CN113329758A - 转铁蛋白受体靶向肽 - Google Patents

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Abstract

本文描述了肽及其变体以及包含缀合于、连接于或融合于剂的肽的肽构建体，其中所述肽和肽构建体能够结合TfR。如本文所述的肽或肽构建体与TfR的结合可使得能够达成穿过内皮层例如血脑屏障的胞吞转运，或对细胞膜的穿过。本文还描述了肽和肽构建体的药物组合物和用途，以及设计和制造此类肽和肽构建体以治疗疾病或疾患的方法。

Description

转铁蛋白受体靶向肽
交叉引用
本申请要求2018年12月14日提交的美国临时申请第62/779,885号和2019年4月19日提交的美国临时申请第62/836,520号的优先权和权益，所述美国临时申请中的每一者的全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已以ASCII格式电子提交，并且据此通过引用以它的整体并入本文的序列表。所述ASCII拷贝于2019年12月12日创建，名为44189-723_601_SL.txt，并且大小是552,571字节。
背景技术
药物向中枢神经系统(CNS)中的靶标的递送受到血脑屏障(BBB)阻碍，所述血脑屏障是用于CNS毛细血管中特别不可通过的血管内皮细胞的术语。BBB存在是为了保持毒性代谢物和病原体处于脑外，但还起致使CNS的疾病特别难以使用常规药品进行治疗的作用。举例来说，原发性CNS肿瘤(例如神经胶质瘤)以及神经炎症性和神经变性疾病(例如多发性硬化症和阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease))对在影响外周组织的类似疾病的情况下将不同地是更加有效的治疗模态的响应特别不良。因此，需要用于达成治疗性和/或诊断性分子向CNS以及其他器官和组织中的改善递送的方法。
发明内容
在各个方面，本公开提供了一种包含经工程改造转铁蛋白受体(TfR)结合肽或其变体、同源物、片段或类似物的组合物。
在各个方面，本公开提供了一种包含肽构建体的组合物，其中所述肽构建体包含：a)转铁蛋白受体(TfR)结合肽或其变体、同源物、片段或类似物；以及b)活性剂，其中所述肽缀合于、连接于或融合于所述活性剂。
在各个方面，本公开提供了一种包含经工程改造肽的组合物，所述经工程改造肽与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或功能性片段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。
在一些方面，肽穿透包含血脑屏障(BBB)的细胞层。在一些方面，肽穿透膜，并且其中所述膜是细胞的膜。在一些方面，细胞表达TfR。在一些方面，肽通过TfR介导的胞吞作用来穿透细胞的膜。
在一些方面，肽通过结合TfR，然后从TfR解离来穿过血脑屏障递送至CNS。在一些方面，肽通过受体介导的胞吞转运来穿过血脑屏障加以递送。在一些方面，细胞是肿瘤细胞。在一些方面，肽定位在其中的细胞或器官过度表达TfR。在一些方面，肽包含SEQ ID NO:206–SEQ ID NO:224以及SEQ ID NO:334–SEQ ID NO:344。
在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50和Q51或它们的任何组合的表面界面残基。在一些方面，以SEQID NO:32为参考，肽包含对应于位置3、4、9、11、15、16、19、23、26、28、29、30、31、32、33、35、36、37、39和40中的任一者或它们的任何组合的亲水性表面远端残基。在一些方面，亲水性表面远端残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39和D40的亲水性表面远端残基中的任一者或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ IDNO:32为参考，肽在对应于15、35、39或49中的任一者或它们的任何组合的位置处包含亲水性残基。在一些方面，亲水性残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。在一些方面，以SEQ IDNO:32为参考，肽包含对应于D15、E35、E39和H49或它们的任何组合的亲水性残基。
在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于11、25或27或它们的任何组合的位置处包含疏水性残基。在一些方面，疏水性残基选自氨基酸A、M、I、L、V、F、W或Y或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于M11、M25、M27的疏水性残基中的任一者或它们的任何组合。
在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于位置45的脂族残基。在一些方面，脂族残基选自氨基酸A、M、I、L或V。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于L45的脂族残基。
在一些方面，肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键，或至少五个二硫键。在一些方面，肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，肽包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段的序列。在一些方面，肽包含以SEQ ID NO:1阐述的序列。在一些方面，肽包含以SEQ ID NO:2阐述的序列。在一些方面，肽包含以SEQ ID NO:4阐述的序列。在一些方面，肽包含以SEQ ID NO:30阐述的序列。在一些方面，肽包含以SEQ ID NO:32阐述的序列。
在一些方面，肽还与细胞穿透部分一起配制，融合于或缀合于细胞穿透部分。在一些方面，细胞穿透部分包括聚阳离子、聚有机酸、内体释放聚合物、聚(2-丙基丙烯酸)、聚(2-乙基丙烯酸)、Tat肽、Arg补丁、打结肽、CysTAT、S19-TAT、R8(SEQ ID NO:73)、pAntp、Pas-TAT、Pas-R8(SEQ ID NO:76)、Pas-FHV、Pas-pAntP、F2R4(SEQ ID NO:79)、B55、绿纹树蛙肽(aurein)、IMT-P8、BR2、OMOTAG1、OMOTAG2、pVEC、SynB3、DPV1047、C105Y、转运肽(Transportan)、MTS、hLF、PFVYLI(SEQ ID NO:93)、maurocalcine、imperatoxin、hadrucalin、hemicalcin、opicalcin-1、opicalcin-2、中期因子(midkine)(62-104)、MCoTI-II、氯毒素(chlorotoxin)、DRI-TAT、cFΦR4(SEQ ID NO:96)、R6W3(SEQ ID NO:421)、肉豆蔻酸酯、yBBR，或它们的片段或变体，或它们的任何组合。在一些方面，细胞穿透部分是SEQ ID NO:71–SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98–SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:116–SEQ ID NO:126，或SEQ ID NO:403–SEQ ID NO:455中的任一者。
在一些方面，肽序列包含至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58个残基、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65、至少66、至少67、至少68、至少69、至少70、至少71、至少72、至少73、至少74、至少75、至少76、至少77、至少78、至少79、至少80或至少81个氨基酸残基。
在一些方面，活性序列被移植至肽上，或其中肽缀合于、连接于或融合于活性剂，或被移植至活性剂上，从而产生肽构建体。在一些方面，肽构建体包含与SEQ ID NO:33–SEQID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361、SEQ IDNO:373、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:381、SEQ DI NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:400或SEQ IDNO:401中的任一者的至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。
在一些方面，活性剂通过接头来连接，其中所述接头选自表7，或SEQ ID NO:103–SEQ ID NO:115或SEQ ID NO:125中的任一者。在一些方面，活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15剂、融合IL-15/IL-15Ra复合物剂、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀或神经递质。在一些方面，Kv1.3抑制剂是Vm24、ShK-170、ShK-186或ShK-192。在一些方面，Vm24具有SEQ ID NO:378或SEQ ID NO:391的序列。在一些方面，Shk-185具有SEQID NO:379、SEQ ID NO:390或SEQ ID NO:402的序列。在一些方面，神经递质是神经降压素、神经降压素肽变体，或它们的功能性片段。在一些方面，神经降压素肽变体包含与SEQ IDNO:350或SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:369的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。
在一些方面，组合物还包含偶联于肽的半衰期调节剂。在一些方面，半衰期调节剂包括聚合物、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、水溶性聚合物、两性离子水溶性聚合物、水溶性聚(氨基酸)，脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，含有甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，Fc区、脂肪酸、棕榈酸，或结合白蛋白的分子。在一些方面，半衰期调节剂包括SA21。在一些方面，SA21具有SEQ ID NO:376或SEQ ID NO:377的序列。
在一些方面，组合物还包含通过接头来偶联于肽的可检测剂。在一些方面，可检测剂通过接头来连接，其中所述接头选自表7，或SEQ ID NO:103–SEQ ID NO:115或SEQ IDNO:125中的任一者。在一些方面，可检测剂是荧光团、近红外染料、造影剂、纳米颗粒、含有金属的纳米颗粒、金属螯合物、X射线造影剂、PET剂、放射性核素或放射性核素螯合剂。
在各个方面，本公开提供了一种包含本文所述的任何组合物或其盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。
在各个方面，本公开提供了一种用于穿过细胞层来转运组合物的方法，所述方法包括：a)使所述细胞层与包含本文所述的任何肽的组合物或本文所述的任何药物组合物接触；以及b)穿过所述细胞层来转运所述组合物。
在各个方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括：a)向所述受试者施用包含本文所述的任何肽的组合物或本文所述的任何药物组合物，以及b)穿过细胞层来转运所述组合物。
在各个方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的包含本文所述的任何肽的组合物或本文所述的任何药物组合物，所述量基于所述受试者的组织中TfR的表达。
在一些方面，肽构建体能够结合和活化神经降压素受体。在一些方面，方法还包括在将肽施用至受试者后减轻疼痛的水平。在一些方面，施用采用以下方式达成：吸入、鼻内、口服、局部、静脉内、皮下、肌内施用、腹膜内、肿瘤内、鞘内，或它们的组合。在一些方面，组合物以团注、输注或延长输注形式加以静脉内施用。
在一些方面，方法还包括将肽施用至患有精神分裂症、药物滥用、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、高血压、进食障碍、中风、阿尔茨海默氏病、癌症、炎症、疼痛、癫痫、情绪障碍或内分泌病症的患者。在一些方面，受试者患有癌症。在一些方面，受试者患有CNS的疾病。在一些方面，受试者患有神经病变性疼痛、偏头痛、焦虑或癫痫。
在各个方面，本公开提供了一种用于穿过细胞层来转运根据权利要求1-53中任一项所述的组合物或权利要求54所述的药物组合物的方法，所述方法包括使所述细胞层与所述组合物接触，以及穿过所述细胞层来转运所述组合物。
在各个方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-53中任一项所述的组合物或权利要求54所述的药物组合物。
在一些方面，转运包括组合物与TfR的结合。在一些方面，转运还包括胞吞转运。在一些方面，胞吞转运是囊泡胞吞转运。在一些方面，胞吞转运是TfR介导的。在一些方面，转运还包括组合物从TfR的解离。在一些方面，转运还包括从组合物释放活性剂。
在各个方面，本公开提供了一种用于设计TfR结合肽的方法，所述方法包括：a)使用计算机程序从具有经优化稳定性和折叠的肽的文库鉴定肽，其中所述肽文库中的每个肽包含至少三个分子内二硫键；b)使用计算机程序叠加来自肽:TfR复合物的结合补丁的氨基酸残基以确定在将所述结合补丁移植至所述肽上之后结合TfR的稳定肽；以及c)将所述结合补丁移植至所述肽上以产生所述稳定肽。
在一些方面，方法还包括进行位点饱和诱变以获得相比于稳定肽，对TfR具有更高结合亲和力的突变肽。在一些方面，来自肽文库的肽在长度方面在20与75个氨基酸残基之间。
在各个方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含能够结合转铁蛋白受体(TfR)的非天然存在的肽或其变体、同源物、片段或类似物。
在各个方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含肽构建体，其中所述肽构建体包含：能够结合转铁蛋白受体(TfR)的肽或其变体、同源物、片段或类似物；以及活性剂，其中所述肽缀合于、连接于或融合于所述活性剂。
在一些方面，转铁蛋白受体(TfR)是人转铁蛋白受体，或鼠转铁蛋白受体，或人转铁蛋白受体和鼠转铁蛋白受体。
在各个方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或功能性片段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性的肽。
在一些方面，肽穿透包含内皮细胞的细胞层。在一些方面，肽穿透包含血脑屏障(BBB)的细胞层。在一些方面，肽通过TfR介导的胞吞转运来穿透包含内皮细胞的细胞层。在一些方面，肽穿透膜，并且所述膜是细胞的膜。在一些方面，细胞表达TfR。在一些方面，肽通过TfR介导的胞吞作用来穿透细胞的膜。在一些方面，肽能够定位在表达TfR的任何细胞中，或与表达TfR的任何细胞一起定位。在一些方面，肽保持结合于表达TfR的细胞表面膜。在一些方面，肽通过结合TfR来内化至细胞中。在一些方面，肽通过结合TfR，然后从TfR解离来穿过血脑屏障递送至CNS。在一些方面，肽通过受体介导的胞吞转运来穿过血脑屏障加以递送。
在一些方面，细胞是CNS细胞、红细胞、红细胞前体细胞、免疫细胞、干细胞、肌肉细胞、脑细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、骨髓细胞、阑尾细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、脾细胞、肌肉细胞、肝细胞、胆囊细胞、胰腺细胞、胃肠道细胞、腺细胞、肾细胞、膀胱细胞、内皮细胞、上皮细胞、脉络丛上皮细胞、神经胶质细胞、星形细胞，或与神经系统相关的细胞。
在一些方面，细胞是肿瘤细胞。在一些方面，肿瘤细胞是卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、位于骨或骨髓中的癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、星形细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞、髓母细胞瘤细胞、室管膜瘤细胞、脉络丛癌细胞、中线神经胶质瘤细胞、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、脑癌细胞、脾癌细胞、唾液腺癌细胞、肾癌细胞、肌肉癌细胞、骨髓细胞癌细胞、皮肤癌细胞、泌尿生殖系统癌细胞、骨肉瘤细胞、肌肉源性肉瘤细胞、黑素瘤细胞、头颈癌细胞、神经母细胞瘤细胞、前列腺癌细胞、膀胱癌细胞、急性淋巴细胞性白血病细胞、急性髓性白血病细胞、慢性淋巴细胞性白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、霍奇金氏(Hodgkin)淋巴瘤细胞、非霍奇金氏淋巴瘤细胞，或CMYC过度表达性癌细胞。在一些方面，肽定位于器官或组织。
在一些方面，器官或组织是脑、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、骨髓、阑尾、淋巴结、扁桃体、脾、肌肉、肝、胆囊、胰腺、胃肠道、肾、膀胱、输卵管、乳腺、阴道、子宫颈、子宫内膜、卵巢、胎盘和皮肤。在一些方面，肽定位在其中的细胞或器官过度表达TfR。在一些方面，肽定位于器官的实质。
在一些方面，肽结合至少一个选自对应于人TfR1(UniProtKB-P02786)的SEQ IDNO:363(MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLA RQVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPAARRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF)的残基506-510、523-531，或611-662的组的氨基酸残基。在一些方面，肽包含SEQID NO:206–SEQ ID NO:224以及SEQ ID NO:334–SEQ ID NO:344。在一些方面，以SEQ IDNO:32为参考，肽包含对应于G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50和Q51或它们的任何组合的表面界面残基。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于位置3、4、9、11、15、16、19、23、26、28、29、30、31、32、33、35、36、37、39和40中的任一者或它们的任何组合的亲水性表面远端残基。
在一些方面，亲水性表面远端残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39和D40的亲水性表面远端残基中的任一者或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于15、35、39或49中的任一者或它们的任何组合的位置处包含亲水性残基。
在一些方面，亲水性残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。在一些方面，以SEQ IDNO:32为参考，肽包含对应于D15、E35、E39和H49或它们的任何组合的亲水性残基。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于11、25或27或它们的任何组合的位置处包含疏水性残基。在一些方面，疏水性残基选自氨基酸A、M、I、L、V、F、W或Y或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于M11、M25、M27的疏水性残基中的任一者或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于位置45的脂族残基。在一些方面，脂族残基选自氨基酸A、M、I、L或V。
在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于L45的脂族残基。在一些方面，肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键，或至少五个二硫键。在一些方面，肽包含三个二硫键。在一些方面，肽包含至少两个、至少四个，或至少六个半胱氨酸残基。在一些方面，肽包含六个半胱氨酸残基。
在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于C6、C10、C20、C34、C44和C48或它们的任何组合的位置处包含半胱氨酸残基。在一些方面，肽的至少一个半胱氨酸残基参与二硫键。在一些方面，六个半胱氨酸残基参与二硫键。在一些方面，二硫键增加肽的稳定性。
在一些方面，肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，肽包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段的序列。
在一些方面，肽包含以SEQ ID NO:1阐述的序列。在一些方面，肽包含以SEQ IDNO:2阐述的序列。在一些方面，肽包含以SEQ ID NO:4阐述的序列。在一些方面，肽包含以SEQ ID NO:30阐述的序列。在一些方面，肽包含以SEQ ID NO:32阐述的序列。
在一些方面，包含三个二硫键的肽源于胱氨酸密集肽(CDP)。在一些方面，包含三个二硫键的肽是CDP。在一些方面，肽与转铁蛋白或其同源物、变体或片段竞争结合TfR。在一些方面，肽螯合TfR，或阻止另一蛋白结合TfR。在一些方面，相较于转铁蛋白或其内源性衍生物的亲和力或特异性，肽对TfR具有相等或更大的亲和力或特异性。在一些方面，相较于转铁蛋白或其内源性衍生物的解离常数，肽关于TfR具有相等或更低的解离常数。在一些方面，肽具有小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM，或小于0.1nM的KD。在一些方面，肽穿透靶细胞，或定位至靶细胞中。
在一些方面，肽还与细胞穿透部分一起配制，融合于或缀合于细胞穿透部分。在一些方面，细胞穿透部分包括聚阳离子、聚有机酸、内体释放聚合物、聚(2-丙基丙烯酸)、聚(2-乙基丙烯酸)、Tat肽、Arg补丁、打结肽、CysTAT、S19-TAT、R8(SEQ ID NO:73)、pAntp、Pas-TAT、Pas-R8(SEQ ID NO:76)、Pas-FHV、Pas-pAntP、F2R4(SEQ ID NO:79)、B55、绿纹树蛙肽、IMT-P8、BR2、OMOTAG1、OMOTAG2、pVEC、SynB3、DPV1047、C105Y、转运肽、MTS、hLF、PFVYLI(SEQ ID NO:93)、maurocalcine、imperatoxin、hadrucalin、hemicalcin、opicalcin-1、opicalcin-2、中期因子(62-104)、MCoTI-II、氯毒素、DRI-TAT、cFΦR4(SEQID NO:96)、肉豆蔻酸酯、yBBR，或它们的片段或变体，或它们的任何组合。在一些方面，细胞穿透部分是maurocalcin、imperatoxin、hadrucalcin、hemicalcin、opicalcin-1、opicalcin-2、中期因子(62-104)、MCoTI-II或氯毒素。
在一些方面，肽靶向组织或细胞，归巢至组织或细胞，在组织或细胞中积累，或选择性穿透组织或细胞。在一些方面，肽定位至靶细胞的核中。在一些方面，通过与核定位信号肽或部分一起配制，融合于或缀合于核定位信号肽或部分，肽定位至靶细胞的核中。在一些方面，肽还缀合于、连接于或融合于靶向癌性组织或癌细胞，归巢至癌性组织或癌细胞，在癌性组织或癌细胞中积累，或选择性穿透癌性组织或癌细胞的部分或第二肽。在一些方面，部分或第二肽是打结肽或其变体或片段。在一些方面，靶细胞是癌细胞或肿瘤细胞。在一些方面，靶细胞是CNS细胞、红细胞、红细胞前体细胞、免疫细胞、干细胞、肌肉细胞、脑细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、骨髓细胞、阑尾细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、脾细胞、肌肉细胞、肝细胞、胆囊细胞、胰腺细胞、胃肠道细胞、腺细胞、肾细胞、膀胱细胞、内皮细胞、上皮细胞、脉络丛上皮细胞、神经胶质细胞、星形细胞，或与神经系统相关的细胞。
在一些方面，肽包含穿过二硫结的二硫键。在一些方面，肽包含在半胱氨酸残基之间形成的多个二硫键。在一些方面，肽包含在半胱氨酸残基之间形成的三个或更多个二硫键，其中所述二硫键中的一者穿过由两个其他二硫键形成的环。在一些方面，肽不包含二硫键或二硫结。在一些方面，肽的至少一个氨基酸残基呈L构型，或其中至少一个氨基酸残基呈D构型。
在一些方面，肽包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个带正电荷残基。在一些方面，肽包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个连续的带正电荷残基。在一些方面，带正电荷残基是Arg、Lys，或它们的任何组合。在一些方面，肽包含Arg补丁。在一些方面，肽在N端包含两个或更多个连续Arg残基。
在一些方面，肽包含Tat肽或其片段。在一些方面，Tat肽包含序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:99)、GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:100)，或它们的片段或变体。在一些方面，Tat肽使用具有序列(GS)x(SEQ ID NO:105)或GxSy(SEQ ID NO:104)的接头来附加于肽的N端或C端，其中x和y独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些方面，Tat肽附加于肽的任何残基。
在一些方面，肽包含至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个半胱氨酸残基。在一些方面，肽包含一个或多个具有带负电荷残基的区域。在一些方面，肽包含一个或多个具有带正电荷残基的区域。
在一些方面，肽序列包含至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58个残基、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65、至少66、至少67、至少68、至少69、至少70、至少71、至少72、至少73、至少74、至少75、至少76、至少77、至少78、至少79、至少80或至少81个氨基酸残基。
在一些方面，肽包含或源于人蛋白质或肽。在一些方面，肽与至少一个其他肽以多聚结构排列。在一些方面，多聚结构包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或七聚体。在一些方面，肽包含在约3.0至约10.0的范围内的等电点。在一些方面，肽包含在约4.5至约8.9的范围内的等电点。在一些方面，肽包含非均一电荷分布。在一些方面，肽在生理或细胞内pH值下是稳定的。
在一些方面，肽在约7或7.5的pH下是稳定的。在一些方面，肽在约6.5至7.5的pH下是稳定的。在一些方面，肽在小于或等于约5.0，小于或等于约3.0，或在约3.0至约5.0的范围内的pH值下是稳定的。在一些方面，肽在处于约5.0至约7.0的范围内的pH值下是稳定的。在一些方面，肽包含疏水性核心。
在一些方面，肽对蛋白酶降解具有抗性。在一些方面，蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血清蛋白酶、细胞内蛋白酶中的任一者或它们的任何组合。在一些方面，肽对还原具有抗性，或在还原环境中是稳定的。在一些方面，还原或还原环境包括DTT或GSH。在一些方面，肽在高温下是稳定的。在一些方面，肽展现抗癌作用。在一些方面，肽包含一个或多个化学修饰。在一些方面，化学修饰改进肽的一种或多种药代动力学性质。在一些方面，化学修饰延长肽的血浆半衰期和/或生物半衰期。
在一些方面，化学修饰阻断肽的N端。在一些方面，化学修饰是甲基化、乙酰化或酰化。在一些方面，化学修饰是：一个或多个赖氨酸残基或其类似物的甲基化；N端的甲基化；或一个或多个赖氨酸残基或其类似物的甲基化以及N端的甲基化。在一些方面，肽连接于酰基加合物。在一些方面，活性序列被移植至肽上，或肽缀合于、连接于或融合于活性剂，或被移植至活性剂上，从而产生肽构建体。
在一些方面，肽构建体包含与SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、以及SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361中的任一者的至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。在一些方面，肽构建体是SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360或SEQ IDNO:361。在一些方面，活性剂在肽的N端或C端缀合于、连接于或融合于肽。在一些方面，活性剂是抗体、抗体片段、Fc、单链Fv、多肽、肽、小分子或核酸。
在一些方面，核酸是DNA。在一些方面，核酸是RNA。在一些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个活性剂通过接头来连接于肽。在一些方面，肽通过可切割接头或pH敏感性接头来连接于活性剂。在一些方面，肽通过接头来在肽的N端，在肽的内部赖氨酸残基的ε胺处，在肽的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧酸处，或在肽的C端连接于活性剂。在一些方面，组合物还包含非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是插入物、附加物，或对另一氨基酸的取代物。在一些方面，肽通过接头来在非天然氨基酸处连接于活性剂。在一些方面，接头包含酰胺键、酯键、醚键、三唑、大环、肟键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、腙键、偶氮键、肟键、二硫键、硫酯键、硫醚键、碳-碳单键、碳-碳双键或碳-碳三键、二硫键、两个半胱氨酸之间的二碳桥、两个半胱氨酸之间的三碳桥，或碳-氮键。
在一些方面，可切割接头包含蛋白酶的切割位点。在一些方面，蛋白酶是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase)、凝血酶(thrombin)、组织蛋白酶(cathepsin)或β-葡萄糖醛酸酶(beta-glucuronidase)。在一些方面，接头是水解不稳定性接头。在一些方面，肽通过不可切割接头来连接于活性剂。在一些方面，活性剂通过接头来连接，其中所述接头选自表4。在一些方面，活性剂是抗癌剂。在一些方面，活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15剂、融合IL-15/IL-15Ra复合物剂、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀或神经递质。
在一些方面，神经递质是神经降压素、神经降压素肽变体，或它们的功能性片段。在一些方面，功能性片段是至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基。
在一些方面，神经降压素肽变体包含与SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:369的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。在一些方面，神经降压素与SEQ ID NO:350具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。在一些方面，肽构建体能够结合和活化神经降压素受体。在一些方面，肽能够减轻受试者中的疼痛的水平。在一些方面，肽被施用至患有精神分裂症、药物滥用、帕金森氏病、高血压、进食障碍、中风、阿尔茨海默氏病、癌症、炎症或内分泌病症的患者。在一些方面，肽与多巴胺信号传导神经元相互作用。在一些方面，肽增加神经元中的多巴胺释放。在一些方面，组合物还包含偶联于肽的半衰期调节剂。在一些方面，半衰期调节剂包括聚合物、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、水溶性聚合物、两性离子水溶性聚合物、水溶性聚(氨基酸)，脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，含有甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，Fc区、脂肪酸、棕榈酸，或结合白蛋白的分子。
在一些方面，组合物还包含通过接头来偶联于肽的可检测剂。在一些方面，可检测剂在肽的N端或C端缀合于、连接于肽，或与肽融合。在一些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个可检测剂连接于肽。在一些方面，肽通过可切割接头来连接于可检测剂。在一些方面，肽通过接头来在肽的N端，在肽的内部赖氨酸残基的ε胺处，或在肽的C端连接于可检测剂。在一些方面，组合物还包含非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是插入物、附加物，或对另一氨基酸的取代物。在一些方面，肽通过接头来在非天然氨基酸处连接于可检测剂。在一些方面，接头包含酰胺键、酯键、醚键、三唑、大环、肟键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、腙键、偶氮键、肟键、二硫键、硫酯键、硫醚键、碳-碳单键、碳-碳双键或碳-碳三键、二硫键、两个半胱氨酸之间的二碳桥、两个半胱氨酸之间的三碳桥，或碳-氮键。在一些方面，可切割接头包含基质金属蛋白酶、凝血酶、组织蛋白酶或β-葡萄糖醛酸酶的切割位点。在一些方面，肽通过稳定接头来连接于可检测剂。在一些方面，可检测剂通过接头来连接，其中所述接头选自表4。
在一些方面，可检测剂是荧光团、近红外染料、造影剂、纳米颗粒、含有金属的纳米颗粒、金属螯合物、X射线造影剂、PET剂、放射性核素或放射性核素螯合剂。在一些方面，可检测剂是荧光染料。
在各个方面，本公开提供了一种包含本文公开的任何组合物或其盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。
在一些方面，药物组合物被配制以施用至受试者。在一些方面，药物组合物被配制以进行口服施用、静脉内施用、皮下施用、肌内施用，或它们的组合。
在各个方面，本公开提供了一种用于穿过细胞层来转运组合物的方法，所述方法包括：使所述细胞层与所述组合物接触；以及穿过所述细胞层来转运所述组合物。
在一些方面，组合物包含肽。在一些方面，肽包含含有SEQ ID NO:206–SEQ ID NO:224以及SEQ ID NO:334–SEQ ID NO:344中的任一者或其功能性片段的氨基酸序列。在一些方面，肽能够结合转铁蛋白受体(TfR)。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50和Q51或它们的任何组合的表面界面残基。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于3、4、9、11、15、16、19、23、26、28、29、30、31、32、33、35、36、37、39和40或它们的任何组合的位置处包含亲水性表面远端残基。在一些方面，亲水性表面远端残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。在一些方面，以SEQ IDNO:32为参考，肽包含对应于R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39和D40的亲水性表面远端残基中的任一者或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于15、35、39或49的位置中的任一者或它们的任何组合处包含亲水性残基。
在一些方面，亲水性残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。在一些方面，以SEQ IDNO:32为参考，肽包含对应于D15、E35、E39和H49的亲水性残基中的任一者或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于11、25或27的位置中的任一者或它们的任何组合处包含疏水性残基。在一些方面，疏水性残基选自氨基酸A、M、I、L、V、F、W或Y或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于M11、M25、M27的疏水性残基中的任一者或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于位置45的脂族残基。在一些方面，脂族残基选自氨基酸A、M、I、L或V。在一些方面，以SEQ IDNO:32为参考，肽包含对应于L45的脂族残基。
在一些方面，肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键，或至少五个二硫键。在一些方面，肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，肽包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段的序列。在一些方面，肽穿透靶细胞，或定位至靶细胞中，或定位在靶细胞上。在一些方面，活性序列被移植至肽上，或肽缀合于、连接于或融合于活性剂，或被移植至活性剂上，从而产生肽构建体。
在一些方面，肽缀合于、连接于或融合于活性剂。在一些方面，活性剂通过接头来连接，其中所述接头选自表4。在一些方面，活性剂是抗体、抗体片段、Fc、单链Fv、多肽、肽、小分子或核酸。在一些方面，肽构建体包含与SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205、SEQ IDNO:225–SEQ ID NO:332、以及SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361中的任一者的至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。在一些方面，肽构建体是SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360或SEQ IDNO:361。
在一些方面，活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15剂、融合IL-15/IL-15Ra复合物剂、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀或神经递质。在一些方面，神经递质是神经降压素、神经降压素肽变体，或它们的功能性片段。
在一些方面，功能性片段是至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基。在一些方面，神经降压素肽变体包含与SEQ ID NO:365–SEQID NO:369的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。在一些方面，神经降压素与SEQ ID NO:350具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。
在一些方面，肽构建体能够结合和活化神经降压素受体。在一些方面，在施用至受试者后，肽能够减轻疼痛的水平。在一些方面，肽被施用至患有精神分裂症、药物滥用、帕金森氏病、高血压、进食障碍、中风、阿尔茨海默氏病、癌症、炎症或内分泌病症的患者。在一些方面，肽与多巴胺信号传导神经元相互作用。在一些方面，肽增加神经元中的多巴胺释放。在一些方面，肽还与细胞穿透部分一起配制，融合于或缀合于细胞穿透部分。在一些方面，细胞层是内皮细胞层或上皮细胞层。在一些方面，内皮细胞层是血脑屏障。在一些方面，内皮细胞层是肠内皮细胞层。在一些方面，上皮细胞层是肠上皮细胞层。在一些方面，转运包括组合物与TfR的结合。在一些方面，转运还包括胞吞转运。在一些方面，胞吞转运是囊泡胞吞转运。在一些方面，胞吞转运是TfR介导的。在一些方面，转运还包括组合物从TfR的解离。
在各个方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括：向所述受试者施用组合物，以及穿过细胞层来转运所述组合物。
在一些方面，组合物包含肽。在一些方面，肽包含SEQ ID NO:206–SEQ ID NO:224以及SEQ ID NO:334–SEQ ID NO:344中的任一者的氨基酸序列。在一些方面，肽能够结合转铁蛋白受体(TfR)。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50和Q51或它们的任何组合的表面界面残基。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于3、4、9、11、15、16、19、23、26、28、29、30、31、32、33、35、36、37、39和40的位置中的任一者或它们的任何组合处包含亲水性表面远端残基。在一些方面，亲水性表面远端残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39和D40的亲水性表面远端残基中的任一者或它们的任何组合。
在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于15、35、39或49的位置中的任一者或它们的任何组合处包含亲水性残基。在一些方面，亲水性残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于D15、E35、E39和H49的亲水性残基中的任一者或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于11、25或27的位置中的任一者或它们的任何组合处包含疏水性残基。在一些方面，疏水性残基选自氨基酸A、M、I、L、V、F、W或Y或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于M11、M25、M27的疏水性残基中的任一者或它们的任何组合。
在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于位置45的脂族残基。在一些方面，脂族残基选自氨基酸A、M、I、L或V。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于L45的脂族残基。在一些方面，肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键，或至少五个二硫键。
在一些方面，肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，肽包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段的序列。
在一些方面，肽穿透靶细胞，或定位至靶细胞中。在一些方面，活性序列被移植至肽上，或肽缀合于、连接于或融合于活性剂，或被移植至活性剂上，从而产生肽构建体。在一些方面，肽缀合于、连接于或融合于活性剂。在一些方面，活性剂通过接头来连接，其中所述接头选自表4。
在一些方面，活性剂是抗体、抗体片段、Fc、单链Fv、多肽、肽、小分子或核酸。在一些方面，肽构建体包含与SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、以及SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361中的任一者的至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。在一些方面，肽构建体是SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360或SEQ ID NO:361。
在一些方面，活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15剂、融合IL-15/IL-15Ra复合物剂、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀或神经递质。
在一些方面，神经递质是神经降压素、神经降压素肽变体，或它们的功能性片段。在一些方面，功能性片段是至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基。在一些方面，神经降压素肽变体包含与SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:369的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。在一些方面，神经降压素与SEQ ID NO:350具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。
在一些方面，肽构建体能够结合和活化神经降压素受体。在一些方面，在施用至受试者后，肽能够减轻疼痛的水平。在一些方面，肽被施用至患有精神分裂症、药物滥用、帕金森氏病、高血压、进食障碍、中风、阿尔茨海默氏病、癌症、炎症或内分泌病症的患者。在一些方面，肽与多巴胺信号传导神经元相互作用。在一些方面，肽增加神经元中的多巴胺释放。在一些方面，肽还与细胞穿透部分一起配制，融合于或缀合于细胞穿透部分。在一些方面，细胞层是内皮细胞层或上皮细胞层。在一些方面，内皮细胞层是血脑屏障。
在一些方面，内皮细胞层是肠内皮细胞层。在一些方面，上皮细胞层是肠上皮细胞层。在一些方面，转运包括组合物与TfR的结合。在一些方面，转运还包括胞吞转运。在一些方面，胞吞转运是囊泡胞吞转运。在一些方面，胞吞转运是TfR介导的。在一些方面，转运还包括组合物从TfR的解离。在一些方面，转运还包括从组合物释放活性剂。
在各个方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的组合物，所述量基于所述受试者中TfR的表达。
在一些方面，组合物包含肽。在一些方面，肽包含SEQ ID NO:206–SEQ ID NO:224以及SEQ ID NO:334–SEQ ID NO:344中的任一者的氨基酸序列。在一些方面，肽能够结合转铁蛋白受体(TfR)。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50和Q51或它们的任何组合的表面界面残基。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于3、4、9、11、15、16、19、23、26、28、29、30、31、32、33、35、36、37、39和40的位置中的任一者或它们的任何组合处包含亲水性表面远端残基。在一些方面，亲水性表面远端残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39和D40的亲水性表面远端残基中的任一者或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于15、35、39或49的位置中的任一者或它们的任何组合处包含亲水性残基。在一些方面，亲水性残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于D15、E35、E39和H49的亲水性残基中的任一者或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽在对应于11、25或27的位置中的任一者或它们的任何组合处包含疏水性残基。
在一些方面，疏水性残基选自氨基酸A、M、I、L、V、F、W或Y或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于M11、M25、M27的疏水性残基中的任一者或它们的任何组合。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于位置45的脂族残基。在一些方面，脂族残基选自氨基酸A、M、I、L或V。在一些方面，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于L45的脂族残基。在一些方面，肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键，或至少五个二硫键。
在一些方面，肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，肽包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段的序列。
在一些方面，肽穿透靶细胞，或定位至靶细胞中。在一些方面，活性序列被移植至肽上，或肽缀合于、连接于或融合于活性剂，或被移植至活性剂上，从而产生肽构建体。在一些方面，肽缀合于、连接于或融合于活性剂。在一些方面，活性剂通过接头来连接，其中所述接头选自表4。
在一些方面，活性剂是抗体、抗体片段、Fc、单链Fv、多肽、肽、小分子或核酸。在一些方面，肽构建体包含与SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、以及SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361中的任一者的至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。在一些方面，肽构建体是SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360或SEQ ID NO:361。
在一些方面，活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15剂、融合IL-15/IL-15Ra复合物剂、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀或神经递质。
在一些方面，神经递质是神经降压素、神经降压素肽变体，或它们的功能性片段。在一些方面，功能性片段是至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基。在一些方面，神经降压素肽变体包含与SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:369的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。在一些方面，神经降压素与SEQ ID NO:350具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。
在一些方面，肽构建体能够结合和活化神经降压素受体。在一些方面，在施用至受试者后，肽能够减轻疼痛的水平。在一些方面，肽被施用至患有精神分裂症、药物滥用、帕金森氏病、高血压、进食障碍、中风、阿尔茨海默氏病、癌症、炎症或内分泌病症的患者。在一些方面，肽与多巴胺信号传导神经元相互作用。在一些方面，肽增加神经元中的多巴胺释放。在一些方面，肽还与细胞穿透部分一起配制，融合于或缀合于细胞穿透部分。在一些方面，组合物通过以下方式来施用：吸入、鼻内、口服、局部、静脉内、皮下、肌内施用、腹膜内、肿瘤内、鞘内，或它们的组合。
在一些方面，组合物以团注、输注或延长输注形式加以静脉内施用。在一些方面，组合物或药物组合物一天多次、一天两次、一天一次、一周两次、一周三次、一周一次、每两周一次，或一个月一次或每三个月一次加以施用。在一些方面，组合物一天一次、一周一次或一个月一次加以皮下施用。在一些方面，疾患是癌症。
在一些方面，癌症是卵巢癌、结肠癌、肺癌、位于骨或骨髓中的癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、骨髓细胞癌、皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤，或CMYC过度表达性癌。在一些方面，疾患是脑癌。在一些方面，脑癌是胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤，或弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤。
在一些方面，疾患是CNS的疾病。在一些方面，CNS的疾病是神经炎症性或神经变性疾病。在一些方面，神经变性疾病是阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、弗里德赖希共济失调(Friedreich's ataxia)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、路易体病(Lewy bodydisease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、脊髓性肌萎缩、运动神经元疾病、莱姆病(Lyme disease)、共济失调-毛细血管扩张(Ataxia-telangiectasia)、常染色体显性小脑共济失调、巴登病(Batten disease)、皮质基底综合征、克罗伊茨费尔特–雅各布病(Creutzfeldt–Jakob disease)、X染色体脆折相关震颤/共济失调综合征、库福–拉基布综合征(Kufor–Rakeb syndrome)、马查多–约瑟夫病(Machado–Joseph disease)、多发性硬化症、慢性创伤性脑病变，或额颞叶痴呆。在一些方面，疾患是神经病变性疼痛、偏头痛、焦虑或癫痫。在一些方面，疾患是慢性疼痛、急性疼痛、伤害感受性疼痛、神经病变性疼痛、异常性疼痛、幻觉疼痛、内脏疼痛或爆发性疼痛。
在一些方面，疾患是慢性疼痛、急性疼痛、损伤、机械性疼痛、热疼痛、冷疼痛、缺血性疼痛、以及化学物质诱导的疼痛、炎症性疼痛、偏头痛相关疼痛、头痛相关疼痛、肠易激综合征相关疼痛、纤维肌痛相关疼痛、关节炎性疼痛、骨骼疼痛、关节疼痛、胃肠疼痛、肌肉疼痛、心绞痛、面部疼痛、盆腔疼痛、跛行、手术后疼痛、创伤后疼痛、紧张型头痛、产科疼痛、妇科疼痛，或化学疗法诱导的疼痛、伤害感受性疼痛、神经病变性疼痛、异常性疼痛、幻觉疼痛、内脏疼痛、爆发性疼痛、家族性阵发性疼痛综合征、发作性极度疼痛病症、先天性痛觉丧失、与阿片戒断相关的疼痛。在一些方面，疾患是肌营养不良或脊髓延髓肌营养不良(SBMA)。在一些方面，疾患是炎症性肠病。在一些方面，炎症性肠病是克罗恩氏病。
在各个方面，本公开提供了一种用于穿过细胞层来转运本文公开的任何组合物的方法，所述方法包括使所述细胞层与所述组合物接触，以及穿过所述细胞层来转运所述组合物。
在一些方面，细胞层是内皮细胞层或上皮细胞层。在一些方面，内皮细胞层是血脑屏障。在一些方面，内皮细胞层是肠内皮细胞层。在一些方面，上皮细胞层是肠上皮细胞层。在一些方面，转运包括组合物与TfR的结合。在一些方面，转运还包括胞吞转运。在一些方面，胞吞转运是囊泡胞吞转运。在一些方面，胞吞转运是TfR介导的。在一些方面，转运还包括组合物从TfR的解离。在一些方面，转运还包括从组合物释放活性剂。
在各个方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的任何组合物或本文公开的任何药物组合物。
在一些方面，组合物通过以下方式来施用：吸入、鼻内、口服、局部、静脉内、皮下、肌内施用、腹膜内、肿瘤内、鞘内，或它们的组合。在一些方面，组合物以团注、输注或延长输注形式加以静脉内施用。在一些方面，组合物或药物组合物一天多次、一天两次、一天一次、一周两次、一周三次、一周一次、每两周一次，或一个月一次或每三个月一次加以施用。在一些方面，组合物一天一次、一周一次或一个月一次加以皮下施用。在一些方面，疾患是癌症。在一些方面，癌症是卵巢癌、结肠癌、肺癌、位于骨或骨髓中的癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、骨髓细胞癌、皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤，或CMYC过度表达性癌。在一些方面，疾患是脑癌。
在一些方面，脑癌是胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤，或弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤。在一些方面，疾患是CNS的疾病。在一些方面，CNS的疾患是神经炎症性或神经变性疾病。在一些方面，神经变性疾病是阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、弗里德赖希共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩、运动神经元疾病、莱姆病、共济失调-毛细血管扩张、常染色体显性小脑共济失调、巴登病、皮质基底综合征、克罗伊茨费尔特–雅各布病、X染色体脆折相关震颤/共济失调综合征、库福–拉基布综合征、马查多–约瑟夫病、多发性硬化症、慢性创伤性脑病变，或额颞叶痴呆。在一些方面，疾患是神经病变性疼痛、偏头痛、焦虑或癫痫。
在一些方面，疾患是慢性疼痛、急性疼痛、损伤、机械性疼痛、热疼痛、冷疼痛、缺血性疼痛、以及化学物质诱导的疼痛、炎症性疼痛、偏头痛相关疼痛、头痛相关疼痛、肠易激综合征相关疼痛、纤维肌痛相关疼痛、关节炎性疼痛、骨骼疼痛、关节疼痛、胃肠疼痛、肌肉疼痛、心绞痛、面部疼痛、盆腔疼痛、跛行、手术后疼痛、创伤后疼痛、紧张型头痛、产科疼痛、妇科疼痛，或化学疗法诱导的疼痛、伤害感受性疼痛、神经病变性疼痛、异常性疼痛、幻觉疼痛、内脏疼痛、爆发性疼痛、家族性阵发性疼痛综合征、发作性极度疼痛病症、先天性痛觉丧失、与阿片戒断相关的疼痛。在一些方面，疾患是肌营养不良或脊髓延髓肌营养不良(SBMA)。
在一些方面，疾患是炎症性肠病。在一些方面，炎症性肠病是克罗恩氏病。在一些方面，方法还包括穿过细胞层来转运组合物。在一些方面，细胞层是内皮细胞层或上皮细胞层。在一些方面，内皮细胞层是血脑屏障。在一些方面，内皮细胞层是肠内皮细胞层。
在一些方面，上皮细胞层是肠上皮细胞层。在一些方面，转运包括组合物与TfR的结合。在一些方面，转运还包括胞吞转运。在一些方面，胞吞转运是囊泡胞吞转运。在一些方面，胞吞转运是TfR介导的。在一些方面，转运还包括组合物从TfR的解离。在一些方面，转运还包括从组合物释放活性剂。
在各个方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的本文公开的任何组合物或本文公开的任何药物组合物，所述量取决于所述受试者中TfR的表达。
在一些方面，组合物通过以下方式来施用：吸入、鼻内、口服、局部、静脉内、皮下、肌内施用、腹膜内、肿瘤内、鞘内，或它们的组合。在一些方面，组合物以团注、输注或延长输注形式加以静脉内施用。在一些方面，组合物或药物组合物一天多次、一天两次、一天一次、一周两次、一周三次、一周一次、每两周一次，或一个月一次或每三个月一次加以施用。在一些方面，组合物一天一次、一周一次或一个月一次加以皮下施用。在一些方面，疾患是癌症。
在一些方面，癌症是卵巢癌、结肠癌、肺癌、位于骨或骨髓中的癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、骨髓细胞癌、皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤，或CMYC过度表达性癌。在一些方面，疾患是脑癌。在一些方面，脑癌是胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤，或弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤。
在一些方面，疾患是CNS的疾病。在一些方面，CNS的疾病是神经炎症性或神经变性疾病。在一些方面，神经变性疾病是阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、弗里德赖希共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩、运动神经元疾病、莱姆病、共济失调-毛细血管扩张、常染色体显性小脑共济失调、巴登病、皮质基底综合征、克罗伊茨费尔特–雅各布病、X染色体脆折相关震颤/共济失调综合征、库福–拉基布综合征、马查多–约瑟夫病、多发性硬化症、慢性创伤性脑病变，或额颞叶痴呆。
在一些方面，疾患是神经病变性疼痛、偏头痛、焦虑或癫痫。在一些方面，疾患是慢性疼痛、急性疼痛、损伤、机械性疼痛、热疼痛、冷疼痛、缺血性疼痛、以及化学物质诱导的疼痛、炎症性疼痛、偏头痛相关疼痛、头痛相关疼痛、肠易激综合征相关疼痛、纤维肌痛相关疼痛、关节炎性疼痛、骨骼疼痛、关节疼痛、胃肠疼痛、肌肉疼痛、心绞痛、面部疼痛、盆腔疼痛、跛行、手术后疼痛、创伤后疼痛、紧张型头痛、产科疼痛、妇科疼痛，或化学疗法诱导的疼痛、伤害感受性疼痛、神经病变性疼痛、异常性疼痛、幻觉疼痛、内脏疼痛、爆发性疼痛、家族性阵发性疼痛综合征、发作性极度疼痛病症、先天性痛觉丧失、与阿片戒断相关的疼痛。在一些方面，疾患是肌营养不良或脊髓延髓肌营养不良(SBMA)。
在一些方面，疾患是炎症性肠病。在一些方面，炎症性肠病是克罗恩氏病。在一些方面，方法还包括穿过细胞层来转运组合物。在一些方面，细胞层是内皮细胞层或上皮细胞层。在一些方面，内皮细胞层是血脑屏障。在一些方面，内皮细胞层是肠内皮细胞层。在一些方面，上皮细胞层是肠上皮细胞层。
在一些方面，转运包括组合物与TfR的结合。在一些方面，转运还包括胞吞转运。在一些方面，胞吞转运是囊泡胞吞转运。在一些方面，胞吞转运是TfR介导的。在一些方面，转运还包括组合物从TfR的解离。在一些方面，转运还包括从组合物释放活性剂。
在各个方面，本公开提供了一种用于设计能够结合TfR的肽的方法，所述方法包括：使用计算机程序从具有经优化稳定性和折叠的肽的文库鉴定肽，其中所述肽文库中的每个肽包含至少三个分子内二硫键；使用计算机程序叠加来自肽:TfR复合物的结合补丁的氨基酸残基以确定在将所述结合补丁移植至所述肽上之后结合TfR的稳定肽；以及将所述结合补丁移植至所述肽上以产生所述稳定肽。
在一些方面，方法还包括进行位点饱和诱变以获得相比于稳定肽，对TfR具有更高结合亲和力的突变肽。在一些方面，来自肽文库的肽在长度方面在20与75个氨基酸残基之间。
在各个方面，本公开提供了本文公开的任何组合物，其中神经降压素包含SEQ IDNO:350、SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:371中的任一者或其功能性片段。
在各个方面，本公开提供了本文公开的任何方法，其中神经降压素包含SEQ IDNO:350、SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:371中的任一者或其功能性片段。
在各个方面，本公开提供了本文公开的任何方法，其中神经降压素包含SEQ IDNO:350、SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:371中的任一者或其功能性片段。
在各个方面，本公开提供了本文公开的任何方法，其中神经降压素包含SEQ IDNO:350、SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:371中的任一者或其功能性片段。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，所述引用的程度就好像已特定地和单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入一样。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一个以彩色制作的附图。具有一个或多个彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在请求以及支付必要费用后由专利局提供。本发明的新颖特征具体阐述于随附权利要求中。通过参考阐述其中利用本发明的原理的说明性实施方案的以下详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优势的更充分了解，在所述附图中：
图1说明人可溶性转铁蛋白受体(hTfR)胞外域蛋白的考马斯染色凝胶，以及显示从高多样性汇合肽文库对结合hTfR胞外域的细胞的连续富集的流式细胞术图。
图1A说明转铁蛋白受体(TfR)蛋白的考马斯染色凝胶。
图1B说明显示在一次流动分选之后结合TfR的细胞的流式细胞术图。
图1C说明显示在一次流动分选之后具有对照染色的细胞的流式细胞术图。
图1D说明显示在两次流动分选之后结合TfR的细胞的流式细胞术图。
图1E说明显示在两次流动分选之后具有对照染色的细胞的流式细胞术图。
图1F说明显示在三次流动分选之后结合TfR的细胞的流式细胞术图。
图1G说明显示在三次流动分选之后具有对照染色的细胞的流式细胞术图。
图2说明展示TfR和单一克隆肽的细胞。这个实验中使用的对照蛋白质具有以SEQID NO:333(MRLAVGALLVCAVLGLCLADYKDEHHHHHHGLNDIFEAQKIEWHEGGGSKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSMGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYDKSDNCEDTPEAGYFAVAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAPGSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSDVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGEEYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRPGSSELYENKPRRPYIL)阐述的氨基酸序列。
图2A说明表达SEQ ID NO:1的肽(x轴，GFP)的细胞和对照蛋白质(y轴，用荧光抗His抗体染色)的流式细胞术图。
图2B说明表达SEQ ID NO:1的肽(x轴，GFP)的细胞和对照蛋白质(y轴，用荧光链霉亲和素染色)的流式细胞术图。
图2C说明表达SEQ ID NO:1的肽(x轴，GFP)的细胞和TfR(y轴，用荧光抗His抗体染色)的流式细胞术图。
图2D说明表达SEQ ID NO:1的肽(x轴，GFP)的细胞和TfR(y轴，用荧光链霉亲和素染色)的流式细胞术图。
图3说明由排列来自位点饱和诱变(SSM)的富集变体产生的肽变体的TfR结合。每个图代表完成的一轮SSM，并且图内的着色棒条指示相较于开始这轮SSM所采用的相应肽序列，变异肽中突变的数目。数据代表SSM的最后一步，此后选定下一代分子。
图3A说明分别包含SEQ ID NO:3–SEQ ID NO:23的序列的变体结合的hTfR的量，所述变体由用于具有SEQ ID NO:1的序列的肽的亲和力成熟的位点饱和诱变(SSM)获得。
图3B说明分别具有SEQ ID NO:24–SEQ ID NO:31的序列的肽变体结合的hTfR的量，所述肽变体由用于具有SEQ ID NO:2的序列的起始肽的亲和力成熟的位点饱和诱变(SSM)获得。
图4说明分别具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:30和SEQID NO:32的序列的五种可溶性TfR结合肽变体的在还原性(DTT)或非还原性(PBS)条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及RP-HPLC图。数据显示TfR结合肽展现高溶解性。比较在还原性条件(10mM DTT)和非还原性(PBS)条件下的凝胶证明了肽形成二硫键。
图4A说明SEQ ID NO:1的SDS-PAGE和RP-HPLC色谱图。
图4B说明SEQ ID NO:2的SDS-PAGE和RP-HPLC色谱图。
图4C说明SEQ ID NO:4的SDS-PAGE和RP-HPLC色谱图。
图4D说明SEQ ID NO:30的SDS-PAGE和RP-HPLC色谱图。
图4E说明SEQ ID NO:32的SDS-PAGE和RP-HPLC色谱图。
图5说明稍后产生的TfR结合肽具有改善的对谷胱甘肽(GSH)还原的抗性。图5说明未经受处理(红色)、经受10μM GSH(蓝色)或10μM DTT(绿色)的肽的反相HPLC迹线的重叠图(每种测试肽一个重叠图)。
图5A说明具有SEQ ID NO:1的序列的TfR结合肽对谷胱甘肽(GSH)还原的抗性。
图5B说明具有SEQ ID NO:2的序列的肽对谷胱甘肽(GSH)还原的改善的TfR结合肽抗性。
图5C说明具有SEQ ID NO:32的序列的肽对谷胱甘肽(GSH)和二硫苏糖醇(DTT)还原的改善的TfR结合肽抗性。
图5D说明具有SEQ ID NO:30的序列的肽对谷胱甘肽(GSH)还原的改善的TfR结合肽抗性。
图6说明亲和力成熟的TfR结合肽对胃蛋白酶的改善的抗性随肽成熟而改善。图6说明未经受处理(红色)、经受胰蛋白酶(蓝色)或胃蛋白酶(绿色)的TfR结合肽的反相HPLC迹线的重叠图(每种测试肽一个重叠图)。
图6A说明用胰蛋白酶(蓝色)和胃蛋白酶(绿色)对具有SEQ ID NO:1的序列的肽的处理。
图6B说明用胰蛋白酶(蓝色)和胃蛋白酶(绿色)对具有SEQ ID NO:2的序列的肽的处理。
图6C说明用胰蛋白酶(蓝色)和胃蛋白酶(绿色)对具有SEQ ID NO:32的序列的肽的处理。
图6D说明用胰蛋白酶(蓝色)和胃蛋白酶(绿色)对具有SEQ ID NO:30的序列的肽的处理。
图7说明显示SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:32与hTfR的结合的表面等离子体共振(SPR)曲线。
图8说明显示不同浓度的具有SEQ ID NO:2的序列的肽的hTfR结合的表面等离子体共振(SPR)迹线。
图9说明显示不同浓度的具有SEQ ID NO:4的序列的肽的hTfR结合的表面等离子体共振(SPR)迹线。
图10说明根据表面等离子体共振(SPR)的SEQ ID NO:32与经捕获生物素化hTfR的结合的结合和单循环动力学数据。在2种密度的经捕获生物素化(Bt)-hTfR上注射5种浓度的具有SEQ ID NO:32的序列的肽(0.037nM、0.11nM、0.33nM、1nM、3nM)，并且加以整体分析。
图11说明根据SPR的SEQ ID NO:30与经捕获生物素化hTfR的结合的结合和单循环动力学数据。在2种密度的经捕获Bt-hTfR上注射5种浓度的具有SEQ ID NO:30的序列的肽(0.037nM、0.11nM、0.33nM、1nM、3nM)，并且加以整体分析。
图12说明定量来自竞争性结合测定的流式细胞术数据的条形图，其中使具有SEQID NO:2和SEQ ID NO:32的序列的肽与hTfR一起在10μM经铁装载的人全铁转铁蛋白或空的人去铁转铁蛋白存在下孵育。
图13说明hTfR和具有SEQ ID NO:32的序列的hTfR结合肽的共结晶。
图13A说明与具有SEQ ID NO:32的序列的肽共结晶的hTfR的第一视图。结构显示hTfR结合肽的结合位点与内源性结合物转铁蛋白的结合位点重叠。两个螺旋之间的描绘为实心黑色卷曲线的连接序列在晶体结构中未得到分辨，并且基于结构建模。转铁蛋白受体(TfR)的晶体结构显示为空间填充电子密度图。它表现为具有两个突出叶的大型球状蛋白质。在两个叶之间，对应于SEQ ID NO:32的短肽的晶体结构显示为与转铁蛋白受体的球状结构相互作用。SEQ ID NO:32的肽显示为卡通模型，具有从左上至右下以对角方式定向的两个反平行α螺旋。显示了从α螺旋突出的对应于SEQ ID NO:32的氨基酸侧链的棍棒模型，所述氨基酸侧链中一些与TfR的球状蛋白质相互作用。
图13B说明图13A的放大视图，并且显示与具有SEQ ID NO:32的序列的肽共结晶的hTfR。从内源性CDP突变的氨基酸侧链或是界面的一部分的那些显示为棍棒。界面邻近残基以黑色显示，而界面远端残基以青色显示。显示了图13A中描绘的TfR空间填充电子密度图的与SEQ ID NO:32的肽相互作用的部分。如图13A中所示的SEQ ID NO:32的肽显示为具有两个反平行α螺旋的卡通模型，并且位于TfR的结构的正上方，其中α螺旋水平定位。SEQ IDNO:32的氨基酸侧链显示为棍棒。从SEQ ID NO:32的α螺旋向下朝向TfR的球状结构突出的侧链与TfR相互作用。
图13C说明SEQ ID NO:32的结构模型(顶部，N端用蓝色表示，C端用红色表示，可见侧链根据原子类型来着色)、游离SEQ ID NO:32的晶体结构(中间，蓝色；
Figure BDA0003175003630000391
分辨率，4倍叠加)、以及SEQ ID NO:32在与TfR复合时的晶体结构(底部，红色；
Figure BDA0003175003630000392
分辨率，2倍叠加)的卡通表现形式。复合物结构中具有在TfR的
Figure BDA0003175003630000393
内的原子的侧链显示为棍棒。标记了N端和C端。红色箭头标注在N端附近，在SEQ ID NO:32的模型结构、未结合结构以及结合结构之间的最显著结构差异。灰色交叉标注无序螺旋间接头的位置。标记为“模型”的顶部结构显示对应于SEQ ID NO:32的肽的显示为卡通模型的计算机模型。水平定向的反平行α螺旋在右侧由短环连接。肽的N端位于底部螺旋的左侧，并且C端位于上螺旋的左侧。氨基酸侧链显示为从α螺旋突出的棍棒。标记为“4x游离”的中间结构显示在不存在TfR下结晶的对应于SEQ ID NO:32的肽的显示为卡通模型的晶体结构。见于计算机模型中的环在这个结构中不可见，如由在两个螺旋的右侧的X所表示。肽的N端位于底部螺旋的左侧，并且C端位于上螺旋的左侧。氨基酸侧链显示为从α螺旋突出的棍棒。标记为“2x经TfR结合”的底部结构显示在TfR存在下结晶的对应于SEQ ID NO:32的肽的显示为卡通模型的晶体结构。见于计算机模型中的环在这个结构中不可见，如由在两个螺旋的右侧的X所表示。肽的N端位于底部螺旋的左侧，并且C端位于上螺旋的左侧。氨基酸侧链显示为从α螺旋突出的棍棒。在每个结构中在下螺旋的左端指向N端区域的三个三角形箭头指示在三个结构之间具有最显著结构差异的区域。
图13D说明结合于TfR的SEQ ID NO:32的结合的放大视图，所述视图显示驱动结合的众多极性和非极性相互作用。非极性相互作用主要是Leu和Met，而极性相互作用是若干带电荷和非带电荷残基的混合。TfR的晶体结构的一部分显示为空间填充电子密度图。对应于SEQ ID NO:2的肽显示为在TfR结构之上的飘带图。显示了竖直定向的α螺旋，并且环连接两个螺旋的顶端。氨基酸侧链显示为棍棒，并且面对TfR的结构的侧链与TfR相互作用。如下标记SEQ ID NO:32的氨基酸残基(从顶部至底部，然后从左至右)：E16、M9、S6、N12、L43、L15、L36和D44。
图13E说明TfR:SEQ ID NO:32共晶体与公开TfR:转铁蛋白复合物(PDB 3S9L；隐藏了TfR)的共晶体的比对，并且对图14A中所示的结合相互作用放大。结构比对(左侧)证明SEQ ID NO:32(蓝色)的结合位点和转铁蛋白(MRLAVGALLVCAVLGLCLADYKDEHHHHHHGLNDIFEAQKIEWHEGGGSKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSMGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYDKSDNCEDTPEAGYFAVAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAPGSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSDVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGEEYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRP，SEQ ID NO:353，绿色)的结合位点重叠。人(SEQ ID NO:353)和鼠(MRLAVGALLVCAVLGLCLADYKDEHHHHHHGLNDIFEAQKIEWHEGGGSVPDKTVKWCAVSEHENTKCISFRDHMKTVLPPDGPRLACVKKTSYPDCIKAISASEADAMTLDGGWVYDAGLTPNNLKPVAAEFYGSVEHPQTYYYAVAVVKKGTDFQLNQLEGKKSCHTGLGRSAGWVIPIGLLFCKLSEPRSPLEKAVSSFFSGSCVPCADPVAFPKLCQLCPGCGCSSTQPFFGYVGAFKCLKDGGGDVAFVKHTTIFEVLPEKADRDQYELLCLDNTRKPVDQYEDCYLARIPSHAVVARKNNGKEDLIWEILKVAQEHFGKGKSKDFQLFSSPLGKDLLFKDSAFGLLRVPPRMDYRLYLGHNYVTAIRNQQEGVCPEGSIDNSPVKWCALSHLERTKCDEWSIISEGKIECESAETTEDCIEKIVNGEADAMTLDGGHAYIAGQCGLVPVMAEYYESSNCAIPSQQGIFPKGYYAVAVVKASDTSITWNNLKGKKSCHTGVDRTAGWNIPMGMLYNRINHCKFDEFFSQGCAPGYEKNSTLCDLCIGPLKCAPNNKEEYNGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVLDNTEGKNPAEWAKNLKQEDFELLCPDGTRKPVKDFASCHLAQAPNHVVVSRKEKAARVKAVLTSQETLFGGSDCTGNFCLFKSTTKDLLFRDDTKCFVKLPEGTTPEKYLGAEYMQSVGNMRKCSTSRLLEACTFHKH，SEQ ID NO:354)转铁蛋白受体同源物的着色SEQ ID NO:32结合位点显示TfR上结合表面的大部分在两个物种之间共有同一性或类似性(右侧)。左侧图将TfR的结构的一部分显示为空间填充电子密度图。来自3S9L晶体结构的转铁蛋白(标记为“来自3S9L的Tf”)的飘带图位于TfR的右侧，并且叠加在TfR结构上。Tf结构含有与TfR结构相配合的众多α螺旋。结构还在右下区域中含有β-片层结构，以及从α螺旋的末端突出的众多环。与TfR一起结晶的SEQ ID NO:32的结构显示为卡通模型，与TfR在右上侧上相互作用。它由与叠加Tf结构重叠的竖直定位的两个α螺旋组成。右侧图显示左侧图中所示的TfR和SEQ ID NO:32结构的旋转视图。TfR显示为空间填充电子密度图，并且SEQ ID NO:32表现为卡通模型，含有从左上至右下以对角方式定向的两个α螺旋。TfR结构上的阴影区域表示HsTfR和MmTfR结合位点是类似的或不类似的所处的区域。示例性类似和不类似区域由箭头指示。结构的未表示为类似或不类似的其余区域，组成TfR结构的表面的大部分，具有相同结合位点。在SEQ ID NO:32的右螺旋的正上方的小区域和在右螺旋的上端的正下方的小区域表示为具有类似结合位点。在SEQ ID NO:32的右螺旋的正上方的小区域、在右螺旋的下端的正下方的小区域、以及在左螺旋的下端的下方的小区域表示为具有不类似结合位点。
图14说明TfR:转铁蛋白复合物和TfR:肽复合物，显示结合于hTfR的转铁蛋白(数据取自公开文献(RCSB PDB 1SUV))和具有SEQ ID NO:32的序列的肽中的每一者的叠加，从而说明转铁蛋白和具有SEQ ID NO:32的序列的肽在它们在hTfR上的结合位点方面重叠。
图14A说明结合于hTfR的转铁蛋白(数据取自公开文献(RCSB PDB 1SUV))和具有SEQ ID NO:32的序列的肽中的每一者的叠加。TfR的结构表现为具有两个叶的大型球状蛋白质的空间填充电子密度图。来自1SUV晶体结构的转铁蛋白(标记为“来自RCSB 1SUV的转铁蛋白”)的结构表现为卡通模型，具有众多α螺旋和连接环。转铁蛋白结构位于TfR的右下方，并且与TfR结构相配合。标记为“SEQ ID NO:32”的箭头指向在TfR的右侧的在转铁蛋白的正上方的位置，并且指示对应于SEQ ID NO:32的肽的结合位点。
图14B说明结合于TfR的具有SEQ ID NO:32的序列的肽的放大视图，指示当相较于图14A中内源性转铁蛋白的结合位点时，具有SEQ ID NO:32的序列的肽与转铁蛋白两者在hTfR上具有重叠结合位点。从内源性CDP突变或是界面的一部分的氨基酸侧链显示为棍棒。界面邻近残基以黑色显示，而界面远端残基以青色显示。显示了图13A中描绘的TfR空间填充电子密度图的与SEQ ID NO:32的肽相互作用的部分。如图13A中所示的SEQ ID NO:32的肽显示为具有两个反平行α螺旋的卡通模型，并且位于TfR的结构的正上方，其中α螺旋水平定位。SEQ ID NO:32的氨基酸侧链显示为棍棒。从SEQ ID NO:32的α螺旋向下朝向TfR的球状结构突出的侧链与TfR相互作用。
图15说明TfR结合肽在细胞表面结合测定中与鼠TfR(mTfR)具有交叉反应性。用经AlexaFluor 647染料直接标记的可溶性TfR结合肽染色从它们的表面表达人或小鼠TfR的293F细胞。
图15A说明这些实验中使用的TfR，在这个情况下是人TfR，的物种特异性。数据显示为两个地形密度图，并且指示用抗hTfR(CD71)抗体染色的转铁蛋白的流式细胞术数据。从左下至右上以对角方式定向的上密度图描绘293ST+SDGF-hTfR。水平定向的下密度图描绘293ST+SDGF-mTfR。y轴显示从0至107的hTfR+链霉亲和素，采用根据对数标度的10倍增量。x轴显示从0至106的GFP，采用根据对数标度的10倍增量。
图15B说明这些实验中使用的TfR，在这个情况下是鼠TfR，的物种特异性。数据显示为两个地形密度图，并且指示用抗mTfR(CD71)抗体染色的转铁蛋白的流式细胞术数据。从左下至右上以对角方式定向的上密度图描绘293ST+SDGF-mTfR。下密度图，具有三个叶，描绘293ST+SDGF-hTfR。y轴显示从10-4至107的hTfR+链霉亲和素，采用根据对数标度的10倍增量。x轴显示从0至106的GFP，采用根据对数标度的10倍增量。
图15C说明具有SEQ ID NO:1的序列的肽、具有SEQ ID NO:2的序列的肽、具有SEQID NO:30的序列的肽、以及具有SEQ ID NO:32的序列的肽结合人TfR。数据显示为四个地形密度图，并且指示使用293ST细胞+SDGF-hTFR获得的流式细胞术数据。三个密度图看起来几乎叠加，并且定向在第四密度图的上方。下密度图以水平方式定向，并且描绘SEQ ID NO:1(第1代)。三个上密度图从左下至右上以对角方式定向。略微在其他两个密度图的上方的密度图对应于SEQ ID NO:32(第3代)。略微在其他两个密度图的下方的密度图对应于SEQ IDNO:2(第2代)。第三密度图对应于SEQ ID NO:30(第3代)。y轴显示从0至107的hTfR+链霉亲和素，采用根据对数标度的10倍增量。x轴显示从0至106的GFP，采用根据对数标度的10倍增量。
图15D说明具有SEQ ID NO:1的序列的肽、具有SEQ ID NO:2的序列的肽、具有SEQID NO:30的序列的肽、以及具有SEQ ID NO:32的序列的肽结合鼠TfR。数据显示为四个地形密度图，并且指示使用293ST细胞+SDGF-mTFR获得的流式细胞术数据。三个密度图看起来几乎叠加，并且定向在第四密度图的上方。下密度图以水平方式定向，并且描绘SEQ ID NO:1(第1代)。三个上密度图从左下至右上以对角方式定向。略微在其他两个密度图的上方的密度图对应于SEQ ID NO:32(第3代)。略微在其他两个密度图的下方的密度图对应于SEQ IDNO:2(第2代)。第三密度图对应于SEQ ID NO:30(第3代)。y轴显示从0至107的hTfR+链霉亲和素，采用根据对数标度的10倍增量。x轴显示从0至106的GFP，采用根据对数标度的10倍增量。
图16说明用经14C标记TfR结合肽(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30和SEQID NO:32)静脉内注射以评估生物分布的小鼠的全身放射自显影术。在将100nmol的剂量的肽(20mg/kg，假定约25g体重)施用至携带异种移植肿瘤(皮下人星形细胞瘤U87细胞)的小鼠之后3小时获取图像。图像证明在脾、肝、肾中的大量积累，以及还在肌肉、骨髓和皮肤中的高积累。CNS积累小于其他组织，但相较于不穿透血脑屏障(BBB)的化合物和生物制剂的历史值仍然是大量的(血清的>25％)-见于脑中的背景血液水平是心脏血液信号的水平的3％。
图16A说明用经14C标记SEQ ID NO:1静脉内注射的小鼠的全身放射自显影术。
图16B说明用经14C标记SEQ ID NO:2静脉内注射的小鼠的全身放射自显影术。
图16C说明用经14C标记SEQ ID NO:30静脉内注射的小鼠的全身放射自显影术。
图16D说明用经14C标记SEQ ID NO:32静脉内注射的小鼠的全身放射自显影术。
图17说明用经14C标记肽(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32)静脉内注射以评估生物分布的小鼠的全身放射自显影术。也观察到在侧腹肿瘤中的大量积累。在肿瘤中的积累是分散在各处的，而非集中在富含血液的位点。这表明外渗以及散布在整个肿瘤实质中。
图17A说明用经14C标记SEQ ID NO:1静脉内注射的小鼠的全身放射自显影术。
图17B说明用经14C标记SEQ ID NO:1静脉内注射的小鼠的全身放射自显影术。
图17C说明用经14C标记SEQ ID NO:32静脉内注射的小鼠的全身放射自显影术。
图17D说明用经14C标记SEQ ID NO:32静脉内注射的小鼠的全身放射自显影术。
图18说明在单次20mg/kg静脉内剂量的具有SEQ ID NO:1的序列的TfR结合肽或具有SEQ ID NO:32的序列的肽之后，肽生物分布和器官积累的定量。这个剂量在3小时之后实现CNS中>150nM，肿瘤中约1μM的水平。条形图定量在施用后3小时，在来自用肽静脉内注射的小鼠的各种组织中，在采用相同图像中的已知放射性以及相对于肽比活性的情况下获得的每种经14C标记肽的水平，如通过全身放射自显影术所测量。
图19说明具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32的序列的肽的肽生物分布和器官积累的定量。值显示为相对于血液中水平的组织中水平，其中鉴于脑具有3％血液，无脑穿透将赋予3％的水平。条形图定量在施用后3小时，在来自用肽静脉内注射的小鼠的各种组织中，以相同图像中具有已知放射性的对照以及以肽比活性作归一化的每种经14C标记肽的水平，如通过全身放射自显影术所测量。
图20说明在施用20mg/Kg的具有147Ci/mol的比活性的具有SEQ ID NO:32的序列的TfR结合肽之后，在各种组织中随时间的闪烁计数，从而验证全身放射自显影术(WBA)组织积累。
图20A说明肾中随时间的闪烁计数。在时间0时的y轴截距(Y0)是1900pCi，半衰期(t1/2)是0.89小时，并且拟合的R2是0.89。
图20B说明肝中随时间的闪烁计数。在时间0时的y轴截距(Y0)是400pCi，半衰期(t1/2)是7.22小时，并且拟合的R2是0.97。
图20C说明脑中随时间的闪烁计数。在时间0时的y轴截距(Y0)是7.3pCi，半衰期(t1/2)是0.72小时，并且拟合的R2是0.45。
图20D说明脾中随时间的闪烁计数。在时间0时的y轴截距(Y0)是168pCi，半衰期(t1/2)是12.1小时，并且拟合的R2是0.93。
图20E说明肌肉中随时间的闪烁计数。在时间0时的y轴截距(Y0)是31.4pCi，半衰期(t1/2)是2.54小时，并且拟合的R2是0.85。
图20F说明皮肤中随时间的闪烁计数。在时间0时的y轴截距(Y0)是68.3pCi，半衰期(t1/2)是0.33小时，并且拟合的R2是0.31。
图21说明静脉内施用20mg/kg的具有SEQ ID NO:32的序列的肽的小鼠的血清消除图，包括显示快速(95％，15.6分钟t1/2)和缓慢(5％，10.3小时t1/2)相动力学的两相消除回归分析。
图22说明具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32的序列的TfR结合肽的多元时间回归分析和毛细血管消减分析。
图22A在单一图中说明SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32的多元回归分析，其中y轴指示脑与血清比率。
图22B说明具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32的序列的TfR结合肽的实质和毛细血管分布，其中y轴指示组织与血清比率(μL/g)。
图23说明可溶性转铁蛋白受体(TfR)胞外域的纯化和测试。
图23A说明全铁转铁蛋白或去铁转铁蛋白(Tf)与纯化TfR的结合的表面等离子体共振(SPR)。全铁Tf结合TfR，但去铁Tf不结合TfR，如通过响应(RU)随时间而增加所见。
图23B说明用于筛选和优化肽结合性质的载体展示支架和靶标啮合的示意图。在细胞表面上表达编码结合剂(例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:32)的GFP标签化构建体的表面展示载体(SDGF)。用荧光染料(“共染色剂”)标记的靶蛋白(例如TfR)结合表面表达的结合剂。
图23C说明用以筛选特异性TfR结合的流式细胞术，所述特异性TfR结合如通过结合的Alexa Fluor 647-TfR(图23B中的共染色剂)的量所度量。用生物素化TfR和经AlexaFluor 647标记链霉亲和素(Strep-647)、SDGF-MaCV细胞和经Alexa Fluor 647标记弹性蛋白酶，或SDGF-弹性蛋白酶抑制因子细胞和TfR+Strep-647的组合测试用马丘坡病毒糖蛋白(SDGF-MaCV)转染的细胞。弹性蛋白酶和弹性蛋白酶抑制因子细胞缀合物未能结合细胞。
图24说明14C肽变体分布的全身放射自显影术(WBA)。在施用后30分钟和180分钟显示用14C肽变体处理的小鼠的组织切片。显示了三代肽加上对照非TfR结合CDP的代表性脑和心脏(插图)WBA图像。相同切片的全身图像显示于图25中，并且一些180分钟切片还显示于图16中。
图25说明图24中所示的全身放射线摄影术的全身图像，处于施用后30分钟(左列)和180分钟(右列)。来自180分钟的切片中的一些还显示于图16中。
图26说明SEQ ID NO:32在还原和非还原条件下的热稳定性，如使用圆二色谱所测量。将在210nm下的相对椭圆率(毫度)随用℃表示的温度而变化来绘图。NR指示非还原。DTT指示用DTT使肽还原。竖直线代表基于非线性曲线拟合(S形，可变斜率，约束底部＝0；对于两种情况，R2>0.98)的计算熔点(对于NR是约74℃，对于经10mM DTT处理是约38℃)。注意NR样品直至95℃未能达到平衡，因此有可能的是蛋白质在高温下未完全“熔解”，而是仅仅更加无序，特别是在延伸的环区域中。
图27说明本公开的鼠转铁蛋白、鼠转铁蛋白-NT融合物、以及各种CDP-神经降压素(NT)复合物的纯化和表征。在还原性(DTT)和非还原性(PBS)条件下的SDS-PAGE和用考马斯染料染色的凝胶显示在纯化之后肽的纯度。如所示的是鼠内源性转铁蛋白(表示为MmTf，SEQ ID NO:354)、缀合于神经降压素的鼠内源性转铁蛋白(表示为MmTf-NT，SEQ ID NO:355)以及CDP-NT肽构建体(SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35)。在还原性(DTT)或非还原性(PBS)条件下运行凝胶。用10mM DTT进行的还原表明肽形成二硫键。
图28说明在CRE-荧光素酶(CRE-Luc)小鼠中以及在哺乳动物细胞中均诱导在神经降压素受体(NTSR)的下游的IP1响应的CDP-NT肽构建体。
图28A说明在CRE-Luc小鼠中影响CRE驱动的荧光素酶的相关路径。PLC表示磷脂肪酶C。AC表示腺苷酰基环化酶。CaMK表示钙调蛋白依赖性蛋白质激酶。CREB表示cAMP响应元件结合蛋白。PKA表示蛋白质激酶A。PDE表示cAMP磷酸二酯酶。FS表示毛喉素。Rol表示咯利普兰。GPCR表示G蛋白偶联受体。
图28B说明体外神经降压素(NT)受体啮合，所述啮合显示在表达NTSR1的HEK-293细胞中，IP1积累仅响应于NT或NT肽构建体。使用测定试剂盒(CisBio 62IPAPEB)，以FRET比率的示值读数来测量IP1。对于除媒介物之外的所有条件，N＝3个孔，媒介物具有N＝36。水平棒条指示样品平均值。mTF＝鼠转铁蛋白。基线HEK293＝作为参考加以包括的不表达NTSR1的HEK293细胞的平均测定值(N＝36个孔)。
图29说明来自被施用NT肽构建体的小鼠的免疫组织化学染色组织样品。组织染色显示在SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35的CDP-NT施用之后4小时，在小鼠的皮质、纹状体和丘脑中，荧光素酶表达增强。被施用转铁蛋白-NT(“转铁蛋白-NT”，SEQ ID NO:355)或不施用肽(“未刺激”)的小鼠作为对照加以显示。比例尺(左上图)是100μm；所有图都采用相同放大倍数。
图30说明对CDP-NT肽构建体在CRE-荧光素酶(CRE-Luc)小鼠中的作用的定量。
图30A说明在使用匹配群组的情况下，在静脉内施用亲本TfR结合肽(“亲本”)(例如如所表示的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:32，或SEQ ID NO:354)或胱氨酸密集肽(CDP)-NT构建体或鼠转铁蛋白-NT构建体(例如包含如所表示的SEQ ID NO:33–SEQ IDNO:35或SEQ ID NO:355)(“NT融合物”)之前(未刺激)或之后四小时(表示为“NT融合物”或“亲本”)的发光(通过腹膜内荧光素给药)。水平棒条指示样品平均值。使用T检验(未配对，双尾)确定显著性。*：P<0.05。**：P<0.01。#：P<0.0001。对于亲本(SEQ ID NO:354)与NT转铁蛋白肽构建体(SEQ ID NO:355)两者，使用了鼠转铁蛋白。
图30B说明来自图30A中定量的SEQ ID NO:32群组的采用伪彩色发光强度的图像。所有图像都同等地进行背景减除和对比增强，仅为了便于检视。
图31说明在毛喉素和咯利普兰诱导之后四小时的体内CRE-荧光素酶发光。图像显示小鼠的荧光素酶荧光图像，并且充当图30中描绘的实验的阳性对照。毛喉素和咯利普兰不依赖于神经降压素受体路径来活化CRE依赖性荧光素酶表达。毛喉素和咯利普兰分别通过活化腺苷酰基环化酶和抑制cAMP磷酸二酯酶来诱导CRE表达。N＝8只小鼠。图显示用咯利普兰和毛喉素同等处理的重复动物。一只小鼠在未能命中腹膜腔的荧光素注射之后被删失。
图32说明在静脉内施用游离神经降压素肽之后，CRE-Luc小鼠中的荧光素酶表达。静脉内游离神经降压素未能诱导CRE-Luc小鼠中的荧光素酶表达。用腹膜内荧光素注射评估在静脉内施用高剂量游离神经降压素肽(300nmol)或媒介物(10％DMSO PBS溶液)之后4小时，CRE-荧光素酶小鼠的体内发光，并且在IVIS成像仪中成像。“ns”指示结果不显著(P＝0.48)，如通过T检验(未配对，双尾)所计算。
