JP2022513798A

JP2022513798A - トランスフェリン受容体標的ペプチド

Info

Publication number: JP2022513798A
Application number: JP2021533535A
Authority: JP
Inventors: ザッカリークルック，; ミ－ヨンブルスニアック，; ジェイムズオルソン，; アンドリュージェイムズマイア，; チュンフェンイン，; ジーングレゴリーホッピング，; ローランドストロング，
Original assignee: フレッドハッチンソンキャンサーリサーチセンター
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2022-02-09
Also published as: AU2019398467A1; EP3893913A1; CN113329758A; EP3893913A4; IL283839A; CA3120466A1; WO2020124032A1; US20220048961A1

Abstract

本明細書に記載されるのは、ペプチド及びそのバリアント、ならびに薬剤にコンジュゲート、連結、または融合されたペプチドを含むペプチドコンストラクトであり、ペプチド及びペプチドコンストラクトは、ＴｆＲに結合することが可能である。本明細書に記載されるペプチドまたはペプチドコンストラクトのＴｆＲへの結合は、内皮層、例えば、血液脳関門を越えたトランスサイトーシス、または細胞膜の通過を可能にし得る。疾患または状態を治療するためのペプチド及びペプチドコンストラクトの医薬組成物及び使用、ならびにそのようなペプチド及びペプチドコンストラクトの設計及び製造の方法についても本明細書に記載される。【選択図】図７

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月１４日に出願された米国特許仮出願第６２／７７９，８８５号、及び２０１９年４月１９日に出願された同第６２／８３６，５２０号の優先権及び利益を主張するものであり、そのそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に援用される。

配列表
本出願は、電子的に提出されたＡＳＣＩＩ形式の配列表を含み、その全体は、参照により本明細書に援用される。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１９年１２月１２日に作成され、名称は、４４１８９－７２３＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは、５５２，５７１バイトである。

中枢神経系（ＣＮＳ）中の標的への薬物送達は、血液脳関門（ＢＢＢ）によって妨げられており、この用語は、極めて通過が困難なＣＮＳ毛細血管の血管内皮細胞を指す。ＢＢＢは、有害な代謝物及び病原体が脳内に入らないようにするために存在するが、同時に、従来の薬を使用したＣＮＳ疾患の治療を特に困難にしている。例えば、原発性ＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫）ならびに神経炎症性疾患及び神経変性疾患（例えば、多発性硬化症及びアルツハイマー病）は、末梢組織に影響を及ぼす同様の疾患には高い効果を示す治療法に対して、応答が特に低い。したがって、ＣＮＳならびに他の器官及び組織に治療用及び／または診断用分子を送達する改善されたアプローチが必要とされている。

様々な態様において、本開示は、操作されたトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合ペプチド、またはそのバリアント、ホモログ、フラグメント、もしくはアナログを含む組成物を提供する。

様々な態様において、本開示は、ペプチドコンストラクトを含む組成物を提供し、ここで、ペプチドコンストラクトは、ａ）トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合ペプチド、またはそのバリアント、ホモログ、フラグメント、もしくはアナログと、ｂ）活性薬剤とを含み、ペプチドは、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。

様々な態様において、本開示は、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つと、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する操作されたペプチド、またはそのバリアントもしくは機能性フラグメントを含む組成物を提供する。

いくつかの態様において、ペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）を含む細胞層を透過する。いくつかの態様において、ペプチドは、膜を透過し、ここで、膜は、細胞の膜である。いくつかの態様において、細胞は、ＴｆＲを発現する。いくつかの態様において、ペプチドは、ＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して細胞の膜を透過する。

いくつかの態様において、ペプチドは、ＴｆＲに結合し、次いで、解離することによって、血液脳関門を越えてＣＮＳに送達される。いくつかの態様において、ペプチドは、受容体媒介性トランスサイトーシスによって血液脳関門を越えて送達される。いくつかの態様において、細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの態様において、ペプチドが局在する細胞または器官は、ＴｆＲを過剰発現している。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号２０６～配列番号２２４及び配列番号３３４～配列番号３４４を含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、及びＱ５１に対応する表面界面残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、位置３、４、９、１１、１５、１６、１９、２３、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、及び４０のいずれか１つに対応する親水性表面遠位残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、親水性表面遠位残基は、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、及びＤ４０に対応する親水性表面遠位残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、１５、３５、３９、もしくは４９のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに対応する位置に親水性残基を含む。いくつかの態様において、親水性残基は、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、及びＨ４９に対応する親水性残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、１１、２５、もしくは２７、またはこれらの任意の組み合わせに対応する位置に疎水性残基を含む。いくつかの態様において、疎水性残基は、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、もしくはＹ、またはこれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｍ１１、Ｍ２５、Ｍ２７に対応する疎水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、位置４５に対応する脂肪族残基を含む。いくつかの態様において、脂肪族残基は、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｌ４５に対応する脂肪族残基を含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも５つのジスルフィド結合を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つの配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号１に示される配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号４に示される配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３０に示される配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２に示される配列を含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、細胞透過部分と更に製剤化、融合、またはコンジュゲートされる。いくつかの態様において、細胞透過部分は、ポリカチオン、ポリ有機酸、エンドソーム放出ポリマー、ポリ（２－プロピルアクリル酸）、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｔａｔペプチド、Ａｒｇパッチ、ノットペプチド、ＣｙｓＴＡＴ、Ｓ１９－ＴＡＴ、Ｒ８（配列番号７３）、ｐＡｎｔｐ、Ｐａｓ－ＴＡＴ、Ｐａｓ－Ｒ８（配列番号７６）、Ｐａｓ－ＦＨＶ、Ｐａｓ－ｐＡｎｔＰ、Ｆ２Ｒ４（配列番号７９）、Ｂ５５、アウレイン、ＩＭＴ－Ｐ８、ＢＲ２、ＯＭＯＴＡＧ１、ＯＭＯＴＡＧ２、ｐＶＥＣ、ＳｙｎＢ３、ＤＰＶ１０４７、Ｃ１０５Ｙ、トランスポータン、ＭＴＳ、ｈＬＦ、ＰＦＶＹＬＩ（配列番号９３）、マウロカルシン、インペラトキシン、ハドルカリン、ヘミカルシン、オピカルシン－１、オピカルシン－２、ミッドカイン（６２－１０４）、ＭＣｏＴＩ－ＩＩ、クロロトキシン、ＤＲＩ－ＴＡＴ、ｃＦΦＲ_４（配列番号９６）、Ｒ_６Ｗ_３（配列番号４２１）、ミリステート、ｙＢＢＲ、またはそのフラグメントもしくはバリアント、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、細胞透過部分は、配列番号７１～配列番号９６、配列番号９８～配列番号１０１、配列番号１１６～配列番号１２６、または配列番号４０３～配列番号４５５のいずれか１つである。

いくつかの態様において、ペプチド配列は、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８の残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、または少なくとも８１のアミノ酸残基を含む。

いくつかの態様において、ペプチドに活性配列がグラフトされるか、または、ペプチドが、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、もしくは融合されるか、もしくはグラフトされて、ペプチドコンストラクトがもたらされる。いくつかの態様において、ペプチドコンストラクトは、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、配列番号３５９～配列番号３６１、配列番号３７３、配列番号３７５、配列番号３８１、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９３、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号４００、または配列番号４０１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。

いくつかの態様において、活性薬剤は、リンカーを介して連結され、ここで、リンカーは、表７または配列番号１０３～配列番号１１５、もしくは配列番号１２５のいずれか１つから選択される。いくつかの態様において、活性薬剤は、免疫治療薬、ＣＴＬＡ－４標的薬剤、ＰＤ－１標的薬剤、ＰＤＬ－１標的薬剤、ＩＬ１５薬剤、融合されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合薬剤、ＩＦＮガンマ薬剤、抗ＣＤ３薬剤、イオンチャネル調節剤、Ｋｖ１．３阻害薬、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアミシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ－３８、ＢＡＣＥ阻害薬、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害薬、ＷＥＨＩ－５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ－１９９、ナビトクラックス、ＡＴ－１０１、オバトクラックス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体、ドラスタチン、または神経伝達物質である。いくつかの態様において、Ｋｖ１．３阻害薬は、Ｖｍ２４、ＳｈＫ－１７０、ＳｈＫ－１８６、またはＳｈＫ－１９２である。いくつかの態様において、Ｖｍ２４は、配列番号３７８または配列番号３９１の配列を有する。いくつかの態様において、Ｓｈｋ－１８５は、配列番号３７９、配列番号３９０、または配列番号４０２の配列を有する。いくつかの態様において、神経伝達物質は、ニューロテンシン、ニューロテンシンペプチドバリアント、またはその機能性フラグメントである。いくつかの態様において、ニューロテンシンペプチドバリアントは、配列番号３５０または配列番号３６５～配列番号３６９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。

いくつかの態様において、組成物は、ペプチドに結合された半減期改変剤を更に含む。いくつかの態様において、半減期改変剤は、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、双極性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含有する水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸、またはアルブミンに結合する分子を含む。いくつかの態様において、半減期改変剤は、ＳＡ２１を含む。いくつかの態様において、ＳＡ２１は、配列番号３７６または配列番号３７７の配列を有する。

いくつかの態様において、組成物は、リンカーによってペプチドに結合された検出可能な剤を更に含む。いくつかの態様において、検出可能な剤は、リンカーを介して連結され、ここで、リンカーは、表７または配列番号１０３～配列番号１１５、もしくは配列番号１２５のいずれか１つから選択される。いくつかの態様において、検出可能な剤は、フルオロフォア、近赤外色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性核種、または放射性核種キレート剤である。

様々な態様において、本開示は、本明細書に記載される組成物のいずれか、またはその塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

様々な態様において、本開示は、組成物を細胞層を越えて輸送するための方法であって、ａ）本明細書に記載されるペプチドのいずれかを含む組成物または本明細書に記載される医薬組成物のいずれかと細胞層を接触させることと、ｂ）組成物を細胞層を越えて輸送することとを含む、方法を提供する。

様々な態様において、本開示は、状態を治療することを、それを必要とする対象に行うための方法であって、ａ）本明細書に記載されるペプチドのいずれかを含む組成物または本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを対象に投与することと、ｂ）組成物を細胞層を越えて輸送することとを含む、方法を提供する。

様々な態様において、本開示は、状態を治療することを、それを必要とする対象に行う方法であって、対象の組織におけるＴｆＲの発現に基づいて、本明細書に記載されるペプチドのいずれかを含む組成物または本明細書に記載される医薬組成物のいずれかのある量を対象に投与することを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、ペプチドコンストラクトは、ニューロテンシン受容体に結合し、活性化することが可能である。いくつかの態様において、方法は、ペプチドの対象への投与により、疼痛のレベルを低減することを更に含む。いくつかの態様において、投与は、吸入、鼻腔内投与、経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、髄腔内投与、またはこれらの組み合わせである。いくつかの態様において、組成物は、ボーラス、注入、または持続注入として、静脈内投与される。

いくつかの態様において、方法は、統合失調症、薬物乱用、パーキンソン病、高血圧、摂食障害、脳卒中、アルツハイマー病、がん、炎症、疼痛、てんかん、気分障害、または内分泌障害の患者にペプチドを投与することを更に含む。いくつかの態様において、対象は、がんを有する。いくつかの態様において、対象は、ＣＮＳの疾患を有する。いくつかの態様において、対象は、神経障害性疼痛、片頭痛、不安、またはてんかんを有する。

様々な態様において、本開示は、請求項１～５３のいずれか１項に記載の組成物または請求項５４に記載の医薬組成物を細胞層を越えて輸送するための方法であって、組成物と細胞層を接触させることと、組成物を細胞層を越えて輸送することとを含む、方法を提供する。

様々な態様において、本開示は、状態を治療することを、それを必要とする対象に行う方法であって、請求項１～５３のいずれか１項に記載の組成物または請求項５４に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、輸送することは、組成物のＴｆＲへの結合を含む。いくつかの態様において、輸送することは、トランスサイトーシスを更に含む。いくつかの態様において、トランスサイトーシスは、小胞性トランスサイトーシスである。いくつかの態様において、トランスサイトーシスは、ＴｆＲ媒介性である。いくつかの態様において、輸送することは、組成物のＴｆＲからの解離を更に含む。いくつかの態様において、輸送することは、組成物から活性薬剤を放出することを更に含む。

様々な態様において、本開示は、ＴｆＲ結合ペプチドを設計するための方法であって、ａ）コンピュータープログラムを使用して、安定性及びフォールディングが最適化されたペプチドをペプチドのライブラリーから特定することであって、ペプチドのライブラリーの各ペプチドは、少なくとも３つの分子内ジスルフィド結合を含む、特定することと、ｂ）コンピュータープログラムを使用して、ペプチド：ＴｆＲ複合体の結合パッチのアミノ酸残基を重ね合わせ、結合パッチをペプチド上にグラフトした後、ＴｆＲに結合する安定なペプチドを決定することと、ｃ）結合パッチをペプチド上にグラフトして、安定なペプチドを生成することとを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、方法は、部位飽和変異導入を実施して、安定なペプチドよりもＴｆＲに対する結合親和性が高い変異ペプチドを得ることを更に含む。いくつかの態様において、ペプチドのライブラリーのペプチドは、２０～７５アミノ酸残基長である。

様々な態様において、本開示は、組成物であって、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、またはそのバリアント、ホモログ、フラグメント、もしくはアナログに結合することが可能な非天然ペプチドを含む組成物を提供する。

様々な態様において、本開示は、組成物であって、ペプチドコンストラクトを含む組成物であり、ここで、ペプチドコンストラクトは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、またはそのバリアント、ホモログ、フラグメント、もしくはアナログに結合することが可能なペプチドと、活性薬剤とを含み、ペプチドは、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される、組成物を提供する。

いくつかの態様において、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は、ヒトトランスフェリン受容体、またはマウストランスフェリン受容体、またはヒトトランスフェリン受容体及びマウストランスフェリン受容体である。

様々な態様において、本開示は、組成物であって、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つと、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するペプチド、またはそのバリアントもしくは機能性フラグメントを含む組成物を提供する。

いくつかの態様において、ペプチドは、内皮細胞を含む細胞層を透過する。いくつかの態様において、ペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）を含む細胞層を透過する。いくつかの態様において、ペプチドは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスを介して、内皮細胞を含む細胞層を透過する。いくつかの態様において、ペプチドは、膜を透過し、膜は、細胞の膜である。いくつかの態様において、細胞は、ＴｆＲを発現する。いくつかの態様において、ペプチドは、ＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して細胞の膜を透過する。いくつかの態様において、ペプチドは、ＴｆＲを発現する任意の細胞内または細胞とともに局在することが可能である。いくつかの態様において、ペプチドは、ＴｆＲを発現する細胞表面膜に結合した状態を保つ。いくつかの態様において、ペプチドは、ＴｆＲに結合することによって、細胞中に内在化する。いくつかの態様において、ペプチドは、ＴｆＲに結合し、次いで、解離することによって、血液脳関門を越えてＣＮＳに送達される。いくつかの態様において、ペプチドは、受容体媒介性トランスサイトーシスによって血液脳関門を越えて送達される。

いくつかの態様において、細胞は、ＣＮＳ細胞、赤血球、赤血球前駆細胞、免疫細胞、幹細胞、筋細胞、脳細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、骨髄細胞、虫垂細胞、リンパ節細胞、扁桃腺細胞、脾細胞、筋細胞、肝細胞、胆嚢細胞、膵細胞、消化管の細胞、腺細胞、腎細胞、膀胱細胞、内皮細胞、上皮細胞、脈絡叢上皮細胞、グリア細胞、星状膠細胞、または神経系に関連する細胞である。

いくつかの態様において、細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの態様において、腫瘍細胞は、卵巣癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、骨もしくは骨髄に位置する癌細胞、膠芽腫細胞、星細胞腫細胞、神経膠腫細胞、髄芽腫細胞、上衣腫細胞、脈絡叢癌細胞、正中膠腫細胞、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）細胞、乳癌細胞、肝癌細胞、結腸癌細胞、脳癌細胞、脾癌細胞、唾液腺の癌細胞、腎癌細胞、筋肉癌細胞、骨髄細胞癌細胞、皮膚癌細胞、泌尿生殖器癌細胞、骨肉腫細胞、筋肉由来肉腫細胞、黒色腫細胞、頭頸部癌細胞、神経芽細胞腫細胞、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、急性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性リンパ性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞、ホジキンリンパ腫細胞、非ホジキンリンパ腫細胞、またはＣＭＹＣ過剰発現癌細胞である。いくつかの態様において、ペプチドは、器官または組織に局在する。

いくつかの態様において、器官または組織は、脳、甲状腺、副甲状腺、副腎、骨髄、虫垂、リンパ節、扁桃腺、脾臓、筋肉、肝臓、胆嚢、膵臓、消化管、腎臓、膀胱、卵管、乳房、膣、子宮頸、子宮内膜、卵巣、胎盤、及び皮膚である。いくつかの態様において、ペプチドが局在する細胞または器官は、ＴｆＲを過剰発現している。いくつかの態様において、ペプチドは、器官の実質に局在する。

いくつかの態様において、ペプチドは、ヒトＴｆＲ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０２７８６）の配列番号３６３（ＭＭＤＱＡＲＳＡＦＳＮＬＦＧＧＥＰＬＳＹＴＲＦＳＬＡＲＱＶＤＧＤＮＳＨＶＥＭＫＬＡＶＤＥＥＥＮＡＤＮＮＴＫＡＮＶＴＫＰＫＲＣＳＧＳＩＣＹＧＴＩＡＶＩＶＦＦＬＩＧＦＭＩＧＹＬＧＹＣＫＧＶＥＰＫＴＥＣＥＲＬＡＧＴＥＳＰＶＲＥＥＰＧＥＤＦＰＡＡＲＲＬＹＷＤＤＬＫＲＫＬＳＥＫＬＤＳＴＤＦＴＧＴＩＫＬＬＮＥＮＳＹＶＰＲＥＡＧＳＱＫＤＥＮＬＡＬＹＶＥＮＱＦＲＥＦＫＬＳＫＶＷＲＤＱＨＦＶＫＩＱＶＫＤＳＡＱＮＳＶＩＩＶＤＫＮＧＲＬＶＹＬＶＥＮＰＧＧＹＶＡＹＳＫＡＡＴＶＴＧＫＬＶＨＡＮＦＧＴＫＫＤＦＥＤＬＹＴＰＶＮＧＳＩＶＩＶＲＡＧＫＩＴＦＡＥＫＶＡＮＡＥＳＬＮＡＩＧＶＬＩＹＭＤＱＴＫＦＰＩＶＮＡＥＬＳＦＦＧＨＡＨＬＧＴＧＤＰＹＴＰＧＦＰＳＦＮＨＴＱＦＰＰＳＲＳＳＧＬＰＮＩＰＶＱＴＩＳＲＡＡＡＥＫＬＦＧＮＭＥＧＤＣＰＳＤＷＫＴＤＳＴＣＲＭＶＴＳＥＳＫＮＶＫＬＴＶＳＮＶＬＫＥＩＫＩＬＮＩＦＧＶＩＫＧＦＶＥＰＤＨＹＶＶＶＧＡＱＲＤＡＷＧＰＧＡＡＫＳＧＶＧＴＡＬＬＬＫＬＡＱＭＦＳＤＭＶＬＫＤＧＦＱＰＳＲＳＩＩＦＡＳＷＳＡＧＤＦＧＳＶＧＡＴＥＷＬＥＧＹＬＳＳＬＨＬＫＡＦＴＹＩＮＬＤＫＡＶＬＧＴＳＮＦＫＶＳＡＳＰＬＬＹＴＬＩＥＫＴＭＱＮＶＫＨＰＶＴＧＱＦＬＹＱＤＳＮＷＡＳＫＶＥＫＬＴＬＤＮＡＡＦＰＦＬＡＹＳＧＩＰＡＶＳＦＣＦＣＥＤＴＤＹＰＹＬＧＴＴＭＤＴＹＫＥＬＩＥＲＩＰＥＬＮＫＶＡＲＡＡＡＥＶＡＧＱＦＶＩＫＬＴＨＤＶＥＬＮＬＤＹＥＲＹＮＳＱＬＬＳＦＶＲＤＬＮＱＹＲＡＤＩＫＥＭＧＬＳＬＱＷＬＹＳＡＲＧＤＦＦＲＡＴＳＲＬＴＴＤＦＧＮＡＥＫＴＤＲＦＶＭＫＫＬＮＤＲＶＭＲＶＥＹＨＦＬＳＰＹＶＳＰＫＥＳＰＦＲＨＶＦＷＧＳＧＳＨＴＬＰＡＬＬＥＮＬＫＬＲＫＱＮＮＧＡＦＮＥＴＬＦＲＮＱＬＡＬＡＴＷＴＩＱＧＡＡＮＡＬＳＧＤＶＷＤＩＤＮＥＦ）に対応する残基５０６～５１０、５２３～５３１、または６１１～６６２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号２０６～配列番号２２４及び配列番号３３４～配列番号３４４を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、及びＱ５１に対応する表面界面残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、位置３、４、９、１１、１５、１６、１９、２３、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、及び４０のいずれか１つに対応する親水性表面遠位残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの態様において、親水性表面遠位残基は、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、及びＤ４０に対応する親水性表面遠位残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、１５、３５、３９、もしくは４９のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに対応する位置に親水性残基を含む。

いくつかの態様において、親水性残基は、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、及びＨ４９に対応する親水性残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、１１、２５、もしくは２７、またはこれらの任意の組み合わせに対応する位置に疎水性残基を含む。いくつかの態様において、疎水性残基は、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、もしくはＹ、またはこれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｍ１１、Ｍ２５、Ｍ２７に対応する疎水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、位置４５に対応する脂肪族残基を含む。いくつかの態様において、脂肪族残基は、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから選択される。

いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｌ４５に対応する脂肪族残基を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも５つのジスルフィド結合を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、３つのジスルフィド結合を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも２つ、少なくとも４つ、または少なくとも６つのシステイン残基を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、６つのシステイン残基を含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｃ６、Ｃ１０、Ｃ２０、Ｃ３４、Ｃ４４、及びＣ４８、またはこれらの任意の組み合わせに対応する位置にシステイン残基を含む。いくつかの態様において、ペプチドの少なくとも１つのシステイン残基は、ジスルフィド結合に関与する。いくつかの態様において、６つのシステイン残基は、ジスルフィド結合に関与する。いくつかの態様において、ジスルフィド結合は、ペプチドの安定性を高める。

いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つの配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号１に示される配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号４に示される配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３０に示される配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２に示される配列を含む。

いくつかの態様において、３つのジスルフィド結合を含むペプチドは、システイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）に由来する。いくつかの態様において、３つのジスルフィド結合を含むペプチドは、ＣＤＰである。いくつかの態様において、ペプチドは、トランスフェリン、またはそのホモログ、バリアント、もしくはフラグメントと、ＴｆＲへの結合について、競合する。いくつかの態様において、ペプチドは、ＴｆＲを隔離するか、または別のタンパク質がＴｆＲに結合するのを妨げる。いくつかの態様において、ペプチドは、トランスフェリン、またはその内因性誘導体と比較して、ＴｆＲに対して同等またはそれより大きい親和性または特異性を有する。いくつかの態様において、ペプチドは、トランスフェリン、またはその内因性誘導体と比較して、ＴｆＲに対して同等またはそれより小さい解離定数を有する。更なる態様では、ペプチドは、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満または０．１ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する。いくつかの態様において、ペプチドは、標的細胞を透過するか、または標的細胞内に局在する。

いくつかの態様において、ペプチドは、細胞透過部分と更に製剤化、融合、またはコンジュゲートされる。いくつかの態様において、細胞透過部分は、ポリカチオン、ポリ有機酸、エンドソーム放出ポリマー、ポリ（２－プロピルアクリル酸）、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｔａｔペプチド、Ａｒｇパッチ、ノットペプチド、ＣｙｓＴＡＴ、Ｓ１９－ＴＡＴ、Ｒ８（配列番号７３）、ｐＡｎｔｐ、Ｐａｓ－ＴＡＴ、Ｐａｓ－Ｒ８（配列番号７６）、Ｐａｓ－ＦＨＶ、Ｐａｓ－ｐＡｎｔＰ、Ｆ２Ｒ４（配列番号７９）、Ｂ５５、アウリン、ＩＭＴ－Ｐ８、ＢＲ２、ＯＭＯＴＡＧ１、ＯＭＯＴＡＧ２、ｐＶＥＣ、ＳｙｎＢ３、ＤＰＶ１０４７、Ｃ１０５Ｙ、トランスポータン、ＭＴＳ、ｈＬＦ、ＰＦＶＹＬＩ（配列番号９３）、マウロカルシン、インペラトキシン、ハドルカリン、ヘミカルシン、オピカルシン－１、オピカルシン－２、ミッドカイン（６２－１０４）、ＭＣｏＴＩ－ＩＩ、クロロトキシン、ＤＲＩ－ＴＡＴ、ｃＦΦＲ_４（配列番号９６）、ミリステート、ｙＢＢＲ、またはそのフラグメントもしくはバリアント、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、細胞透過部分は、マウロカルシン、インペラトキシン、ハドルカルシン、ヘミカルシン、オピカルシン－１、オピカルシン－２、ミッドカイン（６２－１０４）、ＭＣｏＴＩ－ＩＩ、またはクロロトキシンである。

いくつかの態様において、ペプチドは、組織または細胞を標的とするか、ホーミングするか、蓄積するか、または選択的に透過する。いくつかの態様において、ペプチドは、標的細胞の核内に局在する。いくつかの態様において、ペプチドは、シグナルペプチドまたは部分との製剤化、融合、またはコンジュゲーションによって、標的細胞の核内に局在する。いくつかの態様において、ペプチドは、がん性組織またはがん細胞を標的とするか、ホーミングするか、蓄積するか、または選択的に透過する部分または第２のペプチドに更にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。いくつかの態様において、部分または第２のペプチドは、ノットペプチドまたはそのバリアントもしくはフラグメントである。いくつかの態様において、標的細胞は、がん性細胞または腫瘍細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は、ＣＮＳ細胞、赤血球、赤血球前駆細胞、免疫細胞、幹細胞、筋細胞、脳細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、骨髄細胞、虫垂細胞、リンパ節細胞、扁桃腺細胞、脾細胞、筋細胞、肝細胞、胆嚢細胞、膵細胞、消化管の細胞、腺細胞、腎細胞、膀胱細胞、内皮細胞、上皮細胞、脈絡叢上皮細胞、グリア細胞、星状膠細胞、または神経系に関連する細胞である。

いくつかの態様において、ペプチドは、ジスルフィドノットを介したジスルフィドを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、システイン残基間に形成される３つ以上のジスルフィド架橋を含み、ジスルフィド架橋のうちの１つは、他の２つのジスルフィド架橋によって形成されるループを通過する。いくつかの態様において、ペプチドは、ジスルフィド結合もジスルフィドノットも含まない。いくつかの態様において、ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｌ立体配置であるか、少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｄ立体配置である。

いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の正電荷残基を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の連続した正電荷残基を含む。いくつかの態様において、正電荷残基は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様において、ペプチドは、Ａｒｇパッチを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、Ｎ末端に２つ以上の連続したＡｒｇ残基を含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、Ｔａｔペプチド、またはそのフラグメントを含む。いくつかの態様において、Ｔａｔペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９９）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１００）の配列、またはそのフラグメントもしくはバリアントを含む。いくつかの態様において、Ｔａｔペプチドは、（ＧＳ）_ｘ（配列番号１０５）またはＧ_ｘＳ_ｙ（配列番号１０４）の配列を有するリンカー（配列中、ｘ及びｙは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）を使用して、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加される。いくつかの態様において、Ｔａｔペプチドは、ペプチドの任意の残基に付加される。

いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６のシステイン残基を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、負電荷残基の１つ以上の領域を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、正電荷残基の１つ以上の領域を含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、ヒトタンパク質またはヒトペプチドを含むか、またはそれに由来する。いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも１つの他のペプチドとの多量体構造に配置される。いくつかの態様において、多量体構造は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、または七量体を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、約３．０～約１０．０の範囲内の等電点を有する。いくつかの態様において、ペプチドは、約４．５～約８．９の範囲内の等電点を有する。いくつかの態様において、ペプチドは、不均一な電荷分布を有する。いくつかの態様において、ペプチドは、生理学的または細胞内のｐＨ値で安定である。

いくつかの態様において、ペプチドは、約７または７．５のｐＨで安定である。いくつかの態様において、ペプチドは、約６．５～７．５のｐＨで安定である。いくつかの態様において、ペプチドは、約５．０以下、約３．０以下、または約３．０～約５．０の範囲内のｐＨ値で安定である。いくつかの態様において、ペプチドは、約５．０～約７．０の範囲内のｐＨ値で安定である。いくつかの態様において、ペプチドは、疎水性コアを含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、プロテアーゼ分解に耐性がある。いくつかの態様において、プロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、血清プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼのいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様において、ペプチドは、還元に耐性があるか、または還元環境で安定である。いくつかの態様において、還元または還元環境は、ＤＴＴまたはＧＳＨを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、高温で安定である。いくつかの態様において、ペプチドは、抗がん作用を示す。いくつかの態様において、ペプチドは、１つ以上の化学修飾を含む。いくつかの態様において、化学修飾は、ペプチドの１つ以上の薬物動態特性を変更する。いくつかの態様において、化学修飾は、ペプチドの血漿半減期及び／または生物学的半減期を延長する。

いくつかの態様において、化学修飾は、ペプチドのＮ末端をブロッキングすることである。いくつかの態様において、化学修飾は、メチル化、アセチル化、またはアシル化である。いくつかの態様において、化学修飾は、１つ以上のリシン残基もしくはそのアナログのメチル化；Ｎ末端のメチル化；または１つ以上のリシン残基もしくはそのアナログのメチル化及びＮ末端のメチル化である。いくつかの態様において、ペプチドは、アシル付加物に連結される。いくつかの態様において、ペプチドに活性配列がグラフトされるか、または、ペプチドが、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、もしくは融合されるか、もしくはグラフトされて、ペプチドコンストラクトがもたらされる。

いくつかの態様において、ペプチドコンストラクトは、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、及び配列番号３５９～配列番号３６１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、ペプチドコンストラクトは、配列番号３５９、配列番号３６０、または配列番号３６１である。いくつかの態様において、活性薬剤は、ペプチドにペプチドのＮ末端またはＣ末端で、コンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。いくつかの態様において、活性薬剤は、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ、一本鎖Ｆｖ、ポリペプチド、ペプチド、小分子、または核酸である。

いくつかの態様において、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの態様において、核酸は、ＲＮＡである。いくつかの態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の活性薬剤は、リンカーによってペプチドに連結される。いくつかの態様において、ペプチドは、切断可能なリンカーまたはｐＨ感受性リンカーを介して、活性薬剤に連結される。いくつかの態様において、ペプチドは、リンカーによって、ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のイプシロンアミンで、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、またはＣ末端で、活性薬剤に連結される。いくつかの態様において、組成物は、非天然アミノ酸を更に含み、ここで、非天然アミノ酸は、挿入、付加、または別のアミノ酸との置換である。いくつかの態様において、ペプチドは、リンカーによって、非天然アミノ酸で活性薬剤に連結される。いくつかの態様において、リンカーは、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、トリアゾール、大環状高分子、オキシム結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、アゾ結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、炭素－炭素単結合、二重結合、もしくは三重結合、ジスルフィド結合、２つのシステイン間の２つの炭素架橋、２つのシステイン間の３つの炭素架橋、または炭素－窒素結合を含む。

いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、プロテアーゼの切断部位を含む。いくつかの態様において、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ、トロンビン、カテプシン、またはベータ－グルクロニダーゼである。いくつかの態様において、リンカーは、加水分解的に不安定なリンカーである。いくつかの態様において、ペプチドは、切断不能なリンカーを介して、活性薬剤に連結される。いくつかの態様において、活性薬剤は、リンカーを介して連結され、ここで、リンカーは、表４から選択される。いくつかの態様において、活性薬剤は、抗がん剤である。いくつかの態様において、活性薬剤は、免疫治療薬、ＣＴＬＡ－４標的薬剤、ＰＤ－１標的薬剤、ＰＤＬ－１標的薬剤、ＩＬ１５薬剤、融合されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合薬剤、ＩＦＮガンマ薬剤、抗ＣＤ３薬剤、イオンチャネル調節剤、Ｋｖ１．３阻害薬、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアミシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ－３８、ＢＡＣＥ阻害薬、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害薬、ＷＥＨＩ－５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ－１９９、ナビトクラックス、ＡＴ－１０１、オバトクラックス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体、ドラスタチン、または神経伝達物質である。

いくつかの態様において、神経伝達物質は、ニューロテンシン、ニューロテンシンペプチドバリアント、またはその機能性フラグメントである。いくつかの態様において、機能性フラグメントは、少なくとも少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも６アミノ酸残基、少なくとも７アミノ酸残基、少なくとも８アミノ酸残基、少なくとも９アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１１アミノ酸残基、少なくとも１２アミノ酸残基である。

いくつかの態様において、ニューロテンシンペプチドバリアントは、配列番号３６５～配列番号３６９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、ニューロテンシンは、配列番号３５０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、ペプチドコンストラクトは、ニューロテンシン受容体に結合し、活性化することが可能である。いくつかの態様において、ペプチドは、対象の疼痛のレベルを低減することが可能である。いくつかの態様において、ペプチドは、統合失調症、薬物乱用、パーキンソン病、高血圧、摂食障害、脳卒中、アルツハイマー病、がん、炎症、または内分泌障害の患者に投与される。いくつかの態様において、ペプチドは、ドーパミンシグナル伝達ニューロンと相互作用する。いくつかの態様において、ペプチドは、ニューロンにおけるドーパミン放出を増加させる。いくつかの態様において、組成物は、ペプチドに結合された半減期改変剤を更に含む。いくつかの態様において、半減期改変剤は、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、双極性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含有する水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸、またはアルブミンに結合する分子を含む。

いくつかの態様において、組成物は、リンカーによってペプチドに結合された検出可能な剤を更に含む。いくつかの態様において、検出可能な剤は、ペプチドにペプチドのＮ末端またはＣ末端で、コンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。いくつかの態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の検出可能な剤は、ペプチドに連結される。いくつかの態様において、ペプチドは、切断可能なリンカーを介して、検出可能な剤に連結される。いくつかの態様において、ペプチドは、リンカーによって、ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のイプシロンアミンで、またはＣ末端で、検出可能な剤に連結される。いくつかの態様において、組成物は、非天然アミノ酸を更に含み、ここで、非天然アミノ酸は、挿入、付加、または別のアミノ酸との置換である。いくつかの態様において、ペプチドは、リンカーによって、非天然アミノ酸で検出可能な剤に連結される。いくつかの態様において、リンカーは、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、トリアゾール、大環状高分子、オキシム結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、アゾ結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、炭素－炭素単結合、二重結合、もしくは三重結合、ジスルフィド結合、２つのシステイン間の２つの炭素架橋、２つのシステイン間の３つの炭素架橋、または炭素－窒素結合を含む。いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ、トロンビン、カテプシン、またはベータ－グルクロニダーゼの切断部位を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、安定なリンカーを介して、検出可能な剤に連結される。いくつかの態様において、検出可能な剤は、リンカーを介して連結され、ここで、リンカーは、表４から選択される。

いくつかの態様において、検出可能な剤は、フルオロフォア、近赤外色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性核種、または放射性核種キレート剤である。いくつかの態様において、検出可能な剤は、蛍光色素である。

様々な態様において、本開示は、本明細書で開示される組成物のいずれか、またはその塩と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。

いくつかの態様において、医薬組成物は、対象への投与のために製剤化される。いくつかの態様において、医薬組成物は、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、またはこれらの組み合わせのために製剤化される。

様々な態様において、本開示は、組成物を細胞層を越えて輸送するための方法であって、組成物と細胞層を接触させることと、組成物を細胞層を越えて輸送することとを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、組成物は、ペプチドを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号２０６～配列番号２２４及び配列番号３３４～配列番号３４４のいずれか１つを含むアミノ酸配列、またはその機能性フラグメントを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合することが可能である。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、及びＱ５１に対応する表面界面残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、３、４、９、１１、１５、１６、１９、２３、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、及び４０に対応する１つの位置、またはこれらの任意の組み合わせに、親水性表面遠位残基を含む。いくつかの態様において、親水性表面遠位残基は、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、及びＤ４０に対応する親水性表面遠位残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、１５、３５、３９、もしくは４９に対応する位置のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに、親水性残基を含む。

いくつかの態様において、親水性残基は、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、及びＨ４９に対応する親水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、１１、２５、もしくは２７に対応する位置のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせに、疎水性残基を含む。いくつかの態様において、疎水性残基は、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、もしくはＹ、またはこれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｍ１１、Ｍ２５、Ｍ２７に対応する疎水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、位置４５に対応する脂肪族残基を含む。いくつかの態様において、脂肪族残基は、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｌ４５に対応する脂肪族残基を含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも５つのジスルフィド結合を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つの配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、標的細胞を透過するか、または標的細胞内もしくは標的細胞上に局在する。いくつかの態様において、ペプチドに活性配列がグラフトされるか、または、ペプチドが、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、もしくは融合されるか、もしくはグラフトされて、ペプチドコンストラクトがもたらされる。

いくつかの態様において、ペプチドは、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。いくつかの態様において、活性薬剤は、リンカーを介して連結され、ここで、リンカーは、表４から選択される。いくつかの態様において、活性薬剤は、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ、一本鎖Ｆｖ、ポリペプチド、ペプチド、小分子、または核酸である。いくつかの態様において、ペプチドコンストラクトは、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、及び配列番号３５９～配列番号３６１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、ペプチドコンストラクトは、配列番号３５９、配列番号３６０、または配列番号３６１である。

いくつかの態様において、活性薬剤は、免疫治療薬、ＣＴＬＡ－４標的薬剤、ＰＤ－１標的薬剤、ＰＤＬ－１標的薬剤、ＩＬ１５薬剤、融合されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合薬剤、ＩＦＮガンマ薬剤、抗ＣＤ３薬剤、イオンチャネル調節剤、Ｋｖ１．３阻害薬、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアミシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ－３８、ＢＡＣＥ阻害薬、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害薬、ＷＥＨＩ－５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ－１９９、ナビトクラックス、ＡＴ－１０１、オバトクラックス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体、ドラスタチン、または神経伝達物質である。いくつかの態様において、神経伝達物質は、ニューロテンシン、ニューロテンシンペプチドバリアント、またはその機能性フラグメントである。

いくつかの態様において、機能性フラグメントは、少なくとも少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも６アミノ酸残基、少なくとも７アミノ酸残基、少なくとも８アミノ酸残基、少なくとも９アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１１アミノ酸残基、少なくとも１２アミノ酸残基である。いくつかの態様において、ニューロテンシンペプチドバリアントは、配列番号３６５～配列番号３６９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、ニューロテンシンは、配列番号３５０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。

いくつかの態様において、ペプチドコンストラクトは、ニューロテンシン受容体に結合し、活性化することが可能である。いくつかの態様において、ペプチドは、対象への投与により、疼痛のレベルを低減することが可能である。いくつかの態様において、ペプチドは、統合失調症、薬物乱用、パーキンソン病、高血圧、摂食障害、脳卒中、アルツハイマー病、がん、炎症、または内分泌障害の患者に投与される。いくつかの態様において、ペプチドは、ドーパミンシグナル伝達ニューロンと相互作用する。いくつかの態様において、ペプチドは、ニューロンにおけるドーパミン放出を増加させる。いくつかの態様において、ペプチドは、細胞透過部分と更に製剤化、融合、またはコンジュゲートされる。いくつかの態様において、細胞層は、内皮細胞層または上皮細胞層である。いくつかの態様において、内皮細胞層は、血液脳関門である。いくつかの態様において、内皮細胞層は、腸管内皮細胞層である。いくつかの態様において、上皮細胞層は、腸管上皮細胞層である。いくつかの態様において、輸送することは、組成物のＴｆＲへの結合を含む。いくつかの態様において、輸送することは、トランスサイトーシスを更に含む。いくつかの態様において、トランスサイトーシスは、小胞性トランスサイトーシスである。いくつかの態様において、トランスサイトーシスは、ＴｆＲ媒介性である。いくつかの態様において、輸送することは、組成物のＴｆＲからの解離を更に含む。

様々な態様において、本開示は、状態を治療することを、それを必要とする対象に行うための方法であって、対象に組成物を投与することと、組成物を細胞層を越えて輸送することとを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、組成物は、ペプチドを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号２０６～配列番号２２４及び配列番号３３４～配列番号３４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合することが可能である。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、及びＱ５１に対応する表面界面残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、３、４、９、１１、１５、１６、１９、２３、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、及び４０に対応する位置のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに、親水性表面遠位残基を含む。いくつかの態様において、親水性表面遠位残基は、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、及びＤ４０に対応する親水性表面遠位残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、１５、３５、３９、もしくは４９に対応する位置のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに、親水性残基を含む。いくつかの態様において、親水性残基は、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、及びＨ４９に対応する親水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、１１、２５、もしくは２７に対応する位置のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせに、疎水性残基を含む。いくつかの態様において、疎水性残基は、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、もしくはＹ、またはこれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｍ１１、Ｍ２５、Ｍ２７に対応する疎水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、位置４５に対応する脂肪族残基を含む。いくつかの態様において、脂肪族残基は、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｌ４５に対応する脂肪族残基を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも５つのジスルフィド結合を含む。

いくつかの態様において、ペプチドは、標的細胞を透過するか、または標的細胞内に局在する。いくつかの態様において、ペプチドに活性配列がグラフトされるか、または、ペプチドが、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、もしくは融合されるか、もしくはグラフトされて、ペプチドコンストラクトがもたらされる。いくつかの態様において、ペプチドは、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。いくつかの態様において、活性薬剤は、リンカーを介して連結され、ここで、リンカーは、表４から選択される。

いくつかの態様において、活性薬剤は、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ、一本鎖Ｆｖ、ポリペプチド、ペプチド、小分子、または核酸である。いくつかの態様において、ペプチドコンストラクトは、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、及び配列番号３５９～配列番号３６１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、ペプチドコンストラクトは、配列番号３５９、配列番号３６０、または配列番号３６１である。

いくつかの態様において、活性薬剤は、免疫治療薬、ＣＴＬＡ－４標的薬剤、ＰＤ－１標的薬剤、ＰＤＬ－１標的薬剤、ＩＬ１５薬剤、融合されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合薬剤、ＩＦＮガンマ薬剤、抗ＣＤ３薬剤、イオンチャネル調節剤、Ｋｖ１．３阻害薬、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアミシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ－３８、ＢＡＣＥ阻害薬、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害薬、ＷＥＨＩ－５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ－１９９、ナビトクラックス、ＡＴ－１０１、オバトクラックス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体、ドラスタチン、または神経伝達物質である。

いくつかの態様において、神経伝達物質は、ニューロテンシン、ニューロテンシンペプチドバリアント、またはその機能性フラグメントである。いくつかの態様において、機能性フラグメントは、少なくとも少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも６アミノ酸残基、少なくとも７アミノ酸残基、少なくとも８アミノ酸残基、少なくとも９アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１１アミノ酸残基、少なくとも１２アミノ酸残基である。いくつかの態様において、ニューロテンシンペプチドバリアントは、配列番号３６５～配列番号３６９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、ニューロテンシンは、配列番号３５０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。

いくつかの態様において、ペプチドコンストラクトは、ニューロテンシン受容体に結合し、活性化することが可能である。いくつかの態様において、ペプチドは、対象への投与により、疼痛のレベルを低減することが可能である。いくつかの態様において、ペプチドは、統合失調症、薬物乱用、パーキンソン病、高血圧、摂食障害、脳卒中、アルツハイマー病、がん、炎症、または内分泌障害の患者に投与される。いくつかの態様において、ペプチドは、ドーパミンシグナル伝達ニューロンと相互作用する。いくつかの態様において、ペプチドは、ニューロンにおけるドーパミン放出を増加させる。いくつかの態様において、ペプチドは、細胞透過部分と更に製剤化、融合、またはコンジュゲートされる。いくつかの態様において、細胞層は、内皮細胞層または上皮細胞層である。いくつかの態様において、内皮細胞層は、血液脳関門である。

いくつかの態様において、内皮細胞層は、腸管内皮細胞層である。いくつかの態様において、上皮細胞層は、腸管上皮細胞層である。いくつかの態様において、輸送することは、組成物のＴｆＲへの結合を含む。いくつかの態様において、輸送することは、トランスサイトーシスを更に含む。いくつかの態様において、トランスサイトーシスは、小胞性トランスサイトーシスである。いくつかの態様において、トランスサイトーシスは、ＴｆＲ媒介性である。いくつかの態様において、輸送することは、組成物のＴｆＲからの解離を更に含む。いくつかの態様において、輸送することは、組成物から活性薬剤を放出することを更に含む。

様々な態様において、本開示は、状態を治療することを、それを必要とする対象に行う方法であって、対象におけるＴｆＲの発現に基づいて、ある量の組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、組成物は、ペプチドを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号２０６～配列番号２２４及び配列番号３３４～配列番号３４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合することが可能である。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、及びＱ５１に対応する表面界面残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、３、４、９、１１、１５、１６、１９、２３、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、及び４０に対応する位置のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに、親水性表面遠位残基を含む。いくつかの態様において、親水性表面遠位残基は、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、及びＤ４０に対応する親水性表面遠位残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、１５、３５、３９、もしくは４９に対応する位置のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに、親水性残基を含む。いくつかの態様において、親水性残基は、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、及びＨ４９に対応する親水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、１１、２５、もしくは２７に対応する位置のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせに、疎水性残基を含む。

いくつかの態様において、疎水性残基は、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、もしくはＹ、またはこれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｍ１１、Ｍ２５、Ｍ２７に対応する疎水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、位置４５に対応する脂肪族残基を含む。いくつかの態様において、脂肪族残基は、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｌ４５に対応する脂肪族残基を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも５つのジスルフィド結合を含む。

いくつかの態様において、ペプチドコンストラクトは、ニューロテンシン受容体に結合し、活性化することが可能である。いくつかの態様において、ペプチドは、対象への投与により、疼痛のレベルを低減することが可能である。いくつかの態様において、ペプチドは、統合失調症、薬物乱用、パーキンソン病、高血圧、摂食障害、脳卒中、アルツハイマー病、がん、炎症、または内分泌障害の患者に投与される。いくつかの態様において、ペプチドは、ドーパミンシグナル伝達ニューロンと相互作用する。いくつかの態様において、ペプチドは、ニューロンにおけるドーパミン放出を増加させる。いくつかの態様において、ペプチドは、細胞透過部分と更に製剤化、融合、またはコンジュゲートされる。いくつかの態様において、組成物は、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、髄腔内、またはこれらの組み合わせで投与される。

いくつかの態様において、組成物は、ボーラス、注入、または持続注入として、静脈内投与される。いくつかの態様において、組成物または医薬組成物は、１日に複数回、１日２回、１日１回、週２回、週３回、週１回、２週に１回、または月１回もしくは３ヶ月に１回投与される。いくつかの態様において、組成物は、１日１回、週１回、または月１回、皮下投与される。いくつかの態様において、状態は、がんである。

いくつかの態様において、がんは、卵巣癌、結腸癌、肺癌、骨もしくは骨髄に位置する癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、脾癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、骨髄細胞癌、皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはＣＭＹＣ過剰発現癌である。いくつかの態様において、状態は、脳癌である。いくつかの態様において、脳癌は、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、またはびまん性内在性橋膠腫である。

いくつかの態様において、状態は、ＣＮＳの疾患である。いくつかの態様において、ＣＮＳの疾患は、神経炎症性または神経変性疾患である。いくつかの態様において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、ライム病、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳失調症、バッテン病、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、クフォー・ラケブ症候群、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、慢性外傷性脳症、または前頭側頭型認知症である。いくつかの態様において、状態は、神経障害性疼痛、片頭痛、不安、またはてんかんである。いくつかの態様において、状態は、慢性疼痛、急性疼痛、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、アロディニア、幻痛、内臓痛、または突出痛である。

いくつかの態様において、状態は、慢性疼痛、急性疼痛、損傷、機械的疼痛、熱痛、冷痛、虚血痛、及び化学物質誘発性疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛症関連疼痛、関節炎疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後痛、外傷後痛、緊張型頭痛、産科疼痛、婦人科疼痛、または化学療法誘発性疼痛、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、アロディニア、幻痛、内臓痛、突出痛、家族性エピソード性疼痛症候群、発作性激痛症、先天性無痛覚症、オピオイド離脱関連疼痛である。いくつかの態様において、状態は、筋ジストロフィー、または球脊髄性筋ジストロフィー（ＳＢＭＡ）である。いくつかの態様において、状態は、炎症性腸疾患である。いくつかの態様において、炎症性腸疾患は、クローン病である。

様々な態様において、本開示は、本明細書で開示される組成物のいずれかを細胞層を越えて輸送するための方法であって、組成物と細胞層を接触させることと、組成物を細胞層を越えて輸送することとを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、細胞層は、内皮細胞層または上皮細胞層である。いくつかの態様において、内皮細胞層は、血液脳関門である。いくつかの態様において、内皮細胞層は、腸管内皮細胞層である。いくつかの態様において、上皮細胞層は、腸管上皮細胞層である。いくつかの態様において、輸送することは、組成物のＴｆＲへの結合を含む。いくつかの態様において、輸送することは、トランスサイトーシスを更に含む。いくつかの態様において、トランスサイトーシスは、小胞性トランスサイトーシスである。いくつかの態様において、トランスサイトーシスは、ＴｆＲ媒介性である。いくつかの態様において、輸送することは、組成物のＴｆＲからの解離を更に含む。いくつかの態様において、輸送することは、組成物から活性薬剤を放出することを更に含む。

様々な態様において、本開示は、状態を治療することを、それを必要とする対象に行うための方法であって、本明細書で開示される組成物のいずれかまたは本明細書で開示される医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、組成物は、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、髄腔内、またはこれらの組み合わせで投与される。いくつかの態様において、組成物は、ボーラス、注入、または持続注入として、静脈内投与される。いくつかの態様において、組成物または医薬組成物は、１日に複数回、１日２回、１日１回、週２回、週３回、週１回、２週に１回、または月１回もしくは３ヶ月に１回投与される。いくつかの態様において、組成物は、１日１回、週１回、または月１回、皮下投与される。いくつかの態様において、状態は、がんである。いくつかの態様において、がんは、卵巣癌、結腸癌、肺癌、骨もしくは骨髄に位置する癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、脾癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、骨髄細胞癌、皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはＣＭＹＣ過剰発現癌である。いくつかの態様において、状態は、脳癌である。

いくつかの態様において、脳癌は、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、またはびまん性内在性橋膠腫である。いくつかの態様において、状態は、ＣＮＳの疾患である。いくつかの態様において、ＣＮＳの状態は、神経炎症性または神経変性疾患である。いくつかの態様において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、ライム病、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳失調症、バッテン病、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、クフォー・ラケブ症候群、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、慢性外傷性脳症、または前頭側頭型認知症である。いくつかの態様において、状態は、神経障害性疼痛、片頭痛、不安、またはてんかんである。

いくつかの態様において、状態は、慢性疼痛、急性疼痛、損傷、機械的疼痛、熱痛、冷痛、虚血痛、及び化学物質誘発性疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛症関連疼痛、関節炎疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後痛、外傷後痛、緊張型頭痛、産科疼痛、婦人科疼痛、または化学療法誘発性疼痛、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、アロディニア、幻痛、内臓痛、突出痛、家族性エピソード性疼痛症候群、発作性激痛症、先天性無痛覚症、オピオイド離脱関連疼痛である。いくつかの態様において、状態は、筋ジストロフィー、または球脊髄性筋ジストロフィー（ＳＢＭＡ）である。

いくつかの態様において、状態は、炎症性腸疾患である。いくつかの態様において、炎症性腸疾患は、クローン病である。いくつかの態様において、方法は、組成物を細胞層を越えて輸送することを更に含む。いくつかの態様において、細胞層は、内皮細胞層または上皮細胞層である。いくつかの態様において、内皮細胞層は、血液脳関門である。いくつかの態様において、内皮細胞層は、腸管内皮細胞層である。

いくつかの態様において、上皮細胞層は、腸管上皮細胞層である。いくつかの態様において、輸送することは、組成物のＴｆＲへの結合を含む。いくつかの態様において、輸送することは、トランスサイトーシスを更に含む。いくつかの態様において、トランスサイトーシスは、小胞性トランスサイトーシスである。いくつかの態様において、トランスサイトーシスは、ＴｆＲ媒介性である。いくつかの態様において、輸送することは、組成物のＴｆＲからの解離を更に含む。いくつかの態様において、輸送することは、組成物から活性薬剤を放出することを更に含む。

様々な態様において、本開示は、状態を治療することを、それを必要とする対象に行うための方法であって、対象におけるＴｆＲの発現に依存するある量の本明細書で開示される組成物のいずれかまたは本明細書で開示される医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、組成物は、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、髄腔内、またはこれらの組み合わせで投与される。いくつかの態様において、組成物は、ボーラス、注入、または持続注入として、静脈内投与される。いくつかの態様において、組成物または医薬組成物は、１日に複数回、１日２回、１日１回、週２回、週３回、週１回、２週に１回、または月１回もしくは３ヶ月に１回投与される。いくつかの態様において、組成物は、１日１回、週１回、または月１回、皮下投与される。いくつかの態様において、状態は、がんである。

いくつかの態様において、状態は、ＣＮＳの疾患である。いくつかの態様において、ＣＮＳの疾患は、神経炎症性または神経変性疾患である。いくつかの態様において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、ライム病、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳失調症、バッテン病、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、クフォー・ラケブ症候群、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、慢性外傷性脳症、または前頭側頭型認知症である。

いくつかの態様において、状態は、神経障害性疼痛、片頭痛、不安、またはてんかんである。いくつかの態様において、状態は、慢性疼痛、急性疼痛、損傷、機械的疼痛、熱痛、冷痛、虚血痛、及び化学物質誘発性疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛症関連疼痛、関節炎疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後痛、外傷後痛、緊張型頭痛、産科疼痛、婦人科疼痛、または化学療法誘発性疼痛、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、アロディニア、幻痛、内臓痛、突出痛、家族性エピソード性疼痛症候群、発作性激痛症、先天性無痛覚症、オピオイド離脱関連疼痛である。いくつかの態様において、状態は、筋ジストロフィー、または球脊髄性筋ジストロフィー（ＳＢＭＡ）である。

いくつかの態様において、状態は、炎症性腸疾患である。いくつかの態様において、炎症性腸疾患は、クローン病である。いくつかの態様において、方法は、組成物を細胞層を越えて輸送することを更に含む。いくつかの態様において、細胞層は、内皮細胞層または上皮細胞層である。いくつかの態様において、内皮細胞層は、血液脳関門である。いくつかの態様において、内皮細胞層は、腸管内皮細胞層である。いくつかの態様において、上皮細胞層は、腸管上皮細胞層である。

様々な態様において、本開示は、ＴｆＲに結合可能なペプチドを設計するための方法であって、コンピュータープログラムを使用して、安定性及びフォールディングが最適化されたペプチドをペプチドのライブラリーから特定することであって、ペプチドのライブラリーの各ペプチドは、少なくとも３つの分子内ジスルフィド結合を含む、特定することと、コンピュータープログラムを使用して、ペプチド：ＴｆＲ複合体の結合パッチのアミノ酸残基を重ね合わせ、結合パッチをペプチド上にグラフトした後、ＴｆＲに結合する安定なペプチドを決定することと、結合パッチをペプチド上にグラフトして、安定なペプチドを生成することとを含む、方法を提供する。

様々な態様において、本開示は、本明細書で開示される組成物のいずれかを提供し、ここで、ニューロテンシンは、配列番号３５０、配列番号３６５～配列番号３７１のいずれか１つ、またはその機能性フラグメントを含む。

様々な態様において、本開示は、本明細書で開示される方法のいずれかを提供し、ここで、ニューロテンシンは、配列番号３５０、配列番号３６５～配列番号３７１のいずれか１つ、またはその機能性フラグメントを含む。

参照による援用
本明細書で言及される全ての公開物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の公開物、特許または特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、参照により本明細書に援用される。

本特許及び本出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または本特許出願公開の複写は、請求及び必要な手数料の支払に応じて特許庁より提供される。本発明の新しい特徴は、添付する特許請求の範囲に詳細に示される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって、本発明の特徴及び利点の更なる理解が得られるであろう。

