JP2022519518A

JP2022519518A - 精子関連タンパク質Ｃａｔｓｐｅｒに基づく避妊ワクチン

Info

Publication number: JP2022519518A
Application number: JP2021544400A
Authority: JP
Inventors: ビストロフ，クリストファー; チュン，ジーン－ジュ，ルチア
Original assignee: Rensselaer Polytechnic Institute
Current assignee: Rensselaer Polytechnic Institute
Priority date: 2019-02-08
Filing date: 2020-02-10
Publication date: 2022-03-24
Also published as: EP3920967A1; WO2020163853A1; EP3920967A4; US20220152166A1; AU2020218564A1; CN113454210A

Abstract

組成物は、抗原キャリアドメインと、抗原キャリアドメイン中の精子細胞由来の１つ以上の抗原領域とを含む避妊キメラウイルス様粒子を含み、抗原キャリアドメインは、ヒトパピローマウイルス由来のＬ１を含み、抗原領域は、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の１つ以上の構造要素を含む。患者に投与されると、避妊ワクチンは、抗精子抗体の産生を刺激し、精子と結合すると、精子細胞の運動を阻害し、精子細胞が卵細胞に貫通できなくなる。組成物の誘導された免疫不妊症は、抗原キャリアドメインはないが、抗精子抗体を隔離するための、１つ以上の抗原領域と実質的に同一のタンパク質配列を有する拮抗薬を患者に過剰投与することにより、短期又は長期にわたって拮抗させることができる。【選択図】図１

Description

関連出願を相互参照
本出願は、２０１９年２月８日出願の米国仮出願第６２／８０２，９２２号及び２０２０年２月５日出願の米国仮出願第６２／９７０，２４９号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。

世界中の妊娠のほぼ半分は、望まないもの、あるいはタイミングの合わないものである。現在の長期作用性の可逆的避妊技術は、ホルモン法又は手術が主である。全般的な有効性はあるものの、女性と男性に利用可能な避妊技術には無数の欠点がある。一例を挙げると、一部の女性はホルモン避妊法に耐えられない。さらに、ホルモン法は、患者にかなり自己管理を必要としたり、不快感を与えることが多い。例えば、錠剤又はパッチの投薬は、避妊効果が所望される時間にわたって一定間隔で服用又は適用される必要がある。埋込式又は子宮内避妊具は、軽度から重度の副作用及び合併症を引き起こす可能性があり、再建又は再埋込のために再度来院を必要とすることがある。

したがって、避妊効果を望む患者の処置に関連する負担を軽減する、使用し易い、効果的で、長期間持続する、可逆的な避妊処置が望まれている。

したがって、本開示のいくつかの実施形態は、抗原キャリアドメイン及び抗原キャリアドメイン中の精子細胞由来の１つ以上の抗原領域を含む避妊キメラウイルス様粒子に関する。いくつかの実施形態において、抗原キャリアドメインは、１つ以上のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のカプシドタンパク質は、ヒトパピローマウイルス由来のＬ１を含む。いくつかの実施形態において、ＣＧＰアミノ酸残基は、１つ以上の抗原領域のＮ端末に隣接し、ＧＰＣアミノ酸残基は、１つ以上の抗原領域のＣ端末に隣接する。いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原領域は、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の構造要素を含む。いくつかの実施形態において、構造要素は、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の膜貫通螺旋セグメント間に配置された１つ以上のループの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、構造要素は、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ１ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ１ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ１ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ２ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとのループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ３ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ４ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ４ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒδ ループ７８５～８０５、Ｃａｔｓｐｅｒε ループ３３１～３４８又はその組み合わせの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス様粒子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又はその組み合わせを含む。

本開示のいくつかの実施形態は、抗原キャリアタンパク質の遺伝子をプラスミドに挿入すること、抗原キャリア及び精子細胞由来の１つ以上の抗原領域のキメラ遺伝子のための重複プライマーを調製すること、キメラ遺伝子を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、及びキメラ遺伝子からウイルス様粒子を合成することを含む、避妊キメラウイルス様粒子を作製する方法に関する。いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原領域は、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の構造要素を含む。いくつかの実施形態において、構造要素は、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の膜貫通螺旋セグメント間に配置された１つ以上のループの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、構造要素は、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ１ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ１ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ２ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ３ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ４ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ４ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒδ ループ７８５～８０５、Ｃａｔｓｐｅｒεループ３３１～３４８又はその組み合わせの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス様粒子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又はそれらの組み合わせを含む。

