JP2022513804A - 組織癒着を防止するための低濃縮タンパク質組成物 - Google Patents

Abstract

本明細書では、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含み、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲を有するフィブリノーゲン含有成分の溶液を含む第１の容器と、トロンビン含有成分の溶液を含む第２の容器と、で構成されるキットが提供される。更に、フィブリノーゲン及びトロンビン、カルシウムイオン、並びにアルブミンで構成される混合物であって、この混合物が、約２．５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質と、総タンパク質の約５０％～約８０％の範囲のフィブリノーゲンと、０．６５ｍｇ／ｍＬ超～約３ｍｇ／ｍＬの範囲のアルブミンと、で構成される、混合物が提供される。本明細書では、組織癒着を防止又は低減する方法、及びフィブリンで作製されたヒドロゲル材料が更に提供される。

Description

（発明の分野）
本開示は、フィブリノーゲン及びトロンビンを含むキット、並びに組織癒着を低減及び防止するためのその使用に関する。

（関連技術）
本開示の主題の背景として関連性があると見なされる参照文献を以下に列記する。
－国際公開第９８５５１４０号
－米国特許第６，９６５，０１４号
－米国特許出願公開第２００２／００１５８４号
－米国特許第６，６１３，３２５号
－Ｗｉｓｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｆｉｂｒｉｎ ｓｅａｌａｎｔ ｏｎ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ．Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ｂ Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ．（２００４）； ６８（２）： ２２２－３０。

本明細書において上記参照文献を承認することは、これらが本開示の主題の特許性と何らかの形で関連すると解釈することを示唆するものではない。

侵襲的処置後の組織癒着は、疼痛、不快感をもたらすことが多く、また場合によっては、生命を脅かすことさえある。したがって、このような組織癒着の低減又は防止は非常に重要である。

国際公開第９８５５１４０号では、総タンパク質の８０％未満のフィブリノーゲン濃度範囲を有し、かつフィブロネクチン、第ＶＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子、第ＸＩＩＩ因子、及びビトロネクチンなどの、自然発生血漿タンパク質を総タンパク質の少なくとも２０％有するフィブリノーゲン濃縮物を開示している。

米国特許出願公開第２００２／００１５８４号は、液体中又は凍結状態で安定化し、カオトロープ物質を添加したフィブリノーゲン製剤中に保存されている布地癒着剤を開示しており、トロンビン調製物は、術後布地癒着疾患を低減又は防止する。

米国特許第６，９６５，０１４号は、カルシウムを含まない特定の高強直性強度培地で再構成又は希釈したフィブリノーゲン及びトロンビンを混合することによって得られる生体分解性フィブリン材料を開示している。かかるフィブリン系生体材料は、抗癒着バリアとして使用するのに好適な細い繊維及び小さい孔径を有する緊密な構造を生じる。

米国特許第６，６１３，３２５号は、天然凝固材料に最もよく似た材料を外科癒着形成に適用することによって形成されたフィブリンポリマーフィルムを開示している。

Ｗｉｓｅｍａｎ Ｄらは、トラネキサム又はアプロチニンのいずれかを含有するフィブリンは、癒着の発生及び重症度を低減させることを記載している。

本開示は、いくつかの態様によると、（ｉ）約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含み、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲を有するフィブリノーゲン含有成分の溶液を含む第１の容器と、（ｉｉ）トロンビン含有成分の溶液を含む第２の容器と、を備える、キットを提供する。

本開示は、いくつかの態様によると、フィブリノーゲン含有成分、及びトロンビン含有成分、カルシウムイオン、及びアルブミンを含む混合物であって、この混合物が、約１０ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質と、総タンパク質の約５０％～約８０％の範囲のフィブリノーゲンと、０．６５ｍｇ／ｍＬ超～約３ｍｇ／ｍＬの範囲のアルブミンと、を含む、混合物を提供する。

本開示は、いくつかの他の態様によると、フィブリン及びカルシウムイオンを含むヒドロゲル材料であって、総タンパク質濃度が約２．５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、フィブリンは、総タンパク質の５０～８０重量％の濃度範囲で存在する、ヒドロゲル材料を提供する。

本開示は、いくつかの更なる態様によると、ヒドロゲル材料であって、凝固の形成を可能にする条件下で、（ｉ）約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲と、を含む、フィブリノーゲン含有溶液と、（ｉｉ）トロンビンと、を、組織上に適用することによって得られる、架橋フィブリンを含む、ヒドロゲル材料、を提供する。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有溶液及びトロンビンは、組織上に適用される前に混合される。いくつかの他の実施形態では、フィブリノーゲン含有溶液及びトロンビンは、組織上に別々に適用される（連続的に又は同時に）。

本開示は、いくつかの更なる態様によると、組織癒着の防止に使用するための２成分組成物であって、成分Ａであって、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲と、を含む、フィブリノーゲン含有溶液を含む、成分Ａと、（ｉｉ）トロンビンを含む成分Ｂと、を含む、２成分組成物、を提供する。

キット、混合物、ヒドロゲル、及び２成分組成物は、それぞれ、組織癒着の低減に使用するためのいくつかの態様に従う。

本開示は、いくつかの更なる態様によると、組織癒着を低減、防止、又は阻害する方法であって、この方法が、フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分を、被験体の組織の少なくとも一部に適用することを含み、フィブリノーゲン含有成分は、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質濃度範囲と、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、を含み、フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分の量は、組織と接触させたときに組織癒着を低減／防止／阻害するのに有効である、方法、を提供する。

組織癒着は、侵襲的処置後の治癒プロセスの自然な部分である。しかしながら、組織癒着は、疼痛に関連する炎症及び更なる重篤な影響を引き起こすことが多い。したがって、侵襲的処置後の癒着を低減又は阻害することは、非常に望ましい。

本発明は、組織癒着を低減又は防止又は阻害するために、例えば、侵襲的処置後に組織上に投与され得るキットの開発に基づく。キットは、少なくともフィブリノーゲン成分を含み、以下に詳述するように、追加のトロンビン成分を含むことができる。したがって、本明細書に記載されるキットは、２つの成分、フィブリノーゲン成分及びトロンビン成分を含んでもよい。

フィブリノーゲン系のキットが知られている。例えば、ＦＤＡ承認キット、ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）は、約５５～８５ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンを含む、８０～１２０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質を含むフィブリノーゲン成分を含む。

本発明者らは、驚くべきことに、低量のフィブリノーゲン、より驚くべきことに、低量の総タンパク質を含むキットは、既知のフィブリノーゲン製剤と比較して、侵襲的処置後の癒着を低減／防止するのに有効であることを見出した。具体的には、以下の実施例に示されるように、本開示の製剤は、術後癒着を低減し、並びに形成されたヒドロゲルの保水能力に影響を及ぼす。これに基づいて、本発明者らは、血漿成分の量が低減し、続いて形成された物理的バリアの程度（例えば、ヒドロゲルの形態）が低減している間、本発明のキットが、例えば、癒着を防止／低減／阻害する上で優れた抗癒着特性を呈することを示唆した。

本明細書に記載のキットは、少量の原料を含み、具体的には、フィブリノーゲンを含み、かつ４０ｍｇ／ｍＬ未満の総タンパク質濃度を有するフィブリノーゲン含有成分の溶液を含む。したがって、その最も広い態様によると、本開示は、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含み、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲を有するフィブリノーゲン含有成分の溶液を含む容器を備えるキットを提供する。キットは、追加のトロンビン成分を含むことができる。

したがって、本開示は、いくつかの態様によると、（ｉ）約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含み、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲を有するフィブリノーゲン含有成分の溶液を含む第１の容器と、（ｉｉ）トロンビン含有成分の溶液を含む第２の容器と、を備える、キットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、抗癒着キットであり、すなわち、癒着防止／低減／阻害特性を有する。

本明細書及び当該技術分野において使用する場合、用語「フィブリノーゲン」は、血液凝固マトリックスの前駆体タンパク質を指す。フィブリノーゲンは、約３４０，０００ダルトンの分子量を有し、ジスルフィド結合によって一緒に結合される、３つの対の異なるポリペプチド鎖Ａα、Ｂβ、及びγからなる。典型的には、フィブリノーゲンは、２つの同一のＤ末端球状ドメイン及び１つの中央Ｅ球状ドメインが、高次コイルα－螺旋体によって結合した三節構造を有する。

「フィブリノーゲン含有成分」は、アプリオリフィブリノーゲンを含む製剤として理解されるべきである。フィブリノーゲン含有成分は、水性製剤である。「水性製剤」は、水分子を含有する液体形態又は凍結形態の成分のブレンドを包含する。いくつかの実施形態では、水性製剤は液体形態である。液体形態であるとき、液体キャリアが本質的に中性のｐＨ、例えば、ｐＨ７．０±０．５を有するバッファであるのは、いくつかの実施形態に係る。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、凍結される。使用前に、フィブリノーゲン含有成分を解凍し、それによって室温で液体形態にしてよい。製剤は、溶液の形態であり得る。

用語「液体」は、流動し得、固定形状ではなく、固体又は気体ではない物質に関する。用語「溶液」は、分散若しくは溶解した物質（複数可）、及びそれが分散若しくは溶解される媒体、又はその成分が混合物全体にわたって均一に分布している混合物である単一の均質な液相に関する。

用語「成分（component）」は、薬物製品などの製品中に存在し得る任意の要素（ingredient）に関する。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の総タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約３０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の総タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の総タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約３５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の総タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約１５～３６ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の総タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約２０～３６ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の総タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約２０～４０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の総タンパク質を含む。

