701g（Gly）/g（グルコース + 2 NH3）、Y(max)（燃焼熱） = 1.197g/gの59％
＊ペントース、D-キシロースの受動輸送またはH+シンポート輸送を仮定する。H+シンポーターのための間接的なATP消費または細胞維持に必要とされるATPは、考慮されていない。
いくつかの態様において、MEGおよびグリシンは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い転換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、および1つまたは複数のC3経路を介したG3P中間体のグリシンへの変換から同時生成される。
［R］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびグリシンを同時生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を付加的に有する、（任意で態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、（a）～（e）：
（a）L-セリンおよびテトラヒドロ葉酸（THF）のグリシンおよび5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸（M-THF）への変換を触媒するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からのM-THFのホルムアルデヒドへの変換を触媒するトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）からのホルムアルデヒドのギ酸およびNADHへの変換を触媒するホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）からのギ酸のCO2およびNADHへの変換を触媒するギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（a）からのM-THF、CO2、NH3、および（c）または（d）からのNADHのグリシンおよびTHFへの変換を触媒するグリシン開裂系のタンパク質をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
THFは、工程（b）～（e）から再生され、任意で、（c）からのギ酸は、ギ酸水素リアーゼ複合体によってCO2およびH2へさらに酸化され、MEGおよびグリシンが生成される。
［S］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびグリシンを同時生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を付加的に有する、（任意で態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、（a）～（k）：
（a）3-ホスホグリセリン酸の3-ホスホヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のホスホ-L-セリンへの変換を触媒するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（b）からのホスホ-L-セリンのL-セリンへの変換を触媒するホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（d）からのL-セリンのヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するL-セリントランスアミナーゼまたはセリンオキシダーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（c）または（e）からのヒドロキシピルビン酸のグリコールアルデヒドへの変換を触媒するヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）からのグリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）からのグリコール酸のグリオキシル酸への変換を触媒するグリコール酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）からのグリオキシル酸およびアラニンのグリシンおよびピルビン酸への変換を触媒するアラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（j）（i）からのピルビン酸およびグルタミン酸のアラニンおよび2-オキソグルタル酸への変換を触媒するアラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（k）（j）からの2-オキソグルタル酸およびアンモニアのグルタミン酸への変換を触媒するNAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
態様［A］または態様［B］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸および/または2-ホスホグリセリン酸へ変換され、工程（i）のためのグリオキシル酸は、任意で、微生物のグリオキシル酸シャントに由来し、アラニンおよびグルタミン酸は、工程（j）および（k）から再生され、MEGおよびグリシンが同時生成される。
［T］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびグリシンを同時生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を付加的に有する、（任意で態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、（a）～（l）：
（a）2-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）3-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸-3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）および/または（b）からのグリセリン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）L-セリンのヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するセリンアミノトランスフェラーゼまたはセリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）L-セリンのエタノールアミンへの変換を触媒するL-セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（c）および/または（d）からのヒドロキシピルビン酸のグリコールアルデヒドへの変換を触媒するヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（e）からのエタノールアミンのグリコールアルデヒドへの変換を触媒するエタノールアミンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素またはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（f）および/または（g）からのグリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（i）（g）からのグリコール酸のグリオキシル酸への変換を触媒するグリコール酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（j）（i）からのグリオキシル酸およびアラニンのグリシンおよびピルビン酸への変換を触媒するアラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（k）（j）からのピルビン酸およびグルタミン酸のアラニンおよび2-オキソグルタル酸への変換を触媒するアラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（l）（k）からの2-オキソグルタル酸およびアンモニアのグルタミン酸への変換を触媒するNAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
態様［A］、態様［B］、または態様［C］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸および/または2-ホスホグリセリン酸へ変換され、工程（j）のためのグリオキシル酸は、任意で、微生物のグリオキシル酸シャントに由来し、アラニンおよびグルタミン酸は、工程（k）および（l）から再生され、MEGおよびグリシンが同時生成される。
いくつかの態様では、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、L-セリンをグリシンへと変換する。いくつかの態様では、L-セリンをグリシンへと変換する酵素は、大腸菌glyAに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0A825に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 947022に示される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様では、1炭素基を転移させるトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、M-THFをホルムアルデヒドへと変換するために使用される。ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼおよび関連トランスフェラーゼなどのトランスフェラーゼが使用されてよい。ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼおよび関連トランスフェラーゼの例は、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ、グリシンホルムイミドイルトランスフェラーゼ、グルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ、D-アラニン2-ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、デオキシシチジル酸5-ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、メチオニル-tRNAホルミルトランスフェラーゼ、アミノメチルトランスフェラーゼ、3-メチル-2-オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼおよびUDP-4-アミノ-4-デオキシ-L-アラビノースホルミルトランスフェラーゼを含む。
いくつかの態様では、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、ホルムアルデヒドをギ酸およびNADHへと変換するために使用される。いくつかの態様では、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、サッカロミセス・セレビシエのALD2、サッカロミセス・セレビシエのALD3、ホモサピエンスのALDH3A2およびホモサピエンスのALDH9A1から選択されるホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P47771、UniProt ID P54114、UniProt ID P51648およびUniProt ID P49189から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 855206、Gene ID 855205、Gene ID 224およびGene ID 223から選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様では、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、ギ酸をCO2およびNADHへと変換するために使用される。いくつかの態様では、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌fdhF（chlF、FDH-H）、大腸菌FDH-N、大腸菌FDH-O、カンジダ・ボイジニのFDH1、コリネバクテリウム・グルタミクムのfdhF、カプリアビダス・オキサラティクスのNAD+依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ、ゴッチャルキア・アシズリチのNAD+依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ、メチロバクテリウム・エキストロクエンスのFdh1、メチロシヌス・トリコスポリウムのギ酸デヒドロゲナーゼ、およびモラクセラ属の種のNAD+依存性ギ酸デヒドロゲナーゼfdhからなる群より選択されるギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性に関連する酵素または酵素のサブユニットをコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P07658、UniProt ID P0AEK7、UniProt ID P0AAJ3、UniProt ID P24183、UniProt ID P32176、UniProt ID P0AAJ5、UniProt ID P0AEL0、UniProt ID O13437、UniProt ID Q8NSY6、UniProt ID Q8KTI7、UniProt ID Q8KTI8、およびUniProt ID O08375から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性に関連する酵素または酵素のサブユニットをコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 948584、Gene ID 946038、Gene ID 948794、Gene ID 946035、Gene ID 948394、Gene ID 948395、Gene ID 948383、GenBankアクセッションAJ011046.2、Gene ID 1021531、GenBankアクセッションAF489516、およびGenBankアクセッションY13245.1から選択される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、グリシン開裂系の1つまたは複数のタンパク質は、M-THF、CO2、NH3およびNADHからグリシンを生成するために使用される。いくつかの態様では、グリシン開裂系のタンパク質は、i）P-タンパク質（ピリドキサールリン酸含有タンパク質）またはグリシンデカルボキシラーゼ（EC 1.4.4.2）、ii）T-タンパク質またはアミノメチル-トランスフェラーゼ（EC 2.1.2.10）、iii）L-タンパク質またはジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（EC1.8.1.4）、およびiv）H-タンパク質と呼ばれる輸送タンパク質（リポ酸含有タンパク質）を含む。いくつかの態様では、グリシンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌gcvPに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、グリシンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P33195に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、グリシンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 947394に示される核酸配列を含む。いくつかの態様では、アミノメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌gcvTに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、アミノメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P27248に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、アミノメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 947390に示される核酸配列を含む。いくつかの態様では、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌lpd（lpdA、E3サブユニット）に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0A9P0に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 944854に示される核酸配列を含む。いくつかの態様では、H-タンパク質は、大腸菌gcvHに対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、H-タンパク質をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0A6T9に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、H-タンパク質をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 947393に示される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様では、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、グリコール酸をグリオキシル酸へと変換するために使用される。いくつかの態様では、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌のグリコール酸デヒドロゲナーゼGLCおよびシロイヌナズナのグリコール酸デヒドロゲナーゼから選択されるグリコール酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性に関連する酵素または酵素サブユニットをコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0AEP9、UniProt ID P52073、UniProt ID P52074、およびUniProt ID Q94AX4から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性に関連する酵素または酵素サブユニットをコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 947353、Gene ID 2847718、Gene ID 2847717、およびGenBankアクセッションY13245.1から選択される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、グリオキシル酸をグリシンへと変換するために使用される。いくつかの態様では、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、サッカロミセス・セレビシエのAGX1、ホモサピエンスのAGXT2、シロイヌナズナのAOAT1およびシロイヌナズナのAOAT2から選択されるアラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P43567、UniProt ID Q9BYV1、UniProt ID Q9LR30およびUniProt ID Q9S7E9から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 850514、Gene ID 64902、TAIRアクセッションAT1G23310およびTAIRアクセッションAT1G70580から選択される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、アラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素は、ピルビン酸およびグルタミン酸からアラニンを再構成するために使用される。いくつかの態様では、アラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌のグルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼalaA、大腸菌のグルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼalaB、大腸菌のグルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼalaC、ホモサピエンスのアラニンアミノトランスフェラーゼ1（GPT）、ホモサピエンスのアラニンアミノトランスフェラーゼ2（GPT2）、タマシキゴカイのアラニントランスアミナーゼ、シロイヌナズナのトリプトファンアミノトランスフェラーゼTAA1、シロイヌナズナのAOAT1、シロイヌナズナのAOAT2、カンジダ・マルトーサのアラニンアミノトランスフェラーゼ、クロストリジウム・プロピオニクムのアラニンアミノトランスフェラーゼ、ピロコッカス・フリオサスのアラニンアミノトランスフェラーゼaat、メガチルサス・マキシマスのアラニントランスアミナーゼ、およびパニカム・ミリアセアムのアラニントランスアミナーゼAlaAT-2から選択されるアラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、アラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0A959、UniProt ID P77434、UniProt ID P24298、UniProt ID Q8TD30、UniProt ID Q9S7N2、UniProt ID Q9LR30、UniProt ID Q9S7E9、UniProt ID Q9P9M8、およびUniProt ID P34106から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、アラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 946772、Gene ID 946850、Gene ID 2875、Gene ID 84706、Gene ID 843393、TAIRアクセッションAT1G23310、TAIRアクセッションAT1G70580、GenBankアクセッションAF163769.1およびGenBankアクセッションX69421.1から選択される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、アンモニアおよび2-オキソグルタル酸からグルタミン酸を再構成するために使用される。いくつかの態様では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、サッカロミセス・セレビシエのNAD依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼGDH2、シロイヌナズナのNAD依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼGDH2、シロイヌナズナのNAD依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼGDH1、ペプトニフィラス・アサッカロリチカスのNAD依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼgdhA、ハロバクテリウム・サリナルムのNAD依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼgdhA、サーモトガ・マリティマのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ホモサピエンスのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ1（GLUD1）、ホモサピエンスのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ2（GLUD2）、枯草菌のグルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびソラヌム・リコペルシクムのグルタミン酸デヒドロゲナーゼGDH1から選択されるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有する、少なくとも80％の配列同一性を有する、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P33327、UniProt ID Q38946、UniProt ID Q38946、UniProt ID P28997、UniProt ID P29051、UniProt ID P00367、UniProt ID P49448およびUniProt ID P93541から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 461927、TAIRアクセッションAT5G07440、TAIRアクセッションAT5G18170、GenBankアクセッションM76403.1、GenBankアクセッションX63837.1、Gene ID 2746、Gene ID 2747およびGenBankアクセッションU48695.1から選択される核酸配列によってコードされる。
モノエタノールアミン（MEA）の生成
MEAは、Serの脱炭酸またはグリコールアルデヒドのアミノ基転移を介して生成することができる。
いくつかの好ましい態様では、セリンデカルボキシラーゼは、天然に、すなわち、植物のコリン生合成経路に見いだされるので、これが利用され、グリコールアルデヒド中間体のアミノ基転移は、MEG経路とMEA経路の間にクロストークを生み出すだろう。
あるいは、別の態様では、MEAは、エタノールアミンアンモニアリアーゼ（EC 4.3.1.7）によってアセトアルデヒドおよびアンモニアから形成されてもよい：
Figure 2022521905000084
この場合、MEAは、Ser生合成経路を介して形成されるのではなく、むしろアセチルCoAおよびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによるアセトアルデヒドへのその還元から形成される。レドックス状況は変化しない一方で、この経路は、Serに基づく経路に対して＋1のATPを生成する。それはまた、毒性の中間体Serを回避するが、毒性かつ揮発性の中間体アセトアルデヒドを有する。
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体のロスの無い変換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のグリコールアルデヒドの還元を介したMEG、およびG3P中間体からの1つまたは複数のC3経路を介したMEAの同時生成を使用したMEGおよびMEAの生成は、熱力学的最大収量ポテンシャルに極めて近い。いくつかの態様において、熱力学的収量ポテンシャルは、天然経路または発表されている類似の経路によってグルコースから作成されるMEAの生成と比較して、本願に開示された経路を介したMEGおよびMEAの同時生成の方が、15％高い。
同時生成Ser経路：（ペントースまたはヘキソース） + NH3 → MEG + MEA + 0 ATP＊
同時生成アセトアルデヒド経路：（ペントースまたはヘキソース） + NH3 → MEG + MEA + 1 ATP＊
Y（経路） = （0.371 + 0.365）g/g = 0.736g（MEG + MEA）/g（（ペントースまたはヘキソース） + NH3）、Y(max)（燃焼熱） = 0.749g/gの98％
標準的な経路：グルコース + 2 NH3 → 2 MEA + 2 NADH + 0 ATP
Y（経路） = 0.570g（MEA）/g（グルコース + 2 NH3）、Y(max)（燃焼熱） = 0.669g/gの85％
＊ペントース、D-キシロースの受動輸送またはH+シンポート輸送を仮定する。H+シンポーターのための間接的なATP消費または細胞維持に必要とされるATPは、考慮されていない。
いくつかの態様において、MEGおよびMEAは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い転換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、および1つまたは複数のC3経路を介したG3P中間体のMEAへの変換から同時生成される。
［U］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびMEAを同時生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を付加的に有する、（任意で態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、以下の（a）～（i）：
（a）3-ホスホグリセリン酸の3-ホスホヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）3-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）2-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のホスホ-L-セリンへの変換を触媒するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（d）からのホスホ-L-セリンのL-セリンへの変換を触媒するホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（b）および/または（c）からのグリセリン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（e）および/または（g）からのヒドロキシピルビン酸のL-セリンへの変換を触媒するセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（i）（f）および/または（h）からのL-セリンのMEAへの変換を触媒するセリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
態様［A］、態様［B］、または態様［C］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸および/または2-ホスホグリセリン酸へ変換され、MEGおよびMEAが同時生成される。
［V］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびMEAを同時生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を付加的に有する、（任意で態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、（a）～（f）：
（a）2-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）3-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸-3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）および/または（b）からのグリセリン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）L-セリンのヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼまたはセリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（c）および/または（d）からのヒドロキシピルビン酸のグリコールアルデヒドへの変換を触媒するヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（e）からのグリコールアルデヒドのMEAへの変換を触媒するトランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
態様［A］または態様［B］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸および/または2-ホスホグリセリン酸へ変換され、MEGおよびMEAが同時生成される。
［W］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびMEAを同時生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を付加的に有する、（任意で態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、以下の（a）～（b）：
（a）アセチル-CoAのアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）アセトアルデヒドおよびアンモニアのMEAへの変換を触媒するエタノールアミンアンモニアリアーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
態様［A］、態様［B］、または態様［C］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通してアセチル-CoAへ変換され、MEGおよびMEAが同時生成される。
いくつかの態様において、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素が、アセチル-CoAをアセトアルデヒドへ還元するために使用される。いくつかの態様において、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌mhpF、大腸菌AdhE、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）ADH1、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）CoA依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ペロバクター・アセチレニカス（Pelobacter acetylenicus）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、シュードモナス属の種のdmpF、シュードモナス・プチダ（putida）アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼtodl、シュードモナス・プチダアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼcmtH、およびクロストリジウム・アセトブチリカムアルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼAdhEより選択されるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性を有するか、少なくとも80％の配列同一性を有するか、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P77580、UniProt P0A9Q7、UniProt ID A8JI07、UniProt ID Q52060、UniProt ID Q51949、およびUniprot ID P33744より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 945008、Gene ID 945837、Gene ID 5729132、GenBankアクセッションX60835.1、GenBankアクセッションU09250.1、およびGene ID 1116167より選択される核酸配列を含む。
いくつかの態様において、エタノールアミンアンモニアリアーゼ活性を有する酵素が、アセトアルデヒドおよびアンモニアをMEAへ変換するために使用される。いくつかの態様において、エタノールアミンアンモニアリアーゼ活性を有する酵素は、大腸菌エタノールアミンアンモニアリアーゼに対して少なくとも70％の配列同一性を有するか、少なくとも80％の配列同一性を有するか、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、エタノールアミンアンモニアリアーゼサブユニットをコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P0AEJ6およびUniProt ID P19636より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、エタノールアミンアンモニアリアーゼサブユニットをコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 946924およびGene ID 946925より選択される核酸配列によってコードされる。
エチレンジアミン（EDA）の生成
EDAは、その全体が本明細書に組み入れられるWO2014/049382に記載されている経路A～Eのいずれかによって生成され得る（図7）。
いくつかの態様において、MEGおよびEDAは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い転換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、および1つまたは複数のC3経路を介したG3P中間体のEDAへの変換から同時生成される。
［X］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を付加的に有する、（任意で態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、以下の（a）～（c）：
（a）L-セリンの2-アミノマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒するセリンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からの2-アミノマロン酸セミアルデヒドのアミノアセトアルデヒドへの変換を触媒する2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）からのアミノアセトアルデヒドのEDAへの変換を触媒するアミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
2-アミノマロン酸セミアルデヒドは、任意で、自発反応によってアミノアセトアルデヒドへ変換され得、MEGおよびEDAが同時生成される。
本開示のこの局面によれば、組換え微生物は、セリンデヒドロゲナーゼおよびアミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼの活性を呈する酵素をコードする遺伝子の少なくとも1つを過剰発現する。これらの遺伝子は、内因性遺伝子または外因性遺伝子であり得る。
L-セリンから2-アミノマロン酸セミアルデヒドへの変換の最初の反応は、セリンデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される。この酵素は、アルデヒドレダクターゼとも呼ばれるアルコールデヒドロゲナーゼの大きな酵素ファミリーに属する。数種の酵素がセリンデヒドロゲナーゼ活性を呈することが公知である。本開示の一態様では、これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：シュードモナス・プチダ由来、シネココッカス属（Synechococcus）PCC6301由来またはバチルス・セレウス由来のmmsB；シュードモナス・プチダE23由来のhibdh；シュードモナス・エルギノーサ由来のPA0743；大腸菌由来またはバチルス・ブレビス（Bacillus brevis）由来または枯草菌由来のydfG；アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のsdh；ラタス・ノルベギカス（Rattus norvegicus）由来またはサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）HB8由来のhibadh；大腸菌由来yiaYを非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる（Chowdhury et al., 1996、Yao et al., 2010、Tchigvintsev et al., 2012、Fujisawa et al., 2003、Hawes et al., 1996、およびLokanath et al., 2005）。
本開示の好ましい態様では、セリンデヒドロゲナーゼは、大腸菌由来ydfGまたはシュードモナス・プチダ由来mmsB、または大腸菌由来yiaYによってコードされる。好ましくは、これらの酵素は、L-セリンから2-アミノマロン酸セミアルデヒドへの触媒効率が向上するようにコード遺伝子を変異させることによって最適化される。