图33说明在单次20mg/kg静脉内剂量的具有SEQ ID NO:1的序列的TfR结合肽或具有SEQ ID NO:32的序列的肽之后，肽生物分布和器官积累的定量。测量在30分钟和3小时时的肽水平(3小时数据还显示于图18中)。这个剂量在3小时之后实现CNS中>150nM，肿瘤中约1μM的水平。条形图定量在施用后3小时，在来自用肽静脉内注射的小鼠的各种组织中，在采用相同图像中的已知放射性以及相对于肽比活性的情况下获得的每种经14C标记肽的水平，如通过全身放射自显影术所测量。组织数据绘制成七个聚簇，每个聚簇四个棒条。4棒条聚簇对应于不同组织类型，从左至右，皮肤、脂肪、肌肉、脾、肾、肝、脑和血液，如在x轴上所显示。每个聚簇中的四个棒条从左至右对应于SEQ ID NO:1 30分钟(N＝10切片)、SEQ ID NO:1 180分钟(N＝14个切片)、SEQ ID NO:32 30分钟(N＝12个切片)和SEQ ID NO:32 180分钟(N＝21个切片)。y轴显示nmol g-1组织的肽，从0.01至100，采用根据对数标度的10倍增量。从左至右，每个棒条的值是皮肤：1.33、1.12、1.70、1.02，脂肪：0.79、0.52、0.52、0.27，肌肉：0.63、0.35、0.44、0.35，脾：4.37、20.03、1.17、3.60，肾：29.05、9.71、16.91、3.10，肝：4.79、22.18、1.80、8.54，脑：0.23、0.16、0.21、0.09，以及血液：1.58、0.62、0.86、0.34。对应于脾、肾和肝的棒条明显高于其他集合。插图显示以血液作归一化的来自脑的相同数据。四个棒条从左至右对应于SEQ ID NO:1 30分钟(N＝10切片)、SEQ ID NO:1 180分钟(N＝14个切片)、SEQ ID NO:32 30分钟(N＝12个切片)和SEQ ID NO:32 180分钟(N＝21个切片)。y轴显示以血液作归一化的肽，从1至100，采用根据对数标度的10倍增量。从左至右，每个棒条的值是：血液肽水平的14％、26％、25％和27％。
图34说明SA21融合肽的纯化。
图34A显示对应于SEQ ID NO:373的融合于血清白蛋白肽(SA21)的TfR结合肽的纯化。在DTT还原性(“R”)或非还原性(“NR”)条件下，通过SDS-PAGE(左侧)和RP-HPLC(右侧)来验证纯度。还对未切割(“U”)噬铁蛋白-CDP融合肽运行SDS-PAGE。
图34B显示对应于SEQ ID NO:456(GSRLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGSVRIPVSCKHSGQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCDCTPK)的融合于SA21的肽的纯化。在DTT还原性(“R”)或非还原性(“NR”)条件下，通过SDS-PAGE(左侧)和RP-HPLC(右侧)来验证纯度。还对未切割(“U”)噬铁蛋白-CDP融合肽运行SDS-PAGE。
具体实施方式
药物向位于中枢神经系统(CNS)中的靶标的递送可受到血脑屏障(BBB)阻碍，所述血脑屏障是用于CNS毛细血管中的血管内皮细胞的术语。这个系统存在是为了阻止毒性代谢物和病原体进入CNS(例如脑)，但还起致使CNS的疾病特别难以使用常规药品进行治疗的作用。出于这个原因，可存在以下情况：原发性CNS肿瘤(例如神经胶质瘤)以及神经炎症性和神经变性疾病诸如多发性硬化症和阿尔茨海默氏病对在影响外周组织的类似疾病的情况下可不同地是更加有效的治疗剂的响应特别不良，在所述类似疾病的情况下，药物向靶细胞的递送可受到较小阻碍。数万种CNS病症，从脑癌至神经变性至年龄相关的炎症性过程，需要用以进行CNS药物递送的不同方法。尽管BBB允许渗透剂和营养物从血清进入脑中，并且CNS星形细胞提供由神经元所需的许多生长和存活信号，但若干较大激素和蛋白质诸如转铁蛋白(铁伴侣蛋白)、胰岛素和瘦素可穿过BBB。较大分子诸如转铁蛋白的CNS转运可通过受体介导的胞吞转运或“囊泡胞吞转运”(例如在细胞内囊泡中，运载物从顶侧转运至基底侧，或反之亦然)来实现。举例来说，胰岛素、瘦素和转铁蛋白的内源性受体(分别是InsR、ObR和TfR)的含有正常胞外域的变体可由CNS血管内皮细胞用于促进这些分子转运至CNS中。以这个高度选择性方式，某些大分子如转铁蛋白(分子量是约75kDa)可进入脑实质。
在各种实施方案中，本公开提供了使得能够达成运载物分子或活性剂(例如小分子、肽或蛋白质)穿过细胞层或屏障，包括内皮(例如BBB)或上皮细胞层，的转运的组合物，以及使用这些组合物的方法。在一些实施方案中，本公开提供了使得能够将否则将不能通过BBB的各种分子递送至CNS中的组合物和方法。在一些情况下，本公开提供了用于将治疗性和/或诊断性分子递送至CNS例如脑中的组合物和方法。因此，在各种实施方案中，本公开提供了能够穿过BBB的肽。这些肽可对转铁蛋白受体(TfR)具有亲和力和选择性。TfR结合肽可为胱氨酸密集肽(CDP)。在一些情况下，本公开的肽可通过TfR介导的胞吞转运来穿过BBB。
在一些实施方案中，当前描述的肽可为肽缀合物、肽构建体、融合肽或融合分子，诸如分别通过任何分子类型诸如小分子、肽或蛋白质的化学缀合，或通过肽或蛋白质的重组融合来连接(例如肽构建体)。术语“融合肽”和“肽融合物”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，肽构建体可以生物方式或以合成方式产生。因此，在一些情况下，TfR结合肽可包含连接于另一分子或另一组分子诸如小分子、肽，或蛋白质或其他大分子诸如纳米颗粒的TfR结合肽结构域。
在一些实施方案中，本公开提供了使得能够达成穿过细胞或分子屏障的转运的方法和组合物。在各种实施方案中，本公开提供了使得能够达成TfR介导的穿过细胞层(例如内皮细胞或上皮细胞)或细胞膜的转运的方法和组合物。在一些情况下，本公开的TfR结合肽使得能够达成穿过血脑屏障(BBB)的转运。在各个方面，本公开的肽可用于靶向表达TfR的任何细胞。除BBB之外，各种其他细胞、组织和器官也表达TfR。表达TfR的细胞可包括肝细胞、骨髓中的红细胞和红细胞前体、免疫细胞、干细胞和快速分裂细胞。表达TfR的组织和器官可包括脑(例如大脑皮质、海马、尾状核、小脑)、内分泌组织(例如甲状腺、甲状旁腺和肾上腺)、骨髓和免疫系统(例如阑尾、淋巴结、扁桃体、脾)、肌肉组织(例如心肌、骨骼肌和平滑肌)、肝、胆囊、胰腺、胃肠道(例如口腔粘膜、食道、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠)、肾、膀胱、雌性组织(例如输卵管、乳腺、阴道、子宫颈、子宫内膜、卵巢和胎盘)、脂肪和软组织、以及皮肤。因此，本公开的TfR结合肽可用于靶向这些细胞、组织和器官，并且通过例如TfR介导的胞吞转运(例如穿过细胞屏障诸如BBB)或TfR介导的胞吞作用(例如穿过细胞膜进入细胞中)来将活性剂递送至这些细胞、组织和器官。
在各种实施方案中，本公开提供了使得能够达成TfR介导的向表达TfR的癌细胞或CMYC过度表达性癌的转运和递送的方法和组合物，因为在一些情况下，CMYC过度表达可导致TfR过度表达。过度表达TfR的癌可包括卵巢癌、结肠癌、肺癌、位于骨或骨髓中的癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、骨髓细胞癌、皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤，或CMYC过度表达性癌。
在一些实施方案中，当前描述的肽可为包含缀合于、连接于或融合于一个或多个活性剂的一个或多个如本文所述的TfR结合肽的肽构建体。如本文所述的肽构建体可包括化学缀合物和重组融合分子。在一些情况下，化学缀合物可包含化学缀合于或连接于另一分子的如本文所述的TfR结合肽。分子可包括小分子、肽、多肽、蛋白质，或其他大分子(例如纳米颗粒)和聚合物(例如核酸、聚赖氨酸或聚乙二醇)。在一些情况下，本公开的TfR结合肽通过接头来缀合于另一分子。接头部分可包括可切割(例如pH敏感性或酶不稳定性接头)或稳定接头。在一些实施方案中，肽构建体是可重组表达的融合分子(例如融合肽或融合蛋白)，并且其中所述融合分子可包含融合于一个或多个其他分子肽、多肽、蛋白质或可重组表达的其他大分子的一个或多个TfR结合肽。
在一些情况下，本公开的TfR结合肽缀合于、连接于或融合于能够施加某一生物作用的治疗性(也被称为“活性剂”)运载物分子或诊断性(也被称为“可检测剂”)运载物分子，从而产生肽构建体。在一些情况下，本文所用的治疗性或诊断性运载物分子可通过TfR介导的胞吞转运来穿过BBB加以转运。一旦在CNS内部，运载物分子即可靶向特定细胞、细胞群体或组织。在一些情况下，治疗性或诊断性运载物分子是在与本文公开的组合物和方法组合使用时由于穿过BBB的有效转运而能够在CNS内部施加显著较高效能的已知化合物。
本公开的肽或其衍生物、片段或变体可对TfR或其衍生物或类似物具有亲和力和选择性。在一些情况下，本公开的肽可使用位点饱和诱变(SSM)来工程改造以展现改善的TfR结合性质，或更有效地促进胞吞转运。在一些情况下，本公开的肽是与打结肽或套结素(hitchin)源性肽或打结素(knottin)源性肽相关的胱氨酸密集肽(CDP)。TfR结合肽可为胱氨酸密集肽(CDP)。术语“肽”、“CDP”、“TfR结合肽”、“TfR结合CDP”和“TfR结合肽”在本文中可互换使用。套结素可为CDP的子类，其中六个半胱氨酸残基根据连接性[1-4]、2-5、3-6形成二硫键，所述连接性指示第一半胱氨酸残基与第四残基，第二与第五，并且第三半胱氨酸残基与第六形成二硫键。这个命名法中的括号指示半胱氨酸残基形成打结二硫键。(参见例如Correnti等人Screening,large-scale production,and structure-basedclassification for cystine-dense peptides.Nat Struct Mol Biol.2018年3月；25(3):270–278)。打结素可为CDP的子类，其中六个半胱氨酸残基根据连接性1-4、2-5、[3-6]形成二硫键。打结素是在长度方面通常在约20至约80个氨基酸的范围内的一类肽，所述氨基酸经常折叠成紧密结构。打结素通常组装成复杂三级结构，所述结构的特征在于具有许多分子内二硫交联，并且可含有β折叠股和其他二级结构。二硫键的存在赋予打结素显著环境稳定性，从而允许它们经得住极端温度和pH，并且抵抗血流的蛋白水解酶。在一些情况下，本文所述的肽可源于打结肽。如本文公开的肽的氨基酸序列可包含多个半胱氨酸残基。在一些情况下，存在于肽的氨基酸序列内的多个半胱氨酸残基中的至少半胱氨酸残基参与形成二硫键。在一些情况下，存在于肽的氨基酸序列内的多个半胱氨酸残基中的所有半胱氨酸残基都参与形成二硫键。如本文所述，术语“打结肽”可与术语“胱氨酸密集肽”、“CDP”或“肽”互换使用。
本文提供了对结合转铁蛋白受体，并且允许生物活性分子在治疗相关浓度下在受试者(例如人类或非人类动物)中积累的CDP进行鉴定、成熟、表征和利用的方法。本公开证明了CDP作为可针对关于现代药物发现策略的适用性加以筛选的多样性支架家族的效用。CDP包含对主要是抗体的现有生物制剂的替代物，所述替代物可绕过免疫球蛋白支架的一些不利因素，包括不良组织可渗透性、免疫原性、以及如果出现毒性那么可变得有问题的长久血清半衰期。在20-80个氨基酸的范围内的本公开的肽代表在医学上相关的治疗剂，其具有中等大小，具有抗体的许多有利结合特异性和亲和力特征，但稳定性改善，免疫原性降低，并且制造方法更简单。CDP的分子内二硫键构造提供了特别高的稳定性衡量标准，从而降低断裂和免疫原性，同时它们的较小尺寸可改善组织穿透或细胞穿透，并且促成可调谐血清半衰期。本文公开了代表可充当CNS药物递送载体的候选肽的肽。本公开的肽可为细胞穿透肽(CPP)。CPP可为细胞穿透性的，组织穿透性的，或两者。
在一些实施方案中，CPP可为CDP。CPP可包含有助于各种部分和剂的细胞摄入或摄取的肽，并且它们自身可穿过细胞膜进行易位。CPP可含有蛋白质转导结构域，所述结构域是可穿过细胞膜进行易位的一类短肽序列。细胞穿透肽可直接或间接进入细胞的胞质液、细胞的核，或细胞的其他亚细胞位置。细胞穿透肽可用作各种运载物的适当载体，所述运载物包括核酸、肽、蛋白质、siRNA、dsRNA、具有替代性主链化学的核酸(例如连接的核酸(LNA)或肽核酸(PNA))、放射性核素、成像剂、荧光剂、治疗剂、纳米颗粒等。CPP可为人工或经工程改造序列(例如合成序列)。CPP可包含多个蛋白质序列，无论此类蛋白质序列是天然的，合成的，还是变异的(例如嵌合的)。CPP可源于单一蛋白质序列，无论此类蛋白质序列是天然的，合成的，还是变异的(例如蛋白质源性序列)。CPP可展现多种生理化学性质，诸如阳离子性、两亲性或疏水性。CPP的一些内化机制包括直接细胞穿透、使用胞吞作用路径、以及通过形成短暂结构来易位。应了解本文中对细胞穿透肽(CPP)的描述和使用是非限制性的。CPP的非限制性实例可例如见于Derakhshankhah和Jafari,“Cell penetrating peptides:Aconcise review with emphasis on biomedical applications”(Biomedicine&Pharmacotherapy；第108卷,2018年12月,第1090-1096页)中，所述文献通过引用以它的整体并入本文。
可与本文公开的方法和组合物组合使用的一些治疗性分子可能够靶向作为CNS的一部分的一种或多种特定细胞或组织。举例来说，作为一种G蛋白偶联受体的神经降压素受体(NTSR)被包含连接于神经降压素(在本文中缩写为“NT”；ELYENKPRRPYIL(SEQ ID NO:350))或其衍生物的CDP的融合蛋白靶向，所述神经降压素是一种活化NTSR的神经肽。在一些情况下，CDP-NT肽构建体用于预防或治疗受试者(例如人)中的慢性疼痛或神经病变性疼痛。
本文还描述了选择性归巢至、靶向、定向至、迁移至、能够到达中枢神经系统(CNS)的特定区域、组织、结构或细胞，被所述特定区域、组织、结构或细胞截留，或在所述特定区域、组织、结构或细胞中积累，并且/或者结合所述特定区域、组织、结构或细胞的肽，所述特定区域、组织、结构或细胞涉及于感受、调节、管理、降低、消除或减轻疼痛，包括伤害感受性疼痛，或如本文所述的其他治疗适应症。归巢至、靶向、迁移至、定向至受影响区域的一种或多种特定区域、组织、结构或细胞，被所述一种或多种特定区域、组织、结构或细胞截留，或在所述一种或多种特定区域、组织、结构或细胞中积累，并且/或者结合所述一种或多种特定区域、组织、结构或细胞的肽可具有较少脱靶以及潜在负性作用，例如经常限制疼痛药物的使用和功效的副作用。此外，此类肽可将活性剂递送至诸如CNS的区域，其中那些活性剂否则诸如由于血脑屏障而不能在治疗水平下到达CNS。此类肽还可降低对其他疼痛药物治疗，包括阿片药物治疗的需要。此外，通过使现有药物直接靶向受影响区域的特定区域、组织、结构或细胞，以及有助于接触受影响区域，或增加剂的局部浓度，此类肽可降低现有药物的剂量，并且增加现有药物的功效。肽自身可调节疼痛，或它可缀合于调节疼痛的剂。此疼痛调节可通过各种机制来起作用，诸如调节炎症、自身免疫反应、直接或间接作用于疼痛受体、细胞杀灭，或程序化细胞死亡(无论是通过患病细胞或组织的凋亡路径，非凋亡路径，还是凋亡路径和非凋亡路径)等(Tait等人J Cell Sci 127(Pt10):2135-44(2014))。
相较于其他分子诸如抗体，由于尺寸更小、组织或细胞穿透更大、以及从血清的清除更快，并且相较于较小肽，由于对蛋白酶的抗性(以达成稳定性与免疫原性降低两者)，所以CDP对于递送至CNS来说可为有利的。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽(例如CDP、打结肽或套结素)、TfR结合肽缀合物(例如包含一个或多个TfR结合肽和一个或多个活性剂)，或经工程改造TfR结合融合肽(例如包含一个或多个TfR结合肽和一个或多个肽)可具有优于TfR结合抗体的性质。举例来说，本文所述的肽和构建体可提供优越、更深度以及/或者更快的对细胞和所靶向组织的组织或细胞穿透(例如脑实质穿透、实体肿瘤穿透)，以及更快的从非所靶向组织和血清的清除。相比于TfR结合抗体，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽可具有更低分子量。相较于TfR结合抗体，更低分子量可对本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽赋予有利性质。举例来说，相比于抗TfR抗体，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽可更易于穿透细胞或组织，或相比于抗TfR抗体，可具有更低摩尔剂量毒性。本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽有利于缺乏抗体的Fc功能。本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽有利于允许使用基于摩尔的较高浓度的制剂。
相较于基于TfR结合抗体的治疗剂，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽可具有更宽的治疗窗(例如高于其会观察到治疗药效动力学响应，但低于其会观察到毒性的剂量)。相较于基于TfR结合抗体的治疗剂，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽可在更高摩尔剂量下使用，伴有更小毒性风险。相较于基于TfR结合抗体的治疗剂，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽可具有更少的触发适应性免疫应答的表位，从而导致免疫原性降低。相较于基于TfR结合抗体的治疗剂，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽可展现活性剂更容易并且以更小破坏性并入至蛋白质融合构建体中。相较于基于TfR结合抗体的治疗剂，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽可具有更小表面积，从而导致更低的脱靶结合风险。示例性比较描述于实施例54中。
在一些实施方案中，当在相同摩尔剂量下或在类似有效剂量下施用至受试者时，相比于抗TfR抗体，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽展现更低中靶毒性。在一些实施方案中，当在相同摩尔剂量或类似有效剂量下施用至受试者时，相比于抗体，TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽展现更低脱靶毒性。举例来说，相比于抗体，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽可在是约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍高的摩尔剂量下施用至受试者，同时提供类似或更低的观察毒性。在一些实施方案中，当在以重量计与抗TfR抗体相同的剂量下施用至受试者时，相比于所述抗TfR抗体，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽展现更高功效。本公开的TfR结合肽在融合于半衰期延长部分(例如Fc、SA21、PEG)时可在甚至更低剂量下递送，同时保持活性和功效，因此，远远胜过施用抗TfR抗体。
相比于针对相同靶标的经工程改造抗TfR双特异性抗体，当前公开的TfR结合肽当在肽构建体中融合于活性剂时可展现更高功效。举例来说，本文公开的经工程改造TfR结合肽可还融合于BACE抑制剂。相比于双特异性抗TfR/BACE1抗体，这些经工程改造TfR结合肽-BACE抑制剂构建体可在更高摩尔剂量下施用，同时仍然维持相同或更高功效。举例来说，经工程改造TfR结合肽-BACE抑制剂构建体可导致较小程度的网织红细胞减少症，并且有效抑制淀粉样蛋白β形成，伴有对施用经工程改造TfR结合肽-BACE抑制剂构建体的受试者的较低毒性或无毒性。相比之下，双特异性抗TfR/BACE1抗体可导致更大程度的网织红细胞减少症，并且/或者在预防淀粉样蛋白β形成方面具有较低功效，并且可对受试者具有较高毒性，从而导致嗜睡、痛苦和溶血征象。
在一些实施方案中，本公开提供了结合TfR的肽(例如CDP、打结肽或套结素)、化学缀合物(例如包含一个或多个TfR结合肽和一个或多个活性剂)，或重组表达的融合分子(例如包含一个或多个TfR结合肽和一个或多个活性剂)。TfR结合肽可为胱氨酸密集肽(CDP)。术语“肽”、“CDP”、“TfR结合肽”、“TfR结合CDP”、“TfR结合肽”和“经工程改造TfR结合肽”在本文中可互换使用。本公开中所述的肽与TfR的结合可有助于肽或肽构建体(例如融合蛋白，或缀合于、连接于或融合于剂的肽)穿过细胞屏障(例如BBB)的胞吞转运。本文还公开了哺乳动物表面展示筛选平台筛选CDP的多样性文库，并且鉴定特异性结合人TfR的CDP的用途。可随后实施进一步亲和力成熟以产生具有不同亲和力的TfR结合CDP的等位基因系列。在一些实施方案中，鉴定TfR结合CDP，并且可通过结晶学来确定结合。本公开的肽可具有跨物种交叉反应性。举例来说，在一些情况下，本文公开的肽结合人和鼠TfR。在静脉内施用之后，包括本文公开的肽可在CNS中积累，并且可通过对TfR的啮合来穿透BBB，包括使用神经降压素肽构建体诱导cAMP响应元件信号传导级联。本文公开了作为治疗递送剂用于肿瘤学、自身免疫性疾病、急性和慢性神经变性、以及疼痛管理中的TfR结合CDP。由于制造更简单(肽可通过生物或合成手段来制备)，稳定性改善，以及尺寸更小(运载物活性的空间位阻的潜在性更小)，所以通过TfR结合CDP来递送活性剂或药物剂可优于常规抗TfR抗体。因此，本公开的方法和组合物可提供对有效地将运载物分子(例如治疗性和/或诊断性小分子、肽或蛋白质)转运至CNS(例如脑)中的问题的解决方案。举例来说，本公开的肽有助于药物递送至位于脑中的肿瘤。
在本公开的一些实施方案中，CDP、打结肽、套结素，或源于打结肽或套结素的肽的多样性文库可与哺乳动物表面展示筛选平台组合使用，用于鉴定特异性结合人TfR的肽。(参见例如Crook等人(2017)Mammalian display screening of diverse cystine-densepeptides for difficult to drug targets.Nat Commun 8:2244)。在一些实施方案中，CDP、打结肽、套结素，或源于打结肽或套结素的肽的多样性文库从内源性肽序列加以诱变以提供新型肽序列。TfR结合肽一经鉴定，即可进行亲和力成熟(例如位点饱和诱变)以产生对TfR具有不同(例如改善)亲和力的结合剂的等位基因系列。这些技术可与各种其他分析方法(例如结晶学或光谱法)组合使用以测定肽-受体相互作用的性质(例如对于受体结合是关键的氨基酸残基等)。在一些情况下，本公开的肽被开发来结合人TfR；然而，那些肽可显示与源于其他物种的TfR诸如鼠TfR的交叉反应性。
本公开的肽可具有不同体内生物分布样式。在一些情况下，使用例如经放射性标记肽(例如经14C标记肽)进行小鼠生物分布和药代动力学研究，以测定器官分布、肽在靶器官(例如脑)中的摄取和停留时间、以及它们的清除模式(例如肾清除或肝清除)。
在各种实施方案中，本公开提供了在CNS(例如脑)中积累的肽。在一些情况下，那些肽的CNS积累归因于穿过BBB的穿透。在一些情况下，如本文所述的经工程改造TfR结合肽变体通过TfR介导的胞吞转运来穿过BBB。在一些情况下，本公开的TfR结合肽在位于CNS中的肿瘤组织中积累。在一些情况下，肽在其中积累的肿瘤是脑肿瘤(例如神经胶质瘤)。如本文所述，术语“积累”和“在……中积累”可互换使用，并且用于指代“在细胞和/或组织中积累或在细胞和/或组织上积累”，并且可被理解为相应分子(例如TfR结合肽或肽构建体)的浓度随时间逐渐增加。
在一些实施方案中，本公开的经工程改造肽(例如含有组氨酸或组氨酸富集的TfR结合肽)在生理pH下可具有高TfR结合亲和力，但在较低pH水平诸如内体pH 5.4下具有显著降低的结合亲和力。在一些情况下，本公开的TfR结合肽可被优化以获得改善的囊泡内(例如内体内)和/或细胞内递送功能，同时保留高TfR结合能力。在一些情况下，可进行组氨酸扫描和比较结合实验以开发和筛选此类肽。此外，一些肽可包含(例如缀合于、连接于或融合于)有助于肽或肽构建体的低pH内体逃逸以获得增强的递送功能(例如治疗剂的细胞内递送)的基序。在一些实施方案中，本公开的肽中的氨基酸残基被用不同氨基酸残基取代以改变对TfR的pH依赖性结合亲和力。氨基酸取代可增加在低pH下的结合亲和力，增加在高pH下的结合亲和力，降低在低pH下的结合亲和力，降低在高pH下的结合亲和力，或它们的组合。
本公开的示例性肽显示于表1中，具有以SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、以及SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202阐述的氨基酸序列。
在各种实施方案中，本公开的肽是被设计来穿过细胞层或细胞屏障诸如BBB来转运治疗性和/或诊断性分子(例如小分子、肽或蛋白质)的肽构建体的一部分，所述肽构建体诸如是肽构建体或融合肽(例如具有SEQ ID NO 33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:375、SEQ IDNO:381、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:400和SEQ ID NO:401中的任一者的氨基酸序列的那些)。示例性肽构建体显示于表2、表5和表6中。本公开的肽构建体可包含连接(例如化学缀合或融合)于治疗性和/或诊断性分子或化合物的TfR靶向肽。TfR结合肽构建体可通过TfR介导的胞吞转运来穿过BBB，因此将治疗性和/或诊断性分子或化合物递送至CNS中。因此，本公开的方法和组合物可对各种疾病或疾患的诊断、预防和治疗具有深远影响。本公开的方法和组合物可用于的疾病领域包括但不限于肿瘤学、自身免疫性疾病、急性和慢性神经变性、肌肉病症、神经心理学病症、癫痫、精神分裂症、抑郁、焦虑、双相障碍、发育性脑病症(例如自闭症谱系)、疼痛、癫痫、情绪障碍和疼痛管理。
因此，患有CNS的病症的受试者否则不能受益于受限于不良BBB穿透的药物或药物类别，可受益于本文所述的组合物和方法，因为所述药物在CNS中的治疗有效浓度可通过缀合于本文提供的TfR结合肽来实现。除药理学进步之外，包含TfR结合肽的本文公开的组合物和方法还可在它们的生产、质量控制和安全性方面优于常规CNS和TfR靶向剂(例如抗TfR抗体)。举例来说，本公开的肽和肽构建体以更简单、更廉价并且更具资源有效性的方式制造(例如肽可通过生物或合成方法来合成)；本公开的肽和肽构建体可显示改善的离体和体内稳定性，在尺寸方面更小(例如运载物活性的空间位阻的潜在性更小，并且能够穿透致密组织诸如实体肿瘤，以及具有从体循环更快清除的潜力)，展现更高组织或细胞穿透，并且具有更低免疫原性。通过将结晶学数据与主要组织相容性复合物(MHC)或人白细胞抗原(HLA)肽片段结合实验或其计算预测，或前述事项的组合进行组合，本公开的肽可被工程改造来具有较低免疫原性。
对能够穿过细胞层或屏障诸如BBB的治疗剂或诊断剂的鉴定一直具有挑战性，因为此类方法涉及对以下事项的需要：针对可促进胞吞转运的受体(例如TfR)的高特异性或靶向性、高亲和力结合剂；以及在胞吞转运之后靶向细胞并作用于靶蛋白的能力(低脱靶不利影响)。除了少数例外，用小分子文库进行的高通量筛选活动未能提供能够穿过内皮或上皮层以及/或者穿过那些层来转运运载物的特异性化合物。
在一些实施方案中，本文描述了肽和肽构建体，以及筛选靶向目标蛋白质诸如TfR的肽和肽构建体的方法。相较于野生型或内源性分子诸如转铁蛋白，如本文所述的方法和组合物可提供具有改善的TfR结合能力的肽，或展现改善的穿过BBB的转运能力的肽，或它们的任何组合。在一些情况下，当前描述的肽高效地穿过内皮细胞层(例如BBB)或上皮层来转运运载物分子(例如治疗性或诊断性小分子或蛋白质)。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽结合TfR，并且促进囊泡胞吞转运。在一些情况下，本公开的TfR结合肽结合过度表达TfR的细胞(例如癌细胞)，并且促进由所述细胞对肽的摄取。在一些方面，如本文所述的TfR结合肽或肽构建体促进囊泡胞吞转运和由TfR过度表达性细胞诸如癌达成的摄取，或它们的组合。
本公开的TfR结合肽可结合不同物种的TfR，包括人、猴、小鼠和大鼠TfR。在一些情况下，TfR结合肽的任何氨基酸残基的变异或突变可影响交叉反应性。在一些情况下，TfR结合肽的与TfR的结合位点相互作用的任何氨基酸残基的变异或突变可影响交叉反应性。
本文描述了可足够大以致携带运载物分子，同时保留以高亲和力结合靶蛋白(例如TfR)的能力，但又足够小以致进入细胞区室诸如胞质液或核，或组织诸如细胞凝聚物(例如实体肿瘤)的中心的肽，包括但不限于经设计或经工程改造肽、重组肽、以及胱氨酸密集肽(CDP)/小型二硫键打结肽(例如打结肽、套结素、以及源于它们的肽)。在一些情况下，如本文所述的肽通过血管胞吞转运来携带运载物分子穿过BBB进入CNS(例如实质)中。在一些情况下，胞吞转运是TfR介导的。
本文还描述了用于测定肽-受体相互作用的性质(例如使用X射线结晶学)以及它们的体内药效动力学和药代动力学性质(包括在CNS(例如脑)中的积累)的方法和组合物。本文所述的一些肽具有靶向肿瘤细胞，并且在肿瘤细胞中积累的能力。在一些情况下，肿瘤细胞过度表达TfR。在一些方面，本公开的肽具有高体内稳定性，例如高蛋白酶稳定性，对还原剂诸如谷胱甘肽(GSH)的高可耐受性，并且耐受高温(例如直至95℃)。
在一些实施方案中，本公开提供了一种基于3D蛋白质或受体结构的肽或蛋白质设计方法，所述方法用于鉴定能够结合此受体的肽或蛋白质。在一些情况下，受体是转铁蛋白受体。
根据以下详细描述，本公开的额外方面和优势将变得为本领域技术人员显而易知，在以下详细描述中，显示和描述了本公开的说明性实施方案。如将认识到，本公开能够具有其他和不同实施方案，并且它的若干细节能够在各个方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和描述在性质上应被视为具有说明性而非限制性。
如本文所用，天然L-对映异构氨基酸的缩写是常规的，并且如下：丙氨酸(A，Ala)；精氨酸(R，Arg)；天冬酰胺(N，Asn)；天冬氨酸(D，Asp)；半胱氨酸(C，Cys)；谷氨酸(E，Glu)；谷氨酰胺(Q，Gln)；甘氨酸(G，Gly)；组氨酸(H，His)；异亮氨酸(I，Ile)；亮氨酸(L，Leu)；赖氨酸(K，Lys)；甲硫氨酸(M，Met)；苯丙氨酸(F，Phe)；脯氨酸(P，Pro)；丝氨酸(S，Ser)；苏氨酸(T，Thr)；色氨酸(W，Trp)；酪氨酸(Y，Tyr)；缬氨酸(V，Val)。通常，Xaa可指示任何氨基酸。在一些实施方案中，X可为天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)。
本公开的一些实施方案考虑任何标准或非标准氨基酸的D-氨基酸残基或其类似物。当氨基酸序列表示为一系列三字母或单字母氨基酸缩写时，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向，并且右手方向是羧基末端方向。
术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”、“套结素”、“胱氨酸密集肽”、“打结肽”或“CDP”在本文中可互换用于指代氨基酸残基的聚合物。在各种实施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白质”可为α碳通过肽键来连接的氨基酸的链。因此，在链的一个末端(例如氨基末端)的末端氨基酸可具有游离氨基，而在链的另一末端(例如羧基末端)的末端氨基酸可具有游离羧基。如本文所用，术语“氨基末端”(例如缩写为N端)可指在处于肽的氨基末端的氨基酸上的游离α-氨基或在肽内的任何其他位置处的氨基酸的α-氨基(例如当参与肽键时的亚氨基)。类似地，术语“羧基末端”可指肽的羧基末端上的游离羧基或在肽内的任何其他位置处的氨基酸的羧基。肽还包括基本上任何聚氨基酸，包括但不限于肽模拟物，诸如由醚或硫醚而非酰胺键接合的氨基酸。
如本文所用，术语“肽构建体”可指包含可缀合于、连接于或融合于一个或多个运载物分子的一个或多个本公开的肽的分子。在一些情况下，运载物分子是活性剂。术语“活性剂”可指任何分子，例如能够引发生物作用和/或可允许定位、检测或显现相应肽构建体的物理作用(例如辐射的发射)的任何分子。在各种实施方案中，术语“活性剂”是指治疗剂和/或诊断剂。本公开的肽构建体可包含通过一个或多个如本文所述的接头部分(例如可切割接头或稳定接头)来连接于一个或多个活性剂的TfR结合肽。
如本文所用，术语“包含”和“具有”可互换使用。举例来说，术语“包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的肽”和“具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的肽”可互换使用。
如本文所用，并且除非另外陈述，否则术语“TfR”或“转铁蛋白受体”是本文所用的一类蛋白质，并且可指来自任何物种的转铁蛋白受体(例如人或鼠TfR或任何人类或非人类动物TfR)。在一些情况下，并且如本文所用，术语“TfR”或“转铁蛋白受体”是指人TfR(hTfR)，并且可包括TfR或任何已知TfR同源物或直系同源物，包括TfR1、TfR2、可溶性TfR，或它们的任何组合或片段(例如胞外域)。
术语“经工程改造”在应用于多核苷酸时表示所述多核苷酸已从它的天然遗传环境移除，因此不含其他外来或非所要编码序列，并且呈适于在经遗传工程改造蛋白质产生系统内使用的形式。此类经工程改造分子是从它们的天然环境分离的那些，并且包括cDNA和基因组克隆(即具有含有来自不同生物体的DNA片段的载体的原核或真核细胞)。本发明的经工程改造DNA分子不含它们通常与其相伴的其他基因，但可包括天然存在或非天然存在的5'和3'非翻译区，诸如增强子、启动子和终止子。
“经工程改造”多肽或蛋白质是见于除它的天然环境以外的条件下，诸如离开血液和动物组织的多肽或蛋白质。在一优选形式的情况下，经工程改造多肽大致上不含其他多肽，特别是动物来源的其他多肽。优选的是提供呈高度纯化形式的多肽，例如纯度大于95％，更优选是纯度大于98％，或纯度大于99％。当在这个情形下使用时，术语“经工程改造”不排除同一多肽以替代性实体形式存在，所述形式诸如是二聚体、异二聚体和多聚体，或替代地，糖基化、羧化、经修饰或衍生化形式。
“经工程改造”肽或蛋白质是不同于天然存在的多肽结构、序列或组成的多肽。经工程改造肽包括非天然存在、人工、经分离、合成、经设计、经修饰或重组表达的肽。本文提供了经工程改造TfR结合肽、其变体或片段。这些经工程改造TfR结合肽可还连接于活性剂或可检测剂。活性剂可为半衰期延长部分。
本公开的多肽包括已以任何方式修饰，例如以：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变用于形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，以及(5)赋予或改进其他物理化学或功能性质的多肽。举例来说，在天然存在的序列中(例如在多肽的处于形成分子间接触的一个或多个结构域的外部的部分中)进行单一或多个氨基酸取代(例如保守性氨基酸取代)。“保守性氨基酸取代”可指在多肽中用功能类似氨基酸取代某一氨基酸。以下六组各自含有可为彼此的保守性取代的氨基酸：i)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；ii)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；iii)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；iv)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；v)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；vi)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。
如本文所用的术语“多肽片段”和“截短多肽”可指相较于相应全长肽或蛋白质，具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。在各种实施方案中，片段在长度方面是至少5、至少10、至少25、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1000个氨基酸。在各种实施方案中，片段在长度方面还可为例如至多1000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多450、至多400、至多350、至多300、至多250、至多200、至多150、至多100、至多50、至多25、至多10或至多5个氨基酸。片段还可在它的任一末端或两个末端包含一个或多个额外氨基酸，例如来自不同天然存在蛋白质的氨基酸序列(例如Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如人工接头序列)。
在各种实施方案中，本公开的TfR结合肽的界面残基(例如与TfR相互作用以进行受体结合的那些氨基酸残基)可在肽的两个主要是螺旋性的结构域之间分配。在一些情况下，界面残基可包含以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基5-25(例如并且包含相应残基G5、A7、S8、M11、N14、L17、E18和E21)，或以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基35-51(例如并且包含相应残基L38、L41、L42、L45、D46、H47、H49、S50和Q51)，或两者的残基。举例来说，界面残基可包含以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基5-25(例如并且包含相应残基G5、A7、S8、M11、N14、L17、E18和E21)，或以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基35-51(例如并且包含相应残基L38、L41、L42、L45、D46、H47、H49、S50和Q51)的残基。在一些实施方案中，TfR结合肽可包含本文提供的肽的片段，其中所述片段包含用于结合的最少界面残基，例如以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基5-25(例如并且包含相应残基G5、A7、S8、M11、N14、L17、E18和E21)，或以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基35-51(例如并且包含相应残基L38、L41、L42、L45、D46、H47、H49、S50和Q51)的残基。在一些情况下，TfR结合肽是具有以SEQ ID NO:32阐述的序列的肽，以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于结构域的残基G5、A7、S8、M11、N14、L17、E18和E21以及对应于第二结构域的残基L38、L41、L42、L45、D46、H47、H49、S50和Q51的TfR结合残基。
如本文所用，术语“肽”或“多肽”在与“变异”、“突变”或“富集突变”或“排列富集突变”联合时可指可包含以下氨基酸序列的肽或多肽，在所述氨基酸序列中，相对于另一多肽序列，一个或多个氨基酸残基被插入至所述氨基酸序列中，从所述氨基酸序列缺失，以及/或者取代至所述氨基酸序列中。在各种实施方案中，待插入、缺失或取代的氨基酸残基的数目在长度方面是至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少350、至少400、至少450或至少500个氨基酸。本公开的变体包括肽缀合物或融合分子(例如肽构建体)。
肽或多肽的“衍生物”可为可已被化学修饰的肽或多肽，例如缀合于另一化学部分诸如像聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)，磷酸化和糖基化。
术语“序列同一性％”在本文中可与术语“同一性％”互换使用，并且可指当使用序列比对程序加以比对时，在两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同一性水平，或在两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同一性水平。举例来说，如本文所用，80％同一性意指与通过确定算法来确定的80％序列同一性相同的情况，并且意指给定序列与另一序列的另一长度是至少80％同一的。在各种实施方案中，同一性％选自例如与给定序列的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大序列同一性。在各种实施方案中，同一性％在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％，或约95％至约99％的范围内。
术语“序列同源性％”或“序列同源性百分比”或“序列同一性百分比”在本文中可与术语“同源性％”、“序列同一性％”或“同一性％”互换使用，并且可指当使用序列比对程序加以比对时，在两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同源性水平或在两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同源性水平。举例来说，如本文所用，80％同源性意指与通过确定算法来确定的80％序列同源性相同的情况，因此意指给定序列的同源物历经所述给定序列的某一长度具有大于80％序列同源性。在各种实施方案中，同源性％选自例如与给定序列的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大序列同源性。在各种实施方案中，同源性％在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％，或约95％至约99％的范围内。
当样品的至少约60％至75％展现单一多肽种类时，蛋白质或多肽可为“大致上纯净的”、“大致上同质的”，或“实质上纯化的”。多肽或蛋白质可为单体或多聚体。大致上纯净的多肽或蛋白质可通常占蛋白质样品的约50％、60％、70％、80％或90％W/W，更通常是约95％，并且例如纯度将超过99％。蛋白质纯度或同质性可通过本领域中熟知的许多手段来指示，诸如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，继之以在用本领域中熟知的染色剂对胶凝染色后显现单一多肽条带。出于某些目的，通过使用高压液相色谱法(例如HPLC)或其他高分辨率分析技术(例如LC-质谱测定法)来提供更高分辨率。
如本文所用，术语“药物组合物”可通常是指适于在受试者诸如动物(例如人或小鼠)中进行药物使用的组合物。药物组合物可包含药理学有效量的活性剂以及药学上可接受的载体。术语“药理学有效量”可指剂的有效产生预定生物学或药理学结果的那个量。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”可指任何标准药物载体、媒介物、缓冲剂和赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、5％右旋糖水溶液、和乳液，诸如油/水或水/油乳液，以及各种类型的湿润剂和/或佐剂。适合药物载体和制剂描述于Remington'sPharmaceutical Sciences,第21版2005,Mack Publishing Co,Easton中。“药学上可接受的盐”可为可被配制成用于药物用途的化合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)以及氨或有机胺的盐。
如本文所用，术语“治疗”可指一种缓和或消除生物学病症和/或它的至少一种伴随症状的方法。如本文所用，对于“缓和”疾病、病症或疾患，例如意指降低所述疾病、病症或疾患的症状的严重性和/或发生频率。此外，在本文中提及“治疗”可包括提及治愈性、缓解性和防治性或诊断性治疗。
通常，本公开的细胞可为真核细胞或原核细胞。细胞可为上皮细胞。细胞可为动物细胞或植物细胞。动物细胞可包括来自海洋无脊椎动物、鱼、昆虫、两栖动物、爬行动物或哺乳动物的细胞。哺乳动物细胞可从灵长类动物、猿、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物或啮齿动物获得。哺乳动物可为灵长类动物、猿、犬、猫、兔、雪貂等。啮齿动物可为小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、仓鼠、毛丝鼠或豚鼠。鸟细胞可来自金丝雀、长尾小鹦鹉或鹦鹉。爬行动物细胞可来自龟、蜥蜴或蛇。鱼细胞可来自热带鱼。举例来说，鱼细胞可来自斑马鱼(例如斑马鱼(Danino rerio))。蠕虫细胞可来自线虫(例如秀丽隐杆线虫(C.elegans))。两栖动物细胞可来自蛙。节肢动物细胞可来自狼蛛或寄居蟹。
哺乳动物细胞还可包括从灵长类动物(例如人类或非人灵长类动物)获得的细胞。哺乳动物细胞可包括血细胞、干细胞、上皮细胞、结缔组织细胞、激素分泌性细胞、神经细胞、骨骼肌细胞，或免疫系统细胞。在优选实施方案中，本公开的方法和组合物与一种或多种哺乳动物血细胞组合使用。
如本文所用，术语“载体”通常是指能够在宿主细胞中复制以及/或者另一DNA区段可被操作性地与其连接以便导致所连接区段的复制的DNA分子。质粒是一示例性载体。
如本文所用，术语“受试者”通常是指人或另一动物。受试者可处于任何年龄，例如受试者可为婴儿、学步儿、儿童、青春期前的少年、青少年、成人或年长个体。
范围在本文中可表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。当表示此种范围时，另一实施方案包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当值通过使用先行词“约”来表示为近似值时，应了解特定值形成另一实施方案。还应了解每个范围的端点与另一端点相关，以及独立于另一端点。如本文所用的术语“约”是指从在特定使用的情形内的陈述数值加上或减去15％的范围。举例来说，约10可包括从8.5至11.5的范围。
肽
本文公开了能够结合TfR或任何已知TfR同源物，包括TfR1、TfR2、可溶性TfR，或它们的任何组合或片段(例如胞外域)，的肽序列，诸如表1中所列的那些。能够结合转铁蛋白受体或TfR同源物的肽在本文中可被称为转铁蛋白受体结合肽或TfR结合肽。在一些实施方案中，本文公开的肽可以TfR介导的方式穿透、穿过或进入靶细胞。这些细胞层或细胞可包括TfR表达性内皮细胞、上皮细胞以及各种组织或器官的TfR表达性细胞，诸如肿瘤细胞、脑细胞、癌性或肿瘤细胞、肝细胞、胰腺细胞、结肠细胞、卵巢细胞、乳腺细胞和/或肺细胞，或它们的任何组合。
在各种实施方案中，本公开提供了使得能够达成TfR介导的穿过细胞层(例如内皮细胞或上皮细胞)或细胞膜的转运的方法和组合物。除BBB之外，各种其他细胞、组织和器官也表达TfR。表达TfR的单一细胞可包括肝细胞、骨髓中的红细胞和红细胞前体、免疫细胞、干细胞和快速分裂细胞。表达TfR的组织和器官可包括脑(例如大脑皮质、海马、尾状核、小脑)、内分泌组织(例如甲状腺、甲状旁腺和肾上腺)、骨髓和免疫系统(例如阑尾、淋巴结、扁桃体、脾)、肌肉组织(例如心肌、骨骼肌和平滑肌)、肝、胆囊、胰腺、胃肠道(例如口腔粘膜、食道、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠)、肾、膀胱、雌性组织(例如输卵管、乳腺、阴道、子宫颈、子宫内膜、卵巢和胎盘)、脂肪和软组织、以及皮肤。因此，本公开的TfR结合肽可用于靶向这些细胞、组织和器官，并且通过例如TfR介导的胞吞转运(例如穿过细胞屏障诸如BBB)或TfR介导的胞吞作用(例如穿过细胞膜进入细胞中)或TfR介导的在组织中的积累来将活性剂递送至这些细胞、组织和器官以治疗和/或预防这些细胞、组织或器官中的一者或多者中的疾病或疾患。
在各种实施方案中，本公开提供了使得能够达成TfR介导的向表达TfR的癌细胞的转运和递送的方法和组合物。过度表达TfR的癌可包括卵巢癌、结肠癌、肺癌、位于骨或骨髓中的癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、骨髓细胞癌、皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤，或CMYC过度表达性癌。
可用于预防和/或治疗癌症的TfR结合肽构建体是包含TfR结合肽和具有抗肿瘤活性的活性剂诸如融合IL15/IL15Ra复合物、IFNγ和抗CD3剂的那些。此类肽构建体(例如融合肽)的实例是具有以SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332或SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361中的任一者阐述的氨基酸序列的那些。在一些实施方案中，TfR结合肽构建体融合于IL-15以募集和刺激免疫T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，TfR结合肽构建体融合于INFg以活化巨噬细胞，并且上调肿瘤细胞中的MHC。在一些实施方案中，TfR结合肽构建体融合于CD3以除结合癌细胞上的TfR之外还结合T细胞以创建免疫突触，并且活化T细胞以靶向癌症。
通常，本公开的TfR结合肽可与各种类别的活性剂组合使用。本公开的TfR结合肽可缀合于、连接于或融合于那些活性剂中的一者或多者。在各个方面，活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15剂、融合IL15/IL15Ra复合物剂、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀，或神经递质诸如神经降压素。
在一些实施方案中，如本文公开的肽可分别通过例如TfR介导的囊泡胞吞转运和TfR介导的胞吞作用来穿过细胞层或屏障(例如BBB)或细胞膜。除结合TfR，并且促进胞吞转运和/或胞吞作用之外，本公开的肽还可结合细胞诸如癌细胞上的额外靶蛋白。在一些情况下，肽是包含TfR结合肽的肽或肽构建体，所述TfR结合肽缀合于、连接于或融合于对额外靶蛋白(例如受体或酶)具有亲和力的靶向部分或活性剂(例如治疗剂或诊断剂)，诸如小分子或肽。在一些情况下，TfR结合肽连接于运载物分子，并且使得能够达成或促进TfR介导的所述运载物分子穿过BBB的胞吞转运，或TfR介导的向细胞中的胞吞作用。在一些情况下，并且在胞吞转运之后，包含TfR结合肽和运载物部分的肽构建体可靶向CNS中的特定细胞或组织，并且在到达所述细胞或组织后施加生物作用(例如结合靶蛋白)。在一些情况下，本公开的肽构建体施加由TfR结合肽、运载物分子或活性剂，或它们的组合介导的生物作用。在一些情况下，包含一种或多种活性剂(例如治疗剂)的本公开的TfR结合肽构建体可将所述一种或多种活性剂转运和/或递送至表达TfR的细胞中。在一些情况下，TfR结合肽在CNS中的组织中积累。在一些情况下，由于CNS特异性积累，所以脱靶效应降低。在一些情况下，TfR结合肽在处于CNS外部的组织(例如肝、肾、脾或皮肤)中积累。在一些情况下，表达TfR的细胞是肿瘤细胞，并且TfR结合肽构建体将抗肿瘤剂递送至这些肿瘤细胞。在一些情况下，抗肿瘤剂单独不显示或仅显示极其有限的针对肿瘤细胞的治疗功效；然而，当抗肿瘤剂与本公开的TfR结合肽组合成例如肽构建体时，这些抗肿瘤剂的治疗功效显著改善。
在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽可诱导生物相关应答。在一些实施方案中，生物相关应答可在静脉内剂量之后被诱导，并且在一些实施方案中，在单次静脉内剂量之后被诱导。在一些实施方案中，TfR结合肽可与用于治疗和/或预防疼痛、神经病变性疼痛或其他神经病症诸如神经变性病症、感染性疾病、免疫病症(例如自身免疫性疾病)的各种其他类别的治疗性化合物组合使用。本文所述的肽和肽构建体(例如肽缀合物、融合肽，或重组产生的肽构建体)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如通过TfR介导的囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如通过TfR介导的胞吞作用)的转运可在受试者(例如人)中的与慢性疼痛(例如头痛或偏头痛)、神经病变性疼痛、肥胖症、胰岛素抵抗、阿片成瘾或其他神经或精神病症相关的许多疾病、疾患或病症中具有影响。
本文所述的肽和肽构建体(例如肽缀合物、融合肽，或重组产生的肽构建体)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如通过囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如通过胞吞作用)的转运可在与神经变性相关的许多疾病、疾患或病症中具有影响。可用本文所述的TfR结合肽治疗、预防或诊断的神经变性疾病可包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、弗里德赖希共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩、运动神经元疾病、莱姆病、共济失调-毛细血管扩张、常染色体显性小脑共济失调、巴登病、皮质基底综合征、克罗伊茨费尔特–雅各布病、X染色体脆折相关震颤/共济失调综合征、库福–拉基布综合征、马查多–约瑟夫病、多发性硬化症、慢性创伤性脑病变，或额颞叶痴呆。
本文所述的肽和肽构建体(例如肽缀合物、融合肽，或重组产生的肽构建体)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如通过囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如通过胞吞作用)的转运可在许多自身免疫性疾病中具有影响以治疗性应对脑中的自身免疫性或炎症性病症。在某一情况下，自身免疫性疾病可通过使TfR结合肽缀合于、连接于或融合于可为离子通道调节剂诸如Kv1.3钾通道抑制剂的活性剂来治疗和/或预防。可使用离子通道调节剂诸如Kv1.3钾通道抑制剂治疗和/或预防的额外疾病可包括银屑病和归因于离子通道对效应T细胞的影响的其他非脑自身免疫性疾病，以及神经炎症性和神经变性疾病，例如多发性硬化症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、创伤性脑损伤，或放射疗法毒性。在一些情况下，Kv1.3钾通道抑制剂可为小分子(例如甲苯磺酸多马司他(domatinostat tosylate))，或肽(例如Vm24或ShK肽，诸如ShK-170、ShK-186或ShK-192，或它们的任何片段或衍生物)，或它们的任何组合。(参见例如Bartok等人An engineered scorpion toxin analoguewith improved Kv1.3 selectivity displays reduced conformational flexibility,Sci Rep.2015；5:18397)。
在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽可用于治疗和预防各种神经疾病，包括但不限于癫痫、精神分裂症、抑郁、焦虑、双相障碍、发育性脑病症(例如自闭症谱系)，或情绪障碍。
在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽可用于治疗和预防克罗恩氏病，或更一般来说，炎症性肠病。在一些情况下，本公开的TfR结合肽显示在肠的可表达高量TfR的腺细胞中的高摄取和保留。
在各种实施方案中，相较于在不缀合于如本文所述的TfR结合肽的情况下的施用，当与本公开的TfR结合肽组合使用时，这些药物的治疗功效可显著改善。在各种实施方案中，功效可由于药物在目标组织或细胞中的较高递送和所达到水平而改善。在各种实施方案中，功效可通过增加药物在目标组织或细胞中的相对水平，以及降低药物在其他组织或区室中的水平，由此改善治疗窗或降低毒性副作用来加以改善。
在其他实施方案中，如本文所述的肽与内源性分子竞争结合TfR。如本文所述，“竞争”或肽竞争结合靶蛋白诸如TfR涵盖但不限于空间位阻、占据靶蛋白的结合位点、非共价相互作用诸如盐桥或疏水性相互作用、交联、共价相互作用、螯合、变构调节，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，本公开的肽可结合任何已知TfR同源物，包括TfR1、TfR2、可溶性TfR，或它们的任何组合或片段(例如胞外域)。因此，如本文所用，“TfR”可指TfR家族的任何已知同源物、衍生物、片段或成员，包括TfR1、TfR2和可溶性TfR。在其他实施方案中，肽能够结合一种、一种或多种，或所有TfR同源物。在一些实施方案中，本公开的肽可结合TfR，并且促进特定生物作用，诸如囊泡胞吞转运。在一些实施方案中，本公开的肽，包括具有以SEQID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、以及SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361阐述的氨基酸序列的肽和肽构建体以及它们的任何衍生物或变体，阻止或降低内源性TfR结合物(例如转铁蛋白或任何衍生物诸如去铁转铁蛋白或全铁转铁蛋白)结合TfR。在一些实施方案中，本公开的肽或肽构建体包括与以SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、以及SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361阐述的氨基酸序列具有至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性，或至少99％同源性或至少100％同源性的衍生物和变体。
在一些实施方案中，相较于内源性分子(例如转铁蛋白、全铁转铁蛋白(铁结合的转铁蛋白)、去铁转铁蛋白(未结合于铁的转铁蛋白)或任何其他内源性TfR配体)或其他外源性分子，肽以相等、类似，或更大亲和力(例如更低的解离常数KD)结合TfR。在一些实施方案中，肽可具有小于50μM、小于5μM、小于500nM、小于100nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM，或小于0.1nM的KD。在一些实施方案中，由于相较于内源性分子具有更低亲和力(例如更高解离常数KD)，通过TfR进行的肽转运得到改善。在一些实施方案中，由于相比于内源性分子具有更快的解离速率或更高的k解离，通过TfR进行的肽转运得到改善。在一些实施方案中，解离速率或k解离类似于转铁蛋白的解离速率或k解离。在一些实施方案中，由于具有更快的缔合速率或更高的k缔合，任选地，诸如高于转铁蛋白的k缔合，肽转运得到改善。在其他实施方案中，在转铁蛋白(Tf)-TfR结合界面处的一个或多个保守残基也存在于本文所述的肽的氨基酸序列中。
在一些实施方案中，展现改善的TfR受体结合的肽显示改善的胞吞转运功能。在一些实施方案中，展现改善的TfR受体结合的肽不显示或显示小幅胞吞转运功能变化。在一些实施方案中，展现改善的TfR受体结合的肽显示降低的胞吞转运功能。在一些实施方案中，肽结合于在人TfR与鼠TfR之间具有高同源性的位点处，包括对应于人TfR(SEQ ID NO:363)的残基506-510、523-531、以及611-662的氨基酸结构域中的一者或多者或全部。在一些实施方案中，TfR的由本文公开的肽或其变体结合的区域全部或部分属于此类TfR结构域。在一些实施方案中，本文公开的肽结合包括对应于人TfR(SEQ ID NO:363)的残基506-510、523-531、以及611-662的氨基酸结构域的TfR高同源性区域中的任一者、任何两者或全部三者。在一些实施方案中，本文公开的肽至少结合对应于人TfR的残基611-662的结构域。
在一些实施方案中，TfR结合肽的KA和KD值可被调节和优化(例如通过氨基酸取代)以提供TfR结合亲和力和高效胞吞转运功能的最优比率。
在一些实施方案中，本文公开的肽或其变体在见于TfR与其他外源性或内源性配体(例如转铁蛋白(Tf)、Tf衍生物，或Tf样肽或蛋白质)的结合界面(例如结合结构域或结合口袋)中的残基处结合TfR。在一些实施方案中，结合TfR的本文公开的肽或其变体包含与结合TfR的组成结合口袋的残基的序列的至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性，或至少99％同源性或至少100％同源性。在一些实施方案中，结合TfR的本文公开的肽或其变体包含与已知结合TfR的内源性或外源性多肽，例如内源性转铁蛋白或表1中所列的任一肽，的至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性，或至少99％同源性或至少100％同源性。在其他实施方案中，本文所述的肽结合目标蛋白质，所述目标蛋白质包含与TfR、其片段、同源物或变体的至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性，或至少99％同源性或至少100％同源性。
在一些实施方案中，本文公开的肽或其变体结合TfR的包含对应于残基506-510、523-531、以及611-662(这些氨基酸残基的编号基于以下内源性人TFRC UniProtKB-P02786Uniprot参考蛋白质序列(SEQ ID NO:363，TFR1_人))的氨基酸残基的区域。在一些实施方案中，TfR的由本文公开的肽或其变体结合的区域与Tf、其片段、同源物或变体结合的区域重叠。
在其他实施方案中，核酸、载体、质粒或供体DNA包含编码如本公开中所述的肽、肽构建体，或它们的变体或功能性片段的序列。在其他实施方案中，TfR结合基序(例如保守结合基序)的某些部分或片段可被移植至具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者的序列的肽或肽构建体上。
在一些实施方案中，肽抑制TfR与Tf之间，或TfR与任何其他蛋白质之间的结合。在一些实施方案中，肽阻止TfR进行蛋白质-蛋白质相互作用，并且/或者阻止TfR定位至细胞的核。在一些情况下，肽使TfR失活。在一些实施方案中，肽可导致TfR被降解，或阻止TfR定位至细胞的核，或阻止TfR与Tf或Tf样蛋白质相互作用。
在一些实施方案中，通过结合TfR中的某一氨基酸残基或氨基酸残基基序，相较于内源性Tf或任何其他内源性或外源性TfR结合物，肽竞争性结合TfR。此外，可基于肽结合某一氨基酸残基或氨基酸残基基序的能力来选择所述肽进行进一步测试或使用。TfR中的某一氨基酸残基或氨基酸残基基序可从涉及于TfR与Tf的结合中的氨基酸残基或氨基酸残基序列鉴定。某一氨基酸残基或氨基酸残基基序可从TfR:Tf复合物的晶体结构鉴定。在一些实施方案中，肽(例如CDP)显示对热、蛋白酶(胃蛋白酶)和还原的抗性。
包含以SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、以及SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361阐述的氨基酸序列中的一者或多者的肽和肽构建体(例如肽缀合物或融合肽)可结合目标蛋白质。在一些实施方案中，目标蛋白质是TfR。在一些实施方案中，结合TfR的肽和肽构建体(例如肽缀合物或融合肽)包含以SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ IDNO:332、以及SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361阐述的氨基酸序列中的至少一者。在一些实施方案中，结合TfR的本公开的肽、肽构建体(例如肽缀合物和融合分子)包括与以SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、以及SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361阐述的氨基酸序列具有至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性，或至少99％同源性或至少100％同源性的肽衍生物或变体。
在一些实施方案中，肽或肽文库以计算机方式设计，而不由打结肽的天然存在的支架衍生。在其他实施方案中，肽或肽文库通过衍生，移植已知会结合目标蛋白质或受体的天然存在的肽或蛋白质的蛋白质结合界面中的相关蛋白质结合残基或保守残基来以计算机方式设计。在一些实施方案中，肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167，或SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202)是简单螺旋-转角-螺旋。在一些实施方案中，螺旋-转角-螺旋可用于药效团转移至其他支架上，例如使用融合标签化将所需TfR啮合表面嫁接至螺旋-转角-螺旋支架上。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1的肽作为支架或基础序列用于进一步修饰，包括添加、缺失或氨基酸取代。在一些实施方案中，短氨基酸残基序列诸如GS被添加在肽的N端。在一些实施方案中，肽在N端缺乏GS。在一些情况下，肽经受一种或多种翻译后修饰。
表1列出根据本公开的方法和组合物的示例性肽序列。
表1–示例性肽序列
Figure BDA0003175003630000811
Figure BDA0003175003630000821
Figure BDA0003175003630000831
Figure BDA0003175003630000841
Figure BDA0003175003630000851
Figure BDA0003175003630000861
Figure BDA0003175003630000871
在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCAX1RCX2KYX4DEX2X3KCX3ARMMSMSNTEEDCEQEX2EDX2X2YCX2X3X5CX5X1X4(SEQ ID NO:206)或REGCAX1RCX2KYX4DEX2X3KCX3ARMMSMSNTEEDCEQEX2EDX2X2YCX2X3X5CX5X1X4(SEQ ID NO:334)，其中X1可独立地选自S、T、D或N，X2可独立地选自A、M、I、L或V，X3可独立地选自D、E、N、Q、S或T，X4可独立地选自D、E、H、K、R、N、Q、S或T，并且X5可独立地选自H、K、R、N、Q、S或T。
在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREX1CX2X3RCX4KYX5DEX6X7KCX8ARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCLDHC HSQ(SEQ ID NO:207)或REX1CX2X3RCX4KYX5DEX6X7KCX8ARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:335)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7和X8是TfR结合界面残基，并且可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCMKYNDELEKCEARMMSMSNTEEDCEQEX1EDX2X3YCX4X5X6CX7X8X9(SEQ ID NO:208)或REGCASRCMKYNDELEKCEARMMSMSNTEEDCEQEX1EDX2X3YCX4X5X6CX7X8X9(SEQ ID NO:336)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9是TfR结合界面残基，并且可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREX1CX2X3RCX4KYX5DEX6X7KCX8ARMMSMSNTEEDCEQEX9EDX1 0X11YCX12X13X13CX15X16X17(SEQ ID NO:209)或REX1CX2X3RCX4KYX5DEX6X7KCX8ARMMSMSNTEEDCEQEX9EDX10X11YCX12X13X13CX15X16X17(SEQ ID NO:337)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16和X17是TfR结合界面残基，并且可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCMKYNDELEKCEARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:32)。
在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X1X2X3X4GX5ASX6X7MX8X9NX10X11LEX1 2X13EX14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42X43(SEQ ID NO 210)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X30、X31、X32、X33、X34、X35、X36、X37、X38、X39、X40、X41、X42和X43可独立地是任何氨基酸。
在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X1 5X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36X37LX38X39LLX40X41LDHX42HSQ(SEQID NO:211)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X30、X31、X32、X33、X34、X35、X36、X37、X38、X39、X40、X41和X42可独立地是任何氨基酸。
在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X1X2X3X4GX5ASX6X7MX8X9NX10X11LEX1 2X13EX14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29LX30X31LLX32X33LDHX34HSQ(SEQ ID NO:212)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X30、X31、X32、X33和X34可独立地是任何氨基酸。
在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽或肽构建体包含与SEQ ID NO:1–SEQID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者或其任何变体、同源物，或功能性片段的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同源性。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽或肽构建体包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ IDNO:361中的任一者或其任何变体、同源物，或功能性片段。在一些实施方案中，结合TfR的肽包含以SEQ ID NO:32阐述的氨基酸序列。
在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，TfR结合肽在相应位置5、7、8、14、17、18、21、38、42、45、46、47、50、51中的任一者或它们的组合处包含作为表面界面残基的典型氨基酸残基。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，TfR结合肽在相应位置G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50、Q51中的任一者或它们的组合处包含作为表面界面残基的典型氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽或肽构建体在SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQID NO:356–SEQ ID NO:361中包含这些相应残基中的至少一者或多者。因此，此类肽可被工程改造来具有增强的与TfR的结合。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X1X2X3X4GX5ASX6X7X8X9X10NX11X12LEX13X14EX15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30LX31X32X33LX3 4X35LDHX36X37SQ(SEQ ID NO:213)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X30、X31、X32、X33、X34、X35、X36和X37可独立地是任何氨基酸。
在一些实施方案中，存在于肽的氨基酸序列中的表面远端亲水性氨基酸残基(例如D、E、H、K、R、N、Q、S或T)促进肽溶解性。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，如本文公开的肽在相应位置3、4、9、11、15、16、19、23、26、28、29、30、31、32、33、35、36、37、39、40中的任一者或它们的任何组合处包含亲水性氨基酸残基。在一些情况下，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在以下相应位置处包含亲水性氨基酸残基：R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39、D40，或它们的任何组合。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，相应位置R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39、D40中的任一者或任何组合可被突变成另一亲水性残基，而不显著影响溶解性或TfR结合。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X1X2REX3X4X5X6RX7X8KX9X10DEX11X12KX13X14X15RX16X17SX18SNTEEDX19EQEX20EDX21X22X23X24X25X2 6X27X28X29X30X31
(SEQ ID NO:214)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X30和X31可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSX1X2GCASX3CMX4YNX5X6LEX7CEAX8MMX9MX10X11X12X1 3X14X15CX16X17X18LX19X20LLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:215)或X1X2GCASX3CMX4YNX5X6LEX7CEAX8MMX9MX10X11X12X13X14X15CX16X17X18LX19X20LLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:338)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19和X20可独立地选自D、E、H、K、R、N、Q、S或T。
在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置15、35、39、49或它们的任何组合处包含亲水性残基(例如D、E、H、K、R、N、Q、S或T)。在一些情况下，以SEQID NO:32为参考，本公开的肽在以下相应位置处包含亲水性氨基酸残基：D15、E35、E39、H49或它们的任何组合。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，相应位置D15、E35、E39、H49中的任一者或任何组合可被突变成另一亲水性残基，而不显著影响溶解性或TfR结合。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14DX15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33EX34X35X36EX37X38X39X40X41X42X43X44X45HX46X47(SEQ ID NO:216)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X30、X31、X32、X33、X34、X35、X36、X37、X38、X39、X40、X41、X42、X43、X44、X45、X46和X47可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCMKYNX1ELEKCEARMMSMSNTEEDCX2QELX3DLLYCLDHCX4SQ(SEQ ID NO:217)或REGCASRCMKYNX1ELEKCEARMMSMSNTEEDCX2QELX3DLLYCLDHCX4SQ(SEQ ID NO:339)，其中X1、X2、X3和X4可独立地选自D、E、H、K、R、N、Q、S或T。
在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置15、35、39、49或它们的任何组合处包含疏水性残基(例如A、M、I、L、V、F、W或Y)。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCMKYNX1ELEKCEARMMSMSNTEEDCX2QELX3DLLYCLDHCX4SQ(SEQID NO:218)或REGCASRCMKYNX1ELEKCEARMMSMSNTEEDCX2QELX3DLLYCLDHCX4SQ(SEQ ID NO:340)，其中X1、X2、X3和X4可独立地选自A、M、I、L、V、F、W或Y。在一些实施方案中，以SEQ IDNO:32为参考，在相应位置15、35、39和49中的任一者处的亲水性氨基酸残基与对TfR的较高结合亲和力(例如靶标啮合)和较高溶解性相关联。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，在相应位置15、35、39和49中的任一者处的氨基酸残基从疏水性残基突变成亲水性残基可导致对TfR的较高结合亲和力(例如靶标啮合)和较高溶解性。
在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置11、25、27或它们的任何组合处包含疏水性残基(例如A、M、I、L、V、F、W或Y)。在一些实施方案中，以SEQID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置11、25、27或它们的任何组合处包含亲水性残基(例如D、E、H、K、R、N、Q、S或T)。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，在相应位置11、25和27中的任一者处的疏水性氨基酸残基与对TfR的较高结合亲和力(例如靶标啮合)和较高溶解性相关联。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，在相应位置11、25和27中的任一者处的氨基酸残基从亲水性残基突变成疏水性残基可导致对TfR的较高结合亲和力(例如靶标啮合)和较高溶解性。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置M11、M25、M27或它们的任何组合处包含疏水性氨基酸残基。在一些情况下，以SEQID NO:32为参考，肽在相应位置M11、M25和M27处包含疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，相应位置M11、M25和M27的任何组合可被突变成另一疏水性残基，而不显著影响溶解性或TfR结合。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10MX11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23MX24MX25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X3 6X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48(SEQ ID NO:219)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X30、X31、X32、X33、X34、X35、X36、X37、X38、X39、X40、X41、X42、X43、X44、X45、X46、X47和X48可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCX1KYNDELEKCEARMX2SX3SNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:220)或REGCASRCX1KYNDELEKCEARMX2SX3SNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:341)，其中X1、X2和X3可独立地选自A、M、I、L、V、F、W或Y。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCX1KYNDELEKCEARMX2SX3SNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:221)或REGCASRCX1KYNDELEKCEARMX2SX3SNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ IDNO:342)，其中X1、X2和X3可独立地选自D、E、H、K、R、N、Q、S或T。
在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置45处包含脂族氨基酸残基(例如A、M、I、L或V)。在一些实施方案中，本公开的肽在相应位置45处包含芳族氨基酸残基(例如F、W或Y)。在一些实施方案中，在相应位置45处的脂族氨基酸残基与对TfR的较高结合亲和力相关联。在一些情况下，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于L45的脂族氨基酸残基。在一些实施方案中，在相应位置45处的氨基酸残基从芳族残基突变成脂族残基可导致对TfR的较高结合亲和力(例如靶标啮合)和较高溶解性。在一些实施方案中，使相应位置L45突变成另一脂族残基可不显著影响溶解性或TfR结合。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2 5X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42X43X44LX45X46X47X48X49X50(SEQ ID NO:222)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X30、X31、X32、X33、X34、X35、X36、X37、X38、X39、X40、X41、X42、X43、X44、X45、X46、X47、X48、X49和X50可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCMKYNDELEKCEARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCX1DHCHSQ(SEQ ID NO:223)或REGCASRCMKYNDELEKCEARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCX1DHCHSQ(SEQ ID NO:343)，其中X1可独立地选自A、M、I、L或V。
在一些实施方案中，本公开的肽包含
GSREGCASRCMX1YNDELEX2CEARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:224)或REGCASRCMX1YNDELEX2CEARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:344)，其中X1和X2可独立地选自K或R。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，在相应位置12和19处的这些残基可用于化学缀合于另一分子(例如活性剂或可检测剂)。在一些实施方案中，X1和X2均是R，并且化学缀合发生在肽的N端。
在一些实施方案中，本公开的肽的氨基酸残基中的任何一者或多者的突变可改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的5-80％的氨基酸残基的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的1-100％、5-100％，或5-50％的氨基酸残基的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的15-50％的氨基酸残基的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的15-30％的氨基酸残基的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的25-30％的氨基酸残基的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。举例来说，具有SEQ ID NO:32的序列的肽的51个氨基酸残基中的14个(27.5％)的突变可改善所述肽与TfR的结合亲和力。
在一些实施方案中，本公开的肽的氨基酸残基中的任何一者或多者的突变可处于TfR的结合界面处。在一些实施方案中，对肽的突变可改善结合亲和力，此可有益于本文公开的肽或肽构建体的结合和胞吞转运。在一些实施方案中，本文提供的肽可具有许多突变或少许突变以获得最优活性，其中最优活性是足以啮合TfR的结合，但未必是如此强烈以致阻碍在胞吞转运之后肽和/或肽构建体的释放的结合。因此，本公开的肽可包含调谐结合亲和力和解离速率以获得肽或肽构建体的最优结合、功能(例如胞吞转运、BBB穿透、细胞膜穿透、穿过生物屏障的转运)和释放的许多突变(也被称为突变氨基酸残基％)。因此，导致最高可能亲和力的突变可能未必与具有最优结合和胞吞转运的优越肽相关联。
在一些实施方案中，本公开的肽的1-100％或5-100％的氨基酸残基处于TfR的结合界面处。在一些实施方案中，本公开的肽的10-90％的氨基酸残基处于TfR的结合界面处。在一些实施方案中，本公开的肽的20-80％的氨基酸残基处于TfR的结合界面处。在一些实施方案中，本公开的肽的30-70％的氨基酸残基处于TfR的结合界面处。在一些实施方案中，本公开的肽的40-60％的氨基酸残基处于TfR的结合界面处。在一些实施方案中，本公开的肽的30-35％的氨基酸残基处于TfR的结合界面处。举例来说，具有SEQ ID NO:32的序列的肽的51个氨基酸残基中的17个(33％)可处于TfR的结合界面处。
在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的任何一者或多者的突变可改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的1-100％或5-100％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的5-80％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的10-70％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的15-60％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的20-50％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的25-30％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。举例来说，具有SEQ ID NO:32的序列的肽的处于TfR的结合界面处的17个氨基酸残基中的5个(29％)的突变可改善所述肽与TfR的结合亲和力。
在一些实施方案中，本公开的肽的氨基酸残基中的任何一者或多者的突变在TfR的结合界面的远端。在一些实施方案中，本公开的肽的1-100％或5-100％的氨基酸残基在TfR的结合界面的远端。在一些实施方案中，本公开的肽的10-90％的氨基酸残基在TfR的结合界面的远端。在一些实施方案中，本公开的肽的20-80％的氨基酸残基在TfR的结合界面的远端。在一些实施方案中，本公开的肽的30-70％的氨基酸残基在TfR的结合界面的远端。在一些实施方案中，本公开的肽的40-60％的氨基酸残基在TfR的结合界面的远端。在一些实施方案中，本公开的肽的65-70％的氨基酸残基在TfR的结合界面的远端。举例来说，具有SEQ ID NO:32的序列的肽的51个氨基酸残基中的34个(66％)可处于TfR的结合界面处。
在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的任何一者或多者的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的1-100％或5-100％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的5-80％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的10-70％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的15-60％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的20-50％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的25-30％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。举例来说，在TfR的结合界面的远端的17个氨基酸残基中的5个的突变可改善所述肽与TfR的结合亲和力。举例来说，具有SEQ ID NO:32的序列的肽的在TfR的结合界面的远端的34个氨基酸残基中的9个(26.5％)的突变可改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，并且在不束缚于任何理论下，肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基的一个或多个突变可改善蛋白质折叠，增强蛋白质溶解性，并且/或者改变主链几何结构，所述主链几何结构可通过优化的界面形状互补性来改善结合。
在一些实施方案中，本公开的肽可包含在位置11、12、13、14、19、20、21、22、36、38、39、41中的一者或多者处具有半胱氨酸残基的序列。在一些实施方案中，肽在位置11、12、19、20、36、39或它们的任何组合处包含Cys。举例来说，在某些实施方案中，肽可包含在位置11处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在位置12处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在位置13处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在位置14处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在位置19处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在位置20处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在位置21处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在位置22处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在位置36处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在位置38处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在位置39处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在位置41处具有半胱氨酸残基的序列。在一些实施方案中，序列中的第一半胱氨酸残基可与序列中的第4半胱氨酸残基进行二硫键键合，序列中的第2半胱氨酸残基可与序列中的第5半胱氨酸残基进行二硫键键合，并且序列中的第3半胱氨酸残基可与序列中的第6半胱氨酸残基进行二硫键键合。任选地，肽可包含一个穿过由两个其他二硫键形成的环的二硫键，也被称为“二-并-穿(two-and-through)”结构系统。在一些实施方案中，本文公开的肽具有的一个或多个半胱氨酸可被突变成丝氨酸。
在一些实施方案中，本公开的肽包含至少一个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含至少两个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含至少三个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含至少四个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含至少五个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含至少六个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含至少十个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含六个半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，本公开的肽包含在一个或多个位置处具有半胱氨酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基位于氨基酸位置6、10、20、34、44、48中的任一者或它们的任何组合处。在本公开的一些方面，一个或多个半胱氨酸(C)残基以各种配对样式(例如C10-C20)参与二硫键。在一些实施方案中，配对样式是C6-C48、C10-C44、以及C20-C34。在一些实施方案中，如本文所述的肽包含至少一个、至少两个，或至少三个二硫键。在一些实施方案中，至少一个、至少两个，或至少三个二硫键根据C6-C48、C10-C44和C20-C34配对样式或它们的组合加以排列。在一些实施方案中，如本文所述的肽包含具有配对样式C6-C48、C10-C44、以及C20-C34的三个二硫键。
在某些实施方案中，肽包含在位置6处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽包含在位置10处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽包含在位置20处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽包含在位置34处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽包含在位置44处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽包含在位置50处具有半胱氨酸残基的序列。在一些实施方案中，序列中的第一半胱氨酸残基与序列中的末个半胱氨酸残基进行二硫键键合。在一些实施方案中，序列中的第二半胱氨酸残基与序列中的第二至末个半胱氨酸残基进行二硫键键合。在一些实施方案中，序列中的第三半胱氨酸残基与序列中的第三至末个半胱氨酸残基进行二硫键键合，以此类推。