総タンパク質は、当技術分野で周知の任意の方法によって決定することができる。例えば、２８０ｎｍ（ＵＶレンジ）での吸光度を測定することによって。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｍｇ／ｍＬ（それらの間の任意の値及び範囲を含む）の濃度でフィブリノーゲンを含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約８ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約１１ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約１１ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約１１ｍｇ／ｍＬ～約２３ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約９ｍｇ／ｍＬ～約１４ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含む。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、限定されるものではないが、第ＸＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、及びビトロネクチンから選択される１つ以上の追加因子を含む。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、総タンパク質の約５０％～約８０％の範囲の重量濃度でフィブリノーゲンを含む。

フィブリノーゲン含有成分中のフィブリノーゲンは、血漿から精製及び単離することができる。フィブリノーゲン含有成分は、ヒト血漿を含む溶液からの、フィブリノーゲン濃縮ウイルス不活性化寒冷沈降物などの生物的に活性な構成成分（ＢＡＣ）であり得る。ＢＡＣは、血漿由来タンパク質を含む。用語「由来」は、ソースからの受け取りに関する。例えば、「から由来する」は、そこから取る、そこから得る、そこから受け取ることに関する。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、血漿寒冷沈降したフィブリノーゲンを含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、血漿寒冷沈降したフィブリノーゲンから生ずる（又は由来する）。本開示の状況において、用語「寒冷沈降したフィブリノーゲン」は、凍結血漿から得られたフィブリノーゲンを指し、典型的には、後者は全血から調製される（フィブリノーゲンとも呼ばれ、血漿寒冷沈降反応によって得られる）。

いくつかの実施形態では、寒冷沈降したフィブリノーゲンは、凍結血漿を低温、典型的には０～４℃の温度で解凍し、その結果、当該フィブリノーゲンを主に含有する沈殿物が形成されたときに得られる。いくつかの実施形態では、寒冷沈降物は、例えば遠心分離によって収集され、次いで、１２０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２０ｍＭのグリシン、又は９５ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有するバッファなどの好適なバッファに溶解される。

いくつかの実施形態では、寒冷沈降したフィブリノーゲンは、血漿の生物学的活性成分（biologically active component、ＢＡＣ）と見なされる。いくつかの実施形態では、ＢＡＣは、ウイルス不活性である。いくつかの種類のＢＡＣが存在する。一部の実施形態では、ＢＡＣは、抗線維素溶解剤としてトラネキサム酸を含有する、生物的に活性な構成成分である。

一部の実施形態では、フィブリノーゲンは、生物的に活性な構成成分（ＢＡＣ）の一部として提供される。ＢＡＣの非限定的な調製経路は、それらの内容が参照により組み込まれる、米国特許第６，１２１，２３２号及び／又は国際公開第９８／０３３５３３号に記載されている。

いくつかの実施形態では、ＢＡＣ組成物は、１つ以上の抗線維素溶解剤（例えば、トラネキサム酸）及びアルギニン塩酸塩を含む。

いくつかの実施形態では、ＢＡＣ中のトラネキサム酸などの抗線維素溶解剤の濃度範囲は、約８０～約１１０ｍｇ／ｍＬの範囲である。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、トラネキサム酸を含有しない。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、アプロチニンを含有しない。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、トラネキサム酸又はアプロチニンを含有しない生物的に活性な構成成分である。ＢＡＣ２の調製中に、プラスミノゲン（フィブリノーゲン及びフィブリンを分解するプラスミンの酵素前駆体）及び／又はプラスミンが除去され、したがって、ＢＡＣ２は、トラネキサム酸又はアプロチニンを含有しない。

いくつかの実施形態では、ＢＡＣは生物的に活性な構成成分２（ＢＡＣ２）、即ち、トラネキサム酸を欠如している生物的に活性な構成成分である。ＢＡＣ２は、主にフィブリノーゲン（約８５％）からなり、プラスミノゲンが枯渇しており（プラスミノゲンの除去は、典型的には、欧州特許第１，３９０，４８５号に記載されているように実施される）、抗線維素溶解剤が添加されていない、ヒト血漿の濃縮されたウイルス不活性化寒冷沈降物である（この寒冷沈降物は、典型的には、欧州特許第５３４，１７８号に記載されているように調製される）。寒冷沈降物からプラスミン／プラスミノゲンを除去することを考慮すると、トラネキサム酸、アプロチニン等の抗線維素溶解剤を添加する必要はない。

したがって、いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン成分は、プラスミン（ノゲン）が枯渇し、トラネキサム酸又はアプロチニンを含まないＢＡＣ２由来である。

一部の実施形態では、フィブリノーゲンは、抗血友病因子調製物に由来する血漿寒冷沈降物の生物的に活性な構成成分である。抗血友病因子は、血液の凝固を補助する血液中の自然発生タンパク質である。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、国際公開第２０１３／００１５２４（Ａ１）号に開示されているように、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の製造プロセスにおける副生成物からの水酸化アルミニウム沈殿物から精製される。

ＢＡＣ溶液は、当分野において公知の、アルギニン、リシンなどの安定剤、及び他のシーラント用添加物を更に含むことができる。いくつかの実施形態では、ＢＡＣ、及び好ましくはＢＡＣ２は、血漿寒冷沈降物（具体的には濃縮寒冷沈降物）に由来し得る。

フィブリノーゲン源の例には、以下に限定されないが、ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）のフィブリノーゲン成分（すなわち、ＢＡＣ２）、Ｔｉｓｓｅｅｌ（アプロチニンを含有する、抗線維素溶解剤）のフィブリノーゲン成分を含めた、組換えフィブリノーゲン、血漿精製フィブリノーゲンが挙げられる。

いくつかの実施形態では、血液由来のフィブリノーゲン濃縮物は、第ＶＩＩＩ因子の製造プロセスの副生成物であり、酸沈殿物、寒冷沈殿物、水酸化アルミニウム沈殿物（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，４５５，３００号を参照されたい）、グリシン沈殿物（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，２９７，３４４号を参照されたい）、エタノール沈殿物、及びヘパリン沈殿ペーストから選択され得る。

いくつかの実施形態では、血漿寒冷沈降したフィブリノーゲンは、これに限定されないが、３０～６０ｍｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質；総生菌数（ＴＶＣ）＜１０００ＣＦＵ／ｍＬ；第ＸＩＩＩ因子、２～９ＩＵ／ｍＬ；フィブロネクチン－０．５～６ｍｇ／ｍＬ；及びＣｏｌｔｔａｂｌｅフィブリノーゲン－１８～３９ｍｇ／ｍＬを含有する遠心分離後の新鮮な凍結血漿沈殿物を意味する。

更にいくつかの他の実施形態では、血液由来のフィブリノーゲン濃縮物は、時に「ペーストＩ」とも呼ばれる、懸濁又は沈殿したコーン画分Ｉを含むか又はその画分である。

いくつかの他の実施形態では、コーン分画法は、様々な血漿タンパク質の等電特性の違いを利用するプロセスであり、沈殿によってタンパク質を５つの「画分」（Ｉ～Ｖ）に分離するために、ｐＨ、エタノール濃度、及び温度を変化させることを伴う一連の精製工程を含む。コーンプロセスは、低温エタノール沈殿法としても知られており、例えば、米国特許第２，３９０，０７４号、及びＣｏｈｎら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８：４５９，１９４５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７２：４６５－４７４，１９５０）に記載されている。特に、本開示の状況において、「懸濁又は沈殿したコーン画分Ｆ」に言及するとき、それは、本明細書で上記に言及されたコーンプロセスだけではなく、それによって少なくともフィブリノーゲンが沈殿するエタノール分画の任意の生成物を包含すると理解されるべきである。

いくつかの実施形態では、懸濁又は沈殿したコーン画分Ｉを得るために、血漿をエタノール濃縮に供する。具体的には、コーン沈殿物Ｉ（画分Ｉ）は、例えば、８～１０％のエタノール濃度において－３℃～－５℃及び中性のｐＨで沈殿させることによって、解凍されたプール血漿から得ることができる。

フィブリノーゲン濃縮物は、商業的に入手することもできる。フィブリノーゲンの例としては、ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）のフィブリノーゲン成分（すなわち、ＢＡＣ２）、Ｔｉｓｓｅｅｌ（アプロチニンを含有する、抗線維素溶解剤）のフィブリノーゲン成分が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、希釈されたＢＡＣ２である。上述したように、ＢＡＣ２は、トラネキサム酸又はアプロチニンを含まない。トラネキサム酸及び／又はアプロチニンは、組織抗癒着を低減するために必要であると考えられていた。驚くべきことに、フィブリノーゲン含有成分（すなわち、希釈されたＢＡＣ２）はトラネキサム酸又はアプロチニンを含有しないが、効率的な抗癒着活性が観察されたことが見出された。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、少なくとも２倍に希釈されたＢＡＣ２を含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、少なくとも２～１０倍に希釈されたＢＡＣ２を含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、２倍に希釈されたＢＡＣ２を含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、４倍に希釈されたＢＡＣ２を含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、８倍に希釈されたＢＡＣ２を含む。

フィブリノーゲン含有成分の希釈には、様々なバッファが使用されてもよい。いくつかの実施形態では、バッファは、塩化ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和物、グリシン、アルギニン塩酸塩、及び塩化カルシウム二水和物のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、バッファは、約１２０ｍＭの塩化ナトリウム、約１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム二水和物、約１２０ｍＭのグリシン、約９．５ｍＭのアルギニン塩酸塩、及び約１ｍＭの塩化カルシウム二水和物を含む。いくつかの実施形態では、バッファは、７．０～７．２のｐＨ値を有する。例示的なバッファは、以下の表２に示すとおりである。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分（溶液）の希釈バッファは、アルブミンを含まない。