本開示の別の態様では、セリンデヒドロゲナーゼ酵素は、セリンに対する特異性およびセリンデヒドロゲナーゼ活性を呈する酵素が得られるようにその基質特異性および/またはその触媒効率を改変して酵素を進化させることによって得られる。これらの酵素は、L-セリンと化学的に類似した基質に対して同じタイプの触媒活性を有する酵素群の中から選択される。好ましくは、これらの酵素は、3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼおよびセリンデヒドロゲナーゼの中から選択されてもよい。より好ましくは、これらは、本明細書の遺伝子：大腸菌由来またはロイコノストック・シトレウム（Leuconostoc citreum）由来またはシムビオバクテリウム・サーモフィラム（Symbiobacterium thermophilum）由来のgldA；大腸菌由来のyqhE；大腸菌由来のyafB；ドノバン・リーシュマニア（Leishmania donovani）由来のalr；シネココッカス属の種（Synechococcus sp.）由来のsakR1；枯草菌由来のyhdN；枯草菌由来のytbE；シロイヌナズナ由来のAKR4C9；大腸菌由来のfucOを非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。
これらの酵素の進化は、当業者に周知の手段および方法によって、基質であるL-セリンに対して向上した特異性を有しかつ/または向上した活性でL-セリンから2-アミノマロン酸セミアルデヒドへの変換を可能にする酵素が得られるように実施される。進化した酵素の選択は、進化した酵素を本開示の微生物またはインビトロで基質としてL-セリンを用いて発現させ、生成物である2-アミノマロン酸セミアルデヒドを検出することによって行われる。
2-アミノマロン酸セミアルデヒドからアミノアセトアルデヒドへの変換の二番目の反応は、細胞において自発的に行われる（Fujisawa et al., 2003）。本開示の別の態様では、2-アミノマロン酸セミアルデヒドからアミノアセトアルデヒドへの変換の二番目の反応は、2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性を有する酵素によって触媒される。この酵素は、天然に遭遇することはない。それゆえ、その酵素は、公知の酵素の進化によってまたはメタゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性は、アミノ酸またはケト酸の脱炭酸を触媒する進化したアミノ酸デカルボキシラーゼまたは進化したケト酸デカルボキシラーゼによって発揮される。好ましくは、進化したアミノ酸デカルボキシラーゼが選択される。より好ましくは、進化したアミノ酸デカルボキシラーゼは、ヒスチジンデカルボキシラーゼ、セリンデカルボキシラーゼ、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノブタン酸デカルボキシラーゼ、オミチンデカルボキシラーゼの中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：シロイヌナズナ由来のsdc；アクイフェックス・エオリカス（Aquifex aeolicus）由来または枯草菌由来のpanD；シロイヌナズナ由来のGADまたはGAD2またはGAD3またはGAD4またはGAD5；ボス・タウルス（Bos Taurus）由来のGADまたはGAD2またはOAZ1またはODC1；大腸菌由来のgadAまたはgadBまたはpanDまたはspeCまたはspeF；ストレプトミセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）由来のSCC105.13；マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Mannheimia succiniciproducens）由来のgadB；ハロフェラックス・ボルカニ由来のbdb；ラクトバチルス属の種由来のodc1；ラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス由来のkivD；ラクトコッカス・ラクチス由来のkdcA；ボス・タウルス由来のOAZ1またはODC1；大腸菌由来のspeCまたはspeF；サッカロミセス・セレビシエ由来のSPE1を非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。好ましくは、シロイヌナズナ由来のsdc遺伝子が、2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性を得るために使用される。
これらの酵素の進化は、当業者に周知の手段および方法によって、基質である2-アミノマロン酸セミアルデヒドに対して特異性を有しかつ2-アミノマロン酸セミアルデヒドからアミノアセトアルデヒドへの変換を可能にする酵素が得られるように実施される。進化した酵素の選択は、進化した酵素を本発明の微生物またはインビトロで基質として2-アミノマロン酸セミアルデヒドを用いて発現させ、生成物であるアミノアセトアルデヒドを定量することによって行われる。
アミノアセトアルデヒドからエチレンジアミンへの変換の最後の反応は、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼによって触媒される。この酵素は、天然に遭遇することはない。それゆえ、その酵素は、公知の酵素の進化によってまたはメタゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。本発明の一態様では、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性は、一方の分子のアミノ基ともう一方の分子上のオキソ基との交換を触媒する進化したトランスアミナーゼまたはアミノトランスフェラーゼによって発揮される。好ましくは、進化したアミノトランスフェラーゼは、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼまたはグルタミン酸アミノトランスフェラーゼの中から選択される。より好ましくは、進化したアミノトランスフェラーゼは、アミノ基ドナーとしてグルタミン酸を使用するアミノトランスフェラーゼの中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：大腸菌由来または枯草菌由来またはコリネバクテリウム・グルタミクム由来のserC；サス・スクロファ（Sus scrofa）由来のGOT1；大腸菌由来のpatA；ブルセラ・カニス（Brucella canis）由来のygjG；リゾビウム属（Rhizobium）NGR 234由来またはストレプトミセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）由来のrocD；ストレプトミセス・セリカラー由来のSCO1284；シロイヌナズナ由来のAGTまたはAGT2またはAGT3またはGGT1；ボス・タウルス由来のAGXTを非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。好ましくは、大腸菌由来のserCまたはサス・スクロファ由来のGOT1遺伝子が、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性を得るために使用される。
これらの酵素の進化は、当業者に周知の手段および方法によって、基質であるアミノアセトアルデヒドに対して特異性を有しかつアミノアセトアルデヒドからエチレンジアミンへの変換を可能にする酵素が得られるように実施される。進化した酵素の選択は、進化した酵素を本発明の微生物またはインビトロで基質としてアミノアセトアルデヒドを用いて発現させ、生成物であるエチレンジアミンを検出することによって行われる。
本開示の別の態様では、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ酵素は、エチレンジアミンを唯一の炭素および窒素源として成長する系統から単離することができる。この目的のために、エチレンジアミンによる環境試料由来の集積培養物を、エチレンジアミンを唯一の窒素および炭素源として含む最小培地上で培養する。これらの培養物からメタゲノムライブラリーを生成し、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ酵素の存在についてスクリーニングする。このアプローチは、その酵素活性に対応する遺伝子の単離を可能にし、その分野の専門家によく知られている。
本開示のある具体的な局面によれば、態様［X］からの微生物は、以下の遺伝子：セリンデヒドロゲナーゼをコードするydfG遺伝子またはmmsB遺伝子またはyiaY遺伝子；および/またはアミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性をコードする進化したserC遺伝子またはGOT1遺伝子の少なくとも1つを過剰発現するように工学操作される。
［Y］一態様では、本出願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源からモノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成可能な組換え微生物であって、態様［A］から、態様［B］から、または態様［C］からの（および任意で態様［D］を含む）組換え微生物であり、かつC2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を追加で有し、以下の（a）～（c）：
（a）L-セリンから2-アミノマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒するセリンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子；
（b）（a）からの2-アミノマロン酸セミアルデヒドから2,3-ジアミノプロパン酸への変換を触媒する2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子；
（c）（b）からの2,3-ジアミノプロパン酸からEDAへの変換を触媒する2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子
の1つまたは複数をさらに発現し；
MEGおよびEDAが同時生成される、組換え微生物に関する。
本開示のこの局面によれば、組換え微生物は、セリンデヒドロゲナーゼ、2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼおよび2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼの活性を呈する酵素をコードする遺伝子の少なくとも1つを過剰発現する。これらの遺伝子は、内因性遺伝子または外因性遺伝子であり得る。
L-セリンから2-アミノマロン酸セミアルデヒドへの変換の最初の反応は、セリンデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される。この酵素は、アルデヒドレダクターゼとも呼ばれるアルコールデヒドロゲナーゼの大きな酵素ファミリーに属する。数種の酵素がセリンデヒドロゲナーゼ活性を呈することが公知である。本開示の一態様では、セリンデヒドロゲナーゼは、これらの公知の酵素の中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：シュードモナス・プチダ由来、シネココッカスPCC6301由来またはバチルス・セレウス由来のmmsB；シュードモナス・プチダE23由来のhibdh；シュードモナス・エルギノーサ由来のPA0743；大腸菌由来またはバチルス・ブレビス由来または枯草菌由来のydfG；アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のsdh；ラタス・ノルベギカス由来またはサーマス・サーモフィラスHB8由来のhibadh；大腸菌由来yiaYを非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる（Chowdhury et al., 1996、Yao et al., 2010、Tchigvintsev et al., 2012、Fujisawa et al., 2003、Hawes et al., 1996、およびLokanath et al., 2005）。
本開示の好ましい態様では、セリンデヒドロゲナーゼは、大腸菌由来ydfGまたはシュードモナス・プチダ由来のmmsB、または大腸菌由来yiaYによってコードされる。好ましくは、これらの酵素は、L-セリンから2-アミノマロン酸セミアルデヒドへの触媒効率が向上するようにコード遺伝子を変異させることによって最適化される。
本開示の別の態様では、セリンデヒドロゲナーゼ酵素は、セリンに対する特異性およびセリンデヒドロゲナーゼ活性を呈する酵素が得られるようにその基質特異性および/またはその触媒効率を改変して酵素を進化させることによって得られる。これらの酵素は、L-セリンと化学的に類似した基質に対して同じタイプの触媒活性を有する酵素群の中から選択される。好ましくは、これらの酵素は、3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼおよびセリンデヒドロゲナーゼの中から選択されてもよい。より好ましくは、これらは、本明細書の遺伝子：大腸菌由来またはロイコノストック・シトレウム由来またはシムビオバクテリウム・サーモフィラム由来のgldA；大腸菌由来yqhE；大腸菌由来yafB；ドノバン・リーシュマニア由来alr；シネココッカス属の種由来sakR1；枯草菌由来yhdN；枯草菌由来ytbE；シロイヌナズナ由来AKR4C9；大腸菌由来fucOを非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。
これらの酵素の進化は、当業者に周知の手段および方法によって、基質であるL-セリンに対して向上した特異性を有しかつ/または向上した活性でL-セリンから2-アミノマロン酸セミアルデヒドへの変換を可能にする酵素が得られるように実施される。進化した酵素の選択は、進化した酵素を本開示の微生物またはインビトロで基質としてL-セリンを用いて発現させ、生成物である2-アミノマロン酸セミアルデヒドを検出することによって行われる。
2-アミノマロン酸セミアルデヒドから2,3-ジアミノプロパン酸への変換の二番目の反応は、2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼによって触媒される。この酵素は、天然に遭遇することはない。それゆえ、その酵素は、公知の酵素の進化によってまたはメタゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性は、一方の分子のアミノ基ともう一方の分子のオキソ基との交換を触媒する進化したトランスアミナーゼまたはアミノトランスフェラーゼによって発揮される。好ましくは、進化したアミノトランスフェラーゼは、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼまたはグルタミン酸アミノトランスフェラーゼの中から選択される。より好ましくは、進化したアミノトランスフェラーゼは、アミノ基ドナーとしてグルタミン酸を使用するアミノトランスフェラーゼの中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：大腸菌由来または枯草菌由来またはコリネバクテリウム・グルタミクム由来のserC；サス・スクロファ由来のGOT1；大腸菌由来patA；ブルセラ・カニス由来のygjG；リゾビウムNGR 234由来またはストレプトミセス・アベルミチリス由来のrocD；ストレプトミセス・セリカラー由来のSCO1284；シロイヌナズナ由来のAGTまたはAGT2またはAGT3またはGGT1；ボス・タウルス由来のAGXTを非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。好ましくは、大腸菌由来serCまたはサス・スクロファ由来のGOT1遺伝子が、2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性を得るために使用される。
これらの酵素の進化は、当業者に周知の手段および方法によって、基質である2-アミノマロン酸セミアルデヒドに対して向上した特異性を有しかつ/または向上した活性で2-アミノマロン酸セミアルデヒドから2,3-ジアミノプロパン酸への変換を可能にする酵素が得られるように実施される。進化した酵素の選択は、進化した酵素を本発明の微生物またはインビトロで基質として2-アミノマロン酸セミアルデヒドを用いて発現させ、生成物である2,3-ジアミノプロパン酸を定量することによって行われる。
2,3-ジアミノプロパン酸からエチレンジアミンへの変換の三番目の反応は、2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素によって触媒される。この酵素は、天然に遭遇することはない。それゆえ、その酵素は、公知の酵素の進化によってまたはメタゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性は、アミノ酸またはケト酸の脱炭酸を触媒する進化したアミノ酸デカルボキシラーゼまたは進化したケト酸デカルボキシラーゼによって発揮される。好ましくは、進化したアミノ酸デカルボキシラーゼが選択される。より好ましくは、進化したアミノ酸デカルボキシラーゼは、ヒスチジンデカルボキシラーゼ、セリンデカルボキシラーゼ、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノブタン酸デカルボキシラーゼ、オミチンデカルボキシラーゼの中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：シロイヌナズナ由来のsdc；枯草菌由来のpadCまたはyclB；カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）由来または大腸菌由来のubiD；サッカロミセス・セレビシエ由来のPAD1またはGAD1またはSPE1；アクイフェックス・エオリカス由来または枯草菌由来のpanD；シロイヌナズナ由来のGADまたはGAD2またはGAD3またはGAD4またはGAD5；ボス・タウルス由来のGADまたはGAD2またはOAZ1またはODC1；大腸菌由来のgadAまたはgadBまたはpanDまたはspeCまたはspeF；ストレプトミセス・セリカラー由来のSCC105.13；マンヘミア・サクシニシプロデュセンス由来のgadB；ハロフェラックス・ボルカニ由来のbdb；ラクトバチルス属の種由来のodc1；ラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス由来のkivD；ラクトコッカス・ラクチス由来のkdcA；ボス・タウルス由来のOAZ1またはODC1；大腸菌由来のspeCまたはspeF；サッカロミセス・セレビシエ由来のSPE1を非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。好ましくは、シロイヌナズナ由来のsdc遺伝子が、2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性を得るために使用される。
これらの酵素の進化は、当業者に周知の手段および方法によって、基質である2,3-ジアミノプロパン酸に対して向上した特異性を有しかつ/または向上した活性で2,3-ジアミノプロパン酸からエチレンジアミンへの変換を可能にする酵素が得られるように実施される。進化した酵素の選択は、進化した酵素を本発明の微生物またはインビトロで基質として2,3-ジアミノプロパン酸を用いて発現させ、生成物であるエチレンジアミンを定量することによって行われる。本開示のある具体的な局面によれば、態様［Y］からの微生物は、セリンデヒドロゲナーゼをコードするydfG遺伝子、yiaY遺伝子またはmmsB遺伝子；および/または2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性をコードする進化したserC遺伝子またはGOT1遺伝子；および/または2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼをコードするシロイヌナズナ由来の進化したsdc遺伝子を過剰発現するように工学操作される。
［Z］一態様では、本出願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源からモノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成可能な組換え微生物であって、態様［A］から、態様［B］から、または態様［C］からの（および任意で態様［D］を含む）組換え微生物であり、かつC2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を追加で有し、以下の（a）～（c）：
（a）L-セリンからエタノールアミンへの変換を触媒するセリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子；
（b）（a）からのエタノールアミンからアミノアセトアルデヒドへの変換を触媒するエタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子；
（c）（b）からのアミノアセトアルデヒドからEDAへの変換を触媒するアミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子
の1つまたは複数をさらに発現し；
MEGおよびEDAが同時生成される、組換え微生物に関する。
本開示のこの局面によれば、組換え微生物は、セリンデカルボキシラーゼ、エタノールアミンデヒドロゲナーゼおよびアミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼの活性を呈する酵素をコードする遺伝子の少なくとも1つを過剰発現する。これらの遺伝子は、内因性遺伝子または外因性遺伝子であり得る。
L-セリンからエタノールアミンへの変換の最初の反応は、セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素によって触媒される。この酵素群は、L-セリンからエタノールアミンの脱炭酸を触媒する。本発明の好ましい態様では、セリンデカルボキシラーゼは、シロイヌナズナ由来のsdcによってコードされる（Rontein et al., 2001, W02007/144346）。シロイヌナズナ由来のsdcによってコードされるセリンデカルボキシラーゼによるL-セリンからエタノールアミンへの変換は、特に、参照により本明細書に組み入れられる特許出願W02007/144364に開示されている。好ましくは、これらの酵素は、L-セリンからエタノールアミンへの変換効率が向上するようにコード遺伝子を変異させることによって最適化される。
本開示の一態様では、セリンデカルボキシラーゼ活性は、セリンに対する特異性および向上したセリンデカルボキシラーゼ活性を呈する酵素が得られるようにその基質特異性および/またはその触媒効率を改変して酵素を進化させることによって得られる。これらの酵素は、エタノールアミンと化学的に類似した基質に対して同じタイプの触媒活性を有する酵素群の中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：サッカロミセス・セレビシエ由来のGAD1またはSPE1；アクイフェックス・エオリカス由来または枯草菌由来のpanD；シロイヌナズナ由来のGADまたはGAD2またはGAD3またはGAD4またはGAD5；ボス・タウルス由来のGADまたはGAD2またはOAZ1またはODC1；大腸菌由来のgadAまたはgadBまたはpanDまたはspeCまたはspeF；ストレプトミセス・セリカラー由来のSCC105.13；マンヘミア・サクシニシプロデュセンス由来のgadB；ハロフェラックス・ボルカニ由来のbdb；ラクトバチルス属の種由来のodc1；ボス・タウルス由来のOAZ1またはODC1；大腸菌由来のspeCまたはspeF；サッカロミセス・セレビシエ由来のSPE1を非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。
これらの酵素の進化は、当業者に周知の手段および方法によって、基質であるL-セリンに対して向上した特異性を有しかつ向上した活性でL-セリンからエタノールアミンへの変換を可能にする酵素が得られるように実施される。進化した酵素の選択は、進化した酵素を本発明の微生物またはインビトロで基質としてL-セリンを用いて発現させ、生成物であるエタノールアミンを定量することによって行われる。
エタノールアミンからアミノアセトアルデヒドへの変換の二番目の反応は、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される。この活性を有する天然酵素は、先行技術において開示されていない；しかしながら、いくつかの酵素は、低い触媒活性を有する。それゆえ、低い触媒活性を有するこれらの酵素を、向上した活性を有する進化した酵素へと進化させることが有利である。また、メタゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって有用な酵素を得ることもできる。
本開示の一態様では、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性は、エタノールアミンに対する特異性およびエタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性を呈する酵素が得られるようにその基質特異性および/またはその触媒効率を改変して酵素を進化させることによって得られる。これらの酵素は、エタノールアミンと化学的に類似した基質に対して同じタイプの触媒活性を有する酵素群の中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：シュードモナス・プチダ由来、またはシネココッカスPCC6301由来、またはバチルス・セレウス由来のmmsB；シュードモナス・プチダE23由来のhibdh；シュードモナス・エルギノーサ由来のPA0743；大腸菌由来またはバチルス・ブレビス由来または枯草菌由来のydfG；アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のsdh；ラタス・ノルベギカス由来またはサーマス・サーモフィラスHB8由来のhibadh；大腸菌由来またはロイコノストック・シトレウム由来またはシムビオバクテリウム・サーモフィラム由来のgldA；大腸菌由来yqhE；大腸菌由来yafB；エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）由来aladh；ドノバン・リーシュマニア由来alr；シネココッカス属の種由来sakR1；枯草菌由来yhdN；枯草菌由来ytbE；大腸菌由来yiaY；シロイヌナズナ由来AKR4C9；大腸菌由来fucOを非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。好ましくは、大腸菌由来fucOまたは大腸菌由来yiaY遺伝子が、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性を得るために使用される。
これらの酵素の進化は、当業者に周知の手段および方法によって、基質であるエタノールアミンに対して向上した特異性を有しかつ/または向上した活性でエタノールアミンからアミノアセトアルデヒドへの変換を可能にする酵素が得られるように実施される。進化した酵素の選択は、進化した酵素を本発明の微生物またはインビトロで基質としてエタノールアミンを用いて発現させ、生成物であるアミノアセトアルデヒドを定量することによって行われる。
アミノアセトアルデヒドからエチレンジアミンへの変換の最後の反応は、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼによって触媒される。この酵素は、天然に遭遇することはない。それゆえ、その酵素は、公知の酵素の進化によってまたはメタゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。本開示の一態様では、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性は、一方の分子のアミノ基ともう一方の分子上のオキソ基との交換を触媒する進化したトランスアミナーゼまたはアミノトランスフェラーゼによって発揮される。好ましくは、進化したアミノトランスフェラーゼは、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼまたはグルタミン酸アミノトランスフェラーゼの中から選択される。より好ましくは、進化したアミノトランスフェラーゼは、アミノ基ドナーとしてグルタミン酸を使用するアミノトランスフェラーゼの中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：大腸菌由来または枯草菌由来またはコリネバクテリウム・グルタミクム由来のserC；サス・スクロファ由来のGOT1；大腸菌由来patA；ブルセラ・カニス由来のygjG；リゾビウムNGR 234由来またはストレプトミセス・アベルミチリス由来のrocD；ストレプトミセス・セリカラー由来のSCO1284；シロイヌナズナ由来のAGTまたはAGT2またはAGT3またはGGT1；ボス・タウルス由来のAGXTを非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。好ましくは、大腸菌由来serCまたはサス・スクロファ由来GOT1遺伝子が使用される。
これらの酵素の進化は、当業者に周知の手段および方法によって、基質であるアミノアセトアルデヒドに対して向上した特異性を有しかつ/または向上した活性でアミノアセトアルデヒドからエチレンジアミンへの変換を可能にする酵素が得られるように実施される。進化した酵素の選択は、進化した酵素を本発明の微生物またはインビトロで基質としてアミノアセトアルデヒドを用いて発現させ、生成物であるエチレンジアミンを検出することによって行われる。
本開示の別の態様では、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ酵素は、エチレンジアミンを唯一の炭素および窒素源として成長する系統から単離することができる。この目的のために、エチレンジアミンによる環境試料由来の集積培養物を、エチレンジアミンを唯一の窒素および炭素源として含む最小培地上で培養する。これらの培養物からメタゲノムライブラリーを生成し、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ酵素の存在についてスクリーニングする。このアプローチは、その酵素活性に対応する遺伝子の単離を可能にし、その分野の専門家によく知られている。
本開示のある具体的な局面によれば、態様［Z］からの微生物は、セリンデカルボキシラーゼをコードするシロイヌナズナ由来のsdc遺伝子；および/またはエタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性をコードする大腸菌由来のfucOまたはyiaY遺伝子；および/またはアミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性をコードする進化したserC遺伝子またはGOT1遺伝子を過剰発現するように工学操作される。
［AA］一態様では、本出願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源からモノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成可能な組換え微生物であって、態様［A］から、態様［B］から、または態様［C］からの（および任意で態様［D］を含む）組換え微生物であり、かつC2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を追加で有し、以下の（a）～（c）：
（a）L-セリンからグリシンへの変換を触媒するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子；
（b）（a）からのグリシンからアミノアセトアルデヒドへの変換を触媒するアルデヒドオキシダーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子；
（c）（b）からのアミノアセトアルデヒドからEDAへの変換を触媒するアミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子
の1つまたは複数をさらに発現し；
MEGおよびEDAが同時生成される、組換え微生物に関する。
好ましくは、大腸菌由来glyA遺伝子が、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を得るために使用される。
アルデヒドオキシダーゼ酵素は、グリシンに対する特異性およびアルデヒドオキシダーゼ活性を呈する酵素が得られるようにその基質特異性および/またはその触媒効率を改変して酵素を進化させることによって得られる。これらの酵素は、グリシンと化学的に類似した基質に対して同じタイプの触媒活性を有する酵素群の中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：アクイフェックス・エオリカス由来のaldH1；アノキシバチルス・フラビサーマス（Anoxybacillus flavithermus）由来のdhaS；アピス・メリフェラ（Apis mellifera）由来のAldh；枯草菌由来のaldX、aldY、dhaS、ycbD、yfmTまたはywdH；大腸菌由来prr；サッカロミセス・セレビシエ由来のALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6；ロゼオバクター・デニトリフィカンス（Roseobacter denitrificans）由来のbetB；アルスロバクター・アウレッセンス（Arthrobacter aurescens）由来のAAur_0650を非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。
アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性を有する酵素によるアミノアセトアルデヒドからエチレンジアミンへの変換。この酵素は、アミノアセトアルデヒドに対する特異性およびトランスアミナーゼ活性を呈する酵素が得られるようにその基質特異性および/またはその触媒効率を改変して酵素を進化させることによって得られる。これらの酵素は、アミノアセトアルデヒドと化学的に類似した基質に対して同じタイプの触媒活性を有する酵素群の中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：大腸菌由来または枯草菌由来またはコリネバクテリウム・グルタミクム由来のserC；サス・スクロファ由来GOT1；大腸菌由来patA；ブルセラ・カニス由来ygjG；リゾビウムNGR 234由来またはストレプトミセス・アベルミチリス由来のrocD；ストレプトミセス・セリカラー由来SCO1284；シロイヌナズナ由来のAGTまたはAGT2またはAGT3またはGGT1；ボス・タウルス由来のAGXTを非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。
本開示のある具体的な局面によれば、態様［AA］からの微生物は、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性をコードする進化したserC遺伝子またはGOT1遺伝子を過剰発現するように工学操作される。
［BB］一態様では、本出願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源からモノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成可能な組換え微生物であって、態様［A］から、態様［B］から、または態様［C］からの（および任意で態様［D］を含む）組換え微生物であり、かつC2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を追加で有し、以下の（a）～（c）：
（a）L-セリンからN-アセチルセリンへの変換を触媒するアミノ酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性またはO-アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子；
（b）（a）からのN-アセチルセリンからN-アセチルマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒するN-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子；
（c）（b）からのN-アセチルマロン酸セミアルデヒドからアセチルアミノプロパン酸への変換を触媒するトランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子；
（d）（c）からのアセチルアミノプロパン酸から2,3-ジアミノプロパン酸への変換を触媒するデアセチラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子；
（e）（d）からの2,3-ジアミノプロパン酸からEDAへの変換を触媒する2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内因性または外因性核酸分子
の1つまたは複数をさらに発現し；
MEGおよびEDAが同時生成される、組換え微生物に関する。
態様［BB］の第1の変換工程は、OからNへの転換が自発的であるので、アミノ酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性であってもO-アセチルトランスフェラーゼ活性であってもよい。好ましくは、大腸菌由来argA遺伝子が、アミノ酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を得るために使用される。
N-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、N-アセチルセリンに対する特異性およびN-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性を呈する酵素が得られるようにその基質特異性および/またはその触媒効率を改変して酵素を進化させることによって得られる。これらの酵素は、N-アセチルセリンと化学的に類似した基質に対して同じタイプの触媒活性を有する酵素群の中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：シュードモナス・プチダ由来、またはシネココッカスPCC6301由来、またはバチルス・セレウス由来のmmsB；シュードモナス・プチダE23由来のhibdh；シュードモナス・エルギノーサ由来のPA0743；大腸菌由来またはバチルス・ブレビス由来または枯草菌由来のydfG；アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のsdh；ラタス・ノルベギカス由来またはサーマス・サーモフィラスHB8由来のhibadh；大腸菌由来またはロイコノストック・シトレウム由来またはシムビオバクテリウム・サーモフィラム由来のgldA；大腸菌由来yqhE；大腸菌由来yafB；エンテロバクター・アエロゲネス由来aladh；ドノバン・リーシュマニア由来alr；シネココッカス属の種由来sakR1；枯草菌由来yhdN；枯草菌由来ytbE；大腸菌由来yiaY；シロイヌナズナ由来AKR4C9；大腸菌由来fucOを非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。
N-アセチルマロン酸セミアルデヒドをアセチルアミノプロパン酸へと変換するトランスアミナーゼ活性を有する酵素は、N-アセチルマロン酸セミアルデヒドに対する特異性およびN-アセチルマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性を呈する酵素が得られるようにその基質特異性および/またはその触媒効率を改変して酵素を進化させることによって得てもよい。これらの酵素は、N-アセチルマロン酸セミアルデヒドと化学的に類似した基質に対して同じタイプの触媒活性を有する酵素群の中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：大腸菌由来または枯草菌由来またはコリネバクテリウム・グルタミクム由来のserC；サス・スクロファ由来のGOT1；大腸菌由来patA；ブルセラ・カニス由来のygjG；リゾビウムNGR 234由来またはストレプトミセス・アベルミチリス由来のrocD；ストレプトミセス・セリカラー由来の2SCG18.31c；シロイヌナズナ由来のAGTまたはAGT2またはAGT3またはGGT1；ボス・タウルス由来のAGXTを非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。
好ましくは、大腸菌由来argE遺伝子が、アセチルアミノプロパン酸を2,3-ジアミノプロパン酸へと変換するデアセチラーゼ活性を得るために使用される。