在一些实施方案中，序列中的第一半胱氨酸残基与序列中的第6半胱氨酸残基进行二硫键键合，序列中的第2半胱氨酸残基与序列中的第5半胱氨酸残基进行二硫键键合，并且序列中的第3半胱氨酸残基与序列中的第4半胱氨酸残基进行二硫键键合。任选地，肽可包含一个穿过由两个其他二硫键形成的环的二硫键，也被称为“二-并-穿(two-and-through)”结构系统。在一些实施方案中，本文公开的肽具有的一个或多个半胱氨酸被突变成丝氨酸。
在一些实施方案中，肽不包含半胱氨酸或二硫键。在一些实施方案中，肽包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个，或15个或更多个半胱氨酸或二硫键。在其他实施方案中，1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个半胱氨酸残基已用丝氨酸残基替换。在一些实施方案中，1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个半胱氨酸残基已用苏氨酸残基替换。
在一些实施方案中，肽不包含Cys或二硫键。在一些实施方案中，肽包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个，或15个或更多个Cys或二硫键。在其他实施方案中，1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个Cys残基已用Ser残基替换。在一些实施方案中，1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个Cys残基已用Thr残基替换。
在一些情况下，肽中的甲硫氨酸残基中的一者或多者或全部由亮氨酸或异亮氨酸替换。在一些情况下，肽中的色氨酸残基中的一者或多者或全部由苯丙氨酸或酪氨酸替换。在一些情况下，肽中的天冬酰胺残基中的一者或多者或全部由谷氨酰胺替换。在一些实施方案中，肽的N端诸如由乙酰基阻断。替代地或组合地，在一些情况下，肽的C端诸如由酰胺基团阻断。在一些实施方案中，肽通过在游离胺上的甲基化加以修饰。
举例来说，完全甲基化可通过使用以甲醛和氰基硼氢化钠进行的还原性甲基化来实现。
在一些实施方案中，如本文所述的肽或肽构建体靶向和/或穿透TfR表达性细胞层或屏障和/或TfR表达性细胞的膜。在一些实施方案中，肽靶向和/或穿透细胞的细胞膜，其中所述细胞位于CNS诸如脑中。举例来说，包含TfR结合肽和一种或多种活性剂(例如治疗性或诊断性化合物)的肽构建体通过囊泡胞吞转运来穿过细胞屏障(例如BBB)，并且随后靶向和/或穿透位于CNS内的细胞的细胞膜以将所述一种或多种活性剂递送至那个细胞。
在各种实施方案中，包含如本文所述的TfR结合肽和一种或多种活性剂(例如治疗性或诊断性化合物)的肽构建体靶向和/或穿透位于胃肠道、脾、肝、肾、肌肉、骨髓、脑或皮肤中的TfR表达性细胞的细胞膜。在一些情况下，TfR表达性细胞是肿瘤细胞、免疫细胞、红细胞、红细胞前体细胞、干细胞、骨髓细胞或干细胞。在一些情况下，TfR结合肽负责靶向细胞，例如在其中细胞过度表达TfR的情况下。在各种实施方案中，包含缀合于、连接于或融合于一个或多个运载物分子(例如活性剂和/或可检测剂)的TfR结合肽的如本文所述的肽构建体靶向和/或穿透位于各种器官内的细胞的细胞膜，所述器官诸如是脾、脑、肝、肾、肌肉、骨髓、胃肠道或皮肤。
在一些情况下，运载物分子促进对特定细胞、细胞群体或组织的靶向。在一些情况下，TfR介导的细胞靶向和运载物分子的组合促进细胞靶向。在一些方面，本公开的肽或肽构建体(例如肽缀合物或融合肽)用于靶向所述细胞、细胞群体或组织以施加某一生物(例如治疗)作用。在一些方面，本公开的肽或肽构建体(例如肽缀合物或融合肽)用于将运载物分子递送至所述细胞中以施加某一生物作用。
在一些实施方案中，肽可包含至少一个或多个标签肽序列以达成改善的细胞穿透。举例来说，肽可包含至少一个或多个Arg残基或来自Tat蛋白的残基以达成改善的细胞穿透性质。额外标签肽序列可包括CysTat(CYRKKRRQRRR；SEQ ID NO:71)、S19-TAT(PFVIGAGVLGALGTGIGGIGRKKRRQRRR；SEQ ID NO:72)、R8(RRRRRRRR；SEQ ID NO:73)、pAntp(RQIKIWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO:74)、Pas-TAT(FFLIPKGGRKKRRQRRR；SEQ ID NO:75)、Pas-R8(FFLIPKGRRRRRRRR；SEQ ID NO:76)、PasFHV(FFLIPKGRRRRNRTRRNRRRVR；SEQ ID NO:77)、Pas-pAntP(FFLIPKGRQIKIWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO:78)、F2R4(FFRRRR；SEQ ID NO:79)、B55(KAVLGATKIDLPVDINDPYDLGLLLRHLRHHSNLLANIGDPAVREQVLSAMQEEE；SEQ ID NO:80)、天青蛋白(auzurin)(LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD；SEQ ID NO:81)、IMT-P8(RRWRRWNRFNRRRCR；SEQ ID NO:82)、BR2(RAGLQFPVGRLLRRLLR；SEQ ID NO:83)、OMOTAG1(KRAHHNALERKRR；SEQ ID NO:84)、OMOTAG2(RRMKANARERNRM；SEQ ID NO:85)、pVEC(LLIILRRRIRKQAHAHSK；SEQ ID NO:86)、SynB3(RRLSYSRRRF；SEQ ID NO:87)、DPV1047(VKRGLKLRHVRPRVTRMDV；SEQ ID NO:88)、CY105Y(CSIPPEVKFNKPFVYLI；SEQ ID NO:89)、转运肽(GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL；SEQ ID NO:90)、MTS(KGEGAAVLLPVLLAAPG；SEQ IDNO:91)、hLF(KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR；SEQ ID NO:92)、PFVYLI(PFVYLI；SEQ ID NO:93)、yBBR(VLDSLEFIASKL、SEQ ID NO:94)、DRI-TAT31(rrrqrrkkrgy，其中小写符号指示D-氨基酸；SEQ ID NO:95)、环状七肽环(cFΦR4)(FΦRRRRQ，其中Φ是l-2-萘基丙氨酸，整个部分是环化的，并且Gln充当缀合柄并可被取代成其他官能团诸如Lys(用于胺偶联)或Cys(用于氢硫基偶联)；SEQ ID NO:96)、DPV3(RKKRRRESRKKRRRES；SEQ ID NO:403)、C10H(RKGFYKRKQCKPSRGRKR；SEQID NO:404)、VP22(NAATATRGRSAASRPTQRPRAPARSASRPRRPVQ；SEQID NO:405)、TP10(AGYLLGKINLKALAALAKKIL；SEQ ID NO:406)、MAP(KLALKLALKALKAALKLA；SEQ ID NO:407)、BPrPp(MVKSKIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRP；SEQID NO:408)、ARF(MVRRFLVTLRIRRACGPPRVRV；SEQ ID NO:409)、GALA(WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA；SEQ ID NO:410)、SAP(VRLPPPVRLPPPVRLPPP；SEQ ID NO:411)、MPG(GLAFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV；SEQ ID NO:412)、Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV；SEQID NO:413)、[WR]4(WRWRWRWR；SEQ ID NO:414)、Ig(v)(MGLGLHLLVLAAALQGAKKKRKV；SEQ IDNO:415)、K-FGF(AAVALLPAVLLAHLLAP；SEQ ID NO:416)、蜂毒素(Melittin)(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ；SEQ ID NO:417)、gH625(HGLASTLTRWAHYNALIRAF；SEQ IDNO:418)、HIV-1TAT蛋白(48–60)(GRKKRRQRRRPPQ；SEQ ID NO:419)、MPG HIV-gp41/SV40T-抗原(GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV；SEQ ID NO:420)、R6W3(RRWWRRWRR；SEQ ID NO:421)、NLS(CGYGPKKKRKVGG；SEQ ID NO:422)、8赖氨酸(KKKKKKKK；SEQ ID NO:423)、HRSV(RRIPNRRPRR；SEQ ID NO:424)、AIP6(RLRWR；SEQ ID NO:425)、Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKRKV；SEQ ID NO:426)、MAP17(QLALQLALQALQAALQLA；SEQ ID NO:427)、VT5(DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD；SEQ ID NO:428)、Bac7(RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPG；SEQ ID NO:429)、(PPR)n((PPRPPRPPR；SEQ ID NO:430)、(PPRPPRPPRPPR；SEQ ID NO:431)、(PPRPPRPPRPPRPPR；SEQ ID NO:432)、(PPRPPRPPRPPRPPRPPR；SEQ ID NO:433))、INF7(GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC；SEQ ID NO:434)、CADY(GLWRALWRLLRSLWRLLWRA；SEQ ID NO:435)、Pep-7(SDLWEMMMVSLACQY；SEQ ID NO:436)、TGN(TGNYKALHPHNG；SEQ ID NO:437)、Ku-70(VPMLK；SEQ ID NO:438)、CPP(RRRRRGGRRRRRG；SEQ ID NO:452)(RRRRRRGGRRRRRG；SEQID NO:439)、SVS-1(KVKVKVKVDPPTKVKVKVK；SEQ ID NO:440)、L-CPP(LAGRRRRRRRRRK；SEQID NO:441)、RLW(RLWMRWYSPRTRAYG；SEQ ID NO:442)、K16ApoE(KKKKKKKKKKKKKKKKLRVRLASHLRKLRKRLLRDA；SEQ ID NO:443)、Angiopep-2(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY；SEQ ID NO:444)、ACPP(EEEEEEEEPLGLAGRRRRRRRRN；SEQ ID NO:445)、KAFAK(KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA；SEQID NO:446)、hCT(9-32)(LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP；SEQ ID NO:447)、VP22(形式2)(DAATATRGRSAASRPTQRPRAPARSASRPRRPVE；SEQ ID NO:448)、MPG(GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV；SEQ ID NO:449)、hPP3(KPKRKRRKKKGHGWSR；SEQ ID NO:450)、PepNeg(SGTQEEY；SEQ ID NO:451)、CM18-TAT(KWKLFKKIGAVLKVLTTG；SEQ ID NO:453)、PTD4(YARAAARQARA；SEQ ID NO:454)，或WaTx(MKYFTLALTLLFLLLINPCKDMNFAWAESSEKVERASPQQAKYCYEQCNVNKVPFDQCYQMCSPLERS；SEQ ID NO:455)。举例来说，在一些实施方案中，肽可包含精氨酸补丁(Arg补丁)，例如RRRRRRRR(SEQ ID NO:73)，或其变体或片段，序列可附加于肽的N端或C端。在一些实施方案中，Arg补丁包含两个或更多个Arg残基，或Argn，其中n是整数，并且可为2、3、4、5、6、7、8、9或10(SEQ ID NO:98)。在其他实施方案中，肽可包含Tat肽(Tat蛋白综述于Gump等人TAT transduction:the molec ular mechanism andtherapeutic prospects.Trends Mol Med.2007年10月；13(10):443-8以及Harada等人Antitumor protein therapy；appli cation of the protein transduction domain tothe development of a protein drug for cancer treatment.Breast Cancer.2006；13(1):16-26)。Tat肽可具有例如YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:99)、GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:100)，或它们的任何修饰形式、变体或片段的序列，可附加于本公开的任何TfR结合肽的N端或C端。在一些实施方案中，Tat肽序列可为GRKKRRQRRRPQ(SEQ ID NO:101)、GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:100)，或它们的片段或变体。在一些实施方案中，Tat肽可附加于本公开的任何TfR结合肽的N端，在N端GS二肽之后，并且在例如GGGS(SEQ ID NO:103)间隔体之前。在一些实施方案中，细胞穿透标签肽，诸如SEQ ID NO:71–SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98–SEQ IDNO:101、SEQ ID NO:116–SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126，或SEQ ID NO:403–SEQ ID NO:455中的任一者，可使用肽接头来附加于本文公开的任何肽的N端或C端，所述肽接头诸如是GxSy(SEQ ID NO:104)肽接头，其中x和y可为任何整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在其他实施方案中，细胞穿透肽，诸如Tat肽或Arg补丁，或任何其他部分，可使用肽接头来附加于本文公开的任何肽的N端或C端，所述肽接头诸如是GxSy(SEQ ID NO:104)肽接头，其中x和y可为任何整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在一些实施方案中，肽接头包括(GS)x(SEQID NO:105)，其中x可为任何整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在一些实施方案中，肽接头包括GGSSG(SEQ ID NO:106)、GGGGG(SEQ ID NO:107)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:108)、GSGG(SEQ ID NO:109)、GGGGS(SEQ ID NO:110)、GGGS(SEQ ID NO:103)、GGS(SEQ ID NO:112)、GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:113)，或它们的变体或片段。另外，来自DkTx的KKYKPYVPVTTN(SEQ ID NO:114)和来自人IgG3的EPKSSDKTHT(SEQ ID NO:115)可用作肽接头。在其他实施方案中，标签肽可在任何氨基酸残基处附加于肽。在其他实施方案中，标签肽可在任何氨基酸残基处附加于肽，而不干扰TfR结合活性。在一些实施方案中，标签肽通过缀合、连接或融合技术来附加。在其他实施方案中，Tat肽可在任何氨基酸残基处附加于肽。在其他实施方案中，Tat肽可在任何氨基酸残基处附加于肽，而不干扰TfR结合活性。在一些实施方案中，Tat肽通过缀合、连接或融合技术来附加于TfR结合肽以获得TfR结合细胞穿透肽融合物(CPP融合物)。
细胞穿透肽包括但不限于具有正净电荷的短两亲性或阳离子性短肽，并且能够穿透细胞膜并将共价或非共价连接于肽的分子或运载物转移至细胞中。此类细胞穿透肽可被合成，或源于已知蛋白质，诸如穿透蛋白(penetratin)、Tat肽、pVEC，或嵌合肽，诸如转运肽、MPG、Pep-1，或合成肽，诸如多精氨酸、MAP和R6W3。
在一些实施方案中，肽可包含至少一个或多个细胞穿透肽序列以达成改善的细胞穿透。举例来说，细胞穿透肽可包括maurocaline(GDCLPHLKLCKENKDCCSKKCKRRGTNIEKRCR；SEQ ID NO:116)、imperatoxin(GDCLPHLKRCKADNDCCGKKCKRRGTNAEKRCR；SEQ ID NO:117)、hadrucalcin(SEKDCIKHLQRCRENKDCCSKKCSRRGTNPEKRCR；SEQ ID NO:118)、hemicalcin(GDCLPHLKLCKADKDCCSKKCKRRGTNPEKRCR；SEQ ID NO:119)、opicalc in-1(GDCLPHLKRCKENNDCCSKKCKRRGTNPEKRCR；SEQ ID NO:120)、opicalcin-2(GDCLPHLKRCKENNDCCSKKCKRRGANPEKRCR；SEQ ID NO:121、中期因子(62-104)(CKYKFENWGACDGGTGTKVRQGTLKKARYNAQCQETIRVTKPC；SEQ ID NO:122)、MCoTI-II(SGSDGGVCPKILKKCRRDSDCPGACICRGNGYCG；SEQ ID NO:123)，或氯毒素(MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR；SEQ ID NO:124)。在一些实施方案中，细胞穿透肽可与SEQ ID NO:71–SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98–SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:116–SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126，或SEQ ID NO:403–SEQ ID NO:455中的任何序列具有至少80％、90％、95％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，肽缀合于、连接于或融合于一个或多个能够穿透质膜或核以达成体内递送蛋白质或大分子运载物的细胞穿透肽，诸如精氨酸富集、两亲性和赖氨酸富集、以及疏水性残基或肽。缀合或融合可为直接的，或在之间采用间隔体(基于化学物质或肽)。间隔体可为任何肽接头。举例来说，间隔体可为GGGSGGSGGGS(SEQ ID NO:125)、来自DkTx的KKYKPYVPVTTN(SEQ ID NO:114)、来自人IgG3的EPKSSDKTHT(SEQ ID NO:115)，或它们的任何变体或片段。在一些实施方案中，细胞穿透肽序列可附加于肽的N端或C端。在一些实施方案中，细胞穿透肽可附加于本公开的任何TfR结合肽的N端，在N端GS二肽之后，并且在例如GGGS(SEQ ID NO:103)间隔体之前。在一些实施方案中，细胞穿透标签肽，诸如SEQID NO:71–SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98–SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:116–SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126，或SEQ ID NO:403–SEQ ID NO:455中的任一者，可使用肽接头来附加于本文公开的任何肽的N端或C端，所述肽接头诸如是GxSy(SEQ ID NO:104)肽接头，其中x和y可为任何整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在一些实施方案中，肽接头包括GGSSG(SEQ IDNO:106)、GGGGG(SEQ ID NO:107)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:108)、GSGG(SEQ ID NO:109)、GGGGS(SEQ ID NO:110)、GGGS(SEQ ID NO:103)、GGS(SEQ ID NO:112)、GGGSGGGSGGGS(SEQID NO:113)、GGGSGGSGGGS(SEQ ID NO:225)，或它们的变体或片段。另外，来自DkTx的KKYKPYVPVTTN(SEQ ID NO:114)和来自人IgG3的EPKSSDKTHT(SEQ ID NO:115)可用作肽接头。在其他实施方案中，细胞穿透肽可在任何氨基酸残基处附加于肽。在其他实施方案中，细胞穿透肽可在任何氨基酸残基处附加于肽，而不干扰TfR结合活性。在一些实施方案中，细胞穿透肽通过缀合、连接或融合技术来附加。在其他实施方案中，细胞穿透肽可在任何氨基酸残基处附加于肽。
在其他实施方案中，细胞穿透可使用高剂量的此处所述的肽，诸如直至10μM，或10μM或更多的肽来增加。在一些情况下，Arg补丁可融合于、缀合于、连接于肽，或与肽共同递送。直至10μM，或10μM或更多的Arg补丁可与肽共同递送以有助于细胞穿透。蛋白质转染剂也可用于增加肽的细胞穿透。在一些实施方案中，可使用肽的直接胞质表达。在其他实施方案中，物理破坏方法诸如电穿孔可用于改善肽向细胞中的递送。
在一些实施方案中，本文所述的肽的细胞穿透可被改善。举例来说，本文所述的肽的结合界面可被移植在已知是细胞穿透性的支架诸如calcine上。类似地，已知是细胞穿透性的序列可被移植至本公开的肽上。calcine的一些非限制性实例可为imperatoxin-A、maurocalcine、hemicalcin、opiclacin 1、opicalcin 2和hadrucalcin。支架可包含与SEQID NO:116–SEQ ID NO:124中的任一者的至少60％、70％、80％、90％、95％或98％。在一些实施方案中，细胞穿透肽可为可用于增加细胞穿透的calcine、经修饰calcine、calcine的衍生物，或它们的片段。经修饰calcine、calcine的衍生物，或片段可关于细胞穿透活性加以筛选，所述活性诸如是使肌质网利阿诺定(ryanodine)受体活化，对利阿诺定敏感性Ca2+通道RyR1、Ryr2，或两者的活性，或作为前述各物的选择性激动剂。此外，经修饰calcine可包括在calcine内进行赖氨酸残基或其他带电荷残基的取代、添加或降低，以改进活性，并且优化此calcine细胞穿透活性或对RyR1或RyR2受体的活性。作为一实例，螺旋3的六氨基酸部分(MLICLF；SEQ ID NO:126)可被移植至calcine或经修饰calcine支架上以产生保留calcine的细胞穿透，具有TfR结合肽的新型TfR结合功能的双功能肽。作为另一实例，使用顺式作用性元件，如本文所述的肽可具有改善的细胞穿透能力，包括纳入K/R富集序列如TAT或八精氨酸、螺旋内精氨酸补丁，或融合于在细胞穿透筛选中鉴定的蛋白质如穿透蛋白或蜂毒素的较大片段。
在一些实施方案中，核定位信号可偶联于、缀合于、连接于或融合于本文所述的肽以促进核定位。在一些实施方案中，TfR结合肽缀合于、连接于或融合于核定位信号，诸如K-K/R-X-K/R(SEQ ID NO:129)的四残基序列，其中X可为任何氨基酸；或其变体。在一些实施方案中，TfR结合肽缀合于、连接于或融合于如Lange等人,J Biol Chem.2007年2月23日；282(8):5101-5中所述的核定位信号，诸如PKKKRRV(SEQ ID NO:130)或KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:131)。在一些实施方案中，本文所述的肽缀合于、连接于或融合于包含KxRy(SEQ ID NO:132)的核定位信号，其中x和y独立地可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，诸如KKRR(SEQ ID NO:133)、KKKRR(SEQ ID NO:134)，或KKKK(SEQ ID NO:135)。其他细胞穿透部分也可连接于、缀合于、连接于或融合于本文所述的肽，所述细胞穿透部分包括但不限于聚阳离子、聚有机酸、内体释放聚合物、聚(2-丙基丙烯酸)、聚(2-乙基丙烯酸)，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，本公开的肽(例如含有组氨酸或组氨酸富集的TfR结合肽)在生理pH下可具有高TfR结合亲和力，但在较低pH水平诸如内体pH 5.4下具有显著降低的结合亲和力。在一些情况下，本公开的TfR结合肽可被优化以获得改善的囊泡内(例如内体内)和/或细胞内递送功能，同时保留高TfR结合能力。在一些情况下，可进行组氨酸扫描和比较结合实验以开发和筛选此类肽。此外，一些肽可包含(例如缀合于、连接于或融合于)有助于肽或肽构建体的低pH内体逃逸以获得增强的递送功能(例如治疗剂的细胞内递送)的基序。在一些实施方案中，本公开的肽中的氨基酸残基被用不同氨基酸残基取代以改变对TfR的pH依赖性结合亲和力。氨基酸取代可增加在低pH下的结合亲和力，增加在高pH下的结合亲和力，降低在低pH下的结合亲和力，降低在高pH下的结合亲和力，或它们的组合。
在一些实施方案中，本公开的肽能够达成穿过细胞层或细胞屏障诸如BBB的囊泡胞吞转运。在一些实施方案中，肽靶向细胞或细胞(例如脑细胞)的核，并且/或者穿透至细胞或细胞(例如脑细胞)的核中。可被靶向的细胞或组织的实例包括与疾病或疾患相关的细胞或组织，诸如CNS的细胞或组织、脑细胞、癌细胞、以及其他细胞类型，其中所述细胞中的某一生物路径可被异常调控。可被靶向的细胞或组织的其他实例包括脾、肝、肾、肌肉、骨髓或皮肤的细胞或组织。可用本公开的肽靶向的细胞可为人细胞、哺乳动物细胞、人或哺乳动物细胞系、癌细胞系、在体内或在体外从受试者提取的细胞。
在一些情况下，如本文公开的肽可仅含有一个赖氨酸残基，或不含有赖氨酸残基。在一些情况下，肽中的赖氨酸残基中的一者或多者或全部被用精氨酸残基替换。在一些情况下，肽中的甲硫氨酸残基中的一者或多者或全部由亮氨酸或异亮氨酸替换。肽中的色氨酸残基中的一者或多者或全部可由苯丙氨酸或酪氨酸替换。在一些情况下，肽中的天冬酰胺残基中的一者或多者或全部由谷氨酰胺替换。在一些实施方案中，天冬氨酸残基中的一者或多者或全部可由谷氨酸残基替换。在一些情况下，肽中的赖氨酸残基中的一者或多者或全部由丙氨酸或精氨酸替换。在一些实施方案中，肽的N端诸如由乙酰基或叔丁基氧基羰基阻断或保护。替代地或组合地，肽的C端可诸如由酰胺基团或通过形成酯(例如丁酯或苯甲酯)来阻断或保护。在一些实施方案中，肽通过在游离胺上的甲基化加以修饰。举例来说，完全甲基化通过使用以甲醛和氰基硼氢化钠进行的还原性甲基化来实现。
在一些实施方案中，二肽GS可作为前两个N端氨基酸加以添加，如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:35，或SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:170中所示，或此N端二肽GS可不存在，如SEQID NO:36–SEQ ID NO:70，或SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:205中所示，或可被任何其他一个或两个氨基酸取代。在一些实施方案中，二肽GS用作接头，或用于偶联于接头以形成肽缀合物或融合分子诸如肽构建体。在一些实施方案中，接头包括GxSy(SEQ ID NO:104)肽，其中x和y独立地是任何整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在一些实施方案中，肽接头包括(GS)x(SEQ ID NO:105)，其中x可为任何整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在一些实施方案中，肽接头包括GGSSG(SEQ ID NO:106)、GGGGG(SEQ ID NO:107)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:108)、GGGGS(SEQ ID NO:110)、GGGS(SEQ ID NO:103)，或它们的变体或片段。
在本公开的一些实施方案中，如本文所述的肽或肽构建体包含以SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ IDNO:356–SEQ ID NO:361中的任一者阐述的氨基酸序列。如本文公开的肽可为包含SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167，或SEQID NO:171–SEQ ID NO:202中的任一者的连续片段的片段，所述片段的长度是至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65个残基，其中肽片段选自肽的任何部分。在一些实施方案中，肽序列由额外氨基酸侧接。一个或多个额外氨基酸例如对肽赋予特定体内电荷、等电点、化学缀合位点、稳定性或生理性质。
在一些情况下，能够靶向和结合TfR的如本文所述的肽在长度方面包含至多80个氨基酸，或在长度方面包含至多70、至多60、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15或至多10个氨基酸。
在其他实施方案中，肽可缀合于、连接于或融合于具有针对目标细胞或靶细胞的靶向或归巢功能的载体或分子。在其他实施方案中，肽可缀合于、连接于或融合于延长肽的半衰期，或改进肽的药效动力学和/或药代动力学性质，或它们的任何组合的分子。
在一些情况下，肽包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个带正电荷残基，诸如Arg或Lys，或它们的任何组合。在一些情况下，肽中的一个或多个赖氨酸残基被用精氨酸残基替换。在一些实施方案中，肽包含一个或多个Arg补丁。在一些实施方案中，Arg补丁位于肽的N端中。在其他方面，Arg补丁位于肽的C端中。在一些实施方案中，Arg补丁包含8个连续Arg残基(SEQ ID NO:73)。在一些实施方案中，肽上的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个，或10个或更多个Arg或Lys残基暴露于溶剂。在一些实施方案中，Arg补丁可为两个或更多个连续Arg残基。在一些实施方案中，Arg补丁包含的一个或多个Arg被Lys取代。
本公开的肽可还包含中性氨基酸残基。在一些实施方案中，肽具有35个或更少个中性氨基酸残基。在其他实施方案中，肽具有81个或更少个中性氨基酸残基、70个或更少个中性氨基酸残基、60个或更少个中性氨基酸残基、50个或更少个中性氨基酸残基、40个或更少个中性氨基酸残基、36个或更少个中性氨基酸残基、33个或更少个中性氨基酸残基、30个或更少个中性氨基酸残基、25个或更少个中性氨基酸残基，或10个或更少个中性氨基酸残基。
本公开的肽可还包含负性氨基酸残基。在一些实施方案中，肽具有6个或更少个负性氨基酸残基、5个或更少个负性氨基酸残基、4个或更少个负性氨基酸残基、3个或更少个负性氨基酸残基、2个或更少个负性氨基酸残基，或1个或更少个负性氨基酸残基。尽管负性氨基酸残基可选自任何带负电荷氨基酸残基，但在一些实施方案中，负性氨基酸残基是E，或D，或E与D两者的组合。
在本公开的一些实施方案中，肽的三维或三级结构主要包含β-片层和/或α-螺旋结构。在一些实施方案中，本公开的经设计或经工程改造TfR结合肽是通过用以形成胱氨酸的链内二硫键(例如由半胱氨酸介导)和疏水性核心来稳定的小型紧密肽或多肽。在一些实施方案中，经工程改造TfR结合肽具有包含螺旋束的结构，其中在每个α螺旋之间具有至少一个二硫键，由此使肽稳定。在其他实施方案中，经工程改造TfR结合肽包含具有三个α螺旋和三个链内二硫键的结构，在α螺旋束中的三个α螺旋中的每一者之间具有一个二硫键。
在其他实施方案中，肽可缀合于、连接于或融合于具有针对目标细胞或位于所述细胞的表面上或内部的靶蛋白的靶向或归巢功能的分子(例如小分子、肽或蛋白质)。在其他实施方案中，肽可缀合于、连接于或融合于延长肽的血浆和/或生物半衰期，或改进肽的药效动力学(例如增强的与靶蛋白的结合)和/或药代动力学性质(例如清除的速率和模式)，或它们的任何组合的分子。
通常，相关结构同源物的核磁共振(NMR)溶液结构或X射线结晶学结构可用于向可改善如本文所述的肽的折叠、稳定性和可制造性，同时维持特定生物功能(例如与TfR的结合)的突变策略提供信息。这些技术可用于预测一组结构同源性支架的3D药效团，以及预测相关蛋白的可能移植区域以创建具有改善的性质(例如结合性质)的嵌合体。举例来说，这个策略用于鉴定用于设计具有改善的TfR受体结合和胞吞转运性质、高表达、高体内稳定性，或这些性质的任何组合的肽的关键氨基酸位置和环。
在一些实施方案中，能够结合TfR以及达成穿过细胞膜的胞吞转运的肽包含与表1中所列的示例性肽序列(SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQID NO:136–SEQ ID NO:167、以及SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202)中的任一者或其功能性片段具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的序列。两种或更多种肽可共有一定程度的序列同一性或同源性，并且共有类似体内性质。举例来说，肽可与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167，或SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202的肽中的任一者共有一定程度的序列同一性或同源性。在一些实施方案中，本公开的一种或多种肽具有直至约20％成对序列同一性或同源性、直至约25％成对序列同一性或同源性、直至约30％成对序列同一性或同源性、直至约35％成对序列同一性或同源性、直至约40％成对序列同一性或同源性、直至约45％成对序列同一性或同源性、直至约50％成对序列同一性或同源性、直至约55％成对序列同一性或同源性、直至约60％成对序列同一性或同源性、直至约65％成对序列同一性或同源性、直至约70％成对序列同一性或同源性、直至约75％成对序列同一性或同源性、直至约80％成对序列同一性或同源性、直至约85％成对序列同一性或同源性、直至约90％成对序列同一性或同源性、直至约95％成对序列同一性或同源性、直至约96％成对序列同一性或同源性、直至约97％成对序列同一性或同源性、直至约98％成对序列同一性或同源性、直至约99％成对序列同一性或同源性、直至约99.5％成对序列同一性或同源性，或直至约99.9％成对序列同一性或同源性。在一些实施方案中，本公开的一种或多种肽与第二肽具有至少约20％成对序列同一性或同源性、至少约25％成对序列同一性或同源性、至少约30％成对序列同一性或同源性、至少约35％成对序列同一性或同源性、至少约40％成对序列同一性或同源性、至少约45％成对序列同一性或同源性、至少约50％成对序列同一性或同源性、至少约55％成对序列同一性或同源性、至少约60％成对序列同一性或同源性、至少约65％成对序列同一性或同源性、至少约70％成对序列同一性或同源性、至少约75％成对序列同一性或同源性、至少约80％成对序列同一性或同源性、至少约85％成对序列同一性或同源性、至少约90％成对序列同一性或同源性、至少约95％成对序列同一性或同源性、至少约96％成对序列同一性或同源性、至少约97％成对序列同一性或同源性、至少约98％成对序列同一性或同源性、至少约99％成对序列同一性或同源性、至少约99.5％成对序列同一性或同源性、至少约99.9％成对序列同一性或同源性。
在一些实施方案中，展现改善的TfR受体结合的肽显示改善的胞吞转运功能。在一些情况下，展现改善的TfR受体结合的肽不显示或显示小幅胞吞转运功能变化。在一些情况下，展现改善的TfR受体结合的肽显示降低的胞吞转运功能。在一些实施方案中，TfR结合肽的KA和KD值可被调节和优化(例如通过氨基酸取代)以提供TfR结合亲和力和高效胞吞转运功能的最优比率。
各种方法和软件程序可用于确定两个或更多个肽之间的同源性，诸如NCBIBLAST、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline，或另一适合方法或算法。成对序列比对可用于鉴定可指示两个生物序列(例如氨基酸或核酸序列)之间的功能、结构和/或进化关系的类似性区域。此外，多重序列比对(MSA)是三个或更多个生物序列的比对。根据MSA应用程序的输出，可暗示同源性，并且评估序列之间的进化关系。如本文所用，“序列同源性”和“序列同一性”和“序列同一性百分比(％)”和“序列同源性百分比(％)”可互换用于意指视情况而定与参考多核苷酸或氨基酸序列的序列相关性或相对于参考多核苷酸或氨基酸序列的变异。
在一些情况下，肽或肽构建体是SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者或其功能性片段。在其他实施方案中，本公开的肽或肽构建体还包含与SEQ ID NO:1–SEQID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者或其功能性片段具有99％、95％、90％、85％或80％序列同一性或同源性的肽。
在其他情况下，肽或肽构建体可为与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者或其功能性片段同源的肽。如本文进一步所述，术语“同源”在本文中可用于表示肽或肽构建体与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者或其功能性片段的序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，或大于95％序列同一性或同源性。
在其他情况下，编码SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者的肽或肽构建体的核酸分子可通过确定所编码肽氨基酸序列与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ IDNO:361中的任一者的氨基酸序列的序列同一性或同源性，或通过核酸杂交测定来鉴定。SEQID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者的此类肽变体或肽构建体变体可表征为以下核酸分子：(1)保持在高度严格洗涤条件下与具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者的核苷酸序列(或它的互补序列)的核酸分子杂交，其中洗涤严格性等同于在50-65℃下，0.1×-0.2×SSC伴有0.1％SDS，以及(2)编码与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ IDNO:361中的任一者的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％序列同一性或同源性的肽。
打结肽
在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽包含一个或多个Cys，或一个或多个二硫键。在一些实施方案中，TfR结合肽源于胱氨酸密集肽(CDP)、打结肽或套结素。如本文所用，术语“肽”被视为可与术语“打结肽”、“胱氨酸密集肽”、“CDP”和“套结素”互换。(参见例如Correnti等人Screening,large-scale production,and structure-basedclassification for cystine-dense peptides.Nat Struct Mol Biol.2018年3月；25(3):270–278)。
在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽可结合TfR，由此阻止TfR相互作用，诸如TfR与其他外源性或内源性配体(例如Tf或其同源物或片段)的相互作用。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽可结合TfR，而不影响其他外源性或内源性配体(例如Tf或其同源物或片段)与TfR的结合。在一些实施方案中，TfR结合肽可为经工程改造肽。经工程改造肽可为非天然存在、人工、经分离、合成、经设计或重组表达的肽。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽包含CDP、打结肽或套结素的一种或多种性质，诸如稳定性、对蛋白水解的抗性、对还原性条件的抗性、和/或穿过血脑屏障的能力。
在一些实施方案中，CDP或打结肽，包括经工程改造、非天然存在的CDP以及见于自然界中的那些，可缀合于、连接于或融合于本公开的TfR结合肽，诸如表1中所述的那些，以提供对靶细胞的额外归巢或靶向功能，所述靶细胞诸如是癌细胞、胰腺细胞、肝细胞、结肠细胞、卵巢细胞、乳腺细胞、肺细胞，或它们的任何组合。在一些实施方案中，CDP或打结肽，包括经工程改造CDP、经分离CDP和见于自然界中的CDP，可缀合于、连接于或融合于本公开的TfR结合肽，诸如表1中所述的那些，以提供对靶细胞的额外归巢或靶向功能，所述靶细胞诸如是癌细胞、胰腺细胞、肝细胞、结肠细胞、卵巢细胞、乳腺细胞、肺细胞，或它们的任何组合。经工程改造肽可为非天然存在、人工、合成、经设计或重组表达的肽。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽使得能够达成TfR介导的胞吞转运和/或细胞胞吞作用，并且缀合于、连接于或融合于TfR结合肽的额外CDP或打结肽可选择性靶向与疾病或疾患相关的细胞中的酶或其他目标蛋白质。在一些情况下，细胞是癌细胞。癌症可包括乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤、肺癌、骨髓细胞癌，或皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤，头颈癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、以及弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)，或CMYC过度表达性癌。在一些情况下，其他CDP或打结肽(例如见于自然界中的那些)缀合于、连接于或融合于TfR结合肽，并且能够使TfR结合肽穿过血脑屏障进行定位以将TfR结合肽递送至中枢神经系统中的靶细胞。
CDP(例如打结肽)是在长度方面通常在约11至约81个氨基酸的范围内的一类肽，所述氨基酸经常折叠成紧密结构。打结肽通常组装成复杂三级结构，所述结构的特征在于具有许多分子内二硫交联，并且可含有β折叠股、α螺旋和其他二级结构。二硫键的存在赋予打结肽显著环境稳定性，从而允许它们经得住极端温度和pH，并且抵抗血流的蛋白水解酶。二硫结的存在可提供对由还原剂达成的还原的抗性。打结肽的刚性还允许它们结合靶标，而不用受到松驰肽在结合靶标后产生的“熵罚”。举例来说，结合受到在肽结合靶标以形成复合物时发生的熵损失的不利影响。因此，“熵罚”是对结合的不利影响，并且在这个结合后发生的熵损失越大，“熵罚”越大。此外，由于在束缚在复合物中时损失柔性，所以相比于刚性结构化分子，柔性未结合分子在形成复合物时损失更多熵。然而，未结合分子中的刚性还通常通过限制分子可形成的复合物的数目来增加特异性。肽可以抗体样亲和力或以纳体积摩尔浓度或皮体积摩尔浓度亲和力结合靶标。对打结肽的序列结构和序列同一性或同源性的较广泛考查揭示它们已通过趋同进化而在所有种类的动物和植物中出现。在动物中，它们经常见于毒液例如蜘蛛和蝎子的毒液中，并且已牵涉于离子通道的调节中。植物的打结蛋白可抑制动物的蛋白水解酶或具有抗微生物活性，从而表明打结肽可在见于植物中的分子防御系统中起作用。
本公开的肽包含半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，肽具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，肽具有至少8个半胱氨酸氨基酸残基。在其他实施方案中，肽具有至少10个半胱氨酸氨基酸残基、至少12个半胱氨酸氨基酸残基、至少14个半胱氨酸氨基酸残基或至少16个半胱氨酸氨基酸残基。
打结肽可包含二硫键。打结肽可为其中5％或更多的残基是形成分子内二硫键的半胱氨酸的肽。二硫键连接的肽可为药物支架。在一些实施方案中，二硫键形成结。二硫键可在半胱氨酸残基之间，例如在半胱氨酸1和4、2和5，或3和6之间形成。在一些实施方案中，一个二硫键穿过由其他两个二硫键形成的环，例如以形成结。在其他实施方案中，二硫键可在任何两个半胱氨酸残基之间形成。
本公开还包括例如可用作用于产生额外肽的起始点的肽支架。在一些实施方案中，这些支架可源于多种打结肽(诸如CDP或打结肽)。在某些实施方案中，CDP(例如打结肽)组装成复杂三级结构，所述结构的特征在于具有许多分子内二硫交联，并且任选地含有β折叠股和其他二级结构诸如α螺旋。举例来说，在一些实施方案中，CDP(例如打结肽)包括特征在于穿过二硫结的二硫键的小型二硫键富集蛋白质。这个结可例如在一个二硫键穿过由两个其他二硫键和互连主链形成的大环时获得。在一些实施方案中，打结肽可包括生长因子半胱氨酸结或抑制剂半胱氨酸结。其他可能的肽结构包括具有两个由两个二硫键连接的平行螺旋而无β-片层的肽(例如hefutoxin)。
本公开的一些肽可包含至少一个呈L构型的氨基酸残基。肽可包含至少一个呈D构型的氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是15-75个氨基酸残基。在其他实施方案中，肽的长度是11-55个氨基酸残基。在其他实施方案中，肽的长度是11-65个氨基酸残基。在其他实施方案中，肽的长度是至少20个氨基酸残基。
一些CDP(例如打结肽)可源于或分离自已知存在于毒素或毒液中或与毒素或毒液相关的一类蛋白质。在一些情况下，肽可源于与蝎子或蜘蛛相关的毒素或毒液。肽可源于各个属和种的蜘蛛和蝎子的毒液和毒素。举例来说，肽可源于黑背以色列金蝎(Leiurusquinquestriatus hebraeus)、图尼塔尼地中海黄蝎(Buthus occitanus tunetanus)、以色列黑鳄背蝎(Hottentotta judaicus)、条斑钳蝎(Mesobuthus eupeus)、以色列地中海黄蝎(Buthus occitanus israelis)、吉氏巨毛蝎(Hadrurus gertschi)、黄肥尾蝎(Androctonus australis)、中美毒蝎(Centruroides noxius)、老挝异蝎(Heterometruslaoticus)、非洲黄爪蝎(Opistophthalmus carinatus)、中国虎纹捕鸟蛛(Haplopelmaschmidti)、双针蝎(Isometrus maculatus)、虎纹捕鸟蛛(Haplopelma huwenum)、海南捕鸟蛛(Haplopelma hainanum)、中国虎纹捕鸟蛛、美洲漏斗网蛛(Agelenopsis aperta)、蓝山漏斗网蜘蛛(Haydronyche versuta)、虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)、白额高脚蛛(Heteropoda venatoria)、智利红玫瑰蜘蛛(Grammostola rosea)、虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)、蓝山漏斗网蜘蛛(Hadronyche versuta)、雪梨漏斗网蜘蛛(Atrax robustus)、美洲漏斗网蛛(Angelenopsis aperta)、千里达老虎尾(Psalmopoeuscambridge)、漏斗蛛(Hadronyche infensa)、鲁图斯拟隙蛛(Paracoelotes luctosus)和敬钊缨毛蛛(Chilobrachys jingzhao)或另一适合属或种的蝎子或蜘蛛的毒液或毒素。在一些情况下，肽可源于东亚钳蝎(Buthus martensii Karsh)(蝎子)毒素。
序列同一性和同源性
通过常规方法来确定序列同一性或同源性百分比(％)。(参见例如Altschul等人(1986),Bull.Math.Bio.48:603(1986)，以及Henikoff和Henikoff(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。简而言之，可使用空位开放罚分10、空位延伸罚分1以及Henikoff和Henikoff(同上)的“BLOSUM62”评分矩阵来比对两个氨基酸序列以优化比对评分。然后将序列同一性或同源性计算为：([相同匹配的总数]/[较长序列的长度加上引入至较长序列中以比对两个序列的空位的数目])(100)。
另外，有若干确定算法可用于比对两个氨基酸序列。举例来说，Pearson和Lipman的“FASTA”类似性搜索算法可为一种适于考查由本文公开的肽的氨基酸序列和肽变体的氨基酸序列共有的序列同一性或同源性的水平的蛋白质比对方法。FASTA算法例如由Pearson和Lipman,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 85:2444(1988)以及由Pearson,Meth.Enzymol.183:63(1990)描述。简而言之，FASTA首先通过鉴定由查询序列(例如SEQ ID NO:1)和测试序列共有的具有最高同一性密度(如果ktup变量是1)或同一性对(如果ktup＝2)的区域，而不考虑保守性氨基酸取代、插入或缺失来表征序列类似性。具有最高同一性密度的十个区域然后通过使用氨基酸取代矩阵比较所有配对氨基酸的类似性来再评分，并且区域的末端被“修剪”以仅包括促成最高评分的那些残基。如果有若干区域具有大于“截断”值(通过基于序列长度和ktup值的预定公式来计算)的评分，那么考查修剪的初始区域以确定所述区域是否可被接合以形成具有空位的近似比对。最后，使用Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444(1970)；Sellers,Siam J.Appl.Math.26:787(1974))的修改形式比对两个氨基酸序列的最高评分区域，所述修改形式允许进行氨基酸插入和缺失。举例来说，FASTA分析的说明性参数是：ktup＝1，空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝1，以及取代矩阵＝BLOSUM62。这些参数可通过修改评分矩阵文件(“SMATRIX”)来引入至FASTA程序中，如Pearson,Meth.Enzymol.183:63(1990)的附录2中所说明。
FASTA还可用于使用如上公开的比率来确定核酸序列或分子的序列同一性或同源性。对于核酸序列比较，ktup值可在一至六之间的范围内，优选是三至六，最优选是三，其他参数如本文所述加以设置。
是“保守性氨基酸取代”的常见氨基酸的一些实例由在以下群组中的每一者内的氨基酸之间的取代所说明：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表是由代表超过500组相关蛋白质的高度保守区域的蛋白质序列区段的约2,000个局部多重比对获得的氨基酸取代矩阵(Henikoff和Henikoff,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89:10915(1992))。因此，BLOSUM62取代频率可用于确定可被引入至本发明的氨基酸序列中的保守性氨基酸取代。尽管有可能仅基于化学性质(如上所讨论)来设计氨基酸取代，但措辞“保守性氨基酸取代”优选地指代由大于-1的BLOSUM62值表示的取代。举例来说，如果取代的特征在于BLOSUM62值是0、1、2或3，那么氨基酸取代是保守性的。根据这个系统，优选保守性氨基酸取代的特征在于BLOSUM62值是至少1(例如1、2或3)，而更优选保守性氨基酸取代的特征在于BLOSUM62值是至少2(例如2或3)。
可确定对在对于维持结构完整性是关键的区域或结构域内的氨基酸残基的确定。在这些区域内，可确定可或多或少耐受变化，并且维持分子的总体三级结构的特定残基。用于分析序列结构的方法包括但不限于比对具有高氨基酸或核苷酸同一性或同源性的多个序列以及使用可用软件(例如Insight II.RTM.浏览器和同源性建模工具；MSI,San Diego,Calif.)、二级结构倾向、二元模式、互补性堆积和包埋极性相互作用(Barton,G.J.,Current Opin.Struct.Biol.5:372-6(1995)以及Cordes,M.H.等人,CurrentOpin.Struct.Biol.6:3-10(1996))进行计算机分析。一般来说，当设计对分子的修饰或鉴定特定片段时，对结构的确定可通常伴有评估经修饰分子的活性。
肽的物理化学性质
在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽可包含广泛范围的物理化学性质，诸如分子大小和结构、pH、等电点、以及总体分子净电荷。这些参数可对肽结合TfR，促进胞吞转运，并且穿过细胞屏障诸如BBB来转运运载物分子的能力具有影响。
本公开的肽可包含至少一个呈D构型的氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约5-100个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约10-90个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约15-80个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约15-75个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约15-70个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约20-65个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约20-60个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约25-55个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约25-50个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约25-40个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约11-35个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约10-25个氨基酸残基。
在一些实施方案中，肽的长度是至少5个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少10个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少15个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少20个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少25个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少30个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少35个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少40个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少45个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少50个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少55个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少60个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少65个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少70个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少75个氨基酸残基。
在一些实施方案中，如本文所述的肽的氨基酸序列包含至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58个残基、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65、至少66、至少67、至少68、至少69、至少70、至少71、至少72、至少73、至少74、至少75、至少76、至少77、至少78、至少79、至少80或至少81个氨基酸残基。
在本公开的一些实施方案中，肽的三维或三级结构主要包含β-片层和/或α-螺旋结构。在一些实施方案中，本公开的经设计或经工程改造TfR结合肽是通过链内二硫键(例如由半胱氨酸介导)和疏水性核心来稳定的小型紧密肽或多肽。在一些实施方案中，经工程改造TfR结合肽具有包含螺旋束的结构，其中在每个α螺旋之间具有至少一个二硫键，由此使肽稳定。在其他实施方案中，经工程改造TfR结合肽包含具有三个α螺旋和三个链内二硫键的结构，在α螺旋束中的三个α螺旋中的每一者之间具有一个二硫键。
在生理pH下，如本文所述的肽可具有例如-5、-4、-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4或+5的总体分子净电荷。当净电荷是零时，肽可为不带电荷的或两性离子性的。在一些实施方案中，肽含有一个或多个二硫键，并且在生理pH下具有正性净电荷，其中所述净电荷可为+0.5或小于+0.5、+1或小于+1、+1.5或小于+1.5、+2或小于+2、+2.5或小于+2.5、+3或小于+3、+3.5或小于+3.5、+4或小于+4、+4.5或小于+4.5、+5或小于+5、+5.5或小于+5.5、+6或小于+6、+6.5或小于+6.5、+7或小于+7、+7.5或小于+7.5、+8或小于+8、+8.5或小于+8.5、+9或小于+9.5、+10或小于+10。在一些实施方案中，肽在生理pH下具有负性净电荷，其中所述净电荷可为-0.5或小于-0.5、-1或小于-1、-1.5或小于-1.5、-2或小于-2、-2.5或小于-2.5、-3或小于-3、-3.5或小于-3.5、-4或小于-4、-4.5或小于-4.5、-5或小于-5、-5.5或小于-5.5、-6或小于-6、-6.5或小于-6.5、-7或小于-7、-7.5或小于-7.5、-8或小于-8、-8.5或小于-8.5、-9或小于-9.5、-10或小于-10。
在一些实施方案中，本公开的肽可具有3至10的等电点(pI)值。在其他实施方案中，本公开的肽可具有4.3至8.9的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有3-4的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有3-5的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有3-6的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有3-7的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有3-8的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有3-9的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有4-5的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有4-6的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有4-7的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有4-8的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有4-9的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有4-10的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有5-6的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有5-7的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有5-8的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有5-9的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有5-10的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有6-7的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有6-8的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有6-9的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有6-10的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有7-8的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有7-9的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有7-10的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有8-9的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有8-10的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有9-10的pI值。
在一些情况下，本公开的肽(例如TfR结合肽)内一个或多个突变的工程改造产生在生理pH下具有改变的等电点、电荷、表面电荷或流变学的肽。对可源于蝎子或蜘蛛复合物的肽的突变的此工程改造可例如通过使净电荷降低1、2、3、4或5，或通过使净电荷增加1、2、3、4或5来改变所述肽的净电荷。在此类情况下，工程改造突变可有助于肽结合靶蛋白，促进胞吞转运，并且穿透细胞、内体或核的能力。适于改善肽的流变学和效能的氨基酸修饰可包括保守性或非保守性突变。
相较于肽所源于的毒液或毒素组分的序列，所述肽可包含至多1个氨基酸突变、至多2个氨基酸突变、至多3个氨基酸突变、至多4个氨基酸突变、至多5个氨基酸突变、至多6个氨基酸突变、至多7个氨基酸突变、至多8个氨基酸突变、至多9个氨基酸突变、至多10个氨基酸突变，或另一适合数目。在其他实施方案中，相较于肽所源于的毒液或毒素组分的序列，所述肽或其功能性片段包含至少1个氨基酸突变、至少2个氨基酸突变、至少3个氨基酸突变、至少4个氨基酸突变、至少5个氨基酸突变、至少6个氨基酸突变、至少7个氨基酸突变、至少8个氨基酸突变、至少9个氨基酸突变、至少10个氨基酸突变，或另一适合数目。在一些实施方案中，突变可被工程改造在肽内以提供在生理pH下具有所需电荷或稳定性的肽。
通常，相关结构肽或蛋白质同源物的NMR溶液结构、X射线晶体结构、以及一级结构序列比对或计算机设计可用于产生可改善折叠、稳定性和/或可制造性，同时维持特定生物功能(例如TfR亲和力/结合)的突变策略。用于产生同源物或计算机设计的肽或多肽的一般性策略可包括鉴定蛋白质的带电荷表面补丁或保守残基，使关键氨基酸位置和环突变，继之以在体外以及在体内对肽进行测试。总体肽优化过程就例如在体外或体内测试期间获得的信息用于设计下一代肽而言可具有迭代性质。因此，本文公开的方法可用于设计具有改善的性质的肽，或用于修正使折叠和可制造性复杂化的有害突变。关键氨基酸位置和环可被保留，而肽序列中的其他残基可被突变以改善、改变、移除，或以其他方式改进肽的功能，诸如结合、胞吞转运，或穿透细胞、内体或细胞中的核的能力，归巢或另一活性。
本公开还涵盖本文所述的各种肽的多聚体。多聚体的实例包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体等。多聚体可为由多个相同亚单位形成的同聚体，或由多个不同亚单位形成的异聚体。在一些实施方案中，本公开的肽以与至少一个其他肽，或两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个其他肽的多聚结构加以排列。在某些实施方案中，多聚结构的肽各自具有相同序列。在其他实施方案中，多聚结构的肽中的一者或多者或全部具有不同序列。
在一些实施方案中，本公开提供了可用作用于产生具有更加特定的或改善的性质的额外下一代肽的起始点的肽支架。在一些实施方案中，这些支架源于多种CDP或打结肽。用于支架的一些适合肽可包括但不限于氯毒素、甜味蛋白(brazzein)、环杆菌素(circulin)、stecrisp、hanatoxin、中期因子、hefutoxin、马铃薯羧基肽酶抑制剂、泡蛋白、引蛋白(attractin)、α-GI、α-GID、μ-PIIIA、ω-MVIIA、ω-CVID、χ-MrIA、ρ-TIA、芋螺睡眠肽G(conantokin G)、芋螺迟缓肽G(contulakin G)、GsMTx4、玛格毒素(margatoxin)、shK、毒素K、胰凝乳蛋白酶抑制剂(CTI)和EGF上皮调节蛋白核心。在一些实施方案中，肽序列由额外氨基酸侧接。一个或多个额外氨基酸可对肽赋予所需体内电荷、等电点、化学缀合位点、稳定性或生理性质。
肽的化学修饰
肽可以多种方式中的一者或多者加以化学修饰。在一些实施方案中，肽可被突变以添加功能，缺失功能，或改进体内行为。举例来说，在一些实施方案中，本公开的肽可用将导致TfR的蛋白酶体降解的分子(例如泛素连接酶啮合缀合物或融合物或cereblon结合分子)加以化学修饰。二硫键之间的一个或多个环可被修饰或替换以包括来自其他肽的活性元件(诸如描述于Moore和Cochran,Methods in Enzymology,503,第223-251页,2012中)。氨基酸还可被突变，诸如以增加半衰期，改进、添加或缺失体内结合行为，添加新的靶向功能，改进表面电荷和疏水性，或允许产生缀合位点。N-甲基化是可存在于本公开的肽中的甲基化的一个实例。在一些实施方案中，肽通过在游离胺上的甲基化加以修饰。举例来说，完全甲基化可通过使用以甲醛和氰基硼氢化钠进行的还原性甲基化来实现。
肽可被修饰以添加功能，诸如以将来自其他蛋白质或肽的环或序列移植至本公开的肽上。同样，来自本公开的结构域、环或序列可被移植至具有额外功能的其他肽或蛋白质诸如抗体上。
化学修饰可例如延长肽的半衰期，或改变生物分布或药代动力学概况。化学修饰可包括聚合物、聚醚、聚乙二醇、生物聚合物、聚氨基酸、脂肪酸、树状体、Fc区、简单饱和碳链诸如棕榈酸或肉豆蔻脑酸，或白蛋白。聚氨基酸可包括例如具有重复单一氨基酸的聚氨基酸序列(例如聚甘氨酸)，以及具有可或可不遵循某一样式的混合聚氨基酸序列(例如gly-ala-gly-ala)的聚氨基酸序列，或前述各物的任何组合。
本公开的肽可被修饰以致修饰增加肽的稳定性和/或半衰期。疏水性部分诸如连接于N端、C端或内部氨基酸可用于延长本公开的肽的半衰期。肽还可被修饰以增加或降低肽的肠道可渗透性或细胞可渗透性。在一些情况下，本公开的肽显示在肠的腺细胞中高度积累，从而显示在治疗和/或预防肠的疾病或疾患方面的可应用性，所述疾病或疾患诸如是克罗恩氏病，或更一般来说，炎症性肠病。本公开的肽可包括可影响例如血清半衰期的翻译后修饰(例如甲基化和/或酰胺化和/或糖基化)。在一些实施方案中，简单碳链(例如通过肉豆蔻酰化和/或棕榈基化)可缀合于、连接于融合蛋白或肽。简单碳链可致使融合蛋白或肽可易于与未缀合物质分离。举例来说，可用于使融合蛋白或肽与未缀合物质分离的方法包括但不限于溶剂提取和反相色谱法。亲脂性部分可通过与血清白蛋白的可逆结合来延长半衰期。缀合的部分可例如是通过与血清白蛋白的可逆结合来延长肽的半衰期的亲脂性部分。在一些实施方案中，亲脂性部分可为胆固醇或胆固醇衍生物，包括胆甾烯、胆甾烷、胆甾二烯和氧化固醇。在一些实施方案中，肽可缀合于、连接于肉豆蔻酸(十四烷酸)或其衍生物。在其他实施方案中，本公开的肽可偶联(例如缀合、连接或融合)于半衰期调节剂。半衰期调节剂的实例可包括但不限于：聚合物、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、水溶性聚合物、两性离子水溶性聚合物、水溶性聚(氨基酸)，脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，含有甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，Fc区、脂肪酸、棕榈酸，或结合白蛋白的分子。在一些实施方案中，半衰期调节剂可为血清白蛋白结合肽，例如SA21(SEQ ID NO:376，RLIEDICLPRWGCLWEDD)。在一些实施方案中，SA21肽可缀合或融合于本公开的CDP(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)。SA21融合肽可包括本文公开的SA21 TfR结合肽构建体(例如SEQ ID NO:373或SEQ ID NO:375)。SA21肽可包含用于缀合于一个或多个肽或在一个或多个肽之间融合的接头序列(例如SEQID NO:377，GGGGSGGGGSRLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGS)。示例性SA21肽、融合肽和接头提供于表2中。对照SA21融合肽可包含融合于SA21的对照肽(例如SEQ ID NO 372(GSRLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGSKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、SEQ ID NO:374(RLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGSKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、SEQ ID NO:456(GSRLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGSVRIPVSCKHSGQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCDCTPK)，或SEQ ID NO:457(RLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGSVRIPVSCKHSGQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCDCTPK))。另外，肽与近红外染料诸如Cy5.5或与白蛋白结合剂诸如Albu标签的缀合可延长如本文所述的任何肽的血清半衰期。在一些实施方案中，通过使用最小非人蛋白质序列来延长肽的血清半衰期，免疫原性被降低。
表2–示例性TfR结合肽构建体：与血清白蛋白结合肽融合以达成半衰期延长的TfR结合肽
Figure BDA0003175003630001291
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:170的前两个N端氨基酸(GS)充当间隔体或接头以有助于缀合或融合于另一分子，以及有助于肽从此类缀合、连接或融合分子切割。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白或肽可缀合于、连接于或融合于例如可改进肽的性质或实现对肽的性质的改变的其他部分。
肽-活性剂缀合物(也被称为“肽构建体”)
在一些实施方案中，本公开的肽可自身用于结合TfR。在其他实施方案中，本公开的肽还可用于递送另一活性剂。本公开的肽可缀合于、连接于或融合于用于治疗肿瘤和癌症的剂。举例来说，在某些实施方案中，本文所述的肽融合于另一分子，诸如提供额外功能性能力的活性剂。肽可通过含有所述肽的序列以及活性剂的序列的载体的表达来与所述活性剂融合。在各种实施方案中，肽的序列和活性剂的序列可从同一开放阅读框(ORF)表达。在各种实施方案中，肽的序列和活性剂的序列可包含连续序列。相较于它们在单独表达时的功能性能力，肽和活性剂可在肽构建体中各自保留类似功能性能力。在某些实施方案中，活性剂的实例可包括其他肽。
在某些实施方案中，活性剂的实例包括其他肽诸如神经降压素肽。神经降压素是一种具有13个氨基酸的神经肽，其可涉及于对促黄体生成激素和促乳素释放的调控中，并且可与多巴胺能系统相互作用，但不穿过血脑屏障，并且也由肽酶快速代谢(Wang等人,Curr.Pharm.Des.21(7)；840-848(2015))。
神经降压素是一种见于中枢神经系统和胃肠道中的具有13个氨基酸的肽，并且在广泛范围的生理性和病理性过程中起作用。神经降压素的各种活性以及神经降压素激动剂的潜在治疗作用描述于以下中：Mustain,Rychahou和Evers,Curr Opin EndocrinolDiabetes Obes(2011)，以及Boules,Li,Smith,Fredrickson和Richelson,FrontEndocrinol(Lausanne)(2013)。NT在肠道运动性、心血管系统的调节、纳洛酮非依赖性抗伤害感受、体温过低、垂体前叶激素分泌的控制、肌肉松弛、中心血压和炎症中起作用。NT通过三种受体NTS1、NTS2、NTS3来介导它的作用。NTS1是高亲和力受体，并且遍及CNS，包括内侧隔核、大细胞基底核、视交叉上核、SN和VTA；脊髓的小背根神经节神经元，在神经元与神经胶质细胞两者中广泛表达。NTS2主要定位在嗅觉系统、大脑和小脑皮质、海马结构、以及选择性下丘脑核、VTA和SN中。NTS3也遍及脑在各种位置处表达。NT涉及于调节多巴胺神经传递，可在血清素能系统，包括抗伤害感受、睡眠-觉醒周期和应激中起作用，在谷氨酸释放中起作用，并且可具有抗精神病作用。NT涉及于神经内分泌调控，包括旁分泌和自分泌作用、CRH、GnRH、GHRH、促乳素、ACTH、促性腺激素、生长激素、促乳素、甲状腺激素调节；以及肠道运动性、肠炎症、脂质代谢、食欲和食物摄取中。NT已牵涉于若干CNS病症，诸如精神分裂症、药物滥用、帕金森氏病(PD)、疼痛、中枢性血压控制、进食障碍、中风、阿尔茨海默氏病；以及癌症和炎症以及内分泌功能的其他病症的病理生理学中。正常机制的破坏可导致在从精神分裂症至结肠直肠癌的范围内的疾病。通过选择性靶向或阻断特定神经降压素受体，研究者已鉴定用于治疗精神分裂症、酒精中毒、慢性疼痛或癌症的潜在药物。NT可提供阿片非依赖性止痛作用，并且可治疗热性、内脏性和持续性炎症性疼痛、躯体疼痛和内脏疼痛，并且在应激诱导的抗伤害感受中起作用。NT施加μ-阿片非依赖性抗伤害感受性作用。NT激动剂可阻断精神刺激剂诸如可卡因(cocaine)以及安非他明(amphetamine)和尼古丁(nicotine)的作用。在帕金森氏病患者中，血浆NT水平是较高的，并且施用NT可减轻肌肉僵硬和震颤。NT还可降低体温，并且降低血压。
表3公开了示例性神经降压素(NT)肽变体(Boules等人,Diverse roles ofneurotensin agonists in the central nervous system,Frontiers inEndocrinology,2013)。本公开的任何肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ IDNO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)都可融合于或以其他方式缀合于本文公开的任何NT肽变体(例如表3中公开的任何NT肽变体)或其片段。在一些实施方案中，本公开肽融合于或以其他方式缀合于包含与SEQ ID NO:350的至少53％、至少60％、至少69％、至少75％、至少77％、至少85％、至少90％、至少92％序列同一性的神经降压素(NT)肽变体。在其他实施方案中，本公开的肽融合于或以其他方式缀合于包含序列ELYENKP(SEQ ID NO:370)或ELYENKP-X1-X2-P-X3-X4-L(SEQ ID NO:371)的神经降压素(NT)肽变体，，其中X1和X2可为Lys或Arg，X3可为Trp或Tyr，并且X4可为Ile或Leu，或其中X1-X4和Leu中没有一者或一者或多者包含经修饰氨基酸残基或非天然氨基酸残基。
表3–神经降压素肽变体
Figure BDA0003175003630001311
Figure BDA0003175003630001321
因此，神经降压素肽和可穿过血脑屏障的本文所述的肽中的一者的融合可产生可保留神经降压素肽的功能性能力的能够穿过血液屏障的融合肽。举例来说，将本公开的肽的DNA序列插入至神经降压素的基因中以制造肽-神经降压素融合物。在一些实施方案中，本公开的肽融合于神经降压素或其功能性片段。神经降压素的功能性片段的长度可为至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基，或至少13个氨基酸残基。
作为另一实例，在某些实施方案中，本文所述的肽连接于另一分子，诸如提供功能性能力的活性剂。在一些实施方案中，活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15剂、融合IL-15/IL-15Ra复合物剂、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀或神经递质诸如神经降压素。
在一些实施方案中，TfR结合肽可将活性剂引导至细胞中。在其他实施方案中，TfR结合肽可将活性剂引导至核中。在一些实施方案中，活性剂具有内在肿瘤归巢性质，或活性剂可被工程改造以具有肿瘤归巢性质。在一些实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个活性剂可连接于肽。多个活性剂可通过各种方法来连接，诸如缀合于多个赖氨酸残基和/或N端，或通过使多个活性剂连接于支架，诸如聚合物或树状体，然后使那个剂-支架连接于肽(诸如描述于Yurkovetskiy,A.V.,Cancer Res 75(16):3365–72(2015)中)。活性剂的实例包括但不限于：肽、寡肽、多肽、肽模拟物、多核苷酸、多核糖核苷酸、DNA、cDNA、ssDNA、RNA、双链RNA、微小RNA、寡核苷酸、抗体、单链可变片段(scFv)、抗体片段、适体、细胞因子、干扰素、激素、酶、生长因子、检查点抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CD47抑制剂、CTLA4抑制剂、CD抗原、趋化因子、神经递质、离子通道抑制剂、离子通道活化剂、G蛋白偶联受体抑制剂、G蛋白偶联受体活化剂、化学剂、放射致敏剂、辐射防护剂、放射性核素、治疗性小分子、类固醇、皮质类固醇、抗炎剂、免疫调节剂、补体结合肽或蛋白质、肿瘤坏死因子抑制剂、肿瘤坏死因子活化剂、肿瘤坏死因子受体家族激动剂、肿瘤坏死受体拮抗剂、Tim-3抑制剂、蛋白酶抑制剂、氨基糖、化学治疗剂、细胞毒性分子、毒素、酪氨酸激酶抑制剂、抗感染剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、氨基糖苷、非类固醇抗炎药物(NSAID)、他汀(statin)、纳米颗粒、脂质体、聚合物、生物聚合物、多糖、蛋白聚糖、糖胺聚糖、聚乙二醇、脂质、树状体、脂肪酸，或Fc区，或它们的活性片段或修饰形式。
在一些实施方案中，肽共价或非共价连接于活性剂，例如直接或通过接头。举例来说，可使用的细胞毒分子包括澳瑞他汀、MMAE、MMAF、多洛他汀(dolostatin)、澳瑞他汀F、单甲基澳瑞他汀D、DM1、DM4、美登木素、美登素、卡奇霉素(calicheamicin)、N-乙酰基-γ-卡奇霉素、吡咯并苯并二氮呯、PBD二聚体、多柔比星、长春花生物碱(4-脱乙酰基长春碱)、倍癌霉素(duocarmycin)、蘑菇毒伞肽(amatoxin)的环状八肽类似物、埃博霉素(epothilone)、以及蒽环霉素(anthracyline)、CC-1065、紫杉烷、紫杉醇、卡巴他赛(cabazitaxel)、多西他赛、SN-38、伊立替康、长春新碱、长春碱、铂化合物、顺铂、甲氨蝶呤、BACE(β-分泌酶1)抑制剂诸如维罗司他(verubecestat)、苯丁酸氮芥、丝裂霉素C。活性剂的额外实例描述于McCombs,J.R.,AAPS J,17(2):339–51(2015)，Ducry,L.,Antibody DrugConjugates(2013)，以及Singh,S.K.,Pharm Res.32(11):3541–3571(2015)中。在与本公开的组合物和方法组合使用时治疗功效可显著改善的治疗性有效载荷的额外实例包括卡莫司汀、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、伊立替康、洛莫司汀、丙卡巴肼、替莫唑胺、长春新碱和贝伐珠单抗。治疗性有效载荷的额外实例是在神经变性疾病中具有治疗益处的化合物诸如BACE抑制剂或在自身免疫性疾病中具有治疗益处的化合物，以及对疼痛和偏头痛有效的治疗剂诸如CGRP受体拮抗剂。用于治疗疼痛的活性剂也符合本公开。举例来说，在一些实施方案中，活性剂是神经递质，诸如神经降压素。因此，本文公开的肽构建体是肽-神经降压素构建体。适于与本文实施方案一起使用的示例性接头在以下更详细讨论。
由于它们的不良BBB穿透能力，所以当前可用的药物分子中仅有一小部分可应用于CNS疾病中。约98％的小分子药物不穿过BBB或仅在极其有限程度上穿过BBB。此外，接近100％的大分子药物分子(例如抗体)不展现显著BBB穿透能力。(参见例如Mikitsh等人Pathways for Small Molecule Delivery to the Central Nervous System Across theBlood-Brain Barrier,Perspect Medicin Chem.2014；6:11–24)。因此，可用或当前处于临床前或临床开发中的药物分子可与当前描述的方法和组合物组合使用以提供这些药物在表达TfR的细胞、组织或器官(例如癌细胞或免疫细胞)中的改善的治疗活性，因此相较于常规疗法，提供优越临床效果。举例来说，显示针对特定生物靶标(例如蛋白质或核酸)的活性，但由于细胞屏障或细胞膜而在体内被阻止到达所述靶标的药物分子，所述药物分子可缀合于、连接于或融合于本公开的TfR结合肽以达成通过TfR介导的穿过那些细胞屏障(例如BBB)或细胞膜(例如癌细胞的细胞膜)的转运来实现的增强的递送。肽-药物缀合物或融合分子可通过TfR介导的胞吞转运来穿过BBB，因此提供显著较高的药物浓度(例如CNS中的治疗浓度)以治疗或预防CNS病症(例如脑癌)。举例来说，哌柏西利已在治疗乳腺癌方面显示功效，但针对CNS肿瘤的活性已受到限制。因此，使药物哌柏西利缀合于本公开的TfR结合肽可使得它能够用于治疗和/或预防药物分子自身不可及的肿瘤，例如位于CNS中的那些(例如脑肿瘤)。可使用包含一个或多个本公开的TfR结合肽的缀合物或融合分子治疗或预防的脑肿瘤可包括胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤和弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤。
在一些实施方案中，如本文所述的TfR结合肽可用于治疗和/或预防非CNS和/或外周细胞、组织或器官中的疾病。举例来说，如本文所述的TfR结合肽可用于治疗和/或预防肌肉疾病。可与TfR结合肽组合使用以治疗或预防肌肉疾病的药物或药物候选物可包括用于肌营养不良、脊髓延髓肌营养不良(SBMA)、肌强直性营养不良、恶病质或肌肉减少症的药物或药物候选物。在一些实施方案中，药物可为用于肌肉疾病的长寿药或其他抗衰老分子(例如半胱天冬酶)或基因疗法。
在一些实施方案中，如本文所述的TfR结合肽可用于治疗疼痛。TfR结合肽可连接于神经降压素(NT)以产生CDP-NT肽构建体(例如SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205，或SEQID NO:359–SEQ ID NO:361)。这些肽构建体可靶向CNS中的神经降压素受体以抑制疼痛。在一些实施方案中，在施用后，肽能够减轻受试者中的疼痛的水平。
疼痛的种类包括慢性疼痛、急性疼痛、伤害感受性疼痛、神经病变性疼痛、异常性疼痛、幻觉疼痛、内脏疼痛、爆发性疼痛。神经降压素是非阿片，但可提供止痛作用。阿片可导致成瘾，而神经降压素递送至CNS提供非成瘾性疼痛缓解的可能性。神经降压素肽融合物还可用于治疗多巴胺能、血清素能、γ-氨基丁酸能、谷氨酸能和胆碱能系统、精神分裂症、精神病、药物滥用、帕金森氏病(PD)、疼痛、中枢性血压控制、进食障碍以及癌症和炎症。神经降压素肽融合物可用于治疗疼痛，包括慢性疼痛、急性疼痛、损伤、机械性疼痛、热疼痛、冷疼痛、缺血性疼痛、以及化学物质诱导的疼痛、炎症性疼痛、偏头痛相关疼痛、头痛相关疼痛、肠易激综合征相关疼痛、纤维肌痛相关疼痛、关节炎性疼痛、骨骼疼痛、关节疼痛、胃肠疼痛、肌肉疼痛、心绞痛、面部疼痛、盆腔疼痛、跛行、手术后疼痛、创伤后疼痛、紧张型头痛、产科疼痛、妇科疼痛，或化学疗法诱导的疼痛、伤害感受性疼痛、神经病变性疼痛、异常性疼痛、幻觉疼痛、内脏疼痛、爆发性疼痛、家族性阵发性疼痛综合征、发作性极度疼痛病症、先天性痛觉丧失、与阿片戒断相关的疼痛。神经降压素肽融合物可用于诸如ACTH轴、HPA轴的神经内分泌调控、激素调控和离子通道调控，诸如在包括以下的疾病和病症中：巴特氏综合征(Bartter’s syndrome)、安德森氏综合征(Andersen’s syndrome)、先天性胰岛素过多症、新生儿糖尿病、扩张型心肌病变、阵发性1型共济失调、长QT综合征、短QT综合征、良性新生儿高热惊厥、非综合征性耳聋、长QT综合征、短QT综合征、多囊性肾病、家族性阵发性疼痛综合征、局灶节段性肾小球硬化症、色素性视网膜炎、癫痫、重度肌阵挛性癫痫、长QT综合征、小脑共济失调、红斑性肢痛病、发作性极度疼痛病症、先天性痛觉丧失、良性家族性新生儿癫痫发作、蒂莫西综合征(timothy syndrome)、阵发性2型共济失调、婴儿僵人综合征(stiff baby syndrome)、青少年肌阵挛性癫痫和常染色体显性夜间额叶癫痫。在一些实施方案中，肽构建体(例如肽-NT构建体)与多巴胺信号传导神经元相互作用以减轻疼痛。
在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽可用于治疗和预防各种神经疾病，包括但不限于癫痫、精神分裂症、抑郁、焦虑、双相障碍、发育性脑病症(例如自闭症谱系)，或情绪障碍。
本文所述的经工程改造肽和肽构建体(例如肽缀合物、融合肽，或重组产生的肽构建体)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如通过囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如通过胞吞作用)的转运可在与神经变性相关的许多疾病、疾患或病症中具有影响。可用本文所述的TfR结合肽治疗、预防或诊断的神经变性疾病可包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、弗里德赖希共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩、运动神经元疾病、莱姆病、共济失调-毛细血管扩张、常染色体显性小脑共济失调、巴登病、皮质基底综合征、克罗伊茨费尔特–雅各布病、X染色体脆折相关震颤/共济失调综合征、库福–拉基布综合征、马查多–约瑟夫病、多发性硬化症、慢性创伤性脑病变，或额颞叶痴呆。在一些实施方案中，TfR结合肽可与BACE抑制剂、加兰他敏、金刚烷胺、苯扎托品(benztropine)、比哌立登(biperiden)、溴隐亭、卡比多巴、多奈哌齐(donepezil)、恩他卡朋(entacapone)、左旋多巴、培高利特(pergolie)、普拉克索、丙环定(procyclidine)、利伐斯的明(rivastigmine)、罗匹尼罗、司来吉兰(selegiline)、他克林(tacrine)、托卡朋(tolcapone)或三己芬迪(trihexyphenidyl)组合用于治疗和/或预防神经变性疾病。
在一些实施方案中，使用TfR结合肽和离子通道调节剂诸如Kv1.3钾通道抑制剂缀合物或肽构建体调节(例如抑制)离子通道诸如Kv1.3钾通道可用于治疗或预防脑中的炎症。Kv1.3钾通道例如可在脑中的小神经胶质细胞上高度表达。因此，神经炎症性和神经变性疾病诸如多发性硬化症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、创伤性脑损伤、放射疗法毒性以及其他神经变性和神经炎症性疾病可用缀合于、连接于或融合于Kv1.3抑制剂的TfR结合肽治疗。这些疾病的标志可在于Kv1.3的上调。在一些情况下，Kv1.3抑制可由于它对效应T细胞的作用而用于治疗银屑病和其他非脑自身免疫性疾病。在一些实施方案中，Kv1.3抑制剂肽可为Vm24(SEQ ID NO:378或SEQ ID NO:391，GSAAAISCVGSPECPPKCRAQGCKNGKCMNRKCKCYYC)或ShK-186(SEQ ID NO:379)。Kv1.3抑制剂肽可缀合于本文公开的任何肽(例如SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)。示例性Kv1.3抑制剂肽提供于表4中。
表4–示例性Kv1.3抑制剂肽
Figure BDA0003175003630001381
在一些实施方案中，Kv1.3抑制剂例如Kv1.3肽抑制剂可缀合于本公开的TfR结合肽。示例性Kv1.3抑制剂融合肽提供于表5中。本公开的Kv1.3抑制剂融合肽的对照可包含融合于Kv1.3抑制剂的对照肽(例如SEQ ID NO:380(GSAAAISCVGSPECPPKCRAQGCKNGKCMNRKCKCYYCGGGGSGGGGSRLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGSKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、SEQID NO:382(GSEWSSRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTCGGGGSGGGGSGGGGSKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、SEQ ID NO:383(GSEWSSRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTCKKYKPYVPVTTNKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、SEQ ID NO:386(GSAAAISCVGSPECPPKCRAQGCKNGKCMNRKCKCYYCGGGGSGGGGSGGGGSKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、SEQ ID NO:387(GSAAAISCVGSPECPPKCRAQGCKNGKCMNRKCKCYYCKKYKPYVPVTTNKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、SEQ ID NO:392(AAAISCVGSPECPPKCRAQGCKNGKCMNRKCKCYYCGGGGSGGGGSRLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGSKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、SEQ ID NO:394(EWSSRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTCGGGGSGGGGSGGGGSKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、SEQ IDNO:395(EWSSRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTCKKYKPYVPVTTNKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、SEQ ID NO:398(AAAISCVGSPECPPKCRAQGCKNGKCMNRKCKCYYCGGGGSGGGGSGGGGSKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、以及SEQ ID NO:399(AAAISCVGSPECPPKCRAQGCKNGKCMNRKCKCYYCKKYKPYVPVTTNKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT))。在一些实施方案中，Kv1.3肽抑制剂可包含用于融合或缀合于TfR结合肽的接头。在一些实施方案中，融合于TfR结合肽的Kv1.3肽抑制剂可包含具有SEQ ID NO:390或SEQ ID NO:402的序列的肽。在一些实施方案中，接头可具有SEQ ID NO:103–SEQ ID NO:115或SEQ ID NO:125中的任一者的序列。Kv1.3结合肽(例如SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQID NO:391或SEQ ID NO:402)可缀合于具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者的序列的TfR结合肽。
表5–肽-Kv1.3抑制剂融合物
Figure BDA0003175003630001391
Figure BDA0003175003630001401
在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽可用于治疗和预防克罗恩氏病，或更一般来说，炎症性肠病。在一些情况下，本公开的TfR结合肽显示在肠的可表达高量TfR的腺细胞中的高摄取和保留。
在一些实施方案中，如本文所述的TfR结合肽可用于治疗和/或预防位于CNS中以及CNS外部的癌症，包括但不限于卵巢癌、结肠癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤、以及肺癌、位于骨或骨髓中的癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、以及弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、骨髓细胞癌，或皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤，或CMYC过度表达性癌。