理解されるように、希釈バッファ中のアルブミンの非存在下でのＢＡＣ２では、フィブリノーゲン含有成分中のアルブミンの量は、ＢＡＣ２の希釈倍率によって決定される。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、本質的にアルブミンを含まない。このような実施形態では、トロンビン含有成分は、アルブミンを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、本質的にアルブミンを含まない。このような実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、アルブミンを含んでもよい。

このようないくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、総タンパク質の２０重量％未満のアルブミン濃度範囲を有する。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、総タンパク質の１５重量％未満のアルブミン濃度範囲を有する。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、総タンパク質の１０重量％未満のアルブミン濃度範囲を有する。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、総タンパク質の１１重量％未満のアルブミン濃度範囲を有する。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、総タンパク質の５重量％未満のアルブミン濃度範囲を有する。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、総タンパク質の約２重量％～約１７重量％、時には総タンパク質の約１０重量％～１５重量％、時には総タンパク質の約５重量％～約１５重量％、時には総タンパク質の約８重量％～約１０重量％、時には総タンパク質の約８重量％～約１２重量％のアルブミン濃度範囲を有する。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、本質的にアルブミンを含まない。「本質的にアルブミンを含まない」とは、アルブミンを０．６５ｍｇ／ｍＬ未満の量で含むことを意味する。

フィブリノーゲン含有成分は、フィブリノーゲン及びアルブミン以外の血漿タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン以外の血漿タンパク質が存在してもよい。フィブリノーゲン及びアルブミン以外の血漿タンパク質の非限定的な例としては、フィブロネクチン、第ＶＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子、第ＸＩＩＩ因子、及びビトロネクチンなどの自然発生血漿タンパク質が挙げられる。

本明細書に記載されるように、キットは、トロンビンを含む第２の区画を含む。トロンビンは、血液凝固カスケードの一部であり、フィブリノーゲンをフィブリンの不溶性鎖に変換するとともに、他の凝固関連反応を触媒する、哺乳類セリンプロテアーゼである。本開示の文脈において、用語「トロンビン」はまた、トロンビンの機能的類似体を包含することを意味する。用語「トロンビンの機能性的似体」は、フィブリノーゲンを少なくとも切断してフィブリンを形成することができる実体を指す。

「トロンビン含有成分」は、アプリオリトロンビンと、所望によりアルブミンなどの追加のタンパク質とを含む製剤として理解されるべきである。トロンビン含有成分は、液体形態又は凍結形態であってもよい。トロンビン含有成分は、使用前に、例えば凍結形態で存在する場合に解凍することによって操作されてもよい。

いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、トロンビンを約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬ含む。いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、トロンビンを約１００ＩＵ／ｍＬ～約２００ＩＵ／ｍＬ含む。いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、トロンビンを約１５０ＩＵ／ｍＬ～約２００ＩＵ／ｍＬ含む。本発明で使用する場合、用語「ＩＵ」は「国際単位（International Units）」を示し、例えば、世界保健機関（ＷＨＯ）のトロンビンに関する第２国際規格０１／５８０に対して較正された、効力濃度測定のための内部参照標準に対して、凝固アッセイによって測定され得る。単位（Ｕ）は、国際単位（ＩＵ）と同等である。

いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）の希釈トロンビン成分を含む。いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、少なくとも２倍に希釈されたＥＶＩＣＥＬ（登録商標）のトロンビン成分を含む。いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、少なくとも２～１０倍に希釈されたＥＶＩＣＥＬ（登録商標）のトロンビン成分を含む。いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、２倍に希釈されたＥＶＩＣＥＬ（登録商標）のトロンビン成分を含む。いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、４倍に希釈されたＥＶＩＣＥＬ（登録商標）のトロンビン成分を含む。いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、８倍に希釈されたＥＶＩＣＥＬ（登録商標）のトロンビン成分を含む。

トロンビン含有成分の希釈には、様々なバッファが使用されてもよい。いくつかの実施形態では、バッファは、酢酸ナトリウム三水和物、Ｄ－マンニトール、塩化カルシウム二水和物、及び塩化ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、バッファは、約２０ｍＭの酢酸ナトリウム三水和物、約０．１ｍＭのＤ－マンニトール、約４０ｍＭの塩化カルシウム二水和物、及び約９０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、バッファは、６．８～７．２のｐＨ値を有する。例示的なバッファは、以下の表３に示すとおりである。

いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分の希釈バッファは、アルブミンを含まない。

いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、本質的にアルブミンを含まない。「本質的にアルブミンを含まない」とは、アルブミンを０．６５ｍｇ／ｍＬ未満の量で含むことを意味する。

理解されるように、希釈バッファ中のアルブミンの非存在下では、トロンビン含有成分中のアルブミンの量は、トロンビンの希釈倍率によって決定される。

いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、アルブミンを含む。このような実施形態では、トロンビン含有成分は、アルブミンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、最大約６ｍｇ／ｍＬのアルブミンを含む。いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、１～最大約６ｍｇ／ｍＬのアルブミンを含む。トロンビンは、フィブリノーゲンを自然重合するフィブリンに変換する。このように、２つの成分、フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分を接触させて、抗癒着活性を可能にする。

２つの成分は、組織の適用前に混合されてもよく、あるいは２つの成分のうちの各１つは、組織上で２つの混合が行われるように、同じ組織上に別々に適用されてもよい。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有は、それぞれ０．８：１．２～約１：２：０．８、時には約１：１の比で混合される。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有は、組織上に適用される前に混合される。適用前に２つの成分を混合することは、本明細書では、抗癒着混合物として示される。これらの２つの構成成分を混合することにより、ヒドロゲルが形成され（後述するように）、使用を可能にする時間枠内、典型的には最大１又は１．５分までに組織上に適用されることが理解される。また理解されるように、この混合物は、凝固形成を可能にするために組織上に適用される。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分は、組織上に別々に適用され、組織上で混合されてゲルを形成する。また理解されるように、組織上への２つの成分の適用により、凝固形成が可能となる。

フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有（本明細書では、「複合成分」とも呼ばれる）の混合物（すなわち、適用前に混合）又は形成されたヒドロゲル（すなわち、混合により又は組織上に直接適用されたとき）は、０．６５ｍｇ／ｍＬ超～約３ｍｇ／ｍＬ、時には１．２ｍｇ／ｍＬ以上、時には１．２５ｍｇ／ｍＬ以上、時には３ｍｇ／ｍＬ以下、時には１．５ｍｇ／ｍＬ以上、時には３ｍｇ／ｍＬ以下のアルブミン濃度を含む。

いくつかの実施形態では、複合成分中のアルブミンは、複合成分中の総タンパク質の２０重量％未満である。いくつかの実施形態では、複合フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分は、総タンパク質の約６．５重量％～２０重量％未満のアルブミン、例えば、総タンパク質の６．５重量％～最大１７重量％に等しいアルブミンを含む。

いくつかの実施形態では、複合フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分の総アルブミンは、約１．５～３ｍｇ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、複合フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分の総アルブミンは、約１．５、２、２．５、又は３ｍｇ／ｍＬ（それらの間の任意の値及び範囲を含む）である。

いくつかの実施形態では、複合フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分の総アルブミンは、０．６５超～３ｍｇ／ｍＬの範囲である。

いくつかの実施形態では、複合フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分の総アルブミンは、約０．７、１、１．２、１．２５、１．５、２、２．５、又は３ｍｇ／ｍＬ（それらの間の任意の値及び範囲を含む）である。

いくつかの実施形態では、複合フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分は、本質的にアルブミンを含まない。「本質的にアルブミンを含まない」とは、アルブミンを０．６５ｍｇ／ｍＬ未満の量で含むことを意味する。

複合成分については、適用前に混合されるか、又は組織上に直接適用されるかのいずれでも、安定な凝固を形成するために、重合したフィブリンの架橋が必要である。このような重合フィブリンの架橋は、カルシウムイオンなどの二価イオンの存在下で、トロンビンによって活性化される第ＸＩＩＩ因子の作用によって起こる。換言すれば、安定した凝固の形成のために、カルシウムイオンの存在が必要とされる。フィブリノーゲン含有成分及び／又はトロンビン含有成分は、遊離カルシウムイオンを含む。いくつかの実施形態では、遊離カルシウムイオンは、イオン化され、キレート化されていないカルシウムである。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約０．５～約２μＭの濃度範囲の可溶化カルシウムを含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約０．５～約１μＭの濃度範囲の可溶化カルシウムを含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分は、約１～約２μＭの濃度範囲の可溶化カルシウムを含む。

いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、約３０～約５０μＭの濃度範囲の可溶化カルシウムを含む。いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、約３０～約４０μＭの濃度範囲の可溶化カルシウムを含む。いくつかの実施形態では、トロンビン含有成分は、約４０～約５０μＭの濃度範囲の可溶化カルシウムを含む。

カルシウムは、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、リン酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、又はこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、１つ以上のカルシウム塩で存在するか、又はそれらから生じ得る。いくつかの実施形態では、カルシウム塩は、塩化カルシウムである。いくつかの実施形態では、カルシウムカチオンは塩化カルシウムから生じる、すなわち、製剤は塩化カルシウムを用いて調製される。

いくつかの実施形態では、カルシウムは、キレート化されていないカルシウムである。本明細書で使用する場合、キレート化されていないカルシウムの文脈における用語「キレート化された」又は「キレート化」は、キレート剤及びカルシウム種内の２つ以上の結合部位の間の、１つ以上の結合、又は他の誘引相互作用の形成又は存在を指す。本明細書で使用する場合、用語「キレート剤」は、カルシウム沈殿剤を包含することも意味する。いくつかの実施形態では、沈殿剤は、カルシウムイオンの不溶性塩を生成する。例示的な実施形態では、「キレート化されていないカルシウム」とは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの沈殿剤を含まない媒体中に存在するカルシウムイオンを指すことを意味する。典型的には、ＰＢＳは、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、並びにいくつかの配合においては、塩化カリウム及びリン酸二水素カリウムを含有する水性の食塩水を含む。例示的な実施形態では、フィブリノーゲン及び／又はトロンビンの成分は、ＰＢＳなどのキレート剤を含まない。