本開示のいくつかの実施形態は、抗原キャリアドメインと、抗原キャリアドメイン中の精子細胞由来の１つ以上の抗原領域とを含む避妊キメラウイルス様粒子を含む組成物を調製すること、及び１つ以上の抗原領域に対する患者の免疫応答を高めるために組成物を患者に投与することを含む、患者に避妊処置を提供する方法に関する。いくつかの実施形態において、抗原キャリアドメインは、ヒトパピローマウイルス由来のＬ１を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原領域は、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の構造要素を含み、構造要素は、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ１ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ１ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅ１ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ１ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ１ｐループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ２ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ３ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ４ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ４ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒδループ７８５－８０５、Ｃａｔｓｐｅｒε ループ３３１－３４８、又はその組み合わせの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原領域は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、皮下、静脈内、鼻腔内、又はその組み合わせで投与される。いくつかの実施形態において、本方法は組成物の効果を拮抗させるために、補助組成物を患者に投与することをさらに含み、補助組成物は、１つ以上の抗原領域のものと実質的に同一のタンパク質配列を有する拮抗薬を含む。いくつかの実施形態において、拮抗薬は１つ以上のペプチドを含み、１つ以上のペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又はその組み合わせを含む。

図面は、本発明を説明する目的で、開示された主題の実施形態を示す。ただし、本出願は、図面に示された正確な配置及び手段に限定されないものとする。

図１は、本開示のいくつかの実施形態による避妊キメラウイルス様粒子の概略図である。図２は、本開示のいくつかの実施形態による、避妊キメラウイルス様粒子を作製する方法のチャートである。図３Ａは、本開示のいくつかの実施形態による、患者に避妊治療を提供する方法のチャートである。図３Ｂは、本開示のいくつかの実施形態による、患者に避妊治療を提供する方法のチャートである。

ここで図１を参照すると、本開示のいくつかの実施形態は、個体、使用者、患者などに避妊処置を提供するためのワクチンに関する。いくつかの実施形態において、避妊ワクチンは、従来のホルモン避妊薬、埋込式避妊薬、物理的避妊薬などと実質的に同等の有効性で、使用者に避妊効果を提供するものである。いくつかの実施形態において、避妊ワクチンは、精子細胞上に存在する構造に対する使用者の免疫応答を高める。いくつかの実施形態において、避妊ワクチンは、精子細胞上に存在するタンパク質又はタンパク質の組み合わせの構造に対する使用者の免疫応答を高める。いくつかの実施形態において、避妊ワクチンは、使用者における抗精子抗体の産生を刺激する。いくつかの実施形態において、避妊ワクチンは、精子細胞に結合すると、卵細胞を受精させる精子細胞の能力を阻害する抗精子抗体の産生を刺激する。いくつかの実施形態において、避妊ワクチンは、精子細胞に結合すると、精子細胞の運動性を阻害する抗精子抗体の産生を刺激する。理論に拘束されることは望まないが、女性に投与された場合、避妊ワクチンは、例えば、膣粘膜において、抗精子抗体の産生を刺激し、これが精子と結合し、精子の過活動運動を防止し、精子が卵に貫通できなくなる。これも理論に拘束されることは望まないが、男性に投与すると、避妊ワクチンは、精子を実質的に不活性にする、例えば、エピジジミスにおいて、抗精子抗体の産生を刺激する。

いくつかの実施形態において、避妊ワクチンは、避妊キメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）１００を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬＰ１００は、２つ以上のドメイン１０２を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬＰ１００は、抗原キャリアドメイン１０４を含む。いくつかの実施形態において、抗原キャリアドメイン１０４は、１つ以上のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のカプシドタンパク質は、ヒトパピローマウイルス由来のＬ１を含む。