在一些实施方案中，可用于预防和/或治疗癌症的TfR结合肽构建体是包含TfR结合肽和具有抗肿瘤活性的活性剂诸如IL15、融合IL15/IL15Ra、IFNγ和抗CD3剂的那些。此类肽构建体(例如融合肽)的实例是具有以SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332中的任一者阐述的氨基酸序列的那些。在一些实施方案中，本公开的肽构建体可与SEQ ID NO:225–SEQ IDNO:332中的任一者具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。本公开的示例性肽构建体在以下显示于表6中。这些示例性肽构建体可包含分泌鼠Igκ前导序列、抗CD3 scFv、scFv的赖氨酸至精氨酸突变体、短Flag序列、His标签、IL-15Ra、IL-15、IFNγ、本文公开的任何接头、本文公开的任何肽、以及它们的任何片段或衍生物。表6中还显示肽-神经降压素构建体(例如本公开的肽与神经降压素复合的肽构建体)，例如以SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、以及SEQ ID NO:359–SEQ IDNO:361显示的那些。在一些实施方案中，本公开的肽构建体可与SEQ ID NO:33–SEQ ID NO35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、以及SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361中的任一者具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。
表6–示例性肽构建体序列
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示例性肽-神经降压素构建体以SEQ ID NO 33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205、以及SEQ IDNO:359–SEQ ID NO:361阐述。SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202、以及SEQ ID NO:356–SEQID NO:358的肽可还融合于神经降压素。所述肽或肽-NT融合物中的每一者可包括SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:32(或不具有N端GS的SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQID NO:67)的肽，并且其中每一者可还包括表达标签或序列以改善蛋白质表达、分泌和/或纯化，诸如遗传融合表达标签噬铁蛋白(siderocalin)。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽缀合于、连接于或融合于可包括以下的抗癌药物：EGFRvIII抑制剂、科匹特拉(Copiktra)(杜维利布(duvelisib))、安森珂(Erleada)(阿帕鲁胺(apalutamide))、利塔耀(Libtayo)(西米普利单抗(cemiplimab)-rwlc)、劳布瑞纳(Lorbrena)(劳拉替尼(lorlatinib))、鲁莫西提(Lumoxiti)(帕西妥莫单抗(moxetumomab pasudotox)-tdf)、鲁塔拉(Lutathera)(镥Lu 177dotatate)、塔泽纳(Talzenna)(塔佐帕尼(talazoparib))、威滋普(Vizimpro)(达可替尼(dacomitinib))、安列库帕(Aliqopa)(库潘尼西(copanlisib))、阿伦布格(Alunbrig)(布吉替尼(brigatinib))、百稳益(Bavencio)(阿维鲁单抗(avelumab))、百斯珀萨(Besponsa)(奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin))、卡坤斯(Calquence)(阿卡替尼(acalabrutinib))、埃地法(IDHIFA)(恩西地平(enasidenib))、英飞凡(Imfinzi)(度伐鲁单抗(durvalumab))、击癌利(Kisqali)(瑞博西尼(ribociclib))、凯瑞阿(Kymriah)(替沙来塞(tisagenlecleucel))、来林克斯(Nerlynx)(来那替尼(neratinib))、疗德妥(Rydapt)(米哚妥林(midostaurin))、维西欧斯(Vyxeos)(柔红霉素(daunorubicin)和阿糖胞苷(cytarabine))、赛尔美洛(Xermelo)(特罗司他乙酯)、野斯卡他(Yescarta)(阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel))、则乐(Zejula)(尼拉帕尼(niraparib))、癌必定(Cabometyx)(卡博替尼(cabozantinib))、齐求达(Keytruda)(帕博利珠单抗(pembrolizumab))、拉础沃(Lartruvo)(奥拉妥单抗(olaratumab))、乐卫玛(Lenvima)(乐伐替尼(lenvatinib))、欧狄沃(Opdivo)(尼鲁单抗(nivolumab))、瑞布雷卡(Rubraca)(瑞卡帕尼(rucaparib))、萨斯托尔(Sustol)(格拉司琼(granisetron))、辛德罗斯(Syndros)(屈大麻酚(dronabinol)口服溶液)、泰圣奇(Tecentriq)(阿特珠单抗(atezolizumab))、维克勒塔(Venclexta)(维奈托克(venetoclax))、安圣莎(Alecensa)(艾乐替尼(alectinib))、可泰利(Cotellic)(考比替尼(cobimetinib))、兆珂(Darzalex)(达拉妥木单抗(daratumumab))、伊匹利替(Empliciti)(伊罗妥珠单抗(elotuzumab))、法瑞达(Farydak)(帕比司他(panobinostat))、爱博新(Ibrance)(哌柏西利(palbociclib))、伊姆莱基(Imlygic)(塔莫帕维(talimogene laherparepvec))、乐卫玛(乐伐替尼)、朗斯弗(Lonsurf)(三氟胸苷(trifluridine)和替吡嘧啶(tipiracil))、尼拉柔(Ninlaro)(艾沙佐米(ixazomib))、奥多姆左(Odomzo)(索尼得吉(sonidegib))、安能得(Onivyde)(伊立替康脂质体注射液)、珀特拉扎(Portrazza)(奈西木单抗(necitumumab))、泰瑞沙(Tagrisso)(奥希替尼(osimertinib))、尤尼妥辛(Unituxin)(迪努妥昔单抗(dinutuximab))、瓦瑞比(Varubi)(罗拉吡坦(rolapitant))、维斯托加(Vistogard)(三乙酸尿苷(uridinetriacetate))、永德利斯(Yondelis)(曲贝替定(trabectedin))、奥康泽(Akynzeo)(奈妥吡坦(netupitant)和帕洛诺司琼(palonosetron))、倍乐达奇(Beleodaq)(贝利司他(belinostat))、倍林塞妥(Blincyto)(博纳吐单抗(blinatumomab))、赛拉姆扎(Cyramza)(雷莫芦单抗(ramucirumab))、依布维卡(Imbruvica)(依布替尼(ibrutinib))、利普卓(Lynparza)(奥拉帕尼(olaparib))、思得适(Zydelig)(艾代拉里斯(idelalisib))、柴卡迪(Zykadia)(色瑞替尼(ceritinib))、格兹瓦(Gazyva)(奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab))、吉洛曲夫(Gilotrif)(阿法替尼(afatinib))、依布维卡(Imbruvica)(依布替尼(ibrutinib))、赫赛莱(Kadcyla)(ado-曲妥珠单抗埃姆坦辛(ado-trastuzumabemtansine))、麦欣霓(Mekinist)(曲美替尼(trametinib))、泊马莱斯特(Pomalyst)(泊马度胺(pomalidomide))、雷利米德(Revlimid)(来那度胺(lenalidomide))、斯替瓦加(Stivarga)(瑞戈非尼(regorafenib))、塔菲拉(Tafinlar)(达拉菲尼(dabrafenib))、瓦克洛(Valchlor)(二氯甲基二乙胺)凝胶剂、格瓦(Xgeva)(地诺单抗(denosumab))、镭治骨(Xofigo)(二氯化镭Ra 223)、凯素(Abraxane)(用于可注射混悬剂的蛋白质结合型紫杉醇粒子)、癌伏妥(Afinitor)(依维莫司(everolimus))、癌伏妥(依维莫司)、博舒福(Bosulif)(博舒替尼(bosutinib))、考米曲(Cometriq)(卡博替尼(cabozantinib))、爱维德(Erivedge)(维莫德吉(vismodegib))、伊库斯格(Iclusig)(泊那替尼(ponatinib))、英立达(Inlyta)(阿西替尼(axitinib))、凯博斯(Kyprolis)(卡非佐米(carfilzomib))、玛其波(Marqibo)(硫酸长春新碱脂质体注射液)、纽础瓦(Neutroval)(tbo-非格司亭(tbo-filgrastim))、帕杰塔(Perjeta)(培妥珠单抗(pertuzumab))、毕卡妥(Picato)(巨大戟二萜醇甲基丁烯酸酯(ingenol mebutate))凝胶剂、斯替瓦加(Stivarga)(瑞戈非尼(regorafenib))、萨博西斯(Subsys)(芬太尼(fentanyl)舌下喷雾剂)、斯瑞博(Synribo)(麦普琥珀酸奥玛他辛(omacetaxine mepesuccinate))、伏曲特(Votrient)(帕唑帕尼(pazopanib))、安可坦(Xtandi)(恩杂鲁胺(enzalutamide))、扎曲普(Zaltrap)(ziv-阿柏西普(ziv-aflibercept))、阿布斯曲(Abstral)(芬太尼舌下片剂)、安适利(布妥昔单抗维多汀(brentuximab vedotin))、癌伏妥(依维莫司)、欧文纳斯(Erwinaze)(菊欧文氏菌天冬酰胺酶(asparaginase Erwinia chrysanthemi))、拉赞达(Lazanda)(柠檬酸芬太尼(fentanyl citrate))鼻用喷雾剂、舒腾特(Sutent)(苹果酸舒尼替尼(sunitinibmalate))、西拉创(Sylatron)(聚乙二醇干扰素α-2b)、凡德他尼(Vandetanib)(凡德他尼(vandetanib))、泽科里(Xalkori)(克唑替尼(crizotinib))、叶沃(Yervoy)(易普利单抗(ipilimumab))、泽波拉夫(Zelboraf)(威罗菲尼(vemurafenib))、泽珂(Zytiga)(乙酸阿比特龙(abiraterone acetate))、黑文(Halaven)(甲磺酸艾日布林(eribulin mesylate))、赫赛汀(Herceptin)(曲妥珠单抗(trastuzumab))、杰夫塔那(Jevtana)(卡巴他赛(cabazitaxel))、普罗温基(Provenge)(斯普柳赛-T(sipuleucel-T))、格瓦(Xgeva)(地诺单抗(denosumab))、祖普伦兹(Zuplenz)(昂丹司琼口服可溶性膜剂)、癌伏妥(依维莫司)、阿泽那(Arzerra)(奥法木单抗(ofatumumab))、阿伐斯汀(Avastin)(贝伐珠单抗(bevacizumab))、卉妍康(Cervarix)[重组人乳头状瘤病毒二价(16和18型)疫苗]、埃立特(Elitek)(拉布立酶(rasburicase))、弗洛泰(Folotyn)(普拉曲沙(pralatrexate)注射液)、伊索达克斯(Istodax)(罗米地辛(romidepsin))、奥索利斯(Onsolis)(经颊芬太尼)、伏曲特(帕唑帕尼)、地加瑞克(Degarelix)(用于注射液的地加瑞克(degarelix))、福斯勒夫(Fusilev)(左亚叶酸(levoleucovorin))；莫唑比(Mozobil)(普乐沙福(plerixafor)注射液)、贴固守(Sancuso)(格拉司琼)、曲安达(Treanda)(盐酸苯达莫司汀(bendamustinehydrochloride))、伊维斯塔(Evista)(盐酸雷洛昔芬(raloxifene hydrochloride))、癌康定(Hycamtin)(盐酸拓扑替康(topotecan hydrochloride))、西普拉(Ixempra)(伊沙匹隆(ixabepilone))、塔斯格那(Tasigna)(盐酸尼罗替尼单水合物(nilotinib hydrochloridemonohydrate))、托里赛(Torisel)(坦罗莫司(temsirolimus))、泰科布(Tykerb)(拉帕替尼(lapatinib))、加德西(Gardasil)(四价人乳头状瘤病毒(6、11、16、18型)重组疫苗)、斯普瑞赛(Sprycel)(达沙替尼(dasatinib))、舒腾特(Sutent)(舒尼替尼(sunitinib))、维克替比(Vectibix)(帕尼单抗(panitumumab))、阿仑恩(Arranon)(奈拉滨(nelarabine))、尼沙瓦(Nexavar)(索拉非尼(sorafenib))、力比泰(Alimta)(用于注射液的培美曲塞(pemetrexed))、阿伐斯汀(Avastin)(贝伐珠单抗(bevacizumab))；克洛拉(Clolar)(氯法拉滨(clofarabine))、爱必妥(Erbitux)(西妥昔单抗(cetuximab))、森斯帕(Sensipar)(西那卡塞(cinacalcet))、塔西瓦(Tarceva)(埃罗替尼(erlotinib)、OSI 774)、阿乐喜(Aloxi)(帕洛诺司琼(palonosetron))、伊蒙德(Emend)(阿瑞吡坦(aprepitant))、易瑞沙(Iressa)(吉非替尼(gefitinib))；普来纳西(Plenaxis)(用于可注射混悬剂的阿巴瑞克(abarelix))；普雷马林(Premarin)(缀合雌激素)；尤柔夏曲(UroXatral)(盐酸阿夫唑嗪(alfuzosin HCl)延长释放片剂)；维尔科德(Velcade)(硼替佐米(bortezomib))；癌立佳(Eligard)(乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate))；乐沙定(Eloxatin)(奥沙利铂(oxaliplatin)/5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)/甲酰四氢叶酸(leucovorin))；法斯洛德(Faslodex)(氟维司群(fulvestrant))；格列卫(Gleevec)(甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate))；纽拉司塔(Neulasta)；赛瑞福罗(SecreFlo)(分泌素(secretin))；泽瓦林(Zevalin)(替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan))；佐美塔(Zometa)(唑来膦酸(zoledronic acid))；坎帕斯(Campath)；弗隆(Femara)(来曲唑(letrozole))；格列卫(甲磺酸伊马替尼)；凯特瑞(Kytril)(格拉司琼)溶液；曲斯塔LA(Trelstar LA)(双羟萘酸曲普瑞林(triptorelin pamoate))；希罗达(Xeloda)；佐美塔(Zometa)(唑来膦酸(zoledronicacid))；麦罗塔(Mylotarg)(吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin))；曲斯塔(Trelstar)储库(曲普瑞林双羟萘酸盐)；曲森诺(Trisenox)(三氧化二砷)；瓦度(Viadur)(乙酸亮丙瑞林植入物)；阿诺新(Aromasin)片剂；白舒非(Busulflex)；都可喜(Doxil)(盐酸多柔比星(doxorubicin HCl)脂质体注射液)；艾棱斯(Ellence)；伊索(Ethyol)(阿米福汀(amifostine))；替莫达(Temodar)；乌瓦德克斯(UVADEX)无菌溶液；卓弗兰(Zofran)；阿克替奇(Actiq)；安塞米特(Anzemet)；开普拓沙(Camptosar)；健择(Gemzar)(盐酸吉西他滨)；赫赛汀(Herceptin)；Inform HER-2/neu乳腺癌测试剂；纽普金(Neupogen)；洛尔瓦德(Nolvadex)；光卟啉(Photofrin)；普留净(Proleukin)；斯科洛索(Sclerosol)胸膜内气雾剂；瓦尔斯塔(Valstar)；希罗达(Xeloda)；卓弗兰；安塞米特；溴芬酸(Bromfenac)；弗隆(Femara)(来曲唑(letrozole))；格立得(Gliadel)糯米纸囊剂(以聚苯丙生20为载体的卡莫司汀植入物)；甘乐能(Intron A)(重组干扰素α-2b)；凯特瑞(格拉司琼)片剂；利普安(Lupron)储库(用于储库混悬剂的乙酸亮丙瑞林)；米拉鲁玛测试剂；纽米加(Neumega)；奎曲美(Quadramet)(来昔决南钐Sm153(Samarium Sm 153Lexidronam)注射液)；利妥星(Rituxan)；紫杉醇(Taxol)；安西亚(Anexsia)；阿可达(Aredia)(用于注射液的帕米膦酸二钠)；安美达(Arimidex)(阿那曲唑(anastrozole))；开普斯塔(Campostar)；埃利奥特B溶液(Elliotts B Solution)(缓冲鞘内电解质/右旋糖注射液)；优乐辛(Eulexin)(氟他胺(flutamide))；健择(盐酸吉西他滨)；癌康定(Hycamtin)(盐酸拓扑替康)；卡迪亚(Kadian)；柳克因(Leukine)(沙格司亭(sargramostim))；利普安储库(用于储库混悬剂的乙酸亮丙瑞林)；光动力疗法；泰索帝(Taxotere)(多西他赛)；维斯派克(Visipaque)(碘克沙醇(iodixanol))；伊索(阿米福汀)；甘乐能(重组干扰素α-2b)和柳克因(沙格司亭)。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽缀合于、连接于或融合于阿贝西尼(Abemaciclib)、阿卡替尼(Acalabrutinib)、阿法替尼(Afatinib)、艾乐替尼(Alectinib)、阿西替尼(Axitinib)、巴瑞克替尼(Baricitinib)、贝美替尼(Binimetinib)、博舒替尼(Bosutinib)、布吉替尼(Brigatinib)、卡博替尼(Cabozantinib)、色瑞替尼(Ceritinib)、考比替尼(Cobimetinib)、克唑替尼(Crizotinib)、达拉菲尼(Dabrafenib)、达可替尼(dacomitinib)、达沙替尼(Dasatinib)、恩科菲尼(encorafenib)、埃罗替尼(Erlotinib)、依维莫司(Everolimus)、福他替尼(Fostamatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、依布替尼(Ibrutinib)、伊马替尼(Imatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、乐伐替尼(Lenvatinib)、劳拉替尼(Lorlatinib)、米哚妥林(Midostaurin)、来那替尼(Neratinib)、尼罗替尼(Nilotinib)、尼达尼布(Nintedanib)、奥希替尼(Osimertinib)、哌柏西利(Palbociclib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、泊那替尼(Ponatinib)、瑞戈非尼(Regorafenib)、瑞博西尼(Ribociclib)、鲁索利替尼(Ruxolitinib)、西罗莫司(Sirolimus)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、坦罗莫司(Temsirolimus)、托法替尼(Tofacitinib)、曲美替尼(Trametinib)、凡德他尼(Vandetanib)、威罗菲尼(Vemurafenib)、IL15、融合IL15/IL15Ra、IFNγ和抗CD3剂，或它们的一种或多种片段。
在一些实施方案中，如本文所述的TfR结合肽可用于治疗和/或预防感染，包括中枢神经系统的感染。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽缀合于、连接于或融合于抗感染剂。抗感染剂可包括抗生素、抗病毒剂和抗真菌剂。可使用的抗感染剂包括青蒿素(artemisinin)、阿姆可洛(Aemcolo)(利福霉素(rifamycin))、必妥维(Biktarvy)(比特拉韦(bictegravir)/恩曲他滨(emtricitabine)/替诺福韦艾拉酚胺(tenofoviralafenamide))、努兹拉(Nuzyra)(奥马环素(omadacycline))、特罗格佐(Trogarzo)(伊巴珠单抗-uiyk(ibalizumab-uiyk))、纾伏效(Xofluza)(巴洛沙韦玛波西酯(baloxavirmarboxil))、巴德拉(Baxdela)(德拉沙星(delafloxacin))片剂和注射液、苄硝唑(Benznidazole)、加普瑞扎(Giapreza)(血管紧张素II)、海普利萨-B(Heplisav-B)[佐剂化乙型肝炎疫苗(重组)]、尤卢卡(Juluca)(度鲁特韦(dolutegravir)和利匹韦林(rilpivirine))、卡德拉布(KedRab)[狂犬病免疫球蛋白(人)]、艾诺全(Mavyret)(格卡瑞韦(glecaprevir)和哌仑他韦(pibrentasvir))、灭巨斯(Prevymis)(莱特莫韦(letermovir))、欣安立适(Shingrix)(佐剂化重组带状疱疹疫苗)、索罗塞克(Solosec)(塞尼达唑(secnidazole))、瓦博美罗(Vabomere)(美罗培南(meropenem)和瓦博巴坦(vaborbactam))、施匹(Xepi)(奥泽沙星(ozenoxacin))、安蒂姆(Anthim)(奥比妥昔单抗(obiltoxaximab))、达可挥(Descovy)(恩曲他滨和替诺福韦艾拉酚胺)、丙通沙(Epclusa)(索非布韦(sofosbuvir)和维帕他韦(velpatasvir))、安以斯(Odefsey)(恩曲他滨(emtricitabine)、利匹韦林(rilpivirine)和替诺福韦艾拉酚胺)、威斯霍拉(Vaxchora)(口服活霍乱菌苗)、韦立得(Vemlidy)(替诺福韦艾拉酚胺)、贺肝乐(Zepatier)(依巴司韦(elbasvir)和格佐普韦(grazoprevir))、泽普拉瓦(Zinplava)(贝洛托单抗(bezlotoxumab))、阿维卡兹(Avycaz)(头孢他啶-阿维巴坦(ceftazidime-avibactam))、贝斯洛(Bexsero)(B群脑膜炎球菌疫苗(Meningococcal Group B Vaccine))、驱霉霸(Cresemba)(硫酸艾沙康唑(isavuconazonium sulfate))、坦克干(Daklinza)(达卡他韦(daclatasvir))、伊沃塔兹(Evotaz)(阿扎那韦(atazanavir)和可比司他(cobicistat))、复立达(Fluad)(三价流感疫苗)、捷扶康(Genvoya)(埃替格韦(elvitegravir)、可比司他(cobicistat)、恩曲他滨(emtricitabine)和替诺福韦艾拉酚胺)、普泽力(Prezcobix)(达芦那韦(darunavir)和可比司他(cobicistat))、特尼威(Technivie)(翁比他韦(ombitasvir)、帕利瑞韦(paritaprevir)和利托那韦(ritonavir))、达万斯(Dalvance)(达巴万星(dalbavancin))、夏奉宁(Harvoni)(雷迪帕韦(ledipasvir)和索非布韦(sofosbuvir))、因帕维多(Impavido)(米替福新(miltefosine))、科瑞定(Kerydin)(他伐硼罗(tavaborole))、奥巴替维(Orbactiv)(奥利万星(oritavancin))、瑞匹瓦布(Rapivab)(帕拉米韦注射液)、赛威乐(Sivextro)(磷酸特地唑胺(tedizolid phosphate))、三恩美(Triumeq)(阿巴卡韦(abacavir)、度鲁特韦(dolutegravir)和拉米夫定(lamivudine))、诺倍适(Zerbaxa)(头孢特咯瓒(ceftolozane)+他佐巴坦(tazobactam))、副鲁布罗(Flublok)(季节性流感疫苗)、1％卢祖(Luzu)(卢立康唑(luliconazole))乳膏剂、奥利西奥(Olysio)(司美匹韦(simeprevir))、斯塔威格(Sitavig)(阿昔洛韦(acyclovir))经颊片剂、索华迪(Sovaldi)(索非布韦(sofosbuvir))、瓦瑞奇格(VariZIG)水痘带状疱疹免疫球蛋白(人)、阿布萨拉(Abthrax)(瑞西巴库单抗(raxibacumab))、癌伏妥(依维莫司)、西斯创(Cystaran)(盐酸半胱胺(cysteamine hydrochloride))、鼻适畅(Dymista)(盐酸氮卓斯汀(azelastine hydrochloride)和丙酸氟替卡松(fluticasone propionate))、辅流威适(Flucelvax)流感病毒疫苗、爱睫锐(Jetrea)(奥克纤溶酶(ocriplasmin))、令泽舒(Linzess)(利那洛肽(linaclotide))、米特斯(Mytesi)(克非乐莫(crofelemer))、斯耐瑞(Sirturo)(贝达喹啉(bedaquiline))、斯可赖斯(Sklice)(伊维菌素(ivermectin))洗剂、斯曲比德(Stribild)(埃替格韦(elvitegravir)、可比司他(cobicistat)、恩曲他滨(emtricitabine)、反丁烯二酸替诺福韦二吡呋酯(tenofovir disoproxil fumarate))、图朵普萨(Tudorza Pressair)(阿地溴铵(aclidinium bromide)吸入粉剂)、癌伏妥(依维莫司)、考普勒拉(Complera)(恩曲他滨(emtricitabine)/利匹韦林(rilpivirine)/反丁烯二酸替诺福韦二吡呋酯)、鼎腹欣(Dificid)(非达霉素(fidaxomicin))、恩临(Edurant)(利匹韦林(rilpivirine))、艾利亚(Eylea)(阿柏西普(aflibercept))、菲拉泽(Firazyr)(艾替班特(icatibant))、格拉里舍(Gralise)(加巴喷丁(gabapentin))、因丝维克(Incivek)(特拉瑞韦(telaprevir))、维取力(Victrelis)(波普瑞韦(boceprevir))、埃瑞福塔(Egrifta)(用于注射液的替莫瑞林(tesamorelin))、脑宁安(Menveo)(脑膜炎疫苗)、泽玛西地(Zymaxid)(加替沙星(gatifloxacin)眼用溶液)、癌伏妥(依维莫司)、博普瑞乌(Bepreve)(苯磺酸贝托司汀(bepotastine besilate)眼用溶液)、贺新立适(Hiberix)(b型嗜血杆菌缀合疫苗，破伤风类毒素缀合物)、维巴替维(Vibativ)(特拉万星(telavancin))、捷伏滋(Aptivus)(替拉那韦(tipranavir))、阿斯特普(Astepro)(盐酸氮卓斯汀鼻用喷雾剂)、英特莱(Intelence)(依曲韦林(etravirine))、帕塔雷斯(Patanase)(盐酸奥洛他定(olopatadine hydrochloride))、韦瑞德(Viread)(反丁烯二酸替诺福韦二吡呋酯)、艾生特(Isentress)(拉替拉韦(raltegravir))、赛泽屈(Selzentry)(马拉维诺(maraviroc))、维拉米斯特(Veramyst)(糠酸氟替卡松(fluticasone furoate))、西泽尔(Xyzal)(二盐酸左西替利嗪(levocetirizine dihydrochloride))、助霉飞(Eraxis)(阿尼芬净(anidulafungin))、诺科飞(Noxafil)(泊沙康唑(posaconazole))、普利他(Prezista)(达芦那韦(darunavir))、泰泽卡(Tyzeka)(替比夫定(telbivudine))、酚瑞净(Veregen)(库勒卡晴(kunecatechins))、捷伏滋(替拉那韦)、贝乐克(Baraclude)(恩替卡韦(entecavir))、副鲁米斯特(FluMist)(流感病毒疫苗)、夫赞(Fuzeon)(恩夫韦地(enfuvirtide))、列克西瓦(Lexiva)(福沙那韦钙(fosamprenavir calcium))、瑞塔滋(Reyataz)(硫酸阿扎那韦(atazanavir sulfate))、保妥适美容剂(Botox Cosmetic)(A型肉毒杆菌毒素(botulinumtoxin type A))、克拉里勒(Clarinex)、干适能(Hepsera)(阿德福韦二匹伏酯(adefovirdipivoxil))、彼迪瑞斯(Pediarix)疫苗、珮格西施(Pegasys)(聚乙二醇干扰素α-2a)、萨斯迪瓦(Sustiva)、威凡(Vfend)(伏立康唑(voriconazole))、派乐能(Peg-Intron)(聚乙二醇干扰素α-2b)、瑞比达(Rebetol)(利巴韦林(ribavirin))、斯派崔舍(Spectracef)、塔维斯特(Tavist)(反丁烯二酸氯马斯汀(clemastine fumarate))、双福立适(Twinrix)、万赛维(Valcyte)(盐酸缬更昔洛韦(valganciclovir HCl))、韦瑞德(反丁烯二酸替诺福韦二吡呋酯)、除栓素(Xigris)(阿法多曲考津(drotrecogin alfa)[活化])、阿布雷瓦(ABREVA)(二十二醇(docosanol))、USP头孢唑啉(Cefazolin)和右旋糖、儿童用美林感冒药(Children'sMotrin Cold)、雷贝特龙(REBETRON)(TM)组合疗法、辛那基斯(Synagis)、威匹提克(Viroptic)、艾达乐(Aldara)(咪喹莫特(imiquimod))、新菌灵(Ceftin)(头孢呋辛乙酰氧乙酯(cefuroxime axetil))、可比韦(Combivir)、泛维尔(Famvir)(泛昔洛韦(famciclovir))、耳用福洛辛(Floxin otic)、复得维(Fortovase)、干复津(INFERGEN)(复合干扰素α-1(interferon alfacon-1))、甘乐能(重组干扰素α-2b)、紫杉醇、特美汀(Timentin)、特洛芬(Trovan)、维拉赛特(VIRACEPT)(甲磺酸奈非那韦(nelfinavirmesylate))、赛瑞特(Zerit)(司他夫定)、AK-Con-A(眼用萘唑啉(naphazolineophthalmic))、阿莱格拉(Allegra)(盐酸非索非那定(fexofenadine hydrochloride))、爱喘乐(Atrovent)(异丙托溴铵(ipratropium bromide))、奥格门汀(Augmentin)(阿莫西林(amoxicillin)/克拉维酸盐(clavulanate))、佳息患(Crixivan)(硫酸印地那韦(Indinavir sulfate))、爱泌罗(Elmiron)(戊聚糖多硫酸钠(pentosan polysulfatesodium))、贺福立适(Havrix)、埃布洛克(IvyBlock)、柳克因(沙格司亭)、静脉内美雷姆(Merrem I.V.)(美罗培南(meropenem))、塔维斯特(Tavist)(反丁烯二酸氯马斯汀(clemastine fumarate))、惠妥滋(Videx)(地达诺新(didanosine))、维乐命(Viramune)(奈韦拉平(nevirapine))、希舒美(Zithromax)(阿奇霉素(azithromycin))、先力腾(Cedax)(头孢布坦(ceftibuten))、克拉霉素(Clarithromycin)(比奥新(Biaxin))、益平维(Epivir)(拉米夫定(lamivudine))、因服雷(Invirase)(沙奎那韦(saquinavir))、袪疹易(Valtrex)(盐酸伐昔洛韦(valacyclovir HCl))、赛瑞特(司他夫定)、泽泰克(Zyrtec)(盐酸西替利嗪(cetirizine HCl))，或它们的功能性片段。
在一些实施方案中，如本文所述的TfR结合肽可用于治疗和/或预防炎症，包括中枢神经系统和胃肠(GI)道的炎症。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽缀合于、连接于或融合于抗炎剂。抗炎剂可包括类固醇和非类固醇抗炎剂。非类固醇抗炎剂可包括阿司匹林、塞来昔布、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、吡罗昔康、双水杨酯、舒林酸、托美丁、吡罗昔康、氟比洛芬和非诺洛芬，可与本文公开的方法和组合物组合使用的抗炎药物可包括皮质类固醇和氨基水杨酸，包括但不限于美色拉嗪、巴柳氮和奥沙拉秦，在各种情况下，抗炎药物包括肿瘤坏死因子(TNF)-α抑制剂，诸如英夫利西单抗、阿达木单抗和戈利木单抗，以及靶向其他生物靶标的生物药物(例如抗体、其片段或衍生物)，包括那他珠单抗、维多珠单抗和乌司奴单抗。
相较于抗体-药物缀合物(例如安适利、赫赛莱、麦罗塔)或转铁蛋白，在一些方面，缀合于、连接于或融合于如本文所述的活性剂的肽可由于它的较小尺寸而展现对实体肿瘤或CNS的更好穿透。在某些方面，相较于抗体-药物缀合物，缀合于、连接于或融合于如本文所述的活性剂的肽可携带不同或更高剂量的活性剂。在一些实施方案中，相较于抗体-药物缀合物，缀合于、连接于或融合于如本文所述的活性剂的如所描述的肽可将更高剂量的活性剂递送至骨骼肌组织。因此，使用本公开的肽治疗肌营养不良、SBMA或肌肉源性肉瘤可受到特别关注。在一些方面，相较于抗体或抗体-药物缀合物，如本文所述的TfR结合肽可展现显著更低的血浆半衰期，因此，可允许更快速外周清除(例如在使用经放射性标记缀合物时可为有利的，从而提供显著较低的器官剂量)。在其他方面，相较于抗体-药物缀合物，缀合于、连接于或融合于如本文所述的活性剂的肽可具有确定药物比率的更好位点特异性递送。在其他方面，肽可经受在有机溶剂(除水之外)中的溶剂化，此可允许采用更多的用于药物(其经常具有低水溶性)的溶剂化和缀合的合成路线以及达成较高缀合产率，缀合于、连接于或融合于肽的药物的较高比率(相对于抗体)，并且/或者降低在缀合期间的聚集物/高分子量物质形成。另外，一个或多个独特氨基酸残基可通过否则不存在于短序列中的残基或通过包括非天然氨基酸来引入至肽中，从而允许位点特异性缀合于肽。
本公开的肽或肽构建体还可缀合于、连接于或融合于可起其他作用的其他部分，所述其他作用诸如是提供用于从组织或流体回收肽的亲和柄(例如生物素)。举例来说，本公开的肽或肽构建体还可缀合于、连接于或融合于生物素。除延长半衰期之外，生物素还可作为亲和柄来起从组织或其他位置回收肽或肽构建体的作用。在一些实施方案中，可使用可充当可检测标记与亲和柄两者的荧光生物素缀合物。可商购获得的荧光生物素缀合物的非限制性实例可包括Atto 425-生物素、Atto 488-生物素、Atto 520-生物素、Atto-550生物素、Atto 565-生物素、Atto 590-生物素、Atto 610-生物素、Atto 620-生物素、Atto655-生物素、Atto 680-生物素、Atto 700-生物素、Atto 725-生物素、Atto 740-生物素、荧光素生物素、生物素-4-荧光素、生物素-(5-荧光素)缀合物、以及生物素-B-藻红蛋白、Alexa fluor 488生物胞素、Alexa flour 546、Alexa Fluor 549、荧光黄尸胺生物素-X、荧光黄生物胞素、俄勒冈绿488生物胞素、生物素-罗丹明和四甲基罗丹明生物胞素。在一些其他实例中，缀合物可包括化学发光化合物、胶体金属、发光化合物、酶、放射性同位素和顺磁性标记。在一些实施方案中，本文所述的肽还可连接于另一分子。举例来说，肽序列还可连接于另一活性剂(例如小分子、肽、多肽、多核苷酸、抗体、适体、细胞因子、生长因子、神经递质、任何先前剂的活性片段或修饰形式、荧光团、放射性同位素、放射性核素螯合剂、酰基加合物、化学接头，或糖)。在一些实施方案中，肽可缀合于、连接于活性剂，或与活性剂融合，或共价或非共价连接于活性剂。
在一些实施方案中，本公开的肽或肽构建体还可缀合于、连接于或融合于其他亲和柄。其他亲和柄可包括遗传融合亲和柄。遗传融合亲和柄可包括6xHis(HHHHHH(SEQ IDNO:345)；在固定化金属亲和柱纯化的情况下是可能的)、FLAG(DYKDDDDK(SEQ ID NO:346)；抗FLAG免疫沉淀)、“短”FLAG(DYKDE(SEQ ID NO:347)；抗FLAG免疫沉淀)、血凝素(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:348)；抗HA免疫沉淀)以及链霉亲和素结合肽(DVEAWLGAR(SEQ IDNO:349)；链霉亲和素介导的沉淀)。在一些实施方案中，本公开的肽或肽构建体还可缀合于、连接于或融合于表达标签或序列以改善蛋白质表达和/或纯化。此类表达标签可包括遗传融合表达标签。遗传融合表达标签可包括噬铁蛋白(SEQ ID NO:351，METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYKDEHHHHHHGGSQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDGGGSENLYFQ)。示例性噬铁蛋白肽融合物包括融合于噬铁蛋白的人可溶性转铁蛋白(METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYKDEHHHHHHGGSQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDGGGSENLYFQGSRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTSTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEFGGGSHHHHHHGGGSLNDIFEAQKIEWHE；SEQ ID NO:352)以及融合于噬铁蛋白的本公开的各种肽，诸如METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYKDEHHHHHHGGSQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDGGGSENLYFQGSREGCASRCTKYNAELEKCEARVSSMSNTEETCVQELFDLLHCVDHCVSQ)(SEQ ID NO:356)、METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYKDEHHHHHHGGSQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDGGGSENLYFQGSREGCASRCTKYNAELEKCEARVMSMSNTEEDCEQELEDLLHCLDHCHSQ(SEQ ID NO:357)、以及(METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYKDEHHHHHHGGSQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDGGGSENLYFQGSREGCASRCMKYNDELEKCEARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:358)。值得注意的是，CDP-NT肽构建体可被表达来具有N端噬铁蛋白(例如SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361)。
在一些实施方案中，本公开的肽或肽构建体还可缀合于、连接于或融合于可起其他作用的其他部分，所述其他作用诸如是提供用于将非缀合治疗剂募集至所靶向的组织诸如肿瘤或募集至所述组织中的亲和柄(例如生物素)。在一些情况下，治疗剂是小分子、肽、抗体，或细胞治疗剂(例如CAR T细胞或另一自体或同种异体经工程改造细胞)。举例来说，被工程改造来具有亲和标记(例如亲和素)的CAR T细胞可被募集至由包含生物素部分的TfR结合肽靶向的组织。此外，如本文所述的生物素-(或其他亲和标记化)-TfR结合肽可与可在TfR结合肽靶向或在其中积累的脑、肿瘤或其他组织中提供药理活性的多种不同亲和素标签化药物一起施用(例如共同施用)，所述药物诸如是小分子、肽或蛋白质。
另外，超过一个源于毒素或打结毒液蛋白质的肽序列可存在于特定肽上，缀合于、连接于特定肽，或与特定肽融合。肽可通过各种技术来并入至生物分子中。肽可通过化学转化(诸如形成共价键诸如酰胺键)来并入。肽可例如通过固相或溶液相肽合成来并入。肽可通过制备编码生物分子的核酸序列来并入，其中所述核酸序列包括编码所述肽的子序列。子序列可外加于编码生物分子的序列，或可取代编码生物分子的序列的子序列。
可检测剂肽缀合物
肽可缀合于、连接于或融合于用于成像、研究、治疗法、治疗诊断法、药物、化学疗法、螯合疗法、靶向药物递送以及放射疗法中的剂。在一些实施方案中，肽缀合于、连接于可检测剂，或与可检测剂融合，所述可检测剂诸如是荧光团、近红外染料、造影剂、纳米颗粒、含有金属的纳米颗粒、金属螯合物、X射线造影剂、PET剂、金属、放射性同位素、染料、放射性核素螯合剂，或可用于成像的另一适合物质。
在一些实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个可检测剂可连接于肽。放射性同位素的非限制性实例包括α发射体、β发射体、正电子发射体和γ发射体。在一些实施方案中，金属或放射性同位素选自由以下组成的组：锕、镅、铋、镉、铯、钴、铕、钆、铱、铅、镥、锰、钯、钋、镭、钌、钐、锶、锝、铊和钇。在一些实施方案中，金属是锕、铋、铅、镭、锶、钐或钇。在一些实施方案中，放射性同位素是锕-225或铅-212。在一些实施方案中，近红外染料不易于由生物组织和流体淬灭。在一些实施方案中，荧光团是在650nm与4000nm之间的波长下发射电磁辐射的荧光剂，此类发射用于检测此剂。可用作本公开中的缀合分子的荧光染料的非限制性实例包括DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680、Cy5.5，或吲哚菁绿(ICG)。在一些实施方案中，近红外染料经常包括花青染料(例如Cy7、Cy5.5和Cy5)。用作本公开中的缀合分子的荧光染料的额外非限制性实例包括吖啶橙或吖啶黄、Alexa Fluor(例如Alexa Fluor 790、750、700、680、660和647)及其任何衍生物、7-放线菌素D、8-苯胺基萘-1-磺酸、ATTO染料及其任何衍生物、金胺-罗丹明染色剂及其任何衍生物、苯并蒽酮(bensantrhone)、毕玛恩(bimane)、9-10-双(苯基乙炔基)蒽、5,12–双(苯基乙炔基)并四苯、双苯酰亚胺、脑彩虹、钙黄绿素、羧基荧光素及其任何衍生物、1-氯-9,10-双(苯基乙炔基)蒽及其任何衍生物、DAPI、DiOC6、DyLight Fluor及其任何衍生物、黑附球菌酮(epicocconone)、溴化乙锭、FlAsH-EDT2、Fluo染料及其任何衍生物、FluoProbe及其任何衍生物、荧光素及其任何衍生物、Fura及其任何衍生物、GelGreen及其任何衍生物、GelRed及其任何衍生物、荧光蛋白及其任何衍生物、m亚型蛋白质及其任何衍生物诸如像mCherry、七甲川染料及其任何衍生物、赫斯特(hoeschst)染色剂、亚氨基香豆素(iminocoumarin)、印度黄(indian yellow)、indo-1及其任何衍生物、劳丹(laurdan)、荧光黄及其任何衍生物、荧光素及其任何衍生物、荧光素酶及其任何衍生物、部花青(mercocyanine)及其任何衍生物、尼罗染料及其任何衍生物、苝、焰红染料、藻染料及其任何衍生物、碘化丙锭(propium iodide)、羟基芘磺酸(pyranine)、罗丹明及其任何衍生物、瑞博绿(ribogreen)、RoGFP、红荧烯、均二苯乙烯及其任何其衍生物、磺酰罗丹明及其任何衍生物、SYBR及其任何衍生物、synapto-pHluorin、四苯基丁二烯、三四钠(tetrasodiumtris)、德克萨斯红(Texas Red)、钛黄(Titan Yellow)、TSQ、伞形酮、蒽酮紫、黄色荧光蛋白以及YOYO-1。其他适合荧光染料包括但不限于荧光素和荧光素染料(例如异硫氰酸荧光素或FITC、萘并荧光素、4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM等)、羰花青、部花青、苯乙烯基染料、氧杂菁染料、藻红蛋白、赤藓红、伊红、罗丹明染料(例如羧基四甲基-罗丹明或TAMRA、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、丽丝胺罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明(TMR)等)、香豆素和香豆素染料(例如甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨基甲基香豆素(AMCA)等)、俄勒冈绿染料(例如俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514等)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、光谱红(SPECTRUM RED)、光谱绿(SPECTRUM GREEN)、花青染料(例如CY-3、Cy-5、CY-3.5、CY-5.5等)、ALEXA FLUOR染料(例如ALEXA FLUOR 350、ALEXA FLUOR 488、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、ALEXA FLUOR568、ALEXA FLUOR 594、ALEXA FLUOR 633、ALEXA FLUOR 660、ALEXA FLUOR 680等)、BODIPY染料(例如BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665等)、IRDye(例如IRD40、IRD 700、IRD 800等)等。额外适合可检测剂描述于PCT/US14/56177中。放射性同位素的非限制性实例包括α发射体、β发射体、正电子发射体和γ发射体。在一些实施方案中，金属或放射性同位素选自由以下组成的组：锕、镅、铋、镉、铯、钴、铕、钆、铱、铅、镥、锰、钯、钋、镭、钌、钐、锶、锝、铊和钇。在一些实施方案中，金属是锕、铋、铅、镭、锶、钐或钇。在一些实施方案中，放射性同位素是锕-225或铅-212。另外，以下放射性核素可用于诊断和/或治疗：碳(例如11C或14C)、氮(例如13N)、氟(例如18F)、镓(例如67Ga或68Ga)、铜(例如64Cu或67Cu)、锆(例如89Zr)、镥(例如177Lu)。
肽可缀合于、连接于或融合于放射致敏剂或光敏剂。放射致敏剂的实例包括但不限于：ABT-263、ABT-199、WEHI-539、紫杉醇、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、依他硝唑(etanidazole)、迷索硝唑(misonidazole)、替拉扎明(tirapazamine)以及核酸碱基衍生物(例如卤化嘌呤或嘧啶，诸如5-氟脱氧尿苷)。光敏剂的实例可包括但不限于：在被照射时产生热的荧光分子或珠粒、纳米颗粒、卟啉和卟啉衍生物(例如绿素(chlorin)、菌绿素(bacteriochlorin)、异菌绿素(isobacteriochlorin)、酞菁(phthalocyanine)和萘酞菁(naphthalocyanine))、金属卟啉、金属酞菁、白芷素(angelicin)、硫属元素吡喃鎓染料(chalcogenapyrrillium dye)、叶绿素、香豆素、黄素和相关化合物诸如咯嗪(alloxazine)和核黄素(riboflavin)、富勒烯、脱镁叶绿酸(pheophorbide)、焦脱镁叶绿酸(pyropheophorbide)、花青(例如部花青540)、脱镁叶绿素、噻啉(Sapphyrin)、得克萨卟啉(texaphyrin)、红紫素、卟啉烯(porphycene)、吩噻嗪鎓、亚甲蓝衍生物、萘二甲酰亚胺(naphthalimide)、尼罗蓝衍生物、醌、苝醌(例如金丝桃素(hypericin)、竹红菌素(hypocrellin)和尾孢菌素(cercosporin))、补骨脂素(psoralen)、醌、类视黄醇、罗丹明、噻吩、瓦尔丁(verdin)、呫吨染料(例如伊红、赤藓红、孟加拉玫瑰红(rose bengal))、卟啉的二聚和寡聚形式、以及前药诸如5-氨基乙酰丙酸。有利地，这个方法可允许并行使用治疗剂(例如药物)与电磁能量(例如辐射或光)两者来高度特异性靶向患病细胞(例如癌细胞)。在一些实施方案中，肽缀合于、连接于剂，与剂融合，或共价或非共价连接于剂，例如直接或通过接头。适于与本文实施方案一起使用的示例性接头在以下更详细讨论。
在本公开的一些方面，使用螯合剂使放射性核素连接于如本文所述的肽或肽构建体。示例性螯合剂部分可包括2,2′,2″-(3-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23-七氧杂-2-氮杂二十五烷-25-基)硫脲基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2′,2″-(3-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十一氧杂-2-氮杂三十七烷-37-基)硫脲基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2′-(7-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十一氧杂-2-氮杂三十七烷-37-基)硫脲基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸；2,2′,2″-(3-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)-3,7-二氧代-11,14,17,20,23,26,29-七氧杂-2,8-二氮杂三十一烷-31-基)硫脲基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2′,2″-(3-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)-3,7-二氧代-11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十一氧杂-2,8-二氮杂四十三烷-43-基)硫脲基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2′,2″-(3-(4-(3-(25,28-二氧代-28-((6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)-3,6,9,12,15,18,21-七氧杂-24-氮杂二十八基)硫脲基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2′,2″-(3-(4-(3-(37,40-二氧代-40-((6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十基)硫脲基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2′,2″-(3-(4-(1-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24-七氧杂-2-氮杂二十七烷-27-酰胺基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2′,2″-(2-(4-(1-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯氧基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂三十六烷-36-酰胺基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基)三乙酸；2,2′,2″-(3-(4-(3-(5-氨基-6-((4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯甲基)氨基)-6-氧代己基)硫脲基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2′-(7-(4-(3-(5-氨基-6-((4-6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯甲基)氨基)-6-氧代己基)硫脲基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸；2,2′,2″-(3-(4-(3-(5-氨基-6-((5-氨基-6-((4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯甲基)氨基)-6-氧代己基)氨基)-6-氧代己基)硫脲基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；以及2,2′,2″-(3-(4-(3-(5-氨基-6-((5-氨基-6-((5-氨基-6-((4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯甲基)氨基)-6-氧代己基)氨基)-6-氧代己基)氨基)-6-氧代己基)硫脲基)苯甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸。
接头
本公开的肽可通过接头，或在不存在接头下直接来连接于运载物分子(例如治疗活性剂或可检测剂)，诸如小分子、另一肽、蛋白质、抗体、抗体片段、适体、多肽、多核苷酸、荧光团、放射性同位素、放射性核素螯合剂、聚合物、生物聚合物、脂肪酸、酰基加合物、化学接头，或糖或本文所述的其他活性剂或可检测剂。在不存在接头的情况下，运载物分子直接缀合、连接或融合于肽的N端和/或C端。在其中存在接头的情况下，所述接头可为可切割的，或使用稳定接头。可切割接头可用于体内递送运载物分子，因为在进入组织、细胞、内体或核后，接头可被切割。稳定接头可用于递送在缀合时具有活性或诸如通过分解代谢而被降解的运载物分子。如本文所述，接头还可用于使TfR结合肽共价连接于具有单独功能的另一运载物部分，所述功能诸如是靶向、细胞毒性、治疗、归巢、成像或诊断功能。
在一些实施方案中，运载物分子可缀合于、连接于或融合于肽的N端和/或C端以创建活性剂或可检测剂肽构建体。在一些实施方案中，TfR靶向肽可通过接头来连接在另一功能性肽或蛋白质的N端、内部赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸残基，或C端。在一些实施方案中，肽可通过侧链来连接于另一功能性肽或蛋白质，所述侧链诸如是赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、非天然氨基酸残基或谷氨酸残基的侧链。如本文所用，分子可通过酰胺键、酯键、醚键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、碳-氮键、三唑、大环、肟键、硫酯键、硫醚键、腙键、偶氮键、碳-碳单键、碳-碳双键或碳-碳三键、二硫键、两个半胱氨酸之间的二碳桥、两个半胱氨酸之间的三碳桥，或硫醚键来彼此连接、附着或融合。在一些实施方案中，肽包含一个或多个非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸可为插入物、附加物，或对另一氨基酸的取代物。在一些实施方案中，一种或多种所公开肽自身的类似区域(诸如氨基酸序列的末端、氨基酸侧链，诸如赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、非天然氨基酸残基或谷氨酸残基的侧链，通过酰胺键、酯键、醚键、氨基甲酸酯键、碳-氮键、三唑、大环、肟键、腙键、碳-碳单键、碳-碳双键或碳-碳三键、二硫键、硫醚键，或如本文所述的其他接头)可用于连接其他分子。在一些实施方案中，肽连接于较大多肽或肽分子的氨基酸序列的末端，或连接于侧链，诸如赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、非天然氨基酸残基或谷氨酸残基的侧链。
通过接头来进行的连接可涉及在其他分子(例如活性剂和/或可检测剂)与肽之间并入接头部分。肽与其他分子可均共价连接于接头。接头可为可切割的，稳定的，自我分解性的，亲水性的，或疏水性的。接头可具有在空间上限制酶、水或其他化学物质到达连接基团的大侧基或侧链。接头可具有至少两个官能团，一个键合于其他分子，并且一个键合于肽，以及在两个官能团之间的连接部分。一些实例接头描述于Jain,N.,Pharm Res.32(11):3526–40(2015)，Doronina,S.O.,Bioconj Chem.19(10):1960–3(2008)，Pillow,T.H.,JMed Chem.57(19):7890–9(2014)，Dorywalksa,M.,Bioconj Chem.26(4):650–9(2015)，Kellogg,B.A.,Bioconj Chem.22(4):717–27(2011)，以及Zhao,R.Y.,J Med Chem.54(10):3606–23(2011)中。
用于连接的官能团的非限制性实例可包括能够形成例如酰胺键、酯键、醚键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、碳-氮键、三唑、大环、肟键、腙键、碳-碳单键、碳-碳双键或碳-碳三键、二硫键或硫醚键的官能团。能够形成此类键的官能团的非限制性实例可包括氨基；羧基；羟基；醛基团；叠氮基团；炔和烯基团；酮；酰肼；肼；酰卤诸如酰氟、酰氯、酰溴和酰碘；酸酐，包括对称、混合和环状酐；碳酸酯；键合于离去基团诸如氰基、丁二酰亚胺基和N-羟基丁二酰亚胺基的羰基官能基；顺丁烯二酰亚胺；含有被设计来进行水解的顺丁烯二酰亚胺基团的接头；顺丁烯二酰亚胺基己酰基；MCC([N-顺丁烯二酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸酯)；N-乙基顺丁烯二酰亚胺；顺丁烯二酰亚胺烷烃；mc-vc-PABC；DUBA(倍癌霉素羟基苯甲酰胺-氮杂吲哚接头)；SMCC 4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸丁二酰亚胺酯；SPDP(3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二酰亚胺酯)；SPDB 4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-丁二酰亚胺酯；磺基-SPDB 4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸N-丁二酰亚胺酯；SPP 4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-丁二酰亚胺酯；二硫吡啶基顺丁烯二酰亚胺(DTM)；羟胺、乙烯基-卤基；卤基乙酰胺基；溴乙酰胺基；羟基；氢硫基；以及具有例如烷基、烯基、炔基、烯丙基或苯甲基离去基团的分子，诸如卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、环氧化物、磷酸酯、硫酸酯和苯磺酸酯。
连接部分的非限制性实例可包括亚烷基、亚烯基、亚炔基、聚醚诸如聚乙二醇(PEG)、羟基羧酸、聚酯、聚酰胺、聚氨基酸、多肽、可切割肽、Val-Cit、Phe-Lys、Val-Lys、Val-Ala、如Doronina等人,2008中给出的其他肽接头、可由β葡萄糖醛酸酶切割的接头、可由组织蛋白酶或由组织蛋白酶B、D、E、H、L、S、C、K、O、F、V、X或W切割的接头、Val-Cit-对氨基苯甲基氧基羰基、葡萄糖醛酸苷-MABC、缬氨酸-瓜氨酸、氨基苯甲基氨基甲酸酯、D-氨基酸和多胺，其中任一者都未被取代或被任何数目的取代基取代，所述取代基诸如是卤素、羟基、氢硫基、氨基、硝基、亚硝基、氰基、叠氮基、亚砜基团、砜基团、磺酰胺基团、羧基、羧醛基团、亚胺基团、烷基、卤基-烷基、烯基、卤基-烯基、炔基、卤基-炔基、烷氧基、芳基、芳基氧基、芳烷基、芳基烷氧基、杂环基、酰基、酰基氧基、氨基甲酸酯基团、酰胺基团、氨基甲酸乙酯基团、环氧化物、带电荷基团、两性离子基团和酯基团。用以将分子连接、融合或缀合在一起的反应的其他非限制性实例包括点击化学、无铜点击化学、HIPS连接、施陶丁格(Staudinger)连接、以及肼-异-皮克特-施彭格勒反应(hydrazine-iso-Pictet-Spengler)。
在一些实施方案中，用于使阻抑物结构域连接于dCas9的接头在长度方面可为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个氨基酸残基。接头在长度方面可为约10个氨基酸残基。接头在长度方面可为约11个氨基酸残基。接头在长度方面可为约12个氨基酸残基。接头在长度方面可为约13个氨基酸残基。接头在长度方面可为约14个氨基酸残基。接头在长度方面可为约15个氨基酸残基。接头在长度方面可为约16个氨基酸残基。接头在长度方面可为约17个氨基酸残基。接头在长度方面可为约18个氨基酸残基。接头在长度方面可为约19个氨基酸残基。接头在长度方面可为约20个氨基酸残基。接头在长度方面可为约21个氨基酸残基。接头在长度方面可为约22个氨基酸残基。接头在长度方面可为约23个氨基酸残基。接头在长度方面可为约24个氨基酸残基。接头在长度方面可为约25个氨基酸残基。接头在长度方面可为约26个氨基酸残基。接头在长度方面可为约27个氨基酸残基。接头在长度方面可为约28个氨基酸残基。接头在长度方面可为约29个氨基酸残基。接头在长度方面可为约30个氨基酸残基。
在一些实施方案中，本公开的接头可包括可切割或稳定接头部分。在一些实施方案中，本公开的可切割接头可包括例如蛋白酶可切割肽接头、核酸酶敏感性核酸接头、脂肪酶敏感性脂质接头、糖苷酶敏感性碳水化合物接头、pH敏感性接头、低氧敏感性接头、光可切割接头、热不稳定接头、酶可切割接头(例如酯酶可切割接头)、超声敏感性接头、以及X射线可切割接头。在一些实施方案中，接头不是可切割接头。
接头的非限制性实例包括：
Figure BDA0003175003630001891
Figure BDA0003175003630001892
其中每个n独立地是0至约1,000；1至约1,000；0至约500；1至约500；0至约250；1至约250；0至约200；1至约200；0至约150；1至约150；0至约100；1至约100；0至约50；1至约50；0至约40；1至约40；0至约30；1至约30；0至约25；1至约25；0至约20；1至约20；0至约15；1至约15；0至约10；1至约10；0至约5；或1至约5。在一些实施方案中，每个n独立地是0、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49，或约50。在一些实施方案中，m是1至约1,000；1至约500；1至约250；1至约200；1至约150；1至约100；1至约50；1至约40；1至约30；1至约25；1至约20；1至约15；1至约10；或1至约5。在一些实施方案中，m是0、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49，或约50，或如Jain,N.,Pharm Res.32(11):3526-40(2015)或Ducry,L.,Antibody Drug Conjugates(2013)中公开的任何接头。
在一些情况下，接头可包括环状基团，诸如有机非芳族或芳族环，任选地在环中具有3-10个碳，任选地构建自羧酸，
Figure BDA0003175003630001901
例如反式-4-(氨基甲基)环己烷甲酸，
Figure BDA0003175003630001902
或其经取代类似物或立体异构体。这个接头可任选地用于形成氨基甲酸酯键。在一些情况下，相比于酯键，氨基甲酸酯键对诸如通过水解、酶诸如酯酶，或其他化学反应来达成的切割可更加具有抗性。
在一些情况下，接头可包括环状羧酸，例如环状二羧酸，例如以下基团中的一者：1,4-环己烷二甲酸、1,2-环己烷二甲酸，或1,3-环己烷二甲酸、1,1-环戊烷二乙酸，
Figure BDA0003175003630001911
或其经取代类似物或立体异构体。举例来说，接头可包括以下基团中的一者。
Figure BDA0003175003630001912
在一些情况下，接头可任选地用于形成酯键。在一些情况下，相比于非环状或直链酯键，环状酯键对诸如通过水的水解、酶诸如酯酶，或其他化学反应来达成的切割可在空间上更加具有抗性。
在一些情况下，接头可包括芳族二羧酸，例如对苯二甲酸、间苯二甲酸、邻苯二甲酸
Figure BDA0003175003630001913
或其经取代类似物。
在一些情况下，接头可包括天然或非天然氨基酸，例如半胱氨酸，
Figure BDA0003175003630001914
或其经取代类似物或立体异构体。在一些情况下，接头可包括丙氨酸(A，Ala)；精氨酸(R，Arg)；天冬酰胺(N，Asn)；天冬氨酸(D，Asp)；谷氨酸(E，Glu)；谷氨酰胺(Q，Gln)；甘氨酸(G，Gly)；组氨酸(H，His)；异亮氨酸(I，Ile)；亮氨酸(L，Leu)；赖氨酸(K，Lys)；甲硫氨酸(M，Met)；苯丙氨酸(F，Phe)；脯氨酸(P，Pro)；丝氨酸(S，Ser)；苏氨酸(T，Thr)；色氨酸(W，Trp)；酪氨酸(Y，Tyr)；缬氨酸(V，Val)；或它们中的任何多者或组合。在一些实施方案中，非天然氨基酸可包含一个或多个可用作功能性柄的官能团，例如烯或炔。
在一些情况下，接头可包括以下基团中的一者：
Figure BDA0003175003630001921
或其经取代类似物或立体异构体。在一些情况下，接头选自以下基团中的一者：
Figure BDA0003175003630001922
或其经取代类似物或立体异构体。
在一些情况下，接头可包括以下基团中的一者：
Figure BDA0003175003630001923
或其经取代类似物或立体异构体。在一些情况下，接头选自以下基团中的一者：
Figure BDA0003175003630001931
或其经取代类似物或立体异构体。
在一些情况下，经取代类似物或立体异构体是本文公开的化合物的结构类似物，所述化合物的一个或多个氢原子可被一个或多个卤基(例如Cl、F、Br)、烷基(例如甲基、乙基、丙基)、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基、杂环烷基，或它们的任何组合取代。在一些情况下，立体异构体可为对映异构体、非对映异构体、顺式或反式立体异构体、E或Z立体异构体，或R或S立体异构体。
直链接头的非限制性实例包括
Figure BDA0003175003630001932
Figure BDA0003175003630001933
其中每个n1或n2或m独立地是0至约1,000；1至约1,000；0至约500；1至约500；0至约250；1至约250；0至约200；1至约200；0至约150；1至约150；0至约100；1至约100；0至约50；1至约50；0至约40；1至约40；0至约30；1至约30；0至约25；1至约25；0至约20；1至约20；0至约15；1至约15；0至约10；1至约10；0至约5；或1至约5。在一些实施方案中，每个n独立地是0、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49，或约50。在一些实施方案中，m是1至约1,000；1至约500；1至约250；1至约200；1至约150；1至约100；1至约50；1至约40；1至约30；1至约25；1至约20；1至约15；1至约10；或1至约5。在一些实施方案中，m是0、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49，或约50。在一些情况下，接头可包括直链二羧酸，例如以下基团中的一者：琥珀酸、2,3-二甲基琥珀酸、戊二酸、己二酸、2,5-二甲基己二酸，
Figure BDA0003175003630001941
；或其经取代类似物或立体异构体。在一些情况下，接头可用于形成氨基甲酸酯键。在一些实施方案中，相比于酯键，氨基甲酸酯键对诸如通过水解、酶诸如酯酶，或其他化学反应来达成的切割可更加具有抗性。在一些情况下，接头可用于形成直链酯键。在一些实施方案中，相比于环状酯或氨基甲酸酯键，直链酯键可更易经受诸如通过水解、酶诸如酯酶，或其他化学反应来达成的切割。相比于无侧链，直链酯键上的侧链诸如甲基可任选地使得键较不易经受切割。
在一些情况下，接头可为琥珀酸接头，并且药物可通过酯键或酰胺键来连接于肽，其中有两个亚甲基碳介于之间。在其他情况下，接头可为具有羟基与羧酸两者的任何接头，诸如羟基己酸或乳酸。
在一些情况下，药物可使用以下在表7中显示的接头中的任何一者或多者来连接于肽。
表7–用于肽-药物缀合物中的示例性接头
Figure BDA0003175003630001951
Figure BDA0003175003630001961
Figure BDA0003175003630001971
在一些情况下，药物分子连接于接头，其中所述药物分子的亲核官能团(例如羟基)充当亲核体，并且替换接头部分上的离去基团，由此使药物连接于所述接头。
在其他情况下，药物分子连接于接头，其中所述接头的亲核官能团(例如巯基基团、胺基团等)替换所述药物分子上的离去基团，由此使药物连接于所述接头。此离去基团(或可被转化成离去基团的官能团)可为伯醇以形成硫醚键，由此使药物连接于接头。伯醇可被转化成离去基团诸如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯或对硝基苯磺酸酯以加速亲核取代反应。
本公开的肽-药物缀合物可包含药物、接头和/或本公开的肽。这三种组分之间的一般连接性可为药物-接头-肽，以致接头连接于药物与肽两者。在许多情况下，肽通过酰胺键来连接于接头。相较于本文所述的其他键，诸如酯、碳酸酯等，酰胺键可为相对稳定的(例如在体内)。因此，如果设法从肽-药物缀合物切割药物，而在此体内切割之后接头不连接于药物，那么肽与接头之间的酰胺键可由于它的体内稳定性而提供有利性质。因此，在各种情况下，药物通过诸如酯、碳酸酯、氨基甲酸酯等的键来连接于接头-肽部分，其中肽通过酰胺键来连接于接头。这可允许选择性切割药物-接头键(与接头-肽键相对比)，从而允许药物被释放，而在切割之后无接头部分与它连接。此类不同药物-接头键或键联的使用允许在体内调节药物释放，例如以实现治疗功能，同时使脱靶效应最小化(例如降低在循环期间的药物释放)。
接头可为可切割或稳定接头。可切割接头的使用容许缀合部分(例如治疗剂)从肽释放，例如在靶向至靶组织或细胞或亚细胞区室之后。在一些情况下，接头是酶可切割的，例如可由组织蛋白酶切割的缬氨酸-瓜氨酸接头，或可由酯酶切割的酯接头。在一些实施方案中，接头含有自我分解性部分。在其他实施方案中，接头包括特定蛋白酶的一个或多个切割位点，诸如基质金属蛋白酶(MMP)、凝血酶、尿激酶型纤溶酶原活化因子，或组织蛋白酶(例如组织蛋白酶K)的切割位点。
因此，在一些情况下，本公开的肽-活性剂缀合物可包含可形成可由酶切割的氨基酸序列的一个或多个、约两个或更多个、约三个或更多个、约五个或更多个、约十个或更多个，或约15个或更多个氨基酸。此类酶可包括蛋白酶。肽-药物缀合物可包含可由组织蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、凝血酶I，或尿激酶，或它们的任何组合切割的氨基酸序列。
替代地或组合地，可切割接头可通过其他机制，诸如通过pH、还原或水解来切割、解离或断裂。水解可由于水反应而直接发生，或通过酶来促进，或通过其他化学物质的存在来促进。水解不稳定接头(以及本文所述的其他可切割接头)就从肽释放活性剂而言可为有利的。举例来说，呈与肽的缀合形式的活性剂可不具有活性，但在靶向至靶组织或细胞或亚细胞区室之后从缀合物释放后，所述活性剂具有活性。切割的活性剂可保留在切割之前活性剂的化学结构，或可被修饰。在一些实施方案中，稳定接头可任选地在缓冲液中历经延长时期(例如数小时、数天或数周)不切割。在一些实施方案中，稳定接头可任选地在体液诸如血浆或滑液中历经延长时期(例如数小时、数天或数周)不切割。在一些实施方案中，稳定接头任选地可诸如在暴露于可存在于细胞(诸如巨噬细胞)、细胞区室(诸如内体和溶酶体)、身体的发炎区域(诸如发炎关节)，或组织或身体区室中的酶、反应性氧类、其他化学物质或酶之后切割。在一些实施方案中，稳定接头可任选地在体内不切割，而是呈现在缀合于、连接于或融合于肽时仍然具有活性的活性剂。
可调谐接头(例如肽缀合物的接头)的水解速率。举例来说，相较于具有邻接酯羰基的大基团的接头的水解，具有无位阻酯的接头的水解速率可为更快的。大基团可为甲基、乙基、苯基、环，或异丙基，或提供空间位阻的任何基团。在另一实例中，在酯羰基附近具有亲水性基团诸如醇、酸或醚的情况下，水解速率可为较快的。在另一实例中，作为侧链或通过具有较长烃接头而存在的疏水性基团可减缓酯的切割。在一些实施方案中，氨基甲酸酯基团的切割也可通过位阻、疏水性等来调谐。在另一实例中，使用不稳定性较小的接头，诸如氨基甲酸酯而非酯，可减缓接头的切割速率。在一些情况下，空间位阻可由药物自身，诸如当通过它的羧酸来缀合时由酮咯酸提供。接头的水解速率可根据缀合物在靶组织或细胞或亚细胞区室中的停留时间，根据肽在靶组织或细胞或亚细胞区室中积累的快速程度，或根据为在靶组织或细胞或亚细胞区室中暴露于活性剂所需的时间范围来调谐。举例来说，当肽相对快速地从靶组织或细胞或亚细胞区室清除时，接头可被调谐以快速水解。相反，举例来说，当肽在靶组织或细胞或亚细胞区室中具有较长停留时间时，较慢水解速率可允许达成活性剂的延长递送。这在肽用于将药物递送至靶组织或细胞或亚细胞区室(例如肿瘤细胞或肿瘤组织)时可为重要的。“Programmed hydrolysis in designing paclitaxelprodrug for nanocarrier assembly”Sci Rep 2015,5,12023Fu等人提供了经改进水解速率的一个实例。在一些实施方案中，切割速率可随物种、身体区室和疾病状态而变化。举例来说，相比于在人血浆中，由酯酶达成的切割在大鼠或小鼠血浆中可为更快速的，诸如归因于羧酸酯酶的不同水平。在一些实施方案中，接头可被调谐以在不同物种中达成不同切割速率、类似切割速率。
在一些情况下，接头可为琥珀酸接头，并且药物可通过酯键或酰胺键来连接于肽，其中有两个亚甲基碳介于之间。在其他情况下，接头可为具有羟基与羧酸两者的任何接头，诸如羟基己酸或乳酸。
在一些实施方案中，接头可以未修饰形式释放活性剂。在其他实施方案中，活性剂可在化学修饰的情况下释放。在其他实施方案中，分解代谢可释放仍然连接于接头和/或肽的部分的活性剂。
接头可为稳定接头或可切割接头。在一些实施方案中，稳定接头可通过缀合部分交换至血清白蛋白上的游离巯基上来缓慢释放缀合部分。在一些实施方案中，可切割接头的使用可容许缀合部分(例如治疗剂)从肽释放，例如在施用至有需要的受试者之后。在其他实施方案中，可切割接头的使用可容许缀合治疗剂从肽释放。在一些情况下，接头是酶可切割的，例如缬氨酸-瓜氨酸接头。在一些实施方案中，接头含有自我分解性部分。在其他实施方案中，接头包括特定蛋白酶的一个或多个切割位点，诸如基质金属蛋白酶(MMP)、凝血酶、组织蛋白酶、肽酶或β-葡萄糖醛酸酶的切割位点。替代地或组合地，接头可通过其他机制，诸如通过pH、还原或水解来切割。
视应用而定，接头的水解或还原速率可被精细调谐或改进。举例来说，相较于具有邻接酯羰基的大基团的接头的水解，具有无位阻酯的接头的水解速率可为更快的。大基团可为甲基、乙基、苯基、环，或异丙基，或提供空间位阻的任何基团。在一些情况下，空间位阻可由药物自身，诸如当通过它的羧酸来缀合、连接或融合时由酮咯酸提供。接头的水解速率可根据缀合物或融合物在靶标位置中的停留时间来调谐。举例来说，当肽相对快速地从肿瘤或脑清除时，接头可被调谐以快速水解。当肽在靶标位置中具有较长停留时间时，较慢水解速率将允许达成活性剂的延长递送。
可测量接头(例如肽缀合物的接头)的水解速率。此类测量可包括测定在体内在受试者的血浆或滑液或其他流体或组织中的游离活性剂，以及/或者通过以离体方式将本公开的接头或包含接头的肽缀合物与缓冲液(例如PBS)或来自受试者的血浆(例如大鼠血浆、人血浆等)或滑液或其他流体或组织一起孵育。用于测量水解速率的方法可包括在孵育期间或在施用之后获取样品，并且测定游离活性剂、游离肽，或指示水解的任何其他参数，包括还测量总肽、总活性剂，或缀合活性剂-肽。此类测量的结果可然后用于确定给定接头或包含所述接头的肽缀合物的水解半衰期。视血浆或流体或物种或用于确定此半衰期的其他条件而定，接头的水解半衰期可不同。这可归因于存在于某一血浆(例如大鼠血浆)中的某些酶或其他化合物。举例来说，不同流体(诸如血浆或滑液)可含有不同量的酶诸如酯酶，并且这些化合物的这些水平还可视物种(诸如大鼠相对于人)以及疾病状态(诸如正常相对于关节炎)而变化。
本公开的缀合物可被描述为具有包含各种组分的模块结构，其中组分(例如肽、接头、活性剂和/或可检测剂)中的每一者可依赖于或独立于任何其他组分加以选择。举例来说，用于治疗疼痛的缀合物可包含本公开的TfR结合肽(例如具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ IDNO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者的氨基酸序列的那些)、接头(例如表7中所述的任何接头)和活性剂(例如NSAID疼痛缓解剂、布洛芬或用以治疗CNS的病症，或癌症的分子)。接头例如可被选择和/或修饰以通过某一机制(例如通过水解、诸如酶和/或pH依赖性水解)来在靶标部位处(例如在脑中)实现某一活性剂释放(例如某一释放速率)，并且/或者使全身性活性剂暴露最小化。在缀合物的测试期间，所述缀合物的组分中的任何一者或多者可被修饰和/或改变以实现所述缀合物的某些体内性质，例如药代动力学(例如清除时间、生物利用度、在各种器官中的摄取和保留)和/或药效动力学(例如靶标啮合)性质。因此，本公开的缀合物可被调节以预防、治疗和/或诊断多种疾病和疾患，同时降低副作用(例如如果单独施用此类活性剂(即未缀合于肽)，那么会发生的副作用)。
在一些实施方案中，非天然氨基酸可包含一个或多个可用作功能性柄的官能团，例如烯或炔。举例来说，此类官能团的多重键可用于将一个或多个分子添加至缀合物。一个或多个分子可使用各种合成策略来添加，所述策略中的一些可包括加成和/或取代化学。举例来说，使用多重键进行的加成反应可包括使用氢溴酸，其中溴可充当离去基团，因此被各种部分取代，所述部分例如是活性剂、可检测剂、可改进或改变缀合物的药代动力学(例如血浆半衰期、在中枢神经系统(CNS)或其他地方中的保留和/或摄取)和/或药效动力学(例如水解速率，诸如酶促水解速率)性质的剂。
在一些实施方案中，如本文所述的缀合物包含一个或多个非天然氨基酸和/或一个或多个接头。此类一个或多个非天然氨基酸和/或一个或多个接头可包含一个或多个可用作功能性柄的官能团，例如烯或炔(例如非末端烯和炔)。举例来说，此类官能团的多重键可用于将一个或多个分子添加至缀合物。一个或多个分子可使用各种合成策略来添加，所述策略中的一些可包括加成和/或取代化学、环加成等。举例来说，使用多重键进行的加成反应可包括使用溴化氢(例如通过氢卤化反应)，其中溴离子取代基一旦连接即可充当离去基团，因此被各种包含亲核官能团的部分取代，所述部分例如是活性剂、可检测剂、剂。作为另一实例，多重键可用作环加成反应中的功能性柄。环加成反应可包括1,3-偶极环加成、[2+2]-环加成(例如光催化)、狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应、胡伊斯根(Huisgen)环加成、硝酮-烯烃环加成等。此类环加成反应可用于使各种官能团、功能性部分、活性剂、可检测剂等连接于缀合物。举例来说，1,3-偶极环加成反应可用于使分子连接于缀合物，其中所述分子包含可与例如炔反应以形成5元环，由此使所述分子连接于所述缀合物的1,3-偶极子。
添加此类剂或分子(例如通过亲核或亲电加成，继之以亲核取代)可具有各种应用。举例来说，连接此分子或剂可改进或改变缀合物的药代动力学(例如血浆半衰期、在CNS中的保留和/或摄取，或生物分布)和/或药效动力学(例如水解速率，诸如酶促水解速率)性质。连接此分子或剂还可改变(例如增加)缀合物的储库作用，或提供用于例如使用荧光或其他类型的可检测剂来进行体内追踪的功能性。
在一些实施方案中，本公开的缀合物可包含接头，所述接头包括以下基团中的一者或多者：
Figure BDA0003175003630002031
或其经取代类似物或立体异构体，其中每个n1和n2独立地是从1至10的值。此种基团可作为柄用于通过亲核或亲电加成，继之以亲核取代来使一个或多个分子连接于缀合物，例如以改变缀合物的药代动力学(例如血浆半衰期、在中枢神经系统(CNS)或其他地方中的保留和/或摄取)和/或药效动力学性质。此种基团的官能化可使用基团的一个或多个多重键(例如双键、三键等)来发生。此官能化可包括加成和/或取代化学。举例来说，接头的官能团诸如双键可被转化成单键(例如通过加成反应，诸如亲核加成反应)，其中新形成的单键的碳原子中的一者或两者可具有连接于它们的离去基团(例如溴)。此种离去基团可然后用于(例如通过亲核取代反应)使特定分子(例如活性剂、可检测剂等)连接于接头的那一个或多个碳原子。
作为另一实例，多重键可用作环加成反应中的功能性柄。环加成反应可包括1,3-偶极环加成、[2+2]-环加成(例如光催化)、狄尔斯-阿尔德反应、胡伊斯根环加成、硝酮-烯烃环加成等。此类环加成反应可用于使各种官能团、功能性部分、活性剂、可检测剂等连接于缀合物。举例来说，1,3-偶极环加成反应可用于使分子连接于缀合物，其中所述分子包含可与例如炔反应以形成5元环，由此使所述分子(例如活性剂、可检测剂等)连接于所述缀合物的1,3-偶极子。在一些情况下，分子可连接于缀合物以例如调节半衰期，增加储库作用，或提供缀合物的新功能性，诸如用于追踪的荧光。
肽的药代动力学
本公开的任何肽的药代动力学都可在通过不同施用途径来施用肽之后测定。举例来说，本公开的肽的药代动力学参数可在静脉内、皮下、肌内、经直肠、以气雾剂形式、胃肠外、经眼、经肺、经皮、经阴道、经眼部、经鼻、口服、舌下、吸入、经真皮、鞘内、鼻内、经腹膜、经颊、经滑膜、肿瘤内或局部施用之后加以定量。本公开的肽可通过使用追踪剂诸如放射性标记或荧光团来分析。举例来说，本公开的经放射性标记肽可通过各种施用途径来施用。可使用一系列方法来测定在各种生物样品诸如血浆、尿、粪便、任何器官、皮肤、肌肉和其他组织中的肽浓度或剂量回收率，所述方法包括HPLC、荧光检测技术(TECAN定量、流式细胞术、iVIS)或液体闪烁计数。
本文所述的方法和组合物涉及通过任何途径向受试者进行的肽施用的药代动力学。药代动力学可使用例如房室模型或非房室方法的方法和模型来描述。房室模型包括但不限于单房室模型、二房室模型、多房室模型等。模型经常被分成不同房室，并且可通过相应流程来描述。举例来说，一种流程是吸收、分布、代谢和排泄(ADME)流程。再举例来说，另一流程是释放、吸收、分布、代谢和排泄(LADME)流程。在一些方面，代谢和排泄可被分组至被称为消除房室的一个房室中。举例来说，释放包括组合物的活性部分从递送系统的释放，吸收包括组合物的活性部分由受试者吸收，分布包括组合物在血浆之中以及到达不同组织的分布，代谢包括组合物的代谢或失活，并且最后，排泄包括组合物或组合物的代谢产物的排泄或消除。静脉内施用至受试者的组合物可经受多相药代动力学概况，其包括但不限于组织分布和代谢/排泄的方面。因此，组合物的血浆或血清浓度的降低经常是双相的，包括例如α相和β相，偶尔观察到γ相、δ相或其他相。
药代动力学包括测定至少一个与向受试者施用肽相关的参数。在一些方面，参数至少包括剂量(D)、给药间隔(τ)、曲线下面积(AUC)、最大浓度(C最大)、在施用后续剂量之前达到的最小浓度(C最小)、最小时间(T最小)、达到C最大的最大时间(T最大)、分布容积(Vd)、稳态分布容积(Vss)、在时间0时的回推浓度(C0)、稳态浓度(Css)、消除速率常数(ke)、输注速率(kin)、清除率(CL)、生物利用度(f)、波动(％PTF)和消除半衰期(t1/2)。
在某些实施方案中，在口服施用之后，SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者的肽或肽构建体展现最优药代动力学参数。在其他实施方案中，在任何施用途径，诸如口服施用、吸入、鼻内施用、局部施用、静脉内施用、皮下施用、关节内施用、肌内施用、腹膜内施用、滑膜内施用，或它们的任何组合之后，SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者的肽或肽构建体展现最优药代动力学参数。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361的任何肽或肽构建体展现在达到C最大时的平均T最大是0.5–12小时，或1-48小时；在通过口服途径来将肽施用至受试者之后，在受试者中平均血清生物利用度是0.1％-10％；在口服施用至受试者以递送至GI道之后，平均血清生物利用度是小于0.1％；在胃肠外施用之后，平均血清生物利用度是10-100％；在将肽施用至受试者之后，平均t1/2是0.1小时–168小时，或0.25小时–48小时；在将肽施用至受试者之后，肽的平均清除率(CL)是0.5-100升/小时或0.5–50升/小时；在将肽全身性施用至受试者之后，在受试者中的平均分布容积(Vd)是200–20,000mL，或任选地，无全身性摄取；它们的任何组合。
肽稳定性
本公开的肽在各种生物或生理条件下可为稳定的，所述条件诸如是在细胞内部，在胞质液中，在细胞核或内体或肿瘤中的pH或还原环境。举例来说，SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361的任何肽或肽构建体可展现对还原剂、蛋白酶、氧化条件或酸性条件的抗性。
在一些情况下，生物分子(诸如肽和蛋白质)可提供治疗功能，但此类治疗功能由于由体内环境引起的不稳定性而降低或受阻碍。(Moroz等人Adv Drug Deliv Rev 101:108-21(2016)，Mitragotri等人Nat Rev Drug Discov 13(9):655-72(2014)，Bruno等人Ther Deliv(11):1443-67(2013)，Sinha等人Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.24(1):63-92(2007)，Hamman等人BioDrugs 19(3):165-77(2005))。举例来说，GI道可含有可使肽和蛋白质降解的低pH(例如pH约1)区域、还原环境，或蛋白酶富集环境。在身体的其他区域诸如口、眼、肺、鼻腔内、关节、皮肤、阴道、粘膜和血清中的蛋白水解活性也可为递送功能活性肽和多肽的障碍。另外，肽在血清中的半衰期可部分地由于蛋白酶而是极其短暂的，以致当施用合理给药方案时，肽可被太快降解而不能具有持续治疗作用。同样，细胞区室诸如溶酶体中的蛋白水解活性以及溶酶体和胞质液中的还原活性可降解肽和蛋白质，以致它们不能提供对细胞内靶标的治疗功能。因此，对还原剂、蛋白酶和低pH具有抗性的肽可能够提供增强的治疗作用，或增强共同配制的或缀合、连接或融合的活性剂的体内治疗功效。
另外，药物的口服递送可合乎靶向身体的某些区域(例如GI道中的疾病诸如结肠癌、易激性肠病症、感染、代谢紊乱和便秘)的需要，尽管这个施用方法呈现递送功能活性肽和多肽的障碍。举例来说，相较于胃肠外递送，药物的口服递送可通过提供更便于患者服用的剂型来增加顺应性。口服递送可用于具有大治疗窗的治疗方案中。因此，对还原剂、蛋白酶和低pH具有抗性的肽可允许口服递送肽，而不使它们的治疗功能无效。
肽对还原剂的抗性。本公开的肽可含有一个或多个可参与二硫键的半胱氨酸，所述二硫键对于保持肽的折叠状态可为必要的。肽暴露于具有还原剂的生物环境可导致肽的展开，以及功能性和生物活性的丧失。举例来说，谷胱甘肽(GSH)是可存在于身体的许多区域中以及细胞中，并且可使二硫键还原的还原剂。作为另一实例，在口服施用之后，在肽穿过胃肠上皮细胞的迁移期间，肽可变得被还原。肽可在暴露于GI道的各种部分后变得被还原。GI道可为还原环境，其可由于二硫键的还原而抑制具有二硫键的治疗性分子具有最优治疗功效的能力。肽还可在进入细胞后被还原，诸如在由内体或溶酶体内化，或进入胞质液或其他细胞区室中之后。二硫键的还原和肽的展开可导致功能性的丧失，或影响关键药代动力学参数，诸如生物利用度、峰值血浆浓度、生物活性和半衰期。二硫键的还原还可由于肽对由蛋白酶达成的后续降解的易感性增加而导致功能性的丧失，所述易感性增加导致在施用之后，完整肽的快速丧失。在一些实施方案中，相较于更易于被还原的肽，对还原具有抗性的肽可在身体的各种区室中以及细胞中持续更长时期保持完整，并且可赋予功能活性。
在某些实施方案中，可分析本公开的肽对还原剂的抗性特征以鉴定稳定肽。在一些实施方案中，在暴露于诸如0.00001M–0.0001M、0.0001M–0.001M、0.001M–0.01M、0.01M–0.05M、0.05M–0.1M的不同体积摩尔浓度的还原剂15分钟或更久之后，本公开的肽可保持完整。在一些实施方案中，用于测定肽稳定性的还原剂可为二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、2-巯基乙醇、(还原型)谷胱甘肽(GSH)，或它们的任何组合。在一些实施方案中，在暴露于还原剂之后，至少5％-10％、至少10％-20％、至少20％-30％、至少30％-40％、至少40％-50％、至少50％-60％、至少60％-70％、至少70％-80％、至少80％-90％，或至少90％-100％的肽保持完整。在一些实施方案中，肽对GSH还原性条件具有完全抗性，并且对在DTT还原性条件下的降解具有部分抗性。在一些实施方案中，本文所述的肽可经得住在生理还原性条件下的降解，或对所述降解具有抗性。
肽对蛋白酶的抗性。本公开的肽的稳定性可通过对由蛋白酶达成的降解的抗性来确定。蛋白酶，也被称为肽酶或蛋白质酶，是可通过使邻近氨基酸之间的键断裂来降解肽和蛋白质的酶。对于靶向特定氨基酸具有特异性的蛋白酶的家族可包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和天冬酰胺蛋白酶。另外，金属蛋白酶、基质金属蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、细胞色素P450酶和组织蛋白酶也可消化肽和蛋白质。蛋白酶可在高浓度下存在于血液中，粘膜、肺、皮肤、GI道、口、鼻、眼中，以及细胞的区室中。蛋白酶的错误调控也可存在于各种疾病中，诸如类风湿性关节炎和其他免疫病症。由蛋白酶达成的降解可降低治疗性分子的生物利用度、生物分布、半衰期和生物活性，以致它们不能执行它们的治疗功能。在一些实施方案中，对蛋白酶具有抗性的肽可更好地在体内在合理耐受浓度下提供治疗活性。
在一些实施方案中，本公开的肽可抵抗由任何类别的蛋白酶达成的降解。在某些实施方案中，本公开的肽抵抗由胃蛋白酶(其可见于胃中)、胰蛋白酶(其可见于十二指肠中)、血清蛋白酶，或它们的任何组合达成的降解。在一些实施方案中，用于测定肽稳定性的蛋白酶可为胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，或它们的任何组合。在某些实施方案中，本公开的肽可抵抗由肺蛋白酶(例如丝氨酸、半胱氨酰基和天冬氨酰基蛋白酶，金属蛋白酶、嗜中性白细胞弹性蛋白酶、α-1抗胰蛋白酶、分泌性白细胞蛋白酶抑制因子和弹性蛋白酶抑制因子)或它们的任何组合达成的降解。在一些实施方案中，在暴露于蛋白酶之后，至少5％-10％、至少10％-20％、至少20％-30％、至少30％-40％、至少40％-50％、至少50％-60％、至少60％-70％、至少70％-80％、至少80％-90％，或至少90％-100％的肽保持完整。
肽在酸性条件下的稳定性。本公开的肽可被施用在酸性生物环境中。举例来说，在口服施用之后，肽可在胃的胃液和胃肠(GI)道中经受酸性环境条件。胃的pH可在约1-4的范围内，并且GI道的pH从上GI道下降至结肠在酸性至正常生理pH的范围内。此外，阴道、晚期内体和溶酶体也可具有酸性pH值，诸如小于pH 7。这些酸性条件可导致肽和蛋白质变性成展开状态。肽和蛋白质的展开可导致对由其他酶达成的后续消化的易感性增加，以及肽的生物活性的丧失。在某些实施方案中，本公开的肽可抵抗在酸性条件下以及在模拟酸性条件的缓冲液中的变性和降解。在某些实施方案中，本公开的肽可抵抗在pH小于1，pH小于2，pH小于3，pH小于4，pH小于5，pH小于6，pH小于7，或pH小于8的缓冲液中的变性或降解。在一些实施方案中，本公开的肽在1-3的pH下保持完整。在某些实施方案中，在暴露于pH小于1，pH小于2，pH小于3，pH小于4，pH小于5，pH小于6，pH小于7，或pH小于8的缓冲液之后，至少5％-10％、至少10％-20％、至少20％-30％、至少30％-40％、至少40％-50％、至少50％-60％、至少60％-70％、至少70％-80％、至少80％-90％，或至少90％-100％的肽保持完整。在其他实施方案中，在暴露于具有1-3的pH的缓冲液之后，至少5％-10％、至少10％-20％、至少20％-30％、至少30％-40％、至少40％-50％、至少50％-60％、至少60％-70％、至少70％-80％、至少80％-90％，或至少90％-100％的肽保持完整。在其他实施方案中，本公开的肽可对在模拟胃液(pH 1-2)中的变性或降解具有抗性。在一些实施方案中，在暴露于模拟胃液之后，至少5％-10％、至少10％-20％、至少20％-30％、至少30％-40％、至少40％-50％、至少50％-60％、至少60％-70％、至少70％-80％、至少80％-90％，或至少90％-100％的肽保持完整。在一些实施方案中，低pH溶液诸如模拟胃液可用于测定肽稳定性。
在一些实施方案中，本文所述的肽对在体内，在受试者的血清中，或在细胞内部的降解具有抗性。在一些实施方案中，肽在诸如约pH 7，约pH 7.5，约pH 5至7.5之间，约6.5至7.5之间，约pH 5至8之间，或约pH 5至7之间的生理pH范围下是稳定的。在一些实施方案中，本文所述的肽在诸如小于或等于约pH 5，小于或等于约pH 3，或在约3至约5的范围内的酸性条件下是稳定的。在一些实施方案中，肽在内体或溶酶体的条件下，或在核内部是稳定的。
肽在高温下的稳定性。本公开的肽可被施用在具有高温的生物环境中。举例来说，在口服施用之后，肽可在身体中经受高温。体温可在36℃至40℃的范围内。高温可导致肽和蛋白质变性成展开状态。肽和蛋白质的展开可导致对由其他酶达成的后续消化的易感性增加，以及肽的生物活性的丧失。在一些实施方案中，本公开的肽可在25℃至100℃的温度下保持完整。高温可导致肽的较快降解。在较高温度下的稳定性可允许在热带环境或对冷藏的获取受限制的区域中储存肽。在某些实施方案中，在持续6个月至5年暴露于25℃之后，5％-100％的肽可保持完整。在持续15分钟至1小时暴露于70℃之后，5％-100％的肽可保持完整。在持续15分钟至1小时暴露于100℃之后，5％-100％的肽可保持完整。在其他实施方案中，在持续至少6个月至5年暴露于25℃之后，至少5％-10％、至少10％-20％、至少20％-30％、至少30％-40％、至少40％-50％、至少50％-60％、至少60％-70％、至少70％-80％、至少80％-90％，或至少90％-100％的肽保持完整。在其他实施方案中，在持续15分钟至1小时暴露于70℃之后，至少5％-10％、至少10％-20％、至少20％-30％、至少30％-40％、至少40％-50％、至少50％-60％、至少60％-70％、至少70％-80％、至少80％-90％，或至少90％-100％的肽保持完整。在其他实施方案中，在持续15分钟至1小时暴露于100℃之后，至少5％-10％、至少10％-20％、至少20％-30％、至少30％-40％、至少40％-50％、至少50％-60％、至少60％-70％、至少70％-80％、至少80％-90％，或至少90％-100％的肽保持完整。