ヒト可溶性トランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）エクトドメインタンパク質をクマシー染色したゲルと、プールされた高多様性ペプチドライブラリーに由来する、ｈＴｆＲエクトドメインに結合する細胞の連続的濃縮を示すフローサイトメトリープロットを示す。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）タンパク質のクマシー染色ゲルを示す。ヒト可溶性トランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）エクトドメインタンパク質をクマシー染色したゲルと、プールされた高多様性ペプチドライブラリーに由来する、ｈＴｆＲエクトドメインに結合する細胞の連続的濃縮を示すフローサイトメトリープロットを示す。１回のフローソーティング後における、ＴｆＲに結合する細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。ヒト可溶性トランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）エクトドメインタンパク質をクマシー染色したゲルと、プールされた高多様性ペプチドライブラリーに由来する、ｈＴｆＲエクトドメインに結合する細胞の連続的濃縮を示すフローサイトメトリープロットを示す。１回のフローソーティング後における、対照染色の細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。ヒト可溶性トランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）エクトドメインタンパク質をクマシー染色したゲルと、プールされた高多様性ペプチドライブラリーに由来する、ｈＴｆＲエクトドメインに結合する細胞の連続的濃縮を示すフローサイトメトリープロットを示す。２回のフローソーティング後における、ＴｆＲに結合する細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。ヒト可溶性トランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）エクトドメインタンパク質をクマシー染色したゲルと、プールされた高多様性ペプチドライブラリーに由来する、ｈＴｆＲエクトドメインに結合する細胞の連続的濃縮を示すフローサイトメトリープロットを示す。２回のフローソーティング後における、対照染色の細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。ヒト可溶性トランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）エクトドメインタンパク質をクマシー染色したゲルと、プールされた高多様性ペプチドライブラリーに由来する、ｈＴｆＲエクトドメインに結合する細胞の連続的濃縮を示すフローサイトメトリープロットを示す。３回のフローソーティング後における、ＴｆＲに結合する細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。ヒト可溶性トランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）エクトドメインタンパク質をクマシー染色したゲルと、プールされた高多様性ペプチドライブラリーに由来する、ｈＴｆＲエクトドメインに結合する細胞の連続的濃縮を示すフローサイトメトリープロットを示す。３回のフローソーティング後における、対照染色の細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。ＴｆＲ及び単一クローンペプチドを提示する細胞を示す。本実験に使用された対照タンパク質は、配列番号３３３（ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶＣＡＶＬＧＬＣＬＡＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＳＫＴＶＲＷＣＡＶＳＥＨＥＡＴＫＣＱＳＦＲＤＨＭＫＳＶＩＰＳＤＧＰＳＶＡＣＶＫＫＡＳＹＬＤＣＩＲＡＩＡＡＮＥＡＤＡＶＴＬＤＡＧＬＶＹＤＡＹＬＡＰＮＮＬＫＰＶＶＡＥＦＹＧＳＫＥＤＰＱＴＦＹＹＡＶＡＶＶＫＫＤＳＧＦＱＭＮＱＬＲＧＫＫＳＣＨＴＧＬＧＲＳＡＧＷＮＩＰＩＧＬＬＹＣＤＬＰＥＰＲＫＰＬＥＫＡＶＡＮＦＦＳＧＳＣＡＰＣＡＤＧＴＤＦＰＱＬＣＱＬＣＰＧＣＧＣＳＴＬＮＱＹＦＧＹＳＧＡＦＫＣＬＫＤＧＡＧＤＶＡＦＶＫＨＳＴＩＦＥＮＬＡＮＫＡＤＲＤＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴＲＫＰＶＤＥＹＫＤＣＨＬＡＱＶＰＳＨＴＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬＮＱＡＱＥＨＦＧＫＤＫＳＫＥＦＱＬＦＳＳＰＨＧＫＤＬＬＦＫＤＳＡＨＧＦＬＫＶＰＰＲＭＤＡＫＭＹＬＧＹＥＹＶＴＡＩＲＮＬＲＥＧＴＣＰＥＡＰＴＤＥＣＫＰＶＫＷＣＡＬＳＨＨＥＲＬＫＣＤＥＷＳＶＮＳＶＧＫＩＥＣＶＳＡＥＴＴＥＤＣＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧＧＦＶＹＩＡＧＫＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＤＫＳＤＮＣＥＤＴＰＥＡＧＹＦＡＶＡＶＶＫＫＳＡＳＤＬＴＷＤＮＬＫＧＫＫＳＣＨＴＡＶＧＲＴＡＧＷＮＩＰＭＧＬＬＹＮＫＩＮＨＣＲＦＤＥＦＦＳＥＧＣＡＰＧＳＫＫＤＳＳＬＣＫＬＣＭＧＳＧＬＮＬＣＥＰＮＮＫＥＧＹＹＧＹＴＧＡＦＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡＦＶＫＨＱＴＶＰＱＮＴＧＧＫＮＰＤＰＷＡＫＮＬＮＥＫＤＹＥＬＬＣＬＤＧＴＲＫＰＶＥＥＹＡＮＣＨＬＡＲＡＰＮＨＡＶＶＴＲＫＤＫＥＡＣＶＨＫＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＤＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫＤＬＬＦＲＤＤＴＶＣＬＡＫＬＨＤＲＮＴＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶＧＮＬＲＫＣＳＴＳＳＬＬＥＡＣＴＦＲＲＰＧＳＳＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ）に示されるアミノ酸配列を有する。配列番号１のペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）及び対照タンパク質（ｙ軸、蛍光抗Ｈｉｓ抗体で染色）のフローサイトメトリープロットを示す。ＴｆＲ及び単一クローンペプチドを提示する細胞を示す。本実験に使用された対照タンパク質は、配列番号３３３（ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶＣＡＶＬＧＬＣＬＡＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＳＫＴＶＲＷＣＡＶＳＥＨＥＡＴＫＣＱＳＦＲＤＨＭＫＳＶＩＰＳＤＧＰＳＶＡＣＶＫＫＡＳＹＬＤＣＩＲＡＩＡＡＮＥＡＤＡＶＴＬＤＡＧＬＶＹＤＡＹＬＡＰＮＮＬＫＰＶＶＡＥＦＹＧＳＫＥＤＰＱＴＦＹＹＡＶＡＶＶＫＫＤＳＧＦＱＭＮＱＬＲＧＫＫＳＣＨＴＧＬＧＲＳＡＧＷＮＩＰＩＧＬＬＹＣＤＬＰＥＰＲＫＰＬＥＫＡＶＡＮＦＦＳＧＳＣＡＰＣＡＤＧＴＤＦＰＱＬＣＱＬＣＰＧＣＧＣＳＴＬＮＱＹＦＧＹＳＧＡＦＫＣＬＫＤＧＡＧＤＶＡＦＶＫＨＳＴＩＦＥＮＬＡＮＫＡＤＲＤＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴＲＫＰＶＤＥＹＫＤＣＨＬＡＱＶＰＳＨＴＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬＮＱＡＱＥＨＦＧＫＤＫＳＫＥＦＱＬＦＳＳＰＨＧＫＤＬＬＦＫＤＳＡＨＧＦＬＫＶＰＰＲＭＤＡＫＭＹＬＧＹＥＹＶＴＡＩＲＮＬＲＥＧＴＣＰＥＡＰＴＤＥＣＫＰＶＫＷＣＡＬＳＨＨＥＲＬＫＣＤＥＷＳＶＮＳＶＧＫＩＥＣＶＳＡＥＴＴＥＤＣＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧＧＦＶＹＩＡＧＫＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＤＫＳＤＮＣＥＤＴＰＥＡＧＹＦＡＶＡＶＶＫＫＳＡＳＤＬＴＷＤＮＬＫＧＫＫＳＣＨＴＡＶＧＲＴＡＧＷＮＩＰＭＧＬＬＹＮＫＩＮＨＣＲＦＤＥＦＦＳＥＧＣＡＰＧＳＫＫＤＳＳＬＣＫＬＣＭＧＳＧＬＮＬＣＥＰＮＮＫＥＧＹＹＧＹＴＧＡＦＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡＦＶＫＨＱＴＶＰＱＮＴＧＧＫＮＰＤＰＷＡＫＮＬＮＥＫＤＹＥＬＬＣＬＤＧＴＲＫＰＶＥＥＹＡＮＣＨＬＡＲＡＰＮＨＡＶＶＴＲＫＤＫＥＡＣＶＨＫＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＤＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫＤＬＬＦＲＤＤＴＶＣＬＡＫＬＨＤＲＮＴＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶＧＮＬＲＫＣＳＴＳＳＬＬＥＡＣＴＦＲＲＰＧＳＳＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ）に示されるアミノ酸配列を有する。配列番号１のペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）及び対照タンパク質（ｙ軸、蛍光ストレプトアビジンで染色）のフローサイトメトリープロットを示す。ＴｆＲ及び単一クローンペプチドを提示する細胞を示す。本実験に使用された対照タンパク質は、配列番号３３３（ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶＣＡＶＬＧＬＣＬＡＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＳＫＴＶＲＷＣＡＶＳＥＨＥＡＴＫＣＱＳＦＲＤＨＭＫＳＶＩＰＳＤＧＰＳＶＡＣＶＫＫＡＳＹＬＤＣＩＲＡＩＡＡＮＥＡＤＡＶＴＬＤＡＧＬＶＹＤＡＹＬＡＰＮＮＬＫＰＶＶＡＥＦＹＧＳＫＥＤＰＱＴＦＹＹＡＶＡＶＶＫＫＤＳＧＦＱＭＮＱＬＲＧＫＫＳＣＨＴＧＬＧＲＳＡＧＷＮＩＰＩＧＬＬＹＣＤＬＰＥＰＲＫＰＬＥＫＡＶＡＮＦＦＳＧＳＣＡＰＣＡＤＧＴＤＦＰＱＬＣＱＬＣＰＧＣＧＣＳＴＬＮＱＹＦＧＹＳＧＡＦＫＣＬＫＤＧＡＧＤＶＡＦＶＫＨＳＴＩＦＥＮＬＡＮＫＡＤＲＤＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴＲＫＰＶＤＥＹＫＤＣＨＬＡＱＶＰＳＨＴＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬＮＱＡＱＥＨＦＧＫＤＫＳＫＥＦＱＬＦＳＳＰＨＧＫＤＬＬＦＫＤＳＡＨＧＦＬＫＶＰＰＲＭＤＡＫＭＹＬＧＹＥＹＶＴＡＩＲＮＬＲＥＧＴＣＰＥＡＰＴＤＥＣＫＰＶＫＷＣＡＬＳＨＨＥＲＬＫＣＤＥＷＳＶＮＳＶＧＫＩＥＣＶＳＡＥＴＴＥＤＣＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧＧＦＶＹＩＡＧＫＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＤＫＳＤＮＣＥＤＴＰＥＡＧＹＦＡＶＡＶＶＫＫＳＡＳＤＬＴＷＤＮＬＫＧＫＫＳＣＨＴＡＶＧＲＴＡＧＷＮＩＰＭＧＬＬＹＮＫＩＮＨＣＲＦＤＥＦＦＳＥＧＣＡＰＧＳＫＫＤＳＳＬＣＫＬＣＭＧＳＧＬＮＬＣＥＰＮＮＫＥＧＹＹＧＹＴＧＡＦＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡＦＶＫＨＱＴＶＰＱＮＴＧＧＫＮＰＤＰＷＡＫＮＬＮＥＫＤＹＥＬＬＣＬＤＧＴＲＫＰＶＥＥＹＡＮＣＨＬＡＲＡＰＮＨＡＶＶＴＲＫＤＫＥＡＣＶＨＫＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＤＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫＤＬＬＦＲＤＤＴＶＣＬＡＫＬＨＤＲＮＴＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶＧＮＬＲＫＣＳＴＳＳＬＬＥＡＣＴＦＲＲＰＧＳＳＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ）に示されるアミノ酸配列を有する。配列番号１のペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）及びＴｆＲ（ｙ軸、蛍光抗Ｈｉｓ抗体で染色）のフローサイトメトリープロットを示す。ＴｆＲ及び単一クローンペプチドを提示する細胞を示す。本実験に使用された対照タンパク質は、配列番号３３３（ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶＣＡＶＬＧＬＣＬＡＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＳＫＴＶＲＷＣＡＶＳＥＨＥＡＴＫＣＱＳＦＲＤＨＭＫＳＶＩＰＳＤＧＰＳＶＡＣＶＫＫＡＳＹＬＤＣＩＲＡＩＡＡＮＥＡＤＡＶＴＬＤＡＧＬＶＹＤＡＹＬＡＰＮＮＬＫＰＶＶＡＥＦＹＧＳＫＥＤＰＱＴＦＹＹＡＶＡＶＶＫＫＤＳＧＦＱＭＮＱＬＲＧＫＫＳＣＨＴＧＬＧＲＳＡＧＷＮＩＰＩＧＬＬＹＣＤＬＰＥＰＲＫＰＬＥＫＡＶＡＮＦＦＳＧＳＣＡＰＣＡＤＧＴＤＦＰＱＬＣＱＬＣＰＧＣＧＣＳＴＬＮＱＹＦＧＹＳＧＡＦＫＣＬＫＤＧＡＧＤＶＡＦＶＫＨＳＴＩＦＥＮＬＡＮＫＡＤＲＤＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴＲＫＰＶＤＥＹＫＤＣＨＬＡＱＶＰＳＨＴＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬＮＱＡＱＥＨＦＧＫＤＫＳＫＥＦＱＬＦＳＳＰＨＧＫＤＬＬＦＫＤＳＡＨＧＦＬＫＶＰＰＲＭＤＡＫＭＹＬＧＹＥＹＶＴＡＩＲＮＬＲＥＧＴＣＰＥＡＰＴＤＥＣＫＰＶＫＷＣＡＬＳＨＨＥＲＬＫＣＤＥＷＳＶＮＳＶＧＫＩＥＣＶＳＡＥＴＴＥＤＣＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧＧＦＶＹＩＡＧＫＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＤＫＳＤＮＣＥＤＴＰＥＡＧＹＦＡＶＡＶＶＫＫＳＡＳＤＬＴＷＤＮＬＫＧＫＫＳＣＨＴＡＶＧＲＴＡＧＷＮＩＰＭＧＬＬＹＮＫＩＮＨＣＲＦＤＥＦＦＳＥＧＣＡＰＧＳＫＫＤＳＳＬＣＫＬＣＭＧＳＧＬＮＬＣＥＰＮＮＫＥＧＹＹＧＹＴＧＡＦＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡＦＶＫＨＱＴＶＰＱＮＴＧＧＫＮＰＤＰＷＡＫＮＬＮＥＫＤＹＥＬＬＣＬＤＧＴＲＫＰＶＥＥＹＡＮＣＨＬＡＲＡＰＮＨＡＶＶＴＲＫＤＫＥＡＣＶＨＫＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＤＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫＤＬＬＦＲＤＤＴＶＣＬＡＫＬＨＤＲＮＴＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶＧＮＬＲＫＣＳＴＳＳＬＬＥＡＣＴＦＲＲＰＧＳＳＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ）に示されるアミノ酸配列を有する。配列番号１のペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）及びＴｆＲ（ｙ軸、蛍光ストレプトアビジンで染色）のフローサイトメトリープロットを示す。部位飽和変異導入（ＳＳＭ）で濃縮されたバリアントを順列することで生じるペプチドバリアントに対するＴｆＲ結合を示す。各グラフは、１ラウンドのＳＳＭの完了を示し、グラフ内の色付きの棒は、ＳＳＭのラウンドが開始されたときのそれぞれのペプチド配列と比較したバリアントペプチドの変異数を示す。データは、ＳＳＭの最終ステップを示し、その後、次世代分子が決定される。配列番号１の配列を有するペプチドの親和性成熟のための部位飽和変異導入（ＳＳＭ）から得られた配列番号３～配列番号２３の配列をそれぞれ含むバリアントに結合したｈＴｆＲの量を示す。部位飽和変異導入（ＳＳＭ）で濃縮されたバリアントを順列することで生じるペプチドバリアントに対するＴｆＲ結合を示す。各グラフは、１ラウンドのＳＳＭの完了を示し、グラフ内の色付きの棒は、ＳＳＭのラウンドが開始されたときのそれぞれのペプチド配列と比較したバリアントペプチドの変異数を示す。データは、ＳＳＭの最終ステップを示し、その後、次世代分子が決定される。配列番号２の配列を有する開始ペプチドの親和性成熟のための部位飽和変異導入（ＳＳＭ）から得られた配列番号２４～配列番号３１の配列をそれぞれ有するペプチドバリアントに結合したｈＴｆＲの量を示す。配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号３０、及び配列番号３２の配列をそれぞれ有する５つの可溶性ＴｆＲ結合ペプチドバリアントの還元（ＤＴＴ）または非還元（ＰＢＳ）条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及びＲＰ－ＨＰＬＣプロットを示す。データは、ＴｆＲ結合ペプチドが高い可溶性を呈することを示している。還元条件（１０ｍＭＤＴＴ）及び非還元（ＰＢＳ）条件下でのゲルの比較は、ペプチドがジスルフィド結合を形成することを示している。配列番号１のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号３０、及び配列番号３２の配列をそれぞれ有する５つの可溶性ＴｆＲ結合ペプチドバリアントの還元（ＤＴＴ）または非還元（ＰＢＳ）条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及びＲＰ－ＨＰＬＣプロットを示す。データは、ＴｆＲ結合ペプチドが高い可溶性を呈することを示している。還元条件（１０ｍＭＤＴＴ）及び非還元（ＰＢＳ）条件下でのゲルの比較は、ペプチドがジスルフィド結合を形成することを示している。配列番号２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号３０、及び配列番号３２の配列をそれぞれ有する５つの可溶性ＴｆＲ結合ペプチドバリアントの還元（ＤＴＴ）または非還元（ＰＢＳ）条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及びＲＰ－ＨＰＬＣプロットを示す。データは、ＴｆＲ結合ペプチドが高い可溶性を呈することを示している。還元条件（１０ｍＭＤＴＴ）及び非還元（ＰＢＳ）条件下でのゲルの比較は、ペプチドがジスルフィド結合を形成することを示している。配列番号４のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号３０、及び配列番号３２の配列をそれぞれ有する５つの可溶性ＴｆＲ結合ペプチドバリアントの還元（ＤＴＴ）または非還元（ＰＢＳ）条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及びＲＰ－ＨＰＬＣプロットを示す。データは、ＴｆＲ結合ペプチドが高い可溶性を呈することを示している。還元条件（１０ｍＭＤＴＴ）及び非還元（ＰＢＳ）条件下でのゲルの比較は、ペプチドがジスルフィド結合を形成することを示している。配列番号３０のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号３０、及び配列番号３２の配列をそれぞれ有する５つの可溶性ＴｆＲ結合ペプチドバリアントの還元（ＤＴＴ）または非還元（ＰＢＳ）条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及びＲＰ－ＨＰＬＣプロットを示す。データは、ＴｆＲ結合ペプチドが高い可溶性を呈することを示している。還元条件（１０ｍＭＤＴＴ）及び非還元（ＰＢＳ）条件下でのゲルの比較は、ペプチドがジスルフィド結合を形成することを示している。配列番号３２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。後世代のＴｆＲ結合ペプチドがグルタチオン（ＧＳＨ）還元に対する耐性を改善したことを示す。処理なし（赤）、１０μＭＧＳＨ（青）、または１０μＭＤＴＴ（緑）のいずれかに供したペプチドの逆相ＨＰＬＣトレースの重ね合わせ（試験したペプチドごとに１つ）を示す。配列番号１の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドのグルタチオン（ＧＳＨ）還元に対する耐性を示す。後世代のＴｆＲ結合ペプチドがグルタチオン（ＧＳＨ）還元に対する耐性を改善したことを示す。処理なし（赤）、１０μＭＧＳＨ（青）、または１０μＭＤＴＴ（緑）のいずれかに供したペプチドの逆相ＨＰＬＣトレースの重ね合わせ（試験したペプチドごとに１つ）を示す。配列番号２の配列を有するペプチドのグルタチオン（ＧＳＨ）還元に対するＴｆＲ結合ペプチド耐性の改善を示す。後世代のＴｆＲ結合ペプチドがグルタチオン（ＧＳＨ）還元に対する耐性を改善したことを示す。処理なし（赤）、１０μＭＧＳＨ（青）、または１０μＭＤＴＴ（緑）のいずれかに供したペプチドの逆相ＨＰＬＣトレースの重ね合わせ（試験したペプチドごとに１つ）を示す。配列番号３２の配列を有するペプチドのグルタチオン（ＧＳＨ）及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）還元に対するＴｆＲ結合ペプチド耐性の改善を示す。後世代のＴｆＲ結合ペプチドがグルタチオン（ＧＳＨ）還元に対する耐性を改善したことを示す。処理なし（赤）、１０μＭＧＳＨ（青）、または１０μＭＤＴＴ（緑）のいずれかに供したペプチドの逆相ＨＰＬＣトレースの重ね合わせ（試験したペプチドごとに１つ）を示す。配列番号３０の配列を有するペプチドのグルタチオン（ＧＳＨ）還元に対するＴｆＲ結合ペプチド耐性の改善を示す。親和性成熟させたＴｆＲ結合ペプチドのペプシンに対する耐性がペプチドの成熟に伴って改善することを示す。処理なし（赤）、トリプシン（青）、またはペプシン（緑）のいずれかに供したＴｆＲ結合ペプチドの逆相ＨＰＬＣトレースの重ね合わせ（試験したペプチドごとに１つ）を示す。配列番号１の配列を有するペプチドのトリプシン（青）及びペプシン（緑）による処理を示す。親和性成熟させたＴｆＲ結合ペプチドのペプシンに対する耐性がペプチドの成熟に伴って改善することを示す。処理なし（赤）、トリプシン（青）、またはペプシン（緑）のいずれかに供したＴｆＲ結合ペプチドの逆相ＨＰＬＣトレースの重ね合わせ（試験したペプチドごとに１つ）を示す。配列番号２の配列を有するペプチドのトリプシン（青）及びペプシン（緑）による処理を示す。親和性成熟させたＴｆＲ結合ペプチドのペプシンに対する耐性がペプチドの成熟に伴って改善することを示す。処理なし（赤）、トリプシン（青）、またはペプシン（緑）のいずれかに供したＴｆＲ結合ペプチドの逆相ＨＰＬＣトレースの重ね合わせ（試験したペプチドごとに１つ）を示す。配列番号３２の配列を有するペプチドのトリプシン（青）及びペプシン（緑）による処理を示す。親和性成熟させたＴｆＲ結合ペプチドのペプシンに対する耐性がペプチドの成熟に伴って改善することを示す。処理なし（赤）、トリプシン（青）、またはペプシン（緑）のいずれかに供したＴｆＲ結合ペプチドの逆相ＨＰＬＣトレースの重ね合わせ（試験したペプチドごとに１つ）を示す。配列番号３０の配列を有するペプチドのトリプシン（青）及びペプシン（緑）による処理を示す。配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号３２のｈＴｆＲへの結合を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）曲線を示す。配列番号２の配列を有するペプチドの濃度を変えた場合のｈＴｆＲ結合を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレースを示す。配列番号４の配列を有するペプチドの濃度を変えた場合のｈＴｆＲ結合を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレースを示す。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、捕捉させたビオチン化ｈＴｆＲに結合する配列番号３２の結合及びシングルサイクルカイネティクスデータを示す。５つの濃度の配列番号３２の配列を有するペプチド（０．０３７ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ）が２つの密度の捕捉ビオチン化（Ｂｔ）－ｈＴｆＲに対して注入され、グローバルに解析された。ＳＰＲによる、捕捉させたビオチン化ｈＴｆＲに結合する配列番号３０の結合及びシングルサイクルカイネティクスデータを示す。５つの濃度の配列番号３０の配列を有するペプチド（０．０３７ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ）が２つの密度の捕捉Ｂｔ－ｈＴｆＲに対して注入され、グローバルに解析された。配列番号２及び配列番号３２の配列を有するペプチドを１０μＭの鉄負荷ヒトホロトランスフェリンまたは空のヒトアポトランスフェリンの存在下でｈＴｆＲとインキュベートした競合的結合アッセイからのフローサイトメトリーデータを定量化した棒グラフを示す。ｈＴｆＲと配列番号３２の配列を有するｈＴｆＲ結合ペプチドとの共結晶化を示す。配列番号３２の配列を有するペプチドと共結晶させたｈＴｆＲの第１の図を示す。構造は、ｈＴｆＲ結合ペプチドの結合部位が、内因性結合物質トランスフェリンの結合部位と重なることを示している。コイル状の黒の実線で描かれている２つのヘリックス間の連結配列は、結晶構造では解明されなかったため、構造モデリングに基づいている。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の結晶構造は、空間充填電子密度マップで表示している。２つの顕著な葉を持つ大きな球状のタンパク質に見える。２つの葉の間で、配列番号３２に対応する短いペプチドの結晶構造がトランスフェリン受容体の球状構造と相互作用しているのが示されている。配列番号３２のペプチドは、２つの逆平行α－ヘリックスが左上から右下に向かって斜めに配向したカートゥーンモデルとして示されている。配列番号３２のアミノ酸側鎖に対応する棒状モデルは、α－ヘリックスから突き出て示されおり、そのいくつかは、ＴｆＲの球状タンパク質と相互作用している。ｈＴｆＲと配列番号３２の配列を有するｈＴｆＲ結合ペプチドとの共結晶化を示す。図１３Ａの拡大図を示し、配列番号３２の配列を有するペプチドと共結晶させたｈＴｆＲを示す。内因性ＣＤＰから変異させたアミノ酸側鎖、または界面の一部であるアミノ酸側鎖はいずれも棒で示される。界面に隣接する残基は黒で示され、一方、界面から遠位の残基はシアンで示される。配列番号３２のペプチドと相互作用する、図１３Ａに示されるＴｆＲ空間充填電子密度マップの一部を示す。配列番号３２のペプチドは、図１３Ａに示されるように、２つの逆平行α－ヘリックスを持つカートゥーンモデルとして示され、ＴｆＲの構造の真上に位置し、α－ヘリックスは水平に配置されている。配列番号３２のアミノ酸側鎖は、棒で示される。配列番号３２のα－ヘリックスからＴｆＲの球状構造に向かって下方に突き出している側鎖がＴｆＲと相互作用している。ｈＴｆＲと配列番号３２の配列を有するｈＴｆＲ結合ペプチドとの共結晶化を示す。配列番号３２の構造モデル（上段、Ｎ末端は青、Ｃ末端は赤、目に見える側鎖を原子の種類で色分け）、遊離の配列番号３２の結晶構造（中断、青；分解能２．５５Å、４倍の重ね合わせ）、及びＴｆＲと複合体化したときの配列番号３２の結晶構造（下段、赤；分解能１．８５Å、２倍の重ね合わせ）のカートゥーン表示を示す。複合体構造においてＴｆＲから４Å以内に原子がある側鎖は、棒で示される。Ｎ末端及びＣ末端には表示が付けられている。赤の矢印は、配列番号３２のモデル構造、未結合構造、及び結合構造間のＮ末端近くの最も顕著な構造上の違いを示している。灰色の十字は、無秩序なヘリカル間リンカーの位置を示す。「モデル」と書かれた上段の構造は、カートゥーンモデルとして表示される配列番号３２に対応するペプチドのｉｎｓｉｌｉｃｏモデルを示す。水平に配向された逆平行α－ヘリックスは、右側で短いループによって接続されている。ペプチドのＮ末端は、下側のヘリックスの左側に位置し、Ｃ末端は、上側のヘリックスの左側に位置する。アミノ酸側鎖は、α－ヘリックスから突き出た棒として示される。「４ｘ遊離」と書かれた中段の構造は、カートゥーンモデルとして表示されるＴｆＲがない状態で結晶化された配列番号３２に対応するペプチドの結晶構造を示す。ｉｎｓｉｌｉｃｏモデルで認められたループは、この構造では表示されておらず、２つのヘリックスの右側にＸ印で示される。ペプチドのＮ末端は、下側のヘリックスの左側に位置し、Ｃ末端は、上側のヘリックスの左側に位置する。アミノ酸側鎖は、α－ヘリックスから突き出た棒として示される。「２ｘＴｆＲ結合」と書かれた下段の構造は、カートゥーンモデルとして表示されるＴｆＲがある状態で結晶化された配列番号３２に対応するペプチドの結晶構造を示す。ｉｎｓｉｌｉｃｏモデルで認められたループは、この構造では表示されておらず、２つのヘリックスの右側にＸ印で示される。ペプチドのＮ末端は、下側のヘリックスの左側に位置し、Ｃ末端は、上側のヘリックスの左側に位置する。アミノ酸側鎖は、α－ヘリックスから突き出た棒として示される。各構造の下側のヘリックスの左端にあるＮ末端領域を指している３つの三角の矢印は、３つの構造間で最も顕著な構造上の違いがある領域を示している。ｈＴｆＲと配列番号３２の配列を有するｈＴｆＲ結合ペプチドとの共結晶化を示す。ＴｆＲに結合した配列番号３２の結合の拡大図を示し、結合を駆動する多数の極性及び非極性の相互作用が示されている。非極性相互作用は、主に、Ｌｅｕ及びＭｅｔであるが、極性相互作用は、いくつかの電荷残基及び非電荷残基の混合である。ＴｆＲの結晶構造の一部を空間充填電子密度マップとして示す。配列番号２に対応するペプチドは、ＴｆＲ構造の上にリボン図として示される。α－ヘリックスは、垂直に配向されており、ループは、２つのヘリックスの上端を接続している。アミノ酸側鎖は棒で示され、ＴｆＲの構造と面する側鎖がＴｆＲと相互作用している。配列番号３２のアミノ酸残基は、次のとおりに書かれている（上から下へ、次いで、左から右へ）：Ｅ１６、Ｍ９、Ｓ６、Ｎ１２、Ｌ４３、Ｌ１５、Ｌ３６、及びＤ４４。ｈＴｆＲと配列番号３２の配列を有するｈＴｆＲ結合ペプチドとの共結晶化を示す。ＴｆＲ：配列番号３２の共結晶と、公開されているＴｆＲ：トランスフェリン複合体（ＰＤＢ３Ｓ９Ｌ；ＴｆＲ非表示）の共結晶のアライメントを示し、図１４Ａに示される結合相互作用を拡大したものである。構造アライメント（左）は、配列番号３２（青）とトランスフェリン（ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶＣＡＶＬＧＬＣＬＡＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＳＫＴＶＲＷＣＡＶＳＥＨＥＡＴＫＣＱＳＦＲＤＨＭＫＳＶＩＰＳＤＧＰＳＶＡＣＶＫＫＡＳＹＬＤＣＩＲＡＩＡＡＮＥＡＤＡＶＴＬＤＡＧＬＶＹＤＡＹＬＡＰＮＮＬＫＰＶＶＡＥＦＹＧＳＫＥＤＰＱＴＦＹＹＡＶＡＶＶＫＫＤＳＧＦＱＭＮＱＬＲＧＫＫＳＣＨＴＧＬＧＲＳＡＧＷＮＩＰＩＧＬＬＹＣＤＬＰＥＰＲＫＰＬＥＫＡＶＡＮＦＦＳＧＳＣＡＰＣＡＤＧＴＤＦＰＱＬＣＱＬＣＰＧＣＧＣＳＴＬＮＱＹＦＧＹＳＧＡＦＫＣＬＫＤＧＡＧＤＶＡＦＶＫＨＳＴＩＦＥＮＬＡＮＫＡＤＲＤＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴＲＫＰＶＤＥＹＫＤＣＨＬＡＱＶＰＳＨＴＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬＮＱＡＱＥＨＦＧＫＤＫＳＫＥＦＱＬＦＳＳＰＨＧＫＤＬＬＦＫＤＳＡＨＧＦＬＫＶＰＰＲＭＤＡＫＭＹＬＧＹＥＹＶＴＡＩＲＮＬＲＥＧＴＣＰＥＡＰＴＤＥＣＫＰＶＫＷＣＡＬＳＨＨＥＲＬＫＣＤＥＷＳＶＮＳＶＧＫＩＥＣＶＳＡＥＴＴＥＤＣＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧＧＦＶＹＩＡＧＫＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＤＫＳＤＮＣＥＤＴＰＥＡＧＹＦＡＶＡＶＶＫＫＳＡＳＤＬＴＷＤＮＬＫＧＫＫＳＣＨＴＡＶＧＲＴＡＧＷＮＩＰＭＧＬＬＹＮＫＩＮＨＣＲＦＤＥＦＦＳＥＧＣＡＰＧＳＫＫＤＳＳＬＣＫＬＣＭＧＳＧＬＮＬＣＥＰＮＮＫＥＧＹＹＧＹＴＧＡＦＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡＦＶＫＨＱＴＶＰＱＮＴＧＧＫＮＰＤＰＷＡＫＮＬＮＥＫＤＹＥＬＬＣＬＤＧＴＲＫＰＶＥＥＹＡＮＣＨＬＡＲＡＰＮＨＡＶＶＴＲＫＤＫＥＡＣＶＨＫＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＤＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫＤＬＬＦＲＤＤＴＶＣＬＡＫＬＨＤＲＮＴＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶＧＮＬＲＫＣＳＴＳＳＬＬＥＡＣＴＦＲＲＰ、配列番号３５３、緑）の結合部位の重なりを示す。配列番号３２の結合部位をヒト（配列番号３５３）及びマウス（ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶＣＡＶＬＧＬＣＬＡＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＳＶＰＤＫＴＶＫＷＣＡＶＳＥＨＥＮＴＫＣＩＳＦＲＤＨＭＫＴＶＬＰＰＤＧＰＲＬＡＣＶＫＫＴＳＹＰＤＣＩＫＡＩＳＡＳＥＡＤＡＭＴＬＤＧＧＷＶＹＤＡＧＬＴＰＮＮＬＫＰＶＡＡＥＦＹＧＳＶＥＨＰＱＴＹＹＹＡＶＡＶＶＫＫＧＴＤＦＱＬＮＱＬＥＧＫＫＳＣＨＴＧＬＧＲＳＡＧＷＶＩＰＩＧＬＬＦＣＫＬＳＥＰＲＳＰＬＥＫＡＶＳＳＦＦＳＧＳＣＶＰＣＡＤＰＶＡＦＰＫＬＣＱＬＣＰＧＣＧＣＳＳＴＱＰＦＦＧＹＶＧＡＦＫＣＬＫＤＧＧＧＤＶＡＦＶＫＨＴＴＩＦＥＶＬＰＥＫＡＤＲＤＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴＲＫＰＶＤＱＹＥＤＣＹＬＡＲＩＰＳＨＡＶＶＡＲＫＮＮＧＫＥＤＬＩＷＥＩＬＫＶＡＱＥＨＦＧＫＧＫＳＫＤＦＱＬＦＳＳＰＬＧＫＤＬＬＦＫＤＳＡＦＧＬＬＲＶＰＰＲＭＤＹＲＬＹＬＧＨＮＹＶＴＡＩＲＮＱＱＥＧＶＣＰＥＧＳＩＤＮＳＰＶＫＷＣＡＬＳＨＬＥＲＴＫＣＤＥＷＳＩＩＳＥＧＫＩＥＣＥＳＡＥＴＴＥＤＣＩＥＫＩＶＮＧＥＡＤＡＭＴＬＤＧＧＨＡＹＩＡＧＱＣＧＬＶＰＶＭＡＥＹＹＥＳＳＮＣＡＩＰＳＱＱＧＩＦＰＫＧＹＹＡＶＡＶＶＫＡＳＤＴＳＩＴＷＮＮＬＫＧＫＫＳＣＨＴＧＶＤＲＴＡＧＷＮＩＰＭＧＭＬＹＮＲＩＮＨＣＫＦＤＥＦＦＳＱＧＣＡＰＧＹＥＫＮＳＴＬＣＤＬＣＩＧＰＬＫＣＡＰＮＮＫＥＥＹＮＧＹＴＧＡＦＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡＦＶＫＨＱＴＶＬＤＮＴＥＧＫＮＰＡＥＷＡＫＮＬＫＱＥＤＦＥＬＬＣＰＤＧＴＲＫＰＶＫＤＦＡＳＣＨＬＡＱＡＰＮＨＶＶＶＳＲＫＥＫＡＡＲＶＫＡＶＬＴＳＱＥＴＬＦＧＧＳＤＣＴＧＮＦＣＬＦＫＳＴＴＫＤＬＬＦＲＤＤＴＫＣＦＶＫＬＰＥＧＴＴＰＥＫＹＬＧＡＥＹＭＱＳＶＧＮＭＲＫＣＳＴＳＲＬＬＥＡＣＴＦＨＫＨ、配列番号３５４）トランスフェリン受容体の相同性に合わせて色付けしたものであり、ＴｆＲ上の結合表面のほとんどが２つの種間で同一性または類似性を有することを示している（右）。左パネルは、ＴｆＲの構造の一部を空間充填電子密度マップとして示している。３Ｓ９Ｌ結晶構造に由来するトランスフェリンのリボン図（「３Ｓ９Ｌ由来Ｔｆと書かれている）は、ＴｆＲの右側に配置され、ＴｆＲ構造と重なり合っている。Ｔｆ構造は、ＴｆＲ構造と一致する多数のαヘリックスを含有する。また、この構造は、右下の領域にβシート構造を含有しているだけでなく、α－ヘリックスの末端から多数のループが突き出している。ＴｆＲと結晶化された配列番号３２の構造は、右上のＴｆＲと相互作用するカートゥーンモデルとして示される。垂直に配置された２つのα－ヘリックスからなり、重ね合わせたＴｆ構造と重複している。右パネルは、左パネルに示されるＴｆＲと配列番号３２の構造を回転させた図を示す。ＴｆＲは、空間充填電子密度マップとして示され、配列番号３２は、左上から右下に斜めに配向された２つのα－ヘリックスを含有するカートゥーンモデルとして示される。ＴｆＲ構造上の影付きの領域は、ＨｓＴｆＲ及びＭｍＴｆＲの結合部位が類似または非類似の領域を示す。例示的な類似及び非類似の領域は、矢印で示される。ＴｆＲ構造の表面の大部分を占める、類似または非類似として示されていない構造の残りの領域は、同一の結合部位を有する。配列番号３２の右ヘリックスの真上の小さな領域及び右ヘリックスの上端の真下の小さな領域は、類似の結合部位を有するものとして示されている。配列番号３２の右ヘリックスの真上の小さな領域、右ヘリックスの下端の真下の小さな領域、及び左ヘリックスの下端の下の小さな領域は、非類似の結合部位を有するものとして示されている。ＴｆＲ：トランスフェリン複合体及びＴｆＲ：ペプチド複合体を示すものであり、トランスフェリン（公開文献から取得したデータ（ＲＣＳＢＰＤＢ１ＳＵＶ））と、ｈＴｆＲに結合した配列番号３２の配列を有するペプチドとのそれぞれの重ね合わせを示し、トランスフェリン及び配列番号３２の配列を有するペプチドは、ｈＴｆＲ上の結合部位が重複していることが示される。トランスフェリン（公開文献から取得したデータ（ＲＣＳＢＰＤＢ１ＳＵＶ））と、ｈＴｆＲに結合した配列番号３２の配列を有するペプチドとのそれぞれの重ね合わせを示す。ＴｆＲの構造は、２つの葉を有する大きな球状のタンパク質の空間充填電子密度マップとして示される。１ＳＵＶ結晶構造のトランスフェリンの構造（「ＲＣＳＢ１ＳＵＶ由来トランスフェリン」と書かれる）は、多数のα－ヘリックス及び接続ループを持つカートゥーンモデルとして示される。トランスフェリン構造は、ＴｆＲの右下に位置し、ＴｆＲ構造と一致する。「配列番号３２」と書かれた矢印は、ＴｆＲの右側のトランスフェリンの真上の部位を指しており、配列番号３２に対応するペプチドの結合部位を示す。ＴｆＲ：トランスフェリン複合体及びＴｆＲ：ペプチド複合体を示すものであり、トランスフェリン（公開文献から取得したデータ（ＲＣＳＢＰＤＢ１ＳＵＶ））と、ｈＴｆＲに結合した配列番号３２の配列を有するペプチドとのそれぞれの重ね合わせを示し、トランスフェリン及び配列番号３２の配列を有するペプチドは、ｈＴｆＲ上の結合部位が重複していることが示される。ＴｆＲに結合した配列番号３２の配列を有するペプチドの拡大図を示し、図１４Ａの内因性トランスフェリンの結合部位と比較すると、配列番号３２の配列を有するペプチドとトランスフェリンの両方がｈＴｆＲ上に重複する結合部位を有することを示している。内因性ＣＤＰから変異させたアミノ酸側鎖、または界面の一部であるアミノ酸側鎖はいずれも棒で示される。界面に隣接する残基は黒で示され、一方、界面から遠位の残基はシアンで示される。配列番号３２のペプチドと相互作用する、図１３Ａに示されるＴｆＲ空間充填電子密度マップの一部を示す。配列番号３２のペプチドは、図１３Ａに示されるように、２つの逆平行α－ヘリックスを持つカートゥーンモデルとして示され、ＴｆＲの構造の真上に位置し、α－ヘリックスは水平に配置されている。配列番号３２のアミノ酸側鎖は、棒で示される。配列番号３２のα－ヘリックスからＴｆＲの球状構造に向かって下方に突き出している側鎖がＴｆＲと相互作用している。ＴｆＲ結合ペプチドが、細胞表面結合アッセイにおいて、マウスＴｆＲ（ｍＴｆＲ）に対して交差反応性があることを示す。表面上にヒトまたはマウスのいずれかのＴｆＲを発現する２９３Ｆ細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素で直接標識した可溶性ＴｆＲ結合ペプチドで染色した。これらの実験で使用されたＴｆＲ、この事例ではヒトＴｆＲの種特異性を示す。データは、２つのトポグラフィー密度マップとして示され、抗ｈＴｆＲ（ＣＤ７１）抗体で染色されたトランスフェリンのフローサイトメトリーデータを示す。左下から右上に斜めに配置された上の密度マップは、２９３ＳＴ＋ＳＤＧＦ－ｈＴｆＲを示す。水平に配置された下の密度マップは、２９３ＳＴ＋ＳＤＧＦ－ｍＴｆＲを示す。ｙ軸は、ｈＴｆＲ＋ストレプトアビジンを０～１０^７で、１０刻みの対数スケールで示す。ｘ軸は、ＧＦＰを０～１０^６で、１０刻みの対数スケールで示す。ＴｆＲ結合ペプチドが、細胞表面結合アッセイにおいて、マウスＴｆＲ（ｍＴｆＲ）に対して交差反応性があることを示す。表面上にヒトまたはマウスのいずれかのＴｆＲを発現する２９３Ｆ細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素で直接標識した可溶性ＴｆＲ結合ペプチドで染色した。これらの実験で使用されたＴｆＲ、この事例ではマウスＴｆＲの種特異性を示す。データは、２つのトポグラフィー密度マップとして示され、抗ｍＴｆＲ（ＣＤ７１）抗体で染色されたトランスフェリンのフローサイトメトリーデータを示す。左下から右上に斜めに配置された上の密度マップは、２９３ＳＴ＋ＳＤＧＦ－ｍＴｆＲを示す。３つの葉を有する下の密度マップは、２９３ＳＴ＋ＳＤＧＦ－ｈＴｆＲを示す。ｙ軸は、ｈＴｆＲ＋ストレプトアビジンを１０^－４～１０^７で、１０刻みの対数スケールで示す。ｘ軸は、ＧＦＰを０～１０^６で、１０刻みの対数スケールで示す。ＴｆＲ結合ペプチドが、細胞表面結合アッセイにおいて、マウスＴｆＲ（ｍＴｆＲ）に対して交差反応性があることを示す。表面上にヒトまたはマウスのいずれかのＴｆＲを発現する２９３Ｆ細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素で直接標識した可溶性ＴｆＲ結合ペプチドで染色した。配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号２の配列を有するペプチド、配列番号３０の配列を有するペプチド、及び配列番号３２の配列を有するペプチドがヒトＴｆＲに結合することを示す。データは、４つのトポグラフィー密度マップとして示され、２９３ＳＴ細胞＋ＳＤＧＦ－ｈＴＦＲを使用したフローサイトメトリーデータを示す。３つの密度マップは、ほぼ重なっており、４つ目の密度マップの上に配置されている。下の密度マップは、水平に配置され、配列番号１を示す（第１世代）。上の３つの密度マップは、左下から右上に斜めに配置されている。他の２つよりもわずか上にある密度マップは、配列番号３２に対応する（第３世代）。他の２つよりもわずか下にある密度マップは、配列番号２に対応する（第２世代）。３番目の密度マップは、配列番号３０に対応する（第３世代）。ｙ軸は、ｈＴｆＲ＋ストレプトアビジンを０～１０^７で、１０刻みの対数スケールで示す。ｘ軸は、ＧＦＰを０～１０^６で、１０刻みの対数スケールで示す。ＴｆＲ結合ペプチドが、細胞表面結合アッセイにおいて、マウスＴｆＲ（ｍＴｆＲ）に対して交差反応性があることを示す。表面上にヒトまたはマウスのいずれかのＴｆＲを発現する２９３Ｆ細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素で直接標識した可溶性ＴｆＲ結合ペプチドで染色した。配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号２の配列を有するペプチド、配列番号３０の配列を有するペプチド、及び配列番号３２の配列を有するペプチドがマウスＴｆＲに結合することを示す。データは、４つのトポグラフィー密度マップとして示され、２９３ＳＴ細胞＋ＳＤＧＦ－ｍＴＦＲを使用したフローサイトメトリーデータを示す。３つの密度マップは、ほぼ重なっており、４つ目の密度マップの上に配置されている。下の密度マップは、水平に配置され、配列番号１を示す（第１世代）。上の３つの密度マップは、左下から右上に斜めに配置されている。他の２つよりもわずか上にある密度マップは、配列番号３２に対応する（第３世代）。他の２つよりもわずか下にある密度マップは、配列番号２に対応する（第２世代）。３番目の密度マップは、配列番号３０に対応する（第３世代）。ｙ軸は、ｈＴｆＲ＋ストレプトアビジンを０～１０^７で、１０刻みの対数スケールで示す。ｘ軸は、ＧＦＰを０～１０^６で、１０刻みの対数スケールで示す。生体内分布を評価するために、^１４Ｃ標識ＴｆＲ結合ペプチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３０、及び配列番号３２）を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。異種移植腫瘍（皮下のヒト星細胞腫Ｕ８７細胞）を担持するマウスに用量１００ｎｍｏｌのペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ、およそ２５ｇ体重と仮定）を投与して３時間後に撮像した。これらの画像は、脾臓、肝臓、腎臓にかなりの蓄積があることを示し、筋肉、骨髄、及び皮膚にも高い蓄積があることを示している。ＣＮＳ蓄積は、他の組織よりも少ないが、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過しない化合物及び生物学的製剤のこれまでの値と比較して、依然としてかなりの量である（血清の２５％超）。脳で認められるバックグラウンド血中レベルは、心臓の血液信号の３％である。^１４Ｃで標識した配列番号１を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。生体内分布を評価するために、^１４Ｃ標識ＴｆＲ結合ペプチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３０、及び配列番号３２）を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。異種移植腫瘍（皮下のヒト星細胞腫Ｕ８７細胞）を担持するマウスに用量１００ｎｍｏｌのペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ、およそ２５ｇ体重と仮定）を投与して３時間後に撮像した。これらの画像は、脾臓、肝臓、腎臓にかなりの蓄積があることを示し、筋肉、骨髄、及び皮膚にも高い蓄積があることを示している。ＣＮＳ蓄積は、他の組織よりも少ないが、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過しない化合物及び生物学的製剤のこれまでの値と比較して、依然としてかなりの量である（血清の２５％超）。脳で認められるバックグラウンド血中レベルは、心臓の血液信号の３％である。^１４Ｃで標識した配列番号２を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。生体内分布を評価するために、^１４Ｃ標識ＴｆＲ結合ペプチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３０、及び配列番号３２）を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。異種移植腫瘍（皮下のヒト星細胞腫Ｕ８７細胞）を担持するマウスに用量１００ｎｍｏｌのペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ、およそ２５ｇ体重と仮定）を投与して３時間後に撮像した。これらの画像は、脾臓、肝臓、腎臓にかなりの蓄積があることを示し、筋肉、骨髄、及び皮膚にも高い蓄積があることを示している。ＣＮＳ蓄積は、他の組織よりも少ないが、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過しない化合物及び生物学的製剤のこれまでの値と比較して、依然としてかなりの量である（血清の２５％超）。脳で認められるバックグラウンド血中レベルは、心臓の血液信号の３％である。^１４Ｃで標識した配列番号３０を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。生体内分布を評価するために、^１４Ｃ標識ＴｆＲ結合ペプチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３０、及び配列番号３２）を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。異種移植腫瘍（皮下のヒト星細胞腫Ｕ８７細胞）を担持するマウスに用量１００ｎｍｏｌのペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ、およそ２５ｇ体重と仮定）を投与して３時間後に撮像した。これらの画像は、脾臓、肝臓、腎臓にかなりの蓄積があることを示し、筋肉、骨髄、及び皮膚にも高い蓄積があることを示している。ＣＮＳ蓄積は、他の組織よりも少ないが、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過しない化合物及び生物学的製剤のこれまでの値と比較して、依然としてかなりの量である（血清の２５％超）。脳で認められるバックグラウンド血中レベルは、心臓の血液信号の３％である。^１４Ｃで標識した配列番号３２を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。生体内分布を評価するために、^１４Ｃ標識ペプチド（配列番号１及び配列番号３２）を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。脇腹の腫瘍にもかなりの蓄積がみられた。腫瘍内の蓄積は、血液の多い部位に集中するのではなく、全体に分散している。これは、血管外漏出及び腫瘍実質部全体への分散を示唆している。^１４Ｃで標識した配列番号１を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。生体内分布を評価するために、^１４Ｃ標識ペプチド（配列番号１及び配列番号３２）を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。脇腹の腫瘍にもかなりの蓄積がみられた。腫瘍内の蓄積は、血液の多い部位に集中するのではなく、全体に分散している。これは、血管外漏出及び腫瘍実質部全体への分散を示唆している。^１４Ｃで標識した配列番号１を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。生体内分布を評価するために、^１４Ｃ標識ペプチド（配列番号１及び配列番号３２）を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。脇腹の腫瘍にもかなりの蓄積がみられた。腫瘍内の蓄積は、血液の多い部位に集中するのではなく、全体に分散している。これは、血管外漏出及び腫瘍実質部全体への分散を示唆している。^１４Ｃで標識した配列番号３２を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。生体内分布を評価するために、^１４Ｃ標識ペプチド（配列番号１及び配列番号３２）を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。脇腹の腫瘍にもかなりの蓄積がみられた。腫瘍内の蓄積は、血液の多い部位に集中するのではなく、全体に分散している。これは、血管外漏出及び腫瘍実質部全体への分散を示唆している。^１４Ｃで標識した配列番号３２を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。配列番号１の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドまたは配列番号３２の配列を有するペプチドのいずれかの２０ｍｇ／ｋｇのＩＶ単回投与後におけるペプチドの生体内分布及び器官蓄積の定量化を示す。この用量では、３時間後、ＣＮＳで１５０ｎＭを超えるレベル、腫瘍で約１μＭのレベルに達した。棒グラフは、全身オートラジオグラフィーで測定した、同じ画像内の既知の放射能、及びペプチドを静脈内注射したマウスから投与３時間後に得た様々な組織におけるペプチド比活性に対する各^１４Ｃ標識ペプチドのレベルを定量化する。配列番号１及び配列番号３２の配列を有するペプチドに関するペプチドの生体内分布及び器官蓄積の定量化を示す。値は、組織中レベル対血液中レベルを示し、脳が３％の血液であるとすると、脳への透過がない場合は３％のレベルになる。棒グラフは、全身オートラジオグラフィーで測定した、同じ画像内の既知の放射能を持つ対照、及びペプチドを静脈内注射したマウスから投与３時間後に得た様々な組織におけるペプチド比活性に対して正規化された各^１４Ｃ標識ペプチドのレベルを定量化する。全身オートラジオグラフィー（ＷＢＡ）組織蓄積を検証する、１４７Ｃｉ／ｍｏｌの比活性を持つ配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドの２０ｍｇ／Ｋｇの投与後の様々な組織における経時的なシンチレーション計測を示す。腎臓における経時的なシンチレーション計測を示す。時間０（Ｙ０）でのｙ切片は１９００ｐＣｉであり、半減期（ｔ_１／２）は０．８９時間であり、当てはまり度合いのＲ^２は０．８９である。全身オートラジオグラフィー（ＷＢＡ）組織蓄積を検証する、１４７Ｃｉ／ｍｏｌの比活性を持つ配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドの２０ｍｇ／Ｋｇの投与後の様々な組織における経時的なシンチレーション計測を示す。肝臓における経時的なシンチレーション計測を示す。時間０（Ｙ０）でのｙ切片は４００ｐＣｉであり、半減期（ｔ_１／２）は７．２２時間であり、当てはまり度合いのＲ^２は０．９７である。全身オートラジオグラフィー（ＷＢＡ）組織蓄積を検証する、１４７Ｃｉ／ｍｏｌの比活性を持つ配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドの２０ｍｇ／Ｋｇの投与後の様々な組織における経時的なシンチレーション計測を示す。脳における経時的なシンチレーション計測を示す。時間０（Ｙ０）でのｙ切片は７．３ｐＣｉであり、半減期（ｔ_１／２）は０．７２時間であり、当てはまり度合いのＲ^２は０．４５である。全身オートラジオグラフィー（ＷＢＡ）組織蓄積を検証する、１４７Ｃｉ／ｍｏｌの比活性を持つ配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドの２０ｍｇ／Ｋｇの投与後の様々な組織における経時的なシンチレーション計測を示す。脾臓における経時的なシンチレーション計測を示す。時間０（Ｙ０）でのｙ切片は１６８ｐＣｉであり、半減期（ｔ_１／２）は１２．１時間であり、当てはまり度合いのＲ^２は０．９３である。全身オートラジオグラフィー（ＷＢＡ）組織蓄積を検証する、１４７Ｃｉ／ｍｏｌの比活性を持つ配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドの２０ｍｇ／Ｋｇの投与後の様々な組織における経時的なシンチレーション計測を示す。筋肉における経時的なシンチレーション計測を示す。時間０（Ｙ０）でのｙ切片は３１．４ｐＣｉであり、半減期（ｔ_１／２）は２．５４時間であり、当てはまり度合いのＲ^２は０．８５である。全身オートラジオグラフィー（ＷＢＡ）組織蓄積を検証する、１４７Ｃｉ／ｍｏｌの比活性を持つ配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドの２０ｍｇ／Ｋｇの投与後の様々な組織における経時的なシンチレーション計測を示す。皮膚における経時的なシンチレーション計測を示す。時間０（Ｙ０）でのｙ切片は６８．３ｐＣｉであり、半減期（ｔ_１／２）は０．３３時間であり、当てはまり度合いのＲ^２は０．３１である。高速相（９５％、ｔ_１／２１５．６分）及び低速相（５％、ｔ_１／２１０．３時間）のカイネティクスを示す二相消失回帰分析を含む、配列番号３２の配列を有するペプチド２０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与したマウスにおける血清消失プロットを示す。配列番号１及び配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドの多重時間回帰分析及び毛細血管枯渇分析を示す。配列番号１及び配列番号３２の多重回帰分析を単一プロットで示すものであり、ｙ軸は、脳の血清に対する比を示す。配列番号１及び配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドの多重時間回帰分析及び毛細血管枯渇分析を示す。配列番号１及び配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドの実質及び毛細血管分布を示すものであり、ｙ軸は、組織対血清比（μＬ／ｇ）を示す。可溶性トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）エクトドメインの精製及び試験を示す。精製したＴｆＲに結合するホロまたはアポトランスフェリン（Ｔｆ）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を示す。経時的に応答（ＲＵ）が増加することからもわかるように、ホロＴｆはＴｆＲに結合するが、アポＴｆはＴｆＲに結合しない。可溶性トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）エクトドメインの精製及び試験を示す。ペプチドの結合特性についてのスクリーニング及び最適化に使用されるベクター提示足場及び標的結合の模式図を示す。結合物質（例えば、配列番号１、配列番号２、または配列番号３２）のＧＦＰタグ付コンストラクトをコードする表面提示ベクター（ＳＤＧＦ）は、細胞表面上に発現される。蛍光色素（「共染色」）で標識された標的タンパク質（例えば、ＴｆＲ）は、表面に発現される結合物質に結合する。可溶性トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）エクトドメインの精製及び試験を示す。図２３Ｃは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７－ＴｆＲ（図２３Ｂ中の共染色）の結合量によって測定した、特異的ＴｆＲ結合についてのスクリーニングのフローサイトメトリーを示す。Ｍａｃｈｕｐｏウイルス糖タンパク質（ＳＤＧＦ－ＭａＣＶ）をトランスフェクトした細胞は、ビオチン化ＴｆＲとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐ－６４７）の組み合わせ、ＳＤＧＦ－ＭａＣＶ細胞とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識エラスターゼの組み合わせ、またはＳＤＧＦ－エラフィン細胞とＴｆＲ＋Ｓｔｒｅｐ－６４７の組み合わせで試験される。エラスターゼ及びエラフィンの細胞コンジュゲートは、細胞に結合しない。 ^１４Ｃペプチドバリアント分布の全身オートラジオグラフィー（ＷＢＡ）を示す。^１４Ｃペプチドバリアントで処置したマウスの投与３０分後及び１８０分後の組織学的切片を示す。３つのペプチド世代の代表的な脳及び心臓（挿入図）のＷＢＡ画像と、対照である非ＴｆＲ結合ＣＤＰの画像を示す。同じ切片の全身画像が図２５に示され、１８０分の切片のいくつかは図１６にも示される。図２４に示される全身Ｘ線写真の投与３０分後（左欄）及び１８０分後（右欄）の全身画像を示す。図１６には、１８０分の切片の一部が示されている。円二色性を使用して測定した還元及び非還元条件下における配列番号３２の熱安定性を示す。２１０ｎｍでの相対楕円率（ｍｄｅｇ）が℃単位の温度でプロットされている。ＮＲは、非還元を示す。ＤＴＴは、ＤＴＴでのペプチドの還元を示す。縦線は、非線形カーブフィッティング（シグモイド、可変勾配、制約付き底＝０；いずれの場合もＲ^２＞０．９８）に基づいて算出された融点（ＮＲでは約７４℃、１０ｍＭＤＴＴ処理では約３８℃）を表す。ＮＲサンプルは９５℃まで平衡に達しないため、タンパク質は、高温で完全に「融解」せず、特に拡張ループ領域では、単純に無秩序な状態である可能性があることに留意されたい。マウストランスフェリン、マウストランスフェリン－ＮＴ融合体、及び本開示の様々なＣＤＰ－ニューロテンシン（ＮＴ）複合体の精製及び特徴付けを示す。還元（ＤＴＴ）及び非還元（ＰＢＳ）条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥならびにクマシー色素で染色したゲルは、精製後のペプチドの純度を示す。示されるように、マウス内因性トランスフェリン（ＭｍＴｆと表記、配列番号３５４）、ニューロテンシンにコンジュゲートされたマウス内因性トランスフェリン（ＭｍＴｆ－ＮＴと表記、配列番号３５５）、及びＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクト（配列番号３３～配列番号３５）である。ゲルは、還元（ＤＴＴ）または非還元（ＰＢＳ）条件下で実施される。１０ｍＭＤＴＴによる還元は、ペプチドがジスルフィド結合を形成することを示唆した。ＣＲＥ－ルシフェラーゼ（ＣＲＥ－Ｌｕｃ）マウスと哺乳動物細胞の両方でニューロテンシン受容体（ＮＴＳＲ）の下流でＩＰ_１応答を誘導するＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクトを示す。ＣＲＥ－ＬｕｃマウスのＣＲＥ駆動型ルシフェラーゼに影響を与える関連経路を示す。ＰＬＣは、ホスホリパーゼＣを示す。ＡＣは、アデニリルシクラーゼを示す。ＣａＭＫは、カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼを示す。ＣＲＥＢは、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質を示す。ＰＫＡは、プロテインキナーゼＡを示す。ＰＤＥは、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼを示す。ＦＳは、フォルスコリンを指す。Ｒｏｌは、ロリプラムを指す。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質結合受容体を指す。ＣＲＥ－ルシフェラーゼ（ＣＲＥ－Ｌｕｃ）マウスと哺乳動物細胞の両方でニューロテンシン受容体（ＮＴＳＲ）の下流でＩＰ_１応答を誘導するＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクトを示す。ｉｎｖｉｔｒｏでのニューロテンシン（ＮＴ）受容体結合を示しており、ＮＴＳＲ１を発現するＨＥＫ－２９３細胞において、ＮＴまたはＮＴペプチドコンストラクトに応答する場合にのみＩＰ_１蓄積を示す。ＩＰ_１は、アッセイキット（ＣｉｓＢｉｏ６２ＩＰＡＰＥＢ）を使用してＦＲＥＴ比の読み取りで測定した。ウェル数は、ビヒクルを除く全てでＮ＝３であり、ビヒクルはＮ＝３６であった。横棒は、サンプルの平均を示す。ｍＴＦ＝マウストランスフェリン。ベースラインＨＥＫ２９３＝ＮＴＳＲ１を発現していないＨＥＫ２９３細胞（Ｎ＝３６ウェル）の平均アッセイ値が参照として含まれた。免疫組織化学的に染色したＮＴペプチドコンストラクトを投与したマウスの組織サンプルを示す。組織染色は、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５のＣＤＰ－ＮＴ投与から４時間後に、マウスの皮質、線条体、及び視床で、ルシフェラーゼ発現の増大を示している。トランスフェリン－ＮＴ（「トランスフェリン－ＮＴ」、配列番号３５５）またはペプチドなし（「刺激なし」）を投与したマウスは、対照として示す。スケールバー（左上パネル）は、１００μｍであり、全てのパネルは、同じ倍率である。ＣＲＥ－ルシフェラーゼ（ＣＲＥ－Ｌｕｃ）マウスにおけるＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクトの作用の定量化を示す。一致するコホートを使用した、親ＴｆＲ結合ペプチド（「親」）（例えば、表記のとおり配列番号１、配列番号２、または配列番号３２、または配列番号３５４）またはシステイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）－ＮＴコンストラクトもしくはマウストランスフェリン－ＮＴコンストラクト（例えば、表記のとおり配列番号３３～配列番号３５または配列番号３５５を含む）（「ＮＴ融合体」）を静脈内投与する前（刺激なし）または静脈内投与から４時間後（「ＮＴ融合体」または「親」と表記）のいずれかにおける発光（腹腔内ルシフェリン投与を介する）を示す。横棒は、サンプルの平均を示す。有意性は、Ｔ検定（対応なし、両側）を使用して決定した。（＊：Ｐ＜０．０５。＊＊：Ｐ＜０．０１。＃：Ｐ＜０．０００１）。親（配列番号３５４）及びＮＴトランスフェリンペプチドコンストラクト（配列番号３５５）の両方に、マウストランスフェリンを使用した。ＣＲＥ－ルシフェラーゼ（ＣＲＥ－Ｌｕｃ）マウスにおけるＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクトの作用の定量化を示す。図３０Ａで定量された配列番号３２コホートの画像を疑似カラーの発光強度で示す。全ての画像は、見やすさのためだけに、背景を等しく除去し、コントラスト強調されている。フォルスコリン及びロリプラム誘導の４時間後のｉｎｖｉｖｏＣＲＥ－ルシフェラーゼ発光を示す。画像は、マウスのルシフェラーゼ蛍光画像を示し、図３０に示される実験の陽性対照となる。フォルスコリン及びロリプラムは、ニューロテンシン受容体経路に依存せずに、ＣＲＥ依存性ルシフェラーゼ発現を活性化する。フォルスコリン及びロリプラムは、それぞれアデニリルシクラーゼの活性化及びｃＡＭＰホスホジエステラーゼの阻害を介してＣＲＥ発現を誘導する。Ｎ＝８マウス。パネルは、ロリプラム及びフォルスコリンで同じように処置した反復実験動物を示す。１匹のマウスは、ルシフェリン注射が腹膜内に当たらなかったために打ち切った。遊離ニューロテンシンペプチドを静脈内投与した後のＣＲＥ－Ｌｕｃマウスにおけるルシフェラーゼ発現を示す。静脈内の遊離ニューロテンシンは、ＣＲＥ－Ｌｕｃマウスにおいてルシフェラーゼ発現を誘導できない。高用量の遊離ニューロテンシンペプチド（３００ｎｍｏｌ）またはビヒクル（ＰＢＳ中１０％ＤＭＳＯ）を静脈内投与した４時間後のＣＲＥ－ルシフェラーゼマウスのｉｎｖｉｖｏ発光を腹腔内ルシフェリン注射で評価し、ＩＶＩＳイメージャーで画像化した。「ｎｓ」は、Ｔ検定（対応なし、両側）で算出した場合、結果が有意でなかったことを示す（Ｐ＝０．４８）。配列番号１の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドまたは配列番号３２の配列を有するペプチドのいずれかの２０ｍｇ／ｋｇのＩＶ単回投与後におけるペプチドの生体内分布及び器官蓄積の定量化を示す。ペプチドレベルを３０分及び３時間に測定した（３時間のデータは図１８にも示される）。この用量では、３時間後、ＣＮＳで１５０ｎＭを超えるレベル、腫瘍で約１μＭのレベルに達した。棒グラフは、全身オートラジオグラフィーで測定した、同じ画像内の既知の放射能、及びペプチドを静脈内注射したマウスから投与３時間後に得た様々な組織におけるペプチド比活性に対する各^１４Ｃ標識ペプチドのレベルを定量化する。組織データを７つのクラスターで、それぞれ４本の棒でプロットしている。４本の棒のクラスターは、異なる組織タイプに対応し、ｘ軸に示されるように、左から右に、皮膚、脂肪、筋肉、脾臓、腎臓、肝臓、脳、及び血液である。各クラスターの４本の棒は、左から右に、配列番号１３０分（Ｎ＝１０切片）、配列番号１１８０分（Ｎ＝１４切片）、配列番号３２３０分（Ｎ＝１２切片）、及び配列番号３２１８０分（Ｎ＝２１切片）に対応する。ｙ軸は、ｎｍｏｌｇ^－１組織のペプチドを０．０１～１００で１０刻みの対数スケールで示す。各棒の値は、左から右に、皮膚：１．３３、１．１２、１．７０、１．０２、脂肪：０．７９、０．５２、０．５２、０．２７、筋肉：０．６３、０．３５、０．４４、０．３５、脾臓：４．３７、２０．０３、１．１７、３．６０、腎臓：２９．０５、９．７１、１６．９１、３．１０、肝臓：４．７９、２２．１８、１．８０、８．５４、脳：０．２３、０．１６、０．２１、０．０９、及び血液：１．５８、０．６２、０．８６、０．３４である。脾臓、腎臓、及び肝臓に対応する棒は、他のセットよりも明らかに高い。挿入図は、脳から得た同データを血液に対して正規化したものを示す。４本の棒は、左から右に、配列番号１３０分（Ｎ＝１０切片）、配列番号１１８０分（Ｎ＝１４切片）、配列番号３２３０分（Ｎ＝１２切片）、及び配列番号３２１８０分（Ｎ＝２１切片）に対応する。ｙ軸は、血液に対して正規化したペプチドを１～１００で、１０刻みの対数スケールで示す。各棒の値は、左から右に、１４％、２６％、２５％、及び２７％の血中ペプチドレベルである。ＳＡ２１融合ペプチドの精製を示す。配列番号３７３に対応する血清アルブミンペプチド（ＳＡ２１）に融合させたＴｆＲ結合ペプチドの精製を示す。純度は、ＤＴＴ還元（「Ｒ」）または非還元（「ＮＲ」）条件下におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（右）によって検証された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、切断していない（「Ｕ」）シデロカリン－ＣＤＰ融合ペプチドでも実施された。ＳＡ２１融合ペプチドの精製を示す。配列番号４５６（ＧＳＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＲＩＰＶＳＣＫＨＳＧＱＣＬＫＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＤＣＴＰＫ）に対応するＳＡ２１に融合されたペプチドの精製を示す。純度は、ＤＴＴ還元（「Ｒ」）または非還元（「ＮＲ」）条件下におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（右）によって検証された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、切断していない（「Ｕ」）シデロカリン－ＣＤＰ融合ペプチドでも実施された。

中枢神経系（ＣＮＳ）に位置する標的への薬物送達は、血液脳関門（ＢＢＢ）によって妨げられることがあり、この用語は、ＣＮＳ毛細血管の血管内皮細胞を指す。このシステムは、有害な代謝物及び病原体がＣＮＳ（例えば、脳）内に入らないようにするために存在するが、同時に、従来の薬を使用したＣＮＳ疾患の治療を特に困難にしている。これは、原発性ＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫）ならびに多発性硬化症及びアルツハイマー病などの神経炎症性疾患及び神経変性疾患が、標的細胞への薬物送達が阻害されにくい末梢組織を冒す同様の疾患には高い効果を示し得る治療法に対して、応答が特に低いことの理由であり得る。ＣＮＳの障害は、脳癌から神経変性、加齢に伴う炎症プロセスまで無数にのぼり、ＣＮＳへの薬物送達には様々なアプローチが必要である。ＢＢＢは、オスモライト及び栄養素が血清から脳内に入るのを許可し、ＣＮＳ星状膠細胞は、ニューロンが必要とする成長及び生存シグナルの多くを提供する一方で、トランスフェリン（鉄シャペロン）、インスリン、及びレプチンなどのいくつかの大きなホルモン及びタンパク質は、ＢＢＢを通過することができる。トランスフェリンなどの大きな分子のＣＮＳ輸送は、受容体媒介性トランスサイトーシスまたは「小胞性トランスサイトーシス」（例えば、細胞内の小胞での頂端側から基底側またはその逆へのカーゴの輸送）によって達成することができる。例えば、正常なエクトドメインを含有するインスリン、レプチン、及びトランスフェリンの内因性受容体（それぞれ、ＩｎｓＲ、ＯｂＲ、及びＴｆＲ）のバリアントは、これらの分子のＣＮＳへの輸送を促進するために、ＣＮＳ血管内皮細胞によって利用することができる。このように選択性の高い方法で、トランスフェリン（分子量およそ７５ｋＤａ）のような特定の大きな分子は、脳実質にアクセスすることができる。

種々の実施形態において、本開示は、カーゴ分子または活性薬剤（例えば、小分子、ペプチド、またはタンパク質）を内皮細胞層（例えば、ＢＢＢ）または上皮細胞層を含む細胞層または障壁を越えて輸送することを可能にする組成物、及びこれらの組成物を使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＢＢＢを通過することができない様々な分子をＣＮＳに送達することを可能にする組成物及び方法を提供する。いくつかの場合において、本開示は、治療用及び／または診断用分子をＣＮＳ、例えば、脳に送達するための組成物及び方法を提供する。したがって、種々の実施形態において、本開示は、ＢＢＢを通過することが可能なペプチドを提供する。これらのペプチドは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対して親和性及び選択的を有し得る。ＴｆＲ結合ペプチドは、システイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）であり得る。いくつかの場合において、本開示のペプチドは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを通過することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、小分子、ペプチド、もしくはタンパク質などの任意の分子タイプの化学コンジュゲーションによって、またはペプチドもしくはタンパク質の組換え融合によってそれぞれ連結される、ペプチドコンジュゲート、ペプチドコンストラクト、融合ペプチド、または融合分子であり得る（例えば、ペプチドコンストラクト）。「融合ペプチド」及び「ペプチド融合体」という用語は、本明細書中で区別なく使用される。いくつかの実施形態において、ペプチドコンストラクトは、生物学的または合成的に生成することができる。したがって、いくつかの場合において、ＴｆＲ結合ペプチドは、小分子、ペプチド、もしくはタンパク質などの別の分子もしくは分子群、またはナノ粒子などの他の巨大分子に連結されたＴｆＲ結合ペプチドドメインを含み得る。

いくつかの実施形態において、本開示は、細胞障壁または分子障壁を越える輸送を可能にする方法及び組成物を提供する。種々の実施形態において、本開示は、細胞層（例えば、内皮細胞または上皮細胞）または細胞膜を越えるＴｆＲ媒介性輸送を可能にする方法及び組成物を提供する。いくつかの場合において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）を越える輸送を可能にする。様々な態様において、本開示のペプチドは、ＴｆＲを発現する任意の細胞を標的とするために使用することができる。ＢＢＢに加えて、様々な他の細胞、組織、及び器官がＴｆＲを発現する。ＴｆＲを発現する細胞は、肝細胞、赤血球及び骨髄中の赤血球前駆細胞、免疫細胞、幹細胞、ならびに急速に分裂する細胞を含み得る。ＴｆＲを発現する組織及び器官は、脳（例えば、大脳皮質、海馬、尾状、小脳）、内分泌腺組織（例えば、甲状腺、副甲状腺、及び副腎）、骨髄及び免疫系（例えば、虫垂、リンパ節、扁桃腺、脾臓）、筋肉組織（例えば、心臓、骨格、及び平滑筋）、肝臓、胆嚢、膵臓、消化管（例えば、口腔粘膜、食道、胃、十二指腸、小腸、結腸、直腸）、腎臓、膀胱、婦人科組織（例えば、卵管、乳房、膣、子宮頸、子宮内膜、卵巣、及び胎盤）、脂肪及び軟組織、ならびに皮膚を含み得る。したがって、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、これらの細胞、組織、及び器官を標的とし、これらの細胞、組織、及び器官に、例えば、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスを介して（例えば、ＢＢＢなどの細胞障壁を越えて）またはＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して（例えば、細胞膜を越えて細胞内に）活性薬剤を送達するために使用することができる。

種々の実施形態において、本開示は、いくつかの場合において、ＣＭＹＣ過剰発現がＴｆＲ過剰発現を生じ得るため、ＴｆＲを発現するがん細胞またはＣＭＹＣ過剰発現癌へのＴｆＲ媒介性輸送及び送達を可能にする方法及び組成物を提供する。ＴｆＲを発現するがんは、卵巣癌、結腸癌、肺癌、骨もしくは骨髄に位置する癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、脾癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、骨髄細胞癌、皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはＣＭＹＣ過剰発現癌を含み得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、１つ以上の活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合された本明細書に記載される１つ以上のＴｆＲ結合ペプチドを含む、ペプチドコンストラクトであり得る。本明細書に記載されるペプチドコンストラクトは、化学コンジュゲート及び組換え融合分子を含み得る。いくつかの場合において、化学コンジュゲートは、別の分子に化学的にコンジュゲートされるか、または連結された本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドを含み得る。分子は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または他の巨大分子（例えば、ナノ粒子）及び重合体（例えば、核酸、ポリリシン、またはポリエチレングリコール）を含み得る。いくつかの場合において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、リンカーを介して別の分子にコンジュゲートされる。リンカー部分は、切断可能（例えば、ｐＨ感受性リンカーまたは酵素に不安定なリンカー）または安定なリンカーを含み得る。いくつかの実施形態において、ペプチドコンストラクトは、組換え発現され得る融合分子（例えば、融合ペプチドまたは融合タンパク質）であり、融合分子は、組換え発現され得る１つ以上の他の分子ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または他の巨大分子に融合された１つ以上のＴｆＲ結合ペプチドを含み得る。

いくつかの場合において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ある特定の生物学的作用を発揮することが可能な治療用（「活性薬剤」とも呼ばれる）カーゴ分子または診断用（「検出可能な剤」とも呼ばれる）カーゴ分子にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合されて、ペプチドコンストラクトをもたらす。いくつかの場合において、本明細書で使用される治療用または診断用カーゴ分子は、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを越えて輸送され得る。ＣＮＳ内部に入ると、カーゴ分子は、特定の細胞、細胞集団、または組織を標的とし得る。いくつかの場合において、治療用または診断用カーゴ分子は、本明細書に開示される組成物及び方法と組み合わせて使用される場合、ＢＢＢを越えた効果的な輸送により、ＣＮＳ内で極めて高い効力を発揮することが可能な既知の化合物である。

本開示のペプチド、またはその誘導体、フラグメント、もしくはバリアントは、ＴｆＲ、またはその誘導体もしくはアナログに対して、親和性及び選択的を有し得る。いくつかの場合において、本開示のペプチドは、部位飽和変異導入（ＳＳＭ）を使用して操作され、改善されたＴｆＲ結合特性を示すか、またはトランスサイトーシスをより効果的に促進することができる。いくつかの場合において、本開示のペプチドは、ノットペプチドまたはヒッチン由来ペプチドもしくはノッティン由来ペプチドに関連するシステイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）である。ＴｆＲ結合ペプチドは、システイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）であり得る。「ペプチド」、「ＣＤＰ」、「ＴｆＲ結合ペプチド」、「ＴｆＲ結合ＣＤＰ」、及び「ＴｆＲ結合ペプチド」という用語は、本明細書中で区別なく使用される。ヒッチンは、ＣＤＰのサブクラスであり得、６つのシステイン残基が接続性［１－４］、２－５、３－６に従ってジスルフィド結合を形成し、これは、１番目のシステイン残基が４番目の残基と、２番目のシステイン残基が５番目の残基と、３番目のシステイン残基が６番目の残基とジスルフィド結合を形成することを示す。この命名法の括弧は、システイン残基がノッティングジスルフィド結合を形成することを示す。（例えば、Ｃｏｒｒｅｎｔｉｅｔａｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｃｙｓｔｉｎｅ－ｄｅｎｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏｌ．２０１８Ｍａｒ；２５（３）：２７０－２７８参照）。ノッティンは、ＣＤＰのサブクラスであり得、６つのシステイン残基は、接続性１－４、２－５、［３－６］に従ってジスルフィド結合を形成する。ノッティンは、通常、約２０～約８０アミノ酸長の範囲のペプチドのクラスであり、多くの場合、コンパクトな構造に折り畳まれる。ノッティンは、典型的に、多数の分子内ジスルフィド架橋を特徴とし、ベータストランド及び他の二次構造を含み得る、複雑な三次構造に組み立てられる。ジスルフィド結合の存在は、ノッティンに顕著な環境安定性を付与し、それにより、ノッティンは、極端な温度及びｐＨに耐え、血流のタンパク質分解酵素に抵抗することができる。いくつかの場合において、本明細書に記載されるペプチドは、ノットペプチドに由来し得る。本明細書で開示されるペプチドのアミノ酸配列は、複数のシステイン残基を含み得る。いくつかの場合において、ペプチドのアミノ酸配列内に存在する複数のシステイン残基の少なくともシステイン残基がジスルフィド結合の形成に関与する。いくつかの場合において、ペプチドのアミノ酸配列内に存在する複数のシステイン残基の全てのシステイン残基がジスルフィド結合の形成に関与する。本明細書に記載される場合、「ノットペプチド」という用語は、「システイン高密度ペプチド」、「ＣＤＰ」、または「ペプチド」という用語と区別なく使用され得る。

本明細書で提供されるのは、トランスフェリン受容体に結合し、対象（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）における治療上適切な濃度で生物活性分子の蓄積を可能にするＣＤＰの特定、成熟、特性評価、及び利用の方法である。本開示は、現代の創薬戦略への適用の可能性についてスクリーニングすることができる、多様な足場ファミリーとしてのＣＤＰの実用性を示すものである。ＣＤＰは、既存の生物学的製剤、主に抗体の代替物であり、低い組織透過性、免疫原性、及び毒性が生じた場合に問題となり得る長い血清半減期を含む、免疫グロブリン足場の不利益のいくつかを回避することができる。２０～８０アミノ酸の範囲の本開示のペプチドは、中型であり、抗体の好ましい結合特異性及び親和性の特徴の多くを有しつつも、安定性が改善され、免疫原性が低く、製造方法がより簡単である、医学的に意味のある治療薬である。ＣＤＰの分子内ジスルフィド構造により、特に高い安定性指標が付与され、それにより、フラグメンテーション及び免疫原性が低減し、また、サイズが小さいことで、組織透過または細胞透過が改善し、血清半減期の調整が容易になる。本明細書で開示されるのは、ＣＮＳ薬物送達ビヒクルとして機能することができるペプチド候補を表すペプチドである。本開示のペプチドは、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）であり得る。ＣＰＰは、細胞透過、組織透過、またはその両方であり得る。

いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、ＣＤＰであり得る。ＣＰＰは、様々な部分及び薬剤の細胞の摂取または取り込みを促進するペプチドを含み得、それ自体が細胞膜を越えて移動し得る。ＣＰＰは、細胞膜を越えて移動することができる短いペプチド配列の一種であるタンパク質形質導入ドメインを含有し得る。細胞透過ペプチドは、細胞のサイトゾル、細胞の核、または細胞の他の細胞成分の位置に直接的または間接的に入ることができる。細胞透過ペプチドは、核酸、ペプチド、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、代替的な骨格化学特性を含む核酸（例えば、連結核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ））、放射性核種、造影剤、蛍光剤、治療薬、ナノ粒子などを含む、様々なカーゴの適切な担体として使用することができる。ＣＰＰは、人工または操作された配列（例えば、合成配列）であり得る。ＣＰＰは、複数のタンパク質配列を含み得るが、かかるタンパク質配列は、天然、合成、またはバリアント（例えば、キメラ）にかかわらない。ＣＰＰは、単一のタンパク質配列から得ることができるが、かかるタンパク質配列は、天然、合成またはバリアント（例えば、タンパク質由来配列）にかかわらない。ＣＰＰは、カチオン性、両親媒性または疎水性などの様々な生理化学的特性を示すことができる。ＣＰＰの内在化のいくつかの機序には、直接的な細胞透過、エンドサイトーシス経路の使用、及び一時的な構造体の形成による移動が含まれる。本明細書の細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）の説明及び使用は、限定されないことが理解される。ＣＰＰの非限定的な例は、ＤｅｒａｋｈｓｈａｎｋｈａｈａｎｄＪａｆａｒｉ，“Ｃｅｌｌｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｃｏｎｃｉｓｅｒｅｖｉｅｗｗｉｔｈｅｍｐｈａｓｉｓｏｎｂｉｏｍｅｄｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ；Ｖｏｌｕｍｅ１０８，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０１８，Ｐａｇｅｓ１０９０－１０９６）に見出すことができ、その全体が参照により援用される。

本明細書で開示される方法及び組成物と組み合わせて使用することができるいくつかの治療用分子は、ＣＮＳの一部である１つ以上の特定の細胞または組織を標的とすることが可能である。例えば、Ｇタンパク質結合受容体であるニューロテンシン受容体（ＮＴＳＲ）は、ニューロテンシン（本明細書中「ＮＴ」と略される；ＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ（配列番号３５０））、またはＮＴＳＲと略される神経ペプチドであるその誘導体に連結されたＣＤＰを含む融合タンパク質を用いて標的化される。いくつかの場合において、ＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクトは、対象（例えば、ヒト）の慢性疼痛または神経障害性疼痛を予防または治療するために使用される。

また、本明細書で記載されるのは、侵害受容性疼痛、または本明細書に記載される他の治療適応症を含む疼痛の知覚、調節、管理、減少、除去または低減に関与する中枢神経系（ＣＮＳ）の特定の領域、組織、構造または細胞に対して、選択的にホーミング、標的化、指向、移動、到達可能、保持、蓄積、及び／または結合するペプチドである。罹患領域の１つ以上の特定の領域、組織、構造または細胞に対して、ホーミング、標的化、移動、指向、保持、もしくは蓄積及び／または結合するペプチドは、オフターゲット及び潜在的な悪影響、例えば、鎮痛薬の使用及び有効性を制限することが多い副作用がより小さくなり得る。加えて、そのようなペプチドは、血液脳関門が原因で活性薬剤がＣＮＳに治療レベルで到達することができない場合でも、ＣＮＳなどの領域に、それらの活性薬剤を送達することができる。そのようなペプチドはまた、オピオイド薬を含む他の鎮痛剤の必要性を低減することができる。加えて、そのようなペプチドは、既存の薬物を罹患領域の特定の領域、組織、構造もしくは細胞に直接標的化すること、及び罹患領域との接触を助けること、または薬剤の局所濃度を増加させることによって、既存の薬物の投与量を減らし、有効性を上げることができる。ペプチドは、それ自体が疼痛を調節することができるか、または、疼痛を調節する薬剤にコンジュゲートすることができる。そのような疼痛の調節は、炎症、自己免疫応答、疼痛受容体に対する直接的もしくは間接的作用、細胞殺傷、またはプログラム細胞死を調節することなどの様々な機序によって作用し得る（罹患した細胞または組織などのアポトーシス経路及び／または非アポトーシス経路を介するかにかかわらない（Ｔａｉｔｅｔａｌ．ＪＣｅｌｌＳｃｉ１２７（Ｐｔ１０）：２１３５－４４（２０１４））。

ＣＤＰは、抗体などの他の分子と比較して、サイズが小さく、組織または細胞への透過が高く、血清からのクリアランスが速いという点で、また、小さいペプチドと比較して、プロテアーゼに耐性があるという点（安定性及び免疫原性の低下の両方）で、ＣＮＳへの送達について有利であり得る。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチド（例えば、ＣＤＰ、ノットペプチド、またはヒッチン）、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート（例えば、１つ以上のＴｆＲ結合ペプチド及び１つ以上の活性薬剤を含む）、または操作されたＴｆＲ結合融合ペプチド（例えば、１つ以上のＴｆＲ結合ペプチド及び１つ以上のペプチドを含む）は、ＴｆＲ結合抗体よりも優れた特性を有し得る。例えば、本明細書に記載されるペプチド及びコンストラクトは、細胞及び標的組織へのより優れた、より深い、及び／またはより速い組織または細胞透過（例えば、脳実質への透過、固形腫瘍への透過）、ならびに標的以外の組織及び血清からの速いクリアランスを提供し得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、ＴｆＲ結合抗体よりも低い分子量を有し得る。分子量が低いことは、ＴｆＲ結合抗体と比較して、本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドに有利な特性を付与し得る。例えば、本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、抗ＴｆＲ抗体よりも容易に細胞または組織に透過し得るか、または抗ＴｆＲ抗体よりも低いモル用量毒性を有し得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、抗体のＦｃ機能を欠くため、有利であり得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、モル基準で、製剤の高い濃度を可能にするため、有利であり得る。

本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬と比較して、より広い治療濃度域（例えば、治療上の薬力学応答が観察される量を上回るが、毒性が観察される量を下回る投与量）を有し得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬と比較して、毒性のリスクが少なく、より高いモル投与量で使用され得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬と比較して、適応免疫応答を誘発するエピトープが少ないため、免疫原性が低下し得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬と比較して、活性薬剤のタンパク質融合コンストラクトへの組み込みがより容易で破壊的でないことを示し得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬と比較して、表面積が小さいため、オフターゲット結合のリスクが低くなり得る。例示的な比較は、実施例５４に記載される。

いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、対象に同じモル用量または同様の有効用量で投与された場合、抗ＴｆＲ抗体よりも低いオンターゲット毒性を示す。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、対象に同じモル用量または同様の有効用量で投与された場合、抗体よりも低いオフターゲット毒性を示す。例えば、本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、抗体よりも約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍高いモル用量で対象に投与され得るが、観察される毒性は同等であるか、または低い。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、抗ＴｆＲ抗体と同じ重量の用量で対象に投与された場合、抗ＴｆＲ抗体よりも高い有効性を示す。本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、半減期延長部分（例えば、Ｆｃ、ＳＡ２１、ＰＥＧ）に融合された場合、活性及び有効性を維持しながら、更に低用量で送達することができ、したがって、抗ＴｆＲ抗体の投与よりもはるかに優れている。

本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ペプチドコンストラクトとして活性薬剤に融合される場合、同じ標的に対する操作された抗ＴｆＲ二重特異性抗体よりも高い有効性を示し得る。例えば、本明細書で開示される操作されたＴｆＲ結合ペプチドは、ＢＡＣＥ阻害薬に更に融合され得る。これらの操作されたＴｆＲ結合ペプチド－ＢＡＣＥ阻害薬コンストラクトは、同じまたは高い有効性を維持しながら、二重特異性抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体よりも高いモル用量で投与することができる。例えば、操作されたＴｆＲ結合ペプチド－ＢＡＣＥ阻害薬コンストラクトは、網状赤血球減少症を引き起こすことがあまりなく、アミロイドベータ形成を効果的に阻害することができ、操作されたＴｆＲ結合ペプチド－ＢＡＣＥ阻害薬コンストラクトが投与された対象に対する毒性が低いか、または全くない。対照的に、二重特異性抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体は、網状赤血球減少症を引き起こす可能性があり、及び／またはアミロイドベータ形成を阻害する有効性が低く、対象に対する毒性が高いことがあることから、嗜眠、苦痛、及び溶血の徴候をもたらし得る。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＴｆＲに結合する、ペプチド（例えば、ＣＤＰ、ノットペプチド、またはヒッチン）、化学コンジュゲート（例えば、１つ以上のＴｆＲ結合ペプチド及び１つ以上の活性薬剤を含む）、または組換え発現された融合分子（例えば、１つ以上のＴｆＲ結合ペプチド及び１つ以上の活性薬剤を含む）を提供する。ＴｆＲ結合ペプチドは、システイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）であり得る。「ペプチド」、「ＣＤＰ」、「ＴｆＲ結合ペプチド」、「ＴｆＲ結合ＣＤＰ」、「ＴｆＲ結合ペプチド」、及び「操作されたＴｆＲ結合ペプチド」という用語は、本明細書中で区別なく使用される。本開示に記載されるペプチドのＴｆＲへの結合は、ペプチドまたはペプチドコンストラクト（例えば、融合タンパク質、または薬剤にコンジュゲート、連結、もしくは融合されたペプチド）の細胞障壁（例えば、ＢＢＢ）を越えたトランスサイトーシスを促進することができる。また本明細書で開示されるのは、ＣＤＰの多様なライブラリーをスクリーニングし、ヒトＴｆＲに特異的に結合するＣＤＰを特定するための哺乳動物の表面提示スクリーニングプラットフォームの使用である。その後、更なる親和性成熟を実施して、様々な親和性を有するＴｆＲ結合ＣＤＰのアレルシリーズを得ることができる。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ＣＤＰが特定され、結合は結晶学によって決定され得る。本開示のペプチドは、種間で交差反応性を有し得る。例えば、本明細書で開示されるペプチドは、いくつかの場合において、ヒト及びマウスＴｆＲに結合する。本明細書で開示されるペプチドは、ニューロテンシンペプチドコンストラクトを使用したｃＡＭＰ応答配列シグナル伝達カスケードの誘導を含め、静脈内投与後、ＣＮＳに蓄積し、ＴｆＲの結合を介してＢＢＢを透過することができる。本明細書で開示されるのは、腫瘍学、自己免疫疾患、急性及び慢性神経変性、ならびに疼痛管理における治療薬送達剤として使用するためのＴｆＲ結合ＣＤＰである。ＴｆＲ結合ＣＤＰを介した活性薬剤または医療薬剤の送達は、製造がより簡単で（ペプチドは生物学的または合成的手段により製造することができる）、安定性が改善され、サイズが小さい（カーゴ活性の立体障害の可能性が低い）ことから、従来の抗ＴｆＲ抗体よりも有利であり得る。したがって、本開示の方法及び組成物は、ＣＮＳ（例えば、脳）内にカーゴ分子（例えば、治療用及び／または診断用小分子、ペプチドまたはタンパク質）を効果的に輸送するという課題に対する解決策を提供することができる。例えば、本開示のペプチドは、脳に位置する腫瘍への薬物送達を助ける。

本開示のいくつかの実施形態において、ＣＤＰ、ノットペプチド、ヒッチン、またはノットペプチドもしくはヒッチンに由来するペプチドの多様なライブラリーは、哺乳動物の表面提示スクリーニングプラットフォームと組み合わせて使用することができ、ヒトＴｆＲに特異的に結合するペプチドを特定するために使用される。（例えば、Ｃｒｏｏｋｅｔａｌ．（２０１７）Ｍａｍｍａｌｉａｎｄｉｓｐｌａｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｄｉｖｅｒｓｅｃｙｓｔｉｎｅ－ｄｅｎｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｆｏｒｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｄｒｕｇｔａｒｇｅｔｓ．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ８：２２４４参照）。いくつかの実施形態において、ＣＤＰ、ノットペプチド、ヒッチン、またはノットペプチドもしくはヒッチンに由来するペプチドの多様なライブラリーは、内因性ペプチド配列から変異導入させることで、新規ペプチド配列が得られる。ＴｆＲ結合ペプチドが特定されたら、親和性成熟（例えば、部位飽和変異導入）を実施して、ＴｆＲに対する親和性が様々な（例えば、改善された）結合物質のアレルシリーズを得ることができる。これらの技術は、ペプチド－受容体相互作用の性質（例えば、受容体結合などに重要なアミノ酸残基）を特定するために、様々な他の分析方法（例えば、結晶学または分光法）と組み合わせて使用することができる。いくつかの場合において、本開示のペプチドは、ヒトＴｆＲに結合するように開発されるが、それらのペプチドは、マウスＴｆＲなどの他の種に由来するＴｆＲと交差反応性を示し得る。

本開示のペプチドは、ｉｎｖｉｖｏで様々な生体内分布パターンを有し得る。いくつかの場合において、器官分布、標的器官（例えば、脳）におけるペプチドの取り込み及び滞留時間、ならびにクリアランス様式（例えば、腎臓または肝臓）を決定するために、例えば、放射性標識ペプチド（例えば、^１４Ｃ標識ペプチド）を使用して、マウス生体内分布及び薬物動態学的研究が実施される。

種々の実施形態において、本開示は、ＣＮＳ（例えば、脳）に蓄積するペプチドを提供する。いくつかの場合において、それらのペプチドのＣＮＳ蓄積は、ＢＢＢを越えて透過することによる。いくつかの場合において、本明細書に記載される操作されたＴｆＲ結合ペプチドバリアントは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスによってＢＢＢを通過する。いくつかの場合において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ＣＮＳに位置する腫瘍組織に蓄積する。いくつかの場合において、ペプチドが蓄積する腫瘍は、脳腫瘍（例えば、神経膠腫）である。本明細書に記載される場合、「蓄積する」及び「～に蓄積する」という用語は、区別なく使用され、「細胞及び／または組織内または細胞及び／または組織上の蓄積を指すために使用され得、それぞれの分子（例えば、ＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクト）の濃度が経時的に漸増することが理解され得る。

いくつかの実施形態において、本開示の操作されたペプチド（例えば、ヒスチジン含有またはヒスチジンリッチＴｆＲ結合ペプチド）は、生理学的なｐＨで高いＴｆＲ結合親和性を有するが、エンドソームのｐＨ５．４などの低いｐＨレベルでは、結合親和性が著しく低下し得る。いくつかの場合において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、高いＴｆＲ結合能力を保持しながら、小胞内（例えば、エンドソーム内）及び／または細胞内送達機能を改善するために最適化され得る。いくつかの場合において、ヒスチジンスキャン及び比較結合実験を実施して、そのようなペプチドを開発及びスクリーニングすることができる。加えて、いくつかのペプチドは、送達機能（例えば、治療薬の細胞内送達）を増大させるために、ペプチドまたはペプチドコンストラクトの低ｐＨエンドソーム脱出を促進するモチーフを含み得る（例えば、コンジュゲート、連結、または融合される）。いくつかの実施形態において、本開示のペプチド中のアミノ酸残基は、ＴｆＲへのｐＨ依存性結合親和性を変更するために、異なるアミノ酸残基で置換される。アミノ酸置換は、低いｐＨにおける結合親和性を増加させること、高いｐＨにおける結合親和性を増加させること、低いｐＨにおける結合親和性を減少させること、高いｐＨにおける結合親和性を減少させること、またはこれらの組み合わせを含み得る。

例示的な本開示のペプチドは、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、及び配列番号１７１～配列番号２０２に示されるアミノ酸配列を含む表１に示される。

種々の実施形態において、本開示のペプチドは、治療用及び／または診断用分子（例えば、小分子、ペプチド、またはタンパク質）を細胞層またはＢＢＢなどの細胞障壁を越えて輸送するように設計されたペプチドコンストラクトまたは融合ペプチドなどのペプチドコンストラクトの一部（例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、配列番号３５９～配列番号３６１、配列番号３７３、配列番号３７５、配列番号３８１、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９３、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号４００、及び配列番号４０１のいずれか１つのアミノ酸配列を有するもの）である。例示的なペプチドコンストラクトは、表２、表５、及び表６に示される。本開示のペプチドコンストラクトは、治療用及び／または診断用の分子または化合物に連結された（例えば、化学コンジュゲートまたは融合された）ＴｆＲ標的ペプチドを含み得る。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを通過することができ、したがって、治療用及び／または診断用の分子または化合物をＣＮＳに送達することができる。したがって、本開示の方法及び組成物は、様々な疾患または状態の診断、予防、及び治療に対して大きな影響を与え得る。本開示の方法及び組成物が使用され得る疾患領域としては、腫瘍学、自己免疫疾患、急性及び慢性神経変性、筋肉障害、神経心理学的障害、てんかん、統合失調症、鬱病、不安、双極性障害、脳発達障害（例えば、自閉症スペクトラム）、疼痛、てんかん、気分障害、ならびに疼痛管理が挙げられるが、これらに限定されない。

したがって、ＣＮＳの障害を有する対象は、ＢＢＢへの透過が低いことで制限されている薬物または薬物クラスの利益を享受することができないが、本明細書で提供されるＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲートすることによって、ＣＮＳにおける治療上有効な薬物濃度を達成することができるので、本明細書に記載される組成物及び方法の利益を享受することができる。薬理学的利点に加えて、ＴｆＲ結合ペプチドを含む本明細書に開示される組成物及び方法は、その産生、品質管理、及び安全性の点で、従来のＣＮＳ及びＴｆＲ標的薬剤（例えば、抗ＴｆＲ抗体）よりも優れていることがあり得る。例えば、本開示のペプチド及びペプチドコンストラクトは、より簡単で、より安価で、より資源効果の高い方法で製造され（例えば、ペプチドは生物学的または合成的アプローチを介して合成することができる）、本開示のペプチド及びペプチドコンストラクトは、ｅｘｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｖｏでの安定性の改善を示すことができ、サイズが小さく（例えば、カーゴ活性に対する立体障害の可能性が低く、固形腫瘍などの密な組織を透過する能力があり、体循環からのクリアランスが速くなる可能性がある）、組織または細胞への高い透過を示し、低い免疫原性を有する。本開示のペプチドは、結晶学的データと、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）もしくはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ペプチドフラグメント結合実験もしくはそのコンピューター予測、または前述の組み合わせとを組み合わせることによって、低い免疫原性を有するように操作することができる。

細胞層またはＢＢＢなどの細胞障壁を通過する能力を有する治療用または診断用薬剤の特定は、かかる方法が、高い特異性または標的化、トランスサイトーシスを促進することができる受容体（例えば、ＴｆＲ）に対する親和性の高い結合物質、及び細胞を標的とし、トランスサイトーシス後に標的タンパク質に作用する能力（オフターゲットの悪影響が少ない）を必要とすることから、困難であった。いくつかの例外を除いて、小分子ライブラリーを用いた高スループットスクリーニングプロジェクトは、内皮層もしくは上皮層を通過すること及び／またはそれらの層を越えてカーゴを輸送することが可能な特定の化合物を提供することができなかった。

本明細書に記載されるのは、いくつかの実施形態において、ＴｆＲなどの目的のタンパク質を標的とするペプチド及びペプチドコンストラクトならびにペプチド及びペプチドコンストラクトをスクリーニングする方法である。トランスフェリンなどの野生型または内因性分子と比較して、本明細書に記載される方法及び組成物は、ＴｆＲ結合能力が改善したペプチド、もしくはＢＢＢを越える輸送能力の改善を示すペプチド、またはこれらの任意の組み合わせを提供することができる。いくつかの場合において、本明細書中に記載されるペプチドは、カーゴ分子（例えば、治療用または診断用小分子またはタンパク質）を内皮細胞層（例えば、ＢＢＢ）または上皮層を越えて効率的に輸送する。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ＴｆＲに結合し、小胞性トランスサイトーシスを促進する。いくつかの場合において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ＴｆＲを過剰発現する細胞（例えば、がん細胞）に結合し、細胞によるペプチドの取り込みを促進する。いくつかの態様において、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトは、小胞性トランスサイトーシス及びがんなどのＴｆＲ過剰発現細胞による取り込み、またはこれらの組み合わせを促進する。

本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ヒト、サル、マウス、及びラットＴｆＲを含む、異なる種のＴｆＲに結合することができる。いくつかの場合において、ＴｆＲ結合ペプチドのアミノ酸残基のいずれかにおける変化または変異は、交差反応性に影響し得る。いくつかの場合において、ＴｆＲの結合部位と相互作用するＴｆＲ結合ペプチドのアミノ酸残基のいずれかにおける変化または変異は、交差反応性に影響し得る。

本明細書に記載されるのは、限定するものではないが、高い親和性で標的タンパク質（例えば、ＴｆＲ）に結合する能力を保持しながら、カーゴ分子を運搬するのに十分な大きさでありつつ、サイトゾルもしくは核などの細胞コンパートメント、または細胞凝集塊の中心などの組織（例えば、固形腫瘍）にアクセスするのに十分な小ささであり得る、設計されたまたは操作されたペプチド、組換えペプチド、及びシステイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）／小さなジスルフィド－ノットペプチド（例えば、ノットペプチド、ヒッチン、及びそれらに由来するペプチド）を含む、ペプチドである。いくつかの場合において、本明細書に記載されるペプチドは、血管のトランスサイトーシスを介してＢＢＢを越えてＣＮＳ（例えば、実質）にカーゴ分子を運搬する。いくつかの場合において、トランスサイトーシスは、ＴｆＲ媒介性である。

更に、本明細書に記載されるのは、ペプチド－受容体相互作用の性質の決定（例えば、Ｘ線結晶学を使用する）ならびにＣＮＳ（例えば、脳）内の蓄積を含むｉｎｖｉｖｏにおける薬力学及び薬物動態特性の決定を行うための方法及び組成物である。本明細書に記載されるペプチドのいくつかは、腫瘍細胞を標的とし、腫瘍細胞に蓄積する能力を有する。いくつかの場合において、腫瘍細胞は、ＴｆＲを過剰発現している。いくつかの態様において、本開示のペプチドは、高いｉｎｖｉｖｏ安定性、例えば、高いプロテアーゼ安定性、グルタチオン（ＧＳＨ）などの還元剤に対する高い耐性を有し、高温（例えば、９５℃まで）に耐える。

本開示は、いくつかの実施形態において、３Ｄタンパク質または受容体構造に基づいた、かかる受容体に結合することが可能なペプチドまたはタンパク質を特定するためのペプチドまたはタンパク質の設計アプローチを提供する。いくつかの場合において、受容体は、トランスフェリン受容体である。

本開示の更なる態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態が示され、記載されている以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。認識されるように、本開示は、他の実施形態及び異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、様々な点で、全て本開示を逸脱することなく、変更することが可能である。したがって、図面及び説明は、本質的に例示的なものとしてみなされるべきであり、限定的なものとしてみなされるべきではない。

本明細書で使用される場合、天然のＬ－エナンチオマーアミノ酸の略号は、従来のものであり、次のとおりである：アラニン（Ａ、Ａｌａ）；アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）；システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）；グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）；グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）；リシン（Ｋ、Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）；セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）；チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；バリン（Ｖ、Ｖａｌ）。典型的に、Ｘａａは、任意のアミノ酸を示し得る。いくつかの実施形態において、Ｘは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）であり得る。

本開示のいくつかの実施形態は、任意の標準もしくは非標準アミノ酸またはそのアナログのＤ－アミノ酸残基を企図する。アミノ酸配列が一連の三文字または一文字のアミノ酸略号で表される場合、標準的な用法及び慣例に従って、左方向はアミノ末端方向、右方向はカルボキシ末端方向である。

「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ヒッチン」、「システイン高密度ペプチド」、「ノットペプチド」または「ＣＤＰ」という用語は、アミノ酸残基の重合体を指すために本明細書中で区別なく使用され得る。種々の実施形態において、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、そのアルファ炭素がペプチド結合を介して連結されているアミノ酸の鎖であり得る。したがって、鎖の一端（例えば、アミノ末端）の末端アミノ酸は、遊離アミノ基を有し得、鎖の他端（例えば、カルボキシ末端）の末端アミノ酸は、遊離カルボキシル基であり得る。本明細書で使用される場合、「アミノ末端」（例えば、略してＮ末端）という用語は、ペプチドのアミノ末端のアミノ酸上の遊離α－アミノ基、またはペプチド内の任意の他の位置にあるアミノ酸のα－アミノ基（例えば、ペプチド結合に関与する場合のイミノ基）を指し得る。同様に、「カルボキシ末端」という用語は、ペプチドのカルボキシ末端上の遊離カルボキシル基、またはペプチド内の任意の他の位置にあるアミノ酸のカルボキシル基を指し得る。ペプチドはまた、限定するものではないが、アミド結合に対し、エーテルまたはチオエーテルによって連結されたアミノ酸などのペプチドミメティックを含む、本質的に任意のポリアミノ酸を含む。

本明細書で使用される場合、「ペプチドコンストラクト」という用語は、１つ以上のカーゴ分子にコンジュゲート、連結、または融合することができる１つ以上の本開示のペプチドを含む分子を指し得る。いくつかの場合において、カーゴ分子は、活性薬剤である。「活性薬剤」という用語は、任意の分子、例えば、それぞれのペプチドコンストラクトの位置測定、検出、または可視化を可能にし得る生物学的作用及び／または物理的作用（例えば、放射線の放出）を惹起することが可能な任意の分子を指し得る。種々の実施形態において、「活性薬剤」という用語は、治療剤及び／または診断剤を指す。本開示のペプチドコンストラクトは、本明細書に記載される１つ以上のリンカー部分（例えば、切断可能または安定なリンカー）を介して１つ以上の活性薬剤に連結されたＴｆＲ結合ペプチドを含み得る。

本明細書で使用される場合、「含む」及び「有する」という用語は、区別なく使用され得る。例えば、「配列番号３２のアミノ酸配列を含むペプチド」及び「配列番号３２のアミノ酸配列を有するペプチド」という用語は、区別なく使用され得る。

本明細書で使用される場合、別途の指定がない限り、「ＴｆＲ」または「トランスフェリン受容体」という用語は、本明細書で使用されるタンパク質の一種であり、任意の種（例えば、ヒトもしくはマウスＴｆＲまたは任意のヒトもしくは非ヒト動物ＴｆＲ）に由来するトランスフェリン受容体を指し得る。いくつかの場合において、本明細書で使用される場合、「ＴｆＲ」または「トランスフェリン受容体」という用語は、ヒトＴｆＲ（ｈＴｆＲ）を指し、ＴｆＲまたはＴｆＲ１、ＴｆＲ２、可溶性ＴｆＲを含む既知のＴｆＲホモログもしくはオルソログのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせもしくはフラグメント（例えば、エクトドメイン）を含み得る。

「操作された」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝子環境から取り出され、そのため、他の無関係なコード配列または望ましくないコード配列を含まず、遺伝子操作されたタンパク質産生系内での使用に好適な形態であることを示す。そのような操作された分子は、その天然環境から分離されたものであり、ｃＤＮＡ及びゲノムクローン（すなわち、異なる生物に由来するＤＮＡのフラグメントを含有するベクターを含む原核細胞または真核細胞）を含む。本発明の操作されたＤＮＡ分子は、通常関連する他の遺伝子を含まないが、エンハンサー、プロモーター及びターミネーターなどの天然または非天然の５’及び３’非翻訳領域は含み得る。

「操作された」ポリペプチドまたはタンパク質は、血液及び動物組織などから離れて、その本来の環境以外の状態で存在するポリペプチドまたはタンパク質である。好ましい形態において、操作されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。ポリペプチドは、高度に精製された形態、例えば、９５％を超える純度、より好ましくは、９８％を超える純度、または９９％を超える純度で提供することが好ましい。本文脈で使用される場合、「操作された」という用語は、二量体、ヘテロ二量体及び多量体、またはグリコシル化、カボキシル化、修飾、もしくは誘導体化された形態などの代替の物理的形態で同じポリペプチドが存在することを排除しない。

「操作された」ペプチドまたはタンパク質は、天然のポリペプチドの構造、配列、または組成とは明確に異なるポリペプチドである。操作されたペプチドには、非天然ペプチド、人工ペプチド、単離ペプチド、合成ペプチド、設計されたペプチド、修飾されたペプチド、または組換え発現されたペプチドが含まれる。操作されたＴｆＲ結合ペプチド、そのバリアント、またはフラグメントが本明細書で提供される。これらの操作されたＴｆＲ結合ペプチドは、活性薬剤または検出可能な剤に更に連結され得る。活性薬剤は、半減期延長部分であり得る。

本開示のポリペプチドは、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減すること、（２）酸化に対する感受性を低減すること、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変更すること、（４）結合親和性を変更すること、及び（５）他の物理化学的特性または機能特性を付与または改変することが何らかの方法でなされるように修飾されたポリペプチドを含む。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）は、天然配列（例えば、分子間接触を形成するドメイン（複数可）以外のポリペプチドの部分）になされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸のポリペプチドにおける、機能的に類似したアミノ酸による置換を指し得る。次の６つの群には、それぞれ互いに保存的置換ができるアミノ酸が含まれる：ｉ）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、及びトレオニン（Ｔ）；ｉｉ）アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；ｉｉｉ）アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）；ｉｖ）アルギニン（Ｒ）及びリシン（Ｋ）；ｖ）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）；ｖｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）。

本明細書で使用される「ポリペプチドフラグメント」及び「切断型ポリペプチド」という用語は、対応する完全長ペプチドまたはタンパク質と比較して、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指し得る。種々の実施形態において、フラグメントは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００または少なくとも１０００アミノ酸長である。種々の実施形態において、フラグメントはまた、例えば、最大１０００、最大９００、最大８００、最大７００、最大６００、最大５００、最大４５０、最大４００、最大３５０、最大３００、最大２５０、最大２００、最大１５０、最大１００、最大５０、最大２５、最大１０、または最大５アミノ酸長であり得る。フラグメントは、その末端のいずれかまたは両方に、１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、異なる天然タンパク質に由来するアミノ酸の配列（例えば、Ｆｃまたはロイシンジッパードメイン）または人工アミノ酸配列（例えば、人工リンカー配列）を更に含み得る。

種々の実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドの界面残基（例えば、受容体結合についてＴｆＲと相互作用するアミノ酸残基）は、ペプチドのうち、主に２つのヘリカルドメインに分けることができる。いくつかの場合において、界面残基は、配列番号３２を基準として、残基５～２５に対応する残基（例えば、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｍ１１、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、及びＥ２１の対応する残基を含む）、もしくは配列番号３２を基準として、残基３５～５１に対応する残基（例えば、Ｌ３８、Ｌ４１、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｈ４９、Ｓ５０、及びＱ５１の対応する残基を含む）、または両方を含み得る。例えば、界面残基は、配列番号３２を基準として、残基５～２５に対応する残基（例えば、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｍ１１、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、及びＥ２１の対応する残基を含む）、または配列番号３２を基準として、残基３５～５１に対応する残基（例えば、Ｌ３８、Ｌ４１、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｈ４９、Ｓ５０、及びＱ５１の対応する残基を含む）を含み得る。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドは、本明細書で提供されるペプチドのフラグメントを含み得、ここで、フラグメントは、結合のための最小界面残基、例えば、配列番号３２を基準として、残基５～２５に対応する残基（例えば、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｍ１１、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、及びＥ２１の対応する残基を含む）、または配列番号３２を基準として、残基３５～５１に対応する残基（例えば、Ｌ３８、Ｌ４１、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｈ４９、Ｓ５０、及びＱ５１の対応する残基を含む）を含む。いくつかの場合において、ＴｆＲ結合ペプチドは、配列番号３２を基準として、ドメインの残基Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｍ１１、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、及びＥ２１に対応するＴｆＲ結合残基、ならびに第２のドメインの残基Ｌ３８、Ｌ４１、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｈ４９、Ｓ５０、及びＱ５１に対応するＴｆＲ結合残基を含む、配列番号３２に示される配列を有するペプチドである。

本明細書で使用される場合、「バリアント」「変異体」または「濃縮された変異体」または「順列濃縮された変異体」と関連する「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、別のポリペプチド配列を基準として、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入、欠失及び／または置換されたアミノ酸配列を含み得るペプチドまたはポリペプチドを指し得る。種々の実施形態において、挿入、欠失、または置換されるアミノ酸残基の数は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０または少なくとも５００アミノ酸長である。本開示のバリアントは、ペプチドコンジュゲートまたは融合分子（例えば、ペプチドコンストラクト）を含む。

ペプチドまたはポリペプチドの「誘導体」は、化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、リン酸化、及びグリコシル化などの別の化学部分への、例えば、コンジュゲーションがなされていてもよいペプチドまたはポリペプチドであり得る。

「％の配列同一性」という用語は、「％の同一性」と本明細書中で区別なく使用され得、配列アライメントプログラムを使用して整列させた場合における、２つ以上のペプチド配列間のアミノ酸配列の同一性のレベル、または２つ以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列の同一性のレベルを指し得る。例えば、本明細書で使用される場合、８０％の同一性は、定義されたアルゴリズムによって決定された８０％の配列同一性と同じことを意味し、所与の配列が別の長さの別の配列に対して少なくとも８０％同一であることを意味する。種々の実施形態において、％の同一性は、例えば、所与の配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％以上の配列同一性から選択される。種々の実施形態において、％の同一性は、例えば、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、または約９５％～約９９％の範囲内である。

「％の配列相同性」または「パーセントの配列相同性」または「パーセントの配列同一性」という用語は、「％の相同性」、「％の配列同一性」または「％の同一性」という用語と本明細書中で区別なく使用され得、配列アライメントプログラムを使用して整列させた場合における、２つ以上のペプチド配列間のアミノ酸配列の相同性のレベル、または２つ以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列の相同性のレベルを指し得る。例えば、本明細書で使用される場合、８０％の相同性は、定義されたアルゴリズムによって決定された８０％の配列相同性と同じことを意味し、したがって、所与の配列の相同体は、所与の配列の長さにわたって８０％を超える配列相同性を有する。種々の実施形態において、％の相同性は、例えば、所与の配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％以上の配列相同性から選択される。種々の実施形態において、％の相同性は、例えば、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、または約９５％～約９９％の範囲内である。

タンパク質またはポリペプチドは、サンプルの少なくとも約６０％～７５％が単一種のポリペプチドを示す場合、「実質的に純粋」、「実質的に均質」、または「実質的に精製」であり得る。ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体または多量体であり得る。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、典型的に、約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％Ｗ／Ｗのタンパク質サンプル、より一般的には約９５％のタンパク質サンプルを含み得、例えば、９９％を超える純度である。タンパク質の純度または均質性は、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、当該技術分野においてよく知られている染色によりゲルを染色して単一ポリペプチドバンドを可視化することなど、当該技術分野においてよく知られている多数の手段によって示すことができる。ある特定の目的のために、高速液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）または他の高分解能分析技術（例えば、ＬＣ質量分析）を使用することによって、高分解能が得られる。

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、一般に、動物（例えば、ヒトまたはマウス）などの対象における薬学的使用に好適な組成物を指し得る。医薬組成物は、薬理学上有効な量の活性薬剤及び薬学的に許容される担体を含み得る。「薬理学上有効な量」という用語は、意図された生物学的または薬理学的な結果をもたらすのに有効な薬剤の量を指し得る。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、標準的な薬学的担体、ビヒクル、緩衝液、及び賦形剤、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、５％デキストロース水溶液、及び油／水または水／油乳剤などの乳剤、及び様々な種類の湿潤剤及び／またはアジュバントのいずれかを指し得る。好適な薬学的担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔＥｄ．２００５，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ，Ｅａｓｔｏｎに記載されている。「薬学的に許容される塩」は、薬学的使用のための化合物に製剤化することができる塩であり得、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）及びアンモニアまたは有機アミンの塩を含む。

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」及び「治療」という用語は、生物学的障害及び／またはそれに付随する症状の少なくとも１つを緩和または軽減する方法を指し得る。本明細書で使用される場合、疾患、障害または状態を「緩和する」ことは、例えば、疾患、障害、または状態の重症度及び／または症状の発生頻度を減らすことを意味する。更に、本明細書における「治療」への言及は、治癒的、緩和的、及び予防的または診断的治療への言及を含み得る。

一般に、本開示の細胞は、真核細胞または原核細胞であり得る。細胞は、上皮細胞であり得る。細胞は、動物細胞または植物細胞であり得る。動物細胞は、海洋無脊椎動物、魚類、昆虫、両生類、爬虫類、または哺乳動物に由来する細胞を含み得る。哺乳動物細胞は、霊長類、猿人類、ウマ科動物、ウシ亜科の動物、ブタ、イヌ科動物、ネコ科動物、またはげっ歯類から得ることができる。哺乳動物は、霊長類、猿人類、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレットなどであり得る。げっ歯類は、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、ハムスター、チンチラ、またはモルモットであり得る。鳥類細胞は、カナリア、インコまたはオウムに由来し得る。爬虫類細胞は、カメ、トカゲまたはヘビに由来し得る。魚類細胞は、熱帯魚に由来し得る。例えば、魚類細胞は、ゼブラフィッシュ（例えば、Ｄａｎｉｎｏｒｅｒｉｏ）に由来し得る。蠕虫細胞は、線虫（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）に由来し得る。両生類細胞は、カエルに由来し得る。節足動物細胞は、タランチュラまたはヤドカリに由来し得る。

哺乳動物細胞は、霊長類（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）から得られる細胞も含み得る。哺乳動物細胞は、血液細胞、幹細胞、上皮細胞、結合組織細胞、ホルモン分泌細胞、神経細胞、骨格筋細胞、または免疫系細胞を含み得る。好ましい実施形態において、本開示の方法及び組成物は、１つ以上の哺乳動物の血液細胞と組み合わせて使用される。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、一般に、宿主細胞で複製が可能なＤＮＡ分子、及び／または別のＤＮＡセグメントが作動可能に連結され得、それにより、その結合されたセグメントの複製が生じるＤＮＡ分子を指す。プラスミドは、例示的なベクターである。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、一般に、ヒトまたは別の動物を指す。対象は、任意の年齢であり得、例えば、対象は、乳児、幼児、小児、思春期前の子ども、青年、成人、または高齢者の個体であり得る。

範囲は、本明細書において、１つの特定の「おおよそ（約）」の値から、及び／または別の特定の「おおよそ（約）」の値までを表すことができる。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、及び／または他の特定の値までを含む。同様に、値が「約」という先行詞の使用により近似値で表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。範囲のそれぞれの端点は、他の端点に対応するものであり、他の端点とは独立していることが更に理解される。本明細書で使用される「約」という用語は、特定の使用の範囲内で、指定された数値からプラスマイナス１５％の範囲を指す。例えば、約１０は、８．５～１１．５の範囲を含み得る。

ペプチド
本明細書で開示されるのは、ＴｆＲまたはＴｆＲ１、ＴｆＲ２、可溶性ＴｆＲを含む既知のＴｆＲホモログのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせもしくはフラグメント（例えば、エクトドメイン）に結合することが可能である、表１に列挙されるものなどのペプチド配列である。トランスフェリン受容体またはＴｆＲホモログに結合することが可能なペプチドは、本明細書において、トランスフェリン受容体結合ペプチドまたはＴｆＲ結合ペプチドと呼ばれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるペプチドは、ＴｆＲを媒介した様式で標的細胞に透過、通過、または侵入することができる。これらの細胞層または細胞は、ＴｆＲ発現内皮細胞、ＴｆＲ発現上皮細胞、ならびに腫瘍細胞、脳細胞、がん性もしくは腫瘍細胞、肝細胞、膵細胞、結腸細胞、卵巣細胞、乳房細胞、及び／または肺細胞、またはこれらの任意の組み合わせなどの様々な組織または器官のＴｆＲ発現細胞を含み得る。