本発明によるキットは、互いに分離されている２つの成分を含む。換言すれば、２つの成分のうちの各１つは、分離された容器内に閉じ込められる。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分及び／又はトロンビン含有成分は、アプリケータの形態であってもよい。いくつかの実施形態では、アプリケータは、本明細書に開示されるフィブリノーゲン含有成分及び／又はトロンビン含有成分を保持するバレルと、フィブリノーゲン含有成分及び／又はトロンビン含有成分をそこを通して送達するための再封止可能な開口部と、を含む。

いくつかの実施形態では、アプリケータは、シリンジである。適用は、成分のうちの各成分をシリンジから押し出すことによって、例えば、共通の導管に混入されて組成物（混合物）を形成し、この混合物が、その後、共通の導管から組織に直接適用されてもよく、あるいは、成分のうちの各成分をシリンジから押し出すことによって所望の標的部位に直接適用されても、又は直接組織上に直接適用されてもよい。

フィブリノーゲン含有成分及び／又はトロンビン含有成分は、液体形態、凍結乾燥形態、又は乾燥形態にあってもよく、後者の乾燥形態は、適用前に湿潤させる（例えば、生理食塩水により）ことになる。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン含有成分及び／又はトロンビン含有成分は、例えば、噴霧又は滴下によって使用されて治療される組織に適用されてもよい。

アプリケータは、単回使用向けであり得る、すなわち、フィブリノーゲン含有成分及び／又はトロンビン含有成分の全部又は一部を使用した後に廃棄することができる。あるいは、アプリケータは、その開口部が使用と使用との間に、再封止されるように、複数回使用向けに設計されていてもよい。

複合成分（フィブリノーゲン及びトロンビン）を接触させると（混合物又は直接適用）、凝固が開始し、フィブリン凝固系組織接着剤が形成される。したがって、フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分（混合物又は直接適用）の適用は、シーラント製剤の形成をもたらす。本発明の文脈において、用語「シーラント製剤」は、接触時に反応して、その後、組織接着剤を形成する成分を有する製剤として理解されるべきである。

したがって、本開示は、いくつかの態様では、組織癒着の防止に使用するための２成分組成物であって、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲と、を含む、フィブリノーゲン含有溶液を含む第１の成分（成分Ａ）と、トロンビンを含む第２の成分（成分Ｂ）と、を含む、２成分組成物に関する。

標的組織上へのフィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有組成物の適用（上記のように、アプリオリを混合するか、又はそうでないかのいずれか）により、個々の成分の各々と比較して粘度が増加したゲルが形成される。このような粘度の増加は、「硬化」の結果であり、組成物中のタンパク質成分（例えば、フィブリン）の重合及び／又は架橋を含む相互作用によって得ることができる。硬化反応が実施され得る温度は、室温（例えば、１５～３０°）あたりであり得る。いくつかの実施形態では、数秒～最大６００秒の範囲であってもよい。用語「硬化時間」は、硬化の終点に達するまでの時間を意味する。

用語「ゲル」は、固体中に分散された、実質的な液体を指す。典型的には、ゲルは固体状態の特性を有し、特定の条件下（例えば、温度、ｐＨ）で液体状態の特性を示す。いくつかの実施形態では、ゲルは、ヒドロゲルである。用語「ヒドロゲル」は、含水量を有する親水性ポリマーネットワークを指すことを意図する。

いくつかの実施形態では、硬化は、周囲条件で自発的に実施される。

いくつかの実施形態では、硬化は、活性化剤（触媒など）の使用による、熱、又は紫外線（ＵＶ）放射などの物理的活性化剤によることを含むがこれらに限定されない、１つ以上の方法によって実施される。したがって、本開示は、いくつかの態様によると、フィブリン、カルシウムを含むヒドロゲル材料であって、総タンパク質濃度が約２．５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、フィブリンは、総タンパク質の５０～８０重量％の濃度範囲で存在する、ヒドロゲル材料を提供する。

いくつかの実施形態では、ヒドロゲル中のフィブリンは架橋フィブリンである。

いくつかの実施形態では、ヒドロゲル中の総タンパク質濃度は、約７．５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの範囲である。

いくつかの実施形態では、ヒドロゲル中の総タンパク質濃度は、約５．５ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬの範囲である。

本明細書に記載されるように、形成されたヒドロゲルは、抗癒着特性を有する。

いくつかの実施形態では、アルブミンは、約１．５～３ｍｇ／ｍＬの濃度でヒドロゲルに存在する。いくつかの実施形態では、アルブミンは、１．２５ｍｇ／ｍＬ以上～３ｍｇ／ｍＬ以下の濃度でヒドロゲルに存在する。いくつかの実施形態では、アルブミンは、１．２０ｍｇ／ｍＬ以上～３ｍｇ／ｍＬ以下の濃度でヒドロゲルに存在する。いくつかの実施形態では、アルブミンは、０．６５ｍｇ／ｍＬ超～３ｍｇ／ｍＬ以下の濃度でヒドロゲルに存在する。

以下の実施例に示されるように、ヒドロゲル中の保水は、本発明のキットの影響を受ける。本発明のキットによって形成されるヒドロゲルは、現在入手可能なフィブリン材料よりも高い割合の水を保持する。より高い程度の保水は、ヒドロゲルの治療的使用に特に有益である。いずれの特定の機構にも束縛されるものではないが、保水の程度がより高いことは、ゲル又はバリアの構造が強いことを示す。このようなゲルは、例えば、隣接する組織によって、高圧、圧縮、又は衝撃応力にさらされても水を保持することができる。水の保持は、フィブリンヒドロゲル内に含有され得る治療薬の濃度の制御、並びにこれらの治療薬及び添加剤の有効放出のために有益である。フィブリンヒドロゲルが圧縮力を受けながらも水を保持する能力を試験し、従来のフィブリン材料の保水力と比較した。具体的には、様々な回転速度で材料を遠心分離することによって圧縮を適用し、保持された水の量を測定した。冷蔵遠心分離機（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ ６０００ Ｂ）は、フィブリンハイドロゲルを様々な速度で回転させた。

いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、その表面上に約４００～５００ＰＳＩの圧力を適用すると、初期含水量を少なくとも７０％保持することを特徴とする。

いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、その表面上に約４００～５００ＰＳＩの圧力を適用すると、初期含水量を少なくとも７０％～８０％保持することを特徴とする。

いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、その表面上に約４００～５００ＰＳＩの圧力を適用すると、初期含水量を少なくとも７０％保持することを特徴とする。

いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、その表面上に約４００～５００ＰＳＩの圧力を適用すると、初期含水量を少なくとも約８０％～９５％保持することを特徴とする。

いくつかの更なる態様によると、本開示は、ヒドロゲル材料であって、組織内／組織上で架橋重合フィブリンを形成できる条件下で、（ｉ）約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲と、を含む、フィブリノーゲン含有溶液と、（ｉｉ）トロンビンと、を含む混合物を、組織上に適用することによって得られる、架橋フィブリンを含む、ヒドロゲル材料、を提供する。いくつかの実施形態では、混合物は、遊離カルシウムイオンを含む。いくつかの実施形態では、混合物は、エックスビボでフィブリノーゲン含有溶液とトロンビンとを組み合わせることによって得られる。

上述したように、本開示のキットは、標的組織に適用されたときに、顕著に改善された抗癒着効果を有する。

したがって、更に別の態様では、本発明は、組織における癒着を低減又は防止又は阻害する方法であって、この方法が、フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分を、被験体の組織の少なくとも一部に適用することを含み、フィブリノーゲン含有成分は、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質濃度範囲と、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、を含み、フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分の量は、組織と接触させたときに組織癒着を低減又は防止するのに有効である、方法、を提供する。本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、当業者に既知である考慮事項によって決定されるものである。

いくつかの実施形態では、組織は、創傷組織／損傷組織である。損傷組織は、手術、外傷、感染、又は放射線によるものであり得る。組織の損傷は、例えば、治癒プロセスのために、マクロファージ及び／又は線維芽細胞をトリガし得る任意の生理学的プロセスに関連し得る。

キットによって低減／防止される癒着は、侵襲的処置の後であり得る。本明細書で使用する場合、用語「抗癒着」は、組織内又は組織付近における癒着を防止又は低減することを指す。抗癒着組成物は、癒着を防止又は低減することができる組成物を指し、そのような癒着（例えば術後癒着）は、組織内又は組織付近において侵襲的処置後に現れた合併症から生じ得る。

本方法のいくつかの実施形態では、抗癒着剤を標的領域に適用し、任意に、抗癒着剤を用いて癒着領域又は癒着の恐れがある領域を被覆して癒着を阻害することによって、抗接着効果を発揮することができる。いくつかの実施形態では、抗癒着剤は、標的領域に適用されてもよく、他の所望の領域が抗癒着剤に取り付けられ、次いで、一定の時間にわたって放置又は押圧してもよい。

典型的には、標的部位、例えば、手術部位における抗癒着用途のために、開示される組成物は、手術部位の異なる臓器間に耐久性のある物理障壁を提供することを可能にする。「耐久性のある」という用語は、抗癒着用途の文脈において、上記のような頑丈な物理障壁を、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、又は少なくとも１４日、例えば、１～１４日の期間提供することを意味する。

