JP2022514743A - ３－フコシルラクトースの産生およびラクトース変換α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒト母乳オリゴ糖の一部である３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）を産生するための方法、ならびに新規のフコシルトランスフェラーゼ、より具体的には新規のラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよびそれらの応用に関する。さらに、本発明は、新規のラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼを使用して３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）を産生するための方法を提供する。

Description

本発明は、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ：３－ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ）を産生するための方法、ならびに新たに識別されたフコシルトランスフェラーゼ、より具体的には新たに識別されたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよびそれらの応用に関する。さらに、本発明は、新たに識別されたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼを使用して３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）を産生するための方法を提供する。

背景
今日、ヒト母乳オリゴ糖（ＨＭＯ：Ｈｕｍａｎ Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）のファミリーに属する８０個を超える化合物が、構造的に特徴付けられている。これらのＨＭＯは、プレバイオティクスとして機能する複雑なオリゴ糖のクラスである。加えて、ＨＭＯの上皮エピトープに対する構造相同性は、細菌性病原体に対する保護特性の原因となっている。乳児消化管内で、ＨＭＯは、選択された細菌株の増殖を選択的に育成し、したがって、母乳栄養乳児において独特な腸微生物叢の発達を刺激する。

これらのヒト母乳オリゴ糖の一部は、特定の生物活性を示す可能性が高い特定のフコシル化構造の存在を必要とする。これらのフコシル化オリゴ糖の産生は、フコシルトランスフェラーゼの作用を必要とする。そのようなフコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼの酵素ファミリーに属し、脊椎動物、無脊椎動物、植物、真菌、酵母および細菌において広く発現される。それらは、フコース残基の、ドナー、一般的にグアノシン二リン酸フコース（ＧＤＰ－フコース）から、オリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質を含むアクセプターへの移行を触媒する。このようにしてフコシル化されたアクセプター基質は、様々な生物プロセスおよび病理プロセスに関与する。

いくつかのフコシルトランスフェラーゼは、例えば、細菌Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａにおいて、哺乳動物、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉにおいて、ならびに植物において識別されている。

フコシルトランスフェラーゼは、例えば、アルファ－１，２、アルファ－１，３、アルファ－１，４およびＯ－フコシルトランスフェラーゼへのフコース添加の部位に基づいて分類される。

いくつかのアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼは、既に当該技術分野において説明されている。ＷＯ１９９８／０５５６３０は、ルイスＸ、ルイスＹおよびシアリルルイスＸなどのオリゴ糖の産生において使用することができるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの細菌アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を説明している。ＷＯ２０１６／０４０５３１は、フコシル化オリゴ糖の産生のためのいくつかのアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼを説明している。ここで、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｎｏｒｄｉｉ ＣａｆＣ酵素と２５～１００％の配列同一性を有することが説明されている。しかしながら、その出願の表１において、著者らは、それらの試験した酵素のうちの半分超（１２個のうちの７個）（それらのうちの多くはＣａｆＣとの２５％超の配列同一性を有する）は、ラクトースをアクセプター基質として使用して３－フコシルラクトースを産生することができないことを明確に示している。このことは、明らかに、全ての仮定上のフコシルトランスフェラーゼが実際にラクトース結合フコシルトランスフェラーゼ活性を有するわけではないことを説明している。ＷＯ２０１２／０４９０８３は、いくつかの新しいアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼおよびフコシル化生成物の産生のためのそれらの使用を説明している。Huang et al. 2017は、様々な外因性アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ候補物および一連のＥ．ｃｏｌｉ宿主株の比較を行い、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主株として使用したＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉからのｆｕｔＡは、ヒト母乳オリゴ糖の１つである３－フコシルラクトースの最も高いタイターを産出したことを実証した。

一般的に、アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼは、３－フコシルトランスフェラーゼまたは３－フコシルトランスフェラーゼ酵素としても公知であり、ラクトースについて低い親和性を有することが公知である。３－フコシルトランスフェラーゼは、ＨＭＯ３－フコシルラクトースの産生に必要とされる。低い親和性は、３－フコシルラクトースの生産性に対して負の効果を有する。変換率および生産性を改善するために、十分なラクトース親和性、好ましくはより高いラクトース親和性を有するトランスフェラーゼについて要求がある。

したがって、３－フコシルラクトースを効率的な、時間およびコスト効果の高い方法で産生または合成することができ、最新の方法と比較して、同様の、またはより多くの量の所望の生成物を産出するツールおよび方法を提供することが、本発明の目的である。

国際公開第１９９８／０５５６３０号 国際公開第２０１６／０４０５３１号 国際公開第２０１２／０４９０８３号

説明
驚くべきことに、本発明の新たに識別されたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素は、現在公知のラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素と同様の、またはより高いラクトース結合および／もしくはトランスフェラーゼ特性を有するトランスフェラーゼを提供することが、今や発見された。

それゆえ、本発明は、新たに識別されたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼを使用して３－フコシルラクトース（３ＦＬ）を産生するための方法を提供する。３ＦＬは、ラクトースおよびＧＤＰ－フコースからの３－フコシルラクトースオリゴ糖の形成を触媒することができるアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼの存在下でラクトースを反応させることによって得ることができる。あるいは、また、３ＦＬは、本発明によるアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼを産生する微生物から得ることができる。

定義
本発明およびその様々な実施形態を説明するために本明細書において使用される単語は、それらの一般に定義される意味の語義においてのみではなく、一般に定義される意味の範囲を超える本明細書の特別な定義による構造、材料または作用も含むと理解されるべきである。したがって、要素が本明細書の文脈において２つ以上の意味を含むと理解され得る場合、特許請求の範囲におけるその使用は、明細書によって、および単語それ自体によって支持される全ての可能な意味について包括的であると理解されなければならない。

本明細書で開示される本発明の様々な実施形態および実施形態の態様は、本明細書で具体的に説明される順序および文脈でのみではなく、その任意の順序および任意の組合せを含むと理解されるべきである。文脈が要求する場合は常に、単数形で使用される全ての単語は、複数を含むと考えられるべきであり、その逆も同じである。別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、一般的に、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用される命名法、ならびに本明細書で説明される細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける研究室手技は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されている手技である。核酸およびペプチド合成に、標準技法が使用される。一般的に、酵素反応および精製ステップは、製造業者の仕様書に従って行われる。

図面および明細書において、本発明の実施形態が開示されており、特定の用語が使用されているが、用語は、単に説明の語義において使用され、限定の目的のためではなく、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲で示される。説明される実施形態は例の目的のためにのみ示されており、それは本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことが理解されなければならない。変更、他の実施形態、改善、詳細および使用は、本明細書中の本開示の文言および趣旨と一致して、本開示の範囲内で行うことができ、それは特許請求の範囲によってのみ限定され、均等論を含む特許法に従って解釈されることが当業者に明らかである。以下の特許請求の範囲において、特許請求の範囲のステップを示すために使用される参照符号は、説明の利便性のためにのみ提供され、ステップを行うための任意の特定の順序を意味することを意図しない。

本発明に従って、「ポリヌクレオチド」という用語は、一般的に、非改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ；一本鎖および二本鎖領域または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ；一本鎖および二本鎖ＲＮＡ；ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ；一本鎖、またはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖領域、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。そのような領域内の鎖は、同じ分子からの鎖、または異なる分子からの鎖であり得る。領域は、分子のうちの１つまたは複数の全てを含み得るが、より典型的には、分子のうちの一部の領域のみを含む。三本鎖ヘリックス領域の分子のうちの１つは多くの場合、オリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、また、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つまたは複数の改変された塩基を含有する上記に説明されるＤＮＡまたはＲＮＡを含む。したがって、安定性のためまたは他の理由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明による「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの異常な塩基、またはトリチル化塩基などの改変された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、「ポリヌクレオチド」という用語に包含されると理解されるべきである。当業者に公知の多くの有用な目的を満たす広範な改変がＤＮＡおよびＲＮＡになされていることが理解される。「ポリヌクレオチド」という用語は、それが本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドのそのような化学的、酵素的または代謝的に改変された型、ならびにウイルスおよび単純型および複雑型細胞を含む細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学型を包含する。また、「ポリヌクレオチド」という用語は、多くの場合オリゴヌクレオチドと呼ばれる短いポリヌクレオチドを包含する。

「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合によって互いに接合された２つまたはそれよりも多いアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」とは、一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる短鎖、ならびに一般的にタンパク質と呼ばれるより長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子をコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。「ポリペプチド」は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾などの天然プロセスによって、また化学修飾技法によって改変されたポリペプチドを含む。そのような改変は、基本的な教本およびより詳細な研究書、ならびに多数の研究文献で十分に説明されており、それらは当業者に周知である。所与のポリペプチドのいくつかの部位において、同じ型の改変は、同じ程度または様々な程度で存在し得る。さらに、所与のポリペプチドは、多くの型の改変を含有し得る。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどこで起こってもよい。改変には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ－リボシル化、セレニル化（selenoylation）、アミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介添加、例えば、アルギニル化およびユビキチン化が含まれる。ポリペプチドは、分岐または環式であってもよく、分岐を伴っても、伴わなくてもよい。環式、分岐および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生じてもよく、全て合成法によって作製されてもよい。

「単離された」とは、その天然状態から「人為的に」変更されたこと、すなわち、それが天然に存在する場合、それがその元の環境から変化もしくは除去されているか、またはその両方であることを意味する。例えば、この用語が本明細書で使用される場合、生存生物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いる。同様に、「合成」配列とは、この用語が本明細書で使用される場合、合成生成され、天然源から直接単離されていない任意の配列を意味する。「合成された」とは、この用語が本明細書で使用される場合、任意の合成生成された、天然源から直接単離されていない配列を意味する。

「組換え体」とは、ある種からの遺伝子を様々な種の宿主生物の細胞に移植またはスプライシングすることによって調製した遺伝子操作されたＤＮＡを意味する。そのようなＤＮＡは、宿主の遺伝子構造の部分になり、複製される。「突然変異（体）」細胞または微生物は、本開示の文脈内で使用される場合、遺伝子操作された、または変更された遺伝子構造を有する細胞または微生物を指す。

本開示の文脈内の「３－フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された細胞」という用語は、ｉ）前記３－フコシルラクトースの合成に必要なα１，３フコシルトランスフェラーゼをコードする組換え遺伝子、ｉｉ）前記フコシルトランスフェラーゼによってラクトースに移行されるのに好適なＧＤＰ－フコースを産生する生合成経路、および／またはｉｉｉ）ラクトースを産生する生合成経路、もしくは培養培地から、ラクトースがフコシル化されて３－フコシルラクトースを産生する細胞へのラクトースの内部移行の機構のうちの少なくとも１つを含むように遺伝子操作された微生物の細胞を指す。

「３－フコシルラクトース合成のための酵素をコードする核酸配列」という用語は、３－フコシルラクトースへの合成経路において必要な酵素、例えば、ＧＤＰ－フコースドナー基質のフコース部分をラクトースのガラクトース部分の３ヒドロキシル基上に移行して、したがって３－フコシルラクトースを産生することができる酵素をコードする核酸配列に関する。

本開示の文脈内の「内因性」という用語は、細胞の天然部分であり、細胞染色体のその天然の場所に存在している任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列を指す。「外因性」という用語は、研究のもとで細胞外に由来し、細胞の天然部分でなく、細胞染色体もしくはプラスミド内のその天然の場所に存在しない任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列を指す。

「異種の」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素について使用される場合、宿主生物種以外の源からの、または宿主生物種以外の源に由来するポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素を指す。対照的に、「同種の」ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素は、宿主生物種に由来するポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素を示すために本明細書で使用される。遺伝子配列を維持または操作するために使用される遺伝子調節配列または補助的な核酸配列（例えば、プロモーター、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列、イントロン配列、スプライス部位、リボソーム結合部位、配列内リボソーム進入配列、ゲノムホモロジー領域、組換え部位など）について言及する場合、「異種の」は、調節配列または補助的配列が、構築物、ゲノム、染色体またはエピソームにおいて調節または補助的核酸配列が並置されている遺伝子と天然に関連付けられないことを意味する。したがって、プロモーターがその天然状態では（すなわち、非遺伝子操作生物のゲノムでは）作動可能に連結していない遺伝子に作動可能に連結したプロモーターは、プロモーターが、プロモーターが連結されている遺伝子と同じ種（または一部の場合、同じ生物）に由来し得る場合でさえも、「異種のプロモーター」と本明細書で呼ばれる。

「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明のポリペプチド、特に付属の配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２８、３０または３２で示されるアミノ酸配列を有するα－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。また、明確にするために、配列番号１８、２４および２６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、定義によって包含されるポリヌクレオチドであるが、配列番号１８のポリヌクレオチドは、参照として使用される先行技術のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼであり、配列番号２４および２６のポリヌクレオチドは、アクセプターとしてのラクトースに対して非機能的であるα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素である。また、この用語は、ポリペプチドをコードする単一の連続領域または非連続領域を含むポリヌクレオチド（例えば、組み込まれたファージもしくは挿入配列または編集によって中断された）ならびにこれもまたコード配列および／または非コード配列を含有し得る追加の領域を包含する。

「バリアント」とは、この用語が本明細書で使用される場合、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、本質的な特性を保持する、それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。典型的なポリヌクレオチドのバリアントは、別の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。バリアントのヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更する場合も、変更しない場合もある。ヌクレオチド変化は、以下に説明されるように、参照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をもたらし得る。典型的なポリペプチドのバリアントは、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に、相違は限定的であり、そのため、参照ポリペプチドの配列とバリアントの配列とは、全体的に密接に類似し、多くの領域で同一である。バリアントおよび参照ポリペプチドは、任意の組合せの１つまたは複数の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされる残基であっても、そうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントなどの天然に存在するものであってもよく、またはそれは天然に存在することが公知でないバリアントであってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しないバリアントは、変異誘発技法によって、直接合成によって、および当業者に公知の他の組換え法によって作製され得る。一部の実施形態では、本開示は、本発明において使用される膜タンパク質の構造を改変することによって機能的バリアントを作製することを企図する。バリアントは、アミノ酸置換、欠失、付加またはその組合せによって産生され得る。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、トレオニンのセリンでの単独の置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的突然変異）は、得られる分子の生物活性に対して大きな効果を有しないと予測することが妥当である。保存的置換は、側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的ホモログをもたらすかどうかは、バリアントポリペプチドの、野生型ポリペプチドと同様の様式で細胞において応答をもたらす能力、本発明の場合、バリアントを有しない細胞よりも優れた収率、生産性および／または増殖スピードを提供する能力を評定することによって容易に決定することができる。

「機能的ホモログ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列類似性を有し、また生化学活性などの少なくとも１つの機能的特徴を共有する分子を説明する。機能的ホモログは、典型的に、同様であるが、必ずしも同じではない程度まで同じ特徴を生ずる。機能的に同種のタンパク質は、１つのホモログによって産生される定量的測定値が、他方の少なくとも１０パーセント；より典型的には少なくとも２０パーセント、元の分子によって産生される測定値の約３０パーセント～約４０パーセントの間；例えば、約５０パーセント～約６０パーセントの間；約７０パーセント～約８０パーセントの間；もしくは約９０パーセント～約９５パーセントの間；約９８パーセント～約１００パーセントの間、または１００パーセント超である同じ特徴を与える。したがって、分子が酵素活性を有する場合、機能的ホモログは、元の酵素と比較して上記に列挙されるパーセントの酵素活性を有する。分子がＤＮＡ結合分子（例えば、ポリペプチド）である場合、ホモログは、元の分子と比較して、結合した分子の重量によって測定される上記に列挙されるパーセンテージの結合親和性を有する。

機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであってもよく、配列類似性は、収束性または多様性の進化的事象のためであり得る。機能的ホモログは、オルソログと呼ばれる場合もあり、「オルソログ」とは、別の種の参照される遺伝子またはタンパク質の機能的同等物である同種の遺伝子またはタンパク質を指す。

