JP2022519577A - 養子細胞移植療法における使用のためのカルシニューリン阻害剤耐性免疫細胞 - Google Patents

Abstract

養子細胞移植療法における使用のためのカルシニューリン阻害剤耐性免疫細胞本発明は、ｍｉＲ－１７～９２クラスターまたはそのパラログの調節活性が増加しており、カルシニューリン阻害剤耐性を与える免疫細胞に関する。特に、前記免疫細胞は、ｍｉＲ－１７～９２クラスターまたはそのパラログのうち少なくとも１つのｍｉＲＮＡを過剰発現するか、または少なくとも１つのｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子を不活性化し、カルシニューリン阻害剤耐性を与えるように設計されている。特に、本発明は、それを必要とする患者の養子細胞移植療法における、カルシニューリン阻害剤と組み合わせたカルシニューリン阻害剤耐性免疫細胞の使用に関する。

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本発明は、ｍｉＲ－１７～９２クラスターまたはそのパラログの調節活性が増加しており、カルシニューリン阻害剤耐性を与える免疫細胞に関する。特に、当該免疫細胞は、ｍｉＲ－１７～９２クラスターまたはそのパラログのうち少なくとも１つのｍｉＲＮＡを過剰発現するか、または少なくとも１つのｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子を不活性化し、カルシニューリン阻害剤耐性を与えるように設計されている。特に、本発明は、それを必要とする患者の養子細胞移植療法における、カルシニューリン阻害剤と組み合わせたカルシニューリン阻害剤耐性免疫細胞の使用に関する。

〔背景技術〕
適応的免疫反応に必須なＣＤ４ Ｔ細胞は、異なる転写因子およびサイトカインの発現を特徴とする異なるＴ細胞サブセットに分化する。ＣＤ４ Ｔ細胞はまた、Ｂ細胞が胚中心（ＧＣ）反応を起こすことを補助する。ＣＤ４ Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）に強く依存している。Ｔ細胞レセプターは、共刺激レセプターＣＤ２８と相乗的に作用する。同様に、ＣＤ８Ｔ細胞および他のタイプのＴ細胞は、共刺激分子と共同の、そのＴＣＲを介した活性化に依存している。ＣＤ２８を介するシグナル伝達は、増殖および膨張のために重要である（Levine, B.L., et al. J Immunol, 1997. 159(12):5921-30）だけでなく、ＩＬ－２産生を調節するためにも重要である（Sanchez-Lockhart, M., et al. J Immunol, 2004. 173(12):7120-4）。さらに、ＣＤ２８発現は、Ｔ細胞活性化の間の解糖スイッチに必須である（Frauwirth, K.A., et al. Immunity, 2002. 16(6):769-77；Jacobs, S.R., et al. J Immunol, 2008. 180(7):4476-86）。プライミングとは別に、ＣＤ２８刺激は、ウイルス感染に対する応答の間のＴ細胞ヘルパー１型（ＴＨ１）および濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞の分化および維持のために必要とされ（Linterman, M.A., et al. Elife, 2014. 3）、ならびに、ＧＣ応答の形成のために必要とされる（Ferguson, S.E., et al. J Immunol, 1996. 156(12):4576-81）。それにもかかわらず、ＣＤ２８の機能についての広域研究が実現した場合でも（Esensten, J.H., et al. Immunity, 2016. 44(5):973-88）、このレセプターによって開始される経路の完全な理解には依然として及ばない。

Ｔ細胞活性化の間、全体的なＲＮＡ転写は増加するが、ｍｉＲＮＡは全体的にダウンレギュレートされる（Bronevetsky, Y., et al. J Exp Med, 2013. 210(2):417-32）。ｍｉＲＮＡの転写は、長い一次転写産物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）をもたらし（Lee, Y., et al. EMBO J, 2004. 23(20):4051-60）。この一次転写産物は、核においてＤｒｏｓｈａおよびＤＧＣＲ８によって処理される（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）（Gregory, R.I., et al. Nature, 2004. 432(7014):235-40）。このｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、サイトゾルに出され、ここで、ＲＮＡｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼであるＤｉｃｅｒがｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを二本鎖ＲＮＡ複製物へと加工する。この複製物は、ｍｉＲＮＡおよびそのアンチセンス鎖である（Hutvagner, G., et al. Science, 2001. 293(5531):834-8）。次に、この成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）をその標的ｍＲＮＡへとガイドすることができる。この過程は、標的遺伝子３’ＵＴＲに結合するｍｉＲＮＡのシード領域によって、主に決定される（Bartel, D.P. Cell, 2004. 116(2):281-97；Kim, V.N. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005. 6(5):376-85）。ｍＲＮＡを標的化すると、タンパク質発現は、通常、ｍＲＮＡ切断、ｍＲＮＡ崩壊または翻訳抑制によって、ダウンレギュレートされる（aek, D., et al. Nature, 2008. 455(7209):64-71；Selbach, M., et al. Nature, 2008. 455(7209):58-63）。

全体的なｍｉＲＮＡダウンレギュレーションとは対照的に、ｍｉＲ－１７～９２、ならびに２つのパラログクラスターｍｉＲ－１０６ａ～３６３およびｍｉＲ－１０６ｂ～２５の発現は、Ｔ細胞活性化の間、維持されるか、またはアップレギュレートさえされる。ｍｉＲ－１７～９２は、ＣＤ２８共刺激で誘導される（de Kouchkovsky, D., et al. J Immunol, 2013. 191(4):1594-605）。ｍｉＲ－１７～９２クラスターは、６つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１９ｂ、およびｍｉＲ－９２）をコードする。これら６つのマイクロＲＮＡは、その４つのシードファミリー（ｍｉＲ１７ファミリー、ｍｉＲ１８ファミリー、ｍｉＲ１９ファミリー、およびｍｉＲ９２ファミリー）にしたがって、グループに分類される（Xiao, C. and K. Rajewsky. Cell, 2009. 136(1):26-36）。機能的には、ｍｉＲ－１７～９２は、増殖に重要である（Jiang, S., et al. Blood, 2011. 118(20):5487-97）だけでなく、ＴＦＨを含む種々のＴヘルパーサブセットへの分化にも重要である（Baumjohann, D. Cancer Lett, 2018. 423:147-152； Baumjohann, D., et al. Nat Immunol, 2013. 14(8):840-8；Jeker, L.T. and J.A. Bluestone. Immunol Rev, 2013. 253(1):65-81）。このｍｉＲＮＡクラスターの多くの標的、例えばＰＴＥＮ（Xiao, C., et al. Nat Immunol, 2008. 9(4):405-14）だけでなくＫＬＦ－２（Serr, I., et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016. 113(43):E6659-E6668）およびＲｏｒα（Baumjohann, D., et al. Nat Immunol, 2013. 14(8):840-8）がこれまでに報告され、検証されているとはいえ、これらの標的はいずれも、クラスター発現が変化したときに観察される表現型を十分には説明できていない。このことは、細胞運命を変化させるためには、小さな変化をもたらす多くの標的の集合が必要とされ得ることを示唆する（Jeker, L.T. and J.A. Immunol Rev, 2013. 253(1):65-81）。ｍｉＲ－１７～９２の発現は、増殖（Baumjohann, D., et al. Nat Immunol, 2013. 14(8):840-8；Xiao, C., et al. Nat Immunol, 2008. 9(4):405-14）、代謝（Izreig, S., et al. Cell Rep, 2016. 16(7):1915-28）、ならびにＴＦＨおよびＧＣ Ｂ細胞の分化（Baumjohann, D., et al. Nat Immunol, 2013. 14(8):840-8）などの、ＣＤ２８発現によっても影響されるＴ細胞活性化の態様のために重要である。

養子細胞移植は、免疫細胞の移植を伴い、ウイルス感染、自己免疫疾患および癌を治療するための有望な戦略である。合成生物学の原理を使用して、免疫学および遺伝子工学の進歩は、所望の特異性および増強された機能性を示すヒトＴ細胞を生成することを可能にした。

免疫能が正常な患者において、移植された細胞または臓器がレシピエントとは異なるドナー個人に由来する場合、移植された細胞または臓器は宿主の免疫系により速やかに拒絶される。免疫学的には、このような細胞は異質遺伝子型と呼ばれ、免疫学的拒絶反応は異質遺伝子型拒絶反応と呼ばれる。例外は遺伝学的に同一である双生児間の移植である。したがって、異質遺伝子型移植片の拒絶反応を防止するためには、対象の免疫系を抑制しなければならない。免疫系の異なる経路を標的とする免疫抑制剤は、免疫抑制のための治療に広く用いられている。１つの例は、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはＦＫ５０６（タクロリムス）によるカルシニューリンの標的化である。これらは、Ｔ細胞の活性化を防ぐ。別の薬物であるＣＴＬＡ－４－Ｉｇは、ＣＤ２８共刺激の活性化を防ぎ、その結果同様にＴ細胞の活性化を抑制する。しかし、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法の場合、免疫抑制剤を使用すると、移植された免疫細胞に有害な影響を及ぼす可能性がある。したがって、これらの条件において養子免疫療法アプローチを効果的に使用するために、免疫抑制剤治療に対して耐性がある免疫細胞を開発する必要性が依然として残っている。

〔発明の概要〕
ＣＤ４ｃｒｅ．ｍｉＲ１７９２ｔｇ．ＣＤ２８ｋｏマウスを使用して、ｍｉＲ－１７～９２のトランスジェニック発現がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ２８シグナル伝達を補い、ＣＤ２８ｋｏ細胞のトランスクリプトームを補正できることを、本発明者らは示した。さらに、ｍｉＲ－１７～９２がカルシニューリン／ＮＦＡＴ活性、ＮＦＡＴ核移行を促進し、ＮＦＡＴ依存性遺伝子発現シグネチャーを駆動することの証拠を本発明者らは提供する。さらに、本発明者らは、ｍｉＲ－１７～９２クラスターがカルシニューリン－ＮＦＡＴ軸のリプレッサーであるＲｃａｎ３を標的とすることを実証する。さらに、本発明者らは、この生物学的カルシニューリン阻害剤の発現の減少は、同時に化学的カルシニューリン阻害剤に対してより高い耐性を有する細胞を伝達することを実証する。また、本発明者らは、強制的なｍｉＲ－１７～９２発現は、ＣＤ２８欠失Ｔ細胞における共刺激機能を回復させ、それらの細胞におけるＣＮＩ耐性を付与するだけでなく、野生型、すなわちＣＤ２８十分なＴ細胞にもＣＮＩ耐性を伝達することを実証した。また、本発明者らは、ｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子であるＲｃａｎ３遺伝子の不活性化がＣＮＩ耐性を免疫細胞に伝達することを示した。

本発明は、カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）耐性免疫細胞に関する。当該免疫細胞において、ｍｉＲ－１７～９２クラスターまたはそのパラログの調節活性、好ましくは発現が増加しているか、またはｍｉＲ－１７～９２標的遺伝子が減少しており、それを必要とする対象の養子細胞移植療法において使用され、ここで、前記免疫細胞は、前記対象にＣＮＩと組み合わせて投与される。

特定の実施形態において、前記免疫細胞は、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１９ｂ－１、ｍｉＲ－９２ａ－１、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１８ｂ、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－９２ａ－２、ｍｉＲ３６３、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ－２５からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、好ましくはｍｉＲ－１７またはｍｉＲ－１９を過剰発現するように設計されている。好ましい実施形態において、前記免疫細胞は、前記免疫細胞に対して、配列番号１７～４６からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列、より好ましくは配列番号１～１６からなる群より選択される少なくとも１つのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列を含む核酸構築物を導入することによって、設計されている。より好ましい実施形態において、前記核酸構築物は、エレクトロポレーションによって、導入されている。

別の特定の実施形態において、前記免疫細胞は、少なくとも１つのｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子、好ましくはＲｃａｎ３遺伝子の発現を不活性化または抑制するように設計されており、好ましくは、前記免疫細胞は、前記免疫細胞に対して、Ｒｃａｎ３遺伝子を標的とすることができるＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ複合体を導入することによって、設計されている。

特定の実施形態において、前記カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６およびＣＴＬＡ－４Ｉｇからなる群より選択される。

別の特定の実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージおよび制御性Ｔ細胞からなる群より選択され、前記対象またはドナー由来である。好ましい実施形態において、前記免疫細胞は、組み換え抗原レセプター、好ましくはキメラ抗原レセプターをさらに発現する。

特定の実施形態において、養子細胞移植療法は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を必要とする疾患の治療、または、臓器拒絶反応、好ましくは移植片対宿主病、血液悪性腫瘍および移植後リンパ増殖性疾患からなる群より選択される疾患の予防のために使用される。本発明はまた、上述のＣＮＩ耐性免疫細胞と、カルシニューリン阻害剤と、を含む薬学的組成物に関し、特に、それを必要とする対象の養子細胞移植療法における使用するための、薬学的組成物に関する。

〔図面の簡単な説明〕
図１．ｍｉＲ－１７～９２欠損はＣＤ２８欠損を表現型模写する。ｍｉＲ１７９２ｌｏｘ（灰色、左）、ｗｔ（黒）、ｍｉＲ１７９２ｔｇ（灰色、右 Ａ）ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ／ＢＦＡで３時間刺激したＣＤ４^＋細胞におけるフローサイトメトリー細胞内ＩＬ－２染色の定量；Ｂ）ＥＬＩＳＡにより測定した４８時間における培養上清中のＩＬ－２分泌；Ｃ）プレート結合αＣＤ３／αＣＤ２８ｍＡｂで４８時間活性化したＣＦＳＥ標識Ｔ^{１７９２Δ／Δ}（灰色、左）、ｗｔ（黒）、およびＴ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}（灰色、右）ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖。エラーバーは平均±ＳＤを表す、Ｄｕｎｎの多重比較検定、ｐ値：ｎｓ＝有意ではない、^＊＜０．０５ ^＊＊＜０．００２ ^＊＊＊＜０．０００２ ^＊＊＊＊＜０．０００１。データは、１グループあたり３～４回の生物学的反復を用いた２～３回の独立した実験を表す。

図２．ｍｉＲ－１７～９２の発現は活性化ＣＤ４ Ｔ細胞における代謝を改変する。Ｔ^{１７９１Δ／Δ}（明灰色）、ｗｔ（黒）、Ｔ^{１７９２／ｔｇ／ｔｇ}（灰色）由来のＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ｓｅａｈｏｒｓｅマシンを用いたミトコンドリアストレス試験によってそれらの代謝活性について評価した。Ａ）ミトコンドリアストレス試験は、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞において９６ウェルｓｅａｈｏｒｓｅを用いて測定した。１グループあたり３～４回の生物学的反復を用いた２つの実験および実験を示す。左：細胞外酸性化速度、右：酸素消費速度。両パラメータは３つの遺伝子型で重複している。Ｂ）ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞における基礎呼吸およびＡＴＰ共役呼吸。Ｃ）４８時間活性化したＣＤ４^＋Ｔ細胞において測定したミトコンドリアストレス試験、ならびにＤ）活性化したＣＤ４^＋Ｔ細胞における基底呼吸とＡＴＰ共役呼吸。４つの実験からのプールされた３～８回の生物学的反復を示す。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ値：^＊＜０．０５ Ｅ）ＲＮＡ配列データは、ＴＣＡに関連する遺伝子のエンリッチメントを示す。活性化後２４時間、４８時間のナイーブなＴ^{１７９２Δ／Δ}およびＴ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}の間で異なって発現する遺伝子に基づく遺伝子セット：リアクトーム＿ＴＣＡ＿サイクル＿および＿呼吸＿エレクトロン＿輸送（ＲＥＡＣＴＯＭＥ＿ＴＣＡ＿ＣＹＣＬＥ＿ＡＮＤ＿ＲＥＳＰＩＲＡＴＯＲＹ＿ＥＬＥＣＴＲＯＮ＿ＴＲＡＮＳＰＯＲＴ）のエンリッチメントを示す。色は、灰色の左側がＴ^{１７９２Δ／Δ}でアップレギュレートされ（増加）、灰色の右側がダウンレギュレートされた（減少）、倍率変化（fold change）の方向を示す。

図３．トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２の発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ２８欠損Ｔ細胞の共刺激を回復させる。ｗｔ（黒）、ＣＤ２８^－／－（暗灰色、中央）、ｍｉＲ１７９２ｔｇ（＝レスキュー）を伴うＣＤ２８^－／－（明灰色、右側）。Ａ）ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ／ＢＦＡで３時間刺激したＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるフローサイトメトリー細胞内ＩＬ－２染色の定量。Ｂ）増殖をＣＦＳＥ希釈により測定し、生存ＣＤ４^＋Ｔ細胞上でゲートした。αＣＤ２８なし（空白）またはあり（灰色）で活性化された各遺伝子型の代表的なヒストグラム。Ｃ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞の芽球化は、リンパ球ゲートのＦＳＣ－ＡのＭＦＩとして示された。Ｄ－Ｅ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、αＣＤ２８を含む（＋）または含まない（－）プレート結合αＣＤ３で４８時間刺激し、発現について、初期活性化マーカーＣＤ２５／ＣＤ６９発現（Ｄ）ならびにＣＤ４４／ＣＤ６２Ｌ発現（Ｅ）を調べた。１グループあたり３～４回の生物学的反復を含む３回の独立した実験からのデータ。エラーバーは平均±ＳＤを表す、ＴｕｋｅｙまたはＨｏｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定；ｐ値：ｎｓ＝有意ではない、^＊＜０．０５ ^＊＊＜０．００２ ^＊＊＊＜０．０００２ ^＊＊＊＊＜０．０００１。