種々の実施形態において、本開示は、細胞層（例えば、内皮細胞または上皮細胞）または細胞膜を越えるＴｆＲ媒介性輸送を可能にする方法及び組成物を提供する。ＢＢＢに加えて、様々な他の細胞、組織、及び器官がＴｆＲを発現する。ＴｆＲを発現する単一細胞は、肝細胞、赤血球及び骨髄中の赤血球前駆細胞、免疫細胞、幹細胞、ならびに急速に分裂する細胞を含み得る。ＴｆＲを発現する組織及び器官は、脳（例えば、大脳皮質、海馬、尾状、小脳）、内分泌腺組織（例えば、甲状腺、副甲状腺、及び副腎）、骨髄及び免疫系（例えば、虫垂、リンパ節、扁桃腺、脾臓）、筋肉組織（例えば、心臓、骨格、及び平滑筋）、肝臓、胆嚢、膵臓、消化管（例えば、口腔粘膜、食道、胃、十二指腸、小腸、結腸、直腸）、腎臓、膀胱、婦人科組織（例えば、卵管、乳房、膣、子宮頸、子宮内膜、卵巣、及び胎盤）、脂肪及び軟組織、ならびに皮膚を含み得る。したがって、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、これらの細胞、組織、及び器官を標的とし、これらの細胞、組織、及び器官に、例えば、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスを介して（例えば、ＢＢＢなどの細胞障壁を越えて）またはＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して（例えば、細胞膜を越えて細胞内に）または組織におけるＴｆＲ媒介性蓄積を介して、活性薬剤を送達し、これらの細胞、組織、または器官のうちの１つ以上における疾患または状態を治療及び／または予防するために、使用することができる。

種々の実施形態において、本開示は、ＴｆＲを発現するがん細胞へのＴｆＲ媒介性輸送及び送達を可能にする方法及び組成物を提供する。ＴｆＲを発現するがんは、卵巣癌、結腸癌、肺癌、骨もしくは骨髄に位置する癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、脾癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、骨髄細胞癌、皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはＣＭＹＣ過剰発現癌を含み得る。

がんを予防及び／または治療するために使用することができるＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、ＴｆＲ結合ペプチドと、融合されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ複合体、ＩＦＮガンマ、及び抗ＣＤ３薬剤などの抗腫瘍活性を有する活性薬剤とを含むものである。そのようなペプチドコンストラクト（例えば、融合ペプチド）の例は、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２または配列番号３５９～配列番号３６１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するものである。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、免疫Ｔ細胞またはＮＫ細胞を動員及び刺激するために、ＩＬ－１５に融合される。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、マクロファージを活性化し、腫瘍細胞におけるＭＨＣを上方制御するために、ＩＮＦｇに融合される。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、がん細胞上のＴｆＲへの結合に加えて、Ｔ細胞に結合して免疫シナプスを形成し、Ｔ細胞を活性化してがんを標的とするために、ＣＤ３に融合される。

一般に、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、様々な種類の活性薬剤と組み合わせて使用することができる。本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、それらの活性薬剤のうちの１つ以上にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。様々な態様において、活性薬剤は、免疫治療薬、ＣＴＬＡ－４標的薬剤、ＰＤ－１標的薬剤、ＰＤＬ－１標的薬剤、ＩＬ１５薬剤、融合されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合薬剤、ＩＦＮガンマ薬剤、抗ＣＤ３薬剤、イオンチャネル調節剤、Ｋｖ１．３阻害薬、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアミシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ－３８、ＢＡＣＥ阻害薬、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害薬、ＷＥＨＩ－５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ－１９９、ナビトクラックス、ＡＴ－１０１、オバトクラックス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体、ドラスタチン、またはニューロテンシンなどの神経伝達物質である。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるペプチドは、例えば、ＴｆＲ媒介性小胞性トランスサイトーシス及びＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスをそれぞれ介して、細胞層もしくは障壁（例えば、ＢＢＢ）または細胞膜を通過することができる。ＴｆＲに結合し、トランスサイトーシス及び／またはエンドサイトーシスを促進することに加えて、本開示のペプチドはまた、がん細胞などの細胞上の追加の標的タンパク質に結合することができる。いくつかの場合において、ペプチドは、追加の標的タンパク質（例えば、受容体または酵素）に対して親和性を有する小分子またはペプチドなどの標的化部分または活性薬剤（例えば、治療用または診断用薬剤）にコンジュゲート、連結、または融合されたＴｆＲ結合ペプチドを含む、ペプチドまたはペプチドコンストラクトである。いくつかの場合において、ＴｆＲ結合ペプチドは、カーゴ分子に連結され、ＢＢＢを越えたカーゴ分子のＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスまたは細胞内へのＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを可能にするか、または促進する。いくつかの例では、トランスサイトーシスの後、ＴｆＲ結合ペプチド及びカーゴ部分を含むペプチドコンストラクトは、ＣＮＳ内の特定の細胞または組織を標的とし、当該細胞または組織に到達すると、生物学的作用（例えば、標的タンパク質への結合）を発揮することができる。いくつかの場合において、本開示のペプチドコンストラクトは、ＴｆＲ結合ペプチド、カーゴ分子もしくは活性薬剤、またはこれらの組み合わせによって媒介される生物学的作用を発揮する。いくつかの場合において、１つ以上の活性薬剤（例えば、治療薬）を含む本開示のＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、１つ以上の活性薬剤を、ＴｆＲを発現する細胞内に輸送及び／または送達することができる。いくつかの場合において、ＴｆＲ結合ペプチドは、ＣＮＳの組織に蓄積する。いくつかの場合において、ＣＮＳ特異的蓄積により、オフターゲット効果が減少する。いくつかの場合において、ＴｆＲ結合ペプチドは、ＣＮＳ以外の組織（例えば、肝臓、腎臓、脾臓、または皮膚）に蓄積する。いくつかの場合において、ＴｆＲを発現する細胞は、腫瘍細胞であり、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、これらの腫瘍細胞に抗腫瘍薬剤を送達する。いくつかの場合において、抗腫瘍薬剤は、単独では、腫瘍細胞に対する治療効果が全くないか、非常に限られているが、抗腫瘍薬剤を本開示のＴｆＲ結合ペプチドと、例えば、ペプチドコンストラクトとして組み合わせる場合、これらの抗腫瘍薬剤の治療効果が大幅に改善される。

いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、生物学的に関連する応答を誘導することができる。いくつかの実施形態において、生物学的に関連する応答は、静脈内投与後に誘導され得、いくつかの実施形態において、静脈内単回投与後であり得る。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドは、疼痛、神経障害性疼痛または神経変性障害、感染症、免疫障害（例えば、自己免疫疾患）などの他の神経障害を治療及び／または予防するために使用される様々な他のクラスの治療用化合物と組み合わせて使用することができる。本明細書に記載されるペプチド及びペプチドコンストラクト（例えば、ペプチドコンジュゲート、融合ペプチド、または組換え産生されたペプチドコンストラクト）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの細胞障壁を越えて（例えば、ＴｆＲ媒介性小胞性トランスサイトーシスを介して）または細胞膜を越えて（例えば、ＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して）輸送されることは、対象（例えば、ヒト）における慢性疼痛（例えば、頭痛または片頭痛）、神経障害性疼痛、肥満症、インスリン抵抗性、オピオイド中毒、または他の神経障害もしくは精神障害に関連する多数の疾患、状態、または障害に影響を与え得る。

本明細書に記載されるペプチド及びペプチドコンストラクト（例えば、ペプチドコンジュゲート、融合ペプチド、または組換え産生されたペプチドコンストラクト）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの細胞障壁を越えて（例えば、小胞性トランスサイトーシスを介して）または細胞膜を越えて（例えば、エンドサイトーシスを介して）輸送されることは、神経変性に関連する多数の疾患、状態、または障害に影響を与え得る。本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドで治療、予防、または診断することができる神経変性疾患としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、ライム病、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳失調症、バッテン病、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、クフォー・ラケブ症候群、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、慢性外傷性脳症、または前頭側頭型認知症を挙げることができる。

本明細書に記載されるペプチド及びペプチドコンストラクト（例えば、ペプチドコンジュゲート、融合ペプチド、または組換え産生されたペプチドコンストラクト）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの細胞障壁を越えて（例えば、小胞性トランスサイトーシスを介して）または細胞膜を越えて（例えば、エンドサイトーシスを介して）輸送されることは、多数の自己免疫疾患に影響を与え、脳の自己免疫障害または炎症性障害に治療的に対応することができる。いくつかの場合において、自己免疫疾患は、ＴｆＲ結合ペプチドをＫｖ１．３カリウムチャネル阻害薬などのイオンチャネル調節剤であり得る活性薬剤にコンジュゲート、連結、または融合することによって、治療及び／または予防することができる。Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害薬などのイオンチャネル調節剤を使用して治療及び／または予防することができる追加の疾患としては、乾癬及びエフェクターＴ細胞への影響に起因する脳以外の他の自己免疫疾患、ならびに神経炎症性疾患及び神経変性疾患、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、または放射線療法による毒性を挙げることができる。いくつかの場合において、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害薬は、小分子（例えば、トシル酸ドマチノスタット）、またはペプチド（例えば、Ｖｍ２４またはＳｈＫ－１７０、ＳｈＫ－１８６、もしくはＳｈＫ－１９２などのＳｈＫペプチド、またはこれらの任意のフラグメントもしくは誘導体）またはこれらの任意の組み合わせであり得る。（例えば、Ｂａｒｔｏｋｅｔａｌ．ＡｎｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｓｃｏｒｐｉｏｎｔｏｘｉｎａｎａｌｏｇｕｅｗｉｔｈｉｍｐｒｏｖｅｄＫｖ１．３ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｄｉｓｐｌａｙｓｒｅｄｕｃｅｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ，ＳｃｉＲｅｐ．２０１５；５：１８３９７参照）。

いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、限定するものではないが、てんかん、統合失調症、鬱病、不安、双極性障害、脳発達障害（例えば、自閉症スペクトラム）、または気分障害を含む様々な神経疾患の治療及び予防に使用することができる。

いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、クローン病またはより一般的には炎症性腸疾患の治療及び予防に使用することができる。いくつかの場合において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、多量のＴｆＲを発現し得る腸の腺細胞において、高い取り込み及び保持を示す。

種々の実施形態において、これらの薬物の治療効果は、本開示のＴｆＲ結合ペプチドと組み合わせて使用される場合、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドへのコンジュゲーションがない投与と比較して、大幅に改善し得る。種々の実施形態において、有効性は、目的の組織または細胞における薬物の送達及び達成レベルの高さにより、改善し得る。種々の実施形態において、有効性は、目的の組織または細胞における薬物の相対レベルを増加させ、他の組織またはコンパートメントにおける薬物のレベルを減少させることによって改善され得、それにより、治療濃度域が改善するか、または毒性副作用が低下する。

他の実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、ＴｆＲへの結合について、内因性分子と競合する。本明細書に記載される場合、ＴｆＲなどの標的タンパク質への結合に対する「競合」またはペプチド競合は、立体障害、標的タンパク質の結合部位の占有、塩橋もしくは疎水性相互作用などの非共有結合性相互作用、架橋、共有結合性相互作用、隔離、アロステリック調節、またはこれらの任意の組み合わせを包含するが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、ＴｆＲ１、ＴｆＲ２、可溶性ＴｆＲを含む既知のＴｆＲホモログのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせもしくはフラグメント（例えば、エクトドメイン）に結合することができる。したがって、本明細書で使用される場合、「ＴｆＲ」は、ＴｆＲ１、ＴｆＲ２、及び可溶性ＴｆＲを含む、任意の既知のホモログ、誘導体、フラグメント、またはＴｆＲファミリーのメンバーを指し得る。他の実施形態において、ペプチドは、１つ、１つ以上、または全てのＴｆＲホモログに結合することが可能である。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、ＴｆＲに結合し、小胞性トランスサイトーシスなどの特定の生物学的作用を促進することができる。いくつかの実施形態において、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、及び配列番号３５６～配列番号３６１に示されるアミノ酸配列、ならびにその任意の誘導体またはバリアントを含むペプチド及びペプチドコンストラクトを含む、本開示のペプチドは、内因性ＴｆＲ結合物質（例えば、トランスフェリンまたはアポトランスフェリンもしくはホロトランスフェリンなどの任意の誘導体）のＴｆＲへの結合を阻止または減少させる。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、及び配列番号３５６～配列番号３６１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性または少なくとも１００％の相同性を有する誘導体及びバリアントを含む。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、内因性分子（例えば、トランスフェリン、ホロトランスフェリン（鉄が結合したトランスフェリン）、アポトランスフェリン（鉄が結合していないトランスフェリン）、または任意の他の内因性ＴｆＲリガンド）または他の外因性分子と比較して、同等、類似、またはより高い親和性（例えば、より低い解離定数Ｋ_Ｄ）でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、５０μＭ未満、５μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満のＫ_Ｄを有し得る。いくつかの実施形態において、ＴｆＲによるペプチド輸送は、内因性分子と比較して、より低い親和性（例えば、より高い解離定数Ｋ_Ｄ）を有することによって、改善される。いくつかの実施形態において、ＴｆＲによるペプチド輸送は、内因性分子よりも速いオフレートまたはより高いｋ_ｏｆｆを有することによって、改善される。いくつかの実施形態において、オフレートまたはｋ_ｏｆｆは、トランスフェリンと同様である。いくつかの実施形態において、ペプチド輸送は、より速いオンレートまたはより高いｋ_ｏｎ、任意選択によりトランスフェリンよりも高いｋ_ｏｎを有することによって、改善される。他の実施形態において、トランスフェリン（Ｔｆ）－ＴｆＲ結合界面にある１つ以上の保存残基は、本明細書に記載されるペプチドのアミノ酸配列にも存在する。

いくつかの実施形態において、ＴｆＲ受容体結合の改善を示すペプチドは、トランスサイトーシス機能の改善を示す。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ受容体結合の改善を示すペプチドは、トランスサイトーシス機能に変化が全くないか、または小さな変化を示す。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ受容体結合の改善を示すペプチドは、トランスサイトーシス機能の低下を示す。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ヒトＴｆＲ（配列番号３６３）の残基５０６～５１０、５２３～５３１、及び６１１～６６２に対応するアミノ酸ドメインの１つ以上、または全てを含む、ヒトＴｆＲとマウスＴｆＲとの間で高い相同性を示す部位に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるペプチドまたはそのバリアントが結合するＴｆＲの領域は、かかるＴｆＲドメインの全てまたは一部である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるペプチドは、ヒトＴｆＲ（配列番号３６３）の残基５０６～５１０、５２３～５３１、及び６１１～６６２に対応するアミノ酸ドメインを含む、高い相同性を示すＴｆＲ領域のいずれか１つ、いずれか２つ、または３つ全てに結合する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるペプチドは、少なくともヒトＴｆＲの残基６１１～６６２に対応するドメインに結合する。

いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドのＫ_Ａ値及びＫ_Ｄ値を調節及び最適化して（例えば、アミノ酸置換を介して）、ＴｆＲ結合親和性と効率的なトランスサイトーシス機能の最適な比率をもたらすことができる。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるペプチドまたはそのバリアントは、ＴｆＲと他の外因性または内因性リガンド（例えば、トランスフェリン（Ｔｆ）、Ｔｆ誘導体、またはＴｆ様ペプチドもしくはタンパク質）との結合界面（例えば、結合ドメインまたは結合ポケット）に見出される残基でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲに結合するペプチドまたはそのバリアントは、結合ポケットを構成するＴｆＲの残基に結合する配列に対して、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性または少なくとも１００％の相同性を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲに結合するペプチドまたはそのバリアントは、ＴｆＲに結合することが知られている内因性もしくは外因性ポリペプチド、例えば、内因性トランスフェリン、または表１に列挙されるペプチドのいずれか１つに対して、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性または少なくとも１００％の相同性を有する。他の実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、ＴｆＲ、そのフラグメント、ホモログ、またはバリアントに対して、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性または少なくとも１００％の相同性を有する目的のタンパク質に結合する。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるペプチドまたはそのバリアントは、残基５０６～５１０、５２３～５３１、及び６１１～６６２に対応するアミノ酸残基を含むＴｆＲの領域に結合する（これらのアミノ酸残基のナンバリングは、内因性ヒトＴＦＲＣの次のＵｎｉｐｒｏｔ参照タンパク質配列ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０２７８６（配列番号３６３、ＴＦＲ１＿ＨＵＭＡＮ）に基づく）。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるペプチドまたはそのバリアントが結合するＴｆＲの領域は、Ｔｆ、そのフラグメント、ホモログ、またはバリアントのものと重複する。

他の実施形態において、核酸、ベクター、プラスミド、またはドナーＤＮＡは、本開示に記載されるペプチド、ペプチドコンストラクト、またはそのバリアントもしくは機能性フラグメントをコードする配列を含む。更なる実施形態において、ＴｆＲ結合モチーフ（例えば、保存結合モチーフ）のある特定の部分またはフラグメントは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つの配列を含むペプチドまたはペプチドコンストラクト上にグラフトされ得る。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＴｆＲとＴｆとの間、またはＴｆＲと任意の他のタンパク質との間の結合を阻害する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＴｆＲのタンパク質－タンパク質相互作用を阻止し、及び／または細胞の核へのＴｆＲ局在化を阻止する。いくつかの場合において、ペプチドは、ＴｆＲを非活性化する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＴｆＲの分解を引き起こすか、またはＴｆＲの細胞の核への局在化を阻止するか、ＴｆＲとＴｆもしくはＴｆ様タンパク質との相互作用を阻止することができる。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＴｆＲ中のある特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフに結合することによって、内因性Ｔｆまたは任意の他の内因性もしくは外因性ＴｆＲ結合物質と比較して、ＴｆＲに競合的に結合する。更に、ペプチドは、ある特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフに結合する能力に基づいて、更なる試験または使用のために選択され得る。ＴｆＲ中のある特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフは、ＴｆＲのＴｆへの結合に関与するアミノ酸残基またはアミノ酸残基の配列で特定することができる。ある特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフは、ＴｆＲ：Ｔｆ複合体の結晶構造から特定することができる。いくつかの実施形態において、ペプチド（例えば、ＣＤＰ）は、熱、プロテアーゼ（ペプシン）、及び還元に対する耐性を示す。

配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、及び配列番号３５６～配列番号３６１に示されるアミノ酸配列のうちの１つ以上を含むペプチド及びペプチドコンストラクト（例えば、ペプチドコンジュゲートまたは融合ペプチド）は、目的のタンパク質に結合することができる。いくつかの実施形態において、目的のタンパク質は、ＴｆＲである。いくつかの実施形態において、ＴｆＲに結合するペプチド及びペプチドコンストラクト（例えば、ペプチドコンジュゲートまたは融合ペプチド）は、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、及び配列番号３５６～配列番号３６１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲに結合するペプチド、ペプチドコンストラクト（例えば、ペプチドコンジュゲート及び融合分子）は、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、及び配列番号３５６～配列番号３６１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性または少なくとも１００％の相同性を有するペプチド誘導体またはバリアントを含む。

いくつかの実施形態において、ペプチドまたはペプチドのライブラリーは、ノットペプチドの天然足場から導き出すのではなく、ｉｎｓｉｌｉｃｏで設計される。他の実施形態において、ペプチドまたはペプチドのライブラリーは、目的のタンパク質または受容体に結合することが知られている天然ペプチドまたはタンパク質に、関連するタンパク質結合残基、またはタンパク質結合界面の保存残基をグラフト化する誘導によってｉｎｓｉｌｉｃｏで設計される。いくつかの実施形態において、ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、または配列番号１７１～配列番号２０２）は、単純なヘリックスターンヘリックスである。いくつかの実施形態において、ヘリックスターンヘリックスは、他の足場上にファーマコフォアを移すために使用することができ、例えば、融合タグを使用して、ヘリックスターンヘリックス足場上に所望のＴｆＲ係合表面を移植することができる。

いくつかの実施形態において、配列番号１を含むペプチドは、付加、欠失、またはアミノ酸置換を含む更なる修飾のための足場またはベース配列として使用される。いくつかの実施形態において、ＧＳなどのアミノ酸残基の短い配列がペプチドのＮ末端に付加される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、Ｎ末端にＧＳを欠く。いくつかの例では、ペプチドは、１つ以上の翻訳後修飾を受ける。

表１は、本開示の方法及び組成物による例示的なペプチド配列を列挙する。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＸ_１ＲＣＸ_２ＫＹＸ_４ＤＥＸ_２Ｘ_３ＫＣＸ_３ＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＸ_２ＥＤＸ_２Ｘ_２ＹＣＸ_２Ｘ_３Ｘ_５ＣＸ_５Ｘ_１Ｘ_４（配列番号２０６）またはＲＥＧＣＡＸ_１ＲＣＸ_２ＫＹＸ_４ＤＥＸ_２Ｘ_３ＫＣＸ_３ＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＸ_２ＥＤＸ_２Ｘ_２ＹＣＸ_２Ｘ_３Ｘ_５ＣＸ_５Ｘ_１Ｘ_４（配列番号３３４）を含み、配列中、Ｘ_１は、Ｓ、Ｔ、Ｄ、またはＮから独立して選択することができ、Ｘ_２は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから独立して選択することができ、Ｘ_３は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができ、Ｘ_４は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができ、Ｘ_５は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＸ_１ＣＸ_２Ｘ_３ＲＣＸ_４ＫＹＸ_５ＤＥＸ_６Ｘ_７ＫＣＸ_８ＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号２０７）またはＲＥＸ_１ＣＸ_２Ｘ_３ＲＣＸ_４ＫＹＸ_５ＤＥＸ_６Ｘ_７ＫＣＸ_８ＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号３３５）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７及びＸ_８は、ＴｆＲ結合界面残基であり、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＸ_１ＥＤＸ_２Ｘ_３ＹＣＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ＣＸ_７Ｘ_８Ｘ_９（配列番号２０８）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＸ_１ＥＤＸ_２Ｘ_３ＹＣＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ＣＸ_７Ｘ_８Ｘ_９（配列番号３３６）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、及びＸ_９は、ＴｆＲ結合界面残基であり、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＸ_１ＣＸ_２Ｘ_３ＲＣＸ_４ＫＹＸ_５ＤＥＸ_６Ｘ_７ＫＣＸ_８ＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＸ_９ＥＤＸ_１０Ｘ_１１ＹＣＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１３ＣＸ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７（配列番号２０９）またはＲＥＸ_１ＣＸ_２Ｘ_３ＲＣＸ_４ＫＹＸ_５ＤＥＸ_６Ｘ_７ＫＣＸ_８ＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＸ_９ＥＤＸ_１０Ｘ_１１ＹＣＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１３ＣＸ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７（配列番号３３７）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６及びＸ_１７は、ＴｆＲ結合界面残基であり、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号３２）を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５ＡＳＸ_６Ｘ_７ＭＸ_８Ｘ_９ＮＸ_１０Ｘ_１１ＬＥＸ_１２Ｘ_１３ＥＸ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０Ｘ_４１Ｘ_４２Ｘ_４３（配列番号２１０）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、Ｘ_３７、Ｘ_３８、Ｘ_３９、Ｘ_４０、Ｘ_４１、Ｘ_４２、及びＸ_４３は、独立して任意のアミノ酸であり得る。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７ＬＸ_３８Ｘ_３９ＬＬＸ_４０Ｘ_４１ＬＤＨＸ_４２ＨＳＱ（配列番号２１１）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、Ｘ_３７、Ｘ_３８、Ｘ_３９、Ｘ_４０、Ｘ_４１、及びＸ_４２は、独立して任意のアミノ酸であり得る。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５ＡＳＸ_６Ｘ_７ＭＸ_８Ｘ_９ＮＸ_１０Ｘ_１１ＬＥＸ_１２Ｘ_１３ＥＸ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９ＬＸ_３０Ｘ_３１ＬＬＸ_３２Ｘ_３３ＬＤＨＸ_３４ＨＳＱ（配列番号２１２）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、及びＸ_３４は、独立して任意のアミノ酸であり得る。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、もしくは配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ、またはその任意のバリアント、ホモログ、もしくは機能性フラグメントに対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、もしくは配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ、またはその任意のバリアント、ホモログ、もしくは機能性フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ＴｆＲに結合するペプチドは、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドは、配列番号３２を基準として、５、７、８、１４、１７、１８、２１、３８、４２、４５、４６、４７、５０、５１に対応する位置のいずれか１つまたはこれらの組み合わせに、表面界面残基としてカノニカルアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、Ｑ５１に対応する位置のいずれか１つまたはこれらの組み合わせに、表面界面残基としてカノニカルアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のこれらの対応する残基の少なくとも１つ以上を含む。したがって、そのようなペプチドは、ＴｆＲへの結合が増大するように操作することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５ＡＳＸ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＮＸ_１１Ｘ_１２ＬＥＸ_１３Ｘ_１４ＥＸ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＬＸ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３ＬＸ_３４Ｘ_３５ＬＤＨＸ_３６Ｘ_３７ＳＱ（配列番号２１３）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、及びＸ_３７は、独立して任意のアミノ酸であり得る。

いくつかの実施形態において、ペプチドのアミノ酸配列に存在する表面遠位親水性アミノ酸残基（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴ）は、ペプチドの可溶性に寄与する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるペプチドは、配列番号３２を基準として、３、４、９、１１、１５、１６、１９、２３、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、４０に対応する位置のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに親水性アミノ酸残基を含む。いくつかの例では、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、次の対応する位置の親水性アミノ酸残基：Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、Ｄ４０、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号３２を基準として、対応する位置Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、Ｄ４０のいずれか１つまたは任意の組み合わせは、可溶性またはＴｆＲ結合に大きな影響を与えることがなければ、別の親水性残基に変更することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２ＲＥＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＲＸ_７Ｘ_８ＫＸ_９Ｘ_１０ＤＥＸ_１１Ｘ_１２ＫＸ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＲＸ_１６Ｘ_１７ＳＸ_１８ＳＮＴＥＥＤＸ_１９ＥＱＥＸ_２０ＥＤＸ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１（配列番号２１４）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、及びＸ_３１は、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＸ_１Ｘ_２ＧＣＡＳＸ_３ＣＭＸ_４ＹＮＸ_５Ｘ_６ＬＥＸ_７ＣＥＡＸ_８ＭＭＸ_９ＭＸ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＣＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＬＸ_１９Ｘ_２０ＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号２１５）またはＸ_１Ｘ_２ＧＣＡＳＸ_３ＣＭＸ_４ＹＮＸ_５Ｘ_６ＬＥＸ_７ＣＥＡＸ_８ＭＭＸ_９ＭＸ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＣＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＬＸ_１９Ｘ_２０ＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号３３８）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、及びＸ_２０は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができる。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置１５、３５、３９、４９、またはこれらの任意の組み合わせに親水性残基（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴ）を含む。いくつかの例では、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、次の対応する位置の親水性アミノ酸残基：Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、Ｈ４９、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号３２を基準として、対応する位置Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、Ｈ４９のいずれか１つまたは任意の組み合わせは、可溶性またはＴｆＲ結合に大きな影響を与えることがなければ、別の親水性残基に変更することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４ＤＸ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３ＥＸ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６ＥＸ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０Ｘ_４１Ｘ_４２Ｘ_４３Ｘ_４４Ｘ_４５ＨＸ_４６Ｘ_４７（配列番号２１６）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、Ｘ_３７、Ｘ_３８、Ｘ_３９、Ｘ_４０、Ｘ_４１、Ｘ_４２、Ｘ_４３、Ｘ_４４、Ｘ_４５、Ｘ_４６、及びＸ_４７は、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＸ_１ＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＸ_２ＱＥＬＸ_３ＤＬＬＹＣＬＤＨＣＸ_４ＳＱ（配列番号２１７）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＸ_１ＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＸ_２ＱＥＬＸ_３ＤＬＬＹＣＬＤＨＣＸ_４ＳＱ（配列番号３３９）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、及びＸ_４は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができる。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置１５、３５、３９、４９、またはこれらの任意の組み合わせに疎水性残基（例えば、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＹ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＸ_１ＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＸ_２ＱＥＬＸ_３ＤＬＬＹＣＬＤＨＣＸ_４ＳＱ（配列番号２１８）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＸ_１ＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＸ_２ＱＥＬＸ_３ＤＬＬＹＣＬＤＨＣＸ_４ＳＱ（配列番号３４０）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、及びＸ_４は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＹから独立して選択することができる。いくつかの実施形態において、配列番号３２を基準として、対応する位置１５、３５、３９、及び４９のいずれか１つの親水性アミノ酸残基は、ＴｆＲに対するより高い結合親和性（例えば、標的結合）及びより高い可溶性に関連する。いくつかの実施形態において、配列番号３２を基準として、対応する位置１５、３５、３９、及び４９のいずれか１つのアミノ酸残基の疎水性残基から親水性残基への変異は、ＴｆＲに対するより高い結合親和性（例えば、標的結合）及びより高い可溶性をもたらすことができる。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置１１、２５、２７、またはこれらの任意の組み合わせに疎水性残基（例えば、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＹ）を含む。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置１１、２５、２７、またはこれらの任意の組み合わせに親水性残基（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴ）を含む。いくつかの実施形態において、配列番号３２を基準として、対応する位置１１、２５、及び２７のいずれか１つの疎水性アミノ酸残基は、ＴｆＲに対するより高い結合親和性（例えば、標的結合）及びより高い可溶性に関連する。いくつかの実施形態において、配列番号３２を基準として、対応する位置１１、２５、及び２７のいずれか１つのアミノ酸残基の親水性残基から疎水性残基への変異は、ＴｆＲに対するより高い結合親和性（例えば、標的結合）及びより高い可溶性をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置Ｍ１１、Ｍ２５、Ｍ２７の疎水性アミノ酸残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの例では、ペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置Ｍ１１、Ｍ２５、及びＭ２７の疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、配列番号３２を基準として、対応する位置Ｍ１１、Ｍ２５、及びＭ２７の任意の組み合わせは、可溶性またはＴｆＲ結合に大きな影響を与えることがなければ、別の疎水性残基に変更することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＭＸ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３ＭＸ_２４ＭＸ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０Ｘ_４１Ｘ_４２Ｘ_４３Ｘ_４４Ｘ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７Ｘ_４８（配列番号２１９）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、Ｘ_３７、Ｘ_３８、Ｘ_３９、Ｘ_４０、Ｘ_４１、Ｘ_４２、Ｘ_４３、Ｘ_４４、Ｘ_４５、Ｘ_４６、Ｘ_４７、及びＸ_４８は、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＸ_１ＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＸ_２ＳＸ_３ＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号２２０）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＸ_１ＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＸ_２ＳＸ_３ＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号３４１）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＹから独立して選択することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＸ_１ＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＸ_２ＳＸ_３ＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号２２１）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＸ_１ＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＸ_２ＳＸ_３ＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号３４２）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができる。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置４５に脂肪族アミノ酸残基（例えば、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶ）を含む。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、対応する位置４５に芳香族アミノ酸残基（例えば、Ｆ、Ｗ、またはＹ）を含む。いくつかの実施形態において、対応する位置４５の脂肪族アミノ酸残基は、ＴｆＲへのより高い結合親和性に関連する。いくつかの例では、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｌ４５に対応する脂肪族アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、対応する位置４５のアミノ酸残基の芳香族残基から脂肪族残基への変異は、ＴｆＲに対するより高い結合親和性（例えば、標的結合）及びより高い可溶性をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、対応する位置Ｌ４５を別の脂肪族残基に変更することは、可溶性またはＴｆＲ結合に大きな影響を与えない。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０Ｘ_４１Ｘ_４２Ｘ_４３Ｘ_４４ＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７Ｘ_４８Ｘ_４９Ｘ_５０（配列番号２２２）を含み、配列中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、Ｘ_３７、Ｘ_３８、Ｘ_３９、Ｘ_４０、Ｘ_４１、Ｘ_４２、Ｘ_４３、Ｘ_４４、Ｘ_４５、Ｘ_４６、Ｘ_４７、Ｘ_４８、Ｘ_４９、及びＸ_５０は、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＸ_１ＤＨＣＨＳＱ（配列番号２２３）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＸ_１ＤＨＣＨＳＱ（配列番号３４３）を含み、配列中、Ｘ_１は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから独立して選択することができる。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＸ_１ＹＮＤＥＬＥＸ_２ＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号２２４）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＭＸ_１ＹＮＤＥＬＥＸ_２ＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号３４４）を含み、配列中、Ｘ_１及びＸ_２は、ＫまたはＲから独立して選択することができる。いくつかの実施形態において、配列番号３２を基準として、対応する位置１２及び１９のこれらの残基は、別の分子（例えば、活性薬剤または検出可能な剤）への化学コンジュゲーションに使用することができる。いくつかの実施形態において、Ｘ_１及びＸ_２はいずれもＲであり、化学コンジュゲーションはペプチドのＮ末端でなされる。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基のうちの任意の１つ以上の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善することができる。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の５～８０％における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１～１００％、５～１００％、または５～５０％における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１５～５０％における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１５～３０％における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の２５～３０％における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。例えば、配列番号３２の配列を有するペプチドの５１アミノ酸残基のうちの１４アミノ酸残基における変異（２７．５％）は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善することができる。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基のうちの任意の１つ以上の変異は、ＴｆＲの結合界面にあり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドに対する変異は、結合親和性を改善することができ、これは、本明細書で開示されるペプチドまたはペプチドコンストラクトの結合及びトランスサイトーシスに有益であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるペプチドは、最適な活性を得るために、多くの変異または少数の変異を有し得、ここで、最適な活性は、ＴｆＲの結合に十分な結合であるが、必ずしもペプチド及び／またはペプチドコンストラクトのトランスサイトーシス後の放出を妨げるほど強い結合ではない。したがって、本開示のペプチドは、ペプチドまたはペプチドコンストラクトの最適な結合、機能（例えば、トランスサイトーシス、ＢＢＢ透過、細胞膜透過、生物学的障壁を越えた輸送）、及び放出を得るために、結合親和性及びオフレートを調整する多数の変異（変異アミノ酸残基％とも称される）を含み得る。したがって、最大限の親和性をもたらす変異は、最適な結合及びトランスサイトーシスを有する優れたペプチドと必ずしも相関しない場合がある。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１～１００％または５～１００％は、ＴｆＲの結合界面にある。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１０～９０％は、ＴｆＲの結合界面にある。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の２０～８０％は、ＴｆＲの結合界面にある。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の３０～７０％は、ＴｆＲの結合界面にある。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の４０～６０％は、ＴｆＲの結合界面にある。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の３０～３５％は、ＴｆＲの結合界面にある。例えば、配列番号３２の配列を有するペプチドの５１アミノ酸残基のうちの１７アミノ酸残基（３３％）は、ＴｆＲの結合界面にあり得る。

いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基のうちの任意の１つ以上の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善することができる。いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の１～１００％または５～１００％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の５～８０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の１０～７０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の１５～６０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の２０～５０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の２５～３０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。例えば、ＴｆＲの結合界面にある配列番号３２の配列を有するペプチドの１７アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基（２９％）における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善することができる。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基のうちの任意の１つ以上の変異は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１～１００％または５～１００％は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１０～９０％は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の２０～８０％は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の３０～７０％は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の４０～６０％は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基の６５～７０％は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。例えば、配列番号３２の配列を有するペプチドの５１アミノ酸残基のうちの３４アミノ酸残基（６６％）は、ＴｆＲの結合界面にあり得る。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドのアミノ酸残基のうちの任意の１つ以上の変異は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にあり、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の１～１００％または５～１００％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の５～８０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の１０～７０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の１５～６０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の２０～５０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態において、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の２５～３０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。例えば、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある１７アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善することができる。例えば、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある配列番号３２の配列を有するペプチドの３４アミノ酸残基のうちの９アミノ酸残基（２６．５％）における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善することができる。いくつかの実施形態において、いかなる理論に拘束されるものではないが、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にあるペプチドのアミノ酸残基における１つ以上の変異は、タンパク質のフォールディングを改善し、タンパク質の可溶性を向上させ、及び／または最適化された界面形状の相補性を介して結合を改善することができる骨格の幾何学的形状を変更することができる。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、位置１１、１２、１３、１４、１９、２０、２１、２２、３６、３８、３９、４１のうちの１つ以上にシステイン残基を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、位置１１、１２、１９、２０、３６、３９、またはこれらの任意の組み合わせにＣｙｓを含む。例えば、特定の実施形態において、ペプチドは、位置１１にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態において、ペプチドは、位置１２にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態において、ペプチドは、位置１３にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態において、ペプチドは、位置１４にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態において、ペプチドは、位置１９にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態において、ペプチドは、位置２０にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態において、ペプチドは、位置２１にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態において、ペプチドは、位置２２にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態において、ペプチドは、位置３６にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態において、ペプチドは、位置３８にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態において、ペプチドは、位置３９にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態において、ペプチドは、位置４１にシステイン残基を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態において、配列中の１番目のシステイン残基は、配列中の４番目のシステイン残基にジスルフィド結合することができ、配列中の２番目のシステイン残基は、配列中の５番目のシステイン残基にジスルフィド結合することができ、配列中の３番目のシステイン残基は、配列中の６番目のシステイン残基にジスルフィド結合することができる。任意選択により、ペプチドは、「ツーアンドスルー」構造系としても知られる、別の２つのジスルフィド架橋によって形成される環を通過する１つのジスルフィド架橋を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるペプチドは、セリンに変異された１つ以上のシステインを有し得る。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、少なくとも１つのシステイン残基を含む。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、少なくとも２つのシステイン残基を含む。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、少なくとも３つのシステイン残基を含む。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、少なくとも４つのシステイン残基を含む。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、少なくとも５つのシステイン残基を含む。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、少なくとも６つのシステイン残基を含む。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、少なくとも１０個のシステイン残基を含む。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、６つのシステイン残基を含む。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、１つ以上の位置にシステイン残基を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のシステイン残基は、アミノ酸位置６、１０、２０、３４、４４、４８のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに位置する。本開示のいくつかの態様において、１つ以上のシステイン（Ｃ）残基は、様々な対形成パターン（例えば、Ｃ１０－Ｃ２０）を有するジスルフィド結合に関与する。いくつかの実施形態において、対形成パターンは、Ｃ６－Ｃ４８、Ｃ１０－Ｃ４４、及びＣ２０－Ｃ３４である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのジスルフィド結合は、Ｃ６－Ｃ４８、Ｃ１０－Ｃ４４、及びＣ２０－Ｃ３４対形成パターン、またはこれらの組み合わせに従って配置される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、対形成パターンＣ６－Ｃ４８、Ｃ１０－Ｃ４４、及びＣ２０－Ｃ３４を有する３つのジスルフィド結合を含む。

特定の実施形態において、ペプチドは、位置６にシステイン残基を有する配列を含む。特定の実施形態において、ペプチドは、位置１０にシステイン残基を有する配列を含む。特定の実施形態において、ペプチドは、位置２０にシステイン残基を有する配列を含む。特定の実施形態において、ペプチドは、位置３４にシステイン残基を有する配列を含む。特定の実施形態において、ペプチドは、位置４４にシステイン残基を有する配列を含む。特定の実施形態において、ペプチドは、位置５０にシステイン残基を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、配列中の１番目のシステイン残基は、配列中の最後のシステイン残基とジスルフィド結合する。いくつかの実施形態において、配列中の２番目のシステイン残基は、配列中の最後から２番目のシステイン残基とジスルフィド結合する。いくつかの実施形態において、配列中の３番目のシステイン残基は、配列中の最後から３番目のシステイン残基とジスルフィド結合するなどである。

いくつかの実施形態において、配列中の１番目のシステイン残基は、配列中の６番目のシステイン残基にジスルフィド結合し、配列中の２番目のシステイン残基は、配列中の５番目のシステイン残基にジスルフィド結合し、配列中の３番目のシステイン残基は、配列中の４番目のシステイン残基にジスルフィド結合する。任意選択により、ペプチドは、「ツーアンドスルー」構造系としても知られる、別の２つのジスルフィド架橋によって形成される環を通過する１つのジスルフィド架橋を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるペプチドは、セリンに変異された１つ以上のシステインを有する。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、システインもジスルフィドも含まない。いくつかの実施形態において、ペプチドは、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、または１５個以上のシステインまたはジスルフィドを含む。他の実施形態において、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０個以上のシステイン残基がセリン残基で置換されている。いくつかの実施形態において、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０個以上のシステイン残基がトレオニン残基で置換されている。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、Ｃｙｓもジスルフィドも含まない。いくつかの実施形態において、ペプチドは、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、または１５個以上のＣｙｓまたはジスルフィドを含む。他の実施形態において、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０個以上のＣｙｓ残基がＳｅｒ残基で置換されている。いくつかの実施形態において、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０個以上のＣｙｓ残基がＴｈｒ残基で置換されている。

いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上または全てのメチオニン残基がロイシンまたはイソロイシンによって置換される。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上または全てのトリプトファン残基がフェニルアラニンまたはチロシンによって置換される。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上または全てのアスパラギン残基がグルタミンによって置換される。いくつかの実施形態において、ペプチドのＮ末端は、アセチル基などによってブロッキングされる。代替として、または組み合わせて、いくつかの例では、ペプチドのＣ末端は、アミド基などによってブロッキングされる。いくつかの実施形態において、ペプチドは、遊離アミン上のメチル化によって修飾される。

例えば、完全なメチル化は、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元的メチル化の使用を介して達成することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドまたはペプチドコンストラクトは、ＴｆＲ発現細胞層もしくは障壁及び／またはＴｆＲ発現細胞の膜を標的及び／または透過する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、細胞の細胞膜を標的及び／または透過し、当該細胞は、脳などのＣＮＳに位置する。例えば、ＴｆＲ結合ペプチド及び１つ以上の活性薬剤（例えば、治療用または診断用化合物）を含むペプチドコンストラクトは、細胞障壁（例えば、ＢＢＢ）を小胞性トランスサイトーシスを介して通過し、その後、ＣＮＳ内に位置する細胞の細胞膜を標的及び／または透過して、当該細胞に当該１つ以上の活性薬剤を送達する。

種々の実施形態において、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド及び１つ以上の活性薬剤（例えば、治療用または診断用化合物）を含むペプチドコンストラクトは、消化管、脾臓、肝臓、腎臓、筋肉、骨髄、脳、または皮膚内に位置するＴｆＲ発現細胞の細胞膜を標的及び／または透過する。いくつかの場合において、ＴｆＲ発現細胞は、腫瘍細胞、免疫細胞、赤血球、赤血球前駆細胞、幹細胞、骨髄細胞、または幹細胞である。いくつかの場合において、例えば、細胞がＴｆＲを過剰発現している場合において、ＴｆＲ結合ペプチドは、細胞の標的化に関与する。種々の実施形態において、１つ以上のカーゴ分子（例えば、活性薬剤及び／または検出可能な剤）にコンジュゲート、連結、または融合されたＴｆＲ結合ペプチドを含む本明細書に記載されるペプチドコンストラクトは、脾臓、脳、肝臓、腎臓、筋肉、骨髄、消化管、または皮膚などの様々な器官内に位置する細胞の細胞膜を標的及び／または透過する。

いくつかの場合において、カーゴ分子は、特定の細胞、細胞集団、または組織の標的化を促進する。いくつかの場合において、それは、ＴｆＲ媒介性細胞標的化と、細胞標的化を促進するカーゴ分子との組み合わせである。いくつかの態様において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクト（例えば、ペプチドコンジュゲートまたは融合ペプチド）は、ある特定の生物学的（例えば、治療的）作用を発揮するために、当該細胞、細胞集団、または組織の標的化に使用される。いくつかの態様において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクト（例えば、ペプチドコンジュゲートまたは融合ペプチド）は、当該細胞内にカーゴ分子を送達して、ある特定の生物学的作用を発揮するために使用される。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、細胞透過を改善するための少なくとも１つ以上のタグペプチド配列を含み得る。例えば、ペプチドは、細胞透過特性を改善するために、少なくとも１つまたは複数のＡｒｇ残基またはＴａｔタンパク質に由来する残基を含み得る。追加のタグペプチド配列としては、ＣｙｓＴａｔ（ＣＹＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号７１）、Ｓ１９－ＴＡＴ（ＰＦＶＩＧＡＧＶＬＧＡＬＧＴＧＩＧＧＩＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号７２）、Ｒ８（ＲＲＲＲＲＲＲＲ；配列番号７３）、ｐＡｎｔｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；配列番号７４）、Ｐａｓ－ＴＡＴ（ＦＦＬＩＰＫＧＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号７５）、Ｐａｓ－Ｒ８（ＦＦＬＩＰＫＧＲＲＲＲＲＲＲＲ；配列番号７６）、ＰａｓＦＨＶ（ＦＦＬＩＰＫＧＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ；配列番号７７）、Ｐａｓ－ｐＡｎｔＰ（ＦＦＬＩＰＫＧＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；配列番号７８）、Ｆ２Ｒ４（ＦＦＲＲＲＲ；配列番号７９）、Ｂ５５（ＫＡＶＬＧＡＴＫＩＤＬＰＶＤＩＮＤＰＹＤＬＧＬＬＬＲＨＬＲＨＨＳＮＬＬＡＮＩＧＤＰＡＶＲＥＱＶＬＳＡＭＱＥＥＥ；配列番号８０）、アウズリン（ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ；配列番号８１）、ＩＭＴ－Ｐ８（ＲＲＷＲＲＷＮＲＦＮＲＲＲＣＲ；配列番号８２）、ＢＲ２（ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＬＬＲＲＬＬＲ；配列番号８３）、ＯＭＯＴＡＧ１（ＫＲＡＨＨＮＡＬＥＲＫＲＲ；配列番号８４）、ＯＭＯＴＡＧ２（ＲＲＭＫＡＮＡＲＥＲＮＲＭ；配列番号８５）、ｐＶＥＣ（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ；配列番号８６）、ＳｙｎＢ３（ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ；配列番号８７）、ＤＰＶ１０４７（ＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＭＤＶ；配列番号８８）、ＣＹ１０５Ｙ（ＣＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＹＬＩ；配列番号８９）、トランスポータン（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ；配列番号９０）、ＭＴＳ（ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ；配列番号９１）、ｈＬＦ（ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ；配列番号９２）、ＰＦＶＹＬＩ（ＰＦＶＹＬＩ；配列番号９３）、ｙＢＢＲ（ＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ、配列番号９４）、ＤＲＩ－ＴＡＴ３１（ｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇｙ、配列中の小文字表示はＤ－アミノ酸を示す；配列番号９５）、環状ヘプタペプチドシクロ（ｃＦΦＲ_４）（ＦΦＲＲＲＲＱ、配列中のΦはｌ－２－ナフチルアラニンを示し、全部分が環化されており、Ｇｌｎはコンジュゲーションハンドルとして作用し、Ｌｙｓ（アミンカップリングの場合）またはＣｙｓ（スルフヒドリルカップリングの場合）などの他の官能基で置換され得る；配列番号９６）、ＤＰＶ３（ＲＫＫＲＲＲＥＳＲＫＫＲＲＲＥＳ；配列番号４０３）、Ｃ１０Ｈ（ＲＫＧＦＹＫＲＫＱＣＫＰＳＲＧＲＫＲ；配列番号４０４）、ＶＰ２２（ＮＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＱＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＱ；配列番号４０５）、ＴＰ１０（ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ；配列番号４０６）、ＭＡＰ（ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ；配列番号４０７）、ＢＰｒＰｐ（ＭＶＫＳＫＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＡＭＷＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰ；配列番号４０８）、ＡＲＦ（ＭＶＲＲＦＬＶＴＬＲＩＲＲＡＣＧＰＰＲＶＲＶ；配列番号４０９）、ＧＡＬＡ（ＷＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡ；配列番号４１０）、ＳＡＰ（ＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰ；配列番号４１１）、ＭＰＧ（ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号４１２）、Ｐｅｐ－１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号４１３）、［ＷＲ］４（ＷＲＷＲＷＲＷＲ；配列番号４１４）、Ｉｇ（ｖ）（ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＫＫＫＲＫＶ；配列番号４１５）、Ｋ－ＦＧＦ（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＨＬＬＡＰ；配列番号４１６）、メリチン（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ；配列番号４１７）、ｇＨ６２５（ＨＧＬＡＳＴＬＴＲＷＡＨＹＮＡＬＩＲＡＦ；配列番号４１８）、ＨＩＶ－１ＴＡＴタンパク質（４８－６０）（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ；配列番号４１９）、ＭＰＧＨＩＶ－ｇｐ４１／ＳＶ４０Ｔ－抗原（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号４２０）、Ｒ６Ｗ３（ＲＲＷＷＲＲＷＲＲ；配列番号４２１）、ＮＬＳ（ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ；配列番号４２２）、８－リシン（ＫＫＫＫＫＫＫＫ；配列番号４２３）、ＨＲＳＶ（ＲＲＩＰＮＲＲＰＲＲ；配列番号４２４）、ＡＩＰ６（ＲＬＲＷＲ；配列番号４２５）、Ｐｅｐ－１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＲＫＶ；配列番号４２６）、ＭＡＰ１７（ＱＬＡＬＱＬＡＬＱＡＬＱＡＡＬＱＬＡ；配列番号４２７）、ＶＴ５（ＤＰＫＧＤＰＫＧＶＴＶＴＶＴＶＴＶＴＧＫＧＤＰＫＰＤ；配列番号４２８）、Ｂａｃ７（ＲＲＩＲＰＲＰＰＲＬＰＲＰＲＰＲＰＬＰＦＰＲＰＧ；配列番号４２９）、（ＰＰＲ）ｎ（（ＰＰＲＰＰＲＰＰＲ；配列番号４３０）、（ＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲ；配列番号４３１）、（ＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲ；配列番号４３２）、（ＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲ；配列番号４３３））、ＩＮＦ７（ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣ；配列番号４３４）、ＣＡＤＹ（ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡ；配列番号４３５）、Ｐｅｐ－７（ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ；配列番号４３６）、ＴＧＮ（ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＨＮＧ；配列番号４３７）、Ｋｕ－７０（ＶＰＭＬＫ；配列番号４３８）、ＣＰＰ（ＲＲＲＲＲＧＧＲＲＲＲＲＧ；配列番号４５２）（ＲＲＲＲＲＲＧＧＲＲＲＲＲＧ；配列番号４３９）、ＳＶＳ－１（ＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＫＶＫＶＫ；配列番号４４０）、Ｌ－ＣＰＰ（ＬＡＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫ；配列番号４４１）、ＲＬＷ（ＲＬＷＭＲＷＹＳＰＲＴＲＡＹＧ；配列番号４４２）、Ｋ１６ＡｐｏＥ（ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡ；配列番号４４３）、Ａｎｇｉｏｐｅｐ－２（ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹ；配列番号４４４）、ＡＣＰＰ（ＥＥＥＥＥＥＥＥＰＬＧＬＡＧＲＲＲＲＲＲＲＲＮ；配列番号４４５）、ＫＡＦＡＫ（ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；配列番号４４６）、ｈＣＴ（９－３２）（ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ；配列番号４４７）、ＶＰ２２（バージョン２）（ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＱＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ；配列番号４４８）、ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ；配列番号４４９）、ｈＰＰ３（ＫＰＫＲＫＲＲＫＫＫＧＨＧＷＳＲ；配列番号４５０）、ＰｅｐＮｅｇ（ＳＧＴＱＥＥＹ；配列番号４５１）、ＣＭ１８－ＴＡＴ（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧ；配列番号４５３）、ＰＴＤ４（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ；配列番号４５４）、またはＷａＴｘ（ＭＫＹＦＴＬＡＬＴＬＬＦＬＬＬＩＮＰＣＫＤＭＮＦＡＷＡＥＳＳＥＫＶＥＲＡＳＰＱＱＡＫＹＣＹＥＱＣＮＶＮＫＶＰＦＤＱＣＹＱＭＣＳＰＬＥＲＳ；配列番号４５５）を挙げることができる。例えば、いくつかの実施形態において、ペプチドは、アルギニンパッチ（Ａｒｇパッチ）、例えば、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号７３）、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含み得、配列は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。いくつかの実施形態において、Ａｒｇパッチは、２つ以上のＡｒｇ残基、またはＡｒｇ_ｎ（式中、ｎは、整数であり、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る）（配列番号９８）を含む。他の実施形態において、ペプチドは、Ｔａｔペプチドを含み得る（Ｔａｔタンパク質は、Ｇｕｍｐｅｔａｌ．ＴＡＴｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ．２００７Ｏｃｔ；１３（１０）：４４３－８及びＨａｒａｄａｅｔａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒｐｒｏｔｅｉｎｔｈｅｒａｐｙ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｄｏｍａｉｎｔｏｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｐｒｏｔｅｉｎｄｒｕｇｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ．２００６；１３（１）：１６－２６に概説されている）。Ｔａｔペプチドは、例えば、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９９）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１００）、またはその任意の修飾体、バリアント、もしくはフラグメントの配列を有し得、本開示の任意のＴｆＲ結合ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。いくつかの実施形態において、Ｔａｔペプチド配列は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（配列番号１０１）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１００）、またはそのフラグメントもしくはバリアントであり得る。いくつかの実施形態において、Ｔａｔペプチドは、本開示の任意のＴｆＲ結合ペプチドのＮ末端に、Ｎ末端ＧＳジペプチドの後、かつスペーサー、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号１０３）スペーサーの前に付加され得る。いくつかの実施形態において、配列番号７１～配列番号９６、配列番号９８～配列番号１０１、配列番号１１６～配列番号１２４、配列番号１２６、または配列番号４０３～配列番号４５５のいずれか１つなどの細胞透過タグペプチドは、Ｇ_ｘＳ_ｙ（配列番号１０４）ペプチドリンカー（配列中、ｘ及びｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０などの任意の整数であり得る）などのペプチドリンカーを使用して、本明細書で開示される任意のペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。他の実施形態において、ＴａｔペプチドもしくはＡｒｇパッチなどの細胞透過ペプチド、または任意の他の部分は、Ｇ_ｘＳ_ｙ（配列番号１０４）ペプチドリンカー（配列中、ｘ及びｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０などの任意の整数であり得る）などのペプチドリンカーを使用して、本明細書で開示される任意のペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、（ＧＳ）ｘ（配列番号１０５）を含み、配列中、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０などの任意の整数であり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、ＧＧＳＳＧ（配列番号１０６）、ＧＧＧＧＧ（配列番号１０７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１０８）、ＧＳＧＧ（配列番号１０９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１０）、ＧＧＧＳ（配列番号１０３）、ＧＧＳ（配列番号１１２）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１１３）、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。更に、ＤｋＴｘに由来するＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮ（配列番号１１４）、及びヒトＩｇＧ３に由来するＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号１１５）は、ペプチドリンカーとして使用され得る。他の実施形態において、タグペプチドは、任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。更なる実施形態において、タグペプチドは、ＴｆＲ結合活性に干渉することなく、任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。いくつかの実施形態において、タグペプチドは、コンジュゲーション、連結、または融合技術を介して付加される。他の実施形態において、Ｔａｔペプチドは、任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。更なる実施形態において、Ｔａｔペプチドは、ＴｆＲ結合活性に干渉することなく、任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。いくつかの実施形態において、Ｔａｔペプチドは、コンジュゲーション、連結、または融合技術を介してＴｆＲ結合ペプチドに付加され、ＴｆＲ結合細胞透過ペプチド融合体（ＣＰＰ融合体）が得られる。

細胞透過ペプチドには、限定するものではないが、正の正味電荷を持つ短い両親媒性またはカチオン系短ペプチドが含まれ、細胞膜を透過し、ペプチドに共有結合または非共有結合のいずれかで結合された分子またはカーゴを細胞内に輸送することが可能である。そのような細胞透過ペプチドは、または既知のタンパク質、例えば、ペネトラチン、Ｔａｔペプチド、ｐＶＥＣ、またはキメラペプチド、例えば、トランスポータン、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、または合成ペプチド、例えば、ポリアルギニン、ＭＡＰ、及びＲ_６Ｗ_３から合成または誘導することができる。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、細胞透過を改善するための少なくとも１つ以上の細胞透過ペプチド配列を含み得る。例えば、細胞透過ペプチドとしては、マウロカリン（ＧＤＣＬＰＨＬＫＬＣＫＥＮＫＤＣＣＳＫＫＣＫＲＲＧＴＮＩＥＫＲＣＲ；配列番号１１６）、インペラトキシン（ＧＤＣＬＰＨＬＫＲＣＫＡＤＮＤＣＣＧＫＫＣＫＲＲＧＴＮＡＥＫＲＣＲ；配列番号１１７）、ハドルカルシン（ＳＥＫＤＣＩＫＨＬＱＲＣＲＥＮＫＤＣＣＳＫＫＣＳＲＲＧＴＮＰＥＫＲＣＲ；配列番号１１８）、ヘミカルシン（ＧＤＣＬＰＨＬＫＬＣＫＡＤＫＤＣＣＳＫＫＣＫＲＲＧＴＮＰＥＫＲＣＲ；配列番号１１９）、オピカルシン－１（ＧＤＣＬＰＨＬＫＲＣＫＥＮＮＤＣＣＳＫＫＣＫＲＲＧＴＮＰＥＫＲＣＲ；配列番号１２０）、オピカルシン－２（ＧＤＣＬＰＨＬＫＲＣＫＥＮＮＤＣＣＳＫＫＣＫＲＲＧＡＮＰＥＫＲＣＲ；配列番号１２１、ミッドカイン（６２－１０４）（ＣＫＹＫＦＥＮＷＧＡＣＤＧＧＴＧＴＫＶＲＱＧＴＬＫＫＡＲＹＮＡＱＣＱＥＴＩＲＶＴＫＰＣ；配列番号１２２）、ＭＣｏＴＩ－ＩＩ（ＳＧＳＤＧＧＶＣＰＫＩＬＫＫＣＲＲＤＳＤＣＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧ；配列番号１２３）、またはクロロトキシン（ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ；配列番号１２４）を挙げることができる。いくつかの実施形態において、細胞透過ペプチドは、配列番号７１～配列番号９６、配列番号９８～配列番号１０１、配列番号１１６～配列番号１２４、配列番号１２６、または配列番号４０３～配列番号４５５のいずれかの配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有し得る。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、タンパク質または巨大分子カーゴをｉｎｖｉｖｏ送達するために、原形質膜または核に透過することが可能なアルギニンリッチ、両親媒性及びリシンリッチ、ならびに疎水性の残基またはペプチドなどの１つ以上の細胞透過ペプチドにコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。コンジュゲーションまたは融合は、直接的であってもよいし、その間にスペーサーがあってもよい（化学またはペプチドベース）。スペーサーは、任意のペプチドリンカーであり得る。例えば、スペーサーは、ＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１２５）、ＤｋＴｘに由来するＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮ（配列番号１１４）、ヒトＩｇＧ３に由来するＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号１１５）またはその任意のバリアントもしくはフラグメントであり得る。いくつかの実施形態において、細胞透過ペプチド配列は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。いくつかの実施形態において、細胞透過ペプチドは、本開示の任意のＴｆＲ結合ペプチドのＮ末端に、Ｎ末端ＧＳジペプチドの後、かつスペーサー、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号１０３）スペーサーの前に付加され得る。いくつかの実施形態において、配列番号７１～配列番号９６、配列番号９８～配列番号１０１、配列番号１１６～配列番号１２４、配列番号１２６、または配列番号４０３～配列番号４５５のいずれか１つなどの細胞透過タグペプチドは、Ｇ_ｘＳ_ｙ（配列番号１０４）ペプチドリンカー（配列中、ｘ及びｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０などの任意の整数であり得る）などのペプチドリンカーを使用して、本明細書で開示される任意のペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、ＧＧＳＳＧ（配列番号１０６）、ＧＧＧＧＧ（配列番号１０７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１０８）、ＧＳＧＧ（配列番号１０９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１０）、ＧＧＧＳ（配列番号１０３）、ＧＧＳ（配列番号１１２）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１１３）、ＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２２５）、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。更に、ＤｋＴｘに由来するＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮ（配列番号１１４）、及びヒトＩｇＧ３に由来するＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号１１５）は、ペプチドリンカーとして使用され得る。他の実施形態において、細胞透過ペプチドは、任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。更なる実施形態において、細胞透過ペプチドは、ＴｆＲ結合活性に干渉することなく、任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。いくつかの実施形態において、細胞透過ペプチドは、コンジュゲーション、連結、または融合技術を介して付加される。他の実施形態において、細胞透過ペプチドは、任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。

他の実施形態において、細胞透過は、最大１０μＭ、または１０μＭ以上のペプチドなど、高投与量の本明細書に記載されるペプチドを使用することによって増加し得る。いくつかの場合において、Ａｒｇパッチは、ペプチドと融合されるか、コンジュゲートされるか、連結されるか、または同時送達され得る。最大１０μＭ、または１０μＭ以上のＡｒｇパッチは、細胞透過を促進するために、ペプチドと同時送達され得る。タンパク質のトランスフェクション剤もまた、ペプチドの細胞透過を増加させるために使用することができる。いくつかの実施形態において、ペプチドの直接的サイトゾル発現を使用することができる。他の実施形態において、エレクトロポレーションなどの物理的破壊法を使用して、ペプチドの細胞内への送達を改善することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドの細胞透過性は、改善され得る。例えば、本明細書に記載されるペプチドの結合界面は、細胞透過性であることが知られているカルシンなどの足場上にグラフトされ得る。同様に、細胞透過性であることが知られている配列は、本開示のペプチド上にグラフトされ得る。カルシンのいくつかの非限定的な例は、インペラトキシン－Ａ、マウロカルシン、ヘミカルシン、オピクラシン１、オピカルシン２、及びハドルカルシンであり得る。足場は、配列番号１１６～配列番号１２４のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％含み得る。いくつかの実施形態において、細胞透過性ペプチドは、カルシン、修飾カルシン、カルシンの誘導体またはそのフラグメントであり得、細胞透過を増加させるために使用することができる。修飾カルシン、カルシンの誘導体、またはフラグメントは、筋小胞体リアノジン受容体の活性化、リアノジン感受性Ｃａ^２＋チャネルのＲｙＲ１、Ｒｙｒ２、もしくは両方に対する活性などの細胞透過活性、または前述の選択的アゴニストとしての細胞透過活性についてスクリーニングすることができる。更に、修飾カルシンは、活性の改変及び当該カルシンの細胞透過活性またはＲｙＲ１もしくはＲｙＲ２受容体に対する活性の最適化を行うために、カルシン内にあるリシン残基または他の荷電残基の置換、付加または還元を含み得る。一例として、ヘリックス３の６アミノ酸部分（ＭＬＩＣＬＦ；配列番号１２６）をカルシンまたは修飾カルシン足場上に移植すると、ＴｆＲ結合ペプチドの新しいＴｆＲ結合機能を有するカルシンの細胞透過を保持する二機能性ペプチドが生成され得る。別の例として、ＴＡＴもしくはオクタ－アルギニンなどのＫ／Ｒリッチ配列の包含、ヘリカル内アルギニンパッチ、またはペネトラチンもしくはメリチンなどの細胞透過性スクリーニングにおいて特定されたタンパク質のより大きなフラグメントへの融合を含む、本明細書に記載されるペプチドは、シス作用エレメントの使用により、細胞透過能を改善することができる。

いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、本明細書に記載されるペプチドに結合、コンジュゲート、連結、または融合されて、核局在化を促進し得る。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドは、Ｋ－Ｋ／Ｒ－Ｘ－Ｋ／Ｒ（配列番号１２９）（配列中、Ｘは、任意のアミノ酸、またはそのバリアントであり得る）の４残基配列などの核局在化シグナルにコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドは、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号１３０）またはＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１３１）などのＬａｎｇｅｅｔａｌ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００７Ｆｅｂ２３；２８２（８）：５１０１－５に記載されている核局在化シグナルにコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、ＫｘＲｙ（配列番号１３２）（配列中、ｘ及びｙは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得、ＫＫＲＲ（配列番号１３３）、ＫＫＫＲＲ（配列番号１３４）、またはＫＫＫＫ（配列番号１３５）など）を含む核局在化シグナルにコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。他の細胞透過部分は、限定するものではないが、ポリカチオン、ポリ有機酸、エンドソーム放出ポリマー、ポリ（２－プロピルアクリル酸）、ポリ（２－エチルアクリル酸）、またはこれらの任意の組み合わせを含め、本明細書に記載されるペプチドに連結されるか、コンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチド（例えば、ヒスチジン含有またはヒスチジンリッチＴｆＲ結合ペプチド）は、生理学的なｐＨで高いＴｆＲ結合親和性を有するが、エンドソームのｐＨ５．４などの低いｐＨレベルでは、結合親和性が著しく低下し得る。いくつかの場合において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、高いＴｆＲ結合能力を保持しながら、小胞内（例えば、エンドソーム内）及び／または細胞内送達機能を改善するために最適化され得る。いくつかの場合において、ヒスチジンスキャン及び比較結合実験を実施して、そのようなペプチドを開発及びスクリーニングすることができる。加えて、いくつかのペプチドは、送達機能（例えば、治療薬の細胞内送達）を増大させるために、ペプチドまたはペプチドコンストラクトの低ｐＨエンドソーム脱出を促進するモチーフを含み得る（例えば、コンジュゲート、連結、または融合される）。いくつかの実施形態において、本開示のペプチド中のアミノ酸残基は、ＴｆＲへのｐＨ依存性結合親和性を変更するために、異なるアミノ酸残基で置換される。アミノ酸置換は、低いｐＨにおける結合親和性を増加させること、高いｐＨにおける結合親和性を増加させること、低いｐＨにおける結合親和性を減少させること、高いｐＨにおける結合親和性を減少させること、またはこれらの組み合わせを含み得る。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、細胞層またはＢＢＢなどの細胞障壁を越えた小胞性トランスサイトーシスが可能である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、細胞または細胞（例えば、脳細胞）の核を標的及び／または透過する。標的とすることができる細胞または組織の例としては、ＣＮＳの細胞または組織、脳細胞、がん性細胞、及び他の細胞種などの疾患または状態に関連する細胞または組織が挙げられ、当該細胞のある特定の生物学的経路が調節不全である。標的とすることができる細胞または組織の更なる例としては、脾臓、肝臓、腎臓、筋肉、骨髄、または皮膚の細胞または組織が挙げられる。本開示のペプチドを用いて標的とすることができる細胞は、ｉｎｖｉｖｏ、またはｉｎｖｉｔｒｏのヒト細胞、哺乳動物細胞、ヒトもしくは哺乳動物細胞株、がん細胞株、対象から抽出した細胞であり得る。

いくつかの例では、本明細書で開示されるペプチドは、リシン残基を１つしか含有しないか、またはリシン残基を含有しない。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上または全てのリシン残基がアルギニン残基で置換されている。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上または全てのメチオニン残基がロイシンまたはイソロイシンによって置換される。ペプチド中の１つ以上または全てのトリプトファン残基がフェニルアラニンまたはチロシンによって置換され得る。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上または全てのアスパラギン残基がグルタミンによって置換される。いくつかの実施形態において、１つ以上または全てのアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基によって置換され得る。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上または全てのリシン残基がアラニンまたはアルギニンによって置換され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドのＮ末端は、アセチル基またはｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基などによって、ブロッキングまたは保護される。代替的にまたは組み合わせで、ペプチドのＣ末端は、アミド基などによって、またはエステルの形成（例えば、ブチルまたはベンジルエステル）などによって、ブロッキングまたは保護され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、遊離アミン上のメチル化によって修飾される。例えば、完全なメチル化は、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元的メチル化の使用を介して達成される。

いくつかの実施形態において、ジペプチドＧＳは、配列番号１～配列番号３５、または配列番号１３６～配列番号１７０に示されるように、最初の２つのＮ末端アミノ酸として追加することができ、あるいは、そのようなＮ末端ジペプチドＧＳは、配列番号３６～配列番号７０、もしくは配列番号１７１～配列番号２０５に示されるようになくてもよいし、または任意の他の１つもしくは２つのアミノ酸によって置換されてもよい。いくつかの実施形態において、ジペプチドＧＳは、リンカーとして使用されるか、またはリンカーに結合され、ペプチドコンストラクトなどのペプチドコンジュゲートもしくは融合分子を形成するために使用される。いくつかの実施形態において、リンカーは、Ｇ_ｘＳ_ｙ（配列番号１０４）ペプチドを含み、配列中、ｘ及びｙは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０などの任意の整数である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、（ＧＳ）ｘ（配列番号１０５）を含み、配列中、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０などの任意の整数であり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、ＧＧＳＳＧ（配列番号１０６）、ＧＧＧＧＧ（配列番号１０７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１０８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１０）、ＧＧＧＳ（配列番号１０３）、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。

本開示のいくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。本明細書で開示されるペプチドは、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５残基長である、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、または配列番号１７１～配列番号２０２のいずれか１つの連続フラグメントを含むフラグメントであり得、ペプチドフラグメントは、ペプチドの任意の部分から選択される。いくつかの実施形態において、ペプチド配列は、追加のアミノ酸に隣接する。１つ以上の追加のアミノ酸は、例えば、特定のｉｎｖｉｖｏ電荷、等電点、化学コンジュゲーション部位、安定性、または生理学的特性をペプチドに付与する。

いくつかの例では、ＴｆＲの標的化及び結合が可能な本明細書に記載されるペプチドは、８０アミノ酸長以下、または７０アミノ酸長以下、６０アミノ酸長以下、４０アミノ酸長以下、３５アミノ酸長以下、３０アミノ酸長以下、２５アミノ酸長以下、２０アミノ酸長以下、１５アミノ酸長以下、もしくは１０アミノ酸長以下を含む。

他の実施形態において、ペプチドは、目的の細胞または標的細胞に対して標的化またはホーミング機能を有する担体または分子にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。他の実施形態において、ペプチドは、ペプチドの半減期の延長または薬力学及び／または薬物動態特性の変更またはこれらの任意の組み合わせをもたらす分子にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。

いくつかの例では、ペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個のＡｒｇもしくはＬｙｓ、またはこれらの任意の組み合わせなどの正電荷残基を含む。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上のリシン残基がアルギニン残基で置換されている。いくつかの実施形態において、ペプチドは、１つ以上のＡｒｇパッチを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｇパッチは、ペプチドのＮ末端に位置する。他の態様において、Ａｒｇパッチは、ペプチドのＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、Ａｒｇパッチは、８つの連続したＡｒｇ残基（配列番号７３）を含む。いくつかの実施形態において、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０個以上のＡｒｇまたはＬｙｓ残基は、ペプチドにおいて、溶媒露出している。いくつかの実施形態において、Ａｒｇパッチは、２つ以上の連続したＡｒｇ残基であり得る。いくつかの実施形態において、Ａｒｇパッチは、Ｌｙｓで置換された１つ以上のＡｒｇを含む。

本開示のペプチドは、中性アミノ酸残基を更に含み得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、３５個以下の中性アミノ酸残基を有する。他の実施形態において、ペプチドは、８１個以下の中性アミノ酸残基、７０個以下の中性アミノ酸残基、６０個以下の中性アミノ酸残基、５０個以下の中性アミノ酸残基、４０個以下の中性アミノ酸残基、３６個以下の中性アミノ酸残基、３３個以下の中性アミノ酸残基、３０個以下の中性アミノ酸残基、２５個以下の中性アミノ酸残基、または１０個以下の中性アミノ酸残基を有する。

本開示のペプチドは、負のアミノ酸残基を更に含み得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、６個以下の負のアミノ酸残基、５個以下の負のアミノ酸残基、４個以下の負のアミノ酸残基、３個以下の負のアミノ酸残基、２個以下の負のアミノ酸残基、または１個以下の負のアミノ酸残基を有する。負のアミノ酸残基は、任意の負電荷アミノ酸残基から選択することができるが、いくつかの実施形態において、負のアミノ酸残基は、ＥもしくはＤのいずれか、またはＥとＤの組み合わせである。

本開示のいくつかの実施形態において、ペプチドの三次元または三次構造は、主に、ベータシート及び／またはアルファヘリックス構造から構成される。いくつかの実施形態において、本開示の設計または操作されたＴｆＲ結合ペプチドは、システインを形成する鎖内ジスルフィド結合（例えば、システインによって媒介される）及び疎水性コアによって安定化された小型で緻密なペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、操作されたＴｆＲ結合ペプチドは、アルファヘリックスのそれぞれの間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を有するらせん状バンドルを含む構造を有し、それによって、ペプチドが安定化される。他の実施形態において、操作されたＴｆＲ結合ペプチドは、３つのアルファヘリックス及び３つの鎖内ジスルフィド結合を有する構造を含み、鎖内ジスルフィド結合は、アルファヘリックスバンドル中の３つのアルファヘリックスのぞれぞれの間に１つある。

他の実施形態において、ペプチドは、目的の細胞または当該細胞の表面上もしくは内部に位置する標的タンパク質に対して標的化またはホーミング機能を有する分子（例えば、小分子、ペプチド、またはタンパク質）にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。他の実施形態において、ペプチドは、ペプチドの血漿半減期及び／または生物学的半減期の延長、または薬力学（例えば、標的タンパク質への結合の向上）及び／または薬物動態特性（例えば、クリアランスの速度及び様式）の変更、またはこれらの任意の組み合わせをもたらす分子にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。

一般に、関連する構造相同体の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分解構造またはＸ線結晶学構造を使用して、特定の生物学的機能（例えば、ＴｆＲへの結合）を維持しながら、本明細書に記載されるペプチドのフォールディング、安定性、及び製造可能性を改善することができる変異戦略の情報を得ることができる。これらの技術を使用して、構造的に相同な足場群の３Ｄファーマコフォアを予測することができ、また、特性（例えば、結合特性）が改善されたキメラを生成するために、関連タンパク質のグラフト可能領域を予測することができる。例えば、この戦略は、ＴｆＲ受容体結合及びトランスサイトーシス特性、高発現、ｉｎｖｉｖｏ高安定性、またはこれらの特性の任意の組み合わせが改善されたペプチドを設計するために使用される重要なアミノ酸位置及びループを特定するために使用される。

いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合及び細胞膜を越えたトランスサイトーシスが可能なペプチドは、表１に列挙される例示的なペプチド配列（配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、及び配列番号１７１～配列番号２０２）のいずれか１つと、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列、またはその機能性フラグメントを含む。２つ以上ペプチドは、ある程度の配列同一性または相同性を有し得、ｉｎｖｉｖｏで同様の特性を有し得る。例えば、ペプチドは、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、または配列番号１７１～配列番号２０２のペプチドのいずれか１つと、ある程度の配列同一性または相同性を有し得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の本開示のペプチドは、最大約２０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約２５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約３０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約３５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約４０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約４５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約５０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約５５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約６０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約６５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約７０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約７５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約８０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約８５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９６％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９７％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９８％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９９％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９９．５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、または最大約９９．９％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上の本開示のペプチドは、第２のペプチドと、少なくとも約２０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約２５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約３０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約３５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約４０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約４５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約５０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約５５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約６０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約６５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約７０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約７５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約８０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約８５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９６％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９７％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９８％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９９％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９９．５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９９．９％のペアワイズ配列同一性または相同性を有する。

いくつかの実施形態において、ＴｆＲ受容体結合の改善を示すペプチドは、トランスサイトーシス機能の改善を示す。いくつかの場合において、ＴｆＲ受容体結合の改善を示すペプチドは、トランスサイトーシス機能に変化が全くないか、または小さな変化を示す。いくつかの場合において、ＴｆＲ受容体結合の改善を示すペプチドは、トランスサイトーシス機能の低下を示す。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドのＫ_Ａ値及びＫ_Ｄ値を調節及び最適化して（例えば、アミノ酸置換を介して）、ＴｆＲ結合親和性と効率的なトランスサイトーシス機能の最適な比率をもたらすことができる。

２つ以上のペプチド間の相同性を決定するには、ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＭＡＦＦＴ、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅ、または別の好適な方法もしくはアルゴリズムなどの様々な方法及びソフトウェアプログラムを使用することができる。ペアワイズ配列アライメントは、２つの生物学的配列（例えば、アミノ酸または核酸配列）間の機能的、構造的及び／または進化的関係を示すことができる類似性の領域を特定するために使用することができる。加えて、多重配列アライメント（ＭＳＡ）は、３つ以上の生物学的配列のアライメントである。ＭＳＡアプリケーションの結果から、相同性が推定され、配列間の進化的関係を評価することができる。本明細書で使用される場合、「配列相同性」及び「配列同一性」及び「パーセント（％）の配列同一性」及び「パーセント（％）の配列相同性」は、区別なく使用され、必要に応じて、参照ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する配列の関連性または変化量を意味する。

いくつかの例では、ペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、もしくは配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ、またはその機能性フラグメントである。他の実施形態において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、もしくは配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つまたはその機能性フラグメントに対して、９９％、９５％、９０％、８５％、または８０％の配列同一性または相同性を有するペプチドを更に含む。

他の例において、ペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、もしくは配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ、またはその機能性フラグメントに対して相同であるペプチドであり得る。本明細書に更に記載されるように、「相同」という用語は、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、もしくは配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つの配列またはその機能性フラグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の配列同一性または相同性を有するペプチドまたはペプチドコンストラクトを示すために本明細書で使用され得る。

更に他の例において、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つのペプチドまたはペプチドコンストラクトをコードする核酸分子は、コードされたペプチドアミノ酸配列と、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、もしくは配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つのアミノ酸配列との配列同一性もしくは相同性のいずれかの決定によって、または核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって、特定することができる。配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つのそのようなペプチドバリアントまたはペプチドコンストラクトバリアントは、（１）０．１×－０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０～６５℃に相当する洗浄ストリンジェンシーの高ストリンジェントな洗浄条件下において、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つのヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）とハイブリダイズ状態を維持し、かつ（２）配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％超の配列同一性または相同性を有するペプチドをコードする、核酸分子として特徴付けることができる。

ノットペプチド
いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、１つ以上のＣｙｓ、または１つ以上のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドは、システイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）、ノットペプチド、またはヒッチンに由来する。本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、「ノットペプチド」、「システイン高密度ペプチド」、「ＣＤＰ」、及び「ヒッチン」という用語と同義であるとみなされる。（例えば、Ｃｏｒｒｅｎｔｉｅｔａｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｃｙｓｔｉｎｅ－ｄｅｎｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏｌ．２０１８Ｍａｒ；２５（３）：２７０－２７８参照）。

いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ＴｆＲに結合することができ、それにより、ＴｆＲと他の外因性または内因性リガンド（例えば、Ｔｆまたはそのホモログもしくはフラグメント）との相互作用などのＴｆＲ相互作用を阻止する。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ＴｆＲと他の外因性または内因性リガンド（例えば、Ｔｆまたはそのホモログもしくはフラグメント）との結合に影響を与えることなく、ＴｆＲに結合することができる。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドは、操作されたペプチドであり得る。操作されたペプチドは、非天然、人工、単離、合成、設計、または組換え発現されたペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、安定性、タンパク質分解に対する耐性、還元条件に対する耐性、及び／または血液脳関門を通過する能力などのＣＤＰ、ノットペプチド、またはヒッチンの１つ以上の特性を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤＰまたはノットペプチドは、操作された非天然ＣＤＰ及び天然に見出されるものを含め、がん細胞、膵細胞、肝細胞、結腸細胞、卵巣細胞、乳房細胞、肺細胞、またはこれらの任意の組み合わせなどの標的細胞に対する追加のホーミングまたは標的化機能を提供するために、表１に記載されるものなどの本開示のＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。いくつかの実施形態において、ＣＤＰまたはノットペプチドは、操作されたＣＤＰ、単離されたＣＤＰ及び天然に見出されるＣＤＰを含め、がん細胞、膵細胞、肝細胞、結腸細胞、卵巣細胞、乳房細胞、肺細胞、またはこれらの任意の組み合わせなどの標的細胞に対する追加のホーミングまたは標的化機能を提供するために、表１に記載されるものなどの本開示のＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。操作されたペプチドは、非天然、人工、合成、設計、または組換え発現されたペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシス及び／または細胞エンドサイトーシスを可能にし、ＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合される追加のＣＤＰまたはノットペプチドは、疾患または状態に関連する細胞内の酵素または目的の他のタンパク質を選択的に標的とすることができる。いくつかの場合において、細胞は、がん細胞である。がんは、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、脾癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、卵巣癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫、肺癌、骨髄細胞癌、または皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、及びびまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、またはＣＭＹＣ過剰発現癌を含み得る。いくつかの場合において、他のＣＤＰまたはノットペプチド（例えば、天然に見出されるもの）は、ＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合され、血液脳関門を越えてＴｆＲ結合ペプチドを局在化させ、中枢神経系の標的細胞にＴｆＲ結合ペプチドを送達することができる。

ＣＤＰ（例えば、ノットペプチド）は、通常、約１１～約８１アミノ酸長の範囲のペプチドのクラスであり、多くの場合、コンパクトな構造に折り畳まれる。ノットペプチドは、典型的に、多数の分子内ジスルフィド架橋を特徴とし、ベータストランド、アルファヘリックス、及び他の二次構造を含み得る、複雑な三次構造に組み立てられる。ジスルフィド結合の存在は、ノットペプチドに顕著な環境安定性を付与し、それにより、ノットペプチドは、極端な温度及びｐＨに耐え、血流のタンパク質分解酵素に抵抗することができる。ジスルフィドノットの存在は、還元剤による還元に対する耐性を提供し得る。ノットペプチドはまた、その剛直性により、柔軟性ペプチドが標的細胞と結合するときに生じる「エントロピーペナルティ」を受けることなく、標的への結合が可能になる。例えば、結合は、ペプチドが標的に結合して複合体を形成するときに生じるエントロピー損失により、悪影響を受ける。したがって、「エントロピーペナルティ」は、結合に対して有害な作用であり、この結合の際に生じるエントロピー損失が大きいほど「エントロピーペナルティ」が大きくなる。更に、柔軟な非結合分子は、結合して複合体になると柔軟性が失われるため、剛直性構造の分子よりも複合体を形成するときに多くのエントロピーを失う。一方、非結合分子の剛直性はまた、一般に、分子が形成することができる複合体の数を限定することで、特異性が高まる。ペプチドは、抗体と同様の親和性、またはナノモルもしくはピコモルの親和性で標的に結合することができる。ノットペプチドの配列構造及び配列同一性または相同性を詳しく調べると、あらゆる種類の動物及び植物において、ノットペプチドが収斂進化によって生じていることがわかる。動物において、ノットペプチドは、多くの場合、毒液、例えば、クモ及びサソリの毒液に見出され、イオンチャネルの調節に関与している。植物のノットタンパク質は、動物のタンパク質分解酵素を阻害するか、または抗菌活性を有し得ることから、ノットペプチドが植物に見出される分子防御系で機能し得ることを示唆している。

本開示のペプチドは、システインアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個のシステインアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも８つのシステインアミノ酸残基を有する。他の実施形態において、ペプチドは、少なくとも１０個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１２個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１４個のシステインアミノ酸残基または少なくとも１６個のシステインアミノ酸残基を有する。

ノットペプチドは、ジスルフィド架橋を含み得る。ノットペプチドは、残基の５％以上が分子内ジスルフィド結合を形成するシステインであるペプチドであり得る。ジスルフィド連結ペプチドは、薬物の足場であり得る。いくつかの実施形態において、ジスルフィド架橋は、ノットを形成する。ジスルフィド架橋は、例えば、システイン１と４、２と５、または３と６との間などのシステイン残基間で形成され得る。いくつかの実施形態において、１つのジスルフィド架橋は、他の２つのジスルフィド架橋によって形成されるループを通過して、例えば、ノットを形成する。他の実施形態において、ジスルフィド架橋は、任意の２つのシステイン残基間に形成され得る。

本開示は、ペプチド足場を更に含み、これは、例えば、追加のペプチドを生成するための出発点として使用することができる。いくつかの実施形態において、これらの足場は、様々なノットペプチド（ＣＤＰまたはノットペプチドなど）に由来し得る。特定の実施形態において、ＣＤＰ（例えば、ノットペプチド）は、多数の分子内ジスルフィド架橋を特徴とし、任意選択によりベータストランド、及びアルファヘリックスなどの他の二次構造を含む、複雑な三次構造に組み立てられる。例えば、ＣＤＰ（例えば、ノットペプチド）は、いくつかの実施形態において、ジスルフィドノットを介したジスルフィドを特徴とする小さなジスルフィドリッチタンパク質を含む。このノットは、例えば、１つのジスルフィド架橋が、他の２つのジスルフィド及びその相互接続骨格によって形成される大環状高分子を通過する場合に得ることができる。いくつかの実施形態において、ノットペプチドとしては、成長因子システインノットまたは阻害因子システインノットを挙げることができる。他の可能なペプチド構造としては、βシートを含まずに２つのジスルフィド架橋によって連結された２つの平行ヘリックスを有するペプチド（例えば、ヘフトキシン）が挙げられる。

いくつかの本開示のペプチドは、Ｌ立体配置である少なくとも１つのアミノ酸残基を含み得る。ペプチドは、少なくとも１つのＤ立体配置のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、１５～７５アミノ酸残基長である。他の実施形態において、ペプチドは、１１～５５アミノ酸残基長である。更に他の実施形態において、ペプチドは、１１～６５アミノ酸残基長である。更なる実施形態において、ペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基長である。

いくつかのＣＤＰ（例えば、ノットペプチド）は、毒素または毒液に存在することまたは関連することが知られているタンパク質の一種から誘導または単離することができる。いくつかの場合において、ペプチドは、サソリまたはクモに関連する毒素または毒液から得ることができる。ペプチドは、様々な属及び種のクモ及びサソリの毒液及び毒素から得ることができる。例えば、ペプチドは、Ｌｅｉｕｒｕｓｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓｈｅｂｒａｅｕｓ、Ｂｕｔｈｕｓｏｃｃｉｔａｎｕｓｔｕｎｅｔａｎｕｓ、Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａｊｕｄａｉｃｕｓ、Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓｅｕｐｅｕｓ、Ｂｕｔｈｕｓｏｃｃｉｔａｎｕｓｉｓｒａｅｌｉｓ、Ｈａｄｒｕｒｕｓｇｅｒｔｓｃｈｉ、Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓｎｏｘｉｕｓ、Ｈｅｔｅｒｏｍｅｔｒｕｓｌａｏｔｉｃｕｓ、Ｏｐｉｓｔｏｐｈｔｈａｌｍｕｓｃａｒｉｎａｔｕｓ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａｓｃｈｍｉｄｔｉ、Ｉｓｏｍｅｔｒｕｓｍａｃｕｌａｔｕｓ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａｈｕｗｅｎｕｍ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａｈａｉｎａｎｕｍ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａｓｃｈｍｉｄｔｉ、Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓａｐｅｒｔａ、Ｈａｙｄｒｏｎｙｃｈｅｖｅｒｓｕｔａ、Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａｈｕｗｅｎａ、Ｈｅｔｅｒｏｐｏｄａｖｅｎａｔｏｒｉａ、Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａｒｏｓｅａ、Ｏｒｎｉｔｈｏｃｔｏｎｕｓｈｕｗｅｎａ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅｖｅｒｓｕｔａ、Ａｔｒａｘｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｎｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓａｐｅｒｔａ、Ｐｓａｌｍｏｐｏｅｕｓｃａｍｂｒｉｄｇｅｉ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅｉｎｆｅｎｓａ、Ｐａｒａｃｏｅｌｏｔｅｓｌｕｃｔｏｓｕｓ、及びＣｈｉｌｏｂｒａｃｈｙｓｊｉｎｇｚｈａｏｏｒ別の好適な属または種のサソリまたはクモの毒液または毒素から得ることができる。いくつかの場合において、ペプチドは、ＢｕｔｈｕｓｍａｒｔｅｎｓｉｉＫａｒｓｈ（サソリ）毒素から得ることができる。

配列同一性及び相同性
パーセント（％）の配列同一性または相同性は、従来の方法によって決定される。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９８６），Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３（１９８６）、及びＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５参照）。簡潔に述べると、２つのアミノ酸配列は、ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１、ならびにＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（同上）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを使用して、アライメントスコアを最適化するように整列させることができる。次いで、配列同一性または相同性を次のように算出する：（［同一マッチ総数］／［長いほうの配列の長さと、２つの配列を整列させるために長いほうの配列に導入したギャップの数］）（１００）。