2,3-ジアミノプロパン酸をエチレンジアミンへと変換するアミノ酸デカルボキシラーゼ活性またはケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、2,3-ジアミノプロパン酸に対する特異性およびアミノ酸デカルボキシラーゼまたはケト酸デカルボキシラーゼ活性を呈する酵素が得られるようにその基質特異性および/またはその触媒効率を改変して酵素を進化させることによって得てもよい。これらの酵素は、2,3-ジアミノプロパン酸と化学的に類似した基質に対して同じタイプの触媒活性を有する酵素群の中から選択される。これらの酵素は、本明細書に列記した遺伝子：シロイヌナズナ由来sdc；枯草菌由来のpadCまたはyclB；カンピロバクター・ジェジュニ由来または大腸菌由来のubiD；サッカロミセス・セレビシエ由来のPAD1またはGAD1またはSPE1；アクイフェックス・エオリカス由来または枯草菌由来のpanD；シロイヌナズナ由来のGADまたはGAD2またはGAD3またはGAD4またはGAD5；ボス・タウルス由来のGADまたはGAD2またはOAZ1またはODC1；大腸菌由来のgadAまたはgadBまたはpanDまたはspeCまたはspeF；ストレプトミセス・セリカラー由来のSCC105.13；マンヘミア・サクシニシプロデュセンス由来のgadB；ハロフェラックス・ボルカニ由来のbdb；ラクトバチルス属の種由来のodc1；ラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス由来のkivD；ラクトコッカス・ラクチス由来のkdcA；ボス・タウルス由来のOAZ1またはODC1；大腸菌由来のspeCまたはspeF；サッカロミセス・セレビシエ由来のSPE1を非限定的に含む、当技術分野において周知の遺伝子の一覧の中から選択される遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが使用され得る。
本開示のさらなる態様では、セリン生合成が最適化される方法が微生物を用いて実施される。この最適化は、特に、参照により本明細書に組み入れられる特許出願WO 2007/144346に開示されている。
あるいは、別の態様では、EDAは、以下のプロセスによって生成することができる：Serを、セリンアミナーゼ（EC 2.6.1.-）によって(S)-2,3-ジアミノプロパン酸へと直接アミノ化し、次いで、例えばL-2,4-ジアミノ酪酸またはオルニチンデカルボキシラーゼのファミリー由来の酵素によって、EDAへと脱炭酸することができる（図7）。しかしながら、(S)-2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性を有するそのような酵素が特異的でないならば、他のアミノ酸またはセリンそれ自体に作用させてもよい。
いくつかの態様では、EDAは、以下のプロセスによって生成することができる：中間体(S)-2,3-ジアミノプロパン酸を、(S)-2,3-ジアミノプロパン酸アンモニアリアーゼ（EC 4.3.1.15）を使用したピルビン酸の直接アミノ化によって生成してもよい（図7）。
Figure 2022521905000085
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い変換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のグリコールアルデヒドの還元を介したMEG、およびG3P中間体からの1つまたは複数のC3経路を介したEDAの同時生成を使用したMEGおよびEDAの生成は、熱力学的最大収量ポテンシャルに極めて近い。いくつかの態様において、熱力学的収量ポテンシャルは、天然経路または発表されている類似の経路によってグルコースから作成されるEDAの生成と比較して、本願に開示された経路を介したMEGおよびEDAの同時生成の方が、14％高い。
同時生成：（ペントースまたはヘキソース） + 2 NH3 → MEG + EDA + 0 ATP＊
Y（経路） = （0.337 + 0.326）g/g = 0.663g（MEG + EDA）/g（（ペントースまたはヘキソース） + 2 NH3）、Y(max)（燃焼熱） = 0.687g/gの97％
標準的な経路：グルコース + 4 NH3 → 2 EDA + 2 NADH + 0 ATP
Y（経路） = 0.484g（EDA）/g（グルコース + 4 NH3）、Y(max)（燃焼熱） = 0.571g/gの85％
＊ペントース、D-キシロースの受動輸送またはH+シンポート輸送を仮定する。H+シンポーターのための間接的なATP消費または細胞維持に必要とされるATPは、考慮されていない。
［CC］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を付加的に有する、（任意で態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、以下の（a）～（b）：
（a）L-セリンの(S)-2,3-ジアミノプロパン酸への変換を触媒するセリンアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からの(S)-2,3-ジアミノプロパン酸のEDAへの変換を触媒する(S)-2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
MEGおよびEDAが同時生成される。
［DD］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成することができる組換え微生物に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［E］を付加的に有する、（任意で態様［D］を含む）態様［A］、態様［B］、または態様［C］からの組換え微生物は、以下の（a）～（b）：
（a）ピルビン酸およびアンモニウムの(S)-2,3-ジアミノプロパン酸への変換を触媒する(S)-2,3-ジアミノプロパン酸アンモニアリアーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からの(S)-2,3-ジアミノプロパン酸のEDAへの変換を触媒する(S)-2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現し；
G3Pは、組換え微生物の内在性解糖を介してピルビン酸へ変換され、MEGおよびEDAが同時生成される。
いくつかの態様において、2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼ活性を有する酵素が、ピルビン酸およびアンモニウムを(S)-2,3-ジアミノプロパン酸へ変換するために使用される。いくつかの態様において、2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼ活性を有する酵素は、大腸菌2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼygeXに対して少なくとも70％の配列同一性を有するか、少なくとも80％の配列同一性を有するか、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼ活性を有する酵素は、大腸菌ygeXである。いくつかの態様において、2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、UniProt ID P66899に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、2,3-ジアミノプロピオン酸アンモニア-リアーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、Gene ID 947012に記載の核酸配列によってコードされる。
前記開示の任意の局面の1つの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌およびS.セレビシエより選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様において、1つまたは複数の核酸分子は、gldA、GRE2、GRE3、yqhD、ydjG、fucO、yafB（dkgB）、および/もしくはyqhE（dkgA）、またはそれらの相同体より選択される。別の態様において、1つまたは複数の核酸分子は、yqhDである。いくつかの態様において、yqhDは、G149E変異を含む。さらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:13、15、17、20、23、25、28、30、および32からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:12、14、16、18、19、21、22、24、26、27、29、および31からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
前記開示の任意の態様の1つの態様において、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム属の種、バチルス属の種、大腸菌、サッカロミセス属の種、およびマリノバクター属（Marinobacter）の種からなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・サーモサッカロリチカム（thermosaccharolyticum）、バチルス・セレウス（cereus）、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ、およびマリノバクター・ヒドロカルボノクラスチカス（hydrocarbonoclasticus）からなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、1つまたは複数の核酸分子は、thlA、atoB、および/もしくはERG10、またはそれらの相同体である。さらなる態様において、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:35、37、および40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:33、34、36、38、および39からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
前記開示の任意の局面の1つの態様において、アセチル-CoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム属の種および大腸菌より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様において、アセチル-CoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、アセチル-CoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、atoAおよび/もしくはatoD、またはそれらの相同体である。別の態様において、アセチル-CoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム・アセトブチリカムから得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、ctfAおよび/もしくはctfB、またはそれらの相同体である。さらなる態様において、アセチル-CoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:43、46、97、99、101、および103からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、アセチル-CoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:41、42、44、45、96、98、100、および102からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
前記開示の任意の局面の1つの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム属の種、バチルス属の種、クロモバクテリウム属（Chromobacterium）の種、およびシュードモナス属の種からなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。別の態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・セルロリチカム（cellulolyticum）、バチルス・ポリミキサ（polymyxa）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（violaceum）、およびシュードモナス・プチダからなる群より選択される微生物から得られる1つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、adcまたはその相同体である。さらなる態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:49および52からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:47、48、50、および51からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
［EE］別の態様において、態様［D］または態様［E］より選択される組換え微生物は、任意で、
（i）グリコールアルデヒドのモノエチレングリコール（MEG）への変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異；
（ii）グリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異；および
（iii）ピルビン酸の乳酸への変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異
からなる群より選択される1つまたは複数の改変をさらに含む。
いくつかの態様において、グリコール酸を生成する組換え微生物は、グリコールアルデヒドのモノエチレングリコール（MEG）への変換を防止し、その代わりに、グリコールアルデヒドのグリコール酸（GA）への変換に向かって反応をシャントするため、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異を含む。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来である。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、fucO遺伝子またはその相同体によってコードされる。
いくつかの態様において、MEG（またはグリコール酸）またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成する組換え微生物は、グリコールアルデヒドからのグリコール酸の生成を防止し、その代わりに、グリコールアルデヒドのMEGへの変換に向かって反応をシャントするため、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異を含む。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、大腸菌由来である。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、aldA遺伝子またはその相同体によってコードされる。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異は、部分的なものであって、いくらかのグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ機能が依然として存在し、ある量のグリコール酸が依然として生成される。
いくつかの態様において、MEG（またはグリコール酸）、または、任意で、MEG（またはグリコール酸）および1つもしくは複数の同時生成物を生成する組換え微生物は、ピルビン酸からの乳酸の生成を防止し、その代わりに、1つまたは複数の同時生成物の生成に向かって反応をシャントするため、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異を含む。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌由来である。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、ldhA遺伝子またはその相同体によってコードされる。
本明細書に記載される組換え微生物および方法の態様のいずれかの非限定的な組み合わせが、本開示の一部として含まれる。
組換え微生物
本開示は、様々な内在性または外来性の酵素を発現するよう操作されていてよい微生物を提供する。
本明細書に記載された様々な態様において、組換え微生物は、真核微生物である。いくつかの態様において、真核微生物は、酵母である。例示的な態様において、酵母は、ヤロウイア（Yarrowia）、カンジダ（Candida）、サッカロミセス、ピキア（Pichia）、ハンセヌラ（Hansenula）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、イッサチェンキア（Issatchenkia）、ザイゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）、デバリオミセス（Debaryomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、パキソレン（Pachysolen）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、トリコスポロン（Trichosporon）、ロドトルラ（Rhodotorula）、およびミキソザイマ（Myxozyma）からなる群より選択される属のメンバーである。
いくつかの態様において、組換え微生物は、原核微生物である。例示的な態様において、原核微生物は、エシェリキア（Escherichia）、クロストリジウム、ザイモモナス（Zymomonas）、サルモネラ（Salmonella）、ロドコッカス（Rhodococcus）、シュードモナス、バチルス、ラクトバチルス、エンテロコッカス（Enterococcus）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、クレブシエラ（Klebsiella）、パエニバチルス（Paenibacillus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、およびブレビバクテリウム（Brevibacterium）からなる群より選択される属のメンバーである。
いくつかの態様において、組換え微生物は、モノエチレングリコール（MEG）またはグリコール酸（GA）またはMEGおよび本明細書に開示された1つもしくは複数の同時生成物を生成するために使用される。
従って、別の局面において、本発明は、本明細書に記載された組換え微生物を使用して、MEGまたはGA、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成する方法を提供する。1つの態様において、方法は、MEGまたはGA、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とが生成されるまで、炭素源を供給する供給原料を含有する培養培地において組換え微生物を培養する工程を含む。さらなる態様において、MEGまたはGA、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とは、回収される。回収は、蒸留、膜ベースの分離、ガスストリッピング、溶媒抽出、およびエクスパンデッドベッド（expanded bed）吸着のような、当技術分野において公知の方法によるものであり得る。
いくつかの態様において、供給原料は、炭素源を含む。本明細書に記載された様々な態様において、炭素源は、糖、グリセロール、アルコール、有機酸、アルカン、脂肪酸、リグノセルロース、タンパク質、二酸化炭素、および一酸化炭素より選択され得る。例示的な態様において、炭素源は、糖である。いくつかの態様において、糖は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖を含む。他の態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、モノマー、オリゴマー、またはそれらの組み合わせから構成される。さらなる例示的な態様において、糖は、グルコースまたはそのグルコースのオリゴマーである。他の態様において、グルコースのオリゴマーは、フルクトース、スクロース、デンプン、セロビオース、マルトース、ラクトース、およびセルロースより選択される。さらなる態様において、糖は、D-キシロース、D-ガラクトース、D-マンノース、D-アラビノース、L-アラビノース、D-フルクトース、またはそれらの組み合わせを含む。
MEG（またはグリコール酸）またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成するかまたは蓄積する組換え微生物を作製する方法
別の態様において、本願は、前記態様のいずれかの組換え微生物を使用して、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成する方法であって、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物が生成されるまで、炭素源を供給する1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖を含有する培養培地において組換え微生物を培養する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、組換え微生物は、モノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を生成する。さらなる態様において、1つまたは複数の同時生成物は、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン（EDA）、またはそれらの組み合わせより選択される。さらなる態様において、1つまたは複数の生成物は、モノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される。
さらに別の局面において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体への変換のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；D-リボース-5-リン酸中間体のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；C2経路におけるグリコールアルデヒドからの1つまたは複数の生成物の生成のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；ならびに1つまたは複数のC3経路におけるG3Pからの1つまたは複数の生成物の生成のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；ならびに組換え微生物を、1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積するよう、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖を含有する培養培地において培養する工程を含む、ペントースリン酸中間体（ここで、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸である）を介して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積する組換え微生物を作製する方法を提供する。いくつかの態様において、組換え微生物は、モノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を同時生成する。さらなる態様において、1つまたは複数の同時生成物は、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン（EDA）、またはそれらの組み合わせより選択される。さらなる態様において、1つまたは複数の生成物は、モノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドは、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼによってGAへ酸化される。
1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖をロスの無い変換においてペントースリン酸中間体へ変換する活性を有する少なくとも1つの酵素、ならびにD-リボース-5-リン酸中間体をグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-ホスファターゼ（G3P）へ変換するペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素（ここで、酵素はD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼ活性、またはD-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する）を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程を含む、ペントースリン酸中間体を介して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積する組換え微生物を作製する方法に関する。
いくつかの態様において、方法は、トランスケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素、およびD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程を含む。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtktAに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtktAである。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtktBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtktBである。別の態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:148および150からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、tktAまたはその相同体である。いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、tktBまたはその相同体である。さらなる態様において、トランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:147および149からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のdeoCに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のdeoCである。
いくつかの態様において、方法は、トランスアルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程を含む。いくつかの態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtalAまたはtalBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtalAである。他の態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のtalBである。別の態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:152および154からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、トランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:151および153からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、方法は、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程を含む。いくつかの態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のrpeに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のrpeである。別の態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:158に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:157に記載の核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、方法は、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程を含む。いくつかの態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のrpiAに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のrpiAである。他の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のrpiBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。他の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来のrpiBである。別の態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:156に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:155に記載の核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、方法は、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性、およびD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程を含む。他の態様において、方法は、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、およびホスホグリセリン酸キナーゼ、およびホスホグリセリン酸ムターゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入することをさらに含む。いくつかの態様において、内在性グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ酵素はgapAであり、ホスホグリセリン酸キナーゼはpgkであり、ホスホグリセリン酸ムターゼはgpmAまたはgpmMである。
いくつかの態様において、方法は、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程を含む。いくつかの態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・デンチウムBDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクチスxfp、ラクトバチルス・パラプランタラムxpkA、およびビフィドバクテリウム・ブレベxfpからなる群より選択されるフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素は、ビフィドバクテリウム・デンチウムBDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクチスxfp、ラクトバチルス・パラプランタラムxpkA、およびビフィドバクテリウム・ブレベxfpからなる群より選択される。別の態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:212、214、216、および218からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:211、213、215、および217からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、方法は、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程を含む。いくつかの態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリカムptaより選択されるリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリカムptaより選択される。別の態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:220および222より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:219および221より選択される核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、方法は、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性、およびD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程を含む。他の態様において、方法は、内在性6-ホスホフルクトキナーゼ酵素の活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む。いくつかの態様において、内在性6-ホスホフルクトキナーゼ酵素は、pfkAおよび/またはpfkBである。
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、D-キシロースを含み、方法は、キシロースイソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素およびキシルロース5-キナーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含む。いくつかの態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素は、大腸菌またはピロミセス属の種に由来するxylAに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌xylAおよびピロミセス属の種のxylAより選択される。さらに別の態様において、キシロースイソメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:95および144より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、キシロースイソメラーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:93、94、および143からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、キシルロース5-キナーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素は、大腸菌由来のxylBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、キシルロース5-キナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌xylBである。別の態様において、D-キシルロース5-キナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:146に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、D-キシルロース5-キナーゼをコードする1つまたは複数の核酸分子は、SEQ ID NO:145に記載の核酸配列によってコードされる。
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、D-フルクトースを含み、方法は、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する少なくとも1つの酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含む。1つの態様において、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する少なくとも1つの酵素は、大腸菌由来のfbpに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる。好ましい態様において、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素は、大腸菌fbpである。いくつかの態様において、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素は、D-フルクトース1,6-ビスリン酸をD-フルクトース6-リン酸へ変換する。他の態様において、D-フルクトースは、組換え微生物の内在性酵素によってフルクトース1,6-ビスリン酸へ変換される。
前記方法のいずれかのいくつかの態様において、方法は、グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む。さらなる態様において、グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼはzwfであり、6-ホスホグルコノラクトナーゼはpglであり、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはgndである。
いくつかの態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得る。他の態様において、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、モノマー、オリゴマー、またはそれらの組み合わせから構成される。
いくつかの態様において、トランスケトラーゼ活性および/またはフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現、ならびにペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い変換、ならびにその後のペントースリン酸のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換を可能にする。
いくつかの態様において、方法は、C2経路におけるグリコールアルデヒドの変換および1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通したMEGまたはグリコール酸（GA）の生成を可能にする。いくつかの態様において、MEGは、C2経路におけるグリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの還元によって生成される。他の態様において、GAは、C2経路におけるグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの酸化によって生成される。
いくつかの態様において、MEGまたはGAの生成のための少なくとも1つの酵素は、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、グリセリン酸デカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、およびグリオキシル酸レダクターゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択される。