「癒着」という用語は、一般に、１つの組織内から別の組織まで、通常は腹腔などの事実上の空間にわたって広がる瘢痕の形成を説明するために適用される。侵襲的処置後の癒着形成は、通常、２つの損傷した表面が互いに近接している場合に発生し、これによって炎症を引き起こし、損傷した組織上にフィブリン沈着を引き起こす場合がある。癒着形成は、多くの場合、互いに接合しない組織間に界面を形成し得る。癒着自体は無痛であるが、癒着に関連した合併症が発生し、例えば、痛み及び閉塞などを引き起こす場合がある。上述したように、本発明者らは、驚くべきことに、低量のフィブリノーゲンを含む本発明のキットが、組織癒着を低減／阻害するのに有効であることを見出した。

本開示は、特定の損傷／創傷組織に限定されない。組織の非限定的な例は、例えば、腹部の組織、心臓組織、胸部組織、頭部の組織、頸部の組織、骨盤組織、皮膚組織であり得る。いくつかの実施形態では、本方法は、腹部手術、心臓血管手術、又は骨盤手術後の組織癒着を低減／防止するためのものである。

いくつかの実施形態では、損傷組織は、出血組織ではない。

いくつかの他の実施形態では、本方法は、侵襲的処置中の組織癒着を防止又は低減するためのものである。

侵襲的処置は、いくつかの実施形態によれば、外科的処置であり得る。

これらに限定されるものではないが、腹部手術、心臓血管手術、胸部手術、頭部及び頸部手術、骨盤手術、皮膚及び皮下組織処置などの、本開示の方法及びキットを使用することができる多くの外科的処置が存在する。いくつかの実施形態では、本方法は、腹部手術、心臓血管手術、又は骨盤手術後の組織癒着を低減／防止するためのものである。

腹部手術という用語は、腹部を開くこと（開腹術）を伴う外科的処置を包含する。腹部手術の非限定的な例としては、虫垂切除術、帝王切開術、試験開腹術、又は腹腔鏡検査を挙げることができる。

侵襲的処置は、いくつかの他の実施形態によれば、診断処置であり得る。

いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体用である。

フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分は、標的組織へ上の適用前に混合されてもよく、又は標的組織上に同時に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、標的組織上への適用は、噴霧若しくは滴下噴霧、スミアリング、ブラッシング、又は注入を含む。用語「阻害」、「緩和」、「低減」、「減少」、又は「減衰」又は「防止」又は「漸減」という用語は、本明細書で言及されるように、プロセス（例えば、組織癒着など）が現象又は表現型に少なくとも約１％～１００％、約５％～９５％、約１０％～９０％、約１５％～８５％、約２０％～８０％、約２５％～７５％、約３０％～７０％、約３５％～６５％、約４０％～６０％、又は約４５％～５５％関連することを理解しなければならない。プロセス、現象、又は表現型（組織癒着など）の阻害、緩和、減衰、制限、防止、阻止、減少、低減、又は漸減はまた、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％であってもよい。

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、言及された値よりも、最大で１％、より具体的には５％、より具体的には１０％、より具体的には１５％、場合によっては、最大２０％高く又は低く逸脱する可能性のある値を示し、偏差範囲は、整数値及び該当する場合は非整数値も含み、連続範囲を構成する。

用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（having）」及びそれらの複合体は、「含むが、これらに限定されない（including but not limited to）」を意味する。用語「～からなる（consisting of）」は、「包含し、限定される（including and limited to）」ことを意味する。用語「～から本質的になる（consisting essentially of）」とは、組成物、方法又は構成が、追加の成分、工程及び／又は部分を含み得ることを意味するが、追加の成分、工程及び／又は部分が、特許請求される組成物、方法又は構成の基本的かつ新規の特性を実質的に変えない場合に限る。

単語「代表的な」とは、本明細書では、「実例、事例又は例証としての役割を果たす」ことを意味する。「代表的な」として記載される任意の実施形態は、他の実施形態よりも好ましい又は有利であると必ずしも解釈される必要はない、及び／又はその他の実施形態からの特徴の組み込みを必ずしも排除する必要はない。

本明細書では、単語「任意選択で（optionally）」は、「いくつかの実施形態では提供され、他の実施形態では提供されない」ことを意味する。本発明の任意の特定の実施形態は、このような特徴が矛盾しない限り、複数の「任意の（optional）」特徴を含んでもよい。

本発明で使用する場合、その内容に別段の明確な指示がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示物を含むものとする。例えば、用語「化合物（compound）」又は「少なくとも１つの化合物（at least one compound）」は、これらの混合物を含む複数の化合物を含んでよい。

本出願全体を通して、本発明の種々の実施形態が範囲形式にて提示されてもよい。範囲形式の説明は単に便宜上及び簡潔さのためのものであり、本発明の範囲上の確固とした制限として解釈されるべきではない、と理解すべきである。したがって、範囲の説明は、全ての可能な部分範囲、並びにその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示される部分範囲、並びにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６を有すると見なされるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。

数値範囲が本明細書に示される場合はいつでも、示された範囲内の任意の引用された数字（分数又は整数）を含むことを意味する。用語、第１の表示番号と第２の表示番号との「間の範囲（ranging）／範囲（ranges）」、及び第１の表示番号「から」第２の表示番号「までの範囲（ranging）／範囲（ranges）」が本明細書で互換的に使用されるが、これは、第１及び第２の表示番号並びにこれらの間の全ての分数及び整数を含むことを意味する。

本発明で使用する場合、用語「方法」とは、所与のタスクを達成するための方法、手段、技術及び手順を意味し、化学的、薬理学的、生物学的、生化学的及び医学的分野の施術者による周知の方法、手段、技術及び手順として、知られるか又は容易に開発されるか、のいずれかの方法、手段、技術及び手順のようなものを含むが、これらに限定されない。

本発明で使用する場合、用語「治療する（treating）」は、病状の進行を抑制すること、実質的に阻害すること、緩徐化すること、若しくは逆行させること、状態の臨床症状若しくは審美的症状を実質的に改善すること、又は状態の臨床症状若しくは審美的症状の外観を実質的に予防することを含む。

「Ａ、Ｂ、及びＣなどのうちの少なくとも１つ」に類する表記が用いられる場合、一般に、このような構文は、当業者がその表記を理解するであろう意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つを有する組成物」は、限定するものではないが、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方及び／又はＡとＢとＣの全てなどを有する組成物を含む）。明細書、特許請求の範囲、又は図面のいずれにおいても、２つ以上の代替用語を提示する事実上全ての分離語及び／又は句は、用語のうちの１つ、用語のいずれか、又は両用語を含む可能性を考慮すると理解されるべきであることを当業者は更に理解するだろう。例えば、語句「Ａ又はＢ」は、「Ａ」若しくは「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むものと理解されよう。

本発明の特定の特徴は、明確性のために別個の実施形態の文脈において記載されているが、これはまた、単一の実施形態において組み合わせて提示されてもよいことが理解されている。逆に、本発明の種々の特徴は、簡潔さのために、単一の実施形態の文脈において記載されているが、これはまた、別個に、若しくは任意の好適な部分的組み合わせで、又は本発明の任意のその他の記載される実施形態において好適にもたらされてもよい。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしには動作不可能である場合を除き、それらの実施形態の必須特徴であるとして考慮されるべきではない。

本明細書の上記で詳述され、以下の特許請求の範囲において特許請求されるような、本発明の種々の実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的な裏付けを見出す。

ここで、本発明を、本発明に基づいて実施された実験の以下の説明文にて例示する。これらの実施例は、限定というよりも例示という性質を帯びたものであることが意図されていると理解すべきである。明らかなことに、上の教示に照らし合わせて、これらの実施例の多数の修正及び改変が可能である。

非限定的な実施例
実施例：様々な条件下での保水
この研究は、様々な製剤を使用して形成された凝固における保水率（％）を定量し、保水率（％）に対するアルブミンの効果を評価することを目的とした。各実験は、本明細書でフィブリノーゲン成分及びトロンビン成分として示される２つの異なる成分を組み合わせる（各成分０．５ｍＬ）ことを含んだ。

２つの成分、ＢＡＣ２及びトロンビン（希釈なし）は、まとめて製品ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）の成分として知られる。表１に試験した製剤を要約する。フィブリノーゲン成分及びトロンビン成分は、これらの成分のそれぞれを別々に指すが、ヒドロゲルは、複合された２つの成分中のアルブミン濃度（ｍｇ／ｍＬ）を指す（組織への適用前又は適用後のいずれか）。

この実験では、使用されたフィブリノーゲン材料は、表１に示されるように希釈されたＢＡＣ２として示されるＦＤＡ認可された市販材料である。ＢＡＣ２（生物的に活性な構成成分２）は、Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．により供給されるフィブリノーゲン含有製品である。ＢＡＣ２は、約７０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンと、８０～１２０ｍｇ／ｍＬ（約１００ｍｇ／ｍＬ）の総タンパク質濃度とを含む。この研究の目的のために、ＢＡＣ－２サンプルを解凍し、アルブミン系バッファ溶液又はアルブミンを含まないバッファ溶液のいずれかを用いて、１：４＝約１４ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン、又は１：８＝約８ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンに希釈した。これらのフィブリノーゲン溶液をトロンビン成分で１：１に希釈して、約７ｍｇ／ｍＬ（１：４）及び４ｍｇ／ｍＬ（１：８）の混合最終溶液を得た。アルブミンを含まないバッファで希釈するため、トロンビンと混合する前の総タンパク質濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬ（１：４）及び１１ｍｇ／ｍＬ（１：８）であった。トロンビンと１：１で混合した後の総タンパク質は、約１０及び５．５であった。表２は、それぞれ、ＢＡＣ－２の希釈に使用されたアルブミン系バッファ溶液及びアルブミンを含まないバッファ溶液の成分を詳細に詳述する。