更に、２つのアミノ酸配列を整列させるには、いくつかの確立されたアルゴリズムが利用可能である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書で開示されるペプチドのアミノ酸配列とペプチドバリアントのアミノ酸配列とが共有する配列同一性または相同性のレベルを調べるために好適なタンパク質アライメント法であり得る。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、例えば、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）、及びＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）によって記載されている。簡潔に述べると、ＦＡＳＴＡは、まず、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮せずに、クエリー配列（例えば、配列番号１）と、最も高い密度の一致（ｋｔｕｐ変数が１の場合）または一致のペア（ｋｔｕｐ＝２の場合）のいずれかを有する試験配列とによって共有される領域を特定することによって、配列類似性を特徴付ける。次に、アミノ酸置換マトリックスを使用して、全てのペア形成アミノ酸の類似性を比較することによって、最も高い密度の一致を有する１０の領域を再スコアリングし、最も高いスコアに寄与する残基だけを含むように、領域の末端を「トリミング」する。「カットオフ」値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予め決定された式により計算される）よりも大きいスコアを有する複数の領域がある場合、トリミングされた初期領域を調べることにより、これらの領域を結合して、ギャップのある近似アライメントを形成することができるかどうかを決定する。最後に、２つのアミノ酸配列の最高スコアリング領域を、アミノ酸の挿入及び欠失を許容するＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ－Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４（１９７０）；Ｓｅｌｌｅｒｓ，ＳｉａｍＪ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２６：７８７（１９７４））の改変を使用して整列させる。例えば、ＦＡＳＴＡ解析の例示的なパラメーターは、ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝１、及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメーターは、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）の付録２に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を改変することによって、ＦＡＳＴＡプログラムに導入することができる。

ＦＡＳＴＡはまた、上に開示されている比を使用して、核酸配列または分子の配列同一性または相同性を特定するために使用することもできる。核酸配列を比較する場合、ｋｔｕｐ値は、１～６の範囲、好ましくは、２～６、最も好ましくは、３であり得、他のパラメーターは本明細書に記載のとおりに設定される。

「保存的アミノ酸置換」である一般的なアミノ酸のいくつかの例は、次の群：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（３）セリン及びトレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、ならびに（６）リシン、アルギニン及びヒスチジンのそれぞれのうちのアミノ酸間の置換によって例示される。ＢＬＯＳＵＭ６２表は、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局所的な多重アライメントから導出された、５００を超える関連タンパク質群の高度に保存された領域を表す、アミノ酸置換マトリックスである（ＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９９２））。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度を使用して、本発明のアミノ酸配列へ導入することができる保存的アミノ酸置換を定義することができる。化学的特性にのみ基づいてアミノ酸置換を設計することも可能であるが（上述のとおり）、「保存的アミノ酸置換」という言葉は、好ましくは、－１よりも大きいＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換を指す。例えば、アミノ酸置換は、０、１、２、または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる置換である場合、保存的である。このシステムによれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられ、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる。

構造的完全性の維持に重要な領域またはドメイン内のアミノ酸残基の決定を行うことができる。これらの領域のうち、変化に対してある程度の耐性があり、分子の全体的な三次構造を維持することができる特定の残基を決定することができる。配列構造を解析するための方法としては、限定するものではないが、アミノ酸またはヌクレオチドの同一性または相同性が高い多重配列のアライメント及び利用可能なソフトウェア（例えば、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ．ＲＴＭ．ビューワー及び相同性モデリングツール；ＭＳＩ、ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を使用したコンピューター解析、二次構造傾向、バイナリーパターン、相補的パッキング及び埋没極性相互作用が挙げられる（Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３７２－６（１９９５）及びＣｏｒｄｅｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：３－１０（１９９６））。一般に、分子に対する改変の設計または特定のフラグメントの特定を行う場合、構造の決定は、典型的に、改変された分子の活性を評価することによって達成することができる。

ペプチドの物理化学的特性
いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、分子の大きさ及び構造、ｐＨ、等電点、ならびに全体的な分子正味電荷などの広範囲の物理化学的特性を含み得る。これらのパラメーターは、ＴｆＲに結合し、トランスサイトーシスを促進し、ＢＢＢなどの細胞障壁を越えてカーゴ分子を輸送するペプチドの能力に影響し得る。

本開示のペプチドは、少なくとも１つのＤ立体配置のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約５～１００アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約１０～９０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約１５～８０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約１５～７５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約１５～７０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約２０～６５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約２０～６０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約２５～５５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約２５～５０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約２５～４０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約１１～３５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約１０～２５アミノ酸残基長である。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも１５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも２５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも３０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも３５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも４０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも４５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも５０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも５５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも６０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも６５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも７０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも７５アミノ酸残基長である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８の残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、または少なくとも８１のアミノ酸残基を含む。

本開示のいくつかの実施形態において、ペプチドの三次元または三次構造は、主に、ベータシート及び／またはアルファヘリックス構造から構成される。いくつかの実施形態において、本開示の設計または操作されたＴｆＲ結合ペプチドは、鎖内ジスルフィド結合（例えば、システインによって媒介される）及び疎水性コアによって安定化された小型で緻密なペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、操作されたＴｆＲ結合ペプチドは、アルファヘリックスのそれぞれの間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を有するらせん状バンドルを含む構造を有し、それによって、ペプチドが安定化される。他の実施形態において、操作されたＴｆＲ結合ペプチドは、３つのアルファヘリックス及び３つの鎖内ジスルフィド結合を有する構造を含み、鎖内ジスルフィド結合は、アルファヘリックスバンドル中の３つのアルファヘリックスのぞれぞれの間に１つある。

生理学的ｐＨで、本明細書に記載されるペプチドは、例えば、－５、－４、－３、－２、－１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、または＋５の全体的な分子正味電荷を有し得る。正味電荷がゼロの場合、ペプチドは、非電荷または双極性イオン性であり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、１つ以上のジスルフィド結合を含有し、生理学的ｐＨで正の正味電荷を有し、正味電荷は、＋０．５または＋０．５未満、＋１または＋１未満、＋１．５または＋１．５未満、＋２または＋２未満、＋２．５または＋２．５未満、＋３または＋３未満、＋３．５または＋３．５未満、＋４または＋４未満、＋４．５または＋４．５未満、＋５または＋５未満、＋５．５または＋５．５未満、＋６または＋６未満、＋６．５または＋６．５未満、＋７または＋７未満、＋７．５または＋７．５未満、＋８または＋８未満、＋８．５または＋８．５未満、＋９または＋９．５未満、＋１０または＋１０未満であり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、生理学的ｐＨで負の正味電荷を有し、正味電荷は、－０．５または－０．５未満、－１または－１未満、－１．５または－１．５未満、－２または－２未満、－２．５または－２．５未満、－３または－３未満、－３．５または－３．５未満、－４または－４未満、－４．５または－４．５未満、－５または－５未満、－５．５または－５．５未満、－６または－６未満、－６．５または－６．５未満、－７または－７未満、－７．５または－７．５未満、－８または－８未満、－８．５または－８．５未満、－９または－９．５未満、－１０または－１０未満であり得る。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、３～１０の等電点（ｐＩ）値を有し得る。他の実施形態において、本開示のペプチドは、４．３～８．９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、３～４のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、３～５のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、３～６のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、３～７のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、３～８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、３～９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、４～５のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、４～６のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、４～７のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、４～８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、４～９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、４～１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、５～６のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、５～７のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、５～８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、５～９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、５～１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、６～７のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、６～８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、６～９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、６～１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、７～８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、７～９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、７～１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、８～９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、８～１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、９～１０のｐＩ値を有し得る。

いくつかの場合において、本開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド）内の１つ以上の変異の操作は、生理学的ｐＨでの等電点、電荷、表面電荷、またはレオロジーが改変されたペプチドをもたらす。サソリまたはクモ複合体に由来し得るペプチドに対するそのような変異の操作により、例えば、正味電荷を１、２、３、４、もしくは５下げるか、または正味電荷を１、２、３、４、または５上げることによって、ペプチドの正味電荷を変えることができる。そのような場合において、操作された変異は、標的タンパク質に結合し、トランスサイトーシスを促進し、細胞、エンドソーム、または核を透過するペプチドの能力を促進することができる。ペプチドのレオロジー及び効力を改善するのに好適なアミノ酸修飾は、保存的または非保存的変異を含み得る。

ペプチドは、ペプチドの由来となる毒液または毒素成分の配列と比較して、最大で１つのアミノ酸変異、最大で２つのアミノ酸変異、最大で３つのアミノ酸変異、最大で４つのアミノ酸変異、最大で５つのアミノ酸変異、最大で６つのアミノ酸変異、最大で７つのアミノ酸変異、最大で８つのアミノ酸変異、最大で９つのアミノ酸変異、最大で１０のアミノ酸変異、または別の好適な数の変異を含み得る。他の実施形態において、ペプチド、またはその機能性フラグメントは、ペプチドの由来となる毒液または毒素成分の配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異、少なくとも２つのアミノ酸変異、少なくとも３つのアミノ酸変異、少なくとも４つのアミノ酸変異、少なくとも５つのアミノ酸変異、少なくとも６つのアミノ酸変異、少なくとも７つのアミノ酸変異、少なくとも８つのアミノ酸変異、少なくとも９つのアミノ酸変異、少なくとも１０のアミノ酸変異、または別の好適な数の変異を含み得る。いくつかの実施形態において、ペプチド内で変異の操作を行うことで、生理学的ｐＨで所望の電荷または安定性を有するペプチドを提供することができる。

一般に、ＮＭＲ分解構造、Ｘ線結晶構造、ならびに関連する構造ペプチドもしくはタンパク質ホモログの一次構造配列アライメントまたはｉｎｓｉｌｉｃｏ設計を使用して、特定の生物学的機能（例えば、ＴｆＲ親和性／結合）を維持しながら、フォールディング、安定性、及び／または製造可能性を改善することができる変異戦略を生成することができる。ホモログまたはｉｎｓｉｌｉｃｏ設計ペプチドもしくはポリペプチドを生成するための一般的な戦略は、タンパク質の荷電表面パッチまたは保存的残基の特定、重要なアミノ酸の位置及びループの変異、続いて、ペプチドのｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ試験を含み得る。全体的なペプチド最適化プロセスは、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏ試験中に得られた情報が次世代のペプチドの設計に使用されるという点で、反復的な性質のものであり得る。したがって、本明細書で開示される方法を使用して、特性が改善されたペプチドを設計すること、またはフォールディング及び製造可能性を困難にする有害な変異を修正することができる。重要なアミノ酸の位置及びループの保持を可能にしながら、ペプチド配列中の他の残基を変異させて、ペプチドの機能、例えば、結合、トランスサイトーシス、または細胞、エンドソーム、もしくは細胞核に浸透する能力、ホーミング、または別の活性を改善、変更、除去、または別様に修正することができる。

本開示はまた、本明細書に記載される様々なペプチドの多量体も包含する。多量体の例としては、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体などが挙げられる。多量体は、複数の同一サブユニットから形成されるホモマーまたは複数の異なるサブユニットから形成されるヘテロマーであり得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、少なくとも１つの他のペプチド、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上の他のペプチドとの多量体構造に配置される。特定の実施形態において、多量体構造のペプチドはそれぞれ同じ配列を有する。他の実施形態において、多量体構造の１つ以上または全てのペプチドは、異なる配列を有する。

いくつかの実施形態において、本開示は、より特異的な特性または改善された特性を有する追加の次世代ペプチドを生成するための出発点として使用することができるペプチド足場を提供する。いくつかの実施形態において、これらの足場は、様々なＣＤＰまたはノットペプチドに由来する。足場に好適ないくつかのペプチドとしては、クロロトキシン、ブラゼイン、サーキュリン、ステクリスプ、ハナトキシン、ミッドカイン、ヘフトキシン、ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害薬、バブルタンパク質、アトラクチン、α－ＧＩ、α－ＧＩＤ、μ－ＰＩＩＩＡ、ω－ＭＶＩＩＡ、ω－ＣＶＩＤ、χ－ＭｒＩＡ、ρ－ＴＩＡ、コナントキンＧ、コンツラキンＧ、ＧｓＭＴｘ４、マルガトキシン、ｓｈＫ、毒素Ｋ、キモトリプシン阻害薬（ＣＴＩ）、及びＥＧＦエピレグリンコアを挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ペプチド配列は、追加のアミノ酸に隣接する。１つ以上の追加のアミノ酸は、所望のｉｎｖｉｖｏ電荷、等電点、化学コンジュゲーション部位、安定性、または生理学的特性をペプチドに付与することができる。

ペプチドの化学修飾
ペプチドは、１つ以上の様々な方法で化学修飾することができる。いくつかの実施形態において、ペプチドは、機能の追加、機能の欠失、またはｉｎｖｉｖｏ挙動の改変がなされるように変異がなされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、ＴｆＲのプロテアソーム分解をもたらす分子（例えば、ユビキチンリガーゼ結合コンジュゲートもしくは融合体またはセレブロン結合分子）で化学修飾することができる。ジスルフィド連結間の１つ以上のループを修飾または置き換えることで、他のペプチドに由来する活性成分を含めることができる（ＭｏｏｒｅａｎｄＣｏｃｈｒａｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０３，ｐ．２２３－２５１，２０１２に記載のとおり）。アミノ酸はまた、半減期の延長、ｉｎｖｉｖｏにおける結合挙動の改変、追加もしくは欠失、新しい標的化機能の追加、表面電荷及び疎水性の改変、またはコンジュゲーション部位の可能をもたらすために変異がなされ得る。Ｎ－メチル化は、本開示のペプチドになされ得るメチル化の一例である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、遊離アミン上のメチル化によって修飾される。例えば、完全なメチル化は、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元的メチル化の使用を介して達成され得る。

ペプチドは、他のタンパク質またはペプチドに由来するループまたは配列を本開示のペプチド上にグラフトするなど、機能を追加するために修飾され得る。同様に、本開示に由来するドメイン、ループ、または配列は、追加の機能を有する抗体などの他のペプチドまたはタンパク質上にグラフトされ得る。

化学修飾は、例えば、ペプチドの半減期の延長または生体内分布もしくは薬物動態プロファイルの変更をもたらすことができる。化学修飾は、ポリマー、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、バイオポリマー、ポリアミノ酸、脂肪酸、デンドリマー、Ｆｃ領域、パルミチン酸もしくはミリスチン酸などの単純な飽和炭素鎖、またはアルブミンを含み得る。ポリアミノ酸としては、例えば、単一のアミノ酸が反復されるポリアミノ酸配列（例えば、ポリグリシン）、及びあるパターンに従っても従わなくてもよい混合ポリアミノ酸配列（例えば、ｇｌｙ－ａｌａ－ｇｌｙ－ａｌａ）または前述の任意の組み合わせを挙げることができる。

本開示のペプチドは、修飾がペプチドの安定性及び／または半減期を増大させるように修飾することができる。Ｎ末端、Ｃ末端、または内部アミノ酸などへの疎水性部分の結合を使用して、本開示のペプチドの半減期を延長することができる。ペプチドはまた、ペプチドの腸透過性または細胞透過性が増加または減少するように修飾することができる。いくつかの場合において、本開示のペプチドは、腸の腺細胞に高い蓄積を示すことから、クローン病またはより一般的には炎症性腸疾患などの腸の疾患または状態の治療及び／または予防における適用可能性を示す。本開示のペプチドは、例えば、血清半減期に影響し得る翻訳後修飾（例えば、メチル化及び／またはアミド化及び／またはグリコシル化）を含み得る。いくつかの実施形態において、単純な炭素鎖（例えば、ミリストイル化及び／またはパルミチル化による）が融合タンパク質またはペプチドにコンジュゲートされ、連結され得る。単純な炭素鎖は、融合タンパク質またはペプチドを非コンジュゲート材料から容易に分離できるようにし得る。例えば、非コンジュゲート材料から融合タンパク質またはペプチドを分離するのに使用することができる方法としては、溶媒抽出及び逆相クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。親油性部分は、血清アルブミンへの可逆的結合により、半減期を延長することができる。コンジュゲート部分は、例えば、血清アルブミンへの可逆的結合により、ペプチドの半減期を延長する親油性部分であり得る。いくつかの実施形態において、親油性部分は、コレステロールまたはコレステロール誘導体であり得、コレステン、コレスタン、コレスタジエン及びオキシステロールを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ミリスチン酸（テトラデカン酸）またはその誘導体にコンジュゲートされ、連結され得る。他の実施形態において、本開示のペプチドは、半減期改変剤に結合（例えば、コンジュゲート、連結、または融合）され得る。半減期改変剤の例としては、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、双極性イオン性水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含有する水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸、またはアルブミンに結合する分子を挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、半減期改変剤は、血清アルブミン結合ペプチド、例えば、ＳＡ２１（配列番号３７６、ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ）であり得る。いくつかの実施形態において、ＳＡ２１ペプチドは、本開示のＣＤＰ（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか）にコンジュゲートされるか、または融合され得る。ＳＡ２１融合ペプチドは、本明細書で開示されるＳＡ２１ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクト（例えば、配列番号３７３または配列番号３７５）を含み得る。ＳＡ２１ペプチドは、１つ以上のペプチドへのコンジュゲーション、またはその間の融合のためのリンカー配列を含み得る（例えば、配列番号３７７、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）。例示的なＳＡ２１ペプチド、融合ペプチド、及びリンカーは、表２に記載される。対照ＳＡ２１融合ペプチドは、ＳＡ２１に融合された対照ペプチド（例えば、配列番号３７２（ＧＳＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、配列番号３７４（ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、配列番号４５６（ＧＳＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＲＩＰＶＳＣＫＨＳＧＱＣＬＫＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＤＣＴＰＫ）、または配列番号４５７（ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＲＩＰＶＳＣＫＨＳＧＱＣＬＫＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＤＣＴＰＫ））を含み得る。更に、Ｃｙ５．５などの近赤外色素、またはＡｌｂｕタグなどのアルブミン結合物質へのペプチドのコンジュゲーションは、本明細書に記載される任意のペプチドの血清半減期を延長することができる。いくつかの実施形態において、免疫原性は、最小限の非ヒトタンパク質配列を使用することによって低減され、ペプチドの血清半減期が延長される。

いくつかの実施形態において、配列番号１～配列番号３５または配列番号１３６～配列番号１７０の最初の２つのＮ末端アミノ酸（ＧＳ）は、別の分子へのコンジュゲーションまたは融合を促進し、かつそのようなコンジュゲートされた分子、連結された分子、または融合された分子からのペプチドの切断を容易にするためのスペーサーまたはリンカーとして機能する。いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質またはペプチドは、例えば、ペプチドの特性を改変または変化させ得る他の部分にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。

ペプチドと活性薬剤のコンジュゲート（「ペプチドコンストラクト」とも呼ばれる）
いくつかの実施形態において、ＴｆＲへの結合に本開示のペプチド自体を使用することができる。他の実施形態において、本開示のペプチドはまた、別の活性薬剤を送達するために使用することができる。本開示に係るペプチドは、腫瘍及びがんの治療に使用される薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。例えば、特定の実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、追加の機能的能力を提供する活性薬剤などの別の分子に融合される。ペプチドは、ペプチドの配列と活性薬剤の配列とを含有するベクターの発現を介して、活性薬剤と融合され得る。種々の実施形態において、ペプチドの配列及び活性薬剤の配列は、同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から発現され得る。種々の実施形態において、ペプチドの配列及び活性薬剤の配列は、連続配列を含み得る。ペプチド及び活性薬剤は、ペプチドコンストラクトにおいて、個別に発現された場合の機能的能力と比較して、類似の機能的能力をそれぞれ保持し得る。特定の実施形態において、活性薬剤の例は、他のペプチドを含み得る。

特定の実施形態において、活性薬剤の例としては、ニューロテンシンペプチドなどの他のペプチドが挙げられる。ニューロテンシンは、１３アミノ酸の神経ペプチドであり、黄体形成ホルモン及びプロラクチン放出の制御に関与し、ドーパミン作動系と相互作用することができるが、血液脳関門を通過せず、またペプチダーゼによって急速に代謝される（Ｗａｎｇ，ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．２１（７）；８４０－８４８（２０１５））。

ニューロテンシンは、中枢神経系及び消化管に見出される１３アミノ酸ペプチドであり、広範な生理学的及び病理的プロセスに関与している。ニューロテンシンの様々な活性及びニューロテンシンアゴニストの潜在的な治療上の役割については、次に記載されている：Ｍｕｓｔａｉｎ，Ｒｙｃｈａｈｏｕ，ａｎｄＥｖｅｒｓ，ＣｕｒｒＯｐｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＤｉａｂｅｔｅｓＯｂｅｓ（２０１１）及びＢｏｕｌｅｓ，Ｌｉ，Ｓｍｉｔｈ，Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ，ａｎｄＲｉｃｈｅｌｓｏｎ，ＦｒｏｎｔＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）（２０１３）。ＮＴは、腸運動、心臓血管系の調節、ナロキソン非依存性抗侵害受容作用、低体温症、下垂体前葉ホルモン分泌の制御、筋肉弛緩、中心血圧、及び炎症に関与する。ＮＴは、３つの受容体ＮＴＳ１、ＮＴＳ２、ＮＴＳ３を介してその作用を調節する。ＮＴＳ１は、高親和性受容体であり、ニューロンとグリア細胞の両方において、内側中隔核、マイネルト基底核大細胞部、視交叉上核、ＳＮ、及びＶＴＡ、脊髄の小さな後根神経節ニューロンを含め、ＣＮＳ全体に広く発現している。ＮＴＳ２は、嗅覚系、大脳皮質及び小脳皮質、海馬形成、ならびに選択的視床下部核、ＶＴＡ、及びＳＮに主に位置する。ＮＴＳ３はまた、脳全体の様々な場所に発現している。ＮＴは、ドーパミン神経伝達の調節に関与しており、抗侵害受容作用、睡眠覚醒サイクル、及びストレスを含むセロトニン作動系の役割、グルタミン酸放出の役割を有し得、抗精神病作用を有し得る。ＮＴは、パラクライン及びオートクラインの役割、ＣＲＨ、ＧｎＲＨ、ＧＨＲＨ、プロラクチン、ＡＣＴＨ、性腺刺激ホルモン、成長ホルモン、プロラクチン、甲状腺ホルモン調節を含む神経内分泌制御、ならびに腸運動、腸炎症、脂質代謝、食欲、及び食物摂取に関与する。ＮＴは、統合失調症、薬物乱用、パーキンソン病（ＰＤ）、疼痛、血圧の中枢制御、摂食障害、脳卒中、アルツハイマー病などのいくつかのＣＮＳ障害、ならびにがん及び炎症及び内分泌機能の他の障害の病態生理学に関与しているとされる。正常な機序の崩壊は、統合失調症から大腸癌に及ぶ疾患につながり得る。特定のニューロテンシン受容体の選択的標的化または遮断によって、研究者は、統合失調症、アルコール依存症、慢性疼痛、またはがんの治療に使用するための潜在的な薬物を特定してきた。ＮＴは、オピオイド非依存性鎮痛作用をもたらし得、熱性、内臓性、及び持続性の炎症性疼痛、体性痛及び内臓痛を治療することができ、ストレス誘発性抗侵害受容作用の一因となる。ＮＴは、ミューオピオイド非依存性抗侵害受容作用を発揮する。ＮＴアゴニストは、コカイン及びアンフェタミン及びニコチンなどの精神刺激薬の作用を遮断し得る。血漿ＮＴレベルは、パーキンソン病患者でより高く、ＮＴの投与は、筋固縮及び振戦を減らすことができる。ＮＴはまた、体温を下げ、血圧を下げ得る。

表３は、例示的なニューロテンシン（ＮＴ）ペプチドバリアントを開示する（Ｂｏｕｌｅｓ，ｅｔａｌ．，Ｄｉｖｅｒｓｅｒｏｌｅｓｏｆｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎａｇｏｎｉｓｔｓｉｎｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１３）。本開示の任意のペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）は、本明細書で開示されるＮＴペプチドバリアントのいずれか（例えば、表３に開示されるＮＴペプチドバリアントのいずれか）、またはそのフラグメントに融合されるか、または別様にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、配列番号３５０と、少なくとも５３％、少なくとも６０％、少なくとも６９％、少なくとも７５％、少なくとも７７％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％の配列同一性を含むニューロテンシン（ＮＴ）ペプチドバリアントに融合されるか、または別様にコンジュゲートされる。他の実施形態において、本開示のペプチドは、配列ＥＬＹＥＮＫＰ（配列番号３７０）またはＥＬＹＥＮＫＰ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｐ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｌ（配列番号３７１）（配列中、Ｘ_１及びＸ_２は、ＬｙｓまたはＡｒｇであり得、Ｘ_３は、ＴｒｐまたはＴｙｒであり得、Ｘ_４は、ＩｌｅまたはＬｅｕであり得るか、あるいは、Ｘ_１－Ｘ_４及びＬｅｕのいずれも修飾アミノ酸残基も非天然アミノ酸残基も含まないか、またはその１つ以上は修飾アミノ酸残基もしくは非天然アミノ酸残基を含む）を含むニューロテンシン（ＮＴ）ペプチドバリアントに融合されるか、または別様にコンジュゲートされる。

したがって、ニューロテンシンペプチドと血液脳関門を通過することができる本明細書に記載されるペプチドのうちの１つとの融合は、ニューロテンシンペプチドの機能的能力を保持することができ、血液関門を通過することが可能な融合ペプチドをもたらし得る。例えば、本開示のペプチドのＤＮＡ配列は、ペプチド－ニューロテンシン融合体を製造するために、ニューロテンシンの遺伝子に挿入される。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、ニューロテンシンまたはその機能性フラグメントに融合される。ニューロテンシンの機能性フラグメントは、少なくとも５アミノ酸残基長、少なくとも６アミノ酸残基長、少なくとも７アミノ酸残基長、少なくとも８アミノ酸残基長、少なくとも９アミノ酸残基長、少なくとも１０アミノ酸残基長、少なくとも１１アミノ酸残基長、少なくとも１２アミノ酸残基長、または少なくとも１３アミノ酸残基長であり得る。

別の例として、特定の実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、機能的能力を提供する活性薬剤などの別の分子に結合される。いくつかの実施形態において、活性薬剤は、免疫治療薬、ＣＴＬＡ－４標的薬剤、ＰＤ－１標的薬剤、ＰＤＬ－１標的薬剤、ＩＬ１５薬剤、融合されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合薬剤、ＩＦＮガンマ薬剤、抗ＣＤ３薬剤、イオンチャネル調節剤、Ｋｖ１．３阻害薬、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアミシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ－３８、ＢＡＣＥ阻害薬、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害薬、ＷＥＨＩ－５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ－１９９、ナビトクラックス、ＡＴ－１０１、オバトクラックス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体、ドラスタチン、またはニューロテンシンなどの神経伝達物質である。

いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドは、活性薬剤を細胞内に誘導し得る。更なる実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドは、活性薬剤を核内に誘導し得る。いくつかの実施形態において、活性薬剤は、固有の腫瘍ホーミング特性を有するか、または、活性薬剤は、腫瘍ホーミング特性を有するように操作され得る。いくつかの実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の活性薬剤がペプチドに連結され得る。複数の活性薬剤は、複数のリシン残基及び／またはＮ末端にコンジュゲートさせるなどの方法によって、または複数の活性薬剤をポリマーもしくはデンドリマーなどの足場に連結させ、次いで、その薬剤－足場をペプチドに結合させることによって、結合され得る（Ｙｕｒｋｏｖｅｔｓｋｉｙ，Ａ．Ｖ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７５（１６）：３３６５－７２（２０１５）に記載のとおり）。活性薬剤の例としては、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、抗体フラグメント、アプタマー、サイトカイン、インターフェロン、ホルモン、酵素、成長因子、チェックポイント阻害薬、ＰＤ－１阻害薬、ＰＤ－Ｌ１阻害薬、ＣＤ４７阻害薬、ＣＴＬＡ４阻害薬、ＣＤ抗原、ケモカイン、神経伝達物質、イオンチャネル阻害薬、イオンチャネル賦活剤、Ｇタンパク質結合受容体阻害薬、Ｇタンパク質結合受容体賦活剤、化学薬剤、放射線増感剤、放射線防護剤、放射性核種、治療用小分子、ステロイド類、コルチコステロイド、抗炎症薬、免疫調節剤、補体結合ペプチドもしくはタンパク質、腫瘍壊死因子阻害薬、腫瘍壊死因子賦活剤、腫瘍壊死因子受容体ファミリーアゴニスト、腫瘍壊死受容体アンタゴニスト、Ｔｉｍ－３阻害薬、プロテアーゼ阻害薬、アミノ糖、化学療法剤、細胞毒性分子、毒素、チロシンキナーゼ阻害薬、抗感染症薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、アミノグリコシド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、バイオポリマー、多糖、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ポリエチレングリコール、脂質、デンドリマー、脂肪酸、もしくはＦｃ領域、またはこれらの活性フラグメントもしくは修飾体が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、活性薬剤に、例えば、直接的にまたはリンカーを介して共有結合的または非共有結合的に連結される。例えば、使用することができる細胞毒性分子には、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ドロスタチン、アウリスタチンＦ、モノメチルオウルスタチンＤ、ＤＭ１、ＤＭ４、メイタンシノイド、マイタンシン、カリケアミシン、Ｎ－アセチル－γ－カリケアミシン、ピロロベンゾジアゼピン、ＰＢＤ二量体、ドキソルビシン、ビンカアルカロイド（４－デアセチルビンブラスチン）、デュオカルマイシン、キノコアマトキシンの環状オクタペプチドアナログ、エポチロン、及びアントラサイリン、ＣＣ－１０６５、タキサン、パクリタキセル、カバジタキセル、ドセタキセル、ＳＮ－３８、イリノテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、白金化合物、シスプラチン、メトトレキサート、ベルベセスタット、クロラムブシル、マイトマイシンＣなどのＢＡＣＥ（ベータ－セクレターゼ１）阻害薬が含まれる。活性薬剤の追加の例は、ＭｃＣｏｍｂｓ，Ｊ．Ｒ．，ＡＡＰＳＪ，１７（２）：３３９－５１（２０１５），Ｄｕｃｒｙ，Ｌ．，ＡｎｔｉｂｏｄｙＤｒｕｇＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ（２０１３）、及びＳｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ．３２（１１）：３５４１－３５７１（２０１５）に記載されている。本開示の組成物及び方法と組み合わせて使用した場合に治療効果が著しく改善され得る治療用ペイロードの追加の例としては、カルムスチン、シスプラチン、シクロホスファミド、エトポシド、イリノテカン、ロムスチン、プロカルバジン、テモゾロミド、ビンクリスチン、及びベバシズマブが挙げられる。治療用ペイロードの追加の例は、ＢＡＣＥ阻害薬などの神経変性疾患または自己免疫疾患において治療上の利益を有する化合物、ならびにＣＧＲＰ受容体アンタゴニストなどの疼痛及び片頭痛に有効な治療薬である。疼痛の治療に使用される活性薬剤もまた、本開示と一致する。例えば、いくつかの実施形態において、活性薬剤は、ニューロテンシンなどの神経伝達物質である。したがって、本明細書で開示されるペプチドコンストラクトは、ペプチド－ニューロテンシンコンストラクトである。本明細書における実施形態での使用に適した例示的なリンカーは、以下に更に詳細に考察される。

ＢＢＢ透過能が低いため、現在利用可能な薬物分子のうち、ごく一部のみがＣＮＳ疾患に適用可能である。小分子薬物の約９８％がＢＢＢを通過しないか、非常に限られた程度しか通過しない。加えて、巨大分子薬物分子（例えば、抗体）のほぼ１００％が有効なＢＢＢ透過能を示さない。（例えば、Ｍｉｋｉｔｓｈｅｔａｌ．ＰａｔｈｗａｙｓｆｏｒＳｍａｌｌＭｏｌｅｃｕｌｅＤｅｌｉｖｅｒｙｔｏｔｈｅＣｅｎｔｒａｌＮｅｒｖｏｕｓＳｙｓｔｅｍＡｃｒｏｓｓｔｈｅＢｌｏｏｄ－ＢｒａｉｎＢａｒｒｉｅｒ，ＰｅｒｓｐｅｃｔＭｅｄｉｃｉｎＣｈｅｍ．２０１４；６：１１－２４参照）。したがって、利用可能な薬物分子または現在前臨床もしくは臨床開発中の薬物分子を本明細書に記載される方法及び組成物と組み合わせて使用して、ＴｆＲを発現している細胞、組織、または器官（例えば、がん細胞または免疫細胞）におけるこれらの薬物の治療活性に改善をもたらし、それにより、従来の治療薬と比較して優れた臨床転帰をもたらすことができる。例えば、特定の生物学的標的（例えば、タンパク質または核酸）に対する活性を示すが、細胞障壁または細胞膜により当該標的にｉｎｖｉｖｏで到達することができない薬物分子を本開示のＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合することで、これらの細胞障壁（例えば、ＢＢＢ）または細胞膜（例えば、がん細胞の細胞膜）を越えるＴｆＲ媒介性輸送を介した送達を向上することができる。ペプチド－薬物コンジュゲートまたは融合分子は、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを通過することができるため、極めて高い薬物濃度（例えば、ＣＮＳ障害（例えば、脳癌）を治療または予防するためのＣＮＳにおける治療濃度）をもたらすことができる。例えば、パルボシクリブは乳癌の治療において有効性が示されているが、ＣＮＳ腫瘍に対する活性は限定されている。したがって、パルボシクリブ薬物を本開示のＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲートすることにより、薬物分子自体がアクセスできない腫瘍、例えば、ＣＮＳに位置する腫瘍（例えば、脳腫瘍）の治療及び／または予防での使用が可能になる。１つ以上の本開示のＴｆＲ結合ペプチドを含むコンジュゲートまたは融合分子を使用して治療または予防することができる脳腫瘍は、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、及びびまん性内在性橋膠腫を含み得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドは、非ＣＮＳ及び／または末梢の細胞、組織、または器官の疾患を治療及び／または予防するために使用することができる。例えば、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドは、筋肉疾患を治療及び／または予防するために使用することができる。筋肉疾患を治療または予防するためにＴｆＲ結合ペプチドと組み合わせて使用され得る薬物または薬物候補は、筋ジストロフィー、球脊髄性筋ジストロフィー（ＳＢＭＡ）、筋強直性ジストロフィー、悪液質、またはサルコペニアのための薬物または薬物候補を含み得る。いくつかの実施形態において、薬物は、セノリティクスもしくは他の抗老化分子（例えば、カスパーゼ）、または筋肉疾患のための遺伝子治療であり得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドは、疼痛の治療に使用することができる。ＴｆＲ結合ペプチドは、ＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクト（例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、または配列番号３５９～配列番号３６１）を生成するために、ニューロテンシン（ＮＴ）に連結され得る。これらのペプチドコンストラクトは、ＣＮＳのニューロテンシン受容体を標的とし、疼痛を抑制することができる。いくつかの実施形態において、ペプチドは、投与により、対象の疼痛のレベルを低減することが可能である。

疼痛の種類には、慢性疼痛、急性疼痛、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、アロディニア、幻痛、内臓痛、突出痛が含まれる。ニューロテンシンは、非オピオイドであるが、鎮痛を提供し得る。オピオイドは、中毒を引き起こす場合があり、ＣＮＳへのニューロテンシン送達は、中毒性のない疼痛緩和の可能性を提供する。ニューロテンシンとペプチドの融合体はまた、ドーパミン作動系、セロトニン作動系、ＧＡＢＡ作動系、グルタミン酸作動系、及びコリン作動系、統合失調症、精神病、薬物乱用、パーキンソン病（ＰＤ）、疼痛、血圧の中枢制御、摂食障害、ならびにがん及び炎症を治療するために使用され得る。ニューロテンシンペプチド融合体は、慢性疼痛、急性疼痛、損傷、機械的疼痛、熱痛、冷痛、虚血痛、及び化学物質誘発性疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛症関連疼痛、関節炎疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後痛、外傷後痛、緊張型頭痛、産科疼痛、婦人科疼痛、または化学療法誘発性疼痛、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、アロディニア、幻痛、内臓痛、突出痛、家族性エピソード性疼痛症候群、発作性激痛症、先天性無痛覚症、オピオイド離脱関連疼痛を含む疼痛の治療に使用され得る。ニューロテンシンペプチド融合体は、バーター症候群、アンダーセン病、先天性高インスリン血症、新生児糖尿病、拡張型心筋症、反復発作性運動失調症１型、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、良性新生児熱性痙攣、非症候性難聴、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、多嚢胞性腎疾患、家族性エピソード性疼痛症候群、巣状分節性糸球体硬化症、網膜色素変性症、てんかん、重症ミオクロニーてんかん、ＱＴ延長症候群、小脳性運動失調症、皮膚紅痛症、発作性激痛症、先天性無痛覚症、良性家族性新生児痙攣、チモシー症候群、反復発作性運動失調症２型、乳児硬直症候群、若年性ミオクロニーてんかん、及び常染色体優性夜間前頭葉てんかんを含む疾患及び障害などにおけるＡＣＴＨ軸、ＨＰＡ軸、ホルモン制御、及びイオンチャネル制御などの神経内分泌的制御に使用され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドコンストラクト（例えば、ペプチド－ＮＴコンストラクト）は、ドーパミン－シグナル伝達ニューロンと相互作用して疼痛を低減させる。

本明細書に記載される操作されたペプチド及びペプチドコンストラクト（例えば、ペプチドコンジュゲート、融合ペプチド、または組換え産生されたペプチドコンストラクト）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの細胞障壁を越えて（例えば、小胞性トランスサイトーシスを介して）または細胞膜を越えて（例えば、エンドサイトーシスを介して）輸送されることは、神経変性に関連する多数の疾患、状態、または障害に影響を与え得る。本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドで治療、予防、または診断することができる神経変性疾患としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、ライム病、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳失調症、バッテン病、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、クフォー・ラケブ症候群、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、慢性外傷性脳症、または前頭側頭型認知症を挙げることができる。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドは、神経変性疾患を治療及び／または予防するために、ＢＡＣＥ阻害薬である、ガランタミン、アマンタジン、ベンザトロピン、ビペリデン、ブロモクリプチン、カルビドパ、ドネペジル、エンタカポン、レボドパ、ペルゴリ、プラミペキソール、プロシクリジン、リバスチグミン、ロピニロール、セレギリン、タクリン、トルカポン、またはトリヘキシフェニジルと組み合わせて使用することができる。

いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドを使用したＫｖ１．３カリウムチャネルなどのイオンチャネルの調節（例えば、阻害）及びＫｖ１．３カリウムチャネル阻害薬コンジュゲートまたはペプチドコンストラクトなどのイオンチャネル調節剤は、脳の炎症を治療または予防するために使用され得る。Ｋｖ１．３カリウムチャネルは、例えば、脳内のミクログリアに高度に発現され得る。したがって、神経炎症性及び神経変性疾患、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、放射線療法による毒性ならびに他の神経変性疾患及び神経炎症性疾患は、Ｋｖ１．３阻害薬にコンジュゲート、連結、または融合されたＴｆＲ結合ペプチドで治療することができる。これらの疾患は、Ｋｖ１．３の上方制御を特徴とし得る。いくつかの場合において、Ｋｖ１．３阻害薬は、エフェクターＴ細胞への作用により、乾癬及び他の脳以外の自己免疫疾患の治療のために使用され得る。いくつかの実施形態において、Ｋｖ１．３阻害薬ペプチドは、Ｖｍ２４（配列番号３７８または配列番号３９１、ＧＳＡＡＡＩＳＣＶＧＳＰＥＣＰＰＫＣＲＡＱＧＣＫＮＧＫＣＭＮＲＫＣＫＣＹＹＣ）またはＳｈＫ－１８６（配列番号３７９）であり得る。Ｋｖ１．３阻害薬ペプチドは、本明細書で開示されるペプチドのいずれか（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）にコンジュゲートされ得る。例示的なＫｖ１．３阻害薬ペプチドは、表４に提供される。

いくつかの実施形態において、Ｋｖ１．３阻害薬、例えば、Ｋｖ１．３ペプチド阻害薬は、本開示のＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲートされ得る。例示的なＫｖ１．３阻害薬融合ペプチドは、表５に提供される。本開示のＫｖ１．３阻害薬融合ペプチドの対照は、Ｋｖ１．３阻害薬に融合された対照ペプチドを含み得る（例えば、配列番号３８０（ＧＳＡＡＡＩＳＣＶＧＳＰＥＣＰＰＫＣＲＡＱＧＣＫＮＧＫＣＭＮＲＫＣＫＣＹＹＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、配列番号３８２（ＧＳＥＷＳＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、配列番号３８３（ＧＳＥＷＳＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、配列番号３８６（ＧＳＡＡＡＩＳＣＶＧＳＰＥＣＰＰＫＣＲＡＱＧＣＫＮＧＫＣＭＮＲＫＣＫＣＹＹＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、配列番号３８７（ＧＳＡＡＡＩＳＣＶＧＳＰＥＣＰＰＫＣＲＡＱＧＣＫＮＧＫＣＭＮＲＫＣＫＣＹＹＣＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、配列番号３９２（ＡＡＡＩＳＣＶＧＳＰＥＣＰＰＫＣＲＡＱＧＣＫＮＧＫＣＭＮＲＫＣＫＣＹＹＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、配列番号３９４（ＥＷＳＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、配列番号３９５（ＥＷＳＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、配列番号３９８（ＡＡＡＩＳＣＶＧＳＰＥＣＰＰＫＣＲＡＱＧＣＫＮＧＫＣＭＮＲＫＣＫＣＹＹＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、及び配列番号３９９（ＡＡＡＩＳＣＶＧＳＰＥＣＰＰＫＣＲＡＱＧＣＫＮＧＫＣＭＮＲＫＣＫＣＹＹＣＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ））。いくつかの実施形態において、Ｋｖ１．３ペプチド阻害薬は、ＴｆＲ結合ペプチドに融合またはコンジュゲートするためのリンカーを含み得る。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドに融合されるＫｖ１．３ペプチド阻害薬は、配列番号３９０または配列番号４０２の配列を含むペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号１０３～配列番号１１５または配列番号１２５のいずれか１つの配列を有し得る。Ｋｖ１．３結合ペプチド（例えば、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３９１、または配列番号４０２）は、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つの配列を含むＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲートされ得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドは、限定するものではないが、卵巣癌、結腸癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫、及び肺癌、骨もしくは骨髄に位置する癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、及びびまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、脾癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、骨髄細胞癌、または皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、またはＣＭＹＣ過剰発現癌を含む、ＣＮＳの内側及び外側の両方に位置する癌を治療及び／または予防するために使用され得る。

いくつかの実施形態において、がんを予防及び／または治療するために使用することができるＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、ＴｆＲ結合ペプチドと、ＩＬ１５、融合されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ、ＩＦＮガンマ、及び抗ＣＤ３薬剤などの抗腫瘍活性を有する活性薬剤とを含むものである。そのようなペプチドコンストラクト（例えば、融合ペプチド）の例は、配列番号２２５～配列番号３３２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するものである。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドコンストラクトは、配列番号２２５～配列番号３３２のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。本開示の例示的なペプチドコンストラクトは、以下の表６に示される。これらの例示的なペプチドコンストラクトは、分泌マウスＩｇカッパリーダー配列、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖのリシンからアルギニンへの変異体、短いＦｌａｇ配列、Ｈｉｓ－タグ、ＩＬ－１５Ｒａ、ＩＬ－１５、ＩＦＮガンマ、本明細書で開示される任意のリンカー、本明細書で開示される任意のペプチド、及びこれらの任意のフラグメントまたは誘導体を含み得る。また、表６には、ペプチド－ニューロテンシンコンストラクト（例えば、本開示のペプチドをニューロテンシンに複合体化したペプチドコンストラクト）が示され、例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、及び配列番号３５９～配列番号３６１に示されるものである。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドコンストラクトは、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、及び配列番号３５９～配列番号３６１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。

例示的なペプチド－ニューロテンシンコンストラクトは、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、及び配列番号３５９～配列番号３６１に示される。配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、及び配列番号３５６～配列番号３５８のペプチドは、ニューロテンシンに更に融合され得る。当該ペプチドまたはペプチド－ＮＴ融合体のそれぞれは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３２（または配列番号３６、配列番号３７、もしくはＮ末端ＧＳのない配列番号６７）のペプチドを含み得、そのそれぞれは、タンパク質の発現、分泌、及び／または精製を改善するために、遺伝子融合発現タグのシデロカリンなどの発現タグまたは配列を更に含み得る。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ阻害薬、Ｃｏｐｉｋｔｒａ（デュベリシブ）、Ｅｒｌｅａｄａ（アパルタミド）、Ｌｉｂｔａｙｏ（セミプリマブ－ｒｗｌｃ）、Ｌｏｒｂｒｅｎａ（ロルラチニブ）、Ｌｕｍｏｘｉｔｉ（モキセツモマブパスードトクス－ｔｄｆ）、Ｌｕｔａｔｈｅｒａ（ルテチウムＬｕ１７７ドータテート）、Ｔａｌｚｅｎｎａ（タラゾパリブ）、Ｖｉｚｉｍｐｒｏ（ダコミチニブ）、Ａｌｉｑｏｐａ（コパンリシブ）、Ａｌｕｎｂｒｉｇ（ブリガチニブ）、Ｂａｖｅｎｃｉｏ（アベルマブ）、Ｂｅｓｐｏｎｓａ（イノツズマブオゾガマイシン）、Ｃａｌｑｕｅｎｃｅ（アカラブルチニブ）、ＩＤＨＩＦＡ（エナシデニブ）、Ｉｍｆｉｎｚｉ（デュルバルマブ）、Ｋｉｓｑａｌｉ（リボシクリブ）、Ｋｙｍｒｉａｈ（チサゲンレクルユーセル）、Ｎｅｒｌｙｎｘ（ネラチニブ）、Ｒｙｄａｐｔ（ミドスタウリン）、Ｖｙｘｅｏｓ（ダウノルビシン及びシタラビン）、Ｘｅｒｍｅｌｏ（テロトリスタットエチル）、Ｙｅｓｃａｒｔａ（アキシカブタゲンシロルユーセル）、Ｚｅｊｕｌａ（ニラパリブ）、Ｃａｂｏｍｅｔｙｘ（カボザンチニブ）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ペンブロリズマブ）、Ｌａｒｔｒｕｖｏ（オララツマブ）、Ｌｅｎｖｉｍａ（レンバチニブ）、Ｏｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）、Ｒｕｂｒａｃａ（ルカパリブ）、Ｓｕｓｔｏｌ（グラニセトロン）、Ｓｙｎｄｒｏｓ（ドロナビノール経口溶液）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（アテゾリズマブ）、Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（ベネトクラクス）、Ａｌｅｃｅｎｓａ（アレクチニブ）、Ｃｏｔｅｌｌｉｃ（コビメチニブ）、Ｄａｒｚａｌｅｘ（ダラツムマブ）、Ｅｍｐｌｉｃｉｔｉ（エロツズマブ）、Ｆａｒｙｄａｋ（パノビノスタット）、Ｉｂｒａｎｃｅ（パルボシクリブ）、Ｉｍｌｙｇｉｃ（タリモジンラヘルパレプベク）、Ｌｅｎｖｉｍａ（レンバチニブ）、Ｌｏｎｓｕｒｆ（トリフルリジン及びチピラシル）、Ｎｉｎｌａｒｏ（イキサゾミブ）、Ｏｄｏｍｚｏ（ソニデジブ）、Ｏｎｉｖｙｄｅ（イリノテカンリポソーム注射）、Ｐｏｒｔｒａｚｚａ（ネシツムマブ）、Ｔａｇｒｉｓｓｏ（オシメルチニブ）、Ｕｎｉｔｕｘｉｎ（ジヌツキシマブ）、Ｖａｒｕｂｉ（ロラピタント）、Ｖｉｓｔｏｇａｒｄ（ウリジントリアセテート）、Ｙｏｎｄｅｌｉｓ（トラベクテジン）、Ａｋｙｎｚｅｏ（ネツピタント及びパロノセトロン）、Ｂｅｌｅｏｄａｑ（ベリノスタット）、Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（ブリナツモマブ）、Ｃｙｒａｍｚａ（ラムシルマブ）、Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（イブルチニブ）、Ｌｙｎｐａｒｚａ（オラパリブ）、Ｚｙｄｅｌｉｇ（イデラリシブ）、Ｚｙｋａｄｉａ（セリチニブ）、Ｇａｚｙｖａ（オビヌツズマブ）、Ｇｉｌｏｔｒｉｆ（アファチニブ）、Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（イブルチニブ）、Ｋａｄｃｙｌａ（ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン）、Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（トラメチニブ）、Ｐｏｍａｌｙｓｔ（ポマリドミド）、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（レナリドミド）、Ｓｔｉｖａｒｇａ（レゴラフェニブ）、Ｔａｆｉｎｌａｒ（ダブラフェニブ）、Ｖａｌｃｈｌｏｒ（メクロレタミン）ゲル、Ｘｇｅｖａ（デノスマブ）、Ｘｏｆｉｇｏ（ラジウムＲａ２２３二塩化物）、Ａｂｒａｘａｎｅ（懸濁注射用パクリタキセルタンパク質結合粒子）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）、Ｂｏｓｕｌｉｆ（ボスチニブ）、Ｃｏｍｅｔｒｉｑ（カボザンチニブ）、Ｅｒｉｖｅｄｇｅ（ビスモデギブ）、Ｉｃｌｕｓｉｇ（ポナチニブ）、Ｉｎｌｙｔａ（アキシチニブ）、Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（カルフィルゾミブ）、Ｍａｒｑｉｂｏ（ビンクリスチン硫酸塩リポソーム注射）、Ｎｅｕｔｒｏｖａｌ（ｔｂｏ－フィルグラスチム）、Ｐｅｒｊｅｔａ（ペルツズマブ）、Ｐｉｃａｔｏ（インゲノールメブタート）ゲル、Ｓｔｉｖａｒｇａ（レゴラフェニブ）、Ｓｕｂｓｙｓ（フェンタニル舌下スプレー）、Ｓｙｎｒｉｂｏ（オマセタキシンメペスクシナート）、Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（パゾパニブ）、Ｘｔａｎｄｉ（エンザルタミド）、Ｚａｌｔｒａｐ（ｚｉｖ－アフリベルセプト）、Ａｂｓｔｒａｌ（フェンタニル舌下錠剤）、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（ブレンツキシマブベドチン）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）、Ｅｒｗｉｎａｚｅ（アスパラギナーゼエルウィニアクリサンチミー）、Ｌａｚａｎｄａ（フェンタニルクエン酸塩）鼻スプレー、Ｓｕｔｅｎｔ（スニチニブリンゴ酸塩）、Ｓｙｌａｔｒｏｎ（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）、Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ（バンデタニブ）、Ｘａｌｋｏｒｉ（クリゾチニブ）、Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ）、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（ベムラフェニブ）、Ｚｙｔｉｇａ（アビラテロン酢酸エステル）、Ｈａｌａｖｅｎ（エリブリンメシル酸塩）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、Ｊｅｖｔａｎａ（カバジタキセル）、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（シプリューセル－Ｔ）、Ｘｇｅｖａ（デノスマブ）、Ｚｕｐｌｅｎｚ（オンダンセトロン経口可溶性フィルム）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）、Ａｒｚｅｒｒａ（オファツムマブ）、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、Ｃｅｒｖａｒｉｘ［二価ヒトパピローマウイルス（１６及び１８型）ワクチン、組換え、Ｅｌｉｔｅｋ（ラスブリカーゼ）、Ｆｏｌｏｔｙｎ（プララトレキセート注射）、Ｉｓｔｏｄａｘ（ロミデプシン）、Ｏｎｓｏｌｉｓ（フェンタニルバッカル錠）、Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（パゾパニブ）、Ｄｅｇａｒｅｌｉｘ（注射用デガレリクス）、Ｆｕｓｉｌｅｖ（レボロイコボリン）；Ｍｏｚｏｂｉｌ（プレリキサフォル注射）、Ｓａｎｃｕｓｏ（グラニセトロン）、Ｔｒｅａｎｄａ（ベンダムスチン塩酸塩）、Ｅｖｉｓｔａ（ラロキシフェン塩酸塩）、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（トポテカン塩酸塩）、Ｉｘｅｍｐｒａ（イクサベピロン）、Ｔａｓｉｇｎａ（ニロチニブ塩酸塩一水和物）、Ｔｏｒｉｓｅｌ（テムシロリムス）、Ｔｙｋｅｒｂ（ラパチニブ）、Ｇａｒｄａｓｉｌ（四価ヒトパピローマウイルス（６、１１、１６、１８型）組換えワクチン）、Ｓｐｒｙｃｅｌ（ダサチニブ）、Ｓｕｔｅｎｔ（スニチニブ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ）、Ａｒｒａｎｏｎ（ネララビン）、Ｎｅｘａｖａｒ（ソラフェニブ）、Ａｌｉｍｔａ（注射用ペメトレキセド）、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）；Ｃｌｏｌａｒ（クロファラビン）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、Ｓｅｎｓｉｐａｒ（シナカルセト）、Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブ、ＯＳＩ７７４）、Ａｌｏｘｉ（パロノセトロン）、Ｅｍｅｎｄ（アプレピタント）、Ｉｒｅｓｓａ（ゲフィチニブ）；Ｐｌｅｎａｘｉｓ（懸濁注射用アバレリクス）；Ｐｒｅｍａｒｉｎ（結合型エストロゲン）；ＵｒｏＸａｔｒａｌ（アルフゾシンＨＣｌ徐放性錠剤）；Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ）；Ｅｌｉｇａｒｄ（リュープロレリン酢酸塩）；Ｅｌｏｘａｔｉｎ（オキサリプラチン／５－フルオロウラシル／ロイコボリン）；Ｆａｓｌｏｄｅｘ（フルベストラント）；Ｇｌｅｅｖｅｃ（イマチニブメシル酸塩）；Ｎｅｕｌａｓｔａ；ＳｅｃｒｅＦｌｏ（セクレチン）；Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブチウキセタン）；Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロン酸）；Ｃａｍｐａｔｈ；Ｆｅｍａｒａ（レトロゾール）；Ｇｌｅｅｖｅｃ（イマチニブメシル酸塩）；Ｋｙｔｒｉｌ（グラニセトロン）溶液；ＴｒｅｌｓｔａｒＬＡ（トリプトレリンパモエート）；Ｘｅｌｏｄａ；Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロン酸）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン）；ＴｒｅｌｓｔａｒＤｅｐｏｔ（トリプトレリンパモエート）；Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（三酸化ヒ素）；Ｖｉａｄｕｒ（リュープロレリン酢酸塩埋め込み製剤）；Ａｒｏｍａｓｉｎ錠剤；Ｂｕｓｕｌｆｌｅｘ；Ｄｏｘｉｌ（ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射）；Ｅｌｌｅｎｃｅ；Ｅｔｈｙｏｌ（アミホスチン）；Ｔｅｍｏｄａｒ；ＵＶＡＤＥＸ無菌液；Ｚｏｆｒａｎ；Ａｃｔｉｑ；Ａｎｚｅｍｅｔ；Ｃａｍｐｔｏｓａｒ；Ｇｅｍｚａｒ（ゲムシタビンＨＣＬ）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；ＩｎｆｏｒｍＨＥＲ－２／ｎｅｕ乳癌検査；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ；Ｎｏｌｖａｄｅｘ；Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；ＳｃｌｅｒｏｓｏｌＩｎｔｒａｐｌｅｕｒａｌＡｅｒｏｓｏｌ；Ｖａｌｓｔａｒ；Ｘｅｌｏｄａ；Ｚｏｆｒａｎ；Ａｎｚｅｍｅｔ；Ｂｒｏｍｆｅｎａｃ；Ｆｅｍａｒａ（レトロゾール）；ＧｌｉａｄｅｌＷａｆｅｒ（カルムスチン含有ポリフェプロサン２０埋め込み剤）；ＩｎｔｒｏｎＡ（インターフェロンアルファ－２ｂ、組換え）；Ｋｙｔｒｉｌ（グラニセトロン）錠剤；ＬｕｐｒｏｎＤｅｐｏｔ（デポ懸濁液用リュープロレリン酢酸塩）；Ｍｉｒａｌｕｍａ検査；Ｎｅｕｍｅｇａ；Ｑｕａｄｒａｍｅｔ（サマリウムＳｍ１５３レキシドロナム注射）；Ｒｉｔｕｘａｎ；Ｔａｘｏｌ；Ａｎｅｘｓｉａ；Ａｒｅｄｉａ（注射用パミドロン酸二ナトリウム）；Ａｒｉｍｉｄｅｘ（アナストロゾール）；Ｃａｍｐｏｓｔａｒ；ＥｌｌｉｏｔｔｓＢ溶液（緩衝髄腔内電解質／デキストロース注射）；Ｅｕｌｅｘｉｎ（フルタミド）；Ｇｅｍｚａｒ（ゲムシタビンＨＣＬ）；Ｈｙｃａｍｔｉｎ（トポテカン塩酸塩）；Ｋａｄｉａｎ；Ｌｅｕｋｉｎｅ（サルグラモスチム）；ＬｕｐｒｏｎＤｅｐｏｔ（デポ懸濁液用リュープロレリン酢酸塩）；光線力学的療法；Ｔａｘｏｔｅｒｅ（ドセタキセル）；Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ（イオジキサノール）；Ｅｔｈｙｏｌ（アミホスチン）；ＩｎｔｒｏｎＡ（インターフェロンアルファ－２ｂ、組換え）、及びＬｅｕｋｉｎｅ（サルグラモスチム）を含み得る抗がん薬物にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、アベマシクリブ、アカラブルチニブ、アファチニブ、アレクチニブ、アキシチニブ、バリシチニブ、ビニメチニブ、ボスチニブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、セリチニブ、コビメチニブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダサチニブ、エンコラフェニブ、エルロチニブ、エベロリムス、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ロルラチニブ、ミドスタウリン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニンテダニブ、オシメルチニブ、パルボシクリブ、パゾパニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、リボシクリブ、ルキソリチニブ、シロリムス、ソラフェニブ、スニチニブ、テムシロリムス、トファシチニブ、トラメチニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ＩＬ１５、融合されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ、ＩＦＮガンマ、及び抗ＣＤ３薬剤、またはそのフラグメント（複数可）にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドは、中枢神経系の感染症を含む感染症を治療及び／または予防するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、抗感染薬にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。抗感染薬は、抗生物質、抗ウイルス剤、及び抗真菌剤を含み得る。使用することができる抗感染薬としては、アルテミシニン、Ａｅｍｃｏｌｏ（リファマイシン）、Ｂｉｋｔａｒｖｙ（ビクテグラビル／エムトリシタビン／テノホビルアラフェナミド）、Ｎｕｚｙｒａ（オマダサイクリン）、Ｔｒｏｇａｒｚｏ（イバリズマブ－ｕｉｙｋ）、Ｘｏｆｌｕｚａ（バロキサビルマルボキシル）、Ｂａｘｄｅｌａ（デラフロキサシン）錠剤及び注射、Ｂｅｎｚｎｉｄａｚｏｌｅ、Ｇｉａｐｒｅｚａ（アンギオテンシンＩＩ）、Ｈｅｐｌｉｓａｖ－Ｂ［Ｂ型肝炎ワクチン（組換え）、アジュバント化］、Ｊｕｌｕｃａ（ドルテグラビル及びリルピビリン）、ＫｅｄＲａｂ［狂犬病免疫グロブリン（ヒト）］、Ｍａｖｙｒｅｔ（グレカプレビル及びピブレンタスビル）、Ｐｒｅｖｙｍｉｓ（レテルモビル）、Ｓｈｉｎｇｒｉｘ（組換え帯状疱疹ワクチン、アジュバント化）、Ｓｏｌｏｓｅｃ（セクニダゾール）、Ｖａｂｏｍｅｒｅ（メロペネム及びバボルバクタム）、Ｘｅｐｉ（オゼノキサシン）、Ａｎｔｈｉｍ（オビルトキサキシマブ）、Ｄｅｓｃｏｖｙ（エムトリシタビン及びテノホビルアラフェナミド）、Ｅｐｃｌｕｓａ（ソホスブビル及びベルパタスビル）、Ｏｄｅｆｓｅｙ（エムトリシタビン、リルピビリン、及びテノホビルアラフェナミド）、Ｖａｘｃｈｏｒａ（コレラワクチン、生ワクチン、経口）、Ｖｅｍｌｉｄｙ（テノホビルアラフェナミド）、Ｚｅｐａｔｉｅｒ（エルバスビル及びグラゾプレビル）、Ｚｉｎｐｌａｖａ（ベズロトクスマブ）、Ａｖｙｃａｚ（セフタジジム－アビバクタム）、Ｂｅｘｓｅｒｏ（Ｂ群髄膜炎菌ワクチン）、Ｃｒｅｓｅｍｂａ（イサブコナゾニウム硫酸塩）、Ｄａｋｌｉｎｚａ（ダクラタスビル）、Ｅｖｏｔａｚ（アタザナビル及びコビシスタット）、Ｆｌｕａｄ（三価インフルエンザワクチン）、Ｇｅｎｖｏｙａ（エルビテグラビル、コビシスタット、エムトリシタビン、及びテノホビルアラフェナミド）、Ｐｒｅｚｃｏｂｉｘ（ダルナビル及びコビシスタット）、Ｔｅｃｈｎｉｖｉｅ、（オムビタスビル、パリタプレビル及びリトナビル）、Ｄａｌｖａｎｃｅ（ダルババンシン）、Ｈａｒｖｏｎｉ（レジパスビル及びソホスブビル）、Ｉｍｐａｖｉｄｏ（ミルテホシン）、Ｋｅｒｙｄｉｎ（タバボロール）、Ｏｒｂａｃｔｉｖ（オリタバンシン）、Ｒａｐｉｖａｂ（ペラミビル注射）、Ｓｉｖｅｘｔｒｏ（トレゾリドリン酸エステル）、Ｔｒｉｕｍｅｑ（アバカビル、ドルテグラビル、及びラミブジン）、Ｚｅｒｂａｘａ（セフトロザン＋タゾバクタム）、Ｆｌｕｂｌｏｋ（季節性インフルエンザワクチン）、Ｌｕｚｕ（ルリコナゾール）クリーム１％、Ｏｌｙｓｉｏ（シメプレビル）、Ｓｉｔａｖｉｇ（アシクロビル）バッカル錠、Ｓｏｖａｌｄｉ（ソホスブビル）、ＶａｒｉＺＩＧ、水痘帯状疱疹免疫グロブリン（ヒト）、Ａｂｔｈｒａｘ（ラキシバクマブ）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）、Ｃｙｓｔａｒａｎ（システアミン塩酸塩）、Ｄｙｍｉｓｔａ（塩酸アゼラスチン及びプロピオン酸フルチカゾン）、Ｆｌｕｃｅｌｖａｘ、インフルエンザウイルスワクチン、Ｊｅｔｒｅａ（オクリプラスミン）、Ｌｉｎｚｅｓｓ（リナクロチド）、Ｍｙｔｅｓｉ（クロフェレマー）、Ｓｉｒｔｕｒｏ（ベダキリン）、Ｓｋｌｉｃｅ（イベルメクチン）ローション剤、Ｓｔｒｉｂｉｌｄ（エルビテグラビル、コビシスタット、エムトリシタビン、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩）、ＴｕｄｏｒｚａＰｒｅｓｓａｉｒ（アクリジニウム臭化物吸入粉末剤）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）、Ｃｏｍｐｌｅｒａ（エムトリシタビン／リルピビリン／テノホビルジソプロキシルフマル酸塩）、Ｄｉｆｉｃｉｄ（フィダキソマイシン）、Ｅｄｕｒａｎｔ（リルピビリン）、Ｅｙｌｅａ（アフリベルセプト）、Ｆｉｒａｚｙｒ（イカチバント）、Ｇｒａｌｉｓｅ（ガバペンチン）、Ｉｎｃｉｖｅｋ（テラプレビル）、Ｖｉｃｔｒｅｌｉｓ（ボセプレビル）、Ｅｇｒｉｆｔａ（注射用テサモレリン）、Ｍｅｎｖｅｏ（髄膜炎ワクチン）、Ｚｙｍａｘｉｄ（ガチフロキサシン点眼液）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）、Ｂｅｐｒｅｖｅ（ベポタスチンベシル酸塩点眼液）、Ｈｉｂｅｒｉｘ（ヘモフィルス属ｂ型結合型ワクチン、破傷風菌毒素結合体）、Ｖｉｂａｔｉｖ（テラバンシン）、Ａｐｔｉｖｕｓ（チプラナビル）、Ａｓｔｅｐｒｏ（アゼラスチン塩酸塩鼻スプレー）、Ｉｎｔｅｌｅｎｃｅ（エトラビリン）、Ｐａｔａｎａｓｅ（オロパタジン塩酸塩）、Ｖｉｒｅａｄ（テノホビルジソプロキシルフマル酸塩）、Ｉｓｅｎｔｒｅｓｓ（ラルテグラビル）、Ｓｅｌｚｅｎｔｒｙ（マラビロク）、Ｖｅｒａｍｙｓｔ（フルチカゾンフランカルボン酸エステル）、Ｘｙｚａｌ（レボセチリジン塩酸塩）、Ｅｒａｘｉｓ（アニデュラファンギン）、Ｎｏｘａｆｉｌ（ポサコナゾール）、Ｐｒｅｚｉｓｔａ（ダルナビル）、Ｔｙｚｅｋａ（テルビブジン）、Ｖｅｒｅｇｅｎ（クネカテキン）、Ａｐｔｉｖｕｓ（チプラナビル）、Ｂａｒａｃｌｕｄｅ（エンテカビル）、ＦｌｕＭｉｓｔ（インフルエンザウイルスワクチン）、Ｆｕｚｅｏｎ（エンフビルチド）、Ｌｅｘｉｖａ（ホスアンプレナビル）、Ｒｅｙａｔａｚ（アタザナビル硫酸塩）、ＢｏｔｏｘＣｏｓｍｅｔｉｃ（ボツリヌス毒素Ａ型）、Ｃｌａｒｉｎｅｘ、Ｈｅｐｓｅｒａ（アデホビルジピボキシル）、Ｐｅｄｉａｒｉｘワクチン、Ｐｅｇａｓｙｓ（ペグインターフェロンアルファ－２ａ）、Ｓｕｓｔｉｖａ、Ｖｆｅｎｄ（ボリコナゾール）、Ｐｅｇ－Ｉｎｔｒｏｎ（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）、Ｒｅｂｅｔｏｌ（リバビリン）、Ｓｐｅｃｔｒａｃｅｆ、Ｔａｖｉｓｔ（フマル酸クレマスチン）、Ｔｗｉｎｒｉｘ、Ｖａｌｃｙｔｅ（バルガンシクロビルＨＣｌ）、Ｖｉｒｅａｄ（テノホビルジソプロキシルフマル酸塩）、Ｘｉｇｒｉｓ（ドロトレコギンアルファ［活性化］）、ＡＢＲＥＶＡ（ドコサノール）、セファゾリン及びデキストロースＵＳＰ、子ども用ＭｏｔｒｉｎＣｏｌｄ、ＲＥＢＥＴＲＯＮ（商標）併用療法、Ｓｙｎａｇｉｓ、Ｖｉｒｏｐｔｉｃ、Ａｌｄａｒａ（イミキモド）、Ｃｅｆｔｉｎ（セフロキシムアキセチル）、Ｃｏｍｂｉｖｉｒ、Ｆａｍｖｉｒ（ファムシクロビル）、Ｆｌｏｘｉｎｏｔｉｃ、Ｆｏｒｔｏｖａｓｅ、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン－１）、ＩｎｔｒｏｎＡ（インターフェロンアルファ－２ｂ、組換え）、Ｔａｘｏｌ、Ｔｉｍｅｎｔｉｎ、Ｔｒｏｖａｎ、ＶＩＲＡＣＥＰＴ（ネルフィナビルメシル酸塩）、Ｚｅｒｉｔ（スタブジン）、ＡＫ－Ｃｏｎ－Ａ（ナファゾリン点眼液）、Ａｌｌｅｇｒａ（フェキソフェナジン塩酸塩）、Ａｔｒｏｖｅｎｔ（臭化イプラトロピウム）、Ａｕｇｍｅｎｔｉｎ（アモキシシリン／クラブラン酸塩）、Ｃｒｉｘｉｖａｎ（インジナビル硫酸塩）、Ｅｌｍｉｒｏｎ（ペントサン多硫酸ナトリウム）、Ｈａｖｒｉｘ、ＩｖｙＢｌｏｃｋ、Ｌｅｕｋｉｎｅ（サルグラモスチム）、ＭｅｒｒｅｍＩ．Ｖ．（メロペネム）、Ｔａｖｉｓｔ（クレマスチンフマル酸塩）、Ｖｉｄｅｘ（ジダノシン）、Ｖｉｒａｍｕｎｅ（ネビラピン）、Ｚｉｔｈｒｏｍａｘ（アジスロマイシン）、Ｃｅｄａｘ（セフチブテン）、Ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ（Ｂｉａｘｉｎ）、Ｅｐｉｖｉｒ（ラミブジン）、Ｉｎｖｉｒａｓｅ（サキナビル）、Ｖａｌｔｒｅｘ（バラシクロビルＨＣｌ）、Ｚｅｒｉｔ（スタブジン）、Ｚｙｒｔｅｃ（セチリジンＨＣｌ）、またはその機能性フラグメントが挙げられる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドは、中枢神経系及び消化（ＧＩ）管の炎症を含む炎症を治療及び／または予防するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、抗炎症薬にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。抗炎症薬は、ステロイド性及び非ステロイド性抗炎症薬を含み得る。非ステロイド性抗炎症薬としては、アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク、トルメチン、ピロキシカム、フルルビプロフェン、及びフェノプロフェンを挙げることができる。本明細書で開示される方法及び組成物と組み合わせて使用することができる抗炎症薬としては、コルチコステロイド及びアミノサリチル酸、例えば、限定するものではないが、メサラミン、バルサラジド、及びオルサラジンを挙げることができる。様々な場合において、抗炎症薬としては、インフリキシマブ、アダリムマブ、及びゴリムマブなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－アルファ阻害薬、ならびにナタリズマブ、ベドリズマブ、及びウステキヌマブを含む他の生物学的標的を標的とする生物学的薬物（例えば、抗体、フラグメントまたはその誘導体）が挙げられる。

いくつかの態様において、本明細書に記載される活性薬剤にコンジュゲート、連結、または融合されたペプチドは、抗体－薬物コンジュゲート（例えば、Ａｄｃｅｔｒｉｓ、Ｋａｄｃｙｌａ、Ｍｙｌｏｔａｒｇ）またはトランスフェリンと比較してサイズが小さいことから、固形腫瘍またはＣＮＳへの良好な透過を示し得る。ある特定の態様において、本明細書に記載される活性薬剤にコンジュゲート、連結、または融合されたペプチドは、抗体－薬物コンジュゲートと比較して異なる用量またはより高用量の活性薬剤を運ぶことができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される活性薬剤にコンジュゲート、連結、または融合された記載のペプチドは、抗体－薬物コンジュゲートと比較してより高用量の活性薬剤を骨格筋組織に送達することができる。したがって、本開示のペプチドを使用した筋ジストロフィー、ＳＢＭＡ、または筋肉由来肉腫の治療は、特に興味深いものであり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドは、抗体または抗体－薬物コンジュゲートと比較して大幅に短い血漿半減期を示すことができることから、より迅速な末梢クリアランスが可能となり得る（例えば、放射性標識コンジュゲートが使用される場合、器官放射線量が大幅に低下するため利点であり得る）。更に他の態様において、本明細書に記載される活性薬剤にコンジュゲート、連結、または融合されたペプチドは、抗体－薬物コンジュゲートと比較して、規定された薬物比のより良好な部位特異的送達を有し得る。他の態様において、ペプチドは、有機溶媒中（水に加えて）で溶媒和になりやすい傾向があり得、これにより、薬物（多くの場合、水への可溶性が低い）の溶媒和及びコンジュゲーションの合成経路がより多くなり、コンジュゲーション収率がより高くなり、ペプチドにコンジュゲート、連結、もしくは融合された薬物の比率がより高くなり（抗体に対して）、及び／またはコンジュゲーション中の凝集／高分子量種の形成が低減し得る。更に、短い配列に存在しない残基を介して、または非天然アミノ酸の含有を介して、ユニークなアミノ酸残基（複数可）をペプチドに導入することで、ペプチドへの部位特異的コンジュゲーションが可能となり得る。

本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトはまた、組織または体液からペプチドを回収するための親和性ハンドル（例えば、ビオチン）を提供することなどの他の役割を果たし得る他の部分にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。例えば、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトは、ビオチンにコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。半減期の延長に加えて、ビオチンはまた、組織または他の位置からペプチドまたはペプチドコンストラクトを回収するための親和性ハンドルとして作用し得る。いくつかの実施形態において、検出可能な標識及び親和性ハンドルの両方として作用し得る蛍光ビオチンコンジュゲートを使用することができる。市販の蛍光ビオチンコンジュゲートの非限定的な例としては、Ａｔｔｏ４２５－ビオチン、Ａｔｔｏ４８８－ビオチン、Ａｔｔｏ５２０－ビオチン、Ａｔｔｏ－５５０ビオチン、Ａｔｔｏ５６５－ビオチン、Ａｔｔｏ５９０－ビオチン、Ａｔｔｏ６１０－ビオチン、Ａｔｔｏ６２０－ビオチン、Ａｔｔｏ６５５－ビオチン、Ａｔｔｏ６８０－ビオチン、Ａｔｔｏ７００－ビオチン、Ａｔｔｏ７２５－ビオチン、Ａｔｔｏ７４０－ビオチン、フルオレセインビオチン、ビオチン－４－フルオレセイン、ビオチン－（５－フルオレセイン）コンジュゲート、及びビオチン－Ｂ－フィコエリトリン、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ビオシチン、Ａｌｅｘａｆｌｏｕｒ５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４９、ルシファーイエローカダベリンビオチン－Ｘ、ルシファーイエロービオシチン、オレゴングリーン４８８ビオシチン、ビオチン－ローダミン及びテトラメチルローダミンビオシチンを挙げることができる。いくつかの他の例において、コンジュゲートとしては、化学発光化合物、コロイド金属、発光化合物、酵素、放射性同位体、及び常磁性標識を挙げることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドはまた、別の分子に結合され得る。例えば、ペプチド配列はまた、別の活性薬剤（例えば、小分子、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、アプタマー、サイトカイン、成長因子、神経伝達物質、前述の薬剤のいずれかの活性フラグメントもしくは修飾体、フルオロフォア、放射性同位体、放射性核種キレート剤、アシル付加物、化学リンカー、または糖）に結合され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合されるか、または共有結合的もしくは非共有結合的に連結され得る。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトはまた、他の親和性ハンドルにコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。他の親和性ハンドルは、遺伝子融合親和性ハンドルを含み得る。遺伝子融合親和性ハンドルは、６ｘＨｉｓ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３４５）；固定化金属アフィニティーカラム精製が可能）、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３４６）；抗ＦＬＡＧ免疫沈降）、「短い」ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＥ（配列番号３４７）；抗ＦＬＡＧ免疫沈降）、ヘマグルチニン（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号３４８）；抗ＨＡ免疫沈降）、及びストレプトアビジン結合ペプチド（ＤＶＥＡＷＬＧＡＲ（配列番号３４９）；ストレプトアビジン媒介性沈殿）を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトはまた、タンパク質発現及び／または精製を改善する発現タグまたは配列にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。そのような発現タグは、遺伝子融合発現タグを含み得る。遺伝子融合発現タグは、シデロカリン（配列番号３５１、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＧＳＱＤＳＴＳＤＬＩＰＡＰＰＬＳＫＶＰＬＱＱＮＦＱＤＮＱＦＱＧＫＷＹＶＶＧＬＡＧＮＡＩＬＲＥＤＫＤＰＱＫＭＹＡＴＩＹＥＬＫＥＤＫＳＹＮＶＴＳＶＬＦＲＫＫＫＣＤＹＷＩＲＴＦＶＰＧＳＱＰＧＥＦＴＬＧＮＩＫＳＹＰＧＬＴＳＹＬＶＲＶＶＳＴＮＹＮＱＨＡＭＶＦＦＫＫＶＳＱＮＲＥＹＦＫＩＴＬＹＧＲＴＫＥＬＴＳＥＬＫＥＮＦＩＲＦＳＫＳＬＧＬＰＥＮＨＩＶＦＰＶＰＩＤＱＣＩＤＧＧＧＳＥＮＬＹＦＱ）を含み得る。例示的なシデロカリンペプチド融合体としては、シデロカリンに融合されたヒト可溶性トランスフェリン（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＧＳＱＤＳＴＳＤＬＩＰＡＰＰＬＳＫＶＰＬＱＱＮＦＱＤＮＱＦＱＧＫＷＹＶＶＧＬＡＧＮＡＩＬＲＥＤＫＤＰＱＫＭＹＡＴＩＹＥＬＫＥＤＫＳＹＮＶＴＳＶＬＦＲＫＫＫＣＤＹＷＩＲＴＦＶＰＧＳＱＰＧＥＦＴＬＧＮＩＫＳＹＰＧＬＴＳＹＬＶＲＶＶＳＴＮＹＮＱＨＡＭＶＦＦＫＫＶＳＱＮＲＥＹＦＫＩＴＬＹＧＲＴＫＥＬＴＳＥＬＫＥＮＦＩＲＦＳＫＳＬＧＬＰＥＮＨＩＶＦＰＶＰＩＤＱＣＩＤＧＧＧＳＥＮＬＹＦＱＧＳＲＬＹＷＤＤＬＫＲＫＬＳＥＫＬＤＳＴＤＦＴＳＴＩＫＬＬＮＥＮＳＹＶＰＲＥＡＧＳＱＫＤＥＮＬＡＬＹＶＥＮＱＦＲＥＦＫＬＳＫＶＷＲＤＱＨＦＶＫＩＱＶＫＤＳＡＱＮＳＶＩＩＶＤＫＮＧＲＬＶＹＬＶＥＮＰＧＧＹＶＡＹＳＫＡＡＴＶＴＧＫＬＶＨＡＮＦＧＴＫＫＤＦＥＤＬＹＴＰＶＮＧＳＩＶＩＶＲＡＧＫＩＴＦＡＥＫＶＡＮＡＥＳＬＮＡＩＧＶＬＩＹＭＤＱＴＫＦＰＩＶＮＡＥＬＳＦＦＧＨＡＨＬＧＴＧＤＰＹＴＰＧＦＰＳＦＮＨＴＱＦＰＰＳＲＳＳＧＬＰＮＩＰＶＱＴＩＳＲＡＡＡＥＫＬＦＧＮＭＥＧＤＣＰＳＤＷＫＴＤＳＴＣＲＭＶＴＳＥＳＫＮＶＫＬＴＶＳＮＶＬＫＥＩＫＩＬＮＩＦＧＶＩＫＧＦＶＥＰＤＨＹＶＶＶＧＡＱＲＤＡＷＧＰＧＡＡＫＳＧＶＧＴＡＬＬＬＫＬＡＱＭＦＳＤＭＶＬＫＤＧＦＱＰＳＲＳＩＩＦＡＳＷＳＡＧＤＦＧＳＶＧＡＴＥＷＬＥＧＹＬＳＳＬＨＬＫＡＦＴＹＩＮＬＤＫＡＶＬＧＴＳＮＦＫＶＳＡＳＰＬＬＹＴＬＩＥＫＴＭＱＮＶＫＨＰＶＴＧＱＦＬＹＱＤＳＮＷＡＳＫＶＥＫＬＴＬＤＮＡＡＦＰＦＬＡＹＳＧＩＰＡＶＳＦＣＦＣＥＤＴＤＹＰＹＬＧＴＴＭＤＴＹＫＥＬＩＥＲＩＰＥＬＮＫＶＡＲＡＡＡＥＶＡＧＱＦＶＩＫＬＴＨＤＶＥＬＮＬＤＹＥＲＹＮＳＱＬＬＳＦＶＲＤＬＮＱＹＲＡＤＩＫＥＭＧＬＳＬＱＷＬＹＳＡＲＧＤＦＦＲＡＴＳＲＬＴＴＤＦＧＮＡＥＫＴＤＲＦＶＭＫＫＬＮＤＲＶＭＲＶＥＹＨＦＬＳＰＹＶＳＰＫＥＳＰＦＲＨＶＦＷＧＳＧＳＨＴＬＰＡＬＬＥＮＬＫＬＲＫＱＮＮＧＡＦＮＥＴＬＦＲＮＱＬＡＬＡＴＷＴＩＱＧＡＡＮＡＬＳＧＤＶＷＤＩＤＮＥＦＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ；配列番号３５２）ならびにＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＧＳＱＤＳＴＳＤＬＩＰＡＰＰＬＳＫＶＰＬＱＱＮＦＱＤＮＱＦＱＧＫＷＹＶＶＧＬＡＧＮＡＩＬＲＥＤＫＤＰＱＫＭＹＡＴＩＹＥＬＫＥＤＫＳＹＮＶＴＳＶＬＦＲＫＫＫＣＤＹＷＩＲＴＦＶＰＧＳＱＰＧＥＦＴＬＧＮＩＫＳＹＰＧＬＴＳＹＬＶＲＶＶＳＴＮＹＮＱＨＡＭＶＦＦＫＫＶＳＱＮＲＥＹＦＫＩＴＬＹＧＲＴＫＥＬＴＳＥＬＫＥＮＦＩＲＦＳＫＳＬＧＬＰＥＮＨＩＶＦＰＶＰＩＤＱＣＩＤＧＧＧＳＥＮＬＹＦＱＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＴＫＹＮＡＥＬＥＫＣＥＡＲＶＳＳＭＳＮＴＥＥＴＣＶＱＥＬＦＤＬＬＨＣＶＤＨＣＶＳＱ）（配列番号３５６）、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＧＳＱＤＳＴＳＤＬＩＰＡＰＰＬＳＫＶＰＬＱＱＮＦＱＤＮＱＦＱＧＫＷＹＶＶＧＬＡＧＮＡＩＬＲＥＤＫＤＰＱＫＭＹＡＴＩＹＥＬＫＥＤＫＳＹＮＶＴＳＶＬＦＲＫＫＫＣＤＹＷＩＲＴＦＶＰＧＳＱＰＧＥＦＴＬＧＮＩＫＳＹＰＧＬＴＳＹＬＶＲＶＶＳＴＮＹＮＱＨＡＭＶＦＦＫＫＶＳＱＮＲＥＹＦＫＩＴＬＹＧＲＴＫＥＬＴＳＥＬＫＥＮＦＩＲＦＳＫＳＬＧＬＰＥＮＨＩＶＦＰＶＰＩＤＱＣＩＤＧＧＧＳＥＮＬＹＦＱＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＴＫＹＮＡＥＬＥＫＣＥＡＲＶＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＨＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号３５７）、及び（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＧＳＱＤＳＴＳＤＬＩＰＡＰＰＬＳＫＶＰＬＱＱＮＦＱＤＮＱＦＱＧＫＷＹＶＶＧＬＡＧＮＡＩＬＲＥＤＫＤＰＱＫＭＹＡＴＩＹＥＬＫＥＤＫＳＹＮＶＴＳＶＬＦＲＫＫＫＣＤＹＷＩＲＴＦＶＰＧＳＱＰＧＥＦＴＬＧＮＩＫＳＹＰＧＬＴＳＹＬＶＲＶＶＳＴＮＹＮＱＨＡＭＶＦＦＫＫＶＳＱＮＲＥＹＦＫＩＴＬＹＧＲＴＫＥＬＴＳＥＬＫＥＮＦＩＲＦＳＫＳＬＧＬＰＥＮＨＩＶＦＰＶＰＩＤＱＣＩＤＧＧＧＳＥＮＬＹＦＱＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号３５８）などのシデロカリンに融合された様々な本開示のペプチドが挙げられる。とりわけ、ＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクトは、Ｎ末端のシデロカリンとともに発現され得る（例えば、配列番号３５９～配列番号３６１）。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトはまた、非コンジュゲート治療薬を腫瘍などの標的化された組織にまたは組織内に動員するための親和性ハンドル（例えば、ビオチン）を提供することなどの他の役割を果たし得る他の部分にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。いくつかの場合において、治療薬は、小分子、ペプチド、抗体、または細胞治療薬（例えば、ＣＡＲＴ細胞または別の自己由来もしくは同種異系の操作された細胞）である。例えば、親和性標識（例えば、アビジン）を用いて操作されたＣＡＲＴ細胞は、ビオチン部分を含むＴｆＲ結合ペプチドによって標的化された組織に動員され得る。加えて、本明細書に記載されるビオチン（または他の親和性標識）－ＴｆＲ結合ペプチドは、ＴｆＲ結合ペプチドが標的とするか、またはＴｆＲ結合ペプチドが蓄積される脳、腫瘍、または他の組織において薬理学的活性をもたらすことができる小分子、ペプチド、またはタンパク質などの様々な異なるアビジンタグ付き薬物とともに投与（例えば、共投与）され得る。

更に、毒素またはノット毒液タンパク質に由来する２つ以上のペプチド配列が特定のペプチドに存在するか、コンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。ペプチドは、様々な技術によって、生体分子に組み込むことができる。ペプチドは、アミド結合などの共有結合の形成などの化学変換によって組み込むことができる。ペプチドは、例えば、固相または溶液相ペプチド合成によって組み込むことができる。ペプチドは、生体分子をコードする核酸配列を調製することによって組み込むことができ、ここで、核酸配列は、ペプチドをコードする部分配列を含む。部分配列は、生体分子をコードする配列に付加されてもよいし、または生体分子をコードする配列の部分配列に代えてもよい。

検出可能な剤とペプチドのコンジュゲート
ペプチドは、イメージング、研究、治療薬、セラノスティクス、医薬品、化学療法、キレート療法、標的薬物送達、及び放射線療法に使用される薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、フルオロフォア、近赤外色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、金属、放射性同位体、色素、放射性核種キレート剤、またはイメージングに使用することができる別の好適な物質などの検出可能な剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。

いくつかの実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の検出可能な剤は、ペプチドに連結され得る。放射性同位体の非限定的な例としては、アルファ放射体、ベータ放射体、陽電子放射体、及びガンマ放射体が挙げられる。いくつかの実施形態において、金属または放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユウロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、イットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、またはイットリウムである。いくつかの実施形態において、放射性同位体は、アクチニウム－２２５または鉛－２１２である。いくつかの実施形態において、近赤外色素は、生物学的組織及び体液によって容易にクエンチされない。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、６５０ｎｍ～４０００ｎｍの波長で電磁放射線を放出する蛍光剤であり、そのような薬剤を検出するためにそのような放射が使用される。本開示におけるコンジュゲート分子として使用され得る蛍光色素の非限定的な例としては、ＤｙＬｉｇｈｔ－６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ－７５０、Ｖｉｖｏａｇ－７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ－８００、ＩＲＤｙｅ－８００、Ｖｉｖｏｔａｇ－６８０、Ｃｙ５．５、またはインドシアニングリーン（ＩＣＧ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、近赤外色素は、多くの場合、シアニン色素（例えば、Ｃｙ７、Ｃｙ５．５、及びＣｙ５）を含む。本開示におけるコンジュゲート分子として使用される蛍光色素の更なる非限定的な例としては、アクラジンオレンジまたはイエロー、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０、７５０、７００、６８０、６６０、及び６４７）及びその任意の誘導体、７－アクチノマイシンＤ、８－アニリノナフタレン－１－スルホン酸、ＡＴＴＯ色素及びその任意の誘導体、オーラミン－ローダミン染色剤及びその任意の誘導体、ベンサントロン、ビマン、９－１０－ビス（フェニルエチニル）アントラセン、５，１２－ビス（フェニルエチニル）ナフタセン、ビスベンズイミド、ブレインボー、カルセイン、カルボジフルオレセイン及びその任意の誘導体、１－クロロ－９，１０－ビス（フェニルエチニル）アントラセン及びその任意の誘導体、ＤＡＰＩ、ＤｉＯＣ６、ＤｙＬｉｇｈｔＦｌｕｏｒ及びその任意の誘導体、エピコッコノン、エチジウムブロミド、ＦｌＡｓＨ－ＥＤＴ２、Ｆｌｕｏ色素及びその任意の誘導体、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅ及びその任意の誘導体、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ及びその任意の誘導体、Ｆｕｒａ及びその任意の誘導体、ＧｅｌＧｒｅｅｎ及びその任意の誘導体、ＧｅｌＲｅｄ及びその任意の誘導体、蛍光タンパク質及びその任意の誘導体、ｍアイソフォームタンパク及びその任意の誘導体、例えば、ｍＣｈｅｒｒｙなど、ヘタメチン色素及びその任意の誘導体、ｈｏｅｓｃｈｓｔ染色剤、イミノクマリン、インディアンイエロー、インド－１及びその任意の誘導体、ラウルダン、ルシファーイエロー及びその任意の誘導体、ルシフェリン及びその任意の誘導体、ルシフェラーゼ及びその任意の誘導体、メルコシアニン及びその任意の誘導体、ナイル色素及びその任意の誘導体、ペリレン、フロキシン、フィコ色素及びその任意の誘導体、ヨウ化プロピウム、ピラニン、ローダミン及びその任意の誘導体、リボグリーン、ＲｏＧＦＰ、ルブレン、スチルベン及びその任意の誘導体、スルホローダミン及びその任意の誘導体、ＳＹＢＲ及びその任意の誘導体、シナプト－ｐＨルオリン、テトラフェニルブタジエン、テトラナトリウムｔｒｉｓ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＴｉｔａｎＹｅｌｌｏｗ、ＴＳＱ、ウンベリフェロン、ビオラントロン、黄色蛍光タンパク質ならびにＹＯＹＯ－１が挙げられる。他の好適な蛍光色素としては、フルオレセイン及びフルオレセイン色素（例えば、蛍光イソチオシアニンまたはＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、６－カルボキシフルオレセインまたはＦＡＭなど）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィコエリスリン、エリスロシン、エオシン、ローダミン色素（例えば、カルボキシテトラメチル－ローダミンまたはＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）など）、クマリン及びクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）など）、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ色素（例えば、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ４８８、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ５００、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ５１４など）、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＴｅｘａｓＲｅｄ－Ｘ、ＳＰＥＣＴＲＵＭＲＥＤ、ＳＰＥＣＴＲＵＭＧＲＥＥＮ、シアニン色素（例えば、ＣＹ－３、Ｃｙ－５、ＣＹ－３．５、ＣＹ－５．５など）、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ色素（例えば、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ３５０、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ４８８、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ５３２、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ５４６、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ５６８、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ５９４、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ６３３、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ６６０、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ６８０など）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹＦＬ、ＢＯＤＩＰＹＲ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５など）、ＩＲＤｙｅ（例えば、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００など）などが挙げられるが、これらに限定されない。追加の好適な検出可能な剤は、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１７７に記載されている。放射性同位体の非限定的な例としては、アルファ放射体、ベータ放射体、陽電子放射体、及びガンマ放射体が挙げられる。いくつかの実施形態において、金属または放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユウロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、イットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、またはイットリウムである。いくつかの実施形態において、放射性同位体は、アクチニウム－２２５または鉛－２１２である。更に、診断及び／または治療には、次の放射性核種を使用することができる：炭素（例えば、^１１Ｃまたは^１４Ｃ）、窒素（例えば、^１３Ｎ）、フッ素（例えば、^１８Ｆ）、ガリウム（例えば、^６７Ｇａまたは^６８Ｇａ）、銅（例えば、^６４Ｃｕまたは^６７Ｃｕ）、ジルコニウム（例えば、^８９Ｚｒ）、ルテチウム（例えば、^１７７Ｌｕ）。