いくつかの態様において、方法は、C2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通したMEGの生成、および1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成を可能にする。他の態様において、1つまたは複数の同時生成物は、アセトン、イソプロパノール、プロペン、イソブテン、および1つまたは複数のセリン経路化合物より選択される。いくつかの好ましい態様において、1つまたは複数のセリン経路化合物は、セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、およびエチレンジアミン（EDA）より選択される。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、アセトンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、イソプロパノールを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性、およびデヒドラターゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、プロペンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）シンターゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ活性、メチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ活性、メチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ活性、メチルクロトニル-CoAヒドラターゼ活性、3-ヒドロキシイソバレリル-CoAチオエステラーゼ活性、3HIVキナーゼ活性、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性、および3HIVデカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、イソブテンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、およびグリセリン酸2-キナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、L-セリンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性、グリシン開裂系に関連した活性、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性、アラニントランスアミナーゼ活性、NAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、グリシンを含む。別の態様において、グリシン開裂系に関連した活性は、グリシンデカルボキシラーゼ（Pタンパク質）、アミノメチルトランスフェラーゼ（Tタンパク質）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Lタンパク質）、およびHタンパク質より選択される酵素またはタンパク質を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、トランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、およびエタノールアミンアンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、モノエタノールアミン（MEA）を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素は、セリンデヒドロゲナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、アルデヒドオキシダーゼ活性、N-アセチルトランスフェラーゼまたはO-アセチルトランスフェラーゼ活性、N-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性、トランスアミナーゼ活性、デアセチラーゼ活性、セリンアミナーゼ活性、および2,3-ジアミノプロパン酸アンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物は、エチレンジアミン（EDA）を含む。
前記方法のいずれかのいくつかの態様において、方法は、グリコールアルデヒドレダクターゼ、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはそれらの組み合わせの活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む。
1つの態様において、C3経路において生成される過剰のNADHの少なくとも一部は、C2経路における還元当量源として使用される。別の態様において、C3経路において生成される過剰のNADHの少なくとも一部は、ATPを生成するために使用される。
1つの態様において、過剰のバイオマス形成が最小化され、MEGまたはグリコール酸、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生成が最大化される。
ペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体への変換、ならびにその後のペントースリン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸への変換
本開示において、ペントース糖および/またはヘキソース糖は、非酸化的ペントースリン酸経路の中間体、ペントースリン酸へ変換され、ここで、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸である。ペントースリン酸中間体は、次いで、グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸を生成するため、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼ活性、またはD-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有するペントースリン酸アルドラーゼの基質として機能し、それらの化合物は、次いで、MEGまたはGA、またはMEGおよび1つもしくは複数の同時生成物へさらに変換され得る。
［mA］従って、1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、ペントースリン酸中間体を介して、グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）を生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、方法は、以下の（a）～（h）：
（a）D-フルクトース-6-リン酸およびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸の、それぞれ、D-エリトロース-4-リン酸およびD-キシルロース-5-リン酸への可逆的変換を触媒し、かつ/または（b）からのD-グリセルアルデヒド-3-リン酸および（b）からのD-セドヘプツロース-7-リン酸の、それぞれ、D-リボース-5-リン酸およびD-キシルロース-5-リン酸への可逆的変換を触媒するトランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）D-フルクトース-6-リン酸および（a）からのD-エリトロース-4-リン酸の、それぞれ、D-グリセルアルデヒド-3-リン酸およびD-セドヘプツロース-7-リン酸への可逆的変換を触媒するトランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）および/または（f）からのD-キシルロース-5-リン酸とD-リブロース-5-リン酸との相互変換を触媒するリブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）からのD-リブロース-5-リン酸とD-リボース-5-リン酸との相互変換を触媒するリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するキシルロース5-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）D-フルクトース1,6-ビスリン酸のD-フルクトース6-リン酸への変換を触媒するフルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（a）および/または（d）からのD-リボース-5-リン酸のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸への変換を触媒するD-リボース5-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程を含み；
方法は、任意で、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、および/またはホスホグリセリン酸ムターゼをコードする遺伝子に欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異を導入する工程を含み；
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得、
グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）が生成される。
［mB］別の態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、ペントースリン酸中間体を介して、グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）を生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、方法は、以下の（a）～（j）：
（a）D-フルクトース-6-リン酸のD-エリトロース-4-リン酸およびアセチル-リン酸への可逆的変換を触媒するフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からのアセチル-リン酸のアセチル-CoAへの可逆的変換を触媒するリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）D-フルクトース-6-リン酸および（a）からのD-エリトロース-4-リン酸の、それぞれ、D-グリセルアルデヒド-3-リン酸およびD-セドヘプツロース-7-リン酸への可逆的変換を触媒するトランスアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）からのD-グリセルアルデヒド-3-リン酸および（c）からのD-セドヘプツロース-7-リン酸の、それぞれ、D-リボース-5-リン酸およびD-キシルロース-5-リン酸への可逆的変換を触媒するトランスケトラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（d）および/または（h）からのD-キシルロース-5-リン酸とD-リブロース-5-リン酸との相互変換を触媒するリブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（e）からのD-リブロース-5-リン酸とD-リボース-5-リン酸との相互変換を触媒するリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するキシルロース5-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（i）D-フルクトース1,6-ビスリン酸のD-フルクトース6-リン酸への変換を触媒するフルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（j）（d）および/または（f）からのD-リボース-5-リン酸のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸への変換を触媒するD-リボース5-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程を含み；
方法は、任意で、6-ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子に欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異を導入する工程をさらに含み；
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖は、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得、
工程（b）において生成されるアセチル-CoAは、グリコール酸、アセトン、イソプロパノール、プロペン、イソブテン、および1つまたは複数のセリン経路化合物より選択される1つまたは複数の同時生成物を生成するために使用され得；
グリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸（G3P）が生成される。
いくつかの態様において、ペントースリン酸経路の酸化ブランチは、ペントースリン酸経路への非酸化的流入に向かう糖のフラックスを最適化するため、欠失させられるかまたは不活化される。
［mC］従って、1つの態様において、態様［mA］または態様［mB］の方法は、任意で、
（i）グルコース6-リン酸の6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンへの変換を触媒するグルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異；
（ii）6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンのグルコン酸-6-リン酸への変換を触媒する6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異；および
（iii）グルコン酸-6-リン酸のD-リブロース-5-リン酸への変換を触媒する6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異
からなる群より選択される1つまたは複数の改変を導入する工程をさらに含む。
MEGまたはグリコール酸またはMEGおよび同時生成物の生成経路
いくつかの態様において、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］から生成されたグリコールアルデヒドおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸中間体は、付加的なMEG（またはグリコール酸）および/または1つもしくは複数の同時生成物を同時生成するため、下記のように、C3経路と共役させられる、公知のMEG（またはグリコール酸）C2生成経路において使用される。
いくつかの態様において、MEGは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換するため、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素を使用するC2経路を介して生成される。別の態様において、グリコール酸（GA）は、グリコールアルデヒドをGAへ酸化するため、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を使用するC2経路を介して生成される。
［mD］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、モノエチレングリコール（MEG）を生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、グリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み、組換え微生物は、任意で、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異をさらに含み、MEGが生成される。
［mE］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、グリコール酸（GA）を生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、グリコールアルデヒドのGAへの変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み、組換え微生物は、任意で、グリコールアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異を含み、GAが生成される。
C2経路を介したMEG（またはグリコール酸）およびC3経路を介したMEG（またはグリコール酸）の生成
1つの局面において、MEG（またはグリコール酸）は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い転換、その後のペントースリン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびG3P中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEG（またはグリコール酸）への変換、およびC3経路を介したG3PのMEG（またはグリコール酸）への変換によって、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から生成される。ここで、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸である。
いくつかの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、MEG（またはグリコール酸）を生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEG（またはグリコール酸）の生成のための態様［mD］または態様［mE］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、MEG（またはグリコール酸）の生成のための1つまたは複数のC3生合成経路をさらに含む。
［mK］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）を生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEG（またはグリコール酸）の生成のための態様［mD］または態様［mE］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（h）：
（a）3-ホスホグリセリン酸の3-ホスホヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のホスホ-L-セリンへの変換を触媒するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（b）からのホスホ-L-セリンのL-セリンへの変換を触媒するホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（d）からのL-セリンのヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するL-セリントランスアミナーゼまたはセリンオキシダーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（c）または（e）からのヒドロキシピルビン酸のグリコールアルデヒドへの変換を触媒するヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）からのグリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（f）からのグリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
態様［mA］または態様［mB］から生成された中間体G3Pは、組換え微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸へ変換され、MEG（またはグリコール酸）が生成される。
［mL］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）を生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEG（またはグリコール酸）の生成のための態様［mD］または態様［mE］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（j）：
（a）2-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）3-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素またはグリセリン酸-3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）および/または（b）からのグリセリン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）L-セリンのヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素またはセリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）L-セリンのエタノールアミンへの変換を触媒するL-セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（c）および/または（d）からのヒドロキシピルビン酸のグリコールアルデヒドへの変換を触媒するヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（e）からのエタノールアミンのグリコールアルデヒドへの変換を触媒するエタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（a）および/または（b）からのグリセリンのMEGへの変換を触媒するグリセリン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（i）（f）および/または（g）からのグリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（j）（f）および/または（g）からのグリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
態様［mA］または態様［mB］から生成された中間体G3Pは、組換え微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸および/または2-ホスホグリセリン酸へ変換され、MEG（またはグリコール酸）が生成される。
別の態様において、MEGは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い転換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、およびC3経路を介したG3P中間体の1つまたは複数の同時生成物への変換から生成される。
C2経路を介したMEG、ならびにC3経路を介したアセトン、イソプロパノール、プロペン、および/またはイソブテンの同時生成
いくつかの態様において、MEGは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い転換、その後のペントースリン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、およびC3経路を介したG3P中間体のアセトンへの変換から生成される。ここで、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸である。
［mM］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、モノエチレングリコール（MEG）およびアセトンを同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、（a）～（c）：
（a）アセチル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒するチオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からのアセトアセチル-CoAのアセト酢酸への変換を触媒するアセチル-CoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素または酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；および/または
（c）（b）からのアセト酢酸のアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
態様［mA］または態様［mB］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通してアセチル-CoAへ変換され、MEG（またはグリコール酸）およびアセトンが同時生成される。
いくつかの態様において、MEGは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い転換、その後のペントースリン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、およびC3経路を介したG3P中間体のイソブテンへの変換から生成される。ここで、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸である。
［mN］いくつかの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、モノエチレングリコール（MEG）およびイソブテンを同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（d）：
（a）アセチル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒するチオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からのアセトアセチル-CoAのアセト酢酸への変換を触媒するアセチル-CoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素または酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）からのアセト酢酸のアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）からのアセトンおよびアセチル-CoAの3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）への変換を触媒する3-ヒドロキシイソ吉草酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含むか；または
方法は、以下の（e）～（j）：
（e）アセチル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒するチオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（e）からのアセトアセチル-CoAおよびアセチル-CoAの3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA（HMG-CoA）への変換を触媒するヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）からのHMG-CoAの3-メチルグルタコニル-CoAへの変換を触媒するメチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）からの3-メチルグルタコニル-CoAの3-メチルクロトニル-CoAへの変換を触媒するメチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）からの3-メチルクロトニル-CoAの3-ヒドロキシイソバレリル-CoAへの変換を触媒するメチルクロトニル-CoAヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（j）（i）からの3-ヒドロキシイソバレリル-CoAの3HIVへの変換を触媒する3-ヒドロキシイソバレリル-CoAチオエステラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程を含み；
方法は、
（a1）（d）または（j）からの3HIVの3HIV-3-リン酸への変換を触媒する3HIVキナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（a2）（a1）からの3HIV-3-リン酸のイソブテンへの変換を触媒する3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b1）（d）または（j）からの3HIVのイソブテンへの変換を触媒する3HIVデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
より選択される（a1）および（a2）および/または（b1）を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
態様［mA］または態様［mB］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通してアセチル-CoAへ変換され、MEGおよびイソブテンが同時生成される。
いくつかの態様において、MEGは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い転換、その後のD-リボース-5-リン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、およびC3経路を介したG3P中間体のイソプロパノールへの変換によって生成される。
［mO］1つの態様において、（任意で態様［mEE］を含む）態様［mM］および/または［mN］の方法は、任意で、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含む。
いくつかの態様において、MEGは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い転換、その後のペントースリン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、およびC3経路を介したG3P中間体のプロペンへの変換によって生成される。ここで、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸である。
［mP］別の態様において、（任意で態様［mEE］を含む）態様［mO］の方法は、任意で、イソプロパノールのプロペンへの変換を触媒するデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子をさらに含む。
C2経路を介したMEGおよびC3経路を介した1つまたは複数のセリン経路化合物の同時生成
いくつかの態様において、MEGおよびL-セリンは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い転換、その後のペントースリン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、および1つまたは複数のC3経路を介したG3P中間体のLセリンへの変換から同時生成される。ここで、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸である。
［mQ］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびL-セリンを同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（h）：
（a）3-ホスホグリセリン酸の3-ホスホヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）3-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）2-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のホスホ-L-セリンへの変換を触媒するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（d）からのホスホ-L-セリンのL-セリンへの変換を触媒するホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（b）および/または（c）からのグリセリン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（e）および/または（g）からのヒドロキシピルビン酸のL-セリンへの変換を触媒するセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
態様［mA］または態様［mB］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸および/または2-ホスホグリセリン酸へ変換され、MEGおよびL-セリンが生成される。
いくつかの態様において、MEGおよびグリシンは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い転換、その後のペントースリン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、および1つまたは複数のC3経路を介したG3P中間体のグリシンへの変換から生成される。ここで、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸である。
［mR］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびグリシンを同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（e）：
（a）L-セリンおよびテトラヒドロ葉酸（THF）のグリシンおよび5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸（M-THF）への変換を触媒するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からのM-THFのホルムアルデヒドへの変換を触媒するトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）からのホルムアルデヒドのギ酸およびNADHへの変換を触媒するホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）からのギ酸のCO2およびNADHへの変換を触媒するギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（a）からのM-THF、CO2、NH3、および（c）または（d）からのNADHのグリシンおよびTHFへの変換を触媒するグリシン開裂系のタンパク質をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
THFは工程（b）～（e）から再生され、任意で、（c）からのギ酸は、ギ酸水素リアーゼ複合体によってCO2およびH2へさらに酸化され、MEGおよびグリシンが生成される。
［mS］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびグリシンを同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］からの組換え微生物は、以下の（a）～（k）：
（a）3-ホスホグリセリン酸の3-ホスホヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のホスホ-L-セリンへの変換を触媒するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（b）からのホスホ-L-セリンのL-セリンへの変換を触媒するホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（d）からのL-セリンのヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するL-セリントランスアミナーゼまたはセリンオキシダーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（c）または（e）からのヒドロキシピルビン酸のグリコールアルデヒドへの変換を触媒するヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）からのグリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）からのグリコール酸のグリオキシル酸への変換を触媒するグリコール酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）からのグリオキシル酸およびアラニンのグリシンおよびピルビン酸への変換を触媒するアラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（j）（i）からのピルビン酸およびグルタミン酸のアラニンおよび2-オキソグルタル酸への変換を触媒するアラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（k）（j）からの2-オキソグルタル酸およびアンモニアのグルタミン酸への変換を触媒するNAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
態様［mA］または態様［mB］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸および/または2-ホスホグリセリン酸へ変換され、アラニンおよびグルタミン酸は、工程（j）および（k）から再生され、MEGおよびグリシンが同時生成される。
［mT］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびグリシンを同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］からの組換え微生物は、以下の（a）～（l）：
（a）2-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）3-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸-3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）および/または（b）からのグリセリン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）L-セリンのヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するセリンアミノトランスフェラーゼまたはセリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）L-セリンのエタノールアミンへの変換を触媒するL-セリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（c）および/または（d）からのヒドロキシピルビン酸のグリコールアルデヒドへの変換を触媒するヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（e）からのエタノールアミンのグリコールアルデヒドへの変換を触媒するエタノールアミンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素またはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（f）および/または（g）からのグリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（i）（g）からのグリコール酸のグリオキシル酸への変換を触媒するグリコール酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（j）（i）からのグリオキシル酸のグリシンおよびピルビン酸への変換を触媒するアラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（k）（j）からのピルビン酸およびグルタミン酸のアラニンおよび2-オキソグルタル酸への変換を触媒するアラニントランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（l）（k）からの2-オキソグルタル酸およびアンモニアのグルタミン酸への変換を触媒するNAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
態様［mA］または態様［mB］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸および/または2-ホスホグリセリン酸へ変換され、アラニンおよびグルタミン酸は、工程（k）および（l）から再生され、MEGおよびグリシンが同時生成される。
いくつかの態様において、MEGおよびMEAは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い転換、その後のペントースリン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、および1つまたは複数のC3経路を介したG3P中間体のMEAへの変換から同時生成される。ここで、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸である。
［mU］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびMEAを同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（i）：
