KR20220143701A

KR20220143701A - 돌연변이체 ras 단백질을 표적화하는 분자

Info

Publication number: KR20220143701A
Application number: KR1020227031654A
Authority: KR
Inventors: 필립 마리아 헨드릭 클래스; 요스트 슈임코비츠; 프레데릭 로우쎄우
Original assignee: 에린 테라퓨틱스; 브이아이비 브이지더블유; 카톨리에케 유니버시테이트 루벤
Priority date: 2020-02-19
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2022-10-25
Also published as: IL295623A; BR112022016513A2; EP4106787A1; AU2021223702A1; ZA202209674B; US20230100941A1; CN115427057A; MX2022010193A; JP2023514420A; CN115916234A; ZA202209632B; CA3170658A1; BR112022016517A2; IL295634A; EP4106785A1; WO2021165452A1; MX2022010191A; KR20220143702A; AU2021222972A1; US20230090247A1

Abstract

본 발명의 측면은 위치 12 또는 13에서 돌연변이된 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 형성하고 야생형 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 실질적으로 형성하지 않도록 구성된 비천연 생성 분자, 및 이의 치료적 적용에 관한 것이다.

Description

돌연변이체 RAS 단백질을 표적화하는 분자

본 발명은 넓게는 의료 분야에 속하고, 보다 구체적으로 돌연변이체 인간 RAS 단백질에 대한 분자에 관한 것이다. 개시된 분자는 신생물성 질환의 치료 방법과 같은 요법에 특히 유용하다. 본원은 개시된 분자를 제조하고 사용하는 방법 및 이 분자를 포함하는 조성물도 교시한다.

RAS 단백질은 작은 GTPase 부류의 단백질에 속하고 다양한 정상 세포 과정들, 예컨대, 세포 생장과 분열, 분화 및 생존을 조절하는 세포질 신호 전달도입 경로에 관여한다. RAS GTPase는 활성화를 촉진하는 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자(GEF)와, GTP 가수분해를 촉매함으로써 RAS를 불활성화시키는 GTPase 활성화 단백질(GAP)의 도움을 받아 GDP 결합 불활성 상태와 GTP 결합 활성 상태 사이를 순환한다. 일단 활성화되면, RAS-GTP는 상이한 촉매 기능을 가진 광범위한 다운스트림 이펙터들에 결합하여 이들을 활성화시킨다. 3개의 인간 RAS 유전자(Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자 상동체(KRAS), 신경모세포종 RAS 바이러스 종양유전자 상동체(NRAS) 및 Harvey 래트 육종 바이러스 종양유전자 상동체(HRAS))는 KRAS 전사체의 대안적 RNA 스플라이싱으로부터 생성된 2개의 KRAS 동형체(isoform)(KRAS4A 및 KRAS4B)와 함께 4개의 RAS 단백질을 코딩한다.

RAS 유전자의 특정 돌연변이는 영구적으로 활성화된 RAS 단백질의 생성을 유발하여, 유입 신호의 부재 하에서도 활성 세포내 신호전달을 유발할 수 있고, 이것은 궁극적으로 이러한 돌연변이된 RAS 단백질을 발현하는 세포의 신생물성 형질전환을 초래할 수 있거나 이러한 형질전환에 기여할 수 있다. RAS 유전자의 기능 획득 미스센스 돌연변이(RAS 유전자에서 130개 이상의 상이한 미스센스 돌연변이가 보고됨)는 모든 인간 암의 약 27% 및 특정 유형의 암의 최대 90%에서 발견됨으로써, 돌연변이체 RAS 유전자가 종양 시작 및 유지를 유도하는 가장 흔한 종양유전자는 아닐지라도 매우 흔한 종양유전자임을 입증한다. 인간 암에서, KRAS는 우세하게 돌연변이된 RAS 동형체(85%)인 반면, HRAS(4%) 및 NRAS(11%)는 덜 빈번하게 돌연변이된다. 더욱이, 돌연변이의 98%는 3개의 미스센스 돌연변이 핫스폿들 중 하나에서 발견된다: G12(G12C, G12D, G12S 및 G12V 돌연변이는 G12에서 가장 빈번한 돌연변이들에 속함), G13(G13C, G13D, G13R, G13S 및 G13V 돌연변이는 G13에서 가장 빈번한 돌연변이들에 속함) 및 Q61(Q61H, Q61K, Q61L 및 Q61R 돌연변이는 Q61에서 가장 빈번한 돌연변이들에 속함). 통상적으로, 돌연변이체 RAS는 항시적 활성 GTP 결합 RAS가 세포에 축적되게 하는, GAP 매개 GTP 가수분해의 결함을 가진 것으로 간주된다. 문헌[Hobbs et al. J Cell Sci. 2016, vol. 129, 1287-92]을 참조한다.

국제 특허출원 공개 제WO2007/071789호(A1) 및 제WO2012/123419호(A1)는 관심 있는 단백질의 상응하는 β-응집 성향 영역(APR)으로 향하고 이 영역과 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 β-응집 서열을 포함하는 드 노보(de novo) 디자인된 펩타이드 기반 분자(이 문헌들에서 '간섭제'로서 지칭됨)를 사용하여 관심 있는 단백질의 표적화된 하향조절을 가능하게 하는 기술을 설명한다. TANGO(Fernandez-Escamilla et al. Nat Biotechnol. 2004, vol. 22, 1302-6, http://tango.embl.de/) 또는 Zyggregator(Pawar et al. J Mol Biol. 2005, vol. 350, 379-92; Tartaglia and Vendruscolo, Chem Soc Rev. 2008, vol. 37, 1395-401)와 같은 공개적으로 이용 가능한 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램을 사용하여 단백질 서열에서 이러한 APR을 확인할 수 있다.

아미노산 서열 내에 APR을 포함하는 관심 있는 단백질과 상기 APR에 상응하는 β-응집 서열을 포함하는 간섭제 분자 사이의 접촉 시, 특정 β-시트 상호작용 및 공-응집이 상기 간섭제와 관심 있는 단백질 사이에 발생하여, 관심 있는 단백질의 용해도 감소 및 응집체 또는 봉입체 내로의 이의 격리, 및 결과적으로 관심 있는 상기 단백질의 생물학적 기능의 효과적인 하향조절 또는 넉다운을 유발한다는 것이 국제 특허출원 공개 제WO2007/071789호(A1) 및 제WO2012/123419호(A1)에서 제안되었다.

본 발명은 인간 RAS 단백질의 G12 또는 G13에서의 특정 미스센스 돌연변이가 인간 RAS 단백질의 β-응집 성향 영역(APR)의 프로파일을 변경한다는 예상치 못한 발견에 적어도 부분적으로 기반하고, 이러한 발견은 이러한 돌연변이체 RAS 단백질을 특이적으로 표적화하는 신규 분자를 디자인하는 데 성공적으로 활용될 수 있다.

특히, 인간 RAS 단백질은 적어도 5개 아미노산의 5개 APR 영역을 함유할 것으로 예측된다(표 6 참조). 최외각 N-말단 APR(TEYKLVVVGAG, 서열번호 1)은 야생형 단백질에서 G12(밑줄로 표시됨)에 의해 C-말단의 경계가 정해진다. 그러나, 특히 G12V, G12C, G12A 또는 G12S와 같은 특정 G12 미스센스 돌연변이는 각각의 RAS 돌연변이체의 APR이 위치 12의 돌연변이된 잔기뿐만 아니라 추가로 하나 이상의 후속 잔기도 포함하도록 이 APR을 확장한다. 또한, 특히 G13V, G13C 또는 G13S와 같은 특정 G13 미스센스 돌연변이는 각각의 RAS 돌연변이체의 APR이 위치 12의 글리신뿐만 아니라, 추가로 위치 13의 돌연변이된 잔기 및 임의로 하나 이상의 후속 잔기도 포함하도록 이 APR을 확장한다.

따라서, 이 APR은 위치 2 내지 15에 걸쳐 있고 G12V RAS 돌연변이체에서 서열 TEYKLVVVGAVGVG(서열번호 2)를 표시하고; 위치 2 내지 14에 걸쳐 있고 G12C RAS 돌연변이체에서 서열 TEYKLVVVGACGV(서열번호 3)를 표시하고; 위치 2 내지 14에 걸쳐 있고 G12A RAS 돌연변이체에서 서열 TEYKLVVVGAAGV(서열번호 4)를 표시하고; 위치 2 내지 13에 걸쳐 있고 G12S RAS 돌연변이체에서 서열 TEYKLVVVGASG(서열번호 5)를 표시할 것으로 예측된다. 추가로, 인간 RAS의 G12에서의 적어도 일부 돌연변이, 특히 G12V 돌연변이는 또한 상응하는 APR의 예측된 응집 성향을 유의미하게 증가시킨다. 예를 들어, TANGO 알고리즘은 서열번호 1로 기재된 야생형 APR에 대해 약 20%의 응집 점수를 예측하나, 서열번호 2로 기재된 G12V RAS 돌연변이체의 APR에 대해 거의 41%의 응집 점수를 예측한다. 또한, 이 APR은 위치 2 내지 14에 걸쳐 있고 G13C RAS 돌연변이체에서 서열 TEYKLVVVGAGCV(서열번호 81)를 표시하고; 위치 2 내지 15에 걸쳐 있고 G13V RAS 돌연변이체에서 서열 TEYKLVVVGAGVVG(서열번호 82)를 표시하고; 위치 2 내지 13에 걸쳐 있고 G13S RAS 돌연변이체에서 서열 TEYKLVVVGAGS(서열번호 83)를 표시할 것으로 예측된다. 추가로, 인간 RAS의 G13에서의 적어도 일부 돌연변이, 예컨대, 특히 G13V 돌연변이는 또한 상응하는 APR의 예측된 응집 성향을 유의미하게 증가시킨다. 예를 들어, TANGO 알고리즘은 서열번호 1로 기재된 야생형 APR에 대해 약 20%의 응집 점수를 예측하나, 서열번호 82로 기재된 G13V RAS 돌연변이체의 APR에 대해 거의 41%의 응집 점수를 예측한다.

본 발명자들은 광범위한 실험을 수행하여, G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질과 야생형 RAS에서 예측된 N-말단 최외각 APR들 사이의 이 차이가 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질에서 발견된 APR을 특이적으로 표적화하고 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질을 하향조절할 수 있으나 야생형 RAS를 실질적으로 하향조절할 수 없는 β-응집 서열(들)을 포함하는 분자를 디자인할 수 있게 함을 입증한다.

따라서, 한 측면은 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질(또는 달리 표현하면, G12 또는 G13에서 돌연변이된 인간 RAS 단백질, 또는 여전히 상이하게는 위치 12의 글리신 또는 위치 13의 글리신이 돌연변이된 인간 RAS 단백질)과 분자간 베타-시트를 형성하고 야생형 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 실질적으로 형성하지 않도록 구성된 비천연 생성 분자를 제공한다. 분자간 β-시트 형성을 위해 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질을 특이적으로 표적화하는 이러한 분자의 능력은 구체적으로 예를 들어, 적절한 시험관내, 세포 배양 또는 생체내 환경에서 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질을 하향조절하고/하거나, 이 단백질의 용해도를 감소시키고/시키거나, 이 단백질의 응집 또는 봉입체 형성을 유도하되, 야생형 RAS에 실질적으로 영향을 미치지 않는 상기 분자의 능력으로서 나타날 수 있다.

추가 측면은 의학에 사용하기 위한 본원에 교시된 임의의 분자를 제공한다.

추가 측면은 인간 RAS 단백질의 G12 또는 G13 돌연변이에 의해 야기되거나 이 돌연변이와 관련된 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본원에 교시된 임의의 분자를 제공한다.

관련 측면은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 본원에 교시된 임의의 분자를 치료 유효량으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

추가 측면은 본원에 교시된 임의의 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 분자가 예를 들어, 인간 RAS의 표적화된 APR과 비인간 RAS의 상응하는 APR 사이의 허용 가능한 정도의 서열 동일성으로 인해, 비인간 돌연변이체 RAS 분자(예컨대, 다른 진핵생물, 특히 효모, 진균 또는 동물, 보다 구체적으로 동물, 훨씬 더 구체적으로 온혈 동물, 보다 구체적으로 포유동물, 예컨대, 가축, 농장 동물, 스포츠 동물 또는 반려동물의 RAS 분자)를 표적화할 수 있는 한, 상기 분자는 인간에 대해 본원에 기재된 바와 유사하게 비인간 동물에서도 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본원에서 고려되는 의학적 중재시술 및 약학 조성물은 수의학적 치료 및 수의학적 용도를 위한 조성물도 포함할 수 있다. 동일한 이유로, 본 분자는 인간 세포 또는 조직뿐만 아니라 비인간 세포 또는 조직 및 비인간 동물에서도 다양한 시험관내, 세포내(in cellulo) 또는 생체내 적용(예를 들어, 진단, 영상화, 세포 또는 비인간 동물 모델에서의 사용, 연구 수단 사용 등)에 적합할 수 있다. 따라서, 돌연변이체 RAS를 발현하는, 예를 들어, 내생적 또는 외생적으로 발현하는 세포(예를 들어, 인간 또는 비인간 세포)에서 돌연변이체 RAS의 양 또는 생물학적 활성을 하향조절하는 시험관내 방법으로서, 상기 세포를 본원에 교시된 RAS 표적화 펩트-인(pept-in) 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(폴리펩타이드 펩트-인에 대한 이용 가능한 대안)와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법도 제공한다. 따라서, 돌연변이체 RAS를 발현하는, 예를 들어, 내생적 또는 외생적으로 발현하는 비-인간 유기체에서 돌연변이체 RAS의 양 또는 생물학적 활성을 하향조절하는 방법으로서, 본원에 교시된 RAS 표적화 펩트-인 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 상기 유기체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.

본 발명의 이들 측면과 추가 측면 및 바람직한 실시양태는 하기 단락들 및 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 첨부된 청구범위의 보호대상은 본 명세서에 구체적으로 포함된다.

도 1은 NCI-H441 종양 세포주 배양물에 대한 본 발명의 특정 실시양태에 따른 RAS 표적화 분자('펩트-인')의 스크린을 예시한다. (A) 부착 생장(2D) NCI-H441 세포에 대한 RAS 표적화 펩트-인의 일회 용량(25 μM) 스크린. 시험 화합물에 노출된 지 4일 후에 생존율을 평가하고 비히클 조건(30 mM 요소)으로 정규화하였다. (B) 현탁 스페로이드(spheroid) 배양물(3D)로서 생장하는 NCI-H441 세포에 대한 RAS 표적화 펩트-인의 일회 용량(25 μM) 스크린. 시험 화합물에 노출된 지 5일 후에 생존율을 평가하고 비히클 조건(30 mM 요소)으로 정규화하였다. NT: 시험되지 않음. 오차 막대는 SD를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 특정 실시양태에 따른 RAS 표적화 분자('펩트-인') 및 음성 대조군의 용량-반응 및 IC₅₀ 측정을 예시한다. 부착 생장(2D) NCI-H441 세포에서 최고 용량으로서 50 μM부터 시작하는 1/2 연속 희석을 이용하여 5점 용량-반응으로 펩트-인을 시험하였다. 시험 화합물에 노출된 지 3일 후에 생존율을 평가하고 비히클 조건으로 정규화하였다. 오차 막대는 SD를 나타낸다.
도 3은 현탁 스페로이드 배양물에 대한 본 발명의 특정 실시양태에 따른 RAS 표적화 분자('펩트-인')의 IC₅₀을 예시한다. 현탁 스페로이드 배양물에 대한 RAS 표적화 펩트-인의 중앙값 IC₅₀을 보여주는 폭포 플롯. 상이한 KRAS 돌연변이를 가진 한 세트의 세포주의 스페로이드 현탁 배양물에서 최고 용량으로서 50 μM부터 시작하는 1/2 연속 희석을 이용하여 5점 용량-반응으로 펩트-인을 시험하였다. 시험 화합물에 노출된 지 5일 후에 생존율을 평가하였다. 오차 막대는 적용 가능한 경우 중앙값에 대한 SD를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 특정 실시양태에 따른 RAS 표적화 분자('펩트-인')에 대한 동역학 착색 응집 어세이를 예시한다. 아밀로이드 응집체 센서 염료인 티오플라빈(Thioflavin) T(ThT; 하단 패널) 및 오량체성 포르밀 티오펜 아세트산(p-FTAA, 상단 패널)을 사용하여 동역학 착색 어세이를 수행함으로써, RAS 표적화 펩트-인의 응집 거동을 연구하였다. 모든 4종의 생물학적 활성 펩트-인들이 두 염료의 사용 시 명확한 아밀로이드 응집 동역학을 보인 반면, 불활성 대조군은 유의미한 ThT 신호를 보이지 않았고 시간 경과에 따라 p-FTAA 신호의 약간의 증가만을 보였다.
도 5는 본 발명의 특정 실시양태에 따른 RAS 표적화 분자('펩트-인')에 의한 KRAS G12V의 시딩을 예시한다. 다양한 KRAS 표적화 펩트-인들의 말기 단계 응집체(왼쪽 패널) 또는 초음파처리된 시드(오른쪽 패널)를 사용하여 재조합 천연 KRAS G12V 단백질의 시딩 실험을 수행하였다. 이를 위해, 펩트-인이 22시간 동안 응집될 수 있게 하였다. 말기 단계 샘플을 재조합 KRAS G12V와 혼합하고 ThT를 사용하여 응집을 동역학적으로 모니터링하였다. 이 접근법은 KRAS G12V에 대한 이 말기 단계 펩트-인 응집체의 약한 시딩 능력만을 보여주었다. 그러나, 초음파처리를 통해 성숙 응집체가 파괴될 때, KRAS G12V의 응집을 효율적으로 유도하는 강력한 시드가 형성된다.
도 6은 본 발명의 특정 실시양태에 따른 RAS 표적화 분자('펩트-인')의 표적 선택성을 보여주는 시험관내 번역 어세이를 예시한다. 바이오티닐화된 RAS 표적화 펩트-인의 존재 하에 야생형 또는 상이한 돌연변이체 KRAS를 생성하는 시험관내 번역 어세이. 스트렙타비딘 풀-다운(pull-down)을 이용하여 번역 반응으로부터 바이오티닐화된 펩트-인을 포획하였고, 웨스턴 블롯을 이용하여 KRAS에 대해 풀-다운 분획을 프로빙하였다. 야생형 APR로부터 유래한 APR 윈도우 서열을 보유하는 펩트-인 04-004-N001의 바이오티닐화된 버전, 즉 04-004-N011은 RAS 단백질의 돌연변이 상태와 무관하게 모든 RAS 단백질들을 표적화할 것으로 예측된다. 04-004-N001에 의한 효율적인 풀-다운은 실제로 KRAS 야생형, G12V 및 G12C에 대해 관찰되었지만, G12D 및 G13D 돌연변이체에의 결합은 덜 효율적인 것으로 보였다. 그러나, G12V 돌연변이체 부위를 함유하는 APR 윈도우를 보유하는 생물학적 활성 펩트-인의 바이오티닐화된 버전(04-006-N007, 04-015-N026 및 04-033-N003)을 사용하였을 때 G12V 돌연변이체 KRAS에 대한 풀-다운만이 관찰되었고, 04-015-N026의 경우 G12C 돌연변이체 KRAS에 대한 풀-다운이 관찰되었다.
도 7은 본 발명의 특정 실시양태에 따른 RAS 표적화 분자('펩트-인')에 의한 표적 맞물림을 보여주는 세포 공-면역침전 어세이를 예시한다. 공-면역침전 어세이를 이용하여 바이오티닐화된 펩트-인의 세포 표적 맞물림을 평가하였다. NCI-H441 세포를 25 μM 바이오티닐화된 펩트-인으로 하룻밤 동안 처리한 후, 스트렙타비딘 코팅 비드를 사용하여 용해물로부터 펩트-인을 면역침전시켰다. 웨스턴 블롯을 이용하여 KRAS에 대해 침전된 분획을 프로빙하였다. 이 접근법은 비히클 또는 음성 대조군 펩타이드 처리 조건으로부터의 침전된 분획에서 검출 가능한 KRAS 단백질을 제공하지 않았지만, KRAS 단백질은 생물학적 활성 펩트-인으로 처리된 NCI-H441 세포로부터의 침전된 분획에서 용이하게 검출되었다.
도 8은 본 발명의 특정 실시양태에 따른 mCherry-표지된 KRAS와 FITC-표지된 RAS 표적화 분자('펩트-인') 사이의 세포 공-국소화를 예시한다. mCherry 태그가 부착된 KRAS G12V를 과다발현하는 HeLa 세포를 펩트-인 04-015-N001의 RAS 표적화 FITC-표지된 버전(04-015-N032)으로 처리하고 펩트-인에 처음 노출시킨 지 75분 후에 영상화하였다. mCherry-표지된 KRAS는 FITC 및 mCherry 둘 다에 대한 양성을 나타내는 봉입체 유사 핵주위 구조물의 생성에 의해 확인된 바와 같이 펩트-인과 회합한다(흰색 화살표).
도 9는 본 발명의 특정 실시양태에 따른 RAS 표적화 분자('펩트-인')가 KRAS 단백질의 용해도 및 총 수준을 낮춘다는 것을 예시한다. NCI-H441 세포를 IC₅₀에 가까운 용량(12.5 μM)과 2XIC₅₀에 가까운 용량(25 μM)으로 24시간 동안 처리하였다. 용해물의 불용성 단백질을 원심분리로 수집하고 가용성 단백질 분획 및 불용성 단백질 분획 둘 다를 웨스턴 블롯에서 KRAS에 대해 프로빙하였다. 이 분석은 모든 생물학적 활성 RAS 표적화 펩타이드들이 불용성 분획에서 KRAS의 퍼센트를 용량 의존적으로 증가시킨 반면, 불용성 KRAS의 퍼센트가 비히클 처리 샘플과 음성 대조군 펩타이드 처리 샘플 사이에 필적할만함을 보여주었다(A). 이 샘플들에서 총 KRAS 수준(즉, 각각의 처리에 대한 가용성 분획 및 불용성 분획의 KRAS 수준의 합계)의 정량은 총 KRAS 수준도 생물학적 활성 RAS 표적화 펩트-인으로 처리된 샘플에서 용량 의존적으로 감소되었음을 보여주었다(B).
도 10은 RASless MEF 패널을 사용하여 돌연변이체 선택적 세포 효능을 예시한다. 내생성 KRAS, HRAS 및 NRAS의 부재 하에 야생형(WT), 돌연변이체 G12V 또는 G12C KRAS, 또는 V600E 돌연변이체 BRAF를 발현하는 RASless MEF의 패널에 대한 표시된 RAS 표적화 펩트-인의 효능을 평가하는 적어도 3회의 독립적인 실험으로부터 평균 ± SD 및 개별 어세이 IC₅₀을 보여주는 그래프.
도 11은 본 발명의 특정 실시양태에 따른 RAS 표적화 분자('펩트-인')에 의한 표적 맞물림을 보여주는 세포 공-면역침전 어세이를 예시한다. 공-면역침전 어세이를 이용하여 바이오티닐화된 펩트-인의 세포 표적 맞물림을 평가하였다. KRAS 야생형 또는 돌연변이체 G12V 발현 RASless MEF. RASless MEF 기반 어세이에서, 블롯은 04-004 유래의 바이오티닐화된 펩트-인이 야생형 및 돌연변이체 G12V KRAS 둘 다를 잘 침전시켰음을 보여준다. 그러나, G12V 선택적 펩트-인의 바이오티닐화된 버전은 G12V 돌연변이체 KRAS 단백질에의 우선적인 결합을 보여준다.
도 12는 RAS 표적화 펩트-인으로 처리할 때 세포 사멸 및 단백질 응집을 프로빙하는 유세포분석 어세이를 예시한다. NCI-H441 폐 선암종 세포를 6시간, 16시간 또는 24시간 동안 표시된 RAS 표적화 펩트-인 및 대조군 조건으로 처리하였다. 처리 후, 세포를 회수하고 세포 사멸(사이톡스™ 블루(Sytox™ Blue)) 및 단백질 응집(아미트랙커™ 레드(Amytracker™ Red))에 대해 염색한 다음, 유세포분석기에서 분석하였다. 산점도는 Y 축 상에 사이톡스 블루 강도를 보여주고 X 축 상에 아미트랙커 레드 강도를 보여준다. Hpt: 처리 후 시간. 아미트랙커 레드 신호의 증가에 의해 입증된 바와 같이, 대조군 조건만을 제외한 모든 RAS 표적화 펩트-인을 사용한 처리는 단백질 응집을 유도하였다. 더욱이, 이 응집 증가는 사이톡스 블루에서의 더 느리지만 동시적인 증가에 의해 표시된 바와 같이 세포 사멸을 야기하는 것으로 보인다.
도 13은 RAS 표적화 펩트-인이 KRAS G12V 돌연변이체 암의 이종이식편 모델에서 종양 성장을 감소시킴을 예시한다. 인간 KRAS G12V 돌연변이체 대장암의 이종이식편 모델인 SW620을 사용하여, RAS 표적화 펩트-인의 생체내 투여가 종양 성장을 감소시키는지를 평가하였다. 일단 종양이 100 내지 150 mm³에 도달하면, 20 또는 200 ㎍의 펩트-인을 종양내 주사로 주당 3회 투여하였다. 100 mg/kg의 이리노테칸을 3주 동안 주당 1회 제공받은 양성 대조군으로 모델 반응을 모니터링하였다. 군 크기는 비치료 군의 경우 N=6, 비히클 군의 경우 N=5, 및 펩트-인 군과 양성 대조군의 경우 N=8이었다. 그래프는 치료 시작 후 22일째 날 종양 부피의 상자 플롯을 보여준다. 표시된 그래프는 일원 ANOVA로 04-004-N001(200 ㎍ 투여 군) 및 04-015-N001(20 g 및 200 g 투여 군)에 대한 종양 부피의 유의미한 감소를 입증한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 단수 형태는 단수 지시대상 및 복수 지시대상 둘 다를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "포함하는", "포함한다" 및 "로 구성된"은 "포괄하는", "포괄한다" 또는 "함유하는", "함유한다"와 동의어이며, 포괄적이거나 제한이 없고 추가 언급되지 않은 구성원, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 이 용어들은 특허 전문용어에서 잘 확립된 의미를 가진 "로 구성된" 및 "본질적으로 …로 구성된"도 포괄한다. 다시 말해, 용어 "본질적으로 …로 구성된"의 경우, 추가 예시로서, 분자가 본질적으로 구조적 요소 A-B-C로 구성된 것으로 언급되는 경우, 상기 분자는 반드시 나열된 요소를 포함할 것이고 분자의 기본 성질 및 신규 성질에 실질적으로 영향을 미치지 않는 나열되지 않은 구조적 요소도 함유하도록 개방되어 있을 것이다. 따라서, 요소 A-B-C가 특히 분자와 주어진 표적의 상호작용 또는 주어진 표적에 대한 분자의 효과를 용이하게 함으로써 분자의 작동 부분 또는 원리를 형성하는 경우, 용어 "본질적으로 …로 구성된"은 분자에서 상기 요소 A-B-C의 존재를 보장할 것이고, 분자와 상기 표적의 상호작용에 실질적으로 영향을 미치지 않는 나열되지 않은 요소의 존재도 허용할 것이다.

종점에 의한 수치 범위의 인용은 인용된 종점뿐만 아니라, 각각의 범위 내에 포함된 모든 숫자와 분수도 포함한다. 이것은 수치 범위가 표현 "… 내지 …" 또는 표현 "…와 … 사이" 또는 또 다른 표현에 의해 도입되는지와 관계없이 수치 범위에 적용된다.

측정 가능한 값, 예컨대, 파라미터, 양, 시간적 지속기간 등을 언급할 때 본원에서 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 특정된 값으로부터의 변동, 예컨대, 특정된 값으로부터의 +/-10% 이하, 바람직하게는 +/-5% 이하, 보다 바람직하게는 +/-1% 이하, 훨씬 더 바람직하게는 +/-0.1% 이하의 변동을 포괄하기 위한 것이되, 단 이러한 변동은 개시된 발명에서 수행하기에 적절해야 한다. 구체적으로 및 바람직하게는, 수식어 "약" 또는 "대략"이 언급하는 값 자체도 개시되어 있음을 이해해야 한다.

용어 "하나 이상" 또는 "적어도 하나", 예컨대, 구성원 군의 하나 이상의 구성원 또는 적어도 하나의 구성원은 그 자체로 명확한 반면, 추가 예시로서, 이 용어는 특히 상기 구성원 중 어느 한 구성원, 또는 상기 구성원 중 임의의 2개 이상의 구성원, 예를 들어, 상기 구성원 중 임의의 ≥3개, ≥4개, ≥5개, ≥6개 또는 ≥7개 등의 구성원 및 최대 모든 상기 구성원의 언급을 포괄한다. 또 다른 예에서, "하나 이상" 또는 "적어도 하나"는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 이상을 의미할 수 있다.

본원에서 본 발명에 대한 배경의 논의는 본 발명의 맥락을 설명하기 위해 포함된다. 이것은 언급된 임의의 자료가 청구범위의 임의의 청구항의 우선일을 기준으로 임의의 국가에서 공개되었거나, 알려졌거나, 공통 일반 지식의 일부이었음을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

본 개시내용 전체에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서는 식별 인용에 의해 언급된다. 본 명세서에 인용된 모든 문헌은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다. 특히, 본원에 구체적으로 언급된 이러한 문헌의 교시 또는 단락은 참고로 포함된다.

달리 정의되지 않는 한, 기술 및 과학 용어를 포함하는, 본 발명을 개시하는데 사용된 모든 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 추가 지침으로서, 용어 정의는 본 발명의 교시를 더 잘 이해하기 위해 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 특정 용어가 본 발명의 특정 측면 또는 본 발명의 특정 실시양태와 관련하여 정의될 때, 이러한 함축 또는 의미는 본 명세서 전체에 걸쳐, 즉 본 발명의 다른 측면 또는 실시양태의 맥락에도 적용되기 위한 것이다.

하기 구절에서, 본 발명의 상이한 측면 또는 실시양태가 더 상세히 정의된다. 반대로 명시되어 있지 않은 한, 이와 같이 정의된 각각의 측면 또는 실시양태는 임의의 다른 측면(들) 또는 실시양태(들)와 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로서 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로서 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.

본 명세서 전체에서 "한 실시양태", "하나의 실시양태"의 언급은 실시양태와 관련하여 기재된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 다양한 곳에서 어구 "한 실시양태" 또는 "하나의 실시양태"의 출현은 반드시 모두 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니지만, 그럴 수도 있다. 더욱이, 본 개시내용으로부터 당분야에서 숙련된 자에게 자명할 바와 같이, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 나아가, 당업자가 이해할 바와 같이, 본원에 기재된 일부 실시양태가 다른 실시양태에 포함된 일부 특징을 포함하되, 다른 특징을 포함하지 않지만, 상이한 실시양태의 특징의 조합은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 여겨지고 상이한 실시양태를 형성한다. 예를 들어, 첨부된 청구범위에서, 청구된 실시양태들 중 임의의 실시양태가 임의의 조합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 특정 대표적인 실시양태를 예시하는 실험 단락에 의해 확증된 바와 같이, 본 발명자들은 위치 12 또는 위치 13의 특정 미스센스 돌연변이, 예컨대, G12V, G12C, G12A 또는 G12S RAS 돌연변이, 또는 G13V, G13C 또는 G13S RAS 돌연변이로 인해 돌연변이체 인간 RAS 단백질에서 생성된 β-응집 성향 영역(APR)을 특이적으로 표적화하도록 디자인된 하나 이상의 β-응집 서열을 포함하는 분자의 치료 잠재력을 최초로 개시하고 입증한다. 특히, 본 발명은 야생형 RAS의 G12 또는 G13이 다른 잔기로 미스센스 돌연변이된 결과로서, 야생형 인간 RAS의 위치 2 내지 12에서 예측된 APR이 변경된다는, 예컨대, C-말단에서 하나 이상의 아미노산에 의해 연장되고/되거나 증가된 예측 응집 성향을 나타낼 수 있다는 사실을 이용한다.

G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질에서 이러한 변경된 APR 프로파일의 존재를 인식한 본 발명자들은 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질을 하향조절할 수 있게 하는 분자간 β-시트 상호작용을 위해, G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질의 변경된 APR을 특이적으로 표적화하되, 야생형 RAS의 상응하는 비변경 APR을 특이적으로 표적화하지 않음으로써 이 차이를 이용하는 분자를 연구하였고 본원에 교시한다. 임의의 가설 또는 이론으로 제한되고자 하지 않지만, 본원에 제시된 데이터는 이 하향조절이 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질과의 특이적 공-응집을 유도하는 분자의 능력에 기인할 가능성이 있음을 암시하고, 이 능력은 이러한 단백질의 용해도를 감소시키고 이러한 단백질을 응집체 또는 봉입체(세포 기구에 의해 분해될 수 있음) 내에 격리시키고, 사실상 세포내 신호전달에 이용될 수 있는 상태로 남아있는 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질의 양을 감소시킨다. 일단 분자가 그의 표적 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질의 응집을 유도하거나 시작하면, 이로써 응집된 RAS는 그 자체가 응집체 내로의 추가 가용성 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질의 봉입을 용이하게 하거나 유도하는 능력을 획득할 수 있다. 즉, 기존 RAS 응집체는 상기 단백질의 추가 응집 및 응집체의 성장을 위한 '시드'로서 작용할 수 있다. 상기 분자는 야생형 RAS와의 공-응집 및 야생형 RAS의 하향조절의 필적할만 또는 동등한 유도를 나타내지 않는다. 이것은 예를 들어, 일부 분자간 β-시트 형성이 분자와 야생형 RAS 사이에 발생하더라도, 이의 결과가 비교적 무시할만할 것이고 분자가 야생형 RAS를 관찰 가능할 정도로 하향조절하지 않을 것이거나 이러한 하향조절이 야생형 RAS에 의한 세포내 신호전달을 해롭게 감소시킬 정도까지 야생형 RAS를 하향조절하지 않을 것임을 의미할 수 있다.

따라서, 한 측면은 위치 12에서 돌연변이된 인간 RAS 단백질(이하, G12 돌연변이체 인간 RAS 단백질) 또는 위치 13에서 돌연변이된 인간 RAS 단백질(이하, G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질)과 분자간 베타-시트를 형성하고 야생형 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 실질적으로 형성하지 않도록 구성된 비천연 생성 분자를 제공한다. 분자간 β-시트 형성을 위해 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질을 특이적으로 표적화하는 이러한 분자의 능력은 예를 들어, 적절한 시험관내, 세포 배양 또는 생체내 환경에서 특히 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질을 하향조절하고/하거나, 이 단백질의 용해도를 감소시키고/시키거나, 이 단백질의 응집 또는 봉입체 형성을 유도하되, 야생형 RAS에 실질적으로 영향을 미치지 않는 분자의 능력으로서 나타날 수 있다.

앞서 언급된 분자의 정의는 편리하고 유의미하게는 분자가 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질을 특이적으로 하향조절하지만, 야생형 RAS를 하향조절하지 않는다는 관찰의 기초가 되는 것으로 간주되는 분자 기작(야생형 RAS에 비해 분자와 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질 사이의 분자간 베타-시트의 선택적 또는 우선적 형성)에 초점을 맞출 수 있는 반면, 다른 대안적 정의가 채택될 수 있다. 예를 들어, 이러한 정의 중 하나는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질과 함께 분자간 베타-시트를 형성하도록 구성된 비천연 생성 분자를 지칭할 수 있고, 이때 상기 분자는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 용해도를 감소시킬 수 있거나, 이러한 단백질의 응집 또는 봉입체 형성을 유도할 수 있고, 야생형 인간 RAS 단백질에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 또 다른 이러한 정의는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 형성하도록 구성된 비천연 생성 분자로 읽을 수 있으며, 이때 상기 분자는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 활성을 하향조절할 수 있거나 감소시킬 수 있고, 야생형 인간 RAS 단백질에 실질적으로 영향을 미치지 않는다.