機能的ホモログは、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列整列の分析によって特定することができる。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースについて照会を行うことにより、バイオマス調節ポリペプチドのホモログを特定することができる。配列分析は、バイオマス調節ポリペプチドのアミノ酸配列を参照配列として使用する非重複データベースのＢＬＡＳＴ、Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ分析を含み得る。アミノ酸配列は、一部の場合、ヌクレオチド配列から推測される。典型的に、４０パーセント超の配列同一性を有するデータベース内のそれらのポリペプチドは、バイオマス調節ポリペプチドとしての適合性についてのさらなる評価の候補物である。アミノ酸配列類似性は、保存的アミノ酸置換、例えば、１つの疎水性残基の別の疎水性残基への置換、または１つの極性残基の別の極性残基への置換を可能にする。所望の場合、さらに評価するべき候補物の数を狭めるために、そのような候補物の手動の検査を行ってもよい。手動の検査は、生産性調節ポリペプチドに存在するドメイン、例えば、保存された機能的ドメインを有するように見えるそれらの候補物を選択することによって行うことができる。

ポリヌクレオチドについての「断片」とは、ポリヌクレオチド分子のクローンまたは任意の部分、特に使用可能な機能的特徴を保持するポリヌクレオチドの部分を指す。有用な断片は、ハイブリダイゼーションもしくは増幅技術において、または複製、転写もしくは翻訳の調節において使用され得るオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド断片」とは、典型的に、本明細書で提供される配列のうちのいずれかの少なくとも約９個の連続ヌクレオチド、例えば、少なくとも約３０個のヌクレオチドまたは少なくとも約５０個のヌクレオチドの、ポリヌクレオチドの任意のサブ配列を指す。例示的な断片は、加えて、またはあるいは、ポリペプチドの保存されたファミリードメインをコードする領域を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる断片を含み得る。例示的な断片は、加えて、またはあるいは、ポリペプチドの保存されたドメインを含む断片を含み得る。

断片は、加えて、またはあるいは、ポリペプチドおよびタンパク質分子のサブ配列、またはポリペプチドのサブ配列を含み得る。一部の場合、断片またはドメインは、インタクトなポリペプチドが行うのと実質的に同じ様式で、または同様の程度まで、インタクトなポリペプチドの少なくとも１つの生物機能を行うポリペプチドのサブ配列である。例えば、ポリペプチド断片は、認識可能な構造モチーフまたは機能的ドメイン、例えば、ＤＮＡプロモーター領域に結合するＤＮＡ結合部位またはドメイン、活性化ドメイン、またはタンパク質－タンパク質相互作用のためのドメインを含んでもよく、転写を開始してもよい。断片は、わずか３個のアミノ酸残基からインタクトなポリペプチドの全長まで大きさが変動し、例えば、少なくとも約２０個のアミノ酸残基の長さ、例えば、少なくとも約３０個のアミノ酸残基の長さであり得る。優先的に、断片は、それが由来するポリペプチドの少なくとも１つの特性または活性を有する機能的断片であり、例えば、断片は、ポリペプチドの機能的ドメインまたは保存されたドメインを含み得る。ドメインは、例えば、ＰｆａｍまたはＣｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）命名法によって特徴付けることができる。

「アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ」、「アルファ１，３フコシルトランスフェラーゼ」、「３－フコシルトランスフェラーゼ」、「α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ」、「α１，３フコシルトランスフェラーゼ」、「３フコシルトランスフェラーゼ」、「３－ＦＴ」または「３ＦＴ」という用語は、本発明で使用される場合、互換的に使用され、フコースの、ドナー基質ＧＤＰ－Ｌ－フコースからアルファ－１，３－結合でのアクセプター分子ラクトースへの移行を触媒するグリコシルトランスフェラーゼを指す。「アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ」または上記の用語のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、フコースの、ドナー基質ＧＤＰ－Ｌ－フコースからアルファ－１，３－結合でのアクセプター分子ラクトースへの移行を触媒するそのようなグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを指す。

「３－フコシルラクトース」、「アルファ－１，３－フコシルラクトース」、「アルファ１，３フコシルラクトース」、「α－１，３－フコシルラクトース」、「α１，３フコシルラクトース」、「Ｇａｌβ－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ」、「３ＦＬ」または「３－ＦＬ」という用語は、本発明で使用される場合、互換的に使用され、フコース残基をＧＤＰ－Ｌ－フコースからアルファ－１，３－結合でラクトースへ移行するアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼの触媒によって得られる生成物を指す。

「オリゴ糖」とは、この用語が本明細書で使用される場合、および一般的に最新の技術において理解されるように、少数の、典型的に、３～１０個の単純な糖、すなわち、単糖を含有する糖ポリマーを指す。

「精製された」という用語は、生体分子の活性に干渉する成分から実質的または本質的に遊離している材料を指す。細胞、糖、核酸およびポリペプチドについて、「精製された」という用語は、材料のそのネイティブの状態において見られる場合に普通、材料に付随する成分から実質的に遊離しているまたは本質的に遊離している材料を指す。典型的に、本発明の精製した糖、オリゴ糖、タンパク質または核酸は、銀染色ゲル上のバンド強度または純度を決定するための他の方法によって測定して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％純粋であり、通常少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％純粋である。純度または均一性は、当該技術分野で周知のいくつかの手段、例えば、タンパク質または核酸試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、および続く染色に際しての可視化によって示すことができる。ある特定の目的のために、高分解能が必要とされ、ＨＰＬＣまたは精製のための同様の手段が利用される。オリゴ糖、例えば、３－フコシルラクトースについて、純度は、非限定的に、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動または質量分析などの方法を使用して決定することができる。

２つまたはそれよりも多い核酸またはポリペプチド配列に関する「同一の」または「同一性」パーセントまたは「同一性」％という用語は、最大一致について比較および整列した場合、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定して、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する２つまたはそれよりも多い配列またはサブ配列を指す。配列比較のために、１つの配列が、参照配列として働き、試験配列をそれと比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合、サブ配列協調を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。その後、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを使用して決定することができる（Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:3, 403- 410；Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res 25: 17, 3389-402）。本発明の目的のために、同一性パーセントは、ＭａｔＧＡＴ２．０１を使用して決定される（Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics 4:29）。ＭａｔＧＡＴは、対整列を行うためにＭｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒのグローバルアライメントアルゴリズムを利用する。タンパク質についての以下のデフォルトパラメーターが使用される：（１）Ｇａｐ ｃｏｓｔ Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１２およびＥｘｔｅｎｓｉｏｎ：２；（２）使用されるマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ５０であった。

「制御配列」という用語は、宿主細胞転写および翻訳系によって認識され、ポリヌクレオチド配列のポリペプチドへの転写および翻訳を可能にする配列を指す。したがって、そのようなＤＮＡ配列は、特定の宿主細胞または生物において作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要である。そのような制御配列は、プロモーター配列、リボソーム結合配列、シャイン・ダルガノ配列、コザック配列、転写ターミネーター配列であり得るが、これらに限定されない。例えば、原核生物に好適な制御配列は、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。プレ配列もしくは分泌リーダーについてのＤＮＡは、それが、ポリペプチドの分泌に参加するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結され得るか；プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるか；またはリボソーム結合部位は、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるか；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結される。前記制御配列は、さらに、非限定的に、ＩＰＴＧ、アラビノース、ラクトース、アロラクトース、ラムノースまたはフコースなどの外部化学物質によって、誘導性プロモーターを介して、または前記ポリヌクレオチドのポリペプチドへの転写もしくは翻訳を誘導もしくは抑制する遺伝子制御機構を介して制御され得る。

「発酵の終わり」という用語は、本発明で使用される場合、発酵が生成物精製のために回収される時間を指す。

一般的に、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合、連続し、読み出し相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続していなくてもよい。

発明の詳細な説明
第１の実施形態によれば、本発明は、α－１，３－フコシルラクトースを産生するための方法を提供する。この方法は、
ａ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドを提供するステップであって、前記ポリペプチドが、
ｉ）保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）をコードするアミノ酸配列、
ｉｉ）保存された［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］ドメイン（配列番号３４）をコードするアミノ酸配列
を含み、
ｉｉｉ）加えて、ｉｉ）の前記ドメインがＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦ（配列番号３６）に等しい場合、保存されたモチーフ［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）が、Ｎ末端領域に存在し、
式中、Ｘが、任意の別個のアミノ酸であってもよく、
前記ポリペプチドのＣ末端が、前記ＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個未満またはそれに等しいアミノ酸を有する、ステップと、
ｂ）ステップａ）のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを、ＧＤＰ－フコースをドナー基質として、およびラクトースをアクセプター基質として含む混合物と、前記ポリペプチドが、フコース残基の、前記ドナー基質から前記アクセプター基質への移行を触媒する条件下で接触させ、
それによって、α－１，３－フコシルラクトースを産生するステップと、
を含む。

上記のドメインの両方（または、場合によって、配列番号３３～３６の全て）を含むこれらの新たに識別されたポリペプチドは、現在公知のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼを超える、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有する代替のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼを提供する。上記のドメインの両方（または、場合によって、配列番号３３～３６の全て）を含むポリペプチドは、現在公知のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼと同様の、もしくはより高いラクトース結合、および／または同様の、もしくはより高いトランスフェラーゼ特性を有するトランスフェラーゼを提供する。

本発明の第１の好ましい実施形態では、本発明で有用なポリペプチドは、配列番号３３～３４または３６を有するドメインの両方（または、場合によって、配列番号３３～３６の全て）を含み、前記配列番号３３は、アミノ酸配列ＹＸＴＥＫ（配列番号３７）（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）を有する保存されたドメインである。

本発明の第２の好ましい実施形態では、本発明で有用なポリペプチドは、配列番号３３～３４または３６を有するドメインの両方（または、場合によって、配列番号３３～３６の全て）を含み、前記配列番号３４は、アミノ酸配列［Ｋ／Ｄ］ＬＸ［Ｉ／Ｌ／Ｍ］Ｇ［Ｆ／Ｙ］（配列番号３８）、［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ］ｘＬ［Ｓ／Ｇ］［Ｆ／Ｙ］（配列番号３９）または［Ｋ／Ｄ］ＬＸＬＧ［Ｆ／Ｙ］（配列番号４０）（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）を有する保存されたドメインである。

ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有することが新たに識別され、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、新たに識別されたドメインを有するポリペプチドの一部を使用するさらなる利点は、３－フコシルラクトースが、新たに識別された３－フコシルトランスフェラーゼの、ラクトースを３ＦＬ産生のために使用するより優れた変換能力のために、反応または発酵の終わりに、配列番号１８を有する参照先行技術のポリペプチドで得られる純度よりも高い純度で産生されるという事実にある。より具体的には、ラクトース濃度の３－フコシルラクトース濃度に対する比は、１：５よりも小さく、好ましくは１：１０よりも小さく、より好ましくは１／２０よりも小さく、最適には１：４０よりも小さい。別の好ましい実施形態では、３－フコシルラクトース純度は、発酵の終わりにおいて８０％またはそれよりも高い。

本発明に従って、α－１，３－フコシルラクトースを産生するための方法は、細胞非含有系で、または細胞を含有する系で行うことができる。基質ＧＤＰ－フコースおよびラクトースを、アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドと、酵素生成物の形成を可能するのに十分な時間、十分な条件下で反応させる。これらの条件は、基質および酵素の量および純度、ならびに系が細胞非含有系であるか、細胞ベースの系であるかに依存して変動する。これらの変数は、当業者によって容易に調整される。

細胞非含有系では、本発明によるポリペプチド、アクセプター基質、ドナー基質ならびに場合によって、他のグリコシルトランスフェラーゼおよび付属の酵素を含む他の反応混合物成分を、酵素反応を行うための水性反応媒体中での混合によって合わせる。酵素は、溶液中で遊離して利用してもよく、またはそれらはポリマーなどの支持体に結合もしくは固定してもよく、基質を支持体に添加してもよい。支持体は、例えば、カラムに充填され得る。

本明細書で説明される３－フコシルラクトースの合成のための細胞含有系または細胞ベースの系は、遺伝子改変された宿主細胞を含み得る。本発明の一態様に従って、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、ポリペプチドを産生する細胞、例えば、本明細書で説明される宿主細胞によって産生される。本発明の別の態様に従って、ＧＤＰ－フコースおよび／またはラクトースは、前記ＧＤＰ－フコースおよび／またはラクトースを産生する細胞によって提供される。細胞は、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼもまた産生する宿主細胞であり得る。あるいは、細胞は、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼを産生する宿主細胞とは別の細胞であってもよく、この場合、当業者は細胞カップリングについて議論し得る。そのようなＧＤＰ－フコースを産生する細胞は、例えば、宿主細胞に添加されるフコースをＧＤＰ－フコースに変換する酵素を発現し得る。この酵素は、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓからのＦｋｐのような二機能性フコースキナーゼ／フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、または１つの別々のフコースキナーゼと１つの別々のフコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼとの組合せ（それらが、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａおよびＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓを含むいくつかの種から公知であるように）であり得る。

別の実施形態では、本発明は、α－１，３－フコシルラクトースを産生するための方法であって、以下：
ｉ）α－１，３－フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された細胞を提供するステップであって、前記細胞が、α－１，３－フコシルラクトース合成のための酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、前記細胞が、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドの発現を含み、前記ポリペプチドが、
ａ）保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）をコードするアミノ酸配列、
ｂ）保存された［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］ドメイン（配列番号３４）をコードするアミノ酸配列
を含み、
ｃ）加えて、ｂ）のドメインがＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦ（配列番号３６）に等しい場合、保存されたモチーフ［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）が、Ｎ末端領域に存在し、
式中、Ｘが、任意の別個のアミノ酸であってもよく、
前記ポリペプチドのＣ末端が、ＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個未満またはそれに等しいアミノ酸を有する、ステップと、
ｉｉ）細胞を媒体中でα－１，３－フコシルラクトースの産生を許容する条件下で培養し、それによって、３－ＦＬを産生するステップと
を含む方法に関する。

さらなる実施形態では。本発明は、α－１，３－フコシルラクトースを産生するための方法に関する。この方法は、
ａ）本明細書中に定義される、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドを発現する宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）宿主細胞を、α－１，３－フコシルラクトースの産生を許容し、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現を許容する好適な栄養条件下で、増殖させるステップと、
ｃ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドがフコース残基の、ドナー基質ＧＤＰ－フコースからアクセプター基質ラクトースへの移行を触媒するために、ＧＤＰ－フコースおよびラクトースをステップｂ）と同時に、またはそれに続いて提供し、それによって、α－１，３－フコシルラクトースを産生するステップと、
を含む。必要に応じて、産生された３ＦＬは、その後、宿主細胞および／またはその増殖培地から分離される。

また別の実施形態に従って、本明細書で説明される方法における前記３－フコシルラクトースの産生は、細胞による、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの異種の、または同種の（過剰）発現の手段によって行われる。

本明細書で説明される本発明の方法では、宿主細胞は、本明細書で説明され、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有する外因性ポリペプチドを発現するように形質転換またはトランスフェクトされ得る。かくして、本発明は、宿主細胞を使用してα－１，３－フコシルラクトースを産生するための方法であって、以下：
ａ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有する外因性ポリペプチドを発現するように形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を増殖させるステップであって、ポリペプチドが、本明細書で示される、ステップと、
ｂ）ステップａ）と同時に、またはそれに続いて、ドナー基質ＧＤＰ－フコースおよびアクセプター基質ラクトースを提供するステップであって、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドが、フコース残基の、ドナー基質からアクセプター基質への移行を触媒し、それによって、α－１，３－フコシルラクトースを産生する、ステップと
を含む方法に関する。

好ましくは、本明細書で使用される、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有する外因性ポリペプチドは、１：５よりも小さい、発酵の終わりのラクトース濃度の３ＦＬ濃度に対する比で、３ＦＬを産生する。