（a）3-ホスホグリセリン酸の3-ホスホヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）3-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）2-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のホスホ-L-セリンへの変換を触媒するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（a）からの3-ホスホヒドロキシピルビン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒する3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（d）からのホスホ-L-セリンのL-セリンへの変換を触媒するホスホセリンホスファターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（g）（b）および/または（c）からのグリセリン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（h）（e）および/または（g）からのヒドロキシピルビン酸のL-セリンへの変換を触媒するセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（i）（f）および/または（h）からのL-セリンのMEAへの変換を触媒するセリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
態様［mA］または態様［mB］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸および/または2-ホスホグリセリン酸へ変換され、MEGおよびMEAが同時生成される。
［mV］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびMEAを同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（f）：
（a）2-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸-2-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）3-ホスホグリセリン酸のグリセリン酸への変換を触媒する3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素および/またはグリセリン酸-3-キナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）および/または（b）からのグリセリン酸のヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）L-セリンのヒドロキシピルビン酸への変換を触媒するセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼまたはセリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（c）および/または（d）からのヒドロキシピルビン酸のグリコールアルデヒドへの変換を触媒するヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（f）（e）からのグリコールアルデヒドのMEAへの変換を触媒するトランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
態様［mA］または態様［mB］から生成された中間体G3Pは、微生物の内在性解糖を通して3-ホスホグリセリン酸および/または2-ホスホグリセリン酸へ変換され、MEGおよびMEAが同時生成される。
［mW］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびMEAを同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（b）：
（a）アセチル-CoAのアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）アセトアルデヒドおよびアンモニアのMEAへの変換を触媒するエタノールアミンアンモニアリアーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
態様［mA］または態様［mB］から生成された中間体G3Pは、組換え微生物の内在性解糖を通してアセチル-CoAへ変換され、MEGおよびMEAが同時生成される。
いくつかの態様において、MEGおよびEDAは、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い転換、その後のペントースリン酸中間体のグリコールアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）中間体への変換、その後のC2経路を介したグリコールアルデヒド中間体のMEGへの変換、および1つまたは複数のC3経路を介したG3P中間体のEDAへの変換から同時生成される。ここで、ペントースリン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸である。
［mX］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（c）：
（a）L-セリンの2-アミノマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒するセリンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からの2-アミノマロン酸セミアルデヒドのアミノアセトアルデヒドへの変換を触媒する2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）からのアミノアセトアルデヒドのEDAへの変換を触媒するアミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
2-アミノマロン酸セミアルデヒドは、任意で、自発反応によってアミノアセトアルデヒドへ変換され得、MEGおよびEDAが同時生成される。
［mY］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（c）：
（a）L-セリンの2-アミノマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒するセリンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からの2-アミノマロン酸セミアルデヒドの2,3-ジアミノプロパン酸への変換を触媒する2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）からの2,3-ジアミノプロパン酸のEDAへの変換を触媒する2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
MEGおよびEDAが同時生成される。
［mZ］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、（a）～（c）：
（a）L-セリンのエタノールアミンへの変換を触媒するセリンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からのエタノールアミンのアミノアセトアルデヒドへの変換を触媒するエタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）からのアミノアセトアルデヒドのEDAへの変換を触媒するアミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
MEGおよびEDAが同時生成される。
［mAA］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（c）：
（a）L-セリンのグリシンへの変換を触媒するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からのグリシンのアミノアセトアルデヒドへの変換を触媒するアルデヒドオキシダーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）からのアミノアセトアルデヒドのEDAへの変換を触媒するアミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
MEGおよびEDAが同時生成される。
［mBB］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（e）：
（a）L-セリンのN-アセチルセリンへの変換を触媒するアミノ酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性またはO-アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からのN-アセチルセリンのN-アセチルマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒するN-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）からのN-アセチルマロン酸セミアルデヒドのアセチルアミノプロパン酸への変換を触媒するトランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）からのアセチルアミノプロパン酸の2,3-ジアミノプロパン酸への変換を触媒するデアセチラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（e）（d）からの2,3-ジアミノプロパン酸のEDAへの変換を触媒する2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
MEGおよびEDAが同時生成される。
［mCC］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（b）：
（a）L-セリンの(S)-2,3-ジアミノプロパン酸への変換を触媒するセリンアミナーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からの(S)-2,3-ジアミノプロパン酸のEDAへの変換を触媒する(S)-2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
MEGおよびEDAが同時生成される。
［mDD］1つの態様において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖および窒素源から、モノエチレングリコール（MEG）（またはグリコール酸）およびエチレンジアミン（EDA）を同時生成することができる組換え微生物を作製する方法に関し、ここで、C2経路におけるMEGの生成のための態様［mD］を付加的に有する、（任意で態様［mC］を含む）態様［mA］または態様［mB］の方法は、以下の（a）～（b）：
（a）ピルビン酸およびアンモニウムの(S)-2,3-ジアミノプロパン酸への変換を触媒する(S)-2,3-ジアミノプロパン酸アンモニアリアーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）からの(S)-2,3-ジアミノプロパン酸のEDAへの変換を触媒する(S)-2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも1つの内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程をさらに含み；
G3Pは、組換え微生物の内在性解糖を介してピルビン酸へ変換され、MEGおよびEDAが同時生成される。
［mEE］別の態様において、態様［mD］または態様［mE］の方法は、任意で、
（i）グリコールアルデヒドのモノエチレングリコール（MEG）への変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異；
（ii）グリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異；および
（iii）ピルビン酸の乳酸への変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失変異、挿入変異、または機能喪失変異
からなる群より選択される1つまたは複数の改変を導入する工程をさらに含む。
酵素工学
組換え微生物中の酵素は、基質から生成物への変換の1つまたは複数の局面を向上させるために工学操作することができる。本開示の方法において使用するためにさらに工学操作することができる酵素の非限定例は、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、アルデヒドレダクターゼ、アセトアセチル補酵素Aヒドロラーゼ、キシロースイソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリントランスアミナーゼ、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ、3-ホスホヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、セリンデカルボキシラーゼ、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）、グリセリン酸デカルボキシラーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ、グリセリン酸3-キナーゼ、グリセリン酸2-キナーゼ、メバロン酸ジリン酸デカルボキシラーゼ、およびそれらの組み合わせを含む。これらの酵素は、触媒活性の向上、選択性の向上、安定性の向上、様々な発酵条件（温度、pHなど）に対する耐性の向上、または様々な代謝基質、生成物、副生成物、中間体などに対する耐性の向上のために工学操作することができる。本明細書において特定の酵素活性に関して使用される「触媒活性の向上」という用語は、同等な工学操作されていない酵素に対して測定されたものより高いレベルの酵素活性のことを指す。
指向性進化法は、実験室で自然の進化過程を模倣することを可能にする分子生物学技法全体を説明するために使用される用語である。酵素について、これは、一般に、1つまたは複数の出発遺伝子のランダム変異誘発と、それに続く、1つまたは複数の望ましい特性が向上した酵素バリアントを単離または濃縮するスクリーニングまたは選択工程を伴う。そのプロセスは、所望の変化レベルに達するまでまたはさらなる変化が誘発されなくなるまで繰り返すことができる。自然では何百万年かかるプロセスを実験室においてわずか数週間または数ヶ月に短縮する多種多様なツールおよび技法が20年以上にわたって開発されている。最も一般的な戦略、例えば、DNA産物の集団にランダム点変異を導入するエラープローンPCR（epPCR）、および典型的には＞70％の相同性を有する親遺伝子間でランダム組換えを可能にするDNAシャッフリング法は、自然で起こる進化のメカニズムを模倣する。後者の技法は、事前に選ばれた部位にまたはランダムに分布している部位で標的化された飽和またはカセット式変異誘発を通じて多種多様なアミノ酸にアクセスし、非相同遺伝子のランダム組換えを可能にした。さらなる技法は、コドンのランダム挿入および欠失を創出し、ドメインもしくはエクソンまたはループ領域をシャッフルし、ランダムトランケーションのライブラリーを作製することができる。
例えば、アルドラーゼの安定性、基質特異性、および立体特異性を変化させて、生体触媒プロセス用の優れた酵素を作製するために、操作手法が使用されてきた。フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ（FBP-アルドラーゼ）の耐熱性および溶媒耐性は、大腸菌およびエドワージエラ・イクタルリ（Edwardsiella ictaluri）に由来するfda遺伝子のファミリーDNAシャフリングの使用により増加した。53℃においていずれの親よりも平均280倍高い半減期を示す第4世代のバリアントが同定された。同バリアントは、様々な極性および非極性の有機溶媒においても増強された活性を示した（Hao and Berry 2004 Protein Eng Des Sel 17:689-697）。
別の例として、アセトアセチル補酵素Aヒドロラーゼは、アセトアセチルCoAをアセト酢酸へ変換することができる。しかしながら、ヒドロラーゼは、酵素チオラーゼによるアセトアセチルCoA形成のために必要とされる基質であるアセチルCoAともほぼ同じ大きさで反応するという点で非特異的である。従って、より効率的なアセトアセチルCoAヒドロラーゼを作出するため、触媒作用のために重要な酵素βサブユニット内の数個のグルタミン酸残基を交換することによって、アセチルCoA基質より少なくとも10倍高い活性をアセトアセチルCoA基質に対して有するよう、これらの酵素は操作された（WO 2015/042588）。
別の例として、大腸菌YqhD酵素は、10種を超えるアルデヒド基質に対してNADPH依存性レダクターゼ活性を有する広基質アルデヒドレダクターゼであって、再生可能バイオ燃料および化学物質を生成するための有用な酵素である（Jarboe 2010 Applied Microbiology and Biotechnology 89:249）。YqhD酵素活性は、毒性アルデヒドの除去を通して有益であるが、酵素は、NADPH依存性でもあり、NADPH枯渇および生物の増殖阻害に寄与する。3-ヒドロキシプロピオンアルデヒド（3-HPA）からの1,3-プロパンジオール生成を改善するため、YqhDのエラープローンPCRが実施された。この定方向の操作は、ある特定のアルデヒド、具体的には、3-HPAに対する減少したKmおよび増加したkcatを有する2つの変異体、D99QN147HおよびQ202Aを与えた（Li et al.2008 Prog.Nat.Sci.18(12):1519-1524）。残基Asp99およびAsn147は両方ともNADPHと相互作用するため、D99QN147H変異体の改善された触媒活性は、YqhDの構造について公知のものと一致している（Sulzenbacher et al.2004 J.Mol.Biol.342(2):489-502）。D99QN147H変異体の使用は、3-HPAからの1,3-プロパンジオール生成を2倍増加させた。NADPHに対する増加した触媒効率（増加したKcat/Km）を有する変異体YqhD酵素は、その全体が本明細書に組み入れられるWO 2011012697 A2にも記載されている。
別の例として、キシロースイソメラーゼは、アルドース糖とケトース糖、主として、キシロースとキシルロースおよびグルコースとフルクトースの間の相互変換を触媒する金属依存性酵素である。それは、リキソース糖、アラビノース糖、およびマンノース糖に対してより低い親和性を有する。糖のヒドロキシル基が、糖イソメラーゼの基質の好みを定義し得る。サーマス・サーモフィラスキシロースイソメラーゼの残基256のアスパラギン酸が、アルギニンに交換された（Patel et al.2012 Protein Engineering,Design & Selection vol.25 no.7 pp.331-336）。この変異体キシロースイソメラーゼは、D-リキソース、L-アラビノース、およびD-マンノースに対する特異性の増加を示した。D256Rキシロースイソメラーゼ変異体の、これらの3種類の基質に対する触媒効率も、野生型酵素と比較して高かった。変異体酵素における残基256のアルギニンは、触媒反応において役割を果たすか、または基質配向の変化に影響する可能性があると仮定された。
別の例として、酵素キシリトールデヒドロゲナーゼは、キシロースレダクターゼと共に、キシロースの利用において役割を果たす。キシロースレダクターゼ（XR）が、キシロースをキシリトールに還元し、次いで、キシリトールデヒドロゲナーゼ（XDH）が、キシリトールを再酸化してキシルロースを形成させる。しかしながら、XRは共基質としてNADPHを好むが、XDHは共基質として排他的にNAD+を使用するため、共基質再利用問題に遭遇する。一つの解決策は、共基質特異性がNAD+からNADP+へ変化するよう、XDHを操作することである（Ehrensberger et al., 2006 Structure 14:567-575）。グルコノバクター・オキシダンスのホロ酵素の結晶構造は、Asp38がXDHのNAD+特異性を概して担うことを明らかにした。Asp38が、アデノシンリボースのヒドロキシルと相互作用し、Met39が、プリン環下に積み重なり、2'ヒドロキシルの近くにも位置する。酵素活性を失うことなく、NADP+を排他的に使用する二重変異体（D38S/M39R）XDHが構築された。
別の例として、酵素メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（MVD）は、メバロン酸（MVA）経路において(R)-メバロン酸-5-二リン酸からイソペンテニルピロリン酸（IPP）へのリン酸化/脱炭酸を触媒するATP依存性酵素である。古典的MVA経路において、MVDは、ATPに依存する不可逆的な反応において(R)-メバロン酸-5-二リン酸（MVAPP）からIPPを生成する最終段階を触媒する。MVAPPは、最初にリン酸化され、結果として生じる脱炭酸が、無機リン酸の同時放出と共に起こる。同じ機構で、古典的MVDはまた、非リン酸化3-ヒドロキシイソ吉草酸（3-HIV）からイソブテンへの変換を触媒する。3-ホスホノオキシイソ吉草酸からイソブテンへの変換に改善された活性を有するメバロン酸二リン酸（MDP）デカルボキシラーゼバリアントは、例えば、WO2012052427およびWO2015004211に開示されており、これらの各々は、その全体で本明細書に組み入れられる。
代謝工学 － 経路フラックスの増加のための酵素の過剰発現または酵素のダウンレギュレーション/欠失
本明細書中に記載された様々な態様において、本明細書中に記載された生合成経路に関与する外来性および内在性の酵素は、組換え微生物において過剰発現され得る。
「過剰発現された」または「過剰発現」という用語は、基底レベルのmRNAを発現するかまたは基底レベルのタンパク質を有する類似の対応する未改変細胞と比較した、タンパク質をコードするmRNAのレベルの上昇（例えば、異常レベル）、および/または細胞内のタンパク質のレベルの上昇をさす。具体的な態様において、mRNAまたはタンパク質は、遺伝子mRNA、タンパク質、および/または活性の増加を示すよう操作された微生物において、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍、15倍、またはそれ以上、過剰発現され得る。
いくつかの態様において、本開示の組換え微生物は、D-リボース-5-リン酸、グリコールアルデヒド、D-グリセルアルデヒド3-リン酸、D-キシルロース、D-リブロース、D-リブロース-1-リン酸、D-キシルロース-1-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、D-キシルロース-5-リン酸、D-キシロノラクトン、D-キシロン酸、2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸、グリコールアルデヒド、DHAP、ピルビン酸、アセトアセチルCoA、アセト酢酸または3-ヒドロキシイソ吉草酸などの基質を合成する酵素能力を含有する宿主から作製される。いくつかの態様において、例えば、D-リボース-5-リン酸、グリコールアルデヒド、D-グリセルアルデヒド3-リン酸、D-キシルロース、D-リブロース、D-リブロース-1-リン酸、D-キシルロース-1-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、D-キシルロース-5-リン酸、D-キシロノラクトン、D-キシロン酸、2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸、グリコールアルデヒド、DHAP、ピルビン酸、アセトアセチルCoA、アセト酢酸または3-ヒドロキシイソ吉草酸の合成または蓄積を増加させて、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生成を増加させるために有用であることができる。
いくつかの態様において、例えば、D-リボース-5-リン酸、グリコールアルデヒド、D-グリセルアルデヒド3-リン酸、D-キシルロース、D-リブロース、D-リブロース-1-リン酸、D-キシルロース-1-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、D-キシルロース-5-リン酸、D-キシロノラクトン、D-キシロン酸、2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸、グリコールアルデヒド、DHAP、ピルビン酸、アセトアセチルCoA、アセト酢酸または3-ヒドロキシイソ吉草酸からのフラックスを増加させるためのMEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生合成経路に関与する内在性または外来性の酵素の発現を増加させ、それによって、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との合成または蓄積の増加をもたらすことが有用であり得る。
合成または蓄積の増加は、例えば、上記のMEG（もしくはGA）の1つもしくは複数、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生合成経路酵素をコードする核酸の過剰発現によって達成することができる。MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との1つまたは複数の生合成経路酵素の過剰発現は、例えば、1つもしくは複数の内在性遺伝子の発現増加を通じて、または1つもしくは複数の外来性遺伝子の発現もしくは発現増加を通じて、起こすことができる。従って、天然に生じる生物は、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生合成経路酵素をコードする1つまたは複数の核酸分子の過剰発現を通じて、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成する非天然微生物を作製するために容易に改変することができる。加えて、天然に存在しない生物は、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生合成経路中の酵素の活性に増加をもたらす内在性遺伝子の変異誘発によって作製することができる。
本開示の組換え微生物は、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成するのに十分な量で、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生合成経路酵素をコードする少なくとも1種類の核酸を外因的に発現するように、上記に例示したような当技術分野において周知の方法を用いて構築することができることから、本開示を与えられた当業者は、本明細書において記載された組換え微生物を容易に構築することができる。
天然に存在しない、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物とを生成する、宿主を構築し、その発現レベルを試験する方法は、例えば当技術分野において周知の組換えおよび検出の方法によって実施することができる。そのような方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubo et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1999)に記載されるように見出すことができる。
外来性または内在性の遺伝子を発現させるかまたは過剰発現させるため、当技術分野において公知の多様な機構を使用することができる。例えば、宿主生物において機能性の発現調節配列に機能的に連結された、本明細書中に例示される核酸をコードする1つもしくは複数のMEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生合成経路酵素を保有するよう、1つまたは複数の発現ベクターを構築することができる。本発明の微生物宿主生物において使用するために適用可能な発現ベクターには、例えば、宿主染色体への安定的な組み込みのために機能性のベクターおよび選択配列またはマーカーを含む、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、および人工染色体が含まれる。例えば、抗生物質もしくは毒素に対する耐性を提供するか、栄養要求の欠乏を補完するか、または培養培地中に存在しない重要栄養素を供給する選択可能マーカー遺伝子も、含まれることができる。発現調節配列には、当技術分野において周知の構成性プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーター等が含まれることができる。2種類以上の外来性のコード核酸を共発現させたい時には、例えば、単一の発現ベクターに、または別々の発現ベクターに、両核酸を挿入することができる。単一ベクター発現の場合、コード核酸は、1個の共通の発現調節配列に機能的に連結されることができ、または1個の誘導性プロモーターおよび1個の構成性プロモーターのような異なる発現調節配列に連結されることができる。代謝経路または合成経路に関与する外来性の核酸配列の形質転換は、当技術分野において周知の方法を使用して確認することができる。
当業者によって理解されるように、特定の宿主におけるその発現を増強するため、コード配列を改変することが有利であることができる。遺伝暗号は64種類の可能なコドンを含み重複しているが、大部分の生物は、典型的には、これらのコドンのサブセットを使用する。種において最も高頻度に利用されるコドンは、最適コドンと呼ばれ、さほど高頻度に利用されないものは、希少または低頻度使用コドンとして分類される。宿主の好ましいコドン使用頻度を反映するため、コドンを置換することができ、そのプロセスは、時に、「コドン最適化」または「種コドンバイアスの調節」と呼ばれる。
例えば、翻訳の速度を増加させるため、または最適化されていない配列から生成される転写物と比較して、より長い半減期のような、望ましい特性を有する組換えRNA転写物を生成するため、特定の原核生物または真核生物の宿主にとって好ましいコドンを含有している最適化されたコード配列（Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:477-508も参照すること）を調製することができる。翻訳終止コドンも、宿主の好みを反映するために改変することができる。例えば、S.セレビシエおよび哺乳動物のための典型的な終止コドンは、それぞれ、UAAおよびUGAである。単子葉植物のための典型的な終止コドンは、UGAであるが、昆虫および大腸菌は、一般的に、UAAを終止コドンとして使用する（Dalphin et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24: 216-218）。
当業者は、遺伝暗号の縮重性のため、多様な核酸配列が、本開示の所定の酵素をコードするために使用できることを認識するであろう。生合成酵素をコードする核酸配列は、本開示の態様を例示するために本明細書中に参照されるに過ぎず、本開示は、本開示の酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を含む。同様に、ポリペプチドは、典型的には、所望の活性を失うこともまたは顕著に失うこともなく、そのアミノ酸配列内の1個または複数個のアミノ酸の置換、欠失、および挿入を許容することができる。本開示は、改変されたポリペプチドまたはバリアントポリペプチドが、参照ポリペプチドの酵素的な同化活性または異化活性を有する限り、本明細書中に記載された特定のタンパク質と異なるアミノ酸配列を有するそのようなポリペプチドを含む。さらに、本明細書に示された核酸配列によってコードされたアミノ酸配列は、本開示の態様を例示するものに過ぎない。
発現調節配列は、当技術分野において公知であり、例えば、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現を提供するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、配列内リボソーム進入部位（IRES）等を含む。発現調節配列は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する（Maniatis et al., Science, 236: 1237-1245 (1987)）。例示的な発現調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol.185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。
様々な態様において、発現調節配列は、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている場合がある。「機能的に連結された」とは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が発現調節配列に結合した時に遺伝子発現が可能になるような方式で、ポリヌクレオチド配列と発現調節配列とが接続されていることを意味する。機能的に連結されたプロモーターは、転写および翻訳の方向に関して、選択されたポリヌクレオチド配列の上流に位置する。機能的に連結されたエンハンサーは、選択されたポリヌクレオチドの上流、内部、または下流に位置することができる。
いくつかの態様において、組換え微生物は、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生成のための生合成経路と競合する経路における反応を触媒する1つまたは複数の内在性酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。
いくつかの態様において、組換え微生物は、ペントースリン酸経路の酸化的分岐における1つまたは複数の内在性酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。いくつかの態様において、操作は、ペントースリン酸経路の酸化的分岐を経由するグルコース-6-リン酸の変換を妨げ、代わりに、グルコース-6-リン酸を、ペントースリン酸経路の非酸化的分岐を経由して切り換えて、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生成に必要なペントース-リン酸中間体を生成する。ペントース-リン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース5-リン酸である。いくつかのそのような態様において、1つまたは複数の内在性酵素は、グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼより選択される。さらなる態様において、グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼはzwfであり、6-ホスホグルコノラクトナーゼはpglであり、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはgndである。
いくつかの態様において、組換え微生物は、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼを欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。いくつかの態様において、操作は、グリセルアルデヒド3-リン酸から1,3-ビスホスホ-D-グリセリン酸への変換を妨げ、代わりに、トランスケトラーゼによってグリセルアルデヒド3-リン酸をキシルロース-5-リン酸に（フルクトース-6-リン酸からエリトロース-4-リン酸への同時変換と共に）変換できるようにし、したがって、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生成に必要なペントース-5-リン酸中間体を生成し、ペントース-リン酸中間体をさらに生成するためのペントースリン酸経路の非酸化的分岐のためにより多くのエリトロース-4-リン酸を提供する。いくつかの態様において、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼはgapAである。ペントース-リン酸中間体は、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース5-リン酸である。
いくつかの態様において、組換え微生物は、6-ホスホフルクトキナーゼを欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。いくつかの態様において、操作は、フルクトース-6-リン酸から1,6-ビスリン酸への変換を妨げ、代わりに、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼによってフルクトース-6-リン酸をエリトロース-4-リン酸およびアセチル-リン酸に変換できるようにし、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生成に必要なペントース-リン酸中間体をさらに生成するためのペントースリン酸経路の非酸化的分岐のためにより多くのエリトロース-4-リン酸を提供する。いくつかの態様において、6-ホスホフルクトキナーゼはpfkAおよび/またはpfkBである。
いくつかの態様において、組換え微生物は、グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒する1つまたは複数の内在性酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。いくつかのそのような態様において、グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒する酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼである。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは大腸菌由来である。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、aldA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、操作は、グリコールアルデヒドからのグリコール酸の生成を妨げ、代わりに、反応をグリコールアルデヒドからMEGへの変換に切り換える。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒する1つまたは複数の内在性酵素の欠失、破壊、変異、および/またはその活性の低下は、部分的であり、あるグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼの機能はまだ存在し、グリコール酸の量がまだ生成される。
いくつかの態様において、組換え微生物は、ピルビン酸の乳酸への変換を触媒する1つまたは複数の内在性酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。いくつかのそのような態様において、ピルビン酸から乳酸への変換を触媒する酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼである。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、ldhA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、操作は、ピルビン酸からの乳酸の生成を妨げ、代わりに、MEG（もしくはGA）、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物の生成に向けて反応を切り替える。
いくつかの態様において、組換え微生物は、グリコールアルデヒドのモノエチレングリコール（MEG）への変換を触媒する1つまたは複数の内在性酵素の活性を欠失させ、破壊し、変異させ、かつ/または低下させ、その代わりに、グリコールアルデヒドのグリコール酸（GA）への変換に向かって反応をシャントするため、操作される。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌由来である。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、fucO遺伝子またはその相同体によってコードされる。
上記の詳細な説明は、理解の明確のために与えられているに過ぎず、当業者には修飾が明らかであるため、それらから不必要な限定が理解されるべきではない。
本開示は、その具体的な態様に関して記載されてきたが、さらなる修飾が可能であることが理解され、本願は、一般に、本開示の原理に従う、本開示の任意の変動、使用、または適応をカバーし、本開示が属する技術分野において公知のまたは慣習的な実務に含まれるような本開示からの逸脱、本明細書に記載の本質的な特徴に適用され得るような本開示からの逸脱、および添付の特許請求の範囲の範囲に従うような本開示からの逸脱を含むものであることが理解されるであろう。