図４．トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化中のＣＤ２８シグナルを部分的に補うことができる。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を、ＴＨ１（Ｔ細胞培地１ｍｌあたり５０Ｕ ＩＬ－２、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ１２および１０μｇ／ｍｌ αＩＬ４）、ＴＨ１７（Ｔ細胞培地１ｍｌあたり５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ６、３ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ、５μｇ／ｍｌ αＩＦＮγおよび１０μｇ／ｍｌ αＩＬ４）、およびｉＴｒｅｇ（２５０Ｕ ＩＬ－２、０．７５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ、１０μｇ／ｍｌ αＩＦＮγおよび１０μｇ／ｍｌ αＩＬ４に加えて０．９ｍＭレチノイン酸）の生成のためのスキューイング条件（ｓｋｅｗｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の存在下で、プレート結合抗体（０．２μｇ／ｍｌ αＣＤ２８、０．５μｇ／ｍｌ αＣＤ３）２４時間、４８時間、および７２時間活性化した。ｗｔ（黒、左）、ＣＤ２８ｋｏ（暗灰色、左から２番目）、レスキュー（灰色、右から２番目）およびｍｉＲ１７９２ｔｇ（明灰色、右）。２つの独立した実験からのデータを、各時点および遺伝子型の代表的なＦＡＣＳプロットと共に示す。Ａ）ＴＨ１分化は、生存ＣＤ４ Ｔ細胞においてＩＦＮγおよびＴｂｘ２１（Ｔｂｅｔ）で染色された。ｍｉＲ－１７～９２の人工発現はＩＦＮγ産生をさせる。Ｂ）ＴＨ１７は生存ＣＤ４ Ｔ細胞中でＩＬ－１７ＡおよびＲｏｒγＴについて染色され、ＲｏｒγＴ^＋は２つの上象限であったが、Ｒｏｒγｔ^＋ＩＬ１７Ａ^＋細胞は右上象限のみであった。Ｃ）ｉＴｒｅｇをＣＤ２５およびＦｏｘｐ３で染色し、データ要約は％Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ２５集団を示した。

図５．トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ２８欠損細胞の共刺激を回復させる。６－８週齢のマウスにＬＣＭＶ Ａｒｍｓｔｒｏｎｇを感染させ、感染後８日目に脾臓を分析した。ｗｔ（黒）、ＣＤ２８^－／－（暗灰色）、レスキュー（明灰色）。Ａ－Ｄ）生存ＣＤ４^＋ＣＤ３^＋または生存ＣＤ１９^＋Ｂ２２０^＋細胞上でプレゲーティング（pre－gating）した、１グループあたり４匹のマウスを用いた４つの独立した実験からのデータを表す。Ａ）ＣＤ４４の発現。Ｂ）Ｂｃｌ６^＋ＩＣＯＳ^＋集団（ＴＦＨ）の相対数。Ｃ）ＣＸＣＲ５^＋ＰＤ－１^＋集団（ＴＦＨ）の相対数。Ｄ）Ｆａｓ^＋ＧＬ７^＋集団（ＧＣ Ｂ細胞）の相対数。Ｅ）Ｔｂｘ２１およびＩＦＮγ発現の代表的なコンタープロット。Ｆ）Ｔｂｘ２１^＋ＩＦＮγ^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞の定量。Ｇ）総Ｔｂｘ２１^＋細胞に対するＴｂｘ２１^＋ＩＦＮγ^＋の比率。エラーバーは平均ＳＤを表す、Ｄｕｎｎの多重比較検定；ｐ値：ｎｓ＝有意ではない、^＊＜０．０５、^＊＊＜０．００２、^＊＊＊＜０．０００２、^＊＊＊＊＜０．０００１。

図６．ｍｉＲ－１７～９２発現の消失は、ＬＣＭＶ感染時にｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ２８欠損を表現型模写し、ｍｉＲ－１７～９２のヘテロ接合体発現はＣＤ２８ｋｏを部分的にレスキューできる。６－８週齢のマウスを２^＊１０^５ＰＦＵ ＬＣＭＶ Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｉ．ｐ．に感染させ、感染後８日目に、図５のように脾臓を分析した。ｗｔ（左）、Ｔ^{１７９２Δ／Δ}（左から２番目）、ＣＤ２８^－／－（左から３番目）、ヘテロ接合トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現のＣＤ２８^－／－＝ヘトレスキュー（hetrescue）（右から３番目）、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現のＣＤ２８^－／－＝レスキュー（右から２番目）、Ｔ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}（右）。Ａ－Ｄ）生存ＣＤ４^＋ＣＤ３^＋または生存ＣＤ１９^＋Ｂ２２０^＋細胞上でゲートされた１グループあたり３～４匹のマウスを用いた４つの独立した実験からのデータを表す。Ａ）ＣＤ４４発現 Ｂ）％Ｂｃ１６^＋ＩＣＯＳ^＋（ＴＦＨ）Ｃ）％ＣＸＣＲ５^＋ＰＤ－１^＋（ＴＦＨ）およびＤ）％Ｆａｓ^＋ＧＬ７^＋（ＧＣ Ｂ細胞）の定量。エラーバーはＳＤの平均を表す、Ｄｕｎｎの多重比較検定、ｐ値：ｎｓ＝有意ではない、^＊＜０．０３３２，^＊＊＜０．００２１，^＊＊＊＜０．０００２，^＊＊＊＊＜０．０００１。Ｅ－Ｇ）脾細胞をＧＰ－６４およびＢＦＡで４時間再刺激し、生存ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞上でプレゲートしたＴＨ１表現型について調べた。１グループあたり３～４回の生物学的反復による２～３回の独立した実験を示す。Ｅ）Ｔｂｘ２１およびＩＦＮγ発現の代表的なコンタープロット。Ｆ）Ｔｂｘ２１^＋ＩＦＮγデータ要約。Ｇ）総Ｔｂｘ２１^＋細胞に対するＴｂｘ２１^＋ＩＦＮγ^＋の比率。

図７．ｍｉＲ－１７～９２によるＣＤ２８機能の回復は細胞内在である。ナイーブＳＭＡＲＴＡ^＋ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞のＣＤ２８^－／－宿主への養子移植、その後のＬＣＭＶ－Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ感染、および感染後ｄ８の臓器の分析。ドナー遺伝子型ｗｔ（黒、左側）、ＣＤ２８^－／－（灰色、中央）、レスキュー（灰色、右側）。点線は、非移植コントロール宿主で測定されたレシピエント固有のＶα２^＋Ｖβ８．３^＋集団を示す。Ａ）生存ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞上でプレゲートした末梢リンパ節（ＬＮ）由来のＶα２^＋Ｖβ８．３^＋細胞；Ｂ）末梢ＬＮ由来のＶα２^＋Ｖβ８．３^＋集団におけるＣＤ４４発現。２回の独立実験、グループあたり４レシピエント。エラーバーは平均±ＳＤ、Ｄｕｎｎの多重比較検定を表す、ｐ値：ｎｓ＝有意ではない、^＊＜０．０５、^＊＊＜０．００２、^＊＊＊＜０．０００２。Ｃ－Ｄ）脾臓（Ｃ）および腸間膜ＬＮ（Ｄ）由来の生存ＣＤ４＋集団におけるＶα２＋Ｖβ８．３＋細胞；Ｅ－Ｆ）脾臓（Ｅ）および腸間膜ＬＮ（Ｆ）由来のＶα２＋Ｖβ８．３＋集団におけるＣＤ４４発現。２回の独立した実験、グループあたり４レシピエント。エラーバーは平均±ＳＤを表す、Ｄｕｎｎの多重比較検定、ｐ値：ｎｓ＝有意ではない、^＊＜０．０５、^＊＊＜０．００２、^＊＊＊＜０．０００２。

図８ ｍｉＲ－１７～９２はＴ細胞活性化後にトランスクリプトームを形作り、ＮＦＡＴ依存遺伝子発現を促進する。Ｔ^{１７９２Δ／Δ}（明灰色）、Ｔ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}（灰色）またはｗｔ（黒）由来のナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞を、プレート結合αＣＤ２８およびαＣＤ３で０、２４時間および４８時間活性化した。全ＲＮＡをバルクＲＮＡ配列決定のために抽出した。Ａ）２５％の最も変動の大きい遺伝子に基づくＰＣＡ（ＰＣ１対ＰＣ２）。Ｂ）Ｔ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}対Ｔ^{１７９２Δ／Δ}比較の、ａｂｓ（ｌｏｇ２ＦＣ）＞１および調整済みＰ値（ａｄｊ．Ｐ．Ｖａｌ）＜０．００１で選択された遺伝子のセットの２４時間での階層的クラスタリング。ヒートマップは、百万当たりのカウントの中心ログを表示する。注釈「ＤＥ」は倍率変化方向を示し、「ＤＥイントロン」はＥＩＳＡ分析において顕著な変化が観察されるかどうかを示し、「ＴＳ」はシードマッチの存在（灰色）または非存在（空白）およびその位置を示し、「ＡＨＣ」は、ＨＩＴＳ－ＣＬＩＰデータにおける３’ＵＴＲシグナル強度を示す。ボックスＩ～ＩＶｂは遺伝子クラスターを示す。Ｃ）火山プロットは、レギュロン解析からの絶対ｌｏｇ２倍率変化および－ｌｏｇ１０ ｐ値を示す。１％ＦＤＲの閾値を適用した。ドットサイズは各レギュロン内の遺伝子の数を示し、色は倍率変化方向を示す。Ｄ）ＮＦＡＴＣ２＿ＤおよびＮＦＡＴＣ３＿Ｄレギュロン下にある遺伝子のヒートマップに加えて、ＣＤ４細胞（Ｉｌ１０、Ｉｌ１２ａ、Ｉｌ６、Ｒｏｒｃ、Ｉｌ２３ａ）におけるいくつかの既知の活性化遺伝子。階層的クラスタリングを遺伝子に適用した。百万当たりのカウントの中央ログを表示する。Ｅ－Ｆ）各遺伝子の遺伝子発現比のｌｏｇ２値対ナイーブ（Ｅ）および２４ｈ活性化（Ｆ）における全ｌｏｇ２比の累積画分（cumulative fraction）として示した、ゲノムワイドなトランスクリプトーム解析。Ｔ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}対ｗｔおよびＴ^{１７９２Δ／Δ}対の比較のためのｍｉＲ－１７シードファミリーを示す。黒い曲線：シードマッチを持たず、５つ以下のＡＨＣ読み取り（ｒｅａｄ）を示したデータセットのすべての遺伝子、灰色：シードファミリーについてシード配列を有し、ＡＨＣにおいて５以上の読み取りを有する遺伝子のサブセット。

図９．ｍｉＲ－１７～９２の発現はＣＤ２８ｋｏ細胞のトランスクリプトームを部分的にレスキューする。Ｔ^{１７９２Δ／Δ}（灰色）、ｗｔ（黒）、Ｔ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}（明灰色）、ＣＤ２８^－／－（暗灰色）、およびレスキュー（灰色）マウス由来のＣＤ４^＋Ｔ細胞を２４時間活性化した。全ＲＮＡを配列決定のために抽出した。Ａ）２５％の最も変動の大きい遺伝子に基づくＰＣＡ（ＰＣ１対ＰＣ２）Ｂ）各遺伝子に対する遺伝子発現比のｌｏｇ２値対全ｌｏｇ２比の累積画分として示した、ゲノムワイドなトランスクリプトーム解析。示されているのは、ＣＤ２８^－／－対ｗｔおよびレスキュー対ｗｔ比較についての、ｍｉＲ－１７シードファミリーによって分離された活性化サンプル間のコントラストである。黒い曲線：シードマッチを持たない、＜５ ＡＨＣリードを持たないおよび２回目のＲＮＡ配列決定において発現差異を示さない遺伝子。灰色：ｍｉＲ－１７シードファミリー（ＴＳ）のための保存された結合部位を有しており、＞５ ＡＨＣ読み取り、およびＡＨＣ発現差異を示さない遺伝子、灰色：ｍｉＲ－１７シードファミリー（ＴＳ）のための保存された結合部位を有し、およびＡＨＣ中の＞５読み取りならびに２回目のＲＮＡ配列決定データセットで発現差異を示す遺伝子。

図１０．Ｒｃａｎ３発現およびシクロスポリンＡ感度はｍｉＲ－１７～９２およびＣＤ２８発現により改変される。Ａ）ＨＩＴＳ－ＣＬＩＰによって検出されたＲｃａｎ３の３’ＵＴＲにおけるＡｒｇｏｎａｕｔｅ２の結合部位、およびフラッグによって示される示される予測されたｍｉＲ－１７標的部位。Ｂ）活性化の２４時間後にｑＰＣＲで検出されたＲｃａｎ３ ｍＲＮＡ発現、ｗｔ．Ｔ^{１７９２Δ／Δ}（左）、ｗｔ（黒）、Ｔ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}（右）に正規化した３つの独立した実験からのプールされたデータで示す。ｍＲＮＡ発現は１８ＳリボソームＲＮＡに正規化した。値は平均±ＳＤ、Ｄｕｎｎの多重比較検定、ｐ値：ｎｓ＝有意ではない、^＊＜０．０５、^＊＊＊＊＜０．０００１。Ｃ）活性化の２４時間後に標的プロテオミクスで測定されたＲｃａｎ３タンパク質存在量。ＣＤ２８^－／（左）、Ｔ^{１７９２Δ／Δ}（左から２番目）、レスキュー（中）、およびＴ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}（右）をｗｔ（右から２番目）と比較する。Ｒｃａｎ３の標的プロテオミクスおよび全ＲＮＡ配列決定のために、同じ細胞からタンパク質を単離した。数字は、Ｔ検定からのｐ値を示す。Ｄ）ＣＤ４^＋ ｗｔ（黒）、ＣＤ２８^－／－（暗灰色）およびレスキュー（明灰色）細胞を、示すように増加する濃度のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の存在下で４８時間活性化し、ＣＤ２５およびＣＤ６９について染色した。左：生存ＣＤ４ Ｔ細胞のＣＤ２５／ＣＤ６９発現の代表プロット（４８ｈ用、６．２５ｎｇ／ｍｌ ＣｓＡなし）。右：ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋集団のうち、左側にゲートがあるものの割合。２つの独立した実験を示し、エラーバーは平均±ＳＤを表す。Ｔｕｋｅｙの多重比較、ｐ値：^＊＊＜０．００２、^＊＊＊＊＜０．０００１は、ＣＤ２８^－／－とｗｔとの間の有意差を指す。Ｅ）生存ＣＤ４＋細胞の芽球化（リンパ球ゲートのＦＳＣ－Ａ）に対する６．２５ｎｇ／ｍｌのＣｓＡの影響。Ｆ）６．２５ｎｇ／ｍｌシクロスポリンＡの存在下で４８時間活性化したＣＤ４^＋ Ｔ細胞のｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ解析を行い、ＤＡＰＩおよびＮＦＡＴｃ２で染色した。ＣＤ２８^－／－サンプル中の細胞質（上部）および核（底部）ＮＦＡＴｃ２の例。Ｇ）類似性拡張（similarity dilate）のヒストグラム、ＮＦＡＴｃ２およびＤＡＰＩシグナルの共局在化の表示、ゲートは転座集団（高い類似性拡張）および細胞質集団（低い類似性拡張）を示す。

図１１：ｗｔ ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるトランスジェニックｍｉＲ－１７～９２の発現は、カルシニューリン阻害剤（ＣｓＡおよびＦＫ５０６）に対するより高い耐性を細胞に与える。Ａ、Ｂ）ｍｉＲ１７９２ｔｇ（灰色）またはｗｔ（黒）マウス由来のＣＤ４ Ｔ細胞を、（Ａ）で示すように、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはＦＫ５０６（Ｂ）の漸増濃度の存在下で４８時間活性化し、それらのＣＤ２５およびＣＤ６９の発現について染色した。２つの独立した実験を示し、エラーバーは平均±ＳＤを表す。Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋｓの多重比較、ｐ値：ｎｓ＞０．１２３４ ^＊＜０．０３３２ ^＊＊＜０．００２１、^＊＊＊＜０．０００２ ^＊＊＊＊＜０．０００１はｍｉＲ１７９２ｔｇとｗｔとの間の有意差を指す。Ｃ，Ｄ）ｍｉＲ１７９２ｔｇ（灰色）またはｗｔ（黒）マウス由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞を、示されているようにＣｓＡ（Ｃ）またはＦＫ５０６（Ｄ）の漸増濃度の存在下で４８時間活性化し、それらのＣＤ２５およびＣＤ６９の発現について染色した。２つの独立した実験を示し、エラーバーは平均±ＳＤを表す。Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋｓの多重比較、ｐ値：ｎｓ＞０．１２３４ ^＊＜０．０３３２ ^＊＊＜０．００２１、^＊＊＊＜０．０００２ ^＊＊＊＊＜０．０００１はｍｉＲ１７９２ｔｇとｗｔとの間の有意差を指す。

図１２：ｍｉＲ－１７～９２の標的遺伝子であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＲｃａｎ３欠失は、ＣｓＡに対する耐性を付与する。コントロールｇＲＮＡまたはＲｃａｎ３を標的とするｇＲＮＡ（ＣＩＣドメインまたはエキソン２（ｃｒＲＮＡ １１１９、ｃｒＲＮＡ１５５８））でエレクトロポレーションしたＣＤ４ Ｔ細胞を、示したように、漸増濃度のＣｓＡの存在下で４８時間活性化した。Ｔ細胞活性化のマーカーとしてのＣＤ４４発現を、フローサイトメトリーによって定量した。ＭＦＩ：平均蛍光強度。

〔発明の詳細な説明〕
免疫能が正常な患者では、（養子）移植された臓器または細胞は、宿主免疫系により急速に拒絶される。さらに、異質遺伝子型ＨＳＣＴとの関連において、移植された免疫系は宿主を攻撃し得、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）と呼ばれる疾患を引き起こす。移植片合併症を予防するために、移植後にカルシニューリン阻害剤などの免疫抑制剤を投与する。残念ながら、病原性免疫細胞を選択的に阻害し、同時に有益な免疫応答をそのまま残すことは今のところ不可能である。結果として、感染症や腫瘍に対する免疫反応を含め、すべての免疫反応が防がれる。このことは、免疫抑制された有益な応答に代わるさらなる細胞導入の潜在的必要性を持ち込む。しかしながら、ＧｖＨＤの移植拒絶を防止するためには免疫抑制を維持しなければならないので、移植された細胞は、そうでなければＣＮＩによって阻害されるので、カルシニューリン阻害剤のような免疫抑制剤に対する耐性を必要とする。

本発明者らは、ｍｉＲ－１７～９２クラスターおよびＣＤ２８を介したシグナルがシクロスポリンＡに対する感受性に影響を及ぼすことを示した。したがって、ｍｉＲ－１７～９２クラスターの発現が増加しているか、または少なくとも１つのｍｉＲ－１７～９２標的遺伝子、例えばＲｃａｎ３（内因性カルシニューリン阻害剤）が欠失している免疫細胞を、カルシニューリン阻害剤と組み合わせて、対象における養子細胞移植治療に用いることができる。