方法
肽产生和纯化。在一些实施方案中，使用表达载体或固相或溶液相肽合成方法合成是肽文库的一部分的氨基酸序列。举例来说，可将TfR结合肽克隆至分泌可溶性蛋白质产生/表达载体中，并且随后加以纯化。肽纯化方法包括但不限于亲和纯化柱、离子交换(阳离子和/或阴离子柱色谱法)、反相色谱法、疏水性相互作用色谱法、以及尺寸排阻柱色谱法。SDS-PAGE继之以考马斯(Coomassie)染色和反相高压液相色谱法(HPLC)可用于分析纯化蛋白质的样品。通过紫外光谱吸收(例如在280nm下的吸光度)和/或氨基酸分析来测定蛋白浓度。在一些实施方案中，肽可使用Crook ZR等人Methods Mol Biol.2020；2070:363-396中所述的方法来产生和纯化。
表面展示载体构建。在各种实施方案中，基于原始Daedalus载体(Bandaranayake等人,2011)的表面展示载体SDGF和SDPR(SDGF载体的变体，但移除了茎部内的所有碱性和芳族残基以防止胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶切割，并且具有添加至肽的C端的6xHis标签(SEQID NO:345))可用于克隆和表达如本文所述的重组肽。肽可用经修饰编码序列以及在无IRES-GFP的情况下克隆或表达。在一些情况下，载体的编码序列包含：GFP；单次穿膜II型跨膜蛋白FASLG(人Fas配体)的跨膜结构域；聚GGGS间隔体(SEQ ID NO:103)；9残基牛视紫红质抗原；聚GGGS间隔体(SEQ ID NO:103)；TEV切割位点，包括GS接头；展示肽；以及仅对于SDPR来说的6xHis标签(SEQ ID NO:345)。在一些情况下，编码序列包括编码在肽的N端的噬铁蛋白的序列(例如SEQ ID NO:352，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361)。如同原始Daedalus载体一样，在一些实施方案中，整个构建体与慢病毒LTR一起克隆，并且通过短暂转染或转导来引入至细胞。肽序列可被插入在SDGF载体的独特BamHI与NotI切割位点之间，或在SDPR的独特BamHI与AgeI切割位点之间。在SDGF或SDPR构建体中，许多标准克隆策略可用于插入所需编码序列，包括限制消化(BamHI和NotI，NEB；T4 DNA连接酶，Invitrogen)、In-Fusion(Clontech)，或Gibson组装(NEB)，其中所有转化都使用Stellar化学感受态细胞(Clontech)或通过电穿孔来转化的电感受态细胞(NEB 10-β细胞)。DNA可使用示例性引物诸如：SDGF正向引物：TGTACTTCCAGGGAGGATCC(SEQ ID NO:127)；SDGF反向引物：AATGGTGATGAGCGGCC(SEQ ID NO:128)来加以PCR扩增。
磁性分选与流动分选两者的使用可允许筛选约109个细胞。可转导待筛选细胞的数目的八分之一或>1.2x108个细胞，以允许有3天用于达成最优构建体表达和约24小时倍增时间。为测试有限数目的肽支架，可通过饱和诱变(例如NNK)来实现文库多样性。然而，如果更具多样性的支架文库是优选的，那么可使文库降低至约10,000个成员，以寡核苷酸汇合物形式定购，并且进一步通过易出错PCR诱变来使它具有多样化。对于通过易出错PCR诱变来达成多样化的文库，总文库大小(文库变体的数目)可严重依赖于施加的诱变程度。因为终止密码子和改变半胱氨酸拓扑结构可致使肽是非功能性的。较低诱变率(每个肽1–1.5)可降低包含CDP的文库中由半胱氨酸拓扑结构破坏所致的复杂情况，但诱变率可针对每个文库加以调整。
用于文库设计以达成向SDGF中的优化克隆的一示例性方法可包括以下步骤：1)确定所需肽文库。肽文库可从现有数据库(例如Uniprot)中富含半胱氨酸的序列鉴定，或可源于使用蛋白质设计软件(例如Rosetta)进行的计算机对接模拟；2)使肽序列转变成克隆备用寡核苷酸。使肽序列转变成克隆备用寡核苷酸可包括以下步骤：(a)使用人密码子优化逆翻译肽序列；(b)并入统一侧接序列以有助于PCR扩增和克隆；(c)如果NGS待用于文库表征，那么验证每个文库成员含有全体NGS读数内的独特序列。可引入沉默突变以确保独特定位是可能的；以及(d)定购最终文库。
将汇合寡核苷酸文库克隆至SDGF中。用于将汇合寡核苷酸文库克隆至SDGF中的一示例性方法可包括以下步骤：1)将汇合寡核苷酸文库再悬浮于50μL分子生物学等级水或Tris–EDTA缓冲液中；2)制备四个反应以对文库进行PCR扩增，在不同循环数目(例如14、16、18和20)下运行四个反应；3)在琼脂糖凝胶上运行所有PCR产物，并且从缺乏在所需产物上方的不适当高分子量扩增子拖尾的泳道提取预期条带，所述拖尾可为当引物耗尽时PCR产物交叉引发的结果，以及使用凝胶提取试剂盒纯化条带；4)任选地，如果需要进一步多样化，那么使用Gene-Morph II随机诱变试剂盒和SDGF Gibson引物，利用制造商推荐的反应条件，以来自先前步骤的PCR产物作为模板，通过易出错PCR来进行诱变，以及在凝胶上运行，并且如同步骤3中一样，从不具有大量交叉引发拖尾的泳道纯化所需条带；5)制备2μg/文库或100ng/单例以克隆至BamHI/NotI消化的SDGF主链。6)将扩增子克隆至SDGF中，例如通过在50℃下孵育Gibson反应2小时而非推荐的1小时；7)使用PCR纯化试剂盒将反应脱盐，洗脱于20μL的降低体积中；8)将文库电穿孔至感受态大肠杆菌中，以及在37℃下孵育过夜，例如使用专门化电感受态细胞，将经电穿孔细胞铺至LB琼脂+羧苄西林的大板(25x25cm)上，务必完全铺展，以及使其完全干燥，随后倒置和过夜37℃孵育，其中对照陪替氏培养皿(petri dish)含有文库的连续稀释液以确定文库菌落形成单位(CFU)；9)对对照板进行计数以确定CFU，并且如果CFU是足够的，那么通过添加25–50mL LB培养基加羧苄西林(100μg/mL)以及用细胞刮、细胞铲或细胞涂布器进行刮削来刮削一个或多个板，用更多培养基和刮削进行重复直至完全转移；10)在37℃下以200mL的最终体积将细菌振荡1小时，然后沉淀50mL等分试样(4000x g，持续20分钟)；以及11)在-20℃下冷冻除一个沉淀物以外的所有沉淀物，大量制备剩余沉淀物，并且优选地，在慢病毒产生之前无菌过滤最终DNA产物。
哺乳动物表面展示。对肽或单一候选物与TfR的结合的验证可使用HEK-293细胞的悬液来验证。在一些实施方案中，在24孔悬浮组织培养皿中，对于1mL培养基中的2E6个细胞，用2.5μg包含推定或候选肽的SDGF载体和3.5μg聚乙烯亚胺转染细胞。在孵育细胞之后，所有汇合筛选都可在以约1或直至5的MOI用递送SDGF构建体的慢病毒(VSV-G外壳化，通过标准方法在293T细胞中产生)转导的293T细胞的情况下进行。可使经转导或经转染悬浮HEK-293细胞沉淀(500xg，5分钟)，并在至多8E6个细胞/毫升下再悬浮于含有DAPI和靶蛋白的流动缓冲液(具有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS)中，具有或不具有与靶蛋白等摩尔数量的Alexa Fluor 647缀合链霉亲和素(ThermoFisher)。所有染色孵育都在4C下在温和搅拌下持续30分钟进行。对于低严格性方案(初始测定验证和汇合筛选)，可使用200nM靶蛋白，并且可使链霉亲和素与靶蛋白预混合。可孵育细胞，用流动缓冲液稀释10倍，沉淀(500xg，5分钟)，并且再悬浮于新鲜流动缓冲液中(至多6.5E6个细胞/毫升)，随后进行流式细胞术。对于中等严格性方案(SSM成熟)，可使用仅20nM靶蛋白，并且可使细胞与单独靶蛋白一起孵育，用流动缓冲液稀释10倍，沉淀，然后用20nM链霉亲和素再悬浮。再次孵育细胞，用流动缓冲液稀释10倍，沉淀(500xg，5分钟)，并且再悬浮于新鲜流动缓冲液中(至多6.5E6个细胞/毫升)，随后进行流式细胞术。高严格性方案与中等严格性方案相同，例外之处是在靶蛋白染色之后立刻包括额外的仅用流动缓冲液进行的洗涤步骤。初始筛选用200nM TfR浓度进行，使用用于达成四价靶标亲合力的一步染色方案，而非用于达成较微弱单价亲合力的两步染色方案。后续亲和力成熟使用20nM一步染色(第一亲和力成熟筛选)和8nM两步染色(第二亲和力成熟筛选)。单例变体验证和排列测试染色在与富集和鉴定变体所根据的筛选相同的条件下进行。对于转铁蛋白竞争染色测定，两步染色的TfR水平是8nM，并且转铁蛋白水平是10μM。首先将经转染细胞与转铁蛋白(10μM)一起孵育，然后添加TfR溶液以进行第一染色步骤。使细胞沉淀，然后再悬浮于链霉亲和素溶液中以进行第二染色步骤。在这个第二孵育之后，使细胞沉淀，并且通过流式细胞术来分析链霉亲和素染色(代表TfR结合)。对于鼠转铁蛋白相对于人转铁蛋白交叉反应性测试，通过NHS酯缀合来用AlexaFluor 647染料标记可溶性肽，然后在50nM下在于它们的细胞表面上表达人或小鼠TfR的细胞上染色。不必要共染色，但染色方案在其他方面是相同的。在一些情况下，流动分选在Beckton-DickinsonAria II上进行，而分析在Beckton-Dickson LSR II和Acea NovoCyte流式细胞仪的组合上进行。数据分析可在FlowJo(FlowJo,LLC)和Excel(Microsoft)上进行。
肽的位点饱和诱变(SSM)。SSM可用于本公开的肽的亲和力成熟，例如对于在第一哺乳动物表面展示实验中鉴定的那些肽。在每轮成熟期间，可构建每个可能的非半胱氨酸点变体的文库，并且在高于第一筛选的严格性下针对TfR加以筛选。可富集具有改善的结合的变体，并且通过桑格尔(Sanger)测序来鉴定。此类富集变异突变可以各种排列(显示于数据中)彼此组合以鉴定复合改善结合剂。
下一代测序。在一些实施方案中，用于富集或消减影响TfR结合的变体的筛选可通过Illumina测序来评估。此测序方法涉及收集细胞沉淀物(1.5E6，3个技术性重复测定)，再悬浮于50μL Terra直接PCR混合物(来自Clontech)中，并且使用原始克隆引物持续16个循环加以扩增。直至四个等分试样可16倍稀释至60μL Phusion DNA聚合酶反应中，并且使用含有用于流动池粘着的衔接头序列的不同Illumina引物加以扩增。正向引物可包括用于多路化的6bp条形码。处于快速模式的Illumina HiSeq 2500可用于运行样品，Bowtie2软件可用于定位，并且Excel(Microsoft)和MATLAB(MathWorks)用于数据分析。
His-Avi-TfR产生、纯化和生物素化。在一些实施方案中，体外测定用于分析候选肽结合TfR的能力。在一些情况下，可在哺乳动物细胞中表达生物素化和His-Avi-TfR。任选地，可在纯化之后对蛋白质进行生物素化(例如使用BirA来使所编码AviTag生物素化)。在一些实施方案中，所表达肽在N端融合于噬铁蛋白(SEQ ID NO:351)以达成在翻译或分泌期间稳定性增加(例如SEQ ID NO:352，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361)。如本文公开的肽可使用公开方法来在哺乳动物细胞培养中产生。(A.D.Bandaranayke,C.Correnti,B.Y.Ryu,M.Brault,R.K.Strong,D.Rawlings.2011.Daedalus:a robust,turnkeyplatform for rapid production of decigram quantities of active recombinantproteins in human cell lines using novel lentiviral vectors.Nucleic AcidsResearch.(39)21,e143)。将肽序列逆翻译成DNA，合成，并且使用标准分子生物学技术与噬铁蛋白同框克隆。(M.R.Green,Joseph Sambrook.Molecular Cloning.2012Cold SpringHarbor Press.)。将所得构建体包装至慢病毒中，转导至HEK-293细胞中，扩增，通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)来分离，用烟草蚀刻病毒蛋白酶切割，并且通过使用乙腈和0.1％TFA的梯度进行尺寸排阻色谱法来纯化(例如分离肽和噬铁蛋白载体(SEQ ID NO:351))以获得同质性。可用烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶处理以噬铁蛋白融合物形式表达的肽以切割噬铁蛋白，并且留下N端GS。因此，本公开的序列可任选地包括N端GS。肽可使用色谱法来与噬铁蛋白载体分离，例如尺寸排阻色谱法(SEC)或反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。在纯化之后，将每种肽冻干，并且冷冻储存。或者，可将纯化蛋白质在具有低温保护剂(例如5％甘油)的水溶液(例如PBS)中快速冷冻，并且冷冻储存。
荧光团缀合。在一些实施方案中，筛选肽或肽文库涉及用荧光团或任何其他可检测部分标记目标蛋白质或蛋白质配偶体，以致对来自所述荧光团或可检测部分的信号的检测指示与肽的结合。可使用的荧光团的一个实例是Alexa Fluor 647NHS酯(LifeTechnologies)，其可用于根据制造商方案标记目标蛋白质。饱和度是每个分子约1个荧光团，如通过质谱测定法所测定。游离染料可在标记之后移除(例如通过旋转柱透析)。
表面等离子体共振(SPR)相互作用分析。在一些实施方案中，TfR结合可使用表面等离子体共振(SPR)来评估。本公开的肽可为烟草蚀刻病毒(TEV)可切割的，因此可作为独立可溶性蛋白质加以分析。
可分析本公开的各种肽对TfR的结合亲和力。结合亲和力可通过使用经捕获生物素化TfR进行的SPR实验来分析，所述实验可在25℃下用S系列SA芯片在Biacore T100仪器(GE Healthcare)上进行。HBS-EP+(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20)可作为运行缓冲液与0.1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)一起用于实验中。可通过孵育一系列稀释液来评估可溶性TfR结合肽的结合，其中浓度范围可视TfR结合肽而变化，所述TfR结合肽用2ug/ml TfR加以测试，从而捕获约300共振单位(RU)的蛋白质用于SPR实验。
在一些情况下，通过在两种密度的经捕获和生物素化hTfR上注射肽来进行SPR，并且所得数据可然后加以整体分析。可对于TfR与TfR结合肽之间的相互作用计算结合常数(例如KD值)以及缔合和解离速率。
在一些实施方案中，用纯化去铁转铁蛋白和全铁转铁蛋白进行SPR。全铁转铁蛋白可通过用铁溶液(例如0.4当量的Fe(NTA)2，每5分钟进行添加，直至已添加3.2当量)装载去铁转铁蛋白来从去铁转铁蛋白产生。过量铁可随后通过缓冲液更换(例如向PBS中的旋转柱透析)来移除。
圆二色谱。蛋白质二级结构可使用圆二色谱(CD)来评估。CD光谱可用Jasco J-720W分光偏振计，使用1.0mm光程长比色皿来测量。于10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中的蛋白质样品可在25-30uM蛋白浓度下。样品可在260-190nM的波长范围下加以分析。数据可以相对椭圆率[θ]；(mdeg)表示。为测定蛋白质的热稳定性，可使样品经受以2℃/min的匀变从20℃至95℃的递增性温度增加。在210nm下监测α-螺旋二级结构的稳定性和蛋白质展开。蛋白质展开也可在215nm或220nm下监测。数据可以相对椭圆率[θ]表示，所述相对椭圆率以毫度加以报告。
蛋白酶抗性测试。肿瘤环境例如含有高浓度的蛋白酶。此外，对蛋白水解(由蛋白酶达成的降解或切割)的抗性会降低例如在循环中肽降解和后续免疫原性的可能性。对蛋白水解的抗性可还增加肽的血清半衰期和肽的总体生物利用度。因此，对于本公开的肽来说，有利的是对由蛋白酶达成的降解具有抗性。
为测定对蛋白水解消化的抗性，可将本公开的各种肽与50U的猪胃蛋白酶(Sigma-Aldrich P7012)在处于pH 1.05的模拟胃液中混合，或与50U的猪胰蛋白酶(Sigma-Aldrich6567)在PBS中混合，在37℃下孵育30分钟，并且通过反相HPLC(RP-HPLC)来分析。单独地，可将肽与50U的猪胃蛋白酶(Sigma-Aldrich P7012)在处于pH 1.05的模拟胃液43中混合，或与50U的猪胰蛋白酶(Sigma-Aldrich 6567)在PBS中混合，在37℃下孵育30分钟，并且通过RP-HPLC来分析。可在PBS中孵育对照肽。所有肽都可在非还原性条件下孵育。
在一些实施方案中，SDPR蛋白酶抗性测试可在采用包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的一系列测序等级酶的情况下进行。胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂可用于HPLC分析。
在还原性条件下的肽稳定性测试。可被设计或工程改造来与细胞中的一种或多种靶蛋白诸如核中的蛋白质相互作用的肽可暴露于细胞的胞质区室中的还原性条件。因此，对于本公开的肽来说，可为有利的是在还原性条件下显示稳定性。可测试本公开的肽在10mM二硫苏糖醇(DTT)和/或10mM谷胱甘肽(GSH)中的稳定性。对于测试肽在细胞内条件下的稳定性，GSH可为一种更具生理相关性的还原剂。肽-靶蛋白相互作用的实例是肽与TfR蛋白的结合。对测试肽的稳定性可使用例如HPLC(或当使用经放射性标记肽时的放射HPLC)来评估。
热迁移测定。蛋白质熔解温度(Tm)测定可通过使用SYPRO橙染料(MolecularProbes)监测蛋白质展开来进行。简而言之，可将含0.1mg/mL蛋白质样品的20μL总体积PBS缓冲液与2μL 10X SYPRO橙染料混合。使用具有CFX96深孔实时系统的C1000 Touch热循环仪(BioRad)测定在蛋白质展开之后染料向疏水性蛋白质核心中的插入。将样品从20℃至95℃进行加热，采用每分钟0.5℃的逐步增量以及每个点保持5秒的步骤，随后进行荧光读取。通过分析相对荧光单位(RFU)的导数来计算Tm。
TfR结合肽与鼠TfR的交叉反应性。如本文公开的TfR结合肽与人和鼠Tf R的交叉反应性可使用细胞表面结合测定来进行。表面展示范式的反转进一步描述于实施例3中。用经AlexaFluor 647染料直接标记的可溶性TfR结合肽染色从它们的表面表达人或小鼠TfR的293F细胞。流式细胞术可随后用于数据分析以评估TfR结合肽的人反应性相对于小鼠反应性。
使TfR结合肽与TfR共结晶以及解析晶体结构。使TfR结合肽与TfR共结晶可如下进行。可将肽在约5-15mg/mL，在一些情况下是10mg/mL的目标浓度下再悬浮。当例如单一肽存在于溶液中而在它之中无任何其他组分时，直至80mg/mL的更高浓度可用于结晶。可通过蒸气扩散来在室温下进行结晶筛选，采用1:1蛋白质溶液:储库溶液坐滴，使用Nextal JCSG+、PEG和(NH4)2SO4析因套件(Qiagen)和亚微升机器人(TTP Labtech mosquito)来设置。可使用Rigaku MicroMax 007HF家用光源或在Advanced Light Source(Lawrence BerkleyNational Laboratory,Berkeley,CA)的光束线5.0.1来从单晶体收集衍射数据。可通过以下方式来测定初始相：分子置换(MR)，使用CCP4程序套件(Winn,M.D.,Acta Crystallogr DBiol Crystallogr.,67(Pt 4):235-42(2011))中的PHASER(McCoy,A.J.,J ApplCrystallogr.,40(Pt 4):658-674(2007))，使用来自RCSB PDB(Berman,H.M.,NucleicAcids Res.,28(1):235-42(2000))的同源性结构作为搜索模型；或硫单波长异常衍射(sSAD)(Liu,Q.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.,69(Pt 7):1314-32(2013))，使用CuKα辐射来使异常信号最大化，以及用SHELX(Sheldrick,G.M.,Acta Crystallogr DBiol Crystallogr.,66(Pt 4):479-85(2010))测定硫子结构。对于sSAD定相，可通过以1°振荡，采用180°的交替
Figure BDA0003175003630002191
旋转，通过5°楔收集数据来优化Bijvoet对测量。可用HKL2000(Otwinowski,Z.,Methods Enzymol.,276:307-326(1997))简化和定标数据。可用COOT(Emsely,P.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.,60(Pt 12Pt 1):2126-32(2004))和REFMAC(Murshudov,G.N.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.,53(Pt 3):240-55(1997))进行模型构建和细化的迭代循环。可用MolProbity(Davis,I.W.,Nucleic AcidsRes.,35(网络服务器期号):W375-83(2007))进行结构验证。
用以阐明TfR结合肽在小鼠中的生物分布的全身放射自显影术。全身放射自显影术(WBA)矢状切片可使用以下步骤来进行。可通过在N端使赖氨酸甲基化来放射性标记每种肽，如实施例14中进一步所述。因此，肽可含有甲基或二甲基赖氨酸和甲基化或二甲基化氨基末端。可将100nmol的剂量的经放射性标记肽通过尾静脉注射来施用在具有完整肾，称重是20-25g的雌性哈兰(Harlan)无胸腺裸小鼠中。可使每种经放射性标记肽在动物内自由循环所述时期，随后将动物安乐死并切片。
治疗群组的所有小鼠都可用100nmol经放射性标记肽或肽构建体(约20mg/kg)给药。对照小鼠可用盐水或PBS注射。在给药时期结束时，将小鼠冷冻在己烷/干冰浴中，然后包埋在一块冷冻羧甲基纤维素中。可制备全动物矢状薄片，所述薄片产生薄冷冻切片用于成像。薄冷冻切片可使用切片机来获得，并且允许显现组织，诸如脑、肿瘤、肝、肾、肺、心脏、脾、胰腺、肌肉、脂肪、胆囊、上胃肠道、下胃肠道、骨、骨髓、生殖道、眼、软骨、胃、皮肤、脊髓、膀胱、唾液腺以及更多组织。在成像之前使切片在冷冻器中干燥。
对于放射自显影术成像，使胶带封固的薄切片冷冻干燥，并且可使放射性样品暴露于磷光成像仪板约7天。使这些板显影，并且将来自每个器官的信号(密度计量术)以见于每个动物的心脏血液中的信号作归一化。组织中的信号暗于对那个组织中的血液预期的信号指示在某一区域、组织、结构或细胞中积累。
通过参考块内标准曲线和肽的14C比活性来实现对组织中肽的报告定量(nmol/g)。
历经某一时程的血清和组织肽水平定量。视所用放射性核素而定，离体液体闪烁计数(例如14C)或γ计数(例如所有正电子发射核素)可用于测定在特定时间点时各种器官的肽水平以及随时间的肽行为，诸如对于血液半衰期以及器官摄取和清除。治疗群组的所有小鼠都可用100nmol经放射性标记肽或肽构建体(约20mg/kg)给药。对照小鼠可用盐水或PBS注射。可使每种经放射性标记肽在动物内自由循环所述时期，随后将动物安乐死并切片。收集的器官，包括肾、肝、脑、脾、肌肉和皮肤，可在计数之前或之后加以均质化或称重。还可计数内部参考标准和对照样品。肽摄取数据可显现为每克组织的肽量，或每克(或每摩尔或每体积)的注射剂量百分比。
细胞或组织中肽摄取的一般性测定。可离体或在体内测定如本文公开的肽或肽构建体在特定细胞、细胞群体、组织或器官中的摄取。以相同方式，可离体或在体内，例如在其中运载物分子包含可检测剂的情况下，测定运载物或有效载荷递送的功效。离体分析包括器官收集和固定(例如使用4％甲醛)所收集组织，随后进行分析。组织样品可使用多种分析方法来分析，包括显微术、光谱法、流式细胞术、聚合酶链式反应(PCR)，以及通过测量超声、电磁辐射(例如UV/VIS、X-ray)或放射性。举例来说，组织摄取可通过测量细胞、细胞群体、组织或器官样品的发光或生物发光，或通过测量细胞、细胞群体、组织或器官样品的放射性，以及通过计算摄取值诸如每克(或每摩尔或每体积)的注射剂量百分比来测定。此外，对显现在特定时间点时(例如静态成像)或历经某一时程(例如动态成像)的生物分布的核图像的获取可使用各种技术(例如PET或SPECT)和经适当放射性标记的肽来进行。
MTR BBB胞吞转运模型以及实质/毛细血管分布的毛细血管消减定量。可使小鼠(品系CD-1，N＝1/时间点)麻醉，并且可通过手术暴露左侧颈静脉和右侧颈动脉。可将经标记肽(例如0.25-1μCi，于约200μL体积中；SEQ ID NO:1的比活性是22-40Ci/mol，并且SEQID NO:32的比活性是127-150Ci/mol)注射至颈静脉中。在某一时程(0-30分钟)内的给定时期之后，可收集动脉血液，随后断头并收集脑。可通过液体闪烁计数来测试脑和血清的14C水平，并且可将数据并入至多元时间回归数学模型中以定量CNS积累率。为确定这个CNS积累是限于毛细血管还是实际上代表血管胞吞转运，可在给药之后5分钟使单独一组动物(N＝3/肽)安乐死，并且使脑匀浆经受右旋糖酐密度梯度离心。这可允许从实质分离毛细血管，并且可使两种组织单独经受闪烁计数以定量14C信号。归一化信号比可为BBB穿透的指标；举例来说，SEQ ID NO:1可具有的在实质中的信号实质上高于毛细血管，此被解释为BBB胞吞转运的证据。
用于NT融合以及活化神经元CRE报告体小鼠的方法。可使用在环AMP响应元件(CRE)的控制下表达萤火虫荧光素酶的转基因小鼠。在环AMP(cAMP)升高或活化转录因子CRE结合蛋白1(CREB)的其他机制的条件下，这些小鼠中的细胞可表达荧光素酶，可在用被配制来供动物使用的荧光素静脉内给药之后在全动物发光仪器(IVIS成像仪)中测量所述荧光素酶。通过用毛喉素和咯利普兰对这些小鼠给药，可验证小鼠在适当响应元件控制下表达转基因，这两种药物刺激神经元cAMP产生并抑制它的降解(分别)。可然后如本文所述在4小时后测试用毛喉素和咯利普兰给药的动物的荧光素酶表达。在这些对照实验中，来自动物的脑的高发光水平可为典型的。可对在这个测定中验证的动物给与约1周以恢复至稳态(低)荧光素酶表达，并且可然后用神经降压素或与神经降压素融合的TfR结合蛋白测试。神经降压素受体表达可限于CNS中细胞的子组，包括额皮质。在活化后，导致CREB磷酸化和CRE介导的转录的信号转导路径可被活化。它的配体神经降压素是一种不能穿过BBB的神经肽。因此，如果CRE驱动的荧光素酶在这些小鼠的脑中被诱导，那么包含神经降压素和TfR结合肽的融合蛋白的静脉内给药可证明BBB穿透。
是NT融合物的肽构建体包括与SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205，或SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361中的任一者具有至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性的任何序列。
制造方法
各种表达载体/宿主系统可用于重组表达本文所述的肽。此类系统的非限制性实例包括微生物，诸如用含有编码本文所述的肽、肽构建体，或肽融合蛋白/嵌合蛋白的核酸序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌，用含有以上提及的核酸序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有以上提及的核酸序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统，用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV))感染，或用含有以上提及的核酸序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统，或用重组病毒表达载体(例如腺病毒、痘苗病毒、慢病毒)感染的动物细胞系统，包括被工程改造来含有以上提及的核酸序列的多个拷贝的细胞系，所述多个拷贝是稳定扩增的(例如CHO/dhfr、CHO/谷氨酰胺合成酶)，或在双微染色体中不稳定扩增(例如鼠细胞系)。二硫键形成和肽的折叠可在表达期间，或在表达之后，或在表达期间以及在表达之后发生。
宿主细胞可适合于表达本文所述的一种或多种肽。宿主细胞可为原核、真核或昆虫细胞。在一些情况下，宿主细胞能够以所需特定方式调节插入序列的表达，或修饰和加工基因或蛋白质产物。举例来说，从某些启动子的表达可在某些诱导剂(例如用于金属硫蛋白启动子的锌和镉离子)存在下升高。在一些情况下，肽产物的修饰(例如磷酸化)和加工(例如切割)对于肽的功能可为重要的。宿主细胞可具有用于肽的翻译后加工和修饰的特征和特定机制。在一些情况下，用于表达肽的宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。
在基于细胞或病毒的样品的情况下，可在纯化之前处理生物体以保持和/或释放靶标多肽。在一些实施方案中，使用固定剂固定细胞。在一些实施方案中，使细胞溶解。细胞材料可以不破坏显著比例的细胞，但从细胞材料的表面，以及/或者从细胞之间的空隙移除蛋白质的方式加以处理。举例来说，细胞材料可被浸渍在液体缓冲液中，或在植物材料的情况下，可经受真空，以移除位于细胞间隙中以及/或者植物细胞壁中的蛋白质。如果细胞材料是微生物，那么可从微生物培养基提取蛋白质。或者，肽可被包装在包涵体中。包涵体可进一步与培养基中的细胞组分分离。在一些实施方案中，细胞未被破坏。由细胞或病毒呈现的细胞肽或病毒肽可用于完整细胞或病毒颗粒的附着和/或纯化。除重组系统之外，肽还可使用蛋白质和肽合成中采用的多种已知技术来在无细胞系统中合成，随后提取。
在一些情况下，宿主细胞产生具有用于运载物分子(例如治疗剂)的连接点的肽。连接点可包括赖氨酸残基、N端、半胱氨酸残基、半胱氨酸二硫键、谷氨酸或天冬氨酸残基、C端，或非天然氨基酸。肽还可以合成方式产生，诸如通过固相肽合成，或溶液相肽合成。肽合成可通过芴基甲基氧基羰基(Fmoc)化学或通过丁基氧基羰基(Boc)化学来进行。肽可在合成期间，或在合成之后，或在合成期间以及在合成之后折叠(形成二硫键)。肽片段可以合成方式或以重组方式产生。肽片段可然后以酶法或以合成方式接合在一起。
在其他方面，本公开的肽可通过常规固相化学合成技术，例如根据Fmoc固相肽合成方法(“Fmoc solid phase peptide synthesis,a practical approach,”由W.C.Chan和P.D.White编著,Oxford University Press,2000)来制备。
在一些实施方案中，本公开的肽可在制造期间更稳定。举例来说，本公开的肽可在重组表达和纯化期间更稳定，从而导致由存在于制造过程中的蛋白酶达成的降解率较低，肽的纯度较高，肽的产率较高，或它们的任何组合。在一些实施方案中，肽还可对在制造、储存和销售期间在高温以及低温下的降解更稳定。举例来说，在一些实施方案中，本公开的肽在25℃下可为稳定的。在其他实施方案中，本公开的肽在70℃或高于70℃下可为稳定的。在一些实施方案中，本公开的肽在100℃或高于100℃下可为稳定的。
药物组合物
本公开的药物组合物可为如本文所述的任何肽与其他化学组分的组合，所述其他化学组分诸如是载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂、抗氧化剂、增溶剂、缓冲剂、渗透剂、盐、表面活性剂、氨基酸、囊封剂、增积剂、低温保护剂和/或赋形剂。药物组合物有助于向生物体施用本文所述的肽。在一些情况下，药物组合物包含延长肽的半衰期并且/或者帮助肽穿透靶细胞的因子。
药物组合物可通过各种形式和途径以药物组合物形式以治疗有效量施用，所述各种形式和途径包括例如静脉内、皮下、肌内、经直肠、气雾剂、胃肠外、经眼、经肺、经皮、经阴道、经眼部、经鼻、口服、舌下、吸入、经真皮、鞘内、肿瘤内、鼻内和局部施用。药物组合物可以局部或全身方式施用，例如通过将本文所述的肽直接注射至器官中，任选地于储库中。
胃肠外注射液可被配制以用于团式注射或连续输注。药物组合物可呈作为于油性或水性媒介物中的无菌混悬剂、溶液或乳液的适于胃肠外注射的形式，并且可含有配制剂，诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。用于胃肠外施用的药物制剂包括呈水溶性形式的本文所述的肽的水溶液。本文所述的肽-抗体复合物的混悬剂可制备成油性注射混悬剂。适合亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油诸如芝麻油，或合成脂肪酸酯诸如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。混悬剂还可含有适合稳定剂或增加本文所述的此类肽-抗体复合物的溶解性并且/或者降低所述复合物的聚集以允许制备高度浓缩溶液的剂。
用以增加如本文所述的肽的细胞穿透的制剂或方法可包括但不限于使用高剂量的如本文所述的肽，诸如直至10μM；使Tat肽或细胞穿透肽或它们的变体或衍生物缀合或融合于肽；共同递送Tat肽或细胞穿透肽或它们的变体或衍生物与肽；使Arg补丁缀合或融合于肽；或共同递送肽与Arg补丁肽，诸如直至10μM。在一些实施方案中，蛋白质转染剂、肽的直接胞质表达，或肽的电穿孔可用于增加细胞穿透。在一些实施方案中，其他赋形剂可与肽一起配制以增加所述肽的细胞穿透，诸如“Protein and Peptide Drug Delivery:OralApproaches”Indian J.Pharm.Sci.,Shaji和Patole,v70(3)269-277,2008中所述的那些方法。这些制剂或方法的任何组合都可用于增加如本文所述的肽的细胞穿透。
或者，本文所述的肽可被冻干，或呈用于在使用之前用适合媒介物例如无菌无热原水复原的粉末形式。在一些实施方案中，纯化肽以静脉内方式施用。本文所述的肽可被施用至受试者以归巢至、靶向、迁移至，或定向至CNS细胞、脑细胞、癌细胞，或肿瘤。在一些实施方案中，肽可缀合于、连接于或融合于提供对中枢神经系统中或穿过血脑屏障的特定靶细胞类型的靶向功能的另一肽。示例性靶细胞包括CNS细胞、红细胞、红细胞前体细胞、免疫细胞、干细胞、肌肉细胞、脑细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、骨髓细胞、阑尾细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、脾细胞、肌肉细胞、肝细胞、胆囊细胞、胰腺细胞、胃肠道细胞、腺细胞、肾细胞、膀胱细胞、内皮细胞、上皮细胞、脉络丛上皮细胞、神经元、神经胶质细胞、星形细胞，或与神经系统相关的细胞。
本公开的肽可在手术程序期间直接施加至器官，或器官组织或细胞，诸如脑或脑组织或细胞。本文所述的重组肽可局部施用，并且可配制成多种可局部施用的组合物，诸如溶液、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂、含药棒、香膏剂、乳膏剂和软膏剂。此类药物组合物可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
在实施本文提供的治疗或使用方法时，治疗有效量的本文所述的肽可以药物组合物形式施用至罹患影响免疫系统的疾患的受试者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如人或灵长类动物。治疗有效量可视疾病的严重性、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的效能以及其他因素而广泛变化。
在一些实施方案中，肽被克隆至病毒或非病毒表达载体中。此表达载体可被包装在以基因疗法形式施用至患者的病毒颗粒、病毒颗粒，或非病毒载体或递送机构中。在其他实施方案中，提取并修饰患者细胞以表达能够离体结合TfR的肽，随后使经修饰细胞以基于细胞的疗法形式返回至患者中，以致一旦移植回患者中，经修饰细胞就将表达所述肽。
药物组合物可使用一种或多种有助于将活性化合物加工成可在药学上使用的制剂的生理上可接受的载体来配制，所述载体包括赋形剂和助剂。视所选施用途径而定，配方可加以修改。包含本文所述的肽的药物组合物可例如通过以下方式来制造：在重组系统中表达所述肽，纯化所述肽，将所述肽冻干，混合、溶解、粒化、糖衣片制备、磨细、乳化、囊封、包封或压制工艺。药物组合物可包括至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以及呈游离碱或药学上可接受的盐形式的本文所述的化合物。
用于制备包含本文所述的化合物的本文所述的肽的方法包括将本文所述的肽与一种或多种惰性药学上可接受的赋形剂或载体一起配制以形成固体、半固体或液体组合物。固体组合物包括例如粉剂、片剂、可分散颗粒剂、胶囊、扁囊剂和栓剂。这些组合物还可含有少量无毒辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂以及其他药学上可接受的添加剂。
药学上可接受的赋形剂的非限制性实例可例如见于以下中：Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems,第7版(Lippincott Williams&Wilkins1999)，所述文献中的每一者通过引用以它的整体并入本文。
药物组合物还可包括渗透或吸收增强剂(Aungst等人AAPS J.14(1):10-8.(2012)以及Moroz等人Adv Drug Deliv Rev 101:108-21.(2016))。渗透增强剂可有助于分子从GI道摄取至体循环中。渗透增强剂可包括中链脂肪酸的盐、癸酸钠、辛酸钠、N-(8-氨基)辛酸(SNAC)、N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸(5-CNAC)、亲水性芳族醇诸如苯氧基乙醇、苯甲醇和苯基醇，壳聚糖、烷基糖苷、2-N,N-二甲基氨基丙酸十二酯(DDAIPP)、二价阳离子的螯合剂，包括EDTA、EGTA和柠檬酸，烷基硫酸钠、水杨酸钠、基于卵磷脂的剂或胆汁盐衍生剂诸如脱氧胆酸盐。
组合物还可包括蛋白酶抑制剂，包括大豆胰蛋白酶抑制剂、抑肽酶、甘胆酸钠、甲磺酸卡莫司他(camostat mesilate)、杆菌肽或环十五内酯。
肽在治疗中的用途
在一些实施方案中，方法包括将有效量的如本文所述的肽施用至有需要的受试者。
在一个实施方案中，方法包括将有效量的如本文所述的肽施用至有需要的受试者。
TfR可在各种组织诸如脑、胃、肝或胆囊中表达。因此，本公开的TfR结合肽可用于诊断和治疗与各种组织和器官相关的疾病和疾患。举例来说，药物向这些组织和器官的递送可通过使用携带诊断和/或治疗有效载荷的本文所述的肽和肽构建体来改善。
如本文所用的术语“有效量”是指所施用的剂或化合物的将在一定程度上减轻所治疗疾病或疾患的症状中的一者或多者的足够量。结果可为疾病的征象、症状或原因的减轻和/或缓和，或生物系统的任何其他所需改变。含有此类剂或化合物的组合物可被施用以达成防治性、增强性和/或治疗性治疗。在任何单个情况下的适当“有效”量都可使用诸如剂量逐步升高研究的技术来确定。
本公开的方法、组合物和药盒可包括用以预防、治疗、遏止、逆转或改善疾患的症状的方法。治疗可包括用本公开的肽治疗受试者(例如受疾病或疾患折磨的个体、家养动物、野生动物，或实验室动物)。疾病可为癌症或肿瘤。在治疗疾病时，肽可接触肿瘤或癌细胞。受试者可为人。受试者可为人；非人灵长类动物，诸如黑猩猩、以及其他猿和猴物种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，诸如兔、犬和猫；实验室动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠，等。受试者可处于任何年龄。受试者可为例如年长成人、成人、青少年、青春期前的少年、儿童、学步儿(toddler)、婴儿和在子宫内的胎儿。
治疗可在疾病的临床发作之前向受试者提供。治疗可在疾病的临床发作之后向受试者提供。治疗可在疾病的临床发作之后1天、1周、6个月、12个月或2年或更久后向受试者提供。治疗可在疾病的临床发作之后向受试者提供，持续超过1天、1周、1个月、6个月、12个月、2年或更久。治疗可在疾病的临床发作之后向受试者提供，持续小于1天、1周、1个月、6个月、12个月、2年。治疗还可包括在临床试验中治疗人。治疗可包括向受试者施用药物组合物，诸如遍及本公开所述的药物组合物中的一者或多者。治疗可包括每日一次给药。治疗可包括以静脉内、皮下、肌内、通过吸入、经真皮、局部、通过关节内注射、口服、舌下、鞘内、经皮、鼻内、通过腹膜途径、直接向肿瘤中例如直接注射至肿瘤中、直接向脑中例如通过脑室内途径，或直接向关节上例如通过局部、关节内注射途径的方式将本公开的肽递送至受试者。治疗可包括以静脉内、皮下、肌内、通过吸入、通过关节内注射、经真皮、局部、口服、鞘内、经皮、鼻内、胃肠外、口服、通过腹膜途径、经鼻、舌下，或直接向癌性组织上的方式将肽-活性剂复合物施用至受试者。
本文所述的肽和肽构建体(例如肽缀合物或重组产生的肽构建体)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如通过囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如通过胞吞作用，诸如受体介导的胞吞作用)的转运或在组织中的积累可在各种细胞、组织和器官特别是表达和/或过度表达TfR的那些细胞组织或器官中的许多疾病、疾患或病症中具有影响，所述疾病、疾患或病症诸如是与细胞生长、细胞增殖、血管生成、器官发生、肿瘤进展、和/或转移、细胞死亡(例如衰老)、神经变性和疼痛相关的那些。在一些实施方案中，肽构建体(例如肽-NT构建体)与多巴胺信号传导神经元相互作用以减轻疼痛。包含结合TfR的本文公开的肽中的任一者的组合物或其药物组合物可用于在多种癌症的情况下治疗、预防或诊断癌症、肿瘤进展、细胞生长调控异常的方法中，所述多种癌症包括卵巢癌、结肠癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤、以及肺癌、位于骨或骨髓中的癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、以及弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、骨髓细胞癌，或皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤，或CMYC过度表达性癌。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽使得能够达成向肿瘤细胞、骨髓细胞(例如红系前体细胞)、脾细胞、免疫细胞、唾液腺癌，或肌肉细胞的递送。本公开的TfR结合肽与用于治疗或预防神经和CNS相关病症(例如神经变性疾病)的药物组合使用。额外疾病、病症或病状可包括多发性骨髓瘤、再生障碍性贫血、骨髓发育不良和相关骨髓衰竭综合征、骨髓增生性疾病、急性和慢性髓性白血病、淋巴系细胞的恶性肿瘤、血液恶性肿瘤、浆细胞病症、骨骼肌病症、肌病变、肌营养不良(例如贝克尔(Becker)肌营养不良、杜兴(Duchenne)肌营养不良、艾梅-德莱富斯(Emery-Dreifuss)肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良、先天性肌强直和肌强直性营养不良)、以及慢性阻塞性肺病症。在一些实施方案中，本文公开的组合物/肽用于治疗与任何以下细胞、组织或器官类型相关的细胞生长调控异常、癌症、肿瘤和/或转移：脑、肺、肝、脾、肾、淋巴结、小肠、血细胞、骨髓细胞、造血干细胞、胰腺、结肠、胃、子宫颈、乳腺、子宫内膜、肌肉、结缔组织、前列腺、睾丸、卵巢、皮肤、头颈部、食道、口腔组织和骨髓。在其他实施方案中，本文公开的组合物/肽用于治疗任何以下疾病：肉瘤、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、肝细胞癌、恶性间皮瘤、许旺细胞瘤(schwannoma)、脑脊髓膜瘤、肾癌、胆管癌、胆管错构瘤、软组织癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、结肠腺瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、胃肠增生、纤维肉瘤、胰腺导管化生、鳞状细胞癌、卡波西氏肉瘤(kaposis sarcoma)、以及HIV诱导的非霍奇金氏淋巴瘤(HIV-induced non-Hodgkin'slymphoma)。
在各种实施方案中，本公开提供了使得能够达成TfR介导的穿过细胞层(例如内皮细胞或上皮细胞)或细胞膜的转运的方法和组合物。除BBB之外，各种其他细胞、组织和器官也表达TfR。表达TfR的单一细胞可包括肝细胞、骨髓中的红细胞和红细胞前体、免疫细胞、干细胞和快速分裂细胞。表达TfR的组织和器官可包括脑(例如大脑皮质、海马、尾状核、小脑)、内分泌组织(例如甲状腺、甲状旁腺和肾上腺)、骨髓和免疫系统(例如阑尾、淋巴结、扁桃体、脾)、肌肉组织(例如心肌、骨骼肌和平滑肌)、肝、胆囊、胰腺、胃肠道(例如口腔粘膜、食道、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠)、肾、膀胱、雌性组织(例如输卵管、乳腺、阴道、子宫颈、子宫内膜、卵巢和胎盘)、脂肪和软组织、以及皮肤。因此，本公开的TfR结合肽可用于靶向这些细胞、组织和器官，并且通过例如TfR介导的胞吞转运(例如穿过细胞屏障诸如BBB)或TfR介导的胞吞作用(例如穿过细胞膜进入细胞中)来将活性剂递送至这些细胞、组织和器官。
在各种实施方案中，本公开提供了使得能够达成TfR介导的向表达TfR的肿瘤细胞的转运和递送的方法和组合物。过度表达TfR的癌可包括卵巢癌、结肠癌、肺癌、位于骨或骨髓中的癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、骨髓细胞癌、皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤，或CMYC过度表达性癌。脑癌包括但不限于胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤和弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤。
可用于预防和/或治疗癌症的TfR结合肽构建体是包含TfR结合肽和具有抗肿瘤活性的活性剂诸如IL15、IL15/IL15Ra融合物、IFNγ和抗CD3剂的那些。包含具有抗肿瘤活性的活性剂的TfR结合肽构建体的实例是具有以SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332中的任一者阐述的氨基酸序列的那些。具有活性肿瘤活性的活性剂(例如IL15、IL15/IL15Ra融合物、IFNγ，或抗CD3剂)可融合于TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ IDNO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)以形成肽-活性剂构建体。
本文所述的肽和肽构建体(例如肽缀合物或重组产生的肽构建体)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如通过TfR介导的囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如通过TfR介导的胞吞作用)的转运可在受试者(例如人)中的与慢性疼痛(例如头痛或偏头痛)、神经病变性疼痛、肥胖症、胰岛素抵抗、阿片成瘾或其他神经或精神病症相关的许多疾病、疾患或病症中具有影响。在一些实施方案中，肽构建体(例如肽-NT构建体)与多巴胺信号传导神经元相互作用以减轻疼痛。
本文所述的肽和肽构建体(例如肽缀合物、融合肽，或重组产生的肽构建体)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如通过囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如通过胞吞作用)的转运可在与神经变性相关的许多疾病、疾患或病症中具有影响。可用本文所述的TfR结合肽治疗、预防或诊断的神经变性疾病可包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、弗里德赖希共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩、运动神经元疾病、莱姆病、共济失调-毛细血管扩张、常染色体显性小脑共济失调、巴登病、皮质基底综合征、克罗伊茨费尔特–雅各布病、X染色体脆折相关震颤/共济失调综合征、库福–拉基布综合征、马查多–约瑟夫病、多发性硬化症、慢性创伤性脑病变，或额颞叶痴呆。在一些情况下，TfR结合肽可与BACE抑制剂、加兰他敏、金刚烷胺、苯扎托品、比哌立登、溴隐亭、卡比多巴、多奈哌齐、恩他卡朋、左旋多巴、培高利特、普拉克索、丙环定、利伐斯的明、罗匹尼罗、司来吉兰、他克林、托卡朋或三己芬迪组合用于治疗和/或预防神经变性疾病。
在一些实施方案中，使用TfR结合肽和离子通道调节剂诸如Kv1.3钾通道抑制剂缀合物或肽构建体调节(例如抑制)离子通道诸如Kv1.3钾通道可用于治疗或预防脑中的炎症。Kv1.3钾通道例如可在脑中的小神经胶质细胞上高度表达。因此，神经炎症性和神经变性疾病诸如多发性硬化症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、创伤性脑损伤、放射疗法毒性以及其他神经变性和神经炎症性疾病可用缀合于、连接于或融合于Kv1.3抑制剂的TfR结合肽治疗。这些疾病的标志可在于Kv1.3的上调。在一些情况下，Kv1.3抑制可由于它对效应T细胞的作用而用于治疗银屑病和其他非脑自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽可用于治疗和预防克罗恩氏病，或更一般来说，炎症性肠病。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽显示在肠的可表达高量TfR的腺细胞中的高摄取和保留。
在一些实施方案中，本公开的肽或肽构建体(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQID NO:361)由于它们在各种生物环境中增强的稳定性而用于到达和治疗这些病症，所述生物环境包括低pH、蛋白酶富集环境、酸性环境、还原环境，或具有不同温度的环境。
在一些实施方案中，组合物包含本文公开的TfR结合肽中的任一者，并且能够穿过细胞层或细胞屏障诸如内皮层(例如BBB)或上皮层，或细胞膜来转运每个TfR结合肽对应的一个或多个运载物分子或活性剂。在一些实施方案中，运载物分子或活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15、IL-15/IL-15Ra复合物剂融合物、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀或神经递质诸如神经降压素。
肽药盒
在一个方面，本文所述的肽可以药盒形式提供。在另一实施方案中，本文所述的肽构建体可以药盒形式提供。在另一实施方案中，药盒包括编码本文所述的肽的氨基酸、载体、宿主生物体和说明手册。在一些实施方案中，药盒包括关于肽的使用或施用的书面说明。
带编号的实施方案
以下实施方案叙述本文公开的特征的组合的非限制性排列。还考虑特征的组合的其他排列。具体地说，这些带编号的实施方案中的每一者应考虑为从属于或相关于每个先前或后续带编号的实施方案，而与如所列出的它们的顺序无关。1.一种组合物，所述组合物包含经工程改造转铁蛋白受体(TfR)结合肽或其变体、同源物、片段或类似物。2.一种包含肽构建体的组合物，其中所述肽构建体包含：a)转铁蛋白受体(TfR)结合肽或其变体、同源物、片段或类似物；以及b)活性剂，其中所述肽缀合于、连接于或融合于所述活性剂。3.如实施方案1-2中的任一者所述的组合物，其中所述TfR是人TfR，或鼠TfR，或人TfR和鼠TfR。4.一种包含经工程改造肽的组合物，所述经工程改造肽与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或功能性片段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。5.如实施方案1-4中的任一者所述的组合物，其中所述肽穿透包含内皮细胞的细胞层。6.如实施方案5所述的组合物，其中所述内皮细胞是脑血管内皮细胞。7.如实施方案1-6中的任一者所述的组合物，其中所述肽穿透包含血脑屏障(BBB)的细胞层。8.如实施方案1-7中的任一者所述的组合物，其中所述肽通过TfR介导的胞吞转运来穿透包含内皮细胞的细胞层。9.如实施方案1-8中的任一者所述的组合物，其中所述肽穿透膜，并且其中所述膜是细胞的膜。10.如实施方案9所述的组合物，其中所述细胞表达TfR。11.如实施方案9-10中的任一者所述的组合物，其中所述肽通过TfR介导的胞吞作用来穿透所述细胞的所述膜。12.如实施方案1-11中的任一者所述的组合物，其中所述肽能够定位在表达TfR的任何细胞中，或与表达TfR的任何细胞一起定位。13.如实施方案1-12中的任一者所述的组合物，其中所述肽保持结合于表达TfR的细胞表面膜。14.如实施方案1-13中的任一者所述的组合物，其中所述肽通过结合TfR来内化至细胞中。15.如实施方案1-14中的任一者所述的组合物，其中所述肽通过结合TfR，然后从TfR解离来穿过所述血脑屏障递送至CNS。16.如实施方案1-15中的任一者所述的组合物，其中所述肽通过受体介导的胞吞转运来穿过所述血脑屏障加以递送。17.如实施方案9-16中的任一者所述的组合物，其中所述细胞是CNS细胞、红细胞、红细胞前体细胞、免疫细胞、干细胞、肌肉细胞、脑细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、骨髓细胞、阑尾细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、脾细胞、肌肉细胞、肝细胞、胆囊细胞、胰腺细胞、胃肠道细胞、腺细胞、肾细胞、膀胱细胞、内皮细胞、上皮细胞、脉络丛上皮细胞、神经胶质细胞、星形细胞，或与神经系统相关的细胞。18.如实施方案9-17中的任一者所述的组合物，其中所述细胞是肿瘤细胞。19.如实施方案18所述的组合物，其中所述肿瘤细胞是卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、位于骨或骨髓中的癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、星形细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞、髓母细胞瘤细胞、室管膜瘤细胞、脉络丛癌细胞、中线神经胶质瘤细胞、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、脑癌细胞、脾癌细胞、唾液腺癌细胞、肾癌细胞、肌肉癌细胞、骨髓细胞癌细胞、皮肤癌细胞、泌尿生殖系统癌细胞、骨肉瘤细胞、肌肉源性肉瘤细胞、黑素瘤细胞、头颈癌细胞、神经母细胞瘤细胞、前列腺癌细胞、膀胱癌细胞、急性淋巴细胞性白血病细胞、急性髓性白血病细胞、慢性淋巴细胞性白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、霍奇金氏淋巴瘤细胞、非霍奇金氏淋巴瘤细胞，或CMYC过度表达性癌细胞。20.如实施方案1-19中的任一者所述的组合物，其中所述肽定位于器官或组织。21.如实施方案20所述的组合物，其中所述器官或组织是脑、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、骨髓、阑尾、淋巴结、扁桃体、脾、肌肉、肝、胆囊、胰腺、胃肠道、肾、膀胱、输卵管、乳腺、阴道、子宫颈、子宫内膜、卵巢、胎盘和皮肤。22.如实施方案9-21中的任一者所述的组合物，其中所述肽定位在其中的所述细胞或器官过度表达TfR。23.如实施方案22所述的组合物，其中过度表达所述TfR的所述细胞或器官是肿瘤细胞或癌性组织。24.如实施方案22-23中的任一者所述的组合物，其中所述肽定位于所述器官的实质。25.如实施方案1-24中的任一者所述的组合物，其中所述肽结合至少一个选自对应于人TfR1(UniProtKB-P02786)的SEQ ID NO:363的残基506-510、523-531，或611-662的组的氨基酸残基。26.如实施方案1-25中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含SEQ IDNO:206–SEQ ID NO:224以及SEQ ID NO:334–SEQ ID NO:344。27.如实施方案1-26中的任一者所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50和Q51或它们的任何组合的表面界面残基。28.如实施方案1-27中的任一者所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于位置3、4、9、11、15、16、19、23、26、28、29、30、31、32、33、35、36、37、39和40中的任一者或它们的任何组合的亲水性表面远端残基。29.如实施方案28所述的组合物，其中所述亲水性表面远端残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。30.如实施方案26-29中的任一者所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39和D40的亲水性表面远端残基中的任一者或它们的任何组合。31.如实施方案1-30中的任一者所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于15、35、39或49中的任一者或它们的任何组合的位置处包含亲水性残基。32.如实施方案28所述的组合物，其中所述亲水性残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。33.如实施方案31-32中的任一者所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于D15、E35、E39和H49或它们的任何组合的亲水性残基。34.如实施方案1-33中的任一者所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于11、25或27或它们的任何组合的位置处包含疏水性残基。35.如实施方案34所述的组合物，其中所述疏水性残基选自氨基酸A、M、I、L、V、F、W或Y或它们的任何组合。36.如实施方案34-35中的任一者所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于M11、M25、M27的疏水性残基中的任一者或它们的任何组合。37.如实施方案1-36中的任一者所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于位置45的脂族残基。38.如实施方案37所述的组合物，其中所述脂族残基选自氨基酸A、M、I、L或V。39.如实施方案37-38中的任一者所述的组合物，其中以SEQ IDNO:32为参考，所述肽包含对应于L45的脂族残基。40.如实施方案1-39中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键，或至少五个二硫键。41.如实施方案1-40中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含三个二硫键。42.如实施方案1-41中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含至少两个、至少四个，或至少六个半胱氨酸残基。43.如实施方案1-42中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含六个半胱氨酸残基。44.如实施方案1-43中的任一者所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于C6、C10、C20、C34、C44和C48或它们的任何组合的位置处包含半胱氨酸残基。45.如实施方案1-44中的任一者所述的组合物，其中所述肽的至少一个半胱氨酸残基参与二硫键。46.如实施方案43所述的组合物，其中所述六个半胱氨酸残基参与二硫键。47.如实施方案1-46中的任一者所述的组合物，其中二硫键增加所述肽的稳定性。48.如实施方案1-47中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202、SEQ IDNO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。49.如实施方案1-48中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQID NO:202、SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段的序列。50.如实施方案1-49中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含以SEQ ID NO:1阐述的序列。51.如实施方案1-49中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含以SEQ ID NO:2阐述的序列。52.如实施方案1-49中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含以SEQ ID NO:4阐述的序列。53.如实施方案1-49中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含以SEQ ID NO:30阐述的序列。54.如实施方案1-49中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含以SEQ ID NO:32阐述的序列。55.如实施方案1-54中的任一者所述的组合物，其中包含三个二硫键的所述肽源于胱氨酸密集肽(CDP)。56.如实施方案1-55中的任一者所述的组合物，其中包含三个二硫键的所述肽是CDP。57.如实施方案1-56中的任一者所述的组合物，其中所述肽与转铁蛋白或其同源物、变体或片段竞争结合TfR。58.如实施方案1-57中的任一者所述的组合物，其中所述肽螯合TfR，或阻止另一蛋白结合TfR。59.如实施方案1-58中的任一者所述的组合物，其中相较于转铁蛋白或其内源性衍生物的亲和力或特异性，所述肽对TfR具有相等或更大的亲和力或特异性。60.如实施方案1-59中的任一者所述的组合物，其中相较于转铁蛋白或其内源性衍生物的解离常数，所述肽关于TfR具有相等或更低的解离常数。61.如实施方案60所述的组合物，其中所述肽具有小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM，或小于0.1nM的KD。62.如实施方案1-61中的任一者所述的组合物，其中所述肽穿透靶细胞，或定位至靶细胞中。63.如实施方案1-62中的任一者所述的组合物，其中所述肽还与细胞穿透部分一起配制，融合于或缀合于细胞穿透部分。64.如实施方案63所述的组合物，其中所述细胞穿透部分包括聚阳离子、聚有机酸、内体释放聚合物、聚(2-丙基丙烯酸)、聚(2-乙基丙烯酸)、Tat肽、Arg补丁、打结肽、CysTAT、S19-TAT、R8(SEQ ID NO:73)、pAntp、Pas-TAT、Pas-R8(SEQ ID NO:76)、Pas-FHV、Pas-pAntP、F2R4(SEQ ID NO:79)、B55、绿纹树蛙肽、IMT-P8、BR2、OMOTAG1、OMOTAG2、pVEC、SynB3、DPV1047、C105Y、转运肽、MTS、hLF、PFVYLI(SEQ ID NO:93)、maurocalcine、imperatoxin、hadrucalin、hemicalcin、opicalcin-1、opicalcin-2、中期因子(62-104)、MCoTI-II、氯毒素、DRI-TAT、cFΦR4(SEQ ID NO:96)、R6W3(SEQ ID NO:421)、肉豆蔻酸酯、yBBR，或它们的片段或变体，或它们的任何组合。65.如实施方案63所述的组合物，其中所述细胞穿透部分是maurocalcin、imperatoxin、hadrucalcin、hemicalcin、opicalcin-1、opicalcin-2、中期因子(62-104)、MCoTI-II或氯毒素。66.如实施方案63所述的组合物，其中所述细胞穿透部分是SEQ ID NO:71–SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:98–SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:116–SEQ ID NO:126，或SEQ ID NO:403–SEQ ID NO:455中的任一者。67.如实施方案1-66中的任一者所述的组合物，其中所述肽靶向组织或细胞，归巢至组织或细胞，在组织或细胞中积累，或选择性穿透组织或细胞。68.如实施方案1-67中的任一者所述的组合物，其中所述肽定位至靶细胞的核中。69.如实施方案68所述的组合物，其中通过与核定位信号肽或部分一起配制，融合于或缀合于核定位信号肽或部分，所述肽定位至所述靶细胞的核中。70.如实施方案1-69中的任一者所述的组合物，其中所述肽还缀合于、连接于或融合于靶向癌性组织或癌细胞，归巢至癌性组织或癌细胞，在癌性组织或癌细胞中积累，或选择性穿透癌性组织或癌细胞的部分或第二肽。71.如实施方案1-70中的任一者所述的组合物，其中所述部分或第二肽是打结肽或其变体或片段。72.如实施方案68-71中的任一者所述的组合物，其中所述靶细胞是癌细胞或肿瘤细胞。73.如实施方案68-72中的任一者所述的组合物，其中所述靶细胞是CNS细胞、红细胞、红细胞前体细胞、免疫细胞、干细胞、肌肉细胞、脑细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、骨髓细胞、阑尾细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、脾细胞、肌肉细胞、肝细胞、胆囊细胞、胰腺细胞、胃肠道细胞、腺细胞、肾细胞、膀胱细胞、内皮细胞、上皮细胞、脉络丛上皮细胞、神经胶质细胞、星形细胞，或与神经系统相关的细胞。74.如实施方案1-73中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含穿过二硫结的二硫键。75.如实施方案1-74中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含在半胱氨酸残基之间形成的多个二硫键。76.如实施方案1-75中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含在半胱氨酸残基之间形成的三个或更多个二硫键，其中所述二硫键中的一者穿过由两个其他二硫键形成的环。77.如实施方案1-76中的任一者所述的组合物，其中所述肽不包含二硫键或二硫结。78.如实施方案1-77中的任一者所述的组合物，其中所述肽的至少一个氨基酸残基呈L构型，或其中至少一个氨基酸残基呈D构型。79.如实施方案1-78中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个带正电荷残基。80.如实施方案1-79中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个连续的带正电荷残基。81.如实施方案1-80中的任一者所述的组合物，其中所述带正电荷残基是Arg、Lys，或它们的任何组合。82.如实施方案1-81中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含Arg补丁。83.如实施方案1-82中的任一者所述的组合物，其中所述肽在N端包含两个或更多个连续Arg残基。84.如实施方案1-83中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含Tat肽或其片段。85.如实施方案84所述的组合物，其中所述Tat肽包含序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:99)、GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:100)，或它们的片段或变体。86.如实施方案84-85中的任一者所述的组合物，其中所述Tat肽使用具有序列(GS)x(SEQ ID NO:105)或GxSy(SEQ ID NO:104)的接头来附加于所述肽的N端或C端，其中x和y独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。87.如实施方案84-86中的任一者所述的组合物，其中所述Tat肽附加于所述肽的任何残基。88.如实施方案1-87中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个半胱氨酸残基。89.如实施方案1-88中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含一个或多个具有带负电荷残基的区域。90.如实施方案1-89中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含一个或多个具有带正电荷残基的区域。91.如实施方案1-90中的任一者所述的组合物，其中所述肽序列包含至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58个残基、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65、至少66、至少67、至少68、至少69、至少70、至少71、至少72、至少73、至少74、至少75、至少76、至少77、至少78、至少79、至少80或至少81个氨基酸残基。92.如实施方案1-91中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含或源于人蛋白质或肽。93.如实施方案1-92中的任一者所述的组合物，其中所述肽与至少一个其他肽以多聚结构排列。94.如实施方案93所述的组合物，其中所述多聚结构包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或七聚体。95.如实施方案1-94中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含在约3.0至约10.0的范围内的等电点。96.如实施方案1-95中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含在约4.5至约8.9的范围内的等电点。97.如实施方案1-96中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含非均一电荷分布。98.如实施方案1-97中的任一者所述的组合物，其中所述肽在生理或细胞内pH值下是稳定的。99.如实施方案1-98中的任一者所述的组合物，其中所述肽在约7或7.5的pH下是稳定的。100.如实施方案1-99中的任一者所述的组合物，其中所述肽在约6.5至7.5的pH下是稳定的。101.如实施方案1-100中的任一者所述的组合物，其中所述肽在小于或等于约5.0，小于或等于约3.0，或在约3.0至约5.0的范围内的pH值下是稳定的。102.如实施方案1-101中的任一者所述的组合物，其中所述肽在处于约5.0至约7.0的范围内的pH值下是稳定的。103.如实施方案1-102中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含疏水性核心。104.如实施方案1-103中的任一者所述的组合物，其中所述肽对蛋白酶降解具有抗性。105.如实施方案104所述的组合物，其中所述蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血清蛋白酶、细胞内蛋白酶中的任一者或它们的任何组合。106.如实施方案1-105中的任一者所述的组合物，其中所述肽对还原具有抗性，或在还原环境中是稳定的。107.如实施方案106所述的组合物，其中所述还原或还原环境包括DTT或GSH。108.如实施方案1-107中的任一者所述的组合物，其中所述肽在高温下是稳定的。109.如实施方案1-108中的任一者所述的组合物，其中所述肽展现抗癌作用。110.如实施方案1-109中的任一者所述的组合物，其中所述肽包含一个或多个化学修饰。111.如实施方案110所述的组合物，其中所述化学修饰改进所述肽的一种或多种药代动力学性质。112.如实施方案110-111中的任一者所述的组合物，其中所述化学修饰延长所述肽的血浆半衰期和/或生物半衰期。113.如实施方案110-112中的任一者所述的组合物，其中所述化学修饰阻断所述肽的N端。114.如实施方案110-113中的任一者所述的组合物，其中所述化学修饰是甲基化、乙酰化或酰化。115.如实施方案110-114所述的组合物，其中所述化学修饰是：一个或多个赖氨酸残基或其类似物的甲基化；N端的甲基化；或一个或多个赖氨酸残基或其类似物的甲基化以及N端的甲基化。116.如实施方案1-115中的任一者所述的组合物，其中所述肽连接于酰基加合物。117.如实施方案1-116中的任一者所述的组合物，其中活性序列被移植至所述肽上，或其中所述肽缀合于、连接于或融合于活性剂，或被移植至活性剂上，从而产生肽构建体。118.如实施方案117所述的组合物，其中所述肽构建体包含与SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:381、SEQ DI NO:384、SEQID NO:385、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401中的任一者的至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。119.如实施方案117-118中的任一者所述的组合物，其中所述肽构建体是SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360或SEQ ID NO:361。120.如实施方案117-119中的任一者所述的组合物，其中所述活性剂在所述肽的N端或C端缀合于、连接于或融合于所述肽。121.如实施方案117-120中的任一者所述的组合物，其中所述活性剂是抗体、抗体片段、Fc、单链Fv、多肽、肽、小分子或核酸。122.如实施方案121所述的组合物，其中所述核酸是DNA。123.如实施方案121所述的组合物，其中所述核酸是RNA。124.如实施方案117-123中的任一者所述的组合物，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个活性剂通过接头来连接于所述肽。125.如实施方案117-124中的任一者所述的组合物，其中所述肽通过可切割接头或pH敏感性接头来连接于所述活性剂。126.如实施方案117-125中的任一者所述的组合物，其中所述肽通过接头来在所述肽的N端，在所述肽的内部赖氨酸残基的ε胺处，在所述肽的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧酸处，或在所述肽的C端连接于所述活性剂。127.如实施方案117-126中的任一者所述的组合物，所述组合物还包含非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是插入物、附加物，或对另一氨基酸的取代物。128.如实施方案127所述的组合物，其中所述肽通过接头来在所述非天然氨基酸处连接于所述活性剂。129.如实施方案124-128中的任一者所述的组合物，其中所述接头包含酰胺键、酯键、醚键、三唑、大环、肟键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、腙键、偶氮键、肟键、二硫键、硫酯键、硫醚键、碳-碳单键、碳-碳双键或碳-碳三键、二硫键、两个半胱氨酸之间的二碳桥、两个半胱氨酸之间的三碳桥，或碳-氮键。130.如实施方案125-129中的任一者所述的组合物，其中所述可切割接头包含蛋白酶的切割位点。131.如实施方案130所述的组合物，其中所述蛋白酶是基质金属蛋白酶、凝血酶、组织蛋白酶或β-葡萄糖醛酸酶。132.如实施方案124-131中的任一者所述的组合物，其中所述接头是水解不稳定性接头。133.如实施方案1-132中的任一者所述的组合物，其中所述肽通过不可切割接头来连接于所述活性剂。134.如实施方案1-133中的任一者所述的组合物，其中所述活性剂通过接头来连接，其中所述接头选自表7，或SEQ ID NO:103–SEQ ID NO:115或SEQ ID NO:125中的任一者。135.如实施方案117-134中的任一者所述的组合物，其中所述活性剂是抗癌剂。136.如实施方案117-134中的任一者所述的组合物，其中所述活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15剂、融合IL-15/IL-15Ra复合物剂、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀或神经递质。137.如实施方案136所述的组合物，其中所述神经递质是神经降压素、神经降压素肽变体，或它们的功能性片段。138.如实施方案137所述的组合物，其中所述功能性片段是至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基。139.如实施方案137-138中的任一者所述的组合物，其中所述神经降压素肽变体包含与SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:369的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。140.如实施方案137-139中的任一者所述的组合物，其中所述神经降压素与SEQ ID NO:350具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。141.如实施方案117-140中的任一者所述的组合物，其中所述肽构建体能够结合和活化神经降压素受体。142.如实施方案117-141中的任一者所述的组合物，其中所述肽能够减轻受试者中的疼痛的水平。143.如实施方案117-142中的任一者所述的组合物，其中所述肽被施用至患有精神分裂症、药物滥用、帕金森氏病、高血压、进食障碍、中风、阿尔茨海默氏病、癌症、炎症、疼痛、癫痫、情绪障碍或内分泌病症的患者。144.如实施方案117-143中的任一者所述的组合物，其中所述肽与多巴胺信号传导神经元相互作用。145.如实施方案117-144中的任一者所述的组合物，其中所述肽增加神经元中的多巴胺释放。146.如实施方案1-145中的任一者所述的组合物，所述组合物还包含偶联于所述肽的半衰期调节剂。147.如实施方案146所述的组合物，其中所述半衰期调节剂包括聚合物、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、水溶性聚合物、两性离子水溶性聚合物、水溶性聚(氨基酸)，脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，含有甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，Fc区、脂肪酸、棕榈酸，或结合白蛋白的分子。148.如实施方案1-147中的任一者所述的组合物，所述组合物还包含通过接头来偶联于所述肽的可检测剂。149.如实施方案148所述的组合物，其中所述可检测剂在所述肽的N端或C端缀合于、连接于所述肽，或与所述肽融合。150.如实施方案148-149中的任一者所述的组合物，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个可检测剂连接于所述肽。151.如实施方案148-150中的任一者所述的组合物，其中所述肽通过可切割接头来连接于所述可检测剂。152.如实施方案148-151中的任一者所述的组合物，其中所述肽通过接头来在所述肽的N端，在所述肽的内部赖氨酸残基的ε胺处，或在所述肽的C端连接于所述可检测剂。153.如实施方案117-152中的任一者所述的组合物，所述组合物还包含非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是插入物、附加物，或对另一氨基酸的取代物。154.如实施方案148-153中的任一者所述的组合物，其中所述肽通过接头来在所述非天然氨基酸处连接于所述可检测剂。155.如实施方案148-154中的任一者所述的组合物，其中所述接头包含酰胺键、酯键、醚键、三唑、大环、肟键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、腙键、偶氮键、肟键、二硫键、硫酯键、硫醚键、碳-碳单键、碳-碳双键或碳-碳三键、二硫键、两个半胱氨酸之间的二碳桥、两个半胱氨酸之间的三碳桥，或碳-氮键。156.如实施方案151-155所述的组合物，其中所述可切割接头包含基质金属蛋白酶、凝血酶、组织蛋白酶或β-葡萄糖醛酸酶的切割位点。157.如实施方案148-150中的任一者所述的组合物，其中所述肽通过稳定接头来连接于所述可检测剂。158.如实施方案148-157中的任一者所述的组合物，其中所述可检测剂通过接头来连接，其中所述接头选自表7，或SEQ ID NO:103–SEQ ID NO:115或SEQ ID NO:125中的任一者。159.如实施方案148-158中的任一者所述的组合物，其中所述可检测剂是荧光团、近红外染料、造影剂、纳米颗粒、含有金属的纳米颗粒、金属螯合物、X射线造影剂、PET剂、放射性核素或放射性核素螯合剂。160.如实施方案148-159中的任一者所述的组合物，其中所述可检测剂是荧光染料。161.一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案1-160中的任一者所述的组合物或其盐以及药学上可接受的载体。162.如实施方案161所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制以施用至受试者。163.如实施方案161-162中的任一者所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制以进行口服施用、静脉内施用、皮下施用、肌内施用，或它们的组合。164.一种用于穿过细胞层来转运组合物的方法，所述方法包括：a)使所述细胞层与所述组合物接触；以及b)穿过所述细胞层来转运所述组合物。165.如实施方案164所述的方法，其中所述组合物包含经工程改造肽。166.如实施方案165所述的方法，其中所述肽包含含有SEQ ID NO:206–SEQ ID NO:224以及SEQ ID NO:334–SEQ ID NO:344中的任一者或其功能性片段的氨基酸序列。167.如实施方案165-166中的任一者所述的方法，其中所述肽是转铁蛋白受体(TfR)结合肽。168.如实施方案165-167中的任一者所述的方法，其中以SEQ IDNO:32为参考，所述肽包含对应于G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50和Q51或它们的任何组合的表面界面残基。169.如实施方案165-168中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于3、4、9、11、15、16、19、23、26、28、29、30、31、32、33、35、36、37、39和40或它们的任何组合的位置处包含亲水性表面远端残基。170.如实施方案169所述的方法，其中所述亲水性表面远端残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。171.如实施方案169-170中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39和D40的亲水性表面远端残基中的任一者或它们的任何组合。172.如实施方案165-171中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于15、35、39或49的位置中的任一者或它们的任何组合处包含亲水性残基。173.如实施方案172所述的方法，其中所述亲水性残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。174.如实施方案172-173中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于D15、E35、E39和H49的亲水性残基中的任一者或它们的任何组合。175.如实施方案165-174中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于11、25或27的位置中的任一者或它们的任何组合处包含疏水性残基。176.如实施方案175所述的方法，其中所述疏水性残基选自氨基酸A、M、I、L、V、F、W或Y或它们的任何组合。177.如实施方案175-176中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于M11、M25、M27的疏水性残基中的任一者或它们的任何组合。178.如实施方案165-177中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于位置45的脂族残基。179.如实施方案178所述的方法，其中所述脂族残基选自氨基酸A、M、I、L或V。180.如实施方案178-179中的任一者所述的方法，其中以SEQ IDNO:32为参考，所述肽包含对应于L45的脂族残基。181.如实施方案165-170中的任一者所述的方法，其中所述肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键，或至少五个二硫键。182.如实施方案165-181中的任一者所述的方法，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。183.如实施方案165-182中的任一者所述的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ IDNO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段的序列。184.如实施方案165-183中的任一者所述的方法，其中所述肽穿透靶细胞，或定位至靶细胞中，或定位在靶细胞上。185.如实施方案165-184中的任一者所述的方法，其中活性序列被移植至所述肽上，或其中所述肽缀合于、连接于或融合于活性剂，或被移植至活性剂上，从而产生肽构建体。186.如实施方案185所述的方法，其中所述肽缀合于、连接于或融合于所述活性剂。187.如实施方案185或186所述的方法，其中所述活性剂通过接头来连接，其中所述接头选自表7，或SEQ ID NO:103–SEQ ID NO:115或SEQ ID NO:125中的任一者。188.如实施方案185-187中的任一者所述的方法，其中所述活性剂是抗体、抗体片段、Fc、单链Fv、多肽、肽、小分子或核酸。189.如实施方案185-188中的任一者所述的方法，其中所述肽构建体包含与SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ IDNO:332、SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:381、SEQ DI NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:393、SEQ IDNO:396、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401中的任一者的至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。190.如实施方案185-189中的任一者所述的方法，其中所述肽构建体是SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360或SEQ ID NO:361。191.如实施方案185-190中的任一者所述的方法，其中所述活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15剂、融合IL-15/IL-15Ra复合物剂、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀或神经递质。192.如实施方案191所述的方法，其中所述神经递质是神经降压素、神经降压素肽变体，或它们的功能性片段。193.如实施方案192所述的方法，其中所述功能性片段是至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基。194.如实施方案192-193中的任一者所述的方法，其中所述神经降压素肽变体包含与SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:369的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。195.如实施方案192-194中的任一者所述的方法，其中所述神经降压素与SEQ ID NO:350具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。196.如实施方案185-195中的任一者所述的方法，其中所述肽构建体能够结合和活化神经降压素受体。197.如实施方案165-196中的任一者所述的方法，其中在施用至受试者后，所述肽能够减轻疼痛的水平。198.如实施方案165-197中的任一者所述的方法，其中所述肽被施用至患有精神分裂症、药物滥用、帕金森氏病、高血压、进食障碍、中风、阿尔茨海默氏病、癌症、炎症、疼痛、癫痫、情绪障碍或内分泌病症的患者。199.如实施方案165-198中的任一者所述的方法，其中所述肽与多巴胺信号传导神经元相互作用。200.如实施方案165-199中的任一者所述的方法，其中所述肽增加神经元中的多巴胺释放。201.如实施方案165-200中的任一者所述的方法，其中所述肽还与细胞穿透部分一起配制，融合于或缀合于细胞穿透部分。202.如实施方案164-201中的任一者所述的方法，其中所述细胞层是内皮细胞层或上皮细胞层。203.如实施方案202所述的方法，其中所述内皮细胞层是血脑屏障。204.如实施方案202所述的方法，其中所述内皮细胞层是肠内皮细胞层。205.如实施方案202所述的方法，其中所述上皮细胞层是肠上皮细胞层。206.如实施方案164-205中的任一者所述的方法，其中所述转运包括所述组合物与TfR的结合。207.如实施方案164-206中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括胞吞转运。208.如实施方案207所述的方法，其中所述胞吞转运是囊泡胞吞转运。209.如实施方案207-208中的任一者所述的方法，其中所述胞吞转运是TfR介导的。210.如实施方案209所述的方法，其中所述转运还包括所述组合物从所述TfR的解离。211.一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括：a)向所述受试者施用组合物，以及b)穿过细胞层来转运所述组合物。212.如实施方案211所述的方法，其中所述组合物包含经工程改造肽。213.如实施方案212所述的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO:206–SEQ ID NO:224以及SEQ IDNO:334–SEQ ID NO:344中的任一者的氨基酸序列。214.如实施方案212-213中的任一者所述的方法，其中所述肽是转铁蛋白受体(TfR)结合肽。215.如实施方案212-214中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50和Q51或它们的任何组合的表面界面残基。216.如实施方案212-215中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于3、4、9、11、15、16、19、23、26、28、29、30、31、32、33、35、36、37、39和40的位置中的任一者或它们的任何组合处包含亲水性表面远端残基。217.如实施方案216所述的方法，其中所述亲水性表面远端残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。218.如实施方案216-217中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39和D40的亲水性表面远端残基中的任一者或它们的任何组合。219.如实施方案212-218中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于15、35、39或49的位置中的任一者或它们的任何组合处包含亲水性残基。220.如实施方案219所述的方法，其中所述亲水性残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。221.如实施方案219-220中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于D15、E35、E39和H49的亲水性残基中的任一者或它们的任何组合。222.如实施方案212-221中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于11、25或27的位置中的任一者或它们的任何组合处包含疏水性残基。223.如实施方案222所述的方法，其中所述疏水性残基选自氨基酸A、M、I、L、V、F、W或Y或它们的任何组合。224.如实施方案221-223中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于M11、M25、M27的疏水性残基中的任一者或它们的任何组合。225.如实施方案212-224中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于位置45的脂族残基。226.如实施方案225所述的方法，其中所述脂族残基选自氨基酸A、M、I、L或V。227.如实施方案225-226中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于L45的脂族残基。228.如实施方案212-227中的任一者所述的方法，其中所述肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键，或至少五个二硫键。229.如实施方案212-228中的任一者所述的方法，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ IDNO:358中的任一者或其变体或片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。230.如实施方案212-229中的任一者所述的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段的序列。231.如实施方案212-230中的任一者所述的方法，其中所述肽穿透靶细胞，或定位至靶细胞中。232.如实施方案212-231中的任一者所述的方法，其中活性序列被移植至所述肽上，或其中所述肽缀合于、连接于或融合于活性剂，或被移植至活性剂上，从而产生肽构建体。233.如实施方案232所述的方法，其中所述肽缀合于、连接于或融合于所述活性剂。234.如实施方案232或233所述的方法，其中所述活性剂通过接头来连接，其中所述接头选自表7，或SEQ ID NO:103–SEQID NO:115或SEQ ID NO:125中的任一者。235.如实施方案232-234中的任一者所述的方法，其中所述活性剂是抗体、抗体片段、Fc、单链Fv、多肽、肽、小分子或核酸。236.如实施方案232-235中的任一者所述的方法，其中所述肽构建体包含与SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ IDNO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:388、SEQ IDNO:389、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401中的任一者的至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。