ＢＡＣ－２中のアルブミンの濃度は約１２ｍｇ／ｍＬであり、トロンビン中のアルブミンの濃度は約６ｍｇ／ｍＬであり（ＴＨ０４ではアルブミンが存在しない）、アルブミンを含まない溶液で希釈した製剤の場合、アルブミン濃度は表５に示されるとおりである。

^＊アルブミンの代わりに注射用水（ＷＦＩ）を添加した。これはＢＡＣＩＩに関連する。

２つの異なるトロンビン材料を研究に使用した。「トロンビン」として示される第１のものは、Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．から供給される。トロンビンは、１０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン、６ｍｇ／ｍＬの塩化カルシウム、及び６ｍｇ／ｍＬのアルブミンを含み、この研究の目的のために、溶液をアルブミン系バッファ溶液又はアルブミンを含まないバッファ溶液のいずれかで約４倍（１：４）に希釈して、表１に詳述される最終溶液を得た。

表３は、それぞれ、トロンビンの希釈に使用されたアルブミン系バッファ溶液及びアルブミンを含まないバッファ溶液の成分を詳細に詳述する。

^＊アルブミンの代わりに注射用水（ＷＦＩ）を添加した。

本明細書で「ＴＨ０４」として示されるトロンビンの第２の供給源は、１００～３００ＩＵ／ｍＬのトロンビンを含む。ＴＨ０４は、トロンビン源がアルブミン及びカルシウムイオンを含まないトロンビン製造におけるプロセス画分である。

カルシウムイオンを含まない製剤（カルシウム無）を調製するために、カルシウムキレート剤であるＥＤＴＡを５ｍＭ添加した。

実施例１Ａ：周囲条件
ヒドロゲル形成の１～２時間後に、保水率（％）を、周囲条件下で評価した（ヒドロゲル形成は目視検査により判定した）。ヒドロゲル形成後１時間～最大２時間後に、表面積は約１ｃｍ^２で３０分間、セントリコンチューブ内で１ｍＬのヒドロゲルを６３０ｇの穏やかな遠心分離にかけ、ヒドロゲル中の保持水の量を評価した。表４は、異なる凝固の保水能力の結果を要約している。

実施例１Ｂ：高圧
ヒドロゲル形成後すぐに、ヒドロゲルの保水率（％）を、高圧条件下で評価した（ヒドロゲル形成は目視検査により判定した）。ヒドロゲル形成後、１ｍＬのヒドロゲルを、エッペンドルフチューブ０．７～１ｃｍ^２中で、３１，５１４ｇ（約４５７ＰＳＩの圧力）で３０分間遠心分離し、ヒドロゲル中の保持水の量を評価した。表５は、異なるヒドロゲルの保水能力の結果を要約している。

結果は、凝固（１：４及び１：８に希釈し、フィブリノーゲンの濃度をそれぞれ１４ｍｇ／ｍＬと８ｍｇ／ｍＬとしたフィブリノーゲンと、トロンビンとを１：１の比率で形成した）フィブリノーゲンの１：１混合物（７ｍｇ／ｍＬ及び４ｍｇ／ｍＬ）は、総タンパク質の７０又は７３％であり（混合物中の総タンパク質はそれぞれ１０及び５．５ｍｇ／ｍＬ）、アルブミンが、０．６７ｍｇ／ｍＬ超（総タンパク質の１２％）、又は１．２ｍｇ／ｍＬ以上（総タンパク質の１２％）、１．８ｍｇ／ｍＬ以下（総タンパク質の１８％）の場合、より多くの水分を保持することができることを示す。

結果は更に、ヒドロゲル又は凝固（１：４及び１：８に希釈し、フィブリノーゲンの濃度を１４ｍｇ／ｍＬと８ｍｇ／ｍＬとし、トロンビンで１：１の比率に希釈したフィブリノーゲンで形成した）フィブリノーゲンは、総タンパク質の７０又は７３％であり、アルブミンが、１．２５ｍｇ／ｍＬに等しい（総タンパク質の６．５％）、及び１．８ｍｇ／ｍＬ以下（総タンパク質の１８％（実施例３））の場合、最大量の水分を保持することができることを示す。

結果は更に、低い濃度（例えば、混合物（トロンビン：フィブリノーゲンが１：１）中でのフィブリノーゲンの濃度が約７ｍｇ／ｍＬ未満（例えば、３．９ｍｇ／ｍＬ）のフィブリノーゲンで調製されたヒドロゲル中の少量のアルブミンの存在（例えば、４５．２ｍｇ／ｍＬ未満、１．２、１．２５、１．８ｍｇ／ｍＬ）の重要性を示す。

結果はまた、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）の存在、又は遊離カルシウムの不在下では、水を保持するための凝固能力を変化させなかったこと、すなわち、水損失の傾向が、群１～４（遊離カルシウムの存在下）において同じであったことも示す。

実施例３：ウサギ子宮角モデルにおけるフィブリノーゲン及びアルブミンの影響
この研究の目的は、ウサギ子宮角癒着モデルにおける、異なる濃度のフィブリノーゲン及びアルブミンを有する様々な製剤の有効性を特徴付けることであった。

材料及び方法
試験システム
若年／若年成人（手術時１３～１５週齢）雌ニュージーランド白色ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）を研究に使用した。ウサギは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｒｅｇｏｎ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏ．（ＰＯ Ｂｏｘ ６５３， Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ， ＯＲ ＵＳＡ）から入手し、供給元によって適用された固有の耳タグによって個別に識別した。
試験施設に到着した直後に、経験豊富な動物管理担当者によって動物を検査した。

動物を、研究開始前に最低５日間順応させ、経験豊富な動物管理担当者が毎日モニターした。この研究に供給された動物は、全体的に正常に見えた場合にのみ使用された（すなわち、毛羽立ちのないきれいな毛並み、明澄な目、身体の開口部からの異常な滲出物がない、警戒し活発な姿勢を示す）。

環境及び飼育：
動物を個別にステンレス鋼ケージに収容し、それぞれ研究番号及び個々の動物番号を示す個別のカードで標識した。室内環境を、約６８°Ｆ（約２０℃）、相対湿度３０～７０％、及び１２時間／１２時間の光／暗サイクルで維持した。

Ｐｕｒｉｎａ Ｐｒｏｌａｂ Ｒａｂｂｉｔダイエット１５％タンパク質（ＬａｂＤｉｅｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び水道水は、研究期間中、動物に自由に与えられ、ニンジン及びアルファルファのキューブが与えられた。

手術前の準備 癒着を手術を用いて研究した。動物を手術当日に秤量した。麻酔は、イソフルランの吸入によって誘導され、維持された（それぞれ５％及び３．５％濃度）。手術部位の脱毛は、電気動物用クリッパーを用いて行われた。この領域を掃除機で吸って切り取った毛髪及びくずを除去し、次いでイソプロピルアルコール７０％ですすいだ。膀胱を搾り出した（すなわち、外部から操作して尿を押し出した）。領域全体に、１％有効ヨウ素の水性ヨードフォア溶液（ヨウ素スクラブ）をで塗った。次いで、この領域を７０％イソプロピルアルコール溶液で拭いた。

無菌生存手術のために確保された室内で、無菌様式で処置を実施した。滅菌タオル、ドレープ、及び器具を使用した。麻酔をかけ、外科的に準備されたウサギを手術台に運び、肢部を拘束して所望の横臥位に置いた。無菌の切開ドレープを、準備された領域に適用した。動物の体重と子宮角のサイズにはおおよその相関関係があるため、範囲外の小さめの又は大きめの子宮角を有する動物での手術を避けるために、また、連続する２週間のそれぞれに２日間の連続手術日があるため、動物は、それらの体重に基づいて順番に手術に割り当てられた。研究群のうちの１つに対する動物の割り当ては、その連続手術の割り当てに従って行われた。

試験システムの正当性：
ウサギの子宮角単純擦過モデルは、本質的にＷｉｓｅｍａｎ １９９２（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎ ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｂａｒｒｉｅｒ． Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ ３７ Ｎｏ ９， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９２）に記載されているように実施される。

群当たり６匹の動物を研究に参加させる。歴史的に観察された分散を考慮すると、これらの群サイズは、治療群と対照群との間の統計的差異を検出するのに十分な検出力を研究に提供するのに十分である。

このモデルは、推定抗癒着剤の有効性の決定に広く使用されており、動物で得られたデータと臨床的に得られたデータとの間には良好な相関関係がある（Ｗｉｓｅｍａｎ， １９９９ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ （ＯＲＣ）ｏｎ ｃｅｃａｌ ａｎｄ ｓｉｄｅｗａｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ａｎｄ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｂｌｅｅｄｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ １２：１４１－１４６）。

４２匹の連続的に割り当てられた動物を、無関係な個人による抽選で７ブロックにランダム化し、研究群のそれぞれを各ブロックで表すようにした。

ウサギの子宮角単純擦過モデルは、Ｗｉｓｅｍａｎら（１９９２）に記載されているように行った。

手術中の手順：長さ約６ｃｍの正中線開腹切開によって腹部に入った。膀胱及び子宮に創傷をつけた。

直径が９以上かつ１６フレンチ以下の子宮角を２つ持つ動物のみが研究に参加した。１０番メスの刃を使用して、子宮分岐部から約１ｃｍの長さの５ｃｍ長の子宮角を、片側４０回ずつ擦り取った。止血はガーゼを有するタンポンによって制御された。必要に応じて、小さな血管を結紮した。臓器を解剖学的に再配置した。処置中、動物を慎重に観察して、麻酔処置に対する予想外の応答を有するあらゆる動物を除去した。対照は、全ての外科的処置が行われたが、試験材料の適用なしの動物で構成された。