본 발명의 원리를 구현하는 특정 분자는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질을 하향조절할 수 있고/있거나, 이 단백질의 용해도를 감소시킬 수 있고/있거나, 이 단백질의 응집 또는 봉입체 형성을 유도할 수 있고 야생형 RAS 단백질에 실질적으로 영향을 미치지 않는 비천연 생성 분자로서도 기재될 수 있고, 이때 상기 분자는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 β-응집 성향 영역(APR)에 대한 β-응집 서열을 포함하고, 상기 APR은 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 위치 12 또는 13에서 돌연변이된 아미노산을 포함한다. 본 발명의 원리를 구현하는 특정 분자는 G12 돌연변이체 인간 RAS 단백질을 하향조절할 수 있고/있거나, 이 단백질의 용해도를 감소시킬 수 있고/있거나, 이 단백질의 응집 또는 봉입체 형성을 유도할 수 있고 야생형 인간 RAS 단백질에 실질적으로 영향을 미치지 않는 비천연 생성 분자로서도 기재될 수 있고, 이때 상기 분자는 각각의 서열의 위치 11의 아미노산을 포함하는, 아미노산 서열 a) TEYKLVVVGAVGVG(서열번호 2); 또는 b) TEYKLVVVGACGVG(서열번호 6) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGACGV(서열번호 3); 또는 c) TEYKLVVVGAAGVG(서열번호 7) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAAGV(서열번호 4); 또는 d) TEYKLVVVGASGVG(서열번호 8) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGASGV(서열번호 9) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGASG(서열번호 5)의 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 β-응집 서열을 포함한다. 본 발명의 원리를 구현하는 특정 분자는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질을 하향조절 수 있고/있거나, 이 단백질의 용해도를 감소시킬 수 있고/있거나, 이 단백질의 응집 또는 봉입체 형성을 유도할 수 있고 야생형 인간 RAS 단백질에 실질적으로 영향을 미치지 않는 비천연 생성 분자로서도 기재될 수 있고, 이때 상기 분자는 각각의 서열의 위치 12의 아미노산을 포함하는, 아미노산 서열 a) TEYKLVVVGAGCVG(서열번호 84) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGCV(서열번호 81); 또는 b) TEYKLVVVGAGVVG(서열번호 82); 또는 c) TEYKLVVVGAGSVG(서열번호 85) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGSV(서열번호 86) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGAGS(서열번호 83)의 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 β-응집 서열을 포함한다.

추가 측면은 특히, 의학에 사용하기 위한 본원에 교시된 임의의 분자; 인간 RAS 단백질의 G12 또는 G13 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본원에 교시된 임의의 분자; 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 본원에 교시된 임의의 분자를 치료 유효량으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법뿐만 아니라; 본원에 교시된 임의의 분자를 포함하는 약학 조성물도 제공한다.

용어 "비천연 생성"은 일반적으로 자연에 의해 형성되지 않거나 자연에 존재하지 않는 물질 또는 독립체를 의미한다. 이러한 비천연 생성 물질 또는 독립체는 본원에 기재되어 있거나 당분야에 공지되어 있는 방법을 이용함으로써 사람에 의해 제조될 수 있거나, 반합성될 수 있거나, 변형될 수 있거나, 개재될 수 있거나 조작될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드와 관련하여 사용될 때 상기 용어는 특히 동일한 아미노산 서열의 펩타이드가 자연에서 발견되지 않음을 의미할 수 있거나, 동일한 아미노산 서열의 펩타이드가 자연에 존재하는 경우, 비천연 생성 펩타이드가 천연 생성 대응물에 포함되지 않아 천연 생성 대응물로부터 비천연 생성 펩타이드를 구별하는 하나 이상의 추가 구조적 요소, 예컨대, 화학 결합, 변형 또는 모이어티를 포함함을 의미할 수 있다. 특정 실시양태에서, 펩타이드와 관련하여 사용될 때 상기 용어는 비천연 생성 펩타이드의 아미노산 서열이 천연 생성 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 의해 포괄되는 연속 아미노산의 스트레치와 동일하지 않음을 의미할 수 있다. 의심의 여지를 피하기 위해, 비천연 생성 펩타이드는 전체 펩타이드보다 더 짧은 아미노산 스트레치를 완벽하게 함유할 수 있고, 이때 특히 그의 서열을 포함하는 아미노산 스트레치의 구조는 천연 생성 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에서 발견되는 연속 아미노산 스트레치와 동일하다.

본 개시내용의 맥락에서, 어구 "하도록 구성된 분자"는 적절한 환경 하에 언급된 결과 또는 기능을 나타내는 임의의 분자를 포괄하기 위한 것이다. 따라서, 상기 어구는 "에 적합한 분자", "하는 능력을 가진 분자", "하도록 디자인된 분자", "에 알맞은 분자", "하도록 만들어진 분자" 또는 "할 수 있는 분자"와 같은 어구와 동의어이고 교환 가능한 것으로서 볼 수 있다.

용어 "베타-시트", "베타-주름 시트", "β-시트", "β-주름 시트"는 당분야에 잘 알려져 있고 더 설명하자면 골격 수소 결합(가닥간 수소 결합)에 의해 측면으로 연결된 2개 이상의 베타-가닥을 포함하는 분자 구조물을 교환 가능하게 지칭한다. 베타-가닥은 '지그재그' 궤적을 따라 거의 완전히 확장된 입체구조로 골격을 가진 전형적으로 3개 내지 10개 아미노산 길이의 아미노산 스트레치이다. 베타-시트의 인접 아미노산 쇄들은 반대 방향(역평행 β 시트) 또는 동일한 방향(평행 β 시트)으로 뻗어있을 수 있거나 혼합된 배열을 보일 수 있다. 베타-시트를 형성하지 않을 때(예를 들어, 베타-시트에 참여하기 전), 아미노산 스트레치는 비-베타-가닥 입체구조를 나타낼 수 있다; 예를 들어, 구조화되지 않은 입체구조를 가질 수 있다.

"분자간" 베타-시트는 2개 이상의 별개의 분자, 예컨대, 2개 이상의 별개의 펩타이드 또는 펩타이드 함유 분자, 폴리펩타이드 및/또는 단백질로부터의 베타-가닥을 포함한다. 본 개시내용의 맥락에서, 상기 용어는 구체적으로 하나 이상의 본원에 교시된 분자로부터의 하나 이상의 베타-가닥 및 하나 이상의 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질 분자로부터의 하나 이상의 베타-가닥을 포함하는 베타-시트를 의미한다. 분자간 베타-시트 형성에 의해 시딩된 공-응집이 본 본자의 작용 방식에서 중요한 역할을 하는 것으로 간주된다는 점을 고려할 때, 수십 개, 수백 개, 수천 개 또는 더 많은 수의 본원에 교시된 분자 및 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 분자는 기저 베타-시트 상호작용에 관여하여, 고차 조직화물 및 구조물, 예컨대, 원시섬유, 원섬유 및 응집체를 생성할 수 있다.

전형적으로, 베타-가닥은 베타-시트에 참여하는 분자, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 단지 일부에 의해(예를 들어, 연속 아미노산 스트레치에 의해) 형성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 교시된 분자는 하나 이상의 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질 분자의 연속 아미노산 스트레치로 구성된 하나 이상의 베타-가닥과 협력하여 베타-시트에 참여하는 베타-가닥으로 조직화되는 하나 이상의 연속 아미노산 스트레치를 포함할 수 있다. 다시 말해, 분자가 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 형성할 수 있다는 말은 전형적으로 분자의 하나 이상의 부분, 예컨대, 분자의 하나 이상의 연속 아미노산 스트레치가 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질 분자의 하나 이상의 연속 아미노산 스트레치와 함께 베타-시트에 참여할 수 있는 베타-가닥으로 조직화되도록 디자인된다는 것을 의미할 것이다. 따라서, 2개 이상의 별개의 분자로부터의 베타-가닥이 베타-시트로 서로 맞물리는 것은 2개 이상의 별개의 분자가 물리적으로 회합되거나 연결되게 되고 공간적으로 인접하게 되는 복합체를 생성할 수 있다. 상기 언급된 설명에 비추어 볼 때, 어구 "G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 형성하도록 구성된 분자"는 다음과 같은 의미도 포함할 수 있다: G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 연속 아미노산 스트레치와 함께 분자간 베타-시트의 생성에 참여할 수 있거나 기여할 수 있거나, 이러한 생성을 유도할 수 있는 분자; G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 연속 아미노산 스트레치와 함께 분자간 베타-시트의 생성에 참여할 수 있거나 기여할 수 있거나, 이러한 생성을 유도할 수 있는 부분을 포함하는 분자; 및 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 연속 아미노산 스트레치와 함께 분자간 베타-시트의 생성에 참여할 수 있거나 기여할 수 있거나, 이러한 생성을 유도할 수 있는 연속 아미노산 스트레치를 포함하는 분자.

RAS 단백질은 작은 GTPase 부류의 단백질에 속하며 당분야에서 잘 연구되어 있다. 3개의 인간 RAS 유전자가 기재되었다: Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자 상동체(KRAS)(미국 정부의 국립 생명공학 정보 센터(NCBI) Genbank 하에 주해됨(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 유전자 ID 번호 3845), 신경모세포종 RAS 바이러스 종양유전자 상동체(NRAS)(유전자 ID 번호 4893), 및 Harvey 래트 육종 바이러스 종양유전자 상동체(HRAS)(유전자 ID 번호 3265). KRAS 전사체의 대안적 RNA 스플라이싱은 C-말단 영역이 상이한 2개의 알려진 KRAS 동형체인 KRAS4A 및 KRAS4B로 이어진다.

인간 야생형 KRAS4A 동형체 아미노산 서열은 Genbank 수탁번호 NP_203524.1 또는 Swissprot/Uniprot(http://www.uniprot.org/) 수탁번호 P01116-1(v1) 하에 주해된 바와 같을 수 있고, 여기에 복사된 NP_203524.1 서열은 다음과 같다:

인간 야생형 KRAS4B 동형체 아미노산 서열은 Genbank 수탁번호 NP_004976.2 또는 Swissprot/Uniprot 수탁번호 P01116-2(v1) 하에 주해된 바와 같을 수 있고, 여기에 복사된 NP_004976.2 서열은 다음과 같다:

인간 야생형 NRAS 아미노산 서열은 Genbank 수탁번호 NP_002515.1 또는 Swissprot/Uniprot 수탁번호 P01111(v1) 하에 주해된 바와 같을 수 있고, 여기에 복사된 NP_002515.1 서열은 다음과 같다:

인간 야생형 HRAS 아미노산 서열은 Genbank 수탁번호 NP_005334.1 또는 Swissprot/Uniprot 수탁번호 P01112(v1) 하에 주해된 바와 같을 수 있고, 여기에 복사된 NP_005334.1 서열은 다음과 같다:

따라서, 특정 실시양태에서, RAS 단백질은 KRAS, NRAS 또는 HRAS 단백질일 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, RAS 단백질은 KRAS 단백질일 수 있다. 인간 암에서, KRAS는 우세하게 돌연변이된 RAS 동형체(85%)이다. 특히, 인간 KRAS, NRAS 및 HRAS의 아미노산 서열은 G12 및 G13 주변의 영역을 포함하는 위치 1 내지 86에서 기본적으로 동일하므로, 동일한 분자를 사용하여 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 KRAS, NRAS 및 HRAS 단백질을 표적화할 수 있다.

RAS 단백질과 관련하여 본원에서 사용된 수식어 "인간"은 특정 해석에서 RAS 단백질의 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 인간에서 발견되는 RAS 단백질로서 아미노산 서열을 가진 RAS 단백질은 기술적 수단, 예를 들어, 재조합 발현, 무세포 번역 또는 비-생물학적 펩타이드 합성에 의해 수득될 수도 있다. 본 분자는 인간에서 돌연변이체 RAS 단백질을 치료적으로 표적화하기 위한 것이기 때문에, 특정 다른 해석에서 수식어 "인간"은 보다 구체적으로 RAS 단백질이 인간 대상체, 장기, 세포 또는 조직의 일부를 형성하는지 아니면 인간 대상체, 장기, 세포 또는 조직으로부터 적어도 부분적으로 단리되는지와 관계없이 인간에서 발견되거나 인간에 존재하는 RAS 단백질을 지칭할 수 있다. 숙련된 자는 RAS 단백질과 같은 주어진 천연 단백질의 아미노산 서열이 동일한 종 내에서의 정상적인 유전적 다양성(대립유전자 변이, 다형성)으로 인해, 및/또는 전사 후 또는 번역 후 변형의 차이로 인해 동일한 종의 상이한 개체들 사이에 또는 상이한 개체들 내에서 상이할 수 있음을 이해한다. 천연 단백질의 임의의 이러한 변이체 또는 동형체는 단백질의 언급 또는 표기에 의해 포함된다.

본원에 교시된 분자는 분자간 베타-시트 형성을 유도함으로써 하향조절을 위해 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질을 선택적으로 표적화하지만, 야생형 RAS의 양 또는 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는다. 이 관점에서 볼 때, 용어 "야생형"은 인간 집단에서 가장 흔히 관찰되는 각각의 RAS 유전자의 대립유전자에 의해 코딩된 RAS 변이체의 통상적인 의미에 귀속될 수 있다. 용어 "야생형"은 증식성 또는 신생물성 질환의 원인이 되지 않거나 이 질환과 연관되지 않은 임의의 RAS 변이체의 표현형 지향적 의미, 또는 항시적으로 활성을 띠지 않는, 보다 구체적으로 GAP 매개 GTP 가수분해에 결함이 없는 임의의 RAS 변이체의 분자 기작 지향적 의미를 부여받을 수도 있다. G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질과 야생형 인간 RAS 단백질 사이에 즉시 인지할 수 있는 구별은 후자의 위치 12 및 13에 글리신 잔기가 존재한다는 것이다. 따라서, 예를 들어, 야생형 RAS 단백질은 위치 10 내지 14에서 서열 GAGGV(서열번호 23)를 표시할 수 있거나, 위치 8 내지 16에서 서열 VVGAGGVGK(서열번호 24)를 표시할 수 있거나, 위치 6 내지 18에서 서열 LVVVGAGGVGKSA(서열번호 25)를 표시할 수 있고, 이때 G12는 볼드체로 표시되어 있다. 따라서, 예를 들어, 야생형 RAS 단백질은 위치 11 내지 15에서 서열 AGGVG(서열번호 87)를 표시할 수 있거나, 위치 9 내지 17에서 서열 VGAGGVGKS(서열번호 88)를 표시할 수 있거나, 위치 7 내지 19에서 서열 VVVGAGGVGKSAL(서열번호 89)를 표시할 수 있고, 이때 G13은 볼드체로 표시되어 있다.

대조적으로, 본원에서 논의된 "G12 돌연변이체 인간 RAS"에서 위치 12의 글리신 잔기(G12)는 돌연변이되어 있다. G12가 글리신 이외의 정확히 하나의 아미노산으로 대체된 돌연변이체 RAS 단백질(G12 미스센스 돌연변이체 RAS)이 특히 의도된다. G12A, G12D, G12F, G12L, G12P, G12S, G12V, G12Y, G12C, G12E, G12I, G12N, G12R, G12T 및 G12W 미스센스 돌연변이를 포함하는, 인간 RAS의 G12를 사실상 모든 다른 아미노산으로 대체하는 미스센스 돌연변이가 질환에서 입증되었다(상기 문헌[Hobbs et al.]). G12Q, G12H, G12K 및 G12M 미스센스 돌연변이도 생각할 수 있다. 본원에서 논의된 "G13 돌연변이체 인간 RAS"에서 위치 13의 글리신 잔기(G13)는 돌연변이되어 있다. G13이 글리신 이외의 정확히 하나의 아미노산으로 대체된 돌연변이체 RAS 단백질(G13 미스센스 돌연변이체 RAS)이 특히 의도된다. G13A, G13D, G13F, G13M, G13P, G13S, G13Y, G13C, G13E, G13I, G13N, G13R 및 G13V 미스센스 돌연변이를 포함하는, 인간 RAS의 G13을 사실상 모든 다른 아미노산으로 대체하는 미스센스 돌연변이가 질환에서 입증되었다(상기 문헌[Hobb et al.]). G13L, G13W, G13H, G13K, G13Q 및 G13T 미스센스 돌연변이도 생각할 수 있다.

따라서, G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질, 특히 G12 또는 G13 미스센스 돌연변이체는 증식성 또는 신생물성 질환의 원인일 수 있거나 이 질환과 연관될 수 있고/있거나, 항시적 활성 RAS, 보다 구체적으로 GAP 매개 GTP 가수분해에 결함이 있는 RAS를 초래할 수 있다.

앞서 언급된 바와 같이, 본 발명자들은 특정 G12 또는 G13 미스센스 돌연변이가 야생형 RAS 단백질에서 일반적으로 G12를 포함하고 G12로 종결될 것으로 예측된 인간 RAS의 β-응집 성향 영역(APR)을 변경하고/하거나, 특히 확장하고/하거나(보다 구체적으로 1개 또는 여러 개의 아미노산을 C-말단에 추가함) APR의 응집 성향을 증가시킴을 인식하였다. 하전된 아미노산(예컨대, D, E, R, K 또는 H)의 포함 때문에, 프롤린(P)은 전형적으로 APR의 응집 성향을 방해하거나 감소시키고, 바람직하게는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질은 G12 또는 G13이 비하전 아미노산으로 대체되어 있는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질이다. 특정 바람직한 실시양태에서, G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질은 G12 또는 G13이 프롤린 이외의 소수성 아미노산, 예컨대, 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 페닐알라닌(F), 메티오닌(M) 및 트립토판(W)으로 대체되어 있는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질일 수 있다. 특정 실시양태에서, G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질은 G12 또는 G13이 극성 아미노산, 예컨대, 세린(S), 트레오닌(T), 시스테인(C), 아스파라긴(N), 글루타민(Q) 또는 티로신(Y)으로 대체되어 있는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질일 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질은 질환, 예컨대, 신생물성 질환에서 특히 우세하고 돌연변이가 상응하는 APR을 연장하는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질일 수 있다. 따라서, 특정 바람직한 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS 단백질은 G12V, G12C, G12A 또는 G12S 돌연변이체 인간 RAS 단백질, 예컨대, G12V, G12C, G12A 또는 G12S 돌연변이체 인간 KRAS, NRAS 또는 HRAS 단백질, 바람직하게는 G12V, G12C, G12A 또는 G12S 돌연변이체 인간 KRAS 단백질일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS 단백질은 G12V 돌연변이체 인간 RAS 단백질, 예컨대, G12V 돌연변이체 인간 KRAS, NRAS 또는 HRAS 단백질, 바람직하게는 G12V 돌연변이체 인간 KRAS 단백질일 수 있다. G12V 돌연변이는 상응하는 APR를 연장할 뿐만 아니라 이 APR의 예측된 응집 성향도 증가시킨다. 특정 바람직한 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질은 G13V, G13C 또는 G13S 돌연변이체 인간 RAS 단백질, 예컨대, G13V, G13C 또는 G13S 돌연변이체 인간 KRAS, NRAS 또는 HRAS 단백질, 바람직하게는 G13V, G13C 또는 G13S 돌연변이체 인간 KRAS 단백질일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질은 G13V 돌연변이체 인간 RAS 단백질, 예컨대, G13V 돌연변이체 인간 KRAS, NRAS 또는 HRAS 단백질, 바람직하게는 G13V 돌연변이체 인간 KRAS 단백질일 수 있다. G13V 돌연변이는 상응하는 APR을 연장할 뿐만 아니라 이 APR의 예측된 응집 성향도 증가시킨다.

용어 "단백질"은 일반적으로 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 거대분자를 포괄한다. 용어 "폴리펩타이드"는 일반적으로 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 선형 중합체 쇄를 포괄한다. "펩타이드 결합", "펩타이드 연결" 또는 "아미드 결합"은 한 아미노산의 카르복실 기가 다른 아미노산의 아미노 기와 반응하여 물 분자를 방출할 때 두 아미노산들 사이에 형성된 공유 결합이다. 특히, 단백질이 단일 폴리펩타이드 쇄로만 구성되는 경우, 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 이러한 단백질을 의미하기 위해 교환 가능하게 사용될 수 있다. 이 용어들은 폴리펩타이드 쇄의 임의의 최소 길이로 제한되지 않는다. 본질적으로 50개 이하(≤ 50개)의 아미노산, 예컨대, ≤ 45개, ≤ 40개, ≤ 35개, ≤ 30개, ≤ 25개, ≤ 20개, ≤ 15개, ≤ 10개 또는 ≤ 5개의 아미노산으로 구성되거나 이러한 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드 쇄는 통상적으로 "펩타이드"로서 표시될 수 있다. 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 맥락에서, "서열"은 아미노에서 카르복실 말단 방향으로 쇄에 있는 아미노산의 순서이고, 이때 서열에서 서로 이웃하는 잔기들은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 1차 구조에서 연속적이다. 상기 용어들은 천연적으로, 재조합적으로, 반합성적으로 또는 합성적으로 생성된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포괄할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 자연에 존재할 수 있거나 자연으로부터 단리될 수 있고, 예를 들어, 세포 또는 조직에 의해 천연적으로 또는 내생적으로 생성될 수 있거나 발현될 수 있고 임의로 이로부터 단리될 수 있거나; 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 재조합체일 수 있고/있거나, 즉 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있고/있거나, 부분적으로 또는 전체적으로 화학적 또는 생화학적으로 합성될 수 있다. 제한 없이, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 적합한 숙주 또는 숙주 세포 발현 시스템(예를 들어, 적합한 세균, 효모, 진균, 식물 또는 동물 숙주 또는 숙주 세포 발현 시스템)에 의해 재조합적으로 생성될 수 있고 임의로 이로부터 단리될 수 있거나, 무세포 번역 또는 무세포 전사와 번역, 또는 비-생물학적 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 합성에 의해 재조합적으로 생성될 수 있다. 상기 용어들은 폴리펩타이드 쇄(들)의 하나 이상의 공-발현 변형 또는 발현 후 변형, 예컨대, 제한 없이 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 아미드화, 인산화, 설폰화, 메틸화, 페길화(전형적으로 폴리에틸렌 글리콜과, 하나 이상의 Lys 잔기의 N-말단 또는 측쇄의 공유 부착), 유비퀴틴화, 수모일화, 시스테이닐화, 글루타티오닐화, 메티오닌 설폭사이드 또는 메티오닌 설폰으로의 메티오닌의 산화, 신호 펩타이드 제거, N-말단 Met 제거, 활성 형태로의 전구 효소 또는 전구 호르몬의 전환 등을 가진 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드도 포괄한다. 이러한 공-발현 또는 발현 후 변형은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 발현하는 숙주 세포에 의해 생체내에서 도입될 수 있거나(공-번역 또는 번역 후 단백질 변형 기구는 숙주 세포에 천연적으로 존재할 수 있고/있거나, 숙주 세포는 하나 이상의 (추가) 공-번역 또는 번역 후 단백질 변형 기능을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있음), 단리된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 화학적(예를 들어, 페길화) 및/또는 생화학적(예를 들어, 효소적) 변형에 의해 시험관내에서 도입될 수 있다. 제한 없이 예로서, 특정 실시양태에서 펩타이드의 전체 전하를 변경하고/하거나 생성된 펩타이드를 안정화하고 엑소펩티다제에 의한 효소 분해에 저항하는 그의 능력을 향상시키기 위해 화학적으로 합성된 펩타이드의 N-말단에서의 유리 알파 아미노 기의 아세틸화, 및/또는 화학적으로 합성된 펩타이드의 C-말단에서의 유리 카르복실 기의 아미드화를 선택할 수 있다.

용어 "아미노산"은 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체 형태의 천연 생성 아미노산, 천연 코딩 아미노산, 비천연 코딩 아미노산, 비천연 생성 아미노산, 천연 생성 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 포괄하되, 단 이들의 구조는 이러한 입체이성질체 형태를 허용해야 한다. 본원에서 아미노산은 그의 명칭, 통상적으로 알려진 그의 세 문자 기호, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장된 한 문자 기호로 지칭된다. "천연 코딩 아미노산"은 20종의 일반 아미노산들 중 하나, 또는 피롤라이신, 피롤린-카르복시-라이신 또는 셀레노시스테인인 아미노산을 지칭한다. 20종의 일반 아미노산은 알라닌(A 또는 Ala), 시스테인(C 또는 Cys), 아스파르트산(D 또는 Asp), 글루탐산(E 또는 Glu), 페닐알라닌(F 또는 Phe), 글리신(G 또는 Gly), 히스티딘(H 또는 His), 이소류신(I 또는 Ile), 라이신(K 또는 Lys), 류신(L 또는 Leu), 메티오닌(M 또는 Met), 아스파라긴(N 또는 Asn), 프롤린(P 또는 Pro), 글루타민(Q 또는 Gln), 아르기닌(R 또는 Arg), 세린(S 또는 Ser), 트레오닌(T 또는 Thr), 발린(V 또는 Val), 트립토판(W 또는 Trp) 및 티로신(Y 또는 Tyr)이다. "비천연 코딩 아미노산"은 20종의 일반 아미노산들 중 하나, 또는 피롤라이신, 피롤린-카르복시-라이신 또는 셀레노시스테인이 아닌 아미노산을 지칭한다. 상기 용어는 천연 코딩 아미노산의 변형(예컨대, 번역 후 변형)에 의해 생성되나, 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩타이드 쇄 내로 스스로 천연적으로 혼입되지 않는 아미노산, 제한 없이 예로서 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신을 제한 없이 포함한다. 비천연 코딩, 비천연 또는 변형된 아미노산의 추가 예는 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 베타-아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 피페리딘산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 2,4-디아미노부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 호모세린, 호모시스테인, 하이드록시라이신, 알로-하이드록시라이신, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, 6-N-메틸라이신, N-메틸발린, 노르발린, 노르류신 또는 오르니틴을 포함한다. 이러한 아미노산의 추가 예는 시트룰린이다. 하나 이상의 개별 원자가 상이한 원자, 동일한 원자의 동위원소 또는 상이한 작용기로 대체되어 있는 아미노산 유사체도 포함된다. 문헌[Ellman et al. Methods Enzymol. 1991, vol. 202, 301-36]에 기재된 비천연 아미노산 및 아미노산 유사체도 포함된다. 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 내로의 비천연 아미노산의 혼입은 다수의 상이한 방식으로 유리할 수 있다. 예를 들어, D-아미노산 함유 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 L-아미노산 함유 대응물에 비해 시험관내 또는 생체내에서 증가된 안정성을 나타낸다. 보다 구체적으로, D-아미노산 함유 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 내생성 펩티다제 및 프로테아제에 대한 더 강한 내성을 나타냄으로써, 생체내에서 분자의 개선된 생체이용률 및 연장된 수명을 제공할 수 있다.

본 분자를 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 형성할 수 있는 것으로서 특징규명하는 것은 특히 '간섭제' 기술의 작동의 기초를 이루는, 국제 특허출원 공개 제WO2007/071789호(A1) 및 제WO2012/123419호(A1)에 기재된 기작에 기반한다. 그러나, 베타-시트 입체구조의 출현은 이용 가능한 방법에 의해 실험적으로 평가될 수도 있다. 비제한적인 예로서, 핵 자기 공명(NMR) 분광법은 용액 중의 단백질의 2차 구조를 특징규명하는 데 수년 동안 이용되어 왔다(문헌[Wuetrich et al. FEBS Letters. 1991, vol. 285, 237-247]에서 검토됨).

아마도, 본 발명의 맥락에서 보다 간단하게, 분자간 베타-시트의 형성은 분자와 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질 사이의 상호작용을 유발하고, 이것은 표준 방법, 예컨대, 공-면역침전 어세이에 의해 정성적 및 정량적으로 평가될 수 있다. 이러한 공-면역침전 어세이의 여러 예가 실시예에 제시되어 있다. 한 예시적인 접근법에서, G12 돌연변이체 또는 야생형 RAS를 발현하는 세포를 바이오틴으로 표지된, 본원에 교시된 분자와 접촉시키고, 상기 세포를 용해시키고, 상기 분자(및 이에 결합된 임의의 RAS 단백질)를 스트렙타비딘 코팅 비드로 풀-다운시키고, 공-침전된 RAS 단백질을 면역어세이 방법, 즉 정량적 웨스턴 블롯으로 정량하였다. 또 다른 예시적인 접근법에서, G12 돌연변이체 또는 야생형 RAS를 생성하는 시험관내 번역 반응을 바이오틴으로 표지된, 본원에 교시된 분자와 접촉시키고, 상기 분자(및 이에 결합된 임의의 RAS 단백질)를 스트렙타비딘 코팅 비드로 풀-다운시키고, 공-침전된 RAS 단백질을 면역어세이 방법, 즉 정량적 웨스턴 블롯으로 정량하였다. 또한 본 발명의 맥락에서, 상기 분자와 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 사이의 상호작용은 RAS의 용해도 감소 및 심지어 RAS 단백질을 함유하는 응집체 또는 봉입체의 세포내 출현으로 이어질 수 있다. 이것은 실시예에도 예시된 표준 면역어세이 또는 형광 현미경관찰 방법에 의해 분석될 수 있다. 한 예시적인 접근법에서, G12 돌연변이체 또는 야생형 RAS를 발현하는 세포를 본원에 교시된 분자와 접촉시키고, 상기 세포를 비변성 완충제로 용해시키고, 이 완충제에서 불용성을 나타내는 단백질을 강한 무질서화제(6 M 우레아)로 처리하였다. 이 처리 후 불용성 상태로 남아있는 분획에 존재하는 RAS를 면역어세이 방법, 즉 정량적 웨스턴 블롯으로 정량하였다. 또 다른 예시적인 접근법에서, 인간 세포와 같은 배양된 포유동물 세포를 형광 모이어티, 예컨대, 표준 녹색 또는 적색 형광 단백질에 융합된 G12 돌연변이체 또는 야생형 RAS로 형질감염시키고, 세포를 본원에 교시된 분자로 처리하고 형광 태그가 부착된 RAS의 세포 국소화를 형광 현미경관찰로 확인하였다. 상황에 따라 적용되고 채택될 수 있는 이 예시적인 어세이들은 RAS가 (세포에서 또는 시험관내에서) 리보좀에서 생성되고 있을 때 상기 분자가 RAS와 접촉할 수 있다는 장점을 가진다. 이러한 아직 접히지 않은 RAS에서, 표적화된 APR은 비교적 더 쉽게 접근될 수 있고 환경에 노출될 것으로 예측되고, 이것은 분자와의 분자간 상호작용을 용이하게 할 수 있다. 추가로 본 발명의 맥락에서, 분자와 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 사이의 상호작용은 돌연변이체 RAS를 하향조절하기 위한 것이고, 이 하향조절은 예를 들어, 본원에 교시된 분자에 노출될 때, G12 또는 G13 돌연변이체 RAS에 의한 항시적 RAS 신호전달에 의존하는 생장을 보이는 형질전환된 세포주의 생존율 감소를 측정함으로써 검출되고 정량될 수 있다. G12 돌연변이체 RAS에 대한 이러한 예시적인 세포주 중 하나는 특히 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)(미국 버지니아주 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 불러바드 10801)으로부터 입수될 수 있는 NCI-H441 폐 선암종 세포(수탁번호 HTB-174^TM)이다. 이것도 실시예에 예시되어 있다.

본 분자가 야생형 인간 RAS와 분자간 베타-시트를 실질적으로 형성하지 않는다고 기재하는 것은 구체적으로 분자가 인간 야생형 RAS에 의한 신호전달을 하향조절할 수 있는 정도(존재하는 경우)가, 이 분자가 이들 각각의 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS에 의한 신호전달을 하향조절하는 정도에 비해 무시할만하거나 무의미함을 의미할 수 있다. 예를 들어, RAS 신호전달은 RAS를 이용하는 다운스트림 경로를 자극하는 것으로 알려진 외부 자극에 노출된 야생형 RAS를 발현하는 배양된 세포에서 평가될 수 있다. 실제로, 분자는 치료 효과적이고 현실적인 양으로 투여될 때 야생형 RAS만을 발현하는 세포에서 정상적인 RAS 신호전달의 하향조절에 기인할 수 있는 원치 않는 효과를 전혀 야기하지 않거나, 경미한 수준 또는 허용 가능한 정도로만 야기할 것이다. 전술된 어세이 또는 시험, 예컨대, 시험관내 어세이 또는 시험이 배양된 세포에서 수행되는 경우, 예를 들어, 분자-RAS 공-면역침전 어세이, RAS 용해도 측정, 또는 RAS의 응집체를 시각화하기 위한 형광 현미경관찰 어세이를 이용하여 분자간 베타-시트의 형성을 평가하고, 분자와 야생형 RAS 사이의 분자간 베타-시트 형성의 실질적인 결여는 각각의 어세이에서 신호의 부재(즉, '양성'으로 간주되는 결과 또는 측정치의 부재)로서 관찰될 수 있거나, 음성 대조군(예를 들어, 유사한 화학 조성을 갖지만 베타-시트 형성 특성을 전혀 갖지 않거나 무시할만한 수준으로만 이러한 특성을 가진 분자, 예를 들어, 펩타이드 분자의 경우 스크램블링된 펩타이드)에 의해 생성된 신호에 필적할만하거나 이 신호보다 유의미하게 더 높지 않은 정량 가능한 신호의 존재로서 관찰될 수 있거나, G12 또는 G13 돌연변이체 RAS에 대해 분자에 의해 생성된 신호보다 상당히 더 낮거나 덜 강한 정량 가능한 신호의 존재로서 관찰될 수 있다. 예를 들어, 증가하는 선호도의 순서로, 야생형 RAS에 대해 분자에 의해 생성된 신호(예를 들어, 분자와 공-침전된 RAS의 양, 불용성 RAS의 양 또는 불용성 대 가용성 RAS의 비율, 또는 세포에서 가시적인 RAS 응집체의 수, 크기 또는 형광 강도)는 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS에 대해 분자에 의해 생성된 신호보다 적어도 10배, 적어도 10²배, 적어도 10³배, 적어도 10⁴배, 적어도 10⁵배 또는 적어도 10⁶배 더 낮을 수 있다.

앞서 설명된 바와 같이, 야생형 인간 RAS의 위치 12 또는 13에 있는 특정 미스센스 돌연변이는 야생형 인간 RAS의 위치 2 내지 12에서 예측된 APR을 변경하므로, 이 변경된 APR은 위치 12에서 돌연변이된 아미노산을 포함할 것이고 전형적으로 이 돌연변이된 아미노산에 C-말단 인접한 1개 또는 몇 개의 아미노산을 추가로 포함할 것이거나, 이 변경된 APR은 위치 13에서 돌연변이된 아미노산을 포함할 것이고 이 돌연변이된 아미노산에 C-말단 인접한 1개 또는 몇 개의 아미노산도 추가로 포함할 수 있다. 따라서, G12 돌연변이체 RAS에서 예측된 APR은 G12 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 12, 또는 바람직하게는 위치 2 내지 13, 2 내지 14 또는 2 내지 15, 또는 보다 바람직하게는 위치 2 내지 14 또는 2 내지 15, 또는 훨씬 더 바람직하게는 위치 2 내지 15에 걸쳐 있을 수 있다. G13 돌연변이체 RAS에서 예측된 APR은 G13 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 13, 또는 바람직하게는 위치 2 내지 14 또는 2 내지 15, 또는 훨씬 더 바람직하게는 위치 2 내지 15에 걸쳐 있을 수 있다.

앞에서도 언급된 바와 같이, 베타-가닥은 3개 내지 10개 아미노산 길이를 갖는 경향이 있다. 따라서, 특정 실시양태에서 분자와 이의 표적 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 사이에 형성된 분자간 베타-시트는 돌연변이체 RAS에서 예측된 N-말단 최외각 APR, 특히 G12 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 12, 2 내지 13, 2 내지 14 또는 2 내지 15에서 예측된 APR, 또는 G13 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 13, 2 내지 14 또는 2 내지 15에서 예측된 APR의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 달리 말하면, 돌연변이체 RAS의 상기 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 연속 아미노산은 베타-시트에 참여하는 베타-가닥을 구성할 것이다. 표적화의 특이성을 향상시키기 위해, 분자는 돌연변이체 RAS에서 예측된 N-말단 최외각 APR, 특히 G12 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 12, 2 내지 13, 2 내지 14 또는 2 내지 15에서 예측된 APR, 또는 G13 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 13, 2 내지 14 또는 2 내지 15에서 예측된 APR의 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개, 예컨대, 정확히 10개의 연속 아미노산을 포함하는 베타-시트를 유도하도록 디자인될 수 있다. 상기 APR의 11개, 12개, 13개 또는 14개의 연속 아미노산을 포함하는 베타-시트도 생각할 수 있지만, 6개 내지 10개의 연속 아미노산의 베타-가닥이 바람직할 수 있는데, 이는 이러한 베타-가닥이 분자의 디자인을 단순화하면서 만족스러운 특이성을 허용하기 때문이다.