本明細書に引用された特許、特許出願、および刊行物の各々の全ての特許請求の範囲、図面、および/または図を含む開示は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
実施例1
DERAバリアント、ペントースキナーゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼのための6-hisタグ付き構築物の生成
デオキシ-リボース-5-リン酸アルドラーゼ（DERA）の構築のため、大腸菌（EcDERAまたはEcdeoC、UniProtアクセッション番号P0A6L0）（SEQ ID NO:255）およびバチルス・カルドリチカス（BcDERAまたはBcdeoC、Uniprotアクセッション番号A0A2H5KL15）（SEQ ID NO:286）に由来するDERAをコードする野生型遺伝子が、BcDERA（SEQ ID NO:287）については大腸菌コドンに基づくコドン最適化によって、GenScript（Hong Kong、China）によって合成された。2つのDNA断片は、pET28プラスミドにクローニングされた。
発表されているDERA配列（Heine, A. et al (2001)Observation of covalent intermediates in an enzyme mechanism at atomic resolution. Science 294: 369-374）［1］に基づき、EcDERAアミノ酸配列の47位システインをアルギニンに置換するか（C47N）、またはタンパク質アライメントによって決定されたBcDERAの等価な位置C37をアルギニンに置換するため（C37N）、部位特異的変異誘発を実施した（図8）。これらの部位が、DERA活性を改善するために選択されたのは、EcDERAのC47およびBcDERAのC47が、活性部位の近くに位置しているためである。部位特異的変異誘発は、製造業者の手順に従って、表2のプライマー（変異コドンは下線付き）および（Thermo Scientific製の）Phusion Site-Directed Mutagenesis Kitを使用して実施された。陰性対照として、EcDERAの201位またはBcDERAの等価な位置、181位において、触媒性リジンを、表2のプライマーを使用して、アスパラギンに変異させることによって（EcDERAについては変異K201NまたはEcDERAについてはK181N）、不活性DERAを構築した。全ての野生型配列および特異的変異の導入が、配列決定（Eurogentec）によって分析され、バリデートされた。
ペントースキナーゼ、リボキナーゼ（rbsK）（SEQ ID NO:290）、キシルロキナーゼ（Xuk）（SEQ ID NO:291）、およびリブロキナーゼ（AraB）（SEQ ID NO:288）は、起源生物由来のゲノムDNAおよび表2のPCRプライマーを使用して得られた。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、大腸菌のゲノムDNAおよび表2のプライマーを使用して得られた。
（表２）標的遺伝子を得るために使用されたDNAの起源およびプライマー
Figure 2022521905000086
タンパク質の発現および精製
新鮮に調製された大腸菌細胞（DE3、New England Biolabs）を、タンパク質発現のために使用した。細菌培養は、50μg/mLのカナマイシンが補足されたリッチ培地LB（酵母抽出物5g/L、トリプトン10g/L、NaCl 10g/L）における一晩の前培養物から、0.05のOD600nmで開始された。次いで、OD600nmが0.6/0.8に達した時、0.5mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を培養培地に添加することによって、タンパク質発現を誘導した。培養は30℃で行われ、発現は4時間誘導された。発現後、大腸菌細胞を遠心分離によって採集し、細胞ペレットを、使用するまで、-20℃で維持した。発現されたタンパク質を回収し、精製するため、凍結ペレットを、結合緩衝液（HEPES 50mM、pH 7.4、NaCl 300mM）に再懸濁させ、超音波処理し（30秒オン/30秒オフを4サイクル、出力30％、Fisher scientific製のマイクロチップ、モデルFB505）、次いで、4℃で15分間、20.000gで遠心分離した。製造業者の推奨に従って、タグ付きhis-タンパク質を精製するため、上清をHis Spintrap TALON（Merck）スラリー溶液と混合した。全てのタンパク質純度をSDS-PAGEでチェックしたところ、予想されたサイズの主要バンドが示され、タンパク質の純度が90％を超えることが示唆された。溶出緩衝液中の精製タンパク質を、10kDa Amicon Ultra Centrifugal Filter（Merck）を使用して、DERAタンパク質酵素アッセイについては、HEPES 50mM、pH 7、KCl 100mM、MgCl2 5mMに交換し、PGM3タンパク質酵素アッセイについては、HEPES 60mM、pH 7.5、KCl 60mM、MgCl2 3mMに交換した。
インビトロペントースキナーゼ活性アッセイ
前記のように精製されたペントースキナーゼ（リボキナーゼ（rbsK）、リブロキナーゼ（AraB）、およびキシルロキナーゼ（XuK））は、生成されたADPの、ピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを使用したNADH酸化との酵素的共役によって、それぞれのペントースに対してアッセイされた（図9および図14）。反応混合物は、HEPES 50mM、pH 7、KCl 100mM、MgCl2 5mM、適切な量の糖キナーゼ、ATP 2mM、NADH 0.25mM、一連のペントース濃度、ホスホ-エノール-ピルビン酸 2mM、2U/mLの市販のピルビン酸キナーゼ（PK）および乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）を含有していた（全ての生成物がMerckから購入された）。
rbsK、キシルロキナーゼ（XuK）、またはAraBについてのペントース基質によるミカエリスメンテン曲線を示すアッセイの結果は、それぞれ、図10、図11、および図12に示される。初速度が、基質濃度の関数としてプロットされる。結果は、発現され精製されたキナーゼの各々が、それぞれのペントース基質に対してキナーゼ活性を示したことを示している。
インビトロDERAバリアント活性アッセイ
DERAバリアントのインビトロ酵素アッセイは、酵素共役法によって実施された。図13は、DERAの天然基質、2-デオキシ-リボース-5Pを使用して実施されたDERAアッセイのスキームを示す。図14は、上流キナーゼ反応に由来するペントース-5P基質を使用して実施されたDERAアッセイのスキームを示す。アッセイは、グリセロール-3-Pデヒドロゲナーゼ（GPDH）によるジヒドロキシアセトン3-P（DHAP）のグリセロール-3Pへの変換に起因するNADHの酸化をOD340nmにおいて測定することによって、モニタリングされた。反応は、37℃で分光光度的に追跡された。
天然基質を使用した反応について、混合物は、HEPES 50mM、pH 7.0：KCl 100mM、MgCl2 5mM、NADH 0.25mM、2-デオキシ-リボース-5P 5mM、2U/mLの市販のトリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）およびグリセロール-3-Pデヒドロゲナーゼ（GPDH）、ならびに適切な量のDERAバリアントタンパク質を含有していた。
キナーゼ由来のペントース-5P基質を使用した反応について、ペントースは、リボース、リブロース、またはキシルロースのいずれかであった。アッセイは、図14のスキームに従って実施され、混合物は、HEPES 50mM、pH 7.0：KCl 100mM、MgCl2 5mM、NADH 0.25mM、2U/mLの市販のトリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）、グリセロール-3-Pデヒドロゲナーゼ（GPDH）、適切な量のDERAバリアントタンパク質、5mMペントース（リボース、リブロース、またはキシルロース）、適切な量の特定のキナーゼ（即ち、rbsK、AraB、またはXuK）、および2.5～5mMのATPを含有していた。
DERAバリアントについてのインビトロアッセイは、天然基質、2-デオキシ-リボース-5Pについての酵素活性に対するDERAタンパク質の変異の影響を証明する。DERAバリアントの活性の各々についてのミカエリスメンテン速度論を示す結果は、図15、図16、図17、図18、図19、および図20に示される。市販の野生型DERA酵素（図15）、合成された野生型EcDERA酵素（図16）、および合成されたBcDERA酵素（図17）についての比活性を決定した。合成されたEcDERA C47Nバリアント（図18）は、野生型EcDERA酵素と比べて低下した活性を保持していた。同様に、合成されたBcDERA C47Nバリアント（図19）は、WT BcDERA酵素と比べて低下した活性を保持していた。陰性対照EcDERA K201Nバリアントは、予想通り、活性を示さなかった（図20）。
表3は、上流ペントースキナーゼによって生成された基質、リボース-5P、リブロース-5P、およびキシルロース-5Pのグリセルアルデヒド-3Pへの酵素的変換、ならびにその後のDHAPおよびグリセロール-3Pへの変換に対する、DERAタンパク質の変異の影響を証明する、DERAバリアントについてのインビトロアッセイの結果を示している。結果は、DERAの変異型が、グリセルアルデヒド-3Pの生成ならびにその後のDHAPおよびグリセロール-3Pへの変換の速度を低下させることを示唆している。
（表３）標的ペントース-5-P中間体に対するDERA活性、ならびにペントース-5PのグリコールアルデヒドおよびG3Pへの変換に対するDERA変異の影響を証明する結果。DERAタンパク質のDERA比活性。Vmaxは、5mMの初期基質濃度によって推定された。
Figure 2022521905000087
aldAについてのインビトロ酵素アッセイ
NADH形成を直接モニタリングすることによって、図21のスキームに従って、AldAタンパク質を、その天然基質、グリコールアルデヒドに対して試験した。反応混合物は、HEPES 50mM、pH 7、KCl 100mM、MgCl2 5mM、適切な量のaldAタンパク質、NAD+ 2.5mM、グリコールアルデヒド 5mMを含有していた（NAD+はMerckから購入された）。
図22の結果は、組換えaldA酵素の比活性が、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換するための活性を保持していたことを証明している。
DERAを使用したペントースおよびペントース-5P中間体からのGA生成のインビトロバリデーション
この酵素アッセイは、DERA酵素およびそのバリアントの使用および依存による、ペントース（リボース、リブロース、またはキシルロース）およびペントース-5P中間体（リボース-5P、リブロース-5P、またはキシルロース-5P）からのグリコール酸のインビトロの生成を確認するため、設計された（図23）。酵素アッセイは、HEPES緩衝液50mM、pH 7.0、KCl 100mM、MgCl2 5mM、NADH 3mM、ATP＊Mg 15mM、ペントース（リボース、リブロース、またはキシルロース）20mMの反応混合物においてセットアップされた。反応混合物は、各0.2mg/mLの精製されたリボキナーゼ（リボース含有反応のため）、リブロキナーゼ（リブロース含有反応のため）、またはキシルロキナーゼ（キシルロース含有反応のため）、および0.25mg/mLの精製されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aldA）、2U/mLのTPIおよびGPDHの混合物（Merck製のTPI/GPDH）、ならびに2.5mg/mLの精製されたDERAタンパク質の添加によって完成された。37℃で24時間、反応が実施された。反応後、0.5mL/分で、2.5mM H2SO4を移動相として使用して、50℃で、RI検出器、205nmにおけるUV検出器、およびPhenomenexカラム（Rezex H+）を備えたThermo Fisher Scientific系（Courtaboeuf、France）を使用した高速液体クロマトグラフィによって、ペントースおよびグリコール酸の濃度を測定した。インビトロバリデーション実験からの結果は、表4、表5、および表6に与えられる。図23のスキームによるキシルロースまたはリブロースからのグリコール酸の生成について、EcDERA C47Nバリアントは、EcDERA WTと比較して、グリコール酸の生成を増加させた。キシルロース、リブロース、またはリボースからのグリコール酸の生成について、BcDERA C37Nは、BcDERA WTと比較して、グリコール酸の低下した生成を保持していた。予想通り、陰性対照バリアントEcDERA K201NおよびBcDERA K181Nは、ペントースからグリコール酸を生成する有意な能力を保持していなかった。結果は、DERA酵素候補の使用による、ペントース糖からの、即ち、リボース、リブロース、およびキシルロースからのグリコール酸のインビトロ生成を証明している。従って、結果は、D-リボース-5P、D-リブロース-5P、およびD-キシルロース-5Pのような標的ペントース-5P中間体に対するDERA活性も証明し、そのようなペントース-5P中間体をグリコールアルデヒドおよびG3Pへ変換するDERAの能力をバリデートした。
（表４）キシルロースからのGA生成についてのインビトロバリデーションアッセイからの結果
Figure 2022521905000088
（表５）リブロナーゼからのGA生成についてのインビトロバリデーションアッセイからの結果
Figure 2022521905000089
（表６）リボースからのGA生成についてのインビトロバリデーションアッセイからの結果
Figure 2022521905000090
実施例2
大腸菌におけるDERAを使用したグリコール酸生成についてのインビボアッセイ
インビボでのグリコール酸（GA）生成のためのDERA使用の実行可能性を査定するため、遺伝子型MG1655ΔtktA-ΔtktBを有するスクリーニング大腸菌株の使用に基づくアッセイを開発した。図24に記載されるように、そのような株は、トランスケトラーゼ遺伝子tktA（GenBank Gene ID：947420）およびtktB（GenBank Gene ID：945865）の欠失のため、それ自体、キシロースで増殖することができない。しかしながら、活性DERAタンパク質を発現する株は、炭素5においてリン酸化されたペントース（ペントース-5P）を使用して、グリコールアルデヒドおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸を生成することができる。グリコールアルデヒドおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸は、グリオキシル酸シャントおよび解糖に流入して、株の増殖を支持することができる。従って、スクリーニング株におけるインビボDERA活性は、細胞増殖と直接相関する。
tktAおよびtktBの欠失
tktAおよびtktBの欠失を、大腸菌MG1655野生型株において連続的に実施した。最初に、両方とも、Keio single-gene deletion collection（Baba T, et al.(2006)Construction of E. Coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutations: the Keio collection. Mol Sys Biol. 2: 2006 0008）から得られた、MG1655ΔtktA：KanR株JW5478およびMG1655ΔtktB：KanR株JW2449を使用して、標準的な手順（Thomason LC, et al. (2007) E.Coli genome manipulation by P1 transduction. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 1:Unit 1 17）による形質導入によって、tktAおよびtktBの欠失を実施した。形質転換体を、100μg/mlカナマイシンが補足されたLB寒天上で選択し、コロニーPCRおよび配列決定によって同定した。さらに、文献（Datsenko KA and Wanner BL(2000)One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645）に以前に記載されたような、Flp組換えを使用したFTR領域の特異的組換えによって、抗生物質マーカーの除去を実施した。得られた株を、DERA_スクリーニング_01:MG1655ΔtktA-ΔtktBと命名した。
DERA C47N変異体の入手
大腸菌由来のDERA（UniProtアクセッション番号P0A6L0）が、GenScript（Hong Kong、China）によって合成され、pET28ベクターにクローニングされた。次いで、製造業者の手順に従って、Phusion Site-Directed Mutagenesis（登録商標）キット（Thermo Scientific（商標））を使用して、表7に記載されたプライマーに従って、点変異を導入するため、部位特異的変異誘発が使用された。EcDERA C47N（SEQ ID NO:294）変異体は、配列決定によってさらに確認された。
（表７）部位特異的変異誘発のために使用されたオリゴヌクレオチド。変異部位は太字である。
Figure 2022521905000091
細胞増殖ベースのスクリーニング株におけるDERA発現のためのプラスミド構築
スクリーニング株においてDERAを発現させるため、最初に、PLtetO-1プロモーターをJ23119（SEQ ID NO:293）またはJ23101（SEQ ID NO:292）構成性プロモーター（http://parts.igem.org/Promoters/Catalog/Anderson）に置換することによって、pZS21プラスミド（Expressys）を改変した。J23119プロモーターおよびJ23101プロモーターは、いずれも、GeneWiz（登録商標）（Leipzig、Germany）によって合成された合成遺伝子断片として得られた。合成プロモーターを、表8に詳述されたプライマーを使用して、PCRによって増幅した。その後、それらを、製造業者のプロトコルに従って、NEBuilder（登録商標）HiFi DNA Assembly Cloningキット（New England Biolabs）を使用することによって、AatIIおよびKpnIによる酵素的制限によって直鎖化されたpZS21プラスミドにクローニングした。構築は、PCRおよび配列決定によって確認された。得られたプラスミドを、それぞれ、pZS2-J23119およびpZS2-J23101と名付けた。
DERAのより高いコピー数を発現させるため、2つのプラスミドを、pZA21プラスミド（Expressys）から回収されたp15A複製開始点によって改変した。pZS2-J23119（またはpZS2-J23101）由来のプロモーターおよびカナマイシンマーカーを含有する断片を、表8に記載されたプライマーを使用して、pZA21のp15A開始点およびマルチプルクローニングサイトを含有する断片と共に、PCRによって増幅した。DNA断片を機能性プラスミドへと組換えるため、In-Fusion（登録商標）HD Cloningキット（Clontech）を、製造業者のプロトコルに従って使用した。得られたプラスミドを、それぞれ、pZA2-J23119およびpZA2-J23101と名付けた。
EcDERA C47Nバリアントを、表8に記載されたプラスミドを使用して、PCRによって増幅した。その後、製造業者のプロトコルに従って、In-Fusion（登録商標）HD Cloningキット（Clontech）を使用することによって、KpnIによる酵素的制限によって直鎖化されたpZA2-J23119およびpZA2-J23101のいずれかに、それをクローニングした。構築は、PCRおよび配列決定によって確認された。得られたプラスミドを、それぞれ、pZA2-J23119-DERA（SEQ ID NO:295）およびpZA2-J23101-DERA（SEQ ID NO:296）と名付けた。
（表８）プラスミドpZS2-J23119、pZS2-J23101、pZA2-J23119、pZA2-J23101、pZA2-J23119-DERA、およびpZA2-J23101-DERAの構築のために使用されたオリゴヌクレオチド。結合領域は下線付きである。
Figure 2022521905000092
大腸菌DERA C47Nバリアントを使用したMG1655ΔtktA-ΔtktBの増殖についてのインビボアッセイ
標準的な手順（Woodall C. A. E.coli Plasmid Vectors. Methods in Molecular Biology（商標）2003. vol 235. doi: 10.1385/1-59259-409-3: 55）を使用して、スクリーニング株DERA_スクリーニング_01（MG1655ΔtktA-ΔtktB）を、pZAP2-J23119-DERAプラスミドもしくはpZAP2-J23101-DERAプラスミドのいずれか、または空ベクターによって、電気穿孔によって形質転換した。得られた株を、M9キシロース培地（20g/Lキシロース）において50時間増殖させた。カナマイシンを、100μg/mLの最終濃度で添加した。OD600によって、増殖をモニタリングした。
増殖アッセイの結果は、図25に示される。pZA2-J23119-DERA（J23119DERA）またはpZA2-J23101-DERA（J23101DERA）を含有するMG1655ΔtktA-ΔtktB株は、それぞれの対照と比較して、増強された増殖を示した。J23119 DERAは、J23101 DERAと比較して増強された増殖を示した。総合すると、結果は、MG1655ΔtktA-ΔtktB株において発現されたEcDERA C47Nバリアントが、キシロース最小培地において培養された時に、増殖を可能にすることを示唆している。
列挙された態様
態様1．
ペントースリン酸中間体を介して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成する1つまたは複数の生化学的経路を含む組換え微生物であって、1つまたは複数の生化学的経路が、ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、組換え微生物。
態様2．
ペントースリン酸中間体がD-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸であり、酵素がD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼ活性、またはD-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する、態様1の組換え微生物。
態様3．
モノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を同時生成する、前記態様の組換え微生物。
態様4．
1つまたは複数の同時生成物がアセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン、またはそれらの組み合わせより選択される、前記態様の組換え微生物。
態様5．
1つまたは複数の生成物がモノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される、前記態様の組換え微生物。
態様6．
1つまたは複数の生化学的経路が、トランスケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、前記態様の組換え微生物。
態様7．
トランスケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のtktAまたはtktBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、前記態様の組換え微生物。
態様8．
ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のdeoCに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、前記態様の組換え微生物。
態様9．
1つまたは複数の生化学的経路が、トランスアルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、前記態様の組換え微生物。
態様10．
トランスアルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のtalAまたはtalBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、前記態様の組換え微生物。
態様11．
1つまたは複数の生化学的経路が、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、前記態様の組換え微生物。
態様12．
リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のrpeに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、前記態様の組換え微生物。
態様13．
1つまたは複数の生化学的経路が、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、前記態様の組換え微生物。
態様14．
リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のrpiAまたはrpiBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、前記態様の組換え微生物。
態様15．
グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、およびホスホグリセリン酸ムターゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性の欠失または減少をさらに含む、前記態様の組換え微生物。
態様16．
グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼがgapAであり、ホスホグリセリン酸キナーゼがpgkであり、ホスホグリセリン酸ムターゼがgpmAおよび/またはgpmMである、前記態様の組換え微生物。
態様17．
1つまたは複数の生化学的経路が、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、前記態様の組換え微生物。
態様18．
フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、ビフィドバクテリウム・デンチウムBDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクチスxfp、ラクトバチルス・パラプランタラムxpkA、およびビフィドバクテリウム・ブレベxfpより選択されるフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、前記態様の組換え微生物。
態様19．
1つまたは複数の生化学的経路が、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、前記態様の組換え微生物。
態様20．
リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリカムptaより選択されるリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、前記態様の組換え微生物。
態様21．
内在性6-ホスホフルクトキナーゼ酵素の活性の欠失または減少をさらに含む、前記態様の組換え微生物。
態様22．
6-ホスホフルクトキナーゼがpfkAおよび/またはpfkBである、前記態様の組換え微生物。
態様23．
グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性の欠失または減少をさらに含む、前記態様の組換え微生物。
態様24．
グルコース6-リン酸1-デヒドロゲナーゼがzwfであり、6-ホスホグルコノラクトナーゼがpglであり、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼがgndである、前記態様の組換え微生物。
態様25．
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がD-キシロースを含み、組換え微生物が、キシロースイソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現およびキシルロース5-キナーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現をさらに含む、前記態様の組換え微生物。
態様26．
キシロースイソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌またはピロミセス属の種に由来するxylAに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、前記態様の組換え微生物。
態様27．
キシルロース5-キナーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のxylBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、前記態様の組換え微生物。
態様28．
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がD-フルクトースを含み、組換え微生物が、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現をさらに含む、前記態様の組換え微生物。
態様29．
フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のfbpに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、前記態様の組換え微生物。
態様30．
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖が、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得る、前記態様の組換え微生物。
態様31．
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖が、モノマー、オリゴマー、またはそれらの組み合わせから構成される、前記態様の組換え微生物。
態様32．
トランスケトラーゼ活性および/またはフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現、ならびにペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現が、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い変換、ならびにその後のD-リボース-5-リン酸のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換を可能にする、前記態様の組換え微生物。
態様33．
MEGまたはGAが、C2経路におけるグリコールアルデヒドの変換および1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して生成される、前記態様の組換え微生物。
態様34．
MEGが、C2経路におけるグリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの還元によって生成される、前記態様の組換え微生物。
態様35．
GAが、C2経路におけるグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの酸化によって生成される、前記態様の組換え微生物。
態様36．
MEGまたはGAの生成のための少なくとも1つの酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、グリセリン酸デカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、およびグリオキシル酸レダクターゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択される、前記態様の組換え微生物。
態様37．
MEGがC2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通して生成され、1つまたは複数の同時生成物が1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して生成される、前記態様の組換え微生物。
態様38．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がアセトンを含む、前記態様の組換え微生物。
態様39．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がイソプロパノールを含む、前記態様の組換え微生物。
態様40．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性、およびデヒドラターゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がプロペンを含む、前記態様の組換え微生物。
態様41．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）シンターゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ活性、メチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ活性、メチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ活性、メチルクロトニル-CoAヒドラターゼ活性、3-ヒドロキシイソバレリル-CoAチオエステラーゼ活性、3HIVキナーゼ活性、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性、および3HIVデカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がイソブテンを含む、前記態様の組換え微生物。
態様42．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、およびグリセリン酸2-キナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がL-セリンを含む、前記態様の組換え微生物。
態様43．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性、グリシン開裂系に関連した活性、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性、アラニントランスアミナーゼ活性、NAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がグリシンを含む、前記態様の組換え微生物。
態様44．
グリシン開裂系に関連した活性が、グリシンデカルボキシラーゼ（Pタンパク質）、アミノメチルトランスフェラーゼ（Tタンパク質）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Lタンパク質）、およびHタンパク質より選択される酵素またはタンパク質を含む、前記態様の組換え微生物。
態様45．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、トランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、およびエタノールアミンアンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がモノエタノールアミン（MEA）を含む、前記態様の組換え微生物。
態様46．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、セリンデヒドロゲナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、アルデヒドオキシダーゼ活性、N-アセチルトランスフェラーゼまたはO-アセチルトランスフェラーゼ活性、N-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性、トランスアミナーゼ活性、デアセチラーゼ活性、セリンアミナーゼ活性、および2,3-ジアミノプロパン酸アンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がエチレンジアミン（EDA）を含む、前記態様の組換え微生物。
態様47．
グリコールアルデヒドレダクターゼ、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはそれらの組み合わせの活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変をさらに含む、前記態様の組換え微生物。
態様48．
C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部がC2経路における還元当量源として使用される、前記態様の組換え微生物。
態様49．
C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部がATPを生成するために使用される、前記態様の組換え微生物。
態様50．
過剰のバイオマス形成が最小化され、MEGまたはGA、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生成が最大化される、前記態様の組換え微生物。
態様51．
前記態様のいずれかの組換え微生物を使用して、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成する方法であって、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物が生成されるまで、炭素源を供給する1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖を含有する培養培地において組換え微生物を培養する工程を含む方法。
態様52．
組換え微生物がモノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を同時生成する、前記態様の方法。
態様53．
1つまたは複数の同時生成物がアセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン（EDA）、またはそれらの組み合わせより選択される、前記態様の方法。
態様54．
1つまたは複数の生成物がモノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される、前記態様の方法。
態様55．
D-リボース-5-リン酸中間体を介して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積する組換え微生物を作製する方法であって、
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体への変換のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；
ペントースリン酸中間体のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；
C2経路におけるグリコールアルデヒドからの1つまたは複数の生成物の生成のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；ならびに
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pからの1つまたは複数の生成物の生成のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；ならびに
組換え微生物を、1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積するよう、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖を含有する培養培地において培養する工程：を含む方法。
態様56．
組換え微生物がモノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を同時生成する、前記態様の方法。
態様57．
1つまたは複数の同時生成物がアセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン、またはそれらの組み合わせより選択される、前記態様の方法。
態様58．
1つまたは複数の生成物がモノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される、前記態様の方法。
態様59．
グリコールアルデヒドがグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼによってグリコール酸へ酸化される、前記態様の方法。
態様60．