ペプチドは、放射線増感剤または光増感剤コンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。放射線増感剤の例としては、ＡＢＴ－２６３、ＡＢＴ－１９９、ＷＥＨＩ－５３９、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、エタニダゾール、ミソニダゾール、チラパザミン、及び核酸塩基誘導体（例えば、５－フルオロデオキシウリジンなどのハロゲン化プリンまたはピリミジン）が挙げられるが、これらに限定されない。光増感剤の例としては、光を当てると熱を生じる蛍光分子またはビーズナノ粒子、ポルフィリン及びポルフィリン誘導体（例えば、クロリン、バクテリオクロリン、イソバクテリオクロリン、フタロシアニン、及びナフタロシアニン）、メタロポルフィリン、メタロフタロシアニン、アンゲリシン、カルコゲナピリリウム色素、クロロフィル、クマリン、フラビン及び関連化合物、例えば、アロキサジン及びリボフラビンなど、フラーレン、フェオホルビド、ピロフェオホルビド、シアニン（例えば、メロシアニン５４０）、フェオフィチン、サフィリン、テキサフィリン、プルプリン、ポルフィセン、フェノチアジニウム、メチレンブルー誘導体、ナフタルイミド、ナイルブルー誘導体、キノン、ペリレンキノン（例えば、ヒペリシン、ヒポクレリン、及びセルコスポリン）、ソラレン、キノン、レチノイド、ローダミン、チオフェン、ベルジン、キサンテン色素（例えば、エオシン、エリスロシン、ローズベンガル）、ポルフィリンの二量体及びオリゴマー体、ならびに５－アミノレブリン酸などのプロドラッグを挙げることができるが、これらに限定されない。有利には、このアプローチは、治療薬（例えば、薬物）と電磁エネルギ（例えば、放射線または光）の両方を同時に使用して、罹患細胞（例えば、がん細胞）を高度に特異的に標的化することを可能にする。いくつかの実施形態において、ペプチドは、薬剤に、例えば、直接的にまたはリンカーを介して、コンジュゲートされるか、連結されるか、融合されるか、または共有結合的もしくは非共有結合的に連結される。本明細書における実施形態での使用に適した例示的なリンカーは、以下に更に詳細に考察される。

本開示のいくつかの態様において、放射性核種は、キレート剤を使用して、本明細書に記載されるペプチドまたはペプチドコンストラクトに結合される。例示的なキレート剤部分としては、２，２’，２’’－（３－（４－（３－（１－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－１－オキソ－５，８，１１，１４，１７，２０，２３－ヘプタオキサ－２－アザペンタコサン－２５－イル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（１－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－１－オキソ－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５－ウンデカオキサ－２－アザヘプタトリアコンタン－３７－イル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’－（７－（４－（３－（１－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－１－オキソ－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５－ウンデカオキサ－２－アザヘプタトリアコンタン－３７－イル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－１，４－ジイル）二酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（１－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－３，７－ジオキソ－１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９－ヘプタオキサ－２，８－ジアザヘントリアコンタン－３１－イル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（１－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－３，７－ジオキソ－１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１－ウンデカオキサ－２，８－ジアザトリテトラコンタン－４３－イル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（２５，２８－ジオキソ－２８－（（６－（６－（ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）アミノ）－３，６，９，１２，１５，１８，２１－ヘプタオキサ－２４－アザオクタコシル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（３７，４０－ジオキソ－４０－（（６－（６－（ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）アミノ）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３－ウンデカオキサ－３６－アザテトラコンチル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（１－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－３－オキソ－６，９，１２，１５，１８，２１，２４－ヘプタオキサ－２－アザヘプタコサン－２７－アミド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（２－（４－（１－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェノキシ）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３－ウンデカオキサヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－１，４，７－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（５－アミノ－６－（（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）アミノ）－６－オキソヘキシル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’－（７－（４－（３－（５－アミノ－６－（（４－６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）アミノ）－６－オキソヘキシル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－１，４－ジイル）二酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（５－アミノ－６－（（５－アミノ－６－（（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）アミノ）－６－オキソヘキシル）アミノ）－６－オキソヘキシル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；及び２，２’，２’’－（３－（４－（３－（５－アミノ－６－（（５－アミノ－６－（（５－アミノ－６－（（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）アミノ）－６－オキソヘキシル）アミノ）－６－オキソヘキシル）アミノ）－６－オキソヘキシル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸を挙げることができる。

リンカー
本開示に係るペプチドは、リンカーを介して、またはリンカーなしで直接的に、小分子、別のペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、フルオロフォア、放射性同位体、放射性核種キレート剤、ポリマー、バイオポリマー、脂肪酸、アシル付加物、化学リンカー、もしくは糖などのカーゴ分子（例えば、治療活性薬剤または検出可能な剤）、または本明細書に記載される他の活性薬剤もしくは検出可能な剤に結合され得る。リンカーがない場合、カーゴ分子は、ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に直接コンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される。リンカーが存在する場合、リンカーは、切断可能であり得るか、または安定なリンカーが使用される。切断可能なリンカーは、組織、細胞、エンドソーム、または核内に入ると切断され得ることから、カーゴ分子のｉｎｖｉｖｏ送達に使用することができる。安定なリンカーは、コンジュゲートされると活性化するか、または異化作用などによって分解されるカーゴ分子の送達に使用することができる。本明細書に記載されるように、リンカーはまた、標的化、細胞毒性、治療、ホーミング、イメージング、または診断の機能などの別の機能を有する別のカーゴ部分にＴｆＲ結合ペプチドを共有結合的に結合させるために使用することができる。

いくつかの実施形態において、カーゴ分子は、活性薬剤または検出可能な剤とペプチドのコンストラクトを生成するために、ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ標的化ペプチドは、別の機能性ペプチドまたはタンパク質のＮ末端、内部リシン、グルタミン酸、もしくはアスパラギン酸残基、またはＣ末端で、リンカーを介して、結合され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、リシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基、またはグルタミン酸残基の側鎖などの側鎖を介して、別の機能性ペプチドまたはタンパク質に結合され得る。本明細書で使用される場合、分子は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、炭素－窒素結合、トリアゾール、大環状高分子、オキシム結合、チオエステル結合、チオエーテル結合ヒドラゾン結合、アゾ結合、炭素－炭素単結合、二重結合、もしくは三重結合、ジスルフィド結合、２つのシステイン間の２つの炭素架橋、２つのシステイン間の３つの炭素架橋、またはチオエーテル結合を介して、互いに連結されるか、結合されるか、または融合され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、１つ以上の非天然アミノ酸を含み、ここで、非天然アミノ酸は、挿入、付加、または別のアミノ酸との置換であり得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチド（複数可）自体の類似の領域（アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カルバメート結合、炭素－窒素結合、トリアゾール、大環状高分子、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素－炭素単結合、二重結合、もしくは三重結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、または本明細書に記載されるリンカーを介した、アミノ酸配列の末端、リシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基、またはグルタミン酸残基の側鎖などのアミノ酸側鎖など）も他の分子に連結するために使用することができる。いくつかの実施形態において、ペプチドは、より大きなポリペプチドもしくはペプチド分子のアミノ酸配列の末端に結合されるか、またはリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基、もしくはグルタミン酸残基の側鎖などの側鎖に結合される。

リンカーを介した結合は、他の分子（例えば、活性薬剤及び／または検出可能な剤）とペプチドとの間のリンカー部分の組み込みを伴い得る。ペプチド及び他の分子は、両方とも、リンカーに共有結合的に結合され得る。リンカーは、切断可能、安定、自壊性、親水性、または疎水性であり得る。リンカーは、酵素、水、または他の化学物質の連結基へのアクセスを立体的に制限する嵩高い側基または側鎖を有し得る。リンカーは、１つが他の分子に結合し、１つがペプチドに結合している少なくとも２つの官能基と、２つの官能基の間の連結部分とを有し得る。いくつかのリンカーの例は、Ｊａｉｎ，Ｎ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ．３２（１１）：３５２６－４０（２０１５），Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｓ．Ｏ．，ＢｉｏｃｏｎｊＣｈｅｍ．１９（１０）：１９６０－３（２００８），Ｐｉｌｌｏｗ，Ｔ．Ｈ．，ＪＭｅｄＣｈｅｍ．５７（１９）：７８９０－９（２０１４），Ｄｏｒｙｗａｌｋｓａ，Ｍ．，ＢｉｏｃｏｎｊＣｈｅｍ．２６（４）：６５０－９（２０１５），Ｋｅｌｌｏｇｇ，Ｂ．Ａ．，ＢｉｏｃｏｎｊＣｈｅｍ．２２（４）：７１７－２７（２０１１）、及びＺｈａｏ，Ｒ．Ｙ．，ＪＭｅｄＣｈｅｍ．５４（１０）：３６０６－２３（２０１１）に記載されている。

結合のための官能基の非限定的な例としては、例えば、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カーボネート結合、カルバメート結合、炭素－窒素結合、トリアゾール、大環状高分子、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素－炭素単結合、二重結合、もしくは三重結合、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合を形成することが可能な官能基を挙げることができる。そのような結合を形成することが可能な官能基の非限定的な例としては、アミノ基；カルボキシル基；ヒドロキシル基；アルデヒド基；アジド基；アルキン基及びアルケン基；ケトン；ヒドラジド；ヒドラジン；酸フッ化物、塩化物、臭化物、及びヨウ化物などの酸ハロゲン化物；対称、混合、及び環式無水物を含む酸無水物；カーボネート；シアノ、スクシンイミジル、及びＮ－ヒドロキシスクシンイミジルなどの脱離基に結合したカルボニル官能基；マレイミド；加水分解するように設計されたマレイミド基含有リンカー；マレイミドカプロイル；ＭＣＣ（［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレート）；Ｎ－エチルマレイミド；マレイミドアルカン；ｍｃ－ｖｃ－ＰＡＢＣ；ＤＵＢＡ（デュオカルマイシンヒドロキシベンズアミド－アザインドールリンカー）；ＳＭＣＣスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート；ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）；ＳＰＤＢＮ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブタノエート；スルホ－ＳＰＤＢＮ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）－２－スルホブタノエート；ＳＰＰＮ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート；ジチオピリジルマレイミド（ＤＴＭ）；ヒドロキシルアミン、ビニル－ハロ基；ハロアセタミド基；ブロモアセタミド；ヒドロキシル基；スルフヒドリル基；ならびに例えば、ハライド、メシレート、トシレート、トリフレート、エポキシド、リン酸エステル、硝酸エステル、及びベシレートなどのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリル、またはベンジル脱離基を有する分子を挙げることができる。

連結部分の非限定的な例としては、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ポリエーテル、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシカルボン酸、ポリエステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリペプチド、切断可能なペプチド、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｄｏｒｏｎｉｎａｅｔａｌ．，２００８に記載されている他のペプチドリンカー、ベータグルクロニダーゼによって切断可能なリンカー、カテプシンまたはカテプシンＢ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｓ、Ｃ、Ｋ、Ｏ、Ｆ、Ｖ、Ｘ、もしくはＷによって切断可能なリンカー、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル、グルクロニド－ＭＡＢＣ、バリン－シトルリン、アミノベンジルカルバメート、Ｄ－アミノ酸、及びポリアミンを挙げることができ、これらはいずれも非置換であるか、ハロゲン、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、シアノ基、アジド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホンアミド基、カルボキシル基、カルボキシアルデヒド基、イミン基、アルキル基、ハロ－アルキル基、アルケニル基、ハロ－アルケニル基、アルキニル基、ハロ－アルキニル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アラルキル基、アリールアルコキシ基、ヘテロシクリル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバメート基、アミド基、ウレタン基、エポキシド、荷電基、双極性イオン基、及びエステル基などの任意数の置換基で置換される。分子を互いに連結、融合、またはコンジュゲートする反応の他の非限定的な例としては、クリックケミストリー、銅フリークリックケミストリー、ＨＩＰＳライゲーション、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、及びヒドラジン－イソ－Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒが挙げられる。

いくつかの実施形態において、抑制ドメインをｄＣａｓ９に連結するためのリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約１０アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約１１アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約１２アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約１３アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約１４アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約１５アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約１６アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約１７アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約１８アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約１９アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約２０アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約２１アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約２２アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約２３アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約２４アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約２５アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約２６アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約２７アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約２８アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約２９アミノ酸残基長であり得る。リンカーは、約３０アミノ酸残基長であり得る。

いくつかの実施形態において、本開示のリンカーは、切断可能なリンカー部分または安定なリンカー部分を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の切断可能なリンカーとしては、例えば、プロテアーゼで切断可能なペプチドリンカー、ヌクレアーゼ感受性核酸リンカー、リパーゼ感受性脂質リンカー、グリコシダーゼ感受性炭水化物リンカー、ｐＨ感受性リンカー、低酸素症感受性リンカー、光で切断可能なリンカー、熱に不安定なリンカー、酵素で切断可能なリンカー（例えば、エステラーゼで切断可能なリンカー）、超音波感受性リンカー、及びＸ線で切断可能なリンカーを挙げることができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカーではない。

リンカーの非限定的な例としては、

が挙げられ、式中、各ｎは、独立して、０～約１，０００；１～約１，０００；０～約５００；１～約５００；０～約２５０；１～約２５０；０～約２００；１～約２００；０～約１５０；１～約１５０；０～約１００；１～約１００；０～約５０；１～約５０；０～約４０；１～約４０；０～約３０；１～約３０；０～約２５；１～約２５；０～約２０；１～約２０；０～約１５；１～約１５；０～約１０；１～約１０；０～約５；または１～約５である。いくつかの実施形態において、各ｎは、独立して、０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または約５０である。いくつかの実施形態において、ｍは、１～約１，０００；１～約５００；１～約２５０；１～約２００；１～約１５０；１～約１００；１～約５０；１～約４０；１～約３０；１～約２５；１～約２０；１～約１５；１～約１０；または１～約５である。いくつかの実施形態において、ｍは、０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、もしくは約５０であり、またはＪａｉｎ，Ｎ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ．３２（１１）：３５２６－４０（２０１５）もしくはＤｕｃｒｙ，Ｌ．，ＡｎｔｉｂｏｄｙＤｒｕｇＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ（２０１３）に開示されている任意のリンカーである。

いくつかの場合において、リンカーは、有機非芳香族または芳香族環などの環状基を含み得、任意選択により環内に３～１０個の炭素を含み、任意選択によりカルボン酸

、例えば、ｔｒａｎｓ－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸、

またはその置換アナログもしくは立体異性体から構築される。このリンカーは、任意選択により、カルバメート連結を形成するために使用され得る。いくつかの場合において、カルバメート連結は、加水分解、エステラーゼなどの酵素、または他の化学反応などによる切断に対して、エステル連結よりも耐性を有し得る。

いくつかの場合において、リンカーは、環状カルボン酸、例えば、環状ジカルボン酸、例えば、次の基：１，４－シクロヘキサンジカルボン酸、１，２－シクロヘキサンジカルボン酸、または１，３－シクロヘキサンジカルボン酸のうちの１つ、１，１－シクロペンタン二酢酸、

またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み得る。例えば、リンカーは、以下の群のうちの１つを含み得る。

。いくつかの例では、リンカーは、任意選択により、エステル連結を形成するために使用され得る。いくつかの場合において、環状エステル連結は、水による加水分解、エステラーゼなどの酵素、または他の化学反応などによる切断に対して、非環状または直鎖状のエステル連結よりも立体的に耐性を有し得る。

いくつかの場合において、リンカーは、芳香族ジカルボン酸、例えば、テレフタル酸、イソフタル酸、フタル酸

またはその置換アナログを含み得る。

いくつかの場合において、リンカーは、天然もしくは非天然アミノ酸、例えば、システイン、

またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み得る。いくつかの例において、リンカーは、アラニン（Ａ、Ａｌａ）；アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）；グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）；グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）；リシン（Ｋ、Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）；セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）；チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；バリン（Ｖ、Ｖａｌ）；または任意の複数もしくはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、官能性ハンドルとして使用され得る１つ以上の官能基、例えば、アルケンまたはアルキンを含み得る。

いくつかの場合において、リンカーは、次の基：

のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体を含み得る。いくつかの例において、リンカーは、以下の群：

のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体から選択される。

いくつかの場合において、リンカーは、次の基：

いくつかの場合において、置換アナログまたは立体異性体は、本明細書で開示される化合物の構造的アナログであり、化合物の１つ以上の水素原子が１つ以上のハロ基（例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ）、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル）、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、またはこれらの任意の組み合わせによって置換されてもよい。いくつかの場合において、立体異性体は、エナンチオマー、ジアステレオマー、シスもしくはトランス立体異性体、ＥもしくはＺ立体異性体、またはＲもしくはＳ立体異性体であり得る。

直鎖リンカーの非限定的な例としては、

が挙げられ、式中、各ｎ１、もしくはｎ２またはｍは、独立して、０～約１，０００；１～約１，０００；０～約５００；１～約５００；０～約２５０；１～約２５０；０～約２００；１～約２００；０～約１５０；１～約１５０；０～約１００；１～約１００；０～約５０；１～約５０；０～約４０；１～約４０；０～約３０；１～約３０；０～約２５；１～約２５；０～約２０；１～約２０；０～約１５；１～約１５；０～約１０；１～約１０；０～約５；または１～約５である。いくつかの実施形態において、各ｎは、独立して、０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または約５０である。いくつかの実施形態において、ｍは、１～約１，０００；１～約５００；１～約２５０；１～約２００；１～約１５０；１～約１００；１～約５０；１～約４０；１～約３０；１～約２５；１～約２０；１～約１５；１～約１０；または１～約５である。いくつかの実施形態において、ｍは、０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または約５０である。いくつかの例では、リンカーは、直鎖ジカルボン酸、例えば、次の基：コハク酸、２，３－ジメチルコハク酸、グルタル酸、アジピン酸、２，５－ジメチルアジピン酸のうちの１つ、

またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み得る。いくつかの場合において、リンカーは、カルバメート連結を形成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、カルバメート連結は、加水分解、エステラーゼなどの酵素、または他の化学反応などによる切断に対して、エステル連結よりも耐性を有し得る。いくつかの場合において、リンカーは、直鎖状のエステル連結を形成するために使用することができる。いくつかの実施形態において、直鎖状のエステル連結は、加水分解、エステラーゼなどの酵素、または他の化学反応などよる切断に対して、環状エステルまたはカルバメート連結よりも高い感受性を有し得る。直鎖状のエステル連結上にメチル基などの側鎖があると、任意選択により、側鎖がない場合と比べて、連結の切断への感受性が低下し得る。

いくつかの場合において、リンカーは、コハク酸リンカーであり得、薬物は、間に２つのメチレン炭素を含むエステル結合またはアミド結合を介してペプチドに結合され得る。他の場合において、リンカーは、ヒドロキシヘキサン酸または乳酸などのヒドロキシル基とカルボン酸の両方を含む任意のリンカーであり得る。

いくつかの場合において、薬物は、以下の表７に示されるリンカーのいずれか１つ以上を使用してペプチドに結合することができる。

いくつかの場合において、薬物分子は、薬物分子の求核官能基（例えば、ヒドロキシル基）が求核試薬として作用し、リンカー部分上の脱離基を置き換えることにより薬物がリンカーに結合することで、リンカーに結合される。

他の例において、薬物分子は、リンカーの求核官能基（例えば、チオール基、アミン基など）が薬物分子上の脱離基を置き換えることにより薬物がリンカーに結合することで、リンカーに結合される。そのような脱離基（または脱離基に変換され得る官能基）は、チオエーテル結合を形成する一級アルコールであり得、それにより、薬物がリンカーに結合される。一級アルコールは、求核置換反応を促進するために、メシレート、トシレート、またはノシレートなどの脱離基に変換され得る。

本開示のペプチド薬物コンジュゲートは、本開示の薬物、リンカー、及び／またはペプチドを含み得る。これら３つの構成要素間の一般的な接続性は、リンカーが薬物とペプチドの両方に結合するように、薬物－リンカー－ペプチドであり得る。多くの場合、ペプチドは、アミド結合を介して、リンカーに結合される。アミド結合は、エステル、カーボネートなどの本明細書に記載される他の結合と比較して比較的安定であり得る（例えば、ｉｎｖｉｖｏにおいて）。したがって、ペプチドとリンカーとの間のアミド結合は、そのｉｎｖｉｖｏ安定性により、そのようなｉｎｖｉｖｏ切断後にリンカーが薬物に結合していない状態で、薬物がペプチド－薬物コンジュゲートから切断されるようにする場合、有利な特性を提供し得る。したがって、様々な場合において、薬物は、エステル、カーボネート、カルバメートなどの連結を介してリンカー－ペプチド部分に結合され、この場合、ペプチドは、アミド結合を介してリンカーに結合される。これにより、薬物－リンカー結合の選択的切断が可能となり得（リンカー－ペプチド結合とは対照的に）、切断後にリンカー部分が薬物に結合していない状態で、薬物を放出することが可能となる。そのような異なる薬物－リンカー結合または連結の使用により、例えば、オフターゲット効果（例えば、循環中の薬物放出の減少）を最小限にしつつ、治療機能を達成するために、ｉｎｖｉｖｏで薬物放出を調節することが可能となり得る。

リンカーは、切断可能なリンカーまたは安定なリンカーであり得る。切断可能なリンカーの使用により、例えば、標的の組織または細胞または細胞内コンパートメントへの標的化後における、ペプチドからのコンジュゲート部分（例えば、治療薬）の放出が可能となる。いくつかの場合において、リンカーは、酵素切断可能なリンカー、例えば、カテプシンによって切断可能なバリン－シトルリンリンカー、またはエステラーゼによって切断可能なエステルリンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは、自壊性部分を含有する。他の実施形態において、リンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、トロンビン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、またはカテプシン（例えば、カテプシンＫ）の切断部位などの、特定のプロテアーゼに対する１つ以上の切断部位を含む。

したがって、いくつかの場合において、本開示のペプチドと活性薬剤のコンジュゲートは、酵素によって切断可能なアミノ酸配列を形成することができる１以上、約２以上、約３以上、約５以上、約１０以上、または約１５以上のアミノ酸を含み得る。そのような酵素は、プロテアーゼを含み得る。ペプチド－薬物コンジュゲートは、カテプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サブチリシン、トロンビンＩ、もしくはウロキナーゼ、またはこれらの任意の組み合わせによって切断され得るアミノ酸配列を含み得る。

代替として、または組み合わせて、切断可能なリンカーは、他の機序、例えば、ｐＨ、還元、または加水分解などを介して、切断、解離、または分解され得る。加水分解は、水の反応により直接生じるか、または酵素によって促進されるか、または他の化学種の存在によって促進され得る。加水分解的に不安定なリンカー（本明細書に記載される他の切断可能なリンカーのなかでも）は、ペプチドから活性薬剤を放出するという点で有利であり得る。例えば、ペプチドとのコンジュゲート形態である活性薬剤は、活性でなくてもよいが、標的の組織または細胞または細胞内コンパートメントへの標的化後にはコンジュゲートから放出されて、活性薬剤は活性となる。切断された活性薬剤は、切断前の活性薬剤の化学構造を保持してもよいし、修飾されてもよい。いくつかの実施形態において、安定なリンカーは、任意選択により、長時間（例えば、数時間、数日、または数週間）にわたって緩衝液中での切断が生じ得ない。いくつかの実施形態において、安定なリンカーは、任意選択により、長時間（例えば、数時間、数日、または数週間）にわたって血漿または滑液などの体液中での切断が生じ得ない。いくつかの実施形態において、安定なリンカーは、任意選択により、細胞（マクロファージなど）、細胞コンパートメント（エンドソーム及びリソソームなど）、身体の炎症領域（炎症を起こした関節など）、または組織もしくは身体コンパートメントに存在し得る酵素、活性酸素種、他の化学物質または酵素への曝露後などに切断が生じ得る。いくつかの実施形態において、安定なリンカーは、任意選択により、ｉｎｖｉｖｏで切断されず、ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合された場合でも活性のままである活性薬剤を提供し得る。

リンカー（例えば、ペプチドコンジュゲートのリンカー）の加水分解速度は、調整することができる。例えば、障害にならないエステルを含むリンカーの加水分解速度は、エステルカルボニルに隣接して嵩高い基を含むリンカーの加水分解と比較してより迅速であり得る。嵩高い基は、メチル基、エチル基、フェニル基、環、もしくはイソプロピル基、または立体的な嵩高さを提供する任意の基であり得る。別の例において、加水分解速度は、アルコール、酸、もしくはエーテルなどの親水基がある場合、またはエステルカルボニルに隣接する場合、迅速になり得る。別の例において、側鎖に疎水性基がある場合、またはより長い炭化水素リンカーを有する場合は、エステルの切断が遅くなり得る。いくつかの実施形態において、カルバメート基の切断はまた、障害、疎水性などによって調整することができる。別の例において、エステルではなくカルバメートなどの反応性の低いリンカーを使用すると、リンカーの切断速度が遅くなり得る。いくつかの場合において、カルボン酸を介してコンジュゲートされたケトロラクなどのように、薬物自体が立体的な嵩高さを提供することができる。リンカーの加水分解速度は、標的の組織もしくは細胞もしくは細胞内コンパートメントにおけるコンジュゲートの滞留時間に応じて、標的の組織もしくは細胞もしくは細胞内コンパートメントにおけるペプチド蓄積の迅速さに応じて、または標的の組織もしくは細胞もしくは細胞内コンパートメントにおける活性薬剤への曝露の所望の時間枠に応じて、調整することができる。例えば、ペプチドが標的の組織または細胞または細胞内コンパートメントから比較的急速に排出される場合、リンカーを急速に加水分解するように調整することができる。対照的に、例えば、ペプチドの標的の組織または細胞または細胞内コンパートメントでの滞留時間が長い場合には、加水分解速度を遅くすることで、活性薬剤の長期送達が可能となる。これは、ペプチドが標的の組織または細胞または細胞内コンパートメント（例えば、腫瘍細胞または腫瘍組織）に薬物を送達するために使用される場合に重要であり得る。“Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｉｎｄｅｓｉｇｎｉｎｇｐａｃｌｉｔａｘｅｌｐｒｏｄｒｕｇｆｏｒｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒａｓｓｅｍｂｌｙ” ＳｃｉＲｅｐ２０１５，５，１２０２３Ｆｕｅｔａｌ．は、加水分解速度の変更の一例を提供している。いくつかの実施形態において、切断速度は、種、身体コンパートメント、及び疾患状態によって変動し得る。例えば、エステラーゼによる切断は、カルボキシエステラーゼのレベルが異なることから、ヒト血漿中よりもラットまたはマウス血漿中でより迅速であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、異なる種における同様の切断速度を得るために、様々な切断速度に調整され得る。

いくつかの実施形態において、リンカーは、活性薬剤を未修飾の形態で放出し得る。他の実施形態において、活性薬剤は、化学修飾を伴って放出され得る。更に他の実施形態において、異化作用により、リンカー及び／またはペプチドの部分に連結したままの活性薬剤が放出され得る。

リンカーは、安定なリンカーまたは切断可能なリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、安定なリンカーは、血清アルブミン上の遊離チオールへのコンジュゲート部分の交換によって、コンジュゲート部分をゆっくり放出し得る。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーの使用により、例えば、それを必要とする対象への投与後における、ペプチドからのコンジュゲート部分（例えば、治療薬）の放出が可能となり得る。他の実施形態において、切断可能なリンカーの使用により、ペプチドからのコンジュゲート治療薬の放出が可能となり得る。いくつかの場合において、リンカーは、酵素切断可能なリンカー、例えば、バリン－シトルリンリンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは、自壊性部分を含有する。他の実施形態において、リンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、トロンビン、カテプシン、ペプチダーゼ、またはベータ－グルクロニダーゼの切断部位などの、特定のプロテアーゼに対する１つ以上の切断部位を含む。代替として、または組み合わせて、リンカーは、ｐＨ、還元、または加水分解などの他の機序を介して切断可能である。

リンカーの加水分解または還元の速度は、用途に応じて微調整または変更することができる。例えば、障害にならないエステルを含むリンカーの加水分解速度は、エステルカルボニルに隣接して嵩高い基を含むリンカーの加水分解と比較してより迅速であり得る。嵩高い基は、メチル基、エチル基、フェニル基、環、もしくはイソプロピル基、または立体的な嵩高さを提供する任意の基であり得る。いくつかの場合において、カルボン酸を介してコンジュゲート、連結、または融合されたケトロラクなどのように、薬物自体が立体的な嵩高さを提供することができる。リンカーの加水分解速度は、標的位置におけるコンジュゲートまたは融合体の滞留時間に応じて、調整することができる。例えば、ペプチドが腫瘍、または脳から比較的急速に排出される場合、リンカーを急速に加水分解するように調整することができる。ペプチドの標的位置での滞留時間が長い場合には、加水分解速度を遅くすることで、活性薬剤の長期送達が可能となる。

リンカー（例えば、ペプチドコンジュゲートのリンカー）の加水分解速度は、測定することができる。そのような測定は、対象の血漿、または滑液、または他の体液もしくは組織中の遊離活性薬剤を決定することを、ｉｎｖｉｖｏで、及び／またはリンカーまたは本開示のリンカーを含むペプチドコンジュゲートを、緩衝液（例えば、ＰＢＳ）または対象の血漿（例えば、ラット血漿、ヒト血漿など）もしくは滑液もしくは他の体液もしくは組織とｅｘｖｉｖｏでインキュベートすることによって行うことを含み得る。加水分解速度を測定するための方法は、インキュベーション中または投与後にサンプルを採取し、遊離活性薬剤、遊離ペプチド、または加水分解を示す任意の他のパラメーターを決定することを含み得、また、ペプチドの総量、活性薬剤の総量、またはコンジュゲートされた活性薬剤ペプチドを測定することも含まれる。次いで、そのような測定の結果を使用して、所与のリンカーまたはリンカーを含むペプチドコンジュゲートの加水分解半減期を決定することができる。リンカーの加水分解半減期は、そのような半減期を決定するために使用される血漿または体液または種または他の条件に応じて異なり得る。これは、ある特定の血漿（例えば、ラット血漿）中に存在するある特定の酵素または他の化合物に起因し得る。例えば、異なる体液（血漿または滑液など）は、エステラーゼなどの酵素を異なる量で含有し得、これらの化合物のこれらのレベルもまた種（ラット対ヒトなど）及び疾患状態（正常に対する関節炎など）に応じて変動し得る。

本開示のコンジュゲートは、様々な成分を含むモジュール構造を有するものとして記載され得、成分のそれぞれ（例えば、ペプチド、リンカー、活性薬剤及び／または検出可能な剤）は、任意の他の成分に依存または独立して選択することができる。例えば、疼痛の治療に使用されるコンジュゲートは、本開示のＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つのアミノ酸配列を有するもの）と、リンカー（例えば、表７に記載される任意のリンカー）と、活性薬剤（例えば、ＮＳＡＩＤ鎮痛薬、イブプロフェン、またはＣＮＳもしくはがんの障害を治療するための分子）とを含み得る。リンカーは、例えば、ある特定の機序（例えば、酵素及び／またはｐＨ依存性加水分解などの加水分解）を介して標的部位（例えば、脳内）である特定の活性薬剤放出（例えば、ある特定の放出速度）を達成するために、及び／または活性薬剤の全身曝露を最小限にするために、選択及び／または修飾することができる。コンジュゲートの試験中に、コンジュゲートのある特定のｉｎｖｉｖｏ特性、例えば、薬物動態（例えば、クリアランス時間、バイオアベイラビリティ、様々な器官での取り込み及び保持）及び／または薬力学（例えば、標的結合）特性を達成するように、コンジュゲートの成分のいずれか１つ以上を修飾及び／または変更することができる。したがって、本開示のコンジュゲートは、副作用（例えば、かかる活性薬剤を単独で投与した場合（すなわち、ペプチドにコンジュゲートされていない場合）に生じる副作用）を軽減しながら、様々な疾患及び状態を予防、治療、及び／または診断するように調節することができる。

いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、官能性ハンドルとして使用され得る１つ以上の官能基、例えば、アルケンまたはアルキンを含み得る。例えば、そのような官能基の多重結合を使用して、１つ以上の分子をコンジュゲートに付加することができる。１つ以上の分子は、様々な合成戦略を使用して付加することができ、そのいくつかには、付加及び／または置換化学が含まれ得る。例えば、多重結合を使用する付加反応は、臭化水素酸の使用を含み得、ここで、臭素は、脱離基として作用することができるため、様々な部分、例えば、活性薬剤、検出可能な剤、コンジュゲートの薬物動態（例えば、血漿半減期、中枢神経系（ＣＮＳ）または他の場所における保持及び／または取り込み）及び／または薬力学（例えば、酵素による加水分解速度などの加水分解速度）の特性を改変または変更することができる薬剤で置換され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲートは、１つ以上の非天然アミノ酸及び／または１つ以上のリンカーを含む。そのような１つ以上の非天然アミノ酸及び／または１つ以上のリンカーは、官能性ハンドルとして使用することができる、１つ以上の官能基、例えば、アルケンまたはアルキン（例えば、非末端アルケン及びアルキン）を含み得る。例えば、そのような官能基の多重結合を使用して、１つ以上の分子をコンジュゲートに付加することができる。１つ以上の分子は、様々な合成戦略を使用して付加することができ、そのいくつかには、付加及び／または置換化学、環化付加などが含まれ得る。例えば、多重結合を使用する付加反応は、臭化水素（例えば、ハロゲン化水素添加反応を介する）の使用を含み得、ここで、臭素置換基は、一度結合すると、脱離基として作用することができるため、求核官能基を含む様々な部分、例えば、活性薬剤、検出可能な剤、薬剤で置換され得る。別の例として、多重結合は、環化付加反応の官能性ハンドルとして使用することができる。環化付加反応は、１，３－双極子環化付加、［２＋２］－環化付加（例えば、光触媒）、ディールス・アルダー反応、ヒュスゲン環化付加、ニトロン－オレフィン環化付加などを含み得る。そのような環化付加反応を使用して、様々な官能基、官能性部分、活性薬剤、検出可能な剤などをコンジュゲートに結合させることができる。例えば、１，３－双極子環化付加反応を使用して分子をコンジュゲートに結合させることができ、ここで、分子は、例えば、アルキンと反応して５員環を形成することができ、それにより、かかる分子がコンジュゲートに結合する、１，３－双極子を含む。

そのような薬剤または分子の付加（例えば、求核または求電子付加に続く求核置換反応を介する）は、様々な用途を有し得る。例えば、そのような分子または薬剤を結合させることで、コンジュゲートの薬物動態（例えば、血漿半減期、ＣＮＳでの保持及び／または取り込みまたは生体内分布）及び／または薬力学（例えば、酵素による加水分解速度などの加水分解速度）の特性を改変または変更することができる。また、そのような分子または薬剤を結合させることで、コンジュゲートのデポ効果を変更（例えば、増大）すること、または、例えば、蛍光もしくは他のタイプの検出可能な剤を使用して、ｉｎｖｉｖｏ追跡の機能性を提供することができる。

いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、次の基：

またはその置換アナログもしくは立体異性体（式中、各ｎ１及びｎ２は、独立して、１～１０の値である）のうちの１つ以上を含むリンカーを含み得る。そのような基は、１つ以上の分子をコンジュゲートに結合させるハンドルとして使用して、例えば、求核または求電子付加に続く求核置換反応を介して、コンジュゲートの薬物動態（例えば、血漿半減期、中枢神経系（ＣＮＳ）または他の場所における保持及び／または取り込み）及び／または薬力学の特性を変更することができる。そのような基の官能化は、基の１つ以上の多重結合（例えば、二重結合、三重結合など）を使用して行うことができる。そのような官能化は、付加及び／または置換化学を含み得る。例えば、二重結合などのリンカーの官能基は、単結合（例えば、求核付加反応などの付加反応を介して）に変換することができ、ここで、新しく形成された単結合の炭素原子の一方または両方は、それらに結合している脱離基（例えば、臭素）を有し得る。次いで、そのような脱離基を使用して（例えば、求核置換反応を介して）、特定の分子（例えば、活性薬剤、検出可能な剤など）をリンカーのその炭素原子（複数可）に結合させることができる。

別の例として、多重結合は、環化付加反応の官能性ハンドルとして使用することができる。環化付加反応は、１，３－双極子環化付加、［２＋２］－環化付加（例えば、光触媒）、ディールス・アルダー反応、ヒュスゲン環化付加、ニトロン－オレフィン環化付加などを含み得る。そのような環化付加反応を使用して、様々な官能基、官能性部分、活性薬剤、検出可能な剤などをコンジュゲートに結合させることができる。例えば、１，３－双極子環化付加反応を使用して分子をコンジュゲートに結合させることができ、ここで、分子は、例えば、アルキンと反応して５員環を形成することができ、それにより、かかる分子（例えば、活性薬剤、検出可能な剤など）がコンジュゲートに結合する、１，３－双極子を含む。いくつかの場合において、分子は、例えば、半減期の調節、デポ効果の増大、または追跡用の蛍光などのコンジュゲートの新しい機能性の提供のために、コンジュゲートに結合され得る。

ペプチドの薬物動態
本開示のペプチドのいずれかの薬物動態は、異なる投与経路を介したペプチドの投与後に決定され得る。例えば、本開示のペプチドの薬物動態パラメーターは、静脈内、皮下、筋肉内、直腸、エアロゾル、非経口、眼科用、肺、経皮、膣、眼、鼻、経口、舌下、吸入、皮膚、髄腔内、鼻腔内、腹膜、口腔、滑膜、腫瘍内、または局所投与後に定量することができる。本開示のペプチドは、放射性標識またはフルオロフォアなどの追跡剤を使用することによって分析され得る。例えば、本開示の放射性標識ペプチドは、様々な投与経路を介して投与することができる。血漿、尿、糞便、任意の器官、皮膚、筋肉、及び他の組織などの様々な生体サンプル中のペプチド濃度または用量回収は、ＨＰＬＣ、蛍光検出技術（ＴＥＣＡＮ定量、フローサイトメトリー、ｉＶＩＳ）、または液体シンチレーション計測を含む様々な方法を使用して決定され得る。

本明細書に記載される方法及び組成物は、任意の経路を介した対象へのペプチド投与の薬物動態に関する。薬物動態は、例えば、コンパートメントモデルまたはノンコンパートメント方法などの方法及びモデルを使用して記述され得る。コンパートメントモデルには、モノコンパートメントモデル、２コンパートメントモデル、マルチコンパートメントモデルなどが含まれるが、これらに限定されない。モデルは、多くの場合、様々なコンパートメントに分割され、対応するスキームによって記述され得る。例えば、１つのスキームは、吸収、分布、代謝及び排泄（ＡＤＭＥ）スキームである。別の例として、別のスキームは、放出、吸収、分布、代謝及び排泄（ＬＡＤＭＥ）スキームである。いくつかの態様において、代謝及び排泄は、消失コンパートメントと呼ばれる１つのコンパートメントに分類することができる。例えば、放出は、送達系からの組成物の活性部分の放出を含み、吸収は、対象による組成物の活性部分の吸収を含み、分布は、血漿を介して、異なる組織への組成物の分布を含み、代謝は、組成物の代謝または不活性化を含み、最後に排泄は、組成物または組成物の代謝産物の排泄または消失を含む。対象に静脈内投与された組成物は、多相薬物動態プロファイルに供することができ、これは、組織分布及び代謝／排泄の側面を含み得るが、これらに限定されない。したがって、組成物の血漿または血清濃度の減少は、多くの場合、例えば、アルファ相及びベータ相を含む二相であり、時として、ガンマ、デルタまたは他の相が観察される。

薬物動態は、対象へのペプチドの投与に関連する少なくとも１つのパラメーターを決定することを含む。いくつかの態様において、パラメーターは、少なくとも、用量（Ｄ）、投与間隔（τ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、最大濃度（Ｃ_ｍａｘ）、次の用量が投与されるまでに到達する最小濃度（Ｃ_ｍｉｎ）、最小時間（Ｔ_ｍｉｎ）、Ｃｍａｘに到達するまでの最大時間（Ｔ_ｍａｘ）、分布容積（Ｖ_ｄ）、定常状態分布容積（Ｖ_ｓｓ）、０時点での外挿濃度（Ｃ_０）、定常状態濃度（Ｃ_ｓｓ）、消失速度定数（ｋ_ｅ）、注入速度（ｋ_ｉｎ）、クリアランス（ＣＬ）、バイオアベイラビリティ（ｆ）、変動（％ＰＴＦ）及び消失半減期（ｔ_１／２）を含む。

特定の実施形態において、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれかのペプチドまたはペプチドコンストラクトは、経口投与後に、最適な薬物動態パラメーターを示す。他の実施形態において、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれかのペプチドまたはペプチドコンストラクトは、任意の投与経路、例えば、経口投与、吸入、鼻腔内投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、滑液嚢、またはこれらの任意の組み合わせなどの後、最適な薬物動態パラメーターを示す。

いくつかの実施形態において、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれかのペプチドまたはペプチドコンストラクトは、Ｃ_ｍａｘに到達するまでの平均Ｔ_ｍａｘが０．５～１２時間もしくは１～４８時間、経口経路による対象へのペプチド投与後の対象の血清における平均バイオアベイラビリティが０．１％～１０％、消化管への送達の場合における対象への経口投与後の血清の平均バイオアベイラビリティが０．１％未満、非経口投与後の血清における平均バイオアベイラビリティが１０～１００％、対象へのペプチド投与後の対象における平均ｔ_１／２が０．１時間～１６８時間もしくは０．２５時間～４８時間、対象へのペプチド投与後のペプチドの平均クリアランス（ＣＬ）が０．５～１００Ｌ／時間もしくは０．５～５０Ｌ／時間、対象へのペプチドの全身投与後の対象の平均分布容積（Ｖ_ｄ）が２００～２０，０００ｍＬ、または任意選択により全身取り込みなし、これらの任意の組み合わせを示す。

ペプチド安定性
本開示のペプチドは、細胞内、サイトゾル内、細胞核内もしくはエンドソーム内、または腫瘍内のｐＨまたは還元環境などの様々な生物学的または生理学的条件で安定であり得る。例えば、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１の任意のペプチドまたはペプチドコンストラクトは、還元剤、プロテアーゼ、酸化条件、または酸性条件に対する耐性を示し得る。

いくつかの場合において、生体分子（ペプチド及びタンパク質など）は、治療機能を提供し得るが、そのような治療機能は、ｉｎｖｉｖｏ環境によって生じる不安定性によって減少または阻害される。（Ｍｏｒｏｚｅｔａｌ．ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ１０１：１０８－２１（２０１６），Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉｅｔａｌ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ１３（９）：６５５－７２（２０１４），Ｂｒｕｎｏｅｔａｌ．ＴｈｅｒＤｅｌｉｖ（１１）：１４４３－６７（２０１３），Ｓｉｎｈａｅｔａｌ．ＣｒｉｔＲｅｖＴｈｅｒＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔ．２４（１）：６３－９２（２００７），Ｈａｍｍａｎｅｔａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ１９（３）：１６５－７７（２００５））。例えば、消化管は、低ｐＨ（例えば、ｐＨ約１）の領域、還元環境、またはペプチド及びタンパク質を分解し得るプロテアーゼの多い環境を含有し得る。口、眼、肺、鼻腔内の空洞、関節、皮膚、膣管、粘膜、及び血清などの身体の他の領域のタンパク質分解活性もまた、機能的に活性なペプチド及びポリペプチドの送達の障害となり得る。更に、血清中におけるペプチドの半減期は、プロテアーゼに部分的に起因して極めて短い場合があり、そのため、ペプチドは、妥当な投与レジメンを実施した場合、持続的な治療効果をもたらすにはあまりにも急速に分解され得る。同様に、リソソームなどの細胞内コンパートメント内のタンパク質分解活性ならびにリソソーム及びサイトゾル内の還元活性は、ペプチド及びタンパク質を分解し得るため、細胞内標的に治療機能を提供できないことがある。したがって、還元剤、プロテアーゼ、及び低ｐＨに対して耐性のあるペプチドは、ｉｎｖｉｖｏにおいて、共製剤化されたまたはコンジュゲート、連結、もしくは融合された活性薬剤の治療効果の増大を提供するか、または治療効果を増大させることができ得る。

更に、薬物の経口送達は、この投与方法によって提示される機能的に活性なペプチド及びポリペプチドの送達に対する障害にもかかわらず、ある特定の身体領域（例えば、結腸癌などの消化管の疾患、過敏性腸障害、感染症、代謝性障害、及び便秘）を標的とするためには、望ましい場合がある。例えば、薬物の経口送達は、非経口送達と比較して、患者の服用により便利な剤形を提供することにより、コンプライアンスが向上し得る。経口送達は、大きい治療濃度域を有する治療レジメンに有用であり得る。したがって、還元剤、プロテアーゼ、及び低ｐＨに対して耐性のあるペプチドは、その治療機能を無効にすることなく、ペプチドの経口送達を可能にし得る。

還元剤に対するペプチドの耐性。本開示のペプチドは、ペプチドのフォールディング状態を維持するのに不可欠であり得るジスルフィド架橋に関与し得る１つ以上のシステインを含有し得る。還元剤を含む生物学的環境にペプチドを曝露すると、ペプチドのアンフォールディングが生じ、機能性及び生物学的活性を失い得る。例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）は、体内及び細胞内の多くの領域に存在し得、ジスルフィド結合を還元し得る還元剤である。別の例として、ペプチドは、経口投与後、消化管上皮を通過してペプチドが輸送される際に還元され得る。ペプチドは、消化管の様々な部分に曝露されると還元され得る。消化管は、還元環境であり得、ジスルフィド結合の還元により、ジスルフィド結合のある治療用分子が最適な治療効果をもたらす能力を阻害し得る。ペプチドはまた、エンドソームもしくはリソソームによる内在化後などの細胞への進入時、またはサイトゾルもしくは他の細胞コンパートメントへの進入時にも還元され得る。ジスルフィド結合の還元及びペプチドのアンフォールディングは、機能性の喪失につながるか、またはバイオアベイラビリティ、ピーク血漿中濃度、生物活性、及び半減期などの重要な薬物動態パラメーターに影響し得る。ジスルフィド結合の還元はまた、後に続くプロテアーゼによる分解に対するペプチドの感受性を増大させることから、機能性の喪失につながり得、それにより、投与後にインタクトなペプチドが急速に失われることになる。いくつかの実施形態において、還元に対して耐性のあるペプチドは、インタクトのままであり得、容易に還元されるペプチドと比較して、身体の様々なコンパートメント及び細胞において、より長期にわたって機能的活性を付与し得る。

特定の実施形態において、本開示のペプチドは、安定なペプチドを特定するために、還元剤に対する耐性の特徴について分析され得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、０．００００１Ｍ～０．０００１Ｍ、０．０００１Ｍ～０．００１Ｍ、０．００１Ｍ～０．０１Ｍ、０．０１Ｍ～０．０５Ｍ、０．０５Ｍ～０．１Ｍなどの異なるモル濃度の還元剤に１５分間以上曝露させた後もインタクトのままであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチド安定性を決定するために使用される還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、２－メルカプトエタノール、（還元型）グルタチオン（ＧＳＨ）、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、還元剤への曝露後、少なくとも５％～１０％、少なくとも１０％～２０％、少なくとも２０％～３０％、少なくとも３０％～４０％、少なくとも４０％～５０％、少なくとも５０％～６０％、少なくとも６０％～７０％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも８０％～９０％、または少なくとも９０％～１００％のペプチドがインタクトのままである。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＧＳＨ還元条件に対して完全に耐性があり、ＤＴＴ還元条件での分解に部分的に耐性がある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、生理学的還元条件での分解に耐えることができるか、または耐性があり得る。

プロテアーゼに対するペプチドの耐性。本開示のペプチドの安定性は、プロテアーゼによる分解に対する耐性によって決定され得る。プロテアーゼはまた、ペプチダーゼまたはプロテアーゼとも呼ばれ、隣接するアミノ酸の間の結合を破壊することによって、ペプチドとタンパク質を分解することができる酵素である。特定のアミノ酸を標的化する特異性を有するプロテアーゼのファミリーには、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、及びアスパラギンプロテアーゼが含まれ得る。更に、メタロプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、シトクロムＰ４５０酵素、及びカテプシンもまた、ペプチド及びタンパク質を消化することができる。プロテアーゼは、血液、粘膜、肺、皮膚、消化管、口、鼻、眼、及び細胞のコンパートメント中に高濃度で存在し得る。プロテアーゼの誤調節は、リウマチ様関節炎及び他の免疫障害などの様々な疾患にも存在し得る。プロテアーゼによる分解は、治療用分子のバイオアベイラビリティ、生体内分布、半減期、及び生物活性を低下させ得、それにより、その治療機能を果たすことができなくなる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼに対して耐性のあるペプチドは、ｉｎｖｉｖｏにおいて合理的に許容される濃度で、より良好な治療活性を提供し得る。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、任意のクラスのプロテアーゼによる分解に抵抗し得る。特定の実施形態において、本開示のペプチドは、ペプシン（胃に存在し得る）、トリプシン（十二指腸に存在し得る）、血清プロテアーゼ、またはこれらの任意の組み合わせによる分解に抵抗する。いくつかの実施形態において、ペプチド安定性を決定するために使用されるプロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。特定の実施形態において、本開示のペプチドは、肺プロテアーゼ（例えば、セリン、システイニル、及びアスパルチルプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、好中球エラスターゼ、アルファ－１アンチトリプシン、分泌性ロイコプロテアーゼ阻害薬、及びエラフィン）、またはこれらの任意の組み合わせによる分解に抵抗し得る。いくつかの実施形態において、プロテアーゼへの曝露後、少なくとも５％～１０％、少なくとも１０％～２０％、少なくとも２０％～３０％、少なくとも３０％～４０％、少なくとも４０％～５０％、少なくとも５０％～６０％、少なくとも６０％～７０％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも８０％～９０％、または少なくとも９０％～１００％のペプチドがインタクトのままである。

酸性条件におけるペプチド安定性。本開示のペプチドは、酸性の生物学的環境に投与され得る。例えば、経口投与後、ペプチドは、胃の胃液及び消化（ＧＩ）管の酸性環境条件に曝され得る。胃のｐＨは、約１～４の範囲であり得、消化管のｐＨは、酸性から正常な生理学的ｐＨまでの範囲であり、上部消化管から結腸にかけて下がっていく。加えて、膣、後期エンドソーム、及びリソソームもまた、ｐＨ７未満などの酸性のｐＨ値を有し得る。これらの酸性条件は、ペプチド及びタンパク質を変性させ、アンフォールディング状態にし得る。ペプチド及びタンパク質のアンフォールディングは、後に続く他の酵素による消化に対する感受性を増加させ、ペプチドの生物学的活性の喪失をもたらし得る。特定の実施形態において、本開示のペプチドは、酸性条件、及び酸性条件をシミュレートする緩衝液中での変性及び分解に抵抗し得る。特定の実施形態において、本開示のペプチドは、１未満のｐＨ、２未満のｐＨ、３未満のｐＨ、４未満のｐＨ、５未満のｐＨ、６未満のｐＨ、７未満のｐＨ、または８未満のｐＨの緩衝液中での変性または分解に抵抗し得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、１～３のｐＨでインタクトのままである。特定の実施形態において、１未満のｐＨ、２未満のｐＨ、３未満のｐＨ、４未満のｐＨ、５未満のｐＨ、６未満のｐＨ、７未満のｐＨ、または８未満のｐＨの緩衝液に曝露後、少なくとも５％～１０％、少なくとも１０％～２０％、少なくとも２０％～３０％、少なくとも３０％～４０％、少なくとも４０％～５０％、少なくとも５０％～６０％、少なくとも６０％～７０％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも８０％～９０％、または少なくとも９０％～１００％のペプチドがインタクトのままである。他の実施形態において、１～３のｐＨの緩衝液に曝露後、少なくとも５％～１０％、少なくとも１０％～２０％、少なくとも２０％～３０％、少なくとも３０％～４０％、少なくとも４０％～５０％、少なくとも５０％～６０％、少なくとも６０％～７０％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも８０％～９０％、または少なくとも９０％～１００％のペプチドがインタクトのままである。他の実施形態において、本開示のペプチドは、人工胃液（ｐＨ１～２）中の変性または分解に対して耐性があり得る。いくつかの実施形態において、人工胃液への曝露後、少なくとも５％～１０％、少なくとも１０％～２０％、少なくとも２０％～３０％、少なくとも３０％～４０％、少なくとも４０％～５０％、少なくとも５０％～６０％、少なくとも６０％～７０％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも８０％～９０％、または少なくとも９０％～１００％のペプチドがインタクトのままである。いくつかの実施形態において、人工胃液などの低ｐＨ溶液は、ペプチド安定性を決定するために使用され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、ｉｎｖｉｖｏ、対象の血清中、または細胞内での分解に耐性がある。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ｐＨ約７、ｐＨ約７．５、ｐＨ約５～７．５、約６．５～７．５、ｐＨ約５～８、またはｐＨ約５～７などの生理学的ｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、ｐＨ約５以下、ｐＨ約３以下、または約３～約５の範囲内などの酸性条件で安定である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、エンドソームもしくはリソソームの条件下、または核内部で安定している。

高温でのペプチド安定性。本開示のペプチドは、高温の生物学的環境に投与され得る。例えば、経口投与後、ペプチドは、体内で高温に曝され得る。体温は、３６℃～４０℃の範囲であり得る。高温は、ペプチド及びタンパク質を変性させ、アンフォールディング状態にし得る。ペプチド及びタンパク質のアンフォールディングは、後に続く他の酵素による消化に対する感受性を増加させ、ペプチドの生物学的活性の喪失をもたらし得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、２５℃～１００℃の温度でインタクトのままであり得る。高温は、ペプチドのより迅速な分解をもたらし得る。高温での安定性は、熱帯環境または冷蔵へのアクセスが制限されている地域でのペプチドの保存を可能にし得る。特定の実施形態において、６ヶ月～５年間にわたる２５℃への曝露後、５％～１００％のペプチドがインタクトのままであり得る。１５分～１時間にわたる７０℃への曝露後、５％～１００％のペプチドがインタクトのままであり得る。１５分～１時間にわたる１００℃への曝露後、５％～１００％のペプチドがインタクトのままであり得る。他の実施形態において、少なくとも６ヶ月～５年間にわたる２５℃への曝露後、少なくとも５％～１０％、少なくとも１０％～２０％、少なくとも２０％～３０％、少なくとも３０％～４０％、少なくとも４０％～５０％、少なくとも５０％～６０％、少なくとも６０％～７０％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも８０％～９０％、または少なくとも９０％～１００％のペプチドがインタクトのままである。他の実施形態において、１５分～１時間にわたる７０℃への曝露後、少なくとも５％～１０％、少なくとも１０％～２０％、少なくとも２０％～３０％、少なくとも３０％～４０％、少なくとも４０％～５０％、少なくとも５０％～６０％、少なくとも６０％～７０％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも８０％～９０％、または少なくとも９０％～１００％のペプチドがインタクトのままである。他の実施形態において、１５分～１時間にわたる１００℃への曝露後、少なくとも５％～１０％、少なくとも１０％～２０％、少なくとも２０％～３０％、少なくとも３０％～４０％、少なくとも４０％～５０％、少なくとも５０％～６０％、少なくとも６０％～７０％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも８０％～９０％、または少なくとも９０％～１００％のペプチドがインタクトのままである。

方法
ペプチド産生及び精製。いくつかの実施形態において、ペプチドライブラリーの一部であるアミノ酸配列は、発現ベクターまたは固相もしくは液相のペプチド合成法を使用して合成される。例えば、ＴｆＲ結合ペプチドは、分泌される可溶性タンパク質産生／発現ベクターにクローニングされ、その後、精製され得る。ペプチド精製法としては、アフィニティー精製カラム、イオン交換（カチオン及び／またはアニオンカラムクロマトグラフィー）、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。ＳＤＳ－ＰＡＧＥと、それに続くクマシー染色及び逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、精製タンパク質のサンプルを分析することができる。タンパク質濃度は、ＵＶスペクトル吸収（例えば、吸光度２８０ｎｍ）及び／またはアミノ酸分析によって決定された。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＣｒｏｏｋＺＲｅｔａｌ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．２０２０；２０７０：３６３－３９６に記載されている方法を使用して、産生及び精製され得る。

表面提示ベクターの構築。種々の実施形態において、本明細書に記載される組換えペプチドのクローニング及び発現には、元のＤａｅｄａｌｕｓベクター（Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅｅｔａｌ．，２０１１）に基づいて、表面提示ベクターＳＤＧＦ及びＳＤＰＲ（ＳＤＧＦベクターのバリアントであるが、トリプシン／キモトリプシン切断を防ぐために、ストーク内の全ての塩基性及び芳香族残基が除去され、ペプチドのＣ末端に６ｘＨｉｓタグ（配列番号３４５）が付加されているもの）が使用され得る。ペプチドは、改変されたコード配列を使用し、ＩＲＥＳ－ＧＦＰを使用せずに、クローニングまたは発現され得る。いくつかの場合において、ベクターのコード配列は、ＧＦＰ；単回通過ＩＩ型膜貫通タンパク質ＦＡＳＬＧ（ヒトＦａｓリガンド）の膜貫通ドメイン；ポリＧＧＧＳスペーサー（配列番号１０３）；９残基ウシロドプシン抗原；ポリＧＧＧＳスペーサー（配列番号１０３）；ＧＳリンカーを含むＴＥＶ切断部位；提示ペプチド；及びＳＤＰＲの場合にのみ６ｘＨｉｓタグ（配列番号３４５）を含む。いくつかの場合において、コード配列は、ペプチドのＮ末端にシデロカリンをコードする配列を含む（例えば、配列番号３５２、または配列番号３５６～配列番号３６１）。元のＤａｅｄａｌｕｓベクターと同様に、いくつかの実施形態において、コンストラクト全体は、レンチウイルスＬＴＲとともにクローニングされ、一過性トランスフェクションまたは形質導入によって細胞に導入される。ペプチド配列は、ＳＤＧＦベクターの場合は、ユニークなＢａｍＨＩとＮｏｔＩの切断部位の間、ＳＤＰＲの場合は、ユニークなＢａｍＨＩとＡｇｅＩの切断部位の間に挿入され得る。ＳＤＧＦまたはＳＤＰＲコンストラクトのいずれにおいても、制限消化（ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ、ＮＥＢ；Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、またはＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）を含む多数の標準的なクローニング戦略を使用して所望のコード配列を挿入することができ、形質転換体は全て、Ｓｔｅｌｌａｒケミカルコンピテントセル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、またはエレクトロポレーションによって形質転換されるエレクトロコンピテントセル（ＮＥＢ１０－ベータ細胞）が使用される。ＤＮＡは、ＳＤＧＦフォワードプライマー：ＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号１２７）；ＳＤＧＦリバースプライマー：ＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣ（配列番号１２８）などの例示的なプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。

磁気ソーティングとフローソーティングの両方を使用すると、約１０^９細胞のスクリーニングが可能となり得る。最適なコンストラクト発現のための３日間及びおよそ２４時間の倍加時間を考慮して、スクリーニングを行う細胞の数の１／８、または１．２×１０^８を越える細胞が形質導入され得る。限定数のペプチド足場を試験するために、飽和変異導入（例えば、ＮＮＫ）によってライブラリー多様性が達成された。しかしながら、多様性の高い足場ライブラリーが好ましい場合には、ライブラリーを約１０，０００メンバーに減らし、オリゴヌクレオチドプールとしてオーダーし、エラープローンＰＣＲ変異導入によって更に多様化させてもよい。エラープローンＰＣＲ変異導入によって多様化されるライブラリーの場合、ライブラリー全体のサイズ（ライブラリーバリアントの数）は、課される変異導入の程度に大きく依存し得る。これは、終止コドン及びシステイントポロジーの変更により、ペプチドが機能しなくなる可能性があるからである。ＣＤＰを含むライブラリーでは、変異導入率（ペプチドあたり１～１．５）を下げればシステイントポロジーの破壊による問題が軽減し得るが、変異導入率は、ライブラリーごとに調整され得る。

ＳＤＧＦへの最適化されたクローニングのためのライブラリー設計の例示的な方法は、次のステップを含み得る：１）所望のペプチドライブラリーを決定する。ペプチドライブラリーは、既存のデータベース（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ）でシステインリッチ配列から特定されてもよいし、タンパク質設計ソフトウェア（例えば、Ｒｏｓｅｔｔａ）を使用してｉｎｓｉｌｉｃｏドッキングシミュレーションから得てもよい。２）ペプチド配列をクローニング可能なオリゴヌクレオチドに変換する。ペプチド配列をクローニング可能なオリゴヌクレオチドに変換することは、次のステップを含み得る：（ａ）ヒトコドン最適化を使用してペプチド配列を逆翻訳すること；（ｂ）ＰＣＲ増幅及びクローニングを容易にするために均一のフランキング配列を組み込むこと；（ｃ）ＮＧＳをライブラリー特性評価に採用する場合は、各ライブラリーメンバーにＮＧＳリード全体でユニーク配列が含まれることを確認すること。ユニークなマッピングを確実に可能にするためにサイレント変異が導入されてもよい。（ｄ）完成したライブラリーをオーダーすること。

プールされたオリゴヌクレオチドライブラリーのＳＤＧＦへのクローニング。プールされたオリゴヌクレオチドライブラリーをＳＤＧＦにクローニングするための例示的な方法は、次のステップを含み得る：１）プールされたオリゴヌクレオチドライブラリーを５０μＬの分子生物学等級の水またはＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁すること；２）ライブラリーをＰＣＲ増幅するために４回の反応を準備し、異なるサイクル数（例えば、１４、１６、１８、及び２０）で４回の反応を行うこと；３）全てのＰＣＲ産物をアガロースゲルで泳動させ、プライマーが枯渇した場合にＰＣＲ産物がクロスプライミングする結果であり得る所望の産物上の不適切な高分子量アンプリコンスメアを含まないレーンから所定のバンドを抽出し、ゲル抽出キットを使用してバンドを精製すること；４）任意選択により、更なる多様化が望まれる場合、前のステップのＰＣＲ産物を鋳型として用いて、Ｇｅｎｅ－ＭｏｒｐｈＩＩＲａｎｄｏｍＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ及びＳＤＧＦＧｉｂｓｏｎプライマーを使用して製造元が推奨する反応条件で使用してエラープローンＰＣＲによって変異導入を実施し、ステップ３のように、ゲルで泳動させ、実質的なクロスプライミングスメアを含まないレーンから所望のバンドを精製すること；５）ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで消化されたＳＤＧＦ骨格をクローニングするためにライブラリーあたり２μｇまたはシングルトンあたり１００ｎｇを準備すること；６）アンプリコンをＳＤＧＦにクローニングすること。例えば、Ｇｉｂｓｏｎ反応液を推奨の１時間ではなく５０℃で２時間インキュベートすること；７）ＰＣＲ精製キットを使用して反応液を脱塩し、溶出して２０μＬの量に減らすこと；８）ライブラリーをコンピテントＥ．ｃｏｌｉにエレクトロポレーションし、３７℃で一晩インキュベートすること。例えば、特殊なエレクトロコンピテント細胞を使用し、エレクトロポレーションした細胞をＬＢ寒天＋カルベニシリンの大きなプレート（２５×２５ｃｍ）に播種し、完全に広がるように注意し、完全に乾燥させてから反転させ、ライブラリーコロニー形成単位（ＣＦＵ）を確立するためのライブラリーの連続希釈液を含む対照ペトリ皿とともに３７℃で一晩インキュベーションすること；９）対照プレートを計数してＣＦＵを確立し、ＣＦＵが十分であれば、２５～５０ｍＬのＬＢ培地＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を加えてプレート（複数可）をこそぎ、セルスクレーパー、リフター、またはスプレッダーでこそぎ、更なる培地を用いて繰り返し、移動が完了するまでこそぐこと；１０）最終体積２００ｍＬの細菌を３７℃で１時間振盪し、次いで、５０ｍＬのアリコートをペレット化すること（４０００×ｇ、２０分間）；ならびに１１）１つを除く全てのペレットを－２０℃で凍結し、残りのペレットをマキシプレップし、好ましくは、レンチウイルス産生の前に最終ＤＮＡ産物を滅菌濾過すること。

哺乳動物表面提示。ＴｆＲに結合するペプチドまたは単一候補の検証は、ＨＥＫ－２９３細胞の懸濁液を使用して検証することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、２４ウェル懸濁組織培養皿内において、１ｍＬ培地中の２Ｅ６細胞に対して、推定または候補のペプチドを含む２．５μｇのＳＤＧＦベクター及び３．５μｇのポリエチレンイミンでトランスフェクトされる。細胞のインキュベーション後、プールされる全てのスクリーニングは、レンチウイルスを形質導入した２９３Ｔ細胞（ＶＳＶ－Ｇコーティング、２９３Ｔ細胞における標準的な方法によって産生）で実施され得、およそ１、または最大５のＭＯＩでＳＤＧＦコンストラクトが送達される。形質導入またはトランスフェクトされた懸濁液ＨＥＫ－２９３細胞は、ペレット化され（５００×ｇ、５分）、標的タンパク質と等モル量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７結合ストレプトアビジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）ありまたはなしで、ＤＡＰＩ及び標的タンパク質を含有するＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒ（０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中に最大８Ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁され得る。染色インキュベーションは全て、穏やかに攪拌しながら、４℃で３０分間実施された。低ストリンジェンシープロトコル（最初のアッセイ検証及びプール化スクリーニング）では、２００ｎＭの標的タンパク質が使用され得、ストレプトアビジンが標的タンパク質と予備混合され得る。細胞は、インキュベートされ、ＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒで１０倍に希釈され、ペレット化され（５００×ｇ、５分）、新鮮なＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒに再懸濁され（最大６．５Ｅ６細胞／ｍＬ）、その後、フローサイトメトリーに供され得る。中ストリンジェンシープロトコル（ＳＳＭ成熟）では、２０ｎＭの標的タンパク質のみが使用され得、細胞は、標的タンパク質のみとインキュベートされ、ＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒで１０倍に希釈され、ペレット化され、次いで、２０ｎＭのストレプトアビジンとともに再懸濁され得る。細胞は、再度インキュベートされ、ＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒで１０倍に希釈され、ペレット化され（５００×ｇ、５分）、新鮮なＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒに再懸濁され（最大６．５Ｅ６細胞／ｍＬ）、その後、フローサイトメトリーに供された。高ストリンジェンシープロトコルは、標的タンパク質の染色の直後に、ＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒのみによる追加の洗浄工程が含まれることを除き、中ストリンジェンシープロトコルと同一である。最初のスクリーニングは、弱い一価のアビディティに対する２ステップ染色プロトコルとは対照的に、四価の標的アビディティに対する１ステップ染色プロトコルを使用して、２００ｎＭのＴｆＲ濃度で実施された。その後の親和性成熟では、２０ｎＭの１ステップ染色（１回目の親和性成熟スクリーニング）及び８ｎＭの２ステップ染色（２回目の親和性成熟スクリーニング）が使用された。シングルトンバリアントの検証及び順列試験の染色は、バリアントの濃縮及び特定を行ったスクリーニングと同じ条件下で実施された。トランスフェリン競合染色アッセイでは、２ステップ染色で、ＴｆＲレベルが８ｎＭ、トランスフェリンレベルが１０μＭであった。トランスフェクト細胞は、まずトランスフェリン（１０μＭ）とインキュベートされ、次いで、最初の染色ステップのためにＴｆＲ溶液が添加された。２回目の染色ステップのために、細胞がペレット化され、次いで、ストレプトアビジン溶液中に再懸濁された。この２回目のインキュベーション後、細胞がペレット化され、フローサイトメトリーによってストレプトアビジン染色（ＴｆＲ結合を示す）が分析された。マウストランスフェリン対ヒトトランスフェリン交差反応性試験では、可溶性ペプチドがＮＨＳ－エステル結合を介してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素で標識され、次いで、細胞表面上にヒトまたはマウスのいずれかのＴｆＲを発現する細胞を５０ｎＭで染色した。共染色は必要なかったが、それ以外の点で染色プロトコルは同一である。いくつかの場合において、フローソーティングは、Ｂｅｃｋｔｏｎ－ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＡｒｉａＩＩで実施され、解析は、Ｂｅｃｋｔｏｎ－ＤｉｃｋｓｏｎＬＳＲＩＩとＡｃｅａＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーターの組み合わせで実施される。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）及びＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）で実施され得る。

ペプチドの部位飽和変異導入（ＳＳＭ）。本開示のペプチド、例えば、最初の哺乳動物表面提示実験で特定されたペプチドの親和性成熟のために、ＳＳＭを採用することができる。各成熟ラウンド中に、可能性のある全ての非システイン点バリアントのライブラリーを構築し、最初のスクリーニングよりも高ストリンジェンシーでＴｆＲに対してスクリーニングすることができる。結合が改善したバリアントをＳａｎｇｅｒシーケンシングによって濃縮及び特定することができる。このように濃縮されたバリアント変異を様々な順列で互いに組み合わせて（データに示される）、複合的に改善された結合物質を特定することができる。

次世代シーケンシング。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合に影響するバリアントの濃縮または枯渇についてのスクリーニングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングによって評価することができる。そのようなシーケンシング法は、５０μＬのＴｅｒｒａＤｉｒｅｃｔＰＣＲＭｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）中に再懸濁した細胞ペレットを回収し（１．５Ｅ６、３回の技術的反復）、元のクローニングプライマーを使用して１６サイクルで増幅させることを含む。最大４つのアリコートが６０μＬのＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ反応液に１６倍で希釈され、フローセル接着のためのアダプター配列を含有する個別のＩｌｌｕｍｉｎａプライマーを使用して増幅され得る。フォワードプライマーは、マルチプレックスのための６ｂｐバーコードを含み得る。サンプル分析にはＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００が急速モードで使用され得、マッピングにはＢｏｗｔｉｅ２ソフトウェアが使用され得、データ解析にはＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）及びＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）が使用され得る。

Ｈｉｓ－Ａｖｉ－ＴｆＲの産生、精製、及びビオチン化。いくつかの実施形態において、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイを使用して、ＴｆＲへの結合能力について候補ペプチドを分析することができる。いくつかの場合において、ビオチン化されたＨｉｓ－Ａｖｉ－ＴｆＲは、哺乳動物細胞で発現され得る。任意選択により、タンパク質は、精製後にビオチン化され得る（例えば、ＢｉｒＡを使用して、コードされたＡｖｉＴａｇをビオチン化する）。いくつかの実施形態において、発現されたペプチドは、翻訳または分泌中の安定性を高めるために、Ｎ末端でシデロカリン（配列番号３５１）に融合される（例えば、配列番号３５２、または配列番号３５６～配列番号３６１）。本明細書で開示されるペプチドは、公開されている方法論を使用して、哺乳動物細胞培養で生成することができる。（Ａ．Ｄ．Ｂａｎｄａｒａｎａｙｋｅ，Ｃ．Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｂ．Ｙ．Ｒｙｕ，Ｍ．Ｂｒａｕｌｔ，Ｒ．Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ，Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ．２０１１．Ｄａｅｄａｌｕｓ：ａｒｏｂｕｓｔ，ｔｕｒｎｋｅｙｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｒａｐｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｅｃｉｇｒａｍｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆａｃｔｉｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓｕｓｉｎｇｎｏｖｅｌｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ．（３９）２１，ｅ１４３）。ペプチド配列は、標準的な分子生物学技術を使用して、ＤＮＡに逆翻訳し、合成し、シデロカリンとインフレームでクローニングされた。（Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，ＪｏｓｅｐｈＳａｍｂｒｏｏｋ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．２０１２ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）。得られたコンストラクトは、レンチウイルスにパッケージングし、ＨＥＫ－２９３細胞に形質導入し、拡大させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって単離し、タバコエッチウイルスプロテアーゼで切断し、アセトニトリル及び０．１％ＴＦＡのグラジエントを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって均質になるまで精製された（例えば、ペプチド及びシデロカリン担体（配列番号３５１）の分離）。シデロカリン融合体として発現されたペプチドは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼで処理してシデロカリンを切断すると、Ｎ末端ＧＳを残すことができる。したがって、本開示の配列は、任意選択により、Ｎ末端ＧＳを含み得る。ペプチドは、クロマトグラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用して、シデロカリン担体から分離することができる。精製後、各ペプチドを凍結乾燥させ、凍結保存した。あるいは、精製されたタンパク質は、抗凍結剤（例えば、５％グリセロール）を含む水溶液（例えば、ＰＢＳ）中で急速凍結され、凍結保存され得る。

フルオロフォアコンジュゲーション。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはペプチドのライブラリーのスクリーニングは、目的のタンパク質またはタンパク質パートナーをフルオロフォアまたは任意の他の検出可能部分で標識することを含み、これにより、フルオロフォアまたは検出可能部分からのシグナルを検出することで、ペプチドへの結合が示される。使用することができるフルオロフォアの一例は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ＮＨＳエステル（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり、これを製造元のプロトコルに従って使用して、目的のタンパク質を標識することができる。飽和は、質量分析によって決定されるように、分子あたり約１個のフルオロフォアである。遊離色素は、標識後に除去することができる（例えば、スピンカラム透析による）。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）相互作用解析。いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価することができる。本開示のペプチドは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断可能であり得、したがって、独立した可溶性タンパク質として分析され得る。

本開示の様々なペプチドは、ＴｆＲへの結合親和性について分析され得る。結合親和性は、ＳｅｒｉｅｓＳＳＡチップを備えたＢｉａｃｏｒｅＴ１００機器（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）において２５℃で実施され得る、捕捉させたビオチン化ＴｆＲを使用したＳＰＲ実験によって分析することができる。０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いる実験において、ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）がランニング緩衝液として使用され得る。可溶性ＴｆＲ結合ペプチドは、試験されるＴｆＲ結合ペプチドに応じて濃度範囲を変えることができる希釈系列を２ｕｇ／ｍｌのＴｆＲとインキュベーションし、ＳＰＲ実験のために約３００共鳴単位（ＲＵ）のタンパク質を捕捉することによって、結合を評価することができる。

いくつかの場合において、ＳＰＲは、２つの密度の捕捉ビオチン化ｈＴｆＲに対してペプチドを注入することによって実施し、次いで、得られたデータをグローバルに解析することができる。ＴｆＲとＴｆＲ結合ペプチドとの間の相互作用について、結合定数（例えば、Ｋ_Ｄ値）ならびにオンレート及びオフレートが算出され得る。

いくつかの実施形態において、ＳＰＲは、精製されたアポトランスフェリン及びホロトランスフェリンを用いて実施される。ホロトランスフェリンは、アポトランスフェリンを鉄溶液に入れることによって、アポトランスフェリンから生成することができる（例えば、０．４当量のＦｅ（ＮＴＡ）_２を３．２当量が添加されるまで５分ごとに添加する）。過剰な鉄は、その後、緩衝液交換（例えば、ＰＢＳへのスピンカラム透析）を介して除去することができる。

円二色性。タンパク質二次構造は、円二色性（ＣＤ）を使用して評価することができる。ＣＤスペクトルは、ＪａｓｃｏＪ－７２０Ｗ分光旋光計により、１．０ｍｍの光路長セルを使用して測定することができる。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）中のタンパク質サンプルは、２５～３０ｕＭのタンパク質濃度であり得る。サンプルは、２６０～１９０ｎＭの波長帯範囲で分析され得る。データは、相対楕円率［θ］；（ｍｄｅｇ）で表され得る。タンパク質の熱安定性を決定するために、サンプルは、２℃／分の勾配で段階的に昇温される２０℃から９５℃までの温度に供され得る。安定性及びタンパク質アンフォールディングは、αヘリックス二次構造について、２１０ｎｍでモニターした。タンパク質アンフォールディングはまた、２１５ｎｍまたは２２０ｎｍでモニターされ得る。データは、相対楕円率［θ］で表され得、ｍｄｅｇ単位で報告される。

プロテアーゼ耐性試験。例えば、腫瘍環境は、高濃度のプロテアーゼを含有する。更に、タンパク質分解（プロテアーゼによる分解または切断）に対する耐性は、例えば、循環中におけるペプチド分解及び後に続く免疫原性の可能性を低減する。タンパク質分解に対する耐性は、更に、ペプチドの血清半減期及びペプチドの全体的なバイオアベイラビリティを増加させ得る。したがって、本開示のペプチドがプロテアーゼによる分解に対して耐性があることは、有利である。

タンパク質分解消化に対する耐性を決定するために、本開示の様々なペプチドは、ｐＨ１．０５の人工胃液中の５０Ｕのブタペプシン（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＰ７０１２）、またはＰＢＳ中の５０Ｕのブタトリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ６５６７）と混合され、３７℃で３０分間インキュベートされ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって分析され得る。これとは別に、ペプチドは、ｐＨ１．０５の人工胃液４３中の５０Ｕのブタペプシン（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＰ７０１２）、またはＰＢＳ中の５０Ｕのブタトリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ６５６７）と混合され、３７℃で３０分間インキュベートされ、ＲＰ－ＨＰＬＣによって分析され得る。対照ペプチドは、ＰＢＳ中でインキュベートされ得る。全てのペプチドは、非還元条件でインキュベートされ得る。

いくつかの実施形態において、ＳＤＰＲプロテアーゼ耐性試験は、トリプシン及びキモトリプシンを含むシーケンシング等級の酵素の配列を有して、実施することができる。トリプシン及びトリプシン阻害薬がＨＰＬＣ分析に使用され得る。

還元条件下におけるペプチド安定性試験。核内のタンパク質などの細胞内の１つ以上の標的タンパク質と相互作用するように設計または操作され得るペプチドは、細胞のサイトゾルコンパートメント内の還元条件に曝露され得る。したがって、本開示のペプチドが還元条件において安定性を示すことは、有利であり得る。本開示のペプチドの安定性は、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び／または１０ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）中で試験され得る。ＧＳＨは、細胞内条件でのペプチド安定性を試験するには、より生理学的に適切な還元剤であり得る。ペプチド－標的タンパク質相互作用の一例は、ＴｆＲタンパク質へのペプチド結合である。試験ペプチドに対する安定性は、例えば、ＨＰＬＣ（または放射性標識ペプチドが使用される場合は放射性ＨＰＬＣ）を使用して評価することができる。

熱シフトアッセイ。タンパク質の融解温度（Ｔｍ）の決定は、ＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅ色素（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を使用して、タンパク質のアンフォールディングをモニターすることによって実施することができる。簡潔に述べると、全体積２０μＬのＰＢＳ緩衝液中の０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質サンプルが２μＬの１０ＸＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅ色素と混合され得る。タンパク質アンフォールディング後の疎水性タンパク質コアへの色素のインターカレーションが、ＣＦＸ９６ＤｅｅｐＷｅｌｌＲｅａｌ－ＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を備えるＣ１０００ＴｏｕｃｈＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒを使用してアッセイされた。サンプルは、毎分０．５℃ずつ段階的に上げながら２０℃から９５℃まで加熱され、各点で５秒間保持し、続いて、蛍光の読み取りがなされた。Ｔｍは、相対蛍光単位（ＲＦＵ）の導関数を分析することによって算出された。

ＴｆＲ結合ペプチドのマウスＴｆＲに対する交差反応性。本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドのヒト及びマウスＴｆＲに対する交差反応性は、細胞表面結合アッセイを使用して実施することができる。表面提示パラダイムを逆にすることついては、実施例３において更に記載される。表面上にヒトまたはマウスのいずれかのＴｆＲを発現する２９３Ｆ細胞が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素で直接標識された可溶性ＴｆＲ結合ペプチドで染色された。その後、フローサイトメトリーがデータ解析に使用され、ＴｆＲ結合ペプチドのヒト対マウスの反応性を評価することができる。

ＴｆＲ結合ペプチドとＴｆＲの共結晶化及び結晶構造の解明。ＴｆＲ結合ペプチドとＴｆＲの共結晶化は、次のとおりに実施することができる。ペプチドは、およそ５～１５ｍｇ／ｍＬの標的濃度、いくつかの場合において１０ｍｇ／ｍＬで再懸濁され得る。例えば、単一ペプチドが任意の他の成分を含まずに溶液中に存在する場合は、最大８０ｍｇ／ｍＬの高濃度が結晶化に使用され得る。結晶化スクリーニングは、ＮｅｘｔａｌＪＣＳＧ＋、ＰＥＧ、及び（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ファクトリアルスイート（Ｑｉａｇｅｎ）ならびにサブマイクロリットルロボティクス（ＴＴＰＬａｂｔｅｃｈｍｏｓｑｕｉｔｏ）を使用して設定した、１：１のタンパク質溶液：リザーバー溶液シッティングドロップによる蒸気拡散によって、室温で実施され得る。回折データは、ＲｉｇａｋｕＭｉｃｒｏＭａｘ－００７ＨＦホームソースまたはＡｄｖａｎｃｅｄＬｉｇｈｔＳｏｕｒｃｅのビームライン５．０．１（ＬａｗｒｅｎｃｅＢｅｒｋｌｅｙＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を使用して、単一結晶から収集され得る。初期位相は、ＲＣＳＢＰＤＢ（Ｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｍ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２８（１）：２３５－４２（２０００））から得た相同な構造を検索モデルとして使用するＣＣＰ４プログラムスイート（Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６７（Ｐｔ４）：２３５－４２（２０１１））でＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．，ＪＡｐｐｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，４０（Ｐｔ４）：６５８－６７４（２００７））を使用する分子置換（ＭＲ）、またはＣｕＫアルファ線を使用して異常シグナルを最大化し、ＳＨＥＬＸ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｍ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６６（Ｐｔ４）：４７９－８５（２０１０））で硫黄部分構造を決定する硫黄単波長異常分散法（ｓＳＡＤ）（Ｌｉｕ，Ｑ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６９（Ｐｔ７）：１３１４－３２（２０１３））のいずれかによって、決定され得る。ｓＳＡＤ位相決定の場合、１°振幅内に１８０°の交互ファイ回転を有する５°ウェッジでデータを収集することによって、Ｂｉｊｖｏｅｔペア測定が最適化され得る。データは、ＨＫＬ２０００を用いて整理され、スケーリングされ得る（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，２７６：３０７－３２６（１９９７））。ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｅｌｙ，Ｐ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６０（Ｐｔ１２Ｐｔ１）：２１２６－３２（２００４））及びＲＥＦＭＡＣ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，５３（Ｐｔ３）：２４０－５５（１９９７））を用いて、モデル構築及び精密化の反復サイクルが実施され得る。構造検証は、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ（Ｄａｖｉｓ，Ｉ．Ｗ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３５（ＷｅｂＳｅｒｖｅｒｉｓｓｕｅ）：Ｗ３７５－８３（２００７））を用いて実施され得る。

マウスにおけるＴｆＲ結合ペプチドの生体内分布を解明するための全身オートラジオグラフィー。全身オートラジオグラフィー（ＷＢＡ）の矢状面切片作成は、次のステップを使用して実施することができる。各ペプチドは、実施例１４に更に記載されるように、Ｎ末端のリシンをメチル化することによって放射性標識され得る。したがって、ペプチドは、メチルまたはジメチルリシン及びメチル化またはジメチル化されたアミノ末端を含有し得る。健全な腎臓を持つ、体重２０～２５ｇの雌のＨａｒｌａｎ無胸腺ヌードマウスに、１００ｎｍｏｌの用量の放射性標識ペプチドが尾静脈注射を介して投与され得る。各放射性標識ペプチドは、記載された時間、動物内を自由に循環させ得、その後、動物を安楽死させ、切片化する。

処置コホートの全てのマウスには、１００ｎｍｏｌの放射性標識ペプチドまたはペプチドコンストラクト（約２０ｍｇ／ｋｇ）が投与され得る。対照マウスには、生理食塩水またはＰＢＳが注射され得る。投与期間の終了後、マウスは、ヘキサン／ドライアイス浴中で凍結され、次いで、カルボキシメチルセルロースの凍結ブロックに包埋される。動物全体の矢状面スライスが調製され得、イメージング用の凍結薄切片が得られる。凍結薄切片は、ミクロトームを使用して取得され得、脳、腫瘍、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、筋肉、脂肪、胆嚢、上部消化管、下部消化管、骨、骨髄、生殖管、眼、軟骨、胃、皮膚、脊髄、膀胱、唾液腺などの組織の可視化が可能になる。切片は、イメージング前に、フリーザー内で乾燥させる。

オートラジオグラフィーのイメージングのために、テープに貼り付けられた薄切片は、凍結乾燥され、放射性サンプルは、ホスフォイメージャープレートに７日間曝露され得る。これらのプレートは現像され、各器官からの信号（デンシトメトリー）が各動物の心臓の血液に見られる信号に正規化された。組織内の信号が当該組織内の血液から予想される信号よりも暗い場合、その領域、組織、構造、または細胞における蓄積を示す。

報告される組織内のペプチドの定量値（ｎｍｏｌ／ｇ）は、ブロック内の標準曲線及びペプチドの^１４Ｃ比活性を参照することによって達成された。

経時的な血清及び組織のペプチドレベルの定量化。利用される放射性核種に応じて、ｅｘｖｉｖｏ液体シンチレーション計測（例えば、^１４Ｃ）またはガンマ計数（例えば、全ての陽電子放出核種）のいずれかが使用されて、特定の時点での様々な器官のペプチドレベル、ならびに血液半減期及び器官取り込み及びクリアランスなどの経時的なペプチドの挙動が決定され得る。処置コホートの全てのマウスには、１００ｎｍｏｌの放射性標識ペプチドまたはペプチドコンストラクト（約２０ｍｇ／ｋｇ）が投与され得る。対照マウスには、生理食塩水またはＰＢＳが注射され得る。各放射性標識ペプチドは、記載された時間、動物内を自由に循環させ、その後、動物を安楽死させ、切片化した。腎臓、肝臓、脳、脾臓、筋肉、及び皮膚を含む、採取された器官は、計数前または後にホモジナイズされるか、または秤量され得る。内部参照標準及び対照サンプルについても計数され得る。ペプチドの取り込みデータは、組織１グラムあたりのペプチドの量として、または１グラムあたり（または１モルあたりまたは１体積あたり）の注入量パーセントとして、可視化され得る。