추가로, 특정 실시양태에서, 분자에 의해 유도된 베타-시트는 표적화된 G12 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 위치 12에 있는 아미노산을 포함할 것이다. 다르게 말하면, 위치 12의 아미노산은 베타-시트에 참여하는 베타-가닥의 일부일 것이다. RAS의 위치 12의 돌연변이가 위치 12를 넘어 연장되는 예측된 APR을 생성하는 경우, 베타-시트는 바람직하게는 위치 12의 C-말단에 있는 적어도 하나의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태로서: RAS의 위치 12의 돌연변이가 G12 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 12에 걸쳐 있는 예측된 APR을 생성하는 경우, 베타-시트는 돌연변이체 RAS의 위치 12의 아미노산을 포함할 수 있거나; RAS의 위치 12의 돌연변이가 G12 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 13에 걸쳐 있는 예측된 APR을 생성하는 경우, 베타-시트는 돌연변이체 RAS의 위치 12의 아미노산을 포함할 수 있거나 돌연변이체 RAS의 위치 12 및 13의 아미노산을 포함할 수 있거나; RAS의 위치 12의 돌연변이가 G12 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 14에 걸쳐 있는 예측된 APR을 생성하는 경우, 베타-시트는 돌연변이체 RAS의 위치 12의 아미노산을 포함할 수 있거나 돌연변이체 RAS의 위치 12 및 13의 아미노산을 포함할 수 있거나, 돌연변이체 RAS의 위치 12 내지 14의 아미노산을 포함할 수 있거나; RAS의 위치 12의 돌연변이가 G12 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 15에 걸쳐 있는 예측된 APR을 생성하는 경우, 베타-시트는 돌연변이체 RAS의 위치 12의 아미노산을 포함할 수 있거나, 돌연변이체 RAS의 위치 12 및 13의 아미노산을 포함할 수 있거나, 돌연변이체 RAS의 위치 12 내지 14의 아미노산을 포함할 수 있거나, 돌연변이체 RAS의 위치 12 내지 15의 아미노산을 포함할 수 있다.

이러한 실시양태에서, 베타-시트는 전형적으로 G12 돌연변이체 RAS의 위치 12의 아미노산에 N-말단 인접한 하나 이상의 연속 아미노산을 추가로 포함함으로써, 베타-시트는 APR의 적어도 6개, 예컨대, 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태로서: 베타-시트는 G12 돌연변이체 RAS의 위치 12의 아미노산, 및 돌연변이체 RAS의 위치 12의 아미노산에 N-말단 인접한 적어도 5개, 예컨대, 5개 내지 9개의 연속 아미노산을 포함할 수 있거나; 베타-시트는 G12 돌연변이체 RAS의 위치 12 및 13의 아미노산, 및 돌연변이체 RAS의 위치 12의 아미노산에 N-말단 인접한 적어도 4개, 예컨대, 4개 내지 8개의 연속 아미노산을 포함할 수 있거나; 베타-시트는 G12 돌연변이체 RAS의 위치 12 내지 14의 아미노산, 및 돌연변이체 RAS의 위치 12의 아미노산에 N-말단 인접한 적어도 3개, 예컨대, 3개 내지 7개의 연속 아미노산을 포함할 수 있거나; 베타-시트는 G12 돌연변이체 RAS의 위치 12 내지 15의 아미노산, 및 돌연변이체 RAS의 위치 12의 아미노산에 N-말단 인접한 적어도 2개, 예컨대, 2개 내지 6개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.

인간 야생형 RAS의 위치 2 내지 12에서 예측된 N-말단 최외각 APR의 서열인 TEYKLVVVGAG(서열번호 1)은 2개의 하전된 잔기, 즉 RAS의 위치 3의 글루타메이트(E) 및 RAS의 위치 5의 라이신(K)을 포함한다. 이 하전된 잔기들을 함유하는 APR의 일부도 베타-시트 형성을 위해 표적화될 수 있는 반면, 국제 특허출원 공개 제WO2007/071789호(A1) 및 제WO2012/123419호(A1)에 기재된 '간섭제' 기술은 바람직하게는 주로 비하전 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 표적화한다. 따라서, 특정 바람직한 실시양태에서, RAS의 위치 6의 류신(L)에 의해 N-말단 경계가 정해진 APR의 부분이 표적화될 수 있다. 따라서, 예시적인 실시양태로서: 베타-시트는 돌연변이체 RAS의 위치 6 내지 12 또는 6 내지 13 또는 6 내지 14 또는 6 내지 15, 또는 7 내지 12 또는 7 내지 13 또는 7 내지 14 또는 7 내지 15, 또는 8 내지 13 또는 8 내지 14 또는 8 내지 15, 또는 9 내지 14 또는 9 내지 15, 또는 10 내지 15의 아미노산을 포함할 수 있다.

따라서, 특정 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G12V 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAVGVG(서열번호 2)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예를 들어, 서열번호 2의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G12V 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 LVVVGAVGVG(서열번호 26)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예를 들어, 서열번호 26의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 모든 10개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G12C 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGACGVG(서열번호 6) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGACGV(서열번호 3)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예를 들어, 서열번호 6 또는 3의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G12C 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 LVVVGACGVG(서열번호 27) 또는 바람직하게는 LVVVGACGV(서열번호 28)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예를 들어, 서열번호 27의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 모든 10개의 연속 아미노산, 또는 서열번호 28의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개 또는 모든 9개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G12A 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAAGVG(서열번호 7) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAAGV(서열번호 4)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예를 들어, 서열번호 7 또는 4의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G12A 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 LVVVGAAGVG(서열번호 29) 또는 바람직하게는 LVVVGAAGV(서열번호 30)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예를 들어, 서열번호 29의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 모든 10개의 연속 아미노산, 또는 서열번호 30의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개 또는 모든 9개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G12S 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGASGVG(서열번호 8) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGASGV(서열번호 9) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGASG(서열번호 5)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예를 들어, 서열번호 8 또는 9 또는 5의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G12S 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 LVVVGASGVG(서열번호 31) 또는 바람직하게는 LVVVGASGV(서열번호 32) 또는 보다 바람직하게는 LVVVGASG(서열번호 33)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예를 들어, 서열번호 31의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 모든 10개의 연속 아미노산, 또는 서열번호 32의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개 또는 모든 9개의 연속 아미노산, 또는 서열번호 33의 적어도 6개, 적어도 7개 또는 모든 8개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.

추가로, 특정 실시양태에서, 분자에 의해 유도된 베타-시트는 표적화된 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 위치 13의 아미노산을 포함할 것이다. 달리 말하면, 위치 13의 아미노산은 베타-시트에 참여하는 베타-가닥의 부분일 것이다. RAS의 위치 13의 돌연변이가 위치 13을 넘어 연장되는 예측된 APR을 생성하는 경우, 베타-시트는 바람직하게는 위치 13의 C-말단에 있는 적어도 하나의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태로서: RAS의 위치 13의 돌연변이가 G13 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 13에 걸쳐 있는 예측된 APR을 생성하는 경우, 베타-시트는 돌연변이체 RAS의 위치 13의 아미노산을 포함할 수 있거나; RAS의 위치 13의 돌연변이가 G13 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 14에 걸쳐 있는 예측된 APR을 생성하는 경우, 베타-시트는 돌연변이체 RAS의 위치 13의 아미노산을 포함할 수 있거나 돌연변이체 RAS의 위치 13 및 14의 아미노산을 포함할 수 있거나; RAS의 위치 13의 돌연변이가 G13 돌연변이체 RAS의 위치 2 내지 15에 걸쳐 있는 예측된 APR을 생성하는 경우, 베타-시트는 돌연변이체 RAS의 위치 13의 아미노산을 포함할 수 있거나, 돌연변이체 RAS의 위치 13 및 14의 아미노산을 포함할 수 있거나, 돌연변이체 RAS의 위치 13 내지 15의 아미노산을 포함할 수 있다.

이러한 실시양태에서, 베타-시트는 전형적으로 돌연변이체 RAS의 위치 13의 아미노산에 N-말단 인접한 하나 이상의 연속 아미노산을 추가로 포함함으로써, 베타-시트는 APR의 적어도 6개, 예를 들어, 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태로서: 베타-시트는 G13 돌연변이체 RAS의 위치 13의 아미노산, 및 돌연변이체 RAS의 위치 13의 아미노산의 N-말단 인접한 적어도 5개, 예컨대, 5개 내지 9개의 연속 아미노산을 포함할 수 있거나; 베타-시트는 G13 돌연변이체 RAS의 위치 13 및 14의 아미노산, 및 돌연변이체 RAS의 위치 13의 아미노산에 N-말단 인접한 적어도 4개, 예컨대, 4개 내지 8개의 연속 아미노산을 포함할 수 있거나; 베타-시트는 G13 돌연변이체 RAS의 위치 13 내지 15의 아미노산, 및 돌연변이체 RAS의 위치 13의 아미노산에 N-말단 인접한 적어도 3개, 예컨대, 3개 내지 7개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G13V 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAGVVG(서열번호 82)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예컨대, 서열번호 82의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G13V 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 LVVVGAGVVG(서열번호 90)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예를 들어, 서열번호 90의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 모든 10개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G13C 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAGCVG(서열번호 91) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGCV(서열번호 81)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예컨대, 서열번호 91 또는 81의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G12C 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 LVVVGAGCVG(서열번호 92) 또는 바람직하게는 LVVVGAGCV(서열번호 93)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예를 들어, 서열번호 92의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 모든 10개의 연속 아미노산, 또는 서열번호 93의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개 또는 모든 9개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G13S 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAGSVG(서열번호 94) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGSV(서열번호 95) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGAGS(서열번호 83)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예를 들어, 서열번호 94, 95 또는 83의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 분자간 베타-시트는 G13S 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 LVVVGAGSVG(서열번호 96) 또는 바람직하게는 LVVVGAGSV(서열번호 97) 또는 보다 바람직하게는 LVVVGAGS(서열번호 98)의 부분, 특히 연속 부분 또는 전체, 예를 들어, 서열번호 96의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 모든 10개의 연속 아미노산, 또는 서열번호 97의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개 또는 모든 9개의 연속 아미노산, 또는 서열번호 98의 적어도 6개, 적어도 7개 또는 모든 8개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.

기재된 바와 같이, 본 분자는 그들 각각의 표적 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 단백질과의 분자간 β-시트 형성을 유도하여, 이 단백질의 특이적 하향조절 또는 넉다운을 유발하도록 디자인된다. 실험적 관찰에 근거할 때, 상기 분자는 표적화된 돌연변이체 RAS의 감소된 용해도 및 응집을 야기할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 교시된 분자는 그의 표적화된 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 용해도를 감소시킬 수 있고/있거나 이 단백질의 응집 또는 봉입체 형성을 유도할 수 있다. RAS 용해도 및 응집을 평가하기에 적합한 어세이는 본 명세서의 다른 곳에서 논의되어 있다.

G12 또는 G13 돌연변이체 RAS의 활성의 임의의 의미 있는 정도의 하향조절이 예상된다. 따라서, 용어 "하향조절한다" 또는 "하향조절된다", 또는 "감소시킨다" 또는 "감소된다", 또는 "저감시킨다" 또는 "저감된다"는 실험 또는 치료 상황과 같은 적절한 상황에서 기준에 비해 통계적으로 유의미한 감소를 의미할 수 있다. 숙련된 자는 이러한 기준을 선택할 수 있다. 적절한 기준의 예는 '음성 대조군' 분자, 예컨대, 유사한 조성을 갖되 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS에 대한 효과를 갖지 않는 것으로 알려진 분자에 노출될 때 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 활성일 수 있다. 예를 들어, 이러한 감소는 기준에 대한 오차 한계(예를 들어, 표준 편차 또는 표준 오차, 또는 이의 미리 결정된 배수, 예를 들어, ±1xSD 또는 ±2xSD, 또는 ±1xSE 또는 ±2xSE로 표현됨)를 벗어날 수 있다. 예시로서, G12 또는 G13 돌연변이체 RAS의 활성은 이것이 기준에 비해 적어도 10%, 예컨대, 적어도 20% 또는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 예컨대, 적어도 50% 또는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 예컨대, 적어도 80% 또는 적어도 90% 이상 감소될 때(최대 100% 감소 포함(즉, 기준에 비해 활성이 없음)) 감소된 것으로 간주될 수 있다.

G12 또는 G13 돌연변이체 RAS의 용해도의 임의의 의미 있는 정도의 감소가 예상된다. 이것은 실험적 또는 치료적 상황과 같은 적절한 상황에서 각각의 기준에 비해, 가용성 단백질 분획에 존재하는 RAS의 양의 통계적으로 유의미한 감소, 또는 불용성 단백질 분획에 존재하는 RAS의 양의 통계적으로 유의미한 증가, 또는 가용성 단백질 분획 대 불용성 단백질 분획에서 RAS의 상대적 존재도의 통계적으로 유의미한 감소를 의미할 수 있다. 숙련된 자는 이러한 기준, 예컨대, 특히 '음성 대조군' 분자의 존재 하에 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 용해도를 표시하는 기준을 선택할 수 있다. 예를 들어, 용해도의 이러한 감소는 기준에 대한 오차 한계(예를 들어, 표준 편차 또는 표준 오차, 또는 이의 미리 결정된 배수, 예를 들어, ±1xSD 또는 ±2xSD, 또는 ±1xSE 또는 ±2xSE로 표현됨)를 벗어날 수 있다. 예시로서, G12 또는 G13 돌연변이체 RAS의 용해도는 이것이 기준에 비해 적어도 10%, 예컨대, 적어도 20% 또는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 예컨대, 적어도 50% 또는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 예컨대, 적어도 80% 또는 적어도 90% 이상 감소될 때(최대 100% 감소 포함(즉, 가용성 단백질 분획에 존재하는 RAS 없음/불용성 단백질 분획에 존재하는 모든 RAS)) 감소된 것으로 간주될 수 있다.

본 분자는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질, 보다 구체적으로 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질에서 예측되는 최외각 N-말단 APR과의 분자간 베타-시트 형성을 유도할 수 있다. 이를 위해, 분자는 유리하게는 RAS 단백질 APR에 의해 제공된 베타-가닥과 상호작용할 수 있는 베타-가닥 입체구조를 취할 수 있거나 모방할 수 있는 적어도 하나의 부분을 포함함으로써, 상기 상호작용 베타-가닥에 의해 형성된 분자간 베타-시트를 생성할 수 있다.

특정 실시양태에서, 분자는 분자간 베타-시트에 참여하는 적어도 하나의 아미노산 스트레치를 포함할 수 있다. 앞서 설명된 바와 같이, 베타-가닥은 3개 내지 10개 아미노산 길이를 갖는 경향이 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 분자에 의해 포함된 적어도 하나의 아미노산 스트레치는 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개 연속 아미노산 길이를 가질 수 있다. 상호작용의 특이성을 향상시키기 위해, 분자에 의해 포함된 적어도 하나의 아미노산 스트레치는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개 또는 적어도 10개, 예컨대, 정확히 10개 연속 아미노산 길이를 가질 수 있다. 11개, 12개, 13개 또는 14개 연속 아미노산 길이를 가진 아미노산 스트레치도 분자에 의해 포함될 수 있는 것으로 생각되지만, 6개 내지 10개 연속 아미노산의 스트레치가 바람직할 수 있는데, 이는 이 스트레치가 분자의 디자인을 단순화하면서 만족스러운 특이성을 허용하기 때문이다.

특정 바람직한 실시양태에서, 분자에 의해 포함된 적어도 하나의 아미노산 스트레치, 예컨대, 6개 내지 10개 연속 아미노산의 적어도 하나의 스트레치(이하, 간결함을 위해 "분자 스트레치")는 베타-시트에 참여하는 돌연변이체 인간 RAS의 N-말단 최외각 APR 내의 연속 아미노산의 스트레치(이하, 간결함을 위해 "RAS 스트레치")에 상응할 수 있다. 특정 예로서, 베타-시트가 돌연변이체 인간 RAS의 위치 2 내지 12, 2 내지 13, 2 내지 14 또는 2 내지 15에서 예측된 N-말단 최외각 APR의 3개, 4개, 5개, 바람직하게는 6개 내지 10개, 예컨대, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개, 또는 심지어 11개, 12개, 13개 또는 14개 연속 아미노산(정확한 G12 또는 G13 돌연변이에 따라 APR 길이)의 RAS 스트레치를 포함할 때, 분자 스트레치는 이 RAS 스트레치에 상응할 수 있다. 특정 추가 예로서, 베타-시트가 G12 돌연변이체 인간 RAS의 위치 12의 아미노산 또는 위치 12 또는 13, 12 내지 14 또는 12 내지 15의 아미노산을 포함하거나, G13 돌연변이체 인간 RAS의 위치 13의 아미노산 또는 위치 13 및 14 또는 13 내지 15의 아미노산을 포함하는 RAS 스트레치를 포함할 때, 분자 스트레치는 이 RAS 스트레치에 상응할 수 있다. 추가 예로서, 베타-시트가 돌연변이체 인간 RAS의 위치 6 내지 12 또는 6 내지 13 또는 6 내지 14 또는 6 내지 15, 또는 7 내지 12 또는 7 내지 13 또는 7 내지 14 또는 7 내지 15, 또는 8 내지 13 또는 8 내지 14 또는 8 내지 15, 또는 9 내지 14 또는 9 내지 15, 또는 10 내지 15에서 RAS 스트레치를 포함할 때, 분자 스트레치는 이 RAS 스트레치에 상응할 수 있다.

분자 스트레치와 RAS 스트레치 사이의 상응은 특히 하기 상황들을 포괄할 수 있다:

a) 분자 스트레치의 아미노산 서열이 RAS 스트레치의 아미노산 서열과 동일한 상황;

b) 분자 스트레치의 아미노산 서열이 RAS 스트레치의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 상황, 단 이 정도의 서열 동일성은 본원에 교시된 분자간 베타-시트의 형성과 양립할 수 있어야 함 - 예를 들어, 상기 적어도 80% 서열 동일성은 특정 실시양태에서 RAS 스트레치가 6개 또는 7개 아미노산 길이를 가질 때 6개 내지 7개 아미노산 길이의 분자 스트레치가 최대 1개의 아미노산 치환에 의해 RAS 스트레치와 상이하거나, RAS 스트레치가 8개 내지 12개 아미노산 길이를 가질 때, 8개 내지 12개 아미노산 길이의 분자 스트레치가 최대 2개의 아미노산 치환에 의해 RAS 스트레치와 상이하거나, RAS 스트레치가 13개 또는 14개 아미노산 길이를 가질 때, 13개 또는 14개 아미노산 길이의 분자 스트레치가 최대 3개의 아미노산 치환에 의해 RAS 스트레치와 상이함을 의미할 수 있음;

c) 분자 스트레치의 아미노산 서열이 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 아미노산 치환에 의해 RAS 스트레치의 아미노산 서열과 상이한 상황, 단 이 치환 또는 치환들이 본원에 교시된 분자간 베타-시트의 형성과 양립할 수 있어야 함;

d) 분자 스트레치의 아미노산 서열이 RAS 스트레치의 아미노산 서열에 대해 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나에 기재된 정도의 서열 동일성을 나타내고 분자 스트레치의 모든 아미노산이 L-아미노산인 상황;

e) 분자 스트레치의 아미노산 서열이 RAS 스트레치의 아미노산 서열에 대해 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나에 기재된 정도의 서열 동일성을 나타내고, 분자 스트레치의 적어도 하나(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개 이상 또는 전부)의 아미노산이 D-아미노산인 상황, 단 D-아미노산 또는 D-아미노산들의 혼입은 본원에 교시된 분자간 베타-시트의 형성과 양립할 수 있어야 함;

f) 분자 스트레치의 아미노산 서열이 RAS 스트레치의 아미노산 서열에 대해 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나에 기재된 정도의 서열 동일성을 나타내고, 분자 스트레치의 적어도 하나(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개 이상 또는 전부)의 아미노산이 각각의 아미노산의 유사체로 대체되는 상황, 단 유사체 또는 유사체들의 혼입은 본원에 교시된 분자간 베타-시트의 형성과 양립할 수 있어야 함; 또는

g) 분자 스트레치의 아미노산 서열이 RAS 스트레치의 아미노산 서열에 대해 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나에 기재된 정도의 서열 동일성을 나타내고, 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산이 D-아미노산이고 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산이 각각의 아미노산의 유사체로 대체되는 상황, 단 D-아미노산 또는 D-아미노산들 및 유사체 또는 유사체들의 혼입은 본원에 교시된 분자간 베타-시트의 형성과 양립할 수 있어야 함.

바람직하게는, 분자 스트레치는 그의 아미노산 서열이 RAS 패밀리 구성원 이외의 인간 단백질의 아미노산 서열과 동일하지 않아, 이러한 분자 스트레치를 함유하는 분자의 오프-표적 활성을 감소시키거나 방해하도록 디자인될 수 있다. 이 평가를 수행하기 위해 분자 스트레치의 아미노산 서열을 전체 인간 프로테옴과 용이하게 정렬할 수 있다.

아미노산 서열에 관한 용어 "서열 동일성"은 N-말단부터 C-말단까지 판독된 아미노산 서열들 사이의 총 서열 동일성(즉, 비교 시 완전한 또는 전체 아미노산 서열을 포함함)의 정도(%로 표현됨)를 의미한다. 서열 동일성은 서열 정렬 및 서열 동일성의 측정을 수행하기에 적합한 알고리즘을 그 자체로 알려진 바와 같이 사용함으로써 측정될 수 있다. 예시적이되 비제한적인 알고리즘은 문헌[Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10)]에 처음 기재된 기본 국소 정렬 검색 수단(BLAST)에 기반한 알고리즘, 예컨대, 공개된 디폴트 설정 또는 다른 적합한 설정을 이용하는, 문헌[Tatusova and Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)]에 기재된 "Blast 2 서열" 알고리즘을 포함한다(예를 들어, BLASTN 알고리즘의 경우: 갭 개방에 대한 값 = 5, 갭 연장에 대한 값 = 2, 불일치에 대한 패널티 = -2, 일치에 대한 보상 = 1, gap x_dropoff = 50, 기대 값 = 10.0, 단어 크기 = 28; 또는 BLASTP 알고리즘의 경우: 매트릭스 = Blosum62(Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89:10915-10919), 갭 개방에 대한 값 = 11, 갭 연장에 대한 값 = 1, 기대 값 = 10.0, 단어 크기 = 3).

특정 아미노산 서열과 질의(query) 아미노산 서열(예를 들어, RAS 스트레치의 서열) 사이의 퍼센트 동일성을 측정하기 위한 예시적인 절차는 적합한 알고리즘 파라미터를 사용하여, NCBI 웹 사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 웹 애플리케이션 또는 독립형 실행 가능한 프로그램(BLAST 버전 2.2.31+)으로서 입수 가능한 Blast 2 서열(Bl2seq) 알고리즘을 사용하여 N-말단부터 C-말단까지 각각 판독된 2개의 아미노산 서열들을 정렬하는 단계를 수반할 것이다. 적합한 알고리즘 파라미터의 예는 매트릭스 = Blosum62, 갭 개방에 대한 값 = 11, 갭 연장에 대한 값 = 1, 기대 값 = 10.0, 단어 크기 = 3을 포함한다. 2개의 비교된 서열들이 동일성을 공유하는 경우, 결과물은 동일한 영역을 정렬된 서열로서 제시할 것이다. 2개의 비교된 서열들이 동일성을 공유하지 않는 경우, 결과물은 정렬된 서열을 제시하지 않을 것이다. 일단 정렬되면, 일치의 수는 동일한 아미노산 잔기가 두 서열들에 존재하는 위치의 수를 카운팅함으로써 측정될 것이다. 퍼센트 동일성은 일치의 수를 질의 서열의 길이로 나눈 다음, 결과 값에 100을 곱함으로써 측정된다. 퍼센트 동일성 값은 가장 가까운 10분의 1까지 반올림될 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들어, 78.11, 78.12, 78.13 및 78.14는 78.1로 반내림될 수 있는 반면, 78.15, 78.16, 78.17, 78.18 및 78.19는 78.2로 반올림될 수 있다. Bl2seq에 의해 출력된 정렬의 각각의 분절에 대한 상세한 보기는 이미 편리하게는 동일성 퍼센트를 포함한다는 것도 주목해야 한다.

언급된 바와 같이, 특정 실시양태에서, 분자 스트레치의 아미노산 서열은 RAS 스트레치의 아미노산 서열과 100% 미만으로 동일할 수 있고, 예를 들어, 분자 스트레치 서열은 RAS 스트레치 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 81%, 82%, 83%, 또는 84%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.

이러한 실시양태에서, 분자 스트레치는 RAS 스트레치에 비해(즉, RAS 스트레치와 비교될 때) 하나 이상의 아미노산 추가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 RAS 스트레치에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 최대 3개 또는 보다 바람직하게는 최대 2개 또는 훨씬 더 바람직하게는 최대 1개의 아미노산 치환, 예컨대, 특히 하나 이상의 단일 아미노산 치환, 바람직하게는 최대 3개 또는 보다 바람직하게는 최대 2개 또는 훨씬 더 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 치환, 특히 하나 이상의 단일 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 한 아미노산이, 유사한 특성을 가진 또 다른 아미노산으로 치환되는 것이다. 보존적 아미노산 치환은 하기 군 내에서의 치환을 포함한다: 발린, 알라닌 및 글리신; 류신, 발린 및 이소류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 시스테인 및 트레오닌; 라이신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 비극성 소수성 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된(즉, 염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된(즉, 산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 동일한 기의 또 다른 구성원에 의한 상기 언급된 극성, 염기성 또는 산성 기의 한 구성원의 임의의 치환은 보존적 치환으로서 간주될 수 있다. 대조적으로, 비-보존적 치환은 한 아미노산이 유사하지 않은 특성을 가진 또 다른 아미노산으로 치환되는 것이다.

특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 특히 하나 이상의 단일 아미노산 치환은 각각 독립적으로 비하전 아미노산, 바람직하게는 프롤린을 제외한 소수성 아미노산, 예컨대, 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 페닐알라닌(F), 메티오닌(M) 및 트립토판(W)에 의한 치환일 수 있다. 이러한 치환은 분자 스트레치의 베타-시트 유도 잠재력을 증가시킬 수 있다.

특정 바람직한 실시양태에서, 표적화된 G12 돌연변이체 인간 RAS의 위치 12에 상응하거나 이와 정렬되는 분자 스트레치의 아미노산은 돌연변이체 RAS의 위치 12에서 발견되는 아미노산과 동일할 수 있거나, 이 아미노산의 D-이성질체일 수 있거나, 이 아미노산의 유사체일 수 있고, 바람직하게는 이 아미노산과 동일하다. 예를 들어, G12V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 분자에서, G12V RAS의 위치 12에 상응하는 분자 스트레치의 아미노산은 L-발린 또는 D-발린 또는 발린 유사체, 바람직하게는 L-발린일 것이거나; G12A 돌연변이체 인간 RAS에 대한 분자에서, G12A RAS의 위치 12에 상응하는 분자 스트레치의 아미노산은 L-알라닌 또는 D-알라닌 또는 알라닌 유사체, 바람직하게는 L-알라닌일 것이거나; G12S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 분자에서, G12S RAS의 위치 12에 상응하는 분자 스트레치의 아미노산은 L-세린 또는 D-세린 또는 세린 유사체, 바람직하게는 L-세린일 것이거나; G12C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 분자에서, G12C RAS의 위치 12에 상응하는 분자 스트레치의 아미노산은 L-시스테인 또는 D-시스테인 또는 시스테인 유사체, 바람직하게는 L-시스테인일 것이다. G12C RAS와 관련하여, 보호되지 않은 시스테인을 분자에 포함시키는 것은 반응성 -SH 기가 시스테인 잔기에 존재하기 때문에 덜 적절할 수 있다. 따라서, G12C RAS에 대한 분자는 그 위치에서 세린과 같은 또 다른 아미노산을 함유할 수 있거나, 그 위치에서 시스테인을 함유할 수 있되, 이 시스테인은 예를 들어, 보호기(예를 들어, p-메틸벤질 기, 디페닐메틸 기, p-메톡시벤질 기 또는 아세트아미도메틸 기)에 의해 보호되거나, 그의 -SH 기를 동일한 분자 내에서 또는 두 분자들 사이에서 또 다른 시스테인의 -SH 기와 반응시킴으로써(디설파이드 가교) 보호된다. 따라서, 특정 실시양태에서, G12C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 분자에서, G12C RAS의 위치 12에 상응하는 분자 스트레치의 아미노산은 L-세린 또는 D-세린 또는 세린 유사체, 바람직하게는 L-세린일 것이다. 특정 다른 실시양태에서, G12C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 분자에서, G12C RAS의 위치 12에 상응하는 분자 스트레치의 아미노산은 보호기에 의해 보호되거나 디설파이드 가교에 참여함으로써 보호된 -SH 기를 가진 L-시스테인 또는 D-시스테인 또는 시스테인 유사체, 바람직하게는 L-시스테인일 것이다.

특정 바람직한 실시양태에서, 표적화된 G13 돌연변이체 인간 RAS의 위치 13에 상응하거나 이와 정렬되는 분자 스트레치의 아미노산은 돌연변이체 RAS의 위치 13에서 발견되는 아미노산과 동일할 수 있거나, 이 아미노산의 D-이성질체일 수 있거나, 이 아미노산의 유사체일 수 있고, 바람직하게는 이 아미노산과 동일하다. 예를 들어, G13V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 분자에서, G13V RAS의 위치 13에 상응하는 분자 스트레치의 아미노산은 L-발린 또는 D-발린 또는 발린 유사체, 바람직하게는 L-발린일 것이거나; G13S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 분자에서, G13S RAS의 위치 13에 상응하는 분자 스트레치의 아미노산은 L-세린 또는 D-세린 또는 세린 유사체, 바람직하게는 L-세린일 것이거나; 또는 G13C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 분자에서, G13C RAS의 위치 13에 상응하는 분자 스트레치의 아미노산은 L-시스테인 또는 D-시스테인 또는 시스테인 유사체, 바람직하게는 L-시스테인일 것이다. G13C RAS와 관련하여, 분자에 보호되지 않은 시스테인을 포함시키는 것에 대한 앞서 언급된 설명이 적용된다. 따라서, 특정 실시양태에서, G13C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 분자에서, G13C RAS의 위치 13에 상응하는 분자 스트레치의 아미노산은 L-세린 또는 D-세린 또는 세린 유사체, 바람직하게는 L-세린일 것이다. 특정 다른 실시양태에서, G13C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 분자에서, G13C RAS의 위치 13에 상응하는 분자 스트레치의 아미노산은 보호기에 의해 보호되거나 디설파이드 가교에 참여함으로써 보호된 -SH 기를 가진 L-시스테인 또는 D-시스테인 또는 시스테인 유사체, 바람직하게는 L-시스테인일 것이다.

따라서, 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 2의 위치 11에서 발린(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 TEYKLVVVGAVGVG(서열번호 2)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개, 예컨대, 정확히 10개, 또는 11개, 12개, 13개 또는 14개, 보다 바람직하게는 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 상기 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 상기 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 상기 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다(여기 및 아래에서 상기 언급된 특징 a'), b') 및/또는 c')가 언급되는 경우, 특징 a') 및 b')가 적용될 수 있고 특징 c')가 적용되지 않을 수 있거나, 특징 a') 및 c')가 적용될 수 있고 특징 b')가 적용되지 않을 수 있거나, 특징 b') 및 c')가 적용될 수 있고 특징 a')가 적용되지 않을 수 있거나, 특징 a'), b') 및 c')가 모두 적용될 수 있음). 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 2의 위치 11에서 발린을 포함하는 서열번호 2의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 2의 위치 11에서 발린을 포함하는 서열번호 2의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 2의 위치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 2의 위치 5 또는 6의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 2의 위치 11, 12, 13 또는 14의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 2의 위치 12, 13 또는 14의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 2의 위치 13 또는 14의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 2의 위치 14의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 26의 위치 7에서 발린(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 LVVVGAVGVG(서열번호 26)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 상기 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 상기 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 상기 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 26의 위치 7에서 발린을 포함하는 서열번호 26의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 26의 위치 7에서 발린을 포함하는 서열번호 26의 6 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 26의 위치 1, 2 또는 3의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 26의 위치 1 또는 2의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 26의 위치 7, 8, 9 또는 10의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 26의 위치 8, 9 또는 10의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 26의 위치 9 또는 10의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 26의 위치 10의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

분자 스트레치의 범위 및 경계를 정의할 수 있는 서열번호 26의 연속 부분의 비제한적인 예는 하기 표 1에 제시되어 있다. 표의 첫 번째 행은 서열번호 26을 복사하고 각각의 후속 행은 분자 스트레치에 포함되거나("+") 포함되지 않은("-") 서열번호 26의 아미노산을 표시함으로써 서열번호 26에 기반한 특정 분자 스트레치를 예시한다.

[표 1]

특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 6 또는 3의 위치 11에서 시스테인(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 TEYKLVVVGACGVG(서열번호 6) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGACGV(서열번호 3)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개, 예컨대, 정확히 10개, 또는 11개, 12개, 13개 또는 14개, 보다 바람직하게는 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고(본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 이 단락 및 뒤따르는 2개의 단락과 표 2에 기재된 실시양태 각각에서 시스테인은 세린으로 교체될 수 있거나 적합한 보호기 또는 디설파이드 가교에 의해 보호될 수 있음)(여기 및 아래에서 언급된 서열에 실제로 존재하는 아미노산의 수를 초과하는 다수의 연속 아미노산이 언급되는 경우, 연속 아미노산의 최대 수는 서열을 구성하는 아미노산의 수와 일치함을 이해할 것임), 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 6 또는 3의 위치 11에서 시스테인을 포함하는 서열번호 6 또는 3의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 6 또는 3의 위치 11에서 시스테인을 포함하는 서열번호 6 또는 3의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 6의 위치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 6의 위치 5 또는 6의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 6의 위치 11, 12, 13 또는 14의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 6의 위치 12, 13 또는 14의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 6의 위치 13 또는 14의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 6의 위치 13의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 27 또는 28의 위치 7에서 시스테인(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 LVVVGACGVG(서열번호 27) 또는 바람직하게는 LVVVGACGV(서열번호 28)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 27 또는 28의 위치 7에서 시스테인을 포함하는 서열번호 27 또는 28의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 27 또는 28의 위치 7에서 시스테인을 포함하는 서열번호 27 또는 28의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 27의 위치 1, 2 또는 3의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 27의 위치 1 또는 2의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 27의 위치 7, 8, 9 또는 10의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 27의 위치 8, 9 또는 10의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 27의 위치 9 또는 10의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 27의 위치 9의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

분자 스트레치의 범위 및 경계를 정의할 수 있는 서열번호 27의 연속 부분의 비제한적인 예는 하기 표 2에 제시되어 있다. 표의 첫 번째 행은 서열번호 27을 복사하고 각각의 후속 행은 분자 스트레치에 포함되거나("+") 포함되지 않은("-") 서열번호 27의 아미노산을 표시함으로써 서열번호 27에 기반한 특정 분자 스트레치를 예시한다.

[표 2]

특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12A 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 7 또는 4의 위치 11에서 알라닌(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 TEYKLVVVGAAGVG(서열번호 7) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAAGV(서열번호 4)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개, 예컨대, 정확히 10개, 또는 11개, 12개, 13개 또는 14개, 보다 바람직하게는 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12A 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 7 또는 4의 위치 11에서 알라닌을 포함하는 서열번호 7 또는 4의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12A 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 7 또는 4의 위치 11에서 알라닌을 포함하는 서열번호 7 또는 4의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 7의 위치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 7의 위치 5 또는 6의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 7의 위치 11, 12, 13 또는 14의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 7의 위치 12, 13 또는 14의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 7의 위치 13 또는 14의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 7의 위치 13의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12A 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 29 또는 30의 위치 7에서 알라닌(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 LVVVGAAGVG(서열번호 29) 또는 바람직하게는 LVVVGAAGV(서열번호 30)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12A 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 29 또는 30의 위치 7에서 알라닌을 포함하는 서열번호 29 또는 30의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12A 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 29 또는 30의 위치 7에서 알라닌을 포함하는 서열번호 29 또는 30의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 29의 위치 1, 2 또는 3의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 29의 위치 1 또는 2의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 29의 위치 7, 8, 9 또는 10의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 29의 위치 8, 9 또는 10의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 29의 위치 9 또는 10의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 29의 위치 9의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

분자 스트레치의 범위 및 경계를 정의할 수 있는 서열번호 29의 연속 부분의 비제한적인 예는 하기 표 3에 제시되어 있다. 표의 첫 번째 행은 서열번호 29를 복사하고 각각의 후속 행은 분자 스트레치에 포함되거나("+") 포함되지 않은("-") 서열번호 29의 아미노산을 표시함으로써 서열번호 29에 기반한 특정 분자 스트레치를 예시한다.