ラクトース濃度の３ＦＬ濃度に対する比は、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１１０、１：１２０、１：１３０、１：１４０、１：１５０、１：１６０、１：１７０、１：１８０、１：１９０、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００未満であり得る。

好ましい実施形態では、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１１０、１：１２０、１：１３０、１：１４０、１：１５０、１：１６０、１：１７０、１：１８０、１：１９０、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００よりも低い、ラクトース濃度の３ＦＬ濃度に対する比は、産生プロセス内で得られ、２５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌまたは０ｇ／Ｌよりも低い最終ラクトース濃度を生ずる。

別の実施形態では、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１１０、１：１２０、１：１３０、１：１４０、１：１５０、１：１６０、１：１７０、１：１８０、１：１９０、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００よりも低い、ラクトース濃度の３ＦＬ濃度に対する比は、産生プロセス内で得られ、ラクトース濃度は、基質制限条件で供給され、基質制限は、基質変換率を決定するバイオリアクター内の濃度として定義される。

別の実施形態では、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１１０、１：１２０、１：１３０、１：１４０、１：１５０、１：１６０、１：１７０、１：１８０、１：１９０、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００よりも低い、ラクトース濃度の３ＦＬ濃度に対する比は、産生プロセス内で得られ、ラクトースは、律速条件で細胞において形成される。

別の実施形態では、ブロス中の３－フコシルラクトース純度は、ブロス中の（ラクトースおよび３ＦＬの）合計の約８０％よりも高く、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％である。本明細書で使用される場合、３－フコシルラクトース純度は、３ＦＬ濃度の、３ＦＬ濃度とラクトース濃度との合計に対する比（［３ＦＬ］／（［３ＦＬ］＋［ラクトース］））として定義される。

本発明に従って、ＧＤＰ－フコースおよび／またはラクトースは、発酵培地または水性培養培地中の宿主細胞に供給され得る。あるいは、ＧＤＰ－フコースおよび／またはラクトースは、宿主細胞において同時発現される酵素によって、または宿主細胞の代謝によって提供され得る。したがって、また、宿主細胞は、ＧＤＰ－フコースおよび／またはラクトースのそばでα－１，３－フコシルトランスフェラーゼを産生する。別の実施形態では、ＧＤＰ－フコースおよび／またはラクトースは、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼを産生する宿主細胞とは別の細胞である細胞によって産生されてもよく、この場合、当業者は、細胞カップリングについて議論し得る。そのようなＧＤＰ－フコースを産生する細胞は、例えば、宿主細胞に添加されるフコースをＧＤＰ－フコースに変換する酵素を発現し得る。この酵素は、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓからのＦｋｐのような二機能性フコースキナーゼ／フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、または１つの別々のフコースキナーゼと１つの別々のフコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼとの組合せ（それらが、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａおよびＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓを含むいくつかの種から公知であるように）であり得る。

また別の実施形態に従って、前記α－１，３－フコシルラクトースの産生は、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの異種の、または同種の（過剰）発現を含む、本明細書で説明される宿主細胞の手段によって行われる。

さらなる態様では、本発明は、本明細書で説明されるα－１，３－フコシルラクトースを産生するための方法であって、α－１，３－フコシルラクトースを宿主細胞またはその増殖培地から分離するステップをさらに含む方法を提供する。

本明細書で使用される場合、「分離するステップ」という用語は、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼを産生する反応混合物から、および／または細胞から、本発明によるα－１，３－フコシルトランスフェラーゼによって産生されたα－１，３－フコシルラクトースを回収、収集または回復するステップを意味する。

α－１，３－フコシルラクトースが細胞の使用または発酵によって製造される場合、３－ＦＬは、混合物が製造された水性培養培地から、従来型の様式で分離することができる。アルファ－１，３－フコシルラクトースがα－１，３－フコシルラクトースを産生する細胞内にまだ存在している場合、細胞からα－１，３－フコシルラクトースを遊離または抽出するための従来型の様式、例えば、高ｐＨ、ヒートショック、超音波処理、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、酵素加水分解、化学加水分解、溶媒加水分解、洗剤、加水分解などを使用する細胞破壊を使用することができる。培養培地、反応混合物および／または細胞抽出物は、共に、および別々に、３－ＦＬ含有混合物と呼ばれ、その後、３－ＦＬを分離するためにさらに使用され得る。これは、好ましくは、３－ＦＬ含有混合物を浄化して、懸濁された微粒子および夾雑物、特に、遺伝子改変された細胞を培養することおよび／または酵素反応を行うことによって産生された細胞、細胞成分、不溶性代謝物および細片を除去することを含む。このステップでは、３－ＦＬ含有混合物は、従来型の様式で浄化され得る。好ましくは、３－ＦＬ含有混合物は、遠心分離、凝結、デカンテーションおよび／または濾過によって浄化される。３－ＦＬを３－ＦＬ含有混合物から分離する第２のステップは、好ましくは３－ＦＬ含有混合物が浄化された後に、好ましくは、実質的に全てのタンパク質、ならびに次の分離ステップに干渉し得るペプチド、アミノ酸、ＲＮＡおよびＤＮＡおよび任意のエンドトキシンおよび糖脂質を、３－ＦＬ含有混合物から除去することを含む。このステップでは、タンパク質および関連する不純物は、従来型の様式で３－ＦＬ含有混合物から除去され得る。好ましくは、タンパク質、塩、副産物、色および他の関連する不純物は、限外濾過、ナノ濾過、逆浸透法、精密濾過、活性炭もしくは炭素処理、接線流高性能濾過、接線流限外濾過、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、非限定的に、カチオン交換、アニオン交換、混床式イオン交換）、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／またはゲル濾過（すなわち、サイズ排除クロマトグラフィー）によって、特にクロマトグラフィーによって、より具体的にはイオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはリガンド交換クロマトグラフィーによって３－ＦＬ含有混合物から除去される。サイズ排除クロマトグラフィーを除いては、タンパク質および関連する不純物は、クロマトグラフィー媒体または選択される膜によって保持され、一方で、３－ＦＬは３－ＦＬ含有混合物中に残る。

３－ＦＬは、反応混合物および／または培養培地および／または細胞からさらに分離され、蒸発、凍結乾燥、結晶化、沈殿および／または乾燥、噴霧乾燥によるさらなる精製ステップを伴うか、または伴わない。

またさらなる態様では、また、本発明は、α－１，３－フコシルラクトースのさらなる精製を提供する。前記アルファ－１，３－フコシルラクトースのさらなる精製は、例えば、（活性）炭もしくは炭素、ナノ濾過、限外濾過またはイオン交換の使用によって達成されて、任意の残留するＤＮＡ、タンパク質、ＬＰＳ、エンドトキシンまたは他の不純物を除去し得る。また、アルコール、例えば、エタノールおよび水性アルコール混合物を使用してもよい。別の精製ステップは、生成物の結晶化、蒸発または沈殿によって達成される。別の精製ステップは、α－１，３－フコシルラクトースを乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥することである。

分離され、好ましくは、また、精製された３－ＦＬは、調整粉乳中の栄養補助剤として、および新生児における様々な疾患を処置するために使用することができる。

本発明の別の態様は、ポリペプチドおよび好ましくは、また、３－ＦＬが、真菌、酵母、細菌、昆虫、動物および植物発現系または本明細書で説明される細胞において、および／またはこれらによって産生される、方法を提供する。発現系または細胞は、細菌、酵母もしくは真菌を含むリストから選択されるか、または植物もしくは動物細胞を指す。後者の細菌は、好ましくは、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門またはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門またはＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門またはＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ門に属する。Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する後者の細菌は、好ましくはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科に、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種に属する。後者の細菌は、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種に属する任意の株、例えば、非限定的に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに関する。より具体的には、後者の用語は、研究室環境に十分に適合され、野生型株とは異なり、腸内で繁栄する能力を失っている、培養されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株と命名される）に関する。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株の周知の例は、Ｋ１２野生型、Ｗ３１１０、ＭＧ１６５５、Ｍ１８２、ＭＣ１０００、ＭＣ１０６０、ＭＣ１０６１、ＭＣ４１００、ＪＭ１０１、ＮＺＮ１１１およびＡＡ２００である。それゆえ、本発明は、上記に示される変異導入され、かつ／または形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主細胞または株であって、前記Ｅ．ｃｏｌｉ株が、Ｋ１２株である、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主細胞または株に特に関する。より好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５である。Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する後者の細菌は、好ましくはＢａｃｉｌｌｉ、好ましくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓなどのメンバーを有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉａｌｅｓ；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ；またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属などからのメンバーを有するＢａｃｉｌｌａｌｅｓに属する。Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する後者の細菌は、好ましくは、メンバーＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍもしくはＣ．ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓを有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科に属するか、またはメンバーＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓもしくはＳ．ｆｒａｄｉａｅを有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科に属する。後者の酵母は、好ましくは、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ門またはＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門またはＤｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ門またはＺｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ門に属する。後者の酵母は、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属またはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ属に属する。後者の真菌は、好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｍｕｃｏｒ属またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する。

本発明のさらなる態様に従って、アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、各々の細胞または発現系のコドン利用に適合される。

さらなる好ましい実施形態では、本発明の方法は、本発明のアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞または微生物の増殖のために培養培地を使用し、培養培地中のラクトース濃度は、５０～１５０ｇ／Ｌの範囲に及ぶ。そのような培養培地中のラクトース濃度は、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１０５ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１１５ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１３５ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１４５ｇ／Ｌまたは１５０ｇ／Ｌであり得る。

さらなる好ましい実施形態では、本発明の方法は、７０ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌの間の範囲の３－フコシルラクトースの最終濃度範囲を産生する。そのような３－ＦＬ濃度は、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１０５ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１１５ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１３５ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１４５ｇ／Ｌ、１４５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１５５ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１６５ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１７５ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１８５ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、１９５ｇ／Ｌまたは２００ｇ／Ｌである。培養培地中のより高いラクトース濃度は、産生法で得られるさらにより高い３－ＦＬ最終濃度を提供し得る。

さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、上記に説明される７０ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌの範囲に及ぶ３ＦＬの最終濃度をもたらし、ブロス中の３ＦＬ純度は、８０％またはそれよりも高い。本発明による３ＦＬ純度は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％である。

本明細書に記載の本発明の方法では、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドは、
ａ）保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）をコードするアミノ酸配列、
ｂ）保存された［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］ドメイン（配列番号３４）をコードするアミノ酸配列
を含み、
ｃ）加えて、ｂ）の前記ドメインがＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦ（配列番号３６）に等しい場合、保存されたモチーフ［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）が、Ｎ末端領域に存在し、
式中、Ｘが、任意の別個のアミノ酸であってもよく、
前記ポリペプチドのＣ末端が、前記ＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個未満またはそれに等しいアミノ酸を有する。

本発明の範囲内では、そのようなポリペプチドは、ラクトース結合α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有することが証明されており、好ましくは、現在公知のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素と比較して、より優れたラクトース変換効率を有する。

本発明の好ましい実施形態では、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有する前記ポリペプチドは、
ｉ）添付の配列表の配列番号６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２８、３０または３２のうちのいずれか１つ；
ｉｉ）配列番号２、２０または２２の全長アミノ酸配列との８７％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つの全長アミノ酸配列との８０％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｖ）配列番号２、２０または２２で示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも４５個のその連続アミノ酸を含む断片；
ｖ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも１０個のその連続アミノ酸を含み、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する断片
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

必要に応じて、前記ポリペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸伸長部によってさらに改変される。

本明細書で使用されるポリペプチドのアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２８、３０または３２から選択される配列であり得る。また、アミノ酸配列は、配列番号２、２０または２２のいずれか１つの全長アミノ酸配列との約８７％超の配列同一性、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり得る。また、アミノ酸配列は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のいずれか１つの全長アミノ酸配列との約８０％超の配列同一性、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり得る。

さらに、本発明の範囲内では、アミノ酸配列は、配列番号２、２０または２２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の断片であってもよく、前記断片は、少なくとも４５個のその連続アミノ酸を含むか；あるいは、アミノ酸配列は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の断片であってもよく、前記断片は、少なくとも１０個のその連続アミノ酸を含み、ラクトース結合α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する。

必要に応じて、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸伸長部によってさらに改変される、本明細書で説明されるα－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドが、本発明の範囲内にさらに含まれる。そのようなアミノ酸伸長部は、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端でのポリペプチド配列の付加として理解されるべきである。例えば、ポリペプチド配列は、追加の酵素活性を実現するためにアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドに融合され得る。そのようなアミノ酸伸長部は、特異的タグおよび／またはＨＱタグ；最高で２０個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸の延長であってもよく；また、そのような延長は、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０個またはそれよりも多いアミノ酸の長さであり得る。また、必要に応じたＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸伸長部は、精製のためのタグ、ポリペプチドの可溶性を増大させるためのタグ、メタボロン形成のためのタグまたはアミノ酸伸長部、タンパク質メタボロミクスのためのタグ、基質結合のためのタグ、遺伝子融合における同じまたは異なる機能を有する別のポリペプチド、例えば、非限定的に、ＧＤＰ－フコースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、二機能性フコースキナーゼ／フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼまたはフコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードするポリペプチドであってもよく、前記他のポリペプチドは、必要に応じて、ペプチドリンカーを介してアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドに融合される。例えば、本明細書で説明されるアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、必要に応じて、１つまたは複数の外因性親和性タグ、例えば、精製または基質結合タグ、例えば、６－Ｈｉｓタグ配列、ＧＳＴタグ、ＨＱタグ、ＨＡタグ配列、複数の６－Ｈｉｓタグ配列、複数のＧＳＴタグ、複数のＨＡタグ配列、ＳＮＡＰタグ、ＳＵＭＯｓｔａｒタグを含む。他の例は、タンパク質分解切断部位、保持部位、切断部位、ポリヒスチジンタグ、ビオチン、アビジン、ＢｉＴａｇ配列、Ｓタグ、エンテロキナーゼ部位、トロンビン部位、抗体もしくは抗体ドメイン、抗体断片、抗原、受容体、受容体ドメイン、受容体断片、リガンド、染料、アクセプター、クエンチャーまたはその組合せを含む。

加えて、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、機能的に同等のポリペプチドを表すタンパク質またはポリペプチドを含み得る。そのような同等のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、本明細書で説明されるα－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含有し得るが、それはサイレント変化をもたらし、したがって、機能的に同等のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼを産生する。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親和性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行われ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含み；平面状の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含み；正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンを含み；負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。本発明の文脈内では、「機能的に同等の」とは、本明細書で使用される場合、非限定的に、酵素活性を含むいくつかの基準のいずれかによって判断して、本発明のラクトース結合α－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドと実質的に同様のｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すことができるポリペプチドを指す。

翻訳中または翻訳後に差次的に改変されるアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、ポリペプチドおよび誘導体（断片を含む）が、本発明の範囲内に含まれる。さらに、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログは、アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチド配列への置換または付加として導入され得る。

α－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、当該技術分野で周知の技法を使用して組換えＤＮＡ技術によって産生されたポリヌクレオチドによる発現によって産生され得る。当業者に周知である方法を使用して、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼコード配列ならびに適切な転写および／または翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えを含む。例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New YorkまたはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989 and yearly updates)で説明されている技法を参照されたい。あるいは、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、直接合成によって、天然に、または細胞非含有系および／もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ系内でポリペプチドを産生する細胞の抽出によって産生され得る。

３－フコシルラクトースを産生するために使用されるラクトースに結合する能力を有し、好ましくはそのような３ＦＬを８０％またはそれよりも高い純度で産生する、新たに識別されたアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼの適合性は、非常に驚くべきものであり、したがって、それらの使用は、３－フコシルラクトースを容易に、効率的に、コスト効果的に産生する優れたツールである。

α－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の技法を使用して組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。当業者に周知である方法を使用して、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼコード配列ならびに適切な転写および／または翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えを含む。例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New YorkまたはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989 and yearly updates)で説明されている技法を参照されたい。