「免疫抑制剤」により、いくつかの作用機序の１つによって免疫機能を抑制する薬剤を意味する。言い換えれば、免疫抑制剤は、免疫応答の程度および／または貪食性（ｖｏｒａｃｉｔｙ）を減少させる能力によって示される化合物によって果たされる役割である。本発明によるカルシニューリン阻害剤は、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路を直接的または間接的に遮断することによって機能する免疫抑制剤である。カルシニューリン阻害剤はシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６であり得、タクロリムスとも呼ばれる。本発明によれば、カルシニューリン阻害剤はＣＴＬＡ４－Ｉｇであってもよい。カルシニューリン（ＰＰ２Ｂ）は多くの生物学的プロセスに含まれ、遍在的に発現されるセリン／トレオニンプロテインホスファターゼであり、そして、これはＴ細胞活性化の中心である。カルシニューリンは触媒サブユニット（ＣｎＡ；３つのアイソフォーム）および調節サブユニット（ＣｎＢ；２つのアイソフォーム）からなるヘテロ二量体である。Ｔ細胞レセプターが関与した後、カルシニューリンは転写因子ＮＦＡＴを脱リン酸化し、核への移行を可能にし、他の転写因子と共に二量化し、ＩＬ－２のような主要標的遺伝子の転写を開始する。ある種の遺伝子はＮＦＡＴの結合によって活性化されるが、他の遺伝子は阻害される。ＦＫＢＰ１２との複合体のＦＫ５０６、またはＣｙＰＡとの複合体のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、ＮＦＡＴがカルシニューリンの活性部位に接近するのを阻害し、その脱リン酸化を妨げ、それによってＴ細胞の活性化を阻害する（Brewin, Mancao et al. 2009）。ＣＴＬＡ－４－Ｉｇは、Ｔ細胞ＣＤ２８共刺激の阻害を通してＮＦＡＴ活性を遮断する（Diehn M. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002, 99(18):11796－11801；Wang CJ. Et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(2):524－9）。

本発明によれば、ｍｉＲ－１７～９２クラスターまたはそのパラログの調節活性を増大させることにより、カルシニューリン阻害剤耐性が免疫細胞に付与される。「ｍｉＲＮＡの調節活性」により、標的転写産物の結合および分解を介して、またはｍＲＮＡが翻訳されるのを妨げることによって、標的遺伝子抑制を誘導することを意味している。

特に、本発明によれば、ｍｉＲ１７～９２クラスターまたはそのパラログの少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、標的転写物の結合およびその後の分解を通して、またはｍＲＮＡが翻訳されるのを妨げることによって、少なくとも１つの標的遺伝子の遺伝子抑制の増加を誘導する。ｍｉＲ１７～９２の標的遺伝子は表１の遺伝子のリストを含むが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、ｍｉＲ１７～９２クラスターまたはそのパラログの少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、カルシニューリン遺伝子（例えば、ＲＣＡＮ１、ＲＣＡＮ２およびＲＣＡＮ３遺伝子、好ましくはＲＣＡＮ３遺伝子）のレギュレーターの遺伝子抑制の増加を誘導する。

ｍｉＲ－１７～９２クラスターの調節活性の増加は、ｍｉＲ－１７～９２クラスターまたはそのパラログの標的遺伝子の発現レベルを測定することによって決定され得る。特定の実施形態において、標的遺伝子は、表１の遺伝子のリストにおいて選択される。より特定の実施形態では、標的遺伝子はＲＣＡＮ３遺伝子、Ｃａｓｔ遺伝子、Ｃｙｌｄ遺伝子およびＺｂｔｂ４遺伝子からなる群より選択され、より好ましくはＲＣＡＮ３遺伝子である。ｍｉＲ－１７～９２クラスターまたはそのパラログの調節活性は、標的遺伝子、好ましくはＲＣＡＮ３遺伝子、Ｃａｓｔ遺伝子、Ｃｙｌｄ遺伝子およびＺｂｔｂ４遺伝子からなる群から選択され、より好ましくはＲＣＡＮ３遺伝子、の発現レベルが非設計免疫細胞よりも少なくとも１．５倍低いか、または２、３、４、５倍低い場合に、設計された免疫細胞において増加する。

ｍＲＮＡの発現レベルは、当業者に公知の任意の適切な方法によって決定され得る。通常、これらの方法は、ｍＲＮＡの量を測定することを含む。ｍＲＮＡの量を決定するための方法は、当該分野で公知である。例えば、サンプルに含まれる核酸は最初に、標準的な方法に従って、例えば、溶解酵素または化学溶液を使用して抽出されるか、または製造業者の説明書に従って核酸結合樹脂によって抽出される。次いで、抽出されたｍＲＮＡはハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット分析）および／または増幅（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）によって検出される。定量的または半定量的ＲＴ－ＰＣＲが好ましい。

標的遺伝子タンパク質のレベルはまた、当業者に公知の任意の適切な方法によって決定され得る。通常、これらの方法は、細胞サンプル、好ましくは細胞溶解物を、サンプル中に存在する標的遺伝子タンパク質と選択的に相互作用することができる結合パートナーと接触させることを含む。結合パートナーは一般に、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。タンパク質の量は例えば、半定量的ウェスタンブロット分析か、ＥＬＩＳＡ、ビオチン／アビジン型アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動もしくは免疫沈降などの酵素標識および媒介イムノアッセイによって、またはタンパク質もしくは抗体アレイによって測定することができる。反応には、一般に、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識もしくは色素分子などの標識を明らかにすることが含まれ、または抗原と抗体との間の複合体の形成、もしくは、それらとともに反応した抗体を検出するための他の方法が含まれる。好ましい実施形態において、細胞溶解物は、分画されたタンパク質を受け取るために、特定の酵素、例えばトリプシンで消化される。次いで、サンプルをスパイクペプチドと混合する。スパイクペプチドは、同位体標識を有する、目的のタンパク質に由来する短いペプチドとして定義される。その後、質量分析による測定は、質量シフトを検出し、目的のタンパク質の存在量を定量化することを可能にする。

別の特定の実施形態において、ｍｉＲ－１７～９２クラスターの調節活性の増加は、ｍｉＲ－１７～９２クラスターおよびそのパラログのｍｉＲＮＡの少なくとも１つの発現レベルを測定することによって決定され得る。ｍｉＲ－１７～９２クラスターの調節活性は、ｍｉＲ－１７～９２クラスターおよびそのパラログの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが非設計免疫細胞よりも少なくとも１．５倍高いか、または２、３、４、５倍高い場合に、設計された免疫細胞において増加する。ｍｉＲＮＡの発現レベルは、上記のように当業者に公知の任意の適切な方法によって決定され得る。

ｍｉＲ－１７～９２クラスターおよびパラログの調節活性または量は、化学物質、抗生物質、遺伝子発現を改変することが知られている化合物、修飾または非修飾ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）、ポリペプチド、ペプチド、低分子ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含むがこれらに限定されない薬剤によって増加させることができる。

特定の実施形態において、ｍｉＲ－１７～９２クラスター化およびそのパラログの調節活性は、設計された免疫細胞によって増加され、ｍｉＲ－１７～９２クラスター化およびそのパラログの少なくとも１つのｍｉＲＮＡを過剰発現する。

本明細書中で使用される場合、用語「過剰発現（overexpress、overexpression）」は、正規化後に、非改変免疫細胞における発現レベルよりも少なくとも１．５倍高い、または２、３、４、５倍高い発現レベルを指す。発現レベルは、リボソーム１８Ｓ、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）またはβ－アクチンなどの安定な発現を有することが知られているｍＲＮＡの発現レベルを使用することによって、正規化することができる。

免疫細胞におけるｍｉＲ１７～９２クラスターの過剰発現は、当業者に公知の任意の方法、例えば、ＭＩＲ１７ＨＧ遺伝子またはそのパラログの転写を増加させること（例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有さないｄＣａｓ９を有するＣＲＩＳＰＲ活性化システムおよびｄＣａｓ９またはガイドＲＮＡ上に付加された転写活性化因子を用いることによる）によって得られ得る。免疫細胞におけるｍｉＲ１７～９２クラスターの過剰発現はまた、ｍｉＲ１７～９２クラスターおよびそのパラログの少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸構築物またはベクターを導入すること、および／または当該ｍｉＲＮＡの分解を減少させることによっても得られ得る。

用語「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲ」は、一本鎖および二本鎖ｍｉＲＮＡを包含する。好ましくは、ｍｉＲＮＡは二本鎖形態である。ｍｉＲＮＡはそれらの標的ｍＲＮＡに部分的に相補的であり、１０～２５ヌクレオチド、好ましくは２０～２５ヌクレオチドのサイズを有する。

本発明に従って使用されるｍｉＲＮＡは、一本鎖もしくは二本鎖形態、またはこれら２つの混合物であり得る。それらは、例えば、ヌクレアーゼに対するそれらの耐性を増大させ、したがって細胞中でのそれらの寿命を増大させることを可能にする、修飾ヌクレオチドまたは化学修飾を含有することができる。それらは、特に、例えば、イノシン、メチル－５－デオキシシチジン、ジメチルアミノ－５－デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ－２，６－プリン、ブロモ－５－デオキシウリジン、またはハイブリダイゼーションを可能にする任意の他の修飾塩基などの、修飾塩基を有するヌクレオチドなどの、少なくとも１つの修飾または非天然ヌクレオチドを含むことができる。本発明に従って使用される干渉ＲＮＡはまた、ヌクレオチド間結合、例えばホスホロチオエート、Ｈ－ホスホネートもしくはアルキルホスホネートで、または主鎖において、例えばアルファ－オリゴヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキルリボースもしくはＰＮＡ（ペプチド核酸）で修飾され得る（M. Egholm et al., 1992）。

干渉ＲＮＡは、天然ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または組換え技術によって産生されたものであり得る。これらのｍｉＲＮＡは、当業者に公知の任意の方法、例えば、化学合成、データベースのスクリーニング、転写ｉｎ ｖｉｖｏもしくは組み換えＤＮＡまたは増幅技術によって調製され得る。

ｍｉＲ－１７～９２クラスターは、Ｃ１３ｏｒｆ２５とも呼ばれるＭＩＲ１７ＨＧ遺伝子によってコードされるポリシストロン性転写物（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ１７６７０８．１）である。ｍｉＲ－１７～９２クラスターは、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－２０、ｍｉＲ－１９ｂおよびｍｉＲ－９２の６つのｍｉＲＮＡの群からなる。

ｍｉＲ－１７～９２クラスターの２つのパラログ、ｍｉＲ－１０６ａ－３６３およびｍｉＲ－１０６ｂ－２５クラスターが同定された。ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターは染色体Ｘ上に位置し、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１８ｂ、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－９２ａ－２、ｍｉＲ－３６３の６つのｍｉＲＮＡをコードしている。クラスターｍｉＲ１０６ｂ－２５は、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ－２５の３つのｍｉＲＮＡをコードする。

本発明によれば、「ｍｉＲ－１７～９２クラスター」とは、ｍｉＲ－１７～９２クラスターおよびそのパラログ（ｍｉＲ－１０６ａ－３６３およびｍｉＲ－１０６ｂ－２５クラスターなど）を意味する。本明細書で使用する「パラログ」という用語は、１つの種における遺伝子（または他のコード配列）の別々の出現を示す。別々の出現は、類似しているが、同一ではない配列を有し、配列類似性の程度は、部分的には別々の出現を引き起こす遺伝子重複事象からの進化的距離に依存する。したがって、「パラログ」という用語は天然に存在する変異体を指す。

本発明に従って使用されるｍｉＲＮＡは、前駆体の形態で投与され得る。ｍｉＲＮＡは特に、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの形態で投与することができる。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡの前駆体であり、細胞の核内で切断されてｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとなる。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、１つ以上のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含み得る。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡもｍｉＲＮＡの前駆体である。それらは６０～８０ヌクレオチドを含み、不完全なステム－ループ構造に折り畳まれる。これらのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは細胞質で切断されて二本鎖ｍｉＲＮＡとなり、次にＡｒｇｏｎａｕｔｅファミリーのタンパク質と相互作用できる一本鎖ｍｉＲＮＡとなってＲＩＳＣ複合体を形成する。これは標的ｍＲＮＡが分解されるか、あるいはこのｍＲＮＡの翻訳が抑制されるためである。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが成熟ｍｉＲＮＡに処理されると、ｍｉＲ－ＸＸＸ－５ｐとｍｉＲ－ＸＸＸ－３ｐと名づけられた２つの１９～２３ｎｔの長いｍｉＲＮＡが生じる。成熟ｍｉＲ－ＸＸＸ－５ｐ ｍｉＲＮＡは５’末端に由来し、ｍｉＲ－ＸＸＸ－３ｐはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの３末端に由来する。用語「ｍｉＲＮＡ」は、Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、５ｐ－ｍｉＲＮａおよび３ｐ－ｍｉＲＮＡへの言及を含む。

本開示で使用することができるｍｉＲ－１７～９２クラスターおよびパラログの前駆体ｍｉＲＮＡを表２に挙げる。

従って、ｍｉＲ－１７～９２の前駆体ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－１７（配列番号２；ＮＣＢＩ参照：ＮＲ＿０２９４８７．１）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－１８ａ（配列番号３；ＮＣＢＩ参照：ＮＲ＿０２９４８８．１）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－１９ａ（配列番号４；ＮＣＢＩ参照：ＮＲ＿０２９４８９．１）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２０ａ（配列番号５；ＮＣＢＩ参照：ＮＲ＿０２９４９２．１）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－１９ｂ－１（配列番号６；ＮＣＢＩ参照：ＮＲ＿０２９４９０．１）およびｐｒｅ－ｍｉＲ－９２ａ－１（配列番号７；ＮＣＢＩ参照：ＮＲ＿０２９５０８．１）からなる群より選択される。

ｍｉＲ１７～９２クラスターパラログの前駆体ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－１０６ａ（配列番号８、ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＭ６０８１９６．１）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－１８ｂ（配列番号９、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿０２９９４９．１）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－１９ｂ－２（配列番号１０、ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＭ６０８１６４．１）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２０ｂ（配列番号１１、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿０２９９５０．１）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－９２ａ－２（配列番号１２、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿０２９５０９．１）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６３（配列番号１３、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿０２９８５２．１）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－１０６ｂ（配列番号１４、ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＭ６０８６６１．１）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－９３（配列番号１５、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿０２９５１０．１）およびｐｒｅ－ｍｉＲ－２５（配列番号１６、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿０２９４９８．１）からなる群より選択される。

ｍｉＲ－１７～９２クラスターおよびそのパラログは、以下の表３のリストから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む。

ｍｉＲ－１７～９２クラスターおよびそのパラログは、ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１７）、ｍｉＲ－１７－３ｐ（配列番号１８）、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ（配列番号１９）、ｍｉＲ１８ａ－３ｐ（配列番号２０）、ｍｉＲ－１９ａ－５ｐ（配列番号２１）、ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ（配列番号２２）、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ（配列番号２３）、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ（配列番号２４）、ｍｉＲ－１９ｂ－１－５ｐ（配列番号２５）およびｍｉＲ－１９ｂ－１－３ｐ（配列番号２６）およびｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ（配列番号２７）、ｍｉＲ－９２ａ－１－３ｐ（配列番号２８）、ｍｉＲ－１０６ａ－５ｐ（配列番号２９）、ｍｉＲ－１０６ａ－３ｐ（配列番号３０）、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ（配列番号３１）、ｍｉＲ－１８ｂ－３ｐ（配列番号３２）、ｍｉＲ－１９ｂ－２－５ｐ（配列番号３３）、ｍｉＲ－１９ｂ－２－３ｐ（配列番号３４）、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ（配列番号３５）、ｍｉＲ－２０ｂ－３ｐ（配列番号３６）、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ－９２ａ－２－３ｐ（配列番号３８）、ｍｉＲ－３６３－５ｐ（配列番号３９）、ｍｉＲ－３６３－３ｐ（配列番号４０）、ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ（配列番号４１）、ｍｉＲ－１０６ｂ－３ｐ（配列番号４２）、ｍｉＲ－９３－５ｐ（配列番号４３）、ｍｉＲ－９３－３ｐ（配列番号４４）、ｍｉＲ－２５－５ｐ（配列番号４５）およびｍｉＲ－２５－３ｐ（配列番号４６）からなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡを含む。

好ましい実施形態において、免疫細胞は、配列番号１７～４６、好ましくは配列番号１７、１８、２１、２２、２５および２６からなる群より選択される、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０のｍＲＮＡ配列を含む核酸構築物を免疫細胞に導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、前記核酸構築物は、配列番号１～１６、好ましくは配列番号２、４および６からなる群より選択される、少なくとも１つのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列、より好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列を含む。

用語「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」は、モノマーヌクレオチドから構成されるか、またはモノマーヌクレオチドを含む任意の分子を指すために、互換的に使用され得る。核酸は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ヌクレオチド配列は、化学的に修飾されていても、人工的であってもよい。ヌクレオチド配列には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が含まれる。これらの配列の各々は、分子の主骨格の変化によって、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡと区別される。また、ホスホロチオエート型ヌクレオチドが使用され得る。他のデオキシヌクレオチドアナログには、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’Ｐ５’－ホスホラミデートおよびオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエート、ならびにそれらの２’－０－アリルアナログおよび２’－０－メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが含まれ、これらは本発明のヌクレオチドに使用することができる。

「核酸構築物」という用語は、本明細書中で使用される場合、組換えＤＮＡ技術の使用から生じる人工核酸分子を指す。核酸構築物は、核酸配列のセグメントを含むように修飾された、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子であり、そうでなければこれらは天然には存在しない様式で組み合わされ、そして並置される。核酸構築物は通常、「ベクター」、すなわち、外因的に作製されたＤＮＡを宿主細胞内に送達するために使用される核酸分子である。

一般に、核酸構築物は、コード配列ならびに選択された遺伝子産物の発現に必要なコード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を含む。従って、核酸構築物は、典型的にはプロモーター配列、コード配列、ならびに通常ポリアデニル化部位および／または転写ターミネーターを含有する３’非翻訳領域を含む。核酸構築物はまた、さらなる調節エレメント、例えば、エンハンサー配列、ベクター内のＤＮＡフラグメントの挿入を容易にするポリリンカー配列および／またはスプライシングシグナル配列などを含み得る。