237.如实施方案232-236中的任一者所述的方法，其中所述肽构建体是SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360或SEQ ID NO:361。238.如实施方案232-237中的任一者所述的方法，其中所述活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15剂、融合IL-15/IL-15Ra复合物剂、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀或神经递质。239.如实施方案238所述的方法，其中所述神经递质是神经降压素、神经降压素肽变体，或它们的功能性片段。240.如实施方案239所述的方法，其中所述功能性片段是至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基。241.如实施方案239-240中的任一者所述的方法，其中所述神经降压素肽变体包含与SEQID NO:365–SEQ ID NO:369的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。242.如实施方案239-241中的任一者所述的方法，其中所述神经降压素与SEQ ID NO:350具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。243.如实施方案232-242中的任一者所述的方法，其中所述肽构建体能够结合和活化神经降压素受体。244.如实施方案232-243中的任一者所述的方法，其中在施用至所述受试者后，所述肽能够减轻疼痛的水平。245.如实施方案212-244中的任一者所述的方法，其中所述肽被施用至患有精神分裂症、药物滥用、帕金森氏病、高血压、进食障碍、中风、阿尔茨海默氏病、癌症、炎症、疼痛、癫痫、情绪障碍或内分泌病症的患者。246.如实施方案212-245中的任一者所述的方法，其中所述肽与多巴胺信号传导神经元相互作用。247.如实施方案212-246中的任一者所述的方法，其中所述肽增加神经元中的多巴胺释放。248.如实施方案212-247中的任一者所述的方法，其中所述肽还与细胞穿透部分一起配制，融合于或缀合于细胞穿透部分。249.如实施方案212-248中的任一者所述的方法，其中所述细胞层是内皮细胞层或上皮细胞层。250.如实施方案249所述的方法，其中所述内皮细胞层是血脑屏障。251.如实施方案249所述的方法，其中所述内皮细胞层是肠内皮细胞层。252.如实施方案249所述的方法，其中所述上皮细胞层是肠上皮细胞层。253.如实施方案211-252中的任一者所述的方法，其中所述转运包括所述组合物与TfR的结合。254.如实施方案211-253中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括胞吞转运。255.如实施方案254所述的方法，其中所述胞吞转运是囊泡胞吞转运。256.如实施方案254-255中的任一者所述的方法，其中所述胞吞转运是TfR介导的。257.如实施方案253-256中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括所述组合物从所述TfR的解离。258.如实施方案253-257中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括从所述组合物释放所述活性剂。259.一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的组合物，所述量基于所述受试者中TfR的表达。260.如实施方案259所述的方法，其中所述组合物包含经工程改造肽。261.如实施方案250所述的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO:206–SEQ ID NO:224以及SEQ ID NO:334–SEQID NO:344中的任一者的氨基酸序列。262.如实施方案260-261中的任一者所述的方法，其中所述肽是转铁蛋白受体(TfR)结合肽。263.如实施方案260-262中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50和Q51或它们的任何组合的表面界面残基。264.如实施方案260-263中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于3、4、9、11、15、16、19、23、26、28、29、30、31、32、33、35、36、37、39和40的位置中的任一者或它们的任何组合处包含亲水性表面远端残基。265.如实施方案264所述的方法，其中所述亲水性表面远端残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。266.如实施方案264-265中的任一者所述的方法，其中以SEQ IDNO:32为参考，所述肽包含对应于R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39和D40的亲水性表面远端残基中的任一者或它们的任何组合。267.如实施方案260-266中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于15、35、39或49的位置中的任一者或它们的任何组合处包含亲水性残基。268.如实施方案267所述的方法，其中所述亲水性残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。269.如实施方案260-268中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于D15、E35、E39和H49的亲水性残基中的任一者或它们的任何组合。270.如实施方案260-269中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于11、25或27的位置中的任一者或它们的任何组合处包含疏水性残基。271.如实施方案270所述的方法，其中所述疏水性残基选自氨基酸A、M、I、L、V、F、W或Y或它们的任何组合。272.如实施方案270-271中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于M11、M25、M27的疏水性残基中的任一者或它们的任何组合。273.如实施方案260-272中的任一者所述的方法，其中以SEQID NO:32为参考，所述肽包含对应于位置45的脂族残基。274.如实施方案273所述的方法，其中所述脂族残基选自氨基酸A、M、I、L或V。275.如实施方案273-274中的任一者所述的方法，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于L45的脂族残基。276.如实施方案260-275中的任一者所述的方法，其中所述肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键，或至少五个二硫键。277.如实施方案260-276中的任一者所述的方法，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ IDNO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。278.如实施方案260-277中的任一者所述的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段的序列。279.如实施方案260-278中的任一者所述的方法，其中所述肽穿透靶细胞，或定位至靶细胞中。280.如实施方案260-279中的任一者所述的方法，其中活性序列被移植至所述肽上，或其中所述肽缀合于、连接于或融合于活性剂，或被移植至活性剂上，从而产生肽构建体。281.如实施方案280所述的方法，其中所述肽缀合于、连接于或融合于所述活性剂。282.如实施方案280或281所述的方法，其中所述活性剂通过接头来连接，其中所述接头选自表7，或SEQ ID NO:103–SEQ ID NO:115或SEQ IDNO:125中的任一者。283.如实施方案280-282中的任一者所述的方法，其中所述活性剂是抗体、抗体片段、Fc、单链Fv、多肽、肽、小分子或核酸。284.如实施方案280-283中的任一者所述的方法，其中所述肽构建体包含与SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:375、SEQ IDNO:381、SEQ DI NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401中的任一者的至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。285.如实施方案280-284中的任一者所述的方法，其中所述肽构建体是SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360或SEQ ID NO:361。286.如实施方案280-285中的任一者所述的方法，其中所述活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15剂、融合IL-15/IL-15Ra复合物剂、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀或神经递质。287.如实施方案286所述的方法，其中所述神经递质是神经降压素、神经降压素肽变体，或它们的功能性片段。288.如实施方案287所述的方法，其中所述功能性片段是至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基。289.如实施方案287-288中的任一者所述的方法，其中所述神经降压素肽变体包含与SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:369的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。290.如实施方案287-289中的任一者所述的方法，其中所述神经降压素与SEQ ID NO:350具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。291.如实施方案280-290中的任一者所述的方法，其中所述肽构建体能够结合和活化神经降压素受体。292.如实施方案260-291中的任一者所述的方法，其中在施用至所述受试者后，所述肽能够减轻疼痛的水平。293.如实施方案260-292中的任一者所述的方法，其中所述肽被施用至患有精神分裂症、药物滥用、帕金森氏病、高血压、进食障碍、中风、阿尔茨海默氏病、癌症、炎症、疼痛、癫痫、情绪障碍或内分泌病症的患者。294.如实施方案260-293中的任一者所述的方法，其中所述肽与多巴胺信号传导神经元相互作用。295.如实施方案260-294中的任一者所述的方法，其中所述肽增加神经元中的多巴胺释放。296.如实施方案260-295中的任一者所述的方法，其中所述肽还与细胞穿透部分一起配制，融合于或缀合于细胞穿透部分。297.如实施方案259-296中的任一者所述的方法，其中所述组合物通过以下方式来施用：吸入、鼻内、口服、局部、静脉内、皮下、肌内施用、腹膜内、肿瘤内、鞘内，或它们的组合。298.如实施方案259-297中的任一者所述的方法，其中所述组合物以团注、输注或延长输注形式加以静脉内施用。299.如实施方案259-298中的任一者所述的方法，其中所述组合物或药物组合物一天多次、一天两次、一天一次、一周两次、一周三次、一周一次、每两周一次，或一个月一次或每三个月一次加以施用。300.如实施方案259-2969中的任一者所述的方法，其中所述组合物一天一次、一周一次或一个月一次加以皮下施用。301.如实施方案259-300中的任一者所述的方法，其中所述疾患是癌症。302.如实施方案301所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、结肠癌、肺癌、位于骨或骨髓中的癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、骨髓细胞癌、皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤，或CMYC过度表达性癌。303.如实施方案259-302中的任一者所述的方法，其中所述疾患是脑癌。304.如实施方案303所述的方法，其中所述脑癌是胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤，或弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤。305.如实施方案259-304中的任一者所述的方法，其中所述疾患是CNS的疾病。306.如实施方案305所述的方法，其中CNS的所述疾病是神经炎症性或神经变性疾病。307.如实施方案306所述的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、弗里德赖希共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩、运动神经元疾病、莱姆病、共济失调-毛细血管扩张、常染色体显性小脑共济失调、巴登病、皮质基底综合征、克罗伊茨费尔特–雅各布病、X染色体脆折相关震颤/共济失调综合征、库福–拉基布综合征、马查多–约瑟夫病、多发性硬化症、慢性创伤性脑病变，或额颞叶痴呆。308.如实施方案259-302中的任一者所述的方法，其中所述疾患是神经病变性疼痛、偏头痛、焦虑或癫痫。309.如实施方案259-302或308中的任一者所述的方法，其中所述疾患是慢性疼痛、急性疼痛、伤害感受性疼痛、神经病变性疼痛、异常性疼痛、幻觉疼痛、内脏疼痛或爆发性疼痛。310.如实施方案259-302或308-309中的任一者所述的方法，其中所述疾患是慢性疼痛、急性疼痛、损伤、机械性疼痛、热疼痛、冷疼痛、缺血性疼痛、以及化学物质诱导的疼痛、炎症性疼痛、偏头痛相关疼痛、头痛相关疼痛、肠易激综合征相关疼痛、纤维肌痛相关疼痛、关节炎性疼痛、骨骼疼痛、关节疼痛、胃肠疼痛、肌肉疼痛、心绞痛、面部疼痛、盆腔疼痛、跛行、手术后疼痛、创伤后疼痛、紧张型头痛、产科疼痛、妇科疼痛，或化学疗法诱导的疼痛、伤害感受性疼痛、神经病变性疼痛、异常性疼痛、幻觉疼痛、内脏疼痛、爆发性疼痛、家族性阵发性疼痛综合征、发作性极度疼痛病症、先天性痛觉丧失、与阿片戒断相关的疼痛。311.如实施方案259-310中的任一者所述的方法，其中所述疾患是肌营养不良或脊髓延髓肌营养不良(SBMA)。312.如实施方案259-311中的任一者所述的方法，其中所述疾患是炎症性肠病。313.如实施方案312所述的方法，其中所述炎症性肠病是克罗恩氏病。314.一种用于穿过细胞层来转运根据实施方案1-313中的任一者所述的组合物的方法，所述方法包括使所述细胞层与所述组合物接触，以及穿过所述细胞层来转运所述组合物。315.如实施方案314所述的方法，其中所述细胞层是内皮细胞层或上皮细胞层。316.如实施方案314-315中的任一者所述的方法，其中所述内皮细胞层是血脑屏障。317.如实施方案314-315中的任一者所述的方法，其中所述内皮细胞层是肠内皮细胞层。318.如实施方案317所述的方法，其中所述上皮细胞层是肠上皮细胞层。319.如实施方案314-318中的任一者所述的方法，其中所述转运包括所述组合物与TfR的结合。320.如实施方案314-319中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括胞吞转运。321.如实施方案320所述的方法，其中所述胞吞转运是囊泡胞吞转运。322.如实施方案320-321中的任一者所述的方法，其中所述胞吞转运是TfR介导的。323.如实施方案319-319中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括所述组合物从所述TfR的解离。324.如实施方案314-323中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括从所述组合物释放活性剂。325.一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用实施方案1-163中的任一者所述的组合物或实施方案164-324中的任一者所述的药物组合物。326.如实施方案325所述的方法，其中所述组合物通过以下方式来施用：吸入、鼻内、口服、局部、静脉内、皮下、肌内施用、腹膜内、肿瘤内、鞘内，或它们的组合。327.如实施方案325-326中的任一者所述的方法，其中所述组合物以团注、输注或延长输注形式加以静脉内施用。328.如实施方案325-327中的任一者所述的方法，其中所述组合物或所述药物组合物一天多次、一天两次、一天一次、一周两次、一周三次、一周一次、每两周一次，或一个月一次或每三个月一次加以施用。329.如实施方案325-328中的任一者所述的方法，其中所述组合物一天一次、一周一次或一个月一次加以皮下施用。330.如实施方案325-329中的任一者所述的方法，其中所述疾患是癌症。331.如实施方案330所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、结肠癌、肺癌、位于骨或骨髓中的癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、骨髓细胞癌、皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤，或CMYC过度表达性癌。332.如实施方案325-331中的任一者所述的方法，其中所述疾患是脑癌。333.如实施方案332所述的方法，其中所述脑癌是胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤，或弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤。334.如实施方案325-329中的任一者所述的方法，其中所述疾患是CNS的疾病。335.如实施方案334所述的方法，其中CNS的所述疾患是神经炎症性或神经变性疾病。336.如实施方案335所述的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、弗里德赖希共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩、运动神经元疾病、莱姆病、共济失调-毛细血管扩张、常染色体显性小脑共济失调、巴登病、皮质基底综合征、克罗伊茨费尔特–雅各布病、X染色体脆折相关震颤/共济失调综合征、库福–拉基布综合征、马查多–约瑟夫病、多发性硬化症、慢性创伤性脑病变，或额颞叶痴呆。337.如实施方案325-329中的任一者所述的方法，其中所述疾患是神经病变性疼痛、偏头痛、焦虑或癫痫。338.如实施方案325-329中的任一者所述的方法，其中所述疾患是慢性疼痛、急性疼痛、损伤、机械性疼痛、热疼痛、冷疼痛、缺血性疼痛、以及化学物质诱导的疼痛、炎症性疼痛、偏头痛相关疼痛、头痛相关疼痛、肠易激综合征相关疼痛、纤维肌痛相关疼痛、关节炎性疼痛、骨骼疼痛、关节疼痛、胃肠疼痛、肌肉疼痛、心绞痛、面部疼痛、盆腔疼痛、跛行、手术后疼痛、创伤后疼痛、紧张型头痛、产科疼痛、妇科疼痛，或化学疗法诱导的疼痛、伤害感受性疼痛、神经病变性疼痛、异常性疼痛、幻觉疼痛、内脏疼痛、爆发性疼痛、家族性阵发性疼痛综合征、发作性极度疼痛病症、先天性痛觉丧失、与阿片戒断相关的疼痛。339.如实施方案325-329中的任一者所述的方法，其中所述疾患是肌营养不良或脊髓延髓肌营养不良(SBMA)。340.如实施方案301-305中的任一者所述的方法，其中所述疾患是炎症性肠病。341.如实施方案340所述的方法，其中所述炎症性肠病是克罗恩氏病。342.如实施方案325-341中的任一者所述的方法，所述方法还包括穿过细胞层来转运所述组合物。343.如实施方案342所述的方法，其中所述细胞层是内皮细胞层或上皮细胞层。344.如实施方案342-343中的任一者所述的方法，其中所述内皮细胞层是血脑屏障。345.如实施方案342-344中的任一者所述的方法，其中所述内皮细胞层是肠内皮细胞层。346.如实施方案340所述的方法，其中所述上皮细胞层是肠上皮细胞层。347.如实施方案325-346中的任一者所述的方法，其中所述转运包括所述组合物与TfR的结合。348.如实施方案325-347中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括胞吞转运。349.如实施方案348所述的方法，其中所述胞吞转运是囊泡胞吞转运。350.如实施方案348-349中的任一者所述的方法，其中所述胞吞转运是TfR介导的。351.如实施方案347-350中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括所述组合物从所述TfR的解离。352.如实施方案325-351中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括从所述组合物释放活性剂。353.一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的实施方案164-253中的任一者所述的组合物或实施方案161-163中的任一者所述的药物组合物，所述量取决于所述受试者的组织中TfR的表达。354.如实施方案353所述的方法，其中所述组合物通过以下方式来施用：吸入、鼻内、口服、局部、静脉内、皮下、肌内施用、腹膜内、肿瘤内、鞘内，或它们的组合。355.如实施方案353-354中的任一者所述的方法，其中所述组合物以团注、输注或延长输注形式加以静脉内施用。356.如实施方案353-355中的任一者所述的方法，其中所述组合物或所述药物组合物一天多次、一天两次、一天一次、一周两次、一周三次、一周一次、每两周一次，或一个月一次或每三个月一次加以施用。357.如实施方案353-356中的任一者所述的方法，其中所述组合物一天一次、一周一次或一个月一次加以皮下施用。358.如实施方案353-357中的任一者所述的方法，其中所述疾患是癌症。359.如实施方案354-358中的任一者所述的方法，其中所述受试者的所述组织是癌性组织。360.如实施方案358所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、结肠癌、肺癌、位于骨或骨髓中的癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、骨髓细胞癌、皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤，或CMYC过度表达性癌。361.如实施方案353-360中的任一者所述的方法，其中所述疾患是脑癌。362.如实施方案361所述的方法，其中所述脑癌是胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤，或弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤。363.如实施方案353-357中的任一者所述的方法，其中所述疾患是CNS的疾病。364.如实施方案363所述的方法，其中CNS的所述疾病是神经炎症性或神经变性疾病。365.如实施方案364所述的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、弗里德赖希共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩、运动神经元疾病、莱姆病、共济失调-毛细血管扩张、常染色体显性小脑共济失调、巴登病、皮质基底综合征、克罗伊茨费尔特–雅各布病、X染色体脆折相关震颤/共济失调综合征、库福–拉基布综合征、马查多–约瑟夫病、多发性硬化症、慢性创伤性脑病变，或额颞叶痴呆。366.如实施方案353-365中的任一者所述的方法，其中所述疾患是神经病变性疼痛、偏头痛、焦虑或癫痫。367.如实施方案353-366中的任一者所述的方法，其中所述疾患是慢性疼痛、急性疼痛、损伤、机械性疼痛、热疼痛、冷疼痛、缺血性疼痛、以及化学物质诱导的疼痛、炎症性疼痛、偏头痛相关疼痛、头痛相关疼痛、肠易激综合征相关疼痛、纤维肌痛相关疼痛、关节炎性疼痛、骨骼疼痛、关节疼痛、胃肠疼痛、肌肉疼痛、心绞痛、面部疼痛、盆腔疼痛、跛行、手术后疼痛、创伤后疼痛、紧张型头痛、产科疼痛、妇科疼痛，或化学疗法诱导的疼痛、伤害感受性疼痛、神经病变性疼痛、异常性疼痛、幻觉疼痛、内脏疼痛、爆发性疼痛、家族性阵发性疼痛综合征、发作性极度疼痛病症、先天性痛觉丧失、与阿片戒断相关的疼痛。368.如实施方案353-367中的任一者所述的方法，其中所述疾患是肌营养不良或脊髓延髓肌营养不良(SBMA)。369.如实施方案353-367中的任一者所述的方法，其中所述疾患是炎症性肠病。370.如实施方案369所述的方法，其中所述炎症性肠病是克罗恩氏病。371.如实施方案353-370中的任一者所述的方法，所述方法还包括穿过细胞层来转运所述组合物。372.如实施方案371所述的方法，其中所述细胞层是内皮细胞层或上皮细胞层。373.如实施方案372所述的方法，其中所述内皮细胞层是血脑屏障。374.如实施方案372-373中的任一者所述的方法，其中所述内皮细胞层是肠内皮细胞层。375.如实施方案372-373中的任一者所述的方法，其中所述上皮细胞层是肠上皮细胞层。376.如实施方案371-375中的任一者所述的方法，其中所述转运包括所述组合物与TfR的结合。377.如实施方案371-376中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括胞吞转运。378.如实施方案377所述的方法，其中所述胞吞转运是囊泡胞吞转运。379.如实施方案377-378中的任一者所述的方法，其中所述胞吞转运是TfR介导的。380.如实施方案371-379中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括所述组合物从所述TfR的解离。381.如实施方案371-380中的任一者所述的方法，其中所述转运还包括从所述组合物释放活性剂。382.一种用于设计TfR结合肽的方法，所述方法包括：a)使用计算机程序从具有经优化稳定性和折叠的肽的文库鉴定肽，其中所述肽文库中的每个肽包含至少三个分子内二硫键；b)使用计算机程序叠加来自肽:TfR复合物的结合补丁的氨基酸残基以确定在将所述结合补丁移植至所述肽上之后结合TfR的稳定肽；以及c)将所述结合补丁移植至所述肽上以产生所述稳定肽。383.如实施方案382所述的方法，所述方法还包括进行位点饱和诱变以获得相比于所述稳定肽，对TfR具有更高结合亲和力的突变肽。384.如实施方案382-383所述的方法，其中来自肽文库的所述肽在长度方面在20与75个氨基酸残基之间。385.如实施方案137-145中的任一者所述的组合物，其中所述神经降压素包含SEQ ID NO:350、SEQ IDNO:365–SEQ ID NO:371中的任一者或其功能性片段。386.如实施方案192-200中的任一者所述的方法，其中所述神经降压素包含SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:371中的任一者或其功能性片段。387.如实施方案239-247中的任一者所述的方法，其中所述神经降压素包含SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:371中的任一者或其功能性片段。388.如实施方案287-295中的任一者所述的方法，其中所述神经降压素包含SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:371中的任一者或其功能性片段。389.如实施方案136-163中的任一者所述的组合物，其中所述Kv1.3抑制剂是Vm24、ShK-170、ShK-186或ShK-192。390.如实施方案389所述的组合物，其中Vm24具有SEQ ID NO:378或SEQ ID NO:391的序列。391.如实施方案389所述的组合物，其中Shk-185具有SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:390或SEQID NO:402的序列。392.如实施方案148-163中的任一者所述的组合物，其中所述半衰期调节剂包括SA21。393.如实施方案392所述的组合物，其中所述SA21具有SEQ ID NO:376或SEQID NO:377的序列。394.如实施方案191-210、238-258，或286-313中的任一者所述的方法，其中所述Kv1.3抑制剂是Vm24、ShK-170、ShK-186或ShK-192。395.如实施方案394所述的方法，其中Vm24包含SEQ ID NO:378或SEQ ID NO:391。396.如实施方案394所述的方法，其中Shk-185包含SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:390或SEQ ID NO:402。397.如实施方案165-210、213-258，或261-381中的任一者所述的方法，所述方法还包括偶联于所述肽的半衰期调节剂。398.如实施方案397所述的方法，其中所述半衰期调节剂包括聚合物、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、水溶性聚合物、两性离子水溶性聚合物、水溶性聚(氨基酸)，脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，含有甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，Fc区、脂肪酸、棕榈酸，或结合白蛋白的分子。399.如实施方案397所述的方法，其中所述半衰期调节剂包括SA21。400.如实施方案399所述的方法，其中所述SA21包含SEQ ID NO:376或SEQID NO:377。401.如实施方案1-163、385，或389-393中的任一者所述的组合物，其中相比于基于TfR结合抗体的治疗剂，所述肽具有更宽的治疗窗。402.如实施方案401所述的组合物，其中所述更宽的治疗窗是高于其会观察到治疗药效动力学响应，但低于其会观察到毒性的剂量。403.如实施方案1-163、385、389-393、401或402中的任一者所述的组合物，其中当在相同摩尔剂量下施用至受试者时，相比于基于TfR结合抗体的治疗剂，所述肽具有更低中靶毒性、更低脱靶毒性，或它们的组合。404.如实施方案165-210、212-258、260-384、386-388，或394-400中的任一者所述的方法，其中相比于基于TfR结合抗体的治疗剂，所述肽具有更宽的治疗窗。405.如实施方案404所述的方法，其中所述更宽的治疗窗是高于其会观察到治疗药效动力学响应，但低于其会观察到毒性的剂量。406.如实施方案165-210、212-258、260-384、386-388、394-400、404或405中的任一者所述的方法，其中当在相同摩尔剂量下施用至受试者时，相比于基于TfR结合抗体的治疗剂，所述肽具有更低中靶毒性或更低脱靶毒性。
实施例
以下实施例被包括来进一步描述本公开的一些方面，并且不应用于限制本发明的范围。
实施例1
肽的制造
该实施例描述本文所述的肽和肽构建体(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ IDNO:361中的任一者)的制造。使用公开方法来在哺乳动物细胞培养中产生源于蛋白质的肽。(A.D.Bandaranayke,C.Correnti,B.Y.Ryu,M.Brault,R.K.Strong,D.Rawlings.2011.Daedalus:a robust,turnkey platform for rapid production ofdecigram quantities of active recombinant proteins in human cell lines usingnovel lentiviral vectors.Nucleic Acids Research.(39)21,e143)。
将肽序列逆翻译成DNA，合成，并且使用标准分子生物学技术(M.R.Green,JosephSambrook.Molecular Cloning.2012Cold Spring Harbor Press)与噬铁蛋白同框克隆。将所得构建体包装至慢病毒中，转导至HEK-293细胞中，扩增，通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)来分离，用烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶切割，并且通过反相色谱法来纯化以获得同质性。在纯化之后，将每种肽冻干，并且冷冻储存。
实施例2
使用哺乳动物表达系统进行的肽表达
该实施例描述使用哺乳动物表达系统来表达肽和肽构建体。根据Bandaranayake等人,Nucleic Acids Res.2011年11月；39(21):e143中所述的方法来表达肽。使用烟草蚀刻病毒蛋白酶来从噬铁蛋白切割肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者)，并且通过以乙腈和0.1％TFA水溶液的梯度进行反相HPLC(RP-HPLC)来纯化，然后等分和冻干以供稍后使用。通过质谱测定法来验证分子量。
为优化和验证筛选方法以及为鉴定TfR结合肽，将转铁蛋白受体(TfR)胞外域(“可溶性TfR”，SEQ ID NO:353)克隆至Daedalus可溶性蛋白质产生慢病毒载体中，并且从生长培养基纯化蛋白质(可溶性TfR的凝胶显示于图1A中)。相同策略用于产生和纯化人去铁转铁蛋白(残基23-698，SEQ ID NO:364，KTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSMGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYNKSDNCEDTPEAGYFAIAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAPGSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSNVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGEEYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRP)，并且对一些物质进行铁装载以产生全铁转铁蛋白。通过表面等离子体共振(图23A)来测试去铁转铁蛋白与全铁转铁蛋白两者与可溶性TfR胞外域的结合，其中仅全铁转铁蛋白显示与固定化TfR的任何相互作用。
作为在筛选中使用的可溶性TfR代表人内源性蛋白质结构的进一步验证，测试了与马丘坡病毒(Machupo virus)糖蛋白(被称为MaCV)的相互作用，所述糖蛋白使用TfR来确定嗜性以及介导细胞进入。为此，将MaCV克隆至哺乳动物表面展示载体SDGF(图23B)中，并且用SDGF-MaCV或对照蛋白质(SDGF-弹性蛋白酶抑制因子，即已知结合一些天然CDP的弹性蛋白酶抑制剂)转染悬浮293Freestyle(293F)细胞。将经转染细胞用各自200nM的生物素化TfR(细胞结合测定中使用的所有TfR都是生物素化的)和经Alexa Fluor 647标记链霉亲和素染色，然后通过流式细胞术来分析(图23C)。TfR成功染色了用MaCV转染的细胞，而SDGF-弹性蛋白酶抑制因子细胞并非如此。同时，与200nM荧光弹性蛋白酶一起孵育的SDGF-MaCV细胞未被染色。这证明了TfR与它的内源性配体的结合的特异性，以及SDGF作为用以鉴定新型TfR结合配偶体的手段的效用。
实施例3
功能性转铁蛋白受体的表达和纯化
转铁蛋白受体(TfR)胞外域(SEQ ID NO:352，HsTfR的根据UniProt编号的残基121-760)、去铁转铁蛋白(SEQ ID NO:353(人)和SEQ ID NO:354(小鼠))以及所有可溶性CDP如同实施例2和实施例3加以产生和纯化。简而言之，将相关序列克隆至作为驱动目标蛋白质的分泌的慢病毒载体的Daedalus载体中。蛋白质含有它们的内源性信号肽，或在它们的N端融合于噬铁蛋白以达成在翻译/分泌期间的稳定化；使用TEV蛋白酶切割噬铁蛋白融合物，从而留下N端“GS”。通过标准方法来在293细胞中产生VSV-G假型慢病毒。这个病毒用于在FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen 12338018)中在近似感染复数(MOI)10下转导1x107个悬浮293Freestyle(293F，ThermoFisher R79007)细胞。然后使培养物生长(悬浮培养孵育器，在125RPM、37℃、80％湿度、8％CO2下)，并且历经10-12天的过程加以扩增(2L最终体积)，此后，收集培养基并加以无菌过滤。通过分批Ni-NTA树脂结合来从培养基纯化蛋白质。通过TEV蛋白酶切割来将CDP与噬铁蛋白载体分离，并且用SEC(
Figure BDA0003175003630002681
Pure，GEHealthcare)或RP-HPLC(Agilent 1260型，C18柱，214nm吸光度，具有串联Agilent 6120LC/MS)进行最终精制(图1A)。将TfR和转铁蛋白冷冻在PBS+5％甘油中，而将通过RP-HPLC来纯化的CDP肽在小瓶中等分并冻干。在体内使用之前通过氨基酸分析来确定肽定量。
使用表面等离子体共振来验证纯化TfR的适当折叠和功能。测量去铁转铁蛋白(ApoTf)或全铁转铁蛋白(HoloTf)与纯化TfR的结合(图23A)。相比于ApoTf，HoloTf的优先结合指示适当TfR功能。
所有蛋白质都通过SDS-PAGE(NuPAGE 4-12％Bis-Tris，Thermo Fisher)和考马斯染色来分析(图4和图27)。以非还原方式以及以用10mM DTT还原的方式操作CDP。在用50U猪胃蛋白酶(Sigma-Aldrich P7012)在模拟胃液中或50U猪胰蛋白酶(Sigma-Aldrich 6567)在PBS中处理，随后在37℃下孵育30分钟之后，在与用于纯化相同的RP-HPLC仪器上进行蛋白水解和还原抗性测试。类似地，谷胱甘肽或DTT还原涉及用10mM谷胱甘肽或DTT PBS溶液处理肽>5分钟，随后进行RP-HPLC分析。在具有或不具有10mM DTT的pH 7.4 20mM磷酸盐缓冲液中，在15-25μM的浓度下，用Jasco J-720W分光偏振计(1mm光程长)测量SEQ ID NO:32的肽的CD光谱。数据以在210nm下的以毫度报告的相对椭圆率[θ]变化表示。
根据Hamilton等人的方法来产生全铁转铁蛋白。简而言之，用HCl和NaOH将10mL含有4.5mM FeCl3(Sigma Aldrich)和9mM氮川三乙酸(NTA，Sigma Aldrich)的4.5mM Fe(NTA)2水溶液滴定至pH 4.0。在每5分钟一次下用0.4当量Fe(NTA)2装载去铁转铁蛋白PBS溶液，直至已添加3.2当量。使用旋转柱透析(Amicon Ultra-4离心过滤装置，10kDa分子量截断值)将溶液的缓冲液更换成PBS以达成>1,000倍游离Fe(NTA)2清除。
Alexa Fluor 647(Thermo Fisher A37573)CDP标记在PBS缓冲液中以约1.5NHS酯染料:1CDP的摩尔比进行>1小时，此后，通过旋转柱透析(Amicon Ultra-4离心过滤装置，3kDa分子量截断值)来移除游离染料以达成>1,000倍游离染料清除。对Avitag化TfR的生物素化根据制造商方案来使用BirA-500试剂盒(Avidity)，随后将最终缓冲液更换成含有5％甘油的PBS，并且以小等分试样在-80℃下储存。
实施例4
TfR结合肽的哺乳动物表面展示
该实施例描述本公开的TfR结合肽的哺乳动物表面展示，所述TfR结合肽包括SEQID NO:1(SEQ ID NO:1是添加了N端GS的SEQ ID NO:36)、SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:2是添加了N端GS的SEQ ID NO:37)、SEQ ID NO:30(SEQ ID NO:30是添加了N端GS的SEQ ID NO:65)和SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:32是添加了N端GSSEQ ID NO:67)、以及SEQ ID NO:33–SEQ IDNO:35(SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35分别是添加了N端GS的SEQ ID NO:68-SEQ ID NO:70)。对TfR结合肽的筛选通过以下方式来进行：转染或转导哺乳动物细胞以展示候选肽(图23B)，随后针对可溶性人转铁蛋白受体胞外域SEQ ID NO:352(200nM，图23C，图1)进行筛选。哺乳动物细胞在折叠二硫键交联的蛋白质方面具有改善的保真度，从而使得它们成为适于展示本公开的肽的细胞类型。
如下进行哺乳动物细胞表面展示筛选。筛选策略使用表面展示GFP FasL(SDGF)载体。在载体中，FasL-TM是FasL蛋白的跨膜结构域。更具体来说，将设计的肽以汇合物形式克隆至SDGF中，然后将所述SDGF制备成慢病毒。将293F细胞用这个文库在约1的感染复数下转导，并且在生长三天之后，使经转导细胞的汇合物与经Alexa647标记TfR一起孵育。对于这些实验，通过用荧光链霉亲和素或荧光抗His抗体共染色TfR来实现荧光标记。可溶性TfR含有His标签与生物素标记两者。Alexa Fluor 647或iFluor 647用于抗体/链霉亲和素荧光。分选一定百分比的来自GFP和TfR双重阳性细胞的最高染色TfR阳性细胞，并且进行扩增。在每次扩增时，收集一部分细胞，并且在最后，通过测序来鉴定富集肽。流式细胞术用于评估用以鉴定通过SDGF肽构建体来在它们的表面上表达蛋白质的GFP+293F细胞的门控准则。门控在使用FSC-H相对于SSC-H来排除碎片；使用FSC-H相对于FSC-A来排除双粘体；使用FSC-H相对于太平洋蓝H(Pacific Blue H)来排除DAPI+死细胞；以及使用任选的FITC-H直方图来鉴定GFP+细胞的情况下进行。一旦照此门控，Alexa Fluor 647(用于检测靶标结合的共染色剂)即用于分选和分析。
使用磁性分选和流动分选的组合来进行筛选。如下进行磁性分选：将2x108个293F细胞用SDGF CDP文库在约1的MOI下转导，并且扩增直至转导后3天。对于初始筛选，进行磁性细胞分选。将1x109个经转导细胞再悬浮于含有200nM生物素化TfR、2mL抗生物素微珠粒(UltraPure，Miltenyi 130-105-637)和21mL流动缓冲液(PBS+2mM EDTA和0.5％牛血清白蛋白)的结合缓冲液中，最终体积是25mL。在冰上在搅拌下(每2-5分钟温和倒置)孵育细胞30分钟，并且然后用流动缓冲液稀释10倍以达到250mL，沉淀(500x g，5分钟)，并且用高BSA流动缓冲液(含有2mM EDTA和3％BSA的PBS)再悬浮至40mL。将细胞分装成四个10mL等分试样，并且通过Miltenyi
Figure BDA0003175003630002711
Pro分离器，在每次分选之后使用“posseld”方案和“快速冲洗”来操作。运行和洗涤缓冲液分别是高BSA流动缓冲液和PBS+2mM EDTA。将洗脱的细胞汇合，沉淀，并且PCR扩增(TerraTMPCR直接聚合酶混合物(Takara 639271)，持续16个循环，随后Phusion)它们的CDP序列。如上将这个子文库克隆至SDGF中，制备成慢病毒，并且转导至一批新的293F细胞(1x107个细胞，MOI约1)中以进行流动分选。
如下进行流动分选：使用2.4x107个在3mL流动缓冲液中染色的细胞进行流动分选，所述流动缓冲液具有200nM TfR、200nM链霉亲和素Alexa Fluor 647缀合物(ThermoFisher S21374)和1μg mL-1DAPI。将细胞用流动缓冲液稀释4倍以达到12mL，沉淀(500x g，5分钟)，并且再悬浮于3.6mL流动缓冲液中。在FACSAria II系统(BD)上分选细胞，基于FSC-A(中)、SSC-A(中)、DAPI-A(阴性)、GFP-A(阳性)和APC-A(GFP+的前7％)通道来门控。在每次流动分选之后，在FreeStyle培养基中培养细胞，在悬浮24孔板中以0.5-1mL起始，在300rpm下振荡，在以125RPM振荡的125mL挡板烧瓶中扩大至30mL的最终体积。此时，如上对细胞进行再分选。在第三次流动分选之后，使细胞扩增，并且以1.5x106个细胞的沉淀物冷冻。如上对沉淀物进行PCR扩增(Terra直接PCR，随后InFusion)，将CDP插入物亚克隆至SDGF中，转化(Stellar感受态细胞)，并且挑选菌落以进行所克隆CDP的小型制备和测序。富集变体是在序列分析中在约100个挑选菌落中出现超过一次的那些。所有位点饱和诱变(SSM)亲和力成熟筛选都如上进行，具有以下变化。1)染色是依序的；首先用TfR，然后用等摩尔量的经染料标记链霉亲和素。2)将TfR/链霉亲和素浓度降低至对于第一SSM成熟来说的20nM以及对于第二SSM成熟筛选来说的8nM。在每次SSM筛选之后，研究富集变体以组装相比于含有单个突变中的1者或2者的任何变体，显示更高TfR染色的复合突变体(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:32的肽)。
图1中的流式细胞术图说明从高多样性汇合文库对结合TfR的细胞的连续富集。图1A说明转铁蛋白受体(TfR)蛋白的考马斯染色凝胶。图1B说明显示在一次流动分选之后结合TfR的细胞的流式细胞术图。图1C说明显示在一次流动分选之后具有对照染色的细胞的流式细胞术图。图1D说明显示在两次流动分选之后结合TfR的细胞的流式细胞术图。图1E说明显示在两次流动分选之后具有对照染色的细胞的流式细胞术图。图1F说明显示在三次流动分选之后结合TfR的细胞的流式细胞术图。图1G说明显示在三次流动分选之后具有对照染色的细胞的流式细胞术图。
每次流动分选代表使细胞文库生长至>3000万个细胞，针对TfR结合进行染色，以及流动分选顶尖结合物。使分选的结合物生长，随后进行下次流动分选。
实施例5
TfR结合肽的鉴定
该实施例描述使用如实施例4中所述的哺乳动物表面展示系统来鉴定TfR结合肽。
使用实施例4的哺乳动物表面展示系统，鉴定了具有SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:1是添加了N端GS的SEQ ID NO:36)的序列的单一克隆肽。扩增并诱变编码10,000种CDP的寡核苷酸的文库。CDP在长度方面是17-50个氨基酸，具有4、6、8或10个半胱氨酸。尽管文库朝向经注释打结素或防御素有一定偏重，但文库含有来自生命的每个域/界的CDP。将这个文库克隆至SDGF中，制备成慢病毒，并且转导至悬浮293F细胞中。历经一轮磁性细胞分选和三轮流动分选的过程，使经转导细胞经受用TfR(200nM)和共染色剂的染色，每轮对被TfR染色的细胞进行富集。使用200nM被生物素化或连接于His标签的可溶性AF647-TfR验证在表面展示测定中特异性结合TfR的结合。使用用于达成四价靶标亲合力的一步染色方案进行染色。通过对最终富集细胞群体的DNA测序，鉴定了单一TfR结合CDP，指定为SEQ ID NO:1。它代表来自海洋领鞭毛虫Monosiga brevicolis的细胞色素BC1复合物亚单位6(Uniprot标识符：A9V0D7，DOI：10.1093/nar/gku989)的随机突变变体，在长度方面是49个氨基酸(六个半胱氨酸)，并且具有5.6kDa的预测分子质量。然后使SEQ ID NO:36经受使用位点饱和诱变(SSM)进行的亲和力成熟，其中创建含有每个可能的非半胱氨酸单一氨基酸取代的文库(43个非Cys氨基酸x 18种可能的非Cys取代＝775种变体，包括SEQ ID NO:1)。
图2中的流式细胞术图说明展示TfR和单一克隆肽的细胞。图2A说明表达SEQ IDNO:1的肽(x轴，GFP)的细胞和对照蛋白质(y轴，用荧光抗His抗体染色)的流式细胞术图。图2B说明表达SEQ ID NO:1的肽(x轴，GFP)的细胞和对照蛋白质(y轴，用荧光链霉亲和素染色)的流式细胞术图。图2C说明表达SEQ ID NO:1的肽(x轴，GFP)的细胞和TfR(y轴，用荧光抗His抗体染色)的流式细胞术图。图2D说明表达SEQ ID NO:1的肽(x轴，GFP)的细胞和TfR(y轴，用荧光链霉亲和素染色)的流式细胞术图。
在表达所鉴定克隆的细胞的情况下观察到TfR染色，在对照蛋白质的情况下未见染色。当荧光链霉亲和素或抗His抗体是共染色剂时观察到这个染色，从而证明结合的性质仅依赖于TfR，而非共染色剂。双重阳性细胞(右手上方象限)指示结合于TfR的肽表达性细胞。
一替代性方法也用于鉴定和优化(“成熟”)是使用哺乳动物展示筛选获得的第二代和第三代结合剂的TfR结合肽。使用较低浓度的靶标和共染色剂(20nM)以及单独染色步骤，用经修改染色方案筛选这个文库，通过消除由链霉亲和素给予的四价亲合力，所述单独染色步骤进一步增加严格性。直至四轮流动分选和富集用于鉴定具有改善的TfR结合特征的变体。富集变体的排列鉴定了最优突变体(SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:2是添加了N端GS的SEQ ID NO:37))，并且再次重复这个过程(8nM TfR和共染色剂；在其他方面是相同的方案)而产生SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:32是添加了N端GS的SEQID NO:67)。相对于原始文库成员(GSREGCASHCTKYKAELEKCE ARVSSRSNTEETCVQELFDFLHCVDHCVSQ，SEQ ID NO:362)这个两次成熟变体含有14个点突变。相对于亲本序列的4个点突变见于SEQ ID NO:1中，而SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:32相对于上代分别含有6个和4个突变。
以可溶性肽形式产生SEQ ID NO:1和它的变体(例如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32)，并且通过反相HPLC(RP-HPLC)、SDS-PAGE和质谱测定法来验证(图4A、图4C和图4E)。基于它们的约5-6kDa的质量，它们在SDS-PAGE中慢于预期的迁移性是对一些CDP具有的引起关注的电泳迁移性特征的证明。在SDS-PAGE与RP-HPLC两者中，在DTT还原(10mM)后，所有变体都显示显著不同的迁移性，从而确认二硫键稳定化作用。通过表面等离子体共振验证了它们与TfR的结合(图7)，从而还确认成熟变体的亲和力增加(SEQ ID NO:32[KD＝216±1pM]>SEQ ID NO:2[KD＝8.7±0.4nM]>SEQ ID NO:1[KD未测出])。还评估了肽在还原、蛋白酶暴露和加热的条件下的稳定性(图5、图6和图26)。所有变体都显示对细胞还原性条件(10mM谷胱甘肽)的完全或部分抗性，而亲和力成熟变体显示对胃蛋白酶的部分抗性(但所有变体都易受胰蛋白酶蛋白水解)。相对于DTT还原的蛋白质的热耐受性，SEQ ID NO:32蛋白的完整非还原肽显示实质上改善的热耐受性，在圆二色谱特征方面不具有大量变化直至远高于常见环境温度(>50℃)，并且直至95℃未能观察到完全展开。
实施例6
肽的位点饱和诱变
该实施例说明本公开的肽的位点饱和诱变(SSM)以鉴定有益或有害突变。对SEQID NO:1(SEQ ID NO:1是添加了N端GS的SEQ ID NO:36，结果在图3A中)的肽和SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:2是添加了N端GS的SEQ ID NO:37，结果在图3B中)的肽进行位点饱和诱变。
图3显示在肽成熟期间鉴定的TfR结合肽变体的TfR结合能力。SSM用于如在第一哺乳动物表面展示实验(参见例如图1和图2)中鉴定的具有SEQ ID NO:1的序列的肽的亲和力成熟。在每轮成熟期间，构建每个可能的非半胱氨酸点变体的文库，并且在高于第一筛选的严格性下针对TfR加以筛选。富集具有改善的结合的变体，并且通过桑格尔测序来鉴定。将此类富集变异突变以各种排列(显示于数据中)彼此组合以鉴定复合改善结合剂。完成了两轮SSM，从而分别产生包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32的成熟肽(SEQ ID NO:32是添加了N端GS的SEQ ID NO:67)。第一轮SSM中的TfR浓度是20nM，并且使用一步染色进行SSM。第二轮SSM中的TfR浓度是8nM，并且使用两步染色进行SSM。
如实施例4和实施例5中所述进行表达SSM文库的肽的哺乳动物细胞的TfR结合，但采用更高严格性方案。更高严格性方案包括更低TfR浓度(例如20nM)。
图3A说明以SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:1是添加了N端GS的SEQ ID NO:36)进行第一位点饱和诱变筛选的结果，其中一些变体展现改善的与TfR的结合活性，诸如具有SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8分别是添加了N端GS的SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:43)的序列的肽。图3B显示在第二变异突变期间鉴定的变体的TfR结合。
x轴显示所有变体的SEQ ID NO，并且y轴显示从流式细胞术实验外推的以相对荧光单位(RFU)表示的结合的TfR的量。
实施例7
SSM产生的TfR结合肽变体的TfR结合
该实施例显示位点饱和诱变(SSM)产生的TfR结合肽变体的TfR结合，所述变体如在如实施例6中所述的SSM期间所鉴定
体内BBB穿透实验揭示肽的TfR结合能力未必与促进囊泡胞吞转运的能力相对应。
以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基C6、C10、C20、C34、C44和C48(以SEQ ID NO:67为参考，C4、C8、C18、C32、C42和C46)的六个半胱氨酸参与二硫键，因此促进肽稳定性。
以SEQ ID NO:32为参考，存在于TfR结合肽的全部三代中的对应于残基G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50、Q51(以SEQ ID NO:67为参考，G3、A5、S6、N12、L15、E16、E19、L36、L40、L43、D44、H45、S48、Q49)的表面界面残基可能促进TfR结合。在一些实施方案中，本公开的肽或肽构建体在SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中包含这些相应残基中的至少一者或多者。因此，此类肽可被工程改造来具有增强的与TfR的结合。
亲水性表面远端残基诸如D、E、H、K、R、N、Q、S或T可能促进肽溶解性，以SEQ ID NO:32为参考，对应于以下氨基酸残基R3、E4、R9、K12、D14、E15、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39和D40(以SEQ ID NO:67为参考，R1、E3、R7、K10、D12、E13、K17、R21、S24、S26、N27、T28、E29、E30、D31、E33、Q34、E35、E37和D38)。在一些实施方案中，本公开的肽或肽构建体在SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中包含这些相应残基中的至少一者或多者。因此，此类肽可被工程改造来具有增强的溶解性。
较高结合亲和力与存在亲水性残基诸如D、E、H、K、R、N、Q、S或T相关联，如通过由在以SEQ ID NO:32为参考，对应于D15、E35、E39和H49(以SEQ ID NO:67为参考，D13、E33、E37和H47)的残基处的从非极性或疏水性残基诸如A、M、I、L、V、F、W或Y的突变所致的改善的结合所显示。在一些实施方案中，本公开的肽或肽构建体在SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ IDNO:361中包含这些相应残基中的至少一者或多者。因此，此类肽可被工程改造来具有改进的结合亲和力。
对TfR的较高结合亲和力与非极性或疏水性残基诸如A、M、I、L、V、F、W或Y相关联，如通过由在以SEQ ID NO:32为参考，对应于M11、M25和M27(以SEQ ID NO:67为参考，M9、M23和M25)的氨基酸残基处的从亲水性残基诸如D、E、H、K、R、N、Q、S或T的突变所致的改善的结合所显示。在一些实施方案中，本公开的肽或肽构建体在SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ IDNO:361中包含这些相应残基中的至少一者或多者。因此，此类肽可被工程改造来具有改进的结合亲和力。
较高TfR结合亲和力与脂族残基诸如A、M、I、L或V相关联，如通过由在以SEQ IDNO:32为参考，对应于L45(以SEQ ID NO:67为参考，L43)的氨基酸残基处的从大型芳族残基诸如F、W或Y的突变所致的改善的结合所显示。将本公开的肽中的任何一个或多个F、W或Y取代成包括A、M、I、L或V的脂族残基可用于增强所述肽对TfR的结合亲和力。
本公开的任何肽或肽构建体(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者)都可在本文所述的相应残基中的一者或多者处加以修饰，以产生具有改善的性质的肽变体，所述改善的性质包括增强的稳定性和增加的(或降低的)结合性质或改进的TfR结合亲和力和增加的(或降低的)胞吞转运性质，包括改性的ka(缔合)和kd(解离)速率常数。
某些TfR结合肽的序列比对显示于表8中。涉及于与TfR的相互作用中的某些残基以粗体显示。表面相互作用残基包括但不限于指示的那些。
表8–TfR结合肽中的相应残基
Figure BDA0003175003630002781
Figure BDA0003175003630002791
Figure BDA0003175003630002801
实施例8
肽在还原性条件下的稳定性
该实施例描述经设计或经工程改造肽在还原性条件下的稳定性。被设计或工程改造来与细胞中的一种或多种靶蛋白诸如核或细胞质中的蛋白质相互作用的肽暴露于细胞的胞质区室中的还原性条件。因此，对于本公开的肽来说，有利的是在还原性条件下显示稳定性。测试了本公开的肽在10mM二硫苏糖醇(DTT)和10mM谷胱甘肽(GSH)中的稳定性。DTT是一种强烈还原剂，其代表比肽将在生物环境(例如细胞)中暴露于的条件更严苛的条件。对于测试肽在细胞内条件下的稳定性，GSH是一种更具生理相关性的还原剂。肽-靶蛋白相互作用的一个实例是肽与TfR蛋白的结合。该实施例描述肽在还原性条件下的稳定性。以可溶性蛋白质形式产生SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:1的变体，并且测试它们在溶液中的行为以及它们在二硫键还原后的迁移性。
测试了肽在10mM GSH(一种生物相关的还原剂)和10mM DTT(比GSH更强烈的还原剂)中的稳定性。如图7中所示，使具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:32分别是添加了N端GS的SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:67)的序列的肽暴露于使用DTT的还原性条件，并且与其中在PBS中孵育肽的对照实验进行比较。通过SDS-PAGE和HPLC来测量肽稳定性。图4A至图4E中呈现的数据显示SEQID NO:2和SEQ ID NO:32的肽对用DTT进行的还原最具抗性，如通过在暴露于DTT之后在HPLC色谱图中保留有原始肽峰所证实。
在后续研究中，使分别包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:32(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32分别是添加了N端GS的SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:67)的四种肽经受使用10mM DTT和10mM GSH的还原性条件，如图5中所示。图5A至图5D中所示的重叠HPLC色谱图显示具有SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的序列的肽对GSH还原具有几乎完全抗性，其中具有SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2的序列的肽对GSH还原具有仅部分抗性。对于测试在细胞内条件下的稳定性，GSH还原是一种更具生理相关性的还原剂，但所有四种肽都在暴露于DTT之后显示还原。这些结果证明SEQ ID NO:1和它的变体展现二硫键驱动的结构和行为。
实施例9
肽对蛋白酶的稳定性
该实施例说明本公开的肽对蛋白酶的稳定性。肿瘤环境例如含有高浓度的蛋白酶。此外，对蛋白水解(由蛋白酶达成的降解或切割)的抗性会降低例如在循环中肽降解和后续免疫原性的可能性。对蛋白水解的抗性可还增加肽的血清半衰期和肽的总体生物利用度。因此，对于本公开的肽来说，有利的是对由蛋白酶达成的降解具有抗性。
为测定对蛋白水解消化的抗性，将SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32分别是添加了N端GS的SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:67)的肽与50U的猪胃蛋白酶(Sigma-Aldrich P7012)在处于pH 1.05的模拟胃液中混合，或与50U的猪胰蛋白酶(Sigma-Aldrich 6567)在PBS中混合，在37℃下孵育30分钟，并且通过反相HPLC(RP-HPLC)来分析。单独地，将肽与50U的猪胃蛋白酶(Sigma-Aldrich P7012)在处于pH 1.05的模拟胃液43中混合，或与50U的猪胰蛋白酶(Sigma-Aldrich 6567)在PBS中混合，在37℃下孵育30分钟，并且通过RP-HPLC来分析。在PBS中孵育对照肽。所有肽都在非还原性条件下孵育。
图6说明TfR结合肽对包括胃蛋白酶和胰蛋白酶处理的蛋白酶的抗性。图6说明未经受处理(红色)、经受胰蛋白酶(蓝色)或胃蛋白酶(绿色)的肽的反相HPLC迹线的重叠图(每种测试肽一个重叠图)。图6A说明具有SEQ ID NO:1的序列的肽对胰蛋白酶(蓝色)和胃蛋白酶(绿色)的抗性。图6B说明具有SEQ ID NO:2的序列的肽对胰蛋白酶(蓝色)和胃蛋白酶(绿色)的抗性。图6C说明具有SEQ ID NO:32的序列的肽对胰蛋白酶(蓝色)和胃蛋白酶(绿色)的抗性。图6D说明具有SEQ ID NO:30的序列的肽对胰蛋白酶(蓝色)和胃蛋白酶(绿色)的抗性。
在这些条件下，具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的序列的肽对胃蛋白酶处理而非胰蛋白酶处理具有部分抗性。具有SEQ ID NO:1的序列的肽易受两种蛋白酶的影响。
实施例10
肽结合相互作用的表面等离子体共振(SPR)分析
该实施例说明对肽与TfR的结合相互作用的表面等离子体共振(SPR)分析。
分析了本公开的各种肽对TfR的结合亲和力。简而言之，通过使用经捕获生物素化TfR进行的SPR实验来分析结合亲和力，并且所述实验在25℃下用S系列SA芯片在BiacoreT100仪器(GE Healthcare)上进行。HBS-EP+(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20)作为运行缓冲液与0.1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)一起用于实验中。通过孵育一系列稀释液来评估可溶性TfR结合肽的结合，其中浓度范围视TfR结合肽而变化，所述TfR结合肽用2ug/ml TfR加以测试，从而捕获约300共振单位(RU)的蛋白质用于SPR实验。
首先，通过SPR确认具有不同亲和力的TfR结合肽的等位基因系列，如图7中所示。在300nM的浓度下测试具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:32(SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:32分别是添加了N端GS的SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:67)的序列的肽。结果确认由稍后轮次的亲和力成熟获得的肽变体展现不同的对TfR的结合亲和力。也就是说，由最近轮次的亲和力成熟获得的具有SEQ ID NO:32的序列的肽显示最高的对TfR的结合亲和力，而SEQ ID NO:1显示最低的对人TfR(hTfR)的结合亲和力。
然后，测量分别具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32分别是添加了N端GS的SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:67)的序列的四种肽与经捕获和生物素化hTfR的结合。图8说明显示从100pM至200nM的不同浓度的具有SEQ ID NO:2的序列的肽的TfR结合的表面等离子体共振(SPR)迹线。图9说明显示从100pM至200nM的不同浓度的具有SEQ ID NO:4的序列的肽的TfR结合的表面等离子体共振(SPR)迹线。图10说明根据SPR的SEQ ID NO:32与经捕获生物素化(Bt)hTfR的结合的结合和单循环动力学数据。在2种密度的经捕获Bt-hTfR上注射5种浓度的具有SEQ ID NO:32的序列的肽(0.037nM、0.11nM、0.33nM、1nM、3nM)，并且加以整体分析。图11说明根据SPR的SEQ ID NO:30与经捕获生物素化hTfR的结合的结合和单循环动力学数据。在2种密度的经捕获Bt-hTfR上注射5种浓度的具有SEQ ID NO:30的序列的肽(0.037nM、0.11nM、0.33nM、1nM、3nM)，并且加以整体分析。
在100pM与200nM之间的连续稀释度下测量SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的结合，而在37pM至3nM的连续稀释度下测试SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32，以产生动力学数据。对于SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的肽，通过在两种密度(在图10和图11中显示为红色和绿色迹线)的经捕获和生物素化hTfR上注射肽来进行动力学测试，并且整体分析数据。
下表9概述从对图8–图11中所示的图的分析获得的数据。对于具有SEQ ID NO:2的序列的肽，确定了8.7±4nM的KD和23.1±2RU的R最大。对于具有SEQ ID NO:4的序列的肽，确定了14.8±6nM的KD和21.2±2RU的R最大。对于具有SEQ ID NO:32的序列的肽，确定了216±1pM的KD。对于具有SEQ ID NO:30的序列的肽，确定了468±1pM的KD。较低KD值指示较高结合亲和力。R最大代表肽与hTfR的最大结合能力。如下表中所示，SEQ ID NO:32具有最低KD，从而指示它显示最强烈的与hTfR的结合。增加的TfR结合亲和力可对应于改善的胞吞转运功能。在一些情况下，增加的TfR结合亲和力可对应于降低的胞吞转运功能，其中在一些情况下，相较于参考肽，增加的TfR结合亲和力不对应于胞吞转运功能变化。在不束缚于任何理论下，假定Ka/Kd的比率可影响肽的胞吞转运功能，因此，调节Ka和/或Kd可用于产生具有最优TfR结合亲和力和胞吞转运功能的TfR结合肽。
表9–SPR分析结果
Figure BDA0003175003630002851
*报告的ka接近可通过仪器来测量的限值
实施例11
在内源性TfR结合物存在下肽与TfR的竞争性结合
该实施例描述在内源性TfR结合物去铁转铁蛋白(无铁)和全铁转铁蛋白(铁装载)存在下，本公开的肽与TfR的竞争性结合。
使表达具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32分别是添加了N端GS的SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:67)的序列的SDGF-肽的HEK-293悬浮细胞与TfR+PBS、TfR+在10μM下的去铁转铁蛋白(非铁装载)，或TfR+在10μM下的全铁转铁蛋白(铁装载)一起孵育。使经转染细胞与全铁转铁蛋白或去铁转铁蛋白一起孵育，随后添加含有8nM生物素化TfR的TfR溶液。使细胞沉淀，并且再悬浮于AF647-链霉亲和素溶液中。使细胞沉淀，并且通过流式细胞术来分析指示TfR结合的链霉亲和素染色。
图12中所示的数据证明具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32的序列的肽成功地与全铁转铁蛋白竞争TfR结合(y轴显示由流式细胞术实验获得的相对荧光单位)。在全铁转铁蛋白存在下，相比于具有SEQ ID NO:2的序列的第一代肽，第三代SSM产生的具有SEQ ID NO:32的序列的肽展现更高的对TfR的竞争性结合。
这个数据指示即使在全铁转铁蛋白或去铁转铁蛋白存在下，诸如在血流中，本公开的肽也可仍然结合TfR。这另外确认亲和力成熟产生了具有对TfR的高结合亲和力，并且相较于内源性结合物，显示与TfR的竞争性结合的肽。
实施例12
SEQ ID NO:32的肽的解析晶体结构
该实施例说明SEQ ID NO:32的肽和TfR的解析晶体结构。首先通过尺寸排阻色谱法来纯化TfR-SEQ ID NO:32复合物，随后添加至晶体托盘。
简而言之，将冻干SEQ ID NO:32以11mg/mL的浓度复溶于25mM PIPES(pH＝7.0)、150mM NaCl和1mM EDTA中。以蒸气平衡形式使用JCSG-plus稀疏矩阵筛选(MolecularDimensions)来确定初步结晶条件。通过在环境温度下，包含1μL蛋白质溶液加1μL孔溶液的液滴在具有1mL 9％w/w PEG(MW＝3350)、30mM(NH4)2SO4、100mM Bis-Tris(pH＝5.0)的孔上的蒸气平衡来获得衍射品质晶体。通过转移至孔溶液加20％v/v甘油中来低温保存晶体以进行数据收集。在具有Osmic Varimax光学器件和Rigaku Saturn 944+CCD检测器的内部Rigaku MicroMax-007HF旋转阳极发生器上收集衍射数据
Figure BDA0003175003630002861
Figure BDA0003175003630002862
为分离化学计量复合物，在1.2:1摩尔比下混合纯化SEQ ID NO:32和TfR，孵育，并且通过尺寸排阻色谱法来在Superose 6 10/300柱(GE Healthcare Life Sciences)上在25mM PIPES、150mM NaCl和1mM EDTA(pH＝7.0)中分级分离。在10mg/mL的目标浓度下再悬浮hTfR-肽复合物。通过蒸气扩散来在室温下进行结晶筛选，采用1:1蛋白质溶液:储库溶液坐滴，使用Nextal JCSG+、PEG和(NH4)2SO4析因套件(Qiagen)和亚微升机器人(TTP Labtechmosquito)来设置。通过在环境温度下，包含1μL蛋白质溶液加1μL孔溶液的液滴在具有1mL5％w/w PEG(Mr＝6000)、100mM MES(pH＝6.5)的孔上的蒸气平衡来获得衍射品质晶体。通过转移至孔溶液加15％v/v甘油中来低温保存晶体以进行数据收集。使用Rigaku MicroMax007HF家用光源或在Advanced Light Source(Lawrence Berkley National Laboratory,Berkeley,CA)的光束线5.0.1在
Figure BDA0003175003630002871
的波长下从单晶体收集衍射数据
Figure BDA0003175003630002872
通过以下方式来测定初始相：分子置换(MR)，使用CCP4程序套件(Winn,M.D.,ActaCrystallogr D Biol Crystallogr.,67(Pt 4):235-42(2011))中的PHASER(McCoy,A.J.,JAppl Crystallogr.,40(Pt 4):658-674(2007))，使用来自RCSB PDB(Berman,H.M.,Nucleic Acids Res.,28(1):235-42(2000))的同源性结构作为搜索模型；或硫单波长异常衍射(sSAD)(Liu,Q.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.,69(Pt 7):1314-32(2013))，使用CuKα辐射来使异常信号最大化，以及用SHELX(Sheldrick,G.M.,ActaCrystallogr D Biol Crystallogr.,66(Pt 4):479-85(2010))测定硫子结构。对于sSAD定相，通过以1°振荡，采用180°的交替
Figure BDA0003175003630002873
旋转，通过5°楔收集数据来优化Bijvoet对测量。用HKL2000(Otwinowski,Z.,Methods Enzymol.,276:307-326(1997))简化和定标数据。用COOT(Emsely,P.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.,60(Pt 12Pt 1):2126-32(2004))和REFMAC(Murshudov,G.N.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.,53(Pt 3):240-55(1997))进行模型构建和细化的迭代循环。用MolProbity(Davis,I.W.,NucleicAcids Res.,35(网络服务器期号):W375-83(2007))进行结构验证。需要REFMAC5中的孪晶细化以产生apo-SEQ ID NO:32的可解释电子密度图。
解析了单独以及结合于TfR的SEQ ID NO:32的晶体结构(图13和图14)。如通过结构建模所示，CDP是反平行两螺旋束。它含有具有简单发夹拓扑结构的三个二硫键(配对的C4:C46、C8:C42和C18:C32)(图13C)。在与TfR复合后，N端和C端残基变得有序，从而接触TfR。然而，在结合形式与未结合形式之间，CDP的螺旋核心(在C8:C42二硫键之间，并且包括C8:C42二硫键)几乎是相同的，其中进行主链比对以获得
Figure BDA0003175003630002881
(N＝8个比对)的RMSD。在两种晶体中，连接螺旋的环均是无序的。图13中的游离和TfR结合SEQ ID NO:32的卡通表现形式是不对称单元的所有分子的叠加：四倍用于游离SEQ ID NO:32，两倍用于经TfR结合。对蛋白酶降解具有抗性的稳定肽使在用肽对人或其他动物给药后的任何免疫原性风险降低。对本公开的肽的TfR结合药效团的准确结晶学了解可允许进行序列优化以进一步限制肽片段与主要组织相容性复合物(MHC)的任何结合，因此降低由肽的重复给药引起的任何免疫原性风险。对外来蛋白质的免疫识别要求在抗原呈递细胞中进行蛋白质的断裂，以及那些片段与MHC(在人中是HLA)结合。一些基序有利于片段:MHC结合，而其他基序是不利的。在了解经结合肽和未结合肽的结构的情况下，可通过产生破坏片段与MHC的结合的突变，同时使关键结合残基不受影响来设计具有降低的免疫原性的变体。
与TfR的结合由极性相互作用与非极性相互作用两者介导；后者主要是Met和Leu残基装入在界面处的小型疏水性口袋中(图13D)。N端的变形由与TfR形成三个氢键所致，而在结合状态与未结合状态之间C端螺旋的调整适应了SEQ ID NO:32的H47周围的空间排列。N端GS残段，即来自噬铁蛋白融合配偶体的在TEV切割之后的残余部分，也是无序的。总之，考虑到小包埋表面积
Figure BDA0003175003630002882
亲和力(KD＝216±1pM)相当强；相较于113种异二聚复合物的公开亲和力和包埋表面积，具有较小包埋表面积的86种复合物中仅两者显示较强烈亲和力(巧合的是，它们中的一者是蛋白酶抑制性CDP和它的靶标)。
通过与TfR:转铁蛋白共晶体结构进行比较，SEQ ID NO:32足迹与转铁蛋白的足迹重叠，从而预示竞争性结合(图13D)。这在可溶性去铁转铁蛋白或全铁转铁蛋白存在下的表面展示流式细胞术结合测定中得到确认(图12)。尽管这可由于全铁转铁蛋白的高血浆水平(据报道是20μM或更大)而降低BBB穿透，但相比于对于TfR:转铁蛋白相互作用所公开的解离速率和缔合速率，最高亲和力TfR结合变体(SEQ ID NO:32)具有类似解离速率(kd)，但缔合速率(ka)快得多。可能一旦携带TfR至顶端细胞表面的囊泡融合并使受体暴露于血流，SEQ ID NO:32就容易地能够比转铁蛋白更快速地与新近血浆暴露的TfR结合。相比于转铁蛋白的报道胞吞作用速率(t1/2＝3.5分钟)，SEQ ID NO:32释放的半衰期(约10分钟)长得多，并且因为TfR摄取不依赖配体，所以SEQ ID NO:32可能容易地在与转铁蛋白竞争它的结合位点中胜出，并且足够长久地占据它以达成摄取。在人直系同源物与鼠直系同源物之间，构成TfR上的SEQ ID NO:32结合位点的残基中的大多数是保守的(图13E)。这暗示交叉反应性，所述交叉反应性在使用表面展示的人或鼠TfR(通过SDGF)和染料缀合的可溶性TfR结合变体进行的流式细胞术结合测定(图13E和图15)中得到确认。采用了这个替代性策略(可溶性CDP、表面结合的靶标)，因为可溶性鼠TfR胞外域不可被产生，但作为表面展示的蛋白质表现良好。
图13说明hTfR和具有SEQ ID NO:32的序列的肽的共结晶。图13A说明与具有SEQID NO:32的序列的肽共结晶的hTfR的第一视图，所述视图显示肽分子在hTfR的相对面上，并且确认在结合的肽与hTfR之间的2:2结合化学计量。两个螺旋之间的描绘为实心黑色卷曲线的连接序列在晶体结构中未得到分辨，并且基于结构建模。图13B说明图13A的放大视图，并且显示与具有SEQ ID NO:32的序列的肽共结晶的hTfR，显示了驱动结合的众多极性和非极性相互作用。非极性相互作用主要是Leu和Met，而极性相互作用是若干带电荷和非带电荷残基的混合。以SEQ ID NO:32为参考，涉及于此相互作用或与TfR的结合中的氨基酸残基对应于残基G5、C6、A7、S8、C10、M11、N14、L17、E18、E21、L38、L41、L42、L45、D46、H47、H49、S50、Q51(以SEQ ID NO:67为参考，G3、C4、A5、S6、C8、M9、N12、L15、E16、E19、L36、L39、L40、L43、D44、H45、H47、S48、Q49)。在一些实施方案中，本公开的肽或肽构建体在SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中包含这些相应残基中的至少一者或多者。从内源性CDP突变的氨基酸侧链或是界面的一部分的那些显示为棍棒。界面邻近残基以黑色显示，而界面远端残基以青色显示。图14说明具有SEQ ID NO:32的序列的肽和来自公开文献的转铁蛋白(RCSB PDB 1SUV)的叠加，两者均结合于hTfR。类似地，图13E说明同一肽与不同公开转铁蛋白受体(RCSB PDB 3S9L)的叠加。叠加说明转铁蛋白和具有SEQ ID NO:32的序列的肽在它们在TfR上的结合位点方面重叠(图13E，左侧)。人(SEQ ID NO:353)同源物与鼠(SEQ IDNO:354)同源物两者的SEQ ID NO:32结合位点显示TfR上结合表面的大部分在两个物种之间共有同一性或类似性(图13E，右侧)。图14A说明结合于TfR的转铁蛋白(数据取自公开文献(RCSB PDB 1SUV))和具有SEQ ID NO:32的序列的肽的叠加。图14B说明结合于TfR的具有SEQ ID NO:32的序列的肽的放大视图，指示当相较于图14A中内源性转铁蛋白的结合位点时，具有SEQ ID NO:32的序列的肽与转铁蛋白两者在hTfR上具有重叠结合位点。从内源性CDP突变或是界面的一部分的氨基酸侧链显示为棍棒。界面邻近残基以黑色显示，而界面远端残基以青色显示。
由hTfR和具有SEQ ID NO:32的序列的TfR结合肽形成的复合物的解析晶体结构确认SEQ ID NO:32与TfR的结合位点和转铁蛋白与TfR的结合位点重叠。
本公开的任何肽或肽构建体(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者)都可在以上晶体结构中鉴定的相应残基中的一者或多者处加以修饰，以产生具有改善的性质的肽变体，所述改善的性质包括增强的稳定性和增加的(或降低的)结合性质或改进的TfR结合亲和力，和/或增加的(或降低的)胞吞转运功能。
实施例13
TfR结合肽与鼠TfR的交叉反应性
该实施例说明在细胞表面结合测定中本公开的TfR结合肽与鼠TfR的交叉反应性。使用实施例3中所述的表面展示范式的反转。简而言之，用通过NHS酯缀合来经AlexaFluor647染料直接标记的可溶性TfR结合肽染色在它们的表面上表达人或小鼠TfR的293F细胞。图15A和图15B显示使用物种特异性抗体来验证人TfR表达相对于小鼠TfR表达的流式细胞术图。图15C和图15D显示肽有效地结合两种同源物。在一类似实验中，流式细胞术用于证明SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32和抗Tf抗体(阳性对照)的有效结合。通过物种特异性抗体来确认人和鼠TfR胞外域(分别是HsTfR和MmTfr)的SDGF表面表达。用经AlexaFluor 647标记CDP变体(例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)对这些细胞染色证明了较高亲和力变体的交叉反应性和改善的染色(图13E)。
本公开的任何肽或肽构建体(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者)都可在以上晶体结构中鉴定的相应残基中的一者或多者处加以修饰，以产生具有改善的性质的肽变体，所述改善的性质包括增强的稳定性和增加的(或降低的)结合性质或改进的TfR结合亲和力，和/或增加的(或降低的)胞吞转运功能。在不受任何理论束缚下，本文所述的数据指示TfR结合肽的所有氨基酸残基对于交叉反应性都可为重要的。
表面展示流式细胞术还用于验证SEQ ID NO:32在转铁蛋白受体上的结合界面，如来自实施例12的晶体结构中所鉴定(图13至图14)。TfR:SEQ ID NO:32界面与转铁蛋白的界面重叠，从而预示竞争性结合(图14A和图13E)。相比于对于TfR:转铁蛋白相互作用所公开的解离速率和缔合速率，SEQ ID NO:1的变体家族的所鉴定的最高亲和力变体(具有SEQ IDNO:32的序列的变体)具有类似解离速率(kd)，但缔合速率(ka)快得多。还研究了TfR上SEQID NO:32结合表面的鼠/人同源性(图14A和图13E)，相较于鼠TfR，人TfR具有少许不类似残基。这暗示交叉反应性，所述交叉反应性在流式细胞术结合测定(图15)中得到确认。
实施例14
TfR结合肽的全身放射自显影术
该实施例说明对具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32分别是添加了N端GS的SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:67)的序列的经放射性标记肽的生物分布的测定，所述测定通过体内放射自显影术来获得。
通过使赖氨酸和N端甲基化来放射性标记每种肽，如实施例19中所述。因此，肽可含有甲基或二甲基赖氨酸和甲基化或二甲基化氨基末端。将100nmol的剂量的经放射性标记肽通过尾静脉注射来施用在称重是20-25g的雌性哈兰无胸腺裸小鼠中。将经14C标记CDP再悬浮于100μL PBS中以达到100nmol，用于静脉内注射至小鼠中。
使每种经放射性标记肽在动物内自由循环所述时期(30分钟或3小时)，随后将动物安乐死并切片。
如下进行全身放射自显影术(WBA)矢状切片。在给药时期结束时，将小鼠冷冻在己烷/干冰浴中，然后包埋在一块冷冻羧甲基纤维素中。使冷冻尸体在-20℃下经受脱气己烷过夜，随后包埋在冷却2％羧甲基纤维素(Sigma Aldrich，C5013)中。然后向每块中钻孔，并且将含放射性14C甘氨酸对照(0.5μCi mL-1，American Radiolabeled Chemicals)的PBS+0.5％BSA吸移在孔中并使其冷冻，随后在H/IBright 8250低温恒温器(HackerInstruments)上切片(40μm)。制备全动物矢状薄片，所述薄片产生薄冷冻切片用于成像。使用切片机获得薄冷冻切片，并且允许显现组织，诸如脑、肿瘤、肝、肾、肺、心脏、脾、胰腺、肌肉、脂肪、胆囊、上胃肠道、下胃肠道、骨、骨髓、生殖道、眼、软骨、胃、皮肤、脊髓、膀胱、唾液腺以及更多组织。将切片在2-6个深度下收集至4英寸宽的胶带(Scotch 821，ULINE)上以对所有目标组织取样，并且在低温恒温器中冷冻干燥2-3天，此后，将它们封固在坚固的纸上并用玻璃纸覆盖。使封固切片连同放射性标准曲线(146S-PL，American RadiolabeledChemicals)一起暴露于储存磷光板(Raytest)7天。在成像之前使切片在冷冻器中干燥。
对于放射自显影术成像，使胶带封固的薄切片冷冻干燥，并且使放射性样品暴露于磷光成像仪板7天。使这些板显影，并且将来自每个器官的信号(密度计量术)以见于每个动物的心脏血液中的信号作归一化。组织中的信号暗于对那个组织中的血液预期的信号指示在某一区域、组织、结构或细胞中积累。在Raytest CR-35成像仪上，在“25μm灵敏”设置下进行扫描。使用AIDA图像分析器v5.1全身放射自显影术专业软件(Raytest)，通过背景调整的密度计量术来进行定量。对于定量，将来自单一切片内单一组织的所有目标区域测量结果平均化，关于面积加以调整。评估心脏中的血液值。以nmol g-1组织表示的报告值需要相对于与每个WBA样品集共暴露的商业标准条带进行校正。将条带自身加以校正，以致通过液体闪烁计数(LSC)来测定的每克组织的已知量的每分钟放射性计数(CPM)对应于在11个标准条带浓度数据点(对应于6.3nCi g-1至3.3μCi g-1的线性范围)下测量的WBA密度计量。这个校正与肽的已知浓度和比活性(通过液体闪烁计数来测定)组合容许转换成nmol g-1。对于图18、图19和图33中所示的定量，分析的切片的总数在图例中指示；并非每个切片含有每种组织，但每个组织定量代表3-10只小鼠每只小鼠1-4个切片每个切片1-3个目标区域。值得注意的是，在100nmol剂量和25g的平均小鼠重量下，4nmol/g代表“100％注射剂量”。一些组织(脾/肾/肝)超过这个值，因为肽在组织处积累超出通过简单全身扩散来预期的值。这可指示肽优先在那些组织中积累。因此，计算在非血清组织中剩余的注射剂量百分比可产生不均匀组织分布数，因为不存在组织特异性“时间零点”量。
图16显示用具有SEQ ID NO:1(图16A)、SEQ ID NO:2(图16B)、SEQ ID NO:30(图16C)和SEQ ID NO:32(图16D)的序列的TfR结合肽施用的小鼠的放射自显影术图像。全身放射自显影术与静脉内注射的经14C标记肽一起用于评估生物分布。在用100nmol药物(在约25g小鼠的情况下，约20mg/kg)给药之后3小时获取图像。图像证明在脾、肝、肾中的大量积累，以及还在肌肉、骨髓和皮肤中的高积累。CNS积累小于其他组织，但相较于血清水平是大量的(血清的>25％)。发现脑中的背景血液水平是心脏血液信号的3％。
图17说明用经14C标记肽(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32)静脉内注射以评估生物分布的小鼠的全身放射自显影术。也观察到在侧腹肿瘤中的大量积累。图17A说明用经14C标记SEQ ID NO:1静脉内注射的小鼠的白光图像。图17B说明用经14C标记SEQ ID NO:1静脉内注射的小鼠的白光图像。图17C说明用经14C标记SEQ ID NO:32静脉内注射的小鼠的全身放射自显影术。图17D说明用经14C标记SEQ ID NO:32静脉内注射的小鼠的全身放射自显影术。值得注意的是，两种肽的U87肿瘤分布是完全的，如通过遍及动物的背部上的侧腹肿瘤具有显著水平的肽所示，尽管肿瘤似乎在右侧的白光图像中处于不良血管化。肿瘤是皮下U87脑肿瘤。
除放射自显影术之外，还使用具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32的序列的肽进行离体闪烁计数(图18、图19和图33)。图18和图19分别显示以块中的经放射性标记对照样品以及以肽比活性作归一化，以nmol/g水平给出；以及仅归一化成血清水平的％的器官摄取数据的条形图。在30分钟时间点与3小时时间点两者的以nmol/g水平给出的肽比活性显示于图33中。图18说明在单次20mg/kg静脉内剂量的具有SEQ ID NO:1的序列的TfR结合肽或具有SEQ ID NO:32的序列的肽之后，肽生物分布和器官积累的定量。这个剂量在3小时之后实现CNS中>150nM，肿瘤中约1μM的水平。图19说明分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32的两种肽的肽生物分布和器官积累的定量。值显示为血液水平的百分比，其是常用BBB穿透量度(3％基线)。数据显示对于具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32的序列的TfR结合肽，肽的生物分布和器官积累发生在脾、肝、肾、皮肤、骨和脑中。
对于脑，在切片之前不对小鼠进行灌注。因此，CNS毛细血管可保持充满血液，并且仍然在循环中的任何肽都可在脑中创建微弱信号。然而，普遍接受的是CNS血液/毛细血管占据脑体积的约3％，因此，相对于血液，3％的信号可被视为等于“无CNS积累”。高于3％的任何信号都被视为肽CNS积累的证据，保留在毛细血管细胞中，或实际BBB穿透。因此，在>25％血液水平下，根据这个量度，两种肽均显示大量CNS积累。
实施例15
通过闪烁计数来对组织中肽积累的定量
该实施例说明通过闪烁计数来对组织中血清中肽的定量。通过实施例19中所述的方法来对肽进行放射性标记，然后静脉内施用至具有完整肾的雌性哈兰无胸腺裸小鼠。在100nmol(14.7μCi，20mg/kg)的剂量下静脉内施用经放射性标记肽。在各种时间点通过CO2窒息来使小鼠安乐死，并且收集组织和生物流体，包括肾、肝、脑、脾、肌肉和皮肤。在液体闪烁计数之前使实体组织均质化。通过参考肽的分子量和14C比活性来进行对组织中肽的量(nmol/g)的定量。图20显示在施用具有SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:32是添加了N端GS的SEQID NO:67)的序列的肽之后，通过闪烁计数来测定的对组织积累的定量。图20A说明肾中随时间的闪烁计数。图20B说明肝中随时间的闪烁计数。图20C说明脑(CNS)中随时间的闪烁计数。图20D说明脾中随时间的闪烁计数。图20E说明肌肉中随时间的闪烁计数。图20F说明皮肤中随时间的闪烁计数。数据显示对于具有SEQ ID NO:32的序列的肽，确认了肽在包括脾、肝、肾、皮肤、骨和脑的各种组织中的积累。历经64小时的时程，在诸如肾、肝、脾和肌肉的组织中，具有SEQ ID NO:32的序列的肽的量显著降低，在施用之后约1-2小时开始，其中肽在脑中的量略微降低，但然后历经实验的过程保持稳定。SEQ ID NO:32显示双相血浆消除动力学，其中第一消除半衰期是15.6分钟。最高水平见于肾、肝和脾中；肾负责排泄小血浆溶质，而肝组织与脾组织两者据报道表达高水平的TfR。脑显示较小但可测量的水平。
还测试了SEQ ID NO:32的肽在雌性哈兰无胸腺裸小鼠中的消除。在100nmol(14.7μCi，20mg/kg)的剂量下静脉内施用SEQ ID NO:32。图21说明静脉内施用SEQ ID NO:32的小鼠的血清消除图，包括显示快速(95％，15.6分钟t1/2)和缓慢(5％，10.3小时t1/2)相动力学的两相消除回归分析。
这个数据证明这些肽在诸如脾、肝、肾、皮肤、骨和脑的器官中的摄取和保留允许使用本公开的TfR结合肽将活性剂和/或可检测剂有效靶向和递送至这些器官。
实施例16
肽的多元时间回归和毛细血管消减分析
该实施例说明本公开的肽的多元时间回归(MTR)和毛细血管消减分析。
使小鼠(品系CD-1，N＝1/时间点)麻醉，并且通过手术暴露左侧颈静脉和右侧颈动脉。将经标记肽(0.45μCi，于200μL体积中；SEQ ID NO:1的比活性是32Ci/mol，并且SEQ IDNO:32的比活性是147Ci/mol(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32分别是添加了N端GS的SEQ IDNO:36和SEQ ID NO:67)，根据实施例19中所述的方法)注射至颈静脉中。在某一时程(0-30分钟)内的给定时间之后，收集动脉血液，随后断头并收集脑。通过液体闪烁计数来测试脑和血清的14C水平，并且将数据并入至多元时间回归数学模型中以定量CNS积累率。为确定这个CNS积累是限于毛细血管还是实际上代表血管胞吞转运，在给药之后5分钟使单独一组动物(N＝3/肽)安乐死，并且使脑匀浆经受右旋糖酐密度梯度离心。这允许从实质分离毛细血管，并且使两种组织单独经受闪烁计数以定量14C信号。归一化信号比是BBB穿透的指标；举例来说，SEQ ID NO:1展现的在实质中的信号实质上高于毛细血管，此证明穿过BBB的胞吞转运。
图22说明具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32的序列的TfR结合肽的多元时间回归分析和毛细血管消减分析。图22A在单一图中说明SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32的多元回归分析，其中y轴指示脑与血清比率。图22B说明具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32的序列的TfR结合肽的实质和毛细血管分布，其中y轴指示组织与血清(T与S)比率(μL/g)，即在相同时间点在相应组织(在这个情况下是实质或毛细血管)中测量的放射性与在循环血清中测量的放射性的比率。
图22B的条形图尤其强烈表明SEQ ID NO:1的肽的BBB转运和实质进入，从而证明本公开的肽实际上能够促进TfR介导的穿过BBB的转运(例如囊泡胞吞转运)。本公开的任何肽或肽构建体(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ IDNO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者)都可类似地能够促进TfR介导的穿过BBB的转运(例如通过囊泡胞吞转运)。毛细血管消减实验的短时间点(30分钟)可能解释在这个测定中观察到的缺乏SEQ ID NO:32的明显胞吞转运，但成功诱导了小鼠中的CRE-Luc报告体(4小时时间点)。
这个数据证明本公开的肽使得能够达成TfR介导的转运，从而使得能够将治疗剂和/或诊断剂递送至表达TfR的组织诸如脑(通过BBB达成的胞吞转运)、肿瘤、骨和骨髓、以及免疫细胞中。转运可穿过细胞层诸如内皮细胞(例如完整BBB)或穿过细胞膜来发生。因此，本公开的肽可用作多种活性剂进入表达TfR的任何细胞、组织或器官中的有效递送载体。此外，这个数据证明本文所述的肽与鼠TfR的结合。相较于常规方法，到达以及特异性靶向在完整BBB之后的肿瘤可为本文所述的TfR结合肽的特定优势(例如高度的未满足的临床需求)。
实施例17
肽在高温下的稳定性
该实施例显示本公开的肽在较高温度下是稳定的。
使用圆二色谱(CD)来评估蛋白质二级结构。用Jasco J-720W分光偏振计，使用1.0mm光程长比色皿来测量CD光谱。于10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中的蛋白质样品在25-30μM蛋白浓度下。在210nm的波长下分析样品。数据以相对椭圆率[θ]；(mdeg)表示。为测定蛋白质的热稳定性，使样品经受以2℃/min的匀变从20℃至95℃的递增性温度增加。在210nm下监测α-螺旋二级结构的稳定性和蛋白质展开。数据以相对椭圆率[θ]表示，所述相对椭圆率以毫度加以报告。