本発明の別の態様に従って、本明細書で説明されるアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターが提供され、ポリヌクレオチドは、ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結されている。特に好ましい実施形態では、ベクターは、発現ベクターであり、本発明の別の態様に従って、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、リポソームまたはウイルスの形態で存在し得る。

したがって、本発明に従うポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞を安定に形質転換する／宿主細胞に安定にトランスフェクトされるベクターに含まれ得る。ベクターでは、本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターの制御下にある。プロモーターは、例えば、誘導性プロモーターであってもよく、そのため、遺伝子／ポリヌクレオチドの発現は、特にターゲティングされてもよく、所望の場合、遺伝子は、そのような方法で過剰発現され得る。また、プロモーターは、構成的プロモーターであってもよい。

多様な発現系を使用して、本発明のポリペプチドを産生することができる。そのようなベクターは、中でも、染色体、エピソームおよびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス由来のベクター、およびその組合せ由来のベクター、例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント、例えば、コスミドおよびファージミド由来のベクターを含む。これらのベクターは、選択マーカー、例えば、非限定的に、抗生物質マーカー、栄養要求性マーカー、毒素－抗毒素マーカー、ＲＮＡセンス／アンチセンスマーカーを含有し得る。発現系構築物は、発現を調節および発生させる制御領域を含有し得る。一般的に、ポリヌクレオチドを維持、伝播もしくは発現させるためおよび／または宿主においてポリペプチドを発現させるために好適な任意の系またはベクターは、この点で発現のために使用され得る。適切なＤＮＡ配列は、例えば、Sambrook et al.（上記を参照されたい）で示される技法などの様々な周知で慣例の技法のいずれかによって発現系に挿入され得る。

組換え産生のために、宿主細胞は、発現系もしくはその部分または本発明のポリヌクレオチドを組み込むように遺伝子操作され得る。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、多くの標準の研究室マニュアル、例えば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)およびSambrook et al., 1989（上記）で説明されている方法によってもたらされ得る。

本発明の別の態様に従って、上記に説明されるベクターを含有する宿主細胞が、提供される。

さらなる態様に従って、本発明は、α－１，３－フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞であって、３－フコシルラクトース合成のための酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドの発現を含む宿主細胞を提供する。前記ポリペプチドは、本明細書で説明される通りである。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、現在、外因性ポリヌクレオチド配列によって形質転換もしくはトランスフェクトされたか、または形質転換もしくはトランスフェクト可能であり、したがって、前記宿主細胞に天然に存在しない少なくとも１つの配列を含有する細胞として定義される。

様々な宿主－発現ベクター系を利用して、本発明のアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリヌクレオチドを発現することができる。そのような宿主－発現系は、目的のコード配列が産生され、次に精製され得る媒体を表すが、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合、その場での本発明のアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物を示す細胞も表す。

本発明の別の態様に従って、３－フコシルラクトースの産生のための宿主細胞が提供され、宿主細胞は、本明細書で説明されるラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる配列を含有し、配列は、宿主細胞にとって外来性の配列であり、配列は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。ポリヌクレオチドは、宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結される。

本発明の代替の態様に従って、３－フコシルラクトースの産生のための宿主細胞が提供され、宿主細胞は、本明細書で説明される前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含有し、ポリヌクレオチドは、ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結される。

さらなる態様では、また、本発明は、α－１，３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、ａ）本明細書で説明される細胞を提供するステップと、ｂ）細胞を、培地中でα－１，３－フコシルトランスフェラーゼの産生を許容する条件下で培養するステップとを含む方法を提供する。

好ましくは、前記α－１，３－フコシルトランスフェラーゼは、本明細書で説明される培養から分離される。好ましくは、また、精製は、本明細書で説明される通りに行われ得る。

別のさらなる態様では、本発明は、３－フコシルラクトースの産生ための、本明細書で説明される細胞の使用を提供する。

本発明のさらなる態様に従って、本明細書で説明され、好ましくは本明細書で説明されるポリヌクレオチドによってコードされるアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼを発現する微生物が提供される。

本明細書で使用される微生物または生物または細胞または宿主細胞という用語は、細菌、酵母もしくは真菌を含むリストから選択される微生物を指すか、または植物もしくは動物細胞を指す。後者の細菌は、好ましくは、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門またはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門またはＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門またはＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ門に属する。Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する後者の細菌は、好ましくはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科に、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種に属する。後者の細菌は、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種に属する任意の株、例えば、非限定的に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに関する。より具体的には、後者の用語は、研究室環境に十分に適合され、野生型株とは異なり、腸内で繁栄する能力を失っている、培養されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株と命名される）に関する。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株の周知の例は、Ｋ１２野生型、Ｗ３１１０、ＭＧ１６５５、Ｍ１８２、ＭＣ１０００、ＭＣ１０６０、ＭＣ１０６１、ＭＣ４１００、ＪＭ１０１、ＮＺＮ１１１およびＡＡ２００である。それゆえ、本発明は、上記に示される変異導入され、かつ／または形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主細胞または株であって、前記Ｅ．ｃｏｌｉ株が、Ｋ１２株である、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主細胞または株に特に関する。より好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５である。Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する後者の細菌は、好ましくはＢａｃｉｌｌｉ、好ましくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓなどのメンバーを有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉａｌｅｓ；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ；またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属などからのメンバーを有するＢａｃｉｌｌａｌｅｓに属する。Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する後者の細菌は、好ましくは、メンバーＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍもしくはＣ．ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓを有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科に属するか、またはメンバーＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓもしくはＳ．ｆｒａｄｉａｅを有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科に属する。後者の酵母は、好ましくは、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ門またはＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門またはＤｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ門またはＺｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ門に属する。後者の酵母は、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属またはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ属に属する。後者の真菌は、好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｍｕｃｏｒ属またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する。

本発明の別の態様に従って、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、各々の宿主細胞のコドン利用に適合される。

本発明のさらなる態様は、アルファ－１，３－フコシルラクトースの産生のための、本明細書で説明されるポリペプチドの使用を提供する。本発明のさらなる態様は、アルファ－１，３－フコシルラクトースの産生のための、本明細書で説明されるポリヌクレオチドの、または本明細書で説明されるベクターの使用を提供する。

１つの他の実施形態に従って、今まで未知のラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼが提供される。本発明は、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する単離および／または合成されたポリペプチドであって、
保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）および保存された［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］ドメイン（配列番号３４）をコードするアミノ酸配列を含み、加えて、このドメインがＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦ（配列番号３６）に等しい場合、保存されたモチーフ［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）が、Ｎ末端領域に存在し、式中、Ｘが、任意の別個のアミノ酸であってもよく、前記アミノ酸配列のＣ末端が、ＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個未満またはそれに等しいアミノ酸を有する、単離および／または合成されたポリペプチドを提供する。

好ましくは、前記ポリペプチドは、
ｉ）添付の配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２８、３０または３２；
ｉｉ）配列番号２、２０または２２の全長との８７％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のいずれか１つの全長アミノ酸配列との少なくとも８０％の配列同一性を含むアミノ酸配列；
ｉｖ）配列番号２、２０または２２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも４５個のその連続アミノ酸を含む断片；
ｖ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも１０個のその連続アミノ酸を含む断片
からなる群から選択される。

必要に応じて、前記ポリペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸伸長部によってさらに改変される。

本発明の範囲内では、単離および／または合成されたポリペプチドは、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する。そのようなポリペプチドは、保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）および保存された［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］ドメイン（配列番号３４）をコードするアミノ酸配列を含み、加えて、このドメインがＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦ（配列番号３６）に等しい場合、保存されたモチーフ［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）は、Ｎ末端領域に存在し、式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であってもよく、前記アミノ酸配列のＣ末端は、上記に定義される保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個未満またはそれに等しいアミノ酸、例えば、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０個のアミノ酸を有する。

必要に応じて、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸伸長部によってさらに改変される、本明細書で説明されるアルファ１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドが、本発明の範囲にさらに含まれる。

新たに識別されたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼは、驚くべきことに、天然に存在しない反応を行うために使用可能であることが分かった。さらに、上記に識別されるアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼは、現在公知のアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素と同様の、またはそれよりも高いラクトース結合特性で、ラクトースを基質として使用することができ、３－フコシルラクトースを産生することができることが分かった。

今日までに、本発明の新たに識別されたフコシルトランスフェラーゼは、表１で見ることができるように、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有することが示されなかった。

表２で示されるように、また、３－フコシルラクトースを産生するために使用されるラクトースに結合する能力を有する新たに識別されたα－１，３－フコシルトランスフェラーゼは、全て、保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）を含むアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列のＣ末端が、ＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個未満またはそれに等しいアミノ酸を有する、同じ特別な特色を共有することが分かった。このことは、例えば、上記に定義されるＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個のアミノ酸よりも長いＣ末端を有する、ＷＯ２０１２／０４９０８３で説明される公知のラクトース結合３－フコシルトランスフェラーゼとは対照的である。

さらに、また、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のポリペプチド配列は、ドメインが囲みで示される図１で示されるように、ドメインＰＥＮＸＸＸＸＸＸＸＴＥＫ（配列番号３７）（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）を共有することが分かった。全ての整列はＭＡＦＦＴ ｖ７．３０７によって行われ、可視化はＪａｌｖｉｅｗ ２．１０によって行われた。

さらに、また、保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）に加えて、新たに識別されたポリペプチドは、全て、ドメインが囲みで示される図１１で示されるように、共通の保存されたモチーフ［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］（配列番号３４）（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）、およびラクトース結合に重要な保存されたアミノ酸領域［ＦＷ］Ｗを共有することが分かった。

加えて、私たちは、この共通の特色がＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦ（配列番号３６）である場合、ドメインが囲みで示される図１２の整列において示されるように、酵素がアクセプター基質としてのラクトースに対してα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するために、さらに、保存された［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）モチーフ（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）が、タンパク質のＮ末端ドメインにおいて必要とされることに気づいた。実施例１４で例示されるように、配列番号２、配列番号４、配列番号２０および配列番号２２を有するポリペプチドは、両方のコンセンサスモチーフを含有し、アクセプター基質としてのラクトースに対してアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するように見え、一方で、配列番号２４および配列番号２６を有するポリペプチドは、Ｎ末端［ＮＨ］ＸＤＰＡＸＬＤモチーフ（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）（配列番号３５）を含有せず、この活性を示す。

さらに、また、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２のポリペプチド配列は、ドメインが囲みで示される図１３の整列で示されるように、ドメインＫ［ＩＶ］Ｆ［ＦＬ］ＸＧＥＮ（配列番号４１）およびＲＦＰＬＷ（配列番号４２）（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）を共有することが分かった。

第２の実施形態では、また、本発明は、上記に説明されるラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離および／または合成されたポリヌクレオチドに関する。

本発明の範囲内では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２８、３０、３２で示されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドの対立遺伝子バリアントであり得る。

したがって、また、本発明は、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ａ）添付の配列表の配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１９、２１、２７、２９、３１；ｂ）配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１９、２１、２７、２９、３１に相補的な核酸配列；ｃ）配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１９、２１、２７、２９、３１との８０％またはそれよりも高い配列同一性を有する核酸配列からなる群から選択される配列を含む、単離および／または合成されたポリヌクレオチドに関する。

したがって、また、本発明は、本発明による方法によって得た３－フコシルラクトース、および３－フコシルラクトースの産生のための上記に説明されるポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、微生物またはポリペプチドの使用に関する。アルファ－１，３－フコシルラクトースは、食品添加物、プレバイオティクス、シンバイオティクスとして、乳児食、成人食もしくは飼料の栄養補助のため、または治療的に、もしくは医薬として活性な化合物として使用することができる。新規の方法により、アルファ－１，３－フコシルラクトースは、複雑で、時間およびコストのかかる合成プロセスを必要とすることなく、容易かつ有効に提供され得る。

別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、一般的に、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用される命名法、ならびに上記および以下に説明される細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学における研究室手技は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されている手技である。核酸およびペプチド合成に、標準技法が使用される。一般的に、酵素反応および精製ステップは、製造業者の仕様書に従って行われる。

さらなる利点は、特定の実施形態、実施例および添付の図面に従う。

上記に挙げられる特色および以下にさらに説明される特色は、それぞれ識別された組合せだけでなく、本発明の範囲から逸脱することなく他の組合せまたはそれら単独でも使用することができることは言うまでもない。