一実施形態において、核酸構築物はプロモーターを含む。前記プロモーターは、宿主細胞への導入時に導入遺伝子発現を開始する。本明細書で使用する「プロモーター」という用語は、それが作動可能に連結されている核酸の転写を指示する調節エレメントを指す。プロモーターは、作動可能に連結されている核酸の転写の速度および効率の両方を調節することができる。プロモーターはまた、核酸のプロモーター依存性転写を増強する（「エンハンサー」）または抑制する（「リプレッサー」）他の調節エレメントに作動可能に連結されていてもよい。これらの調節エレメントは、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写の量を調節するために直接的または間接的に作用することが当業者に公知のヌクレオチドの任意の他の配列、例えば、アテニュエーター、エンハンサー、およびサイレンサーが含まれる、を含むが、これらに限定されない。プロモーターは、機能的に連結されている遺伝子またはコード配列の転写開始部位の近く、ＤＮＡ配列の同じ鎖および上流（センス鎖の５’領域に向かって）に位置する。プロモーターは、約１００～１０００塩基対の長さであり得る。プロモーター中の位置は、特定の遺伝子についての転写開始部位に対して指定される（すなわち、上流の位置は－１から数えて負の数であり、例えば、－１００は１００塩基対上流の位置である）。

本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結されている」は、機能的関係にあるポリヌクレオチド（またはポリペプチド）エレメントの連結を指す。核酸が別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、核酸は「作動可能に連結されている」。例えば、プロモーターまたは転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が典型的には連続していることである；２つのタンパク質をコードする領域を連結しなければならない場合、それらは連続しており、リーディングフレーム内にある。

別の特定の実施形態において、前記核酸構築物はベクターである。適切なベクターの例としては、組換え組込み型または非組込み型ウイルスベクター、および組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ベクターは組換え組込み型または非組込み型ウイルスベクターである。組換えウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）のような負鎖ＲＮＡウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのような正鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン－バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。

本発明による核酸分子または核酸構築物、発現カセットまたはベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ウイルス感染またはリポソーム媒介トランスフェクションを含むが、これらに限定されない、任意の公知の技術を使用して、免疫細胞に移植され得る。好ましい実施形態において、ＲＮＡ、好ましくはｍｉＲＮＡは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってｉｎ ｖｉｔｒｏで産生することができる。次いで、ＲＮＡはエレクトロポレーションによって免疫細胞に導入され得る（例えば、Almasbak et al., Cytotherapy 2011,13:629－640；Rabinovich et al., Hum Gene Ther, 2009,2:51－60；and Beatty et al., Cancer Immunol Res 2014, 2, 1:12－120に記載されるように）。あるいは、ＲＮＡは他の手段、例えば、リポソームまたはカチオン性分子などによって導入され得る。別の実施形態において、細胞に導入された核酸構築物またはベクターは、エピソーム的に発現され得るか、または細胞のゲノムに組み込まれ得る。

別の特定の実施形態において、ｍｉＲ－１７～９２クラスターおよびそのパラログの調節活性は、免疫細胞を設計して、少なくとも１つのｍｉＲ－１７～９２標的遺伝子活性を減少させることによって増加する。前記標的遺伝子には上記表１に列挙した遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。特に、前記標的遺伝子は、ＲＣＡＮ１、ＲＣＡＮ２、ＲＣＡＮ３遺伝子、Ｃａｓｔ遺伝子、Ｃｙｌｄ遺伝子およびＺｂｔｂ４遺伝子からなる群から選択され、好ましくはＲＣＡＮ３遺伝子である。

特定の実施形態において、前記免疫細胞は、少なくとも１つのｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子の発現を不活性化または抑制するように設計される。前記標的遺伝子の不活性化はゲノム修飾によって行われることが望ましく、より特に、ｍｉＲ－１７～９２の標的遺伝子の産生に直接または間接的に関与する遺伝子座を標的とすることができる、特異的な希切断エンドヌクレアーゼの免疫細胞における導入を通して行われる。メガヌクレアーゼ、ＴＡＬ－ヌクレアーゼ、ｚｉｎｇ－ｆｉｎｇｅｒヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲもしくはＡｒｇｏｎａｕｔｅのようなＲＮＡ／ＤＮＡ誘導エンドヌクレアーゼなどの、異なる種類の希切断エンドヌクレアーゼを使用することができる。

標的遺伝子を不活性化することにより、目的の遺伝子が機能性タンパク質形態で発現されないか、または少なく発現されることが意図される。特定の実施形態において、この方法の遺伝子改変は、設計するために提供される細胞における１つの希切断エンドヌクレアーゼの導入に依存する。このような前記希切断エンドヌクレアーゼは１つの標的遺伝子における切断を特異的に触媒し、それによって、前記標的遺伝子を不活性化する。

「希切断エンドヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる野生型または変異体酵素を指す。特定の実施形態において、本発明による前記希切断エンドヌクレアーゼはＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ複合体などのＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）である。ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼがＲＮＡ分子と結合する遺伝子操作のツールである。このシステムにおいて、ＲＮＡ分子ヌクレオチド配列は標的特異性を決定し、エンドヌクレアーゼを活性化する（Gasiunas, Barrangou et al. 2012；Jinek, Chylinski et al. 2012；Cong, Ran et al. 2013；Mali, Yang et al. 2013）。

好ましい実施形態において、前記免疫細胞は、好ましくは少なくとも１つのｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子を標的とすることができるＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ複合体を前記免疫細胞に導入することによって、より好ましくはＣａｓ９ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（本明細書ではシングルガイドＲＮＡとも呼ばれる）を前記免疫細胞に導入することによって、少なくとも１つのｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子の発現を不活性化するように設計される。前記シングルガイドＲＮＡは、好ましくは少なくとも１つのｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子、より好ましくはＲＣＡＮ１、ＲＣＡＮ２、ＲＣＡＮ３遺伝子、Ｃａｓｔ遺伝子、Ｃｙｌｄ遺伝子およびＺｂｔｂ４遺伝子からなる群より選択されるクラスター標的遺伝子、さらに好ましくはＲｃａｎ３遺伝子を標的とすることができる。より好ましい実施形態において、前記シングルガイドＲＮＡはＲｃａｎ３遺伝子を標的とすることができる。

前記標的遺伝子の不活性化はまた、部位特異的塩基エディターの使用によって、例えば、早期終止コドンを導入すること、開始コドンを欠失させること、またはＲＮＡスプライシングを変化させることによって、実施され得る。塩基編集は、ＤＮＡの二本鎖切断を起こすことなく、ＤＮＡに正確な点突然変異を直接生じさせる。特定の実施形態において、塩基編集は、触媒的に損なわれたＣａｓヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ上で機能する塩基修飾酵素との間の融合を含むＤＮＡ塩基エディターを使用することによって行われる（総説については、Rees H.A. et al. Nat Rev Genet. 2018. 19(12):770－788を参照のこと。

別の実施形態において、前記免疫細胞は、ｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子の発現を抑制するように設計される。ｍｉＲ－１７～９２クラスターによって媒介される抑制は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物、低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡに基づき得る。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１７～９２標的遺伝子ｍＲＮＡへの結合により、その翻訳を阻害し、従ってタンパク質翻訳を妨げるか、またはｍＲＮＡの分解を増加させることにより、細胞内でのｍｉＲ－１７～９２標的遺伝子のレベル、ひいては活性を減少させるように直接作用するであろう。例えば、少なくとも約１５塩基であり、ｍＲＮＡ転写配列のユニークな領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば、従来のホスホジエステル技術によって合成され得、そして例えば、静脈内注射または注入によって投与され得る。その配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するための、アンチセンス技術を使用するための方法は、当該分野で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；同第６，５６６，１３１号；同第６，３６５，３５４号；同第６，４１０，３２３号；同第６，１０７，０９１号；同第６，０４６，３２１号；および同第５，９８１，７３２号を参照のこと）。

別の実施形態において、低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明においてｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子発現レベルを低下させるために使用され得る。ｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子発現は、ｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子発現が特異的に阻害されるような（すなわち、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、または低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターもしくは構築物を、細胞内に導入することにより減少させることができる。適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、その配列が公知である遺伝子について当該分野で周知である（例えば、Tuschl, T. et al. (1999)；Elbashir, S. M. et al. (2001)；Hannon, GJ. (2002)；McManus, MT. et al. (2002)；Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許番号第６，５７３，０９９号および第６，５０６，５５９号；ならびに国際特許公開番号ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ９９／３２６１９、およびＷＯ０１／６８８３６を参照のこと）。

別の実施形態において、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）もまた、本発明においてｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子発現レベルを低下させるために使用され得る。ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）はＲＮＡの配列であり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用できるタイトヘアピンターンを作る。細胞におけるｓｈＲＮＡの発現は、典型的には、プラスミドの送達によって、またはウイルスもしくは細菌ベクターを介して達成される。強固なｓｈＲＮＡ発現を達成するためには、プロモーターの選択が不可欠である。当初、Ｕ６およびＨＩなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーターが用いられたが、これらのプロモーターは空間的および時間的制御を欠いている。そのため、ポリメラーゼＩＩプロモーターを用いてｓｈＲＮＡの発現を調節する転換があった。

別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ干渉もまた、本発明においてｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子発現レベルを低下させるために使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ干渉は、エンドヌクレアーゼ活性を欠くが、転写リプレッサーと共役し、ＲＮＡ誘導抑制を用いて特定の遺伝子をダウンレギュレートする、触媒的に活性のないＣａｓ９タンパク質を用いる。標的特異性は、ゲノム遺伝子座に対するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の相補的塩基対形成により決定される。好ましくは、エンドヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓ９タンパク質または他のＣａｓをコードする核酸構築物と、好ましくはＲＣＡＮ１、ＲＣＡＮ２、ＲＣＡＮ３遺伝子、Ｃａｓｔ遺伝子、Ｃｙｌｄ遺伝子およびＺｂｔｂ４遺伝子からなる群より選択されるｍｉＲ１７～９２クラスター標的遺伝子、好ましくはＲＣＡＮ３遺伝子に特異的なシングルガイドＲＮＡとを免疫細胞に導入することによって、免疫細胞が設計される。

好ましい実施形態において、免疫細胞は、前記ヌクレアーゼ、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物、低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡを含む、上記のような核酸構築物を免疫細胞に導入することによって遺伝子操作される。より好ましい実施形態において、前記核酸構築物は上記のベクターである。

より好ましい実施形態において、免疫細胞は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、少なくとも１つのｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子、好ましくはＲＣＡＮ１、ＲＣＡＮ２、ＲＣＡＮ３遺伝子、Ｃａｓｔ遺伝子、Ｃｙｌｄ遺伝子およびＺｂｔｂ４遺伝子からなる群より選択される標的遺伝子、より好ましくはＲｃａｎ３遺伝子を標的とすることができる、本明細書ではシングルガイドＲＮＡとも呼ばれるガイドＲＮＡとを免疫細胞に導入することによって、設計される。前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするベクターもしくはｍＲＮＡなどの核酸構築物を導入することによって、またはＣａｓ９タンパク質を前記細胞に直接導入することによって、前記細胞に導入することができる。本明細書中で使用される場合、用語「免疫細胞」は、造血起源であり、そして免疫応答において役割を果たす細胞を含む。免疫細胞には、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球などの骨髄細胞が含まれる。

本明細書中で使用される場合、用語「Ｔ細胞」は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を有する細胞を含む。本発明によるＴ－細胞は炎症性Ｔ－リンパ球、細胞毒性Ｔ－リンパ球、調節性Ｔ－リンパ球、腫瘍浸潤リンパ球またはヘルパーＴリンパ球からなる群より選択することができる。ヘルパーＴ細胞は１型および２型ヘルパーＴ細胞およびＴｈ１７ヘルパー細胞の両方を含む。別の実施形態において、前記細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋ Ｔ－リンパ球、又はＭＲ１拘束性Ｔ細胞、ＭＡＩＴ細胞、ＭＲ１Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞又は自然発生様Ｔ細胞のような非古典的Ｔ細胞からなるグループに由来することができる。前記免疫細胞は、健康なドナーまたは対象に由来し得る。

免疫細胞は、血液から抽出され得るか、または幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より詳細には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞はＣＤ３４＋細胞である。

Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む多くの非限定的な供給源から得ることができる。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離のような当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液のユニットから得られ得る。一実施形態において、対象の循環血液からの細胞がアフェレーシスによって得られる。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから単離される。ＰＢＭＣは、全血の密度勾配遠心分離、例えば、ＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（商標）勾配、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配またはＦＩＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって得られるバフィーコートから単離され得る。Ｔ細胞は、単球の枯渇によって、例えばＣＤ１４ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を用いることによって、ＰＢＭＣから単離され得る。いくつかの実施形態において、赤血球は、密度勾配遠心分離の前に溶解され得る。

別の実施形態において、前記細胞は、健康なドナー、癌もしくは自己免疫疾患と診断された対象、または感染していると診断された対象に由来し得る。

一般に、免疫細胞は、活性化されそして増殖させて、ＡＣＴ治療において利用される。本発明の免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで増殖させることができる。免疫細胞、特にＴ細胞は、当技術分野で公知の方法を一般に使用して活性化および増殖させることができる。一般に、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤、およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを付着させた表面と接触させることによって増殖させられる。

養子細胞移植治療における使用のために、特定の実施形態において、免疫細胞は、所望の特異性および増強された機能性を示すように改変され得る。特に、免疫細胞は、特定の標的に向けられるように改変され得る。特定の実施形態において、前記免疫細胞は、その細胞表面上に組換え抗原レセプターを発現し得る。「組換え～」とは、その天然の状態で細胞によってコードされない、すなわち、異種性、非内因性である抗原レセプターを意味する。したがって、組換え抗原レセプターの発現は、免疫細胞に新たな抗原特異性を導入し、細胞にこれまで認識されていなかった抗原を認識させ、結合させることがわかる。抗原レセプターは、任意の有用な供給源から単離され得る。

特定の実施形態において、前記組換え抗原レセプターは組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）である。ＴＣＲはＴ細胞の表面に存在し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとして抗原の断片を認識する役割を担っている。ほとんどのＴＣＲはα鎖およびβ鎖を含み、これらは両方とも可変領域および定常領域からなる。可変領域は鎖のＮ末端に位置し、完全に細胞外にある。定常領域は鎖のＣ末端に位置し、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび短い細胞質ドメインからなる。ＴＣＲ鎖は、Ｎ末端シグナル（またはリーダー）配列を有する未成熟形態でコードされ、合成される。この配列は、それが合成される場合、αまたはβＴＣＲ鎖の可変領域のＮ末端を形成する。ＴＣＲ鎖の合成に続いて、シグナル配列は切断され、細胞表面にある成熟ＴＣＲには提示しない。

α鎖またはβ鎖の可変領域は、３つの超可変な相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。これらのＣＤＲはＴＣＲの特異性を決定し、ＣＤＲ３（すなわち、Ｎ末端から３番目のＣＤＲ）は、ＴＣＲ特異性を決定する際に最も重要なＣＤＲである。ＴＣＲは特異的なＭＨＣ－抗原複合体を認識する。ＴＣＲがその同族のＭＨＣ－抗原複合体に結合すると、Ｔ細胞は増殖するように刺激され、そのエフェクター機能が活性化される。このように、Ｔ細胞は組換えＴＣＲを発現するように改変することにより、容易にリダイレクトできる。医学的に興味深い多くのＴＣＲが知られており、臨床試験および治療に使用されている。

本発明において有用な別の組換え抗原レセプターは、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）である。ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達ドメインに連結された、典型的には抗体に由来する抗原結合ドメインを含む融合タンパク質である。ＣＡＲは、適切な抗原結合ドメインが選択される場合、標的抗原に対してＴ細胞またはＮＫ細胞のような免疫細胞を誘導するために使用され得る。

ＣＡＲの抗原結合ドメインは、典型的には抗体に由来するｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）に基づく。Ｎ末端の細胞外抗体結合ドメインに加えて、ＣＡＲは典型的には、抗原結合ドメインをそれが発現される免疫エフェクター細胞の原形質膜から離れて伸長させるためのスペーサーとして機能するヒンジドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＴＣＲ複合体のＣＤ３分子（ＣＤ３ζ）のゼータ鎖からのシグナル伝達ドメイン、または同等物）、および場合によりＣＡＲを発現する細胞のシグナル伝達または機能性を補助し得る１つ以上の共刺激ドメインを含み得る。ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む共刺激分子からのシグナル伝達ドメインを、単独（第２世代）または組み合わせ（第３世代）で添加し、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞の生存を増強し、増殖を増加させることができる。

当業者は、本発明に従って使用される免疫細胞をリダイレクトするための適切な抗原レセプターを選択することができる。特定の実施形態において、本発明の方法において使用するための免疫細胞は、リダイレクトされたＴ細胞、例えばリダイレクトされたＣＤ８＋ Ｔ細胞またはリダイレクトされたＣＤ４＋ Ｔ細胞である。

組換え抗原レセプターまたは表面タンパク質を発現するように免疫細胞を遺伝的に改変することができる方法は、当技術分野で周知である。抗原レセプターまたは表面タンパク質をコードする核酸分子は、例えば、ベクターまたは任意の他の適切な核酸構築物の形態で細胞に導入され得る。ベクターおよびそれらに必要な成分は、当技術分野で周知である。抗原レセプターをコードする核酸分子は、当該分野で公知の任意の方法、例えばＰＣＲを使用する分子クローニングを使用して生成され得る。抗原レセプター配列は、部位特異的突然変異誘発のような、一般的に使用される方法を使用して改変され得る。

特定の実施形態において、免疫細胞は、癌抗原に対してリダイレクトされる。「癌抗原」とは、癌に関連する任意の抗原（すなわち、免疫応答を誘導することができる分子）を意味する。本明細書で定義される抗原は、免疫応答を誘導する任意の種類の分子であり得、例えば、それは多糖類または脂質であり得るが、最も好ましくはペプチド（またはタンパク質）である。ヒト癌抗原は、ヒトまたはヒト由来であり得る。がん抗原は、腫瘍特異的抗原であってもよく、これは健康な細胞には存在しない抗原を意味する。腫瘍特異的抗原は、一般的に突然変異、特に、健康なヒトプロテオームには見られない全く新しいアミノ酸配列を生成するフレームシフト突然変異に起因する。