SEQ ID NO:32的熔解曲线显示于图27中。在还原性(10mM DTT)和非还原性(NR)条件下测试热稳定性。竖直线代表基于非线性曲线拟合(S形，可变斜率，约束底部＝0；对于两种情况，R2>0.98)的计算熔点(对于NR是约74℃，对于经10mM DTT处理是约38℃)。注意NR样品直至95℃未能达到平衡，因此有可能的是蛋白质在高温下未完全“熔解”，而是仅仅更加无序，特别是在延伸的环区域中。还原样品和非还原样品的差异说明由二硫键提供的在熔解温度和结构稳健性方面的显著增加。
实施例18
肽血浆半衰期的延长
该实施例显示一种延长如本文公开的肽的血清或血浆半衰期的方法。修饰具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者的序列的肽或肽构建体以增加它的血浆半衰期。肽与近红外染料诸如Cy5.5的缀合用于延长肽构建体的血清半衰期。或者，肽与白蛋白结合剂诸如Albu标签或C14-C18脂肪酸的缀合用于延长血浆半衰期。任选地，由于通过使用最小非人蛋白质序列达成的免疫原性降低，血浆半衰期得到延长。
实施例19
用14C进行的肽放射性标记
该实施例描述用14C对肽的放射性标记。
通过使用标准技术(诸如Jentoft等人J Biol Chem.254(11):4359-65.1979中所述的那些)来用14C甲醛和氰基硼氢化钠进行还原性甲基化，对本公开的肽进行放射性标记。简而言之，将肽(10mg)溶解于具有470μL 10x PBS的3.2mL水中。添加0.72mCi(12.6μM)14C-甲醛(57Ci mol-1，Pharmaron)和氰基硼氢化钠(直至100mmol，于水中)，随后涡旋15秒。在室温下将反应孵育过夜。将10μL反应搁置在1mL水中以进行分析，此后，在Strata-X反相柱(30mg，Phenomenex，用3mL甲醇和3mL水洗涤)上纯化14C甲基化肽。在上样之后，将柱用4mL水洗涤，并且用4mL 2％甲酸甲醇溶液洗脱。在吹风蒸发器(40℃，在氮气流下)中干燥经标记CDP，并且在18℃下储存直至使用。通过闪烁计数来测定比活性。SEQ ID NO:1的变体的变体比活性如下。SEQ ID NO:1：对于180分钟动物是32Ci/mol，对于30分钟动物是187Ci/mol。SEQ ID NO:2：对于180分钟动物是260Ci/mol，对于30分钟动物是179Ci/mol。SEQ ID NO:32：对于180分钟动物是273Ci/mol，对于30分钟动物是147Ci/mol。序列被工程改造来在N端具有氨基酸“G”和“S”。参见Methods in Enzymology V91:1983第570页以及JBC 254(11):1979第4359页。过量的甲醛用于驱动完全甲基化(每个游离胺的二甲基化)。
实施例20
肽可检测剂缀合物
该实施例描述染料对肽的标记。重组表达或化学合成本公开的肽，然后通过活化的酯(例如NHS酯)在DCC或EDC存在下来使所述肽的N端缀合于、连接于或融合于可检测剂以产生肽-可检测剂缀合物。可检测剂可为花青染料诸如Cy5.5、Alexa荧光团或Alexa647。
将肽可检测剂缀合物施用至受试者。受试者可为人类或非人类动物。在施用之后，肽可检测剂缀合物归巢至肾。使受试者或来自受试者的活检体成像以显现肽可检测剂缀合物向肾的定位。在一些方面，对肾病症的诊断基于在施用之后肽可检测剂缀合物在肾中的显现。
实施例21
肽活性剂缀合物
该实施例描述肽活性剂缀合物。重组表达或化学合成本公开的肽，然后通过活化的酯(例如NHS酯)在DCC或EDC存在下来使所述肽的N端缀合于、连接于或融合于活性剂以产生肽-活性剂缀合物。
将肽活性剂缀合物施用至有需要的受试者。受试者可为人类或非人类动物。在施用之后，肽活性剂缀合物通过TfR介导的胞吞转运来穿过内皮屏障胞吞转运至器官中。内皮屏障是血脑屏障(BBB)。肽活性剂缀合物改善治疗受试者所针对的疾患，例如脑癌。
实施例22
肽的用以改善结合亲和力的突变
该实施例说明肽的用以降低受体结合的解离速率并且/或者增加受体结合的缔合速率的突变。
使用位点饱和诱变(SSM)或任何随机诱变方法来使本公开的肽突变以增加或降低解离速率并且/或者增加缔合速率，由此增加或降低结合亲和力。肽选自以SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ IDNO:356–SEQ ID NO:361显示的肽中的任一者。测量肽递送至靶组织诸如脑实质的速率以确定肽的对于给定应用来说是最优的结合亲和力。
实施例23
癌症的治疗
该实施例说明使用本公开的肽来治疗癌症。
重组表达或化学合成本公开的肽，并且随后连接于治疗性分子。将肽或肽构建体以药物组合物形式作为癌症的治疗剂施用至有需要的受试者。肽选自具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ IDNO:356–SEQ ID NO:361的序列的肽或肽构建体中的任一者。将一种或多种肽施用至受试者。受试者可为人或动物。以静脉内、皮下、肌内或口服方式施用药物组合物。待用如本文所述的肽-药物缀合物治疗的癌症可为脑癌或CNS相关癌症。
实施例24
癌症的组合治疗
该实施例说明使用本公开的肽来组合治疗癌症。重组表达或化学合成本公开的肽，并且直接使用。使肽缀合于、连接于或融合于具有抗癌活性的活性剂。将肽以药物组合物形式作为癌症的治疗剂施用至有需要的受试者。肽或肽构建体选自具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ IDNO:356–SEQ ID NO:361的序列的肽中的任一者。
将一种或多种肽连同标准小分子或化学疗法的治疗方案一起施用至受试者，所述小分子或化学疗法诸如是顺铂、甲氨蝶呤、多西他赛和依托泊苷以及其他小分子或化学疗法。受试者是人或动物。以静脉内、皮下、肌内、口服方式施用药物组合物，或直接注射至肿瘤微环境中。所施用肽缀合物与标准小分子疗法一起治疗受试者中的癌症疾患。癌症疾患可为脑癌、乳腺癌、肝癌或结肠癌。
实施例25
用TfR结合肽使脑疾患成像
该实施例说明使用本文公开的TfR结合肽或肽构建体(例如SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者)来将连接于肽的可检测剂分子转运至CNS中所达成的对脑疾患的成像。
如实施例20中所述来使本公开的肽缀合于可检测剂。将肽可检测剂缀合物施用至有需要的受试者。受试者患有疾患，诸如脑癌或阿尔茨海默氏病。受试者是人或动物。以静脉内、皮下、肌内、口服方式施用肽可检测剂缀合物，或直接注射至肿瘤微环境中。
任选地，还使肽连接于亲和部分，例如针对淀粉样蛋白斑块的亲和部分诸如F-18。肽可检测剂通过TfR-肽介导的胞吞转运来穿过BBB。进行非侵袭性成像以显现脑中的可检测剂，从而允许诊断或追踪受试者中的疾患。
实施例26
用TfR结合肽治疗脑癌
该实施例说明使用如本文所述的TfR结合肽或肽构建体(例如SEQ ID NO:1–SEQID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者)来将连接于肽的治疗剂分子转运至CNS中以及肿瘤细胞中所达成的对脑癌的治疗。
如实施例21中所述使本公开的肽连接于活性剂。活性剂是替莫唑胺。受试者是人或动物。以静脉内、皮下、肌内、口服方式施用肽可检测剂缀合物，或直接注射至肿瘤微环境中。将肽活性剂缀合物施用至有需要的受试者。受试者患有脑癌。在施用后，肽活性剂缀合物穿过血脑屏障(BBB)，并且进入癌症定位在其中的脑实质。肽活性剂缀合物改善和/或根除脑癌。
这个数据证明通常被阻止进入脑的活性剂(例如是阻止穿过BBB的内皮细胞的P-糖蛋白转运体的底物的替莫唑胺)可高效地穿过BBB加以转运以预防和/或治疗位于脑中的疾病和疾患(例如癌症)。
实施例27
细胞穿透肽融合物
该实施例描述细胞穿透肽融合物。以与额外细胞穿透肽部分的融合物形式重组表达本公开的TfR结合肽。TfR结合肽或肽构建体选自SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者。细胞穿透肽部分是缀合于、连接于，或融合在本公开的任何TfR结合肽的N端的一个或多个Arg残基，诸如RRRRRRRR(SEQ ID NO:73)序列，或缀合于、连接于或融合于本公开的任何TfR结合肽的N端的具有序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:99)的Tat肽。或者，细胞穿透肽部分选自融合于本公开的任何TfR结合肽的N端的maurocaline、imperatoxin、hadrucalcin、hemicalcin、oplicalin-1、opicalcin-2、中期因子(62-104)、MCoTI-II或氯毒素。或者，细胞穿透肽部分选自融合于本公开的任何TfR结合肽的N端的TAT诸如CysTAT(SEQ ID NO:71)、S19-TAT(SEQ ID NO:72)、R8(SEQ ID NO:73)、pAntp(SEQ ID NO:74)、Pas-TAT(SEQ ID NO:75)、Pas-R8(SEQ ID NO:76)、Pas-FHV(SEQ ID NO:77)、Pas-pAntP(SEQ ID NO:78)、F2R4(SEQ ID NO:79)、B55(SEQ ID NO:80)、天青蛋白(SEQ ID NO:81)、IMT-P8(SEQ ID NO:82)、BR2(SEQ ID NO:83)、OMOTAG1(SEQ ID NO:84)、OMOTAG2(SEQ IDNO:85)、pVEC(SEQ ID NO:86)、SynB3(SEQ ID NO:87)、DPV1047(SEQ ID NO:88)、C105Y(SEQID NO:89)、转运肽(SEQ ID NO:90)、MTS(SEQ ID NO:91)、hLF(SEQ ID NO:92)、PFVYLI(SEQID NO:93)，或yBBR(SEQ ID NO:94)。或者，通过接头来使细胞穿透肽部分融合于本公开的任何TfR结合肽的N端。接头选自GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:113)、KKYKPYVPVTTN(SEQ IDNO:114)(来自DkTx的接头)，或EPKSSDKTHT(SEQ ID NO:115)(来自人IgG3的接头)，或任何其他接头。或者，通过其他手段来接合TfR结合肽、细胞穿透肽部分以及任选的接头。举例来说，其他手段包括但不限于在任何位置处的化学缀合，使细胞穿透肽部分和/或接头融合于TfR结合肽的C端，与脂质体共配制，或其他方法。
将细胞穿透肽融合物或缀合物施用至有需要的受试者。受试者是人或动物，并且患有疾病，诸如脑癌或其他脑疾患。在施用后，TfR结合肽促进穿过BBB的胞吞转运，并且细胞穿透肽促进穿过细胞膜以进入细胞内区室。
实施例28
用以促进核定位的肽融合物
该实施例描述用以促进核定位的肽融合物。重组表达或化学合成本公开的TfR结合肽。肽或肽构建体选自SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任何序列。使TfR结合肽缀合于、连接于或融合于核定位信号，诸如K-K/R-X-K/R(SEQ ID NO:129)的四残基序列，其中X可为任何氨基酸；或其变体(Lange等人,J Biol Chem.2007年2月23日；282(8):5101-5)。将肽融合物施用至有需要的受试者。受试者是人或动物，并且患有疾病，诸如脑癌或其他脑疾患。在施用后，TfR结合肽促进穿过BBB的胞吞转运，并且核定位信号促进向核的迁移。
实施例29
用免疫治疗剂治疗脑癌
该实施例说明使用缀合于、连接于或融合于一种或多种免疫治疗剂的本公开的肽或肽构建体(例如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136-SEQ ID NO:205、SEQ IDNO:225-SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356-SEQ ID NO:361中的任一者)来治疗脑癌(例如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、中线神经胶质瘤、DIPG、髓母细胞瘤、MYC或MYCN扩增的脑肿瘤，或室管膜瘤)，所述免疫治疗剂诸如是CTLA-4、PD-1、PDL-1靶向剂，或IL15，或融合IL15/IL15Ra、IFNγ，或抗CD3融合多肽。在这个实验中，免疫治疗剂是帕博利珠单抗(抗PD-1抗体)。
重组表达或化学合成具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ IDNO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者的序列的TfR结合肽或肽构建体。在使用液相色谱法(例如反相、离子交换，或尺寸排阻色谱)来纯化后，然后根据实施例21中所述的方法来使肽缀合于帕博利珠单抗或其功能性片段(例如可变链片段)(或者，还可使肽连接于或融合(例如重组表达)于帕博利珠单抗(或任何其他免疫治疗剂)或其功能性片段)。纯化和配制缀合物以向受试者(例如小鼠或人)中注射。
在施用至有需要的受试者之后，包含缀合于帕博利珠单抗或其功能性片段的TfR结合肽的肽构建体通过囊泡胞吞转运来穿透BBB，并且在CNS中积累。核成像(例如正电子发射断层摄影术、计算机断层摄影术(PET)或磁共振成像)以及取自罹患脑癌的受试者的组织或活检体显示肽构建体显著降低受试者中的肿瘤负荷。全身成像(例如WBA或PET)显示肽构建体不仅降低了脑中的肿瘤尺寸和疾病部位，而且还在受试者的身体内的其他位点(例如肝、肺和骨)处达成所述作用。
实施例30
使用含有神经降压素的肽构建体治疗神经病变性疼痛
该实施例说明使用如本文所述的融合于神经降压素(NT)，与神经降压素(NT)一起重组表达，与神经降压素(NT)一起化学合成，或以其他方式缀合于神经降压素(NT)的TfR结合肽来将神经降压素转运至CNS中所达成的对神经病变性疼痛的治疗。
重组表达或化学合成具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者的序列的TfR结合肽。任选地使用液相色谱法(例如反相、离子交换，或尺寸排阻色谱)来纯化肽，并且根据实施例21中所述的方法来进一步使其缀合于NT。与TfR结合肽一起重组表达或化学合成具有SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:365–SEQ IDNO:371中的任一者或其功能性片段的序列的NT肽以形成肽-NT构建体。或者，与神经降压素或其功能性片段一起以肽-NT融合物(例如以SEQ ID NO33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205，或SEQ IDNO:359–SEQ ID NO:361显示的肽-NT构建体)形式重组表达或化学合成肽，并且任选地使用液相色谱法(例如反相、离子交换，或尺寸排阻色谱)来纯化。NT的功能性片段可为长度是至少8个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基，或至少13个氨基酸残基的片段。配制纯化NT缀合物或融合肽(“肽构建体”)以向受试者(例如小鼠或人)中注射。
在施用之后，肽构建体穿透BBB，在CNS中积累。由于NT部分有效靶向至NT受体，受试者中的神经病变性疼痛的症状得到显著减轻。
本公开的TfR结合肽在CNS中提供NT受体结合肽的治疗有效浓度以有效治疗神经病变性疼痛。
实施例31
用肽-NT构建体治疗或管理疼痛
该实施例描述一种用于治疗或管理疼痛的方法。这个方法用作针对急性和/或慢性症状的治疗。表达本公开的肽，并且以药物组合物形式作为针对由于损伤或如本文所述的其他疾患的疼痛的治疗剂施用至患者。使本公开的肽融合于神经降压素。重组表达或化学合成肽。
使本文公开的任何肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:137–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)融合于NT以形成肽-NT构建体。与TfR结合肽一起重组表达或化学合成具有SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:371中的任一者或其功能性片段的序列的NT肽以形成肽-NT构建体。
或者，使用本文公开的肽-NT构建体(例如SEQ ID NO 33–SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205，或SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361中的任一者)。任选地使肽突变以维持TfR结合功能，但添加或增加神经降压素与神经降压素受体的相互作用。任选地使用液相色谱法(例如反相、离子交换，或尺寸排阻色谱)来纯化肽-NT构建体。配制肽以进行施用，并且施用至受试者。在施用之后，肽构建体靶向受疼痛影响的区域、组织或系统。肽构建体可调节疼痛。此疼痛调节可通过各种机制来起作用，诸如调节炎症、自身免疫反应、直接或间接作用于疼痛受体、细胞杀灭，或程序化细胞死亡。以皮下、静脉内或口服方式将一种或多种肽施用至人或动物，或加以注射。
实施例32
使用含有神经降压素的肽构建体治疗慢性疼痛
该实施例说明使用如本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ IDNO:205，或SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361的肽-NT融合物)或可融合于NT的肽(例如SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358)来将神经降压素(NT，SEQID NO:350)转运至CNS中所达成的对神经病变性疼痛的治疗。
重组表达或可化学合成具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者的序列的TfR结合肽，或融合于NT的TfR结合肽(例如SEQ IDNO 33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQID NO:203–SEQ ID NO:205，或SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361中的任一者)。在使用液相色谱法(例如反相、离子交换，或尺寸排阻色谱)来纯化后，可任选地根据实施例21中所述的方法来进一步使肽缀合于神经降压素(NT)或其功能性片段。NT的功能性片段可为长度是至少8个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基，或至少13个氨基酸残基的片段。与TfR结合肽一起重组表达或化学合成具有SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:371中的任一者或其功能性片段的序列的NT肽以形成肽-NT构建体。或者，使肽融合于神经降压素或其功能性片段(例如重组表达)，例如用于制备SEQ ID NO 33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205，或SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361的肽-NT融合物，或可用于使NT融合于诸如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358的肽，然后如本文所述或使用其他已知方法来重组表达和纯化。
配制肽-神经降压素融合物或缀合物以向受试者(例如小鼠或人)中注射。在施用缀合物之后，肽构建体穿透BBB，并且在CNS中积累。由于NT部分有效靶向至NT受体，受试者中的慢性疼痛得到显著减轻。
肽自身可调节疼痛，或它可缀合于调节疼痛的剂。此疼痛调节可通过各种机制来起作用，诸如调节炎症、自身免疫反应、直接或间接作用于疼痛受体、细胞杀灭，或程序化细胞死亡。肽-NT融合物可用于治疗慢性疼痛，包括来自慢性损伤、疾病或慢性疾患，包括家族性阵发性疼痛综合征、红斑性肢痛病或发作性极度疼痛病症，的慢性疼痛。
实施例33
使用含有神经降压素的肽构建体治疗急性疼痛
该实施例说明使用如本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ IDNO:205，或SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361的肽-NT融合物)或可融合于NT的肽(例如SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358)来将神经降压素(NT，SEQID NO:350)转运至CNS中所达成的对神经病变性疼痛的治疗。
重组表达或可化学合成任选地融合于NT，具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQID NO:136–SEQ ID NO:205，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者的序列的TfR结合肽。在使用液相色谱法(例如反相、离子交换，或尺寸排阻色谱)来纯化后，可根据实施例21中所述的方法来进一步使肽缀合于神经降压素(NT)或其功能性片段。NT的功能性片段可为长度是至少8个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基，或至少13个氨基酸残基的片段。与TfR结合肽一起重组表达或化学合成具有SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:371中的任一者或其功能性片段的序列的NT肽以形成肽-NT构建体。或者，使肽融合于神经降压素或其功能性片段(例如重组表达)，例如用于制备SEQ ID NO 33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205，或SEQID NO:359–SEQ ID NO:361的肽-NT融合物，或可用于使NT融合于诸如SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358的肽，然后如本文所述或使用其他已知方法来重组表达和纯化。
配制肽-神经降压素融合物或缀合物以向受试者(例如小鼠或人)中注射。在施用缀合物之后，肽构建体穿透BBB，并且在CNS中积累。由于NT部分有效靶向至NT受体，受试者中的急性疼痛得到显著减轻。
肽自身可调节疼痛，或它可缀合于调节疼痛的剂。此疼痛调节可通过各种机制来起作用，诸如调节炎症、自身免疫反应、直接或间接作用于疼痛受体、细胞杀灭，或程序化细胞死亡。肽-NT融合物可用于治疗急性疼痛，包括来自急性损伤、疾病或急性疾患，或来自伤害感受性疼痛、神经病变性疼痛、异常性疼痛、幻觉疼痛、内脏疼痛、爆发性疼痛的急性疼痛。受试者任选地经历在五分钟至一小时内达成的快速疼痛缓解，并且疼痛减轻可持续长达超过3小时。
实施例34
布洛芬肽缀合物
该实施例描述使用PEG接头来使布洛芬缀合于如本文所述的TfR结合肽(例如SEQID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358)。重组表达或可化学合成TfR结合肽。任选地使用液相色谱法(例如反相、离子交换，或尺寸排阻色谱)或其他已知方法来纯化肽。使用布洛芬和PEG接头来产生肽-布洛芬缀合物，所述PEG接头形成可水解的酯键，如“In vitro and in vivo study of poly(ethylene glycol)conjugatedibuprofen to extend the duration of action,”Scientia Pharmaceutica,2011,79:359-373,Nayak和Jain中所述。费舍尔(Fischer)酯化用于使布洛芬与短PEG例如与三乙二醇缀合，以产生布洛芬-酯-PEG-OH。
在制备如上所示的PEG-布洛芬缀合物之后，用碳酸N,N’-二丁二酰亚胺酯(DSC)活化PEG的羟基部分以形成布洛芬-酯-PEG-碳酸丁二酰亚胺酯，然后使其与肽的赖氨酸或N端反应以形成布洛芬-酯-PEG-肽缀合物。配制肽-布洛芬融合物或缀合物以向受试者(例如小鼠或人)中注射。在施用缀合物之后，肽构建体通过囊泡胞吞转运来穿透BBB，并且在CNS中积累。缀合物可显示抗炎活性，或游离布洛芬从缀合物释放以提供抗炎活性。游离布洛芬可由在施用之后发生的水解诸如在酯键处的水解产生。
肽自身可调节疼痛，或它可缀合于调节疼痛的剂(例如布洛芬)。此疼痛调节可通过各种机制来起作用，诸如调节炎症、自身免疫反应、直接或间接作用于疼痛受体、细胞杀灭，或程序化细胞死亡。将布洛芬-肽缀合物施用至有需要的受试者。受试者可为人类或非人类动物。
实施例35
肽达拉他肽(Dalazatide)缀合物
该实施例描述缀合于用于治疗自身免疫性疾病的Kv1.3钾通道抑制剂的如本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)。在这个情况下，Kv1.3抑制剂是达拉他肽。
重组表达或化学合成本公开的肽，然后通过活化的酯(例如NHS酯)在DCC或EDC存在下来使所述肽的N端缀合于、连接于或融合于达拉他肽以产生TfR结合肽-达拉他肽缀合物。
将肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内或口服方式施用肽构建体。受试者可为人类或非人类动物。在施用之后，肽-Kv1.3抑制剂缀合物通过TfR介导的胞吞转运和/或TfR介导的胞吞作用来递送至目标组织或器官。肽-达拉他肽缀合物改善治疗受试者所针对的自身免疫性疾病或疾患，例如由自身反应性T淋巴细胞引起的那些。
这个数据证明本公开的TfR结合肽在CNS中提供Kv1.3抑制剂的治疗有效浓度以治疗自身免疫性病症。相较于用单独Kv1.3抑制剂进行的治疗，治疗活性得到改善。
实施例36
肽4SC-202缀合物
该实施例描述缀合于用于治疗自身免疫性疾病的Kv1.3钾通道抑制剂的如本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)。在这个情况下，Kv1.3抑制剂是4SC-202(甲苯磺酸多马司他)。
重组表达或化学合成本公开的肽，然后通过例如活化的酯(例如NHS酯)在DCC或EDC存在下来使所述肽的N端缀合于、连接于或融合于4SC-202以产生TfR结合肽-4SC-202缀合物。
将肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内或口服方式施用肽构建体。受试者可为人类或非人类动物。在施用之后，肽-Kv1.3抑制剂缀合物通过TfR介导的胞吞转运和/或TfR介导的胞吞作用来递送至目标组织或器官。肽-4SC-202通过囊泡胞吞转运来穿透BBB，并且在CNS中积累。肽-4SC-202缀合物改善治疗受试者所针对的自身免疫性疾病或疾患，例如由自身反应性T淋巴细胞引起的那些。
这个数据证明本公开的TfR结合肽提供Kv1.3抑制剂的治疗有效浓度以治疗自身免疫性病症。相较于用单独Kv1.3抑制剂进行的治疗，治疗活性得到改善。
实施例37
TfR结合肽抗Kv1.3肽缀合物
该实施例描述缀合于、连接于或融合于用于治疗自身免疫性疾病的Kv1.3钾通道抑制剂的如本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)。在这个情况下，Kv1.3抑制剂是肽(例如Vm24(SEQ ID NO:378)、ShK-170、ShK-186(SEQ ID NO:379)，或ShK-192)。
重组表达或化学合成本公开的肽，然后通过例如活化的酯(例如NHS酯)在DCC或EDC存在下来使所述肽的N端缀合于、连接于或融合于抗Kv1.3肽以产生TfR结合肽-抗Kv1.3肽构建体或融合肽(如果重组产生)。抗Kv1.3肽是Vm24(SEQ ID NO:378)、ShK-170、ShK-186(SEQ ID NO:379)、ShK-192，或另一抗Kv1.3肽序列。
将肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内或口服方式施用肽构建体。受试者可为人类或非人类动物。在施用之后，TfR结合肽-抗Kv1.3肽构建体或融合肽通过TfR介导的胞吞转运和/或TfR介导的胞吞作用来递送至目标组织或器官。TfR结合肽-抗Kv1.3肽构建体或肽构建体通过囊泡胞吞转运来穿透BBB，并且在CNS中积累。TfR结合肽-抗Kv1.3肽构建体或肽构建体改善治疗受试者所针对的自身免疫性疾病或疾患。
这证明本公开的TfR结合肽提供Kv1.3抑制剂的治疗有效浓度以治疗自身免疫性病症。相较于用单独Kv1.3抑制剂进行的治疗，治疗活性得到改善。
实施例38
用于治疗神经变性疾病的TfR结合肽Kv1.3抑制剂缀合物
该实施例描述缀合于、连接于或融合于用于治疗神经变性疾病(例如阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、弗里德赖希共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩、运动神经元疾病、莱姆病、共济失调-毛细血管扩张、常染色体显性小脑共济失调、巴登病、皮质基底综合征、克罗伊茨费尔特–雅各布病、X染色体脆折相关震颤/共济失调综合征、库福–拉基布综合征、马查多–约瑟夫病、多发性硬化症、慢性创伤性脑病变，或额颞叶痴呆)离子通道调节剂诸如Kv1.3钾通道抑制剂的如本文所述的TfR结合肽(例如SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)。Kv1.3抑制剂可包括小分子(例如达拉他肽或5-(4-苯氧基丁氧基)补骨脂素)和肽(例如ShK-170、ShK-186或ShK-192)。
重组表达或化学合成本公开的肽，然后通过例如活化的酯(例如NHS酯)在DCC或EDC存在下来使所述肽的N端缀合于、连接于或融合于一种或多种Kv1.3抑制剂(例如达拉他肽、5-(4-苯氧基丁氧基)补骨脂素、ShK-170、ShK-186或ShK-192)以产生TfR结合肽-抗Kv1.3肽缀合物、融合肽或肽构建体(如果适用)。将肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内或口服方式施用肽构建体。受试者可为人类或非人类动物。在施用之后，TfR结合肽-Kv1.3抑制剂缀合物或肽构建体通过TfR介导的胞吞转运和/或TfR介导的胞吞作用来递送至目标组织或器官。TfR结合肽-Kv1.3抑制剂缀合物或肽构建体通过囊泡胞吞转运来穿透BBB，并且在CNS中积累。TfR结合肽-Kv1.3抑制剂缀合物或肽构建体改善治疗受试者所针对的神经变性疾病或疾患。
这证明本公开的TfR结合肽提供Kv1.3抑制剂的治疗有效浓度以治疗神经变性疾病。相较于用单独Kv1.3抑制剂进行的治疗，治疗活性得到改善。
实施例39
TfR结合肽维罗司他缀合物
该实施例描述缀合于用于治疗阿尔茨海默氏病的BACE抑制剂维罗司他的如本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)。
重组表达或化学合成本公开的肽，然后通过例如活化的酯(例如NHS酯)在DCC或EDC存在下来使所述肽的N端缀合于、连接于或融合于维罗司他以产生TfR结合肽-维罗司他缀合物。
将肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内或口服方式施用肽构建体。受试者可为人类或非人类动物。在施用之后，TfR结合肽-维罗司他缀合物通过TfR介导的胞吞转运和/或TfR介导的胞吞作用来递送至目标组织或器官。TfR结合肽-维罗司他缀合物高效地通过TfR介导的囊泡胞吞转运来穿过BBB加以转运，并且在CNS中积累。TfR结合肽-维罗司他缀合物改善受试者中的阿尔茨海默氏病。
这证明本公开的TfR结合肽提供BACE抑制剂的治疗有效浓度以治疗阿尔茨海默氏病。相较于用单独BACE抑制剂进行的治疗，治疗活性得到改善。
实施例40
用包含非BBB穿透活性剂的肽构建体治疗脑癌
该实施例说明使用包含缀合于、连接于或融合于非BBB穿透活性剂(例如多柔比星)的如本文所述的TfR结合肽(例如具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者的序列的肽)的TfR结合肽构建体来将那个剂通过TfR介导的胞吞转运转运至CNS中以治疗脑肿瘤(例如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、中线神经胶质瘤、DIPG、髓母细胞瘤、MYC或MYCN扩增的脑肿瘤，或室管膜瘤)所达成的对脑癌的治疗，所述脑肿瘤否则将不可用单独药物治疗，或仅显示用单独药物达成的极其有限的功效。
重组表达或化学合成本公开的肽。如实施例21中所述使本公开的肽缀合于、连接于或融合于活性剂。以静脉内、皮下、肌内、口服方式施用肽构建体，或直接注射至肿瘤微环境中。将肽构建体施用至有需要的受试者。受试者是人或动物。受试者患有脑癌。在施用后，肽构建体穿过血脑屏障(BBB)，并且进入癌症定位在其中的一个或多个脑区域。包含非BBB穿透剂的肽构建体改善和/或根除脑癌。
这个数据证明本公开的TfR结合肽可用于在否则单独治疗剂可能不可及的细胞、组织或器官中提供治疗剂(例如多柔比星)的治疗有效浓度。
实施例41
使用TfR结合肽来靶向骨髓
该实施例描述使用本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)来靶向骨髓。可使TfR结合肽分别缀合于、连接于或融合于活性剂或可检测剂以治疗或诊断疾病。
根据实施例1和/或实施例2来重组表达或化学合成本公开的TfR结合肽或肽构建体。将TfR结合肽或肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内、口服方式施用TfR结合肽或肽构建体，或直接注射至肿瘤微环境中。受试者是人或动物。在施用之后，TfR结合肽或肽构建体通过TfR介导的胞吞转运和/或TfR介导的胞吞作用来递送至骨髓。
使用组织样品和/或非侵袭性成像确认TfR结合肽或肽构建体在受试者的骨髓中的存在，从而证明本公开的TfR结合肽或肽构建体成功靶向TfR表达性细胞、组织或器官诸如作为治疗干预的重要组织的骨髓。
实施例42
使用TfR结合肽来靶向红系细胞
该实施例描述使用如本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ IDNO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)来靶向红系细胞或红系前体细胞。可使TfR结合肽分别缀合于、连接于或融合于活性剂或可检测剂以治疗或诊断疾病。
根据实施例1和/或实施例2来重组表达或化学合成本公开的TfR结合肽或肽构建体。将肽或肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内或口服方式施用肽或肽构建体。受试者是人或动物。在施用之后，TfR结合肽或肽构建体通过TfR介导的胞吞转运和/或TfR介导的胞吞作用来递送至红系细胞或红系前体细胞。
使用组织(例如骨髓样品)或血液样品或通过非侵袭性成像确认TfR结合肽或肽构建体在受试者的红系细胞或红系前体细胞中的存在，从而证明本公开的TfR结合肽和肽构建体成功靶向TfR表达性细胞、组织或器官诸如红系细胞或红系前体细胞。
实施例43
使用TfR结合肽来靶向肌肉细胞
该实施例描述使用如本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ IDNO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)来靶向肌肉细胞。可使TfR结合肽分别缀合于、连接于或融合于活性剂或可检测剂以治疗或诊断疾病。
根据实施例1和/或实施例2来重组表达或化学合成本公开的TfR结合肽或肽构建体。将TfR结合肽或肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内或口服方式施用TfR结合肽或肽构建体。在施用之后，TfR结合肽或肽构建体通过TfR介导的胞吞转运和/或TfR介导的胞吞作用来递送至肌肉细胞或肌肉组织。
使用组织(例如肌肉或骨骼肌组织样品)或血液样品或通过非侵袭性成像确认TfR结合肽或肽构建体在受试者的肌肉细胞或肌肉组织中的存在(特别是在骨骼肌组织中的摄取和保留)，从而证明本公开的TfR结合肽或肽构建体成功靶向TfR表达性细胞、组织或器官诸如肌肉细胞或肌肉组织。
实施例44
使用TfR结合肽来治疗炎症性肠病
该实施例描述使用如本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ IDNO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)来治疗炎症性肠病。使TfR结合肽缀合于、连接于或融合于活性剂或可检测剂以治疗炎症性肠病。
根据实施例1和/或实施例2来重组表达或化学合成本公开的TfR结合肽构建体。将TfR结合肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内或口服方式施用TfR结合肽构建体。受试者是人或动物。在施用之后，TfR结合肽构建体递送至肠，并且在肠的腺细胞中积累。
包含活性剂的肽构建体改善和/或根除炎症性肠病。这证明本公开的TfR结合肽可用于在肠道内提供治疗有效浓度以治疗各种疾病诸如炎症性肠病。
实施例45
用于pH依赖性内体递送的TfR结合肽
该实施例描述能够例如在内体pH(例如pH 5.4)下以pH依赖性方式从TfR解离的TfR结合肽或肽构建体的开发和体外测试。
将一个或多个额外组氨酸残基引入至TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ IDNO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)或肽构建体(例如SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361中的任一者)的序列中。在比较结合实验中在各种pH水平或范围下评估所得组氨酸富集的TfR结合肽的TfR结合。选择在生理pH下具有高TfR结合亲和力，但在较低pH水平诸如5.4的内体pH下具有显著降低的结合亲和力的肽用于细胞结合、摄取、以及内体内或囊泡内释放实验。
鉴定和表征具有高内体递送能力的TfR结合肽。这些结果证明本公开的TfR结合肽可展现或可被修饰来展现pH依赖性TfR结合动力学，所述pH依赖性TfR结合动力学允许TfR结合肽和包含一种或多种活性剂的TfR结合肽构建体的囊泡内释放以达成内体和/或细胞内递送。
为改善细胞内递送功能，修饰如本文所述的TfR结合肽和TfR结合肽构建体以包含有助于肽或肽构建体的低pH内体逃逸的基序。
细胞摄取和释放实验证明相较于不包含用于低pH内体逃逸的基序的肽，包含用于低pH内体逃逸的所述基序的TfR结合肽和TfR结合肽构建体显示在更高浓度下存在于胞质液中。这个数据证明本公开的TfR结合肽和TfR结合肽构建体可被成功修饰以达成增强的囊泡内和细胞内递送，同时保留它们的TfR结合能力。这些肽可与各种治疗剂和/或化合物组合用于治疗和/或诊断疾病和疾患。
实施例46
用于治疗位于非CNS组织中的疾病的TfR结合肽
该实施例描述使用本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)来治疗位于表达TfR的非CNS组织中的疾病。
根据实施例1和/或实施例2来重组表达或化学合成本公开的TfR结合肽构建体。任选地，可使用于治疗疾病或疾患的活性剂缀合于、连接于或融合于TfR结合肽以形成TfR结合肽构建体。活性剂任选地是融合于TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)的本文公开的任何NT(例如神经降压素(SEQID NO:350)或神经降压素变体(例如SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:371中的任一者))或其功能性片段。肽-NT融合物可为SEQ ID NO 33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205，或SEQ ID NO:359–SEQID NO:361中的任一者。将TfR结合肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内或口服方式施用TfR结合肽构建体。受试者是人或动物。在施用之后，TfR结合肽构建体在表达TfR的非CNS组织中积累。TfR结合肽构建体改善疾病或疾患。
这个数据证明本公开的TfR结合肽有效地在TfR表达性非CNS组织中积累，因此可用于治疗和/或预防位于这些组织中的一者或多者中的疾病或疾患。
实施例47
用于治疗外周癌症的TfR结合肽
该实施例描述使用本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)来治疗表达和/或过度表达TfR的外周(例如非CNS)癌症。外周癌症可为乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、骨髓细胞癌，或皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤、CMYC过度表达性肿瘤。
根据实施例1和/或实施例2来重组表达或化学合成本公开的TfR结合肽构建体。任选地，可使用于治疗外周癌症的活性剂缀合于、连接于或融合于TfR结合肽以形成TfR结合肽构建体。活性剂任选地是融合于TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)的本文公开的任何NT(例如神经降压素(SEQID NO:350)或神经降压素变体(例如SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:371中的任一者))或其功能性片段。肽-NT融合物可为SEQ ID NO 33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205，或SEQ ID NO:359–SEQID NO:361中的任一者。将TfR结合肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内、口服或肿瘤内方式施用TfR结合肽构建体。受试者是人或动物。在施用之后，TfR结合肽构建体在表达和/或过度表达TfR的外周肿瘤组织中积累。TfR结合肽构建体改善外周癌症。
这个数据证明本公开的TfR结合肽有效地在TfR表达性和/或TfR过度表达性外周癌中积累，因此可用于治疗和/或预防位于这些组织中的一者或多者中的癌症。
实施例48
用于治疗脾癌的TfR结合肽
该实施例描述使用本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)来治疗表达和/或过度表达TfR的脾癌。
根据实施例1和/或实施例2来重组表达或化学合成本公开的TfR结合肽构建体。任选地，可使用于治疗脾癌的活性剂缀合于、连接于或融合于TfR结合肽以形成TfR结合肽构建体。将TfR结合肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内、口服或肿瘤内方式施用TfR结合肽构建体。受试者是人或动物。在施用之后，TfR结合肽构建体在脾癌中积累，如通过分子成像(例如CT、MRI)和/或组织样品的分析所证明。TfR结合肽构建体改善脾癌。
这个数据证明本公开的TfR结合肽有效地在TfR表达性和/或TfR过度表达性癌诸如脾癌中积累，因此可用于治疗和/或预防脾癌或其他外周癌症。
实施例49
用于治疗骨髓癌的TfR结合肽
该实施例描述使用本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者)来治疗位于骨髓中，并且表达和/或过度表达TfR的癌症。
根据实施例1和/或实施例2来重组表达或化学合成本公开的TfR结合肽构建体。任选地，可使用于治疗骨髓癌的活性剂缀合于、连接于或融合于TfR结合肽以形成TfR结合肽构建体。将TfR结合肽构建体施用至有需要的受试者。以静脉内、皮下、肌内、口服或肿瘤内方式施用TfR结合肽构建体。受试者是人或动物。在施用之后，TfR结合肽构建体在骨髓癌中积累，如通过分子成像(例如CT、MRI)和/或组织样品的分析所证明。TfR结合肽构建体改善骨髓癌。
这个数据证明本公开的TfR结合肽有效地在TfR表达性和/或TfR过度表达性外周癌诸如骨髓癌或位于骨髓中的癌中积累，因此可用于治疗和/或预防骨髓癌或其他外周癌症。
实施例50
包含神经降压素的肽构建体、向CNS的递送、以及神经元CRE报告体小鼠的活化
该实施例描述使用包含一种或多种如本文所述的TfR结合肽的肽构建体来使神经元CRE转运体小鼠活化。在这个情况下，使用包含TfR结合肽和神经降压素肽的融合肽。使对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32分别是添加了N端GS的SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:67)的肽与神经降压素在每种肽的C端融合以分别产生肽-NT复合物SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35(分别是具有N端GS的SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70)。神经降压素的下游活性涉及细胞内Ca2+调控和cAMP响应元件(CRE)驱动的转录程序(图28A)，并且已探究它的调节以抑制慢性疼痛。产生了啮合神经降压素受体的CDP-NT肽构建体(图27)。如实施例1–实施例4中所述来在293F细胞中重组表达SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35，并且加以纯化。相对于未还原样品，用DTT(还原剂)处理的纯化肽-NT融合物(例如SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35)显示凝胶迁移，从而表明重组NT肽含有胱氨酸(图27)。使用质谱测定法来验证纯化肽的分子量。
用表达NTSR1的HEK-293细胞系证明与神经降压素受体的结合。为证明神经降压素在各种蛋白质上的延伸是功能性的，使用IP-One–Gq试剂盒(CisBio 62IPAPEB，图28B)测量HEK293细胞或用递送人NTSR1的慢病毒载体转导的HEK293细胞(HEK293-NTSR1)中的NTSR活性。使细胞在DMEM+10％胎牛血清中生长，用Accutase从板移除，沉淀，并且在每mL 1.5X106个细胞的密度下悬浮于汉克斯(Hanks)缓冲盐溶液中。根据制造商说明书，在HTFR 96孔低容量板(CisBio#66PL96025)中建立HTFR反应。每25μL反应使用10,000个细胞(7μL)。将板在37℃下孵育60分钟。然后添加3μLIP1-d2工作溶液，随后添加3μL抗IP1穴状化合物工作溶液。在室温下孵育1小时之后，将板在Perkin Elmer 2104EnVision多标记读取器中扫描以获得在665nm和620nm波长下激发之后的荧光发射。将FRET比率计算为10,000x(信号665nm/信号620nm)。在哺乳动物HEK-293细胞中，神经降压素(NT)受体啮合显示IP1积累仅响应于NT或NT肽构建体(SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35，以及mTf-NT和NT，而非SEQ ID NO:1或SEQID NO:32、媒介物或mTf)，对于除媒介物之外的所有条件，N＝3个孔，媒介物具有N＝36(图28B)。水平棒条指示样品平均值。
用在环AMP响应元件(CRE)的控制下表达萤火虫荧光素酶的转基因小鼠证明NT向CNS的递送。在环AMP(cAMP)升高或活化转录因子CRE结合蛋白1(CREB)的其他机制的条件下，这些小鼠中的细胞表达荧光素酶，在用被配制来供动物使用的荧光素静脉内给药之后在全动物发光仪器(IVIS成像仪)中测量所述荧光素酶。神经降压素受体表达限于CNS中细胞的子组，包括额皮质。在活化后，导致CREB磷酸化和CRE介导的转录的信号转导路径被活化。神经降压素受体的内源性配体神经降压素是一种不能独自穿过BBB的神经肽(在图32中得到证明，用300nmol NT或媒介物给药的小鼠显示相同的CRE-Luc驱动发光水平)。因此，单独NT的静脉内给药将不导致在CRE报告体小鼠的脑中产生荧光素酶。然而，包含神经降压素和本公开的TfR结合蛋白的融合肽的静脉内给药显示了BBB穿透，如通过CRE报告体小鼠的脑中CRE驱动的荧光素酶诱导所表明。测试的所有三种肽-NT复合物(SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:35)都展现穿过BBB递送至脑中，如通过免疫组织化学分析以及由NT在NT受体上的功能性啮合所确定。
通过在施用毛喉素和咯利普兰之后四小时用荧光素给药来验证体内CRE驱动的荧光素酶诱导(图31)，所述毛喉素和咯利普兰是分别通过活化腺苷酰基环化酶和抑制cAMP磷酸二酯酶来起作用的强力CRE诱导剂。通过腹膜内(IP)注射(200μL，于17％DMSO溶液中)来向CRE-luc GPCR报告体小鼠施用1.68mg咯利普兰(Sigma Aldrich R6520)和0.84mg毛喉素(Sigma Aldrich 344270)，或通过静脉内尾静脉注射来施用TfR结合肽或其他测试和对照肽；剂量是于PBS中的100nmol具有或不具有NT的TfR结合肽(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:32–SEQ ID NO:35)或12nmol转铁蛋白或转铁蛋白-NT(SEQ ID NO:354或SEQ IDNO:355)。在施用之后4小时，通过腹膜内注射来向小鼠施用100μL 30mg/mL D-荧光素(RediJect D-荧光素Ultra，PerkinElmer 770505)，并且在无限制活动10分钟之后通过异氟烷暴露来麻醉。在Xenogen IVIS仪器上以1分钟暴露来测量麻醉小鼠中的发光。对于用咯利普兰和毛喉素作为阳性对照进行的给药，在经给药小鼠中观察到来自动物的脑的高水平的发光(图31)。对于用于比较的测试肽，使用LivingImage软件(4.0版，PerkinElmer，图30)来绘制和定量涵盖整个脑的相同目标区域。如果小鼠的发光水平与群组中其他小鼠的平均/SD发光相比>4SD，或如果小鼠的荧光素注射未能命中腹膜腔，那么将它们删失。对于前者，将此解释为与药物治疗或NT受体调节无关的偶然生理应答。对于后者，这通过荧光染料(以RediJect D-荧光素Ultra形式预配制，历经5秒在ICG滤光片组上读取)未能均匀地遍及动物的腹部进行分布来验明；这指示不充分灌注以及整个小鼠不完全暴露于荧光素，从而致使动物的脑发光定量可疑。对在这个测定中验证的动物给与1周以恢复至稳态(低)荧光素酶表达，并且然后用神经降压素肽或包含融合于神经降压素的TfR结合肽的融合肽测试。
在使用匹配群组的情况下，在静脉内施用亲本TfR结合肽(SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:354)或CDP-NT肽构建体(SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35)，或鼠转铁蛋白-NT构建体(MRLAVGALLVCAVLGLCLADYKDEHHHHHHGLNDIFEAQKIEWHEGGGSVPDKTVKWCAVSEHENTKCISFRDHMKTVLPPDGPRLACVKKTSYPDCIKAISASEADAMTLDGGWVYDAGLTPNNLKPVAAEFYGSVEHPQTYYYAVAVVKKGTDFQLNQLEGKKSCHTGLGRSAGWVIPIGLLFCKLSEPRSPLEKAVSSFFSGSCVPCADPVAFPKLCQLCPGCGCSSTQPFFGYVGAFKCLKDGGGDVAFVKHTTIFEVLPEKADRDQYELLCLDNTRKPVDQYEDCYLARIPSHAVVARKNNGKEDLIWEILKVAQEHFGKGKSKDFQLFSSPLGKDLLFKDSAFGLLRVPPRMDYRLYLGHNYVTAIRNQQEGVCPEGSIDNSPVKWCALSHLERTKCDEWSIISEGKIECESAETTEDCIEKIVNGEADAMTLDGGHAYIAGQCGLVPVMAEYYESSNCAIPSQQGIFPKGYYAVAVVKASDTSITWNNLKGKKSCHTGVDRTAGWNIPMGMLYNRINHCKFDEFFSQGCAPGYEKNSTLCDLCIGPLKCAPNNKEEYNGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVLDNTEGKNPAEWAKNLKQEDFELLCPDGTRKPVKDFASCHLAQAPNHVVVSRKEKAARVKAVLTSQETLFGGSDCTGNFCLFKSTTKDLLFRDDTKCFVKLPEGTTPEKYLGAEYMQSVGNMRKCSTSRLLEACTFHKHGSSELYENKPRRPYIL，SEQ ID NO:355)之前或之后四小时进行发光(通过腹膜内荧光素给药)成像(图30A)。首先用荧光素对转基因小鼠给药，并且测量发光(“未刺激”)。然后用(i)亲本肽(SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:354)处理相同小鼠，然后用荧光素再次给药，并且测量发光(“亲本”)，或(ii)用CDP-NT肽构建体和鼠转铁蛋白-NT构建体(SEQ IDNO:355、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35)处理，然后用荧光素再次给药，并且测量发光(“NT融合物”)。定量显示于图30A中。水平棒条指示样品平均值。使用T检验(未配对，双尾)确定显著性。(*：P<0.05。**：P<0.01。#：P<0.0001。)SEQ ID NO:32群组的图像以伪彩色发光显示于图30B中。小鼠在脑中具有可测量基础水平的驱动荧光素酶表达的CRE活性(“未刺激”读数)，并且这不由于用亲本肽给药而增加(“亲本”读数)。然而，在被施用包含本公开的TfR结合肽和NT的肽融合物即SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35的CDP-NT肽构建体的小鼠中，CRE活性的水平显著升高(图30)。对于用CDP-NT肽构建体SEQ ID NO 33处理的小鼠以及对于鼠转铁蛋白-NT融合物SEQ ID NO:354，CRE活性的水平也升高，但不是如同在其他CDP-NT肽构建体(SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35)的情况下的统计升高。如所预期，在静脉内施用之后，在300nmol(是肽-NT融合构建体的剂量的三倍)下施用的单独裸露NT肽未能活化脑中的报告体(图32)，因为它不穿过BBB。总之，这不仅证明融合于SEQ ID NO:1变体的分子的CNS积累，而且证明BBB穿透和神经元到达，以及由本公开的肽的NT融合物对神经降压素受体的啮合。
通过免疫组织化学分析(IHC)来确认肽将NT递送至CNS的区域的能力。通过IHC染色，在用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32的神经降压素变体(例如SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35)处理的小鼠中，荧光素酶水平是明显较高的(图29)，特别是SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35，而在用转铁蛋白-NT(SEQ ID NO:355)处理的小鼠中，较低染色是可见的，并且在未接受肽的小鼠(未刺激)的情况下是低得多的。将经福尔马林固定的石蜡包埋脑在Microm HM 355S切片机上在6μm下切片，并且在带正电荷的Superfrost Plus载片(Fisher 12-550-15)上封固。在Ventana Discovery Ultra IHC/ISH自动染色器上进行自动化染色，使用被设计来在这个仪器上使用的试剂盒和试剂：EZ Prep脱石蜡试剂(Ventana950-100)、蛋白酶3抗原修复试剂盒(Ventana 760-2020)、抗兔HQ(Ventana 760-4815)、抗HQ-HRP(Ventana 760-4815)、ChromoMap DAB试剂盒(Ventana 760-159)、苏木精(Ventana760-2021)和蓝色化试剂(Ventana 760-2037)，全都处于制造商的缺省设置下。初级抗荧光素酶抗体来自Abcam(ab21176，浓度1:350)，并且用具有酪蛋白的Ventana抗体稀释剂(Ventana 760-219)稀释。顺序如下。在69℃下将切片脱石蜡，然后在35℃下持续4分钟进行抗原修复。冲洗载片并升温至37℃，随后手动添加一级抗体(1:350)。使载片与一级抗体一起孵育28分钟并冲洗。后续抗体添加物(继之以冲洗)依次是抗兔HQ和抗HQ HRP，各孵育16分钟。然后对载片进行DAB处理，并且用苏木精和蓝色化试剂复染(各8分钟)。图29中的图像是适度对比增强的，其中对集合内的所有图像同等进行所有图像修改，而不考虑处理组。免疫组织化学分析显示在CDP-NT施用之后4小时，在小鼠的皮质、纹状体和丘脑中，荧光素酶表达增强。比例尺(左上图)是100μm(图29)。所有图都显示相同放大倍数。
包含融合于神经降压素的TfR结合肽的本公开的肽构建体SEQ ID NO:33–SEQ IDNO:35在CRE报告体小鼠的脑中诱导CRE驱动的荧光素酶，从而证明本公开的TfR结合肽能够高效地穿过BBB来转运否则不能进入脑的活性剂(例如肽诸如神经降压素)。包含融合于神经降压素的TfR结合肽的本公开的其他肽构建体包括SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:168-SEQ ID NO:170、以及SEQ ID NO:203-SEQ ID NO:205，也可在CRE报告体小鼠的脑中诱导CRE驱动的荧光素酶。
本文公开的任何肽(例如SEQ ID NO 33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ ID NO:205，或SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361的肽-NT融合物，或可融合于NT的肽，诸如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ IDNO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358的肽)可用于融合于神经降压素以在CRE报告体小鼠的脑中诱导CRE驱动的荧光素酶，从而证明本公开的TfR结合肽能够高效地穿过BBB来转运否则不能进入脑的活性剂(例如肽诸如神经降压素)。
这个数据证明本公开的TfR结合肽可在CNS中提供NT受体结合肽的治疗有效浓度以有效治疗伤害感受性或神经病变性疼痛。本文公开的任何肽(例如SEQ ID NO 33–SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQID NO:205，或SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361的肽-NT融合物，或可融合于NT的肽，诸如SEQID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358的肽)可用于将神经降压素(NT)转运至CNS中。可通过重组融合、化学缀合，或通过其他手段来使肽与NT复合以形成CDP-NT肽构建体。
实施例51
胱氨酸密集肽文库的构建
该实施例描述用于筛选实施例4和实施例5中的肽的文库的产生。筛选Uniprot数据库中长度是30-50个氨基酸，以及含有6、8或10个半胱氨酸的蛋白质区段。这个清单因强调经注释打结素和防御素而缩窄，但除此之外着眼于系统发生多样性，由有限数目的来自其他来源的目标CDP加以补充，以获得具有10,000个CDP的最终文库大小。定购(TwistBioscience)文库的含有适用于扩增和克隆的侧接序列的寡核苷酸，扩增(
Figure BDA0003175003630003301
高保真DNA聚合酶，NEB)，并且诱变(GeneMorph II随机诱变试剂盒，Agilent；22个扩增循环)，随后吉布森组装(Gibson Assembly)克隆至经BamHI/NotI消化的SDGF载体(GenBankMF958494)中。将文库转化至Stellar感受态细胞(Clontech)中，大量制备(QIAgen)，并且制备成慢病毒(VSV-G假型，使用包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX，通过标准方法来在293T细胞中产生)。将需要单独克隆的单例CDP候选物从dsDNA(gBlock，Integrated DNATechnologies)克隆至SDGF中，并且在如上所述在1mL FreeStyle培养基中短暂转染(2.5μg质粒与4μg聚乙烯亚胺(Polysciences 23966-1)一起转染)至2x106个293F细胞中，在24孔悬浮板中振荡之后2天测试结合。测试由用TfR和经染料标记链霉亲和素一起或依序(TfR继之以沉淀和再悬浮于链霉亲和素溶液中)在具有1μg mL-1DAPI的流动缓冲液中染色组成，然后在Acea NovoCyte流式细胞仪上分析。
实施例52
用肽-活性剂构建体治疗或管理疼痛
该实施例描述一种用于治疗或管理疼痛的方法。这个方法用作针对急性和/或慢性症状的治疗。表达本公开的肽，并且以药物组合物形式作为针对由于损伤或如本文所述的其他疾患的疼痛的治疗剂施用至患者。本公开的肽抑制离子通道诸如Nav 1.7。重组表达或化学合成肽，其中所述肽选自如本文所述的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ IDNO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358)。使肽突变以维持TfR结合功能，但添加或增加诸如对Nav 1.7的离子通道抑制。或者，并非肽与离子通道诸如Nav 1.7相互作用，在表达或合成之后，使肽缀合于活性剂。在一些方面，活性剂是NSAID疼痛缓解剂。在一些方面，活性剂是利多卡因。在一些方面，活性剂是Nav 1.7离子通道抑制剂。任选地使用液相色谱法(例如反相、离子交换，或尺寸排阻色谱)来纯化肽-活性剂缀合物。配制肽构建体以进行施用，并且施用至受试者。在施用之后，肽活性剂缀合物靶向受疼痛影响的区域、组织或系统。肽自身可缀合于调节疼痛的剂(例如NSAID疼痛缓解剂)。此疼痛调节可通过各种机制来起作用，诸如调节炎症、自身免疫反应、直接或间接作用于疼痛受体、细胞杀灭，或程序化细胞死亡。以皮下、静脉内或口服方式将一种或多种肽施用至人或动物，或加以注射。
实施例53
使用血清白蛋白结合肽构建体来延长肽血浆半衰期
该实施例显示一种使用如本文公开的血清白蛋白结合肽构建体来延长肽的血清或血浆半衰期的方法。修饰具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:361中的任一者的序列的肽或肽构建体以增加它的血浆半衰期。重组融合，以单一融合物形式化学合成，单独重组表达和缀合，或单独化学合成和缀合肽和血清半衰期延长部分。使肽融合于血清白蛋白结合肽会延长肽构建体的血清半衰期。使肽或肽构建体缀合于血清白蛋白结合肽，诸如SA21(SEQ ID NO:376)。任选地，融合于SA21的肽具有SEQ ID NO:373或SEQ ID NO:375中的任一者的序列。任选地，通过具有SEQ ID NO:377的序列的肽接头来使融合于SA21的肽连接于SA21。具有对应于SEQ ID NO:377的序列的接头使两个单独功能性CDP连接以将血清半衰期延长功能并入至肽或肽构建体中。具有对应于SEQ ID NO:377的序列的接头使得SA21能够在无来自肽构建体的任一成员的空间阻碍的情况下环化。或者，肽与白蛋白结合剂诸如Albu标签或脂肪酸诸如C14-C18脂肪酸的缀合用于延长血浆半衰期。血浆半衰期还任选地由于通过使用最小非人蛋白质序列达成的免疫原性降低而延长。
实施例54
TfR结合肽与TfR结合抗体的剂量毒性比较
该实施例描述当施用至鼠受试者时，本公开的TfR结合肽与抗TfR抗体的剂量毒性的比较。将抗TfR抗体在分别对应于约0.84nmol、4.2nmol和8.4nmol/25g小鼠质量的摩尔剂量的5mg/kg、25mg/kg或50mg/kg的剂量下施用至受试者，如Couch等人,2013(Couch等人,Sci Transl Med.2013年5月1日；5(183):183ra57)中所述。将本公开的TfR结合肽在约31mg/kg的剂量下施用至受试者，对应于约100nmol/25g小鼠质量的摩尔浓度。或者，将本公开的TfR结合肽在0.84nmol、4.2nmol和8.4nmol或100nmol的剂量下施用至受试者。接受31mg/kg或约100nmol/25g小鼠质量的TfR结合肽的受试者历经至少24小时的过程显示有效药效动力学和药代动力学性质，而无痛苦或毒性的征象。当进一步融合于活性剂诸如神经降压素(NT)时，TfR结合肽展现有效治疗功效，诸如如在CRE-荧光素酶模型小鼠中评估的对CRE活性的有效药效动力学诱导，未观察到毒性。同时，相较于接受25或50mg/kg，或4.2或0.4nmol/25kg小鼠质量的受试者，接受5mg/kg或约0.84nmol/25g小鼠质量的处于具有BACE抑制性抗体的双特异性形式中的抗TfR抗体的受试者显示降低的治疗功效，诸如降低的药效动力学淀粉样蛋白β抑制。25或50mg/kg，或4.2或0.4nmol/25kg小鼠质量剂量的抗TfR抗体在施用后至少30分钟内诱导嗜睡、痛苦和溶血，或降低的网织红细胞计数或其他毒性。结果证明相比于基于抗体的治疗剂，基于肽的治疗剂的治疗窗(高于其会观察到治疗药效动力学响应，但低于其会观察到毒性的剂量)是更宽的。结果还证明相较于基于TfR结合抗体的治疗剂，基于TfR结合肽的治疗剂显示更少脱靶结合和更低免疫应答，此归因于较小蛋白质长度(约50个氨基酸)提供较少的用于适应性免疫应答的表位和较小的表面积。
实施例55
TfR结合血清白蛋白结合肽融合物的纯化
该实施例描述融合于血清白蛋白结合肽SA21的TfR结合肽的纯化。图34说明SA21融合肽的纯化。以与CDP的融合肽形式重组表达SA21，并且通过HPLC来纯化。在融合于噬铁蛋白(“Scn-CDP”)以及被切割以产生经切割SA21融合肽(“CDP”)和噬铁蛋白(“Scn”)的情况下对肽进行纯化。图34A显示对应于SEQ ID NO:373的融合于血清白蛋白肽(SA21)的肽TfR结合肽的纯化。在DTT还原性(“R”)或非还原性(“NR”)条件下，通过SDS-PAGE(左侧)和RP-HPLC(右侧)来验证纯度。还对未切割(“U”)噬铁蛋白-CDP融合肽运行SDS-PAGE。在SDS-PAGE中，观察到在未切割(“U”)样品中对应于噬铁蛋白-CDP融合物(“Scn-CDP”)的不同条带，以及在还原(“R”)和非还原(“NR”)样品中对应于经切割SA21融合物(“CDP”)、单独噬铁蛋白(“Scn”)和未切割融合物(“Scn-CDP”)的条带。在未还原RP-HPLC迹线中存在单一峰指示纯净未降解样品。图34B显示对应于SEQ ID NO:456的融合于SA21的肽的纯化。在DTT还原性(“R”)或非还原性(“NR”)条件下，通过SDS-PAGE(左侧)和RP-HPLC(右侧)来验证纯度。还对未切割(“U”)噬铁蛋白-CDP融合肽运行SDS-PAGE。在SDS-PAGE中，观察到在未切割(“U”)样品中对应于噬铁蛋白-CDP融合物(“Scn-CDP”)的不同条带，以及在还原(“R”)和非还原(“NR”)样品中对应于经切割SA21融合物(“CDP”)、单独噬铁蛋白(“Scn”)和未切割融合物(“Scn-CDP”)的条带。在未还原RP-HPLC迹线中存在单一峰指示纯净未降解样品。
尽管本文已显示和描述本发明的优选实施方案，但将为本领域技术人员显而易知的是此类实施方案仅通过举例方式来提供。在不脱离本发明的情况下，众多改变、变化和替代现将为本领域技术人员所想到。应了解本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。意图以下权利要求限定本发明的范围，并且在这些权利要求的范围内的方法和结构以及它们的等同物由所述权利要求涵盖。
序列表
<110> 弗雷德哈钦森癌症研究中心(FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER)
<120> 转铁蛋白受体靶向肽
<130> 44189-723.601
<140>
<141>
<150> 62/836,520
<151> 2019-04-19
<150> 62/779,885
<151> 2018-12-14
<160> 457
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Val Ser Gln
50
<210> 2
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 2
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20 25 30
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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50
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 4
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50
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 11
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 17
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50
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 18
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 19
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 20
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Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 21
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 22
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 23
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 24
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 27
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 33
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 34
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 35
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50 55 60
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 36
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Lys Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys
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Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val Ser
35 40 45
Gln
<210> 37
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 37
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 38
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 38
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Val Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 39
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 39
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 40
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 40
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Val Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 41
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 41
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 42
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 42
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 43
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 43
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys Val Ser
35 40 45
Gln
<210> 44
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 44
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Val Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 45
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 45
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Val Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Val Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 46
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 46
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Val Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 47
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 47
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Val Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 48
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 48
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Val Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys Val Ser
35 40 45
Gln
<210> 49
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 49
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys
20 25 30
Val Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 50
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 50
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 51
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 51
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 52
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 52
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys Val Ser
35 40 45
Gln
<210> 53
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 53
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 54
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 54
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Val Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 55
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 55
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Val Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys Val Ser
35 40 45
Gln
<210> 56
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 56
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 57
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 57
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys Val Ser
35 40 45
Gln
<210> 58
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 58
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val Ser
35 40 45
Gln
<210> 59
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 59
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 60
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 60
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 61
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 61
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 62
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 62
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 63
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 63
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 64
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 64
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 65
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 65
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 66
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 66
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 67
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 67
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 68
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 68
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys
20 25 30
Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val Ser
35 40 45
Gln Gly Ser Ser Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Arg Arg Pro Tyr Ile
50 55 60
Leu
65
<210> 69
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 69
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln Gly Ser Ser Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Arg Arg Pro Tyr Ile
50 55 60
Leu
65
<210> 70
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 70
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln Gly Ser Ser Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Arg Arg Pro Tyr Ile
50 55 60
Leu
65
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 71
Cys Tyr Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 72
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 72
Pro Phe Val Ile Gly Ala Gly Val Leu Gly Ala Leu Gly Thr Gly Ile
1 5 10 15
Gly Gly Ile Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
20 25
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 73
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 74
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 74
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 75
Phe Phe Leu Ile Pro Lys Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg
1 5 10 15
Arg
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 76
Phe Phe Leu Ile Pro Lys Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
<210> 77
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 77
Phe Phe Leu Ile Pro Lys Gly Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg
1 5 10 15
Asn Arg Arg Arg Val Arg
20
<210> 78
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 78
Phe Phe Leu Ile Pro Lys Gly Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn
1 5 10 15
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
20
<210> 79
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 79
Phe Phe Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 80
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 80
Lys Ala Val Leu Gly Ala Thr Lys Ile Asp Leu Pro Val Asp Ile Asn
1 5 10 15
Asp Pro Tyr Asp Leu Gly Leu Leu Leu Arg His Leu Arg His His Ser
20 25 30
Asn Leu Leu Ala Asn Ile Gly Asp Pro Ala Val Arg Glu Gln Val Leu
35 40 45
Ser Ala Met Gln Glu Glu Glu
50 55
<210> 81
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 81
Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala
1 5 10 15
Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp
20 25
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 82
Arg Arg Trp Arg Arg Trp Asn Arg Phe Asn Arg Arg Arg Cys Arg
1 5 10 15
<210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 83
Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu
1 5 10 15
Arg
<210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 84
Lys Arg Ala His His Asn Ala Leu Glu Arg Lys Arg Arg
1 5 10
<210> 85
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 85
Arg Arg Met Lys Ala Asn Ala Arg Glu Arg Asn Arg Met
1 5 10
<210> 86
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 86
Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 87
Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe
1 5 10
<210> 88
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 88
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 89
Cys Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Tyr Leu
1 5 10 15
Ile
<210> 90
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 90
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
20 25
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 91
Lys Gly Glu Gly Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10 15
Gly
<210> 92
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 92
Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro
1 5 10 15
Val Ser Cys Ile Lys Arg
20
<210> 93
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 93
Pro Phe Val Tyr Leu Ile
1 5
<210> 94
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 94
Val Leu Asp Ser Leu Glu Phe Ile Ala Ser Lys Leu
1 5 10
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 未知的描述：DRI-TAT31序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(11)
<223> D-氨基酸
<400> 95
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Tyr
1 5 10
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> l-2-萘基丙氨酸
<400> 96
Phe Ala Arg Arg Arg Arg Gln
1 5
<210> 97
<400> 97
000
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 这个序列可包括2-10个残基
<400> 98
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 99
<211> 11
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 99
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 100
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 101
<211> 12
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 101
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln
1 5 10
<210> 102
<400> 102
000
<210> 103
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 103
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 104
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 这个区域可包括1-10个残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(20)
<223> 这个区域可包括1-10个残基
<220>
<223> 参见如所提交的说明书中对取代和优选实施方案的详细描述
<400> 104
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser
1 5 10 15
Ser Ser Ser Ser
20
<210> 105
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(20)
<223> 这个序列可包括1-10个“Gly Ser”重复单元
<220>
<223> 参见如所提交的说明书中对取代和优选实施方案的详细描述
<400> 105
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser
20
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 106
Gly Gly Ser Ser Gly
1 5
<210> 107
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 107
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 108
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 109
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 109
Gly Ser Gly Gly
1
<210> 110
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 110
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 111
<400> 111
000
<210> 112
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 112
Gly Gly Ser
1
<210> 113
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 113
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 114
<211> 12
<212> PRT
<213> 单柄蛛属种(Haplopelma sp.)