[표 3]

특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 8, 9 또는 5의 위치 11에서 세린(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 TEYKLVVVGASGVG(서열번호 8) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGASGV(서열번호 9) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGASG(서열번호 5)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개, 예컨대, 정확히 10개, 또는 11개, 12개, 13개 또는 14개, 보다 바람직하게는 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 8, 9 또는 5의 위치 11에서 세린을 포함하는 서열번호 8, 9 또는 5의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 8, 9 또는 5의 위치 11에서 세린을 포함하는 서열번호 8, 9 또는 5의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 8의 위치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 8의 위치 5 또는 6의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 8의 위치 11, 12, 13 또는 14의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 8의 위치 12, 13 또는 14의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 8의 위치 12 또는 13의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 8의 위치 12의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 31, 32 또는 33의 위치 7에서 세린(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 LVVVGASGVG(서열번호 31) 또는 바람직하게는 LVVVGASGV(서열번호 32) 또는 보다 바람직하게는 LVVVGASG(서열번호 33)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 31, 32 또는 33의 위치 7에서 세린을 포함하는 서열번호 31, 32 또는 33의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 31, 32 또는 33의 위치 7에서 세린을 포함하는 서열번호 31, 32 또는 33의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 31의 위치 1, 2 또는 3의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 31의 위치 1 또는 2의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 31의 위치 7, 8, 9 또는 10의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 31의 위치 8, 9 또는 10의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 31의 위치 8 또는 9의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 31의 위치 8의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

분자 스트레치의 범위 및 경계를 정의할 수 있는 서열번호 31의 연속 부분의 비제한적인 예는 하기 표 4에 제시되어 있다. 표의 첫 번째 행은 서열번호 31을 복사하고 각각의 후속 행은 분자 스트레치에 포함되거나("+") 포함되지 않은("-") 서열번호 29의 아미노산을 표시함으로써 서열번호 31에 기반한 특정 분자 스트레치를 예시한다.

[표 4]

특정 특히 바람직한 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G12V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 아미노산 스트레치 VVVGAV(서열번호 10), LVVVGAV(서열번호 11), VVVGAVG(서열번호 12) 또는 VVVGAVGVG(서열번호 13)를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특히 바람직하게는, 분자는 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13으로 표시된 아미노산 스트레치를 함유할 수 있다.

특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 82의 위치 12에서 발린(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 TEYKLVVVGAGVVG(서열번호 82)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개, 예컨대, 정확히 10개, 또는 11개, 12개, 13개 또는 14개, 보다 바람직하게는 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다(여기 및 아래에서 상기 언급된 특징 a'), b') 및/또는 c')가 언급되는 경우, 특징 a') 및 b')가 적용될 수 있고 특징 c')가 적용되지 않을 수 있거나, 특징 a') 및 c')가 적용될 수 있고 특징 b')가 적용되지 않을 수 있거나, 특징 b') 및 c')가 적용될 수 있고 특징 a')가 적용되지 않을 수 있거나, 특징 a'), b') 및 c')가 모두 적용될 수 있음). 특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 82의 위치 12에서 발린을 포함하는 서열번호 82의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 82의 위치 12에서 발린을 포함하는 서열번호 82의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 82의 위치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 82의 위치 5 또는 6의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 82의 위치 12, 13 또는 14의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 82의 위치 13 또는 14의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 82의 위치 14의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 90의 위치 8에서 발린(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 LVVVGAGVVG(서열번호 90)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G12 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 90의 위치 8에서 발린을 포함하는 서열번호 90의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 90의 위치 8에서 발린을 포함하는 서열번호 90의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 90의 위치 1, 2 또는 3의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 90의 위치 1 또는 2의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 90의 위치 8, 9 또는 10의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 90의 위치 9 또는 10의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 90의 위치 10의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 91 또는 81의 위치 12에서 시스테인(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 TEYKLVVVGAGCVG(서열번호 91) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGCV(서열번호 81)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개, 예컨대, 정확히 10개, 또는 11개, 12개, 13개 또는 14개, 보다 바람직하게는 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고(본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 이 단락 및 뒤따르는 2개의 단락에 기재된 실시양태 각각에서 시스테인은 세린으로 교체될 수 있거나 적합한 보호기 또는 디설파이드 가교에 의해 보호될 수 있음), 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 91 또는 81의 위치 12에서 시스테인을 포함하는 서열번호 91 또는 81의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 91 또는 81의 위치 12에서 시스테인을 포함하는 서열번호 91 또는 81의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 91의 위치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 91의 위치 5 또는 6의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 91의 위치 12, 13 또는 14의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 91의 위치 13의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 92 또는 93의 위치 8에서 시스테인(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 LVVVGAGCVG(서열번호 92) 또는 바람직하게는 LVVVGAGCV(서열번호 93)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 92 또는 93의 위치 8에서 시스테인을 포함하는 서열번호 92 또는 93의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13C 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 92 또는 93의 위치 8에서 시스테인을 포함하는 서열번호 92 또는 93의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 92의 위치 1, 2 또는 3의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 92의 위치 1 또는 2의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 92의 위치 8, 9 또는 10의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 92의 위치 9의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 94, 95 또는 83의 위치 12에서 세린(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 TEYKLVVVGAGSVG(서열번호 94) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGSV(서열번호 95) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGAGS(서열번호 83)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개, 예컨대, 정확히 10개, 또는 11개, 12개, 13개 또는 14개, 보다 바람직하게는 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 94, 95 또는 83의 위치 12에서 세린을 포함하는 서열번호 94, 95 또는 83의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 94, 95 또는 83의 위치 12에서 세린을 포함하는 서열번호 94, 95 또는 83의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 94의 위치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 94의 위치 5 또는 6의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 94의 위치 12, 13 또는 14의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 94의 위치 12 또는 13의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 94의 위치 12의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 96, 97 또는 98의 위치 8에서 세린(볼드체로 표시됨)을 포함하는 아미노산 서열 LVVVGAGSVG(서열번호 96) 또는 바람직하게는 LVVVGAGSV(서열번호 97) 또는 보다 바람직하게는 LVVVGAGS(서열번호 98)의 적어도 3개, 예컨대, 적어도 4개 또는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 예컨대, 정확히 6개, 또는 적어도 7개, 예컨대, 정확히 7개, 또는 적어도 8개, 예컨대, 정확히 8개, 또는 적어도 9개, 예컨대, 정확히 9개, 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다.

특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 96, 97 또는 98의 위치 8에서 세린을 포함하는 서열번호 96, 97 또는 98의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특정 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13S 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 서열번호 96, 97 또는 98의 위치 8에서 세린을 포함하는 서열번호 96, 97 또는 98의 6개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 분자 스트레치를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 분자 스트레치는 서열번호 96의 위치 1, 2 또는 3의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 96의 위치 1 또는 2의 아미노산에 의해 N-말단의 경계가 정해질 수 있고/있거나; 서열번호 96의 위치 8, 9 또는 10의 아미노산, 보다 바람직하게는 서열번호 96의 위치 8 또는 9의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 96의 위치 8의 아미노산에 의해 C-말단의 경계가 정해질 수 있다.

특정 특히 바람직한 실시양태에서, G13 돌연변이체 인간 RAS, 특히 G13V 돌연변이체 인간 RAS에 대한 본원에 교시된 분자는 아미노산 스트레치 VVVGAGV(서열번호 99), LVVVGAGV(서열번호 100), VVVGAGVV(서열번호 101), 또는 VVVGAGVVG(서열번호 102)를 함유할 수 있고, 임의로 이때 a') 분자 스트레치는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하거나, 가장 바람직하게는 단일 아미노산 치환을 포함하지 않고/않거나; b') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 D-아미노산이고/이거나; c') 분자 스트레치의 적어도 하나의 아미노산은 각각의 아미노산의 유사체로 대체된다. 특히 바람직하게는, 분자는 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101 또는 서열번호 102로 제시된 아미노산 스트레치를 함유할 수 있다.

특정 G12 돌연변이에 대해 디자인된 아미노산 스트레치를 함유하는 적어도 특정 분자는 또한 분자간 베타-시트를 유도할 수 있고 상이한 G12 돌연변이를 보유하는 돌연변이체 인간 RAS의 하향조절을 달성할 수 있다. 예를 들어, 실험 단락에 나타낸 바와 같이, G12V 돌연변이체 인간 RAS에 대해 디자인되고 RAS의 위치 12에 상응하는 위치에서 발린 잔기를 함유하는 분자는 G12V 및 G12C 돌연변이체 인간 RAS 둘 다를 하향조절할 수 있지만, 야생형 인간 RAS에는 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 따라서, G12 돌연변이체 RAS의 하향조절에 대한 의도된 효과가 관찰되는 한, 한 유형의 G12 돌연변이에 대해 디자인된 분자가 또 다른 유형의 G12 돌연변이를 보유하는 돌연변이체 RAS에 대해 사용될 수 있다는 것이 본원에서 예상된다. 또한, 특정 G13 돌연변이에 대해 디자인된 아미노산 스트레치를 함유하는 적어도 특정 분자는 또한 분자간 베타-시트를 유도할 수 있고 상이한 G13 돌연변이를 보유하는 돌연변이체 인간 RAS의 하향조절을 달성할 수 있다. 따라서, G13 돌연변이체 RAS의 하향조절에 대한 의도된 효과가 관찰되는 한, 한 유형의 G13 돌연변이에 대해 디자인된 분자가 또 다른 유형의 G13 돌연변이를 보유하는 돌연변이체 RAS에 대해 사용될 수 있음이 본원에서 예상된다.

추가로, 앞서 예시된 바와 같이, 분자 스트레치, 즉 분자간 베타-시트에 참여하는 본원에 교시된 분자에 의해 포함된 적어도 하나의 아미노산 스트레치는 언급된 아미노산의 D-아미노산 및/또는 유사체도 포함할 수 있다. 더 일반적으로 말하면, 특정 실시양태에서, 분자의 적어도 하나의 아미노산 스트레치는 하나 이상의 D-아미노산 또는 하나 이상의 그의 아미노산의 유사체, 또는 하나 이상의 D-아미노산 및 하나 이상의 그의 아미노산의 유사체를 포함할 수 있되, 단 상기 D-아미노산 또는 D-아미노산들 및/또는 상기 유사체 또는 유사체들의 혼입은 본원에 교시된 분자간 베타-시트의 형성과 양립할 수 있어야 한다.

제한 없이, 특정 실시양태에서, 분자 스트레치는 하나의 D-아미노산만을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 분자 스트레치는 2개 이상(예를 들어, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상)의 D-아미노산을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 분자 스트레치를 구성하는 아미노산의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 100%(즉, 전부)가 D-아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, D-아미노산은 L-아미노산 사이에 산재될 수 있고/있거나, D-아미노산은 L-아미노산에 의해 분리된 2개 이상의 D-아미노산의 하나 이상의 서브스트레치로 조직화될 수 있다. 제한 없이, 특정 실시양태에서, 분자 스트레치는 그의 아미노산들 중 오로지 한 아미노산의 유사체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 분자 스트레치는 그의 아미노산들 중 2개 이상(예를 들어, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상)의 아미노산의 유사체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 분자 스트레치는 그의 아미노산들의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 100%(즉, 전부)의 유사체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아미노산 유사체는 천연 생성 아미노산들 사이에 산재될 수 있고/있거나, 아미노산 유사체는 천연 생성 아미노산에 의해 분리된 2개 이상의 이러한 유사체의 하나 이상의 서브스트레치로 조직화될 수 있다. 제한 없이, 특정 실시양태에서, 분자 스트레치는 D-아미노산 또는 아미노산 유사체인 하나의 구성요소만을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 분자 스트레치는 D-아미노산 또는 아미노산 유사체인 2개 이상(예를 들어, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상)의 구성요소를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 분자 스트레치의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 100%(즉, 전부)의 구성요소가 D-아미노산 또는 아미노산 유사체일 수 있다.

이미 설명된 바와 같이, 분자 스트레치는 RAS 스트레치에 상응하도록 디자인될 수 있고, 이것은 특히 분자 스트레치와 RAS 스트레치 사이에 어느 정도의 서열 동일성을 요구할 수 있다. 예를 들어, 분자 스트레치는 가장 바람직하게는 RAS 스트레치와 동일할 수 있거나, 단일 아미노산 치환(들), 특히 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 보다 바람직하게는 1개 이하의 단일 아미노산 치환에 의해서만 RAS 스트레치와 상이할 수 있다. 분자 스트레치와 RAS 스트레치 사이의 이러한 비교적 높은 정도의 서열 동일성은 이 스트레치들이 특히 이들 사이의 분자간 베타-시트의 형성을 통해 회합할 수 있게 하는 것을 목표로 한다. 천연 생성 단백질 내에서의 베타-응집 영역의 '자가 회합'이 이러한 단백질의 응집의 널리 퍼진 기저 기작이라는 것은 실제로 보고되었고(예를 들어, 상기 문헌[Fernandez-Escamilla et al. 2004] 참조), 본 접근법은 이를 활용할 수 있다. 마찬가지로 이미 설명된 바와 같이, 분자 스트레치와 RAS 스트레치 사이의 상응의 개념은 각각의 아미노산의 D-이성질체 및/또는 유사체가 분자 스트레치에 포함될 수 있게 한다.

아미노산 유사체의 언급은 천연 코딩 아미노산과 동일하거나 유사한 기본 화학 구조를 가진 임의의 화합물, 즉 카르복실 기, 아미노 기 및 R 모이어티(아미노산 잔기)를 포함하는 유기 화합물을 포괄할 수 있다. 전형적으로, 아미노 기 및 R 모이어티는 α 탄소 원자(즉, 카르복실 기가 결합되는 탄소 원자)에 결합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 아미노 기는 α 탄소 원자 이외의 탄소 원자, 예를 들어, β 또는 γ 탄소 원자, 바람직하게는 β 탄소 원자에 결합될 수 있다. 이러한 실시양태에서, R 모이어티는 아미노 기와 동일한 탄소 원자, 또는 α 탄소 원자에 더 가까운 탄소 원자 또는 α 탄소 원자 그 자체에 결합될 수 있다. 전형적으로, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 모이어티가 α 탄소 원자에 결합되는 경우, α 탄소 원자는 수소 원자에도 결합될 수 있다. 전형적으로, 아미노 기 및 R 모이어티가 β 탄소 원자에 결합되는 경우, β 탄소 원자는 수소 원자에도 결합될 수 있다. 제한 없이, 아미노산 유사체의 R 모이어티는 R 기의 하나 이상의 개별 원자 또는 작용기가 상이한 원자로 대체되거나 치환되거나(예를 들어, 수소 원자로 대체된 메틸 기, 또는 O 원자로 대체된 S 원자 등), 동일한 원자의 동위원소로 대체되거나 치환되거나(예를 들어, ¹³C로 대체된 ¹²C, ¹⁵N으로 대체된 ¹⁴N, ²H로 대체된 ¹H 등), 상이한 작용기로 대체되거나 치환됨으로써(예를 들어, 메틸, 에틸 또는 프로필 기, 또는 또 다른 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴 기로 대체된 수소 원자; -OH 기 또는 -NH₂ 기로 대체된 -SH 등), 각각의 천연 코딩 아미노산의 R 기와 상이할 수 있다. 각각의 천연 코딩 아미노산에 비해 아미노산 유사체의 구조적 차이 또는 변형은 바람직하게는 전하 및 극성과 관련하여 아미노산의 핵심 성질을 보존한다. 따라서, 비극성 소수성 아미노산의 아미노산 유사체는 바람직하게는 비극성 소수성 R 모이어티도 가질 수 있고; 극성 중성 아미노산의 아미노산 유사체는 바람직하게는 극성 중성 R 모이어티도 가질 수 있고; 양으로 하전된(염기성) 아미노산의 아미노산 유사체는 바람직하게는 양으로 하전된 R 모이어티, 바람직하게는 동일한 수의 하전된 기를 가진 양으로 하전된 R 모이어티도 가질 수 있고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산의 아미노산 유사체는 바람직하게는 음으로 하전된 R 모이어티, 바람직하게는 동일한 수의 하전된 기를 가진 음으로 하전된 R 모이어티도 가질 수 있다. 모든 아미노산 유사체들은 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체 둘 다로서 예상되되, 이들의 구조는 이러한 입체이성질체 형태를 허용해야 한다.

제한 없이 예로서, 류신 유사체는 2-아미노-3,3-디메틸-부티르산(t-류신), 알파-메틸류신, 하이드록시류신, 2,3-데하이드로-류신, N-알파-메틸-류신, 2-아미노-5-메틸-헥산산(호모류신), 3-아미노-5-메틸헥산산(베타-호모류신), 2-아미노-4,4-디메틸-펜탄산(4-메틸-류신, 네오펜틸글리신), 4,5-데하이드로-노르류신, L-노르류신, N-알파-메틸-노르류신 및 6-하이드록시-노르류신(이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체를 포함함)으로 구성된 목록으로부터 선택될 수 있되, 이들의 구조는 이러한 입체이성질체 형태를 허용해야 한다. 제한 없이 예로서, 발린 유사체는 c-알파-메틸-발린(2,3-디메틸부탄산), 2,3-데하이드로-발린, 3,4-데하이드로-발린, 3-메틸-L-이소발린(메틸발린), 2-아미노-3-하이드록시-3-메틸부탄산(하이드록시발린), 베타-호모발린 및 N-알파-메틸-발린(이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체를 포함함)으로 구성된 목록으로부터 선택될 수 있되, 이들의 구조는 이러한 입체이성질체 형태를 허용해야 한다. 제한 없이 예로서, 글리신 유사체는 N-알파-메틸-글리신(사르코신), 사이클로프로필글리신 및 사이클로펜틸글리신(이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체를 포함함)으로 구성된 목록으로부터 선택될 수 있되, 이들의 구조는 이러한 입체이성질체 형태를 허용해야 한다. 제한 없이 예로서, 알라닌 유사체는 2-아미노-이소부티르산(2-메틸알라닌), 2-아미노-2-메틸부탄산(이소발린), N-알파-메틸-알라닌, c-알파-메틸-알라닌, c-알파-에틸-알라닌, 2-아미노-2-메틸펜트-4-엔산(알파-알릴알라닌), 베타-호모알라닌, 2-인다닐-글리신, 디-n-프로필-글리신, 디-n-부틸-글리신, 디에틸글리신, (1-나프틸)알라닌, (2-나프틸)알라닌, 사이클로헥실글리신, 사이클로프로필글리신, 사이클로펜틸글리신, 아다만틸-글리신 및 베타-호모알릴글리신(이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체를 포함함)으로 구성된 목록으로부터 선택될 수 있되, 이들의 구조는 이러한 입체이성질체 형태를 허용해야 한다.

특정 실시양태에서, 분자는 분자간 베타-시트에 참여하는 정확히 하나의 아미노산 스트레치(즉, 상기 논의된 바와 같이 정확히 하나의 '분자 스트레치')를 포함할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 분자는 분자간 베타-시트에 참여하는 2개 이상의 아미노산 스트레치(즉, 상기 논의된 바와 같이 2개 이상의 '분자 스트레치')를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자는 2개 내지 6개, 바람직하게는 2개 내지 5개, 보다 바람직하게는 2개 내지 4개, 또는 훨씬 더 바람직하게는 2개 또는 3개의 분자 스트레치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자는 정확히 2개, 또는 정확히 3개, 또는 정확히 4개, 또는 정확히 5개의 분자 스트레치, 특히 바람직하게는 정확히 2개 또는 정확히 3개의 분자 스트레치, 훨씬 더 바람직하게는 정확히 2개의 분자 스트레치를 포함할 수 있다. 2개 이상의 분자 스트레치의 포함은 각각의 G12 돌연변이체 인간 RAS 단백질을 하향조절하고 이 단백질의 응집을 유도하는 데 있어서 분자의 효과를 증가시키는 경향이 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 2개 이상의 분자 스트레치는 동일한 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS에 대한 것일 것이다. 그러나, 2개 이상의 분자 스트레치가 상이한 G12 돌연변이체 인간 RAS 단백질에 대한 것인 구성이 예상될 수 있고, 보다 더 보편적인 G12 표적화제를 제공할 수 있다. 2개 이상의 분자 스트레치가 상이한 G13 돌연변이체 인간 RAS 단백질에 대한 것인 구성이 예상될 수 있고, 보다 더 보편적인 G13 표적화제를 제공할 수 있다.

분자가 2개 이상의 본원에 교시된 분자 스트레치를 포함하는 경우, 이들은 각각 독립적으로 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 정확히 2개의 분자 스트레치를 가진 분자에서 2개의 분자 스트레치는 동일할 수 있거나 상이할 수 있거나; 정확히 3개의 분자 스트레치를 가진 분자에서 모든 3개의 스트레치는 동일할 수 있거나, 각각의 스트레치는 각각의 다른 스트레치와 상이할 수 있거나, 2개의 스트레치는 동일할 수 있고 나머지 스트레치는 상이할 수 있거나; 정확히 4개의 분자 스트레치를 가진 분자에서 모든 4개의 스트레치는 동일할 수 있거나, 각각의 스트레치는 각각의 다른 스트레치와 상이할 수 있거나, 2개 또는 3개의 스트레치는 동일할 수 있고 나머지 스트레치(들)는 전자와 상이할 수 있고 임의로 서로 동일할 수 있다.

제한 없이 예로서, 2개의 분자 스트레치가 상이하다고 언급되는 경우, 각각의 분자 스트레치는 상이한 본원에 교시된 RAS 스트레치, 예를 들어, 바람직하게는 동일한 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS의 상이한 비중첩, 중첩 또는 네스티드(nested) RAS 스트레치에 상응할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 2개의 분자 스트레치는 상이한 기저 아미노산 서열을 염두에 두고 디자인될 수 있고, 이들이 각각의 아미노산의 아미노산 치환, D-이성질체 및/또는 유사체를 혼입하는(또는 혼입하지 않는) 정도와 같은 다른 측면에서도 임의로 상이할 수 있다. 또는, 2개의 분자 스트레치가 상이하다고 언급되는 경우, 각각의 분자 스트레치는 2개의 분자 스트레치가 동일한 기저 아미노산 서열을 염두에 두고 디자인되도록 동일한 RAS 스트레치에 상응할 수 있으나, 이들이 각각의 아미노산의 아미노산 치환, D-이성질체 및/또는 유사체를 혼입하는(또는 혼입하지 않는) 정도와 같은 다른 측면에서 상이할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 2개 이상의 분자 스트레치는 동일한 RAS 스트레치에 상응하고, 보다 바람직하게는 2개 이상의 분자 스트레치는 아미노산 치환에서 상이하지 않고(예를 들어, 이들은 RAS 스트레치에 비해 임의의 아미노산 치환을 혼입하지 않거나, 동일한 아미노산 치환을 혼입할 수 있음), 훨씬 더 바람직하게는 또한 이들이 각각의 아미노산의 D-이성질체 및/또는 유사체를 혼입하는 정도에서 상이하지 않다(예를 들어, 이들은 임의의 D-이성질체 및/또는 유사체를 혼입하지 않거나, 동일한 위치(들)에서 동일한 D-이성질체 및/또는 유사체를 혼입할 수 있음). 따라서, 특히 바람직한 실시양태에서, 2개 이상의 분자 스트레치는 동일하다.

분자가 분자간 베타-시트에 참여하는 2개 이상의 아미노산 스트레치(즉, 상기 논의된 바와 같이 2개 이상의 '분자 스트레치')를 포함하는 경우, "분자간 베타-시트"의 언급은 반드시 물리적으로 동일한 베타-시트를 의미하지는 않으나, 또 다른 RAS 단백질 분자와의 또 다른 베타-시트를 의미할 수 있다. 예를 들어, 2개의 분자 스트레치를 가진 분자는 동일한 베타-시트에서, 또는 2개의 별개의 베타-시트에서, 또는 나중에 베타-시트 형성에 의해 유도된 동일한 베타-시트 또는 동일한 고차 구조의 일부가 되는 2개의 별개의 베타-시트에서 2개의 RAS 단백질 분자와 맞물릴 수 있다. 따라서, 특히 추구되는 것은 베타-가닥 및 베타-시트를 향한 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS 분자의 N-말단 최외각 APR의 입체구조적 변화의 발생이고, 이것은 궁극적으로 G12 또는 G13 돌연변이체 RAS의 용해도를 감소시키고 이 돌연변이체 RAS의 응집을 야기한다.

바람직한 실시양태에서, 상기 논의된 아미노산 스트레치 또는 스트레치들을 함유하는 분자가 그의 표적 RAS 단백질에 노출되기 전에도 자가 회합하거나 자가 응집하는(예를 들어, 제조 시 또는 저장 동안 침전되는) 성향을 감소시키기 위해, 아미노산 스트레치 또는 스트레치들은 이러한 자가 회합을 감소시킬 수 있거나 방해할 수 있는 아미노산("게이트키퍼(gatekeeper) 아미노산" 또는 "게이트키퍼"로서도 지칭됨)에 의해 둘러싸일 수 있거나 게이팅될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 분자 내의 아미노산 스트레치 또는 스트레치들은 독립적으로 각각의 말단에서 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 나타내는 하나 이상의 아미노산, 특히 연속 아미노산에 의해 각각 독립적으로 플랭킹되고, 특히 직접적으로 또는 즉시 플랭킹된다. 전형적으로, 이러한 플랭킹 영역은 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 가진 1개 내지 10개, 바람직하게는 1개 내지 8개, 보다 바람직하게는 1개 내지 6개, 또는 훨씬 더 바람직하게는 1개 내지 4개, 예컨대, 정확히 1개, 정확히 2개, 정확히 3개 또는 정확히 4개의 아미노산, 특히 연속 아미노산을 각각 독립적으로 포함할 수 있다.

특정 바람직한 실시양태에서, 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 가진 아미노산은 하전된 아미노산, 예컨대, 양으로 하전된(염기성, 예컨대, 전체 +1 또는 +2 전하) 아미노산 또는 음으로 하전된(산성, 예컨대, 전체 -1 또는 -2 전하) 아미노산, 예컨대, 그의 R 모이어티에 아미노 기(양성자화될 때 -NH₃ ⁺) 또는 카르복실 기(해리될 때 -COO^-)를 함유하는 아미노산일 수 있다. 특정 다른 실시양태에서, 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 가진 아미노산은 예를 들어, 그의 펩타이드 결합 형성 아미노 기가 헤테로환, 예컨대, 피롤리딘에 포함되기 때문에 높은 입체구조적 강성을 특징으로 하는 아미노산일 수 있다.

따라서, 특정 바람직한 실시양태에서, 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 가진 아미노산은 R, K, E, D, P, N, S, H, G, Q 또는 A(이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체, 또는 이들의 유사체를 포함함)일 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 가진 아미노산은 R, K, E, D, P, N, S, H, G 또는 Q(이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체, 또는 이들의 유사체를 포함함)일 수 있다. 특정 보다 바람직한 실시양태에서, 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 가진 아미노산은 R, K, E, D 또는 P(이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체, 또는 이들의 유사체를 포함함)일 수 있다. 특정 보다 바람직한 실시양태에서, 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 가진 아미노산은 R, K, E 또는 D(이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체, 또는 이들의 유사체를 포함함)일 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 분자 내의 아미노산 스트레치 또는 스트레치들은 독립적으로 각각의 말단에서 R, K, E, D, P, N, S, H, G, Q 및 A, 이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체, 및 이들의 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군; 또는 R, K, E, D, P, N, S, H, G 및 Q, 이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체, 및 이들의 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군; 또는 R, K, E, D 및 P, 이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체, 및 이들의 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 1개 내지 4개의 연속 아미노산에 의해 각각 독립적으로 플랭킹된다.

제한 없이 예로서, 아르기닌 유사체, 특히 양전하를 운반하거나 양성자화되어 양전하를 운반할 수 있는 아르기닌 유사체는 2-아미노-3-우레이도-프로피온산, 노르아르기닌, 2-아미노-3-구아니디노-프로피온산, 글리옥살-하이드로이미다졸론, 메틸글리옥살-하이드로이미다졸론, N'-니트로-아르기닌, 호모아르기닌, 오메가-메틸-아르기닌, N-알파-메틸-아르기닌, N,N'-디에틸-호모아르기닌, 카나바닌 및 베타-호모아르기닌(이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체를 포함함)으로 구성된 목록으로부터 선택될 수 있되, 이들의 구조는 이러한 입체이성질체 형태를 허용해야 한다. 제한 없이 예로서, 라이신 유사체, 특히 양전하를 운반하거나 양성자화되어 양전하를 운반할 수 있는 라이신 유사체는 N-엡실론-포르밀-라이신, N-엡실론-메틸-라이신, N-엡실론-i-프로필-라이신, N-엡실론-디메틸-라이신, N-엡실론-트리메틸암모늄-라이신, N-엡실론-니코티닐-라이신, 오르니틴, N-델타-메틸-오르니틴, N-델타-N-델타-디메틸-오르니틴, N-델타-i-프로필-오르니틴, c-알파-메틸-오르니틴, 베타,베타-디메틸-오르니틴, N-델타-메틸-N-델타-부틸-오르니틴, N-델타-메틸-N-델타-페닐-오르니틴, c-알파-메틸-라이신, 베타,베타-디메틸-라이신, N-알파-메틸-라이신, 호모라이신, 베타-호모라이신(이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체를 포함함)으로 구성된 목록으로부터 선택될 수 있되, 이들의 구조는 이러한 입체이성질체 형태를 허용해야 한다. 제한 없이 예로서, 글루탐산 또는 아스파르트산 유사체, 특히 음전하를 운반하거나 해리되어 음전하를 운반할 수 있는 글루탐산 또는 아스파르트산 유사체는 2-아미노-아디프산(호모글루탐산), 2-아미노-헵탄디오산(2-아미노피멜산), 2-아미노-옥탄디오산(아미노수베르산) 및 2-아미노-4-카르복시-펜탄디오산(4-카르복시글루탐산)(이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체를 포함함)으로 구성된 목록으로부터 선택될 수 있되, 이들의 구조는 이러한 입체이성질체 형태를 허용해야 한다. 제한 없이 예로서, 프롤린 유사체는 3-메틸프롤린, 3,4-데하이드로-프롤린, 2-[(2S)-2-(하이드라진카르보닐)피롤리딘-1-일]-2-옥소아세트산, 베타-호모프롤린, 알파-메틸-프롤린, 하이드록시프롤린, 4-옥소-프롤린, 베타,베타-디메틸-프롤린, 5,5-디메틸-프롤린, 4-사이클로헥실-프롤린, 4-페닐-프롤린, 3-페닐-프롤린 및 4-아미노프롤린(이들의 D-입체이성질체 및 L-입체이성질체를 포함함)으로 구성된 목록으로부터 선택될 수 있되, 이들의 구조는 이러한 입체이성질체 형태를 허용해야 한다. 가능하게는 다른 아미노산과 함께, 본원에 개시된 게이트키퍼 모이어티 또는 모이어티들에 포함될 수 있는 아미노산의 추가 비제한적인 예는 디아미노피멜산이다. 가능하게는 다른 아미노산과 함께, 본원에 개시된 게이트키퍼 모이어티 또는 모이어티들에 포함될 수 있는 아미노산의 추가 비제한적인 예는 시트룰린이다.

제한 없이 예시로서, 분자 스트레치를 플랭킹할 수 있는 이러한 게이트키퍼 서열 또는 영역의 예는 각각 독립적으로 R, K, E, D, P, A, 디아미노피멜산, 시트룰린, RR, KK, EE, DD, PP, RK, KR, ED, DE, RRR, KKK, DDD, EEE, PPP, RRK, RKK, KKR, KRR, RKR, KRK, DDE, DEE, EED, EDD, EDE 또는 DED 등일 수 있고, 이때 임의의 아르기닌, 라이신, 글루타메이트, 아스파르테이트, 프롤린 또는 알라닌은 L-이성질체 또는 D-이성질체일 수 있고, 임의로 이때 임의의 아르기닌, 라이신, 글루타메이트, 아스파르테이트, 프롤린 또는 알라닌은 본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이 그의 유사체로 치환될 수 있다.

앞서 논의된 바와 같이, 분자는 RAS 단백질 APR에 의해 제공된 베타-가닥과 상호작용할 수 있는 베타-가닥 입체구조를 취하거나 모방하여, 상기 상호작용 베타-가닥에 의해 형성된 분자간 베타-시트를 생성할 수 있는 적어도 하나의 부분을 포함할 수 있지만, 특정 실시양태에서, 이러한 부분은 바람직하게는 분자간 베타-시트에 참여하는 아미노산 스트레치('분자 스트레치')일 수 있다. 특정 다른 실시양태에서, 상기 부분은 이러한 분자 스트레치의 펩타이드 모방체일 수 있다. 용어 "펩타이드 모방체"는 상응하는 펩타이드의 위상 유사체인 비-펩타이드 작용제를 지칭한다. 펩타이드의 펩타이드 모방체를 합리적으로 디자인하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 황산화된 8-mer 펩타이드 CCK26-33에 기반한 3개의 펩타이드 모방체 및 11-mer 펩타이드 물질 P에 기반한 2개의 펩타이드 모방체의 합리적인 디자인, 및 관련 펩타이드 모방체 디자인 원리는 문헌[Horwell 1995 (Trends Biotechnol 13: 132-134)]에 기재되어 있다.

분자의 나머지 구획들 또는 부분들이 상기 언급된 분자간 베타-시트 상호작용을 방해하지 않거나, 바람직하게는 촉진하거나 가능하게 하는 한, RAS APR의 베타-가닥과 맞물리도록 의도된 부분의 외부, 예컨대, 다시 말해 지금까지 논의된 '분자 스트레치 또는 스트레치들'의 외부의 분자의 화학적 성질과 구조는 비교적 덜 중요하다.

특정 실시양태에서, 분자가 본원에 논의된 바와 같이 2개 이상의 RAS 상호작용 분자 스트레치를 포함하고, 이 분자 스트레치 각각이 임의로 그리고 바람직하게는 게이트키퍼 영역에 의해 플랭킹되는 경우, 이 분자 스트레치들은 직접적으로 또는 바람직하게는 링커(스페이서로서도 알려져 있음)를 통해 연결, 특히 공유 연결된다. 이러한 링커 또는 스페이서의 혼입은 RAS와 상호작용하도록 더 많은 입체구조적 자유 및 더 적은 입체 장애를 개별 분자 스트레치에 부여할 수 있다. 임의로, 링커는 분자 스트레치 사이에 개재되는 것 외에도 분자의 첫 번째 분자 스트레치의 외부 및/또는 분자의 마지막 분자 스트레치의 외부에 추가될 수도 있다. 이것은 임의로 그리고 바람직하게는 게이트키퍼 영역에 의해 플랭킹된 하나의 분자 스트레치만을 포함하는 분자에 준용되고, 이때 링커는 단일 분자 스트레치의 한쪽 또는 양쪽 말단에 커플링될 수 있다.

이러한 링커의 성질 및 구조는 특별히 제한되지 않는다. 링커는 강성 링커 또는 유연성 링커일 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 공유 결합을 달성하는 공유 링커이다. 용어 "공유" 또는 "공유 결합"은 2개의 원자들 사이에 하나 이상의 전자 쌍의 공유를 수반하는 화학 결합을 지칭한다. 링커는 예를 들어, (폴리)펩타이드 또는 비-펩타이드 링커, 예컨대, 비-펩타이드 중합체, 예컨대, 비-생물학적 중합체일 수 있다. 바람직하게는, 임의의 결합은 연장된 기간 동안, 예를 들어, 며칠 동안 가수분해적으로 안정한 결합, 즉 특히 생리학적 조건을 비롯한 유용한 pH 값의 물에서 실질적으로 안정한 결합일 수 있다.

특정 실시양태에서, 각각의 링커는 1개 내지 20개의 동일하거나 동일하지 않은 유닛의 스트레치로부터 독립적으로 선택될 수 있고, 이때 유닛은 아미노산, 단당류, 뉴클레오타이드 또는 단량체이다. 동일하지 않은 유닛은 동일한 성질의 동일하지 않은 유닛(예를 들어, 상이한 아미노산 또는 일부 공중합체)일 수 있다. 이들은 상이한 성질의 동일하지 않은 유닛일 수도 있다(예를 들어, 아미노산 및 뉴클레오타이드 유닛을 가진 링커, 또는 2개 이상의 상이한 단량체 종을 포함하는 이종중합체(공중합체). 특정 실시양태에 따르면, 각각의 링커는 독립적으로 동일한 성질의 1개 내지 10개의 유닛, 특히 동일한 성질의 1개 내지 5개의 유닛으로 구성될 수 있다. 특정 실시양태에 따르면, 분자에 존재하는 모든 링커는 동일한 성질의 링커일 수 있거나 동일할 수 있다.