癌抗原には腫瘍関連抗原も含まれ、腫瘍関連抗原は、その発現または生産が腫瘍細胞に関連する（限定されるわけではない）抗原である。腫瘍関連抗原の例としては、Ｈｅｒ２、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌抗原－１２５（ＣＡ－１２５）、ＣＡ１９－９、カルレチニン、ＭＵＣ－１、上皮膜タンパク質（ＥＭＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９９、ＣＤｌ１７、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グロス嚢胞性疾患液タンパク質（ＧＣＤＦＰ－１５）、ＨＭＢ－４５抗原、タンパク質メラン－Ａ（Ｔリンパ球によって認識されるメラノーマ抗原；ＭＡＲＴ－１）、ｍｙｏ－Ｄｌ、筋肉特異的アクチン（ＭＳＡ）、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィジス（synaptophysis）、サイログロブリン、甲状腺転写因子１、ピルビン酸キナーゼアイソザイムタイプＭ２（腫瘍Ｍ２ＰＫ）の二量体形、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＧＤ２（ガングリオシドＧ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮増殖因子変異体ＩＩＩ）、精子タンパク質１７（Ｓｐｌ７）、メソテリン、ＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、プロステイン、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞レセプターガンマ交互リーディングフレームタンパク質）、Ｔｒｐ－ｐ８、ＳＴＥＡＰ１（前立腺１の六重膜上皮抗原）、異常なｒａｓタンパク質、または異常なｐ５３タンパク質などが含まれる。別の具体的な実施形態において、前記腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原は、インテグリンανβ３（ＣＤ６１）、ガラクチン、Ｋ－Ｒａｓ（Ｖ－Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス性癌遺伝子）、またはＲａｌ－Ｂである。

特定の実施形態において、免疫細胞は、下記から選択される表面タンパク質に対して向けられる：
ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗｌ２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｕ、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１５ｓｕ、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６０ｂ、ＣＤ６０ｃ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５ａ、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ８５ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１４９、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｅ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６７ｂ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７ａ、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０ＣＥ、ＣＤ２４０ＤＣＥ、ＣＤ２４０Ｄ、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、ＣＤ３６３、ＣＤ３６４、ＣＤ３６５、ＣＤ３６６、ＣＤ３６７、ＣＤ３６８、ＣＤ３６９、ＣＤ３７０、ＣＤ３７１、ＢＣＭＡ、免疫グロブリン軽鎖（ラムダまたはカッパ）、ＨＬＡタンパク質、およびβ２－ミクログロブリン。

他の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、感染に関連する抗原、例えば、細菌、ウイルス、寄生虫または真菌由来の抗原に対してリダイレクトされ得る。免疫細胞は、別法として、自己免疫疾患に関連する抗原、または臓器拒絶反応に関連する抗原、特にＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩに対してリダイレクトされ得る。

さらなる態様において、本発明はまた、１つ以上の薬学的または生理学的に許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、上記のＣＮＩ耐性免疫細胞を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、薬学的組成物はシクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ＣＴＬＡ－４ ＩｇおよびＣＤ２８遮断剤などの上記のカルシニューリン阻害剤をさらに含むことができる。

薬学的組成物は、投与経路に従って薬学的に許容可能なキャリア中に製剤化される。好ましくは、組成物は静脈内注入によって投与されるように製剤化される。このような投与に適した薬学的組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質または懸濁剤もしくは増粘剤を含有し得る、使用直前に滅菌注射溶液または分散液に再構成され得る、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張水溶液もしくは非水溶液（例えば、平衡塩溶液（ＢＳＳ））、分散液、懸濁液もしくは乳濁液、または無菌粉末と組み合わせて、免疫細胞を含み得る。

必要に応じて、免疫細胞を含む組成物は、細胞の保存に適切な任意の温度での保存のために凍結され得る。例えば、細胞は、約－２０℃、－８０℃または任意の他の適切な温度で凍結され得る。低温凍結細胞は、適切な容器に保存され、保存のために調製されて、細胞損傷の危険性を減少させ、細胞が解凍を生き延びる可能性を最大化し得る。もしくは、細胞はまた、例えば約４℃で冷蔵された室温で維持されてもよい。

投与される免疫細胞の量は、当業者に周知の標準的な手順によって決定され得る。適切な用量を決定するために、患者の生理学的データ（例えば、年齢、サイズ、および重量）、ならびに処置される疾患の型および重篤度が考慮されなければならない。本発明の薬学的組成物は、単回用量または複数回用量として投与することができる。各々の単位投薬量は例えば、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重の投薬量を含み得る。

薬学的組成物は、コルチコステロイド、抗生物質、鎮痛剤、免疫抑制剤、栄養因子、またはそれらの任意の組合せなどの、１つまたはいくつかの追加の活性化合物をさらに含むことができる。本発明に従って使用される免疫細胞の全ての実施形態もまた、この態様において企図される。

本発明によれば、本発明によるＣＮＩ耐性免疫細胞は、カルシニューリン阻害剤治療を受けている対象における養子細胞移植治療に使用される。本発明による養子細胞移植療法は、癌、自己免疫疾患、感染症、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を必要とする疾患と診断された対象を治療、または臓器拒絶反応を予防するために使用することができる。

本明細書中で使用される場合、用語「対象」または「患者」は動物、好ましくはヒト、ブタ、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、マウス、ウサギまたはラットを含む、免疫応答が誘発され得る哺乳動物を指す。より好ましくは、対象は成人、子供および出生前段階のヒトを含むヒトである。

本明細書中で使用される場合、用語「処置（treatment）」、「処置する（treat）」または「処置している（treating）」は、疾患の治療、予防（prevention）、予防処置（prophylaxis）および遅延のような、患者の健康状態を改善することが意図される任意の行為を指す。特定の実施形態において、このような用語は、疾患または疾患に関連する症状の改善または根絶を指す。他の実施形態において、この用語は、このような疾患を有する対象への１つ以上の治療薬の投与から生じる、疾患の広がりまたは悪化を最小限にすることを指す。

治療され得る癌には、血管新生されていない腫瘍、またはまだ実質的に血管新生されていない腫瘍、ならびに血管新生腫瘍が含まれる。癌は非固形腫瘍（例えば、再発を含む白血病およびリンパ腫、ならびに造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の二次性悪性腫瘍などの治療関連腫瘍などの血液腫瘍）を含み得るか、または固形腫瘍を含み得る。本発明の免疫細胞で処理される癌のタイプは、限定されるものではないが、癌腫、芽腫、および肉腫、およびある種の白血病またはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば肉腫、癌腫、および黒色腫を含む。成人の腫瘍／癌および小児の腫瘍／癌も含まれる。抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光線療法および放射線療法のグループから選択される、癌に対する１つ以上の療法と組み合わせた治療法であることができる。特に興味深いのは、免疫抑制患者に起こる移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）である。例えば、養子移植されたＥＢＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＥＢＶ－ＣＴＬ）は、固形臓器移植レシピエントにおけるＥＢＶ関連ＰＴＬＳの治療に有効である。さらに、免疫抑制患者は一般に癌発生のリスクが高いため、他の新生物も同様に対象となる。

本明細書で使用される用語「自己免疫疾患」は、自己免疫応答から生じる障害として定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な応答の結果である。自己免疫疾患の例にはとりわけ、アジソン病、大脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫肝炎、自己免疫耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉタイプ）、栄養障害性表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン－バー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本開示による自己免疫疾患は、ＣＮＩおよびＣＴＬＡ４－Ｉｇを含む免疫抑制薬で治療される自己免疫障害である。例えば、Ｂ細胞を含む自己反応性細胞の細胞療法ベースの枯渇は、免疫抑制薬と組み合わせてＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＡＲ－Ｔ細胞を用いて達成することができ、同種ＨＳＣＴ後に生じ得る移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は例えば、Ｔｒｅｇ、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇもしくは他の抑制性免疫細胞と免疫抑制との組み合わせで細胞性Ｔ細胞療法を用いて達成することができ、または病原性同種反応性Ｔ細胞枯渇は、免疫抑制と組み合わせてＴ細胞ベースの療法を用いて達成することができる。

感染症は、細菌、ウイルス、寄生虫または真菌などの病原微生物によって引き起こされる疾患である。特定の実施形態において、本開示における感染は、免疫抑制患者、例えばＨＳＣＴ後の患者または固形臓器移植を受けた患者において生じる。ＣＮＩまたはＣＴＬＡ４－Ｉｇの使用または他の免疫抑制を必要とするあらゆる疾患は、時に重篤または致死的な感染症に罹患しやすくする。Ｔ細胞に基づく治療法は、例えばＨＳＣＴ後のリンパ球減少症および好中球減少症患者に対する有望な治療法である。例えば、病原体特異的、例えばウイルス特異的Ｔ細胞を濃縮または設計し、患者に適用することができる。患者がＣＮＩとＣＴＬＡ４－Ｉｇを含む免疫抑制薬を同時に投与されている場合、抗病原体Ｔ細胞ＣＮＩを耐性にすることは特に重要である。

炎症性疾患は、慢性炎症性疾患、自己免疫起源の慢性炎症性疾患、癌の場合の炎症誘発性および炎症状態からなる群から選択される。

造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、先天性と後天性の両方の多くの病態の治療に用いられることがある。ＨＳＣＴを必要とする後天性疾患には急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫（カーラー病）、神経芽腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、ユーイング肉腫、絨毛癌、骨髄異形成、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ；重症再生不良症）、再生不良性貧血、後天性赤芽球癆、真性赤血球増加症、多血球増加症、本態性血小板増加症、骨髄線維症、アミロイドーシス、アミロイドＬ鎖（ＡＬ）アミロイドーシス、放射線中毒、ＨＴＬＶ、ＨＩＶが含まれるが、これらに限定されない。ＨＳＣＴを必要とする先天性疾患には、リピドーシス、ニューロン性セロイドリポフスチノーシス、新生児神経セロイドリポフスチン症、ヤンスキー－ビエルシュスキー病、スフィンゴリピドーシス、ニーマン－ピック病、ゴーシェ病、白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、異染性白質萎縮症、クラッベ病、ムコ多糖症、ハーラー症候群、シェイエ症候群、ハーラー－シェイエ症候群、ハンター症候群、イズロニダーゼ硫酸塩欠乏症、サンフィリポ症候群、モルキオ症候群、マロテオー－ラミー症候群、スリー症候群、グリコプロテイノーシス、ムコリピドーシスＩＩ、フコシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、アルファ－マンノシドーシス、ウォルマン病、毛細血管拡張性運動失調症、ディジョージ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ヴィスコット・オールドリッチ症候群、Ｋｏｓｔｍａｎｎ症候群、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、グリセリ症候群、ＩＩ型、ＮＦ－カッパ－Ｂ必須モジュレーター（ＮＥＭＯ）欠損症、鎌状赤血球病、βサラセミアメジャー、再生不良性貧血、ダイアモンド－ブラックファン貧血、ファンコニ貧血、血球減少症、無巨核球性血小板減少症、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

「臓器拒絶反応」という用語は、移植された臓器または組織がレシピエントの身体によって受容されない状態を意味する。拒絶反応は、レシピエントの免疫系が移植された臓器や組織を攻撃することによって起こる。拒絶反応は、移植後数日から数週間（急性）、または移植後数カ月から数年（慢性）に起こりうる。例えば、Ｔｒｅｇ、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇまたは他の抑制性免疫細胞を用いて、免疫抑制と組み合わせて臓器拒絶反応を予防または治療する細胞性Ｔ細胞療法は特に興味深い。同種固形臓器グラフトを受けている患者は、同じ同種ドナーからのＨＳＣと同時に移植されれば、耐性にすることができる。しかし、この治療法はＧｖＨＤのリスクを負い、免疫抑制薬を伴う。

別の実施形態において、本発明は、癌、自己免疫疾患、感染性疾患を処置するための、またはそれを必要とする対象における臓器拒絶反応の予防のための方法であって、ｍｉＲ－１７～９２クラスターもしくはそのパラログの調節活性が増加する、治療的に有効な量のＣＮＩ耐性免疫細胞、好ましくはｍｉＲ－１７～９２クラスターもしくはそのパラログの少なくとも１つのｍｉＲＮＡを過剰発現するように設計されたＣＮＩ耐性免疫細胞、または本発明の薬学的組成物を、免疫抑制剤としてのカルシニューリン阻害剤、例えば、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６（タクロリムスまたはＣＴＬＡ４－Ｉｇとも呼ばれる）と組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）投与することを含む、方法に関する。

「治療的に有効な量」とは、上記で定義した治療を構成するのに十分な、対象に投与されるＣＮＩ耐性免疫細胞の量を意味する。

特定の実施形態において、ＡＣＴ治療において利用される免疫細胞は、ＣＮＩの存在下で予め培養されて、ｍｉＲ－１７～９２クラスターまたはそのパラログの調節活性が増加するＣＮＩ耐性免疫細胞を選択する。ＣＮＩの存在下では、ｍｉＲ－１７～９２クラスターまたはそのパラログの調節活性を有するＣＮＩ耐性免疫細胞のみが、好ましくはｍｉＲ－１７～９２クラスターもしくはそのパラログの少なくとも１つのｍｉＲＮＡを過剰発現するように上記のように設計されるか、または少なくとも１つのｍｉＲ－１７９２クラスター標的遺伝子の発現を不活性化または抑制するように設計される。従って、本開示は、先に記載されるようなＣＮＩ耐性免疫細胞を調製する方法であって、ｉ）ｍｉＲ－１７～９２クラスターもしくはそのパラログの標的遺伝子の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを過剰発現するように、または上記のような少なくとも１つのｍｉＲ－１７～９２クラスター標的遺伝子の発現を不活性化するように免疫細胞を設計する工程、ｉｉ）ＣＮＩの存在下で前記免疫細胞を培養する工程、ｉｉｉ）ＣＮＩ耐性免疫細胞を選択する工程、を包含する方法に関する。

任意に、ＣＮＩ耐性は、選択の工程の後に、例えば、ｍｉＲ－１７～９２クラスターの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現を不活性化することによって、または少なくとも１つのｍｉＲ－１７９２クラスター標的遺伝子を発現することによって、除去され得る。この特定の場合において、細胞に付与されたＣＮＩ耐性は、好ましくはＡＣＴ治療において利用される前に、ｅｘ ｖｉｖｏで正しく標的化された細胞を選択するためのレポーター遺伝子として使用される。

別の特定の実施形態において、前記ＣＮＩ耐性免疫細胞は、したがって、それを必要な対象におけるＡＣＴ治療に利用することができる。したがって、特定の実施形態において、本開示は以下を含む、癌、自己免疫疾患、感染性疾患を処置するための、またはそれを必要とする対象における臓器拒絶反応の予防のための方法に関する：ｉ）先に記載されるようにＣＮＩ耐性免疫細胞を調製する工程、およびｉｉ）治療的に有効な量のＣＮＩ耐性免疫細胞を、免疫抑制剤としてのカルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡ、ＦＫ５０６（これはまた、タクロリムスまたはＣＴＬＡ４－Ｉｇと呼ばれる）と組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）投与する工程。

本発明による免疫細胞または薬学的組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植または注入を含む任意の好都合な様式で実施され得る。本明細書に記載の組成物は、患者に皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ管内注射によって、または腹腔内投与することができる。別の実施形態において、本発明の免疫細胞または薬学的組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。本発明の免疫細胞または薬学的組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射され得る。

細胞または細胞の集団の投与は、体重ｋｇ当たり１０^４－１０^９細胞、好ましくは１０^５から１０^７細胞／体重ｋｇであり、これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む。細胞または細胞の集団は、１つまたは複数の用量で投与することができる。別の実施形態において、前記有効な量の細胞は、単回用量として投与される。別の実施形態において、前記有効な量の細胞はある期間にわたって１回より多い用量として投与される。投与のタイミングは管理医師の判断の範囲内であり、対象の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から得ることができる。個々の必要性は変化するが、特定の疾患または状態についての所与の細胞型の有効な量の最適範囲の決定は当業者の技術範囲内である。有効な量は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康および体重、もしあれば同時治療の種類、治療の頻度ならびに所望の効果の性質に依存する。別の実施形態において、細胞またはそれらの細胞を含む組成物の前記有効な量は、非経口的に投与される。

ＣＮＩ耐性免疫細胞または薬学的組成物は、免疫抑制剤としてのカルシニューリン阻害剤、例えばタクロリムスまたはＣＴＬＡ４－Ｉｇとも呼ばれるシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６と組み合わせて（例えば、前、同時または後に）対象に投与される。

本発明の特定の実施形態において、本発明によるＣＮＩ耐性免疫細胞はまた、免疫チェックポイント経路阻害剤、例えばＰＤ－１阻害剤、ＰＤＬ－１阻害剤またはＣＴＬＡ－４阻害剤、好ましくはＰＤ－１阻害剤、特に抗ＰＤ１抗体と組み合わせて（例えば、前、同時または後に）対象に投与され得る。

以下の実施例は例示の目的で与えられるものであり、限定の目的で与えられるものではない。

〔実施例〕
〔１．材料および方法〕
〔１．１ マウス〕
Ｃ５７ＢＬ／６－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ３（ＣＡＧ－ＭＩＲ１７－９２，－ＥＧＦＰ）Ｒｓｋｙ／Ｊ（ｍｉＲ１７９２Ｔｇ）（Xiao, C., et al., Nat Immunol, 2008. 9(4):405－14）およびＭｉｒｃ１ｔｍ１．１Ｔｙｊ／Ｊ（ｍｉＲ１７９２ｌｏｘ）（Ventura, A., et al., Cell, 2008. 132(5):875－86）マウスを、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｃｄ４－ｃｒｅ）１Ｃｗｉ／ＢｆｌｕＪ（ＣＤ４ｃｒｅ）（Lee, P.P., et al. Immunity, 2001. 15(5):763－74）と交配させた。Ｃｒｅネガティブ同腹子をｗｔコントロールとした。Ｂ６．ＣＤ４ｃｒｅ．Ｒ２６ｍｉＲ１７９２ｔｇ株を、レスキューモデルのためにＣｄ２８ｋｏマウス（Shahinian, A., et al. Science, 1993. 261(5121):609－12）とさらに交配させ、ここではｃｒｅネガティブ同腹子をＣＤ２８ｋｏとして使用した。雄マウスおよび雌マウスを、実験の開始日に５～６週齢で使用した。動物は、大学病院バーゼルの生物医学部の施設指針に従って、特別な病原体のない条件下で飼育した。