いくつかの実施形態において、ＶＬＰ１００は、抗原ドメイン１０６を含む。いくつかの実施形態において、抗原ドメイン１０６は、１つ以上の抗原領域１０６Ａを含む。いくつかの実施形態において、抗原領域１０６Ａは、抗原キャリアドメイン１０４内に位置する。いくつかの実施形態において、抗原領域１０６Ａは、精子細胞外表面上又はその周りに露出し、精子細胞中にのみ存在し、ヒトの体の他の組織中には存在せず、そして精子機能のために必要なものである、といううちの１つ以上を満たすものである。いくつかの実施形態において、抗原領域１０６Ａは、精子細胞由来の構造的特徴又は構造的特徴の部分を含む。いくつかの実施形態において、抗原領域１０６Ａは、精子細胞上に存在するタンパク質又はタンパク質の組み合わせの構造要素を含む。いくつかの実施形態において、抗原領域１０６Ａは、精子細胞べん毛上に存在する。いくつかの実施形態において、抗原領域１０６Ａは、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の構造要素を含む。いくつかの実施形態において、抗原領域１０６Ａは、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の膜貫通ヘリックスセグメント間に位置する１つ以上のループの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、抗原領域１０６Ａは、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ１ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ１ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ１ｐ－ループの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ２ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ３ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ４ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ４ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒδ ループ７８５－８０５、Ｃａｔｓｐｅｒε ループ３３１－３４８、又はその組み合わせの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、抗原領域１０６Ａは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又はその組み合わせを含む。

いくつかの実施形態において、ＣＧＰアミノ酸残基は、抗原領域１０６ＡのＮ端末に隣接する。いくつかの実施形態において、ＧＰＣアミノ酸残基は、１つ以上の抗原領域１０６ＡのＣ末端に隣接する。理論に拘束されることは望まないが、これらの追加の残基は、抗原キャリアドメイン１０４内の抗原領域１０６Ａを安定化するのに役立つ。いくつかの実施形態において、ＶＬＰ１００は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又はそれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態において、ＶＬＰ１００は組成物に含まれる。いくつかの実施形態において、組成物は、１つ以上の防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、充填剤などを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、皮下、静脈内、鼻腔内、又はそれらの組み合わせを、使用者に投与するように構成される。

ここで図２を参照すると、本開示のいくつかの実施形態は、避妊キメラＶＬＰを作製する方法２００に関する。２０２で、抗原キャリアタンパク質の遺伝子をプラスミドに挿入する。２０４で、抗原キャリア及び精子細胞由来の１つ以上の抗原領域のキメラ遺伝子のための重複プライマーを調製する。上述のように、いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原領域は、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の構造要素を含み、例えば、構造要素は、複合体の膜貫通ヘリックスセグメント間に位置する１つ以上のループの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、構造要素は、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ１ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ１ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ２ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ３ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ４ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ４ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒδループ７８５～８０５、Ｃａｔｓｐｅｒεループ３３１～３４８、又はその組み合わせの少なくとも一部を含む。２０６で、ポリメラーゼ連鎖反応を行って、キメラ遺伝子を増幅する。２０８で、キメラ遺伝子からＶＬＰが合成される。いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、細菌又は酵母細胞培養物中で合成される。いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又はその組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＶＬＰは自然に折り畳まれる。いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、上述のＶＬＰ１００の１つ以上である。

ここで、図３Ａを参照すると、本開示のいくつかの実施形態は、患者に避妊処置を提供するための方法３００に関する。３０２で、抗原キャリアドメインと抗原キャリアドメイン中の精子細胞由来の１つ以上の抗原領域とを含む避妊キメラＶＬＰを含む組成物が調製される。いくつかの実施形態において、キメラＶＬＰは、上述のＶＬＰ１００の１つ以上である。３０４で、組成物を患者に投与して、１つ以上の抗原領域に対する患者の免疫応答を高める。いくつかの実施形態において、組成物は、皮下、静脈内、鼻腔内、又はその組み合わせで患者に投与される。理論に拘束されることは望まないが、ＨＰＶに対する免疫を付与された女性についての過去の経験に基づくと、避妊免疫は約１～約９年間続くと期待される。

ここで図３Ｂを参照すると、いくつかの実施形態において、３０６で、補助組成物を患者に投与して、組成物の効果を拮抗させる。いくつかの実施形態において、補助組成物は、１つ以上の抗原領域のタンパク質配列と実質的に同一のタンパク質配列を有する拮抗薬を含む。いくつかの実施形態において、補助組成物は、抗原キャリアタンパク質を含まない。いくつかの実施形態において、拮抗薬は、１つ以上のペプチドを含み、１つ以上のペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又はその組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、補助組成物は、１つ以上の防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、充填剤などを含む。理論に拘束されることは望まないが、組成物の誘導された免疫不妊症は、補助組成物での過剰投与を使用して抗精子抗体を隔離することによって拮抗する。いくつかの実施形態において、精子免疫を持った個体が、短期間の間、受精能を回復することを望む場合、受精能は、拮抗薬の適用によって与えられる。