특정 실시양태에서, 임의의 하나의 링커는 하나 이상의 아미노산의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커일 수 있다. 특정 실시양태에서, 분자 내의 모든 링커는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커일 수 있다. 보다 구체적으로, 펩타이드 링커는 1개 내지 20개 아미노산 길이, 예컨대, 바람직하게는 1개 내지 10개 아미노산 길이, 예컨대, 보다 바람직하게는 2개 내지 5개 아미노산 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 링커는 정확히 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 아미노산 길이, 예컨대, 바람직하게는 정확히 2개, 3개 또는 4개 아미노산 길이를 가질 수 있다. 링커를 구성하는 아미노산의 성질은 링커에 의해 연결된 분자 스트레치의 생물학적 활성이 실질적으로 손상되지 않는 한 특별히 중요하지는 않다. 바람직한 링커는 본질적으로 면역원성을 나타내지 않고/않거나, 단백질분해에 의해 절단되는 경향이 없다. 특정 실시양태에서, 링커는 알파-나선 구조와 같은 예측된 2차 구조를 함유할 수 있다. 그러나, 유연한 무작위 코일 구조를 취할 것으로 예측되는 링커가 바람직하다. 베타-가닥을 형성하는 성향을 가진 링커는 덜 바람직할 수 있거나 피해야 할 필요가 있을 수 있다. 시스테인 잔기는 분자간 디설파이드 가교를 형성하는 그의 능력으로 인해 덜 바람직할 수 있거나 피해야 할 필요가 있을 수 있다. 염기성 또는 산성 아미노산 잔기, 예컨대, 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산은 의도되지 않은 정전기 상호작용에 대한 그들의 능력으로 인해 덜 바람직할 수 있거나 피해야 할 필요가 있을 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 펩타이드 링커는 글리신, 세린, 알라닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 프롤린(이들의 D-이성질체 및 유사체를 포함함) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이러한 아미노산으로 구성될 수 있거나, 이러한 아미노산으로 구성될 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 펩타이드 링커는 글리신, 세린, 알라닌, 트레오닌, 프롤린(이들의 D-이성질체 및 유사체를 포함함) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이러한 아미노산으로 구성될 수 있거나, 이러한 아미노산으로 구성될 수 있다. 훨씬 더 바람직한 실시양태에서, 펩타이드 링커는 글리신, 세린(이들의 D-이성질체 및 유사체를 포함함) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이러한 아미노산으로 구성될 수 있거나, 이러한 아미노산으로 구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 펩타이드 링커는 글리신 및 세린 잔기만으로 구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 펩타이드 링커는 글리신 잔기 또는 이의 유사체만으로, 바람직하게는 글리신 잔기만으로 구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 펩타이드 링커는 세린 잔기, 또는 이의 D-이성질체 또는 유사체만으로, 바람직하게는 세린 잔기만으로 구성될 수 있다. 이러한 링커는 특히 우수한 유연성을 제공한다. 특정 실시양태에서, 링커는 본질적으로 글리신 및 세린 잔기로 구성될 수 있거나, 글리신 및 세린 잔기로 구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 글리신 및 세린 잔기는 4:1 내지 1:4(수 기준), 예컨대, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2 또는 약 1:3 글리신:세린의 비로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 글리신은 예를 들어, 4:1 내지 1.5:1 글리신:세린, 예컨대, 약 3:1 또는 약 2:1 글리신:세린(수 기준)의 비로 세린보다 더 풍부할 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기는 둘 다 세린 잔기이거나; 링커의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기는 둘 다 글리신 잔기이거나; N-말단 잔기는 세린 잔기이고 C-말단 잔기는 글리신 잔기이거나; N-말단 잔기는 글리신 잔기이고 C-말단 잔기는 세린 잔기이다. 특정 실시양태에서, 펩타이드 링커는 프롤린 잔기, 또는 이의 D-이성질체 또는 유사체만으로, 바람직하게는 프롤린 잔기만으로 구성될 수 있다. 제한 없이 예로서, 본원에서 의도된 펩타이드 링커는 예를 들어, PP, PPP, GS, SG, SGG, SSG, GSS, GGS, GSGS(서열번호 14), AS, SA, GF, FF 등일 수 있다.

특정 실시양태에서, 링커는 비-펩타이드 링커일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 비-펩타이드 링커는 비-펩타이드 중합체를 포함할 수 있거나, 본질적으로 비-펩타이드 중합체로 구성될 수 있거나, 비-펩타이드 중합체로 구성될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "비-펩타이드 중합체"는 펩타이드 결합을 제외한 공유 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 반복 유닛을 포함하는 생체적합성 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 비-펩타이드 중합체는 2개 내지 200개 유닛 길이 또는 2개 내지 100개 유닛 길이 또는 2개 내지 50개 유닛 길이 또는 2개 내지 45개 유닛 길이 또는 2개 내지 40개 유닛 길이 또는 2개 내지 35개 유닛 길이 또는 2개 내지 30개 유닛 길이 또는 5개 내지 25개 유닛 길이 또는 5개 내지 20개 유닛 길이 또는 5개 내지 15개 유닛 길이를 가질 수 있다. 비-펩타이드 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리비닐 알코올, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 중합체, 예컨대, PLA(폴리젖산) 및 PLGA(폴리젖산-글리콜산), 지질 중합체, 키틴, 히알루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이 특히 바람직하다. 또 다른 구체적으로 예상되는 화학적 링커는 Ttds(4,7,10-트리옥사트리데칸-13-석신남산)이다. 비-펩타이드 중합체의 분자량은 바람직하게는 1 내지 100 kDa, 바람직하게는 1 내지 20 kDa일 수 있다. 비-펩타이드 중합체는 하나의 중합체, 또는 상이한 유형의 중합체의 조합일 수 있다. 비-펩타이드 중합체는 링커에 의해 커플링될 요소에 결합할 수 있는 반응성 기를 가진다. 바람직하게는, 비-펩타이드 중합체는 각각의 말단에서 반응성 기를 가진다. 바람직하게는, 반응성 기는 반응성 알데하이드 기, 프로피온 알데하이드 기, 부틸 알데하이드 기, 말레이미드 기 및 석신이미드 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 석신이미드 유도체는 석신이미딜 프로피오네이트, 하이드록시 석신이미딜, 석신이미딜 카르복시메틸 또는 석신이미딜 카르보네이트일 수 있다. 비-펩타이드 중합체의 양쪽 말단에 있는 반응성 기는 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 특정 실시양태에서, 비-펩타이드 중합체는 양쪽 말단에서 반응성 알데하이드 기를 가진다. 예를 들어, 비-펩타이드 중합체는 한쪽 말단에 말레이미드 기를 가질 수 있고 다른쪽 말단에서 알데하이드 기, 프로피온산 알데하이드 기 또는 부틸 알데하이드 기를 가질 수 있다. 양쪽 말단에서 반응성 하이드록시 기를 가진 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 비-펩타이드 중합체로서 사용하는 경우, 공지된 화학 반응으로 하이드록시 기를 다양한 반응성 기로 활성화시킬 수 있거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응성 기를 가진 PEG를 사용하여 단백질 접합체를 제조할 수 있다.

특정 특히 바람직한 실시양태에서, 분자의 작동 부분, 즉 RAS에 대한 효과를 담당하는 부분은 펩타이드일 수 있다. 달리 말하면, 이러한 실시양태에서, RAS APR과 상호작용하는 베타-가닥을 형성하는 분자 스트레치 또는 스트레치들, 바람직한 임의적 플랭킹 게이트키퍼 영역, 임의로 그리고 바람직하게는 분자 스트레치들 사이에 개재되는 링커, 및 임의로 그러나 덜 바람직하게는 최외각 분자 스트레치의 외부에 추가되는 링커는 모두 펩타이드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산(D-입체이성질체 및 L-입체이성질체, 및 아미노산 유사체를 포함할 수 있음)으로 구성된다. 바람직하게는, 분자의 이러한 펩타이드 작동 부분의 총 길이는 50개 아미노산을 초과하지 않고, 예컨대, 45개, 40개, 35개, 30개, 25개 또는 심지어 20개 아미노산을 초과하지 않는다. 본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 분자의 이러한 펩타이드 작동 부분은 하나 이상의 다른 모이어티에 커플링될 수 있고, 이 모이어티는 그 자체가 아미노산, 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있으나, 반드시 그러할 필요는 없고, 다른 기능, 예컨대, 분자의 검출을 허용하거나, 대상체에게 투여될 때 분자의 반감기를 증가시키거나, 분자의 용해도를 증가시키거나, 분자의 세포 흡수를 증가시키는 등의 기능을 제공할 수 있다. 특정 특히 바람직한 실시양태에서, 분자는 펩타이드이다. 바람직하게는, 이러한 펩타이드의 총 길이는 50개 아미노산을 초과하지 않으며, 예컨대, 45개, 40개, 35개, 30개, 25개 또는 심지어 20개 아미노산을 초과하지 않는다. 분자가 펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 펩타이드로 구성되거나, 펩타이드로 구성되는 경우, 예를 들어, 펩타이드인 경우, 상기 분자의 N-말단은 예를 들어, 아세틸화에 의해 변형될 수 있고/있거나, 상기 분자의 C-말단은 예를 들어, 아미드화에 의해 변형될 수 있다.

상기 논의에 비추어 볼 때, 특정 실시양태에서, 본원에 교시된 분자는 하기 구조를 포함하거나, 본질적으로 하기 구조로 구성되거나, 하기 구조로 구성되는 것으로서 편리하게 표시될 수 있다:

상기 구조에서,

P1 내지 P4는 각각 독립적으로 상기 교시된 아미노산 스트레치('분자 스트레치')를 표시하고,

NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4는 각각 독립적으로 상기 교시된 게이트키퍼 영역을 표시하고,

Z1 내지 Z3은 각각 독립적으로 상기 교시된 직접 결합 또는 바람직하게는 링커를 표시한다.

따라서, 구조 a)는 하나의 본원에 교시된 분자 스트레치만을 함유하는 분자를 지칭하는 반면, 구조 b), c) 및 d)는 각각 2개, 3개 또는 4개의 본원에 교시된 분자 스트레치를 함유하는 분자를 지칭한다.

특정 실시양태에서, 상기 설명된 바와 같이, NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4는 각각 독립적으로 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 나타내는 1개 내지 4개의 연속 아미노산, 예컨대, R, K, D, E, P, N, S, H, G, Q 및 A, 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 연속 아미노산, 바람직하게는 R, K, D, E, P, N, S, H, G 및 Q, 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 연속 아미노산, 보다 바람직하게는 R, K, D, E 및 P, 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 연속 아미노산을 표시할 수 있다. 특정 실시양태에서, NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4는 각각 독립적으로 R, K, A 및 D, 및 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 연속 아미노산을 표시할 수 있고, 예컨대, NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4는 각각 독립적으로 K, R, D, A 또는 KK일 수 있다. 특정 특히 바람직한 실시양태에서, NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4는 각각 독립적으로 R, K 및 D, 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 연속 아미노산을 표시할 수 있고, 예컨대, NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4는 각각 독립적으로 K, R, D 또는 KK일 수 있다.

특정 특히 바람직한 실시양태에서, 각각의 링커는 1개 내지 10개의 유닛, 바람직하게는 1개 내지 5개의 유닛의 스트레치로부터 독립적으로 선택되고, 이때 유닛은 각각 독립적으로 아미노산 또는 PEG이고, 예컨대, 각각의 링커는 독립적으로 GS, PP, AS, SA, GF, FF 또는 GSGS(서열번호 14), 또는 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체이고, 바람직하게는 각각의 링커는 독립적으로 GS, PP 또는 GSGS(서열번호 14), 바람직하게는 GS, 또는 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 각각 독립적으로 링커 대신에 직접 결합이 포함된다.

특정 바람직한 실시양태에서, 분자는 하기 구조의 펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이러한 펩타이드로 구성되거나, 이러한 펩타이드로 구성된다:

a) 게이트-Pept-게이트

b) 링커-게이트-Pept-게이트;

c) 게이트-Pept-게이트-링커;

d) 링커-게이트-Pept-게이트-링커;

e) 게이트-Pept-게이트-(링커)-게이트-Pept-게이트;

f) 링커-게이트-Pept-게이트-(링커)-게이트-Pept-게이트;

g) 게이트-Pept-게이트-(링커)-게이트-Pept-게이트-링커;

h) 링커-게이트-Pept-게이트-(링커)-게이트-Pept-게이트-링커;

i) 게이트-Pept-게이트-(링커)-게이트-Pept-게이트-(링커)-게이트-Pept-게이트;

j) 링커-게이트-Pept-게이트-(링커)-게이트-Pept-게이트-(링커)-게이트-Pept-게이트;

k) 게이트-Pept-게이트-(링커)-게이트-Pept-게이트-(링커)-게이트-Pept-게이트-링커; 또는

l) 링커-게이트-Pept-게이트-(링커)-게이트-Pept-게이트-(링커)-게이트-Pept-게이트-링커;

상기 구조에서, "게이트", "Pept" 및 "링커"는 펩타이드 결합(들)에 의해 인접 펩타이드 요소(들)에 결합된 펩타이드 요소를 표시하고, 이때 펩타이드 요소들의 왼쪽부터 오른쪽까지 순서는 펩타이드에서 그들의 N-말단부터 C-말단까지 조직화를 의미하고;

(G12 돌연변이체 RAS에 대한) "Pept"는 각각 독립적으로 LVVVGAVGVG(서열번호 26), VVVGAVGVG(서열번호 13), VVGAVGVG(서열번호 34), VGAVGVG(서열번호 35), LVVVGAVGV(서열번호 36), VVVGAVGV(서열번호 37), VVGAVGV(서열번호 38), VGAVGV(서열번호 39), LVVVGAVG(서열번호 40), VVVGAVG(서열번호 12), VVGAVG(서열번호 41), LVVVGAV(서열번호 11), VVVGAV(서열번호 10), LVVVGACGVG(서열번호 27), VVVGACGVG(서열번호 42), VVGACGVG(서열번호 43), VGACGVG(서열번호 44), LVVVGACGV(서열번호 28), VVVGACGV(서열번호 45), VVGACGV(서열번호 46), VGACGV(서열번호 47), LVVVGACG(서열번호 48), VVVGACG(서열번호 49), VVGACG(서열번호 30), LVVVGAC(서열번호 51), VVVGAC(서열번호 52), LVVVGAAGVG(서열번호 29), VVVGAAGVG(서열번호 53), VVGAAGVG(서열번호 54), VGAAGVG(서열번호 55), LVVVGAAGV(서열번호 30), VVVGAAGV(서열번호 56), VVGAAGV(서열번호 57), VGAAGV(서열번호 58), LVVVGAAG(서열번호 59), VVVGAAG(서열번호 60), VVGAAG(서열번호 61), LVVVGAA(서열번호 62), VVVGAA(서열번호 63), LVVVGASGVG(서열번호 31), VVVGASGVG(서열번호 64), VVGASGVG(서열번호 65), VGASGVG(서열번호 66), LVVVGASGV(서열번호 32), VVVGASGV(서열번호 67), VVGASGV(서열번호 68), VGASGV(서열번호 69), LVVVGASG(서열번호 33), VVVGASG(서열번호 70), VVGASG(서열번호 71), LVVVGAS(서열번호 72) 또는 VVVGAS(서열번호 73)이고, 임의로 이때 언급된 아미노산들 중 어느 하나 이상의 아미노산 또는 이들 전부는 이의 또는 이들의 D-이성질체(들), 또는 이의 또는 이들의 유사체(들)(이러한 유사체(들)의 L-이성질체 및 D-이성질체를 포함함)로 대체되거나(본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 시스테인을 함유하는 것으로 표시된 임의의 "Pept"에서 시스테인은 세린으로 교체될 수 있거나, 적절한 보호기 또는 디설파이드 가교에 의해 보호될 수 있음); (G13 돌연변이체 RAS에 대한) "Pept"는 각각 독립적으로 LVVVGAGVVG(서열번호 90), VVVGAGVVG(서열번호 102), VVGAGVVG(서열번호 103), VGAGVVG(서열번호 104), GAGVVG(서열번호 105), LVVVGAGVV(서열번호 106), VVVGAGVV(서열번호 107), VVGAGVV(서열번호 108), VGAGVV(서열번호 109), LVVVGAGV(서열번호 100), VVVGAGV(서열번호 99), VVGAGV(서열번호 110), LVVVGAGCVG(서열번호 92), VVVGAGCVG(서열번호 109), VVGAGCVG(서열번호 110), VGAGCVG(서열번호 111), GAGCVG(서열번호 112), LVVVGAGCV(서열번호 93), VVVGAGCV(서열번호 113), VVGAGCV(서열번호 114), VGAGCV(서열번호 115), LVVVGAGC(서열번호 116), VVVGAGC(서열번호 117), VVGAGC(서열번호 118), LVVVGAGSVG(서열번호 96), VVVGAGSVG(서열번호 119), VVGAGSVG(서열번호 120), VGAGSVG(서열번호 121), GAGSVG(서열번호 122), LVVVGAGSV(서열번호 97), VVVGAGSV(서열번호 123), VVGAGSV(서열번호 124), VGAGSV(서열번호 125), LVVVGAGS(서열번호 98), VVVGAGS(서열번호 126), VVGAGS(서열번호 127)이고, 임의로 이때 언급된 아미노산들 중 어느 하나 이상의 아미노산 또는 이들 전부는 이의 또는 이들의 D-이성질체(들), 또는 이의 또는 이들의 유사체(들)(이러한 유사체(들)의 L-이성질체 및 D-이성질체를 포함함)로 대체되고(본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 시스테인을 함유하는 것으로 표시된 임의의 "Pept"에서 시스테인은 세린으로 교체될 수 있거나, 적절한 보호기 또는 디설파이드 가교에 의해 보호될 수 있음);

"게이트"는 각각 독립적으로 라이신(K) 또는 D-라이신 또는 D-라이신 유사체 또는 L-라이신 유사체(바람직하게는 라이신), 아르기닌(R) 또는 D-아르기닌 또는 D-아르기닌 유사체 또는 L-아르기닌 유사체(바람직하게는 아르기닌), 아스파르트산(D) 또는 D-아스파르트산 또는 D-아스파르트산 유사체 또는 L-아스파르트산 유사체(바람직하게는 아스파르트산), 글루탐산(E) 또는 D-글루탐산 또는 D-글루탐산 유사체 또는 L-글루탐산 유사체(바람직하게는 글루탐산), KK, KKK, KKKK(서열번호 50), RR, RRR, RRRR(서열번호 133), DD, DDD, DDDD(서열번호 134), EE, EEE, EEEE(서열번호 135), KR, RK, KKR, KRK, RKK, RRK, RKR, KRR, KRKR(서열번호 136), KRRK(서열번호 137), RKKR(서열번호 138), DE, ED, DDE, DED, EED, EED, EDE, DEE, DEDE(서열번호 139), DEED(서열번호 140) 또는 EDDE(서열번호 141)이고, 임의로 이때 언급된 아미노산들 중 어느 하나 이상의 아미노산 또는 이들 전부는 이의 또는 이들의 D-이성질체(들), 또는 이의 또는 이들의 유사체(들)(이러한 유사체(들)의 L-이성질체 및 D-이성질체를 포함함)로 대체되고;

"링커"라는 단어가 괄호 안에 포함되는 것은 링커가 각각 독립적으로 부재할 수 있거나 바람직하게는 존재함을 의미하고, "링커"는 각각 독립적으로 글리신(G), 또는 D-글리신 유사체 또는 L-글리신 유사체(바람직하게는 글리신), 세린(S) 또는 D-세린, 또는 D-세린 유사체 또는 L-세린 유사체(바람직하게는 세린), 프롤린(P) 또는 D-프롤린, 또는 D-프롤린 유사체 또는 L-프롤린 유사체(바람직하게는 프롤린), GG, GGG, GGGG(서열번호 142), SS, SSS, SSSS(서열번호 143), GS, SG, GGS, GSG, SGG, SSG, SGS, SSG, GGGS(서열번호 144), GGSG(서열번호 145), GSGG(서열번호 146), SGGG(서열번호 147), GGSS(서열번호 148), GSSG(서열번호 149), SSGG(서열번호 150), GSGS(서열번호 14), SGSG(서열번호 151), GSGSG(서열번호 152), SGSGS(서열번호 153), PP, PPP 또는 PPPP(서열번호 154)이고, 임의로 이때 언급된 아미노산들 중 어느 하나 이상의 아미노산 또는 이들 전부는 이의 또는 이들의 D-이성질체(들), 또는 이의 또는 이들의 유사체(들)(이러한 유사체(들)의 L-이성질체 및 D-이성질체를 포함함)로 대체된다.

이러한 펩타이드에서, N-말단 아미노산은 변형될, 예컨대, 아세틸화될 수 있고/있거나, C-말단 아미노산은 변형될, 예컨대, 아미드화될 수 있다. 이러한 펩타이드에서, D-아미노산(들) 및/또는 아미노산 유사체(들)는, 이들의 혼입이 본원에 교시된 분자간 베타-시트의 형성과 양립할 수 있는 한, 혼입될 수 있다.

특정 특히 바람직한 실시양태에서, 분자는 표 5에 개별화된 펩타이드들 중 어느 한 펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이러한 펩타이드로 구성되거나, 이러한 펩타이드로 구성되고, 이때 표 5의 각각의 행은 개별 펩타이드를 나타내며, 표 5의 주어진 행 내의 각각의 칸은 그 행에 의해 개별화된 펩타이드에 포함된 개별 펩타이드 요소를 특정하고, 상기 펩타이드 요소는 펩타이드 결합(들)에 의해 그에 인접한 펩타이드 요소(들)에 결합되고, 표 5의 주어진 행에서 칸의 왼쪽부터 오른쪽까지 순서는 그 행에 의해 개별화된 펩타이드에서 그 칸에 의해 특정된 펩타이드 요소의 N-말단부터 C-말단까지 조직화를 의미하고, 이때 "Pept"의 경우, "i"은 VVVGAV(서열번호 10) 또는 VVVGAGV(서열번호 99), 바람직하게는 서열번호 10이고, "ii"는 LVVVGAV(서열번호 11) 또는 LVVVGAGV(서열번호 100), 바람직하게는 서열번호 11이고, "iii"은 VVVGAVG(서열번호 12) 또는 VVVGAGVV(서열번호 101), 바람직하게는 서열번호 12이고, "iv"는 VVVGAVGVG(서열번호 13) 또는 VVVGAGVVG(서열번호 102), 바람직하게는 서열번호 13이고, 임의로 이때 언급된 아미노산들 중 어느 하나 이상의 아미노산 또는 이들 전부는 이의 또는 이들의 D-이성질체(들), 또는 이의 또는 이들의 유사체(들)(이러한 유사체(들)의 L-이성질체 및 D-이성질체를 포함함)로 대체되고; 바람직하게는 "Pept"의 경우, "i"은 VVVGAV(서열번호 10)이고, "ii"는 LVVVGAV(서열번호 11)이고, "iii"은 VVVGAVG(서열번호 12)이고, "iv"는 VVVGAVGVG(서열번호 13)이고;

"게이트"의 경우, "i"은 라이신(K) 또는 D-라이신 또는 D-라이신 유사체 또는 L-라이신 유사체, 바람직하게는 라이신이고, "ii"는 아르기닌(R) 또는 D-아르기닌 또는 D-아르기닌 유사체 또는 L-아르기닌 유사체, 바람직하게는 아르기닌이고, "iii"은 아스파르트산(D) 또는 D-아스파르트산 또는 D-아스파르트산 유사체 또는 L-아스파르트산 유사체, 바람직하게는 아스파르트산이고, "iv"는 KK이고, 임의로 이때 언급된 아미노산들 중 어느 하나 이상의 아미노산 또는 이들 전부는 이의 또는 이들의 D-이성질체(들), 또는 이의 또는 이들의 유사체(들)(이러한 유사체(들)의 L-이성질체 및 D-이성질체를 포함함)로 대체되고; 바람직하게는 "게이트"의 경우, "i"은 K이고, "ii"는 R이고, "iii"은 D이고, "iv"는 KK이고;

부재할 수 있거나 바람직하게는 존재하는 "링커"의 경우, "i"은 GS이고, "ii"는 GSG이고, "iii"은 GSGS(서열번호 14)이고, "iv"는 PP이고, 임의로 이때 언급된 아미노산들 중 어느 하나 이상의 아미노산 또는 이들 전부는 이의 또는 이들의 D-이성질체(들), 또는 이의 또는 이들의 유사체(들)(이러한 유사체(들)의 L-이성질체 및 D-이성질체를 포함함)로 대체되고; 바람직하게는 "링커"의 경우, "i"은 GS이고, "ii"는 GSG이고, "iii"은 GSGS(서열번호 14)이고, "iv"는 PP이다.

[표 5]

표 5에 개별화된 펩타이드에서, N-말단 아미노산은 변형될, 예컨대, 아세틸화될 수 있고/있거나, C-말단 아미노산은 변형될, 예컨대, 아미드화될 수 있다. 이러한 펩타이드에서, D-아미노산(들) 및/또는 아미노산 유사체(들)는, 이들의 혼입이 본원에 교시된 분자간 베타-시트의 형성과 양립할 수 있는 한, 혼입될 수 있다.

본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이 또는 보다 구체적으로 표 5와 관련하여 정의된 바와 같이, 표 5에 개별화된 임의의 펩타이드는 각각 독립적으로 N-말단, 또는 C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 다에 추가되거나 융합된 추가 링커를 가질 수 있다.

특정 특히 바람직한 실시양태에서, 분자는 아미노산 서열 a) KVVVGAVKGSKVVVGAVK(서열번호 15); 또는 b) KLVVVGAVKGSKLVVVGAVK(서열번호 16); 또는 c) KVVVGAVGKGSKVVVGAVGK(서열번호 17); 또는 d) KVVVGAVGVGKGSKVVVGAVGVGK(서열번호 18)의 펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이러한 펩타이드로 구성되거나, 이러한 펩타이드로 구성되고, 임의로 이때 아미노산 서열은 하나 이상의 D-아미노산 및/또는 하나 이상의 그의 아미노산의 유사체를 포함하고, 임의로 이때 N-말단 아미노산은 아세틸화되고/되거나, C-말단 아미노산은 아미드화된다.

특정 특히 바람직한 실시양태에서, 분자는 아미노산 서열 a) KVVVGAVKGSKVVVGAVK(서열번호 15); b) KLVVVGAVKGSKLVVVGAVK(서열번호 16); c) KVVVGAVGKGSKVVVGAVGK(서열번호 17); 또는 d) KVVVGAVGVGKGSKVVVGAVGVGK(서열번호 18)의 펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이러한 펩타이드로 구성되거나, 이러한 펩타이드로 구성되고, 임의로 이때 N-말단 아미노산은 아세틸화되고/되거나, C-말단 아미노산은 아미드화된다.

특정 특히 바람직한 실시양태에서, 분자는 아미노산 서열 a) KVVVGAVKGSKVVVGAVK(서열번호 15); b) KLVVVGAVKGSKLVVVGAVK(서열번호 16); c) KVVVGAVGKGSKVVVGAVGK(서열번호 17); 또는 d) KVVVGAVGVGKGSKVVVGAVGVGK(서열번호 18)의 펩타이드로 구성되고, 임의로 이때 N-말단 아미노산은 아세틸화되고/되거나, C-말단 아미노산은 아미드화된다.

특정 특히 바람직한 실시양태에서, 분자는 아미노산 서열 a) KVVVGAGVKGSKVVVGAGVK(서열번호 128); 또는 b) KLVVVGAGVKGSKLVVVGAGVK(서열번호 129); 또는 c) KVVVGAGVVKGSKVVVGAGVVK(서열번호 130); 또는 d) KVVVGAGVVGKGSKVVVGAGVVGK(서열번호 131)의 펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이러한 펩타이드로 구성되거나, 이러한 펩타이드로 구성되고, 임의로 이때 아미노산 서열은 하나 이상의 D-아미노산 및/또는 하나 이상의 그의 아미노산의 유사체를 포함하고, 임의로 이때 N-말단 아미노산은 아세틸화되고/되거나, C-말단 아미노산은 아미드화된다.

특정 특히 바람직한 실시양태에서, 분자는 표 12에 나타낸 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 157, 158, 159, 161 내지 176, 178, 180 또는 181의 펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이러한 펩타이드로 구성되거나, 이러한 펩타이드로 구성되고, 임의로 이때 아미노산 서열은 하나 이상의 D-아미노산 및/또는 하나 이상의 그의 아미노산의 유사체를 포함하고, 임의로 이때 N-말단 아미노산은 아세틸화되고/되거나, C-말단 아미노산은 아미드화된다. 따라서, 특정 특히 바람직한 실시양태에서, 분자는 하기 아미노산 서열의 펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이러한 펩타이드로 구성되거나, 이러한 펩타이드로 구성되고:

a) [Dap]LSVFAIKGSKLSVFAI[Dap](서열번호 160); 또는

b) [Dap]VVVGAVKGSKVVVGAV[Dap](서열번호 161); 또는

c) [Dap]VVVGAVGKGSKVVVGAVG[Dap](서열번호 162); 또는

d) [Dap]VVVGAVGVGKGSKVVVGAVGVG[Dap](서열번호 163); 또는

e) [Cit]VVVGAVKGSKVVVGAVK(서열번호 164); 또는

f) KVVVGAV[Cit]GSKVVVGAVK(서열번호 165); 또는

g) AVVVGAVKGSKVVVGAVK(서열번호 166); 또는

h) KVVVGAVAGSKVVVGAVK(서열번호 167); 또는

i) KVVVGAVKGSAVVVGAVK(서열번호 168); 또는

j) KVVVGAVKGSKVVVGAVA(서열번호 169); 또는

k) AVVVGAVKGSAVVVGAVK(서열번호 170); 또는

l) KVVVGAVAGSKVVVGAVA(서열번호 171); 또는

m) AVVVGAVAGSKVVVGAVK(서열번호 172); 또는

n) KVVVGAVKASKVVVGAVK(서열번호 173); 또는

o) KVVVGAVKGAKVVVGAVK(서열번호 174); 또는

p) KVVVGAVGKGFKVVVGAVGK(서열번호 175); 또는

q) KVVVGAVGKFFKVVVGAVGK(서열번호 176); 또는

r) KVVVGAVGVGKKVVVGAVGVGK(서열번호 178);

임의로 이때 아미노산 서열은 하나 이상의 D-아미노산 및/또는 하나 이상의 그의 아미노산의 유사체를 포함하고, 임의로 이때 N-말단 아미노산은 아세틸화되고/되거나, C-말단 아미노산은 아미드화된다('[Dap]'는 디아미노피멜산을 표시하고, '[Cit]'는 시트룰린을 표시함).

특정 실시양태에서, 본원에 교시된 분자는 아미노산 서열 KLVVVGAVGV(서열번호 182)로 구성된 펩타이드가 아니다. 특정 실시양태에서, 본원에 교시된 분자는 아미노산 서열 KLVVVGAVGVGKSALTI(서열번호 183)로 구성된 펩타이드가 아니다. 특정 실시양태에서, 본원에 교시된 분자는 아미노산 서열 KLVVVGAVGVGKS(서열번호 184)로 구성된 펩타이드가 아니다.

앞서 이미 언급된 바와 같이, 특정 실시양태에서, 본원에 교시된 분자는 다른 기능을 제공할 수 있거나 다른 역할 및 활성을 수행할 수 있는 하나 이상의 추가 모이어티, 기, 구성요소 또는 부분을 포함할 수 있다. 이러한 기능, 역할 또는 활성은 예를 들어, 분자의 생성, 합성, 단리, 정제 또는 제제화와 관련하여, 또는 그의 실험적 또는 치료적 용도와 관련하여 유용할 수 있거나 요구될 수 있다. 편리하게는, 분자의 작동 부분, 즉 RAS에 대한 효과를 담당하는 부분은 직접적으로 또는 링커를 통해 하나 이상의 이러한 추가 모이어티, 기, 구성요소 또는 부분에 연결될 수 있고, 바람직하게는 공유 연결될 수 있거나, 결합될 수 있거나, 회합될 수 있거나 융합될 수 있다. 이러한 추가 모이어티, 기, 구성요소 또는 부분이 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질인 경우, 분자의 작동 부분에의 연결은 바람직하게는 직접적인 펩타이드 결합 또는 펩타이드 링커를 통한 펩타이드 결합을 수반할 수 있다.

모든 이러한 추가된 모이어티의 경우, 모이어티 및 분자가 그들의 특정 기능을 발휘할 수 있는 한, 융합 또는 링커의 성질은 본 발명에 중요하지 않다. 특정 실시양태에 따르면, 분자에 융합된 모이어티는 예를 들어, 프로테아제 인식 부위를 가진 링커 모이어티의 사용에 의해 절단될 수 있다. 이 방식으로, 모이어티와 분자의 기능을 분리할 수 있고, 이것은 더 큰 모이어티의 경우 또는 모이어티가 특정 시점 후에 더 이상 필요하지 않는 실시양태, 예를 들어, 태그를 사용한 분리 단계 후 절단되는 태그의 경우 특히 흥미로울 수 있다.

특정 바람직한 실시양태에서, 분자는 검출 가능한 표지, 분자의 단리를 허용하는 모이어티, 분자의 안정성을 증가시키는 모이어티, 분자의 용해도를 증가시키는 모이어티, 분자의 세포 흡수를 증가시키는 모이어티, 분자를 세포에 표적화하는 것을 달성하는 모이어티, 또는 이들 중 임의의 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 단일 모이어티가 2종 이상의 기능 또는 활성을 수행할 수 있음을 인식할 것이다.

따라서, 특정 실시양태에서, 분자는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 용어 "표지"는 검출 가능하고 바람직하게는 정량 가능한 판독값 또는 성질을 제공하는 데 사용될 수 있고 관심 있는 독립체, 예컨대, 본원에 교시된 분자, 예컨대, 본원에 교시된 펩타이드에 부착될 수 있거나 이의 일부가 될 수 있는 임의의 원자, 분자, 모이어티 또는 생체분자를 지칭한다. 표지는 예를 들어, 질량 분광측정 수단, 분광학적 수단, 광학 수단, 비색 수단, 자기 수단, 광화학적 수단, 생화학적 수단, 면역화학적 수단 또는 화학적 수단에 의해 적절하게 검출될 수 있다. 표지는 염료; 방사성표지, 예컨대, 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소, 염소 또는 요오드의 동위원소, 예컨대, 각각 ²H, ³H, ¹³C, ¹¹C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷O, ³¹P, ³²P, ³³P, ³⁵S, ¹⁸F, ³⁶Cl, ¹²⁵I 또는 ¹³¹I; 전자 조밀 시약; 효소(예를 들어, 면역어세이에 일반적으로 사용되는 호스라디쉬 퍼록시다제 또는 알칼리성 포스파타제); 결합 모이어티, 예컨대, 바이오틴-스트렙타비딘; 햅텐, 예컨대, 디곡시제닌; 발광, 인광 또는 형광 모이어티; 질량 태그; 단독으로 사용되거나, 형광 공명 에너지 전달(FRET)로 방출 스펙트럼을 억제할 수 있거나 이동시킬 수 있는 모이어티와 함께 사용되는 형광 염료(예를 들어, 형광단, 예컨대, 플루오레세인, 카르복시플루오레세인(FAM), 테트라클로로-플루오레세인, TAMRA, ROX, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Texas Red 등); 및 형광 단백질(예를 들어, GFP, RFP)을 제한 없이 포함한다. 본원에 교시된 펩타이드와 같은 특정 동위원소-표지된 분자, 예를 들어, 방사성 동위원소, 예컨대, ³H 및 ¹⁴C가 혼입되어 있는 분자는 약물 및/또는 기질 조직 분포 어세이에 유용하다. ³H 및 ¹⁴C 동위원소는 이들의 제조 및 검출 용이성으로 인해 특히 바람직하다. 추가로, ²H와 같은 더 무거운 동위원소로의 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들어, 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 용량 요구로부터 비롯된 특정 치료적 이점을 제공할 수 있으므로, 일부 상황에서 바람직할 수 있다. 동위원소-표지된 분자, 예컨대, 펩타이드는 일반적으로 쉽게 입수될 수 있는 동위원소-표지된 시약을 비-동위원소-표지된 시약 대신에 사용하는 제조 또는 합성 방법을 수행함으로써 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 또 다른 작용제(예를 들어, 프로브 결합 파트너)로 검출할 수 있게 하는 태그를 분자에 제공할 수 있다. 이러한 태그는 예를 들어, 바이오틴, 스트렙타비딘, his-태그, myc 태그, FLAG 태그(DYKDDDDK, 서열번호 74), 말토스, 말토스 결합 단백질, 또는 결합 파트너를 가진, 당업계에 공지된 임의의 다른 종류의 태그일 수 있다. 프로브:결합 파트너 배열에서 사용될 수 있는 회합의 예는 임의의 회합일 수 있고, 예를 들어, 바이오틴:스트렙타비딘, his-태그:금속 이온(예를 들어, Ni²⁺), 말토스:말토스 결합 단백질 등을 포함한다. 표지된 RAS 표적화 분자는 다양한 용도 및 적용, 예컨대, 제한 없이, 표지된 RAS 표적화 펩트-인이 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 관심 있는 RAS 단백질, 예컨대, 돌연변이체 RAS 단백질에 결합하여 이의 검출을 허용하는 원리를 제공할 수 있는 경우 진단 어세이를 비롯한 시험관내 어세이에서의 사용; 또는 투여 후 비-침습적 영상화 방법으로 체내의 표지된 RAS 표적화 펩트-인의 분포를 추적할 수 있는 경우 생체내 영상화에서의 사용에 적합할 수 있다.