〔１．２ 臓器・血液分離〕
臓器はＣＯ_２安楽死後に採取し、処理中氷上に保管した。腸間膜リンパ節（ＬＮ）、鼠径部ＬＮ、腋窩ＬＮ、上腕ＬＮ、頸部ＬＮおよび脾臓を大部分の実験のために採取した。脾臓に、処理前に赤血球溶解のために０．５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液を注射した。器官を０．４μｍフィルターでメッシュし、単細胞懸濁液を得、次いでこれをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。ＥＬＩＳＡ用の血液は、安楽死させた直後に心臓穿刺で採取した。血液を室温で３０分間ワックスチューブ中でインキュベートし、次いで１０分間７０００ｒｐｍで遠心分離して血清を分離した。次いで、血清を新鮮なチューブに移し、分析まで－２０℃で凍結した。

〔１．３ ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞単離〕
リンパ節および脾臓をプールした細胞懸濁液からナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を単離した。ＳｔｅｍＣｅｌｌマウスナイーブＣＤ４ Ｔ細胞単離キットを用いて、製造業者の説明書に従って単離を行った。次いで、得られた非接触ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、純度を、ＣＤ４、ＣＤ４４についての染色および生存率で日常的にチェックした。

〔１．４ 細胞トレースバイオレット（ＣＴＶ）による増殖アッセイ〕
新たに単離したナイーブＣＤ４ Ｔ細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで、１０×１０^６細胞について、１ｍｌのＰＢＳ当たり１μｌのセルトレースストック溶液（製造業者の説明書に従ってＤＭＳＯに溶解した）を使用した。細胞を３７℃で２０分間インキュベートし、次いで、元の染色体積の５倍の正常Ｔ細胞培養培地を５分間添加して、残留色素を除去した。次いで、細胞を再び洗浄し、完全培養培地中にプレーティングした。

〔１．５ プレート結合ＣＤ４ Ｔ細胞活性化〕
ほとんどの実験（低刺激（Baumjohann, D., et al. Nat Immunol, 2013. 14(8):840－8））のために、１ｍｌのＰＢＳあたり０．２μｇのαＣＤ２８および０．５μｇのαＣＤ３でプレートを一晩コーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄した後、１ウェルあたり２×１０^５細胞を、１ｍＬあたり５０Ｕ ＩＬ－２を含む２００μｌ培地中の９６ウェル平底に平板培養した。２４ウェルプレートについては、培地１ｍＬ当たり２×１０^６細胞をプレーティングした。

〔１．６ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化〕
ＴＨ１分化条件を、５０Ｕ ＩＬ－２、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ１２および１０μｇ／ｍｌ αＩＬ４／ｍｌ Ｔ細胞培地を用いて生成した。ＴＨ２分化条件は、５０Ｕ ＩＬ－２、５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ４、５μｇ／ｍｌ αＩＦＮγおよび１０μｇ／ｍｌ αＩＬ１２／ＩＬ２３で達成された。ｉＴｒｅｇは、レチノイン酸（０．９ｍＭ）の有無にかかわらず、常に２５０Ｕ ＩＬ－２、０．７５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ、１０μｇ／ｍｌ αＩＦＮγおよび１０μｇ／ｍｌ αＩＬ４で分化した。ＴＨ１７は、１ｍＬあたり５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ６、３ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ、５μｇ／ｍｌ αＩＦＮγおよび１０μｇ／ｍｌ αＩＬ４のＴ細胞培地を用いて生成した。分化のために、２×１０^５のナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を、予めコーティングした９６ウェル平底プレート（１ｍＬあたり０．２μｇ ａＣＤ２８、０．５μｇ ａＣＤ３のＰＢＳで一晩コーティング）上にプレーティングし、プレーティングの２４時間、４８時間または７２時間後に回収した。次に、Ｔ細胞サブセットを顕著なサイトカイン／転写因子の組み合わせ：ＴＨ１（Ｔｂｅｔ／ＩＦＮγ）、ＴＨ１７（Ｒｏｒγｔ／ＩＬ１７Ａ）およびｉＴｒｅｇ（ＦｏｘＰ３／ＣＤ２５）について染色した。

〔１．７ Ｓｅａｈｏｒｓｅ〕
キャリブレーションプレートを２００μｌのキャリブラントで一晩コーティングした。細胞プレートを、１８μｌの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．０ ６．６７％ ＣｅｌｌＴａｋ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６ ｆｌｕｘ ｐａｃｋ、Ｂｕｃｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＣＨ）でコーティングした。翌日、細胞プレートをＨ_２Ｏで洗浄し、細胞調製中に乾燥させるために放置した。化合物を、オリゴマイシンについては１μＭ、ＦＣＣＰについては２μＭ、およびロテノンについては１１μＭの最終インウェル濃度で調製した。無グルコースＲＰＭＩ中で細胞を調製し、洗浄し、多数回カウントした後、無グルコースＲＰＭＩ中でウェル当たり３×１０^５細胞を平板培養した。ミトコンドリア摂動を、グルコース（８０ｍＭストック）、オリゴマイシン、ＦＣＣＰおよびロテノンの連続注入によって行った。酸素消費速度（ＯＣＲ、ｐＭｏｌｅｓ／分）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ；ｍｐＨ／分）の測定を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６フラックス分析器（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いて行った。Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ７．０ｄ）を用いてデータ分析を行い、Ｇｕｂｓｅｒら（Gubser, P.M., et al. Nat Immunol, 2013. 14(10)：p. 1064－72）に記載されているようにミトコンドリアパラメータを計算した。

〔１．８ ＦＡＣＳ染色〕
サイトカイン染色のために、細胞を染色前に、３７℃で３時間、５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ、５００ｎｇ／ｍｌ イオノマイシンおよび１０μｇ／ｍｌ ＢＦＡで刺激した（ＬＣＭＶ実験におけるＰＭＡ／Ｉｏｎｏの代わりにＧＰ－６４、ＬＣＭＶ項を参照のこと）。次いで、細胞を、まず、４℃で２０分間、ＰＢＳ中のviability dye７８０で生存能力について染色し、次いで、ＰＢＳで洗浄した。非特異的結合は、１０分間氷上でａＣＤ１６／ａＣＤ３２ ０．５ｍｇ／ｍｌでブロックした。表面染色を、ＦＡＣＳ緩衝液中、４℃で２０～３０分間行った。細胞固定は、Ｆｉｘ－Ｐｅｒｍを用いて４℃で少なくとも２０分間行った（ＬＣＭＶ実験では１時間）。細胞内染色は、４℃で１時間、透過処理緩衝液中で行った。データはＦｏｒｔｅｓｓａで入手し、ＦｌｏｗＪｏ（ｖｅｒｓｉｏｎ１０．４．１）で分析した。

〔１．９ ｑＰＣＲ用のＲＮＡ抽出〕
細胞をＰＢＳで洗浄した後、計数し、ＲＮＡを氷上に保持した。次に、５×１０^５細胞を４００μｌのＴＲＩ試薬に再懸濁した。次いで、ＲＮＡ単離を、ＴＲＩ試薬供給者（ＳＩＧＭＡ）からの単離プロトコルに従って行った。簡単に述べると、ＴＲＩ試薬１ｍｌ当たり０．１ｍｌの１－ブロモ－３－クロロプロパンを添加し、サンプルを混合し、室温で１５分間インキュベートし、次いで、相分離のために４℃で１５分間１２’０００ｇで遠心分離した。次いで、水相を、使用したＴＲＩ試薬１ｍｌ当たり０．５ｍｌのイソプロパノールと混合し、再びＲＮＡ沈殿のために１０分間遠心分離した。次いで、ＲＮＡを７５％エタノールで洗浄し、最後にＲＮＡｓｅを含まない水に再懸濁した。その後、ＲＮＡ濃度および純度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。

〔１．１０ ＲＮＡ配列決定のためのＲＮＡ抽出、プロテオミクスのためのタンパク質抽出および消化〕
抽出のための全ての手順は、設備の専門家の材料、プロトコルおよび監督によって設備で実施した。配列決定のためのＲＮＡを、ＤＮＡｓｅ処置を含むＺｙｍｏ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌキットを用いてＴｒｉｚｏｌサンプルから抽出した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて品質管理を行った。タンパク質を抽出し、Ｌｙｓ－Ｃおよびトリプシンによる質量分析のために消化した。

〔１．１１ 逆転写および定量ＰＣＲ〕
Ｒｃａｎ３ ｑＰＣＲについては、１μｇ ＲＮＡについてＳＩＧＭＡ ＭＭＬＶキットを用いてｃＤＮＡを生成した。ｑＰＣＲは、Ｒｃａｎ３を観察する実験の参考として１８Ｓを用いて行った。ｑＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標） Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム上でＴａｑＭａｎ ＦＡＳＴ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックスを用いて行った。

〔１．１２ ２－ＮＢＤＧによるグルコース取込み染色〕
２×１０^５のナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を培地で洗浄し、次いで、５０μＭの２－ＮＢＤＧを加えた培地と共に３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、元の染色量の５倍の標準Ｔ細胞培養培地を５分間添加して、残留色素を除去した。次いで、細胞を再び洗浄し、ＦＡＣＳ分析の前に生存率および表面マーカーについて染色した。

〔１．１３ ＥＬＩＳＡ法〕
ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸマウスＩＬ－２セットを用いて、製造業者の説明書に従って行った。

〔１．１４ ＬＣＭＶ－Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ実験〕
マウスに２×１０^５ ＰＦＵ ＬＣＭＶ－Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ株を腹腔内感染させた。ウイルスは、Ｒｅｃｈｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって提供された。感染の８日後、動物をＣＯ２で安楽死させ、脾臓を回収した。脾細胞の再刺激を、ポリクローナル５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ、５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンで刺激との比較として、ＬＣＭＶ特異的ペプチド１μｇ／ｍｌのＧＰ－６４を用いて平底９６ウェルプレート中で１時間行った後、１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡを染色前にさらに３時間添加した。

〔１．１５ シクロスポリンＡ滴定〕
カルシニューリン阻害剤、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６の増加量を培養物に添加した：２×１０^５細胞を、予めコーティングした９６ウェルプレート中の１００μｌの完全Ｔ細胞培地にプレーティングした。次いで、カルシニューリン阻害剤の連続希釈物１００μｌを添加して、異なる濃度のインウェルを得た。次いで、細胞を、これらのカルシニューリン阻害剤濃度の存在下で４８時間活性化し、その後、採取し、そして生存率および活性化マーカーについて染色した。

〔１．１６ Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ〕
ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を単離し、上述の通りに４８時間活性化した。次に、それらを採取し、ＰＢＳで洗浄した後、４℃で２０分間固定した。ＮＦＡＴｃ２の細胞内染色は、透過処理緩衝液中のａＮＦＡＴｃ２を用いて室温（ＲＴ）で最初の１時間、続いて透過処理緩衝液中のヤギ抗マウスＩｇＧ１を用いて室温（ＲＴ）で１時間の、二工程染色で行った。核を、インキュベーションの最後の５分間にＤＡＰＩで染色した。取得をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ Ｍａｒｋ２画像フローサイトメーターで行い、データ分析をＩＤＥＡＳソフトウェアで行った。

〔２．結果〕
〔２．１ ｍｉＲ－１７～９２はＣＤ４ Ｔ細胞の活性化および増殖の下流イベントに影響する〕
ＣＤ２８共刺激は、例えば、サイトカイン産生（Sanchez-Lockhart, M., et al. J Immunol, 2004. 173(12):7120－4）、増殖（Levine, B.L., et al. 1997. 159(12):5921－30）、胚中心形成（Wang, C.J., et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015. 112(2):524－9.）および解糖スイッチ（Frauwirth, K.A., et al. Immunity, 2002. 16(6):769－77）を含むＣＤ４ Ｔ細胞機能に重要である。また、ｍｉＲ－１７～９２発現も誘導し（de Kouchkovsky, D., et al. 2013. 191(4):1594－605）、同様のプロセスに影響を及ぼすことが報告されている（Baumjohann, D., et al. Nat Immunol, 2013. 14(8):840－8 ；Xiao, C., et al. Nat Immunol, 2008. 9(4):405-14）。

ｍｉＲ－１７～９２を欠いたか過剰表現するＣＤ４ Ｔ細胞が活性化にどのように反応するかを直接比較するために、本発明者らは以前に公表されたマウスモデルＣＤ４ｃｒｅ．ｍｉＲ１７９２ｌｏｘ（ｍｉＲ１７９２ｌｏｘ）およびＣＤ４ｃｒｅ．Ｒ２６ｍｉＲ１７９２ｔｇ（ｍｉＲ１７９２ｔｇ）（Xiao, C., et al. Nat Immunol, 2008. 9(4):405－14 ；Ventura, A., et al. Cell, 2008. 132(5):875－86 ；Lee, P.P., et al. Immunity, 2001. 15(5):763－74）を利用し、ＣＤ４ｃｒｅネガティブ同腹子をｗｔコントロールとして用いた。脾臓、末梢および腸間膜リンパ節由来のナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を単離し、その後の活性化に用いた。

ＰＭＡ／イオノマイシン／ＢＦＡで３時間活性化すると、本発明者らは、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現を伴うＩＬ－２産生の～１．７倍の増加（図１Ａ）、およびｍｉＲ１７９２ｌｏｘ細胞における染色の減少を見出した。これは、４８時間活性化されたＴ細胞の培養上清でＥＬＩＳＡによって測定されたＩＬ－２分泌においても真であり（図１Ｂ）、ｍｉＲ１７９２ｌｏｘ細胞は、ｗｔ細胞によって分泌されたＩＬ－２の半分だけを分泌した。増殖能力はクラスター発現に比例し（図１Ｃ）、これは以前の報告（Baumjohann, D., et al. Nat Immunol, 2013. 14(8):840－8）と一致する。

ナイーブ細胞の代謝活性は遺伝子型間で類似していた（図２Ａ）。一方、ｍｉＲ１７９２ｌｏｘマウスからの活性化ＣＤ４ Ｔ細胞は、それらの代謝においてわずかに減少した活性を持っていた（図２Ｃ、Ｄ）。加えて、本発明者らはメタボロミクスによって細胞のメタボロームを分析した結果、ｍｉＲ１７９２ｔｇ細胞における特定の代謝産物の発生量がわずかに増加していることがわかった（データは示していない）が、具体的な経路は明らかにされていない。本発明者らはさらに、代謝経路の発現に関連する遺伝子についてのＲＮＡ配列決定データを調査し、ｗｔと比較してｍｉＲ１７９２ｔｇ細胞におけるＴＣＡおよび電子伝達鎖に関与する遺伝子のわずかに高い発現を検出した（図２Ｅ）。本発明者らはこのデータから、マイクロＲＮＡクラスターｍｉＲ－１７～９２はＴ細胞活性化において重要なプロセスに影響を及ぼし、ｍｉＲ－１７～９２発現の増加は「より活性化された」細胞表現型をもたらし、その結果、より活性な代謝表現型にも至ると結論付けた。

〔２．２ トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２の発現はｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ２８欠損をレスキューする〕
ｍｉＲ－１７～９２の発現を枯渇させると、ＣＤ２８シグナル伝達の低下と同様の表現型が得られることから、本発明者らは、ｍｉＲ－１７～９２のトランスジェニック発現がＣＤ２８ｋｏ細胞の表現型を部分的にレスキューできるのではないかという仮説を立てた。それらはＣＤ４ｃｒｅ．Ｒ２６ｍｉＲ１７９２ｔｇをＣＤ２８ｋｏマウス（Shahinian, A., et al. Science, 1993. 261(5121):609－12）と後輩し、ＣＤ４ｃｒｅ．Ｒ２６ｍｉＲ１７９２ｔｇ．ＣＤ２８ｋｏマウス（レスキュー）を得て、および以前と同様の単離ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を得た。ＣＤ２８ｋｏ ＣＤ４ Ｔ細胞は、３時間のＰＭＡ／イオノマイシン刺激で、ｗｔ細胞で見られたＩＬ－２量の半分を産生したが、レスキュー細胞はｗｔより約２．５倍多く産生した（図３Ａ）。次に、本発明者らは、ＣＤ２８共刺激の有無にかかわらず、ａＣＤ３による４８時間のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化後のＣＤ４ Ｔ細胞の挙動を調査した。増殖能はαＣＤ２８共刺激なしでは活性化で低下したが、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現によりレスキューされた（図３Ｂ）。ＦＳＣ－Ａ（図３Ｃ）として示される芽細胞のサイズは、ＣＤ２８シグナルの欠失により減少したが、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現によりレスキューされた。αＣＤ２８共刺激の有無にかかわらず、４８時間の活性化（図３Ｄ）後、すべての遺伝子型は類似のＣＤ６９^＋ＣＤ２５^＋集団を発達させた。

しかし、ＣＤ２５のＭＦＩはＣＤ２８シグナルに依存し、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現によりレスキューされた。これとは対照的に、ＴＣＲシグナル伝達に依存することが知られているＣＤ６９発現（Testi, R., J.H. Phillips, and L.L. Lanier. J Immunol, 1989, 142(6):1854－60.）は、全ての条件の間で無関係であった。また、後期活性化マーカーＣＤ４４（図３Ｅ）について、本発明者らは、ＣＤ２８またはｍｉＲ－１７～９２シグナルに対する強い依存性を観察した。

ｍｉＲ－１７～９２クラスターは、ＴＨ１（Wu, T., et al. J Immunol, 2015. 195(6):2515－9 ；Jiang, S., et al. Blood, 2011. 118(20):5487－97）、ＴＨ２（Simpson, L.J., et al. Nat Immunol, 2014. 15(12):1162－70）、ＴＨ１７（Liu, S.Q., et al. J Biol Chem, 2014. 289(18):12446－56）およびＴｒｅｇｓの分化に影響を及ぼすことが報告されている。したがって、本発明者らはＣＤ２８ｋｏおよびレスキュー細胞を用いて分化アッセイを実施し、ＴＨ１、ＴＨ１７およびｉＴｒｅｇスキューイングを調べた（図４）。Ｔｂｅｔ（Ｔｂｘ２１）誘導はＣＤ２８ｋｏ細胞では遅延したが、ｍｉＲ－１７～９２発現でレスキューされ、ＩＦＮγ産生はトランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現でさらに過剰に補償された（図４Ａ）。ＣＤ２８ｋｏ細胞におけるＲｏｒγｔ誘導およびＩＬ１７ａ生産の低下は部分的にレスキューされた（図４Ｂ）。ｉＴｒｅｇ誘導は、ｗｔレベルにレスキューされた全ての時点において、ＣＤ２８ｋｏサンプル中のＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋集団の減少した集団をもたらした（図４Ｃ）。全体として、試験したＴ細胞サブセットはＣＤ２８ｋｏにより影響され、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現によりある程度レスキューされた。しかし、レスキューのタイミングと範囲はサブセット間で異なり、これは相対的寄与も可変であることを主張する。