実施例
キメラＬ１の設計
一例として、精子カチオン性イオンチャネルＣａｔｓｐｅｒからの短い抗原セグメントを含むキメラＬ１ＶＬＰ形成タンパク質を調製した。相同モデルを用いて細胞外ループを同定することにより、Ｃａｔｓｐｅｒの抗原セグメントを予測した。ホモログパピローマウイルスＬ１配列の多重整列により、Ｌ１遺伝子への挿入部位を同定した。３つの候補挿入部位を、天然の挿入／欠失部位として同定した。ブラケットＣＧＰ．．ＧＰＣシーケンスを添加して、挿入されたループを安定化させた。ＤＮＡ配列は、ＤＮＡＷｏｒｋｓを用いて設計した。

キメラＬ１のクローニング
アセンブリＰＣＲ法を用いてＨＰＶ１１型Ｌ１の遺伝子を合成した。この遺伝子をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩクローニング部位でｐＥＴ２８ａ＋ベクターに挿入した。このプラスミドを増殖させ、大腸菌株ＤＨ５αを用いて細胞培養から精製した。所望の抗原領域の配列を含む重複オリゴを用いてプラスミドを増幅することによって（逆ＰＣＲ）、キメラ構築物を作製した。アンプリコンをプラスミド増幅のためにＤＨ５α細胞に形質転換し、タンパク質発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に移した。

封入体（ＩＢ）の分離
ＨＰＶ１１型（Ｌ１）の組換えタンパク質Ｌ１タンパク質、ＣａｔｓｐｅｒループＳ３－Ｓ４（Ｐ１）のＬ１タンパク質、及びＣａｔｓｐｅｒ－Ｅｐｓｉｌｏｎループ３３１－３４８（Ｃ５）のＬ１を大腸菌で発現させた。組換えタンパク質（Ｌ１、Ｐ１及びＣ５）を、プラスミド構築物ｐＥＴ２８ａ－Ｌ１－Ｐ１及びｐＥＴ２８ａ－Ｌ１－Ｃ５によって形質転換された大腸菌Ｂｌ２１（ＤＥ３）から単離された封入体（ＩＢ）から精製した。組換えタンパク質合成のための誘導後、形質転換大腸菌細胞の５００ｍｌ培養物から細胞を回収した。およそ重量１ｇの湿潤細胞バイオマスを緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ９．５）２５ｍｌ中で穏やかに撹拌することによって懸濁した。懸濁液を超音波処理（１５周期、氷中で１０秒オン及び１０秒オフ）に供し、次いで１２，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離してＩＢをペレット化した。回収したＩＢを洗浄緩衝液５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）で２回洗浄した。

可溶化及びリフォールディング
比較で精製したＩＢを５ｍｌの可溶化緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）、５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＣｌ、８Ｍ尿素）に可溶化し、室温で２時間穏やかに撹拌した。得られた懸濁液を、２５℃、１１０００ｒｐｍで３６分間遠心分離し、全可溶性タンパク質を回収した。可溶化されたＩＢを、約０．１ｍｌ／分のレートでパルス希釈法を使用して、１０容量の氷冷リフォールディング緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ、５０ｍＭＮａＣｌ、５％β-メルカプトエタノール及び１００ｍＭＬ-アルギニン（ｐＨ９．５））中でリフォールディングした。リフォールディングされたタンパク質を、１１０００ｒｐｍで４５分間、４℃で遠心分離した。

ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の透析及びインビトロアセンブリ
リフォールディングしたタンパク質を、０．２μｍフィルター（ＶＷＲ）を通して濾過し、１２～１４ｋＤａカットオフ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、ＶＷＲ）を用いて４℃で透析緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ９．５）に対して透析した。３時間隔で透析緩衝液を３回交換した後、ＮａＣｌ濃度を５００ｍＭまで段階的に増加させた。最終透析を、高塩緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ９．５）に対して２時間行った。

本開示のいくつかの実施形態による方法及びシステムは、長期間持続するが可逆的な避妊効果を提供するための避妊ワクチンに関する。避妊ワクチンの構造は、精子細胞にのみ存在する抗原に対する免疫応答を刺激し、その結果生じる抗精子抗体は精子に結合し、それらの細胞を受精不能にするのに有効である。避妊ワクチンの製造と使用は簡単である。本開示の組成物の利点を実現するために、ワクチン接種以外の行動は必要ないので、ホルモン処置及び／又は外科手術の必要性は回避される。最後に、避妊免疫は容易かつ即座に可逆的であり、免疫は時間とともに自動的に避妊状態に戻る。