試験した処方を、動物１匹当たり各成分５ｍＬのバイアル中で使用し、麻酔導入前に室温で解凍した。各製品は、製造業者の使用説明書に従って取り扱い、Ｏｍｒｉｘアプリケーションエアレス噴霧装置を使用して噴霧することによって送達した。外傷を受けた表面を薄膜で覆うのに十分な量の製品を適用した。適用された体積を記録した。

術後の手順 腹部切開を、連続的なバイクリル４－０縫合糸を使用して閉じた。筋膜は４－０バイクリルで緩く閉じ、皮膚は未染色の４－０バイクリル（切断針）で皮下縫合法を使用して閉じた。

ブプレノルフィン（ブプレネックス）（０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍＬｘ０．３ｍｇ／ｍＬ）の３回の投与（手術の朝に１回、６～８時間後に１回、翌朝に１回）が皮下注射によって行われた。獣医が必要と判断した場合は、追加の投与量を与えた。

動物の臨床的徴候：全ての動物を、それらがケージに戻されたときに垂直に横たわる状態が再開されるまで注意深く観察した。この術後の最初の期間、ウサギを加熱ランプの下又は加熱ブランケットの上に置いた。

手術後、各ウサギを毎日観察して、一般的な姿勢及び外見、摂食量、体重減少、糞便及び尿排泄、並びに異常な排泄物の有無に基づいてその健康状態を判断した。動物は、切開部の完全性、過度のあざ及び感染、痛み及び／又は不快感の評価について毎日観察され、上記標準投与量に加えて鎮痛剤が与えられた。担当獣医師が必要と判断した場合、動物を安楽死させ、分析から除外した。

毎日のモニタリング記録を維持した。異常な所見は研究監督者及び／又は獣医に報告され、動物を治療するか、又は瀕死の動物の場合は安楽死させる決定を行った。瀕死の動物を安楽死させ、記録した。

動物飼育担当者は、群の割り当てについて知らされていなかった。

癒着及び着強度の検出：手術の１１～１６日後に癒着の評価を行い、１．５ｍＬのＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ－Ｄ（ペントバルビタールナトリウム３９０ｍｇ／ｍＬ；フェニトインナトリウム５０ｍｇ／ｍＬ）（Ｍｅｒｃｋ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＮＪ）を静脈内注射することによって動物を安楽死させた。動物の体重を記録した。

腹部を開け、手術部位を検査した。癒着は、盲検観察者によって等級付けされた。

実施された試験
癒着の程度及び発生率：癒着のある各子宮角の長さを推定する。結果は、癒着の発生率（癒着を伴う子宮角の数／総数）及び癒着の程度（癒着を伴う子宮角の長さ％）として表される。

癒着の着強度：癒着（等級）の着強度（重症度）を０（なし）、１（膜状の癒着）、２（強粘着性、鋭利な切開が必要）として等級付けする。

子宮の回旋の程度：癒着による臓器の解剖学的歪みの尺度である子宮の回旋の程度は、次の尺度に従って記録される。
・回旋なし：癒着した又は癒着していない子宮角の直線長さがはっきりと見える。
・部分的な回旋：子宮角には癒着があり、子宮角の長さの５０％～７５％が絡み合い直線部分の識別を妨げる。
・完全に回旋子宮：角が完全に絡み合っているため、子宮の解剖学的構造を見ることは不可能である。

癒着のデータ分析：各動物について、２つの子宮角の癒着の平均範囲を計算する。この平均値を使用して、群の癒着の平均範囲（関与する子宮の長さのパーセント）（±ＳＥＭ）を計算し、小数点以下第１位まで表示する。対照群（処置なし）との全ての群の比較は、ダネットの検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ，１９６４）を使用して行われる。各群の癒着の発生率はフィッシャーの正確確率検定を使用して対照群と比較され、着強度及び子宮回旋の程度はカイ二乗検定を使用して比較される。全ての試験について、統計的有意性のレベルはｐ＜０．０５である。

分析からの除外：剖検での動物の検査時、ただし手術部位の検査及び癒着の評価の前に、その動物を一次分析から除外するべきかどうかの判定が行われる。結果に影響を及ぼし得る異常な発生の兆候がある場合、動物は一次分析から除外されるべきである。そのような徴候には、通常、腹腔内の感染の存在、又は過剰な体重減少（体重の＞１０％）を含む。動物を除外する任意の決定は、群の割り当て、又は癒着の有無若しくは程度を知ることなく行われる。

以下の表６は実験の詳細を要約し、以下の表７は、癒着形成に対するフィブリン系製剤の効果の評価に関する結果概要を示す。

１ 癒着のある子宮角の長さの％、左右の子宮角の平均
２ 対照に対するスチューデントｔ検定のｐ値
３ 癒着のない子宮角の％（癒着のない子宮角の数／総数）
４ 癒着なし／等級１癒着／等級２癒着を有する子宮角の数
５ 回旋なし／部分的な回旋／完全な回旋を有する子宮角の数
^＊ ｐ＜０．０５ダネットのｔ検定対対照
＃ ｐ値χ２試験，対対照）。＜０．１の値のみを示す。

改善された抗癒着活性が実験３で観察され、本明細書に記載のキットが優れた抗癒着活性を有することを示している。

表８及び表９は、各組成物（フィブリノーゲン成分－表８；並びに表９のフィブリノーゲン及びトロンビン）について試験した抗癒着実験に使用した６～８個のサンプルの個別データ統計の要約を示す。

^＊ＦＧＢＡＣＩＩ＝ＢＡＣＩＩ中のフィブリノーゲン
^＊＊ＦＧ純粋フィブリノーゲン＝純粋フィブリノーゲン中のフィブリノーゲン^＊＊＊癒着％

最も効果的な癒着防止効果は、サンプル３及び４で得られた。サンプル３及び４中の総タンパク質は、それぞれ、約１８及び１０ｍｇ／ｍＬであり、フィブリノーゲンは、総タンパク質の６７％及び５５％であり、アルブミンは、３ｍｇ／ｍＬ（総タンパク質の１６．７％）及び１．５ｍｇ／ｍＬ（総タンパク質の１５％）である。

比較統計分析により、癒着範囲閾値が３５％超に設定されていると、実験３で最高の抗癒着活性が観察され、閾値を超えるサンプルがないことを更に確認した。

本発明は、その特定の実施形態と共に記載されてきたが、多くの代替、変更及び変形形態が当業者には明白となることは明らかである。したがって、これは、添付の特許請求の趣旨及び広義の範囲内にある、このような代替、変更及び変形形態の全てを包含することを目的としている。

〔実施の態様〕
（１） キットであって、
（ｉ）約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含み、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲を有するフィブリノーゲン含有成分の溶液を含む第１の容器と、
（ｉｉ）トロンビン含有成分の溶液を含む第２の容器と、を備える、キット。
（２） 前記フィブリノーゲン含有成分が、トラネキサム酸又はアプロチニンを含まない、実施態様１に記載のキット。
（３） 前記フィブリノーゲン含有成分が、約２０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の総タンパク質を含む、実施態様１又は２に記載のキット。
（４） 前記フィブリノーゲン含有成分が、約８ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含む、実施態様１～３のいずれかに記載のキット。
（５） 前記フィブリノーゲン含有成分が、約１０ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、約２０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度と、を含む、実施態様１～４のいずれかに記載のキット。

（６） 前記トロンビン含有成分が、約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬの濃度範囲のトロンビンを含む、実施態様１～５のいずれかに記載のキット。
（７） 前記フィブリノーゲン含有成分が、２０重量％未満の濃度範囲のアルブミンを含む、実施態様１～６のいずれかに記載のキット。
（８） 前記フィブリノーゲン含有成分及び／又は前記トロンビン含有成分が、遊離カルシウムイオンを含む、実施態様１～７のいずれかに記載のキット。
（９） 前記フィブリノーゲンが、血漿寒冷沈降反応によって得られる、実施態様１～８のいずれかに記載のキット。
（１０） 前記フィブリノーゲンが、生物的に活性な構成成分２（ＢＡＣ２）に由来する、実施態様１～８のいずれかに記載のキット。

（１１） 前記フィブリノーゲンが、抗血友病因子調製物に由来する血漿寒冷沈降物の生物的に活性な構成成分である、実施態様１～９のいずれかに記載のキット。
（１２） 前記フィブリノーゲン含有成分及び／又は前記トロンビン含有成分が、液体又は凍結形態である、実施態様１～１１のいずれかに記載のキット。
（１３） 組織癒着の防止／低減に使用するための使用説明書を含む、実施態様１～１２のいずれかに記載のキット。
（１４） 抗癒着混合物の製造に使用するための、実施態様１～１２のいずれかに記載のキット。
（１５） 侵襲的処置後の組織癒着の防止／低減に使用するための、実施態様１３及び１４のいずれかに記載のキット。

（１６） 前記侵襲的処置が、外科的処置又は診断処置である、実施態様１５に記載のキット。
（１７） 前記溶液を組織に噴霧又は滴下することによって投与される、実施態様１～１６のいずれかに記載のキット。
（１８） 前記第１の容器及び／又は前記第２の容器が、アプリケータである、実施態様１～１７のいずれかに記載のキット。
（１９） 前記アプリケータが、シリンジである、実施態様１８に記載のキット。
（２０） フィブリノーゲン、トロンビン、カルシウムイオン、及びアルブミンを含む混合物であって、前記混合物が、約２．５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質と、総タンパク質の約５０重量％～約８０重量％の範囲のフィブリノーゲンと、０．６５ｍｇ／ｍＬ超～約３ｍｇ／ｍＬの範囲のアルブミンと、を含む、混合物。