本発明は、以下の特定の実施形態に関する：
実施形態１． α－１，３－フコシルラクトースを産生するための方法であって、
ａ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドを提供するステップであって、前記ポリペプチドが、
ｉ）保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）をコードするアミノ酸配列、
ｉｉ）保存された［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］ドメイン（配列番号３４）をコードするアミノ酸配列
を含み、
ｉｉｉ）加えて、ｉｉ）の前記ドメインがＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦ（配列番号３６）に等しい場合、保存されたモチーフ［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）が、Ｎ末端領域に存在し、
式中、Ｘが、任意の別個のアミノ酸であってもよく、
前記ポリペプチドのＣ末端が、前記ＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個未満またはそれに等しいアミノ酸を有する、ステップと、
ｂ）ステップａ）のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを、ＧＤＰ－フコースをドナー基質として、およびラクトースをアクセプター基質として含む混合物と、前記ポリペプチドが、フコース残基の、前記ドナー基質から前記アクセプター基質への移行を触媒する条件下で接触させ、
それによって、α－１，３－フコシルラクトースを産生するステップと、
ｃ）必要に応じて、前記α－１，３－フコシルラクトースを分離するステップと
を含む方法。
実施形態２． 前記ポリペプチドが、細胞非含有系で提供される、実施形態１に記載の方法。
実施形態３． 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞によって産生される、実施形態１に記載の方法。
実施形態４． 前記ＧＤＰ－フコースおよび／またはラクトースが、前記ＧＤＰ－フコースおよび／またはラクトースを産生する細胞によって提供される、実施形態１または３に記載の方法。
実施形態５． ｉ）α－１，３－フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された細胞を提供するステップであって、前記細胞が、α－１，３－フコシルラクトース合成のための酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
前記細胞が、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有する前記ポリペプチドの発現を含む、ステップと、
ｉｉ）前記細胞を、培地中でα－１，３－フコシルラクトースの産生を許容する条件下で培養するステップと、
ｉｉｉ）好ましくは、前記α－１，３－フコシルラクトースを培養から分離するステップと
を含む、実施形態１、３または４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６． ａ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有する前記ポリペプチドを発現する宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）前記宿主細胞を、α－１，３－フコシルラクトースの産生を許容し、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドの発現を許容する好適な栄養条件下で、増殖させるステップと、
ｃ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドがフコース残基の、ドナー基質ＧＤＰ－フコースからアクセプター基質ラクトースへの移行を触媒するために、ＧＤＰ－フコースおよびラクトースをステップｂ）と同時に、またはそれに続いて提供し、それによって、α－１，３－フコシルラクトースを産生するステップと、
ｄ）必要に応じて、前記α－１，３－フコシルラクトースを前記宿主細胞またはその増殖培地から分離するステップと
を含む、実施形態３に記載の方法。
実施形態７． 前記宿主細胞が、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有する外因性ポリペプチドを発現するように形質転換またはトランスフェクトされる、実施形態５または６に記載の方法。
実施形態８． 前記ＧＤＰ－フコースおよび／またはラクトースが、前記宿主細胞で同時発現される酵素によって、または前記宿主細胞の代謝によって提供されることを特徴とする、実施形態３から７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態９． α－１，３－フコシルラクトースの精製をさらに含む、実施形態１から８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１０． 前記ポリペプチドが、
ｉ）添付の配列表の配列番号６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２８、３０または３２のうちのいずれか１つ；
ｉｉ）配列番号２、２０または２２の全長アミノ酸配列との８７％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つの全長アミノ酸配列との８０％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｖ）配列番号２、２０または２２で示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも４５個のその連続アミノ酸を含む断片；
ｖ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも１０個のその連続アミノ酸を含み、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する断片
からなる群から選択され、
必要に応じて、前記ポリペプチドが、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸伸長部によってさらに改変される、先行実施形態のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１１． 先行実施形態のいずれか一項に記載の３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、以下のステップ：
ｉ）培養培地に、開始リアクター体積につき少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも１５０グラムのラクトースを含むラクトース供給を、好ましくは連続様式で、好ましくは前記培養培地の最終体積が、前記ラクトース供給の添加前の前記培養培地の体積の３倍以下、好ましくは２倍以下、より好ましくは２倍未満であるように、添加するステップ；
ｉｉ）ラクトース供給を、連続様式で前記培養培地に１日、２日、３日、４日、５日の期間にわたり供給溶液の手段によって添加するステップ；
ｉｉｉ）ラクトース供給を、連続様式で前記培養培地に１日、２日、３日、４日、５日の期間にわたり供給溶液の手段によって添加するステップであって、前記ラクトース供給の溶液の濃度が、５０ｇ／Ｌ、好ましくは７５ｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは２００ｇ／Ｌ、より好ましくは２２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２７５ｇ／Ｌ、より好ましくは３００ｇ／Ｌ、より好ましくは３２５ｇ／Ｌ、より好ましくは３５０ｇ／Ｌ、より好ましくは３７５ｇ／Ｌ、より好ましくは４００ｇ／Ｌ、より好ましくは４５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは６００ｇ／Ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３～７の間に設定され、好ましくは前記供給溶液の温度が、２０℃～８０℃の間で維持される、ステップ
のうちの少なくとも１つをさらに含み、
ｉｖ）前記方法が、前記培養培地の最終体積中の少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／Ｌの３－フコシルラクトース濃度をもたらす、方法。
実施形態１２． α－１，３－フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞であって、α－１，３－フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドの発現を含み、前記ポリペプチドが、
ｉ）保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）をコードするアミノ酸配列、
ｉｉ）保存された［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］ドメイン（配列番号３４）をコードするアミノ酸配列
を含み、
ｉｉｉ）加えて、ｉｉ）の前記ドメインがＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦ（配列番号３６）に等しい場合、保存されたモチーフ［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）が、Ｎ末端領域に存在し、
式中、Ｘが、任意の別個のアミノ酸であってもよく、
前記ポリペプチドのＣ末端が、前記ＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個未満またはそれに等しいアミノ酸を有する、宿主細胞。
実施形態１３． ｉ）ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む配列であって、前記宿主細胞にとって外来性の配列であり、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれる配列を含むか、またはｉｉ）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有し、前記ポリヌクレオチドが、前記ベクターで形質転換される宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結されている、実施形態１２に記載の細胞。
実施形態１４． 前記ポリペプチドが、
ｉ）添付の配列表の配列番号６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２８、３０または３２のうちのいずれか１つ；
ｉｉ）配列番号２、２０または２２の全長アミノ酸配列との８７％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つの全長アミノ酸配列との８０％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｖ）配列番号２、２０または２２で示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも４５個のその連続アミノ酸を含む断片；
ｖ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも１０個のその連続アミノ酸を含み、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する断片
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
必要に応じて、前記ポリペプチドが、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸伸長部によってさらに改変される、実施形態１２または１３に記載の細胞。
実施形態１５． 前記細胞が、微生物、植物または動物細胞からなる群から選択され、好ましくは前記微生物が、細菌、真菌または酵母であり、好ましくは前記植物が、イネ、ワタ、ナタネ、ダイズ、トウモロコシまたはコーン植物であり、好ましくは前記動物が、昆虫、魚類、鳥類または非ヒト哺乳動物であり；好ましくは前記細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である、実施形態３から１１のいずれか一項に記載の方法、または実施形態１２、１３もしくは１４のいずれか一項に記載の細胞。
実施形態１６． 細菌の、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の、より好ましくはＫ１２株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の細胞であり、さらにより好ましくは前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５であることを特徴とする、実施形態１２から１５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
実施形態１７． 酵母細胞であることを特徴とする、実施形態１２から１５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
実施形態１８． ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ（alpha-1,2-fucosyltransferase）活性を有する前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、各々の宿主細胞のコドン利用に適合される、実施形態１２から１７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
実施形態１９． α－１，３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、
ａ）実施形態１２から１８のいずれか一項に記載の細胞を提供するステップと、
ｂ）前記細胞を、培地中でα－１，３－フコシルトランスフェラーゼの産生を許容する条件下で培養するステップと、
ｃ）好ましくは、前記α－１，３－フコシルトランスフェラーゼを培養から分離するステップと
を含む方法。
実施形態２０． α－１，３－フコシルラクトースの産生のための、実施形態１２から１８のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用。
実施形態２１． α－１，３－フコシルラクトースの産生のための、実施形態１または１１に記載の方法で説明されるポリペプチドの使用。
実施形態２２． ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドを異種性に発現する微生物であって、前記ポリペプチドが、
ｉ）保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）をコードするアミノ酸配列、
ｉｉ）保存された［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］ドメイン（配列番号３４）をコードするアミノ酸配列
を含み、
ｉｉｉ）加えて、ｉｉ）の前記ドメインがＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦ（配列番号３６）に等しい場合、保存されたモチーフ［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）が、Ｎ末端領域に存在し、
式中、Ｘが、任意の別個のアミノ酸であってもよく、
前記ポリペプチドのＣ末端が、前記ＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個未満またはそれに等しいアミノ酸を有する、微生物。
実施形態２３． 前記ポリペプチドが、
ｉ）添付の配列表の配列番号６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２８、３０または３２のうちのいずれか１つ；
ｉｉ）配列番号２、２０または２２の全長アミノ酸配列との８７％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つの全長アミノ酸配列との８０％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｖ）配列番号２、２０または２２で示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも４５個のその連続アミノ酸を含む断片；
ｖ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも１０個のその連続アミノ酸を含み、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する断片
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
必要に応じて、前記ポリペプチドが、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸伸長部によってさらに改変される、実施形態２２に記載の微生物。
実施形態２４． アルファ－１，３－フコシルラクトースの産生のための、実施形態２２または２３に記載の微生物の使用。
実施形態２５． 前記アルファ－１，３－フコシルラクトースを前記宿主細胞またはその増殖培地から分離するステップをさらに含む、実施形態１から１１、１５または１９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２６． 前記分離が、以下のステップ：浄化、限外濾過、ナノ濾過、逆浸透法、精密濾過、活性炭もしくは炭素処理、接線流高性能濾過、接線流限外濾過、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／またはゲル濾過、リガンド交換クロマトグラフィーのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１から１１、１５、１９または２５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２７． アルファ－１，３－フコシルラクトースの精製をさらに含む、実施形態１から１１、１５、１９、２５または２６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２８． 前記アルファ－１，３－フコシルラクトースの前記精製が、以下のステップ：活性炭または炭素の使用、炭の使用、ナノ濾過、限外濾過またはイオン交換、アルコールの使用、水性アルコール混合物の使用、結晶化、蒸発、沈殿、乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥のうちの少なくとも１つを含む、実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９． 前記ポリペプチドが、真菌、酵母、細菌、昆虫、動物および植物発現系で産生される、実施形態１から１１、１５、１９、２５から２８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３０． 前記宿主細胞が、細菌の、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の、より好ましくはＫ１２株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の細胞であり、さらにより好ましくは前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５である、実施形態２９に記載の方法。
実施形態３１． 前記宿主細胞が、酵母細胞である、実施形態２９に記載の方法。
実施形態３２． 前記培養培地中のラクトース濃度が、５０～１５０ｇ／Ｌの範囲に及ぶ、実施形態１から１１、１５、１９、２５から３１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３３． ３－フコシルラクトースの最終濃度が、７０ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌの範囲に及ぶ、実施形態１から１１、１５、１９、２５から３２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３４． 前記産生が、発酵の終わりに、１：５未満のラクトース濃度の３－フコシルラクトース濃度に対する比をもたらす、実施形態１から１１、１５、１９、２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３５． 前記産生が、発酵の終わりに、８０％またはそれよりも高い３－フコシルラクトース純度をもたらす、実施形態１から１１、１５、１９、２５から３４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３６． α－１，３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、
ａ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドを提供するステップと、
ｂ）ステップａ）のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを、ＧＤＰ－フコースをドナー基質として、およびラクトースをアクセプター基質として含む混合物と、前記ポリペプチドが、フコース残基の、前記ドナー基質から前記アクセプター基質への移行を触媒する条件下で接触させ、
それによって、α－１，３－フコシルラクトースを産生するステップであって、
ｃ）触媒が、発酵の終わりに、１：５未満のラクトース濃度の３－フコシルラクトース濃度に対する比をもたらす、ステップと、
ｄ）必要に応じて、前記α－１，３－フコシルラクトースを分離するステップと
を含む方法。
実施形態３７． α－１，３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、
ａ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドを提供するステップと、
ｂ）ステップａ）のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを、ＧＤＰ－フコースをドナー基質として、およびラクトースをアクセプター基質として含む混合物と、前記ポリペプチドが、フコース残基の、前記ドナー基質から前記アクセプター基質への移行を触媒する条件下で接触させ、
それによって、α－１，３－フコシルラクトースを産生するステップであって、
ｃ）触媒が、発酵の終わりに、８０％またはそれよりも高い３－フコシルラクトース純度をもたらす、ステップと、
ｄ）必要に応じて、前記α－１，３－フコシルラクトースを分離するステップと
を含む方法。
実施形態３８． ３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、以下：
ｉ）培養培地に、開始リアクター体積につき少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも１５０グラムのラクトースを含むラクトース供給を、好ましくは連続様式で、好ましくは前記培養培地の最終体積が、前記ラクトース供給の添加前の前記培養培地の体積の３倍以下、好ましくは２倍以下、より好ましくは２倍未満であるように、添加するステップ；
ｉｉ）ラクトース供給を、連続様式で前記培養培地に１日、２日、３日、４日、５日の期間にわたり供給溶液の手段によって添加するステップ；
ｉｉｉ）ラクトース供給を、連続様式で前記培養培地に１日、２日、３日、４日、５日の期間にわたり供給溶液の手段によって添加するステップであって、ラクトース供給溶液の濃度が、５０ｇ／Ｌ、好ましくは７５ｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは２００ｇ／Ｌ、より好ましくは２２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２７５ｇ／Ｌ、より好ましくは３００ｇ／Ｌ、より好ましくは３２５ｇ／Ｌ、より好ましくは３５０ｇ／Ｌ、より好ましくは３７５ｇ／Ｌ、より好ましくは４００ｇ／Ｌ、より好ましくは４５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは６００ｇ／Ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３～７の間に設定され、好ましくは前記供給溶液の温度が、２０℃～８０℃の間で維持される、ステップ
のうちの少なくとも１つを含み、
前記方法が、前記培養培地の最終体積中の少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／Ｌの３－フコシルラクトース濃度、および好ましくは培養液の最終体積中の１：５未満、より好ましくは１：１０、さらにより好ましくは１：２０、最も好ましくは１：４０のラクトース濃度の３ＦＬ濃度に対する比をもたらす、方法。
実施形態３９． ３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、以下：
ｉ）培養培地に、開始リアクター体積につき少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも１５０グラムのラクトースを含むラクトース供給を、好ましくは連続様式で、好ましくは前記培養培地の最終体積が、前記ラクトース供給の添加前の前記培養培地の体積の３倍以下、好ましくは２倍以下、より好ましくは２倍未満であるように、添加するステップ；
ｉｉ）ラクトース供給を、連続様式で前記培養培地に１日、２日、３日、４日、５日の期間にわたり供給溶液の手段によって添加するステップ；
ｉｉｉ）ラクトース供給を、連続様式で前記培養培地に１日、２日、３日、４日、５日の期間にわたり供給溶液の手段によって添加するステップであって、ラクトース供給溶液の濃度が、５０ｇ／Ｌ、好ましくは７５ｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは２００ｇ／Ｌ、より好ましくは２２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２７５ｇ／Ｌ、より好ましくは３００ｇ／Ｌ、より好ましくは３２５ｇ／Ｌ、より好ましくは３５０ｇ／Ｌ、より好ましくは３７５ｇ／Ｌ、より好ましくは４００ｇ／Ｌ、より好ましくは４５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは６００ｇ／Ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３～７の間に設定され、好ましくは前記供給溶液の温度が、２０℃～８０℃の間で維持される、ステップ
のうちの少なくとも１つを含み、
前記方法が、前記培養培地の最終体積中の少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／Ｌの３－フコシルラクトース濃度、および好ましくは培養液の最終体積中の８０％またはそれよりも高い３ＦＬ純度をもたらす、方法。

以下の図面および実施例は、本発明のさらなる例示および説明として働き、限定することは意図されない。

図１は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のポリペプチド配列の整列を示す。

図２は、増殖実験における３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。

図３は、培地中の少ない量から多くの量のラクトースでの増殖実験における３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。

図４は、培地中の少ない量のラクトースでの増殖実験における３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。

図５は、識別されたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼのうちの１つの、３－ＦＬに変換されるラクトースのパーセンテージを示す。

図６は、様々なプロモーターによって駆動された、様々な識別されたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼの、３－ＦＬに変換されるラクトースのパーセンテージを示す。

図７は、さらなる実験の３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。

図８は、様々なプロモーターによって駆動された、１サブセットの識別されたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼの、３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。

図９は、２つの異なるプロモーターからＨ．ｐｙｌｏｒｉ ｆｕｃＴ（配列番号１８）を発現する株の３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。

図１０は、ＤＭ［ＡＳ］ＶＳＦコンセンサスモチーフを有するポリペプチドを発現する株の３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。

図１１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２のポリペプチド配列の整列を示す。コンセンサスモチーフ［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］、［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］および［ＦＷ］Ｗ（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）を、囲みで示す。 図１１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２のポリペプチド配列の整列を示す。コンセンサスモチーフ［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］、［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］および［ＦＷ］Ｗ（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）を、囲みで示す。 図１１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２のポリペプチド配列の整列を示す。コンセンサスモチーフ［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］、［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］および［ＦＷ］Ｗ（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）を、囲みで示す。

図１２は、配列番号２、配列番号４、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６のポリペプチド配列の整列を示す。コンセンサスモチーフＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦおよび［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）（および非関連モチーフ）を、囲みで示す。

図１３は、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２のポリペプチド配列の整列を示す。コンセンサスモチーフＫ［Ｉ／Ｖ］Ｆ［Ｆ／Ｌ］ＸＧＥＮ（配列番号４１）およびＲＦＰＬＷ（配列番号４２）（式中、Ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）を、囲みで示す。

（実施例１）
材料および方法Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
培地
ルリアブロス（ＬＢ：Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）培地は、１％トリプトンペプトン（Ｄｉｆｃｏ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）および０．５％塩化ナトリウム（ＶＷＲ．Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から構成された。振盪フラスコ実験用培地は、２．００ｇ／Ｌ ＮＨ_４Ｃｌ、５．００ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）２ＳＯ_４、２．９９３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、７．３１５ｇ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４、８．３７２ｇ／Ｌ ＭＯＰＳ、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１４．２６ｇ／Ｌスクロースまたは実施例で特定される場合、別の炭素源、１ｍｌ／Ｌビタミン溶液、１００μｌ／Ｌモリブデート溶液および１ｍＬ／Ｌセレニウム溶液を含有した。培地は、１Ｍ ＫＯＨにより７のｐＨに設定された。ビタミン溶液は、３．６ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ_２．４Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、１．３ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、０．３８ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ、０．９４ｇ／Ｌ ＺｎＣｌ_２、０．０３１１ｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_４、０．４ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＥＤＴＡ．２Ｈ_２Ｏおよび１．０１ｇ／ＬチアミンＨＣｌから構成された。モリブデート溶液は、０．９６７ｇ／Ｌ ＮａＭｏＯ_４．２Ｈ_２Ｏを含有した。セレニウム溶液は、４２ｇ／Ｌ ＳｅＯ_２を含有した。