まとめると、これらのデータは、ＣＤ２８ｋｏ細胞におけるＣＤ４ Ｔ細胞活性化の既知の欠陥がｉｎ ｖｉｔｒｏでのトランスジェニックｍｉＲ－１７～９２の発現によってレスキューされ得ることを示している。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化アッセイで観察されたレスキュー効果は、分化決定経路の上流の機構を示唆した。

〔２．３ トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現はｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ２８欠損をレスキューする〕
胚中心（ＧＣ）およびＴＨ１応答の生成をｉｎ ｖｉｖｏで調べるために、本発明者らは、レスキューマウスモデルをＬＣＭＶ Ａｒｍｓｔｒｏｎｇで感染させ、感染後８日目に脾臓を分析した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏデータと一致して、本発明者らはＣＤ２８ｋｏ ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＣＤ４４発現の減少を観察し、これは、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現によってレスキューされた（図５Ａ）。主要なマーカーであるＢｃｌ６、ＩＣＯＳ（図５Ｂ）、ＣＸＣＲ５およびＰＤ－１（図５Ｃ）で染色したＴＦＨは、ＣＤ２８マウスにおいて５倍減少した集団を示し、これはトランスジェニックｍｉＲ－１７～９２によってレスキューされた。ｍｉＲ１７９２ｌｏｘとＣＤ２８ｋｏとの比較（図６）は、同じ表現型を示している。ＣＤ２８共刺激シグナルが欠損している場合には存在しないことが知られている、ＧＬ－７^＋Ｆａｓ^＋胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞（Wang, C.J., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2015. 112(2):524－9）を、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現でレスキューした（図５Ｄ）。ＧＰ－６４で再刺激すると（Oxenius, A., et al. Eur J Immunol, 1995. 25(12):3402－11；Wolint, P., et al. J Exp Med, 2004. 199(7):925－36）、Ｔｂｅｔ（Ｔｂｘ２１）発現はＣＤ２８ｋｏ細胞では２倍減少したが、レスキュー細胞では有意に増加しなかった。しかし、ＩＦＮγ産生はＣＤ２８ｋｏで５倍減少し、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現により完全に回復した。総Ｔｂｅｔ発現細胞に対するＩＦＮγ産生細胞の比率はすべての遺伝子型の間で中立であり、これは転写因子では阻害されるが、サイトカイン産生レベルでは阻害されないことを主張している（図５Ｅ－Ｇ）。

まとめると、ｉｎ ｖｉｖｏトランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現もＣＤ２８ｋｏ細胞をレスキューする。導入遺伝子のホモ接合性発現はＴＦＨおよびＧＣならびにＴＨ１形成をレスキューし、ヘテロ接合性発現はまた、ＴＦＨおよびＧＣ Ｂ細胞のレスキューには十分であったが、ＴＨ１形成には十分ではなかった（図６）。

〔２．４ ｍｉＲ－１７～９２によるＣＤ２８機能の回復は細胞固有のものである〕
ＣＤ２８の主な機能はＴ細胞に関するものであるが、本発明者らはｍｉＲ－１７～９２－仲介レスキュー効果が細胞固有のものであるか否かを正式に試験しようと試みた。本発明者らは、ＬＣＭＶに特異的なＭＨＣクラスＩＩ制限ＣＤ４^＋ ＴＣＲ遺伝子導入マウス（ＳＭＡＲＴＡ、Ｖα２^＋Ｖβ８．３^＋）を、ｗｔ、ＣＤ２８^－／－およびレスキューマウスに交雑させた。本発明者らはＣＤ２８^－／－宿主マウスに（ＡＴ）ナイーブＣＤ４^＋ Ｔ細胞を養子移植し、続いて急性ＬＣＭＶ感染を行った。感染８日後、本発明者らは脾臓、腸間膜および末梢リンパ節（ＬＮ）を単離した。３つの臓器すべてにおいて、Ｖα２^＋Ｖβ８．３^＋ ＣＤ２８^－／－細胞の頻度および絶対数は、Ｖα２^＋Ｖβ８．３^＋ ＣＤ２８^{ｗｔ／ｗｔ}細胞と比較して強く減少した。対照的に、ｍｉＲ－１７～９２導入遺伝子は、Ｖα２^＋Ｖβ８．３^＋ ＣＤ２８^－／－ Ｔ細胞の相対数および絶対数を回復した（図７Ａ、ＣおよびＤ））。さらに、Ｖα２^＋Ｖβ８．３^＋ Ｔ細胞のうち、少数のＣＤ２８^－／細胞はｗｔ細胞よりもＣＤ４４をアップレギュレーションしたが、これはレスキュー細胞において完全に回復した欠損である（図７Ｂ、ＥおよびＦ）。したがって、これらのデータは、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２細胞が本質的にＣＤ２８欠損を置換することを明らかに示している。まとめると、本発明者らは、非コードＲＮＡ ｍｉＲ－１７～９２が共刺激機能を媒介し得ると結論付けている。

〔２．５ ｍｉＲ－１７～９２の低発現または過剰発現はＴ細胞の活性化に重要な転写変化を誘導する〕
本発明者らは、Ｔ細胞活性化のプロセスに対するｍｉＲ－１７～９２発現の強い効果を観察したため、これらの現象を説明し得るこのｍｉＲＮＡクラスターの標的遺伝子に興味を持った。これまでのところ、例えばＰＴＥＮまたはＲｏｒαのような既知の標的遺伝子のいずれも、報告された表現型を完全に説明することができなかった。ｍｉＲ１７９２ｌｏｘ、ｗｔおよびｍｉＲ１７９２ｔｇマウス由来のナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を２４時間または４８時間で活性化し、その後、配列決定のために全ＲＮＡを分離した。

主成分解析（ＰＣＡ）は、３つのすべての遺伝子型からのナイーブＴ細胞のトランスクリプトームが、特にｗｔおよびＴ^{１７９２Δ／Δ}遺伝子型について非常に類似していることを明らかにした（図８Ａ）。Ｔ細胞活性化は遺伝子発現の大きな変化を誘導し（ＰＣ１、説明された分散の５６．７％、およびＰＣ２、説明された分散の１４％）、また遺伝子型を活性化後２４時間で分離し、４８時間でさらに明確にした（図８Ａ）（ＰＣ１およびＰＣ３、説明された分散の７．２％）。ｍｉＲＮＡはしばしば、個々の遺伝子を穏やかにしか抑制しないので（Bartel, D. P. et al. Cell, 2018. 173(1):20－51）、本発明者らは最も極端な遺伝子型、すなわち、Ｔ^{１７９２Δ／Δ}をＴ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}と比較して、それぞれの時点で、遺伝子発現差異解析の能力を増大させた。１％の偽発見率（ＦＤＲ）で、差異的発現遺伝子（ＤＥＧ）の数は経時的に増加した（０時間で８３０遺伝子がアップレギュレート（増加）および７８９遺伝子がダウンレギュレート（減少）し、２４時間で２，４９３増加および２，３７０減少し、４８時間で３，１７３増加および３，２４２減少した）。活性化２４時間後のＤＥＧの教師なし階層クラスタリングは、遺伝子クラスターの微妙なパターンを明らかにした（図８Ｂ）。ＰＣＡから予想されるように（図８Ａ）、ナイーブＴ細胞では遺伝子型を越えた遺伝子発現は非常に類似しており、活性化後に発現の差の大きさが増加した（図８Ｂ）。それらの発現プロファイルに従って、本発明者らは遺伝子の４つの異なったグループを定義した（図８Ｂ）：クラスターＩ遺伝子は経時的に誘導され、ｗｔと比較してＴ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}で増強されたが、Ｔ^{１７９２Δ／Δ}で減少または遅延した。クラスターＩＩ遺伝子は経時的に減少し、ｍｉＲ－１７～９２はその抑制を支持した。全クラスターＩＩＩ遺伝子発現は活性化後に増加したが、１時点あたりの発現は遺伝子型と逆相関した（Ｔ^{１７９２Δ／Δ}＞Ｔ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}）。このように、ｍｉＲ－１７～９２は、時間とともに誘発されるにもかかわらず、このグループの遺伝子の最初の、あるいは最後の最大発現を制限した。最後に、遺伝子型と最も明らかな逆相関を示す遺伝子をクラスターＩＶａおよびＩＶｂに分類した。要約すると、クラスターＩは間接的に調節された遺伝子を表している可能性が最も高く、クラスターＩＶａおよびＩＶｂは直接的なｍｉＲ－１７～９２標的遺伝子の大部分を含む可能性が最も高い。

異なるクラスターの遺伝子調節様式を分析するために、本発明者らは、転写調節と転写後調節とを識別することを目的とするエキソン－イントロン分割分析（ＥＩＳＡ）アプローチを用いた。この方法は、成熟したｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ前駆体のイントロンおよびエキソンの読み数の違いに依存している。ＲＮＡ－ｓｅｑ実験において、これらの変化は転写速度変化の良好な予測因子である（Gaidatzis D. L. et al. Nat Biotechnol, 2015. 33(7):722－9）。さらに、本発明者らはＴａｒｇｅｔｓｃａｎ（「ＴＳ」）データベース（Agarwal V. et al. Elife, 2015.33(7):722－9）からのｍｉＲ－１７～９２クラスターの各シードファミリーについての標的遺伝子コンピューター予測を用いた。Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎは、ｍｉＲＮＡシードファミリーに対応する進化的に保存された８ｍｅｒ、７ｍｅｒ、および６ｍｅｒの同定を可能にした。さらに、本発明者らは、架橋免疫沈降によって単離されたＲＮＡのＡｒｇｏｎａｕｔｅ２ハイスループット配列決定（「ＡＨＣ」）（Gagnon J. D. et al. Cell Rep, 2019,28(8):2169－2181）によって定義される、生化学的に検出されたＴ細胞における直接的なｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ相互作用のデータセットを用い、ｍｉＲ－１７～９２クラスターシードファミリーのそれぞれについてのＴＳシードマッチの読み取り範囲をそれぞれの遺伝子において定量化した。転写調節（「ＤＥ．イントロン」）および転写後調節（「ＴＳ」、「ＡＨＣ」）のこれらの予測因子は、ヒートマップ上で注釈され（図８Ｂ）、その発現が経時的に増加し、ｍｉＲ－１７～９２遺伝子型と正に相関する遺伝子を明らかにした。それらは転写調節のために濃縮され、少数のＴＳ部位またはＡＨＣ読み取りを示した（図８Ｂ、ボックスＩ）。このように、クラスターＩは主に遺伝子転写の増加により誘導され、ｍｉＲ－１７～９２はこの転写活性を促進した。対照的に、クラスターＩＶａおよびＩＶｂ由来の遺伝子（図８Ｂ、ボックスＩＶａ、ＩＶｂ）は、２４時間および４８時間で、ｍｉＲ－１７～９２投与量（Ｔ^{１７９２Δ／Δ}＞ｗｔ＞Ｔ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}）と逆相関する、遺伝子型にわたる発現レベルの一貫した同一直線上の減少を示した。重要なことに、これらのクラスターには転写調節遺伝子はほとんど含まれていなかったが、ＴＳ部位については濃縮されており（ｐ値＝０．００１０３７；フィッシャー検定）、実験的にＡＨＣ読み取り値を決定した（ｐ値＝０．００３５９８；フィッシャー検定）（図８Ｂ）。このように、これらのクラスターは主に転写後に調節され、経験的に検証された直接ｍｉＲ－１７～９２標的遺伝子について濃縮された。要約すると、ｍｉＲ－１７～９２はＴ細胞活性化後に機能的に関連するようになり、複雑な方法でトランスクリプトームを形成した。本発明者らは、ｍｉＲ－１７～９２が間接的に遺伝子誘導を促進し、遺伝子サイレンシングを間接的に、および誘導された遺伝子の直接的な抑制または減衰発現を介して支持し得ると結論した。

ｍｉＲ－１７～９２クラスターの直接標的候補は、より多くのクラスターが発現され、ｍｉＲ－１７～９２クラスターの少なくとも１つの部材に対する結合部位を有するほど、ダウンレギュレートされるべきである。目的の遺伝子のリストをさらに絞り込むために、本発明者らは、データをＡｇｏ－ＨＩＴＳＣＬＩＰ ＲＮＡ配列決定からのデータセットと比較した。この方法では、塩基配列決定の時点で３’ＵＴＲがＡｒｇｏｎａｕｔｅに結合している遺伝子が明らかになり、ＲＩＳＣ複合体による分解の標的となる遺伝子が見つかる。この比較により、Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎによって予測されるように、それらの３’ＵＴＲにおいてシードマッチを有する遺伝子が、本発明者らのデータセットにおいて、またＨＩＴＳ－ＣＬＩＰデータセットにおいてダウンレギュレートされることが確認された。

本発明者らは、ＲＮＡ配列決定に基づく遺伝子セットエンリッチメント分析において、上位２５の有意に変化した遺伝子セットにおけるサイトカイン発現と関連する遺伝子セットのエンリッチメントに注目した（表４参照）。

ＴＨ２およびＴＨ１７サイトカイン発現だけでなく、ＴＨ１もｍｉＲ１７９２ｔｇ細胞において増加した（図８Ｃ）。これは、これらすべてのサブセットの差別化に関連するマスターレギュレーター経路を主張したものである。

どの分子経路がｍｉＲ－１７～９２によって調節されたかを同定するために、本発明者らは、Ｔ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}とＴ^{１７９２Δ／Δ}との間で差異的に発現される遺伝子について濃縮された、キュレートされた遺伝子セットを分析した。２４時間で、統計的有意性が最も高く、平均倍率変化が最も大きかった遺伝子セットは、サイトカイン、炎症およびＴ細胞分化に関連していた。次に、本発明者らはＤｏＲｏｔｈＥＡレギュロン（Garcia－Alonso L. et al. Genome Res. 2019. 29(8):1363－1375）についてエンリッチメント分析を行い、調節された経路を説明することができる転写因子（ＴＦ）活性を同定した。２４時間で、最も高い倍率変化を有する５つの最も有意に濃縮されたＴＦレギュロンは、２つのＮＦＡＴメンバー（ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＡＴＣ３）ならびにＲＥＬＡ、ＮＦ－κＢ１およびＧＡＴＡ３を含んでいた（図８Ｃ）。ＮＦＡＴ ＴＦはＴ細胞の活性化および分化に重要であるが、ｍｉＲ－１７～９２はＴ細胞におけるＮＦＡＴ活性を促進することは知られていないので、本発明者らはカルシニューリン／ＮＦＡＴ軸に焦点を当てた。レギュロンＮＦＡＴＣ２およびＮＦＡＴＣ３に属する遺伝子には、Ｔ細胞系列を規定するＴＦ、サイトカインおよびサイトカインレセプターが多く含まれ、そのほとんどはｍｉＲ－１７～９２により高度に調節されていた（Ｆｉｇ．８Ｄ）。このことから、ｍｉＲ－１７～９２がＴ細胞活性化の中央レギュレーターを構成していることが確認され、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２は標準的な経路を介して作用し、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＦＨとＴｈ１の分化のためにＣＤ２８を機能的に代替できることが示唆される（Ｆｉｇ．５）。

メカニズム解明を深めるために、本発明者らは直接的なｍｉＲ－１７～９２標的遺伝子を分析しようと試みた。以前の観察（図８Ａ、Ｂ）に基づいて、本発明者らは、ナイーブＴ細胞と、間接的効果がこの時点の後に増加した可能性が高いため２４時間後の時点とに焦点を当てた。個々のｍｉＲ－１７～９２クラスターｍｉＲＮＡがその標的遺伝子に及ぼす影響を可視化するために、本発明者らはＴＳによって予測される遺伝子の発現を比較し、各ｍｉＲＮＡシードファミリーについてのＡＨＣ＞５読み取りを、そのファミリーについてシードマッチを持たない全ての遺伝子と比較した。ｍｉＲ－１７シードファミリーによって示されているように、ｍｉＲ－１７～９２導入遺伝子はナイーブＴ細胞のｍｉＲ－１７標的遺伝子を抑制したが（図８Ｅ、左図）、ｍｉＲ－１７～９２の欠如はｍｉＲ－１７標的遺伝子の発現に影響を及ぼさなかった（図８Ｅ、右図）。対照的に、Ｔ細胞活性化後、ｍｉＲ－１７標的遺伝子は、Ｔ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ} Ｔ細胞において抑制され（図８Ｆ、左側パネル）、Ｔ^{１７９２Δ／Δ} Ｔ細胞において抑制が解除された（図８Ｆ、右側パネル）。同様の効果はｍｉＲ－１８シードファミリーでは少なかったが、全てのシードファミリーで観察された。最後に、本発明者らは遺伝子が以下の基準を満たす場合、遺伝子を経験的に検証されたｍｉＲ－１７～９２標的として定義した：ｉ）Ｔ^{１７９２Δ／Δ}対ｗｔにおける有意な抑制の解除、および２４時間でのＴ^{１７９２ｔｇ／ｔｇ}対ｗｔにおける有意な抑制、ｉｉ）予想されるＴＳマッチ、ｉｉｉ）＞５ ＡＨＣ読み取り、ならびにｉｖ）ＥＩＳＡに基づく転写後調節。ｍｉＲ－１７～９２から得られた４つのシードファミリーにわたってこれらの基準を適用することにより、経験的に裏付けられた直接的なｍｉＲ－１７～９２標的遺伝子のセットが定義された（表１）。これらの遺伝子は、Ｔ細胞において検証されたＰｈｌｐｐ２（Kang S. G. et al. Nat Immunol. 2013. 14(8):849－57）およびＢ細胞において検証されたＣｙｌｄのような、以前に記載されたｍｉＲ－１７～９２標的を含み、解析の妥当性が確認されている（Jin H.Y. et al. EMBO J. 2013. 32(17):2377－91）。さらに、この手法により、Ｔ細胞のｍｉＲ－１７～９２標的として、あまり研究されていない多くの遺伝子が同定された。注目すべきことに、これらの遺伝子のいくつかは負のレギュレーターであり、いくつかは様々な細胞型において既知または示唆されている腫瘍抑制因子である。