（２１） 前記アルブミンが、約１．２０ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬの範囲内である、実施態様２０に記載の混合物。
（２２） フィブリン及びカルシウムイオンを含むヒドロゲル材料であって、前記総タンパク質濃度が約２．５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、前記フィブリンは、総タンパク質の５０～８０重量％の濃度範囲で存在する、ヒドロゲル材料。
（２３） 前記ヒドロゲル材料が、０．６５ｍｇ／ｍＬ超～約３ｍｇ／ｍＬの範囲のアルブミンを更に含む、実施態様２２に記載のヒドロゲル材料。
（２４） 前記アルブミンが、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬの範囲である、実施態様２２又は２３に記載のヒドロゲル材料。
（２５） 前記総タンパク質濃度範囲が、約７．５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬである、実施態様２２～２４のいずれかに記載のヒドロゲル材料。

（２６） 前記フィブリンが、架橋フィブリンである、実施態様２２又は２５に記載のヒドロゲル材料。
（２７） 抗癒着特性を有する、実施態様２２～２６のいずれかに記載のヒドロゲル材料。
（２８） ヒドロゲル材料であって、ヒドロゲルの形成を可能にする条件下で、（ｉ）約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲と、を含み、前記フィブリノーゲンが、総タンパク質の約５０重量％～約８０重量％の範囲である、フィブリノーゲン含有溶液と、（ｉｉ）トロンビン含有溶液と、を含む混合物を、組織上に適用することによって得られる、架橋フィブリンを含む、ヒドロゲル材料。
（２９） 前記混合物が、エックスビボで前記フィブリノーゲン含有溶液と前記トロンビン含有溶液とを組み合わせることによって得られる、実施態様２８に記載のヒドロゲル材料。
（３０） 組織癒着の防止に使用するための２成分組成物であって、
成分Ａであって、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲と、を含み、前記フィブリノーゲンが、総タンパク質の約５０重量％～約８０重量％の範囲である、フィブリノーゲン含有溶液を含む、成分Ａと、トロンビンを含む成分Ｂと、を含む、２成分組成物。

（３１） 前記フィブリノーゲン含有溶液が、約１０ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、約２０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質濃度と、を含む、実施態様３０に記載の２成分組成物。
（３２） 前記成分Ｂが、約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬの濃度範囲のトロンビンを含む、実施態様３０又は３１に記載の２成分組成物。
（３３） 成分Ａ及び／又は成分Ｂが、遊離カルシウムイオンを含む、実施態様３０～３２のいずれかに記載の２成分組成物。
（３４） 組織癒着を防止又は低減する方法であって、前記方法は、フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分を、被験体の前記組織の少なくとも一部に適用することを含み、前記フィブリノーゲン含有成分が、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質濃度と、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、を含み、前記フィブリノーゲンが、総タンパク質の約５０重量％～約８０重量％の範囲である、方法。
（３５） フィブリノーゲン含有成分及びトロンビン含有成分を、被験体の前記組織の少なくとも一部に同時に適用することを含む、実施態様３４に記載の方法。

（３６） 前記組織への前記適用前に、エックスビボで前記フィブリノーゲン含有成分とトロンビン含有成分とを組み合わせることを含む、実施態様３４又は３５に記載の方法。
（３７） 適用することが、噴霧若しくは滴下噴霧、スミアリング、ブラッシング、又は注入を含む、実施態様３４～３６のいずれかに記載の方法。
（３８） 前記組織が、創傷組織であり、前記方法が、侵襲的処置中の組織癒着を防止するためのものである、実施態様３４～３７のいずれかに記載の方法。
（３９） 前記侵襲的処置が、外科的処置である、実施態様３８に記載の方法。
（４０） 前記外科的処置が、腹部手術、心臓血管手術、胸部手術、頭部及び頸部手術、骨盤手術、皮膚及び皮下組織処置のうちの少なくとも１つである、実施態様３９に記載の方法。

（４１） 前記組織が、出血組織ではない、実施態様３４～４０のいずれかに記載の方法。
（４２） 前記被験体が、ヒト被験体である、実施態様３４～４１のいずれかに記載の方法。
（４３） 前記フィブリノーゲン含有成分が、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の総タンパク質と、約８ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、を含む、実施態様３４～４２のいずれかに記載の方法。
（４４） 前記トロンビン含有成分が、約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬの濃度範囲のトロンビンを含む、実施態様３４～４３のいずれかに記載の方法。
（４５） 前記フィブリノーゲン含有成分及び／又は前記トロンビン含有成分が、遊離カルシウムイオンを含む、実施態様３４～４４のいずれかに記載の方法。

（４６） 前記フィブリノーゲンが、血漿寒冷沈降反応によって得られる、又は生物的に活性な構成成分２（ＢＡＣ２）若しくは寒冷沈降物由来抗血友病因子調製物の生物的に活性な構成成分に由来する、実施態様３４～４５のいずれかに記載の方法。

Claims (33)

1. キットであって、
   （ｉ）約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含み、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲を有するフィブリノーゲン含有成分の溶液を含む第１の容器と、
   （ｉｉ）トロンビン含有成分の溶液を含む第２の容器と、を備える、キット。
2. 前記フィブリノーゲン含有成分が、トラネキサム酸又はアプロチニンを含まない、請求項１に記載のキット。
3. 前記フィブリノーゲン含有成分が、約２０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の総タンパク質を含む、請求項１又は２に記載のキット。
4. 前記フィブリノーゲン含有成分が、約８ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。
5. 前記フィブリノーゲン含有成分が、約１０ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、約２０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度と、を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のキット。
6. 前記トロンビン含有成分が、約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬの濃度範囲のトロンビンを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のキット。
7. 前記フィブリノーゲン含有成分が、２０重量％未満の濃度範囲のアルブミンを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のキット。
8. 前記フィブリノーゲン含有成分及び／又は前記トロンビン含有成分が、遊離カルシウムイオンを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のキット。
9. 前記フィブリノーゲンが、血漿寒冷沈降反応によって得られる、請求項１～８のいずれか一項に記載のキット。
10. 前記フィブリノーゲンが、生物的に活性な構成成分２（ＢＡＣ２）に由来する、請求項１～８のいずれか一項に記載のキット。
11. 前記フィブリノーゲンが、抗血友病因子調製物に由来する血漿寒冷沈降物の生物的に活性な構成成分である、請求項１～９のいずれか一項に記載のキット。
12. 前記フィブリノーゲン含有成分及び／又は前記トロンビン含有成分が、液体又は凍結形態である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のキット。
13. 組織癒着の防止／低減に使用するための使用説明書を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のキット。
14. 抗癒着混合物の製造に使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のキット。
15. 侵襲的処置後の組織癒着の防止／低減に使用するための、請求項１３及び１４のいずれか一項に記載のキット。
16. 前記侵襲的処置が、外科的処置又は診断処置である、請求項１５に記載のキット。
17. 前記溶液を組織に噴霧又は滴下することによって投与される、請求項１～１６のいずれか一項に記載のキット。
18. 前記第１の容器及び／又は前記第２の容器が、アプリケータである、請求項１～１７のいずれか一項に記載のキット。
19. 前記アプリケータが、シリンジである、請求項１８に記載のキット。
20. フィブリノーゲン、トロンビン、カルシウムイオン、及びアルブミンを含む混合物であって、前記混合物が、約２．５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質と、総タンパク質の約５０重量％～約８０重量％の範囲のフィブリノーゲンと、０．６５ｍｇ／ｍＬ超～約３ｍｇ／ｍＬの範囲のアルブミンと、を含む、混合物。
21. 前記アルブミンが、約１．２０ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬの範囲内である、請求項２０に記載の混合物。
22. フィブリン及びカルシウムイオンを含むヒドロゲル材料であって、前記総タンパク質濃度が約２．５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、前記フィブリンは、総タンパク質の５０～８０重量％の濃度範囲で存在する、ヒドロゲル材料。
23. 前記ヒドロゲル材料が、０．６５ｍｇ／ｍＬ超～約３ｍｇ／ｍＬの範囲のアルブミンを更に含む、請求項２２に記載のヒドロゲル材料。
24. 前記アルブミンが、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬの範囲である、請求項２２又は２３に記載のヒドロゲル材料。
25. 前記総タンパク質濃度範囲が、約７．５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のヒドロゲル材料。
26. 前記フィブリンが、架橋フィブリンである、請求項２２又は２５に記載のヒドロゲル材料。
27. 抗癒着特性を有する、請求項２２～２６のいずれか一項に記載のヒドロゲル材料。
28. ヒドロゲル材料であって、ヒドロゲルの形成を可能にする条件下で、（ｉ）約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲と、を含み、前記フィブリノーゲンが、総タンパク質の約５０重量％～約８０重量％の範囲である、フィブリノーゲン含有溶液と、（ｉｉ）トロンビン含有溶液と、を含む混合物を、組織上に適用することによって得られる、架橋フィブリンを含む、ヒドロゲル材料。
29. 前記混合物が、エックスビボで前記フィブリノーゲン含有溶液と前記トロンビン含有溶液とを組み合わせることによって得られる、請求項２８に記載のヒドロゲル材料。
30. 組織癒着の防止に使用するための２成分組成物であって、
    成分Ａであって、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度範囲と、を含み、前記フィブリノーゲンが、総タンパク質の約５０重量％～約８０重量％の範囲である、フィブリノーゲン含有溶液を含む、成分Ａと、トロンビンを含む成分Ｂと、を含む、２成分組成物。
31. 前記フィブリノーゲン含有溶液が、約１０ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のフィブリノーゲンと、約２０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質濃度と、を含む、請求項３０に記載の２成分組成物。
32. 前記成分Ｂが、約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬの濃度範囲のトロンビンを含む、請求項３０又は３１に記載の２成分組成物。
33. 成分Ａ及び／又は成分Ｂが、遊離カルシウムイオンを含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の２成分組成物。