<400> 114
Lys Lys Tyr Lys Pro Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn
1 5 10
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 115
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
1 5 10
<210> 116
<211> 33
<212> PRT
<213> 阔爪暗蝎(Maurus palmatus)
<400> 116
Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys
1 5 10 15
Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys
20 25 30
Arg
<210> 117
<211> 33
<212> PRT
<213> 帝王蝎(Pandinus imperator)
<400> 117
Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Arg Cys Lys Ala Asp Asn Asp Cys
1 5 10 15
Cys Gly Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ala Glu Lys Arg Cys
20 25 30
Arg
<210> 118
<211> 35
<212> PRT
<213> 吉氏巨毛蝎(Hadrurus gertschi)
<400> 118
Ser Glu Lys Asp Cys Ile Lys His Leu Gln Arg Cys Arg Glu Asn Lys
1 5 10 15
Asp Cys Cys Ser Lys Lys Cys Ser Arg Arg Gly Thr Asn Pro Glu Lys
20 25 30
Arg Cys Arg
35
<210> 119
<211> 33
<212> PRT
<213> 纤尾半蝎(Hemiscorpius lepturus)
<400> 119
Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Ala Asp Lys Asp Cys
1 5 10 15
Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Pro Glu Lys Arg Cys
20 25 30
Arg
<210> 120
<211> 33
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 未知的描述：opicalcin-1序列
<400> 120
Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Arg Cys Lys Glu Asn Asn Asp Cys
1 5 10 15
Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Pro Glu Lys Arg Cys
20 25 30
Arg
<210> 121
<211> 33
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 未知的描述：opicalcin-2序列
<400> 121
Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Arg Cys Lys Glu Asn Asn Asp Cys
1 5 10 15
Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Ala Asn Pro Glu Lys Arg Cys
20 25 30
Arg
<210> 122
<211> 43
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 未知的描述：中期因子序列
<400> 122
Cys Lys Tyr Lys Phe Glu Asn Trp Gly Ala Cys Asp Gly Gly Thr Gly
1 5 10 15
Thr Lys Val Arg Gln Gly Thr Leu Lys Lys Ala Arg Tyr Asn Ala Gln
20 25 30
Cys Gln Glu Thr Ile Arg Val Thr Lys Pro Cys
35 40
<210> 123
<211> 34
<212> PRT
<213> 木鳖子(Momordica cochinchinensis)
<400> 123
Ser Gly Ser Asp Gly Gly Val Cys Pro Lys Ile Leu Lys Lys Cys Arg
1 5 10 15
Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Ala Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr
20 25 30
Cys Gly
<210> 124
<211> 36
<212> PRT
<213> 以色列金蝎(Leiurus quinquestriatus)
<400> 124
Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys
1 5 10 15
Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln
20 25 30
Cys Leu Cys Arg
35
<210> 125
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 126
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 126
Met Leu Ile Cys Leu Phe
1 5
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 127
tgtacttcca gggaggatcc 20
<210> 128
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 128
aatggtgatg agcggcc 17
<210> 129
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> K或R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> K或R
<400> 129
Lys Xaa Xaa Xaa
1
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 130
Pro Lys Lys Lys Arg Arg Val
1 5
<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 131
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 132
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 这个区域可包括0-10个残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(20)
<223> 这个区域可包括0-10个残基
<400> 132
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg
20
<210> 133
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 133
Lys Lys Arg Arg
1
<210> 134
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 134
Lys Lys Lys Arg Arg
1 5
<210> 135
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 135
Lys Lys Lys Lys
1
<210> 136
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 136
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys
35 40 45
Val Ser Gln
50
<210> 137
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 137
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 138
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 138
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Val Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 139
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 139
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Thr Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 140
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 140
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Val Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 141
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 141
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 142
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 142
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 143
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 143
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
Val Ser Gln
50
<210> 144
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 144
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Val Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Thr Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 145
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 145
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Val Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Val Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 146
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 146
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Val Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 147
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 147
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Val Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 148
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 148
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Val Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
Val Ser Gln
50
<210> 149
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 149
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Thr Cys Val Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 150
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 150
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Thr Cys Glu Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 151
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 151
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Thr Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 152
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 152
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Thr Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
Val Ser Gln
50
<210> 153
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 153
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 154
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 154
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Val Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 155
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 155
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Val Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
Val Ser Gln
50
<210> 156
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 156
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 157
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 157
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
Val Ser Gln
50
<210> 158
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 158
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys
35 40 45
Val Ser Gln
50
<210> 159
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 159
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
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<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 160
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1 5 10 15
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20 25 30
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His Ser Gln
50
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<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 161
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20 25 30
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50
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<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 162
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1 5 10 15
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50
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<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 163
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg Tyr Asn Asp Glu
1 5 10 15
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20 25 30
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50
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<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 164
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1 5 10 15
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<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 165
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<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 166
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<211> 51
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 167
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 168
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
1 5 10 15
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65
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<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 169
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
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50 55 60
Tyr Ile Leu
65
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<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 170
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg Tyr Asn Asp Glu
1 5 10 15
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50 55 60
Tyr Ile Leu
65
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<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 171
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
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Gln
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<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 172
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
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35 40 45
Gln
<210> 173
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 173
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1 5 10 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 174
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Gln
<210> 175
<211> 49
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 175
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Gln
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<211> 49
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 176
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Gln
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<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 177
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Gln
<210> 178
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 178
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 179
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 181
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Gln
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 182
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 183
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 185
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Gln
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 186
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 187
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 188
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 189
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<220>
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<400> 190
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 191
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 192
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<210> 193
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 193
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 194
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
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<210> 195
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 195
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 196
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 197
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Gln
<210> 198
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 198
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1 5 10 15
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20 25 30
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Gln
<210> 199
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 199
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35 40 45
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 200
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20 25 30
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35 40 45
Gln
<210> 201
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 201
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Gln
<210> 202
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 202
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<210> 203
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 203
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1 5 10 15
Arg Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys
20 25 30
Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val Ser
35 40 45
Gln Gly Ser Ser Glu Leu Tyr Glu Asn Arg Pro Arg Arg Pro Tyr Ile
50 55 60
Leu
65
<210> 204
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 204
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu Leu Glu
1 5 10 15
Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser
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Gln Gly Ser Ser Glu Leu Tyr Glu Asn Arg Pro Arg Arg Pro Tyr Ile
50 55 60
Leu
65
<210> 205
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 205
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
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20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
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50 55 60
Leu
65
<210> 206
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
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<400> 206
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Xaa Arg Cys Xaa Lys Tyr Xaa Asp Glu
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Xaa Xaa Xaa
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<210> 207
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
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<400> 207
Gly Ser Arg Glu Xaa Cys Xaa Xaa Arg Cys Xaa Lys Tyr Xaa Asp Glu
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Xaa Xaa Lys Cys Xaa Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
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Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys
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His Ser Gln
50
<210> 208
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<400> 208
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu
1 5 10 15
Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Xaa Glu Asp Xaa Xaa Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Cys
35 40 45
Xaa Xaa Xaa
50
<210> 209
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
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<222> (7)..(7)
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<223> 任何氨基酸
<400> 209
Gly Ser Arg Glu Xaa Cys Xaa Xaa Arg Cys Xaa Lys Tyr Xaa Asp Glu
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20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Xaa Glu Asp Xaa Xaa Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Cys
35 40 45
Xaa Xaa Xaa
50
<210> 210
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
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Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ala Ser Xaa Xaa Met Xaa Xaa Asn Xaa Xaa
1 5 10 15
Leu Glu Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa
50
<210> 211
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
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<222> (37)..(37)
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<223> 任何氨基酸
<400> 211
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu Leu Xaa Xaa Leu Asp His Xaa
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 212
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<222> (13)..(13)
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<222> (15)..(15)
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<222> (16)..(16)
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<220>
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<220>
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<223> 任何氨基酸
<400> 212
Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ala Ser Xaa Xaa Met Xaa Xaa Asn Xaa Xaa
1 5 10 15
Leu Glu Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu Leu Xaa Xaa Leu Asp His Xaa
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 213
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
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<223> 任何氨基酸
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<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (41)..(41)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> 任何氨基酸
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<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
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<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<400> 213
Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa
1 5 10 15
Leu Glu Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu Asp His Xaa
35 40 45
Xaa Ser Gln
50
<210> 214
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
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<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 任何氨基酸
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<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
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<223> 任何氨基酸
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<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> 任何氨基酸
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<223> 任何氨基酸
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<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (46)..(46)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
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<221> MOD_RES
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<220>
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (51)..(51)
<223> 任何氨基酸
<400> 214
Xaa Xaa Arg Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Asp Glu
1 5 10 15
Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Ser Xaa Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Xaa Glu Gln Glu Xaa Glu Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa
50
<210> 215
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
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<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
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<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
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<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<400> 215
Gly Ser Xaa Xaa Gly Cys Ala Ser Xaa Cys Met Xaa Tyr Asn Xaa Xaa
1 5 10 15
Leu Glu Xaa Cys Glu Ala Xaa Met Met Xaa Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 216
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
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<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
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<220>
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<222> (24)..(24)
<223> 任何氨基酸
<220>
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<222> (25)..(25)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (41)..(41)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (42)..(42)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (46)..(46)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (47)..(47)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (48)..(48)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (50)..(50)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (51)..(51)
<223> 任何氨基酸
<400> 216
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
His Xaa Xaa
50
<210> 217
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<400> 217
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Xaa Glu
1 5 10 15
Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Xaa Gln Glu Leu Xaa Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
Xaa Ser Gln
50
<210> 218
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<400> 218
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Xaa Glu
1 5 10 15
Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Xaa Gln Glu Leu Xaa Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
Xaa Ser Gln
50
<210> 219
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (41)..(41)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (50)..(50)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (51)..(51)
<223> 任何氨基酸
<400> 219
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Met Xaa Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa
50
<210> 220
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<400> 220
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Xaa Lys Tyr Asn Asp Glu
1 5 10 15
Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Xaa Ser Xaa Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 221
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<400> 221
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Xaa Lys Tyr Asn Asp Glu
1 5 10 15
Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Xaa Ser Xaa Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 222
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (41)..(41)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (42)..(42)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (46)..(46)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (47)..(47)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (48)..(48)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (50)..(50)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (51)..(51)
<223> 任何氨基酸
<400> 222
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa
50
<210> 223
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> A、M、I、L或V
<400> 223
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu
1 5 10 15
Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Xaa Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 224
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> K或R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> K或R
<400> 224
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Xaa Tyr Asn Asp Glu
1 5 10 15
Leu Glu Xaa Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys
35 40 45
His Ser Gln
50
<210> 225
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 225
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala
20 25 30
Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr
35 40 45
Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser
130 135 140
Gly His His His His His His Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln
145 150 155 160
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val
165 170 175
Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser
195 200 205
Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala
260 265 270
Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg
275 280 285
Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe
290 295 300
Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val Ser Gln
305 310 315
<210> 226
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 226
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala
20 25 30
Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr
35 40 45
Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser
130 135 140
Gly His His His His His His Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln
145 150 155 160
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val
165 170 175
Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser
195 200 205
Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala
260 265 270
Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg
275 280 285
Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu
290 295 300
Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
305 310 315
<210> 227
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 227
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1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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<210> 228
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 228
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
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<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 229
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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<210> 230
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 230
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 231
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<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 232
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
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305 310 315
<210> 233
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 233
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Arg Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala
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Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
305 310 315
<210> 234
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 234
Asp Ile Arg Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Met Ser Cys Arg Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
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<210> 235
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 235
Asp Ile Arg Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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<210> 236
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 236
Asp Ile Arg Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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<210> 237
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 237
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
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290
<210> 238
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 238
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
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245 250 255
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His Ser Gln
290
<210> 239
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 239
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Val Lys Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
Ile Asn Lys Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys
85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu
245 250 255
Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
260 265 270
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys
275 280 285
His Ser Gln
290
<210> 240
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 240
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys
35 40 45
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu
210 215 220
Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys
225 230 235 240
Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys Val Gln
245 250 255
Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val Ser Gln
260 265 270
<210> 241
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 241
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys
35 40 45
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu
210 215 220
Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys
225 230 235 240
Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln
245 250 255
Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
260 265 270
<210> 242
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 242
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys
35 40 45
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu
210 215 220
Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys
225 230 235 240
Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln
245 250 255
Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
260 265 270
<210> 243
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 243
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Val Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
Ser Gly Phe Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
Ile Asn Arg Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg
85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Arg Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
245 250 255
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
260 265 270
Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys
275 280 285
Val Ser Gln
290
<210> 244
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 244
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Val Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
Ser Gly Phe Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
Ile Asn Arg Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg
85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Arg Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
245 250 255
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
260 265 270
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
275 280 285
His Ser Gln
290
<210> 245
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 245
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Val Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
Ser Gly Phe Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
Ile Asn Arg Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg
85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Arg Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg Tyr Asn Asp Glu
245 250 255
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
260 265 270
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys
275 280 285
His Ser Gln
290
<210> 246
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 246
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Arg
35 40 45
Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Arg Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu
210 215 220
Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Arg Cys
225 230 235 240
Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys Val Gln
245 250 255
Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val Ser Gln
260 265 270
<210> 247
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 247
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Arg
35 40 45
Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Arg Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu
210 215 220
Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Arg Cys
225 230 235 240
Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln
245 250 255
Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
260 265 270
<210> 248
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 248
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Arg
35 40 45
Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Arg Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu
210 215 220
Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Arg Cys
225 230 235 240
Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln
245 250 255
Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
260 265 270
<210> 249
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 249
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe
35 40 45
Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu Glu Lys Ser Leu Phe Leu Asp Ile
50 55 60
Trp Arg Asn Trp Gln Lys Asp Gly Asp Met Lys Ile Leu Gln Ser Gln
65 70 75 80
Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu Lys Asp Asn Gln
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100 105 110
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115 120 125
Lys Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu
130 135 140
Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Lys
145 150 155 160
Arg Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser
165 170 175
Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu
180 185 190
Glu Lys Ser Leu Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Lys Asp Gly
195 200 205
Asp Met Lys Ile Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu
210 215 220
Phe Glu Val Leu Lys Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val
225 230 235 240
Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Lys Ala Lys
245 250 255
Lys Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala Lys Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln
260 265 270
Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu
275 280 285
Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu
305 310 315 320
Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr
325 330 335
Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val
340 345 350
Ser Gln
<210> 250
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 250
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe
35 40 45
Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu Glu Lys Ser Leu Phe Leu Asp Ile
50 55 60
Trp Arg Asn Trp Gln Lys Asp Gly Asp Met Lys Ile Leu Gln Ser Gln
65 70 75 80
Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu Lys Asp Asn Gln
85 90 95
Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr
100 105 110
Phe Phe Ser Asn Ser Lys Ala Lys Lys Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala
115 120 125
Lys Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu
130 135 140
Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Lys
145 150 155 160
Arg Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser
165 170 175
Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu
180 185 190
Glu Lys Ser Leu Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Lys Asp Gly
195 200 205
Asp Met Lys Ile Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu
210 215 220
Phe Glu Val Leu Lys Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val
225 230 235 240
Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Lys Ala Lys
245 250 255
Lys Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala Lys Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln
260 265 270
Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu
275 280 285
Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu
305 310 315 320
Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp
325 330 335
Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His
340 345 350
Ser Gln
<210> 251
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 251
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe
35 40 45
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50 55 60
Trp Arg Asn Trp Gln Lys Asp Gly Asp Met Lys Ile Leu Gln Ser Gln
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Phe Phe Ser Asn Ser Lys Ala Lys Lys Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala
115 120 125
Lys Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu
130 135 140
Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Lys
145 150 155 160
Arg Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser
165 170 175
Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu
180 185 190
Glu Lys Ser Leu Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Lys Asp Gly
195 200 205
Asp Met Lys Ile Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu
210 215 220
Phe Glu Val Leu Lys Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val
225 230 235 240
Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Lys Ala Lys
245 250 255
Lys Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala Lys Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln
260 265 270
Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu
275 280 285
Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu
305 310 315 320
Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp
325 330 335
Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His
340 345 350
Ser Gln
<210> 252
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 252
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser His Gly Thr
1 5 10 15
Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly
20 25 30
Ile Asp Val Glu Glu Lys Ser Leu Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp
35 40 45
Gln Lys Asp Gly Asp Met Lys Ile Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe
50 55 60
Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu Lys Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn
65 70 75 80
Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn
85 90 95
Ser Lys Ala Lys Lys Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala Lys Phe Glu Val
100 105 110
Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val
115 120 125
Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser
130 135 140
Arg Gly Gly Gly Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu
145 150 155 160
Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu Glu Lys Ser Leu
165 170 175
Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Lys Asp Gly Asp Met Lys Ile
180 185 190
Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu
195 200 205
Lys Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His
210 215 220
Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Lys Ala Lys Lys Asp Ala Phe
225 230 235 240
Met Ser Ile Ala Lys Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln
245 250 255
Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser
260 265 270
Ser Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly
275 280 285
Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys Glu
290 295 300
Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys Val Gln Glu
305 310 315 320
Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val Ser Gln
325 330
<210> 253
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 253
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser His Gly Thr
1 5 10 15
Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly
20 25 30
Ile Asp Val Glu Glu Lys Ser Leu Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp
35 40 45
Gln Lys Asp Gly Asp Met Lys Ile Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe
50 55 60
Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu Lys Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn
65 70 75 80
Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn
85 90 95
Ser Lys Ala Lys Lys Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala Lys Phe Glu Val
100 105 110
Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val
115 120 125
Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser
130 135 140
Arg Gly Gly Gly Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu
145 150 155 160
Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu Glu Lys Ser Leu
165 170 175
Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Lys Asp Gly Asp Met Lys Ile
180 185 190
Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu
195 200 205
Lys Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His
210 215 220
Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Lys Ala Lys Lys Asp Ala Phe
225 230 235 240
Met Ser Ile Ala Lys Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln
245 250 255
Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser
260 265 270
Ser Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly
275 280 285
Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys Glu
290 295 300
Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu
305 310 315 320
Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
325 330
<210> 254
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 254
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser His Gly Thr
1 5 10 15
Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly
20 25 30
Ile Asp Val Glu Glu Lys Ser Leu Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp
35 40 45
Gln Lys Asp Gly Asp Met Lys Ile Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe
50 55 60
Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu Lys Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn
65 70 75 80
Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn
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100 105 110
Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val
115 120 125
Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser
130 135 140
Arg Gly Gly Gly Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu
145 150 155 160
Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu Glu Lys Ser Leu
165 170 175
Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Lys Asp Gly Asp Met Lys Ile
180 185 190
Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu
195 200 205
Lys Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His
210 215 220
Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Lys Ala Lys Lys Asp Ala Phe
225 230 235 240
Met Ser Ile Ala Lys Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln
245 250 255
Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser
260 265 270
Ser Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly
275 280 285
Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys Glu
290 295 300
Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu
305 310 315 320
Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
325 330
<210> 255
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 255
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe
35 40 45
Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu Glu Arg Ser Leu Phe Leu Asp Ile
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu Arg Asp Asn Gln
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100 105 110
Phe Phe Ser Asn Ser Arg Ala Arg Arg Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala
115 120 125
Arg Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu
130 135 140
Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Arg
145 150 155 160
Arg Arg Arg Ser Arg Gly Gly Gly Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser
165 170 175
Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu
180 185 190
Glu Arg Ser Leu Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Arg Asp Gly
195 200 205
Asp Met Arg Ile Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu
210 215 220
Phe Glu Val Leu Arg Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val
225 230 235 240
Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Arg Ala Arg
245 250 255
Arg Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala Arg Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln
260 265 270
Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu
275 280 285
Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Arg Arg Arg Arg Ser Arg Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu Leu
305 310 315 320
Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr
325 330 335
Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val
340 345 350
Ser Gln
<210> 256
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 256
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe
35 40 45
Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu Glu Arg Ser Leu Phe Leu Asp Ile
50 55 60
Trp Arg Asn Trp Gln Arg Asp Gly Asp Met Arg Ile Leu Gln Ser Gln
65 70 75 80
Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu Arg Asp Asn Gln
85 90 95
Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr
100 105 110
Phe Phe Ser Asn Ser Arg Ala Arg Arg Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala
115 120 125
Arg Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu
130 135 140
Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Arg
145 150 155 160
Arg Arg Arg Ser Arg Gly Gly Gly Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser
165 170 175
Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu
180 185 190
Glu Arg Ser Leu Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Arg Asp Gly
195 200 205
Asp Met Arg Ile Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu
210 215 220
Phe Glu Val Leu Arg Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val
225 230 235 240
Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Arg Ala Arg
245 250 255
Arg Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala Arg Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln
260 265 270
Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu
275 280 285
Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Arg Arg Arg Arg Ser Arg Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu Leu
305 310 315 320
Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp
325 330 335
Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His
340 345 350
Ser Gln
<210> 257
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 257
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe
35 40 45
Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu Glu Arg Ser Leu Phe Leu Asp Ile
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu Arg Asp Asn Gln
85 90 95
Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr
100 105 110
Phe Phe Ser Asn Ser Arg Ala Arg Arg Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala
115 120 125
Arg Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu
130 135 140
Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Arg
145 150 155 160
Arg Arg Arg Ser Arg Gly Gly Gly Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser
165 170 175
Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu
180 185 190
Glu Arg Ser Leu Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Arg Asp Gly
195 200 205
Asp Met Arg Ile Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu
210 215 220
Phe Glu Val Leu Arg Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val
225 230 235 240
Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Arg Ala Arg
245 250 255
Arg Asp Ala Phe Met Ser Ile Ala Arg Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln
260 265 270
Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu
275 280 285
Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Arg Arg Arg Arg Ser Arg Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg Tyr Asn Asp Glu Leu
305 310 315 320
Glu Arg Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp
325 330 335
Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His
340 345 350
Ser Gln
<210> 258
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 258
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser His Gly Thr
1 5 10 15
Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly
20 25 30
Ile Asp Val Glu Glu Arg Ser Leu Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp
35 40 45
Gln Arg Asp Gly Asp Met Arg Ile Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn
85 90 95
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Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val
115 120 125
Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Arg Arg Arg Arg Ser
130 135 140
Arg Gly Gly Gly Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu
145 150 155 160
Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu Glu Arg Ser Leu
165 170 175
Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Arg Asp Gly Asp Met Arg Ile
180 185 190
Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu
195 200 205
Arg Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His
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Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Arg Ala Arg Arg Asp Ala Phe
225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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305 310 315 320
Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val Ser Gln
325 330
<210> 259
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 259
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser His Gly Thr
1 5 10 15
Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly
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Ile Asp Val Glu Glu Arg Ser Leu Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp
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Gln Arg Asp Gly Asp Met Arg Ile Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe
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165 170 175
Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Arg Asp Gly Asp Met Arg Ile
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Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu
195 200 205
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Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Arg Ala Arg Arg Asp Ala Phe
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Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
325 330
<210> 260
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 260
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser His Gly Thr
1 5 10 15
Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly
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Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
325 330
<210> 261
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 261
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu
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225 230 235 240
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245 250 255
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Val Asp His Cys Val Ser Gln
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<210> 262
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 262
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
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Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
Ile Asn Lys Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys
85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys
245 250 255
Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser
260 265 270
Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys
275 280 285
Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295
<210> 263
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 263
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Val Lys Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
Ile Asn Lys Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys
85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys
245 250 255
Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser
260 265 270
Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys
275 280 285
Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295
<210> 264
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 264
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys
35 40 45
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu
225 230 235 240
Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
245 250 255
Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys
260 265 270
Val Ser Gln
275
<210> 265
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 265
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys
35 40 45
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu
225 230 235 240
Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
245 250 255
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
260 265 270
His Ser Gln
275
<210> 266
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 266
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys
35 40 45
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu
225 230 235 240
Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
245 250 255
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys
260 265 270
His Ser Gln
275
<210> 267
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 267
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Val Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
Ser Gly Phe Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
Ile Asn Arg Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg
85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
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180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Arg Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg
245 250 255
Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser
260 265 270
Asn Thr Glu Glu Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys
275 280 285
Val Asp His Cys Val Ser Gln
290 295
<210> 268
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 268
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Val Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
Ser Gly Phe Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
Ile Asn Arg Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg
85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Arg Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg
245 250 255
Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser
260 265 270
Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys
275 280 285
Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295
<210> 269
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 269
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Val Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
Ser Gly Phe Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
Ile Asn Arg Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg
85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Arg Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg
245 250 255
Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser
260 265 270
Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys
275 280 285
Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295
<210> 270
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 270
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Arg
35 40 45
Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Arg Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
225 230 235 240
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
245 250 255
Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys
260 265 270
Val Ser Gln
275
<210> 271
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 271
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Arg
35 40 45
Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Arg Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu
225 230 235 240
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
245 250 255
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys
260 265 270
His Ser Gln
275
<210> 272
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 272
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Arg
35 40 45
Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Arg Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg Tyr Asn Asp Glu
225 230 235 240
Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
245 250 255
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys
260 265 270
His Ser Gln
275
<210> 273
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 273
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Val Lys Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
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85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser
245 250 255
Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val
260 265 270
Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp
275 280 285
Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val Ser Gln
290 295
<210> 274
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 274
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Val Lys Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
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85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser
245 250 255
Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val
260 265 270
Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp
275 280 285
Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295
<210> 275
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 275
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Val Lys Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
Ile Asn Lys Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys
85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser
245 250 255
Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met
260 265 270
Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp
275 280 285
Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295
<210> 276
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 276
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys
35 40 45
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys
225 230 235 240
Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser
245 250 255
Asn Thr Glu Glu Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys
260 265 270
Val Asp His Cys Val Ser Gln
275
<210> 277
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 277
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
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Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
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180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
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210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys
225 230 235 240
Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser
245 250 255
Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys
260 265 270
Leu Asp His Cys His Ser Gln
275
<210> 278
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 278
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
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Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys
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Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys Asn
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Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
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Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
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Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
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Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys
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260 265 270
Leu Asp His Cys His Ser Gln
275
<210> 279
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 279
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
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Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
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Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Arg Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu
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Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser
245 250 255
Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val
260 265 270
Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp
275 280 285
Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val Ser Gln
290 295
<210> 280
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 280
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
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35 40 45
Arg Val Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Arg Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser
245 250 255
Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val
260 265 270
Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp
275 280 285
Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295
<210> 281
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 281
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
Arg Val Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn
50 55 60
Ser Gly Phe Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val
65 70 75 80
Ile Asn Arg Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg
85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Arg Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu
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Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser
245 250 255
Arg Cys Met Arg Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Met
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Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp
275 280 285
Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295
<210> 282
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 282
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Arg
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Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg Val Thr Ala Met
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Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
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180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
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210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg
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Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser
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Asn Thr Glu Glu Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys
260 265 270
Val Asp His Cys Val Ser Gln
275
<210> 283
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 283
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
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Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Arg
35 40 45
Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg Val Thr Ala Met
130 135 140
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Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg
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Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser
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260 265 270
Leu Asp His Cys His Ser Gln
275
<210> 284
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 284
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
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Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Arg
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Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg Asn
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Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
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Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
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Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg Val Thr Ala Met
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg
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245 250 255
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260 265 270
Leu Asp His Cys His Ser Gln
275
<210> 285
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 285
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
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100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
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145 150 155 160
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180 185 190
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195 200 205
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275 280 285
Cys Val Asp His Cys Val Ser Gln
290 295
<210> 286
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 286
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Glu Pro
225 230 235 240
Arg Val Pro Ile Thr Gln Asn Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr
245 250 255
Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met
260 265 270
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275 280 285
Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295
<210> 287
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 287
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile
35 40 45
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65 70 75 80
Ile Asn Lys Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys
85 90 95
Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His
130 135 140
Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys
145 150 155 160
Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His
165 170 175
Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly
195 200 205
Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Glu Pro
225 230 235 240
Arg Val Pro Ile Thr Gln Asn Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met
245 250 255
Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met
260 265 270
Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr
275 280 285
Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295
<210> 288
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 288
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys
35 40 45
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys Asn
50 55 60
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Thr Gln Asn Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala
225 230 235 240
Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu
245 250 255
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260 265 270
Cys Val Ser Gln
275
<210> 289
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 289
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
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Cys His Ser Gln
275
<210> 290
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 290
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115 120 125
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<210> 291
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 291
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<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 292
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290 295
<210> 293
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 293
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
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275 280 285
Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295
<210> 294
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 294
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
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Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
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Cys Val Ser Gln
275
<210> 295
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 295
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
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Cys His Ser Gln
275
<210> 296
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 296
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
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<210> 297
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 297
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<210> 298
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 298
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<210> 299
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 299
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275 280 285
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
290 295
<210> 300
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 300
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala
20 25 30
Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu
35 40 45
Glu Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His
50 55 60
Cys Val Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro
65 70 75 80
Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn Tyr Ser Val Asn
85 90 95
Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly
100 105 110
Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys Asn Thr Asn Val Ala
115 120 125
His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile
165 170 175
Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp
180 185 190
Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu
195 200 205
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210 215 220
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Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu
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260 265 270
Met Phe Ile Asn Thr Ser
275
<210> 301
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 301
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala
20 25 30
Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu
35 40 45
Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His
50 55 60
Cys His Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro
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Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn Tyr Ser Val Asn
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Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly
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115 120 125
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130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile
165 170 175
Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp
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Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu
195 200 205
Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn
210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
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275
<210> 302
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 302
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 303
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
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290 295
<210> 304
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 304
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Glu
20 25 30
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
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Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
290 295
<210> 305
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 305
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Glu
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165 170 175
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195 200 205
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290 295
<210> 306
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 306
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala
20 25 30
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile
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Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp
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Met Phe Ile Asn Thr Ser
275
<210> 307
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 307
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala
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Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile
165 170 175
Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp
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260 265 270
Met Phe Ile Asn Thr Ser
275
<210> 308
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 308
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg Tyr Asn Asp
20 25 30
Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu
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Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His
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Cys His Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro
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Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Arg Arg Arg Ala Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile
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Met Phe Ile Asn Thr Ser
275
<210> 309
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 309
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
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<210> 310
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 310
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
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100 105 110
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115 120 125
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275 280 285
Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295 300
<210> 311
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 311
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
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115 120 125
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Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Glu Pro
225 230 235 240
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Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu
275 280 285
Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
290 295 300
<210> 312
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 312
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
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Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Glu Pro Arg Ile Pro Lys
210 215 220
Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys
225 230 235 240
Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser
245 250 255
Met Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu
260 265 270
His Cys Val Asp His Cys Val Ser Gln
275 280
<210> 313
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 313
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys
35 40 45
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys Asn
50 55 60
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
130 135 140
Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser
165 170 175
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180 185 190
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
195 200 205
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210 215 220
Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys
225 230 235 240
Thr Lys Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser
245 250 255
Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu
260 265 270
His Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
275 280
<210> 314
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 314
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys Asn
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Lys
35 40 45
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
115 120 125
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165 170 175
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195 200 205
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275 280
<210> 315
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 315
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
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100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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275 280 285
Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His Cys Val Ser Gln
290 295 300
<210> 316
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 316
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
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145 150 155 160
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275 280 285
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290 295 300
<210> 317
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 317
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp
115 120 125
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165 170 175
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195 200 205
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290 295 300
<210> 318
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 318
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
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Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe Arg
35 40 45
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50 55 60
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Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp
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Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
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Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile
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245 250 255
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His Cys Val Asp His Cys Val Ser Gln
275 280
<210> 319
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 319
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
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Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
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Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg Asn
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Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr
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His Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
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<210> 320
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 320
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Gly Ser Gly Thr Thr
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Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg Asn
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Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
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<210> 321
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 321
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
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<210> 322
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 322
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
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Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe
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Leu Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
290 295 300
<210> 323
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 323
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
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<210> 324
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 324
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe
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Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu
245 250 255
Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe
260 265 270
Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
275 280
<210> 325
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 325
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Tyr Asn Ala
20 25 30
Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu
35 40 45
Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His
50 55 60
Cys His Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr
65 70 75 80
Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe
100 105 110
Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys
115 120 125
Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg
130 135 140
Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr
165 170 175
Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr
180 185 190
Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala
195 200 205
Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser
210 215 220
Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn
225 230 235 240
Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu
245 250 255
Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe
260 265 270
Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
275 280
<210> 326
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 326
Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp
20 25 30
Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu
35 40 45
Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His
50 55 60
Cys His Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr
65 70 75 80
Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Lys
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe
100 105 110
Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Lys
115 120 125
Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg
130 135 140
Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr
165 170 175
Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr
180 185 190
Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala
195 200 205
Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser
210 215 220
Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn
225 230 235 240
Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu
245 250 255
Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe
260 265 270
Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
275 280
<210> 327
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 327
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Glu
20 25 30
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr
35 40 45
Arg Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met
50 55 60
Ser Asn Thr Glu Glu Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His
65 70 75 80
Cys Val Asp His Cys Val Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp
100 105 110
Ile Arg Val Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys
115 120 125
Asn Ser Gly Phe Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys
130 135 140
Val Ile Asn Arg Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu
145 150 155 160
Arg Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile
180 185 190
Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile
195 200 205
His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys
210 215 220
Arg Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu
225 230 235 240
His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu
245 250 255
Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser
260 265 270
Gly Cys Arg Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe
275 280 285
Leu Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
290 295 300
<210> 328
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 328
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Glu
20 25 30
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr
35 40 45
Arg Tyr Asn Ala Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met
50 55 60
Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His
65 70 75 80
Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp
100 105 110
Ile Arg Val Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys
115 120 125
Asn Ser Gly Phe Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys
130 135 140
Val Ile Asn Arg Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu
145 150 155 160
Arg Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile
180 185 190
Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile
195 200 205
His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys
210 215 220
Arg Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu
225 230 235 240
His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu
245 250 255
Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser
260 265 270
Gly Cys Arg Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe
275 280 285
Leu Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
290 295 300
<210> 329
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 329
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Glu
20 25 30
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met
35 40 45
Arg Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met
50 55 60
Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr
65 70 75 80
Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp
100 105 110
Ile Arg Val Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys
115 120 125
Asn Ser Gly Phe Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys
130 135 140
Val Ile Asn Arg Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu
145 150 155 160
Arg Cys Ile Arg Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile
180 185 190
Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile
195 200 205
His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys
210 215 220
Arg Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu
225 230 235 240
His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu
245 250 255
Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser
260 265 270
Gly Cys Arg Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe
275 280 285
Leu Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
290 295 300
<210> 330
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 330
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala
20 25 30
Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Met Ser Asn Thr Glu
35 40 45
Glu Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Leu Leu His Cys Val Asp His
50 55 60
Cys Val Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr
65 70 75 80
Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe
100 105 110
Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg
115 120 125
Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg Cys Ile Arg
130 135 140
Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr
165 170 175
Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr
180 185 190
Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg Val Thr Ala
195 200 205
Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser
210 215 220
Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn
225 230 235 240
Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Arg Glu
245 250 255
Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe
260 265 270
Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
275 280
<210> 331
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 331
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Thr Arg Tyr Asn Ala
20 25 30
Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Val Met Ser Met Ser Asn Thr Glu
35 40 45
Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu His Cys Leu Asp His
50 55 60
Cys His Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr
65 70 75 80
Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe
100 105 110
Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg
115 120 125
Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg Cys Ile Arg
130 135 140
Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr
165 170 175
Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr
180 185 190
Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg Val Thr Ala
195 200 205
Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser
210 215 220
Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn
225 230 235 240
Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Arg Glu
245 250 255
Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe
260 265 270
Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
275 280
<210> 332
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 332
Asp Tyr Arg Asp Glu His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gln Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Arg Tyr Asn Asp
20 25 30
Glu Leu Glu Arg Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu
35 40 45
Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His
50 55 60
Cys His Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr
65 70 75 80
Thr Cys Pro Pro Pro Val Ser Ile Glu His Ala Asp Ile Arg Val Arg
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Asn Ser Arg Glu Arg Tyr Val Cys Asn Ser Gly Phe
100 105 110
Arg Arg Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ile Glu Cys Val Ile Asn Arg
115 120 125
Asn Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Arg Cys Ile Arg
130 135 140
Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr
165 170 175
Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ser Leu Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr
180 185 190
Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His Pro Ser Cys Arg Val Thr Ala
195 200 205
Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser
210 215 220
Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn
225 230 235 240
Ser Thr Leu Ser Ser Asn Arg Asn Val Ala Glu Ser Gly Cys Arg Glu
245 250 255
Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe
260 265 270
Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
275 280
<210> 333
<211> 741
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 333
Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu
1 5 10 15
Cys Leu Ala Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Leu
20 25 30
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala Thr Lys
50 55 60
Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser Asp Gly
65 70 75 80
Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys Ile Arg
85 90 95
Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala Gly Leu
100 105 110
Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val Val Ala
115 120 125
Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr Ala Val
130 135 140
Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu Arg Gly
145 150 155 160
Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn Ile
165 170 175
Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys Pro Leu
180 185 190
Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro Cys Ala
195 200 205
Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly Cys Gly
210 215 220
Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys
225 230 235 240
Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser Thr Ile
245 250 255
Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu Leu Leu
260 265 270
Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp Cys His
275 280 285
Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met Gly Gly
290 295 300
Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu His Phe
305 310 315 320
Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro His Gly
325 330 335
Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys Val Pro
340 345 350
Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Thr Ala
355 360 365
Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr Asp Glu
370 375 380
Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg Leu Lys
385 390 395 400
Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys Val Ser
405 410 415
Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly Glu Ala
420 425 430
Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly Lys Cys
435 440 445
Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asp Lys Ser Asp Asn Cys
450 455 460
Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val Lys Lys
465 470 475 480
Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys Ser Cys
485 490 495
His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu
500 505 510
Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Ser Glu
515 520 525
Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys Leu Cys
530 535 540
Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu Gly Tyr
545 550 555 560
Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val
565 570 575
Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly Lys Asn
580 585 590
Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu Leu Leu
595 600 605
Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn Cys His
610 615 620
Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp Lys Glu
625 630 635 640
Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe Gly Ser
645 650 655
Asp Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser Glu Thr
660 665 670
Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys Leu His
675 680 685
Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val Lys Ala
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Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu Ala Cys
705 710 715 720
Thr Phe Arg Arg Pro Gly Ser Ser Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Arg
725 730 735
Arg Pro Tyr Ile Leu
740
<210> 334
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> S、T、D或N
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> A、M、I、L或V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> A、M、I、L或V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> D、E、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> D、E、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> A、M、I、L或V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> A、M、I、L或V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> A、M、I、L或V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> A、M、I、L或V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> D、E、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (47)..(47)
<223> H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (48)..(48)
<223> S、T、D或N
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<400> 334
Arg Glu Gly Cys Ala Xaa Arg Cys Xaa Lys Tyr Xaa Asp Glu Xaa Xaa
1 5 10 15
Lys Cys Xaa Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Xaa Glu Asp Xaa Xaa Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa
35 40 45
Xaa
<210> 335
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 任何氨基酸
<400> 335
Arg Glu Xaa Cys Xaa Xaa Arg Cys Xaa Lys Tyr Xaa Asp Glu Xaa Xaa
1 5 10 15
Lys Cys Xaa Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 336
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (47)..(47)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (48)..(48)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> 任何氨基酸
<400> 336
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Xaa Glu Asp Xaa Xaa Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa
35 40 45
Xaa
<210> 337
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (47)..(47)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (48)..(48)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> 任何氨基酸
<400> 337
Arg Glu Xaa Cys Xaa Xaa Arg Cys Xaa Lys Tyr Xaa Asp Glu Xaa Xaa
1 5 10 15
Lys Cys Xaa Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Xaa Glu Asp Xaa Xaa Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa
35 40 45
Xaa
<210> 338
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<400> 338
Xaa Xaa Gly Cys Ala Ser Xaa Cys Met Xaa Tyr Asn Xaa Xaa Leu Glu
1 5 10 15
Xaa Cys Glu Ala Xaa Met Met Xaa Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 339
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (47)..(47)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<400> 339
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Xaa Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Xaa Gln Glu Leu Xaa Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys Xaa Ser
35 40 45
Gln
<210> 340
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (47)..(47)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<400> 340
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Xaa Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Xaa Gln Glu Leu Xaa Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys Xaa Ser
35 40 45
Gln
<210> 341
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> A、M、I、L、V、F、W或Y
<400> 341
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Xaa Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Met Xaa Ser Xaa Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 342
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> D、E、H、K、R、N、Q、S或T
<400> 342
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Xaa Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Met Xaa Ser Xaa Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 343
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> A、M、I、L或V
<400> 343
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Xaa Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 344
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> K或R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> K或R
<400> 344
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Xaa Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Xaa Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
35 40 45
Gln
<210> 345
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成6xHis标签
<400> 345
His His His His His His
1 5
<210> 346
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 346
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 347
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 347
Asp Tyr Lys Asp Glu
1 5
<210> 348
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 348
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 349
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 349
Asp Val Glu Ala Trp Leu Gly Ala Arg
1 5
<210> 350
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 350
Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Arg Arg Pro Tyr Ile Leu
1 5 10
<210> 351
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 351
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser
35 40 45
Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
50 55 60
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys
65 70 75 80
Asp Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
85 90 95
Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr
100 105 110
Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu
115 120 125
Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val
130 135 140
Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val
145 150 155 160
Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys
165 170 175
Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser
180 185 190
Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln
195 200 205
Cys Ile Asp Gly Gly Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
210 215 220
<210> 352
<211> 891
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 352
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly
20 25 30
Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser
35 40 45
Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
50 55 60
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys
65 70 75 80
Asp Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
85 90 95
Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr
100 105 110
Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu
115 120 125
Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val
130 135 140
Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val
145 150 155 160
Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys
165 170 175
Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser
180 185 190
Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln
195 200 205
Cys Ile Asp Gly Gly Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Arg
210 215 220
Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser
225 230 235 240
Thr Asp Phe Thr Ser Thr Ile Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val
245 250 255
Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val
260 265 270
Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln
275 280 285
His Phe Val Lys Ile Gln Val Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile
290 295 300
Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly
305 310 315 320
Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val
325 330 335
His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro
340 345 350
Val Asn Gly Ser Ile Val Ile Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala
355 360 365
Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile
370 375 380
Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe
385 390 395 400
Phe Gly His Ala His Leu Gly Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe
405 410 415
Pro Ser Phe Asn His Thr Gln Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu
420 425 430
Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu
435 440 445
Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser
450 455 460
Thr Cys Arg Met Val Thr Ser Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val
465 470 475 480
Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile
485 490 495
Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg
500 505 510
Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu
515 520 525
Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly
530 535 540
Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp
545 550 555 560
Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser
565 570 575
Leu His Leu Lys Ala Phe Thr Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu
580 585 590
Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu
595 600 605
Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe
610 615 620
Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu
625 630 635 640
Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val
645 650 655
Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr
660 665 670
Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys
675 680 685
Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu
690 695 700
Thr His Asp Val Glu Leu Asn Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln
705 710 715 720
Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys
725 730 735
Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe
740 745 750
Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys
755 760 765
Thr Asp Arg Phe Val Met Lys Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val
770 775 780
Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe
785 790 795 800
Arg His Val Phe Trp Gly Ser Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu
805 810 815
Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr
820 825 830
Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala
835 840 845
Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe Gly
850 855 860
Gly Gly Ser His His His His His His Gly Gly Gly Ser Leu Asn Asp
865 870 875 880
Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
885 890
<210> 353
<211> 725
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 353
Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu
1 5 10 15
Cys Leu Ala Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Leu
20 25 30
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala Thr Lys
50 55 60
Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser Asp Gly
65 70 75 80
Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys Ile Arg
85 90 95
Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala Gly Leu
100 105 110
Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val Val Ala
115 120 125
Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr Ala Val
130 135 140
Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu Arg Gly
145 150 155 160
Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn Ile
165 170 175
Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys Pro Leu
180 185 190
Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro Cys Ala
195 200 205
Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly Cys Gly
210 215 220
Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys
225 230 235 240
Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser Thr Ile
245 250 255
Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu Leu Leu
260 265 270
Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp Cys His
275 280 285
Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met Gly Gly
290 295 300
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305 310 315 320
Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro His Gly
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Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys Val Pro
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Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Thr Ala
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Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr Asp Glu
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Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly Lys Cys
435 440 445
Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asp Lys Ser Asp Asn Cys
450 455 460
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465 470 475 480
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val
565 570 575
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580 585 590
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610 615 620
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660 665 670
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705 710 715 720
Thr Phe Arg Arg Pro
725
<210> 354
<211> 727
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 354
Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu
1 5 10 15
Cys Leu Ala Asp Tyr Lys Asp Glu His His His His His His Gly Leu
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165 170 175
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Gly Cys Gly Cys Ser Ser Thr Gln Pro Phe Phe Gly Tyr Val Gly Ala
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Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Gly Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His
245 250 255
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260 265 270
Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Gln Tyr Glu
275 280 285
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290 295 300
Asn Asn Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Ile Leu Lys Val Ala Gln
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Glu His Phe Gly Lys Gly Lys Ser Lys Asp Phe Gln Leu Phe Ser Ser
325 330 335
Pro Leu Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Phe Gly Leu Leu
340 345 350
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355 360 365
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 355
Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu
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<210> 356
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 356
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 357
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 358
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 359
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<210> 360
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 360
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<220>
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<400> 361
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<210> 362
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 362
Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser His Cys Thr Lys Tyr Lys Ala Glu
1 5 10 15
Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Val Ser Ser Arg Ser Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Thr Cys Val Gln Glu Leu Phe Asp Phe Leu His Cys Val Asp His Cys
35 40 45
Val Ser Gln
50
<210> 363
<211> 760
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 363
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1 5 10 15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
20 25 30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala
35 40 45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly
50 55 60
Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
85 90 95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro
100 105 110
Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys
115 120 125
Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile
130 135 140
Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln
145 150 155 160
Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val
180 185 190
Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg
195 200 205
Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys
210 215 220
Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys
225 230 235 240
Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile
245 250 255
Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu
260 265 270
Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe
275 280 285
Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly
290 295 300
Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln
305 310 315 320
Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr
325 330 335
Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp
340 345 350
Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser
355 360 365
Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile
370 375 380
Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp
385 390 395 400
His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala
405 410 415
Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met
420 425 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
435 440 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
450 455 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
485 490 495
Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn
500 505 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
515 520 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
530 535 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
545 550 555 560
Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
565 570 575
Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
580 585 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn
595 600 605
Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp
610 615 620
Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln
625 630 635 640
Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu
645 650 655
Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys
660 665 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro
675 680 685
Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser
690 695 700
Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys
705 710 715 720
Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala
725 730 735
Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp
740 745 750
Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe
755 760
<210> 364
<211> 676
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 364
Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala Thr Lys Cys
1 5 10 15
Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser Asp Gly Pro
20 25 30
Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys Ile Arg Ala
35 40 45
Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala Gly Leu Val
50 55 60
Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val Val Ala Glu
65 70 75 80
Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr Ala Val Ala
85 90 95
Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu Arg Gly Lys
100 105 110
Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn Ile Pro
115 120 125
Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys Pro Leu Glu
130 135 140
Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro Cys Ala Asp
145 150 155 160
Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly Cys Gly Cys
165 170 175
Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu
180 185 190
Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser Thr Ile Phe
195 200 205
Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu Leu Leu Cys
210 215 220
Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp Cys His Leu
225 230 235 240
Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met Gly Gly Lys
245 250 255
Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu His Phe Gly
260 265 270
Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro His Gly Lys
275 280 285
Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys Val Pro Pro
290 295 300
Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Thr Ala Ile
305 310 315 320
Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr Asp Glu Cys
325 330 335
Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg Leu Lys Cys
340 345 350
Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys Val Ser Ala
355 360 365
Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly Glu Ala Asp
370 375 380
Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly Lys Cys Gly
385 390 395 400
Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp Asn Cys Glu
405 410 415
Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Ile Ala Val Val Lys Lys Ser
420 425 430
Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys Ser Cys His
435 440 445
Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu
450 455 460
Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Ser Glu Gly
465 470 475 480
Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys Leu Cys Met
485 490 495
Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu Gly Tyr Tyr
500 505 510
Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala
515 520 525
Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly Lys Asn Pro
530 535 540
Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu Leu Leu Cys
545 550 555 560
Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn Cys His Leu
565 570 575
Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp Lys Glu Ala
580 585 590
Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe Gly Ser Asn
595 600 605
Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser Glu Thr Lys
610 615 620
Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys Leu His Asp
625 630 635 640
Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val Lys Ala Val
645 650 655
Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu Ala Cys Thr
660 665 670
Phe Arg Arg Pro
675
<210> 365
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> N-甲基-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> l-新-Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 叔-Leu
<400> 365
Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Arg Lys Pro Trp Leu Leu
1 5 10
<210> 366
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> d-Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> l-新-Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 叔-Ile
<400> 366
Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Arg Lys Pro Trp Ile Leu
1 5 10
<210> 367
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> d-Orn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> l-新-Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 叔-Leu
<400> 367
Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Arg Xaa Pro Trp Leu Leu
1 5 10
<210> 368
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> N-甲基-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> d-3,1-Nal
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 叔-Leu
<400> 368
Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Arg Arg Pro Xaa Leu Leu
1 5 10
<210> 369
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> H-Lys-ψ[CH2NH]
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Tle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Leu-Oet
<400> 369
Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Lys Lys Pro Tyr Xaa Leu
1 5 10
<210> 370
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 370
Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro
1 5
<210> 371
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> K或R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> K或R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> W或Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> I或L
<400> 371
Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Leu
1 5 10
<210> 372
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 372
Gly Ser Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu
1 5 10 15
Trp Glu Asp Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Cys
20 25 30
Leu Pro Pro Gly Lys Pro Cys Tyr Gly Ala Thr Gln Lys Ile Pro Cys
35 40 45
Cys Gly Val Cys Ser His Asn Asn Cys Thr
50 55
<210> 373
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 373
Gly Ser Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu
1 5 10 15
Trp Glu Asp Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu
20 25 30
Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys
35 40 45
Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln
50 55 60
Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
65 70 75
<210> 374
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 374
Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Cys Leu Pro
20 25 30
Pro Gly Lys Pro Cys Tyr Gly Ala Thr Gln Lys Ile Pro Cys Cys Gly
35 40 45
Val Cys Ser His Asn Asn Cys Thr
50 55
<210> 375
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 375
Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys
20 25 30
Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala
35 40 45
Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu
50 55 60
Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
65 70 75
<210> 376
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 376
Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 377
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 377
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Ile Glu Asp Ile
1 5 10 15
Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35
<210> 378
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 378
Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro Lys Cys
1 5 10 15
Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys
20 25 30
Cys Tyr Tyr Cys
35
<210> 379
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 379
Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln
1 5 10 15
Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys
20 25 30
Gly Thr Cys
35
<210> 380
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 380
Gly Ser Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro
1 5 10 15
Lys Cys Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys Lys Cys Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
50 55 60
Asp Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Cys Leu Pro
65 70 75 80
Pro Gly Lys Pro Cys Tyr Gly Ala Thr Gln Lys Ile Pro Cys Cys Gly
85 90 95
Val Cys Ser His Asn Asn Cys Thr
100
<210> 381
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 381
Gly Ser Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro
1 5 10 15
Lys Cys Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys Lys Cys Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
50 55 60
Asp Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys
65 70 75 80
Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala
85 90 95
Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu
100 105 110
Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
115 120 125
<210> 382
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 382
Gly Ser Glu Trp Ser Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser
1 5 10 15
Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Cys Leu Pro Pro Gly Lys Pro
50 55 60
Cys Tyr Gly Ala Thr Gln Lys Ile Pro Cys Cys Gly Val Cys Ser His
65 70 75 80
Asn Asn Cys Thr
<210> 383
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 383
Gly Ser Glu Trp Ser Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser
1 5 10 15
Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys Lys Lys Tyr Lys Pro Tyr Val
35 40 45
Pro Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Pro Pro Gly Lys Pro Cys Tyr Gly
50 55 60
Ala Thr Gln Lys Ile Pro Cys Cys Gly Val Cys Ser His Asn Asn Cys
65 70 75 80
Thr
<210> 384
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 384
Gly Ser Glu Trp Ser Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser
1 5 10 15
Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys
50 55 60
Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser
65 70 75 80
Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu
85 90 95
Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
100 105
<210> 385
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 385
Gly Ser Glu Trp Ser Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser
1 5 10 15
Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys Lys Lys Tyr Lys Pro Tyr Val
35 40 45
Pro Val Thr Thr Asn Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr
50 55 60
Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn
65 70 75 80
Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu
85 90 95
Asp His Cys His Ser Gln
100
<210> 386
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 386
Gly Ser Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro
1 5 10 15
Lys Cys Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys Lys Cys Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Ser Lys Cys Leu Pro Pro Gly Lys Pro Cys Tyr Gly
50 55 60
Ala Thr Gln Lys Ile Pro Cys Cys Gly Val Cys Ser His Asn Asn Cys
65 70 75 80
Thr
<210> 387
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 387
Gly Ser Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro
1 5 10 15
Lys Cys Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys Lys Cys Tyr Tyr Cys Lys Lys Tyr Lys Pro Tyr Val Pro Val Thr
35 40 45
Thr Asn Lys Cys Leu Pro Pro Gly Lys Pro Cys Tyr Gly Ala Thr Gln
50 55 60
Lys Ile Pro Cys Cys Gly Val Cys Ser His Asn Asn Cys Thr
65 70 75
<210> 388
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 388
Gly Ser Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro
1 5 10 15
Lys Cys Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys Lys Cys Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr
50 55 60
Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn
65 70 75 80
Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu
85 90 95
Asp His Cys His Ser Gln
100
<210> 389
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 389
Gly Ser Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro
1 5 10 15
Lys Cys Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys Lys Cys Tyr Tyr Cys Lys Lys Tyr Lys Pro Tyr Val Pro Val Thr
35 40 45
Thr Asn Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu
50 55 60
Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu
65 70 75 80
Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys
85 90 95
His Ser Gln
<210> 390
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 390
Gly Ser Glu Trp Ser Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser
1 5 10 15
Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys
35 40
<210> 391
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 391
Gly Ser Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro
1 5 10 15
Lys Cys Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys Lys Cys Tyr Tyr Cys
35
<210> 392
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 392
Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro Lys Cys
1 5 10 15
Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys
20 25 30
Cys Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu
35 40 45
Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Cys Leu Pro Pro Gly
65 70 75 80
Lys Pro Cys Tyr Gly Ala Thr Gln Lys Ile Pro Cys Cys Gly Val Cys
85 90 95
Ser His Asn Asn Cys Thr
100
<210> 393
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 393
Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro Lys Cys
1 5 10 15
Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys
20 25 30
Cys Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu
35 40 45
Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser
65 70 75 80
Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met
85 90 95
Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser Gln
115 120
<210> 394
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 394
Glu Trp Ser Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys
1 5 10 15
Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys
20 25 30
Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Cys Leu Pro Pro Gly Lys Pro Cys Tyr
50 55 60
Gly Ala Thr Gln Lys Ile Pro Cys Cys Gly Val Cys Ser His Asn Asn
65 70 75 80
Cys Thr
<210> 395
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 395
Glu Trp Ser Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys
1 5 10 15
Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys
20 25 30
Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys Lys Lys Tyr Lys Pro Tyr Val Pro Val
35 40 45
Thr Thr Asn Lys Cys Leu Pro Pro Gly Lys Pro Cys Tyr Gly Ala Thr
50 55 60
Gln Lys Ile Pro Cys Cys Gly Val Cys Ser His Asn Asn Cys Thr
65 70 75
<210> 396
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 396
Glu Trp Ser Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys
1 5 10 15
Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys
20 25 30
Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys
50 55 60
Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser
65 70 75 80
Asn Thr Glu Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys
85 90 95
Leu Asp His Cys His Ser Gln
100
<210> 397
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 397
Glu Trp Ser Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys
1 5 10 15
Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys
20 25 30
Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys Lys Lys Tyr Lys Pro Tyr Val Pro Val
35 40 45
Thr Thr Asn Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp
50 55 60
Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu
65 70 75 80
Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His
85 90 95
Cys His Ser Gln
100
<210> 398
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 398
Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro Lys Cys
1 5 10 15
Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys
20 25 30
Cys Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Ser Lys Cys Leu Pro Pro Gly Lys Pro Cys Tyr Gly Ala Thr
50 55 60
Gln Lys Ile Pro Cys Cys Gly Val Cys Ser His Asn Asn Cys Thr
65 70 75
<210> 399
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 399
Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro Lys Cys
1 5 10 15
Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys
20 25 30
Cys Tyr Tyr Cys Lys Lys Tyr Lys Pro Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn
35 40 45
Lys Cys Leu Pro Pro Gly Lys Pro Cys Tyr Gly Ala Thr Gln Lys Ile
50 55 60
Pro Cys Cys Gly Val Cys Ser His Asn Asn Cys Thr
65 70 75
<210> 400
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 400
Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro Lys Cys
1 5 10 15
Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys
20 25 30
Cys Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Ser Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp
50 55 60
Glu Leu Glu Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu
65 70 75 80
Glu Asp Cys Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His
85 90 95
Cys His Ser Gln
100
<210> 401
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 401
Ala Ala Ala Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro Lys Cys
1 5 10 15
Arg Ala Gln Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys
20 25 30
Cys Tyr Tyr Cys Lys Lys Tyr Lys Pro Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn
35 40 45
Arg Glu Gly Cys Ala Ser Arg Cys Met Lys Tyr Asn Asp Glu Leu Glu
50 55 60
Lys Cys Glu Ala Arg Met Met Ser Met Ser Asn Thr Glu Glu Asp Cys
65 70 75 80
Glu Gln Glu Leu Glu Asp Leu Leu Tyr Cys Leu Asp His Cys His Ser
85 90 95
Gln
<210> 402
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 402
Glu Trp Ser Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys
1 5 10 15
Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys
20 25 30
Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys
35
<210> 403
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 403
Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser
1 5 10 15
<210> 404
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 404
Arg Lys Gly Phe Tyr Lys Arg Lys Gln Cys Lys Pro Ser Arg Gly Arg
1 5 10 15
Lys Arg
<210> 405
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 405
Asn Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
1 5 10 15
Gln Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro
20 25 30
Val Gln
<210> 406
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 406
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ala Lys Lys Ile Leu
20
<210> 407
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 407
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 408
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 408
Met Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala
1 5 10 15
Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro
20 25
<210> 409
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 409
Met Val Arg Arg Phe Leu Val Thr Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly
1 5 10 15
Pro Pro Arg Val Arg Val
20
<210> 410
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 410
Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His
1 5 10 15
Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala
20 25 30
<210> 411
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 411
Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 412
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 412
Gly Leu Ala Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 413
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 413
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 414
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 414
Trp Arg Trp Arg Trp Arg Trp Arg
1 5
<210> 415
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 415
Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly
1 5 10 15
Ala Lys Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 416
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 416
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala His Leu Leu Ala
1 5 10 15
Pro
<210> 417
<211> 26
<212> PRT
<213> 西方蜜蜂(Apis mellifera)
<400> 417
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln
20 25
<210> 418
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 418
His Gly Leu Ala Ser Thr Leu Thr Arg Trp Ala His Tyr Asn Ala Leu
1 5 10 15
Ile Arg Ala Phe
20
<210> 419
<211> 13
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 419
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 420
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 420
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 421
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 421
Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg
1 5
<210> 422
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 422
Cys Gly Tyr Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly
1 5 10
<210> 423
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 423
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 424
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 424
Arg Arg Ile Pro Asn Arg Arg Pro Arg Arg
1 5 10
<210> 425
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 425
Arg Leu Arg Trp Arg
1 5
<210> 426
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 426
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Val
20
<210> 427
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 427
Gln Leu Ala Leu Gln Leu Ala Leu Gln Ala Leu Gln Ala Ala Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 428
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 428
Asp Pro Lys Gly Asp Pro Lys Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr
1 5 10 15
Val Thr Gly Lys Gly Asp Pro Lys Pro Asp
20 25
<210> 429
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 429
Arg Arg Ile Arg Pro Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg
1 5 10 15
Pro Leu Pro Phe Pro Arg Pro Gly
20
<210> 430
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 430
Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg
1 5
<210> 431
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 431
Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg
1 5 10
<210> 432
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 432
Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg
1 5 10 15
<210> 433
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 433
Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro
1 5 10 15
Pro Arg
<210> 434
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 434
Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
1 5 10 15
Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Cys
20
<210> 435
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 435
Gly Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Arg Ala
20
<210> 436
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 436
Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr
1 5 10 15
<210> 437
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 437
Thr Gly Asn Tyr Lys Ala Leu His Pro His Asn Gly
1 5 10
<210> 438
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 438
Val Pro Met Leu Lys
1 5
<210> 439
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 439
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg Gly
1 5 10
<210> 440
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 440
Lys Val Lys Val Lys Val Lys Val Asp Pro Pro Thr Lys Val Lys Val
1 5 10 15
Lys Val Lys
<210> 441
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 441
Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys
1 5 10
<210> 442
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 442
Arg Leu Trp Met Arg Trp Tyr Ser Pro Arg Thr Arg Ala Tyr Gly
1 5 10 15
<210> 443
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 443
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu
20 25 30
Leu Arg Asp Ala
35
<210> 444
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 444
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 445
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 445
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Asn
20
<210> 446
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 446
Lys Ala Phe Ala Lys Leu Ala Ala Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Leu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Leu Gly Val Ala Ala
20
<210> 447
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 447
Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro
20
<210> 448
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 448
Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
1 5 10 15
Gln Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro
20 25 30
Val Glu
<210> 449
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 449
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 450
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 450
Lys Pro Lys Arg Lys Arg Arg Lys Lys Lys Gly His Gly Trp Ser Arg
1 5 10 15
<210> 451
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 451
Ser Gly Thr Gln Glu Glu Tyr
1 5
<210> 452
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 452
Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg Gly
1 5 10
<210> 453
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 453
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr
1 5 10 15
Thr Gly
<210> 454
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 454
Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 455
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 455
Met Lys Tyr Phe Thr Leu Ala Leu Thr Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ile
1 5 10 15
Asn Pro Cys Lys Asp Met Asn Phe Ala Trp Ala Glu Ser Ser Glu Lys
20 25 30
Val Glu Arg Ala Ser Pro Gln Gln Ala Lys Tyr Cys Tyr Glu Gln Cys
35 40 45
Asn Val Asn Lys Val Pro Phe Asp Gln Cys Tyr Gln Met Cys Ser Pro
50 55 60
Leu Glu Arg Ser
65
<210> 456
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 456
Gly Ser Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu
1 5 10 15
Trp Glu Asp Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg
20 25 30
Ile Pro Val Ser Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys
35 40 45
Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys Asp Cys
50 55 60
Thr Pro Lys
65
<210> 457
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 457
Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Ile Pro
20 25 30
Val Ser Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp Ala
35 40 45
Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys Asp Cys Thr Pro
50 55 60
Lys
65

Claims (76)

1.一种组合物，所述组合物包含经工程改造转铁蛋白受体(TfR)结合肽或其变体、同源物、片段或类似物。
2.一种包含肽构建体的组合物，其中所述肽构建体包含：
a)转铁蛋白受体(TfR)结合肽或其变体、同源物、片段或类似物；以及
b)活性剂，
其中所述肽缀合于、连接于或融合于所述活性剂。
3.一种包含经工程改造肽的组合物，所述经工程改造肽与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ IDNO:202，或SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或功能性片段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽穿透包含血脑屏障(BBB)的细胞层。
5.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽穿透膜，并且其中所述膜是细胞的膜。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述细胞表达TfR。
7.如权利要求5所述的组合物，其中所述肽通过TfR介导的胞吞作用来穿透所述细胞的所述膜。
8.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽通过结合TfR，然后从TfR解离来穿过所述血脑屏障递送至CNS。
9.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽通过受体介导的胞吞转运来穿过所述血脑屏障加以递送。
10.如权利要求5所述的组合物，其中所述细胞是肿瘤细胞。
11.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽定位在其中的细胞或器官过度表达TfR。
12.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:206–SEQ IDNO:224以及SEQ ID NO:334–SEQ ID NO:344。
13.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50和Q51或它们的任何组合的表面界面残基。
14.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于位置3、4、9、11、15、16、19、23、26、28、29、30、31、32、33、35、36、37、39和40中的任一者或它们的任何组合的亲水性表面远端残基。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述亲水性表面远端残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。
16.如权利要求12所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39和D40的亲水性表面远端残基中的任一者或它们的任何组合。
17.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于15、35、39或49中的任一者或它们的任何组合的位置处包含亲水性残基。
18.如权利要求14所述的组合物，其中所述亲水性残基选自氨基酸D、E、H、K、R、N、Q、S或T。
19.如权利要求17-18中任一项所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于D15、E35、E39和H49或它们的任何组合的亲水性残基。
20.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽在对应于11、25或27或它们的任何组合的位置处包含疏水性残基。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述疏水性残基选自氨基酸A、M、I、L、V、F、W或Y或它们的任何组合。
22.如权利要求20所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于M11、M25、M27的疏水性残基中的任一者或它们的任何组合。
23.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于位置45的脂族残基。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述脂族残基选自氨基酸A、M、I、L或V。
25.如权利要求23所述的组合物，其中以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于L45的脂族残基。
26.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键，或至少五个二硫键。
27.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQID NO:202、SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
28.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:136–SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:171–SEQ IDNO:202、SEQ ID NO:356–SEQ ID NO:358中的任一者或其变体或片段的序列。
29.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽包含以SEQ ID NO:1阐述的序列。
30.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽包含以SEQ ID NO:2阐述的序列。
31.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽包含以SEQ ID NO:4阐述的序列。
32.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽包含以SEQ ID NO:30阐述的序列。
33.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽包含以SEQ ID NO:32阐述的序列。
34.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽还与细胞穿透部分一起配制，融合于或缀合于细胞穿透部分。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述细胞穿透部分包括聚阳离子、聚有机酸、内体释放聚合物、聚(2-丙基丙烯酸)、聚(2-乙基丙烯酸)、Tat肽、Arg补丁、打结肽、CysTAT、S19-TAT、R8(SEQ ID NO:73)、pAntp、Pas-TAT、Pas-R8(SEQ ID NO:76)、Pas-FHV、Pas-pAntP、F2R4(SEQ ID NO:79)、B55、绿纹树蛙肽、IMT-P8、BR2、OMOTAG1、OMOTAG2、pVEC、SynB3、DPV1047、C105Y、转运肽、MTS、hLF、PFVYLI(SEQ ID NO:93)、maurocalcine、imperatoxin、hadrucalin、hemicalcin、opicalcin-1、opicalcin-2、中期因子(62-104)、MCoTI-II、氯毒素、DRI-TAT、cFΦR4(SEQ ID NO:96)、R6W3(SEQ ID NO:421)、肉豆蔻酸酯、yBBR，或它们的片段或变体，或它们的任何组合。
36.如权利要求34所述的组合物，其中所述细胞穿透部分是SEQ ID NO:71–SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98–SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:116–SEQ ID NO:126，或SEQ ID NO:403–SEQID NO:455中的任一者。
37.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述肽序列包含至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58个残基、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65、至少66、至少67、至少68、至少69、至少70、至少71、至少72、至少73、至少74、至少75、至少76、至少77、至少78、至少79、至少80或至少81个氨基酸残基。
38.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中活性序列被移植至所述肽上，或其中所述肽缀合于、连接于或融合于活性剂，或被移植至活性剂上，从而产生肽构建体。
39.如权利要求38所述的组合物，其中所述肽构建体包含与SEQ ID NO:33–SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:68–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:168–SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:203–SEQ IDNO:205、SEQ ID NO:225–SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:359–SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:381、SEQ DINO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:388、SEQ IDNO:389、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401中的任一者的至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。
40.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述活性剂通过接头来连接，其中所述接头选自表7，或SEQ ID NO:103–SEQ ID NO:115或SEQ ID NO:125中的任一者。
41.如权利要求38-40中任一项所述的组合物，其中所述活性剂是免疫治疗剂、CTLA-4靶向剂、PD-1靶向剂、PDL-1靶向剂、IL15剂、融合IL-15/IL-15Ra复合物剂、IFNγ剂、抗CD3剂、离子通道调节剂、Kv1.3抑制剂、澳瑞他汀、MMAE、美登木素、DM1、DM4、多柔比星、卡奇霉素、铂化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维奈托克、ABT-199、纳维托克、AT-101、奥贝托克、吡咯并苯并二氮呯或吡咯并苯并二氮呯二聚体、多拉司他汀或神经递质。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述Kv1.3抑制剂是Vm24、ShK-170、ShK-186或ShK-192。
43.如权利要求42所述的组合物，其中所述Vm24具有SEQ ID NO:378或SEQ ID NO:391的序列。
44.如权利要求42所述的组合物，其中所述Shk-185具有SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:390或SEQ ID NO:402的序列。
45.如权利要求41所述的组合物，其中所述神经递质是神经降压素、神经降压素肽变体，或它们的功能性片段。
46.如权利要求45所述的组合物，其中所述神经降压素肽变体包含与SEQ ID NO:350或SEQ ID NO:365–SEQ ID NO:369的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％序列同一性。
47.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，所述组合物还包含偶联于所述肽的半衰期调节剂。
48.如权利要求48所述的组合物，其中所述半衰期调节剂包括聚合物、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、水溶性聚合物、两性离子水溶性聚合物、水溶性聚(氨基酸)，脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，含有甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，Fc区、脂肪酸、棕榈酸，或结合白蛋白的分子。
49.如权利要求47所述的组合物，其中所述半衰期调节剂包括SA21。
50.如权利要求49所述的组合物，其中所述SA21具有SEQ ID NO:376或SEQ ID NO:377的序列。
51.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，所述组合物还包含通过接头来偶联于所述肽的可检测剂。
52.如权利要求51所述的组合物，其中所述可检测剂通过接头来连接，其中所述接头选自表7，或SEQ ID NO:103-SEQ ID NO:115或SEQ ID NO:125中的任一者。
53.如权利要求51所述的组合物，其中所述可检测剂是荧光团、近红外染料、造影剂、纳米颗粒、含有金属的纳米颗粒、金属螯合物、X射线造影剂、PET剂、放射性核素或放射性核素螯合剂。
54.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-53中任一项所述的组合物或其盐以及药学上可接受的载体。
55.一种用于穿过细胞层来转运组合物的方法，所述方法包括：
a)使所述细胞层与权利要求1-53中任一项所述的包含所述肽的组合物或权利要求54所述的药物组合物接触；以及
b)穿过所述细胞层来转运所述组合物。
56.一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括：
a)向所述受试者施用权利要求1-53中任一项所述的包含所述肽的组合物或权利要求54所述的药物组合物，以及
b)穿过细胞层来转运所述组合物。
57.一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的权利要求1-53中任一项所述的包含所述肽的组合物或权利要求54所述的药物组合物，所述量基于所述受试者的组织中TfR的表达。
58.如权利要求55-57中任一项所述的方法，其中所述肽能够结合和活化神经降压素受体。
59.如权利要求56-58中任一项所述的方法，所述方法还包括在将所述肽施用至所述受试者后降低疼痛的水平。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述施用采用以下方式达成：吸入、鼻内、口服、局部、静脉内、皮下、肌内施用、腹膜内、肿瘤内、鞘内，或它们的组合。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述组合物以团注、输注或延长输注形式加以静脉内施用。
62.如权利要求56-58中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述肽施用至患有精神分裂症、药物滥用、帕金森氏病、高血压、进食障碍、中风、阿尔茨海默氏病、癌症、炎症、疼痛、癫痫、情绪障碍或内分泌病症的患者。
63.如权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
64.如权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述受试者患有CNS的疾病。
65.如权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述受试者患有神经病变性疼痛、偏头痛、焦虑或癫痫。
66.一种用于穿过细胞层来转运根据权利要求1-53中任一项所述的组合物或权利要求54所述的药物组合物的方法，所述方法包括使所述细胞层与所述组合物接触，以及穿过所述细胞层来转运所述组合物。
67.一种治疗有需要的受试者中的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-53中任一项所述的组合物或权利要求54所述的药物组合物。
68.如权利要求55-56或60中任一项所述的方法，其中所述转运包括所述组合物与TfR的结合。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述转运还包括胞吞转运。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述胞吞转运是囊泡胞吞转运。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述胞吞转运是TfR介导的。
72.如权利要求69所述的方法，其中所述转运还包括所述组合物从所述TfR的解离。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述转运还包括从所述组合物释放活性剂。
74.一种用于设计TfR结合肽的方法，所述方法包括：
a)使用计算机程序从具有经优化稳定性和折叠的肽的文库鉴定肽，
其中所述肽文库中的每个肽包含至少三个分子内二硫键；
b)使用计算机程序叠加来自肽:TfR复合物的结合补丁的氨基酸残基以确定在将所述结合补丁移植至所述肽上之后结合TfR的稳定肽；以及
c)将所述结合补丁移植至所述肽上以产生所述稳定肽。
75.如权利要求74所述的方法，所述方法还包括进行位点饱和诱变以获得相比于所述稳定肽，对TfR具有更高结合亲和力的突变肽。
76.如权利要求74所述的方法，其中来自肽文库的所述肽在长度方面在20与75个氨基酸残基之间。
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