추가 실시양태에서, 분자는 분자의 단리(분리, 정제)를 가능하게 하는 모이어티를 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 모이어티는 다른 성분으로부터 관심 있는 특정 성분을 단리하는 능력이 면역학적 결합제(항체)와 같은 분리 가능한 결합제와 관심 있는 성분 사이의 특이적 결합에 의해 부여되는 친화성 정제 방법과 함께 작동한다. 이러한 친화성 정제 방법은 친화성 크로마토그래피 및 자기 입자 분리를 제한 없이 포함한다. 이러한 모이어티는 당분야에 잘 알려져 있고, 비제한적인 예는 바이오틴(스트렙타비딘을 사용한 친화성 정제 방법을 이용하여 단리할 수 있음), his-태그(금속 이온, 예를 들어, Ni²⁺을 사용한 친화성 정제 방법을 이용하여 단리할 수 있음), 말토스(말토스 결합 단백질을 사용한 친화성 정제 방법을 이용하여 단리할 수 있음), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)(글루타티온을 사용한 친화성 정제 방법을 이용하여 단리할 수 있음), 또는 myc 또는 FLAG 태그(각각 항-myc 또는 항-FLAG 항체를 사용한 친화성 정제 방법을 이용하여 단리할 수 있음)를 포함한다.

추가 실시양태에서, 분자는 분자의 용해도를 증가시키는 모이어티를 포함할 수 있다. 분자의 용해도는 상기 논의된 바와 같이 분자 스트레치 또는 스트레치들을 플랭킹하는 게이트키퍼 부분의 포함에 의해 보장되고 제어될 수 있으므로, 이것은 원칙적으로 분자의 조기 응집을 방해하고 분자를 용액에서 유지하기에 충분할 수 있고, 용해도를 증가시키는, 즉 응집을 방해하는 모이어티를 추가로 추가하면 분자를 더 쉽게 취급할 수 있고, 특히 분자의 안정성과 저장 수명을 개선할 수 있다. 상기 논의된 대다수의 표지 및 단리 태그도 분자의 용해도를 증가시킬 것이다. 추가로, 이러한 가용화 모이어티의 잘 알려진 예는 PEG(폴리에틸렌 글리콜)이다. 이 모이어티는 가용화 모이어티뿐만 아니라 링커로서도 사용될 수 있기 때문에 특히 예상된다. 다른 예는 펩타이드 및 단백질 또는 단백질 도메인, 또는 심지어 전체 단백질, 예를 들어, GFP를 포함한다. 이와 관련하여, 하나의 모이어티는 PEG처럼 상이한 기능 또는 효과를 가질 수 있다는 점을 주목해야 한다. 예를 들어, FLAG 태그는 표지로서 사용될 수 있는 펩타이드 모이어티이지만, 그의 전하 밀도로 인해 가용화도 향상시킬 것이다. PEG화는 이미 종종 생물의약품의 용해도를 증가시키는 것으로 입증되었다(예를 들어, Veronese and Mero, BioDrugs. 2008; 22(5):315-29). 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 또는 단백질 도메인 태그를 관심 있는 분자에 추가하는 것은 당분야에 광범위하게 기재되어 있다. 예는 시누클레인(예를 들어, Park et al., Protein Eng. Des. Sel. 2004; 17:251-260), SET(용해성 향상 태그, Zhang et al., Protein Expr Purif 2004; 36:207-216), 티오레독신(TRX), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), N-이용 물질(NusA), 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO), 유비퀴틴(Ub), 디설파이드 결합 C(DsbC), 17 킬로달톤(Seventeen kilodalton) 단백질(Skp), 파지 T7 단백질 키나제 단편(T7PK), 단백질 G B1 도메인, 단백질 A IgG ZZ 반복부 도메인 및 세균 면역글로불린 결합 도메인(Hutt et al., J Biol Chem., 287(7):4462-9, 2012)으로부터 유래한 펩타이드들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 태그의 성질은 숙련된 자에 의해 확인될 수 있는 바와 같이 적용에 의해 좌우될 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 분자의 형질전환 발현의 경우, 분자를 더 큰 도메인에 융합시켜 세포 기구에 의한 조기 분해를 방해하는 것이 예상될 것이다. 다른 적용은 분자의 성질을 너무 많이 변경하지 않기 위해 더 작은 가용화 태그(예를 들어, 30개 미만의 아미노산, 또는 20개 미만의 아미노산, 또는 심지어 10개 미만의 아미노산)에의 융합을 예상할 수 있다.

추가 실시양태에서, 분자는 투여되었을 때 분자의 안정성을 증가시키고/시키거나 분자의 제거를 감소시키는 것을 포함할 수 있는, 분자의 안정성, 예를 들어, 분자의 저장 수명 및/또는 분자의 반감기를 증가시키는 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 모이어티는 분자의 약동학적 및 약력학적 성질을 조절할 수 있다. 상기 논의된 대다수의 표지, 단리 태그 및 가용화 태그는 분자의 저장 수명 또는 생체내 반감기도 증가시킬 것이고, D-아미노산 및/또는 아미노산 유사체의 포함도 그렇게 할 수 있다. 예를 들어, 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민), 알부민 결합 도메인 또는 합성 알부민 결합 펩타이드와의 융합은 다양한 치료 단백질들의 약동학 및 약력학을 개선하는 것으로 알려져 있다(Langenheim and Chen, Endocrinol.; 203(3): 375-87, 2009). 자주 사용되는 또 다른 모이어티는 항체의 단편 결정화 가능한 영역(Fc)이다. 문헌[Strohl, BioDrugs. 2015, vol. 29, 215-39]에는 인간 IgG Fc 도메인에의 융합, HSA에의 융합, 인간 트랜스페린에의 융합, 인공 젤라틴 유사 단백질(GLP)에의 융합 등을 제한 없이 포함하는, 생물제제의 반감기 연장을 위한 융합 단백질 기반 전략이 검토되어 있다. 특정 실시양태에서, 분자는 아가로스 비드, 라텍스 비드, 셀룰로스 비드, 자기 비드, 실리카 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 마이크로스피어, 유리 비드 또는 임의의 고체 지지체(예를 들어, 폴리스티렌, 플라스틱, 니트로셀룰로스 막, 유리) 또는 NusA 단백질에 융합되지 않는다. 그러나, 이 융합은 가능하고, 특정 실시양태에서 이 융합도 예상된다.

추가 실시양태에서, 분자는 분자의 세포 흡수를 증가시키는 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자는 세포 침투(또는 세포 전위)를 매개하는 서열을 추가로 포함할 수 있고, 즉 분자는 세포 침투 서열의 재조합 또는 합성 부착을 통해 추가로 변형된다. 세포 침투 펩타이드(CPP) 또는 단백질 형질도입 도메인(PTD) 서열은 당분야에 잘 알려져 있다. 이 용어들은 일반적으로 세포에 들어갈 수 있는 펩타이드를 지칭한다. 이 능력은 본원에 개시된 분자를 세포로 전달하는 데 활용될 수 있다. 예시적인 그러나 비제한적인 CPP는 HIV-1 Tat 유래의 CPP(예를 들어, 문헌[Frankel et al. 1988 (Science 240: 70-73)] 참조); 안테나페디아(Antennapedia) 펩타이드 또는 페네트라틴(penetratin)(예를 들어, 문헌[Derossi et al. 1994 (J Biol Chem 269: 10444-10450)] 참조); HSV-1 VP22 유래의 펩타이드(예를 들어, 문헌[Aints et al. 2001 (Gene Ther 8: 1051-1056)] 참조); 트랜스포탄(transportan)(예를 들어, 문헌[Pooga et al. 1998 (FASEB J 12: 67-77)] 참조); 프로테그린(protegrin) 1(PG-1) 항균 펩타이드 SynB(Kokryakov et al. 1993 (FEBS Lett 327: 231-236)); 모델 양친매성(MAP) 펩타이드(예를 들어, 문헌[Oehlke et al. 1998 (Biochim Biophys Acta 1414: 127-139)] 참조); 신호 서열 기반 세포 침투 펩타이드(NLS)(예를 들어, 문헌[Lin et al. 1995 (J Biol Chem 270: 14255-14258)] 참조); 소수성 막 전위 서열(MTS) 펩타이드(예를 들어, 상기 문헌[Lin et al. 1995] 참조); 및 폴리아르기닌, 올리고아르기닌 및 아르기닌 풍부 펩타이드(예를 들어, 문헌[Futaki et al. 2001 (J Biol Chem 276: 5836-5840)] 참조)를 포함한다. 다른 통상적으로 사용되는 세포 침투 펩타이드(천연 펩타이드 및 인공 펩타이드 둘 다)는 예를 들어, 문헌[Sawant and Torchilin, Mol Biosyst. 6(4):628-40, 2010; Noguchi et al., Cell Transplant. 19(6):649-54, 2010] 및 문헌[Lindgren and Langel, Methods Mol Biol. 683:3-19, 2011]에 개시되어 있다. 이 단백질들로부터 유래한 담체 펩타이드는 서로 서열 상동성을 거의 보이지 않으나, 모두 높은 양이온성 및 풍부한 아르기닌 또는 라이신을 가진다. CPP는 임의의 길이의 CPP일 수 있다. 예를 들어, CPP는 길이가 500개, 250개, 150개, 100개, 50개, 25개, 10개 또는 6개 이하의 아미노산일 수 있다. 예를 들어, CPP는 길이가 4개, 5개, 6개, 10개, 25개, 50개, 100개, 150개 또는 250개 이상의 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, CPP는 길이가 4개 내지 25개 아미노산일 수 있다. CPP의 적합한 길이와 디자인은 당분야에서 숙련된 자에 의해 용이하게 결정될 것이다. CPP에 대한 일반적인 참고문헌으로서 특히 문헌["Cell penetrating peptides: processes and applications" (ed. Ulo Langel, 1st ed., CRC Press 2002)]; 문헌[Advanced Drug Delivery Reviews 57: 489-660 (2005)]; 및 문헌[Dietz & Bahr 2004 (Moll Cell Neurosci 27: 85-131)]을 이용할 수 있다. 본원에 개시된 작용제는 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들어, 적합한 링커, 예컨대, 제한 없이 PEG 기반 링커에 의해 CPP와 접합될 수 있다. 본원에 기재된 분자는 세포에 들어가기 위해 CPP를 요구하지 않을 것이다. 실제로, 실시예에서 확인되는 바와 같이, 세포내 단백질을 표적화하는 것이 가능하고, 이러한 표적화는 분자가 세포에 의해 흡수되는 것을 요구하고, 이것은 CPP에의 융합 없이 일어난다.

추가 실시양태에서, 분자는 분자를 세포에 표적화하는 것을 달성하는 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자는 예를 들어, 주어진 표적에 대한 특이성, 특히 분자가 향하는 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS를 발현하는 세포에 대한 특이성, 또는 그 세포의 표면에 특이적으로 발현된 단백질에 대한 특이성을 가진 항체, 펩타이드 또는 소분자에 융합될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 분자는 표적화된 세포에서 특이적으로 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS의 하향조절 또는 응집을 시작한다. 일부 경우, 결합 도메인은 화학적 화합물(예를 들어, 적어도 하나의 표적 단백질에 대해 친화성을 가진 작은 화합물)이고, 일부 다른 경우 결합 도메인은 폴리펩타이드이고, 일부 다른 경우 결합 도메인은 단백질 도메인이다. 단백질 결합 도메인은 자가 안정화하고 종종 단백질 쇄의 나머지 부분과 관계없이 접히는 전체 단백질 구조의 요소이다. 결합 도메인의 길이는 약 25개 아미노산 내지 최대 500개 아미노산이거나 더 길 수 있다. 많은 결합 도메인은 접힘으로 분류될 수 있고 인식 가능하고 식별 가능한 3D 구조이다. 일부 접힘은 특별한 명칭이 주어질 정도로 많은 상이한 단백질들에서 흔하다. 비제한적인 예는 로스만(Rossman) 접힘, TIM 배럴(barrel), 아르마딜로(armadillo) 반복부, 류신 지퍼, 캐드헤린(cadherin) 도메인, 사멸 이펙터 도메인, 면역글로불린 유사 도메인, 포스포티로신 결합 도메인, 플렉스트린(pleckstrin) 상동성 도메인, src 상동성 2 도메인, BRCA1의 BRCT 도메인, G-단백질 결합 도메인, Eps 15 상동성(EH) 도메인 및 p53의 단백질 결합 도메인이다. 항체는 소위 상보성 결정 영역(CDR)인 초가변 루프 영역을 통해 매개된 특이성을 가진 특이적 결합 단백질의 천연 원형이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 그의 가장 넓은 의미로 사용되고 일반적으로 임의의 면역학적 결합제를 지칭한다. 상기 용어는 구체적으로 온전한 단일클론 항체, 다중클론 항체, 적어도 2개의 온전한 항체로부터 형성된 다가(예를 들어, 2가 또는 3가 이상) 및/또는 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 이상의 항체), 및 원하는 생물학적 활성(특히, 관심 있는 항원에 특이적으로 결합하는 능력, 즉 항원 결합 단편)을 나타내는 항체 단편뿐만 아니라, 이러한 단편의 다가 및/또는 다중특이적 복합체도 포괄한다. 용어 "항체"는 면역화를 포함하는 방법에 의해 생성된 항체를 포함할 뿐만 아니라, 관심 있는 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하도록 만들어진 임의의 폴리펩타이드, 예를 들어, 재조합적으로 발현된 폴리펩타이드도 포함한다. 따라서, 상기 용어는 시험관내 또는 생체내에서 생성되는지 여부와 관계없이 이러한 분자에 적용된다.

항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 클래스 중 임의의 클래스 항체일 수 있으며, 바람직하게는 IgG 클래스 항체일 수 있다. 항체는 다중클론 항체, 예를 들어, 항혈청 또는 이로부터 정제된(예를 들어, 친화성 정제된) 면역글로불린일 수 있다. 항체는 단일클론 항체, 또는 단일클론 항체의 혼합물일 수 있다. 단일클론 항체는 더 큰 선택성 및 재현성으로 특정 항원 또는 항원 내의 특정 에피토프를 표적화할 수 있다. 제한 없이 예로서, 단일클론 항체는 문헌[Kohler et al. 1975 (Nature 256: 495)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에서와 같이)에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체는 예를 들어, 문헌[Clackson et al. 1991 (Nature 352: 624-628)] 및 문헌[Marks et al. 1991 (J Mol Biol 222: 581-597)]에 기재된 기법을 이용함으로써 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

항체 결합제는 항체 단편일 수 있다. "항체 단편"은 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 단일 도메인(sd) Fv, 예컨대, VH 도메인, VL 도메인 및 VHH 도메인; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자, 특히 중쇄 항체; 및 항체 단편(들)으로부터 형성된 다가 및/또는 다중특이적 항체, 예를 들어, 디바디, 트리바디 및 멀티바디를 포함한다. 상기 명칭 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 등은 이들의 분야에서 확립된 의미를 갖기 위한 것이다.

용어 항체는 임의의 동물 종, 바람직하게는 예를 들어, 조류 및 포유동물을 비롯한 척추동물 종으로부터 유래한 하나 이상의 부분으로부터 유래하거나 이를 포함하는 항체를 포함한다. 제한 없이, 항체는 닭, 칠면조, 거위, 오리, 뿔닭, 메추라기 또는 꿩일 수 있다. 또한, 제한 없이, 항체는 인간, 뮤린(예를 들어, 마우스, 래트 등), 당나귀, 토끼, 염소, 양, 기니피그, 낙타(예를 들어, 카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로마데리우스(Camelus dromaderius)), 라마(예를 들어, 라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 또는 라마 비쿠그나(Lama vicugna)) 또는 말일 수 있다.

숙련된 자는 항체가 하나 이상의 아미노산 결실, 추가 및/또는 치환(예를 들어, 보존적 치환)을 포함할 수 있되, 단 이러한 변경은 항체와 각각의 항원의 결합을 보존해야 함을 이해할 것이다. 항체는 그의 구성요소인 아미노산 잔기의 하나 이상의 천연 또는 인공 변형(예를 들어, 글리코실화 등)도 포함할 수 있다.

다중클론 및 단일클론 항체뿐만 아니라 이들의 단편도 제조하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있고, 재조합 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법도 마찬가지이다(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988; Harlow and Lane, "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447; "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", by Zola, ed., CRC Press 1987, ISBN 0849364760; "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach", by Dean & Shepherd, eds., Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229; Methods in Molecular Biology, vol. 248: "Antibody Engineering: Methods and Protocols", Lo, ed., Humana Press 2004, ISBN 1588290921] 참조).

특정 실시양태에서, 작용제는 나노바디(Nanobody)^®일 수 있다. 용어 "나노바디^®" 및 "나노바디들^®"은 애블린스 엔브이(Ablynx NV)(벨기에)의 상표이다. 용어 "나노바디"는 당분야에 잘 알려져 있고, 본원에 사용된 바와 같이 그의 가장 넓은 의미로 (1) 중쇄 항체, 바람직하게는 낙타과로부터 유래한 중쇄 항체의 V_HH 도메인의 단리; (2) V_HH 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현; (3) 천연 생성 V_HH 도메인의 "인간화" 또는 이러한 인간화된 V_HH 도메인을 코딩하는 핵산의 발현; (4) 임의의 동물 종, 특히 포유동물 종, 예컨대, 인간으로부터의 V_H 도메인의 "낙타화", 또는 이러한 낙타화된 V_H 도메인을 코딩하는 핵산의 발현; (5) 당분야에 기재된 바와 같은 "도메인 항체" 또는 "dAb"의 "낙타화", 또는 이러한 낙타화된 dAb를 코딩하는 핵산의 발현; (6) 단백질, 폴리펩타이드 또는 그 자체로 공지된 다른 아미노산 서열을 제조하는 합성 또는 반합성 기법의 이용; (7) 그 자체로 공지된 핵산 합성 기법을 이용한 나노바디 코딩 핵산의 제조 후, 이로써 수득된 핵산의 발현; 및/또는 (8) 상기 방법들 중 하나 이상의 방법의 임의의 조합에 의해 수득된 면역학적 결합제를 포괄한다. 본원에서 사용된 "낙타과"는 구세계 낙타과(카멜루스 박트리아누스 및 카멜루스 드로마데리우스) 및 신세계 낙타과(예를 들어, 라마 파코스, 라마 글라마 또는 라마 비쿠그나)를 포함한다.

일반적으로, 항체 유사 스캐폴드는 특이적 결합제로서 잘 작동하는 것으로 입증되었지만, CDR 유사 루프를 표시하는 단단한 스캐폴드의 패러다임을 엄격하게 고수할 필요가 없다는 것은 자명해졌다. 항체 이외의 많은 다른 천연 단백질들이 도메인들 사이의 특이적 고친화성 상호작용을 매개한다. 면역글로불린에 대한 대안은 신규 결합(인식) 분자의 디자인을 위한 매력적인 출발점을 제공하였다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 스캐폴드는 특정 표적 단백질에의 결합을 부여하는 변경된 아미노산 또는 서열 삽입을 보유할 수 있는 단백질 프레임워크를 지칭한다. 스캐폴드의 조작과 라이브러리의 디자인은 서로 상호의존적인 과정이다. 특이적 결합제를 수득하기 위해, 스캐폴드의 조합 라이브러리를 생성해야 한다. 이것은 통상적으로 축퇴 코돈 또는 트리뉴클레오타이드를 사용하여 적절한 아미노산 위치에서 코돈을 무작위화함으로써 DNA 수준에서 수행된다. 광범위하게 다양한 기원과 특성을 가진 매우 다양한 비-면역글로불린 스캐폴드들이 조합 라이브러리 디스플레이에 현재 사용된다. 이들 중 일부는 크기가 항체의 scFv(약 30 kDa)에 필적할만하지만, 이들 중 대다수는 훨씬 더 작다. 반복부 단백질에 기반한 모듈식 스캐폴드는 반복 유닛의 수에 따라 크기가 달라진다. 예의 비제한적인 목록은 인간 10번째 피브로넥틴 유형 III 도메인에 기반한 결합제, 리포칼린에 기반한 결합제, SH3 도메인에 기반한 결합제, 노틴 패밀리의 구성원에 기반한 결합제, CTLA-4에 기반한 결합제, T-세포 수용체, 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 탄수화물 결합 모듈 4-2, 텐다미스타트(tendamistat), 쿠니츠(kunitz) 도메인 억제제, PDZ 도메인, Src 상동성 도메인(SH2), 전갈 독소, 곤충 데펜신(defensin) A, 식물 호메오도메인(homeodomain) 핑거 단백질, 세균 효소 TEM-1 베타-락타마제, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 이. 콜라이(E. coli) 콜리신 E7 면역 단백질, 이. 콜라이 사이토크롬 b562, 안키린(ankyrin) 반복부 도메인을 포함한다. 따라서, 용어 "항체 유사 단백질 스캐폴드" 또는 "조작된 단백질 스캐폴드"는 넓게는 전형적으로 조합 조작(예컨대, 파지 디스플레이 또는 다른 분자 선택 기법과 병용되는 부위 지정 무작위 돌연변이유발)에 의해 수득된 단백질성 비-면역글로불린 특이적 결합제를 포괄한다. 통상적으로, 이러한 스캐폴드는 견고하고 작은 가용성 단량체 단백질(예컨대, 쿠니츠 억제제 또는 리포칼린), 또는 세포 표면 수용체의 안정적으로 접힌 막외 도메인(예컨대, 단백질 A, 피브로넥틴 또는 안키린 반복부)으로부터 유래한다. 이러한 스캐폴드는 문헌[Binz et al., Gebauer and Skerra, Gill and Damle, Skerra 2000, and Skerra 2007]에서 광범위하게 검토되었고, 그의 알파-나선들 중 2개의 알파-나선 상에 계면을 제공하는 58개 잔기의 3-나선 다발인, 스타필로코커스 단백질 A의 Z-도메인에 기반한 아피바디(Nygren); 다양한 프로테아제 특이성을 위해 조작될 수 있는, 전형적으로 인간 기원의 작고(약 58개 잔기) 강력한 디설파이드 가교결합된 세린 프로테아제 억제제(예를 들어, LACI-D1)에 기반한 조작된 구니츠 도메인(Nixon 및 Wood); 2개 또는 3개의 노출된 루프를 가진 Ig 유사 베타-샌드위치 접힘(94개 잔기)을 채택하되, 중심 디설파이드 가교를 결여하는, 인간 피브로넥틴 III의 10번째 세포외 도메인(10Fn3)에 기반한 모노바디 또는 애드넥틴(Koide and Koide); 인간, 곤충 및 많은 다른 유기체에 풍부한, 개방 말단에서 4개의 구조적 가변 루프를 통해 작은 리간드에 대한 결합 부위를 천연적으로 형성하는 8-가닥 베타-배럴 단백질(약 180개 잔기)의 다양한 패밀리인 리포칼린으로부터 유래한 안티칼린(Skerra 2008); 전형적으로 3회 반복된 베타-회전으로부터 비롯된 단단한 계면을 제공하는, 디자인된 안키린 반복부 도메인(166개 잔기)인 DARPin(Stumpp et al.); 아비머(다량체화된 LDLR-A 모듈)(Silverman et al.); 및 시스테인 풍부 노틴(knottin) 펩타이드(Kolmar)를 제한 없이 포함한다. 주어진 표적 단백질에 대한 특이성을 가진 화합물, 환형 및 선형 펩타이드 결합제, 펩타이드 앱타머, 다가 아비머 단백질 또는 작은 모듈식 면역약학 약물, 수용체 또는 보조수용체에 대한 특이성을 가진 리간드, 투-하이브리드 분석에서 확인된 단백질 결합 파트너, 바이오틴-아비딘 고친화성 상호작용의 특이성에 기반한 결합 도메인, 사이클로필린-FK506 결합 단백질의 특이성에 기반한 결합 도메인도 결합 도메인으로서 포함된다. 특정 탄수화물 구조에 친화성을 가진 렉틴도 포함된다.

예를 들어, G12 또는 G13 RAS 돌연변이는 종종 암에서 발견되기 때문에, 본 분자에 융합된 단일클론 항체는 대상체의 종양 세포에 의해 발현된 단백질, 예컨대, 종양 항원, 바람직하게는 표면 종양 항원에 특이적으로 결합하도록 구성될 수 있다. 용어 "종양 항원"은 정상 또는 비-신생물성 세포에 비해, 세포내에서 발현되든 아니면 종양 세포 표면에서 발현되든 관계없이(바람직하게는 종양 세포 표면에서 발현됨) 종양 세포에 의해 독특하게 또는 차등적으로 발현되는 항원을 지칭한다. 예를 들어, 종양 항원은 종양 세포 내에 또는 상에 존재할 수 있고 전형적으로 정상 세포 또는 비-신생물성 세포 내에 또는 상에 존재하지 않을 수 있거나(예를 들어, 고환 및/또는 태반과 같은 제한된 수의 정상 조직에 의해서만 발현됨), 종양 항원은 정상 또는 비-신생물성 세포보다 더 많은 양으로 종양 세포 내에 또는 상에 존재할 수 있거나, 종양 항원은 정상 또는 비-신생물성 세포 내에서 또는 상에서 발견되는 형태와 상이한 형태로 종양 세포 내에 또는 상에 존재할 수 있다. 따라서, 상기 용어는 종양 특이적 막 항원을 포함하는 종양 특이적 항원(TSA), 종양 관련 막 항원을 포함하는 종양 관련 항원(TAA), 종양 상의 배아 항원, 성장 인자 수용체, 성장 인자 리간드 등을 포함한다. 상기 용어는 암/고환(CT) 항원을 추가로 포함한다. 종양 항원의 예는 β-인간 융모막 고나도트로핀(βHCG), 당단백질 100(gp100/Pme117), 암배아 항원(CEA), 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질 1(gp75/TRP1), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP-2), NY-BR-1, NY-CO-58, NY-ESO-1, MN/gp250, 이디오타입, 텔로머라제, 활액 육종 X 중단점 2(SSX2), 뮤신 1(MUC-1), 흑색종 관련 항원(MAGE) 패밀리의 항원, 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART1), 윌름스 종양 유전자 1(WT1), HER2/neu, 메소텔린(MSLN), 알파태아단백질(AFP), 암 항원 125(CA-125) 및 비정상적인 형태의 ras 또는 p53을 제한 없이 포함한다. 신생물성 질환의 추가 표적은 CD37(만성 림프구성 백혈병), CD123(급성 골수성 백혈병), CD30(호지킨/대세포 림프종), MET(NSCLC, 위식도암), IL-6(NSCLC) 및 GITR(악성 흑색종)을 제한 없이 포함한다.

다른 모이어티가 분자에 융합되는 경우, 이 모이어티가 분자로부터 제거될 수 있음이 특정 실시양태에서 예상된다. 전형적으로, 이것은 특이적 프로테아제 절단 부위의 혼입 또는 동등한 접근법을 통해 수행될 것이다. 이것은 특히 모이어티가 큰 단백질인 경우이다: 이러한 경우, 모이어티는 본원에 기재된 임의의 방법에서 분자를 사용하기 전(예를 들어, 분자의 정제 동안)에 절단될 수 있다.

그러나, 분자 자체가 특이적 서열 인식을 통해 그의 표적을 찾을 수 있기 때문에, 표적화 모이어티는 필요하지 않음을 주목한다. 대안적 실시양태에서, 이것은 또한 분자를 표적화 모이어티로서 사용할 수 있게 하고 약물, 독소 또는 소분자와 같은 다른 모이어티에 추가로 융합될 수 있게 한다. 분자를 돌연변이된 RAS에 표적화함으로써, 이 화합물을 특정 세포 유형/구획에 표적화할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 독소는 돌연변이체 RAS를 발현하는 암 세포에게 선택적으로 전달될 수 있다.

본 발명은 국제 특허출원 공개 제WO2007/071789호(A1) 및 제WO2012/123419호(A1)에 일반적으로 기재되어 있는 '간섭제' 기술을 이용하고, 예상치 못한 표적화 특이성이 본원에 의해 입증된 특정 상황인 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS에 이 기술을 적용하기 때문에, 이러한 '간섭제' 분자를 생성하고 단리하고 정제하고 저장하고 제제화할 수 있는 방식에 관한 국제 특허출원 공개 제WO2007/071789호(A1) 및 제WO2012/123419호(A1)의 교시는 본 발명의 맥락에서 적용될 수 있으며 본원에서 매우 상세히 설명될 필요가 없음을 인식할 것이다.

언급된 바와 같이, 특정 실시양태에서, 분자의 작동 부분은 펩타이드를 포함할 수 있거나, 본질적으로 펩타이드로 구성될 수 있거나 펩타이드로 구성될 수 있고, 바람직하게는 분자의 작동 부분은 펩타이드일 수 있다. 더욱이, 많은 실시양태에서, 예를 들어, 분자의 작동 부분이 다른 보조 모이어티에 연결되지 않거나 융합되지 않는 경우, 또는 이러한 추가 모이어티 또는 모이어티들 그 자체가 펩타이드인 경우, 전체 분자는 펩타이드일 수 있다. 따라서, 화학적 펩타이드 합성, 또는 재조합 펩타이드 또는 폴리펩타이드 제조의 표준 수단 및 방법이 본 분자의 제조에 적용될 수 있다. 재조합 단백질 제조는 그 자체로 단백질성 모이어티인 추가 모이어티 또는 모이어티들이 분자에 포함되고 펩타이드 결합에 의해 분자의 작동 부분에 융합되어 있는 분자를 제조하는 데 적용될 수도 있다.

이러한 기법이 일반적으로 일상적이 되었다는 점을 고려할 때, 간결함을 위해, 본 분자의 재조합 제조는 본원에 교시된 분자를 코딩하는 핵산 및 이 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 또는 발현 벡터를 사용할 수 있고, 이때 상기 발현 카세트 또는 발현 벡터는 적합한 숙주 세포, 예컨대, 세균 세포, 효모 세포를 비롯한 진균 세포, 동물 세포, 또는 인간 세포 및 비인간 포유동물 세포를 비롯한 포유동물 세포에서 분자의 발현을 달성하도록 구성된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 박테리오파지, 박테리오파지 유래의 벡터, PAC, BAC, 선형 핵산, 예를 들어, 선형 DNA 또는 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 자율적일 수 있거나 통합적일 수 있다. 발현 벡터는 형질전환된 세포의 검출 및/또는 선택을 허용하기 위해 선택 마커(들), 예를 들어, URA3, TRP1을 함유할 수 있다. 작동 가능한 연결은 조절 서열 및 발현시키고자 하는 서열이 상기 발현을 허용하는 방식으로 연결되는 연결이다. 프로모터는 항시성 또는 유도성(조건부) 프로모터, 예를 들어, 화학적으로 조절되거나 물리적으로 조절되는 유도성 프로모터일 수 있다. 프로모터의 비제한적인 예는 T7, U6, H1, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함한다. 전사 터미네이터 및 임의로 전사 인핸서가 포함될 수 있다. 재조합 핵산은 다양한 방법들, 예컨대, 직접 주입, 원형질체 융합, 염화칼슘, 염화루비듐, 염화리튬, 인산칼슘, DEAE 덱스트란, 양이온성 지질 또는 리포좀, 유전자총법 입자 충격("유전자 총" 방법), 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 안티바이러스로부터 유래함)를 사용한 감염, 전기천공 등의 이용을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 소규모 또는 대규모 제조에 사용될 수 있는 발현 시스템(숙주 세포)은 미생물, 예컨대, 세균(예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia. coli), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 브루셀라(Brucella) 종, 살모넬라 팀피뮤리움(Salmonella tymphimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 진균 세포(예를 들어, 야로위아 리폴라이티카(Yarrowia lipolytica), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans)), 메틸영양 효모(예를 들어, 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 오가테아(Oogataea), 피키아(Pichia) 또는 토룰롭시스(Torulopsis) 속의 메틸영양 효모, 예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 오가테아 미누타(Ogataea minuta) 또는 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica)), 또는 아스퍼길루스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora), 푸사리움(Fusarium) 또는 크리소스포리움(Chrysosporium) 속의 사상 진균, 예를 들어, 아스퍼길루스 니게르(Aspergillus niger), 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei), 또는 사카로마이스세스(Saccharomyces) 또는 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속의 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), 곤충 세포 시스템(예를 들어, 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)로부터 유래한 세포, 예컨대, Schneider 2 세포, 군벌레 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터 유래한 세포주, 예컨대, Sf9 및 Sf21 세포, 또는 양배추 자벌레 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)로부터 유래한 세포, 예컨대, High Five 세포), 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 담배 모자이크 바이러스)에 감염되었거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)에 의해 형질전환된 식물 세포 시스템을 제한 없이 포함한다. 포유동물 발현 시스템은 인간 및 비인간 포유동물 세포, 예컨대, 설치류 세포, 영장류 세포 또는 인간 세포를 포함한다. 인간 또는 비인간 포유동물 세포와 같은 포유동물 세포는 1차 세포, 2차 세포, 3차 세포 등을 포함할 수 있거나, 클론 세포주를 비롯한 불멸화된 세포주를 포함할 수 있다. 바람직한 동물 세포는 조직 배양에서 용이하게 유지될 수 있고 형질전환될 수 있다. 인간 세포의 비제한적인 예는 인간 HeLa(자궁경부암) 세포주를 포함한다. 조직 배양 실습에서 일반적으로 사용되는 다른 인간 세포주는 특히 인간 배아 신장 293 세포(HEK 세포), DU145(전립선암), Lncap(전립선암), MCF-7(유방암), MDA-MB-438(유방암), PC3(전립선암), T47D(유방암), THP-1(급성 골수성 백혈병), U87(교모세포종), SHSY5Y(신경모세포종) 또는 Saos-2 세포(골암)를 포함한다. 영장류 세포의 비제한적인 예는 Vero(아프리카 녹색 원숭이 버빗원숭이(Chlorocebus) 신장 상피 세포주) 세포 및 COS 세포이다. 설치류 세포의 비제한적인 예는 래트 GH3(뇌하수체 종양), CHO(중국 햄스터 난소), PC12(갈색세포종) 세포주, 또는 마우스 MC3T3(배아 두개관) 세포주이다.

본원에서 제조된 임의의 분자, 예컨대, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 적절하게 정제될 수 있다. 분자, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 관련하여 용어 "정제된"은 절대적인 순도를 요구하지 않는다. 대신, 상기 용어는 다른 성분에 비해 이러한 분자, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이 출발 조성물 또는 샘플, 예를 들어, 제조 샘플, 예컨대, 분자, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 생성하는 재조합 숙주 세포의 용해물 또는 상청액에서의 존재도보다 더 큰 존재도(질량 또는 중량 또는 농도의 관점에서 편리하게 표현됨)로 분리된 환경에 있음을 의미한다. 분리된 환경은 단일 매질, 예를 들어, 단일 용액, 겔, 침전물, 동결건조물 등을 의미한다. 정제된 분자, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 예를 들어, 화학적 합성, 크로마토그래피, 분취 전기영동, 원심분리, 침전, 친화성 정제 등을 비롯한 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 정제된 분자, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 바람직하게는 중량 기준으로 분리된 환경의 비-용매 함량의 ≥ 10%, 보다 바람직하게는 ≥ 50%, 예컨대, ≥ 60%, 보다 바람직하게는 ≥ 70%, 예컨대, ≥ 80%, 훨씬 더 바람직하게는 ≥ 90%, 예컨대, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% 또는 심지어 100%를 구성할 수 있다. 예를 들어, 정제된 분자, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 바람직하게는 중량 기준으로 분리된 환경의 단백질 함량의 ≥ 10%, 보다 바람직하게는 ≥ 50%, 예컨대, ≥ 60%, 보다 바람직하게는 ≥ 70%, 예컨대, ≥ 80%, 훨씬 더 바람직하게는 ≥ 90%, 예컨대, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% 또는 심지어 100%를 구성할 수 있다. 단백질 함량은 임의로 문헌[Hartree 1972 (Anal Biochem 48: 422-427)]에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 로우리(Lowry) 방법(Lowry et al. 1951. J Biol Chem 193: 265)에 의해 측정될 수 있다. 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 순도는 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에 HPLC 또는 SDS-PAGE에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 제조된 임의의 분자, 예컨대, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 다운스트림 사용에 편리한 분자의 농도, 예컨대, 제한 없이, 약 1 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 250 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 20 mM로 탈이온수 또는 DMSO 함유 탈이온수, 예를 들어, 탈이온수 중의 50% v/v DMSO, 또는 수용액, 또는 적합한 완충제, 예컨대, 생리학적 pH 또는 5 내지 9의 pH, 보다 구체적으로 6 내지 8의 pH를 가진 완충제, 예컨대, 중성 완충 식염수, 포스페이트 완충 식염수, Tris-HCl, 아세테이트 또는 포스페이트 완충제, 또는 강한 무질서화제, 예컨대, 6 M 우레아에서 용액으로 적절하게 보관될 수 있다. 대안적으로, 본원에서 제조된 임의의 분자, 예컨대, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 당분야에 일반적으로 알려진 바와 같이 동결건조될 수 있다. 저장은 전형적으로 실온 이하(25℃ 이하), 특정 실시양태에서 0℃ 초과의 온도(비-극저온 저장), 예컨대, 0℃를 초과하고 25℃ 초과하지 않는 온도, 또는 냉동보존이 바람직할 수 있는 특정 실시양태에서 0℃ 이하, 전형적으로 -5℃ 이하, 보다 전형적으로 -10℃ 이하, 예컨대, -20℃ 이하, -25℃ 이하, -30℃ 이하, 또는 심지어 -70℃ 이하 또는 -80℃ 이하의 온도, 또는 액체 질소에서 수행될 수 있다.