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体への変換のための1つまたは複数の酵素が、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性、およびリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素より選択される、前記態様の方法。
態様61．
グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（gapA）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（pgk）、ならびにホスホグリセリン酸ムターゼ（gpmAおよび/またはgpmM）より選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、前記態様の方法。
態様62．
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体への変換のための1つまたは複数の酵素が、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性、およびリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素より選択される、前記態様の方法。
態様63．
内在性6-ホスホフルクトキナーゼ（pfkAおよび/またはpfkB）酵素の活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、前記態様の方法。
態様64．
ペントースリン酸中間体のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換のための1つまたは複数の酵素が、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素である、態様54～62のいずれか1つの方法。
態様65．
グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、前記態様の方法。
態様66．
グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼがzwfであり、6-ホスホグルコノラクトナーゼがpglであり、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼがgndである、前記態様の方法。
態様67．
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がD-キシロースを含み、
前記方法が、
D-キシロースのD-キシルロースへの変換のためのキシロースイソメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；および
D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換のためのキシルロース5-キナーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程
をさらに含む、前記態様の方法。
態様68．
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がD-フルクトースを含み、組換え微生物が、D-フルクトース1,6-ビスリン酸のD-フルクトース6-リン酸への変換のためのフルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させることをさらに含み、D-フルクトースが組換え微生物の内在性酵素によってフルクトース1,6-ビスリン酸へ変換される、前記態様の方法。
態様69．
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖が組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得る、前記態様の方法。
態様70．
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がモノマー、オリゴマー、またはそれらの組み合わせから構成される、前記態様の方法。
態様71．
トランスケトラーゼ活性および/またはフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素の発現、ならびにペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素の発現が1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い変換、ならびにその後のD-リボース-5-リン酸のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換を可能にする、前記態様の方法。
態様72．
MEGまたはGAが、C2経路におけるグリコールアルデヒドの変換および1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して生成される、前記態様の方法。
態様73．
MEGが、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの還元によって生成される、前記態様の方法。
態様74．
GAが、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの酸化によって生成される、前記態様の方法。
態様75．
MEGまたはGAの生成のための1つまたは複数の酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、グリセリン酸デカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、およびグリオキシル酸レダクターゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択される、前記態様の方法。
態様76．
MEGがC2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通して生成され、1つまたは複数の同時生成物が1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して生成される、前記態様の方法。
態様77．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がアセトンを含む、前記態様の方法。
態様78．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がイソプロパノールを含む、前記態様の方法。
態様79．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性、およびデヒドラターゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がプロペンを含む、前記態様の方法。
態様80．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）シンターゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ活性、メチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ活性、メチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ活性、メチルクロトニル-CoAヒドラターゼ活性、3-ヒドロキシイソバレリル-CoAチオエステラーゼ活性、3HIVキナーゼ活性、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性、および3HIVデカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がイソブテンを含む、前記態様の方法。
態様81．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、およびグリセリン酸2-キナーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がL-セリンを含む、前記態様の方法。
態様82．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性、グリシン開裂系に関連した活性、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性、アラニントランスアミナーゼ活性、NAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がグリシンを含む、前記態様の方法。
態様83．
グリシン開裂系に関連した活性が、グリシンデカルボキシラーゼ（Pタンパク質）、アミノメチルトランスフェラーゼ（Tタンパク質）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Lタンパク質）、およびHタンパク質より選択される酵素またはタンパク質を含む、前記態様の方法。
態様84．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、トランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、およびエタノールアミンアンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がモノエタノールアミン（MEA）を含む、前記態様の方法。
態様85．
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、セリンデヒドロゲナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、アルデヒドオキシダーゼ活性、N-アセチルトランスフェラーゼまたはO-アセチルトランスフェラーゼ活性、N-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性、トランスアミナーゼ活性、デアセチラーゼ活性、セリンアミナーゼ活性、および2,3-ジアミノプロパン酸アンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がエチレンジアミン（EDA）を含む、前記態様の方法。
態様86．
グリコールアルデヒドレダクターゼ、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはそれらの組み合わせの活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、前記態様の方法。
態様87．
C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部がC2経路における還元当量源として使用される、前記態様の方法。
態様88．
C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部がATPを生成するために使用される、前記態様の方法。
態様89．
過剰のバイオマス形成が最小化され、MEGまたはGA、またはMEGとび1つもしくは複数の同時生成物との生成が最大化される、前記態様の方法。
さらに別の局面において、本願は、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体への変換のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；D-リボース-5-リン酸中間体のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；C2経路におけるグリコールアルデヒドからの1つまたは複数の生成物の生成のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；ならびに1つまたは複数のC3経路におけるG3Pからの1つまたは複数の生成物の生成のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；ならびに組換え微生物を、1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積するよう、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖を含有する培養培地において培養する工程を含む、D-リボース-5-リン酸中間体を介して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積する組換え微生物を作製する方法を提供する。いくつかの態様において、組換え微生物は、モノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を同時生成する。さらなる態様において、1つまたは複数の同時生成物は、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン（EDA）、またはそれらの組み合わせより選択される。さらなる態様において、1つまたは複数の生成物は、モノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される。
[本発明1001]
ペントースリン酸中間体を介して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成する1つまたは複数の生化学的経路を含む、組換え微生物であって、
1つまたは複数の生化学的経路が、ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、
組換え微生物。
[本発明1002]
ペントースリン酸中間体が、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸であり、酵素が、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼ活性、またはD-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1003]
1つまたは複数の生成物がモノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1004]
モノエチレングリコール（MEG）またはグリコール酸（GA）および1つもしくは複数の同時生成物を同時生成する、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1005]
1つまたは複数の同時生成物が、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン、またはそれらの組み合わせより選択される、本発明1003の組換え微生物。
[本発明1006]
1つまたは複数の生化学的経路が、トランスケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、本発明1001～1005のいずれかの組換え微生物。
[本発明1007]
トランスケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌（E.coli）由来のtktAまたはtktBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、本発明1006の組換え微生物。
[本発明1008]
ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のdeoCのSEQ ID NO:256に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1009]
ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、B.カルドリチカス（caldolyticus）由来のdeoCのSEQ ID NO:298に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1010]
大腸菌由来のdeoCが47位のシステインからアルギニンへの変異（C47N）を含む、本発明1008の組換え微生物。
[本発明1011]
B.カルドリチカス由来のdeoCが37位のシステインからアルギニンへの変異（C37N）を含む、本発明1009の組換え微生物。
[本発明1012]
1つまたは複数の生化学的経路が、トランスアルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、本発明1001～1008のいずれかの組換え微生物。
[本発明1013]
トランスアルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のtalAまたはtalBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、本発明1008の組換え微生物。
[本発明1014]
1つまたは複数の生化学的経路が、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、本発明1001～1012のいずれかの組換え微生物。
[本発明1015]
リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のrpeに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、本発明1012の組換え微生物。
[本発明1016]
1つまたは複数の生化学的経路が、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、本発明1001～1014のいずれかの組換え微生物。
[本発明1017]
リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のrpiAまたはrpiBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、本発明1015の組換え微生物。
[本発明1018]
グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、およびホスホグリセリン酸ムターゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性の欠失または減少をさらに含む、本発明1001～1016のいずれかの組換え微生物。
[本発明1019]
グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼがgapAであり、ホスホグリセリン酸キナーゼがpgkであり、ホスホグリセリン酸ムターゼがgpmAおよび/またはgpmMである、本発明1017の組換え微生物。
[本発明1020]
1つまたは複数の生化学的経路が、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、本発明1001～1015のいずれかの組換え微生物。
[本発明1021]
フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Bifidobacterium dentium）BDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクチス（lactis）xfp、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）xpkA、およびビフィドバクテリウム・ブレベ（breve）xfpより選択されるフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、本発明1018の組換え微生物。
[本発明1022]
1つまたは複数の生化学的経路が、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、本発明1018または1019の組換え微生物。
[本発明1023]
リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ptaより選択されるリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、本発明1020の組換え微生物。
[本発明1024]
内在性6-ホスホフルクトキナーゼ酵素の活性の欠失または減少をさらに含む、本発明1001～1015または1018～1021のいずれかの組換え微生物。
[本発明1025]
6-ホスホフルクトキナーゼがpfkAおよび/またはpfkBである、本発明1022の組換え微生物。
[本発明1026]
グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性の欠失または減少をさらに含む、本発明1001～1023のいずれかの組換え微生物。
[本発明1027]
グルコース6-リン酸1-デヒドロゲナーゼがzwfであり、6-ホスホグルコノラクトナーゼがpglであり、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼがgndである、本発明1024の組換え微生物。
[本発明1028]
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がD-キシロースを含み、組換え微生物が、キシロースイソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現およびキシルロース5-キナーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現をさらに含む、本発明1001～1025のいずれかの組換え微生物。
[本発明1029]
キシロースイソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌またはピロミセス属（Pyromyces）の種に由来するxylAに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、本発明1026の組換え微生物。
[本発明1030]
キシルロース5-キナーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のxylBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、本発明2264の組換え微生物。
[本発明1031]
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がD-フルクトースを含み、組換え微生物が、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現をさらに含む、本発明1001～1028のいずれかの組換え微生物。
[本発明1032]
フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のfbpに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、本発明1029の組換え微生物。
[本発明1033]
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖が、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得る、本発明1001～1030のいずれかの組換え微生物。
[本発明1034]
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖が、モノマー、オリゴマー、またはそれらの組み合わせから構成される、本発明1001～1031のいずれかの組換え微生物。
[本発明1035]
トランスケトラーゼ活性および/またはフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現、ならびにD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現が、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い変換、ならびにその後のD-リボース-5-リン酸のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換を可能にする、本発明1005～1032のいずれかの組換え微生物。
[本発明1036]
MEGまたはGAが、C2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通しておよび1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して生成される、本発明1004～1033のいずれかの組換え微生物。
[本発明1037]
MEGが、C2経路におけるグリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの還元によって生成される、本発明1034の組換え微生物。
[本発明1038]
GAが、C2経路におけるグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの酸化によって生成される、本発明1034の組換え微生物。
[本発明1039]
MEGまたはGAの生成のための少なくとも1つの酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、グリセリン酸デカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、およびグリオキシル酸レダクターゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択される、本発明1034の組換え微生物。
[本発明1040]
MEGがC2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通して生成され、1つまたは複数の同時生成物が1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して生成される、本発明1002～1033のいずれかの組換え微生物。
[本発明1041]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がアセトンを含む、本発明1038の組換え微生物。
[本発明1042]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がイソプロパノールを含む、本発明1038の組換え微生物。
[本発明1043]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性、およびデヒドラターゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がプロペンを含む、本発明1038の組換え微生物。
[本発明1044]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）シンターゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ活性、メチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ活性、メチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ活性、メチルクロトニル-CoAヒドラターゼ活性、3-ヒドロキシイソバレリル-CoAチオエステラーゼ活性、3HIVキナーゼ活性、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性、および3HIVデカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がイソブテンを含む、本発明1038の組換え微生物。
[本発明1045]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、およびグリセリン酸2-キナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がL-セリンを含む、本発明1038の組換え微生物。
[本発明1046]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性、グリシン開裂系に関連した活性、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性、アラニントランスアミナーゼ活性、NAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がグリシンを含む、本発明1038の組換え微生物。
[本発明1047]
グリシン開裂系に関連した活性が、グリシンデカルボキシラーゼ（Pタンパク質）、アミノメチルトランスフェラーゼ（Tタンパク質）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Lタンパク質）、およびHタンパク質より選択される酵素またはタンパク質を含む、本発明1044の組換え微生物。
[本発明1048]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、トランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、およびエタノールアミンアンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がモノエタノールアミン（MEA）を含む、本発明1038の組換え微生物。
[本発明1049]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、セリンデヒドロゲナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、アルデヒドオキシダーゼ活性、N-アセチルトランスフェラーゼまたはO-アセチルトランスフェラーゼ活性、N-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性、トランスアミナーゼ活性、デアセチラーゼ活性、セリンアミナーゼ活性、および2,3-ジアミノプロパン酸アンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がエチレンジアミン（EDA）を含む、本発明1038の組換え微生物。
[本発明1050]
グリコールアルデヒドレダクターゼ、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはそれらの組み合わせの活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変をさらに含む、本発明1001～1047のいずれかの組換え微生物。
[本発明1051]
C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部がC2経路における還元当量源として使用される、本発明1001～1048のいずれかの組換え微生物。
[本発明1052]
C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部がATPを生成するために使用される、本発明1001～1048のいずれかの組換え微生物。
[本発明1053]
過剰のバイオマス形成が最小化され、MEGまたは/およびGAおよび1つもしくは複数の同時生成物の生成が最大化される、本発明1001～1050のいずれかの組換え微生物。
[本発明1054]
前記本発明のいずれかの組換え微生物を使用してグリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成する方法であって、
グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物が生成されるまで、炭素源を供給する1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖を含有する培養培地において組換え微生物を培養する工程を含む、方法。
[本発明1055]
組換え微生物が、モノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を同時生成する、本発明1054の方法。
[本発明1056]
1つまたは複数の同時生成物が、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン（EDA）、またはそれらの組み合わせより選択される、本発明1055の方法。
[本発明1057]
1つまたは複数の生成物がモノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される、本発明1054の方法。
[本発明1058]
ペントースリン酸中間体を介して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積する組換え微生物を作製する方法であって、
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体への変換のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；
D-リボース-5-リン酸中間体のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；
C2経路におけるグリコールアルデヒドからの1つまたは複数の生成物の生成のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；ならびに
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pからの1つまたは複数の生成物の生成のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；ならびに
1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積するよう、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖を含有する培養培地において、組換え微生物を培養する工程
を含む、方法。
[本発明1059]
組換え微生物が、モノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を同時生成する、本発明1058の方法。
[本発明1060]
1つまたは複数の同時生成物が、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン、またはそれらの組み合わせより選択される、本発明1059の方法。
[本発明1061]
1つまたは複数の生成物が、モノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される、本発明1058の方法。
[本発明1062]
グリコールアルデヒドが、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼによってグリコール酸へ酸化される、本発明1058の方法。
[本発明1063]
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体への変換のための1つまたは複数の酵素が、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性、およびリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素より選択される、本発明1058～1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（gapA）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（pgk）、ならびにホスホグリセリン酸ムターゼ（gpmAおよび/またはgpmM）より選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、本発明1063の方法。
[本発明1065]
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体への変換のための1つまたは複数の酵素が、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性、およびリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素より選択される、本発明1058～1062のいずれかの方法。
[本発明1066]
内在性6-ホスホフルクトキナーゼ（pfkAおよび/またはpfkB）酵素の活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、本発明1065の方法。
[本発明1067]
ペントースリン酸中間体のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換のための1つまたは複数の酵素が、ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素である、本発明1058～1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、本発明1058～1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼがzwfであり、6-ホスホグルコノラクトナーゼがpglであり、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼがgndである、本発明1068の方法。
[本発明1070]
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がD-キシロースを含み、
前記方法が、
D-キシロースのD-キシルロースへの変換のためのキシロースイソメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；および
D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換のためのキシルロース5-キナーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程
をさらに含む、本発明1058～1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がD-フルクトースを含み、組換え微生物が、D-フルクトース1,6-ビスリン酸のD-フルクトース6-リン酸への変換のためのフルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させることをさらに含み、D-フルクトースが組換え微生物の内在性酵素によってフルクトース1,6-ビスリン酸へ変換される、本発明1058～1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖が、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得る、本発明1058～1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖が、モノマー、オリゴマー、またはそれらの組み合わせから構成される、本発明1058～1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
トランスケトラーゼ活性および/またはフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素の発現、ならびにペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素の発現が、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い変換、ならびにその後のペントースリン酸のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換を可能にする、本発明1063～1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
MEGまたはGAが、C2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通しておよび1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して生成される、本発明1061～1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
MEGが、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの還元によって生成される、本発明1075の方法。
[本発明1077]
GAが、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの酸化によって生成される、本発明1075の方法。
[本発明1078]
MEGまたはGAの生成のための1つまたは複数の酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、グリセリン酸デカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、およびグリオキシル酸レダクターゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択される、本発明1075の方法。
[本発明1079]