要約すると、本発明者らは、Ｔ細胞におけるｍｉＲ－１７～９２標的遺伝子のセットを厳密に定義した。ｍｉＲ－１７～９２はナイーブＴ細胞の標的遺伝子を抑制しなかったが、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２は抑制した。しかし、この抑制はナイーブＴ細胞のトランスクリプトーム全体には実質的に影響しなかった。対照的に、Ｔ細胞活性化後、ｍｉＲ－１７～９２は直接的に標的遺伝子を抑制し、主要なＴ細胞シグナル伝達経路を増強する重要な結果をもたらした。このように、ｍｉＲ－１７～９２－仲介遺伝子による抑制は、Ｔ細胞の活性化の際にＴ細胞のトランスクリプトームを形作るのに非常に強力である。そのカルシニューリン／ＮＦＡＴ増強活性は、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２によるＣＤ２８^－／－ Ｔ細胞の表現型レスキューに寄与するだろう。

〔２．６ ｍｉＲ－１７～９２標的はＣＤ２８ｋｏ細胞でアップレギュレートされ、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現によりｗｔレベルまで抑制される〕
本発明者の仮説に従い、本発明者らはＣＤ２８ｋｏ、ｗｔ、レスキュー、ｍｉＲ１７９２ｔｇおよびｍｉＲ１７９２ｌｏｘマウス由来のナイーブおよび２４時間活性化ＣＤ４ Ｔ細胞からＲＮＡを単離し、ＣＤ２８ｋｏ細胞における遺伝子シグネチャーがｍｉＲ－１７～９２のトランスジェニック発現によってレスキューされるかどうかを調べた。バイアスなしＰＣＡ分析は、ＰＣ１上の時点を分離した。遺伝子発現はナイーブサンプルで重複しており、ＰＣ２は遺伝子型で活性化サンプルを分割し、ＣＤ２８ｋｏサンプルは他のサンプルと最も異なっていた。レスキュー細胞は他のサンプルにより類似しており、ｍｉＲ１７９２ｔｇサンプルは、ＣＤ２８ｋｏサンプルと最も異なっていた（図９Ａ）。このことはＣＤ２８ｋｏとｗｔサンプルの間で異なる遺伝子発現の部分のみが、強制ｍｉＲ－１７～９２発現によってレスキューできることを主張している。次いで、本発明者らは、遺伝子の異なるサブセットを見てデータセットを分析した：異なるコントラストにおける全てのｌｏｇ２の倍率変化に対するｌｏｇ２（倍率変化）の比を比較した。彼らはさらに、ｍｉＲ１７（または表示されていないｍｉＲ－１７～９２の他のメンバー、データは示さない）の結合サイトを持つ彼らのデータセットの遺伝子のセットを明灰色で表示し、この遺伝子セットが比較対象ｍｉＲ１７９２ｌｏｘ対ｗｔで右にシフトされていることを確認した（図９Ｂ）。これは、ｍｉＲ－１７の結合サイトを有するすべての遺伝子の合計が、クラスターを表現しない細胞において実際に増加していることを示す。同じ遺伝子のセットは、ｍｉＲ１７９２ｔｇ対ｗｔの比較において、より低い発現であるように左にシフトされる（データは示さない）。さらに、彼らは、ｍｉＲ１７９２ｌｏｘで表現が増加し、ｍｉＲ１７９２ｔｇで減少し、ｔａｒｇｅｔｓｃａｎに従ってｍｉＲ－１７の結合サイトを含み、エクソンレベルでのみ変化するが、イントロンレベルでは変化しない、遺伝子のサブセットに注目した。ｍｉＲ１７９２ｌｏｘ対ｗｔにおけるｍｉＲ１７結合部位をもつ遺伝子の遺伝子発現が増大する方向へのシフト（データは示さない）と同様に、ＣＤ２８ｋｏ対ｗｔにおいても遺伝子発現が高い発現にシフトした（図９Ｃ）。このことは、ｍｉＲ－１７～９２によって調節された遺伝子はＣＤ２８によっても調節されていることを示唆している。このシフトは、レスキュー細胞におけるｍｉＲ－１７～９２発現のトランスジェニック発現で完全に消失した（図９Ｂ）。このことは、ＣＤ２８ｋｏ細胞で見られるいくつかの調節不全がｍｉＲ－１７～９２の欠損によって説明され得、したがって、それらの発現はトランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現によって調節され得ることを示している。これはｍｉＲ－１７を標的とした遺伝子について真であったが、ｍｉＲ－１７～９２クラスターの他のメンバーについても同様であった（データは示さない）。

〔２．７ Ｒｃａｎ３ ３’ＵＴＲはｍｉＲ－１７によって標的化され、発現レベルはＣＤ２８またはｍｉＲ－１７～９２の発現に依存する〕
２番目のＲＮＡ配列データセットは、ｗｔと比較して、ＣＤ２８ｋｏ細胞におけるＲｃａｎ３ ＲＮＡの～０．５倍の増加を示したが、これはｍｉＲ１７９２ｌｏｘ対ｗｔ細胞に類似している。これはレスキュー細胞中ではｗｔレベルまで低下した。Ｒｃａｎ３のタンパク質発現は、ｗｔと比較してＣＤ２８ｋｏおよびｍｉＲ１７９２ｌｏｘ細胞で２倍に増加し、これはレスキュー細胞におけるトランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現によってｗｔまで低下した。しかしながら、ｍｉＲ１７９２ｔｇ細胞のＲＮＡ発現レベルがｗｔ細胞に比べて低下したとしても、タンパク質レベルは実際には大きな変化はなかった。このことは、ｗｔ細胞で到達した内因性ｍｉＲ－１７～９２発現レベルが活性化中のＲｃａｎ３の調節に十分である可能性を示唆する。

〔２．８ シクロスポリンＡに対する感受性はＣＤ２８の影響を受け、トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現によりレスキューされる〕
以前の項で述べたように、データは、全てのＴヘルパーサブセットがｍｉＲ－１７～９２またはＣＤ２８シグナル伝達の喪失によって影響され、異なるサブセットにおいても同様にレスキュー効果があることを示した。この表現型を説明できる１つの経路は、カルシニューリン－ＮＦＡＴ軸である。従って、本発明者らは、この経路を負に調節し得、それによってＮＦＡＴ経路の発現が減少した場合、ＮＦＡＴ経路のシグナル伝達を増加させる候補について、潜在的な標的遺伝子のリスト（表１）をマイニングした。このための１つの候補はカルシニューリン３のレギュレーター（Ｒｃａｎ３）であり、これは、カルシニューリンと相互作用し、これを阻害することが報告されている（Mulero, M.C., et al. Biochim Biophys Acta, 2007. 1773(3):330－41）。

ＨＩＴＳＣＬＩＰのデータから、Ｒｃａｎ３の３’ＵＴＲのｍｉＲ－１７結合部位は、配列決定の時に実際にＡｒｇｏｎａｕｔｅに結合していることが示され（図１０Ａ）、これが真の標的遺伝子である可能性が高まった。Ｒｃａｎ３ ｍＲＮＡ発現は、ｍｉＲ１７９２ｌｏｘ細胞ではｗｔと比較して増加し（図１０Ｂ）、ｍｉＲ１７９２ｔｇ細胞では減少した。また、タンパク質発現も、ＣＤ２８ｋｏおよびｍｉＲ１７９２ｌｏｘ細胞ではｗｔより高くなり、レスキュー細胞ではＲｃａｎ３タンパク質発現が低かった。さらに、Ｒｃａｎ３の３’ＵＴＲは、保存されたｍｉＲ－１７－５ｐ ８ｍｅｒ結合部位（ｃｈｒ４：１３５４１６２３２－１３５４１６２４０）を含み、ＡＨＣはこの場所で単一の分離したピークを確認し、一次Ｔ細胞におけるＲｃａｎ３ ３’ＵＴＲとｍｉＲ－１７－５ｐとの直接相互作用の証拠である（図１０ＡおよびLoeb. G.B. et al. Molecular Cell. 2012 and Gagnon J.D. et al. Cell Rep. 2019. 28(8):2169－2181）。

次いで、本発明者らは、Ｒｃａｎ３発現の増加が、カルシニューリン阻害剤であるシルコスポリンＡ（ＣｓＡ）に対する細胞の感受性を増加させ得、したがって、増加する濃度のＣｓＡの存在下で細胞を活性化させたと仮定した。図３に示されるように、全てのサンプルはＣＤ２５^＋ＣＤ６９^＋発現の同様のパーセンテージから開始したが、ＣＤ２８ｋｏ細胞は増加するＣｓＡ濃度に対してより感受的に反応し（図１０Ｄ）、一方、レスキュー細胞はさらにより耐性であった。これは、ＦＳＣ－Ａ（図１０Ｅ）として示される細胞サイズを見る場合にも当てはまった。通常、カルシニューリンはＴ細胞活性化の際にＮＦＡＴを脱リン酸化し、その後にのみＮＦＡＴが核に移行して重要な転写プログラムを開始できる。カルシニューリンの阻害により、この移行は減少する。本発明者らは、これをｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ技術を用いて図１０Ｆに示す。彼らは低用量シクロスポリン（６．２５ｎｇ／ｍｌ、９日目においてＣＤ２８ｋｏは反応するが、ｗｔまたはレスキュー細胞は反応しないことが示された）の存在下で細胞を活性化し、ＮＦＡＴの転座を調べた。ＣＤ２８ｋｏサンプルのみが、より低い類似性拡張を有する細胞の集団を示し（図１０Ｇ）、これは転座がより少ないことを示す。

〔２．９ 野生型細胞におけるカルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６）に対する感受性は、ｍｉＲ－１７～９２のトランスジェニック発現、またはｍｉＲ－１７～９２標的遺伝子、例えばＲｃａｎ３の欠失によって低下させることができる〕
ＣＤ２８ｋｏ細胞のシクロスポリンＡに対する高い感受性はｍｉＲ－１７～９２のトランスジェニック発現により回復したことから、本発明者らは、ｍｉＲ－１７～９２のトランスジェニック発現は一般的にＣＤ２８十分な細胞においてもこの免疫抑制剤に対する耐性を増加させ得ると仮定した。したがって、彼らは、シクロスポリンＡ（図１１Ａ、Ｃ）およびＦＫ５０６（図１１Ｂ、Ｄ）のようなカルシニューリン抑制剤の増加する濃度の存在下で、野生型からのＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ならびにｍｉＲ１７９２ｔｇ細胞を活性化し、正常な共刺激を有する細胞ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞において本当にトランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現が、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６に対する抵抗性の増加をもたらすことを見出した（図１１）。

以前のデータは、ＣＤ２８共刺激がｍｉＲ１７－５ｐを巻き込んでＲｃａｎ３を抑制することを示唆しているため、本発明者らは、Ｒｃａｎ３発現の抑制または排除が、ｍｉＲ－１７～９２発現を変化させずにも、Ｔ細胞におけるカルシニューリン阻害剤に対する抵抗性を増大させうるという仮説を立てた。ＣＤ４ Ｔ細胞を、コントロールｇＲＮＡまたはＲｃａｎ３を標的とする２つの異なるｇＲＮＡ（ＧＡＧＡＡＡＴＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡＣＧＣ；ｃｒＲＮＡ１１１９、配列番号４７およびＧＡＴＧＧＴＣＴＴＣＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧ、ｃｒＲＮＡ１５５８、配列番号４８）でエレクトロポレーションした。細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで休止させ、次いで種々のＣｓＡ濃度の存在下で再活性化した。予想通り、ＣＤ４４のアップレギュレーション（Ｔ細胞活性化のマーカー）は、野生型細胞においてより高いＣｓＡ濃度で阻害された。対照的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した欠失またはＲｃａｎ３は、Ｒｃａｎ３ ＫＯ細胞をＣｓＡ耐性にした（図１２）。このように、ｍｉＲ－１７～９２標的遺伝子を欠失させると、ｍｉＲ－１７～９２を過剰発現させた場合と同じ治療効果が得られた。

ｍｉＲ－１７～９２欠損はＣＤ２８欠損を表現型模写する。 （Ａ～Ｂ）ｍｉＲ－１７～９２の発現は活性化ＣＤ４ Ｔ細胞における代謝を改変する。 （Ｃ～Ｄ）ｍｉＲ－１７～９２の発現は活性化ＣＤ４ Ｔ細胞における代謝を改変する。 （Ｅ）ｍｉＲ－１７～９２の発現は活性化ＣＤ４ Ｔ細胞における代謝を改変する。 （Ａ～Ｂ）トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２の発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ２８欠損Ｔ細胞の共刺激を回復させる。 （Ｃ～Ｄ）トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２の発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ２８欠損Ｔ細胞の共刺激を回復させる。 （Ｅ）トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２の発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ２８欠損Ｔ細胞の共刺激を回復させる。 トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化中のＣＤ２８シグナルを部分的に補うことができる。 （Ａ～Ｃ）トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ２８欠損細胞の共刺激を回復させる。 （Ｄ～Ｇ）トランスジェニックｍｉＲ－１７～９２発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ２８欠損細胞の共刺激を回復させる。 （Ａ～Ｃ）ｍｉＲ－１７～９２発現の消失は、ＬＣＭＶ感染時にｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ２８欠損を表現型模写し、ｍｉＲ－１７～９２のヘテロ接合体発現はＣＤ２８ｋｏを部分的にレスキューできる。 （Ｄ～Ｇ）ｍｉＲ－１７～９２発現の消失は、ＬＣＭＶ感染時にｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ２８欠損を表現型模写し、ｍｉＲ－１７～９２のヘテロ接合体発現はＣＤ２８ｋｏを部分的にレスキューできる。 （Ａ～Ｂ）ｍｉＲ－１７～９２によるＣＤ２８機能の回復は細胞内在である。 （Ｃ～Ｆ）ｍｉＲ－１７～９２によるＣＤ２８機能の回復は細胞内在である。 （Ａ）ｍｉＲ－１７～９２はＴ細胞活性化後にトランスクリプトームを形作り、ＮＦＡＴ依存遺伝子発現を促進する。 （Ｂ）ｍｉＲ－１７～９２はＴ細胞活性化後にトランスクリプトームを形作り、ＮＦＡＴ依存遺伝子発現を促進する。 （Ｃ～Ｄ）ｍｉＲ－１７～９２はＴ細胞活性化後にトランスクリプトームを形作り、ＮＦＡＴ依存遺伝子発現を促進する。 （Ｅ～Ｆ）ｍｉＲ－１７～９２はＴ細胞活性化後にトランスクリプトームを形作り、ＮＦＡＴ依存遺伝子発現を促進する。 ｍｉＲ－１７～９２の発現はＣＤ２８ｋｏ細胞のトランスクリプトームを部分的にレスキューする。 （Ａ～Ｃ）Ｒｃａｎ３発現およびシクロスポリンＡ感度はｍｉＲ－１７～９２およびＣＤ２８発現により改変される。 （Ｄ～Ｇ）Ｒｃａｎ３発現およびシクロスポリンＡ感度はｍｉＲ－１７～９２およびＣＤ２８発現により改変される。 ｗｔ ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるトランスジェニックｍｉＲ－１７～９２の発現は、カルシニューリン阻害剤（ＣｓＡおよびＦＫ５０６）に対するより高い耐性を細胞に与える。 ｍｉＲ－１７～９２の標的遺伝子であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＲｃａｎ３欠失は、ＣｓＡに対する耐性を付与する。

Claims (14)

1. カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）耐性免疫細胞であって、
   ｍｉＲ－１７～９２クラスターまたはそのパラログの調節活性が増加しており、
   それを必要とする対象の養子細胞移植療法において使用され、ここで、前記免疫細胞は、前記対象にＣＮＩと組み合わせて投与される、
   ＣＮＩ耐性免疫細胞。
2. 前記免疫細胞は、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１９ｂ－１およびｍｉＲ－９２ａ－１、ｍｉＲ１０６ａ、ｍｉＲ－１８ｂ、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－９２ａ－２、ｍｉＲ－３６３、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ－２５からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、好ましくはｍｉＲ－１７またはｍｉＲ１９を過剰発現するように設計されている、
   請求項１に記載の使用のためのＣＮＩ耐性免疫細胞。
3. 前記免疫細胞は、前記免疫細胞に対して、配列番号１７～４６からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む核酸構築物を導入することによって、設計されている、
   請求項２に記載の使用のためのＣＮＩ耐性免疫細胞。
4. 前記核酸構築物は、配列番号１～１６からなる群より選択される少なくとも１つのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列を含む、
   請求項２に記載の使用のためのＣＮＩ耐性免疫細胞。
5. 前記核酸構築物は、エレクトロポレーションによって、前記免疫細胞に対して導入されている、
   請求項３または４に記載の使用のためのＣＮＩ耐性免疫細胞。
6. 前記免疫細胞は、少なくとも１つのｍｉＲ－１７９２クラスター標的遺伝子、好ましくはＲｃａｎ３遺伝子の発現を不活性化するように設計されている、
   請求項１に記載の使用のためのＣＮＩ耐性免疫細胞。
7. 前記免疫細胞は、前記免疫細胞に対して、Ｒｃａｎ３遺伝子を標的とすることができるＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ複合体を導入するように設計されている、
   請求項６に記載の使用のためのＣＮＩ耐性免疫細胞。
8. 前記カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６およびＣＴＬＡ－４Ｉｇからなる群より選択される、
   請求項１～７のいずれか１項に記載の使用のためのＣＮＩ耐性免疫細胞。
9. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージおよび制御性Ｔ細胞からなる群より選択される、
   請求項１～８のいずれか１項に記載の使用のためのＣＮＩ耐性免疫細胞。
10. 前記免疫細胞は、前記対象またはドナー由来である、
    請求項９に記載の使用のためのＣＮＩ耐性免疫細胞。
11. 前記免疫細胞は、組み換え抗原レセプター、好ましくはキメラ抗原レセプターをさらに発現する、
    請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用のためのＣＮＩ耐性免疫細胞。
12. 前記養子細胞移植療法は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を必要とする疾患の治療、または、臓器拒絶反応、好ましくは移植片対宿主病、血液悪性腫瘍もしくは移植後リンパ増殖性疾患、自己免疫性疾患からなる群より選択される疾患の予防のために使用される、
    請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用のためのＣＮＩ耐性免疫細胞。
13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載のＣＮＩ耐性免疫細胞と、
    カルシニューリン阻害剤と、
    薬学的に許容可能なキャリアと、
    を含む薬学的組成物。
14. それを必要とする対象の養子細胞移植療法における使用のための、
    請求項１３に記載の薬学的組成物。

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