재조합 핵산 기술은 폴리펩타이드 성질을 갖고 핵산에 의해 코딩되는 펩트-인의 이종 발현 및 단리를 허용할 수 있을 뿐만 아니라, 심지어 이러한 펩트-인을 형질전이유전자로서 투여할 수 있게, 즉 각각의 펩트-인을 코딩하고 세포 내로 도입될 때 각각의 펩트-인의 발현을 달성할 수 있는 핵산(예를 들어, DNA 기반 또는 RNA 기반 카세트, 벡터 또는 구축물)을 투여할 수 있게 한다. 예를 들어, DNA 구축물에서 펩트-인 코딩 서열은 DNA 구축물로부터 펩트-인의 전사 및 번역을 유도하도록 구성된 조절 서열(들), 예컨대, 프로모터 및 전사 터미네이터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. RNA 또는 mRNA 구축물에서, 펩트-인 코딩 서열은 이것이 세포 단백질 번역 기구에 의해 번역될 수 있도록 포함될 수 있다. 상기 언급된 구축물에서, 적절한 번역을 용이하게 하기 위해, 전형적으로 프레임내 번역 개시 코돈 다음에 펩트-인 코딩 서열이 있을 것이고, 그 다음에 번역 종결 코돈이 있을 것이다. 따라서, 본원에 교시된 펩트-인을 사용한 투여/치료가 본 명세서에서 예상될 때마다, 이 펩트-인을 코딩하는 핵산의 투여는 본 개시내용에 의해 포괄된다. 이러한 투여/치료는 통상적으로 유전자 요법으로서 지칭될 수 있다. 따라서, 본원의 분자를 사용하는 모든 방법 및 용도는 분자가 그를 코딩하는 핵산 서열로서 제공되고 분자가 핵산 서열로부터 발현되는 방법 및 용도도 포괄한다.

따라서, 본원은 본원에 개시된 임의의 펩트-인 분자를 코딩하는 핵산도 제공하고, 이때 이러한 펩트-인 분자는 폴리펩타이드 성질을 가진다. 필요에 따라, 핵산 서열은 본원에 기재된 모든 특징 및 변이를 가진 분자를 코딩한다는 것이 특히 예상된다. 따라서, 코딩된 폴리펩타이드는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같고, 즉 이 측면과 양립할 수 있는 펩트-인 분자에 대해 언급된 변이는 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드에 대한 변이로서도 예상된다.

특정 실시양태에서, 핵산 서열은 인공 유전자이다. 핵산 측면은 형질전환 발현을 이용하는 적용에 가장 특히 적합하기 때문에, 특히 예상되는 실시양태는 핵산 서열(또는 인공 유전자)이 또 다른 모이어티, 특히 유전자 생성물의 용해도 및/또는 안정성을 증가시키는 모이어티에 융합되는 실시양태일 수 있다.

이 측면에서, 본원에 기재된 분자를 코딩하는 이러한 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터도 제공한다. 이 재조합 벡터는 하향조절될 단백질이 발현되는 세포 내부로 관심 있는 핵산 서열을 운반하고 상기 세포에서 핵산의 발현을 유도하는 비히클로서 이상적으로 적합하다. 재조합 벡터는 세포에서 별개의 독립체(예를 들어, 플라스미드)로서 존속할 수 있거나, 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 재조합 벡터는 특히 플라스미드 벡터, 이원 벡터, 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다. 따라서, 분자가 분자를 코딩하는 핵산 서열을 가진 재조합 벡터로서 제공되고 분자가 재조합 벡터에 제공된 핵산 서열로부터 발현되는 방법 및 용도도 본원에 포함된다. 따라서, 본원은 본원에 기재된 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나 이러한 펩트-인 분자를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.

본원에 교시된 분자는 치료에 유용하다. 따라서, 한 측면은 의학에 사용하기 위한 본원에 교시된 임의의 분자, 즉 치료에 사용하기 위한 본원에서 교시된 임의의 분자를 제공한다. 이하에서 논의된 바와 같이, 본원에 교시된 분자는 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 따라서, 치료에 있어서 분자의 사용(또는 이러한 표현의 임의의 변경)에 대한 임의의 언급은 치료에 있어서 분자를 포함하는 약학 조성물의 사용도 포함한다.

구체적으로, 분자는 인간 RAS의 위치 12 또는 13의 돌연변이가 중요한 역할을 하는 질환의 치료를 위한 것이다. 따라서, 인간 RAS 단백질의 G12 또는 G13 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본원에 교시된 임의의 분자도 제공한다. 치료를 필요로 하는 대상체, 특히 인간 RAS 단백질의 G12 또는 G13 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 본원에 교시된 임의의 분자를 치료 유효량으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 인간 RAS 단백질의 G12 또는 G13 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본원에 교시된 임의의 분자의 용도를 추가로 제공한다. 인간 RAS 단백질의 G12 또는 G13 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환의 치료를 위한 본원에 교시된 임의의 분자의 용도를 추가로 제공한다.

"요법" 또는 "치료"의 언급은 치유적 치료 및 예방적 치료 둘 다를 광범위하게 포괄하고, 이 용어는 구체적으로 질환 또는 장애와 같은 병리학적 상태의 하나 이상의 증상 또는 측정 가능한 마커의 완화 또는 측정 가능한 경감을 의미할 수 있다. 상기 용어는 1차 치료뿐만 아니라, 네오아쥬번트 치료, 아쥬번트 치료 및 보조 요법도 포괄한다. 측정 가능한 경감은 측정 가능한 마커 또는 증상의 임의의 통계적으로 유의미한 감소를 포함한다. 일반적으로, 상기 용어는 치유적 치료, 및 질환의 증상을 감소시키고/시키거나 질환의 진행을 늦추기 위한 치료를 둘 다를 포괄한다. 상기 용어는 이미 발생된 병리학적 상태의 치유적 치료뿐만 아니라, 병리학적 상태의 발병을 예방하거나 발병 가능성을 감소시키는 것을 목표로 하는 예방적 또는 방지적 조치도 포괄한다. 특정 실시양태에서, 상기 용어는 치유적 치료를 의미할 수 있다. 특정 다른 실시양태에서, 상기 용어는 예방적 치료를 의미할 수 있다. 관해 기간 동안 만성 병리학적 상태의 치료도 치유적 치료를 구성하는 것으로 간주될 수 있다. 상기 용어는 본 발명의 맥락에서 적절한 경우 생체외 또는 생체내 치료를 포괄할 수 있다.

용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 본 명세서 전체에 걸쳐 교환 가능하게 사용되고, 전형적으로 바람직하게는 인간을 의미하나, 비인간 동물, 바람직하게는 온혈 동물, 훨씬 더 바람직하게는 비인간 포유동물의 언급도 포괄할 수 있다. 성별 및 모든 연령 범주 둘 다를 포함하는 인간 대상체가 특히 바람직하다. 다른 실시양태에서, 대상체는 질환 모델로서 실험 동물 또는 동물 대체물이다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별을 의미하지 않는다. 따라서, 남성이든 여성이든 관계없이 성인 및 신생아 대상체뿐만 아니라 태아도 포함된다. 용어 대상체는 형질전환 비인간 종도 포함하기 위한 것이다.

본원에서 사용된 용어 "치료를 필요로 하는 대상체" 또는 이와 유사한 표현은 본원에 언급된 질환으로 진단받거나 이러한 질환을 가진 대상체 및/또는 상기 질환이 예방되어야 하는 대상체를 지칭한다.

용어 "치료 유효량"은 일반적으로 의사, 임상의, 외과의, 수의사 또는 연구원과 같은 의료 종사자에 의해 추구되는, 특히 일회 또는 다회 용량으로 치료되는 질환의 증상 완화를 포함할 수 있는 약리학적 효과 또는 의학적 반응을 대상체에서 이끌어내기에 충분한 양을 의미한다. 본 분자의 적절한 치료 유효 용량은 질환의 성질과 중증도, 및 환자의 연령과 상태를 충분히 고려하여 자격을 갖춘 의사에 의해 결정될 수 있다. 투여될 본원에 기재된 분자의 유효량은 많은 상이한 요인에 의해 좌우될 수 있고 관용적인 실험을 통해 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 결정될 수 있다. 고려될 수 있는 몇 가지 비제한적인 요인은 활성 성분의 생물학적 활성, 활성 성분의 성질, 치료될 대상체의 특성 등을 포함한다. 용어 "투여하는 것"은 일반적으로 분배하거나 적용하는 것을 의미하고 전형적으로 조직으로의 생체내 투여 및 생체외 투여 둘 다, 바람직하게는 생체내 투여를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 전신 또는 국소 투여될 수 있다.

인간 RAS 단백질의 G12 또는 G13 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환의 언급은 G12 또는 G13 RAS 돌연변이가 상기 질환에서 적어도 일부 역할을 하여, G12 돌연변이체 RAS의 하향조절이 치료적으로 유리할 수 있는 임의의 질환을 광범위하게 포괄하기 위한 것이다. 예를 들어, G12 또는 G13 RAS 돌연변이는 단독으로 또는 다른 돌연변이와 같은 다른 요인과 함께 상기 질환의 원인이 될 수 있거나 이러한 질환의 병인에 기여할 수 있고/있거나, G12 또는 G13 RAS 돌연변이는 단독으로 또는 다른 돌연변이와 같은 다른 요인과 함께 상기 질환의 지속성, 진행, 악화, 다른 치료에 대한 내성 또는 재발의 원인이 될 수 있거나 이에 기여할 수 있다. RAS 활성에 대한 G12 또는 G13 RAS 돌연변이의 심각한 영향을 고려할 때, G12 또는 G13 RAS 돌연변이를 특징으로 하는 임의의 질환은 본원에서 의도된 바와 같이 G12 또는 G13 RAS 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환인 것으로 사실상 추정될 수 있다.

본 맥락에서, 영구적 또는 항시적으로 활성화된 RAS 신호전달로 이어지는 G12 또는 G13 RAS 돌연변이, 예컨대, 본 명세서의 다른 곳에서 논의된 G12 RAS 돌연변이, 예컨대, 특히 G12V, G12C, G12S 및 G12A RAS 돌연변이, 또는 G13V, G13C 및 G13S RAS 돌연변이가 특히 의도된다.

추가로, 본 맥락에서, 체세포 G12 또는 G13 RAS 돌연변이가 특히 의도된다. 본원에서 사용된 용어 "체세포 돌연변이"는 임신 후에 발생하는 대상체 DNA의 후천적 변경을 광범위하게 지칭한다. 대상체에서 체세포 RAS 돌연변이를 검출하는 기법, 예컨대, 대상체의 체세포를 함유하는 샘플 중의 RAS 유전자 또는 이의 돌연변이 함유 부분의 PCR 증폭과 시퀀싱 또는 유전형분석은 당분야에서 잘 확립되어 있고, 이때 이러한 유전 정보는 필요하거나 유익한 경우 대상체의 RAS 생식세포계열 서열 변이와 비교될 수 있다. RAS 돌연변이가 신생물성 질환에서 수행하는 역할을 고려할 때, 예시적인 샘플은 대상체의 종양 세포를 함유하는 샘플, 예컨대, 제한 없이, 종양 조직 생검(예를 들어, 원발성 또는 전이성 종양 조직; 예를 들어, 포르말린으로 고정되고 파라핀에 포매된 종양 조직, 또는 새로 냉동된 종양 조직), 미세 바늘 흡인물, 혈액 샘플('액체' 생검), 또는 떨어져 나온 종양 세포를 함유할 수 있는 신체 삼출물, 예컨대, 타액, 소변, 대변(배설물), 눈물, 땀, 피지, 유두 흡인물, 도관 세척물, 뇌척수액 또는 림프를 포함할 수 있다.

앞서 언급된 바와 같이, RAS 유전자의 기능 획득 미스센스 돌연변이는 모든 인간 암의 약 27%에서 발견되고 특정 유형의 암의 최대 90%에서 발견됨으로써, 돌연변이체 RAS 유전자가 종양 시작 및 유지를 유발하는 가장 흔한 종양유전자는 아닐지라도 매우 흔한 종양유전자임을 입증한다. 따라서, 특정 바람직한 실시양태에서, 질환은 신생물성 질환, 특히 암이다.

따라서, 인간 RAS 단백질의 G12 또는 G13 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 신생물성 질환, 특히 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본원에 교시된 임의의 분자도 제공한다. 치료를 필요로 하는 대상체, 특히 인간 RAS 단백질의 G12 또는 G13 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 신생물성 질환, 특히 암을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 본원에 교시된 임의의 분자를 치료 유효량으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다. 인간 RAS 단백질의 G12 또는 G13 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 신생물성 질환, 특히 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본원에 교시된 임의의 분자의 용도를 추가로 제공한다. 인간 RAS 단백질의 G12 또는 G13 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 신생물성 질환, 특히 암의 치료를 위한 본원에 교시된 임의의 분자의 용도를 추가로 제공한다.

용어 "신생물성 질환"은 일반적으로 양성(주변 정상 조직을 침습하지 않고 전이를 형성하지 않음), 전구악성(전구암성) 또는 악성(인접 조직을 침습하고 전이를 일으킬 수 있음) 여부와 관계없이 신생물성 세포 생장과 증식을 특징으로 하는 임의의 질환 또는 장애를 지칭한다. 용어 신생물성 질환은 일반적으로 모든 형질전환된 세포와 조직 및 모든 암성 세포와 조직을 포함한다. 신생물성 질환 또는 장애는 비정상적인 세포 생장, 양성 종양, 전구악성 또는 전구암성 병변, 악성 종양 및 암을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 신생물성 질환 또는 장애의 예는 임의의 조직 또는 장기, 예컨대, 전립선, 결장, 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 또는 비뇨생식기에 위치한 양성, 전구악성 또는 악성 신생물이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "종양" 또는 "종양 조직"은 과도한 세포 분열로부터 비롯된 비정상적인 조직 덩어리를 지칭한다. 종양 또는 종양 조직은 비정상적인 생장 성질을 갖고 유용한 신체 기능을 갖지 않은 신생물성 세포인 종양 세포를 포함한다. 종양, 종양 조직 및 종양 세포는 양성, 전구악성 또는 악성일 수 있거나, 임의의 암 잠재력을 갖지 않은 병변을 나타낼 수 있다. 종양 또는 종양 조직은 종양 관련 비-종양 세포, 예를 들어, 종양 또는 종양 조직에 공급하기 위해 혈관을 형성하는 혈관 세포도 포함할 수 있다. 비-종양 세포는 종양 세포에 의해 복제되고 발달되도록 유도될 수 있고, 예를 들어, 종양 또는 종양 조직에서 혈관신생이 유도될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 이상조절되거나 조절되지 않는 세포 생장을 특징으로 하는 악성 신생물을 지칭한다. 용어 "암"은 원발성 악성 세포 또는 종양(예를 들어, 원래 악성종양 또는 종양의 부위 이외의 대상체의 신체 부위로 이동하지 않은 세포를 가진 악성 세포 또는 종양) 및 2차 악성 세포 또는 종양(예를 들어, 원래 종양 부위와 상이한 2차 부위로의 악성 세포 또는 종양 세포의 이동인 전이로부터 발생된 악성 세포 또는 종양)을 포함한다. 용어 "전이성" 또는 "전이"는 일반적으로 암이 하나의 장기 또는 조직으로부터 또 다른 비-인접 장기 또는 조직으로 퍼지는 것을 의미한다. 다른 비-인접 장기 또는 조직에서의 신생물성 질환의 발생은 전이로서 지칭된다.

암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는 편평 세포암(예를 들어, 상피 편평 세포암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종 및 폐의 대세포 암종을 비롯한 폐암, 복막암, 간세포암, 위장암을 비롯한 위암 또는 복부암, 췌장암, 신경교종, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포종, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 타액샘 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종뿐만 아니라, CNS 암, 흑색종, 두경부암, 골암, 골수암, 십이지장암, 식도암, 갑상선암 또는 혈액암도 제한 없이 포함한다.

암 또는 악성종양의 다른 비제한적인 예는 급성 소아 림프모구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 성인 (원발성) 간세포암, 성인 (원발성) 간암, 성인 급성 림프구성 백혈병, 성인 급성 골수성 백혈병, 성인 호지킨병, 성인 호지킨 림프종, 성인 림프구성 백혈병, 성인 비-호지킨 림프종, 성인 원발성 간암, 성인 연조직 육종, AIDS 관련 림프종, AIDS 관련 악성종양, 항문암, 성상세포종, 담관암, 방광암, 골암, 뇌간 신경교종, 뇌종양, 유방암, 신우 및 요도의 암, 중추신경계 (원발성) 림프종, 중추신경계 림프종, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종, 자궁경부암, 소아 (원발성) 간세포암, 소아 (원발성) 간암, 소아 급성 림프모구성 백혈병, 소아 급성 골수성 백혈병, 소아 뇌간 신경교종, 교모세포종, 소아 소뇌 성상세포종, 소아 대뇌 성상세포종, 소아 두개외 생식 세포 종양, 소아 호지킨병, 소아 호지킨 림프종, 소아 시상하부 및 시각 경로 신경교종, 소아 림프모구성 백혈병, 소아 수모세포종, 소아 비-호지킨 림프종, 소아 송과체 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 소아 원발성 간암, 소아 횡문근육종, 소아 연조직 육종, 소아 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장암, 피부 T 세포 림프종, 내분비 췌장 췌도 세포 암종, 자궁내막암, 뇌실막종, 상피암, 식도암, 유잉 육종 및 관련 종양, 외분비 췌장암, 두개외 생식 세포 종양, 성선외 생식 세포 종양, 간외 담관암, 안암, 여성 유방암, 담낭암, 위암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 종양, 생식 세포 종양, 임신 영양모세포 종양, 모발 세포 백혈병, 두경부암, 간세포암, 호지킨병, 호지킨 림프종, 고감마글로불린혈증, 인두암, 장암, 안내 흑색종, 췌도 세포 암종, 췌도 세포 췌장암, 카포시 육종, 신장암, 후두암, 입술 및 구강 암, 간암, 폐암, 림프증식성 장애, 거대글로불린혈증, 남성 유방암, 악성 중피종, 악성 흉선종, 수모세포종, 흑색종, 중피종, 전이성 잠복 원발성 편평 경부암, 전이성 원발성 편평 경부암, 전이성 편평 경부암, 다발성 골수종, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 골수이형성 증후군, 골수원성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수증식성 장애, 비강 및 부피동 암, 비인두암, 신경모세포종, 임신 동안 비-호지킨 림프종, 비흑색종 피부암, 비-소세포 폐암, 잠복 원발성 전이성 편평 경부암, 구인두암, 골/악성 섬유성 육종, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 골육종/골의 악성 섬유성 조직구종, 난소 상피암, 난소 생식 세포 종양, 낮은 악성 잠재력의 난소 종양, 췌장암, 부단백혈증, 자반병, 부갑상선암, 음경암, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 원발성 중추신경계 림프종, 원발성 간암, 전립선암, 직장암, 신장 세포암, 신우 및 요도의 암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액샘암, 사르코이드증 육종, 세자리 증후군, 피부암, 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평 경부암, 위암, 천막상 원시 신경외배엽 및 송과체 종양, T 세포 림프종, 고환암, 흉선종, 갑상선암, 신우 및 요도의 이행 세포암, 이행성 신우 및 요도 암, 영양배엽 종양, 요도 및 신우 세포암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 외음부암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 또는 윌름스 종양을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.

특정 실시양태에서, 질환, 신생물성 질환 또는 암은 췌관 선암종, 대장 선암종, 다발성 골수종, 폐 선암종, 피부 흑색종(skin cutaneous melanoma), 자궁체 자궁내막양 암종, 자궁 암육종, 갑상선 암종, 급성 골수성 백혈병, 방광 요로상피 암종, 위 선암종, 자궁경부 선암종, 두경부 편평 세포 암종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 또는 대장암일 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 교시된 임의의 분자는 단독 약제(활성 약학 성분)로서 투여될 수 있거나, 조합이 허용될 수 없는 부작용을 야기하지 않는 경우 하나 이상의 다른 약제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 교시된 2개 이상의 분자는 공-투여될 수 있다. 또 다른 예로서, 본원에 교시된 하나 이상의 분자는 본원에서 예상되는 분자가 아닌 약제와 공-투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 교시된 분자는 공지된 항암 요법 또는 요법들, 예를 들어, 수술, 방사선요법, 화학요법, 생물학적 요법, 또는 이들의 조합과 조합될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "화학요법"은 광범위하게 이해되고 일반적으로 화학 물질 또는 조성물을 사용하는 치료를 포괄한다. 화학요법제는 전형적으로 세포독성 또는 세포증식억제성 효과를 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 화학요법제는 알킬화제, 세포독성 화합물, 항-대사물질, 식물 알칼로이드, 테르페노이드, 토포이소머라제 억제제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "생물학적 요법"은 광범위하게 이해되고 일반적으로 생물학적 물질 또는 조성물, 예컨대, 생체분자, 또는 생물학적 작용제, 예컨대, 바이러스 또는 세포를 사용하는 치료를 포괄한다. 특정 실시양태에서, 생체분자는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산 또는 소분자(예컨대, 1차 대사물질, 2차 대사물질, 또는 천연 생성물), 또는 이들의 조합일 수 있다. 적합한 생체분자의 예는 인터류킨, 사이토카인, 항-사이토카인, 종양 괴사 인자(TNF), 사이토카인 수용체, 백신, 인터페론, 효소, 치료 항체, 항체 단편, 항체 유사 단백질 스캐폴드, 또는 이들의 조합을 제한 없이 포함한다. 적합한 생체분자의 예는 알데스류킨, 알렘투주맙, 아테졸리주맙, 베바시주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 카투막소맙, 세툭시맙, 다라투무맙, 데닐류킨 디프티톡스, 데노수맙, 디누툭시맙, 엘로투주맙, 젬투주맙 오조가미신, ⁹⁰Y-이브리투모맙 티욱세탄, 이다루시주맙, 인터페론 A, 이필리무맙, 네시투무맙, 니볼루맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 라무시루맙, 리툭시맙, 타소네르민, ¹³¹I-토시투모맙, 트라스투주맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 및 이들의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 종양용해 바이러스의 예는 탈리모진 라헤르파렙벡(talimogene laherparepvec)을 포함하나, 이것으로 제한되지 않는다. 항암 요법의 추가 범주는 특히 통상적으로 생물학적 요법 내에 포함되는 것으로서 간주되는 호르몬 요법(내분비 요법), 면역요법 및 줄기 세포 요법을 포함한다. 적합한 호르몬 요법의 예는 타목시펜; 아로마타제 억제제, 예컨대, 아타나스트로졸, 엑세메스탄, 레트로졸 및 이들의 조합; 황체형성 호르몬 차단제, 예컨대, 고세렐린, 류프로렐린, 트립토렐린 및 이들의 조합; 항-안드로겐, 예컨대, 비칼루타미드, 사이프로테론 아세테이트, 플루타미드 및 이들의 조합; 고나도트로핀 방출 호르몬 차단제, 예컨대, 데가렐릭스; 프로게스테론 치료, 예컨대, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 및 이들의 조합; 및 이들의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 용어 "면역요법"은 대상체의 면역 시스템을 조절하는 임의의 치료를 광범위하게 포괄한다. 특히, 상기 용어는 면역 반응, 예컨대, 체액성 면역 반응, 세포 매개 면역 반응, 또는 이들 둘 다를 조절하는 임의의 치료를 포함한다. 면역요법은 면역 세포, 예컨대, T 세포 및/또는 수지상 세포를 환자에게 전달하는 세포 기반 면역요법을 포함한다. 상기 용어는 대상체의 면역 시스템을 조절하는 물질 또는 조성물, 예컨대, 화학적 화합물 및/또는 생체분자(예를 들어, 항체, 항원, 인터류킨, 사이토카인 또는 이들의 조합)의 투여도 포함한다. 암 면역요법의 예는 단일클론 항체, 예를 들어, 종양 세포에 의해 발현된 단백질에 대한 Fc-조작된 단일클론 항체, 면역 체크포인트 억제제, 예방 또는 치료 암 백신, 입양 세포 요법, 및 이들의 조합을 사용하는 치료를 제한 없이 포함한다. 억제를 위한 면역 체크포인트 표적의 예는 PD-1(PD-1 억제제의 예는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 및 이들의 조합을 제한 없이 포함함), CTLA-4(CTLA-4 억제제의 예는 이필리무맙, 트레멜리무맙, 및 이들의 조합을 제한 없이 포함함), PD-L1( PD-L1 억제제의 예는 아테졸리주맙을 제한 없이 포함함), LAG3, B7-H3(CD276), B7-H4, TIM-3, BTLA, A2aR, 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), IDO 및 이들의 조합을 제한 없이 포함한다. 치료 항암 백신접종을 위한 또 다른 접근법은 수지상 세포 백신을 포함한다. 이 용어는 면역 반응이 요구되는 항원(들)으로 로딩된 수지상 세포를 포함하는 백신을 광범위하게 포괄한다. 입양 세포 요법(ACT)은 세포, 가장 일반적으로 면역 유래의 세포, 예컨대, 특히 세포독성 T 세포(CTL)를 동일한 환자에게 다시 전달하거나, 면역학적 기능 및 특성을 새로운 숙주에게 전달할 목적으로 새로운 수용자 숙주에게 전달하는 것을 의미할 수 있다. 가능한 경우, 자가 세포의 사용은 조직 거부 및 이식편 대 숙주 질환 문제를 최소화함으로써 수용자를 돕는다. 다양한 전략을 이용함으로써, 예를 들어, T 세포 수용체(TCR)의 특이성을 변경함으로써, 예를 들어, 선택된 펩타이드 특이성을 가진 새로운 TCR α 및 β 쇄를 도입함으로써 T 세포를 유전적으로 변형시킬 수 있다. 대안적으로, 악성 세포와 같은 선택된 표적에 특이적인 T 세포와 같은 면역반응성 세포를 생성하기 위해 키메라 항원 수용체(CAR)를 사용할 수 있고, 매우 다양한 수용체 키메라 구축물들이 기재되어 있다. CAR 구축물의 예는 1) 항원에 특이적인 항체의 단일 쇄 가변 단편으로 구성된 CAR, 예를 들어, 유연성 링커, 예를 들어, CD8α 힌지 도메인 및 CD8α 막횡단 도메인에 의해 CD3ζ 또는 FcRγ의 막횡단 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된, 특이적 항체의 V_H에 연결된 V_L을 포함하는 CAR; 및 2) 하나 이상의 보조자극 분자, 예컨대, CD28, OX40(CD134) 또는 4-1BB(CD137)의 세포내 도메인을 엔도도메인 내에 추가로 혼입하거나 심지어 이러한 보조자극 엔도도메인의 조합을 포함하는 CAR을 제한 없이 포함한다. 암의 줄기 세포 요법은 통상적으로 방사선요법 및/또는 화학요법에 의해 파괴된 골수 줄기 세포를 대체하는 것을 목표로 하고, 자가, 동계 또는 동종 줄기 세포 이식을 제한 없이 포함한다. 줄기 세포, 특히 조혈 줄기 세포는 전형적으로 골수, 말초혈 또는 제대혈로부터 수득된다. 항암제의 투여 경로, 용량 및 치료 용법의 세부사항은 예를 들어, 문헌["Cancer Clinical Pharmacology" (2005) ed. Jan H. M. Schellens, Howard L. McLeod and David R. Newell, Oxford University Press]에 기재된 바와 같이 당분야에 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, MEK 억제제(예를 들어, 셀루메티닙 또는 트라메티닙), SHP2 억제제(예를 들어, TNO155) 및 mTOR 억제제(예를 들어, 시롤리무스, 템시롤리무스(CCI-779), 템시롤리무스(CCI-779), 에버롤리무스(RAD001) 및 리다포롤리무스(AP-23573)를 포함하는 라파마이신 또는 라파마이신 유도체("라팔로그(rapalog)")) 중 하나 이상과 함께 본원에 교시된 임의의 분자를 사용하는 조합 요법이 예상된다. 임의의 조합 요법의 활성 성분은 혼합될 수 있거나 물리적으로 분리될 수 있고, 동시에 투여될 수 있거나 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다.

본원에 교시된 임의의 분자는 임의의 적합한 또는 작동 가능한 형태 또는 포맷으로 대상체에게 투여될 수 있다.

예를 들어, 본원에서 의도된 바와 같은 분자의 언급은 주어진 치료적으로 유용한 화합물뿐만 아니라, 이러한 화합물의 임의의 약학적으로 허용되는 형태, 예컨대, 이 화합물의 임의의 부가 염, 수화물 또는 용매화물도 포괄할 수 있다. 특히 염, 수화물, 용매화물 및 부형제와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용되는"은 당분야에 부합하고, 약학 조성물의 다른 성분과 양립 가능하고 이의 수용자에게 유해하지 않음을 의미한다. 약학적으로 허용되는 산 및 염기 부가 염은 화합물이 형성할 수 있는 치료 활성 무독성 산 및 염기 부가 염 형태를 포함하기 위한 것이다. 약학적으로 허용되는 산 부가 염은 화합물의 염기 형태를 적절한 산으로 처리함으로써 편리하게 수득될 수 있다. 적절한 산은 예를 들어, 무기산, 예컨대, 할로겐화수소산, 예를 들어, 염산 또는 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등; 또는 유기산, 예를 들어, 아세트산, 프로판산, 하이드록시아세트산, 젖산, 피루브산, 말론산, 석신산(즉, 부탄디오산), 말레산, 푸마르산, 말산, 주석산, 구연산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 사이클람산, 살리실산, p-아미노살리실산, 파모산 등을 포함한다. 대조적으로, 상기 염 형태는 적절한 염기로 처리함으로써 유리 염기 형태로 전환될 수 있다. 산성 양성자를 함유하는 화합물은 또한 적절한 유기 및 무기 염기로 처리함으로써 그의 무독성 금속 또는 아민 부가 염 형태로 전환될 수도 있다. 적절한 염기 염 형태는 예를 들어, 암모늄 염, 알칼리 금속 염 및 알칼리 토금속 염, 예를 들어, 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 염 등, 알루미늄 염, 아연 염, 유기 염기와의 염, 예를 들어, 1차, 2차 및 3차 지방족 및 방향족 아민, 예컨대, 메틸아민, 에틸아민, 프로필아민, 이소프로필아민, 4종의 부틸아민 이성질체, 디메틸아민, 디에틸아민, 디에탄올아민, 디프로필아민, 디이소프로필아민, 디-n-부틸아민, 피롤리딘, 피페리딘, 모르폴린, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 퀴누클리딘, 피리딘, 퀴놀린 및 이소퀴놀린; 벤자틴, N-메틸-D-글루카민, 하이드라바민 염, 및 아미노산, 예를 들어, 아르기닌, 라이신 등과의 염을 포함한다. 대조적으로, 염 형태는 산으로 처리함으로써 유리 산 형태로 전환될 수 있다. 용어 용매화물은 화합물이 형성할 수 있는 수화물 및 용매 부가 형태뿐만 아니라, 이들의 염도 포함한다. 이러한 형태의 예는 예를 들어, 수화물, 알코올화물 등이다.

예를 들어, 분자는 조성물의 일부일 수 있다. 용어 "조성물"은 일반적으로 2종 이상의 성분으로 구성된 것을 지칭하고, 보다 구체적으로 2종 이상의 물질, 예컨대, 원소, 분자, 물질, 생물학적 분자 또는 미생물학적 물질의 혼합물 또는 블렌드뿐만 아니라, 조성물의 물질로부터 형성된 반응 생성물 및 분해 생성물도 의미한다. 예로서, 조성물은 하나 이상의 다른 물질과 조합된, 본원에 교시된 임의의 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 본원에 교시된 분자를 상기 하나 이상의 다른 물질과 조합, 예를 들어, 혼합함으로써 수득될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 조성물은 약학 조성물로서 구성될 수 있다. 약학 조성물은 전형적으로 하나 이상의 약리학적 활성 성분(하나 이상의 약리학적 효과를 가진 화학적 및/또는 생물학적 활성 물질) 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 전형적으로 사용되는 조성물은 액체, 반고체 또는 고체일 수 있고, 용액 또는 분산액을 포함할 수 있다.

따라서, 추가 측면은 본원에 교시된 임의의 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 용어 "약학 조성물" 및 "약학 제제"는 교환 가능하게 사용될 수 있다. 본원에 교시된 약학 조성물은 하나 이상의 활성제 이외에, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학 부형제는 제형 및 활성 성분의 정체에 의해 좌우되고 숙련된 자에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients 7^th Edition 2012, eds. Rowe et al.] 참조).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "담체" 또는 "부형제"는 교환 가능하게 사용되고 넓게는 임의의 모든 용매, 희석제, 완충제(예를 들어, 중성 완충 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 또는 임의로 Tris-HCl, 아세테이트 또는 포스페이트 완충제), 가용화제(예를 들어, Tween^® 80, 폴리소르베이트 80), 콜로이드, 분산 매질, 비히클, 충전제, 킬레이팅제(예컨대, EDTA 또는 글루타티온), 아미노산(예를 들어, 글리신), 단백질, 붕해제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 풍미제, 방향제, 증점제, 데포 효과를 달성하기 위한 작용제, 코팅제, 항진균제, 방부제(예를 들어, Thimerosal^TM, 벤질 알코올), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 장력 조절제, 흡수 지연제, 보조제, 증량제(예를 들어, 락토스, 만니톨) 등을 포함한다. 약학 조성물 및 화장품 조성물의 제제화를 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당분야에 잘 알려져 있다. 허용되는 희석제, 담체 및 부형제는 전형적으로 수용자의 항상성(예를 들어, 전해질 균형)에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 약학 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당분야에 잘 알려져 있다. 이러한 물질은 독성이 없어야 하고 활성 물질의 활성을 방해하지 않아야 한다. 허용되는 담체는 생체적합성, 불활성 또는 생체흡수성 염, 완충제, 올리고당 또는 다당류, 중합체, 점도 개선제, 방부제 등을 포함할 수 있다. 하나의 예시적인 담체는 생리학적 식염수(0.15 M NaCl, pH 7.0 내지 7.4)이다. 또 다른 예시적인 담체는 50 mM 인산나트륨, 100 mM 염화나트륨이다.

담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 의해 좌우될 것이다. 예를 들어, 약학 조성물은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 가진 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태로 존재할 수 있다.

약학 제제는 생리학적 조건에 근접하는 데 요구되는 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대, pH 조절제 및 완충제, 방부제, 착물화제, 장력 조절제, 습윤제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 인산나트륨, 수산화나트륨, 염화수소, 벤질 알코올, 파라벤, EDTA, 올레산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 약학 제제의 pH 값은 생리학적 pH 범위 내에 있고, 예컨대, 특히 상기 제제의 pH는 약 5 내지 약 9.5, 보다 바람직하게는 약 6 내지 약 8.5, 훨씬 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다.

약학 조성물을 제제화하는 데 사용하기 위한 예시적 및 비제한적인 담체는 예를 들어, 수중유 또는 유중수 유화액, 정맥내(IV) 사용에 적합한 유기 보조용매를 포함하거나 포함하지 않는 수성 조성물, 리포좀 또는 계면활성제 함유 소포, 마이크로스피어, 마이크로비드 및 마이크로좀, 분말, 정제, 캡슐, 좌제, 수성 현탁액, 에어로졸, 및 당분야에서 통상의 기술을 자에게 자명한 다른 담체를 포함한다. 리포좀은 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 유용한 인공 막 소포이다. 이 제제는 순 양이온성, 음이온성 또는 중성 전하 특성을 가질 수 있고 시험관내, 생체내 및 생체외 전달 방법에 유용한 특성을 가진다. 크기의 범위가 0.2 내지 4.0 PHI.m인 큰 단층 소포(LUV)는 상당한 퍼센트의 큰 거대분자 함유 수성 완충제를 캡슐화할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 리포좀의 조성은 일반적으로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 조합되는 인지질, 특히 높은 상 전이 온도 인지질의 조합이다. 다른 인지질 또는 다른 지질도 사용될 수 있다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 의해 좌우된다.

본원에서 의도된 바와 같은 약학 조성물은 본질적으로 임의의 투여 경로, 예컨대, 제한 없이, 경구 투여(예를 들어, 경구 섭취 또는 흡입), 비강내 투여(예를 들어, 비강내 흡입 또는 비강내 점막 적용), 비경구 투여(예를 들어, 피하, 정맥내(I.V.), 근육내, 복강내 또는 흉골내 주사 또는 주입), 경피 또는 경점막(예를 들어, 경구, 설하, 비강내) 투여, 국소 투여, 직장, 질 또는 기관내 점적 등을 위해 제제화될 수 있다. 이 방식으로, 방법 및 조성물에 의해 달성될 수 있는 치료 효과는 주어진 적용의 특정 요구에 따라, 예를 들어, 전신 치료 효과, 국소 치료 효과, 조직 특이적 치료 효과 등일 수 있다.