細胞または組織におけるペプチドの取り込みの一般的な決定。本明細書で開示されるペプチドまたはペプチドコンストラクトの取り込みは、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏのいずれかで、特定の細胞、細胞集団、組織、または器官において決定することができる。同様に、カーゴまたはペイロード送達の有効性は、ｅｘｖｉｖｏで、または、例えば、カーゴ分子が検出可能な剤を含む場合、ｉｎｖｉｖｏで、決定され得る。ｅｘｖｉｖｏ分析は、器官の採取及び採取された組織の分析前の固定化（例えば、４％ホルムアルデヒドの使用）を含む。組織サンプルは、顕微鏡、分光法、フローサイトメトリー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び超音波、電磁放射線（例えば、ＵＶ／ＶＩＳ、Ｘ線）または放射能の測定を介する様々な分析方法を使用して、分析することができる。例えば、組織への取り込みは、細胞、細胞集団、組織、もしくは器官サンプルの発光もしくは生物発光を測定することによって、または細胞、細胞集団、組織、もしくは器官サンプルの放射能を測定することによって、及び１グラムあたり（または１モルあたりまたは１体積あたり）の注入量パーセントなどの取り込み値を算出することによって、決定され得る。加えて、特定の時点での生体内分布（例えば、静的イメージング）または経時的な生体内分布（例えば、動的イメージング）を可視化する核画像の取得は、様々な技術（例えば、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ）及び適切な放射性標識ペプチドを使用して実施することができる。

ＭＴＲＢＢＢトランスサイトーシスモデル、及び毛細血管枯渇による実質／毛細血管分布の定量化。マウス（ＣＤ－１系統、各時点でＮ＝１）に麻酔をかけ、左頸静脈及び右頸動脈が外科的に露出され得る。標識されたペプチド（例えば、約２００μＬの体積で０．２５～１μＣｉ；比活性度は、配列番号１で２２～４０Ｃｉ／ｍｏｌ及び配列番号３２で１２７～１５０Ｃｉ／ｍｏｌ）が頸静脈に注射され得る。時間経過（０～３０分）内の所与の時間後、動脈血を採取し、続いて、断頭及び脳の採取を行うことができる。脳及び血清は、^１４Ｃレベルについて液体シンチレーション計測を介して試験することができ、データは、多重時間回帰数学モデルに組み込んでＣＮＳ蓄積率を定量化することができる。このＣＮＳ蓄積が毛細血管に限定されるのか、または実際に血管トランスサイトーシスを示すのかを決定するために、別の一群の動物（Ｎ＝３／ペプチド）を投与から５分後に安楽死させ、脳のホモジネートをデキストラン密度勾配による遠心分離にかけることができる。これにより、実質から毛細血管を分離することが可能になり、２つの組織を別々にシンチレーション計測にかけて^１４Ｃの信号を定量化することができる。正規化された信号比は、ＢＢＢ透過の指標となり得、例えば、配列番号１は、毛細血管よりも実質で実質的に高い信号を有し得、これは、ＢＢＢトランスサイトーシスの証拠と解釈される。

ＮＴ融合体及びニューロンＣＲＥレポーターマウスの活性化の方法。環状ＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）の制御下でホタルルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウスが使用され得る。これらのマウスの細胞は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の上昇または転写因子ＣＲＥ結合タンパク質１（ＣＲＥＢ）を活性化する他の機序の条件下においてルシフェラーゼを発現することができ、これは、動物用途に製剤化されたルシフェリンをＩＶ投与した後、全動物用発光装置（ＩＶＩＳイメージャー）で測定することができる。マウスは、フォルスコリン及びロリプラムというニューロンのｃＡＭＰ産生を刺激し、その分解を阻害する薬物（それぞれ）をこれらのマウスに投与することによって、適切な応答配列制御下で導入遺伝子を発現することが検証され得る。次いで、フォルスコリン及びロリプラムを投与された動物は、本明細書に記載されるように、４時間後にルシフェラーゼ発現について試験され得る。これらの対照実験では、動物の脳からの高レベルの発光が典型的であり得る。このアッセイで検証された動物は、約１週間かけて定常状態（低）ルシフェラーゼ発現に戻し、次いで、ニューロテンシンまたはニューロテンシンに融合されたＴｆＲ結合タンパク質を用いて試験することができる。ニューロテンシン受容体の発現は、前頭葉を含むＣＮＳの細胞のサブセットに限定され得る。活性化されると、シグナル伝達経路が活性化され得、最終的にＣＲＥＢリン酸化及びＣＲＥ媒介性転写に至る。そのリガンドであるニューロテンシンは、ＢＢＢを通過することができない神経ペプチドである。したがって、ニューロテンシン及びＴｆＲ結合ペプチドを含む融合タンパク質のＩＶ投与は、これらのマウスの脳内にＣＲＥ駆動型ルシフェラーゼが誘導される場合、ＢＢＢ透過を示し得る。

ＮＴ融合体であるペプチドコンストラクトは、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、または配列番号３５９～配列番号３６１のいずれか１つと、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する任意の配列を含む。

製造方法
本明細書に記載されるペプチドの組換え発現には、様々な発現ベクター／宿主系が利用され得る。そのような系の非限定的な例としては、本明細書に記載されるペプチド、ペプチドコンストラクト、もしくはペプチド融合タンパク質／キメラタンパク質をコードする核酸配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌、上述の核酸配列を含有する組換え酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌などの微生物、上述の核酸配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させるか、もしくは上述の核酸配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、または安定的に増幅する（例えば、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ、ＣＨＯ／グルタミンシンテターゼ）もしくは二重微小染色体で不安定に増幅する（例えば、マウス細胞株）、上述の核酸配列の複数コピーを含有するように操作された細胞株を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス）を感染させた動物細胞系が挙げられる。ペプチドのジスルフィド結合形成及びフォールディングは、発現中もしくは発現後またはその両方において生じ得る。

宿主細胞は、本明細書に記載される１つ以上のペプチドを発現するように適応され得る。宿主細胞は、原核生物細胞、真核生物細胞、または昆虫細胞であり得る。いくつかの場合において、宿主細胞は、挿入された配列の発現の調節、または所望の特定の様式での遺伝子もしくはタンパク質産物の修飾及びプロセシングが可能である。例えば、ある特定のプロモーターからの発現は、ある特定の誘導物質（例えば、メタロチオニンプロモーターに対する亜鉛及びカドミウムイオン）の存在下で増加し得る。いくつかの場合において、ペプチド産物の修飾（例えば、リン酸化）及びプロセシング（例えば、切断）は、ペプチドの機能にとって重要であり得る。宿主細胞は、ペプチドの翻訳後プロセシング及び修飾について、特徴的かつ特異的な機序を有し得る。いくつかの場合において、ペプチドを発現するために使用される宿主細胞は、微量のタンパク質分解酵素を分泌する。

細胞ベースまたはウイルスベースのサンプルの場合、精製前に生物を処理して標的ポリペプチドを保存及び／または遊離させることができる。いくつかの実施形態において、細胞は、固定剤を使用して固定される。いくつかの実施形態において、細胞は、溶解される。細胞材料は、細胞の多くの部分が破壊されることなく、細胞材料の表面から、及び／または細胞間の隙間からタンパク質を除去するような様式で処理され得る。例えば、細胞内空間内及び／または植物細胞壁内に位置するタンパク質を除去するために、細胞材料は、液体緩衝液中に浸漬されるか、または、植物材料の場合、真空に供してもよい。細胞材料が微生物である場合、タンパク質は、微生物培地から抽出され得る。あるいは、ペプチドは、封入体に充填され得る。封入体は、培地中の細胞成分から更に分離され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、破壊されない。インタクトな細胞またはウイルス粒子の結合及び／または精製のために、細胞またはウイルスによって提示される細胞またはウイルスペプチドが使用され得る。組換え系に加えて、ペプチドはまた、タンパク質及びペプチドの合成に採用される様々な既知の技術を使用して、無細胞系で合成された後、抽出され得る。

いくつかの場合において、宿主細胞は、カーゴ分子（例えば、治療薬）の結合点を有するペプチドを産生する。結合点は、リシン残基、Ｎ末端、システイン残基、システインジスルフィド結合、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基、Ｃ末端、または非天然アミノ酸を含み得る。ペプチドは、固相ペプチド合成、または溶液相ペプチド合成などによって、合成的に産生され得る。ペプチド合成は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学またはブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）化学によって実施され得る。ペプチドは、合成中もしくは合成後またはその両方においてフォールディングが生じ得る（ジスルフィド結合の形成）。ペプチドフラグメントは、合成的または組換え的に産生され得る。次いで、ペプチドフラグメントは、酵素的または合成的に互いに接続され得る。

他の態様において、本開示のペプチドは、従来の固相化学合成技術によって、例えば、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法にしたがって、調製することができる（“Ｆｍｏｃｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，” ｅｄｉｔｅｄｂｙＷ．Ｃ．ＣｈａｎａｎｄＰ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，２０００）。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、製造中により安定であり得る。例えば、本開示のペプチドは、組換え発現及び精製中により安定であり得、それにより、製造プロセスに存在するプロテアーゼによる分解速度の低下、より高いペプチド純度、より高いペプチド収率、またはこれらの任意の組み合わせがもたらされる。いくつかの実施形態において、ペプチドは、製造、保存、及び流通中における高温及び低温での分解により安定であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、２５℃で安定であり得る。他の実施形態において、本開示のペプチドは、７０℃または７０℃より高い温度で安定であり得る。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、１００℃または１００℃より高い温度で安定であり得る。

医薬組成物
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載される任意のペプチドと、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、粘稠化剤、抗酸化剤、溶解剤、緩衝液、オスモライト、塩、界面活性剤、アミノ酸、カプセル化剤、増量剤、抗凍結剤、及び／または賦形剤などの他の化学成分との組み合わせであり得る。医薬組成物は、本明細書に記載されるペプチドの生物への投与を容易にする。いくつかの場合において、医薬組成物は、ペプチドの半減期を延長し、及び／またはペプチドが標的細胞を透過するのを助ける因子を含む。

医薬組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、直腸、エアロゾル、非経口、眼科用、肺、経皮、膣、眼、鼻、経口、舌下、吸入、皮膚、髄腔内、腫瘍内、鼻腔内、及び局所投与を含む、様々な形態及び経路で、医薬組成物として治療上有効な量で投与され得る。医薬組成物は、例えば、本明細書に記載されるペプチドを直接器官に注射することにより、任意選択によりデポ注射で、局所または全身に投与され得る。

非経口注射は、ボーラス注射または連続注入用に製剤化され得る。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の無菌懸濁液、溶液または乳剤として、非経口注射に好適な形態であり得、懸濁化剤、安定化剤及び／または分散剤などの製剤化剤を含有し得る。非経口投与用の医薬製剤は、水溶性形態である、本明細書に記載されるペプチドの水溶液を含む。本明細書に記載されるペプチド抗体複合体の懸濁液は、油性注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶液またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。懸濁液はまた、好適な安定剤、または本明細書に記載されるそのようなペプチド抗体複合体の可溶性を高め、及び／または凝集を減少させる薬剤を含有し得、これにより、高濃度の溶液を調製が可能となる。

本明細書に記載される細胞透過またはペプチドを増加させるための製剤化またはアプローチは、限定するものではないが、最大１０μＭなどの高投与量の本明細書に記載されるペプチドを使用すること；Ｔａｔペプチドもしくは細胞透過ペプチド、またはそのバリアントもしくは誘導体をペプチドにコンジュゲートまたは融合させること；Ｔａｔペプチドもしくは細胞透過ペプチド、またはそのバリアントもしくは誘導体とペプチドを同時送達すること；Ａｒｇパッチをペプチドにコンジュゲートまたは融合させること；あるいは最大１０μＭなどのペプチドとＡｒｇパッチペプチドを同時送達することを含み得る。いくつかの実施形態において、細胞透過を増加させるために、タンパク質トランスフェクション薬剤、ペプチドの直接的サイトゾル発現、またはペプチドのエレクトロポレーションが使用され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドの細胞透過を増加させるために、“ＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ：ＯｒａｌＡｐｐｒｏａｃｈｅｓ” ＩｎｄｉａｎＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，ＳｈａｊｉａｎｄＰａｔｏｌｅ，ｖ７０（３）２６９－２７７，２００８に記載されるアプローチなどのように、他の賦形剤をペプチドと一緒に製剤化することができる。これらの製剤化またはアプローチの任意の組み合わせを使用することで、本明細書に記載されるペプチドの細胞透過が増加し得る。

あるいは、本明細書に記載されるペプチドは、使用前に、好適なビヒクル、例えば、無菌パイロジェンフリー水で再構成するために、凍結乾燥されるか、または粉末形態であり得る。いくつかの実施形態において、精製ペプチドは、静脈内投与される。本明細書に記載されるペプチドは、ＣＮＳ細胞、脳細胞、がん性細胞、または腫瘍にホーミング、標的化、移動、または誘導するために、対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、中枢神経系内または血液脳関門を越えた特定の標的細胞種に対する標的化機能を提供する別のペプチドにコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。例示的な標的細胞としては、ＣＮＳ細胞、赤血球、赤血球前駆細胞、免疫細胞、幹細胞、筋細胞、脳細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、骨髄細胞、虫垂細胞、リンパ節細胞、扁桃腺細胞、脾細胞、筋細胞、肝細胞、胆嚢細胞、膵細胞、消化管の細胞、腺細胞、腎細胞、膀胱細胞、内皮細胞、上皮細胞、脈絡叢上皮細胞、ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、または神経系に関連する細胞が挙げられる。

本開示のペプチドは、外科手術中に脳または脳組織もしくは細胞などの器官、または器官組織もしくは細胞に直接適用することができる。本明細書に記載される組換えペプチドは、局所投与することができ、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、香膏、クリーム、及び軟膏などの様々な局所投与可能な組成物に製剤化することができる。そのような医薬組成物は、溶解剤、安定剤、張度増強剤、緩衝液及び保存剤を含有し得る。

本明細書で提供される治療または使用の方法において、治療上有効な量の本明細書に記載されるペプチドは、免疫系に影響を及ぼす状態に罹患している対象に医薬組成物で投与され得る。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトまたは霊長類などの哺乳動物である。治療上有効な量は、疾患の重症度、対象の年齢及び相対的な健康、使用される化合物の効力、ならびに他の因子に応じて大きく変動し得る。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、ウイルス発現ベクターまたは非ウイルス発現ベクターにクローニングされる。そのような発現ベクターは、遺伝子治療の形態で患者に投与される、ウイルス粒子、ビリオン、または非ウイルス性の担体もしくは送達機構にパッケージングされ得る。他の実施形態において、患者の細胞が抽出され、それをＴｆＲに結合することが可能なペプチドを発現するようにｅｘｖｉｖｏで改変した後、その改変された細胞を細胞治療の形態で患者に戻す。それにより、その改変された細胞は、患者に移植されると、ペプチドを発現する。

医薬組成物は、活性化合物の薬学的に使用することができる調製物への加工を容易にする賦形剤及び助剤を含む、１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して製剤化され得る。製剤は、選択された投与経路に応じて、変更され得る。本明細書に記載されるペプチドを含む医薬組成物は、例えば、組換え系におけるペプチドの発現、ペプチドの精製、ペプチドの凍結乾燥、混合、溶解、造粒、糖衣、研和、乳化、カプセル化、封入、または圧縮の各プロセスによって、製造することができる。医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、遊離塩基もしくは薬学的に許容される塩形態である本明細書に記載される化合物とを含み得る。

本明細書に記載される化合物を含む本明細書に記載されるペプチドを調製する方法は、本明細書に記載されるペプチドと、１つ以上の不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体を一緒に製剤化して、固体、半固体、または液体組成物を形成することを含む。固体組成物には、例えば、散剤、錠剤、分散性顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤、及び坐剤が含まれる。これらの組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び他の薬学的に許容される添加剤などの微量の無毒の補助物質を含有し得る。

薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＮｉｎｅｔｅｅｎｔｈＥｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，ＪｏｈｎＥ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｃｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓａｎｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ，ＳｅｖｅｎｔｈＥｄ．（ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）に見出すことができ、それぞれの内容全体が参照により援用される。

医薬組成物はまた、浸透または吸収促進剤を含み得る（Ａｕｎｇｓｔｅｔａｌ．ＡＡＰＳＪ．１４（１）：１０－８．（２０１２）及びＭｏｒｏｚｅｔａｌ．ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ１０１：１０８－２１．（２０１６））。浸透促進剤は、消化管から体循環への分子の取り込みを促進し得る。浸透促進剤は、中鎖脂肪酸の塩、カプリン酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、Ｎ－（８－［２－ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸（ＳＮＡＣ）、Ｎ－（５－クロロサリチロイル）－８－アミノカプリル酸（５－ＣＮＡＣ）、フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、及びフェニルアルコールなどの親水性芳香族アルコール、キトサン、アルキルグリコシド、ドデシル－２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピオン酸（ＤＤＡＩＰＰ）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びクエン酸を含む二価カチオンのキレート剤、アルキル硫酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、デオキシコール酸などのレシチンベースまたは胆汁酸塩由来の薬剤を含み得る。

組成物はまた、ダイズトリプシン阻害薬、アプロチニン、グリココール酸ナトリウム、カモスタットメシル酸塩、バシトラシン、またはシクロペンタデカラクトンを含むプロテアーゼ阻害薬を含み得る。

治療におけるペプチドの使用
いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載される有効量のペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む。

一実施形態において、方法は、本明細書に記載される有効量のペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む。

ＴｆＲは、脳、胃、肝臓、胆嚢などの様々な組織に発現し得る。したがって、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、様々な組織及び器官に関連する疾患及び状態の診断及び治療に使用することができる。例えば、これらの組織及び器官への薬物送達は、診断用及び／または治療用ペイロードを運搬する本明細書に記載されるペプチド及びペプチドコンストラクトを使用することによって、改善され得る。

「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、治療される疾患または状態の症状のうちの１つ以上をある程度緩和する、投与される薬剤または化合物の十分な量を指す。その結果は、疾患の徴候、症状、もしくは原因の減少及び／または緩和、または生物系の任意の他の所望の改変であり得る。そのような薬剤または化合物を含有する組成物は、予防、増強、及び／または治療的処置のために投与され得る。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、用量漸増試験などの技術を使用して決定され得る。

本開示の方法、組成物、及びキットは、状態の症状を予防、治療、停止、逆転、または改善するための方法を含み得る。治療は、対象（例えば、疾患または状態に罹患した個体、飼育動物、野生動物、または実験動物）を本開示のペプチドで治療することを含み得る。疾患は、がんまたは腫瘍であり得る。疾患を治療することにおいて、ペプチドは、腫瘍またはがん性細胞と接触し得る。対象は、ヒトであり得る。対象は、ヒト；チンパンジー、ならびに他の猿人類及びサル種などの非ヒト霊長類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜；ウサギ、イヌ、及びネコなどの飼育動物；ラット、マウス及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などであり得る。対象は、あらゆる年齢であり得る。対象は、例えば、高齢者、成人、青年、前青年、子ども、幼児、乳児、及び子宮内胎児であり得る。

治療は、疾患の臨床的な発症前に対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的な発症後に対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的な発症から１日、１週間、６ヶ月、１２ヶ月、または２年以上後に対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的な発症から１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、２年以上にわたって対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的な発症から１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、または２年未満の間、対象に提供され得る。治療はまた、臨床試験においてヒトを治療することを含み得る。治療は、本開示全体を通して記載される医薬組成物のうちの１つ以上などの医薬組成物を対象に投与することを含み得る。治療は、１日１回の投与を含み得る。治療は、静脈内、皮下、筋肉内、吸入、皮膚、局所、関節内注射、経口、舌下、髄腔内、経皮、鼻腔内、腹膜経路、腫瘍へ直接、例えば、腫瘍への直接注射、脳内へ直接、例えば、脳室内経路、または関節に直接、例えば、関節内局所注射経路のいずれかで、本開示のペプチドを対象に送達することを含み得る。治療は、静脈内、皮下、筋肉内、吸入、関節内注射、皮膚、局所、経口、髄腔内、経皮、鼻腔内、非経口、経口、腹膜経路、経鼻、舌下、またはがん性組織に直接のいずれかで、ペプチド活性薬剤複合体を対象に投与することを含み得る。

本明細書に記載されるペプチド及びペプチドコンストラクト（例えば、ペプチドコンジュゲートまたは組換え産生されたペプチドコンストラクト）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの細胞障壁を越えて（例えば、小胞性トランスサイトーシスを介して）もしくは細胞膜を越えて（例えば、受容体媒介性エンドサイトーシスなどのエンドサイトーシスを介して）輸送されること、または組織に蓄積されることは、様々な細胞、組織及び器官、特に、ＴｆＲを発現及び／または過剰発現する細胞組織または器官における細胞成長、細胞増殖、血管新生、器官形成、腫瘍進行、及び／または転移、細胞死（例えば、老化）、神経変性、及び疼痛に関連するものなどの多数の疾患、状態、または障害に影響を与え得る。いくつかの実施形態において、ペプチドコンストラクト（例えば、ペプチド－ＮＴコンストラクト）は、ドーパミン－シグナル伝達ニューロンと相互作用して疼痛を低減させる。ＴｆＲに結合する本明細書で開示されるペプチドのいずれか１つを含む組成物、またはその医薬組成物は、卵巣癌、結腸癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫、及び肺癌、骨もしくは骨髄に位置する癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、及びびまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、脾癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、骨髄細胞癌、または皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、またはＣＭＹＣ過剰発現癌を含む、がん、腫瘍進行、様々ながんにおける調節不全の細胞成長を治療、予防、または診断する方法に使用することができる。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、腫瘍細胞、骨髄細胞（例えば、赤血球前駆細胞）、脾細胞、免疫細胞、唾液腺の癌、または筋細胞への送達を可能にする。本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、神経系及びＣＮＳ関連障害（例えば、神経変性疾患）の治療または予防に使用される薬物と組み合わせて使用することができる。更なる疾患、障害、または状態は、多発性骨髄腫、再生不良性貧血（ｐｌａｓｔｉｃａｎｅｍｉａ）、脊髄形成異常症、及び関連骨髄不全症候群、骨髄増殖性疾患、急性及び慢性骨髄性白血病、リンパ様細胞の悪性腫瘍、血液悪性腫瘍、血漿細胞障害、骨格筋障害、ミオパチー、筋ジストロフィー（例えば、ベッカー型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、エメリー・ドレーフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋無緊張症、及び筋強直性ジストロフィー）、ならびに慢性閉塞性肺障害を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される組成物／ペプチドは、次の細胞、組織、または器官の種類：脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、血液細胞、骨髄細胞、造血幹細胞、膵臓、結腸、胃、子宮頸、乳房、子宮内膜、筋肉、結合組織、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、食道、口腔組織、及び骨髄のいずれかに関連する調節不全の細胞成長、がん、腫瘍、及び／または転移を治療するために使用される。更なる実施形態において、本明細書で開示される組成物／ペプチドは、次のいずれか：肉腫、骨肉腫、筋肉由来肉腫、肝細胞癌、悪性中皮腫、シュワン腫、髄膜腫、腎癌、胆管癌、胆管過誤腫、軟部組織癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、卵巣癌、大腸腺腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、消化管過形成、線維肉腫、膵管異形成、扁平上皮癌、カポジ肉腫、及びＨＩＶ誘発性非ホジキンリンパ腫を治療するために使用される。

種々の実施形態において、本開示は、細胞層（例えば、内皮細胞または上皮細胞）または細胞膜を越えるＴｆＲ媒介性輸送を可能にする方法及び組成物を提供する。ＢＢＢに加えて、様々な他の細胞、組織、及び器官がＴｆＲを発現する。ＴｆＲを発現する単一細胞は、肝細胞、赤血球及び骨髄中の赤血球前駆細胞、免疫細胞、幹細胞、ならびに急速に分裂する細胞を含み得る。ＴｆＲを発現する組織及び器官は、脳（例えば、大脳皮質、海馬、尾状、小脳）、内分泌腺組織（例えば、甲状腺、副甲状腺、及び副腎）、骨髄及び免疫系（例えば、虫垂、リンパ節、扁桃腺、脾臓）、筋肉組織（例えば、心臓、骨格、及び平滑筋）、肝臓、胆嚢、膵臓、消化管（例えば、口腔粘膜、食道、胃、十二指腸、小腸、結腸、直腸）、腎臓、膀胱、婦人科組織（例えば、卵管、乳房、膣、子宮頸、子宮内膜、卵巣、及び胎盤）、脂肪及び軟組織、ならびに皮膚を含み得る。したがって、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、これらの細胞、組織、及び器官を標的とし、これらの細胞、組織、及び器官に、例えば、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスを介して（例えば、ＢＢＢなどの細胞障壁を越えて）またはＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して（例えば、細胞膜を越えて細胞内に）活性薬剤を送達するために使用することができる。

種々の実施形態において、本開示は、ＴｆＲを発現する腫瘍細胞へのＴｆＲ媒介性輸送及び送達を可能にする方法及び組成物を提供する。ＴｆＲを発現するがんは、卵巣癌、結腸癌、肺癌、骨もしくは骨髄に位置する癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、脾癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、骨髄細胞癌、皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはＣＭＹＣ過剰発現癌を含み得る。脳癌としては、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、及びびまん性内在性橋膠腫が挙げられるが、これらに限定されない。

がんを予防及び／または治療するために使用することができるＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、ＴｆＲ結合ペプチドと、ＩＬ１５、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａの融合体、ＩＦＮガンマ、及び抗ＣＤ３薬剤などの抗腫瘍活性を有する活性薬剤とを含むものである。抗腫瘍活性を有する活性薬剤を含むＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトの例は、配列番号２２５～配列番号３３２）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するものである。活性腫瘍活性を有する活性薬剤（例えば、ＩＬ１５、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａの融合体、ＩＦＮガンマ、または抗ＣＤ３薬剤）は、ＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）に融合されて、ペプチド－活性薬剤コンストラクトを形成し得る。

本明細書に記載されるペプチド及びペプチドコンストラクト（例えば、ペプチドコンジュゲートまたは組換え産生されたペプチドコンストラクト）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの細胞障壁を越えて（例えば、ＴｆＲ媒介性小胞性トランスサイトーシスを介して）または細胞膜を越えて（例えば、ＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して）輸送されることは、対象（例えば、ヒト）における慢性疼痛（例えば、頭痛または片頭痛）、神経障害性疼痛、肥満症、インスリン抵抗性、オピオイド中毒、または他の神経障害もしくは精神障害に関連する多数の疾患、状態、または障害に影響を与え得る。いくつかの実施形態において、ペプチドコンストラクト（例えば、ペプチド－ＮＴコンストラクト）は、ドーパミン－シグナル伝達ニューロンと相互作用して疼痛を低減させる。

本明細書に記載されるペプチド及びペプチドコンストラクト（例えば、ペプチドコンジュゲート、融合ペプチド、または組換え産生されたペプチドコンストラクト）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの細胞障壁を越えて（例えば、小胞性トランスサイトーシスを介して）または細胞膜を越えて（例えば、エンドサイトーシスを介して）輸送されることは、神経変性に関連する多数の疾患、状態、または障害に影響を与え得る。本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドで治療、予防、または診断することができる神経変性疾患としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、ライム病、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳失調症、バッテン病、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、クフォー・ラケブ症候群、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、慢性外傷性脳症、または前頭側頭型認知症を挙げることができる。いくつかの場合において、ＴｆＲ結合ペプチドは、神経変性疾患を治療及び／または予防するために、ＢＡＣＥ阻害薬である、ガランタミン、アマンタジン、ベンザトロピン、ビペリデン、ブロモクリプチン、カルビドパ、ドネペジル、エンタカポン、レボドパ、ペルゴリ、プラミペキソール、プロシクリジン、リバスチグミン、ロピニロール、セレギリン、タクリン、トルカポン、またはトリヘキシフェニジルと組み合わせて使用することができる。

いくつかの実施形態において、ＴｆＲ結合ペプチドを使用したＫｖ１．３カリウムチャネルなどのイオンチャネルの調節（例えば、阻害）及びＫｖ１．３カリウムチャネル阻害薬コンジュゲートまたはペプチドコンストラクトなどのイオンチャネル調節剤は、脳の炎症を治療または予防するために使用され得る。Ｋｖ１．３カリウムチャネルは、例えば、脳内のミクログリアに高度に発現され得る。したがって、神経炎症性及び神経変性疾患、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、放射線療法による毒性ならびに他の神経変性疾患及び神経炎症性疾患は、Ｋｖ１．３阻害薬にコンジュゲート、連結、または融合されたＴｆＲ結合ペプチドで治療することができる。これらの疾患は、Ｋｖ１．３の上方制御を特徴とし得る。いくつかの場合において、Ｋｖ１．３阻害薬は、エフェクターＴ細胞への作用により、乾癬及び他の脳以外の自己免疫疾患の治療のために使用され得る。

いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、クローン病またはより一般的には炎症性腸疾患の治療及び予防に使用することができる。いくつかの実施形態において、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、多量のＴｆＲを発現し得る腸の腺細胞において、高い取り込み及び保持を示す。

いくつかの実施形態において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクト（例えば、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１）は、低ｐＨ、プロテアーゼの多い環境、酸性環境、還元環境、または温度変動のある環境を含む、様々な生物学的環境において安定性が向上していることから、これらの障害にアクセスし、治療するために使用される。

いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドのいずれか１つを含み、ＴｆＲ結合ペプチドにつき１つ以上のカーゴ分子または活性薬剤を、細胞層または内皮層（例えば、ＢＢＢ）もしくは上皮層などの細胞障壁、あるいは細胞膜を越えて輸送することが可能である。いくつかの実施形態において、カーゴ分子または活性薬剤は、免疫治療薬、ＣＴＬＡ－４標的薬剤、ＰＤ－１標的薬剤、ＰＤＬ－１標的薬剤、ＩＬ１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合剤の融合体、ＩＦＮガンマ薬剤、抗ＣＤ３薬剤、イオンチャネル調節剤、Ｋｖ１．３阻害薬、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアミシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ－３８、ＢＡＣＥ阻害薬、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害薬、ＷＥＨＩ－５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ－１９９、ナビトクラックス、ＡＴ－１０１、オバトクラックス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体、ドラスタチン、またはニューロテンシンなどの神経伝達物質である。

ペプチドキット
一態様において、本明細書に記載されるペプチドは、キットとして提供され得る。別の実施形態において、本明細書に記載されるペプチドコンストラクトは、キットとして提供され得る。別の実施形態において、キットは、本明細書に記載されるペプチドをコードするアミノ酸、ベクター、宿主生物、及び指示マニュアルを含む。いくつかの実施形態において、キットは、ペプチドの使用または投与について書かれた説明書を含む。

番号付きの実施形態
以下の実施形態は、本明細書で開示される特徴の組み合わせの非限定的な順列を列挙する。特徴の組み合わせの他の順列も企図される。特に、これらの番号付きの実施形態のそれぞれは、列挙される順番とは関係なく、全ての前後の番号付きの実施形態に依存または関連することが企図される。１．操作されたトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合ペプチド、またはそのバリアント、ホモログ、フラグメント、もしくはアナログを含む、組成物。２．ペプチドコンストラクトを含む組成物であって、ペプチドコンストラクトが、ａ）トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合ペプチド、またはそのバリアント、ホモログ、フラグメント、もしくはアナログと、ｂ）活性薬剤とを含み、ペプチドは、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される、組成物。３．ＴｆＲが、ヒトＴｆＲ、またはマウスＴｆＲ、またはヒトＴｆＲ及びマウスＴｆＲである、実施形態１～２のいずれか１つの組成物。４．配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つと、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する操作されたペプチド、またはそのバリアントもしくは機能性フラグメントを含む組成物。５．ペプチドが、内皮細胞を含む細胞層を透過する、実施形態１～４のいずれか１つの組成物。６．内皮細胞が脳血管内皮細胞である、実施形態５の組成物。７．ペプチドが、血液脳関門（ＢＢＢ）を含む細胞層を透過する、実施形態１～６のいずれか１つの組成物。８．ペプチドが、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスを介して、内皮細胞を含む細胞層を透過する、実施形態１～７のいずれか１つの組成物。９．ペプチドが、膜を透過し、膜は、細胞の膜である、実施形態１～８のいずれか１つの組成物。１０．細胞がＴｆＲを発現する、実施形態９の組成物。１１．ペプチドが、ＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して細胞の膜を透過する、実施形態９～１０のいずれか１つの組成物。１２．ペプチドが、ＴｆＲを発現する任意の細胞内または細胞とともに局在することが可能である、実施形態１～１１のいずれか１つの組成物。１３．ペプチドが、ＴｆＲを発現する細胞表面膜に結合した状態を保つ、実施形態１～１２のいずれか１つの組成物。１４．ペプチドが、ＴｆＲに結合することによって、細胞中に内在化する、実施形態１～１３のいずれか１つの組成物。１５．ペプチドが、ＴｆＲに結合し、次いで、解離することによって、血液脳関門を越えてＣＮＳに送達される、実施形態１～１４のいずれか１つの組成物。１６．ペプチドが、受容体媒介性トランスサイトーシスによって血液脳関門を越えて送達される、実施形態１～１５のいずれか１つの組成物。１７．細胞が、ＣＮＳ細胞、赤血球、赤血球前駆細胞、免疫細胞、幹細胞、筋細胞、脳細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、骨髄細胞、虫垂細胞、リンパ節細胞、扁桃腺細胞、脾細胞、筋細胞、肝細胞、胆嚢細胞、膵細胞、消化管の細胞、腺細胞、腎細胞、膀胱細胞、内皮細胞、上皮細胞、脈絡叢上皮細胞、グリア細胞、星状膠細胞、または神経系に関連する細胞である、実施形態９～１６のいずれか１つの組成物。１８．細胞が腫瘍細胞である、実施形態９～１７のいずれか１つの組成物。１９．腫瘍細胞が、卵巣癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、骨もしくは骨髄に位置する癌細胞、膠芽腫細胞、星細胞腫細胞、神経膠腫細胞、髄芽腫細胞、上衣腫細胞、脈絡叢癌細胞、正中膠腫細胞、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）細胞、乳癌細胞、肝癌細胞、結腸癌細胞、脳癌細胞、脾癌細胞、唾液腺の癌細胞、腎癌細胞、筋肉癌細胞、骨髄細胞癌細胞、皮膚癌細胞、泌尿生殖器癌細胞、骨肉腫細胞、筋肉由来肉腫細胞、黒色腫細胞、頭頸部癌細胞、神経芽細胞腫細胞、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、急性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性リンパ性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞、ホジキンリンパ腫細胞、非ホジキンリンパ腫細胞、またはＣＭＹＣ過剰発現癌細胞である、実施形態１８の組成物。２０．ペプチドが器官または組織に局在する、実施形態１～１９のいずれか１つの組成物。２１．器官または組織が、脳、甲状腺、副甲状腺、副腎、骨髄、虫垂、リンパ節、扁桃腺、脾臓、筋肉、肝臓、胆嚢、膵臓、消化管、腎臓、膀胱、卵管、乳房、膣、子宮頸、子宮内膜、卵巣、胎盤、及び皮膚である、実施形態２０の組成物。２２．ペプチドが局在する細胞または器官が、ＴｆＲを過剰発現している、実施形態９～２１のいずれか１つの組成物。２３．ＴｆＲを過剰発現している細胞または器官が、腫瘍細胞またはがん性組織である、実施形態２２の組成物。２４．ペプチドが器官の実質に局在する、実施形態２２～２３のいずれか１つの組成物。２５．ペプチドが、ヒトＴｆＲ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０２７８６）の配列番号３６３に対応する残基５０６～５１０、５２３～５３１、または６１１～６６２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、実施形態１～２４のいずれか１つの組成物。２６．ペプチドが、配列番号２０６～配列番号２２４及び配列番号３３４～配列番号３４４を含む、実施形態１～２５のいずれか１つの組成物。２７．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、及びＱ５１に対応する表面界面残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１～２６の組成物。２８．ペプチドが、配列番号３２を基準として、位置３、４、９、１１、１５、１６、１９、２３、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、及び４０のいずれか１つに対応する親水性表面遠位残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１～２７の組成物。２９．親水性表面遠位残基が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される、実施形態２８の組成物。３０．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、及びＤ４０に対応する親水性表面遠位残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２６～２９のいずれか１つの組成物。３１．ペプチドが、配列番号３２を基準として、１５、３５、３９、もしくは４９のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに対応する位置に親水性残基を含む、実施形態１～３０のいずれか１つの組成物。３２．親水性残基が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される、実施形態２８の組成物。３３．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、及びＨ４９に対応する親水性残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態３１～３２のいずれか１つの組成物。３４．ペプチドが、配列番号３２を基準として、１１、２５、もしくは２７、またはこれらの任意の組み合わせに対応する位置に疎水性残基を含む、実施形態１～３３のいずれか１つの組成物。３５．疎水性残基が、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、もしくはＹ、またはこれらの任意の組み合わせから選択される、実施形態３４の組成物。３６．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｍ１１、Ｍ２５、Ｍ２７に対応する疎水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態３４～３５のいずれか１つの組成物。３７．ペプチドが、配列番号３２を基準として、位置４５に対応する脂肪族残基を含む、実施形態１～３６のいずれか１つの組成物。３８．脂肪族残基が、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから選択される、実施形態３７の組成物。３９．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｌ４５に対応する脂肪族残基を含む、実施形態３７～３８のいずれか１つの組成物。４０．ペプチドが、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも５つのジスルフィド結合を含む、実施形態１～３９のいずれか１つの組成物。４１．ペプチドが３つのジスルフィド結合を含む、実施形態１～４０のいずれか１つの組成物。４２．ペプチドが、少なくとも２つ、少なくとも４つ、または少なくとも６つのシステイン残基を含む、実施形態１～４１のいずれか１つの組成物。４３．ペプチドが６つのシステイン残基を含む、実施形態１～４２のいずれか１つの組成物。４４．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｃ６、Ｃ１０、Ｃ２０、Ｃ３４、Ｃ４４、及びＣ４８、またはこれらの任意の組み合わせに対応する位置にシステイン残基を含む、実施形態１～４３のいずれか１つの組成物。４５．ペプチドの少なくとも１つのシステイン残基が、ジスルフィド結合に関与する、実施形態１～４４のいずれか１つの組成物。４６．６つのシステイン残基が、ジスルフィド結合に関与する、実施形態４３の組成物。４７．ジスルフィド結合が、ペプチドの安定性を高める、実施形態１～４６のいずれか１つの組成物。４８．ペプチドが、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む、実施形態１～４７のいずれか１つの組成物。４９．ペプチドが、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つの配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む、実施形態１～４８のいずれか１つの組成物。５０．ペプチドが、配列番号１に示される配列を含む、実施形態１～４９のいずれか１つの組成物。５１．ペプチドが、配列番号２に示される配列を含む、実施形態１～４９のいずれか１つの組成物。５２．ペプチドが、配列番号４に示される配列を含む、実施形態１～４９のいずれか１つの組成物。５３．ペプチドが、配列番号３０に示される配列を含む、実施形態１～４９のいずれか１つの組成物。５４．ペプチドが、配列番号３２に示される配列を含む、実施形態１～４９のいずれか１つの組成物。５５．３つのジスルフィド結合を含むペプチドが、システイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）に由来する、実施形態１～５４のいずれか１つの組成物。５６．３つのジスルフィド結合を含むペプチドが、ＣＤＰである、実施形態１～５５のいずれか１つの組成物。５７．ペプチドが、トランスフェリン、またはそのホモログ、バリアント、もしくはフラグメントと、ＴｆＲへの結合について、競合する、実施形態１～５６のいずれか１つの組成物。５８．ペプチドが、ＴｆＲを隔離するか、または別のタンパク質がＴｆＲに結合するのを妨げる、実施形態１～５７のいずれか１つの組成物。５９．ペプチドが、トランスフェリン、またはその内因性誘導体と比較して、ＴｆＲに対して同等またはそれより大きい親和性または特異性を有する、実施形態１～５８のいずれか１つの組成物。６０．ペプチドが、トランスフェリン、またはその内因性誘導体と比較して、ＴｆＲに対して同等またはそれより小さい解離定数を有する、実施形態１～５９のいずれか１つの組成物。６１．ペプチドが、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満のＫＤを有する、実施形態６０の組成物。６２．ペプチドが、標的細胞を透過するか、または標細胞内に局在する、実施形態１～６１のいずれか１つの組成物。６３．ペプチドが、細胞透過部分と更に製剤化、融合、また

はコンジュゲートされる、実施形態１～６２のいずれか１つの組成物。６４．細胞透過部分が、ポリカチオン、ポリ有機酸、エンドソーム放出ポリマー、ポリ（２－プロピルアクリル酸）、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｔａｔペプチド、Ａｒｇパッチ、ノットペプチド、ＣｙｓＴＡＴ、Ｓ１９－ＴＡＴ、Ｒ８（配列番号７３）、ｐＡｎｔｐ、Ｐａｓ－ＴＡＴ、Ｐａｓ－Ｒ８（配列番号７６）、Ｐａｓ－ＦＨＶ、Ｐａｓ－ｐＡｎｔＰ、Ｆ２Ｒ４（配列番号７９）、Ｂ５５、アウレイン、ＩＭＴ－Ｐ８、ＢＲ２、ＯＭＯＴＡＧ１、ＯＭＯＴＡＧ２、ｐＶＥＣ、ＳｙｎＢ３、ＤＰＶ１０４７、Ｃ１０５Ｙ、トランスポータン、ＭＴＳ、ｈＬＦ、ＰＦＶＹＬＩ（配列番号９３）、マウロカルシン、インペラトキシン、ハドルカリン、ヘミカルシン、オピカルシン－１、オピカルシン－２、ミッドカイン（６２－１０４）、ＭＣｏＴＩ－ＩＩ、クロロトキシン、ＤＲＩ－ＴＡＴ、ｃＦΦＲ４（配列番号９６）、Ｒ６Ｗ３（配列番号４２１）、ミリステート、ｙＢＢＲ、またはそのフラグメントもしくはバリアント、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態６３の組成物。６５．細胞透過部分が、マウロカルシン、インペラトキシン、ハドルカルシン、ヘミカルシン、オピカルシン－１、オピカルシン－２、ミッドカイン（６２－１０４）、ＭＣｏＴＩ－ＩＩ、またはクロロトキシンである、実施形態６３の組成物。６６．細胞透過部分が、配列番号７１～配列番号９６、配列番号９８～配列番号１０１、配列番号１１６～配列番号１２６、または配列番号４０３～配列番号４５５のいずれか１つである、実施形態６３の組成物。６７．ペプチドが、組織または細胞を標的とするか、ホーミングするか、蓄積するか、または選択的に透過する、実施形態１～６６のいずれか１つの組成物。６８．ペプチドが、標的細胞の核内に局在する、実施形態１～６７のいずれか１つの組成物。６９．ペプチドが、シグナルペプチドまたは部分との製剤化、融合、またはコンジュゲーションによって、標的細胞の核内に局在する、実施形態６８の組成物。７０．ペプチドが、がん性組織またはがん細胞を標的とするか、ホーミングするか、蓄積するか、または選択的に透過する部分または第２のペプチドに更にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される、実施形態１～６９のいずれか１つの組成物。７１．部分または第２のペプチドが、ノットペプチドまたはそのバリアントもしくはフラグメントである、実施形態１～７０のいずれか１つの組成物。７２．標的細胞が、がん性細胞または腫瘍細胞である、実施形態６８～７１のいずれか１つの組成物。７３．標的細胞が、ＣＮＳ細胞、赤血球、赤血球前駆細胞、免疫細胞、幹細胞、筋細胞、脳細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、骨髄細胞、虫垂細胞、リンパ節細胞、扁桃腺細胞、脾細胞、筋細胞、肝細胞、胆嚢細胞、膵細胞、消化管の細胞、腺細胞、腎細胞、膀胱細胞、内皮細胞、上皮細胞、脈絡叢上皮細胞、グリア細胞、星状膠細胞、または神経系に関連する細胞である、実施形態６８～７２のいずれか１つの組成物。７４．ペプチドが、ジスルフィドノットを介したジスルフィドを含む、実施形態１～７３のいずれか１つの組成物。７５．ペプチドが、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含む、実施形態１～７４のいずれか１つの組成物。７６．ペプチドが、システイン残基間に形成される３つ以上のジスルフィド架橋を含み、ジスルフィド架橋のうちの１つは、他の２つのジスルフィド架橋によって形成されるループを通過する、実施形態１～７５のいずれか１つの組成物。７７．ペプチドが、ジスルフィド結合もジスルフィドノットも含まない、実施形態１～７６のいずれか１つの組成物。７８．ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基がＬ立体配置であるか、少なくとも１つのアミノ酸残基がＤ立体配置である、実施形態１～７７のいずれか１つの組成物。７９．ペプチドが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の正電荷残基を含む、実施形態１～７８のいずれかの組成物。８０．ペプチドが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の連続した正電荷残基を含む、実施形態１～７９のいずれかの組成物。８１．正電荷残基が、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはこれらの任意の組み合わせである、実施形態１～８０のいずれかの組成物。８２．ペプチドがＡｒｇパッチを含む、実施形態１～８１のいずれかの組成物。８３．ペプチドが、Ｎ末端に２つ以上の連続したＡｒｇ残基を含む、実施形態１～８２のいずれかの組成物。８４．ペプチドが、Ｔａｔペプチド、またはそのフラグメントを含む、実施形態１～８３のいずれかの組成物。８５．Ｔａｔペプチドが、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９９）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１００）の配列、またはそのフラグメントもしくはバリアントを含む、実施形態８４の組成物。８６．Ｔａｔペプチドが、（ＧＳ）ｘ（配列番号１０５）またはＧｘＳｙ（配列番号１０４）の配列を有するリンカー（配列中、ｘ及びｙは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）を使用して、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加される、実施形態８４～８５のいずれかの組成物。８７．Ｔａｔペプチドが、ペプチドの任意の残基に付加される、実施形態８４～８６のいずれかの組成物。８８．ペプチドが、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６のシステイン残基を含む、実施形態１～８７のいずれか１つの組成物。８９．ペプチドが、負電荷残基の１つ以上の領域を含む、実施形態１～８８のいずれか１つの組成物。９０．ペプチドが、正電荷残基の１つ以上の領域を含む、実施形態１～８９のいずれか１つの組成物。９１．ペプチド配列が、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８の残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、または少なくとも８１のアミノ酸残基を含む、実施形態１～９０のいずれか１つの組成物。９２．ペプチドが、ヒトタンパク質またはヒトペプチドを含むか、またはそれに由来する、実施形態１～９１のいずれか１つの組成物。９３．ペプチドが、少なくとも１つの他のペプチドとの多量体構造に配置される、実施形態１～９２のいずれか１つの組成物。９４．多量体構造が、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、または七量体を含む、実施形態９３の組成物。９５．ペプチドが、約３．０～約１０．０の範囲内の等電点を有する、実施形態１～９４のいずれか１つの組成物。９６．ペプチドが、約４．５～約８．９の範囲内の等電点を有する、実施形態１～９５のいずれか１つの組成物。９７．ペプチドが、不均一な電荷分布を有する、実施形態１～９６のいずれか１つの組成物。９８．ペプチドが、生理学的または細胞内のｐＨ値で安定である、実施形態１～９７のいずれか１つの組成物。９９．ペプチドが、約７または７．５のｐＨで安定である、実施形態１～９８のいずれか１つの組成物。１００．ペプチドが、約６．５～７．５のｐＨで安定である、実施形態１～９９のいずれか１つの組成物。１０１．ペプチドが、約５．０以下、約３．０以下、または約３．０～約５．０の範囲内のｐＨ値で安定である、実施形態１～１００のいずれか１つの組成物。１０２．ペプチドが、約５．０～約７．０の範囲内のｐＨ値で安定である、実施形態１～１０１のいずれか１つの組成物。１０３．ペプチドが、疎水性コアを含む、実施形態１～１０２のいずれか１つの組成物。１０４．ペプチドが、プロテアーゼ分解に耐性がある、実施形態１～１０３のいずれか１つの組成物。１０５．プロテアーゼが、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、血清プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼのいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせである、実施形態１０４の組成物。１０６．ペプチドが、還元に耐性があるか、または還元環境で安定である、実施形態１～１０５のいずれか１つの組成物。１０７．還元または還元環境が、ＤＴＴまたはＧＳＨを含む、実施形態１０６の組成物。１０８．ペプチドが、高温で安定である、実施形態１～１０７のいずれか１つの組成物。１０９．ペプチドが、抗がん作用を示す、実施形態１～１０８のいずれか１つの組成物。１１０．ペプチドが、１つ以上の化学修飾を含む、実施形態１～１０９のいずれか１つの組成物。１１１．化学修飾が、ペプチドの１つ以上の薬物動態特性を変更する、実施形態１１０の組成物。１１２．化学修飾が、ペプチドの血漿半減期及び／または生物学的半減期を延長する、実施形態１１０～１１１のいずれか１つの組成物。１１３．化学修飾が、ペプチドのＮ末端をブロッキングすることである、実施形態１１０～１１２のいずれかの組成物。１１４．化学修飾が、メチル化、アセチル化、またはアシル化である、実施形態１１０～１１３のいずれかの組成物。１１５．化学修飾が、１つ以上のリシン残基もしくはそのアナログのメチル化；Ｎ末端のメチル化；または１つ以上のリシン残基もしくはそのアナログのメチル化及びＮ末端のメチル化である、実施形態１１０～１１４の組成物。１１６．ペプチドが、アシル付加物に連結される、実施形態１～１１５のいずれか１つの組成物。１１７．ペプチドに活性配列がグラフトされるか、または、ペプチドが、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、もしくは融合されるか、もしくはグラフトされて、ペプチドコンストラクトがもたらされる、実施形態１～１１６のいずれか１つの組成物。１１８．ペプチドコンストラクトが、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、配列番号３５９～配列番号３６１、配列番号３７３、配列番号３７５、配列番号３８１、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９３、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号４００、または配列番号４０１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態１１７の組成物。１１９．ペプチドコンストラクトが、配列番号３５９、配列番号３６０、または配列番号３６１である、実施形態１１７～１１８のいずれか１つの組成物

。１２０．活性薬剤が、ペプチドにペプチドのＮ末端またはＣ末端で、コンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される、実施形態１１７～１１９のいずれか１つの組成物。１２１．活性薬剤が、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ、一本鎖Ｆｖ、ポリペプチド、ペプチド、小分子、または核酸である、実施形態１１７～１２０のいずれか１つの組成物。１２２．核酸がＤＮＡである、実施形態１２１の組成物。１２３．核酸がＲＮＡである、実施形態１２１の組成物。１２４．１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の活性薬剤が、リンカーによって、ペプチドに連結される、実施形態１１７～１２３のいずれか１つの組成物。１２５．ペプチドが、切断可能なリンカーまたはｐＨ感受性リンカーを介して、活性薬剤に連結される、実施形態１１７～１２４のいずれか１つの組成物。１２６．ペプチドが、リンカーによって、ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のイプシロンアミンで、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、またはＣ末端で、活性薬剤に連結される、実施形態１１７～１２５のいずれか１つの組成物。１２７．非天然アミノ酸を更に含み、非天然アミノ酸は、挿入、付加、または別のアミノ酸との置換である、実施形態１１７～１２６のいずれか１つの組成物。１２８．ペプチドが、リンカーによって、非天然アミノ酸で活性薬剤に連結される、実施形態１２７の組成物。１２９．リンカーが、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、トリアゾール、大環状高分子、オキシム結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、アゾ結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、炭素－炭素単結合、二重結合、もしくは三重結合、ジスルフィド結合、２つのシステイン間の２つの炭素架橋、２つのシステイン間の３つの炭素架橋、または炭素－窒素結合を含む、実施形態１２４～１２８のいずれか１つの組成物。１３０．切断可能なリンカーが、プロテアーゼの切断部位を含む、実施形態１２５～１２９のいずれか１つの組成物。１３１．プロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ、トロンビン、カテプシン、またはベータ－グルクロニダーゼである、実施形態１３０の組成物。１３２．リンカーが加水分解的に不安定なリンカーである、実施形態１２４～１３１のいずれか１つの組成物。１３３．ペプチドが、切断不能なリンカーを介して、活性薬剤に連結される、実施形態１～１３２のいずれか１つの組成物。１３４．活性薬剤が、リンカーを介して連結され、リンカーは、表７または配列番号１０３～配列番号１１５、もしくは配列番号１２５のいずれか１つから選択される、実施形態１～１３３のいずれか１つの組成物。１３５．活性薬剤が抗がん剤である、実施形態１１７～１３４のいずれか１つの組成物。１３６．活性薬剤が、免疫治療薬、ＣＴＬＡ－４標的薬剤、ＰＤ－１標的薬剤、ＰＤＬ－１標的薬剤、ＩＬ１５薬剤、融合されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合薬剤、ＩＦＮガンマ薬剤、抗ＣＤ３薬剤、イオンチャネル調節剤、Ｋｖ１．３阻害薬、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアミシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ－３８、ＢＡＣＥ阻害薬、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害薬、ＷＥＨＩ－５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ－１９９、ナビトクラックス、ＡＴ－１０１、オバトクラックス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体、ドラスタチン、または神経伝達物質である、実施形態１１７～１３４のいずれか１つの組成物。１３７．神経伝達物質が、ニューロテンシン、ニューロテンシンペプチドバリアント、またはその機能性フラグメントである、実施形態１３６の組成物。１３８．機能性フラグメントが、少なくとも少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも６アミノ酸残基、少なくとも７アミノ酸残基、少なくとも８アミノ酸残基、少なくとも９アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１１アミノ酸残基、少なくとも１２アミノ酸残基である、実施形態１３７の組成物。１３９．ニューロテンシンペプチドバリアントが、配列番号３６５～配列番号３６９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態１３７～１３８のいずれか１つの組成物。１４０．ニューロテンシンが、配列番号３５０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。１４１．ペプチドコンストラクトが、ニューロテンシン受容体に結合し、活性化することが可能である、実施形態１１７～１４０のいずれか１つの組成物。１４２．ペプチドが、対象の疼痛のレベルを低減することが可能である、実施形態１１７～１４１のいずれか１つの組成物。１４３．ペプチドが、統合失調症、薬物乱用、パーキンソン病、高血圧、摂食障害、脳卒中、アルツハイマー病、がん、炎症、疼痛、てんかん、気分障害、または内分泌障害の患者に投与される、実施形態１１７～１４２のいずれか１つの組成物。１４４．ペプチドが、ドーパミンシグナル伝達ニューロンと相互作用する、実施形態１１７～１４３のいずれか１つの組成物。１４５．ペプチドが、ニューロンにおけるドーパミン放出を増加させる、実施形態１１７～１４４のいずれか１つの組成物。１４６．ペプチドに結合された半減期改変剤を更に含む、実施形態１～１４５のいずれか１つの組成物。１４７．半減期改変剤が、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、双極性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含有する水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸、またはアルブミンに結合する分子を含む、実施形態１４６の組成物。１４８．リンカーによってペプチドに結合された検出可能な剤を更に含む、実施形態１～１４７のいずれか１つの組成物。１４９．検出可能な剤が、ペプチドにペプチドのＮ末端またはＣ末端で、コンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される、実施形態１４８の組成物。１５０．１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の検出可能な剤が、ペプチドに連結される、実施形態１４８～１４９のいずれか１つの組成物。１５１．ペプチドが、切断可能なリンカーを介して、検出可能な剤に連結される、実施形態１４８～１５０のいずれか１つの組成物。１５２．ペプチドが、リンカーによって、ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のイプシロンアミンで、またはＣ末端で、検出可能な剤に連結される、実施形態１４８～１５１のいずれか１つの組成物。１５３．非天然アミノ酸を更に含み、非天然アミノ酸は、挿入、付加、または別のアミノ酸との置換である、実施形態１１７～１５２のいずれか１つの組成物。１５４．ペプチドが、リンカーによって、非天然アミノ酸で検出可能な剤に連結される、実施形態１４８～１５３のいずれか１つの組成物。１５５．リンカーが、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、トリアゾール、大環状高分子、オキシム結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、アゾ結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、炭素－炭素単結合、二重結合、もしくは三重結合、ジスルフィド結合、２つのシステイン間の２つの炭素架橋、２つのシステイン間の３つの炭素架橋、または炭素－窒素結合を含む、実施形態１４８～１５４のいずれか１つの組成物。１５６．切断可能なリンカーが、マトリックスメタロプロテアーゼ、トロンビン、カテプシン、またはベータ－グルクロニダーゼの切断部位を含む、実施形態１５１～１５５の組成物。１５７．ペプチドが、安定なリンカーを介して、検出可能な剤に連結される、実施形態１４８～１５０のいずれか１つの組成物。１５８．検出可能な剤が、リンカーを介して連結され、リンカーは、表７または配列番号１０３～配列番号１１５、もしくは配列番号１２５のいずれか１つから選択される、実施形態１４８～１５７のいずれか１つの組成物。１５９．検出可能な剤が、フルオロフォア、近赤外色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性核種、または放射性核種キレート剤である、実施形態１４８～１５８のいずれか１つの組成物。１６０．検出可能な剤が蛍光色素である、実施形態１４８～１５９のいずれか１つの組成物。１６１．実施形態１～１６０のいずれか１つの組成物、またはその塩と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。１６２．医薬組成物が、対象への投与のために製剤化される、実施形態１６１の医薬組成物。１６３．医薬組成物が、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、またはこれらの組み合わせのために製剤化される、実施形態１６１～１６２のいずれか１つの医薬組成物。１６４．組成物を細胞層を越えて輸送するための方法であって、ａ）組成物と細胞層を接触させることと、ｂ）組成物を細胞層を越えて輸送することとを含む、方法。１６５．組成物が、操作されたペプチドを含む、実施形態１６４の方法。１６６．ペプチドが、配列番号２０６～配列番号２２４及び配列番号３３４～配列番号３４４のいずれか１つを含むアミノ酸配列、またはその機能性フラグメントを含む、実施形態１６５の方法。１６７．ペプチドが、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合ペプチドである、実施形態１６５～１６６のいずれか１つの方法。１６８．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、及びＱ５１に対応する表面界面残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１６５～１６７のいずれか１つの方法。１６９．ペプチドが、配列番号３２を基準として、３、４、９、１１、１５、１６、１９、２３、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、及び４０に対応する１つの位置、またはこれらの任意の組み合わせに、親水性表面遠位残基を含む、実施形態１６５～１６８のいずれか１つの方法。１７０．親水性表面遠位残基が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される、実施形態１６９の方法。１７１．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、及びＤ４０に対応する親水性表面遠位残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１６９～１７０のいずれか１つの方法。１７２．ペプチドが、配列番号３２を基準として、１５、３５、３９、もしくは４９に対応する位置のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに、親水性残基を含む、実施形態１６５～１７１のいずれか１つの方法。１７３．親水性残基が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される、実施形態１７２の組成物。１７４．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、及びＨ４９に対応する親水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１７２～１７３のいずれか１つの方法。１７５．ペプチドが、配列番号３２を基準として、１１、２５、もしくは２７に対応する位置のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせに、疎水性残基を含む、実施形態１６５～１７４のいずれか１つの方法。１７６．疎水性残基が、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、もしくはＹ、またはこれらの任意の組み合わせから選択される、実施形態１７５の方法。１７７．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｍ１１、Ｍ２５、Ｍ２７に対応する疎水性残基の

いずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１７５～１７６のいずれか１つの方法。１７８．ペプチドが、配列番号３２を基準として、位置４５に対応する脂肪族残基を含む、実施形態１６５～１７７のいずれか１つの方法。１７９．脂肪族残基が、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから選択される、実施形態１７８の方法。１８０．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｌ４５に対応する脂肪族残基を含む、実施形態１７８～１７９のいずれか１つの方法。１８１．ペプチドが、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも５つのジスルフィド結合を含む、実施形態１６５～１７０のいずれか１つの方法。１８２．ペプチドが、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む、実施形態１６５～１８１のいずれか１つの方法。１８３．ペプチドが、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つの配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む、実施形態１６５～１８２のいずれか１つの方法。１８４．ペプチドが、標的細胞を透過するか、または標的細胞内もしくは標的細胞上に局在する、実施形態１６５～１８３のいずれか１つの方法。１８５．ペプチドに活性配列がグラフトされるか、または、ペプチドが、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、もしくは融合されるか、もしくはグラフトされて、ペプチドコンストラクトがもたらされる、実施形態１６５～１８４のいずれか１つの方法。１８６．ペプチドが、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される、実施形態１８５の方法。１８７．活性薬剤が、リンカーを介して連結され、リンカーは、表７または配列番号１０３～配列番号１１５、もしくは配列番号１２５のいずれか１つから選択される、実施形態１８５または１８６の方法。１８８．活性薬剤が、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ、一本鎖Ｆｖ、ポリペプチド、ペプチド、小分子、または核酸である、実施形態１８５～１８７のいずれか１つの方法。１８９．ペプチドコンストラクトが、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、配列番号３５９～配列番号３６１、配列番号３７３、配列番号３７５、配列番号３８１、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９３、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号４００、または配列番号４０１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態１８５～１８８のいずれか１つの方法。１９０．ペプチドコンストラクトが、配列番号３５９、配列番号３６０、または配列番号３６１である、実施形態１８５～１８９のいずれか１つの方法。１９１．活性薬剤が、免疫治療薬、ＣＴＬＡ－４標的薬剤、ＰＤ－１標的薬剤、ＰＤＬ－１標的薬剤、ＩＬ１５薬剤、融合されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合薬剤、ＩＦＮガンマ薬剤、抗ＣＤ３薬剤、イオンチャネル調節剤、Ｋｖ１．３阻害薬、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアミシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ－３８、ＢＡＣＥ阻害薬、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害薬、ＷＥＨＩ－５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ－１９９、ナビトクラックス、ＡＴ－１０１、オバトクラックス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体、ドラスタチン、または神経伝達物質である、実施形態１８５～１９０のいずれか１つの方法。１９２．神経伝達物質が、ニューロテンシン、ニューロテンシンペプチドバリアント、またはその機能性フラグメントである、実施形態１９１の方法。１９３．機能性フラグメントが、少なくとも少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも６アミノ酸残基、少なくとも７アミノ酸残基、少なくとも８アミノ酸残基、少なくとも９アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１１アミノ酸残基、少なくとも１２アミノ酸残基である、実施形態１９２の方法。１９４．ニューロテンシンペプチドバリアントが、配列番号３６５～配列番号３６９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態１９２～１９３のいずれか１つの方法。１９５．ニューロテンシンが、配列番号３５０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態１９２～１９４のいずれか１つの方法。１９６．ペプチドコンストラクトが、ニューロテンシン受容体に結合し、活性化することが可能である、実施形態１８５～１９５のいずれか１つの方法。１９７．ペプチドが、対象への投与により、疼痛のレベルを低減することが可能である、実施形態１６５～１９６のいずれか１つの方法。１９８．ペプチドが、統合失調症、薬物乱用、パーキンソン病、高血圧、摂食障害、脳卒中、アルツハイマー病、がん、炎症、疼痛、てんかん、気分障害、または内分泌障害の患者に投与される、実施形態１６５～１９７のいずれか１つの方法。１９９．ペプチドが、ドーパミンシグナル伝達ニューロンと相互作用する、実施形態１６５～１９８のいずれか１つの方法。２００．ペプチドが、ニューロンにおけるドーパミン放出を増加させる、実施形態１６５～１９９のいずれか１つの方法。２０１．ペプチドが、細胞透過部分と更に製剤化、融合、またはコンジュゲートされる、実施形態１６５～２００のいずれか１つの方法。２０２．細胞層が、内皮細胞層または上皮細胞層である、実施形態１６４～２０１のいずれか１つの方法。２０３．内皮細胞層が、血液脳関門である、実施形態２０２の方法。２０４．内皮細胞層が、腸管内皮細胞層である、実施形態２０２の方法。２０５．上皮細胞層が、腸管上皮細胞層である、実施形態２０２の方法。２０６．輸送することが、組成物のＴｆＲへの結合を含む、実施形態１６４～２０５のいずれか１つの方法。２０７．輸送することが、トランスサイトーシスを更に含む、実施形態１６４～２０６のいずれか１つの方法。２０８．トランスサイトーシスが小胞性トランスサイトーシスである、実施形態２０７の方法。２０９．トランスサイトーシスがＴｆＲ媒介性である、実施形態２０７～２０８のいずれか１つの方法。２１０．輸送することが、組成物のＴｆＲからの解離を更に含む、実施形態２０９の方法。２１１．状態を治療することを、それを必要とする対象に行うための方法であって、ａ）対象に組成物を投与することと、ｂ）組成物を細胞層を越えて輸送することとを含む、方法。２１２．組成物が、操作されたペプチドを含む、実施形態２１１の方法。２１３．ペプチドが、配列番号２０６～配列番号２２４及び配列番号３３４～配列番号３４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態２１２の方法。２１４．ペプチドが、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合ペプチドである、実施形態２１２～２１３のいずれか１つの方法。２１５．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、及びＱ５１に対応する表面界面残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２１２～２１４のいずれか１つの方法。２１６．ペプチドが、配列番号３２を基準として、３、４、９、１１、１５、１６、１９、２３、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、及び４０に対応する位置のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに、親水性表面遠位残基を含む、実施形態２１２～２１５のいずれか１つの方法。２１７．親水性表面遠位残基が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される、実施形態２１６の方法。２１８．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、及びＤ４０に対応する親水性表面遠位残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２１６～２１７のいずれか１つの方法。２１９．ペプチドが、配列番号３２を基準として、１５、３５、３９、もしくは４９に対応する位置のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに、親水性残基を含む、実施形態２１２～２１８のいずれか１つの方法。２２０．親水性残基が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される、実施形態２１９の組成物。２２１．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、及びＨ４９に対応する親水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２１９～２２０のいずれか１つの方法。２２２．ペプチドが、配列番号３２を基準として、１１、２５、もしくは２７に対応する位置のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせに、疎水性残基を含む、実施形態２１２～２２１のいずれか１つの方法。２２３．疎水性残基が、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、もしくはＹ、またはこれらの任意の組み合わせから選択される、実施形態２２２の方法。２２４．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｍ１１、Ｍ２５、Ｍ２７に対応する疎水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２２１～２２３のいずれか１つの方法。２２５．ペプチドが、配列番号３２を基準として、位置４５に対応する脂肪族残基を含む、実施形態２１２～２２４のいずれか１つの方法。２２６．脂肪族残基が、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから選択される、実施形態２２５の方法。２２７．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｌ４５に対応する脂肪族残基を含む、実施形態２２５～２２６のいずれか１つの方法。２２８．ペプチドが、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも５つのジスルフィド結合を含む、実施形態２１２～２２７のいずれか１つの方法。２２９．ペプチドが、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む、実施形態２１２～２２８のいずれか１つの方法。２３０．ペプチドが、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つの配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む、実施形態２１２～２２９のいずれか１つの方法。２３１．ペプチドが、標的

細胞を透過するか、または標細胞内に局在する、実施形態２１２～２３０のいずれか１つの方法。２３２．ペプチドに活性配列がグラフトされるか、または、ペプチドが、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、もしくは融合されるか、もしくはグラフトされて、ペプチドコンストラクトがもたらされる、実施形態２１２～２３１のいずれか１つの方法。２３３．ペプチドが、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される、実施形態２３２の方法。２３４．活性薬剤が、リンカーを介して連結され、リンカーは、表７または配列番号１０３～配列番号１１５、もしくは配列番号１２５のいずれか１つから選択される、実施形態２３２または２３３の方法。２３５．活性薬剤が、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ、一本鎖Ｆｖ、ポリペプチド、ペプチド、小分子、または核酸である、実施形態２３２～２３４のいずれか１つの方法。２３６．ペプチドコンストラクトが、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、配列番号３５９～配列番号３６１、配列番号３７３、配列番号３７５、配列番号３８１、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９３、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号４００、または配列番号４０１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態２３２～２３５のいずれか１つの方法。２３７．ペプチドコンストラクトが、配列番号３５９、配列番号３６０、または配列番号３６１である、実施形態２３２～２３６のいずれか１つの方法。２３８．活性薬剤が、免疫治療薬、ＣＴＬＡ－４標的薬剤、ＰＤ－１標的薬剤、ＰＤＬ－１標的薬剤、ＩＬ１５薬剤、融合されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合薬剤、ＩＦＮガンマ薬剤、抗ＣＤ３薬剤、イオンチャネル調節剤、Ｋｖ１．３阻害薬、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアミシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ－３８、ＢＡＣＥ阻害薬、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害薬、ＷＥＨＩ－５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ－１９９、ナビトクラックス、ＡＴ－１０１、オバトクラックス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体、ドラスタチン、または神経伝達物質である、実施形態２３２～２３７のいずれか１つの方法。２３９．神経伝達物質が、ニューロテンシン、ニューロテンシンペプチドバリアント、またはその機能性フラグメントである、実施形態２３８の方法。２４０．機能性フラグメントが、少なくとも少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも６アミノ酸残基、少なくとも７アミノ酸残基、少なくとも８アミノ酸残基、少なくとも９アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１１アミノ酸残基、少なくとも１２アミノ酸残基である、実施形態２３９の方法。２４１．ニューロテンシンペプチドバリアントが、配列番号３６５～配列番号３６９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態２３９～２４０のいずれか１つの方法。２４２．ニューロテンシンが、配列番号３５０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態２３９～２４１のいずれか１つの方法。２４３．ペプチドコンストラクトが、ニューロテンシン受容体に結合し、活性化することが可能である、実施形態２３２～２４２のいずれか１つの方法。２４４．ペプチドが、対象への投与により、疼痛のレベルを低減することが可能である、実施形態２３２～２４３のいずれか１つの方法。２４５．ペプチドが、統合失調症、薬物乱用、パーキンソン病、高血圧、摂食障害、脳卒中、アルツハイマー病、がん、炎症、疼痛、てんかん、気分障害、または内分泌障害の患者に投与される、実施形態２１２～２４４のいずれか１つの方法。２４６．ペプチドが、ドーパミンシグナル伝達ニューロンと相互作用する、実施形態２１２～２４５のいずれか１つの方法。２４７．ペプチドが、ニューロンにおけるドーパミン放出を増加させる、実施形態２１２～２４６のいずれか１つの方法。２４８．ペプチドが、細胞透過部分と更に製剤化、融合、またはコンジュゲートされる、実施形態２１２～２４７のいずれか１つの方法。２４９．細胞層が、内皮細胞層または上皮細胞層である、実施形態２１２～２４８のいずれか１つの方法。２５０．内皮細胞層が、血液脳関門である、実施形態２４９の方法。２５１．内皮細胞層が、腸管内皮細胞層である、実施形態２４９の方法。２５２．上皮細胞層が、腸管上皮細胞層である、実施形態２４９の方法。２５３．輸送することが、組成物のＴｆＲへの結合を含む、実施形態２１１～２５２のいずれか１つの方法。２５４．輸送することが、トランスサイトーシスを更に含む、実施形態２１１～２５３のいずれか１つの方法。２５５．トランスサイトーシスが小胞性トランスサイトーシスである、実施形態２５４の方法。２５６．トランスサイトーシスがＴｆＲ媒介性である、実施形態２５４～２５５のいずれか１つの方法。２５７．輸送することが、組成物のＴｆＲからの解離を更に含む、実施形態２５３～２５６のいずれか１つの方法。２５８．輸送することが、組成物から活性薬剤を放出することを更に含む、実施形態２５３～２５７のいずれか１つの方法。２５９．状態を治療することを、それを必要とする対象に行う方法であって、対象におけるＴｆＲの発現に基づいて、ある量の組成物を対象に投与することを含む、方法。２６０．組成物が、操作されたペプチドを含む、実施形態２５９の方法。２６１．ペプチドが、配列番号２０６～配列番号２２４及び配列番号３３４～配列番号３４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態２５０の方法。２６２．ペプチドが、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合ペプチドである、実施形態２６０～２６１のいずれか１つの方法。２６３．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、及びＱ５１に対応する表面界面残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２６０～２６２のいずれか１つの方法。２６４．ペプチドが、配列番号３２を基準として、３、４、９、１１、１５、１６、１９、２３、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、及び４０に対応する位置のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに、親水性表面遠位残基を含む、実施形態２６０～２６３のいずれか１つの方法。２６５．親水性表面遠位残基が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される、実施形態２６４の方法。２６６．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、及びＤ４０に対応する親水性表面遠位残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２６４～２６５のいずれか１つの方法。２６７．ペプチドが、配列番号３２を基準として、１５、３５、３９、もしくは４９に対応する位置のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに、親水性残基を含む、実施形態２６０～２６６のいずれか１つの方法。２６８．親水性残基が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される、実施形態２６７の組成物。２６９．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、及びＨ４９に対応する親水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２６０～２６８のいずれか１つの方法。２７０．ペプチドが、配列番号３２を基準として、１１、２５、もしくは２７に対応する位置のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせに、疎水性残基を含む、実施形態２６０～２６９のいずれか１つの方法。２７１．疎水性残基が、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、もしくはＹ、またはこれらの任意の組み合わせから選択される、実施形態２７０の方法。２７２．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｍ１１、Ｍ２５、Ｍ２７に対応する疎水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２７０～２７１のいずれか１つの方法。２７３．ペプチドが、配列番号３２を基準として、位置４５に対応する脂肪族残基を含む、実施形態２６０～２７２のいずれか１つの方法。２７４．脂肪族残基が、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから選択される、実施形態２７３の方法。２７５．ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｌ４５に対応する脂肪族残基を含む、実施形態２７３～２７４のいずれか１つの方法。２７６．ペプチドが、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも５つのジスルフィド結合を含む、実施形態２６０～２７５のいずれか１つの方法。２７７．ペプチドが、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む、実施形態２６０～２７６のいずれか１つの方法。２７８．ペプチドが、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つの配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む、実施形態２６０～２７７のいずれか１つの方法。２７９．ペプチドが、標的細胞を透過するか、または標細胞内に局在する、実施形態２６０～２７８のいずれか１つの方法。２８０．ペプチドに活性配列がグラフトされるか、または、ペプチドが、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、もしくは融合されるか、もしくはグラフトされて、ペプチドコンストラクトがもたらされる、実施形態２６０～２７９のいずれか１つの方法。２８１．ペプチドが、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される、実施形態２８０の方法。２８２．活性薬剤が、リンカーを介して連結され、リンカーは、表７または配列番号１０３～配列番号１１５、もしくは配列番号１２５のいずれか１つから選択される、実施形態２８０または２８１の方法。２８３．活性薬剤が、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ、一本鎖Ｆｖ、ポリペプチド、ペプチド、小分子、または核酸である、実施形態２８０～２８２のいずれか１つの方法。２８４．ペプチドコンストラクトが、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、配列番号３５９～配列番号３６１、配列番号３７３、配列番号３７５、配列番号３８１、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９３、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号４００、または配列番号４０１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９

７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態２８０～２８３のいずれか１つの方法。２８５．ペプチドコンストラクトが、配列番号３５９、配列番号３６０、または配列番号３６１である、実施形態２８０～２８４のいずれか１つの方法。２８６．活性薬剤が、免疫治療薬、ＣＴＬＡ－４標的薬剤、ＰＤ－１標的薬剤、ＰＤＬ－１標的薬剤、ＩＬ１５薬剤、融合されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合薬剤、ＩＦＮガンマ薬剤、抗ＣＤ３薬剤、イオンチャネル調節剤、Ｋｖ１．３阻害薬、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアミシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ－３８、ＢＡＣＥ阻害薬、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害薬、ＷＥＨＩ－５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ－１９９、ナビトクラックス、ＡＴ－１０１、オバトクラックス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体、ドラスタチン、または神経伝達物質である、実施形態２８０～２８５のいずれか１つの方法。２８７．神経伝達物質が、ニューロテンシン、ニューロテンシンペプチドバリアント、またはその機能性フラグメントである、実施形態２８６の方法。２８８．機能性フラグメントが、少なくとも少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも６アミノ酸残基、少なくとも７アミノ酸残基、少なくとも８アミノ酸残基、少なくとも９アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１１アミノ酸残基、少なくとも１２アミノ酸残基である、実施形態２８７の方法。２８９．ニューロテンシンペプチドバリアントが、配列番号３６５～配列番号３６９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態２８７～２８８のいずれか１つの方法。２９０．ニューロテンシンが、配列番号３５０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態２８７～２８９のいずれか１つの方法。２９１．ペプチドコンストラクトが、ニューロテンシン受容体に結合し、活性化することが可能である、実施形態２８０～２９０のいずれか１つの方法。２９２．ペプチドが、対象への投与により、疼痛のレベルを低減することが可能である、実施形態２６０～２９１のいずれか１つの方法。２９３．ペプチドが、統合失調症、薬物乱用、パーキンソン病、高血圧、摂食障害、脳卒中、アルツハイマー病、がん、炎症、疼痛、てんかん、気分障害、または内分泌障害の患者に投与される、実施形態２６０～２９２のいずれか１つの方法。２９４．ペプチドが、ドーパミンシグナル伝達ニューロンと相互作用する、実施形態２６０～２９３のいずれか１つの方法。２９５．ペプチドが、ニューロンにおけるドーパミン放出を増加させる、実施形態２６０～２９４のいずれか１つの方法。２９６．ペプチドが、細胞透過部分と更に製剤化、融合、またはコンジュゲートされる、実施形態２６０～２９５のいずれか１つの方法。２９７．組成物が、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、髄腔内、またはこれらの組み合わせで投与される、実施形態２５９～２９６のいずれか１つの方法。２９８．組成物が、ボーラス、注入、または持続注入として、静脈内投与される、実施形態２５９～２９７のいずれか１つの方法。２９９．組成物または医薬組成物が、１日に複数回、１日２回、１日１回、週２回、週３回、週１回、２週に１回、または月１回もしくは３ヶ月に１回投与される、実施形態２５９～２９８のいずれか１つの方法。３００．組成物が、１日１回、週１回、または月１回、皮下投与される、実施形態２５９～２９６９のいずれか１つの方法。３０１．状態が、がんである、実施形態２５９～３００のいずれか１つの方法。３０２．がんが、卵巣癌、結腸癌、肺癌、骨もしくは骨髄に位置する癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、脾癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、骨髄細胞癌、皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはＣＭＹＣ過剰発現癌である、実施形態３０１の方法。３０３．状態が、脳癌である、実施形態２５９～３０２のいずれか１つの方法。３０４．脳癌が、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、またはびまん性内在性橋膠腫である、実施形態３０３の方法。３０５．状態が、ＣＮＳの疾患である、実施形態２５９～３０４のいずれか１つの方法。３０６．ＣＮＳの疾患が、神経炎症性または神経変性疾患である、実施形態３０５の方法。３０７．神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、ライム病、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳失調症、バッテン病、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、クフォー・ラケブ症候群、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、慢性外傷性脳症、または前頭側頭型認知症である、実施形態３０６の方法。３０８．状態が、神経障害性疼痛、片頭痛、不安、またはてんかんである、実施形態２５９～３０２のいずれか１つの方法。３０９．状態が、慢性疼痛、急性疼痛、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、アロディニア、幻痛、内臓痛、または突出痛である、実施形態２５９～３０２または３０８のいずれか１つの方法。３１０．状態が、慢性疼痛、急性疼痛、損傷、機械的疼痛、熱痛、冷痛、虚血痛、及び化学物質誘発性疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛症関連疼痛、関節炎疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後痛、外傷後痛、緊張型頭痛、産科疼痛、婦人科疼痛、または化学療法誘発性疼痛、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、アロディニア、幻痛、内臓痛、突出痛、家族性エピソード性疼痛症候群、発作性激痛症、先天性無痛覚症、オピオイド離脱関連疼痛である、実施形態２５９～３０２または３０８～３０９のいずれか１つの方法。３１１．状態が、筋ジストロフィー、または球脊髄性筋ジストロフィー（ＳＢＭＡ）である、実施形態２５９～３１０のいずれか１つの方法。３１２．状態が炎症性腸疾患である、実施形態２５９～３１１のいずれか１つの方法。３１３．炎症性腸疾患がクローン病である、実施形態３１２の方法。３１４．実施形態１～３１３のいずれか１つに記載の組成物を細胞層を越えて輸送するための方法であって、組成物と細胞層を接触させることと、組成物を細胞層を越えて輸送することとを含む、方法。３１５．細胞層が、内皮細胞層または上皮細胞層である、実施形態３１４の方法。３１６．内皮細胞層が、血液脳関門である、実施形態３１４～３１５のいずれか１つの方法。３１７．内皮細胞層が、腸管内皮細胞層である、実施形態３１４～３１５のいずれか１つの方法。３１８．上皮細胞層が、腸管上皮細胞層である、実施形態３１７の方法。３１９．輸送することが、組成物のＴｆＲへの結合を含む、実施形態３１４～３１８のいずれか１つの方法。３２０．輸送することが、トランスサイトーシスを更に含む、実施形態３１４～３１９のいずれか１つの方法。３２１．トランスサイトーシスが小胞性トランスサイトーシスである、実施形態３２０の方法。３２２．トランスサイトーシスがＴｆＲ媒介性である、実施形態３２０～３２１のいずれか１つの方法。３２３．輸送することが、組成物のＴｆＲからの解離を更に含む、実施形態３１９～３１９のいずれか１つの方法。３２４．輸送することが、組成物から活性薬剤を放出することを更に含む、実施形態３１４～３２３のいずれか１つの方法。３２５．状態を治療することを、それを必要とする対象に行う方法であって、実施形態１～１６３のいずれか１つの組成物または実施形態１６４～３２４のいずれか１つの医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。３２６．組成物が、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、髄腔内、またはこれらの組み合わせで投与される、実施形態３２５の方法。３２７．組成物が、ボーラス、注入、または持続注入として、静脈内投与される、実施形態３２５～３２６のいずれか１つの方法。３２８．組成物または医薬組成物が、１日に複数回、１日２回、１日１回、週２回、週３回、週１回、２週に１回、または月１回もしくは３ヶ月に１回投与される、実施形態３２５～３２７のいずれか１つの方法。３２９．組成物が、１日１回、週１回、または月１回、皮下投与される、実施形態３２５～３２８のいずれか１つの方法。３３０．状態が、がんである、実施形態３２５～３２９のいずれか１つの方法。３３１．がんが、卵巣癌、結腸癌、肺癌、骨もしくは骨髄に位置する癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、脾癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、骨髄細胞癌、皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはＣＭＹＣ過剰発現癌である、実施形態３３０の方法。３３２．状態が、脳癌である、実施形態３２５～３３１のいずれか１つの方法。３３３．脳癌が、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、またはびまん性内在性橋膠腫である、実施形態３３２の方法。３３４．状態が、ＣＮＳの疾患である、実施形態３２５～３２９のいずれか１つの方法。３３５．ＣＮＳの状態が、神経炎症性または神経変性疾患である、実施形態３３４の方法。３３６．神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、ライム病、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳失調症、バッテン病、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、クフォー・ラケブ症候群、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、慢性外傷性脳症、または前頭側頭型認知症である、実施形態３３５の方法。３３７．状態が、神経障害性疼痛、片頭痛、不安、またはてんかんである、実施形態３２５～３２９のいずれか１つの方法。３３８．状態が、慢性疼痛、急性疼痛、損傷、機械的疼痛、熱痛、冷痛、虚血痛、及び化学物質誘発性疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛症関連疼痛、関節炎疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後痛、外傷後痛、緊張型頭痛、産科疼痛、婦人科疼痛、または化学療法誘発性疼痛、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、アロディニア、幻痛、内臓痛、突出痛、家族性エピソード性疼痛症候群、発作性激痛症、先天性無痛覚症、オピオイド離脱関連疼痛である、実施形態３２５～３２９のいずれか１つの方法。３３９．状態が、筋ジストロフィー、または球脊髄性筋ジストロフィー（ＳＢＭＡ）である、実施形態３２５～３２９のいずれか１つの方法。３４０．状態が炎症性腸疾患である、実施形態３０１～３０５のいずれか１つの方法。３４１．炎症性腸疾患がクローン病である、実施形態３４０の方法。３４２．組成物を細胞層を越えて輸送することを更に含む、実施形態３２５～３４１のいずれか１つの方法。３４３．細胞層が、内皮細胞層または上皮細胞層である、実施形態３４２の方法。３４４．内皮細胞層が、血液脳関門