MEGがC2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通して生成され、1つまたは複数の同時生成物が1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して生成される、本発明1058～1074のいずれかの方法。
[本発明1080]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がアセトンを含む、本発明1079の方法。
[本発明1081]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がイソプロパノールを含む、本発明1079の方法。
[本発明1082]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性、およびデヒドラターゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がプロペンを含む、本発明1079の方法。
[本発明1083]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）シンターゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ活性、メチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ活性、メチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ活性、メチルクロトニル-CoAヒドラターゼ活性、3-ヒドロキシイソバレリル-CoAチオエステラーゼ活性、3HIVキナーゼ活性、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性、および3HIVデカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がイソブテンを含む、本発明1079の方法。
[本発明1084]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、およびグリセリン酸2-キナーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がL-セリンを含む、本発明1079の方法。
[本発明1085]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性、グリシン開裂系に関連した活性、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性、アラニントランスアミナーゼ活性、NAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がグリシンを含む、本発明1079の方法。
[本発明1086]
グリシン開裂系に関連した活性が、グリシンデカルボキシラーゼ（Pタンパク質）、アミノメチルトランスフェラーゼ（Tタンパク質）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Lタンパク質）、およびHタンパク質より選択される酵素またはタンパク質を含む、本発明1081の方法。
[本発明1087]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、トランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、およびエタノールアミンアンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がモノエタノールアミン（MEA）を含む、本発明1079の方法。
[本発明1088]
1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、セリンデヒドロゲナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、アルデヒドオキシダーゼ活性、N-アセチルトランスフェラーゼまたはO-アセチルトランスフェラーゼ活性、N-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性、トランスアミナーゼ活性、デアセチラーゼ活性、セリンアミナーゼ活性、および2,3-ジアミノプロパン酸アンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がエチレンジアミン（EDA）を含む、本発明1079の方法。
[本発明1089]
グリコールアルデヒドレダクターゼ、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはそれらの組み合わせの活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、本発明1058～1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部がC2経路における還元当量源として使用される、本発明1058～1089のいずれかの方法。
[本発明1091]
C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部がATPを生成するために使用される、本発明1058～1089のいずれかの方法。
[本発明1092]
過剰のバイオマス形成が最小化され、MEGまたはGA、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生成が最大化される、本発明1058～1091のいずれかの方法。

Claims (92)

  1. ペントースリン酸中間体を介して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成する1つまたは複数の生化学的経路を含む、組換え微生物であって、
    1つまたは複数の生化学的経路が、ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、
    組換え微生物。
  2. ペントースリン酸中間体が、D-リボース-5-リン酸、D-リブロース-5-リン酸、またはD-キシルロース-5-リン酸であり、酵素が、D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性、D-リブロース-5-リン酸アルドラーゼ活性、またはD-キシルロース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する、請求項1記載の組換え微生物。
  3. 1つまたは複数の生成物がモノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される、請求項1記載の組換え微生物。
  4. モノエチレングリコール（MEG）またはグリコール酸（GA）および1つもしくは複数の同時生成物を同時生成する、請求項1記載の組換え微生物。
  5. 1つまたは複数の同時生成物が、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン、またはそれらの組み合わせより選択される、請求項3記載の組換え微生物。
  6. 1つまたは複数の生化学的経路が、トランスケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、請求項1～5のいずれか一項記載の組換え微生物。
  7. トランスケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌（E.coli）由来のtktAまたはtktBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、請求項6記載の組換え微生物。
  8. ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のdeoCのSEQ ID NO:256に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、請求項1記載の組換え微生物。
  9. ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、B.カルドリチカス（caldolyticus）由来のdeoCのSEQ ID NO:298に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、請求項1記載の組換え微生物。
  10. 大腸菌由来のdeoCが47位のシステインからアルギニンへの変異（C47N）を含む、請求項8記載の組換え微生物。
  11. B.カルドリチカス由来のdeoCが37位のシステインからアルギニンへの変異（C37N）を含む、請求項9記載の組換え微生物。
  12. 1つまたは複数の生化学的経路が、トランスアルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、請求項1～8のいずれか一項記載の組換え微生物。
  13. トランスアルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のtalAまたはtalBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、請求項8記載の組換え微生物。
  14. 1つまたは複数の生化学的経路が、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、請求項1～12のいずれか一項記載の組換え微生物。
  15. リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のrpeに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、請求項12記載の組換え微生物。
  16. 1つまたは複数の生化学的経路が、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、請求項1～14のいずれか一項記載の組換え微生物。
  17. リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のrpiAまたはrpiBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、請求項15記載の組換え微生物。
  18. グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、およびホスホグリセリン酸ムターゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性の欠失または減少をさらに含む、請求項1～16のいずれか一項記載の組換え微生物。
  19. グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼがgapAであり、ホスホグリセリン酸キナーゼがpgkであり、ホスホグリセリン酸ムターゼがgpmAおよび/またはgpmMである、請求項17記載の組換え微生物。
  20. 1つまたは複数の生化学的経路が、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、請求項1～15のいずれか一項記載の組換え微生物。
  21. フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Bifidobacterium dentium）BDP_1006、ビフィドバクテリウム・ラクチス（lactis）xfp、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）xpkA、およびビフィドバクテリウム・ブレベ（breve）xfpより選択されるフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、請求項18記載の組換え微生物。
  22. 1つまたは複数の生化学的経路が、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現を含む、請求項18または19記載の組換え微生物。
  23. リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌ptaおよびクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ptaより選択されるリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、請求項20記載の組換え微生物。
  24. 内在性6-ホスホフルクトキナーゼ酵素の活性の欠失または減少をさらに含む、請求項1～15または18～21のいずれか一項記載の組換え微生物。
  25. 6-ホスホフルクトキナーゼがpfkAおよび/またはpfkBである、請求項22記載の組換え微生物。
  26. グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性の欠失または減少をさらに含む、請求項1～23のいずれか一項記載の組換え微生物。
  27. グルコース6-リン酸1-デヒドロゲナーゼがzwfであり、6-ホスホグルコノラクトナーゼがpglであり、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼがgndである、請求項24記載の組換え微生物。
  28. 1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がD-キシロースを含み、組換え微生物が、キシロースイソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現およびキシルロース5-キナーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現をさらに含む、請求項1～25のいずれか一項記載の組換え微生物。
  29. キシロースイソメラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌またはピロミセス属（Pyromyces）の種に由来するxylAに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、請求項26記載の組換え微生物。
  30. キシルロース5-キナーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のxylBに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、請求項2264記載の組換え微生物。
  31. 1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がD-フルクトースを含み、組換え微生物が、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現をさらに含む、請求項1～28のいずれか一項記載の組換え微生物。
  32. フルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する少なくとも1つの酵素が、大腸菌由来のfbpに対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる、請求項29記載の組換え微生物。
  33. 1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖が、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得る、請求項1～30のいずれか一項記載の組換え微生物。
  34. 1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖が、モノマー、オリゴマー、またはそれらの組み合わせから構成される、請求項1～31のいずれか一項記載の組換え微生物。
  35. トランスケトラーゼ活性および/またはフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現、ならびにD-リボース-5-リン酸アルドラーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素の発現が、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のD-リボース-5-リン酸中間体へのロスの無い変換、ならびにその後のD-リボース-5-リン酸のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換を可能にする、請求項5～32のいずれか一項記載の組換え微生物。
  36. MEGまたはGAが、C2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通しておよび1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して生成される、請求項4～33のいずれか一項記載の組換え微生物。
  37. MEGが、C2経路におけるグリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの還元によって生成される、請求項34記載の組換え微生物。
  38. GAが、C2経路におけるグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの酸化によって生成される、請求項34記載の組換え微生物。
  39. MEGまたはGAの生成のための少なくとも1つの酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、グリセリン酸デカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、およびグリオキシル酸レダクターゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択される、請求項34記載の組換え微生物。
  40. MEGがC2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通して生成され、1つまたは複数の同時生成物が1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して生成される、請求項2～33のいずれか一項記載の組換え微生物。
  41. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がアセトンを含む、請求項38記載の組換え微生物。
  42. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がイソプロパノールを含む、請求項38記載の組換え微生物。
  43. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA:アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸:アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性、およびデヒドラターゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がプロペンを含む、請求項38記載の組換え微生物。
  44. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）シンターゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ活性、メチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ活性、メチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ活性、メチルクロトニル-CoAヒドラターゼ活性、3-ヒドロキシイソバレリル-CoAチオエステラーゼ活性、3HIVキナーゼ活性、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性、および3HIVデカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がイソブテンを含む、請求項38記載の組換え微生物。
  45. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、およびグリセリン酸2-キナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がL-セリンを含む、請求項38記載の組換え微生物。
  46. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性、グリシン開裂系に関連した活性、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性、アラニントランスアミナーゼ活性、NAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がグリシンを含む、請求項38記載の組換え微生物。
  47. グリシン開裂系に関連した活性が、グリシンデカルボキシラーゼ（Pタンパク質）、アミノメチルトランスフェラーゼ（Tタンパク質）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Lタンパク質）、およびHタンパク質より選択される酵素またはタンパク質を含む、請求項44記載の組換え微生物。
  48. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、トランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、およびエタノールアミンアンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がモノエタノールアミン（MEA）を含む、請求項38記載の組換え微生物。
  49. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための少なくとも1つの酵素が、セリンデヒドロゲナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、アルデヒドオキシダーゼ活性、N-アセチルトランスフェラーゼまたはO-アセチルトランスフェラーゼ活性、N-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性、トランスアミナーゼ活性、デアセチラーゼ活性、セリンアミナーゼ活性、および2,3-ジアミノプロパン酸アンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がエチレンジアミン（EDA）を含む、請求項38記載の組換え微生物。
  50. グリコールアルデヒドレダクターゼ、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはそれらの組み合わせの活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変をさらに含む、請求項1～47のいずれか一項記載の組換え微生物。
  51. C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部がC2経路における還元当量源として使用される、請求項1～48のいずれか一項記載の組換え微生物。
  52. C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部がATPを生成するために使用される、請求項1～48のいずれか一項記載の組換え微生物。
  53. 過剰のバイオマス形成が最小化され、MEGまたは/およびGAおよび1つもしくは複数の同時生成物の生成が最大化される、請求項1～50のいずれか一項記載の組換え微生物。
  54. 前記請求項のいずれか一項記載の組換え微生物を使用してグリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成する方法であって、
    グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物が生成されるまで、炭素源を供給する1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖を含有する培養培地において組換え微生物を培養する工程を含む、方法。
  55. 組換え微生物が、モノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を同時生成する、請求項54記載の方法。
  56. 1つまたは複数の同時生成物が、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン（EDA）、またはそれらの組み合わせより選択される、請求項55記載の方法。
  57. 1つまたは複数の生成物がモノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される、請求項54記載の方法。
  58. ペントースリン酸中間体を介して、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖から、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）およびグリコールアルデヒドから派生する1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積する組換え微生物を作製する方法であって、
    1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体への変換のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；
    D-リボース-5-リン酸中間体のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；
    C2経路におけるグリコールアルデヒドからの1つまたは複数の生成物の生成のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；ならびに
    1つまたは複数のC3経路におけるG3Pからの1つまたは複数の生成物の生成のための1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；ならびに
    1つまたは複数の生成物を生成するかまたは蓄積するよう、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖を含有する培養培地において、組換え微生物を培養する工程
    を含む、方法。
  59. 組換え微生物が、モノエチレングリコール（MEG）および1つまたは複数の同時生成物を同時生成する、請求項58記載の方法。
  60. 1つまたは複数の同時生成物が、アセトン、イソプロパノール、プロペン、L-セリン、グリシン、モノエタノールアミン（MEA）、エチレンジアミン、またはそれらの組み合わせより選択される、請求項59記載の方法。
  61. 1つまたは複数の生成物が、モノエチレングリコール（MEG）およびグリコール酸（GA）より選択される、請求項58記載の方法。
  62. グリコールアルデヒドが、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼによってグリコール酸へ酸化される、請求項58記載の方法。
  63. 1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体への変換のための1つまたは複数の酵素が、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性、およびリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素より選択される、請求項58～62のいずれか一項記載の方法。
  64. グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（gapA）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（pgk）、ならびにホスホグリセリン酸ムターゼ（gpmAおよび/またはgpmM）より選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、請求項63記載の方法。
  65. 1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体への変換のための1つまたは複数の酵素が、フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性、リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リブロース-5-リン酸3-エピメラーゼ活性、およびリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素より選択される、請求項58～62のいずれか一項記載の方法。
  66. 内在性6-ホスホフルクトキナーゼ（pfkAおよび/またはpfkB）酵素の活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、請求項65記載の方法。
  67. ペントースリン酸中間体のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換のための1つまたは複数の酵素が、ペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素である、請求項58～66のいずれか一項記載の方法。
  68. グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼより選択される1つまたは複数の内在性酵素の活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、請求項58～67のいずれか一項記載の方法。
  69. グルコース6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼがzwfであり、6-ホスホグルコノラクトナーゼがpglであり、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼがgndである、請求項68記載の方法。
  70. 1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がD-キシロースを含み、
    前記方法が、
    D-キシロースのD-キシルロースへの変換のためのキシロースイソメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程；および
    D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換のためのキシルロース5-キナーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させる工程
    をさらに含む、請求項58～69のいずれか一項記載の方法。
  71. 1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖がD-フルクトースを含み、組換え微生物が、D-フルクトース1,6-ビスリン酸のD-フルクトース6-リン酸への変換のためのフルクトース1,6-ビスホスファターゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を組換え微生物に導入するかまたは発現させることをさらに含み、D-フルクトースが組換え微生物の内在性酵素によってフルクトース1,6-ビスリン酸へ変換される、請求項58～70のいずれか一項記載の方法。
  72. 1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖が、組換え微生物の非酸化的ペントースリン酸経路の1つまたは複数の中間体へ変換され得る、請求項58～71のいずれか一項記載の方法。
  73. 1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖が、モノマー、オリゴマー、またはそれらの組み合わせから構成される、請求項58～72のいずれか一項記載の方法。
  74. トランスケトラーゼ活性および/またはフルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素の発現、ならびにペントースリン酸アルドラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素の発現が、1つまたは複数のペントース糖および/またはヘキソース糖のペントースリン酸中間体へのロスの無い変換、ならびにその後のペントースリン酸のG3Pおよびグリコールアルデヒドへの変換を可能にする、請求項63～73のいずれか一項記載の方法。
  75. MEGまたはGAが、C2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通しておよび1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して生成される、請求項61～74のいずれか一項記載の方法。
  76. MEGが、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの還元によって生成される、請求項75記載の方法。
  77. GAが、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素によるグリコールアルデヒドの酸化によって生成される、請求項75記載の方法。
  78. MEGまたはGAの生成のための1つまたは複数の酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、グリセリン酸デカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、およびグリオキシル酸レダクターゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択される、請求項75記載の方法。
  79. MEGがC2経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通して生成され、1つまたは複数の同時生成物が1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通して生成される、請求項58～74のいずれか一項記載の方法。
  80. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がアセトンを含む、請求項79記載の方法。
  81. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がイソプロパノールを含む、請求項79記載の方法。
  82. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性、およびデヒドラターゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がプロペンを含む、請求項79記載の方法。
  83. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性、アセチル-CoA：アセト酢酸トランスフェラーゼまたは酢酸：アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、3-ヒドロキシイソ吉草酸（3HIV）シンターゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ活性、メチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ活性、メチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ活性、メチルクロトニル-CoAヒドラターゼ活性、3-ヒドロキシイソバレリル-CoAチオエステラーゼ活性、3HIVキナーゼ活性、3HIV-3-リン酸デカルボキシラーゼ活性、および3HIVデカルボキシラーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がイソブテンを含む、請求項79記載の方法。
  84. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、およびグリセリン酸2-キナーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がL-セリンを含む、請求項79記載の方法。
  85. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性、グリシン開裂系に関連した活性、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリントランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンアミノトランスフェラーゼまたはエタノールアミンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリコール酸デヒドロゲナーゼ活性、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性、アラニントランスアミナーゼ活性、NAD(P)H依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がグリシンを含む、請求項79記載の方法。
  86. グリシン開裂系に関連した活性が、グリシンデカルボキシラーゼ（Pタンパク質）、アミノメチルトランスフェラーゼ（Tタンパク質）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Lタンパク質）、およびHタンパク質より選択される酵素またはタンパク質を含む、請求項81記載の方法。
  87. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、3-ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、トランスアミナーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンオキシドレダクターゼ（脱アミノ）またはセリン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性、3-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、2-ホスホグリセリン酸ホスファターゼ活性、グリセリン酸3-キナーゼ活性、グリセリン酸2-キナーゼ活性、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、およびエタノールアミンアンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がモノエタノールアミン（MEA）を含む、請求項79記載の方法。
  88. 1つまたは複数のC3経路におけるG3Pの変換を通した1つまたは複数の同時生成物の生成のための1つまたは複数の酵素が、セリンデヒドロゲナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドデカルボキシラーゼ活性、アミノアセトアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2-アミノマロン酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ活性、2,3-ジアミノプロパン酸デカルボキシラーゼ活性、セリンデカルボキシラーゼ活性、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、アルデヒドオキシダーゼ活性、N-アセチルトランスフェラーゼまたはO-アセチルトランスフェラーゼ活性、N-アセチルセリンデヒドロゲナーゼ活性、トランスアミナーゼ活性、デアセチラーゼ活性、セリンアミナーゼ活性、および2,3-ジアミノプロパン酸アンモニアリアーゼ活性より選択される活性を有する1つまたは複数の酵素より選択され、1つまたは複数の同時生成物がエチレンジアミン（EDA）を含む、請求項79記載の方法。
  89. グリコールアルデヒドレダクターゼ、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはそれらの組み合わせの活性を減少させるかまたは欠失させるための1つまたは複数の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、請求項58～88のいずれか一項記載の方法。
  90. C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部がC2経路における還元当量源として使用される、請求項58～89のいずれか一項記載の方法。
  91. C3経路において生成された過剰のNADHの少なくとも一部がATPを生成するために使用される、請求項58～89のいずれか一項記載の方法。
  92. 過剰のバイオマス形成が最小化され、MEGまたはGA、またはMEGと1つもしくは複数の同時生成物との生成が最大化される、請求項58～91のいずれか一項記載の方法。
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