発酵のための最少培地は、６．７５ｇ／Ｌ ＮＨ_４Ｃｌ、１．２５ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２．９３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４および７．３１ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１４．２６ｇ／Ｌスクロース、上記に説明されるのと同じ組成の１ｍＬ／Ｌビタミン溶液、１００μＬ／Ｌモリブデート溶液および１ｍＬ／Ｌセレニウム溶液を含有した。

複合培地はオートクレーブ（１２１℃、２１分）によって、最少培地は濾過（０．２２μｍ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）によって滅菌した。必要な場合、培地を、抗生物質（例えば、クロラムフェニコール（２０ｍｇ／Ｌ）、カルベニシリン（１００ｍｇ／Ｌ）、スペクチノマイシン（４０ｍｇ／Ｌ）および／またはカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ））を添加することによって選択的にした。

プラスミド
ｐＫＤ４６（Ｒｅｄヘルパープラスミド、アンピシリン耐性）、ｐＫＤ３（ＦＲＴ隣接クロラムフェニコール耐性（ｃａｔ）遺伝子を含有する）、ｐＫＤ４（ＦＲＴ隣接カナマイシン耐性（ｋａｎ）遺伝子を含有する）およびｐＣＰ２０（ＦＬＰリコンビナーゼ活性を発現する）プラスミドは、Ｒ．Ｃｕｎｉｎ教授（Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ、２００７年）から譲渡された。

アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ発現のためのプラスミドを、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ ａｓｓｅｍｂｌｙを使用してｐＭＢ１ ｏｒｉベクターにおいて構築した。遺伝子を、プロモーターａｐＦＡＢ３０５（「ＰＲＯＭ００１２」）、ａｐＦＡＢ１４６（「ＰＲＯＭ００３２」）（両方ともMutalik et al.(Nat. Methods 2013, No. 10, 354-360)によって説明されている）およびｐ１４（「ＵＴＲ００１９」と組み合わせた「ＰＲＯＭ００１６」）（De Mey et al. (BMC Biotechnology 2007)によって説明されている）およびＵＴＲｓ Ｇｅｎｅ１０－ＬｅｕＡＢ－ＢＣＤ２（「ＵＴＲ０００２」）（Mutalik et al. (Nat. Methods 2013, No. 10, 354-360)によって説明されている）を使用して発現した。

プラスミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５アルファ（Ｆ^－、ｐｈｉ８０ｄｌａｃＺデルタＭ１５、デルタ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ^－、ｍｋ^＋）、ｐｈｏＡ、ｓｕｐＥ４４、ｌａｍｂｄａ^－、ｔｈｉ－１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１）で維持した。

株および突然変異
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５［ｌａｍｂｄａ^－、Ｆ^－、ｒｐｈ－１］を、２００７年３月にＣｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＳ）、ＣＧＳＣ株番号７７４０から取得した。Datsenko and Wanner (PNAS 97 (2000), 6640-6645)によって公開された技法を使用して、遺伝子破壊および遺伝子導入を行った。この技法は、ラムダＲｅｄリコンビナーゼによって行われる相同組換え後の抗生物質選択に基づく。次のフリッパーゼリコンビナーゼの触媒により、最終産生株における抗生物質選択カセットは確実に除去される。

ＲｅｄヘルパープラスミドｐＫＤ４６を有する形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）およびＬ－アラビノース（１０ｍＭ）を含む１０ｍｌのＬＢ培地中で３０℃にて０．６のＯＤ６００ｎｍまで増殖させた。細胞を、それらを最初に５０ｍｌの氷冷水で、次に１ｍｌの氷冷水で洗浄することによってエレクトロコンピテントにした。その後、細胞を５０μｌの氷冷水に再懸濁した。５０μｌの細胞および１０～１００ｎｇの直鎖状二本鎖ＤＮＡ生成物で、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（商標）（ＢｉｏＲａｄ）（６００Ω、２５μＦＤおよび２５０ボルト）を使用することによって電気穿孔を行った。

電気穿孔後、細胞を、１ｍｌのＬＢ培地に添加し、３７℃で１時間インキュベートし、最終的に２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールまたは５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天上に拡げて、抗生物質耐性形質転換体を選択した。選択した突然変異体を、改変された領域の上流および下流のプライマーによるＰＣＲによって検証し、ＬＢ寒天中で４２℃にてヘルパープラスミドの喪失のために増殖させた。突然変異体を、アンピシリン感受性について試験した。

直鎖状ｄｓ－ＤＮＡアンプリコンを、ｐＫＤ３、ｐＫＤ４およびそれらの誘導体を鋳型として使用するＰＣＲによって得た。使用したプライマーは、鋳型に相補的な配列の一部、および組換えが起こらなければならない染色体ＤＮＡ上の側に相補的な別の部分を有した。ゲノムノックアウトのために、目的の遺伝子の開始および停止コドンの５０ｎｔ上流および５０ｎｔ下流に、ホモロジー領域を設計した。ゲノムノックインのために、転写開始点（＋１）を、尊重しなければならなかった。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製し、ＤｐｎＩで消化し、アガロースゲルから再精製し、溶離緩衝剤（５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）中に懸濁した。

選択した突然変異体（クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性）を、温度感受性複製およびＦＬＰ合成の熱誘導を示すアンピシリンおよびクロラムフェニコール耐性プラスミドであるｐＣＰ２０プラスミドで形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を、３０℃で選択し、その後、数個をＬＢ中で４２℃にてコロニー精製し、その後、全ての抗生物質耐性の喪失およびＦＬＰヘルパープラスミドの喪失について試験した。遺伝子ノックアウトおよびノックインを、対照プライマー（Ｆｗ／Ｒｖ－ｇｅｎｅ－ｏｕｔ）でチェックする。

Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５に由来する突然変異株を、遺伝子ｌａｃＺ、ｌａｃＹ、ｌａｃＡ、ｇｌｇＣ、ａｇｐ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ、ｐｇｉ、ａｒｃＡ、ｉｃｌＲ、ｗｃａＪ、ｐｇｉ、ｌｏｎおよびｔｈｙＡをノックアウトすることによって作出した。加えて、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＹ遺伝子、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓに由来するフルクトースキナーゼ遺伝子（ｆｒｋ）、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓに由来するスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ：ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）を、ゲノムにノックインし、構成的に発現させた。構成的プロモーターは、De Mey et al. (BMC Biotechnology, 2007)によって説明されるプロモーターライブラリーに由来する。また、これらの遺伝子改変は、ＷＯ２０１６０７５２４３およびＷＯ２０１２００７４８１で説明されている。

仮定上のアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する全ての構築したプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５に由来するこの突然変異株において評価した。全ての株を、クライオバイアル中で－８０℃にて保存する（一晩、７０％グリセロールと１：１の比で混合したＬＢ培養液）。全ての成功したラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼのリスト（配列番号１～１６、１９～２２および２７～３２）ならびに先行技術のアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ（配列番号１７～１８）および２つの非機能的アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ（配列番号２３～２６）を、表３に示す。

異種および同種発現
プラスミド用でもゲノム挿入用でも、発現させる必要があった全ての潜在的なアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＵＳＡ）において合成的に合成した。発現は、コドン利用を発現宿主のコドン利用に最適化することによってさらに促進することができた。遺伝子を、サプライヤーのツールを使用して最適化した。

培養条件
９６ウェルマイクロタイタープレート実験の前培養を、クライオバイアルから１５０μＬのＬＢ中で開始し、８００ｒｐｍの軌道シェーカー上で３７℃にて一晩インキュベートした。この培養物を、４００倍希釈することによって、４００μＬ ＭＭｓｆ培地を有する９６ウェル正方形マイクロタイタープレートのための種菌として使用した。これらの最終的な９６ウェル培養プレートを、その後、８００ｒｐｍの軌道シェーカー上で３７℃にて７２時間またはそれよりも短い時間もしくはそれよりも長い時間インキュベートした。培養実験の終わりに、各ウェルから試料を取って、ブロス上清中の糖濃度（細胞外糖濃度、細胞をスピンダウンした後）または細胞をスピンダウンする前に培養ブロスを９０℃で１５分間沸騰させることによる糖濃度（＝全ブロス測定、細胞内外糖濃度の平均）を測定した。

バイオリアクターのための前培養を、ある特定の株の１ｍＬクライオバイアル全部から開始し、１Ｌまたは２．５Ｌの振盪フラスコ中の２５０ｍＬまたは５００ｍＬのＭＭｓｆ培地に接種し、２００ｒｐｍの軌道シェーカー上で３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、５Ｌのバイオリアクターに接種し（２Ｌの回分培地中に２５０ｍＬの種菌）；プロセスはＭＦＣＳ制御ソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって制御した。培養条件を３７℃および最大撹拌に設定し；圧力ガス流速は、株およびバイオリアクターに依存した。０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４および２０％ＮＨ４ＯＨを使用して、ｐＨを６．８に制御した。排ガスを冷却した。発酵中に発泡する場合、シリコーン消泡剤の１０％溶液を添加した。

光学密度
培養物の細胞密度を、６００ｎｍでの光学密度を測定することによって頻繁にモニターした（Ｉｍｐｌｅｎ Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＮＰ８０、Ｗｅｓｔｂｕｒｇ、ＢｅｌｇｉｕｍまたはＳｐａｒｋ １０Ｍマイクロプレートリーダー、Ｔｅｃａｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより）。

液体クロマトグラフィー
３－フコシルラクトースの標準物質を社内で合成した。非限定的に、ラクトース、スクロース、グルコース、フルクトースなどの他の標準物質は、Ｓｉｇｍａから購入した。

炭水化物をＨＰＬＣ－ＲＩ（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）法により分析し、それによって、ＲＩ（屈折率：Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ）は、試料を含有する場合の移動相の屈折率の変化を検出する。糖を、Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｘ－ｂｒｉｄｇｅ ＨＰＬＣカラム、ＵＳＡ）ならびに７５ｍｌアセトニトリルおよび２５ｍｌ超純水および０．１５ｍｌトリエチルアミンを含有する移動相を使用して無勾配流中で分離した。カラムサイズは４．６×１５０ｍｍであり、３．５μｍの粒径であった。カラムの温度を３５℃に設定し、ポンプ流速は１ｍＬ／分であった。

（実施例２）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに組み込んだ様々なラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素の評価
ＧＤＰ－フコースおよびラクトースから３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）を産生することができる潜在的なアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするいくつかの遺伝子を評価するために、実験を設定した。実施例１で提供される培養条件に従って増殖実験を行った。

図２は、産生培地中の２０ｇ／Ｌラクトースで、２つの異なるプロモーター（ＰＲＯＭ００１２およびＰＲＯＭ００１６）を使用して様々なラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼを首尾よく発現する株の増殖実験で得た３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。各データ点は、１つのウェルからのデータに対応する。水平な破線は、全てのデータ点が正規化された設定点を示す。

実験は、ラクトース結合３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する以下のポリペプチドを識別した：以前に確認されたラクトース結合α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号１８を含有する株と比較して、同様～より優れたラクトース結合α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４。配列番号４のポリペプチドは、配列番号２との９０．８％のグローバル配列同一性を有し、これによって、また、配列番号２と８７％またはそれよりも高い配列同一性を有する配列は、ラクトース結合α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有することを示す。

（実施例３）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに組み込んだラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素の、最少培地において低～高ラクトース濃度で３－ＦＬを産生するその能力についての評価
配列番号６をコードする（さらにＰＲＯＭ００１６と組み合わせた）遺伝子を、様々な濃度のラクトースで最少培地において３－ＦＬを産生するその能力について評価する。実施例１で提供される培養条件に従って、増殖実験を行った。配列番号６および配列番号１８（ＰＲＯＭ００１６によって駆動される）を有する株を、上記に説明されるように９６ウェルプレートの多数のウェルで増殖させた。配列番号１８は、以前に確認された、ラクトースに対するアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する。

図３は、６つの異なる濃度のラクトースを３－ＦＬのための前駆体とする、３－フコシルラクトースの正規化産生を示す（図で示されるように、９０ｇ／Ｌ、およびその２．８ｇ／Ｌまでの１：２希釈系列）。各データ点は、１つのウェルからのデータに対応する。水平な破線は、全てのデータ点が正規化された設定点を示す。

実験は、配列番号６のポリペプチドが、以前に確認されたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである配列番号１８を発現する株と比較して、全てのラクトース濃度でより優れたラクトース結合α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有することを確認した。

（実施例４）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに組み込んだ様々なラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素の、最少培地において低濃度のラクトースで３－ＦＬを産生するそれらの能力についての評価

配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１２および配列番号１４をコードする遺伝子を有する上記に識別された株のいくつかを、低濃度のラクトースでの増殖実験においてＧＤＰ－フコースおよびラクトースから３－フコシルラクトースを産生するそれらの能力について評価した。実施例１で提供される培養条件に従って、増殖実験を行った。

図４は、様々なアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼを発現する（２つの異なるプロモーターＰＲＯＭ００１２およびＰＲＯＭ００１６を使用して）、少ない量のラクトース（２．８ｇ／Ｌラクトース）を含む培地で増殖した株での３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。各データ点は、１つのウェルからのデータに対応する。水平な破線は、全てのデータ点が正規化された設定点を示す。

実験は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１２および配列番号１４を有する以下のポリペプチドが、以前に確認されたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号１８を含有する株と比較して、低濃度のラクトースを提供された場合、同様～より優れたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有することを確認した。

（実施例５）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに組み込んだ配列番号６のポリペプチドの、２つの低濃度のラクトースに対する酵素活性の評価
配列番号６をコードする（さらにＰＲＯＭ００１６と組み合わせた）遺伝子を、ＧＤＰ－フコースを産生する株で２．８ｇ／Ｌまたは５．６２ｇ／Ｌのラクトースおよび３０ｇ／Ｌのスクロースを提供する増殖実験においてラクトースを３－フコシルラクトースに変換するその能力について評価した。実施例１で提供される培養条件に従って、増殖実験を行った。

図５は、３－ＦＬの測定量を、ラクトースの投入濃度に基づいて理論的に得られ得る量で割ることによって計算された、３－ＦＬに変換されるラクトースの％を示す。理論的には、全てのラクトースが変換された場合、１００％の値が得られる。各データ点は、１つのウェルからのデータに対応する。

配列番号６で示されるポリペプチドを発現する株を、ラクトースに対するアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有することが以前に確認されている配列番号１８（ＰＲＯＭ００１６によって駆動される）で示されるポリペプチドを発現する株と比較する。両方のラクトース濃度で、配列番号６で示されるポリペプチドを発現する株は、所与の量の炭素源（３０ｇ／Ｌのスクロース）について、配列番号１８で示されるポリペプチドを発現する株よりもずっと多くのラクトースを３－ＦＬに変換することができる。

（実施例６）
限定的な濃度のラクトースおよびスクロースでの、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに組み込んだ様々なラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性の評価
上記に識別されたポリペプチド配列番号２、配列番号６、配列番号１２および配列番号１４をコードする遺伝子を、ＧＤＰ－フコースを産生する株で低濃度のラクトース（２ｇ／Ｌ）およびスクロース（７．５ｇ／Ｌ）での増殖実験においてラクトースを３－フコシルラクトースに変換するそれらの能力について評価した。実施例１で提供される培養条件に従って、増殖実験を行った。

図６は、３－ＦＬの測定量を、ラクトースの投入濃度に基づいて理論的に得られ得る量で割ることによって計算された、３－ＦＬに変換されるラクトースの％を示す。各データ点は、１つのウェルからのデータに対応する。

配列番号２、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４を有するポリペプチドを発現する株は、所与の量の炭素源（７．５ｇ／Ｌのスクロース）について、配列番号１８を有するポリペプチドを発現する株よりも多くのラクトースを３－ＦＬに変換することができる。