である、実施形態３４２～３４３のいずれか１つの方法。３４５．内皮細胞層が、腸管内皮細胞層である、実施形態３４２～３４４のいずれか１つの方法。３４６．上皮細胞層が、腸管上皮細胞層である、実施形態３４０の方法。３４７．輸送することが、組成物のＴｆＲへの結合を含む、実施形態３２５～３４６のいずれか１つの方法。３４８．輸送することが、トランスサイトーシスを更に含む、実施形態３２５～３４７のいずれか１つの方法。３４９．トランスサイトーシスが小胞性トランスサイトーシスである、実施形態３４８の方法。３５０．トランスサイトーシスがＴｆＲ媒介性である、実施形態３４８～３４９のいずれか１つの方法。３５１．輸送することが、組成物のＴｆＲからの解離を更に含む、実施形態３４７～３５０のいずれか１つの方法。３５２．輸送することが、組成物から活性薬剤を放出することを更に含む、実施形態３２５～３５１のいずれか１つの方法。３５３．状態を治療することを、それを必要とする対象に行うための方法であって、対象の組織におけるＴｆＲの発現に依存するある量の実施形態１６４～２５３のいずれか１つの組成物または実施形態１６１～１６３のいずれか１つの医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。３５４．組成物が、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、髄腔内、またはこれらの組み合わせで投与される、実施形態３５３の方法。３５５．組成物が、ボーラス、注入、または持続注入として、静脈内投与される、実施形態３５３～３５４のいずれか１つの方法。３５６．組成物または医薬組成物が、１日に複数回、１日２回、１日１回、週２回、週３回、週１回、２週に１回、または月１回もしくは３ヶ月に１回投与される、実施形態３５３～３５５のいずれか１つの方法。３５７．組成物が、１日１回、週１回、または月１回、皮下投与される、実施形態３５３～３５６のいずれか１つの方法。３５８．状態が、がんである、実施形態３５３～３５７のいずれか１つの方法。３５９．対象の組織が、がん性組織である、実施形態３５４～３５８のいずれか１つの方法。３６０．がんが、卵巣癌、結腸癌、肺癌、骨もしくは骨髄に位置する癌、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、脾癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、骨髄細胞癌、皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはＣＭＹＣ過剰発現癌である、実施形態３５８の方法。３６１．状態が、脳癌である、実施形態３５３～３６０のいずれか１つの方法。３６２．脳癌が、膠芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、またはびまん性内在性橋膠腫である、実施形態３６１の方法。３６３．状態が、ＣＮＳの疾患である、実施形態３５３～３５７のいずれか１つの方法。３６４．ＣＮＳの疾患が、神経炎症性または神経変性疾患である、実施形態３６３の方法。３６５．神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、ライム病、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳失調症、バッテン病、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、クフォー・ラケブ症候群、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、慢性外傷性脳症、または前頭側頭型認知症である、実施形態３６４の方法。３６６．状態が、神経障害性疼痛、片頭痛、不安、またはてんかんである、実施形態３５３～３６５のいずれか１つの方法。３６７．状態が、慢性疼痛、急性疼痛、損傷、機械的疼痛、熱痛、冷痛、虚血痛、及び化学物質誘発性疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛症関連疼痛、関節炎疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後痛、外傷後痛、緊張型頭痛、産科疼痛、婦人科疼痛、または化学療法誘発性疼痛、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、アロディニア、幻痛、内臓痛、突出痛、家族性エピソード性疼痛症候群、発作性激痛症、先天性無痛覚症、オピオイド離脱関連疼痛である、実施形態３５３～３６６のいずれか１つの方法。３６８．状態が、筋ジストロフィー、または球脊髄性筋ジストロフィー（ＳＢＭＡ）である、実施形態３５３～３６７のいずれか１つの方法。３６９．状態が炎症性腸疾患である、実施形態３５３～３６７のいずれか１つの方法。３７０．炎症性腸疾患がクローン病である、実施形態３６９の方法。３７１．組成物を細胞層を越えて輸送することを更に含む、実施形態３５３～３７０のいずれか１つの方法。３７２．細胞層が、内皮細胞層または上皮細胞層である、実施形態３７１の方法。３７３．内皮細胞層が、血液脳関門である、実施形態３７２の方法。３７４．内皮細胞層が、腸管内皮細胞層である、実施形態３７２～３７３のいずれか１つの方法。３７５．上皮細胞層が、腸管上皮細胞層である、実施形態３７２～３７３のいずれか１つの方法。３７６．輸送することが、組成物のＴｆＲへの結合を含む、実施形態３７１～３７５のいずれか１つの方法。３７７．輸送することが、トランスサイトーシスを更に含む、実施形態３７１～３７６のいずれか１つの方法。３７８．トランスサイトーシスが小胞性トランスサイトーシスである、実施形態３７７の方法。３７９．トランスサイトーシスがＴｆＲ媒介性である、実施形態３７７～３７８のいずれか１つの方法。３８０．輸送することが、組成物のＴｆＲからの解離を更に含む、実施形態３７１～３７９のいずれか１つの方法。３８１．輸送することが、組成物から活性薬剤を放出することを更に含む、実施形態３７１～３８０のいずれか１つの方法。３８２．ＴｆＲ結合ペプチドを設計するための方法であって、ａ）コンピュータープログラムを使用して、安定性及びフォールディングが最適化されたペプチドをペプチドのライブラリーから特定することであって、ペプチドのライブラリーの各ペプチドは、少なくとも３つの分子内ジスルフィド結合を含む、特定することと、ｂ）コンピュータープログラムを使用して、ペプチド：ＴｆＲ複合体の結合パッチのアミノ酸残基を重ね合わせ、結合パッチをペプチド上にグラフトした後、ＴｆＲに結合する安定なペプチドを決定することと、ｃ）結合パッチをペプチド上にグラフトして、安定なペプチドを生成することとを含む、方法。３８３．部位飽和変異導入を実施して、安定なペプチドよりもＴｆＲに対する結合親和性が高い変異ペプチドを得ることを更に含む、実施形態３８２の方法。３８４．ペプチドのライブラリーのペプチドが、２０～７５アミノ酸残基長である、実施形態３８２～３８３の方法。３８５．ニューロテンシンが、配列番号３５０、配列番号３６５～配列番号３７１のいずれか１つ、またはその機能性フラグメントを含む、実施形態１３７～１４５のいずれか１つの組成物。３８６．ニューロテンシンが、配列番号３５０、配列番号３６５～配列番号３７１のいずれか１つ、またはその機能性フラグメントを含む、実施形態１９２～２００のいずれか１つの方法。３８７．ニューロテンシンが、配列番号３５０、配列番号３６５～配列番号３７１のいずれか１つ、またはその機能性フラグメントを含む、実施形態２３９～２４７のいずれか１つの方法。３８８．ニューロテンシンが、配列番号３５０、配列番号３６５～配列番号３７１のいずれか１つ、またはその機能性フラグメントを含む、実施形態２８７～２９５のいずれか１つの方法。３８９．Ｋｖ１．３阻害薬が、Ｖｍ２４、ＳｈＫ－１７０、ＳｈＫ－１８６、またはＳｈＫ－１９２である、実施形態１３６～１６３のいずれか１つの組成物。３９０．Ｖｍ２４が、配列番号３７８または配列番号３９１の配列を有する、実施形態３８９の組成物。３９１．Ｓｈｋ－１８５が、配列番号３７９、配列番号３９０、または配列番号４０２の配列を有する、実施形態３８９の組成物。３９２．半減期改変剤がＳＡ２１を含む、実施形態１４８～１６３のいずれか１つの組成物。３９３．ＳＡ２１が、配列番号３７６または配列番号３７７の配列を有する、実施形態３９２の組成物。３９４．Ｋｖ１．３阻害薬が、Ｖｍ２４、ＳｈＫ－１７０、ＳｈＫ－１８６、またはＳｈＫ－１９２である、実施形態１９１～２１０、２３８～２５８、または２８６～３１３のいずれか１つの方法。３９５．Ｖｍ２４が、配列番号３７８または配列番号３９１を含む、実施形態３９４の方法。３９６．Ｓｈｋ－１８５が、配列番号３７９、配列番号３９０、または配列番号４０２を含む、実施形態３９４の方法。３９７．ペプチドに結合された半減期改変剤を更に含む、実施形態１６５～２１０、２１３～２５８、または２６１～３８１のいずれか１つの方法。３９８．半減期改変剤が、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、双極性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含有する水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸、またはアルブミンに結合する分子を含む、実施形態３９７の方法。３９９．半減期改変剤がＳＡ２１を含む、実施形態３９７の方法。４００．ＳＡ２１が、配列番号３７６または配列番号３７７を含む、実施形態３９９の方法。４０１．ペプチドが、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬よりも広い治療濃度域を有する、実施形態１～１６３、３８５、または３８９～３９３のいずれか１つの組成物。４０２．より広い治療濃度域が、治療上の薬力学応答が観察される量を上回るが、毒性が観察される量を下回る投与量である、実施形態４０１の組成物。４０３．ペプチドが、対象に同じモル用量で投与された場合、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬よりも、低いオンターゲット毒性、低いオフターゲット毒性、またはこれらの組み合わせを有する、実施形態１～１６３、３８５、３８９～３９３、４０１、または４０２のいずれか１つの組成物。４０４．ペプチドが、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬よりも広い治療濃度域を有する、実施形態１６５～２１０、２１２～２５８、２６０～３８４、３８６～３８８、または３９４～４００のいずれか１つの方法。４０５．より広い治療濃度域が、治療上の薬力学応答が観察される量を上回るが、毒性が観察される量を下回る投与量である、実施形態４０４の方法。４０６．ペプチドが、対象に同じモル用量で投与された場合、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬よりも、低いオンターゲット毒性または低いオフターゲット毒性を有する、実施形態１６５～２１０、２１２～２５８、２６０～３８４、３８６～３８８、３９４～４００、４０４、または４０５のいずれか１つの方法。

以下の実施例は、本開示のいくつかの態様を更に説明するために含まれるものであり、本発明の範囲を限定するために使用されるべきではない。

実施例１
ペプチド製造
この実施例は、本明細書に記載されるペプチド及びペプチドコンストラクト（例えば、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ）の製造について記載する。タンパク質由来のペプチドは、公開されている方法論を使用して、哺乳動物細胞培養で生成した。（Ａ．Ｄ．Ｂａｎｄａｒａｎａｙｋｅ，Ｃ．Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｂ．Ｙ．Ｒｙｕ，Ｍ．Ｂｒａｕｌｔ，Ｒ．Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ，Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ．２０１１．Ｄａｅｄａｌｕｓ：ａｒｏｂｕｓｔ，ｔｕｒｎｋｅｙｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｒａｐｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｅｃｉｇｒａｍｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆａｃｔｉｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓｕｓｉｎｇｎｏｖｅｌｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ．（３９）２１，ｅ１４３）。

標準的な分子生物学技術を使用して、ペプチド配列をＤＮＡに逆翻訳し、合成し、シデロカリンとインフレームでクローニングした（Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，ＪｏｓｅｐｈＳａｍｂｒｏｏｋ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．２０１２ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）。得られたコンストラクトをレンチウイルスにパッケージングし、ＨＥＫ－２９３細胞に形質導入し、拡大させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって単離し、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼで切断し、均質になるまで逆相クロマトグラフィーによって精製した。精製後、各ペプチドを凍結乾燥させ、凍結保存した。

実施例２
哺乳動物発現系を使用したペプチド発現
本実施例は、哺乳動物発現系を使用したペプチド及びペプチドコンストラクトの発現について記載する。ペプチドは、Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０１１Ｎｏｖ；３９（２１）：ｅ１４３に記載されている方法に従って発現させた。ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ）を、タバコエッチウイルスプロテアーゼを使用してシデロカリンから切断し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によってアセトニトリル及び０．１％ＴＦＡを含む水のグラジエントで精製し、次いで、その後の使用のために等分し、凍結乾燥させた。分子量を質量分析によって確認した。

スクリーニング方法論を最適化及び検証するために、また、ＴｆＲ結合ペプチドを特定するために、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）エクトドメイン（「可溶性ＴｆＲ」、配列番号３５３）をＤａｅｄａｌｕｓ可溶性タンパク質産生レンチベクターにクローニングし、タンパク質を成長培地から精製した（可溶性ＴｆＲのゲルを図１Ａに示す）。同じ戦略を使用して、ヒトアポトランスフェリン（残基２３～６９８、配列番号３６４、ＫＴＶＲＷＣＡＶＳＥＨＥＡＴＫＣＱＳＦＲＤＨＭＫＳＶＩＰＳＤＧＰＳＶＡＣＶＫＫＡＳＹＬＤＣＩＲＡＩＡＡＮＥＡＤＡＶＴＬＤＡＧＬＶＹＤＡＹＬＡＰＮＮＬＫＰＶＶＡＥＦＹＧＳＫＥＤＰＱＴＦＹＹＡＶＡＶＶＫＫＤＳＧＦＱＭＮＱＬＲＧＫＫＳＣＨＴＧＬＧＲＳＡＧＷＮＩＰＩＧＬＬＹＣＤＬＰＥＰＲＫＰＬＥＫＡＶＡＮＦＦＳＧＳＣＡＰＣＡＤＧＴＤＦＰＱＬＣＱＬＣＰＧＣＧＣＳＴＬＮＱＹＦＧＹＳＧＡＦＫＣＬＫＤＧＡＧＤＶＡＦＶＫＨＳＴＩＦＥＮＬＡＮＫＡＤＲＤＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴＲＫＰＶＤＥＹＫＤＣＨＬＡＱＶＰＳＨＴＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬＮＱＡＱＥＨＦＧＫＤＫＳＫＥＦＱＬＦＳＳＰＨＧＫＤＬＬＦＫＤＳＡＨＧＦＬＫＶＰＰＲＭＤＡＫＭＹＬＧＹＥＹＶＴＡＩＲＮＬＲＥＧＴＣＰＥＡＰＴＤＥＣＫＰＶＫＷＣＡＬＳＨＨＥＲＬＫＣＤＥＷＳＶＮＳＶＧＫＩＥＣＶＳＡＥＴＴＥＤＣＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧＧＦＶＹＩＡＧＫＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＮＫＳＤＮＣＥＤＴＰＥＡＧＹＦＡＩＡＶＶＫＫＳＡＳＤＬＴＷＤＮＬＫＧＫＫＳＣＨＴＡＶＧＲＴＡＧＷＮＩＰＭＧＬＬＹＮＫＩＮＨＣＲＦＤＥＦＦＳＥＧＣＡＰＧＳＫＫＤＳＳＬＣＫＬＣＭＧＳＧＬＮＬＣＥＰＮＮＫＥＧＹＹＧＹＴＧＡＦＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡＦＶＫＨＱＴＶＰＱＮＴＧＧＫＮＰＤＰＷＡＫＮＬＮＥＫＤＹＥＬＬＣＬＤＧＴＲＫＰＶＥＥＹＡＮＣＨＬＡＲＡＰＮＨＡＶＶＴＲＫＤＫＥＡＣＶＨＫＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫＤＬＬＦＲＤＤＴＶＣＬＡＫＬＨＤＲＮＴＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶＧＮＬＲＫＣＳＴＳＳＬＬＥＡＣＴＦＲＲＰ）を生成及び精製し、材料の一部に鉄を付加させてホロトランスフェリンを生成した。可溶性ＴｆＲエクトドメインへの結合について、アポトランスフェリンとホロトランスフェリンの両方を表面プラズモン共鳴を介して試験した（図２３Ａ）。ホロトランスフェリンのみが固定化ＴｆＲとの相互作用を示した。

スクリーニングに使用される可溶性ＴｆＲがヒト内因性タンパク質の構造を表すことを更に検証するために、ＴｆＲを使用して指向性を決定し、細胞進入を媒介するＭａｃｈｕｐｏウイルス糖タンパク質との相互作用を試験した（ＭａＣＶと呼ばれる）。このために、ＭａＣＶを哺乳動物表面提示ベクターＳＤＧＦ（図２３Ｂ）にクローニングし、ＳＤＧＦ－ＭａＣＶまたは対照タンパク質（ＳＤＧＦ－エラフィン、いくつかの天然型ＣＤＰに結合することが知られているエラスターゼの阻害薬）を２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（２９３Ｆ）懸濁細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、各２００ｎＭのビオチン化ＴｆＲ（細胞結合アッセイで使用されるＴｆＲは全てビオチン化される）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ストレプトアビジンで染色し、次いで、フローサイトメトリーによって分析した（図２３Ｃ）。ＭａＣＶをトランスフェクトした細胞は、ＴｆＲによる染色に成功したが、ＳＤＧＦ－エラフィン細胞は、染色されなかった。また、２００ｎＭの蛍光エラスターゼとインキュベートしたＳＤＧＦ－ＭａＣＶ細胞は、染色されなかった。これは、ＴｆＲのその内因性リガンドに対する結合の特異性と、新規ＴｆＲ結合パートナーを特定するための手段としてのＳＤＧＦの有用性の両方を示している。

実施例３
機能性トランスフェリン受容体の発現及び精製
トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）エクトドメイン（配列番号３５２、ＵｎｉＰｒｏｔナンバリングによるＨｓＴｆＲの残基１２１～７６０）、アポトランスフェリン（配列番号３５３（ヒト）及び配列番号３５４（マウス））、及び全ての可溶性ＣＤＰを実施例２及び実施例３として生成及び精製した。簡潔に述べると、目的のタンパク質の分泌を誘導するレンチベクターであるＤａｅｄａｌｕｓベクターに、関連する配列をクローニングした。タンパク質は、その内因性シグナルペプチドを含有するものか、または翻訳／分泌中の安定化のためにＮ末端でシデロカリンに融合されたもののいずれかであり、シデロカリン融合体は、ＴＥＶプロテアーゼを使用して切断し、Ｎ末端「ＧＳ」を残した。ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスを２９３細胞で標準的な方法で産生した。このウイルスを使用して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１２３３８０１８）中、およそ１０の多重感染度（ＭＯＩ）で、１×１０^７の２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ懸濁（２９３Ｆ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＲ７９００７）細胞に形質導入した。次いで、培養物を成長させ（懸濁培養インキュベーター、１２５ＲＰＭ、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ_２）、１０～１２日かけて拡大させ（最終体積２Ｌ）、その後、培地を回収し、滅菌濾過した。バッチＮｉ－ＮＴＡ樹脂結合によって、培地からタンパク質を精製した。ＣＤＰをＴＥＶプロテアーゼ切断によってシデロカリン担体から分離し、ＳＥＣ（ＡＫＴＡＰｕｒｅ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＲＰ－ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔモデル１２６０、Ｃ１８カラム、吸光度２１４ｎｍ、インラインのＡｇｉｌｅｎｔ６１２０ＬＣ／ＭＳ）のいずれかによる最終精製を実施した（図１Ａ）。ＴｆＲ及びトランスフェリンは、ＰＢＳ＋５％グリセロール中で凍結させ、一方、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製したＣＤＰペプチドは、バイアルに分注して凍結乾燥させた。ペプチドの定量化は、ｉｎｖｉｖｏでの使用前に、アミノ酸解析によって確立した。

精製したＴｆＲの適切なフォールディング及び機能は、表面プラズモン共鳴を使用して検証した。精製したＴｆＲへのアポトランスフェリン（ＡｐｏＴｆ）またはホロトランスフェリン（ＨｏｌｏＴｆ）のいずれかの結合を測定した（図２３Ａ）。ＡｐｏＴｆよりもＨｏｌｏＴｆへ優先的に結合することが適切なＴｆＲ機能を示す。

全てのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びクマシー染色によって分析した（図４及び図２７）。ＣＤＰは、非還元及び１０ｍＭＤＴＴによる還元の両方で実施した。タンパク質分解及び還元耐性試験を、人工胃液中の５０Ｕのブタペプシン（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＰ７０１２）またはＰＢＳ中の５０Ｕのブタトリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ６５６７）のいずれかで処理し、続いて、３７℃で３０分間インキュベーションした後に、精製に使用したのと同じＲＰ－ＨＰＬＣ機器で実施した。同様に、グルタチオンまたはＤＴＴ還元には、ＰＢＳ中１０ｍＭのグルタチオンまたはＤＴＴでペプチドを５分を超えて処理した後、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析を行うことが含まれた。配列番号３２のペプチドのＣＤスペクトルを、１０ｍＭＤＴＴを１５～２５μＭの濃度で含むまたは含まない２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、ＪａｓｃｏＪ－７２０Ｗ分光旋光計（１ｍｍ光路長）で測定した。データは、２１０ｎｍにおける相対楕円率［θ］の変化で表し、ｍｄｅｇ単位で報告する。

ホロトランスフェリンは、Ｈａｍｉｌｔｏｎｅｔａｌ．の方法に従って、生成した。簡潔に述べると、４．５ｍＭＦｅＣｌ_３（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）及び９ｍＭニトロロ三酢酸（ＮＴＡ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を含有する水中の４．５ｍＭＦｅ（ＮＴＡ）_２の１０ｍＬ溶液を、ＨＣｌ及びＮａＯＨによりｐＨ４．０まで滴定した。ＰＢＳ中のアポトランスフェリン溶液にＦｅ（ＮＴＡ）_２を、３．２当量が添加されるまで、５分ごとに０．４当量を添加した。１，０００倍を超える遊離Ｆｅ（ＮＴＡ）_２クリアランスにするために、スピンカラム透析（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－４遠心式フィルターユニット、分子量カットオフ１０ｋＤａ）を使用して、溶液をＰＢＳに緩衝液交換した。

ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＡ３７５７３）によるＣＤＰ標識は、ＰＢＳ緩衝液中、約１．５ＮＨＳ－エステル色素：１ＣＤＰのモル比で１時間を超えて行い、その後、１，０００倍を超える遊離色素クリアランスにするために、遊離色素をスピンカラム透析（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－４遠心式フィルターユニット、分子量カットオフ３ｋＤａ）によって除去した。ＢｉｒＡ－５００キット（Ａｖｉｄｉｔｙ）を製造元のプロトコルに従って使用してＡｖｉタグ付きＴｆＲをビオチン化し、続いて、５％グリセロール含有ＰＢＳへの最終の緩衝液交換を行い、小分けして－８０℃で保存した。

実施例４
ＴｆＲ結合ペプチドの哺乳動物表面提示
本実施例は、配列番号１（配列番号１は配列番号３６にＮ末端ＧＳを付加したものである）、配列番号２（配列番号２は配列番号３７にＮ末端ＧＳを付加したものである）、配列番号３０（配列番号３０は配列番号６５にＮ末端ＧＳを付加したものである）、及び配列番号３２（配列番号３２は配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したものである）、及び配列番号３３～配列番号３５（配列番号３３～配列番号３５はそれぞれ配列番号６８～配列番号７０にＮ末端ＧＳを付加したものである）を含む本開示のＴｆＲ結合ペプチドの哺乳動物表面提示について記載する。ＴｆＲ結合ペプチドのスクリーニングは、哺乳動物細胞にトランスフェクトまたは形質導入して候補ペプチドを提示させ（図２３Ｂ）、続いて、可溶性ヒトトランスフェリン受容体エクトドメイン配列番号３５２に対するスクリーニング（２００ｎＭ、図２３Ｃ、図１）によって実施した。哺乳動物細胞は、ジスルフィド架橋タンパク質のフォールディングにおける忠実度が改変されていることから、本開示のペプチドの提示に好適な細胞型となっている。

哺乳動物細胞表面提示スクリーニングは、以下のとおりに実施した。表面提示ＧＦＰＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターを使用したスクリーニング戦略。ベクターにおいて、ＦａｓＬ－ＴＭは、ＦａｓＬタンパク質の膜貫通ドメインである。より詳細には、設計されたペプチドをプールとしてＳＤＧＦにクローニングし、次いで、それをレンチウイルスにした。このライブラリーを用いて、約１の多重感染度で２９３Ｆ細胞に形質導入し、３日間の増殖後、形質導入した細胞のプールをＡｌｅｘａ６４７標識ＴｆＲとともにインキュベートした。これらの実験に関して、蛍光標識は、ＴｆＲを蛍光ストレプトアビジンまたは蛍光抗Ｈｉｓ抗体と共染色することによって実施した。可溶性ＴｆＲは、Ｈｉｓタグとビオチン標識の両方を含有した。抗体／ストレプトアビジン蛍光には、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７またはｉＦｌｕｏｒ６４７のいずれかを使用した。ＧＦＰ及びＴｆＲ二重陽性細胞から最も高く染色されたＴｆＲ陽性細胞の一部をソーティングし、拡大させた。拡大ごとに細胞の一部を回収し、最後に、濃縮されたペプチドをシーケンシングによって特定した。フローサイトメトリーを使用してゲーティング基準を評価し、ＳＤＧＦペプチドコンストラクトを介して表面上にタンパク質を発現しているＧＦＰ＋２９３Ｆ細胞を特定した。ゲーティングは、ＦＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ｈを使用してデブリをゲートアウトし、ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａを使用してダブレットをゲートアウトし、ＦＳＣ－Ｈ対ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅＨを使用してＤＡＰＩ＋死細胞をゲートアウトし、任意選択でＦＩＴＣ－Ｈヒストグラムを使用してＧＦＰ＋細胞を特定することにより進める。このようにゲーティングしたら、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（標的結合を検出するための共染色）を使用してソーティング及び分析を行った。

スクリーニングは、磁気ソーティングとフローソーティングの組み合わせを使用して実施した。磁気ソーティングは、次のとおりに実施した：２×１０^８２９３Ｆ細胞にＳＤＧＦＣＤＰライブラリーを約１のＭＯＩで形質導入し、形質導入後３日まで拡大させた。最初のスクリーニングでは、磁気セルソーティングを実施した。１×１０^９の形質導入した細胞を、最終体積２５ｍＬの２００ｎＭのビオチン化ＴｆＲ、２ｍＬの抗ビオチンＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ１３０－１０５－６３７）、及び２１ｍＬのＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋２ｍＭＥＤＴＡ及び０．５％ウシ血清アルブミン）を含有する結合緩衝液中に再懸濁した。細胞を氷上で攪拌しながら（２～５分ごとに穏やかに反転）３０分間インキュベートし、次いで、ＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒで１０倍に希釈して２５０ｍＬにし、ペレット化し（５００×ｇ、５分）、ＨｉｇｈＢＳＡＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒ（２ｍＭＥＤＴＡ及び３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を用いて再懸濁して４０ｍＬにした。細胞を４つの１０ｍＬアリコートに分割し、「ｐｏｓｓｅｌｄ」プロトコル及び各ソート後の「クイックリンス」を使用して、ＭｉｌｔｅｎｙｉａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）ＰｒｏＳｅｐａｒａｔｏｒにかけた。ランニング緩衝液及び洗浄緩衝液はそれぞれＨｉｇｈＢＳＡＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒ及びＰＢＳ＋２ｍＭＥＤＴＡであった。溶出した細胞をプールし、ペレット化し、そのＣＤＰ配列をＰＣＲ増幅した（Ｔｅｒｒａ（商標）ＰＣＲＤｉｒｅｃｔＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＭｉｘ（Ｔａｋａｒａ６３９２７１）、１６サイクル後にＰｈｕｓｉｏｎ）。このサブライブラリーを上記のようにＳＤＧＦにクローニングし、レンチウイルスにして、フローソーティングのために、新しいバッチの２９３Ｆ細胞（１×１０^７細胞、ＭＯＩ約１）に形質導入した。

フローソーティングは、次のとおりに実施した：２００ｎＭのＴｆＲ、２００ｎＭのストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７コンジュゲート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳ２１３７４）、及び１μｇｍＬ^－１のＤＡＰＩを含む３ｍＬのＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒ中で染色した２．４×１０^７細胞を使用してフローソーティングを行った。細胞をＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒで４倍に希釈して１２ｍＬにし、ペレット化し（５００×ｇ、５分）、３．６ｍＬのＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒ中に再懸濁した。細胞をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＳｙｓｔｅｍ（ＢＤ）でソーティングし、ＦＳＣ－Ａ（培地）、ＳＳＣ－Ａ（培地）、ＤＡＰＩ－Ａ（陰性）、ＧＦＰ－Ａ（陽性）、及びＡＰＣ－Ａ（ＧＦＰ＋の上位７％）の各チャネルに基づいてゲーティングした。各フローソーティング後、細胞を懸濁２４ウェルプレートのＦｒｅｅＳｔｙｌｅＭｅｄｉａ中で０．５～１ｍＬから培養し、３００ｒｐｍで振盪し、１２５ＲＰＭで振盪する１２５ｍＬのバッフル付きフラスコ中で最終体積３０ｍＬまで拡大した。この時点で、細胞を上記のように再びソーティングした。３回目のフローソーティング後、細胞を拡大し、１．５×１０^６細胞のペレットで凍結した。ペレットを上記のようにＰＣＲ増幅し（ＴｅｒｒａＤｉｒｅｃｔＰＣＲに続いてＩｎＦｕｓｉｏｎ）、ＣＤＰインサートをＳＤＧＦにサブクローニングし、形質転換し（Ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細胞）、クローニングされたＣＤＰのミニプレップ及びシーケンシングのためにコロニーを採取した。濃縮バリアントは、配列解析において、採取した約１００のコロニーで１回を超えて出現するものとした。部位飽和変異導入（ＳＳＭ）による親和性成熟スクリーニングは、次の変化を加えて全て上記のように行った：１）染色は連続的に、最初にＴｆＲを用いて、次いで等モル量の色素標識ストレプトアビジンを用いて行った。２）ＴｆＲ／ストレプトアビジン濃度を、最初のＳＳＭ成熟スクリーニングでは２０ｎＭに、２回目のＳＳＭ成熟スクリーニングでは８ｎＭに下げた。各ＳＳＭスクリーニング後、個々の変異のうち１つまたは２つのいずれかを含有するバリアントのいずれよりも高いＴｆＲ染色を示す化合物変異体（配列番号２または配列番号３２のペプチド）を組み立てるために、濃縮バリアントを調べた。

図１のフローサイトメトリープロットは、プールした高多様性ライブラリーに由来する、ＴｆＲに結合する細胞の連続的な濃縮を示す。図１Ａは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）タンパク質のクマシー染色ゲルを示す。図１Ｂは、１回のフローソーティング後における、ＴｆＲに結合する細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１Ｃは、１回のフローソーティング後における、対照染色の細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１Ｄは、２回のフローソーティング後における、ＴｆＲに結合する細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１Ｅは、２回のフローソーティング後における、対照染色の細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１Ｆは、３回のフローソーティング後における、ＴｆＲに結合する細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１Ｇは、３回のフローソーティング後における、対照染色の細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。

各フローソーティングは、３０００万細胞を超える細胞のライブラリーの成長、ＴｆＲ結合の染色、及び上位の結合物質のフローソーティングを表す。ソーティングした結合物質は、成長させてから、次のフローソーティングを実施した。

実施例５
ＴｆＲ結合ペプチドの特定
本実施例は、実施例４に記載されている哺乳動物表面提示系を使用したＴｆＲ結合ペプチドの特定について記載する。

実施例４の哺乳動物表面提示系を使用して、配列番号１の配列（配列番号１は配列番号３６にＮ末端ＧＳを付加したものである）を有する単一クローンペプチドを特定した。１０，０００個のＣＤＰをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリーを増幅し、変異導入した。ＣＤＰは、１７～５０アミノ酸長であり、システインは、４、６、８、または１０個であった。ライブラリーには、アノテーションのあるノッティンまたはデフェンシンに対してある程度の重み付けがあるが、ライブラリーにはあらゆる生物のドメイン／界のＣＤＰが含まれた。このライブラリーをＳＤＧＦにクローニングし、レンチウイルスにし、２９３Ｆ懸濁細胞に形質導入した。形質導入した細胞をＴｆＲ（２００ｎＭ）で染色し、１ラウンドの磁気セルソーティング及び３ラウンドのフローソーティングの過程で共染色し、各ラウンドでＴｆＲで染色された細胞が濃縮された。結合は、ビオチン化したものまたはＨｉｓタグを付けたもののいずれかである２００ｎＭの可溶性ＡＦ６４７－ＴｆＲを使用した表面提示アッセイにおいて、ＴｆＲに特異的に結合することを検証した。染色は、四価の標的アビディティの１ステップ染色プロトコルを使用して実施した。最終の濃縮細胞集団のＤＮＡシーケンシングによって、単一ＴｆＲ結合ＣＤＰが特定され、配列番号１に指定された。これは、海洋襟鞭毛虫Ｍｏｎｏｓｉｇａｂｒｅｖｉｃｏｌｉｓに由来するシトクロムＢＣ１複合体サブユニット６（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ：Ａ９Ｖ０Ｄ７、ＤＯＩ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ９８９）をランダム変異させたバリアントであり、長さは４９アミノ酸（６つのシステイン）で、予測される分子量は５．６ｋＤａである。次いで、部位飽和変異導入（ＳＳＭ）を使用して、配列番号３６を親和性成熟に供し、可能な限りの非システイン単一アミノ酸置換を含むようにライブラリーを作成する（４３個の非Ｃｙｓアミノ酸×１８個の可能な非Ｃｙｓ置換＝７７５個のバリアント、配列番号１を含む）。

図２のフローサイトメトリープロットは、ＴｆＲ及び単一クローンペプチドを提示する細胞を示す。図２Ａは、配列番号１のペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）及び対照タンパク質（ｙ軸、蛍光抗Ｈｉｓ抗体で染色）のフローサイトメトリープロットを示す。図２Ｂは、配列番号１のペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）及び対照タンパク質（ｙ軸、蛍光ストレプトアビジンで染色）のフローサイトメトリープロットを示す。図２Ｃは、配列番号１のペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）及びＴｆＲ（ｙ軸、蛍光抗Ｈｉｓ抗体で染色）のフローサイトメトリープロットを示す。図２Ｄは、配列番号１のペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）及びＴｆＲ（ｙ軸、蛍光ストレプトアビジンで染色）のフローサイトメトリープロットを示す。

ＴｆＲ染色は、特定されたクローンを発現する細胞で観察され、対照タンパク質では染色はみられなかった。この染色は、蛍光ストレプトアビジンまたは抗Ｈｉｓ抗体のいずれかが共染色であるときに観察され、これは、結合の性質が共染色ではなくＴｆＲにのみ依存することを示している。二重陽性細胞（右上の四分円）は、ＴｆＲに結合したペプチド発現細胞を示す。

哺乳動物提示スクリーニングを使用する代替の方法を使用して、第２及び第３世代の結合物質であるＴｆＲ結合ペプチドを特定及び最適化（「成熟」）した。このライブラリーを、低濃度の標的及び共染色（２０ｎＭ）ならびに別個の染色ステップを使用する改変した染色プロトコルでスクリーニングした。後者は、ストレプトアビジンによって付与される四価のアビディティを排除することによって、ストリンジェンシーが更に高まる。最大４ラウンドのフローソーティング及び濃縮を使用して、ＴｆＲ結合特性が改善したバリアントを特定した。濃縮されたバリアントの順列により最適な変異体（配列番号２（配列番号２は、配列番号３７にＮ末端ＧＳを付加したもの））を特定し、このプロセスを再度繰り返して（８ｎＭのＴｆＲ共染色；それ以外は同一のプロトコル）、配列番号３２を生成した（配列番号３２は、配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したもの）。この２回成熟させたバリアントは、元のライブラリーメンバー（ＧＳＲＥＧＣＡＳＨＣＴＫＹＫＡＥＬＥＫＣＥＡＲＶＳＳＲＳＮＴＥＥＴＣＶＱＥＬＦＤＦＬＨＣＶＤＨＣＶＳＱ、配列番号３６２）から１４の点変異を含有する。親配列からの４つの点変異が配列番号１に認められ、配列番号２及び配列番号３２は、先の世代から６及び４つの変異をそれぞれ含有する。

配列番号１及びそのバリアント（例えば、配列番号２及び配列番号３２）を可溶性ペプチドとして生成し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び質量分析によって検証した（図４Ａ、図４Ｃ、及び図４Ｅ）。約５～６ｋＤａの質量に基づくと、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで移動度が予想よりも遅かったことは、一部のＣＤＰが興味深い電気泳動移動度特性を有することを示している。全てのバリアントは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとＲＰ－ＨＰＬＣの両方でＤＴＴ還元（１０ｍＭ）時に極めて異なる移動度を示したことから、ジスルフィド結合の安定化が確認された。ＴｆＲへの結合は、表面プラズモン共鳴（図７）によって検証され、成熟バリアントの親和性の増加も確認された（配列番号３２［Ｋ_Ｄ＝２１６±１ｐＭ］＞配列番号２［Ｋ_Ｄ＝８．７±０．４ｎＭ］＞配列番号１［Ｋ_Ｄは決定されず］）。還元、プロテアーゼ曝露、及び熱の各条件下における安定性についてペプチドを更に評価した（図５、図６、及び図２６）。全てのバリアントは、細胞の還元条件（１０ｍＭグルタチオン）に対して完全または部分的な耐性を示したが、親和性成熟バリアントは、ペプシンに対して部分的な耐性を示した（ただし、全てトリプシンタンパク質分解には弱かった）。配列番号３２タンパク質のインタクトな非還元ペプチドは、ＤＴＴ還元タンパク質に対して実質的に改善した熱耐性を示し、一般的な周囲温度をはるかに超える（５０℃超）まで円二色性の特徴には実質的な変化がなく、９５℃まで完全なアンフォールディングが観察されなかった。

実施例６
ペプチドの部位飽和変異導入
本実施例は、有益な変異または有害な変異を特定するための本開示のペプチドの部位飽和変異導入（ＳＳＭ）について例示する。部位飽和変異導入を配列番号１のペプチド（配列番号１は配列番号３６にＮ末端ＧＳを付加したものであり、図３Ａに結果を示す）及び配列番号２のペプチド（配列番号２は配列番号３７にＮ末端ＧＳを付加したものであり、図３Ｂに結果を示す）に対して実施した。

図３は、ペプチド成熟中に特定されたＴｆＲ結合ペプチドバリアントのＴｆＲ結合能力を示す。最初の哺乳動物表面提示実験（例えば、図１及び図２参照）で特定された配列番号１の配列を有するペプチドの親和性成熟のために、ＳＳＭを採用した。各成熟ラウンド中に、可能性のある全ての非システイン点バリアントのライブラリーを構築し、最初のスクリーニングよりも高ストリンジェンシーでＴｆＲに対してスクリーニングした。結合が改善したバリアントをＳａｎｇｅｒシーケンシングによって濃縮及び特定した。このように濃縮されたバリアント変異を様々な順列で互いに組み合わせて（データに示される）、複合的に改善された結合物質を特定した。ＳＳＭの２ラウンドを完了させ、配列番号２及び配列番号３２をそれぞれ含む成熟ペプチドを得た（配列番号３２は配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したものである）。ＳＳＭの最初のラウンドにおけるＴｆＲ濃度は２０ｎＭであり、１ステップ染色を使用してＳＳＭを実施した。ＳＳＭの２回目のラウンドにおけるＴｆＲ濃度は８ｎＭであり、２ステップ染色を使用してＳＳＭを実施した。

ＳＳＭライブラリーのペプチドを発現する哺乳動物細胞のＴｆＲ結合は、実施例４及び実施例５に記載されているように実施したが、より高いストリンジェンシープロトコルを用いた。より高いストリンジェンシープロトコルは、より低濃度のＴｆＲ（例えば、２０ｎＭ）を含んだ。

図３Ａは、配列番号１（配列番号１は配列番号３６にＮ末端ＧＳを付加したものである）の最初の部位飽和変異導入スクリーニングの結果を示しており、配列番号４、配列番号５、及び配列番号８の配列を有するペプチド（配列番号４、配列番号５、及び配列番号８はそれぞれ配列番号３９、配列番号４０、及び配列番号４３にＮ末端ＧＳを付加したものである）などのいくつかのバリアントは、ＴｆＲに対する結合活性の改善を示している。図３Ｂは、第２のバリアント変異中に特定されたバリアントのＴｆＲ結合を示す。

ｘ軸は全てのバリアントの配列番号を示し、ｙ軸は、フローサイトメトリー実験から推定された相対蛍光単位（ＲＦＵ）でのＴｆＲ結合量を示す。

実施例７
ＳＳＭで生成されたＴｆＲ結合ペプチドバリアントのＴｆＲ結合
本実施例は、実施例６に記載されるようにＳＳＭ中に特定された、部位飽和変異導入（ＳＳＭ）で生成されたＴｆＲ結合ペプチドバリアントのＴｆＲ結合を示す。

ｉｎｖｉｖｏにおけるＢＢＢ透過実験により、ペプチドのＴｆＲ結合能力と小胞性トランスサイトーシスを促進する能力は、必ずしも一致しないことが明らかになった。

配列番号３２を基準として、残基Ｃ６、Ｃ１０、Ｃ２０、Ｃ３４、Ｃ４４、及びＣ４８（配列番号６７を基準にすると、Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１８、Ｃ３２、Ｃ４２、及びＣ４６）に対応する６つのシステインは、ジスルフィドに関与し、したがって、ペプチド安定性に寄与する。

配列番号３２を基準として、残基Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、Ｑ５１、（配列番号６７を基準にすると、Ｇ３、Ａ５、Ｓ６、Ｎ１２、Ｌ１５、Ｅ１６、Ｅ１９、Ｌ３６、Ｌ４０、Ｌ４３、Ｄ４４、Ｈ４５、Ｓ４８、Ｑ４９）に対応する表面界面残基は、三世代全てのＴｆＲ結合ペプチドに存在するものであり、ＴｆＲ結合に寄与している可能性が高い。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のこれらの対応する残基の少なくとも１つ以上を含む。したがって、そのようなペプチドは、ＴｆＲへの結合が増大するように操作することができる。

配列番号３２を基準として、次のアミノ酸残基Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１４、Ｅ１５、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、及びＤ４０（配列番号６７を基準にすると、Ｒ１、Ｅ３、Ｒ７、Ｋ１０、Ｄ１２、Ｅ１３、Ｋ１７、Ｒ２１、Ｓ２４、Ｓ２６、Ｎ２７、Ｔ２８、Ｅ２９、Ｅ３０、Ｄ３１、Ｅ３３、Ｑ３４、Ｅ３５、Ｅ３７、及びＤ３８）に対応する、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴなどの親水性表面遠位残基は、ペプチド可溶性に寄与している可能性が高い。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のこれらの対応する残基の少なくとも１つ以上を含む。したがって、そのようなペプチドは、可溶性が増大するように操作することができる。

より高い結合親和性は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴなどの親水性残基の存在と関連しており、これは、配列番号３２を基準として、Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、及びＨ４９（配列番号６７を基準にすると、Ｄ１３、Ｅ３３、Ｅ３７、及びＨ４７）に対応する残基で、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＹなどの非極性または疎水性残基ではない変異によって結合が改善することに示されるとおりである。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のこれらの対応する残基の少なくとも１つ以上を含む。したがって、そのようなペプチドは、結合親和性が改変するように操作することができる。

ＴｆＲへのより高い結合親和性は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＹなどの非極性または疎水性残基と関連しており、これは、配列番号３２を基準として、Ｍ１１、Ｍ２５、及びＭ２７（配列番号６７を基準にすると、Ｍ９、Ｍ２３、及びＭ２５）に対応するアミノ酸残基で、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴなどの親水性残基ではない変異によって結合が改善することに示されるとおりである。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のこれらの対応する残基の少なくとも１つ以上を含む。したがって、そのようなペプチドは、結合親和性が改変するように操作することができる。

より高いＴｆＲ結合親和性は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶなどの脂肪族残基と関連しており、これは、配列番号３２を基準として、Ｌ４５（配列番号６７を基準にすると、Ｌ４３）に対応するアミノ酸残基で、Ｆ、Ｗ、またはＹなどの大きな芳香族残基ではない変異によって結合が改善することに示されるとおりである。本開示のペプチド中のいずれか１つ以上のＦ、Ｗ、またはＹを、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶを含む脂肪族残基に置換すると、ペプチドのＴｆＲに対する結合親和性を向上させることができる。

本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトのいずれか（例えば、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ）を、本明細書に記載される対応残基のうちの１つ以上において修飾して、安定性の向上及び結合特性の増加（または減少）またはＴｆＲ結合親和性の改変及びトランスサイトーシス特性の増加（または減少）、例えば、ｋ_ａ（会合）及びｋ_ｄ（解離）速度定数の改変を含む、特性が改善されたペプチドバリアントを生成することができる。

ある特定のＴｆＲ結合ペプチドの配列アライメントを表８に示す。ＴｆＲとの相互作用に関与する特定の残基を太字で示す。表面相互作用残基は、以下に示すものが上げられるが、これらに限定されない。

実施例８
還元条件におけるペプチド安定性
本実施例は、還元条件における設計または操作されたペプチドの安定性について記載する。核内または細胞質内のタンパク質などの細胞内の１つ以上の標的タンパク質と相互作用するように設計または操作されたペプチドは、細胞のサイトゾルコンパートメント内の還元条件に曝露される。したがって、本開示のペプチドが還元条件において安定性を示すことは、有利である。本開示のペプチドの安定性を１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び１０ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）中で試験した。ＤＴＴは、ペプチドが生物学的環境（例えば、細胞）で曝露される条件よりも厳しい条件を表す強還元剤である。ＧＳＨは、細胞内条件でのペプチド安定性を試験するには、より生理学的に適切な還元剤である。ペプチド－標的タンパク質相互作用の一例は、ＴｆＲタンパク質へのペプチド結合である。本実施例は、還元条件下におけるペプチドの安定性について記載する。配列番号１及び配列番号１のバリアントを可溶性タンパク質として生成し、溶液中での挙動及びジスルフィド還元時における移動度について試験した。

ペプチドの安定性を１０ｍＭＧＳＨ（生物学的に適切な還元剤）及び１０ｍＭＤＴＴ（ＧＳＨよりも強い還元剤）中で試験した。図７に示されるように、配列番号１、配列番号４、配列番号２、配列番号３０、及び配列番号３２（配列番号１、配列番号４、配列番号２、配列番号３０、及び配列番号３２はそれぞれ配列番号３６、配列番号３９、配列番号３７、配列番号６５、及び配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したものである）の配列を有するペプチドをＤＴＴを使用した還元条件に曝露し、ペプチドをＰＢＳ中でインキュベートした対照実験と比較した。ペプチド安定性をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣによって測定した。図４Ａ～図４Ｅに示されるデータは、ＤＴＴ曝露後のＨＰＬＣクロマトグラムで元のペプチドピークが保持されていることによって証明されるように、配列番号２及び配列番号３２のペプチドがＤＴＴによる還元に対して最も耐性があったことを示している。

追跡研究において、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、及び配列番号３２をそれぞれ含む４つのペプチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３０、及び配列番号３２はそれぞれ配列番号３６、配列番号３７、配列番号６５、及び配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したものである）を、図５に示すように、１０ｍＭＤＴＴ及び１０ｍＭＧＳＨを使用する還元条件に供した。図５Ａ～図５Ｄに示される重ね合わせのＨＰＬＣクロマトグラムは、配列番号３０及び配列番号３２の配列を有するペプチドがＧＳＨ還元にほぼ完全に耐性があり、配列番号１及び配列番号２の配列を有するペプチドがＧＳＨ還元に部分的にのみ耐性があったことを示す。ＧＳＨ還元は、細胞内条件での安定性を試験するには、より生理学的に適した還元剤であるが、４つ全てのペプチドがＤＴＴ曝露後に還元を示した。これらの結果は、配列番号１及びそのバリアントがジスルフィド駆動型の構造及び挙動を示すことを示した。

実施例９
プロテアーゼに対するペプチド安定性
本実施例は、プロテアーゼに対する本開示のペプチドの安定性について例示する。例えば、腫瘍環境は、高濃度のプロテアーゼを含有する。更に、タンパク質分解（プロテアーゼによる分解または切断）に対する耐性は、例えば、循環中におけるペプチド分解及び後に続く免疫原性の可能性を低減する。タンパク質分解に対する耐性は、更に、ペプチドの血清半減期及びペプチドの全体的なバイオアベイラビリティを増加させ得る。したがって、本開示のペプチドがプロテアーゼによる分解に対して耐性があることは、有利である。

タンパク質分解消化に対する耐性を決定するために、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、及び配列番号３２のペプチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３０、及び配列番号３２はそれぞれ配列番号３６、配列番号３７、配列番号６５、及び配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したものである）を、ｐＨ１．０５の人工胃液中の５０Ｕのブタペプシン（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＰ７０１２）、またはＰＢＳ中の５０Ｕのブタトリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ６５６７）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートし、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって分析した。これとは別に、ペプチドを、ｐＨ１．０５の人工胃液４３中の５０Ｕのブタペプシン（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＰ７０１２）、またはＰＢＳ中の５０Ｕのブタトリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ６５６７）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートし、ＲＰ－ＨＰＬＣによって分析した。対照ペプチドをＰＢＳ中でインキュベートした。全てのペプチドを非還元条件でインキュベートした。

図６は、ＴｆＲ結合ペプチドのペプシン及びトリプシン処理を含むプロテアーゼに対する耐性を示す。図６は、処理なし（赤）、トリプシン（青）、またはペプシン（緑）のいずれかに供したペプチドの逆相ＨＰＬＣトレースの重ね合わせ（試験したペプチドごとに１つ）を示す。図６Ａは、配列番号１の配列を有するペプチドのトリプシン（青）及びペプシン（緑）に対する耐性を示す。図６Ｂは、配列番号２の配列を有するペプチドのトリプシン（青）及びペプシン（緑）に対する耐性を示す。図６Ｃは、配列番号３２の配列を有するペプチドのトリプシン（青）及びペプシン（緑）に対する耐性を示す。図６Ｄは、配列番号３０の配列を有するペプチドのトリプシン（青）及びペプシン（緑）に対する耐性を示す。

配列番号２、配列番号３０、及び配列番号３２の配列を有する配列は、これらの条件下において、ペプシン処理に対して部分的に耐性があったが、トリプシン処理に対しては耐性がなかった。配列番号１の配列を有するペプチドは、両方のプロテアーゼに対して脆弱であった。

実施例１０
ペプチド結合相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析
本実施例は、ＴｆＲとのペプチド結合相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析について例示する。

本開示の様々なペプチドをＴｆＲへの結合親和性について分析した。簡潔に述べると、ＳｅｒｉｅｓＳＳＡチップを備えたＢｉａｃｏｒｅＴ１００機器（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）において２５℃で実施される、捕捉させたビオチン化ＴｆＲを使用したＳＰＲ実験によって、結合親和性を分析した。０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いる実験において、ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）をランニング緩衝液として使用した。試験されるＴｆＲ結合ペプチドに応じて濃度範囲を変えた希釈系列を２ｕｇ／ｍｌのＴｆＲとインキュベーションし、ＳＰＲ実験のために約３００共鳴単位（ＲＵ）のタンパク質を捕捉することによって、可溶性ＴｆＲ結合ペプチドの結合を評価した。

まず、図７に示されるように、様々な親和性を有するＴｆＲ結合ペプチドのアレルシリーズをＳＰＲによって確認した。配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号３２の配列を有するペプチド（配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号３２はそれぞれ配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、及び配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したものである）を３００ｎＭの濃度で試験した。その結果から、親和性成熟の後のラウンドのペプチドバリアントは、ＴｆＲに対して異なる結合親和性を示すことが確認された。すなわち、配列番号３２の配列を有する親和性成熟の最終ラウンドのペプチドは、ＴｆＲに対して最も高い結合親和性を示したのに対し、配列番号１は、ヒトＴｆＲ（ｈＴｆＲ）に対して最も低い結合親和性を示した。

次に、配列番号２、配列番号４、配列番号３０、及び配列番号３２の配列をそれぞれ有する４つのペプチド（配列番号２、配列番号４、配列番号３０、及び配列番号３２はそれぞれ配列番号３７、配列番号３９、配列番号６５、及び配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したものである）の、捕捉させたビオチン化ｈＴｆＲに対する結合を測定した。図８は、配列番号２の配列を有するペプチドの濃度を１００ｐＭ～２００ｎＭまで変えた場合のＴｆＲ結合を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレースを示す。図９は、配列番号４の配列を有するペプチドの濃度を１００ｐＭ～２００ｎＭまで変えた場合のＴｆＲ結合を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレースを示す。図１０は、ＳＰＲによる、捕捉させたビオチン化（Ｂｔ）ｈＴｆＲに結合する配列番号３２の結合及びシングルサイクルカイネティクスデータを示す。５つの濃度の配列番号３２の配列を有するペプチド（０．０３７ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ）を２つの密度の捕捉Ｂｔ－ｈＴｆＲに対して注入し、グローバルに解析した。図１１は、ＳＰＲによる、捕捉させたビオチン化ｈＴｆＲに結合する配列番号３０の結合及びシングルサイクルカイネティクスデータを示す。５つの濃度の配列番号３０の配列を有するペプチド（０．０３７ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ）を２つの密度の捕捉Ｂｔ－ｈＴｆＲに対して注入し、グローバルに解析した。

配列番号２及び配列番号４の結合は、１００ｐＭ及び２００ｎＭの連続希釈で測定し、一方、配列番号３０及び配列番号３２は、３７ｐＭ～３ｎＭの連続希釈で試験して、カイネティクスデータを得た。配列番号３０及び配列番号３２のペプチドについては、ペプチドを２つの濃度（図１０及び図１１に赤及び緑のトレースで示される）の捕捉ビオチン化ｈＴｆＲに対して注入することによってカイネティクス試験を実施し、データをグローバルに解析した。

以下の表９は、図８～図１１に示されるグラフを解析して得たデータをまとめたものである。配列番号２の配列を有するペプチドについては、Ｋ_Ｄが８．７±４ｎＭ、Ｒ_ｍａｘが２３．１±２ＲＵであることがわかった。配列番号４の配列を有するペプチドについては、Ｋ_Ｄが１４．８±６ｎＭ、Ｒ_ｍａｘが２１．２±２ＲＵであることがわかった。配列番号３２の配列を有するペプチドについては、Ｋ_Ｄが２１６±１ｐＭであることがわかった。配列番号３０の配列を有するペプチドについては、Ｋ_Ｄが４６８±１ｐＭであることがわかった。Ｋ_Ｄ値が小さいほど結合親和性が高いことを示す。Ｒｍａｘは、ペプチドのｈＴｆＲに対する最大結合能力を表す。以下の表に示されるように、配列番号３２のＫ_Ｄが最も低く、ｈＴｆＲに対して最も強い結合を示すことが示されている。ＴｆＲ結合親和性の増加は、トランスサイトーシス機能の改善に対応し得る。いくつかの場合において、ＴｆＲ結合親和性の増加は、トランスサイトーシス機能の低下に該当する場合があり、いくつかの場合において、ＴｆＲ結合親和性の増加は、参照ペプチドと比較して、トランスサイトーシス機能の変化に対応しない。いかなる理論に拘束されるものではないが、Ｋ_ａ／Ｋ_ｄの比がペプチドのトランスサイトーシス機能に影響を与える可能性があることから、Ｋ_ａ及び／またはＫ_ｄの調節を使用することで、最適なＴｆＲ結合親和性及びトランスサイトーシス機能を持つＴｆＲ結合ペプチドを生成することができると考えられる。

実施例１１
内因性ＴｆＲ結合物質の存在下におけるペプチドのＴｆＲへの競合的結合
本実施例は、内因性ＴｆＲ結合物質アポトランスフェリン（鉄なし）及びホロトランスフェリン（鉄負荷あり）の存在下における、本開示のペプチドのＴｆＲへの競合的結合について記載する。

配列番号２及び配列番号３２の配列を有するＳＤＧＦ－ペプチド（配列番号２及び配列番号３２はそれぞれ配列番号３７及び配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したものである）を発現するＨＥＫ－２９３懸濁細胞を、ＴｆＲ＋ＰＢＳ、ＴｆＲ＋アポトランスフェリン（鉄負荷なし）１０μＭ、またはＴｆＲ＋ホロトランスフェリン（鉄負荷あり）１０μＭのいずれかとインキュベートした。トランスフェクトした細胞をホロトランスフェリンまたはアポトランスフェリンとインキュベートし、続いて、８ｎＭのビオチン化ＴｆＲを含有するＴｆＲ溶液を添加した。細胞をペレット化し、ＡＦ６４７－ストレプトアビジン溶液中に再懸濁した。細胞をペレット化し、フローサイトメトリーによってストレプトアビジン染色について分析すると、ＴｆＲ結合が示された。

図１２に示されるデータは、配列番号２及び配列番号３２の配列を有するペプチドがＴｆＲ結合についてホロトランスフェリンと良好に競合したことを示している（ｙ軸は、フローサイトメトリー実験から得られた相対蛍光単位を示す）。ホロトランスフェリンの存在下において、配列番号３２の配列を有する第３世代のＳＳＭ生成ペプチドは、配列番号２の配列を有する第１世代のペプチドよりもＴｆＲに対して高い競合的結合を示した。

このデータは、血流中などのホロトランスフェリンまたはアポトランスフェリンの存在下であっても、本開示のペプチドは、依然としてＴｆＲに結合することができることを示している。これにより、親和性成熟によって、ペプチドがＴｆＲに対して高い結合親和性を有するようになり、内因性結合物質と比較してＴｆＲへの競合的結合を示すことも更に確認された。

実施例１２
配列番号３２のペプチドの解明された結晶構造
本実施例は、配列番号３２及びＴｆＲのペプチドの解明された結晶構造について例示する。まず、ＴｆＲ－配列番号３２複合体をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した後、結晶トレイに加えた。

簡潔に述べると、凍結乾燥させた配列番号３２を２５ｍＭＰＩＰＥＳ（ｐＨ＝７．０）、１５０ｍＭＮａＣｌ、及び１ｍＭＥＤＴＡ中に１１ｍｇ／ｍＬの濃度で再構成した。予備的な結晶化条件は、ＪＣＳＧ－ｐｌｕｓスパースマトリックススクリーン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）を蒸気平衡形式で使用して決定した。１ｍＬの９％ｗ／ｗＰＥＧ（ＭＷ＝３３５０）、３０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝５．０）のウェル上における、１μＬのタンパク質溶液＋１μＬのウェル溶液を含む液滴の周囲温度における蒸気平衡によって、回折品質の結晶を得た。データ収集のために、結晶をウェル溶液＋２０％ｖ／ｖグリセロールへ移して、凍結保存した。ＯｓｍｉｃＶａｒｉｍａｘ光学系及びＲｉｇａｋｕＳａｔｕｒｎ９４４＋ＣＣＤ検出器を備えた社内のＲｉｇａｋｕＭｉｃｒｏＭａｘ－００７ＨＦ回転対陰極発生装置で回折データ（ｄｍｉｎ＝２．５５Å）を収集した。

化学量論的複合体を単離するために、精製した配列番号３２及びＴｆＲを１．２：１のモル比で混合し、インキュベートし、２５ｍＭＰＩＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、及び１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ＝７．０）中、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６１０／３００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）におけるサイズ排除クロマトグラフィーによって分画した。ｈＴｆＲ－ペプチド複合体を１０ｍｇ／ｍＬの標的濃度で再懸濁した。ＮｅｘｔａｌＪＣＳＧ＋、ＰＥＧ、及び（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ファクトリアルスイート（Ｑｉａｇｅｎ）ならびにサブマイクロリットルロボティクス（ＴＴＰＬａｂｔｅｃｈｍｏｓｑｕｉｔｏ）を使用して設定した、１：１のタンパク質溶液：リザーバー溶液シッティングドロップによる蒸気拡散によって、結晶化スクリーニングを室温で実施した。１ｍＬの５％ｗ／ｗＰＥＧ（Ｍｒ＝６０００）、１００ｍＭＭＥＳ（ｐＨ＝６．５）のウェル上における、１μＬのタンパク質溶液＋１μＬのウェル溶液を含む液滴の周囲温度における蒸気平衡によって、回折品質の結晶を得た。データ収集のために、結晶をウェル溶液＋１５％ｖ／ｖグリセロールへ移して、凍結保存した。ＲｉｇａｋｕＭｉｃｒｏＭａｘ－００７ＨＦホームソースまたはＡｄｖａｎｃｅｄＬｉｇｈｔＳｏｕｒｃｅのビームライン５．０．１（ＬａｗｒｅｎｃｅＢｅｒｋｌｅｙＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を１．００００Åの波長で使用して、単一結晶から回折データ（ｄｍｉｎ＝１．８５Å）を収集した。

ＲＣＳＢＰＤＢ（Ｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｍ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２８（１）：２３５－４２（２０００））から得た相同な構造を検索モデルとして使用するＣＣＰ４プログラムスイート（Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６７（Ｐｔ４）：２３５－４２（２０１１））でＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．，ＪＡｐｐｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，４０（Ｐｔ４）：６５８－６７４（２００７））を使用する分子置換（ＭＲ）、またはＣｕＫアルファ線を使用して異常シグナルを最大化し、ＳＨＥＬＸ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｍ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６６（Ｐｔ４）：４７９－８５（２０１０））で硫黄部分構造を決定する硫黄単波長異常分散法（ｓＳＡＤ）（Ｌｉｕ，Ｑ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６９（Ｐｔ７）：１３１４－３２（２０１３））のいずれかによって、初期位相を決定した。ｓＳＡＤ位相決定の場合、１°振幅内に１８０°の交互ファイ回転を有する５°ウェッジでデータを収集することによって、Ｂｉｊｖｏｅｔペア測定を最適化した。ＨＫＬ２０００を用いてデータを整理し、スケーリングした（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，２７６：３０７－３２６（１９９７））。ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｅｌｙ，Ｐ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６０（Ｐｔ１２Ｐｔ１）：２１２６－３２（２００４））及びＲＥＦＭＡＣ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，５３（Ｐｔ３）：２４０－５５（１９９７））を用いて、モデル構築及び精密化の反復サイクルを実施した。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ（Ｄａｖｉｓ，Ｉ．Ｗ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３５（ＷｅｂＳｅｒｖｅｒｉｓｓｕｅ）：Ｗ３７５－８３（２００７））を用いて構造検証を実施した。アポ型の配列番号３２の解釈可能な電子密度マップを生成するにはＲＥＦＭＡＣ５のツイン精密化が必要であった。

配列番号３２の結晶構造を、単独状態と、ＴｆＲとの結合状態の両方で解明した（図１３及び図１４）。構造モデリングによって示されるように、ＣＤＰは、逆平行の２ヘリックスバンドルである。単純なヘアピントポロジーを持つジスルフィド結合を３つ含有する（Ｃ４：Ｃ４６、Ｃ８：Ｃ４２、及びＣ１８：Ｃ３２のペア）（図１３Ｃ）。ＴｆＲと複合体を形成する際には、Ｎ末端及びＣ末端の残基が整列し、ＴｆＲと接触する。しかしながら、ＣＤＰのヘリカルコア（Ｃ８：Ｃ４２ジスルフィドの間及びそれらを含む）は、結合形態と非結合形態との間でほぼ同一であり、骨格は０．３３１±０．０４９ÅのＲＭＳＤで整合する（Ｎ＝８アライメント）。いずれの結晶においても、ヘリックスを接続するループに秩序はない。図１３の遊離及びＴｆＲ結合した配列番号３２のカートゥーン表示は、非対称ユニットの全ての分子の重ね合わせである（遊離の配列番号３２は４、ＴｆＲ結合は２）。プロテアーゼ分解に耐性のある安定なペプチドは、ヒトまたは他の動物にペプチドを投与した際の免疫原性の任意のリスクを低減する。本開示のペプチドのＴｆＲ結合ファーマコフォアに関する正確な結晶学的知識により、ペプチドフラグメントの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）へのいずれかの結合を更に限定するように配列を最適化することが可能になり、したがって、ペプチドの反復投与によって引き起こされるいずれかの免疫原性リスクを低減することができる。外来タンパク質の免疫認識には、抗原提示細胞におけるタンパク質のフラグメンテーションと、それらのフラグメントのＭＨＣ（ヒトではＨＬＡ）への結合が必要である。いくつかのモチーフはフラグメント：ＭＨＣ結合に有利であるが、他のモチーフは不利である。結合及び非結合の両方のペプチドの構造を理解することで、重要な結合残基に影響を与えることなく、フラグメントのＭＨＣへの結合を破壊する変異をもたらすことによって、免疫原性が低減したバリアントを設計することができる。

ＴｆＲへの結合は、極性と非極性の両方の相互作用によって媒介され、後者は、主に界面の小さな疎水性ポケットに収まっているＭｅｔ残基及びＬｅｕ残基である（図１３Ｄ）。Ｎ末端のゆがみは、ＴｆＲに対する３つの水素結合の形成に起因し、一方、結合状態と非結合状態との間のＣ末端ヘリックスの調整は、配列番号３２のＨ４７周辺の立体構造に対応する。Ｎ末端ＧＳスタブは、シデロカリン融合パートナーからのＴＥＶ切断後の残りであり、これもまた無秩序である。全体として、埋没表面積（１００１Å^２）が小さいことを考慮すると、親和性（Ｋ_Ｄ＝２１６±１ｐＭ）は、極めて強い。公開されている１１３のヘテロ二量体複合体の親和性及び埋没表面積と比較すると、埋没表面積がより小さい８６の複合体のうち、より強い親和性を示すのは２つのみであった（偶然にも、そのうちの１つは、プロテアーゼ阻害ＣＤＰとその標的である）。

ＴｆＲ：トランスフェリン共結晶構造と比較すると、配列番号３２フットプリントは、トランスフェリンのものと重複しており、競合的結合が予想される（図１３Ｄ）。これは、可溶性アポトランスフェリンまたはホロトランスフェリンの存在下における表面提示フローサイトメトリー結合アッセイで確認された（図１２）。これは、ホロトランスフェリンの血漿レベルが高いため（報告によれば２０μＭ以上）、ＢＢＢ透過を減少させる可能性があるが、最も親和性の高いＴｆＲ結合バリアント（配列番号３２）は、ＴｆＲ：トランスフェリン相互作用について公開されているものと同様のオフレート（ｋ_ｄ）を有し、オンレート（ｋ_ａ）ははるかに速い。頂端側の細胞表面にＴｆＲを運ぶ小胞が融合し、受容体が血流に曝露されるとすぐに、配列番号３２が、単純に、トランスフェリンよりも迅速に、新たに血漿に曝露されたＴｆＲに結合することが可能であると考えられる。配列番号３２の放出半減期（約１０分）は、報告されているトランスフェリンのエンドサイトーシス速度よりもはるかに長く（ｔ１／２＝３．５分）、ＴｆＲの取り込みがリガンド依存性でないことから、配列番号３２は、単純に、その結合部位についてトランスフェリンを排除し、取り込みに十分な間、結合部位を占有し得る。ＴｆＲ上の配列番号３２の結合部位を含む残基のほとんどは、ヒトとマウスのオルソログ間で保存されている（図１３Ｅ）。これは、交差反応性を示唆するものであり、交差反応性は、表面提示されたヒトまたはマウスＴｆＲ（ＳＤＧＦを介する）及び色素結合可溶性ＴｆＲ結合バリアントを使用するフローサイトメトリー結合アッセイ（図１３Ｅ及び図１５）で確認された。可溶性マウスＴｆＲエクトドメインが生成できなかったため、この代替戦略（可溶性ＣＤＰ、表面結合標的）を採用したが、表面提示タンパク質として良好に挙動した。

図１３は、ｈＴｆＲと配列番号３２の配列を有するペプチドとの共結晶を示す。図１３Ａは、配列番号３２の配列を有するペプチドと共結晶させたｈＴｆＲの第１の図を示し、ペプチド分子がｈＴｆＲと向かい合う面にあることを示し、結合したペプチドとｈＴｆＲとの間の２：２の結合化学量が確認される。コイル状の黒の実線で描かれている２つのヘリックス間の連結配列は、結晶構造では解明されなかったため、構造モデリングに基づいている。図１３Ｂは、図１３Ａの図を拡大図を示し、配列番号３２の配列を有するペプチドと共結晶させたｈＴｆＲを示し、多数の極性と非極性の相互作用が結合を誘導していることを示す。非極性相互作用は、主に、Ｌｅｕ及びＭｅｔであるが、極性相互作用は、いくつかの電荷残基及び非電荷残基の混合である。ＴｆＲとのそのような相互作用または結合に関与するアミノ酸残基は、配列番号３２を基準として、残基Ｇ５、Ｃ６、Ａ７、Ｓ８、Ｃ１０、Ｍ１１、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４１、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｈ４９、Ｓ５０、Ｑ５１（配列番号６７を基準として、Ｇ３、Ｃ４、Ａ５、Ｓ６、Ｃ８、Ｍ９、Ｎ１２、Ｌ１５、Ｅ１６、Ｅ１９、Ｌ３６、Ｌ３９、Ｌ４０、Ｌ４３、Ｄ４４、Ｈ４５、Ｈ４７、Ｓ４８、Ｑ４９）に対応する。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のこれらの対応する残基の少なくとも１つ以上を含む。内因性ＣＤＰから変異させたアミノ酸側鎖、または界面の一部であるアミノ酸側鎖はいずれも棒で示される。界面に隣接する残基は黒で示し、一方、界面から遠位の残基はシアンで示す。図１４は、いずれもｈＴｆＲに結合した、配列番号３２の配列を有するペプチドと、公開文献のトランスフェリン（ＲＣＳＢＰＤＢ１ＳＵＶ）との重ね合わせを示す。同様に、図１３Ｅは、同ペプチドと、異なる公開トランスフェリン受容体（ＲＣＳＢＰＤＢ３Ｓ９Ｌ）との重ね合わせを示す。重ね合わせは、トランスフェリン及び配列番号３２の配列を有するペプチドは、ＴｆＲ上の結合部位が重複していることを示している（図１３Ｅ、左）。配列番号３２の結合部位は、ヒト（配列番号３５３）とマウス（配列番号３５４）の両方の相同性に関して、ＴｆＲ上の結合表面のほとんどが２つの種間で同一性または類似性を有することを示している（図１３Ｅ、右）。図１４Ａは、ＴｆＲに結合した、トランスフェリン（公開文献から取得したデータ（ＲＣＳＢＰＤＢ１ＳＵＶ））と配列番号３２の配列を有するペプチドとの重ね合わせを示す。図１４Ｂは、ＴｆＲに結合した配列番号３２の配列を有するペプチドの拡大図を示し、図１４Ａの内因性トランスフェリンの結合部位と比較すると、配列番号３２の配列を有するペプチドとトランスフェリンの両方がｈＴｆＲ上に重複する結合部位を有することを示している。内因性ＣＤＰから変異させたアミノ酸側鎖、または界面の一部であるアミノ酸側鎖はいずれも棒で示される。界面に隣接する残基は黒で示し、一方、界面から遠位の残基はシアンで示す。

ｈＴｆＲ及び配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドによって形成される複合体の解明された結晶構造により、配列番号３２のＴｆＲに対する結合部位がトランスフェリンのＴｆＲに対する結合部位と重なることが確認される。

本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトのいずれか（例えば、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ）を、上記の結晶構造で特定された対応残基のうちの１つ以上において修飾して、安定性の向上及び結合特性の増加（または減少）またはＴｆＲ結合親和性の改変及び／またはトランスサイトーシス機能の増加（または減少）を含む、特性が改善されたペプチドバリアントを生成することができる。

実施例１３
ＴｆＲ結合ペプチドのマウスＴｆＲに対する交差反応性
本実施例は、細胞表面結合アッセイにおける、本開示のＴｆＲ結合ペプチドのマウスＴｆＲに対する交差反応性について例示する。実施例３に記載される表面提示パラダイムを逆にして使用した。簡潔に述べると、表面上にヒトまたはマウスのいずれかのＴｆＲを発現する２９３Ｆ細胞を、ＮＨＳ－エステル結合を介してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素で直接標識した可溶性ＴｆＲ結合ペプチドで染色した。図１５Ａ及び図１５Ｂは、種特異的抗体を使用して、ヒト対マウスＴｆＲ発現を検証するフローサイトメトリープロットを示す。図１５Ｃ及び図１５Ｄは、ペプチドが両方のホモログに効果的に結合することを示している。同様の実験において、フローサイトメトリーを使用して、配列番号１、配列番号２、配列番号３２、及び抗Ｔｆ抗体（陽性対照）の効果的な結合を実証した。ヒト及びマウスＴｆＲエクトドメイン（それぞれＨｓＴｆＲ及びＭｍＴｆｒ）のＳＤＧＦ表面発現は、種特異的抗体によって確認した。これらの細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ＣＤＰバリアント（例えば、配列番号１、配列番号２、または配列番号３）で染色すると、交差反応性を示し、親和性の高いバリアントの染色が向上した（図１３Ｅ）。

本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクトのいずれか（例えば、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ）を、上記の結晶構造で特定された対応残基のうちの１つ以上において修飾して、安定性の向上及び結合特性の増加（または減少）またはＴｆＲ結合親和性の改変及び／またはトランスサイトーシス機能の増加（または減少）を含む、特性が改善されたペプチドバリアントを生成することができる。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本明細書に記載されるデータは、ＴｆＲ結合ペプチドの全てのアミノ酸残基が交差反応性に重要であり得ることを示している。

また、表面提示フローサイトメトリーを使用して、実施例１２の結晶構造で特定されたトランスフェリン受容体上の配列番号３２の結合界面を検証した（図１３～図１４）。ＴｆＲ：配列番号３２の界面は、トランスフェリンの界面と重複しており、競合的結合が予想される（図１４Ａ及び図１３Ｅ）。特定された配列番号１のバリアントファミリーのうちで最も親和性の高いバリアント（配列番号３２の配列を有するバリアント）は、ＴｆＲ：トランスフェリン相互作用について公開されているものと同様のオフレート（ｋ_ｄ）を有し、オンレート（ｋ_ａ）ははるかに速い。また、ＴｆＲ上の配列番号３２結合表面のマウス／ヒト相同性について調べたところ（図１４Ａ及び図１３Ｅ）、マウスＴｆＲと比較して、異なる残基がほとんどなかった。これは、交差反応性を示唆するものであり、交差反応性は、フローサイトメトリー結合アッセイで確認された（図１５）。

実施例１４
ＴｆＲ結合ペプチドの全身オートラジオグラフィー
本実施例は、オートラジオグラフィーを介してｉｎｖｉｖｏで取得された配列番号１及び配列番号３２の配列を有する放射性標識ペプチド（配列番号１及び配列番号３２はそれぞれ配列番号３６及び配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したものである）の生体内分布の決定について例示する。

実施例１９に記載されるように、リシン及びＮ末端をメチル化することによって、各ペプチドを放射性標識した。したがって、ペプチドは、メチルまたはジメチルリシン及びメチル化またはジメチル化されたアミノ末端を含有し得る。体重２０～２５ｇの雌のＨａｒｌａｎ無胸腺ヌードマウスに、１００ｎｍｏｌの用量の放射性標識ペプチドを尾静脈注射を介して投与した。^１４Ｃ標識ＣＤＰは、マウスへの静脈内注射用に１００ｎｍｏｌになるように１００μＬのＰＢＳ中に再懸濁した。

各放射性標識ペプチドは、記載される時間（３０分または３時間）、動物内を自由に循環させ、その後、動物を安楽死させ、切片化した。

全身オートラジオグラフィー（ＷＢＡ）矢状面切片作成は、次のとおりに実施した。投与期間の終了後、マウスをヘキサン／ドライアイス浴中で凍結し、次いで、カルボキシメチルセルロースの凍結ブロックに包埋した。凍結した屠体を－２０℃で一晩ヘキサンガスを抜き、その後、冷却した２％カルボキシメチルセルロース（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｃ５０１３）に包埋した。次いで、各ブロックに穴を開け、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ中の放射性^１４Ｃグリシンコントロール（０．５μＣｉｍＬ^－１、ＡｍｅｒｉｃａｎＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＣｈｅｍｉｃａｌｓ）をピペットで入れ、凍結させてから、Ｈ／ＩＢｒｉｇｈｔ８２５０Ｃｒｙｏｓｔａｔ（ＨａｃｋｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で切片化（４０μｍ）した。動物全体の矢状面スライスを調製し、イメージング用の凍結薄切片を得た。ミクロトームを使用して凍結薄切片を取得し、脳、腫瘍、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、筋肉、脂肪、胆嚢、上部消化管、下部消化管、骨、骨髄、生殖管、眼、軟骨、胃、皮膚、脊髄、膀胱、唾液腺などの組織の可視化を可能にした。目的の全ての組織をサンプリングするために、切片を４インチ幅のテープ（Ｓｃｏｔｃｈ８２１、ＵＬＩＮＥ）上に２～６の深さで採取し、クライオスタットで２～３日間凍結乾燥させ、その後、丈夫な紙の上に載せ、セロハンで覆った。固定した切片を輝尽性発光体プレート（Ｒａｙｔｅｓｔ）に放射性標準曲線（１４６Ｓ－ＰＬ、ＡｍｅｒｉｃａｎＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＣｈｅｍｉｃａｌｓ）とともに７日間曝露した。イメージング前に、切片をフリーザー内で乾燥させた。

オートラジオグラフィーのイメージングのために、テープに貼り付けられた薄切片を凍結乾燥させ、放射性サンプルをホスフォイメージャープレートに７日間曝露した。これらのプレートを現像し、各器官からの信号（デンシトメトリー）を各動物の心臓の血液に見られる信号に正規化した。組織内の信号が当該組織内の血液から予想される信号よりも暗い場合、その領域、組織、構造、または細胞における蓄積を示す。スキャンは、ＲａｙｔｅｓｔＣＲ－３５イメージャーで「感度２５μｍ」の設定で実施した。定量化は、ＡＩＤＡＩｍａｇｅＡｎａｌｙｚｅｒｖ５．１ＷｈｏｌｅＢｏｄｙＡｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ）を使用して、バックグラウンド調整済みデンシトメトリーによって実施した。定量化するために、単一切片内の単一組織から得られた目的の全ての領域の測定値を平均し、面積で調整した。血液の値は、心臓で評価した。ｎｍｏｌｇ^－１組織の単位で値を報告するには、各ＷＢＡサンプルセットと共曝露した市販の標準ストリップに対する校正が必要であった。ストリップ自体の校正は、液体シンチレーション計測（ＬＳＣ）によって決定された既知の量の組織１グラムあたりの１分あたりの放射線数（ＣＰＭ）が、１１の標準ストリップ濃度データポイントで測定されたＷＢＡデンシトメトリーに対応するように行った（６．３ｎＣｉｇ^－１～３．３μＣｉｇ^－１に対応する線形範囲）。この校正と、ペプチドの既知の濃度及び比活性度（液体シンチレーション計測によって決定）を組み合わせることで、ｎｍｏｌｇ^－１への変換が可能となった。図１８、図１９、及び図３３に示される定量化について、分析した切片の総数は、凡例に記載されており、全ての切片は、全ての組織を含むわけではないが、全ての組織の定量化は、３～１０匹のマウスから得たマウス１匹あたり１～４切片のうち切片１つあたり１～３個の関心領域を表す。なお、用量１００ｎｍｏｌ及びマウス平均体重２５ｇの場合、４ｎｍｏｌ／ｇは、「１００％注入量」を表す。いくつかの組織（脾臓／腎臓／肝臓）では、単純な全身拡散で予想される値を超えてペプチドが組織に蓄積するので、この値を上回る。これは、ペプチドがそれらの組織に優先的に蓄積することを示し得る。したがって、非血清組織に残っている注入量パーセントを算出すると、組織固有の「時点ゼロ」の量がないので、組織分布数が不均一になり得る。

図１６は、配列番号１（図１６Ａ）、配列番号２（図１６Ｂ）、配列番号３０（図１６Ｃ）、及び配列番号３２（図１６Ｄ）の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドを投与したマウスのオートラジオグラフィーの画像を示す。生体内分布を評価するために、ＩＶ注射される^１４Ｃ標識ペプチドを用いて、全身オートラジオグラフィーを使用した。画像は、１００ｎｍｏｌの薬物（約２５ｇのマウスで約２０ｍｇ／ｋｇ）の投与から３時間後に撮影した。これらの画像は、脾臓、肝臓、腎臓にかなりの蓄積があることを示し、筋肉、骨髄、及び皮膚にも高い蓄積があることを示している。ＣＮＳ蓄積は、他の組織よりも少ないが、血清レベルと比較してかなりの量であった（血清の２５％超）。バックグラウンド血中レベルは、脳内では心臓の血液信号の３％であることがわかった。

図１７は、生体内分布を評価するために、^１４Ｃ標識ペプチド（配列番号１及び配列番号３２）を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。脇腹の腫瘍にもかなりの蓄積がみられた。図１７Ａは、^１４Ｃで標識した配列番号１を静脈内注射したマウスの白色光画像を示す。図１７Ｂは、^１４Ｃで標識した配列番号１を静脈内注射したマウスの白色光画像を示す。図１７Ｃは、^１４Ｃで標識した配列番号３２を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。図１７Ｄは、^１４Ｃで標識した配列番号３２を静脈内注射したマウスの全身オートラジオグラフィーを示す。注目すべきは、右側の白色光画像では腫瘍の血管新生が不十分に見えるが、動物の背中側の脇腹の腫瘍全体に有意なレベルのペプチドが示されることから、両ペプチドのＵ８７腫瘍への分布が完全であることである。腫瘍は、皮下Ｕ８７脳腫瘍であった。

オートラジオグラフィーに加えて、配列番号１及び配列番号３２の配列を有するペプチドを使用して、ｅｘｖｉｖｏシンチレーション計測を実施した（図１８、図１９、及び図３３）。図１８及び図１９は、器官取り込みデータの棒グラフを示し、それぞれ、ブロック内の放射性標識対照サンプル及びｎｍｏｌ／ｇレベルでのペプチドの比活性に正規化したもの、血清レベルの％にのみ正規化したものである。３０分と３時間の両時間点におけるｎｍｏｌ／ｇレベルでのペプチド比活性を図３３に示す。図１８は、配列番号１の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドまたは配列番号３２の配列を有するペプチドのいずれかの２０ｍｇ／ｋｇのＩＶ単回投与後におけるペプチドの生体内分布及び器官蓄積の定量化を示す。この用量では、３時間後、ＣＮＳで１５０ｎＭを超えるレベル、腫瘍で約１μＭのレベルに達した。図１９は、配列番号１及び配列番号３２をそれぞれ含む２つのペプチドに関するペプチドの生体内分布及び器官蓄積の定量化を示す。値は、一般的なＢＢＢ透過測定基準（３％ベースライン）である血中レベルのパーセントとして示される。データは、配列番号１及び配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドについて、ペプチドの生体内分布及び器官蓄積が脾臓、肝臓、腎臓、皮膚、骨、及び脳で生じたことを示している。

脳については、切片化する前にマウスを灌流しなかった。したがって、ＣＮＳ毛細血管は、血液に満ちたままであり得、循環中の任意のペプチドが脳内で弱い信号を発生している可能性がある。しかしながら、ＣＮＳ血液／毛細血管は脳体積のほぼ３％を占めることが一般に認められていることから、血液に対する３％の信号は、「ＣＮＳ蓄積なし」と同等であるとみなされ得る。３％を超える信号は、毛細血管細胞への付着または実際のＢＢＢ透過のいずれかであるペプチドのＣＮＳ蓄積の証拠とみなされる。したがって、両ペプチドは、２５％を超える血中レベルで、この測定基準でかなりの量のＣＮＳ蓄積を示している。

実施例１５
シンチレーション計測による組織中のペプチド蓄積の定量化
本実施例は、シンチレーション計測による組織の血清中のペプチドの定量化について例示する。ペプチドを実施例１９に記載される方法によって放射性標識し、次いで、健全な腎臓を持つ雌のＨａｒｌａｎ無胸腺ヌードマウスに静脈内投与した。放射性標識ペプチドは、１００ｎｍｏｌの用量で静脈内投与した（１４．７μＣｉ、２０ｍｇ／ｋｇ）。様々な時点でマウスをＣＯ_２窒息によって安楽死させ、腎臓、肝臓、脳、脾臓、筋肉、及び皮膚を含む組織及び生体液を採取した。液体シンチレーション計測前に、固形組織をホモジナイズした。組織中のペプチドの量の定量化（ｎｍｏｌ／ｇ）を、ペプチドの分子量及び^１４Ｃ比活性を参照することによって実施した。図２０は、配列番号３２の配列を有するペプチド（配列番号３２は配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したものである）を投与した後のシンチレーション計測によって決定された組織蓄積の定量化を示す。図２０Ａは、腎臓における経時的なシンチレーション計測を示す。図２０Ｂは、肝臓における経時的なシンチレーション計測を示す。図２０Ｃは、脳における経時的なシンチレーション計測を示す。図２０Ｄは、脾臓における経時的なシンチレーション計測を示す。図２０Ｅは、筋肉における経時的なシンチレーション計測を示す。図２０Ｆは、皮膚における経時的なシンチレーション計測を示す。データは、配列番号３２の配列を有するペプチドについて、脾臓、肝臓、腎臓、皮膚、骨、及び脳を含む様々な組織でペプチドの蓄積が確認されたことを示す。６４時間の時間経過にわたって、配列番号３２の配列を有するペプチドの量は、投与後約１～２時間から腎臓、肝臓、脾臓、及び筋肉などの組織で有意に減少したが、脳内のペプチドの量は、わずかに減少するものの、その後、実験中、安定した。配列番号３２は、二相性の血漿消失動態を示し、最初の消失半減期は、１５．６分であった。最も高いレベルは、腎臓、肝臓、及び脾臓で認められ、腎臓は、血漿中の小さな溶質の排泄に関与し、肝臓及び脾臓の両組織は、高レベルのＴｆＲを発現することが報告されている。脳は、小さいが、測定可能なレベルを示した。

配列番号３２のペプチドの排泄は、雌のＨａｒｌａｎ無胸腺ヌードマウスでも試験した。配列番号３２を１００ｎｍｏｌ（１４．７μＣｉ、２０ｍｇ／ｋｇ）の用量で静脈内投与した。図２１は、高速相（９５％、ｔ_１／２１５．６分）及び低速相（５％、ｔ_１／２１０．３時間）のカイネティクスを示す二相消失回帰分析を含む、配列番号３２を静脈内投与したマウスにおける血清消失プロットを示す。

このデータは、脾臓、肝臓、腎臓、皮膚、骨、及び脳などの器官におけるこれらのペプチドの取り込み及び保持により、本開示のＴｆＲ結合ペプチドを使用して、活性薬剤及び／または検出可能な剤をこれらの器官に効果的に標的化及び送達できることを示している。

実施例１６
ペプチドの多重時間回帰分析及び毛細血管枯渇分析
本実施例は、本開示のペプチドの多重時間回帰分析（ＭＴＲ）及び毛細血管枯渇分析について例示する。

マウス（ＣＤ－１系統、各時点でＮ＝１）に麻酔をかけ、左頸静脈及び右頸動脈を外科的に露出させた。標識されたペプチド（２００μＬの体積で０．４５μＣｉ；比活性度は、配列番号１で３２Ｃｉ／ｍｏｌ及び配列番号３２で１４７Ｃｉ／ｍｏｌ（配列番号１及び配列番号３２はそれぞれ配列番号３６及び配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したものである）実施例１９に記載される方法に従う）を頸静脈に注射した。時間経過（０～３０分）内の所与の時間後、動脈血を採取し、続いて、断頭及び脳の採取を行った。脳及び血清の^１４Ｃレベルについて液体シンチレーション計測を介して試験し、データを多重時間回帰数学モデルに組み込んでＣＮＳ蓄積率を定量化した。このＣＮＳ蓄積が毛細血管に限定されるのか、または実際に血管トランスサイトーシスを示すのかを決定するために、別の一群の動物（Ｎ＝３／ペプチド）を投与から５分後に安楽死させ、脳のホモジネートをデキストラン密度勾配による遠心分離にかけた。これにより、実質から毛細血管を分離することが可能になり、２つの組織を別々にシンチレーション計測にかけて^１４Ｃの信号を定量化した。正規化された信号比は、ＢＢＢ透過の指標となり、例えば、配列番号１は、毛細血管よりも実質で実質的に高い信号を示し、これは、ＢＢＢを越えたトランスサイトーシスを示す。

図２２は、配列番号１及び配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドの多重時間回帰分析及び毛細血管枯渇分析を示す。図２２Ａは、配列番号１及び配列番号３２の多重時間回帰分析を単一プロットで示すものであり、ｙ軸は、脳の血清に対する比を示す。図２２Ｂは、配列番号１及び配列番号３２の配列を有するＴｆＲ結合ペプチドの実質及び毛細血管分布を示すものであり、ｙ軸は、組織対血清（Ｔ対Ｓ）比（μＬ／ｇ）を示す。この比は、それぞれの組織（この場合、実質または毛細血管）で測定された放射能と、同じ時点で循環血清中で測定された放射能の比である。

図２２Ｂの棒グラフは、特に、配列番号１のペプチドのＢＢＢ輸送及び実質のアクセスを強く示唆しており、本開示のペプチドは、事実、ＢＢＢを越えたＴｆＲ媒介性輸送（例えば、小胞性トランスサイトーシス）を促進することが可能であることを示している。本開示の任意のペプチドまたはペプチドコンストラクト（例えば、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ）は、同様に、ＢＢＢを越えたＴｆＲ媒介性輸送（例えば、小胞性トランスサイトーシスを介して）を促進することが可能であり得る。本アッセイで観察された配列番号３２の明確なトランスサイトーシスが欠如しているのは、毛細血管枯渇実験の時間点が短いこと（３０分）で説明される可能性が高いが、マウスのＣＲＥ－Ｌｕｃレポーターは良好に誘導された（４時間の時点）。

このデータは、本開示のペプチドがＴｆＲ媒介性輸送を可能にし、脳（ＢＢＢを介したトランスサイトーシス）、腫瘍、骨及び骨髄、ならびに免疫細胞などのＴｆＲを発現する組織への治療用薬剤及び／または診断用薬剤の送達を可能にすることを示している。輸送は、内皮細胞（例えば、インタクトなＢＢＢ）などの細胞層を越えて、または細胞膜を越えて、生じ得る。したがって、本開示のペプチドは、ＴｆＲを発現する任意の細胞、組織、または器官への様々な活性薬剤の効果的な送達ビヒクルとして使用することができる。加えて、このデータは、本明細書に記載されるペプチドのマウスＴｆＲへの結合を示している。インタクトなＢＢＢの向こう側にある腫瘍へのアクセス及び特異的な標的化は、従来の方法と比較して、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドの特に有利な点（例えば、高いアンメットクリニカルニーズ）であり得る。

実施例１７
高温におけるペプチド安定性
本実施例は、本開示のペプチドが高温で安定していることを示す。

タンパク質二次構造を円二色性（ＣＤ）を使用して評価した。ＣＤスペクトルをＪａｓｃｏＪ－７２０Ｗ分光旋光計により１．０ｍｍの光路長セルを使用して測定した。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）中のタンパク質サンプルは、２５～３０μＭのタンパク質濃度であった。サンプルを２１０ｎｍの波長で分析した。データは、相対楕円率［θ］；（ｍｄｅｇ）で表される。タンパク質の熱安定性を決定するために、サンプルを、２℃／分の勾配で段階的に昇温される２０℃から９５℃までの温度に供した。安定性及びタンパク質アンフォールディングは、αヘリックス二次構造について、２１０ｎｍでモニターした。データを相対楕円率［θ］で表し、ｍｄｅｇ単位で報告した。

配列番号３２の融解曲線を図２７に示す。熱安定性を還元条件（１０ｍＭＤＴＴ）下及び非還元条件（ＮＲ）下で試験した。縦線は、非線形カーブフィッティング（シグモイド、可変勾配、制約付き底＝０；いずれの場合もＲ^２＞０．９８）に基づいて算出された融点（ＮＲでは約７４℃、１０ｍＭＤＴＴ処理では約３８℃）を表す。ＮＲサンプルは９５℃まで平衡に達しないため、タンパク質は、高温で完全に「融解」せず、特に拡張ループ領域では、単純に無秩序な状態である可能性があることに留意されたい。還元サンプルと非還元サンプルにおける違いは、ジスルフィド結合によって提供される融解温度の大幅な上昇及び構造上の堅牢性を示している。

実施例１８
ペプチド血漿半減期の延長
本実施例は、本明細書で開示されるペプチドの血清または血漿半減期を延長する方法を示す。配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つの配列を有するペプチドまたはペプチドコンストラクトは、その血漿半減期を延長するために修飾される。Ｃｙ５．５などの近赤外色素へのペプチドのコンジュゲーションを使用してペプチドコンストラクトの血清半減期を延長する。あるいは、Ａｌｂｕタグなどのアルブミン結合物質またはＣ１４～Ｃ１８脂肪酸へのペプチドのコンジュゲーションを使用して血漿半減期を延長する。任意選択により、血漿半減期は、最小限の非ヒトタンパク質配列を使用することによって免疫原性が低下した結果として、延長される。