本発明はその例示的な実施形態に関して説明され、例示されてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、前述及び様々な他の変更、省略、及び追加がその中で行われ得ることは、当業者であれば理解されるものとする。

Claims

抗原キャリアドメインと、
前記抗原キャリアドメイン中の精子細胞由来の１つ以上の抗原領域と
を含む、避妊キメラウイルス様粒子。
前記抗原キャリアドメインは、１つ以上のカプシドタンパク質を含む、請求項１に記載のキメラウイルス様粒子。
前記１つ以上のカプシドタンパク質は、ヒトパピローマウイルス由来のＬ１を含む、請求項２に記載のキメラウイルス様粒子。
ＣＧＰアミノ酸残基は、前記１つ以上の抗原領域のＮ端末に隣接し、ＧＰＣアミノ酸残基は、前記１つ以上の抗原領域のＣ端末に隣接する、請求項１に記載のキメラウイルス様粒子。
前記１つ以上の抗原領域は、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の構造要素を含む、請求項１に記載のキメラウイルス様粒子。
前記構造要素は、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の膜貫通ヘリックスセグメント間に位置する１つ以上のループの少なくとも一部を含む、請求項５に記載のキメラウイルス様粒子。
前記構造要素は、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ１ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ１ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ２ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ３ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ４ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ４ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒδ ループ７８５－８０５、Ｃａｔｓｐｅｒε ループ３３１～３４８、又はその組み合わせの少なくとも一部を含む、請求項６に記載のキメラウイルス様粒子。
前記ウイルス様粒子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又はその組み合わせを含む、請求項７に記載のキメラウイルス様粒子
抗原キャリアタンパク質の遺伝子をプラスミドに挿入し、
前記抗原キャリア及び精子細胞由来の１つ以上の抗原領域のキメラ遺伝子のための重複プライマーを調製し、
ポリメラーゼ連鎖反応を実施して、前記キメラ遺伝子を増幅し、
前記キメラ遺伝子からウイルス様粒子を合成することを含む、避妊キメラウイルス様粒子を作製する方法。
前記１つ以上の抗原領域は、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の構造要素を含む、請求項９に記載の方法。
前記構造要素は、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の膜貫通螺旋セグメント間に配置された１つ以上のループの少なくとも一部を含む、請求項１０に記載の方法。
前記構造要素は、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ１ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ１ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ２ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ３ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ４ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ４ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒδ ループ７８５－８０５、Ｃａｔｓｐｅｒε ループ３３１～３４８、又はその組み合わせの少なくとも一部を含む、請求項１１に記載の方法。
前記ウイルス様粒子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又はその組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。
抗原キャリアドメインと、前記抗原キャリアドメイン中の精子細胞由来の１つ以上の抗原領域とを含む避妊キメラウイルス様粒子を含む組成物を調製し、
前記組成物を患者に投与して、前記１つ以上の抗原領域に対する前記患者の免疫応答を高めることを含む、患者に避妊処置を提供する方法。
前記抗原キャリアドメインは、ヒトパピローマウイルス由来のＬ１を含む、請求項１４に記載の方法。
前記１つ又は複数の抗原領域は、Ｃａｔｓｐｅｒイオンチャネル複合体の構造要素を含み、前記構造要素は、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ１ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ２ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ１ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ１ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ２ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ２ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ３とＣａｔｓｐｅｒ３ｓ４との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｓ５とＣａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとの間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ３ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ３ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｓ１とＣａｔｓｐｅｒ４ｓ２との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒ４ｐ－ループとＣａｔｓｐｅｒ４ｓ６との間のループ、Ｃａｔｓｐｅｒδ ループ７８５－８０５、Ｃａｔｓｐｅｒε ループ３３１～３４８、又はその組み合わせの少なくとも一部を含む、請求項１４に記載の方法。
前記１つ以上の抗原領域は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２又はその組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
前記組成物は、皮下、静脈内、鼻腔内、又はそれらの組み合わせで投与される、請求項１４に記載の方法。
前記患者に補助組成物を投与して、前記組成物の効果を拮抗させることをさらに含み、前記補助組成物は、前記１つ以上の抗原領域のものと実質的に同一のタンパク質配列を有する拮抗薬を含む、請求項１４に記載の方法。
前記拮抗薬は、１つ以上のペプチドを含み、前記１つ以上のペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２又はその組み合わせを含む、請求項１９に記載の方法。