（実施例７）
回分発酵における様々なラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素を発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の評価
バイオリアクタースケールでの回分発酵を行って、配列番号２、配列番号６、配列番号１２および配列番号１４を有する様々なアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素を発現する、実施例１で説明される突然変異体Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株バックグラウンド由来の株を評価した。バイオリアクター稼働は、実施例１で説明されるように行った。これらの実験では、スクロースを炭素源として使用した。ラクトースを、３－ＦＬ形成のための前駆体として９０ｇ／Ｌで回分培地に添加した。

図７は、様々なラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼを首尾よく発現する株での、産生培地中のラクトースを前駆体とする回分発酵において得られた３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。各データ点は、１回の発酵稼働からのデータに対応する。水平な破線は、全てのデータ点が正規化された設定点を示す。

実験は、配列番号２、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４を有する、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する突然変異体Ｅ．ｃｏｌｉ株は、配列番号１８を有するポリペプチドを発現する株と比較して、より多くの量の３－ＦＬを産生することを示す。

（実施例８）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに組み込んだ様々なラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素の評価
配列番号２、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６を有する酵素を発現する株で、さらなる実験を設定し、これらがＧＤＰ－フコースを産生する株においてラクトースから３－フコシルラクトースを産生することができるかどうかを評価した。実施例１で提供される培養条件に従って、増殖実験を行った。

図８は、産生培地中の２０ｇ／Ｌラクトースでの、様々なラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼを首尾よく発現する（３つの異なるプロモーターＰＲＯＭ００１２、ＰＲＯＭ００１６およびＰＲＯＭ００２６を使用して）株による３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。各データ点は、１つのウェルからのデータに対応する。水平な破線は、全てのデータ点が正規化された設定点を示す。

実験は、配列番号１２、配列番号６、配列番号１２および配列番号１４を有するポリペプチドを発現する株についての実施例２からの結果を確認し、配列番号１６を有するポリペプチドが、以前に確認されたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号１８を含有する株と比較して、より優れたラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有することを確認した。

（実施例９）
材料および方法Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
培地
株を、６．７ｇ／Ｌアミノ酸非含有Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＹＮＢ ｗ／ｏ ＡＡ、Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇ／Ｌ寒天（Ｄｉｆｃｏ）（固体培養）、２２ｇ／Ｌグルコース一水和物または２０ｇ／Ｌラクトースおよび０．７９ｇ／Ｌ ＣＳＭまたは０．７７ｇ／Ｌ ＣＳＭ－Ｕｒａ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含有する、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅを含むＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｅｆｉｎｅｄ酵母培地（ＳＤ ＣＳＭ）、またはＣＳＭ ｄｒｏｐ－ｏｕｔを含むＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｅｆｉｎｅｄ酵母培地（ＳＤ ＣＳＭ－Ｕｒａ）で増殖させる。

株
Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎで入手可能な、Bachmann et al. (Yeast (1998) 14:115-32)により作出されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４２を使用した。全ての突然変異株は、Gietz (Yeast 11:355-360, 1995)の方法を使用して相同組換えまたはプラスミド形質転換によって作出された。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｌａｃｔｉｓは、ＬＭＧ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で入手可能である。

プラスミド
酵母発現プラスミドｐ２ａ＿２μ＿ｓｉａ＿ＧＦＡ１（Chan 2013 (Plasmid 70 (2013) 2-17)）を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける外来遺伝子の発現に使用した。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉでの選択および維持を可能にするためのアンピシリン耐性遺伝子および細菌の複製起点を含有する。プラスミドは、酵母での選択および維持のための２μ酵母ｏｒｉおよびＵｒａ３選択マーカーをさらに含有する。次に、このプラスミドは、ラクトースパーミアーゼ（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓからのＬＡＣ１２）、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉからのＧｍｄ）およびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉからのｆｃｌ）を含有するようにｐ２ａ＿２μ＿ｆｌに改変され得る。

酵母発現プラスミドｐ２ａ＿２μ＿ｆｌ＿３ｆｔは、ｐ２ａ＿２μ＿ｆｔに基づくが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８もまた発現されるように改変されている。好ましくは、ただし必ずではなく、フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、フコシルトランスフェラーゼ酵素の可溶性を向上させるためにＳＵＭＯｓｔａｒタグ（例えば、ｐＹＳＵＭＯｓｔａｒ、Ｌｉｆｅ Ｓｅｎｓｏｒｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡから得られる）にＮ末端融合される。

プラスミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５アルファ（Ｆ^－、ｐｈｉ８０ｄｌａｃＺデルタＭ１５、デルタ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ^－、ｍｋ^＋）、ｐｈｏＡ、ｓｕｐＥ４４、ｌａｍｂｄａ^－、ｔｈｉ－１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１）で維持した。

遺伝子発現プロモーター
Blazeck (Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, No. 11, 2012)によって説明されるように、合成構成的プロモーターを使用して遺伝子を発現する。

異種および同種発現
プラスミドからでもゲノムからでも、発現させる必要があった遺伝子を、以下の会社：ＤＮＡ２．０、Ｇｅｎ９またはＩＤＴのうちの１つによって合成的に合成した。

発現は、コドン利用を発現宿主のコドン利用に最適化することによってさらに促進することができた。遺伝子を、サプライヤーのツールを使用して最適化した。

培養条件
一般的に、酵母株は、最初にＳＤ ＣＳＭプレートで増殖させて、シングルコロニーを得た。これらのプレートを、３０℃で２～３日間増殖させた。

シングルコロニーから開始して、前培養液を５ｍＬで３０℃にて２００ｒｐｍで振盪しながら一晩増殖させた。次の１２５ｍＬ振盪フラスコ実験に、２５ｍＬ培地中の２％のこの前培養液を接種した。これらの振盪フラスコを、２００ｒｐｍの軌道振盪を伴って３０℃でインキュベートした。全ての遺伝子は構成的に発現されるので、誘導剤の使用は必要とされない。

（実施例１０）
様々なラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素を使用するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける３－フコシルラクトースの産生
別の実施例は、本発明のための、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形態の真核生物の使用を提供する。実施例９で説明される、株、プラスミドおよび方法を使用して、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８を発現する株を作出する。

なおその上に、３－フコシルラクトースを産生するためにさらなる改変を行う。これらの改変は、ラクトースパーミアーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼの付加を含む。好ましいラクトースパーミアーゼは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓからのＫｌＬＡＣ１２遺伝子（ＷＯ２０１６／０７５２４３）である。好ましいＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼは、それぞれ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからのｇｍｄおよびｆｃｌである。

これらの株は、グルコースまたはグリセロールを炭素源として増殖し、炭素源をＧＤＰ－Ｌ－フコースに変換し、ラクトースを取り込み、ＧＤＰ－Ｌ－フコースおよびラクトースを配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８によって表される酵素のための基質として使用して３－フコシルラクトースを産生することができる（配列番号１８を参照として）。

前記株の前培養を、実施例９で説明されるように、２２ｇ／Ｌのグルコースを含有する５ｍＬの合成規定培地ＳＤ－ＣＳＭ中で行い、３０℃で増殖させる。これらの前培養液を、１０ｇ／Ｌスクロースを唯一の炭素源として含む振盪フラスコ中の２５ｍＬ培地に接種し、３０℃で増殖させる。試料を定期的に採取し、３－フコシルラクトースの産生を、実施例１で説明されるように測定する。

（実施例１１）
３－フコシルラクトースの酵素産生
別の実施例は、本発明の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４または配列番号１６を有する酵素の使用を提供する。これらの酵素は、非限定的に、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＮＥＢ）などの細胞非含有発現系において、または非限定的に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉもしくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの宿主生物において産生され、その後、上記に列挙される酵素は、単離され、必要に応じて、さらに精製され得る。

上記の酵素抽出物または精製酵素の各々を、ＧＤＰ－フコース、ラクトース、およびＴｒｉｓ－ＨＣｌまたはＨＥＰＥＳなどの緩衝成分と共に反応混合物に添加する。その後、前記反応混合物を、ある特定の温度（例えば、３７℃）である特定の時間の間（例えば、２４時間）インキュベートし、その間、ラクトースは、ＧＤＰ－フコースを使用する酵素によって３－フコシルラクトースに変換される。その後、３－フコシルラクトースは、当該技術分野で公知の方法によって反応混合物から分離される。３－ＦＬのさらなる精製は、好ましい場合、行ってもよい。反応の終わりに、または分離および／もしくは精製後、３－フコシルラクトースの産生を、実施例１で説明されるように測定する。

（実施例１２）
様々なラクトース濃度での３－フコシルラクトース産生
発酵プロセスは、実施例１および実施例７で説明される通りであり、培養培地中のラクトース濃度は、５０～１５０ｇ／Ｌの範囲に及ぶ。前記ラクトースは、プロセス中に３－フコシルラクトースに変換され、その後、少量のラクトースが残る。ラクトースの３－フコシルラクトースに対する最終的な比は、プロセスをより早く（より高いラクトースの、３－フコシルラクトースに対する比）またはより遅く（より低いラクトースの、３－フコシルラクトースに対する比）停止させることによって、このプロセス中に操作され得る。ラクトース濃度は、別の炭素源を伴うか、または伴わない高濃度のラクトース溶液をバイオリアクターに供給することによって容器内で増大することができる。前記ラクトース供給は、１００～７００ｇ／Ｌの間のラクトース濃度を含有し、乳業で使用される標準法であるプロセス中のラクツロースの形成を避けるためにラクトースが６未満またはそれに等しいｐＨにて可溶性で維持される温度で維持される。そのような産生プロセス中に達せられる３－フコシルラクトースの最終濃度は、上記に説明されるように、より低いラクトース濃度が使用された場合の７０ｇ／Ｌ～高いラクトース濃度がプロセスで使用された場合の２００ｇ／Ｌまたはそれよりも高い濃度の範囲に及ぶ。

（実施例１３）
様々なプロモーターから発現したＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼｆｕｃＴ（配列番号１８）の評価
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼｆｕｃＴ（配列番号１８）をコードする遺伝子を、発現ベクターにおいてプロモーターＰＲＯＭ００１２またはＰＲＯＭ００１６の制御下にクローニングし、得られたプラスミドを、実施例１で説明されるＥ．ｃｏｌｉ突然変異株に形質転換した。その後、これらの株を、３－ＦＬを産生するそれらの能力について、増殖実験において評価した。両方の株を、９６ウェルプレートの多数のウェルで増殖させた。

図９は、株によって産生された３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。各データ点は、１つのウェルからのデータに対応する。水平な破線は、全てのデータ点が正規化された設定点を示す。

実験は、プロモーターＰＲＯＭ００１２を使用してＨ．ｐｙｌｏｒｉ ＦｕｃＴを発現する株における３－ＦＬ産生は、プロモーターＰＲＯＭ００１６からフコシルトランスフェラーゼを発現する同様の株について観察されるレベルの±３０％まで降下することを示す。

実施例２、４および８で提供されるデータの外挿によって、私たちは、対照株と同様の産生を示す配列番号１０を有する株を除いては、配列番号２～１６のいずれかを含有する全ての株が、フコシルトランスフェラーゼが同じプロモーター（ＰＲＯＭ００１２またはＰＲＯＭ００１６）から発現された場合、１，３－フコシルトランスフェラーゼｆｕｃＴ（配列番号１８）を有する対照株と比較して、有意により高い産生を示すと結論付けることができる。

（実施例１４）
ＤＭ［ＡＳ］ＶＳＦコンセンサスモチーフを有するポリペプチドを発現する株の、３－フコシルラクトースの産生についての評価
配列番号４、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６のいずれかについての発現構築物を含有する突然変異体Ｅ．ｃｏｌｉ株を、実施例１で説明される増殖実験において、それらの３－ＦＬ産生について評価した。図１２で示されるように、全てのポリペプチド配列は、コンセンサスドメインＤＭ［ＡＳ］ＶＳＦ（配列番号３６）を含有するが、配列番号２、配列番号４、配列番号２０および配列番号２２のみは、タンパク質のＮ末端領域においてコンセンサスモチーフ［ＮＨ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）をさらに含有する。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼｆｕｃＴ（配列番号１８）を含有する株を、陽性対照として伴った。全ての株を、９６ウェルプレートの多数のウェルで増殖させ、３０ｇ／Ｌスクロースおよび２０ｇ／Ｌラクトースを含む標準培地で試験した。

図１０は、株によって産生された３－フコシルラクトースの正規化産生を示す。各データ点は、１つのウェルからのデータに対応する。水平な破線は、全てのデータ点が正規化された設定点を示す。

実験は、コンセンサスモチーフ［ＮＨ］ｘＤＰＡｘＬＤおよびＤＭ［ＡＳ］ＶＳＦの両方を有するポリペプチド：すなわち、配列番号２、配列番号４、配列番号２０または配列番号２２を含有する株のみが、３－ＦＬを産生することができ、一方で、ＤＭ［ＡＳ］ＶＳＦを有するが、［ＮＨ］ｘＤＰＡｘＬＤを欠くポリペプチド：すなわち、配列番号２４および配列番号２６を有する株は、３－ＦＬを全く産生しないことを示す。このデータに基づいて、私たちは、ＤＭ［ＡＳ］ＶＳＦ（配列番号３６）ドメインを有するポリペプチドのＮ末端領域における［ＮＨ］ｘＤＰＡｘＬＤ（配列番号３５）コンセンサスモチーフの存在は、酵素が、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するために決定的であると結論付けることができる。

さらに、配列番号２２のポリペプチドは、配列番号２との９２％のグローバル配列同一性を有し、これによって、配列番号２との８７％またはそれよりも高い配列同一性を有する配列もまた、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有することを示す。

（実施例１５）
配列番号２８、配列番号３０または配列番号３２を有するポリペプチドを発現する株の評価
配列番号２８、配列番号３０または配列番号３２のいずれかについての発現構築物を含有する突然変異体Ｅ．ｃｏｌｉ株を、実施例１で説明される増殖実験において、それらの３－ＦＬ産生について評価することができる。増殖実験の終わりに、３－フコシルラクトースの産生は、培養ブロスで観察され得る。

（実施例１６）
流加回分発酵の終わりの３ＦＬ純度の評価
バイオリアクタースケールでの流加回分発酵を行って、配列番号２、配列番号６および配列番号１８を有する様々なアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素を発現する、実施例１で説明される突然変異体Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株バックグラウンド由来の株を評価した。バイオリアクター稼働は、実施例１で説明されるように行った。これらの実験では、スクロースを炭素源として使用した。ラクトースを、３－ＦＬ形成のための前駆体として９０ｇ／Ｌで回分培地に添加し、濃縮スクロース溶液を、流加回分中に供給した。各株について、３つの独立した発酵を行った。

発酵の終わりに、ラクトースおよび３－ＦＬの存在についてブロスを分析し、３－ＦＬ純度を、式３ＦＬ（ｇ／Ｌ）／（３ＦＬ（ｇ／Ｌ）＋ラクトース（ｇ／Ｌ））を使用して計算した。配列番号１８を含有する株について、８５％の平均純度が得られ、一方で、配列番号２または６を含有する株について、それぞれ、９８％超、および９９％超の平均純度が得られた。

実験は、配列番号２または配列番号６を有するラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する突然変異体Ｅ．ｃｏｌｉ株は、バイオリアクタースケールでの流加回分発酵において、配列番号１８を含有する同様の株よりも高い３－ＦＬ純度を有するブロスを産生することを示す。

Claims (39)