実施例１９
^１４Ｃでのペプチド放射性標識
本実施例は、^１４Ｃを用いたペプチドの放射性標識について記載する。

標準的な技術（Ｊｅｎｔｏｆｔｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２５４（１１）：４３５９－６５．１９７９に記載されるものなど）を使用し、^１４Ｃホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元的メチル化によって、本開示のペプチドを放射性標識した。簡潔に述べると、ペプチド（１０ｍｇ）を４７０μＬの１０×ＰＢＳを含む３．２ｍＬの水中に溶解した。０．７２ｍＣｉ（１２．６μＭ）の^１４Ｃ－ホルムアルデヒド（５７Ｃｉｍｏｌ^－１、Ｐｈａｒｍａｒｏｎ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１００ｍｍｏｌまで、水中）を加え、続いて、１５秒間ボルテックスにかけた。反応物を室温で一晩インキュベートした。分析用に１０μＬの反応物を１ｍＬの水中に取っておき、その後、^１４Ｃメチル化ペプチドをＳｔｒａｔａ－Ｘ逆相カラム（３０ｍｇ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、３ｍＬのメタノール及び３ｍＬの水で洗浄）で精製した。ローディングした後、カラムを４ｍＬの水で洗浄し、メタノール中４ｍＬの２％ギ酸で溶出した。標識したＣＤＰをブローダウン蒸発器（窒素流下４０℃）内で乾燥させ、使用するまで１８℃で保存した。比活性度をシンチレーション計測によって決定した。配列番号１のバリアントのバリアント比活性度は、次のとおりであった。配列番号１：１８０分の動物で３２Ｃｉ／ｍｏｌ、３０分の動物で１８７Ｃｉ／ｍｏｌ。配列番号２：１８０分の動物で２６０Ｃｉ／ｍｏｌ、３０分の動物で１７９Ｃｉ／ｍｏｌ。配列番号３２：１８０分の動物で２７３Ｃｉ／ｍｏｌ、３０分の動物で１４７Ｃｉ／ｍｏｌ。配列は、Ｎ末端に「Ｇ」及び「Ｓ」のアミノ酸を有するように操作した。ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶ９１：１９８３ｐ．５７０及びＪＢＣ２５４（１１）：１９７９ｐ．４３５９を参照されたい。過剰なホルムアルデヒドを使用して、完全なメチル化（あらゆる遊離アミンのジメチル化）を誘導した。

実施例２０
ペプチドと検出可能な剤のコンジュゲート
本実施例は、ペプチドの色素標識について記載する。本開示のペプチドを組換え発現させるか、または化学合成し、次いで、ＤＣＣまたはＥＤＣの存在下で、活性化エステル（例えば、ＮＨＳエステル）を介して、ペプチドのＮ末端を検出可能な剤にコンジュゲート、連結、または融合させて、ペプチドと検出可能な剤のコンジュゲートを作製する。検出可能な剤は、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａフルオロフォア、またはＡｌｅｘａ６４７などのシアニン色素であり得る。

ペプチドと検出可能な剤のコンジュゲートを対象に投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。投与後、ペプチド検出可能な剤コンジュゲートは、腎臓にホーミングする。対象、または対象からの生検を画像化し、ペプチドと検出可能な剤のコンジュゲートの腎臓への局在化を可視化する。いくつかの態様において、腎障害の診断は、投与後の腎臓におけるペプチドと検出可能な剤のコンジュゲートの可視化に基づく。

実施例２１
ペプチドと活性薬剤のコンジュゲート
本実施例は、ペプチドと活性薬剤のコンジュゲートについて記載する。本開示のペプチドを組換え発現させるか、または化学合成し、次いで、ＤＣＣまたはＥＤＣの存在下で、活性化エステル（例えば、ＮＨＳエステル）を介して、ペプチドのＮ末端を活性薬剤にコンジュゲート、連結、または融合させて、ペプチドと活性薬剤のコンジュゲートを作製する。

ペプチドと活性薬剤のコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。投与後、ペプチドと活性薬剤のコンジュゲートは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスを介して内皮障壁を越えて器官にトランスサイトーシスされる。内皮障壁は、血液脳関門（ＢＢＢ）である。ペプチドと活性薬剤のコンジュゲートは、対象が治療を受けている状態、例えば、脳癌を改善する。

実施例２２
結合親和性を改善するペプチド変異
本実施例は、受容体結合のオフレートを減少させ、及び／またはオンレート増加させるペプチドの変異について例示する。

部位飽和変異導入（ＳＳＭ）または任意のランダム変異導入法を使用して本開示のペプチドを変異させることで、オフレートを増加もしくは減少させ、及び／またはオンレートを増加させることにより、結合親和性を増加または減少させる。ペプチドは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１に示されるペプチドのいずれか１つから選択する。脳実質などの標的組織へのペプチドの送達速度を測定して、所与の用途におけるペプチドの最適な結合親和性を決定する。

実施例２３
がんの治療
本実施例は、本開示のペプチドを使用したがんの治療について例示する。

本開示のペプチドを組換え発現させるか、または化学合成し、その後、治療用分子に連結する。ペプチドまたはペプチドコンストラクトをがんの治療薬として、それを必要とする対象に医薬組成物で投与する。ペプチドは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１の配列を有するペプチドまたはペプチドコンストラクトのいずれか１つから選択する。１つ以上のペプチドを対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物であり得る。医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、または経口投与する。本明細書に記載されるペプチド－薬物コンジュゲートで治療されるがんは、脳癌またはＣＮＳ関連癌であり得る。

実施例２４
がんの併用治療
本実施例は、本開示のペプチドを使用したがんの併用治療について例示する。本開示のペプチドを組換え発現させるか、または化学合成し、直接使用する。抗がん活性を有する活性薬剤にペプチドをコンジュゲート、連結、または融合させる。ペプチドをがんの治療薬として、それを必要とする対象に医薬組成物で投与する。ペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１の配列を有するペプチドのいずれか１つから選択する。

１つ以上のペプチドを、とりわけ、シスプラチン、メトトレキサート、ドセタキセル、及びエトポシドなどの標準的な小分子または化学療法の治療レジメンとともに、対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物である。医薬組成物を静脈内、皮下、筋肉内、経口投与するか、または腫瘍微小環境に直接注射する。標準的な小分子療法と合わせて投与されたペプチド－コンジュゲートは、対象のがん状態を治療する。がんの状態は、脳癌、乳癌、肝癌、または結腸癌であり得る。

実施例２５
ＴｆＲ結合ペプチドを用いた脳状態のイメージング
本実施例は、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクト（例えば、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ）を使用して、ペプチドに結合された検出可能な薬剤分子をＣＮＳに輸送することで脳状態をイメージングすることについて例示する。

実施例２０に記載されているように、本開示のペプチドを検出可能な剤にコンジュゲートする。ペプチドと検出可能な剤のコンジュゲートをそれを必要とする対象に投与する。対象は、脳癌またはアルツハイマー病などの状態を有する。対象は、ヒトまたは動物である。ペプチドと検出可能な剤のコンジュゲートを静脈内、皮下、筋肉内、経口投与するか、または腫瘍微小環境に直接注射する。

任意選択により、親和性部分、例えば、アミロイドプラークに対するＦ－１８などの親和性部分にペプチドを更に連結する。ペプチドと検出可能な剤は、ＴｆＲペプチド媒介性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを通過する。非侵襲性イメージングを実施して脳内の検出可能な剤を可視化することで、対象の状態を診断または追跡することが可能となる。

実施例２６
ＴｆＲ結合ペプチドによる脳癌の治療
本実施例は、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクト（例えば、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ）を使用して、ペプチドに結合された治療薬分子をＣＮＳ及び腫瘍細胞に輸送することで脳癌を治療することについて例示する。

実施例２１に記載されているように、本開示のペプチドを活性薬剤に連結する。活性薬剤は、テモゾロミドである。対象は、ヒトまたは動物である。ペプチドと検出可能な剤のコンジュゲートを静脈内、皮下、筋肉内、経口投与するか、または腫瘍微小環境に直接注射する。ペプチドと活性薬剤のコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与する。対象は、脳癌を有する。投与後、ペプチドと活性薬剤のコンジュゲートは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、がんが局在する脳実質にアクセスする。ペプチドと活性薬剤のコンジュゲートは、脳癌を改善及び／または根治する。

このデータは、一般に脳へのアクセスが妨げられている活性薬剤（例えば、ＢＢＢの内皮細胞の通過を妨げるＰ糖タンパク質トランスポーターの基質であるテモゾロミド）が、ＢＢＢを越えて効率的に輸送され、脳内に位置する疾患及び状態（例えば、がん）を予防及び／または治療することができることを示す。

実施例２７
細胞透過ペプチド融合体
本実施例は、細胞透過ペプチド融合体について記載する。本開示のＴｆＲ結合ペプチドを、追加の細胞透過ペプチド部分への融合体として組換え発現させる。ＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つから選択する。細胞透過ペプチド部分は、本開示の任意のＴｆＲ結合ペプチドのＮ末端にコンジュゲート、連結、もしくは融合されたＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号７３）配列などの１つもしくは複数のＡｒｇ残基、またはＮ末端にコンジュゲート、連結、もしくは融合された配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９９）を含むＴａｔペプチドである。あるいは、細胞透過ペプチド部分は、マウロカリン、インペラトキシン、ハドルカルシン、ヘミカルシン、オプリカリン－１、オピカルシン－２、ミッドカイン（６２－１０４）、ＭＣｏＴＩ－ＩＩ、またはクロロトキシンから選択し、本開示の任意のＴｆＲ結合ペプチドのＮ末端に融合させる。あるいは、細胞透過ペプチド部分は、ＴＡＴ、例えば、ＣｙｓＴＡＴ（配列番号７１）、Ｓ１９－ＴＡＴ（配列番号７２）、Ｒ８（配列番号７３）、ｐＡｎｔｐ（配列番号７４）、Ｐａｓ－ＴＡＴ（配列番号７５）、Ｐａｓ－Ｒ８（配列番号７６）、Ｐａｓ－ＦＨＶ（配列番号７７）、Ｐａｓ－ｐＡｎｔＰ（配列番号７８）、Ｆ２Ｒ４（配列番号７９）、Ｂ５５（配列番号８０）、アズリン（配列番号８１）、ＩＭＴ－Ｐ８（配列番号８２）、ＢＲ２（配列番号８３）、ＯＭＯＴＡＧ１（配列番号８４）、ＯＭＯＴＡＧ２（配列番号８５）、ｐＶＥＣ（配列番号８６）、ＳｙｎＢ３（配列番号８７）、ＤＰＶ１０４７（配列番号８８）、Ｃ１０５Ｙ（配列番号８９）、トランスポータン（配列番号９０）、ＭＴＳ（配列番号９１）、ｈＬＦ（配列番号９２）、ＰＦＶＹＬＩ（配列番号９３）、またはｙＢＢＲ（配列番号９４）から選択し、本開示の任意のＴｆＲ結合ペプチドのＮ末端に融合させる。あるいは、細胞透過ペプチド部分は、リンカーによって、本開示の任意のＴｆＲ結合ペプチドのＮ末端に融合させる。リンカーは、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１１３）、ＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮ（配列番号１１４）（ＤｋＴｘ由来のリンカー）、またはＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号１１５）（ヒトＩｇＧ３由来のリンカー）、または任意の他のリンカーから選択する。あるいは、ＴｆＲ結合ペプチド、細胞透過ペプチド部分、及び任意選択によりリンカーは、他の手段によって接続させる。例えば、他の手段としては、任意の位置での化学コンジュゲーション、細胞透過ペプチド部分及び／またはリンカーのＴｆＲ結合ペプチドのＣ末端への融合、リポソームとの共製剤化、または他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。

細胞透過ペプチド融合体またはコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物であり、脳癌または他の脳状態などの疾患を有する。投与後、ＴｆＲ結合ペプチドは、ＢＢＢを越えるトランスサイトーシスを促進し、細胞透過ペプチドは、細胞膜を通過して細胞内コンパートメントにアクセスするのを促進する。

実施例２８
核局在化を促進するペプチド融合体
本実施例は、核局在化を促進するペプチド融合体について記載する。本開示のＴｆＲ結合ペプチドを組換え発現させるか、または化学合成する。ペプチドまたはペプチドコンストラクトは、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１の任意の配列から選択する。ＴｆＲ結合ペプチドをＫ－Ｋ／Ｒ－Ｘ－Ｋ／Ｒ（配列番号１２９）（配列中、Ｘは、任意のアミノ酸またはそのバリアントであり得る）の４残基配列などの核局在化シグナルにコンジュゲート、連結、または融合させる（Ｌａｎｇｅｅｔａｌ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００７Ｆｅｂ２３；２８２（８）：５１０１－５）。ペプチド融合体を、それを必要とする対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物であり、脳癌または他の脳状態などの疾患を有する。投与後、ＴｆＲ結合ペプチドは、ＢＢＢを越えるトランスサイトーシスを促進し、核局在化シグナルは、核への輸送を促進する。

実施例２９
免疫療法剤による脳癌の治療
本実施例は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、もしくはＰＤＬ－１標的薬剤、またはＩＬ１５、もしくは融合されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ、ＩＦＮガンマ、または抗ＣＤ３融合ポリペプチドなどの１つ以上の免疫治療薬にコンジュゲート、連結、または融合された本開示のペプチドまたはペプチドコンストラクト（例えば、配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つ）を使用した、脳癌（例えば、膠芽腫、星細胞腫、正中膠腫、ＤＩＰＧ、髄芽腫、ＭＹＣもしくはＭＹＣＮ増幅脳腫瘍、または上衣腫）の治療について例示する。本実験において、免疫治療薬は、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ－１抗体）である。

配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つの配列を有するＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトを組換え発現させるか、または化学合成する。液体クロマトグラフィー（例えば、逆相、イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフ）を使用して精製したら、次いで、実施例２１に記載される方法に従って、ペプチドをペンブロリズマブまたはその機能性フラグメント（例えば、可変鎖フラグメント）にコンジュゲートする（あるいは、ペプチドは、ペンブロリズマブ（または任意の他の免疫治療薬）またはその機能性フラグメントに連結、または融合（例えば、組換え発現）させてもよい）。コンジュゲートを精製し、対象（例えば、マウスまたはヒト）への注射用に製剤化する。

それを必要とする対象への投与後、ペンブロリズマブまたはその機能性フラグメントにコンジュゲートしたＴｆＲ結合ペプチドを含むペプチドコンストラクトは、小胞性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを透過し、ＣＮＳに蓄積する。核イメージング（例えば、陽電子放出断層撮影、コンピューター断層撮影（ＰＥＴ）、または磁気共鳴画像法）及び脳癌を罹患している対象から採取された組織または生検サンプルは、ペプチドコンストラクトが対象の腫瘍組織量を大幅に減少させることを示す。全身イメージング（例えば、ＷＢＡまたはＰＥＴ）は、ペプチドコンストラクトが脳内だけでなく、対象の体内の他の位置（例えば、肝臓、肺、及び骨）の腫瘍サイズ及び疾患の部位も縮小させることを示す。

実施例３０
ニューロテンシン含有ペプチドコンストラクトを使用した神経障害性疼痛の治療
本実施例は、本明細書に記載されるニューロテンシン（ＮＴ）に融合、組換え発現、化学合成、または別様にコンジュゲートされたＴｆＲ結合ペプチドを使用してニューロテンシンをＣＮＳ内に輸送することで神経障害性疼痛を治療することについて例示する。

配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つの配列を有するＴｆＲ結合ペプチドを組換え発現させるか、または化学合成する。任意選択により、液体クロマトグラフィー（例えば、逆相、イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフ）を使用してペプチドを精製し、実施例２１に記載される方法に従って、更にＮＴにコンジュゲートする。配列番号３５０、配列番号３６５～配列番号３７１のいずれか１つの配列を有するＮＴペプチド、またはその機能性フラグメントをＴｆＲ結合ペプチドと組換え発現させるか、または化学合成して、ペプチド－ＮＴコンストラクトを形成する。あるいは、ペプチドを、ニューロテンシン、またはその機能性フラグメントと、ペプチド－ＮＴ融合体（例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、または配列番号３５９～配列番号３６１に示されるペプチド－ＮＴコンストラクト）として組換え発現させるか、または化学合成し、任意選択により、液体クロマトグラフィー（例えば、逆相、イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフ）を使用して精製する。ＮＴの機能性フラグメントは、少なくとも８アミノ酸残基長、少なくとも１０アミノ酸残基長、または少なくとも１３アミノ酸残基長であるフラグメントであり得る。精製されたＮＴコンジュゲートまたは融合ペプチド（「ペプチドコンストラクト」）を対象（例えば、マウスまたはヒト）への注射用に製剤化する。

投与後、ペプチドコンストラクトは、ＢＢＢを透過し、ＣＮＳに蓄積する。神経障害性疼痛の症状は、ＮＴ部分のＮＴ受容体への効果的な標的化により、対象において大幅に減少する。

本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、治療上有効な濃度のＮＴ受容体結合ペプチドをＣＮＳに提供し、神経障害性疼痛を効果的に治療する。

実施例３１
ペプチド－ＮＴコンストラクトによる疼痛の治療または管理
本実施例は、疼痛を治療または管理するための方法を記載する。この方法は、急性及び／または慢性症状の治療として使用される。本開示のペプチドを発現させ、本明細書に記載される損傷または他の状態の結果としての疼痛の治療薬として医薬組成物で患者に投与する。本開示のペプチドをニューロテンシンに融合させる。ペプチドを組換え発現させるか、または化学合成する。

本明細書で開示される任意のペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３７～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）をＮＴに融合させて、ペプチド－ＮＴコンストラクトを形成する。配列番号３５０、配列番号３６５～配列番号３７１のいずれか１つの配列を有するＮＴペプチド、またはその機能性フラグメントをＴｆＲ結合ペプチドと組換え発現させるか、または化学合成して、ペプチド－ＮＴコンストラクトを形成する。

あるいは、本明細書で開示されるペプチド－ＮＴコンストラクト（例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、または配列番号３５９～配列番号３６１のいずれか１つ）を使用する。任意選択により、ＴｆＲ結合機能を維持しつつ、ニューロテンシンのニューロテンシン受容体との相互作用を追加または増加させるようにペプチドを変異させる。任意選択により、液体クロマトグラフィー（例えば、逆相、イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフ）を使用してペプチド－ＮＴコンストラクトを精製する。ペプチドを投与用に製剤化し、対象に投与する。投与後、ペプチドコンストラクトは、疼痛に冒されている領域、組織、または系を標的とする。ペプチドコンストラクトは、疼痛を調節することができる。そのような疼痛の調節は、炎症、自己免疫応答、疼痛受容体に対する直接的もしくは間接的作用、細胞殺傷、またはプログラム細胞死を調節することなどの様々な機序によって作用し得る。１つ以上のペプチドをヒトまたは動物に皮下、静脈内、もしくは経口投与するか、または注射する。

実施例３２
ニューロテンシン含有ペプチドコンストラクトを使用した慢性疼痛の治療
本実施例は、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、または配列番号３５９～配列番号３６１のペプチド－ＮＴ融合体）またはＮＴに融合され得るペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８）を使用してニューロテンシン（ＮＴ、配列番号３５０）をＣＮＳ内に輸送することで神経障害性疼痛を治療することについて例示する。

配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つの配列を有するＴｆＲ結合ペプチド、またはＮＴに融合させたＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、または配列番号３５９～配列番号３６１のいずれか１つ）を組換え発現させるか、または化学合成することができる。液体クロマトグラフィー（例えば、逆相、イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフ）を使用して精製したら、実施例２１に記載される方法に従って、任意選択により、ペプチドをニューロテンシン（ＮＴ）またはその機能性フラグメントに更にコンジュゲートしてもよい。ＮＴの機能性フラグメントは、少なくとも８アミノ酸残基長、少なくとも１０アミノ酸残基長、または少なくとも１３アミノ酸残基長であるフラグメントであり得る。配列番号３５０、配列番号３６５～配列番号３７１のいずれか１つの配列を有するＮＴペプチド、またはその機能性フラグメントをＴｆＲ結合ペプチドと組換え発現させるか、または化学合成して、ペプチド－ＮＴコンストラクトを形成する。あるいは、例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、または配列番号３５９～配列番号３６１のペプチド－ＮＴ融合体を作製するのに使用したように、ペプチドをニューロテンシンもしくはその機能性フラグメントに融合させる（例えば、組換え発現させる）か、または、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のペプチドなどにＮＴを融合させるために使用し、次いで、組換え発現させ、本明細書に記載されるようにまたは他の既知の方法を使用して精製することができる。

ペプチド－ニューロテンシン融合体またはコンジュゲートを対象（例えば、マウスまたはヒト）への注射用に製剤化する。コンジュゲートの投与後、ペプチドコンストラクトは、ＢＢＢを透過し、ＣＮＳに蓄積する。慢性疼痛は、ＮＴ部分のＮＴ受容体への効果的な標的化により、対象において大幅に減少する。

ペプチドは、それ自体が疼痛を調節することができるか、または、疼痛を調節する薬剤にコンジュゲートすることができる。そのような疼痛の調節は、炎症、自己免疫応答、疼痛受容体に対する直接的もしくは間接的作用、細胞殺傷、またはプログラム細胞死を調節することなどの様々な機序によって作用し得る。ペプチド－ＮＴ融合体は、慢性損傷、疾病、または家族性エピソード性疼痛症候群、皮膚紅痛症、もしくは発作性激痛症を含む慢性状態に由来するものを含む、慢性疼痛の治療に使用することができる。

実施例３３
ニューロテンシン含有ペプチドコンストラクトを使用した急性疼痛の治療
本実施例は、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、または配列番号３５９～配列番号３６１のペプチド－ＮＴ融合体）またはＮＴに融合され得るペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８）を使用してニューロテンシン（ＮＴ、配列番号３５０）をＣＮＳ内に輸送することで神経障害性疼痛を治療することについて例示する。

配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つの配列を有し、任意選択により、ＮＴに融合させたＴｆＲ結合ペプチドを組換え発現させるか、または化学合成することができる。液体クロマトグラフィー（例えば、逆相、イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフ）を使用して精製したら、実施例２１に記載される方法に従って、ペプチドをニューロテンシン（ＮＴ）またはその機能性フラグメントに更にコンジュゲートしてもよい。ＮＴの機能性フラグメントは、少なくとも８アミノ酸残基長、少なくとも１０アミノ酸残基長、または少なくとも１３アミノ酸残基長であるフラグメントであり得る。配列番号３５０、配列番号３６５～配列番号３７１のいずれか１つの配列を有するＮＴペプチド、またはその機能性フラグメントをＴｆＲ結合ペプチドと組換え発現させるか、または化学合成して、ペプチド－ＮＴコンストラクトを形成する。あるいは、例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、または配列番号３５９～配列番号３６１のペプチド－ＮＴ融合体を作製するのに使用したように、ペプチドをニューロテンシンもしくはその機能性フラグメントに融合させる（例えば、組換え発現させる）か、または、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のペプチドなどにＮＴを融合させるために使用し、次いで、組換え発現させ、本明細書に記載されるようにまたは他の既知の方法を使用して精製することができる。

ペプチド－ニューロテンシン融合体またはコンジュゲートを対象（例えば、マウスまたはヒト）への注射用に製剤化する。コンジュゲートの投与後、ペプチドコンストラクトは、ＢＢＢを透過し、ＣＮＳに蓄積する。急性疼痛は、ＮＴ部分のＮＴ受容体への効果的な標的化により、対象において大幅に減少する。

ペプチドは、それ自体が疼痛を調節することができるか、または、疼痛を調節する薬剤にコンジュゲートすることができる。そのような疼痛の調節は、炎症、自己免疫応答、疼痛受容体に対する直接的もしくは間接的作用、細胞殺傷、またはプログラム細胞死を調節することなどの様々な機序によって作用し得る。ペプチド－ＮＴ融合体は、急性損傷、疾病、もしくは急性状態に由来するもの、または侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、アロディニア、幻痛、内臓痛、突出痛に由来するものを含む、急性疼痛の治療に使用することができる。対象は、５分から１時間以内に迅速な疼痛緩和を経験し、疼痛緩和は、３時間を超えて持続し得る。

実施例３４
イブプロフェンとペプチドのコンジュゲート
本実施例は、ＰＥＧリンカーを使用した本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８）へのイブプロフェンのコンジュゲーションについて記載する。ＴｆＲ結合ペプチドを組換え発現させるか、または化学合成することができる。任意選択により、液体クロマトグラフィー（例えば、逆相、イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフ）または他の既知の方法を使用してペプチドを精製する。“Ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｓｔｕｄｙｏｆｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｉｂｕｐｒｏｆｅｎｔｏｅｘｔｅｎｄｔｈｅｄｕｒａｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｏｎ，” ＳｃｉｅｎｔｉａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ，２０１１，７９：３５９－３７３，ＮａｙａｋａｎｄＪａｉｎに記載されているように、加水分解され得るエステル結合を形成するＰＥＧリンカー及びイブプロフェンを使用してペプチド－イブプロフェンコンジュゲートを生成する。Ｆｉｓｃｈｅｒエステル化を使用して、イブプロフェンと短いＰＥＧ、例えば、トリエチレングリコールをコンジュゲートして、イブプロフェン－エステル－ＰＥＧ－ＯＨを得る。

上記のＰＥＧ－イブプロフェンコンジュゲートの調製後、ＰＥＧのヒドロキシル部分をＮ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）で活性化してイブプロフェン－エステル－ＰＥＧ－スクシンイミジルカーボネートを形成し、次いで、それをペプチドのリシンまたはＮ末端と反応させてイブプロフェン－エステル－ＰＥＧ－ペプチドコンジュゲートを形成する。ペプチド－イブプロフェン融合体またはコンジュゲートを対象（例えば、マウスまたはヒト）への注射用に製剤化する。コンジュゲートの投与後、ペプチドコンストラクトは、小胞性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを透過し、ＣＮＳに蓄積する。コンジュゲートは、抗炎症活性を呈することができ、または、遊離イブプロフェンがコンジュゲートから放出されて抗炎症活性を提供する。遊離イブプロフェンは、エステル結合での加水分解などの投与後に生じる加水分解から生じ得る。

ペプチドは、それ自体が疼痛を調節することができるか、または、疼痛を調節する薬剤（例えば、イブプロフェン）にコンジュゲートすることができる。そのような疼痛の調節は、炎症、自己免疫応答、疼痛受容体に対する直接的もしくは間接的作用、細胞殺傷、またはプログラム細胞死を調節することなどの様々な機序によって作用し得る。イブプロフェン－ペプチドコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与する。対象は、ヒトまたはヒト以外の動物であり得る。

実施例３５
ペプチドとダラザチドのコンジュゲート
本実施例は、自己免疫疾患の治療のためのＫ_ｖ１．３カリウムチャネル阻害薬にコンジュゲートされた本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）について記載する。この事例において、Ｋ_ｖ１．３阻害薬は、ダラザチドである。

本開示のペプチドを組換え発現させるか、または化学合成し、次いで、ＤＣＣまたはＥＤＣの存在下で、活性化エステル（例えば、ＮＨＳエステル）を介して、ペプチドのＮ末端をダラザチドにコンジュゲート、連結、または融合させて、ＴｆＲ結合ペプチド－ダラザチドコンジュゲートを作製する。

ペプチドコンストラクトは、それを必要とする対象に投与される。ペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、または経口投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。投与後、ペプチド－Ｋ_ｖ１．３阻害薬コンジュゲートは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシス及び／またはＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して、目的の組織または器官に送達される。ペプチド－ダラザチドコンジュゲートは、対象が治療を受けている自己免疫疾患または状態、例えば、自己反応性Ｔリンパ球によって引き起こされるものを改善する。

このデータは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが治療上有効な濃度のＫ_ｖ１．３阻害薬をＣＮＳに提供し、自己免疫障害を治療することを示す。Ｋ_ｖ１．３阻害薬単独での治療と比較して、治療活性が改善する。

実施例３６
ペプチド４ＳＣ－２０２コンジュゲート
本実施例は、自己免疫疾患の治療のためのＫ_ｖ１．３カリウムチャネル阻害薬にコンジュゲートされた本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）について記載する。この事例において、Ｋ_ｖ１．３阻害薬は、４ＳＣ－２０２（トシル酸ドマチノスタット）である。

本開示のペプチドを組換え発現させるか、または化学合成し、次いで、ＤＣＣまたはＥＤＣの存在下で、例えば、活性化エステル（例えば、ＮＨＳエステル）を介して、ペプチドのＮ末端を４ＳＣ－２０２にコンジュゲート、連結、または融合させて、ＴｆＲ結合ペプチド－４ＳＣ－２０２コンジュゲートを作製する。

ペプチドコンストラクトは、それを必要とする対象に投与される。ペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、または経口投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。投与後、ペプチド－Ｋ_ｖ１．３阻害薬コンジュゲートは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシス及び／またはＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して、目的の組織または器官に送達される。ペプチド－４ＳＣ－２０２は、小胞性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを透過し、ＣＮＳに蓄積する。ペプチド－４ＳＣ－２０２コンジュゲートは、対象が治療を受けている自己免疫疾患または状態、例えば、自己反応性Ｔリンパ球によって引き起こされるものを改善する。

このデータは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが治療上有効な濃度のＫ_ｖ１．３阻害薬を提供し、自己免疫障害を治療することを示す。Ｋ_ｖ１．３阻害薬単独での治療と比較して、治療活性が改善する。

実施例３７
ＴｆＲ結合ペプチドと抗Ｋ_ｖ１．３ペプチドのコンジュゲート
本実施例は、自己免疫疾患の治療のためのＫｖ１．３カリウムチャネル阻害薬にコンジュゲート、連結、または融合された本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）について記載する。この事例において、Ｋｖ１．３阻害薬は、ペプチド（例えば、Ｖｍ２４（配列番号３７８）、ＳｈＫ－１７０、ＳｈＫ－１８６（配列番号３７９）、またはＳｈＫ－１９２）である。

本開示のペプチドを組換え発現させるか、または化学合成し、次いで、ＤＣＣまたはＥＤＣの存在下で、例えば、活性化エステル（例えば、ＮＨＳエステル）を介して、ペプチドのＮ末端を抗Ｋ_ｖ１．３ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合させて、ＴｆＲ結合ペプチド－抗Ｋ_ｖ１．３ペプチドコンストラクトまたは融合ペプチド（組換え作製の場合）を作製する。抗Ｋ_ｖ１．３ペプチドは、Ｖｍ２４（配列番号３７８）、ＳｈＫ－１７０、ＳｈＫ－１８６（配列番号３７９）、ＳｈＫ－１９２、または別の抗Ｋ_ｖ１．３ペプチド配列である。

ペプチドコンストラクトを、それを必要とする対象に投与する。ペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、または経口投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。投与後、ＴｆＲ結合ペプチド－抗Ｋ_ｖ１．３ペプチドコンストラクトまたは融合ペプチドは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシス及び／またはＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して、目的の組織または器官に送達される。ＴｆＲ結合ペプチド－抗Ｋ_ｖ１．３ペプチドコンストラクトまたはペプチドコンストラクトは、小胞性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを透過し、ＣＮＳに蓄積する。ＴｆＲ結合ペプチド－抗Ｋ_ｖ１．３ペプチドコンストラクトまたはペプチドコンストラクトは、対象が治療を受けている自己免疫疾患または状態を改善する。

これは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが治療上有効な濃度のＫ_ｖ１．３阻害薬を提供し、自己免疫障害を治療することを示す。Ｋ_ｖ１．３阻害薬単独での治療と比較して、治療活性が改善する。

実施例３８
神経変性疾患の治療のためのＴｆＲ結合ペプチドとＫ_ｖ１．３阻害薬のコンジュゲート
本実施例は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、ライム病、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳失調症、バッテン病、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、クフォー・ラケブ症候群、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、慢性外傷性脳症、または前頭側頭型認知症）の治療のためのＫ_ｖ１．３カリウムチャネル阻害薬などのイオンチャネル調節剤にコンジュゲート、連結、または融合された本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）について記載する。Ｋ_ｖ１．３阻害薬は、小分子（例えば、ダラザチドまたは５－（４－フェノキシブトキシ）ソラレン）及びペプチド（例えば、ＳｈＫ－１７０、ＳｈＫ－１８６、またはＳｈＫ－１９２）を含み得る。

本開示のペプチドを組換え発現させるか、または化学合成し、次いで、ＤＣＣまたはＥＤＣの存在下で、例えば、活性化エステル（例えば、ＮＨＳエステル）を介して、ペプチドのＮ末端を１つ以上のＫ_ｖ１．３阻害薬（例えば、ダラザチド、５－（４－フェノキシブトキシ）ソラレン、ＳｈＫ－１７０、ＳｈＫ－１８６、またはＳｈＫ－１９２）にコンジュゲート、連結、または融合させて、ＴｆＲ結合ペプチド－抗Ｋ_ｖ１．３ペプチドコンジュゲート、融合ペプチド、またはペプチドコンストラクト（該当する場合）を作製する。ペプチドコンストラクトを、それを必要とする対象に投与する。ペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、または経口投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。投与後、ＴｆＲ結合ペプチド－Ｋ_ｖ１．３阻害薬コンジュゲートまたはペプチドコンストラクトは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシス及び／またはＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して、目的の組織または器官に送達される。ＴｆＲ結合ペプチド－Ｋ_ｖ１．３阻害薬コンジュゲートまたはペプチドコンストラクトは、小胞性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを透過し、ＣＮＳに蓄積する。ＴｆＲ結合ペプチド－Ｋ_ｖ１．３阻害薬コンジュゲートまたはペプチドコンストラクトは、対象が治療を受けている神経変性疾患または状態を改善する。

これは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが治療上有効な濃度のＫ_ｖ１．３阻害薬を提供し、神経変性疾患を治療することを示す。Ｋ_ｖ１．３阻害薬単独での治療と比較して、治療活性が改善する。

実施例３９
ＴｆＲ結合ペプチドとベルベセスタットのコンジュゲート
本実施例は、アルツハイマー病の治療のためのＢＡＣＥ阻害薬ベルベセスタットにコンジュゲートされた本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）について記載する。

本開示のペプチドを組換え発現させるか、または化学合成し、次いで、ＤＣＣまたはＥＤＣの存在下で、例えば、活性化エステル（例えば、ＮＨＳエステル）を介して、ペプチドのＮ末端をベルベセスタットにコンジュゲート、連結、または融合させて、ＴｆＲ結合ペプチド－ベルベセスタットコンジュゲートを作製する。

ペプチドコンストラクトを、それを必要とする対象に投与する。ペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、または経口投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。投与後、ＴｆＲ結合ペプチド－ベルベセスタットコンジュゲートは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシス及び／またはＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して、目的の組織または器官に送達される。ＴｆＲ結合ペプチド－ベルベセスタットコンジュゲートは、ＴｆＲ媒介性小胞性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを越えて効率的に輸送され、ＣＮＳに蓄積する。ＴｆＲ結合ペプチド－ベルベセスタットコンジュゲートは、対象のアルツハイマー病を改善する。

これは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが治療上有効な濃度のＢＡＣＥ阻害薬を提供し、アルツハイマー病を治療することを示す。ＢＡＣＥ阻害薬単独での治療と比較して、治療活性が改善する。

実施例４０
非ＢＢＢ透過活性薬剤を含むペプチドコンストラクトによる脳癌の治療
本実施例は、非ＢＢＢ透過活性薬剤（例えば、ドキソルビシン）にコンジュゲート、連結、または融合された本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つの配列を有するペプチド）を含むＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを使用して、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスを介してＣＮＳに薬剤を輸送し、そうでなければ治療不可能であるか、または薬物だけでは極めて限られた有効性しか示さない脳腫瘍（例えば、膠芽腫、星細胞腫、正中膠腫、ＤＩＰＧ、髄芽腫、ＭＹＣもしくはＭＹＣＮ増幅脳腫瘍、または上衣腫）を治療する、脳癌の治療について例示する。

本開示のペプチドを組換え発現させるか、または化学合成する。実施例２１に記載されているように、本開示のペプチドを活性薬剤にコンジュゲート、連結、または融合させる。ペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、経口投与するか、または腫瘍微小環境に直接注射する。ペプチドコンストラクトを、それを必要とする対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物である。対象は、脳癌を有する。投与後、ペプチドコンストラクトは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、がんが局在する脳の領域（複数可）にアクセスする。非ＢＢＢ透過薬剤を含むペプチドコンストラクトは、脳癌を改善及び／または根治する。

このデータは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドを使用して治療上有効な濃度の治療薬（例えば、ドキソルビシン）を、治療薬単独ではアクセスすることができない細胞、組織、または器官に提供することができることを示す。

実施例４１
ＴｆＲ結合ペプチドを使用した骨髄への標的化
本実施例は、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）を使用した骨髄への標的化について記載する。ＴｆＲ結合ペプチドを、疾患の治療または診断のための活性薬剤または検出可能な剤にそれぞれコンジュゲート、連結、または融合することができる。

実施例１及び／または実施例２に従って、本開示のＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトを組換え発現させるか、または化学合成する。ＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトを、それを必要とする対象に投与する。ＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、経口投与するか、または腫瘍微小環境に直接注射する。対象は、ヒトまたは動物である。投与後、ＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシス及び／またはＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して骨髄に送達される。

対象の骨髄におけるＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトの存在は、組織サンプル及び／または非侵襲的イメージングを使用して確認され、それは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトが、ＴｆＲを発現する細胞、組織、または器官、例えば、治療的介入にとって重要な組織である骨髄を標的とすることに成功していることを示す。

実施例４２
ＴｆＲ結合ペプチドを使用した赤血球細胞への標的化
本実施例は、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）を使用した赤血球細胞または赤血球前駆細胞への標的化について記載する。ＴｆＲ結合ペプチドを、疾患の治療または診断のための活性薬剤または検出可能な剤にそれぞれコンジュゲート、連結、または融合することができる。

実施例１及び／または実施例２に従って、本開示のＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトを組換え発現させるか、または化学合成する。ペプチドまたはペプチドコンストラクトを、それを必要とする対象に投与する。ペプチドまたはペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、または経口投与する。対象は、ヒトまたは動物である。投与後、ＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシス及び／またはＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して、赤血球細胞または赤血球前駆細胞に送達される。

対象の赤血球細胞または赤血球前駆細胞におけるＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトの存在は、組織（例えば、骨髄サンプル）もしくは血液サンプルまたは非侵襲的イメージングを使用して確認され、それは、本開示のＴｆＲ結合ペプチド及びペプチドコンストラクトが、ＴｆＲを発現する細胞、組織、または器官、例えば、赤血球細胞または赤血球前駆細胞を標的とすることに成功していることを示す。

実施例４３
ＴｆＲ結合ペプチドを使用した筋細胞への標的化
本実施例は、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）を使用した筋細胞への標的化について記載する。ＴｆＲ結合ペプチドを、疾患の治療または診断のための活性薬剤または検出可能な剤にそれぞれコンジュゲート、連結、または融合することができる。

実施例１及び／または実施例２に従って、本開示のＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトを組換え発現させるか、または化学合成する。ＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトを、それを必要とする対象に投与する。ＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、または経口投与する。投与後、ＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトは、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシス及び／またはＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して、筋細胞または筋肉組織に送達される。

対象の筋細胞または筋肉組織におけるＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトの存在（特に、骨格筋組織における取り込み及び保持）は、組織（例えば、筋肉または骨格筋組織サンプル）もしくは血液サンプルまたは非侵襲的イメージングを使用して確認され、それは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトが、ＴｆＲを発現する細胞、組織、または器官、例えば、筋細胞または筋肉組織を標的とすることに成功していることを示す。

実施例４４
ＴｆＲ結合ペプチドを使用した炎症性腸疾患の治療
本実施例は、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）を使用した炎症性腸疾患の治療について記載する。ＴｆＲ結合ペプチドを、炎症性腸疾患の治療のための活性薬剤または検出可能な剤にコンジュゲート、連結、または融合させる。

実施例１及び／または実施例２に従って、本開示のＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを組換え発現させるか、または化学合成する。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを、それを必要とする対象に投与する。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、または経口投与する。対象は、ヒトまたは動物である。投与後、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、腸に送達され、腸の腺細胞に蓄積する。

活性薬剤を含むペプチドコンストラクトは、炎症性腸疾患を改善及び／または根治する。これは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドを使用して、炎症性腸疾患などの様々な疾患の治療のために、腸管内に治療上有効な濃度を提供することができることを示す。

実施例４５
ｐＨ依存性エンドソーム送達のためのＴｆＲ結合ペプチド
本実施例は、例えば、エンドソームｐＨ（例えば、ｐＨ５．４）で、ＴｆＲからｐＨ依存的に解離することが可能なＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチドコンストラクトの開発及びｉｎｖｉｔｒｏ試験について記載する。

ＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）またはペプチドコンストラクト（例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５９～配列番号３６１のいずれか１つ）の配列中に、１つ以上の追加のヒスチジン残基を導入する。得られたヒスチジンリッチＴｆＲ結合ペプチドを、そのＴｆＲ結合について、様々なｐＨレベルまたは範囲での比較結合実験で評価する。生理学的なｐＨで高いＴｆＲ結合親和性を有するが、エンドソームのｐＨ５．４などの低いｐＨレベルでは結合親和性が著しく低下するペプチドを、細胞結合、取り込み、及びエンドソーム内または小胞内放出実験のために選択する。

エンドソーム送達能力の高いＴｆＲ結合ペプチドを特定し、特徴付ける。これらの結果は、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが、ＴｆＲ結合ペプチドならびにエンドソーム及び／または細胞内送達のための１つ以上の活性薬剤を含むＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトの小胞内放出を可能にするｐＨ依存性ＴｆＲ結合動態を示すことができること、または示すように改変することができることを示す。

細胞内送達機能を改善するために、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド及びＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを、ペプチドまたはペプチドコンストラクトの低ｐＨエンドソーム脱出を促進するモチーフを含むように改変する。細胞取り込み及び放出実験は、低ｐＨエンドソーム脱出のためのモチーフを含むＴｆＲ結合ペプチド及びＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトが、低ｐＨエンドソーム脱出のためのモチーフを含まないペプチドと比較して、より高い濃度でサイトゾルに存在することを示す。このデータは、本開示のＴｆＲ結合ペプチド及びＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトが、そのＴｆＲ結合能力を保持しながら、小胞内及び細胞内送達を向上するように良好に改変できることを示す。これらのペプチドは、疾患及び状態の治療及び／または診断のための様々な治療薬及び／または化合物と組み合わせて使用することができる。

実施例４６
非ＣＮＳ組織に位置する疾患の治療のためのＴｆＲ結合ペプチド
本実施例は、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）を使用して、ＴｆＲを発現する非ＣＮＳ組織に位置する疾患の治療について記載する。

実施例１及び／または実施例２に従って、本開示のＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを組換え発現させるか、または化学合成する。任意選択により、疾患または状態の治療に使用される活性薬剤を、ＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合させて、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを形成することができる。活性薬剤は、任意選択により、ＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）に融合された本明細書で開示される任意のＮＴ（例えば、ニューロテンシン（配列番号３５０）またはニューロテンシンバリアント（例えば、配列番号３６５～配列番号３７１のいずれか１つ））、またはその機能性フラグメントである。ペプチド－ＮＴ融合体は、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、または配列番号３５９～配列番号３６１のいずれか１つであり得る。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを、それを必要とする対象に投与する。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、または経口投与する。対象は、ヒトまたは動物である。投与後、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、ＴｆＲを発現する非ＣＮＳ組織に蓄積する。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、疾患または状態を改善する。

このデータは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが、ＴｆＲを発現する非ＣＮＳ組織に効果的に蓄積し、したがって、これらの組織の１つ以上に位置する疾患または状態の治療及び／または予防に使用することができることを示す。

実施例４７
末梢性癌の治療のためのＴｆＲ結合ペプチド
本実施例は、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）を使用して、ＴｆＲを発現及び／または過剰発現する末梢性（例えば、非ＣＮＳ）癌の治療について記載する。末梢性癌は、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、脾癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、骨髄細胞癌、または皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、ＣＭＹＣ過剰発現腫瘍であり得る。

実施例１及び／または実施例２に従って、本開示のＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを組換え発現させるか、または化学合成する。任意選択により、末梢性癌の治療に使用される活性薬剤を、ＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合させて、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを形成することができる。活性薬剤は、任意選択により、ＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）に融合された本明細書で開示される任意のＮＴ（例えば、ニューロテンシン（配列番号３５０）もしくはニューロテンシンバリアント（例えば、配列番号３６５～配列番号３７１のいずれか１つ））、またはその機能性フラグメントである。ペプチド－ＮＴ融合体は、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、または配列番号３５９～配列番号３６１のいずれか１つであり得る。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを、それを必要とする対象に投与する。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、経口、または腫瘍内投与する。対象は、ヒトまたは動物である。投与後、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、ＴｆＲを発現及び／または過剰発現する末梢腫瘍組織に蓄積する。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、末梢性癌を改善する。

このデータは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが、ＴｆＲを発現する及び／またはＴｆＲを過剰発現する末梢性癌に効果的に蓄積し、したがって、これらの組織の１つ以上に位置する癌の治療及び／または予防に使用することができることを示す。

実施例４８
脾癌の治療のためのＴｆＲ結合ペプチド
本実施例は、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）を使用して、ＴｆＲを発現及び／または過剰発現する脾癌の治療について記載する。

実施例１及び／または実施例２に従って、本開示のＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを組換え発現させるか、または化学合成する。任意選択により、脾癌の治療に使用される活性薬剤を、ＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合させて、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを形成することができる。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを、それを必要とする対象に投与する。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、経口、または腫瘍内投与する。対象は、ヒトまたは動物である。投与後、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、分子イメージング（例えば、ＣＴ、ＭＲＩ）及び／または組織サンプルの分析によって示されるように、脾癌に蓄積する。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、脾癌を改善する。

このデータは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが、脾癌などのＴｆＲを発現する及び／またはＴｆＲを過剰発現する癌に効果的に蓄積し、したがって、脾癌または他の末梢性癌の治療及び／または予防に使用することができることを示す。

実施例４９
骨髄癌の治療のためのＴｆＲ結合ペプチド
本実施例は、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つ）を使用して、骨髄に位置し、ＴｆＲを発現及び／または過剰発現する癌の治療について記載する。

実施例１及び／または実施例２に従って、本開示のＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを組換え発現させるか、または化学合成する。任意選択により、骨髄癌の治療に使用される活性薬剤を、ＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合させて、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを形成することができる。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを、それを必要とする対象に投与する。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトを静脈内、皮下、筋肉内、経口、または腫瘍内投与する。対象は、ヒトまたは動物である。投与後、ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、分子イメージング（例えば、ＣＴ、ＭＲＩ）及び／または組織サンプルの分析によって示されるように、骨髄癌に蓄積する。ＴｆＲ結合ペプチドコンストラクトは、骨髄癌を改善する。

このデータは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが、骨髄の癌または骨髄に位置する癌などのＴｆＲを発現する及び／またはＴｆＲを過剰発現する末梢性癌に効果的に蓄積し、したがって、骨髄癌または他の末梢性癌の治療及び／または予防に使用することができることを示す。

実施例５０
ニューロテンシンを含むペプチドコンストラクト、ＣＮＳへの送達、及びニューロンＣＲＥレポーターマウスの活性化
本実施例は、本明細書に記載される１つ以上のＴｆＲ結合ペプチドを含むペプチドコンストラクトを使用したニューロンＣＲＥトランスポーターマウスの活性化について記載する。この事例において、ＴｆＲ結合ペプチド及びニューロテンシンペプチドを含む融合ペプチドを使用した。配列番号１、配列番号２、及び配列番号３２に対応するペプチド（配列番号１、配列番号２、及び配列番号３２はそれぞれ配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号６７にＮ末端ＧＳを付加したものである）を、各ペプチドのＣ末端でニューロテンシンと融合させて、それぞれ配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５のペプチド－ＮＴ複合体を生成した（それぞれ配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０にＮ末端ＧＳを付加したものである）。ニューロテンシンの下流活性には、細胞内Ｃａ^２＋制御及びｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）駆動型転写プログラム（図２８Ａ）が関与しており、慢性疼痛の抑制のために、その調節が探索されている。ニューロテンシン受容体に結合するＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクト（図２７）を生成した。実施例１～実施例４に記載されるように、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５を２９３Ｆ細胞で組換え発現させ、精製した。ＤＴＴ（還元剤）で処理した精製ペプチド－ＮＴ融合体（例えば、配列番号３３～配列番号３５）は、非還元サンプルと比較してゲルシフトを示すことから、組換えＮＴペプチドがシステインを含有することが示唆される（図２７）。精製ペプチドの分子量は、質量分析を使用して検証した。

ニューロテンシン受容体への結合は、ＮＴＳＲ１を発現するＨＥＫ－２９３細胞株で実証された。様々なタンパク質に対するニューロテンシン拡張が機能的であることを示すために、ＨＥＫ２９３細胞、またはヒトＮＴＳＲ１を送達するレンチベクターを形質導入したＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ＮＴＳＲ１）におけるＮＴＳＲ活性を、ＩＰ－Ｏｎｅ－Ｇｑキットを使用して測定した（ＣｉｓＢｉｏ６２ＩＰＡＰＥＢ、図２８Ｂ）。細胞をＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清中で成長させ、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いてプレートから取り出し、ペレット化し、ハンクス緩衝塩溶液中に１．５×１０^６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。ＨＴＦＲ反応は、ＨＴＦＲ９６ウェル低容量プレート（ＣｉｓＢｉｏ＃６６ＰＬ９６０２５）で製造元の説明書に従ってセットアップした。反応液２５μＬにつき１０，０００細胞（７μＬ）を使用した。プレートを３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、３μＬのＩＰ１－ｄ２作業溶液を加え、続いて、３μＬのＡｎｔｉＩＰ１－Ｃｒｙｐｔａｔｅ作業溶液を加えた。室温で１時間のインキュベーションした後、波長６６５ｎｍ及び６２０ｎｍの励起後の蛍光発光について、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２１０４ＥｎＶｉｓｉｏｎＭｕｌｔｉｌａｂｅｌＲｅａｄｅｒでスキャンした。ＦＲＥＴ比は、１０，０００×（６６５ｎｍのシグナル／６２０ｎｍのシグナル）で算出した。哺乳動物のＨＥＫ－２９３細胞において、ニューロテンシン（ＮＴ）受容体の結合は、ＮＴまたはＮＴペプチドコンストラクトに応答する場合にのみＩＰ_１蓄積を示し（配列番号３３及び配列番号３５、ならびにｍＴｆ－ＮＴ及びＮＴ、配列番号１または配列番号３２、ビヒクル、またはｍＴｆについてはなし）、ウェル数は、ビヒクルを除く全てでＮ＝３であり、ビヒクルはＮ＝３６であった（図２８Ｂ）。横棒は、サンプルの平均を示す。

ＣＮＳへのＮＴの送達は、環状ＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）の制御下でホタルルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウスで実証した。これらのマウスの細胞は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の上昇または転写因子ＣＲＥ結合タンパク質１（ＣＲＥＢ）を活性化する他の機序の条件下においてルシフェラーゼを発現し、これを、動物用途に製剤化されたルシフェリンをＩＶ投与した後、全動物用発光装置（ＩＶＩＳイメージャー）で測定する。ニューロテンシン受容体の発現は、前頭葉を含むＣＮＳの細胞のサブセットに限定された。活性化されると、シグナル伝達経路が活性化され、最終的にＣＲＥＢリン酸化及びＣＲＥ媒介性転写に至る。ニューロテンシン受容体の内因性リガンドであるニューロテンシンは、それ自体ではＢＢＢを通過することができない神経ペプチドである（図３２に示されるように、３００ｎｍｏｌのＮＴまたはビヒクルを投与したマウスは、同一のＣＲＥ－Ｌｕｃ駆動発光レベルを示した）。したがって、ＮＴのＩＶ単独投与では、ＣＲＥレポーターマウスの脳内でルシフェラーゼ産生は生じない。一方、ニューロテンシン及び本開示のＴｆＲ結合タンパク質を含む融合ペプチドをＩＶ投与すると、ＣＲＥレポーターマウスの脳内でＣＲＥ駆動型ルシフェラーゼが誘導されることから明らかなように、ＢＢＢ透過が示された。試験したペプチド－ＮＴ複合体は、その３つ全て（配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５）が、免疫組織化学分析によって決定されるように、ＢＢＢを越えた脳への送達、及びＮＴのＮＴ受容体上での機能的結合を示した。

ＣＲＥ駆動型ルシフェラーゼのｉｎｖｉｖｏ誘導は、アデニリルシクラーゼの活性化及びｃＡＭＰホスホジエステラーゼの阻害をそれぞれ介した強力なＣＲＥ誘導物質であるフォルスコリン及びロリプラムの投与から４時間後にルシフェリンを投与することによって検証した（図３１）。ＣＲＥ－ｌｕｃＧＰＣＲレポーターマウスに、１．６８ｍｇのロリプラム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＲ６５２０）及び０．８４ｍｇのフォルスコリン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ３４４２７０）を腹腔内（ＩＰ）注射（１７％ＤＭＳＯ溶液中２００μＬ）によって投与するか、またはＴｆＲ結合ペプチドもしくは他の試験及び対照ペプチドを尾静脈静脈注射によって投与した。投与量は、１００ｎｍｏｌのＮＴを含むもしくは含まないＴｆＲ結合ペプチド（配列番号１、配列番号２、または配列番号３２～配列番号３５）またはＰＢＳ中の１２ｎｍｏｌのトランスフェリンもしくはトランスフェリン－ＮＴ（配列番号３５４または配列番号３５５）であった。投与から４時間後、マウスに１００μＬの３０ｍｇ／ｍＬＤ－ルシフェリン（ＲｅｄｉＪｅｃｔＤ－ＬｕｃｉｆｅｒｉｎＵｌｔｒａ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ７７０５０５）をＩＰ注射によって投与し、１０分の無制限の活動後、イソフルラン曝露による麻酔をかけた。麻酔をかけたマウスの発光をＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ機器で１分の曝露により測定した。陽性対照としてロリプラム及びフォルスコリンを投与した場合、投与したマウスでは、動物の脳から高レベルの発光が認められる（図３１）。比較のための試験ペプチドについては、脳全体を包含する同一の関心領域を描画し、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェア（バージョン４．０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、図３０）を使用して定量化した。発光レベルがコホート内の他のマウスの平均／ＳＤ発光から４ＳＤを超える場合、またはルシフェリン注射が腹膜内に当たらなかった場合、そのマウスは打ち切った。前者の場合、これは、薬物治療またはＮＴ受容体調節と関係のない偶発的な生理学的応答と解釈した。後者の場合、これは、蛍光色素が動物の腹部全体に均一に分布しなかったことにより特定され（ＲｅｄｉＪｅｃｔＤ－ＬｕｃｉｆｅｒｉｎＵｌｔｒａで予備製剤化、ＩＣＧフィルターで５秒以上設定された読み取り）、これは、ルシフェリンのマウス全体への不十分な灌流及び不完全な曝露を示しており、動物の脳の発光定量を疑わしいものにしている。このアッセイで検証された動物は、１週間かけて定常状態（低）ルシフェラーゼ発現に戻し、次いで、ニューロテンシンペプチドまたはニューロテンシンに融合されたＴｆＲ結合タンパク質を含む融合ペプチドを用いて試験した。

発光（腹腔内ルシフェリン投与を介する）は、親ＴｆＲ結合ペプチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３２、または配列番号３５４）またはＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクト（配列番号３３～配列番号３５）もしくはマウストランスフェリン－ＮＴコンストラクト（ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶＣＡＶＬＧＬＣＬＡＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＳＶＰＤＫＴＶＫＷＣＡＶＳＥＨＥＮＴＫＣＩＳＦＲＤＨＭＫＴＶＬＰＰＤＧＰＲＬＡＣＶＫＫＴＳＹＰＤＣＩＫＡＩＳＡＳＥＡＤＡＭＴＬＤＧＧＷＶＹＤＡＧＬＴＰＮＮＬＫＰＶＡＡＥＦＹＧＳＶＥＨＰＱＴＹＹＹＡＶＡＶＶＫＫＧＴＤＦＱＬＮＱＬＥＧＫＫＳＣＨＴＧＬＧＲＳＡＧＷＶＩＰＩＧＬＬＦＣＫＬＳＥＰＲＳＰＬＥＫＡＶＳＳＦＦＳＧＳＣＶＰＣＡＤＰＶＡＦＰＫＬＣＱＬＣＰＧＣＧＣＳＳＴＱＰＦＦＧＹＶＧＡＦＫＣＬＫＤＧＧＧＤＶＡＦＶＫＨＴＴＩＦＥＶＬＰＥＫＡＤＲＤＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴＲＫＰＶＤＱＹＥＤＣＹＬＡＲＩＰＳＨＡＶＶＡＲＫＮＮＧＫＥＤＬＩＷＥＩＬＫＶＡＱＥＨＦＧＫＧＫＳＫＤＦＱＬＦＳＳＰＬＧＫＤＬＬＦＫＤＳＡＦＧＬＬＲＶＰＰＲＭＤＹＲＬＹＬＧＨＮＹＶＴＡＩＲＮＱＱＥＧＶＣＰＥＧＳＩＤＮＳＰＶＫＷＣＡＬＳＨＬＥＲＴＫＣＤＥＷＳＩＩＳＥＧＫＩＥＣＥＳＡＥＴＴＥＤＣＩＥＫＩＶＮＧＥＡＤＡＭＴＬＤＧＧＨＡＹＩＡＧＱＣＧＬＶＰＶＭＡＥＹＹＥＳＳＮＣＡＩＰＳＱＱＧＩＦＰＫＧＹＹＡＶＡＶＶＫＡＳＤＴＳＩＴＷＮＮＬＫＧＫＫＳＣＨＴＧＶＤＲＴＡＧＷＮＩＰＭＧＭＬＹＮＲＩＮＨＣＫＦＤＥＦＦＳＱＧＣＡＰＧＹＥＫＮＳＴＬＣＤＬＣＩＧＰＬＫＣＡＰＮＮＫＥＥＹＮＧＹＴＧＡＦＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡＦＶＫＨＱＴＶＬＤＮＴＥＧＫＮＰＡＥＷＡＫＮＬＫＱＥＤＦＥＬＬＣＰＤＧＴＲＫＰＶＫＤＦＡＳＣＨＬＡＱＡＰＮＨＶＶＶＳＲＫＥＫＡＡＲＶＫＡＶＬＴＳＱＥＴＬＦＧＧＳＤＣＴＧＮＦＣＬＦＫＳＴＴＫＤＬＬＦＲＤＤＴＫＣＦＶＫＬＰＥＧＴＴＰＥＫＹＬＧＡＥＹＭＱＳＶＧＮＭＲＫＣＳＴＳＲＬＬＥＡＣＴＦＨＫＨＧＳＳＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ、配列番号３５５）を静脈内投与する前（「刺激なし」）または静脈内投与から４時間後のいずれかに、一致するコホートを使用して、画像化した（図３０Ａ）。まず、トランスジェニックマウスにルシフェリンを投与し、発光を測定した（「刺激なし」）。次いで、同じマウスを、（ｉ）親ペプチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３２、または配列番号３５４）を投与し、次いで、ルシフェリンを再度投与し、発光量を測定すること（「親」）、または（ｉｉ）ＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクト及びマウストランスフェリン－ＮＴコンストラクト（配列番号３５５、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５）を投与し、次いで、ルシフェリンを再度投与し、発光を測定すること（「ＮＴ融合体」）のいずれかで処置した。定量化を図３０Ａに示す。横棒は、サンプルの平均を示す。有意性は、Ｔ検定（対応なし、両側）を使用して決定した。（＊：Ｐ＜０．０５。＊＊：Ｐ＜０．０１。＃：Ｐ＜０．０００１）。配列番号３２コホートの画像は、疑似カラーの発光で図３０Ｂに示す。マウスは、脳内でルシフェラーゼ発現を駆動する測定可能な基底レベルのＣＲＥ活性を有し（「刺激なし」の測定値）、親ペプチドの投与によって増加しなかった（「親」の測定値）。一方、ＣＲＥ活性のレベルは、本開示のＴｆＲ結合ペプチド及びＮＴを含むペプチド融合体である配列番号３４及び配列番号３５のＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクトを投与したマウスで有意に上昇した（図３０）。ＣＲＥ活性のレベルはまた、配列番号３３のＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクト及び配列番号３５４のマウストランスフェリン－ＮＴ融合体で処置したマウスでも上昇したが、他のＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクト（配列番号３４及び配列番号３５）のように統計的な上昇ではなかった。ネイキッドＮＴペプチドを３００ｎｍｏｌで単独投与した場合（ペプチド－ＮＴ融合コンストラクトの３倍の用量）、ＢＢＢを通過しないことから予想されるように、静脈内投与後に脳内でレポーターを活性化することができない（図３２）。まとめると、これは、配列番号１バリアントに融合された分子のＣＮＳ蓄積だけでなく、ＢＢＢ透過及びニューロンへのアクセスを示し、更に、本開示のペプチドのＮＴ融合体によるニューロテンシン受容体の結合を示している。

ペプチドがＮＴをＣＮＳの領域に送達する能力を免疫組織化学（ＩＨＣ）によって確認した。ＩＨＣ染色によると、ルシフェラーゼレベルは、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３２（例えば、配列番号３３～配列番号３５）（図２９）、特に、配列番号３４及び配列番号３５のニューロテンシンバリアントで処置したマウスで目にみえて高く、トランスフェリン－ＮＴ（配列番号３５５）で処置したマウスでは低い染色がみられ、ペプチドを投与しなかったマウス（刺激なし）でははるかに低かった。ホルマリン固定パラフィン包理した脳をＭｉｃｒｏｍＨＭ３５５Ｓミクロトームで６μｍに切片化し、正電荷のＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＰｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ１２－５５０－１５）に載せた。染色を、ＶｅｎｔａｎａＤｉｓｃｏｖｅｒｙＵｌｔｒａＩＨＣ／ＩＳＨ自動染色装置で、この機器での使用に設計されたキット及び試薬：ＥＺＰｒｅｐ脱パラフィン試薬（Ｖｅｎｔａｎａ９５０－１００）、プロテアーゼ３抗原賦活化キット（Ｖｅｎｔａｎａ７６０－２０２０）、抗ウサギＨＱ（Ｖｅｎｔａｎａ７６０－４８１５）、抗ＨＱ－ＨＲＰ（Ｖｅｎｔａｎａ７６０－４８１５）、ＣｈｒｏｍｏＭａｐＤＡＢキット（Ｖｅｎｔａｎａ７６０－１５９）、ヘマトキシリン（Ｖｅｎｔａｎａ７６０－２０２１）、及びブルーイング試薬（Ｖｅｎｔａｎａ７６０－２０３７）を全て製造元のデフォルト設定で使用して、自動で行った。一次抗ルシフェラーゼ抗体をＡｂｃａｍ（ａｂ２１１７６、濃度１：３５０）から入手し、カゼインを含むＶｅｎｔａｎａ抗体希釈液（Ｖｅｎｔａｎａ７６０－２１９）で希釈した。配列は以下のとおりであった。切片を６９℃で脱パラフィンした後、次いで、抗原の賦活化を３５℃で４分間行った。スライドをすすぎ、３７℃まで加温した後、手で一次抗体を加えた（１：３５０）。スライドを一次抗体と２８分間インキュベートし、すすいだ。続いて、抗体の添加（それに続いてすすぎ）を抗ウサギＨＱ、次いで、抗ＨＱＨＲＰで行い、それぞれ１６分間インキュベートした。次いで、スライドをＤＡＢ処理し、ヘマトキシリン及びブルーイング試薬で対比染色した（それぞれ８分）。図２９の画像は、軽度にコントラスト強調しており、画像修正は全て、処理群に関係なくセット内の全ての画像で同じように実施した。免疫組織化学は、ＣＤＰ－ＮＴ投与から４時間後に、マウスの皮質、線条体、及び視床で、ルシフェラーゼ発現の増大を示した。スケールバー（左上パネル）は、１００μｍである（図２９）。全てのパネルは、同じ倍率で示す。

配列番号３３～配列番号３５のニューロテンシンに融合されたＴｆＲ結合ペプチドを含む本開示のペプチドコンストラクトは、ＣＲＥレポーターマウスの脳内でＣＲＥ駆動型ルシフェラーゼを誘導したことから、これは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが、他の方法では脳にアクセスできないＢＢＢを効率的に通過して、活性薬剤（例えば、ニューロテンシンなどのペプチド）を輸送することが可能であることを示している。ニューロテンシンに融合されたＴｆＲ結合ペプチドを含む本開示の他のペプチドコンストラクトは、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、及び配列番号２０３～配列番号２０５を含み、ＣＲＥレポーターマウスの脳内においてＣＲＥ駆動型ルシフェラーゼを誘導し得る。

本明細書で開示される任意のペプチド（例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、もしくは配列番号３５９～配列番号３６１のペプチド－ＮＴ融合体、または配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のペプチドなどのＮＴに融合され得るペプチド）を使用してニューロテンシンに融合させ、ＣＲＥレポーターマウスの脳内においてＣＲＥ駆動型ルシフェラーゼを誘導することができ、これは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが、他の方法では脳にアクセスできないＢＢＢを効率的に通過して、活性薬剤（例えば、ニューロテンシンなどのペプチド）を輸送することが可能であることを示している。

このデータは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドが、治療上有効な濃度のＮＴ受容体結合ペプチドをＣＮＳに提供し、侵害受容性または神経障害性疼痛を効果的に治療することができることを示している。本明細書で開示される任意のペプチド（例えば、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、もしくは配列番号３５９～配列番号３６１のペプチド－ＮＴ融合体、または配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のペプチドなどのＮＴに融合され得るペプチド）を使用して、ニューロテンシン（ＮＴ）をＣＮＳ内に輸送することができる。ペプチドは、組換え融合、化学コンジュゲーションを介して、または他の手段によって、ＮＴと複合体化して、ＣＤＰ－ＮＴペプチドコンストラクトを形成することができる。

実施例５１
システイン高密度ペプチドライブラリーの構築
本実施例は、実施例４及び実施例５のペプチドのスクリーニングに使用されるライブラリーの生成について記載する。６、８、または１０個のシステインを含有する３０～５０アミノ酸長のタンパク質セグメントについて、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース検索した。このリストは、アノテーションのあるノッティン及びデフェンシンに重点を置きつつ、それ以外は系統発生的多様性を考慮して絞り込み、他の情報源から関心のある限定数のＣＤＰを追加することで、最終的なライブラリーサイズを１０，０００個のＣＤＰとした。増幅及びクローニングに適切なフランキング配列を含有するライブラリーのオリゴヌクレオチドをオーダーし（ＴｗｉｓｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、増幅し（Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＮＥＢ）、変異導入を行った（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩＲａｎｄｏｍＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ；２２サイクルの増幅）後、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ消化したＳＤＧＦベクター（ＧｅｎＢａｎｋＭＦ９５８４９４）にＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙでクローニングした。ライブラリーをＳｔｅｌｌａｒコンピテント細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に形質転換し、マキシプレップし（ＱＩＡｇｅｎ）、レンチウイルスにした（シュードタイプ化ＶＳＶ－Ｇ、エンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ及びパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸを使用して２９３Ｔ細胞で標準的な方法によって生成した）。個別のクローニングが必要なシングルトンＣＤＰ候補をｄｓＤＮＡ（ｇＢｌｏｃｋ、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からＳＤＧＦにクローニングし、一過性トランスフェクション（上記のように、２４ウェル懸濁プレートで、２．５μｇのプラスミドを４μｇのポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ２３９６６－１）とともに１ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地中の２×１０^６２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、振盪して２日後、結合について試験した。試験は、１μｇｍＬ^－１のＤＡＰＩを含むＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒ中でＴｆＲ及び色素標識ストレプトアビジンを一緒にまたは順次のいずれか（ＴｆＲに続いてペレット化してストレプトアビジン溶液中に再懸濁）で染色し、次いで、ＡｃｅａＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーターで分析した。

実施例５２
ペプチド－活性薬剤コンストラクトによる疼痛の治療または管理
本実施例は、疼痛を治療または管理するための方法を記載する。この方法は、急性及び／または慢性症状の治療として使用される。本開示のペプチドを発現させ、本明細書に記載される損傷または他の状態の結果としての疼痛の治療薬として医薬組成物で患者に投与する。本開示のペプチドは、Ｎａ_ｖ１．７などのイオンチャネルを阻害する。ペプチドを組換え発現させるか、または化学合成し、ペプチドは、本明細書に記載されるＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、または配列番号３５６～配列番号３５８）から選択する。ＴｆＲ結合機能を維持しつつ、Ｎａ_ｖ１．７に対するものなどのイオンチャネル阻害を追加または増加させるようにペプチドを変異させる。あるいは、ペプチドは、Ｎａｖ１．７などのイオンチャネルと相互作用するペプチドではなく、発現または合成後、活性薬剤にコンジュゲートさせる。いくつかの態様において、活性薬剤は、ＮＳＡＩＤ鎮痛薬である。いくつかの態様において、活性薬剤は、リドカインである。いくつかの態様において、活性薬剤は、Ｎａｖ１．７イオンチャネル阻害薬である。任意選択により、液体クロマトグラフィー（例えば、逆相、イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフ）を使用してペプチド－活性薬剤コンジュゲートを精製する。ペプチドコンストラクトを投与用に製剤化し、対象に投与する。投与後、ペプチド活性剤コンジュゲートは、疼痛に冒されている領域、組織、または系を標的とする。ペプチドは、それ自体が疼痛を調節する薬剤（例えば、ＮＳＡＩＤ鎮痛薬）にコンジュゲートすることができる。そのような疼痛の調節は、炎症、自己免疫応答、疼痛受容体に対する直接的もしくは間接的作用、細胞殺傷、またはプログラム細胞死を調節することなどの様々な機序によって作用し得る。１つ以上のペプチドをヒトまたは動物に皮下、静脈内、もしくは経口投与するか、または注射する。

実施例５３
血清アルブミン結合ペプチドコンストラクトを使用したペプチド血漿半減期の延長
本実施例は、本明細書で開示される血清アルブミン結合ペプチドコンストラクトを使用して、ペプチドの血清または血漿半減期を延長する方法を示す。配列番号１～配列番号７０、配列番号１３６～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、または配列番号３５６～配列番号３６１のいずれか１つの配列を有するペプチドまたはペプチドコンストラクトは、その血漿半減期を延長するために修飾される。ペプチド及び血清半減期延長部分を、組換え融合するか、単一融合体としての化学合成するか、別々に組換え発現させてコンジュゲートするか、または別々に化学合成してコンジュゲートする。ペプチドを血清アルブミン結合ペプチドに融合させると、ペプチドコンストラクトの血清半減期が延長する。ペプチドまたはペプチドコンストラクトをＳＡ２１（配列番号３７６）などの血清アルブミン結合ペプチドにコンジュゲートする。任意選択により、ＳＡ２１に融合させたペプチドは、配列番号３７３または配列番号３７５のいずれか１つの配列を有する。任意選択により、ＳＡ２１に融合させたペプチドは、配列番号３７７の配列を有するペプチドリンカーを介してＳＡ２１に連結する。配列番号３７７に対応する配列を有するリンカーは、２つの別々の機能性ＣＤＰを連結して、血清半減期延長機能をペプチドまたはペプチドコンストラクトに組み込む。配列番号３７７に対応する配列を有するリンカーは、ペプチドコンストラクトのいずれのメンバーからも立体的な障害を受けることなく、ＳＡ２１が環化することを可能にする。あるいは、Ａｌｂｕタグなどのアルブミン結合物質またはＣ１４～Ｃ１８脂肪酸などの脂肪酸へのペプチドのコンジュゲーションを使用して血漿半減期を延長する。血漿半減期はまた、任意選択により、最小限の非ヒトタンパク質配列を使用することによって免疫原性が低下した結果として、延長される。

実施例５４
ＴｆＲ結合ペプチドとＴｆＲ結合抗体の用量毒性の比較
本実施例は、マウス対象に投与した場合における本開示のＴｆＲ結合ペプチドと抗ＴｆＲ抗体の用量毒性の比較について記載する。Ｃｏｕｃｈ，ｅｔａｌ，２０１３（Ｃｏｕｃｈｅｔａｌ，ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ．２０１３Ｍａｙ１；５（１８３）：１８３ｒａ５７）に記載されるように、抗ＴｆＲ抗体を５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与する。これは、それぞれ、マウス質量２５ｇあたり約０．８４ｎｍｏｌ、４．２ｎｍｏｌ、及び８．４ｎｍｏｌのモル用量に相当する。本開示のＴｆＲ結合ペプチドを約３１ｍｇ／ｋｇで対象に投与する。これは、マウス質量２５ｇあたり約１００ｎｍｏｌのモル濃度に相当する。あるいは、本開示のＴｆＲ結合ペプチドを０．８４ｎｍｏｌ、４．２ｎｍｏｌ及び８．４ｎｍｏｌまたは１００ｎｍｏｌの用量で対象に投与する。マウス質量２５ｇあたり３１ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｎｍｏｌのＴｆＲ結合ペプチドを投与した対象は、少なくとも２４時間にわたって苦痛または毒性の徴候を示すことなく、効果的な薬力学及び薬物動態特性を示す。ニューロテンシン（ＮＴ）などの活性薬剤に更に融合させると、ＴｆＲ結合ペプチドは、毒性が観察されることなく、ＣＲＥ－ルシフェラーゼモデルマウスで評価されるようなＣＲＥ活性の効果的な薬力学誘導などの効果的な治療効果を示す。一方、マウス質量２５ｇあたり５ｍｇ／ｋｇ、または約０．８４ｎｍｏｌの抗ＴｆＲ抗体をＢＡＣＥ阻害抗体との二重特異性形態で投与した対象は、マウス質量２５ｋｇあたり２５もしくは５０ｍｇ／ｋｇ、または４．２もしくは０．４ｎｍｏｌを投与した対象と比較して、薬力学なアミロイドベータ阻害の低下などの治療効果の低下を示す。マウス質量２５ｋｇあたり２５もしくは５０ｍｇ／ｋｇ、または４．２もしくは０．４ｎｍｏｌの抗ＴｆＲ抗体の用量は、少なくとも投与３０分以内に、嗜眠、苦痛、及び溶血、または網状赤血球数の減少もしくは他の毒性を誘発する。結果は、治療濃度域（治療上の薬力学応答が認められる量を上回るが、毒性が観察される量を下回る投与量）が抗体ベースの治療薬よりもペプチドベースの治療薬でより広いことを示す。結果は、更に、ＴｆＲ結合ペプチドベースの治療薬が、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬と比較して、オフターゲット結合が少なく、免疫応答が低いことを示しており、これは、タンパク質の長さが短いことで（およそ５０アミノ酸）、適応免疫応答に対するエピトープが少なく、表面積が小さくなることに起因する。

実施例５５
ＴｆＲ結合血清アルブミン結合ペプチド融合体の精製
本実施例は、血清アルブミン結合ペプチドＳＡ２１に融合させたＴｆＲ結合ペプチドの精製について記載する。図３４は、ＳＡ２１融合ペプチドの精製を示す。ＳＡ２１をＣＤＰとの融合ペプチドとして組換え発現させ、ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドを精製してシデロカリンに融合し（「Ｓｃｎ－ＣＤＰ」）、切断して、切断されたＳＡ２１融合ペプチド（「ＣＤＰ」）及びシデロカリン（「Ｓｃｎ」）を生成した。図３４Ａは、配列番号３７３に対応する血清アルブミンペプチド（ＳＡ２１）に融合させたペプチドＴｆＲ結合ペプチドの精製を示す。純度は、ＤＴＴ還元（「Ｒ」）または非還元（「ＮＲ」）条件下におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（右）によって検証した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、切断していない（「Ｕ」）シデロカリン－ＣＤＰ融合ペプチドでも実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、切断していない（「Ｕ」）サンプルでは、シデロカリン－ＣＤＰ融合体（「Ｓｃｎ－ＣＤＰ」）に対応する明確なバンドが認められ、還元（「Ｒ」）及び非還元（「ＮＲ」）サンプルでは、切断されたＳＡ２１融合（「ＣＤＰ」）、シデロカリン単独（「Ｓｃｎ」）、及び切断していない融合体（「Ｓｃｎ－ＣＤＰ」）に対応するバンドが認められた。非還元ＲＰ－ＨＰＬＣトレースで単一ピークが存在することは、純粋な未分解のサンプルがあることを示した。図３４Ｂは、配列番号４５６に対応するＳＡ２１に融合させたペプチドの精製を示す。純度は、ＤＴＴ還元（「Ｒ」）または非還元（「ＮＲ」）条件下におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（右）によって検証した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、切断していない（「Ｕ」）シデロカリン－ＣＤＰ融合ペプチドでも実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、切断していない（「Ｕ」）サンプルでは、シデロカリン－ＣＤＰ融合体（「Ｓｃｎ－ＣＤＰ」）に対応する明確なバンドが認められ、還元（「Ｒ」）及び非還元（「ＮＲ」）サンプルでは、切断されたＳＡ２１融合（「ＣＤＰ」）、シデロカリン単独（「Ｓｃｎ」）、及び切断していない融合体（「Ｓｃｎ－ＣＤＰ」）に対応するバンドが認められた。非還元ＲＰ－ＨＰＬＣトレースで単一ピークが存在することは、純粋な未分解のサンプルがあることを示した。

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明してきたが、かかる実施形態は、例としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形形態、変更及び置換を想起するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、この特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物を包含することが意図される。

Claims

操作されたトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合ペプチド、またはそのバリアント、ホモログ、フラグメント、もしくはアナログを含む、組成物。
ペプチドコンストラクトを含む組成物であって、前記ペプチドコンストラクトは、
ａ）トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合ペプチド、またはそのバリアント、ホモログ、フラグメント、もしくはアナログと、
ｂ）活性薬剤とを含み、
前記ペプチドは、前記活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合される、前記組成物。
配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、もしくは配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つと、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する操作されたペプチド、またはそのバリアントもしくは機能性フラグメントを含む組成物。
前記ペプチドが、血液脳関門（ＢＢＢ）を含む細胞層を透過する、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、膜を透過し、前記膜は、細胞の膜である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記細胞がＴｆＲを発現する、請求項５に記載の組成物。
前記ペプチドが、ＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して前記細胞の前記膜を透過する、請求項５に記載の組成物。
前記ペプチドが、ＴｆＲに結合し、次いで、解離することによって、前記血液脳関門を越えてＣＮＳに送達される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、受容体媒介性トランスサイトーシスによって前記血液脳関門を越えて送達される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項５に記載の組成物。
前記ペプチドが局在する細胞または器官が、ＴｆＲを過剰発現している、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号２０６～配列番号２２４及び配列番号３３４～配列番号３４４を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、及びＱ５１に対応する表面界面残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号３２を基準として、位置３、４、９、１１、１５、１６、１９、２３、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、及び４０のいずれか１つに対応する親水性表面遠位残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記親水性表面遠位残基が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される、請求項１４に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、及びＤ４０に対応する親水性表面遠位残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１２に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号３２を基準として、１５、３５、３９、もしくは４９のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに対応する位置に親水性残基を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記親水性残基が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択される、請求項１４に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、及びＨ４９に対応する親水性残基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７または１８に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号３２を基準として、１１、２５、もしくは２７、またはこれらの任意の組み合わせに対応する位置に疎水性残基を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記疎水性残基が、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、もしくはＹ、またはこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項２０に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｍ１１、Ｍ２５、Ｍ２７に対応する疎水性残基のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２０に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号３２を基準として、位置４５に対応する脂肪族残基を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記脂肪族残基が、アミノ酸Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから選択される、請求項２３に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号３２を基準として、Ｌ４５に対応する脂肪族残基を含む、請求項２３に記載の組成物。
前記ペプチドが、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも５つのジスルフィド結合を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号１～配列番号３２、配列番号３６～配列番号６７、配列番号１３６～配列番号１６７、配列番号１７１～配列番号２０２、配列番号３５６～配列番号３５８のいずれか１つの配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号１に示される配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号２に示される配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号４に示される配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号３０に示される配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、配列番号３２に示される配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドが、細胞透過部分と更に製剤化、融合、またはコンジュゲートされる、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記細胞透過部分が、ポリカチオン、ポリ有機酸、エンドソーム放出ポリマー、ポリ（２－プロピルアクリル酸）、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｔａｔペプチド、Ａｒｇパッチ、ノットペプチド、ＣｙｓＴＡＴ、Ｓ１９－ＴＡＴ、Ｒ８（配列番号７３）、ｐＡｎｔｐ、Ｐａｓ－ＴＡＴ、Ｐａｓ－Ｒ８（配列番号７６）、Ｐａｓ－ＦＨＶ、Ｐａｓ－ｐＡｎｔＰ、Ｆ２Ｒ４（配列番号７９）、Ｂ５５、アウレイン、ＩＭＴ－Ｐ８、ＢＲ２、ＯＭＯＴＡＧ１、ＯＭＯＴＡＧ２、ｐＶＥＣ、ＳｙｎＢ３、ＤＰＶ１０４７、Ｃ１０５Ｙ、トランスポータン、ＭＴＳ、ｈＬＦ、ＰＦＶＹＬＩ（配列番号９３）、マウロカルシン、インペラトキシン、ハドルカリン、ヘミカルシン、オピカルシン－１、オピカルシン－２、ミッドカイン（６２－１０４）、ＭＣｏＴＩ－ＩＩ、クロロトキシン、ＤＲＩ－ＴＡＴ、ｃＦΦＲ_４（配列番号９６）、Ｒ_６Ｗ_３（配列番号４２１）、ミリステート、ｙＢＢＲ、またはそのフラグメントもしくはバリアント、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項３４に記載の組成物。
前記細胞透過部分が、配列番号７１～配列番号９６、配列番号９８～配列番号１０１、配列番号１１６～配列番号１２６、または配列番号４０３～配列番号４５５のいずれか１つである、請求項３４に記載の組成物。
前記ペプチド配列が、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８の残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、または少なくとも８１のアミノ酸残基を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドに活性配列がグラフトされるか、または、前記ペプチドが、活性薬剤にコンジュゲートされるか、連結されるか、もしくは融合されるか、もしくはグラフトされて、ペプチドコンストラクトがもたらされる、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ペプチドコンストラクトが、配列番号３３～配列番号３５、配列番号６８～配列番号７０、配列番号１６８～配列番号１７０、配列番号２０３～配列番号２０５、配列番号２２５～配列番号３３２、配列番号３５９～配列番号３６１、配列番号３７３、配列番号３７５、配列番号３８１、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９３、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号４００、または配列番号４０１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項３８に記載の組成物。
前記活性薬剤が、リンカーを介して連結され、前記リンカーは、表７または配列番号１０３～配列番号１１５、もしくは配列番号１２５のいずれか１つから選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記活性薬剤が、免疫治療薬、ＣＴＬＡ－４標的薬剤、ＰＤ－１標的薬剤、ＰＤＬ－１標的薬剤、ＩＬ１５薬剤、融合されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合薬剤、ＩＦＮガンマ薬剤、抗ＣＤ３薬剤、イオンチャネル調節剤、Ｋｖ１．３阻害薬、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアミシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ－３８、ＢＡＣＥ阻害薬、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害薬、ＷＥＨＩ－５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ－１９９、ナビトクラックス、ＡＴ－１０１、オバトクラックス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体、ドラスタチン、または神経伝達物質である、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の組成物。
前記Ｋｖ１．３阻害薬が、Ｖｍ２４、ＳｈＫ－１７０、ＳｈＫ－１８６、またはＳｈＫ－１９２である、請求項４１に記載の組成物。
前記Ｖｍ２４が、配列番号３７８または配列番号３９１の配列を有する、請求項４２に記載の組成物。
前記Ｓｈｋ－１８５が、配列番号３７９、配列番号３９０、または配列番号４０２の配列を有する、請求項４２に記載の組成物。
前記神経伝達物質が、ニューロテンシン、ニューロテンシンペプチドバリアント、またはその機能性フラグメントである、請求項４１に記載の組成物。
前記ニューロテンシンペプチドバリアントが、配列番号３５０または配列番号３６５～配列番号３６９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項４５に記載の組成物。
前記ペプチドに結合された半減期改変剤を更に含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記半減期改変剤が、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、双極性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含有する水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸、またはアルブミンに結合する分子を含む、請求項４８に記載の組成物。
前記半減期改変剤がＳＡ２１を含む、請求項４７に記載の組成物。
前記ＳＡ２１が、配列番号３７６または配列番号３７７の配列を有する、請求項４９に記載の組成物。
リンカーによって前記ペプチドに結合された検出可能な剤を更に含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記検出可能な剤が、リンカーを介して連結され、前記リンカーは、表７または配列番号１０３～配列番号１１５、もしくは配列番号１２５のいずれか１つから選択される、請求項５１に記載の組成物。
前記検出可能な剤が、フルオロフォア、近赤外色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性核種、または放射性核種キレート剤である、請求項５１に記載の組成物。
請求項１～５３のいずれか１項に記載の組成物、またはその塩と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
組成物を細胞層を越えて輸送するための方法であって、
ａ）請求項１～５３のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項５４に記載の医薬組成物と前記細胞層を接触させることと、
ｂ）前記組成物を前記細胞層を越えて輸送することとを含む、
前記方法。
状態を治療することを、それを必要とする対象に行うための方法であって、
ａ）請求項１～５３のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項５４に記載の医薬組成物を含む組成物を前記対象に投与することと、
ｂ）前記組成物を細胞層を越えて輸送することとを含む、
前記方法。
状態を治療することを、それを必要とする対象に行う方法であって、前記対象の組織におけるＴｆＲの発現に基づいて、請求項１～５３のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項５４に記載の医薬組成物のある量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
前記ペプチドが、ニューロテンシン受容体に結合し、活性化することが可能である、請求項５５～５７のいずれか１項に記載の方法。
前記ペプチドの前記対象への投与により、疼痛のレベルを低減することを更に含む、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の方法。
前記投与が、吸入、鼻腔内投与、経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、髄腔内投与、またはこれらの組み合わせである、請求項５９に記載の方法。
前記組成物が、ボーラス、注入、または持続注入として、静脈内投与される、請求項６０に記載の方法。
前記ペプチドを、統合失調症、薬物乱用、パーキンソン病、高血圧、摂食障害、脳卒中、アルツハイマー病、がん、炎症、疼痛、てんかん、気分障害、または内分泌障害の患者に投与することを更に含む、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の方法。
前記対象が、がんを有する、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の方法。
前記対象が、ＣＮＳの疾患を有する、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の方法。
前記対象が、神経障害性疼痛、片頭痛、不安、またはてんかんを有する、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の方法。
請求項１～５３のいずれか１項に記載の組成物または請求項５４に記載の医薬組成物を細胞層を越えて輸送するための方法であって、前記組成物と前記細胞層を接触させることと、前記組成物を前記細胞層を越えて輸送することとを含む、前記方法。
状態を治療することを、それを必要とする対象に行う方法であって、請求項１～５３のいずれか１項に記載の組成物または請求項５４に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
前記輸送することが、前記組成物のＴｆＲへの結合を含む、請求項５５～５６または６０のいずれか１項に記載の方法。
前記輸送することがトランスサイトーシスを更に含む、請求項６８に記載の方法。
前記トランスサイトーシスが小胞性トランスサイトーシスである、請求項６９に記載の方法。
前記トランスサイトーシスがＴｆＲ媒介性である、請求項６９に記載の方法。
前記輸送することが、前記組成物の前記ＴｆＲからの解離を更に含む、請求項６９に記載の方法。
前記輸送することが、前記組成物から活性薬剤を放出することを更に含む、請求項７２に記載の方法。
ＴｆＲ結合ペプチドを設計するための方法であって、
ａ）コンピュータープログラムを使用して、安定性及びフォールディングが最適化されたペプチドをペプチドのライブラリーから特定することであって、前記ペプチドのライブラリーの各ペプチドは、少なくとも３つの分子内ジスルフィド結合を含む、前記特定することと、
ｂ）コンピュータープログラムを使用して、ペプチド：ＴｆＲ複合体の結合パッチのアミノ酸残基を重ね合わせ、前記結合パッチを前記ペプチド上にグラフトした後、ＴｆＲに結合する安定なペプチドを決定することと、
ｃ）前記結合パッチを前記ペプチド上にグラフトして、前記安定なペプチドを生成することとを含む、
前記方法。
部位飽和変異導入を実施して、前記安定なペプチドよりもＴｆＲに対する結合親和性が高い変異ペプチドを得ることを更に含む、請求項７４に記載の方法。
前記ペプチドのライブラリーのペプチドが、２０～７５アミノ酸残基長である、請求項７４に記載の方法。