1. α－１，３－フコシルラクトースを産生するための方法であって、
   ａ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドを提供するステップであって、前記ポリペプチドが、
   ｉ）保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）をコードするアミノ酸配列、
   ｉｉ）保存された［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］ドメイン（配列番号３４）をコードするアミノ酸配列
   を含み、
   ｉｉｉ）加えて、ｉｉ）の前記ドメインがＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦ（配列番号３６）に等しい場合、保存されたモチーフ［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）が、Ｎ末端領域に存在し、
   式中、Ｘが、任意の別個のアミノ酸であってもよく、
   前記ポリペプチドのＣ末端が、前記ＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個未満またはそれに等しいアミノ酸を有する、ステップと、
   ｂ）ステップａ）のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを、ＧＤＰ－フコースをドナー基質として、およびラクトースをアクセプター基質として含む混合物と、前記ポリペプチドが、フコース残基の、前記ドナー基質から前記アクセプター基質への移行を触媒する条件下で接触させ、
   それによって、α－１，３－フコシルラクトースを産生するステップと、
   ｃ）必要に応じて、前記α－１，３－フコシルラクトースを分離するステップと
   を含む方法。
2. 前記ポリペプチドが、細胞非含有系で提供される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞によって産生される、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＧＤＰ－フコースおよび／またはラクトースが、前記ＧＤＰ－フコースおよび／またはラクトースを産生する細胞によって提供される、請求項１または３に記載の方法。
5. ｉ）α－１，３－フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された細胞を提供するステップであって、前記細胞が、α－１，３－フコシルラクトース合成のための酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
   前記細胞が、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有する前記ポリペプチドの発現を含む、ステップと、
   ｉｉ）前記細胞を、培地中でα－１，３－フコシルラクトースの産生を許容する条件下で培養するステップと、
   ｉｉｉ）好ましくは、前記α－１，３－フコシルラクトースを培養から分離するステップと
   を含む、請求項１、３または４のいずれか一項に記載の方法。
6. ａ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有する前記ポリペプチドを発現する宿主細胞を提供するステップと、
   ｂ）前記宿主細胞を、α－１，３－フコシルラクトースの産生を許容し、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドの発現を許容する好適な栄養条件下で、増殖させるステップと、
   ｃ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドがフコース残基の、ドナー基質ＧＤＰ－フコースからアクセプター基質ラクトースへの移行を触媒するために、ＧＤＰ－フコースおよびラクトースをステップｂ）と同時に、またはそれに続いて提供し、それによって、α－１，３－フコシルラクトースを産生するステップと、
   ｄ）必要に応じて、前記α－１，３－フコシルラクトースを前記宿主細胞またはその増殖培地から分離するステップと
   を含む、請求項３に記載の方法。
7. 前記宿主細胞が、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有する外因性ポリペプチドを発現するように形質転換またはトランスフェクトされる、請求項５または６に記載の方法。
8. 前記ＧＤＰ－フコースおよび／またはラクトースが、前記宿主細胞で同時発現される酵素によって、または前記宿主細胞の代謝によって提供されることを特徴とする、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。
9. α－１，３－フコシルラクトースの精製をさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ポリペプチドが、
    ｉ）添付の配列表の配列番号６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２８、３０または３２のうちのいずれか１つ；
    ｉｉ）配列番号２、２０または２２の全長アミノ酸配列との８７％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
    ｉｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つの全長アミノ酸配列との８０％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
    ｉｖ）配列番号２、２０または２２で示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも４５個のその連続アミノ酸を含む断片；
    ｖ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも１０個のその連続アミノ酸を含み、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する断片
    からなる群から選択され、
    必要に応じて、前記ポリペプチドが、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸伸長部によってさらに改変される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
11. 先行請求項のいずれか一項に記載の３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、以下のステップ：
    ｉ）培養培地に、開始リアクター体積につき少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも１５０グラムのラクトースを含むラクトース供給を、好ましくは連続様式で、好ましくは前記培養培地の最終体積が、前記ラクトース供給の添加前の前記培養培地の体積の３倍以下、好ましくは２倍以下、より好ましくは２倍未満であるように、添加するステップ；
    ｉｉ）ラクトース供給を、連続様式で前記培養培地に１日、２日、３日、４日、５日の期間にわたり供給溶液の手段によって添加するステップ；
    ｉｉｉ）ラクトース供給を、連続様式で前記培養培地に１日、２日、３日、４日、５日の期間にわたり供給溶液の手段によって添加するステップであって、前記ラクトース供給の溶液の濃度が、５０ｇ／Ｌ、好ましくは７５ｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは２００ｇ／Ｌ、より好ましくは２２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２７５ｇ／Ｌ、より好ましくは３００ｇ／Ｌ、より好ましくは３２５ｇ／Ｌ、より好ましくは３５０ｇ／Ｌ、より好ましくは３７５ｇ／Ｌ、より好ましくは４００ｇ／Ｌ、より好ましくは４５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは６００ｇ／Ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３～７の間に設定され、好ましくは前記供給溶液の温度が、２０℃～８０℃の間で維持される、ステップ
    のうちの少なくとも１つをさらに含み、
    ｉｖ）前記方法が、前記培養培地の最終体積中の少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／Ｌの３－フコシルラクトース濃度をもたらす、方法。
12. α－１，３－フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞であって、α－１，３－フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドの発現を含み、前記ポリペプチドが、
    ｉ）保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）をコードするアミノ酸配列、
    ｉｉ）保存された［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］ドメイン（配列番号３４）をコードするアミノ酸配列
    を含み、
    ｉｉｉ）加えて、ｉｉ）の前記ドメインがＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦ（配列番号３６）に等しい場合、保存されたモチーフ［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）が、Ｎ末端領域に存在し、
    式中、Ｘが、任意の別個のアミノ酸であってもよく、
    前記ポリペプチドのＣ末端が、前記ＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個未満またはそれに等しいアミノ酸を有する、宿主細胞。
13. ｉ）ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む配列であって、前記宿主細胞にとって外来性の配列であり、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれる配列を含むか、またはｉｉ）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有し、前記ポリヌクレオチドが、前記ベクターで形質転換される宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結されている、請求項１２に記載の細胞。
14. 前記ポリペプチドが、
    ｉ）添付の配列表の配列番号６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２８、３０または３２のうちのいずれか１つ；
    ｉｉ）配列番号２、２０または２２の全長アミノ酸配列との８７％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
    ｉｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つの全長アミノ酸配列との８０％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
    ｉｖ）配列番号２、２０または２２で示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも４５個のその連続アミノ酸を含む断片；
    ｖ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも１０個のその連続アミノ酸を含み、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する断片
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    必要に応じて、前記ポリペプチドが、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸伸長部によってさらに改変される、請求項１２または１３に記載の細胞。
15. 前記細胞が、微生物、植物または動物細胞からなる群から選択され、好ましくは前記微生物が、細菌、真菌または酵母であり、好ましくは前記植物が、イネ、ワタ、ナタネ、ダイズ、トウモロコシまたはコーン植物であり、好ましくは前記動物が、昆虫、魚類、鳥類または非ヒト哺乳動物であり；好ましくは前記細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である、請求項３から１１のいずれか一項に記載の方法、または請求項１２、１３もしくは１４のいずれか一項に記載の細胞。
16. 細菌の、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の、より好ましくはＫ１２株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の細胞であり、さらにより好ましくは前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５であることを特徴とする、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
17. 酵母細胞であることを特徴とする、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
18. ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ（alpha-1,2-fucosyltransferase）活性を有する前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、各々の宿主細胞のコドン利用に適合される、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
19. α－１，３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、
    ａ）請求項１２から１８のいずれか一項に記載の細胞を提供するステップと、
    ｂ）前記細胞を、培地中でα－１，３－フコシルトランスフェラーゼの産生を許容する条件下で培養するステップと、
    ｃ）好ましくは、前記α－１，３－フコシルトランスフェラーゼを培養から分離するステップと
    を含む方法。
20. α－１，３－フコシルラクトースの産生のための、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用。
21. α－１，３－フコシルラクトースの産生のための、請求項１または１１に記載の方法で説明されるポリペプチドの使用。
22. ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼポリペプチドを異種性に発現する微生物であって、前記ポリペプチドが、
    ｉ）保存されたＧＤＰ－フコース結合ドメイン［Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｍ］Ｘ［Ｔ／Ｓ／Ｃ］［Ｅ／Ｑ／Ｄ／Ａ］［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）をコードするアミノ酸配列、
    ｉｉ）保存された［Ｋ／Ｄ］［Ｌ／Ｋ／Ｍ］ＸＸＸ［Ｆ／Ｙ］ドメイン（配列番号３４）をコードするアミノ酸配列
    を含み、
    ｉｉｉ）加えて、ｉｉ）の前記ドメインがＤＭ［Ａ／Ｓ］ＶＳＦ（配列番号３６）に等しい場合、保存されたモチーフ［Ｎ／Ｈ］ＸＤＰＡＸＬＤ（配列番号３５）が、Ｎ末端領域に存在し、
    式中、Ｘが、任意の別個のアミノ酸であってもよく、
    前記ポリペプチドのＣ末端が、前記ＧＤＰ－フコース結合ドメインの第１のアミノ酸から開始して１００個未満またはそれに等しいアミノ酸を有する、微生物。
23. 前記ポリペプチドが、
    ｉ）添付の配列表の配列番号６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２８、３０または３２のうちのいずれか１つ；
    ｉｉ）配列番号２、２０または２２の全長アミノ酸配列との８７％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
    ｉｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つの全長アミノ酸配列との８０％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列；
    ｉｖ）配列番号２、２０または２２で示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも４５個のその連続アミノ酸を含む断片；
    ｖ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２８、３０または３２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも１０個のその連続アミノ酸を含み、ラクトース結合アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する断片
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    必要に応じて、前記ポリペプチドが、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸伸長部によってさらに改変される、請求項２２に記載の微生物。
24. アルファ－１，３－フコシルラクトースの産生のための、請求項２２または２３に記載の微生物の使用。
25. 前記アルファ－１，３－フコシルラクトースを前記宿主細胞またはその増殖培地から分離するステップをさらに含む、請求項１から１１、１５または１９のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記分離が、以下のステップ：浄化、限外濾過、ナノ濾過、逆浸透法、精密濾過、活性炭もしくは炭素処理、接線流高性能濾過、接線流限外濾過、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／またはゲル濾過、リガンド交換クロマトグラフィーのうちの少なくとも１つを含む、請求項１から１１、１５、１９または２５のいずれか一項に記載の方法。
27. アルファ－１，３－フコシルラクトースの精製をさらに含む、請求項１から１１、１５、１９、２５または２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記アルファ－１，３－フコシルラクトースの前記精製が、以下のステップ：活性炭または炭素の使用、炭の使用、ナノ濾過、限外濾過またはイオン交換、アルコールの使用、水性アルコール混合物の使用、結晶化、蒸発、沈殿、乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥のうちの少なくとも１つを含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ポリペプチドが、真菌、酵母、細菌、昆虫、動物および植物発現系で産生される、請求項１から１１、１５、１９、２５から２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記宿主細胞が、細菌の、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の、より好ましくはＫ１２株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の細胞であり、さらにより好ましくは前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５である、請求項２９に記載の方法。
31. 前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項２９に記載の方法。
32. 前記培養培地中のラクトース濃度が、５０～１５０ｇ／Ｌの範囲に及ぶ、請求項１から１１、１５、１９、２５から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. ３－フコシルラクトースの最終濃度が、７０ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌの範囲に及ぶ、請求項１から１１、１５、１９、２５から３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記産生が、発酵の終わりに、１：５未満のラクトース濃度の３－フコシルラクトース濃度に対する比をもたらす、請求項１から１１、１５、１９、２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記産生が、発酵の終わりに、８０％またはそれよりも高い３－フコシルラクトース純度をもたらす、請求項１から１１、１５、１９、２５から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. α－１，３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、
    ａ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドを提供するステップと、
    ｂ）ステップａ）のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを、ＧＤＰ－フコースをドナー基質として、およびラクトースをアクセプター基質として含む混合物と、前記ポリペプチドが、フコース残基の、前記ドナー基質から前記アクセプター基質への移行を触媒する条件下で接触させ、
    それによって、α－１，３－フコシルラクトースを産生するステップであって、
    ｃ）触媒が、発酵の終わりに、１：５未満のラクトース濃度の３－フコシルラクトース濃度に対する比をもたらす、ステップと、
    ｄ）必要に応じて、前記α－１，３－フコシルラクトースを分離するステップと
    を含む方法。
37. α－１，３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、
    ａ）α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、ラクトースをアクセプター基質として使用する能力を有するポリペプチドを提供するステップと、
    ｂ）ステップａ）のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを、ＧＤＰ－フコースをドナー基質として、およびラクトースをアクセプター基質として含む混合物と、前記ポリペプチドが、フコース残基の、前記ドナー基質から前記アクセプター基質への移行を触媒する条件下で接触させ、
    それによって、α－１，３－フコシルラクトースを産生するステップであって、
    ｃ）触媒が、発酵の終わりに、８０％またはそれよりも高い３－フコシルラクトース純度をもたらす、ステップと、
    ｄ）必要に応じて、前記α－１，３－フコシルラクトースを分離するステップと
    を含む方法。
38. ３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、以下：
    ｉ）培養培地に、開始リアクター体積につき少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも１５０グラムのラクトースを含むラクトース供給を、好ましくは連続様式で、好ましくは前記培養培地の最終体積が、前記ラクトース供給の添加前の前記培養培地の体積の３倍以下、好ましくは２倍以下、より好ましくは２倍未満であるように、添加するステップ；
    ｉｉ）ラクトース供給を、連続様式で前記培養培地に１日、２日、３日、４日、５日の期間にわたり供給溶液の手段によって添加するステップ；
    ｉｉｉ）ラクトース供給を、連続様式で前記培養培地に１日、２日、３日、４日、５日の期間にわたり供給溶液の手段によって添加するステップであって、ラクトース供給溶液の濃度が、５０ｇ／Ｌ、好ましくは７５ｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは２００ｇ／Ｌ、より好ましくは２２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２７５ｇ／Ｌ、より好ましくは３００ｇ／Ｌ、より好ましくは３２５ｇ／Ｌ、より好ましくは３５０ｇ／Ｌ、より好ましくは３７５ｇ／Ｌ、より好ましくは４００ｇ／Ｌ、より好ましくは４５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは６００ｇ／Ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３～７の間に設定され、好ましくは前記供給溶液の温度が、２０℃～８０℃の間で維持される、ステップ
    のうちの少なくとも１つを含み、
    前記方法が、前記培養培地の最終体積中の少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／Ｌの３－フコシルラクトース濃度、および好ましくは培養液の最終体積中の１：５未満、より好ましくは１：１０、さらにより好ましくは１：２０、最も好ましくは１：４０のラクトース濃度の３ＦＬ濃度に対する比をもたらす、方法。
39. ３－フコシルラクトースの産生のための方法であって、以下：
    ｉ）培養培地に、開始リアクター体積につき少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも１５０グラムのラクトースを含むラクトース供給を、好ましくは連続様式で、好ましくは前記培養培地の最終体積が、前記ラクトース供給の添加前の前記培養培地の体積の３倍以下、好ましくは２倍以下、より好ましくは２倍未満であるように、添加するステップ；
    ｉｉ）ラクトース供給を、連続様式で前記培養培地に１日、２日、３日、４日、５日の期間にわたり供給溶液の手段によって添加するステップ；
    ｉｉｉ）ラクトース供給を、連続様式で前記培養培地に１日、２日、３日、４日、５日の期間にわたり供給溶液の手段によって添加するステップであって、ラクトース供給溶液の濃度が、５０ｇ／Ｌ、好ましくは７５ｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは２００ｇ／Ｌ、より好ましくは２２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２７５ｇ／Ｌ、より好ましくは３００ｇ／Ｌ、より好ましくは３２５ｇ／Ｌ、より好ましくは３５０ｇ／Ｌ、より好ましくは３７５ｇ／Ｌ、より好ましくは４００ｇ／Ｌ、より好ましくは４５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは６００ｇ／Ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３～７の間に設定され、好ましくは前記供給溶液の温度が、２０℃～８０℃の間で維持される、ステップ
    のうちの少なくとも１つを含み、
    前記方法が、前記培養培地の最終体積中の少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／Ｌの３－フコシルラクトース濃度、および好ましくは培養液の最終体積中の８０％またはそれよりも高い３ＦＬ純度をもたらす、方法。

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