예를 들어, 경구 투여를 위해, 약학 조성물은 환제, 정제, 래커 정제, 코팅(예를 들어, 당 코팅) 정제, 과립, 경질 및 연질 젤라틴 캡슐, 수성, 알코올성 또는 유성 용액, 시럽, 유화액 또는 현탁액의 형태로 제제화될 수 있다. 일례로, 제한 없이, 경구 제형의 제조는 적합한 양의 본원에 개시된 작용제를 분말의 형태로 함께 균일하고 긴밀하게 블렌딩하고 임의로 미분된 하나 이상의 고체 담체를 포함시키고 블렌드를 환제, 정제 또는 캡슐로 제제화함으로써 적절하게 달성될 수 있다. 예시적이되, 비제한적인 고체 담체는 인산칼슘, 스테아르산마그네슘, 활석, 당(예를 들어, 글루코스, 만노스, 락토스 또는 수크로스), 당 알코올(예컨대, 만니톨), 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 폴리비닐피롤리딘, 저융점 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다. 약학 조성물을 함유하는 압축 정제는 본원에 개시된 작용제를 전술된 바와 같은 고체 담체와 균일하고 긴밀하게 혼합하여, 필요한 압축 성질을 가진 혼합물을 제공한 다음, 상기 혼합물을 적합한 기계에서 원하는 모양 및 크기로 압착함으로써 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 적신 분말화된 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐 및 좌제에 적합한 담체는 예를 들어, 지방, 왁스, 반고체 및 액체 폴리올, 천연 또는 경화된 오일 등이다.

예를 들어, 경구 또는 비강 에어로졸 또는 흡입 투여를 위해, 벤질 알코올 또는 다른 적합한 방부제, 생체이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본, 및/또는 당분야에서 공지되어 있는 다른 가용화제 또는 분산제를 추가로 사용하여, 예시적인 담체, 예를 들어, 식염수, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리콜, DPPC, 메틸셀룰로스를 가진 용액, 또는 분말화된 분산제를 가진 혼합물로 약학 조성물을 제제화할 수 있다. 에어로졸 또는 스프레이 형태로 투여하기에 적합한 약학 제제는 예를 들어, 약학적으로 허용되는 용매, 예컨대, 에탄올 또는 물, 또는 이러한 용매의 혼합물 중의 본원에 교시된 작용제 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염의 용액, 현탁액 또는 유화액이다. 필요한 경우, 제제는 다른 약학 보조제, 예컨대, 계면활성제, 유화제 및 안정제뿐만 아니라 추진제도 추가로 함유할 수 있다. 예시적으로, 전달은 1회용 전달 장치, 미스트 분무기, 호흡 작동 분말 흡입기, 에어로졸 정량 흡입기(MDI), 또는 당분야에서 이용 가능한 다수의 분무기 전달 장치들 중 임의의 다른 전달 장치의 이용에 의해 달성될 수 있다. 추가로, 미스트 텐트 또는 기관내 튜브를 통한 직접 투여도 이용될 수 있다.

점막 표면을 통한 투여를 위한 담체의 예는 구체적인 경로, 예를 들어, 경구, 설하, 비강내 등에 의해 좌우된다. 경구 투여될 때, 예시적인 예는 약학 등급의 만니톨, 전분, 락토스, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카라이드, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함하고, 이때 만니톨이 바람직하다. 비강내 투여될 때, 예시적인 예는 폴리에틸렌 글리콜, 인지질, 글리콜 및 당지질, 수크로스, 및/또는 메틸셀룰로스, 증량제, 예컨대, 락토스 및 방부제, 예컨대, 염화벤즈알코늄을 갖거나 갖지 않은 분말 현탁액, EDTA를 포함한다. 특히 예시적인 실시양태에서, 인지질 1,2 디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC)은 약 0.1 내지 3.0 mg/㎖의 농도로 본 발명의 화합물을 비강내 투여하기 위해 약 0.01% 내지 0.2%의 등장성 수성 담체로서 사용된다.

예를 들어, 비경구 투여의 경우, 약학 조성물은 유리하게는 적합한 용매, 희석제, 가용화제 또는 유화제 등과 함께 용액, 현탁액 또는 유화액으로서 제제화될 수 있다. 적합한 용매는 제한 없이 물, 생리식염수 용액, PBS, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 또는 행크 용액, 또는 알코올, 예를 들어, 에탄올, 프로판올, 글리세롤, 또한 당 용액, 예컨대, 글루코스, 전화당, 수크로스 또는 만니톨 용액, 또는 대안적으로 언급된 다양한 용매들의 혼합물이다. 주사 가능한 용액 또는 현탁액은 적합한 비경구적으로 허용되는 무독성 희석제 또는 용매, 예컨대, 만니톨, 1,3-부탄디올, 물, 링거 용액 또는 등장성 염화나트륨 용액, 또는 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제, 예컨대, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 비롯한 멸균된 순한 고정 오일, 및 올레산을 비롯한 지방산을 사용함으로써 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 본 발명의 작용제 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 동결건조될 수도 있고, 수득된 동결건조물은 예를 들어, 주사 또는 주입 제제의 제조에 사용된다. 예를 들어, 정맥내 사용을 위한 담체의 한 예시적인 예는 10% USP 에탄올, 40% USP 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 600 및 나머지 USP 주사용수(WFI)의 혼합물을 포함한다. 정맥내 사용을 위한 다른 예시적인 담체는 10% USP 에탄올 및 USP WFI; USP WFI 중의 0.01% 내지 0.1% 트리에탄올아민; 또는 USP WFI 중의 0.01% 내지 0.2% 디팔미토일 디포스파티딜콜린; 및 1% 내지 10% 스쿠알렌 또는 비경구 식물성 수중유 유화액을 포함한다. 피하 또는 근육내 사용을 위한 담체의 예시적인 예는 포스페이트 완충 식염수(PBS) 용액, WFI 중의 5% 덱스트로스 및 USP WFI 중의 5% 덱스트로스 또는 0.9% 염화나트륨 중의 0.01% 내지 0.1% 트리에탄올아민, 또는 10% USP 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 나머지 허용되는 등장성 용액, 예컨대, 5% 덱스트로스 또는 0.9% 염화나트륨의 1 대 2 또는 1 대 4 혼합물; 또는 USP WFI 중의 0.01% 내지 0.2% 디팔미토일 디포스파티딜콜린 및 1% 내지 10% 스쿠알렌 또는 비경구 식물성 수중유 유화액을 포함한다.

수성 제제가 바람직한 경우, 이러한 제제는 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 적어도 하나의 적합한 계면활성제, 예를 들어, 인지질 계면활성제를 포함하는 미셀 분산액의 형태로 존재할 수 있다. 인지질의 예시적인 예는 디아실 포스파티딜 글리세롤, 예컨대, 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤(DPMG), 디팔미토일 포스파티딜 글리세롤(DPPG), 및 디스테아로일 포스파티딜 글리세롤(DSPG); 디아실 포스파티딜콜린, 예컨대, 디미리스토일 포스파티딜콜린(DPMC), 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC) 및 디스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC); 디아실 포스파티드산, 예컨대, 디미리스토일 포스파티드산(DPMA), 디파니토일 포스파티드산(DPPA) 및 디스테아로일 포스파티드산(DSPA); 및 디아실 포스파티딜 에탄올아민, 예컨대, 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DPME), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE) 및 디스테아로일 포스파티딜 에탄올아민(DSPE)을 포함한다. 전형적으로, 수성 제제에서 계면활성제:활성 물질 몰 비는 약 10:1 내지 약 1:10, 보다 전형적으로 약 5:1 내지 약 1:5일 것이지만, 임의의 유효량의 계면활성제가 관심 있는 특정 목적에 가장 적합하기 위해 수성 제제에 사용될 수 있다.

좌제의 형태로 직장으로 투여될 때, 상온에서 고체이나 직장 공동(cavity)에서 액화되고/되거나 용해되어 약물을 방출하는 이 제제는 본 발명에 따른 화합물을 적합한 비-자극성 부형제, 예컨대, 코코아 버터, 합성 글리세라이드 에스테르 또는 폴리에틸렌 글리콜과 혼합함으로써 제조될 수 있다.

마이크로캡슐, 임플란트 또는 막대(rod)에 적합한 담체는 예를 들어, 글리콜산과 젖산의 공중합체이다.

이 분야에서 숙련된 자는 상기 설명이 완전한 것이라기보다는 오히려 예시적인 것임을 인식할 것이다. 실제로, 다양한 치료 용법으로 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투약 및 치료 용법의 개발과 마찬가지로, 많은 추가 제제화 기법 및 약학적으로 허용되는 부형제 및 담체 용액이 당분야에 숙련된 자에게 잘 알려져 있다.

투여될 하나 이상의 다른 활성 화합물과 임의로 조합되는, 본원에 교시된 분자의 용량 또는 양은 개별 사례에 의해 좌우되고, 관례에 따라, 최적 효과를 달성하기 위해 개별 상황에 맞게 조정되어야 한다. 따라서, 유닛 용량 및 용법은 치료될 장애의 성질과 중증도에 의해 좌우될 뿐만 아니라, 대상체의 종, 성별, 연령, 체중, 일반적인 건강, 식이, 투여 방식과 시간, 치료받을 인간 또는 동물의 면역 상태와 개별 반응성, 사용되는 화합물의 효능, 대사 안정성 및 작용 지속시간, 치료가 급성 또는 만성 또는 예방적 치료인지 여부, 또는 본 발명의 작용제 이외의 다른 활성 화합물이 투여되는지 여부와 같은 요인에 의해서도 좌우된다. 치료 효능을 최적화하기 위해, 본원에 교시된 분자를 상이한 투약 용법으로 먼저 투여할 수 있다. 전형적으로, 예를 들어, 주어진 치료 용법의 효능을 확인하기 위해 임상 시험 절차의 일부로서 적절한 스크리닝 어세이를 이용하여 조직 내의 분자 수준을 모니터링할 수 있다. 투약의 빈도는 의료 종사자(예를 들어, 의사, 수의사 또는 간호사)의 기술 및 임상적 판단 내에 있다. 전형적으로, 투여 용법은 최적 투여 파라미터를 확립할 수 있는 임상 시험에 의해 확립된다. 그러나, 의사는 상기 언급된 요인들 중 하나 이상의 요인, 예를 들어, 대상체의 연령, 건강, 체중, 성별 및 의학적 상태에 따라 이러한 투여 용법을 변경할 수 있다. 투약의 빈도는 치료가 예방적 치료인지 아니면 치유적 치료인지에 따라 달라질 수 있다.

본원에 기재된 분자 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 독성 및 치료 효능은 예를 들어, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 공지된 약학 절차에 의해 측정될 수 있다. 이 절차는 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 치료적으로 효과적인 용량)을 측정하는 데 이용될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고 비 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 약학 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 약학 조성물이 사용될 수 있지만, 정상 세포(예를 들어, 비-표적 세포)에 대한 잠재적 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위해 이러한 화합물을 영향받은 조직의 부위로 표적화하는 전달 시스템을 디자인하는 데 주의를 기울여야 한다.

세포 배양 어세이 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 적절한 대상체에서 사용하기 위한 용량의 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 약학 조성물의 용량은 일반적으로 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 용량은 사용된 제형 및 이용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 사용되는 약학 조성물의 경우, 치료 유효 용량은 먼저 세포 배양 어세이로부터 추정될 수 있다. 세포 배양에서 측정된 IC50(즉, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 약학 조성물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 용량을 제제화할 수 있다. 이러한 정보는 인간에 유용한 용량을 보다 더 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다. 혈장 중의 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

제한 없이, 질환의 유형과 중증도에 따라, 본원에 교시된 분자의 전형적인 용량(예를 들어, 전형적인 1일 용량 또는 전형적인 간헐적 용량, 예를 들어, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 매주, 1.5주마다, 2주마다, 3주마다, 매월 투여를 위한 전형적인 용량)은 상기 언급된 요인에 따라 용량당 약 10 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 대상체 체중일 수 있고, 예를 들어, 용량당 약 100 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 대상체 체중, 또는 용량당 약 200 ㎍/kg 내지 약 75 mg/kg 대상체 체중, 또는 용량당 약 500 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg 대상체 체중, 또는 용량당 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg 대상체 체중, 또는 용량당 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 대상체 체중일 수 있고, 예를 들어, 용량당 약 100 ㎍/kg, 약 200 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 400 ㎍/kg, 약 500 ㎍/kg, 약 600 ㎍/kg, 약 700 ㎍/kg, 약 800 ㎍/kg, 약 900 ㎍/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 2.0 mg/kg, 약 5.0 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 75 mg/kg 또는 약 100 mg/kg 대상체 체중일 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 교시된 분자는 지속 전달 시스템, 예컨대, (부분적으로) 이식된 지속 전달 시스템을 이용함으로써 투여된다. 숙련된 자는 이러한 지속 전달 시스템이 본원에 교시된 작용제를 보유하기 위한 저장소, 펌프 및 주입 수단(예를 들어, 튜빙 시스템)을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.

따라서, 본원은 하기 문장들에 기재된 측면 및 실시양태도 제공한다:

문장 1. 위치 12에서 돌연변이된 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 형성하고 야생형 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 실질적으로 형성하지 않도록 구성된 비천연 생성 분자.

문장 2. 문장 1에 있어서, 돌연변이체 인간 RAS 단백질이 G12V, G12C, G12A 또는 G12S 돌연변이체 인간 RAS 단백질, 바람직하게는 G12V 돌연변이체 인간 RAS 단백질인 분자.

문장 3. 문장 1 또는 2에 있어서, RAS 단백질이 KRAS, NRAS 또는 HRAS 단백질, 바람직하게는 KRAS 단백질인 분자.

문장 4. 문장 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 분자간 베타-시트가 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 위치 12의 아미노산을 포함하는 것인 분자.

문장 5. 문장 4에 있어서, 분자간 베타-시트가

a) G12V 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAVGVG(서열번호 2)의 일부 또는 전부; 또는

b) G12C 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGACGVG(서열번호 6) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGACGV(서열번호 3)의 일부 또는 전부; 또는

c) G12A 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAAGVG(서열번호 7) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAAGV(서열번호 4)의 일부 또는 전부; 또는

d) G12S 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGASGVG(서열번호 8) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGASGV(서열번호 9) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGASG(서열번호 5)의 일부 또는 전부

를 포함하는 것인 분자.

문장 6. 문장 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 위치 12에서 돌연변이된 인간 RAS 단백질의 용해도를 감소시킬 수 있거나 이 단백질의 응집 또는 봉입체 형성을 유도할 수 있는 분자.

문장 7. 문장 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 분자간 베타-시트에 참여하는 아미노산 스트레치를 포함하는 분자.

문장 8. 문장 7에 있어서, 아미노산 스트레치가 각각의 서열의 위치 11의 아미노산을 포함하는, 하기 아미노산 서열의 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 것인 분자:

a) TEYKLVVVGAVGVG(서열번호 2); 또는

b) TEYKLVVVGACGVG(서열번호 6) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGACGV(서열번호 3); 또는

c) TEYKLVVVGAAGVG(서열번호 7) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAAGV(서열번호 4); 또는

d) TEYKLVVVGASGVG(서열번호 8) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGASGV(서열번호 9) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGASG(서열번호 5).

문장 9. 문장 7 또는 8에 있어서, 아미노산 스트레치 VVVGAV(서열번호 10), LVVVGAV(서열번호 11), VVVGAVG(서열번호 12) 또는 VVVGAVGVG(서열번호 13)를 포함하는 분자.

문장 10. 문장 7 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 아미노산 스트레치가 하나 이상의 D-아미노산 및/또는 하나 이상의 그의 아미노산의 유사체를 포함하는 것인 분자.

문장 11. 문장 7 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 동일하거나 상이한 2개 이상, 바람직하게는 2개의 상기 아미노산 스트레치를 포함하는 분자.

문장 12. 문장 7 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 아미노산 스트레치 또는 스트레치들이 독립적으로 각각의 말단에서 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 나타내는 하나 이상의 아미노산에 의해 각각 독립적으로 플랭킹된 것인 분자.

문장 13. 문장 7 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 하기 구조를 포함하거나, 본질적으로 하기 구조로 구성되거나, 하기 구조로 구성된 분자:

상기 구조에서,

P1 내지 P4는 각각 독립적으로 문장 7 내지 10 중 어느 하나에 정의된 아미노산 스트레치를 표시하고;

NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4는 각각 독립적으로 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 나타내는 1개 내지 4개의 연속 아미노산, 예컨대, R, K, D, E, P, N, S, H, G, Q 및 A, 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 연속 아미노산, 바람직하게는 R, K, D, E, P, N, S, H, G 및 Q, 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 연속 아미노산, 보다 바람직하게는 R, K, D, E 및 P, 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 연속 아미노산을 표시하고;

Z1 내지 Z3은 각각 독립적으로 직접 결합 또는 바람직하게는 링커를 표시한다.

문장 14. 문장 13에 있어서, NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4가 각각 독립적으로 R, K, A 및 D, 및 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 연속 아미노산이고, 바람직하게는 NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4가 각각 독립적으로 R, K 및 D, 및 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 연속 아미노산이고, 예컨대, NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4가 각각 독립적으로 K, R, D, A 또는 KK, 바람직하게는 각각 독립적으로 K, R, D 또는 KK이고/이거나;

각각의 링커가 1개 내지 10개의 유닛, 바람직하게는 1개 내지 5개의 유닛의 스트레치로부터 독립적으로 선택되고, 이때 유닛이 각각 독립적으로 아미노산 또는 PEG이고, 예컨대, 각각의 링커가 독립적으로 GS, PP, AS, SA, GF, FF 또는 GSGS(서열번호 14), 또는 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체이고, 바람직하게는 각각의 링커가 독립적으로 GS, PP 또는 GSGS(서열번호 14), 바람직하게는 GS, 또는 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체인 분자.

문장 15. 문장 13 또는 14에 있어서, 하기 아미노산 서열의 펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이러한 펩타이드로 구성되거나, 이러한 펩타이드로 구성된 분자:

a) KVVVGAVKGSKVVVGAVK(서열번호 15); 또는

b) KLVVVGAVKGSKLVVVGAVK(서열번호 16); 또는

c) KVVVGAVGKGSKVVVGAVGK(서열번호 17); 또는

d) KVVVGAVGVGKGSKVVVGAVGVGK(서열번호 18); 또는

e) [Dap]LSVFAIKGSKLSVFAI[Dap](서열번호 160); 또는

f) [Dap]VVVGAVKGSKVVVGAV[Dap](서열번호 161); 또는

g) [Dap]VVVGAVGKGSKVVVGAVG[Dap](서열번호 162); 또는

h) [Dap]VVVGAVGVGKGSKVVVGAVGVG[Dap](서열번호 163); 또는

i) [Cit]VVVGAVKGSKVVVGAVK(서열번호 164); 또는

j) KVVVGAV[Cit]GSKVVVGAVK(서열번호 165); 또는

k) AVVVGAVKGSKVVVGAVK(서열번호 166); 또는

l) KVVVGAVAGSKVVVGAVK(서열번호 167); 또는

m) KVVVGAVKGSAVVVGAVK(서열번호 168); 또는

n) KVVVGAVKGSKVVVGAVA(서열번호 169); 또는

o) AVVVGAVKGSAVVVGAVK(서열번호 170); 또는

p) KVVVGAVAGSKVVVGAVA(서열번호 171); 또는

q) AVVVGAVAGSKVVVGAVK(서열번호 172); 또는

r) KVVVGAVKASKVVVGAVK(서열번호 173); 또는

s) KVVVGAVKGAKVVVGAVK(서열번호 174); 또는

t) KVVVGAVGKGFKVVVGAVGK(서열번호 175); 또는

u) KVVVGAVGKFFKVVVGAVGK(서열번호 176); 또는

v) KVVVGAVGVGKKVVVGAVGVGK(서열번호 178);

문장 16. 문장 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 검출 가능한 표지, 분자의 단리를 허용하는 모이어티, 분자의 안정성 또는 반감기를 증가시키는 모이어티, 분자의 용해도를 증가시키는 모이어티, 분자의 세포 흡수를 증가시키는 모이어티, 및/또는 분자를 세포에 표적화하는 것을 달성하는 모이어티를 포함하는 분자.

문장 17. 문장 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 의학에 사용하기 위한 분자.

문장 17'. 의학에 사용하기 위한, 문장 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 분자를 코딩하는 핵산으로서, 상기 분자가 폴리펩타이드인 핵산.

문장 18. 문장 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 인간 RAS 단백질의 위치 12의 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 분자.

문장 18'. 인간 RAS 단백질의 위치 12의 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 문장 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 분자를 코딩하는 핵산으로서, 상기 분자가 폴리펩타이드인 핵산.

문장 19. 문장 18 또는 18'에 있어서, 질환이 신생물성 질환, 특히 암인 분자 또는 핵산.

문장 20. 문장 18, 18' 또는 19에 있어서, 질환이 췌관 선암종, 대장 선암종, 다발성 골수종, 폐 선암종, 피부 흑색종, 자궁체 내막양 암종, 자궁 암육종, 갑상선 암종, 급성 골수성 백혈병, 방광 요로상피 암종, 위 선암종, 자궁경부 선암종, 두경부 편평 세포 암종, 비-소세포 폐암(NSCLC) 또는 대장암인 분자 또는 핵산.

문장 21. 문장 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 분자를 포함하는 약학 조성물.

문장 21'. 문장 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 약학 조성물로서, 상기 분자가 폴리펩타이드인 약학 조성물.

본원은 하기 문장들에 기술된 측면 및 실시양태도 제공한다:

문장 1*. 위치 13에서 돌연변이된 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 형성하고 야생형 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 실질적으로 형성하지 않도록 구성된 비천연 생성 분자.

문장 2*. 문장 1*에 있어서, 돌연변이체 인간 RAS 단백질이 G13V, G13C, 또는 G13S 돌연변이체 인간 RAS 단백질, 바람직하게는 G13V 돌연변이체 인간 RAS 단백질인 분자.

문장 3*. 문장 1* 또는 2*에 있어서, RAS 단백질이 KRAS, NRAS 또는 HRAS 단백질, 바람직하게는 KRAS 단백질인 분자.

문장 4*. 문장 1* 내지 3* 중 어느 하나에 있어서, 분자간 베타-시트가 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 위치 13의 아미노산을 포함하는 것인 분자.

문장 5*. 문장 4*에 있어서, 분자간 베타-시트가

a) G13V 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAGVVG(서열번호 82)의 일부 또는 전부; 또는

b) G13C 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAGCVG(서열번호 84) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGCV(서열번호 81)의 일부 또는 전부; 또는

c) G13S 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAGSVG(서열번호 85) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGSV(서열번호 86) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGAGS(서열번호 83)의 일부 또는 전부

를 포함하는 것인 분자.

문장 6*. 문장 1* 내지 5* 중 어느 하나에 있어서, 위치 13에서 돌연변이된 인간 RAS 단백질의 용해도를 감소시킬 수 있거나 이 단백질의 응집 또는 봉입체 형성을 유도할 수 있는 분자.

문장 7*. 문장 1* 내지 6* 중 어느 하나에 있어서, 분자간 베타-시트에 참여하는 아미노산 스트레치를 포함하는 분자.

문장 8*. 문장 7*에 있어서, 아미노산 스트레치가 각각의 서열의 위치 12의 아미노산을 포함하는, 하기 아미노산 서열의 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 것인 분자:

a) TEYKLVVVGAGVVG(서열번호 82); 또는

b) TEYKLVVVGAGCVG(서열번호 84) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGCV(서열번호 81); 또는

c) TEYKLVVVGAGSVG(서열번호 85) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGSV(서열번호 86) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGAGS(서열번호 83).

문장 9*. 문장 7* 또는 *8에 있어서, 아미노산 스트레치 VVVGAGV(서열번호 99), LVVVGAGV(서열번호 100), VVVGAGVV(서열번호 101), 또는 VVVGAGVVG(서열번호 102)를 포함하는 분자.

문장 10*. 문장 7* 내지 9* 중 어느 하나에 있어서, 아미노산 스트레치가 하나 이상의 D-아미노산 및/또는 하나 이상의 그의 아미노산의 유사체를 포함하는 것인 분자.

문장 11*. 문장 7* 내지 10* 중 어느 하나에 있어서, 동일하거나 상이한 2개 이상, 바람직하게는 2개의 상기 아미노산 스트레치를 포함하는 분자.

문장 12*. 문장 7* 내지 11* 중 어느 하나에 있어서, 아미노산 스트레치 또는 스트레치들이 독립적으로 각각의 말단에서 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 나타내는 하나 이상의 아미노산에 의해 각각 독립적으로 플랭킹된 것인 분자.

문장 13*. 문장 7* 내지 12* 중 어느 하나에 있어서, 하기 구조를 포함하거나, 본질적으로 하기 구조로 구성되거나, 하기 구조로 구성된 분자:

상기 구조에서,

P1 내지 P4는 각각 독립적으로 문장 7* 내지 10* 중 어느 하나에 정의된 아미노산 스트레치를 표시하고,

Z1 내지 Z3은 각각 독립적으로 링커를 표시한다.

문장 14. 문장 13에 있어서, NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4가 각각 독립적으로 R, K 및 D, 및 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 연속 아미노산이고, 예컨대, NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4가 각각 독립적으로 K, R, D 또는 KK이고/이거나;

각각의 링커가 1개 내지 10개의 유닛, 바람직하게는 1개 내지 5개의 유닛의 스트레치로부터 독립적으로 선택되고, 이때 유닛이 각각 독립적으로 아미노산 또는 PEG이고, 예컨대, 각각의 링커가 독립적으로 GS, PP 또는 GSGS(서열번호 14), 바람직하게는 GS, 또는 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체인 분자.

문장 15*. 문장 13* 또는 14*에 있어서, 하기 아미노산 서열의 펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이러한 펩타이드로 구성되거나, 이러한 펩타이드로 구성된 분자:

a) KVVVGAGVKGSKVVVGAGVK(서열번호 128); 또는

b) KLVVVGAGVKGSKLVVVGAGVK(서열번호 129); 또는

c) KVVVGAGVVKGSKVVVGAGVVK(서열번호 130); 또는

d) KVVVGAGVVGKGSKVVVGAGVVGK(서열번호 131);

임의로 이때 아미노산 서열은 하나 이상의 D-아미노산 및/또는 하나 이상의 그의 아미노산의 유사체를 포함하고, 임의로 이때 N-말단 아미노산은 아세틸화되고/되거나, C-말단 아미노산은 아미드화된다.

문장 16*. 문장 1* 내지 15* 중 어느 하나에 있어서, 검출 가능한 표지, 분자의 단리를 허용하는 모이어티, 분자의 안정성 또는 반감기를 증가시키는 모이어티, 분자의 용해도를 증가시키는 모이어티, 분자의 세포 흡수를 증가시키는 모이어티, 및/또는 분자를 세포에 표적화하는 것을 달성하는 모이어티를 포함하는 분자.

문장 17*. 의학에 사용하기 위한 문장 1* 내지 16* 중 어느 하나에 따른 분자, 또는 분자가 폴리펩타이드인 경우 이 분자를 코딩하는 핵산.

문장 17*'. 의학에 사용하기 위한, 문장 1* 내지 16* 중 어느 하나에 따른 분자를 코딩하는 핵산으로서, 상기 분자가 폴리펩타이드인 핵산.

문장 18*. 문장 1* 내지 16* 중 어느 하나에 있어서, 인간 RAS 단백질의 위치 13의 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 분자.

문장 18*'. 인간 RAS 단백질의 위치 12의 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 문장 1* 내지 16* 중 어느 하나에 따른 분자를 코딩하는 핵산으로서, 상기 분자가 폴리펩타이드인 핵산.

문장 19*. 문장 18* 또는 18*'에 있어서, 질환이 신생물성 질환, 특히 암인 분자 또는 핵산.

문장 20*. 문장 18*, 18*' 또는 19*에 있어서, 질환이 췌관 선암종, 대장 선암종, 다발성 골수종, 폐 선암종, 피부 흑색종, 자궁체 내막양 암종, 자궁 암육종, 갑상선 암종, 급성 골수성 백혈병, 방광 요로상피 암종, 위 선암종, 자궁경부 선암종, 두경부 편평 세포 암종, 비-소세포 폐암(NSCLC) 또는 대장암인 분자 또는 핵산.

문장 21*: 문장 1* 내지 16* 중 어느 하나에 따른 분자를 포함하는 약학 조성물.

문장 21*'. 문장 1* 내지 16* 중 어느 하나에 따른 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 약학 조성물로서, 상기 분자가 폴리펩타이드인 약학 조성물.

본 발명이 그의 특정 실시양태와 관련하여 기재되어 있지만, 상기 설명에 비추어 볼 때 많은 대안, 변형 및 변경이 당분야에서 숙련된 자에게 자명할 것임이 명백하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 사상 및 넓은 범위에서 다음과 같은 모든 이러한 대안, 변형 및 변경을 포괄하기 위한 것이다.

본원에 개시된 본 발명의 측면 및 실시양태는 하기 비제한적인 실시예에 의해 더 뒷받침된다.

실시예

실시예 1 내지 7에 사용된 재료 및 방법

RAS 특이적 응집 분자('펩트-인')의 디자인

RAS 패밀리 구성원 단백질에 대한 단백질 서열을 UniProt(항목: P01116(KRAS), P01112(HRAS) 및 P01111(NRAS))으로부터 입수하였다(Nucleic Acid Res. 47(2008) 36, D190-5). TANGO 알고리즘(상기 문헌[Fernandez-Escamilla et al. 2004])을 이용하여 단백질 서열을 분석하여 응집 성향 영역(APR)을 확인하였다. 이를 위해, 하기 설정을 이용하였다: 온도 = 298K, pH = 7.5, 이온 강도 = 0.10 M 및 잔기당 1의 TANGO 점수에 대한 컷오프. TANGO 프로파일에 대한 우세한 G12 및 G13 돌연변이의 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 영향을 받는 APR을 함유하는 19개 아미노산(1 내지 19)의 서열 단편을 사용하였다. 이 서열 단편은 KRAS, HRAS 및 NRAS 사이에 100% 보존되므로, 결과는 모든 RAS 동형체에 적용된다. 돌연변이를 수동으로 도입하였고, 상기 TANGO 알고리즘을 이용하여 서열을 분석하였다.

RAS 야생형 서열 및 RAS G12V 서열 둘 다를 사용하는 TANGO 결과물을 기반으로, 본 발명자들은 슬라이딩 윈도우 접근법을 이용하여 6개 내지 10개 아미노산의 모든 가능한 APR 윈도우를 생성하였다. 생성된 서열 윈도우를 전체 인간 프로테옴에 대해 교차비교하였고, RAS 단백질과의 고유 정확한 일치를 가진 서열만을, 분자(이하, '펩트-인') 디자인을 위해 유지하였다.

펩타이드 합성 및 정제

고체상 펩타이드 합성

펩타이드 합성을 50 또는 100 ㎛ol 규모로 심포니(Symphony) X 펩타이드 합성기(Gyros Protein Technologies)에서 수행하였다. 링크 아미드 낮은 로딩 수지(100 내지 200 메쉬), O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU) 및 디에틸 에테르를 노바바이오켐(Novabiochem)/머크(Merck)로부터 구입하였다. Fmoc 보호된 아미노산(AA) 및 트리플루오로아세트산(TFA)을 플루오로켐(Fluorochem)으로부터 구입하였다. N,N-디메틸포름아미드(DMF), DMF 용액 중의 20% 피페리딘, N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA), 트리이소프로필실란(TIS) 및 디티오트레이톨(DTT)을 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구입하였다. 디클로로메탄(DCM)을 아크로스 오가닉스(Acros Organics)로부터 구입하였다. 원하는 서열의 연장을 Fmoc 제거 및 아미노산 커플링의 반복된 주기로 수행하였다(규모에 의해 좌우되는 부피 및 농도에 대해서는 하기 표 10 참조). 먼저, 수지를 DMF에서 10분 동안 2회 팽윤시켰다. 다음으로, Fmoc 보호기를 5분 동안 DMF 중의 20% 피페리딘 용액에 2회 노출시켜 제거하였다. 이어서, 수지를 DMF로 세척하고, 30분 동안 DMF에서 4 당량 AA, 4 당량 HCTU 및 16 당량 DIPEA를 사용하여 커플링을 수행하였다. 수지를 다음 주기 전에 DMF로 세척하였다. 연장된 Fmoc 제거(15분 동안 2회) 및 이중 커플링(30분 동안 2회)을 두 번째 APR의 첫 번째 AA부터 원하는 서열의 말단까지 수행하였다. 그 다음, 수지를 DMF, DCM으로 여러 번 세척한 다음 10분 동안 2회 건조하였다. 2.5% 초순수, 2.5% TIS 및 2.5% DTT를 함유하는 TFA 용액을 사용하여 건조된 수지로부터 펩타이드를 2시간 동안 최종적으로 절단하였다. 그 다음, 펩타이드 용액을 냉각된 디에틸 에테르(5 ㎖의 TFA 용액의 경우 35 ㎖)에 침전시키고 원심분리하였고; 이어서, 액체상을 버리고, 펩타이드 펠렛을 15 ㎖ 디에틸 에테르로 세척하였다. 원심분리 후, 펠렛을 30분 동안 공기 건조한 다음, 10 ㎖의 물/아세토니트릴 용액(1:1)에 용해시키고 냉동시키고 하룻밤 동안 동결건조기로 동결건조하여 미정제 분말로서 펩타이드를 제공하였다.

[표 10]

펩타이드 정제

페노메넥스(Phenomenex)로부터의 C18 컬럼(5 ㎛ 110 Å 250 X 21.2 mm, ref 006-4435-P0-AX)을 이용하여 322 펌프, 159 UV-vis 검출기 및 GX281 수집기를 갖춘 길슨(Gilson) 시스템에서 역상 분취 HPLC를 통해 미정제 펩타이드를 정제하였다. HPLC 등급 물 및 아세토니트릴을 VWR로부터 구입하였고, TFA를 플루오로켐으로부터 구입하였다. 구아니딘 염산염(Gu)을 시그마 알드리치로부터 구입하였고; 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 아세트산을 머크로부터 구입하였다. 용매 A는 물 + 0.1% TFA이고 용매 B는 아세토니트릴 + 0.1% TFA이다. 미정제 분말을 DMSO에 20 mg/㎖로 용해시키고, 볼텍싱하고, 초음파처리한 후; 용액을 물 중의 Gu + 10% 아세트산으로 10배 희석하고 마지막으로 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터(Merck)에서 여과하였다. 그 후, 15% B에서 7분의 유지 시간, 10분 이내에 15% B부터 45% B까지 용출, 이어서 2분 동안 95% B를 사용한 컬럼 세척 및 6분 동안 15% B에서의 평형화로 구성된 구배를 이용하여 펩타이드 용액을 30 ㎖/분의 유속으로 정제하였다. 그 다음, 분획을 MALDI 질량 분광측정기로 분석하였다. 순수 분획을 유리 바이알에 함께 모으고 적어도 2일에 걸쳐 냉동시키고 동결건조하였다. UV 및 MS 신호 둘 다에 의한 90% 순도를 역치로서 사용하는 품질 관리 검증을 위해 순수 펩타이드를 LCMS로 최종적으로 분석하였다.

세포 효능 스크리닝

본원에서 사용된 세포주는 하기 표 11에 나열되어 있다:

[표 11]

인간 종양 세포주를 ATCC(즉, NCI-H441(HBT-174^TH), NCI-H1299(CRL-5803TM), NCI-H358(CRL-5807TM), NCI-H727(CRL-5815TM), A-427(HTB-53TM), PANC-1(CRL-1469TM), HCT-116(CCL-247TM), 및 MIAPaCa-2(CRL-1420TM)), CLS 세포주 서비스 게엠베하(Cell Line Service GmbH)(즉, Capan-1(300143), 및 LCLC-97TM1(300409)), 또는 라이프니츠 연구소 DSMZ(즉, PA-TU-8998T(ACC 162))로부터 입수하였다. 단일 RAS 동형체를 발현하는 마우스 배아 섬유모세포('RASless MEF'로서 지칭됨)를 미국 메릴랜드주 프레데릭에 있는 국립 암 연구소의 프레데릭 국립 실험실로부터 입수하였다. 모든 세포주들을 공급자의 설명서에 따라 유지하였다.

부착 생존율 어세이

부착 세포에 대한 일회 용량 생존율 스크린을 위해, 100 ㎕ 완전 생장 배지에서 웰당 4000개의 세포를 검정색 μclear^® Cellstar^® F-바닥 96웰 플레이트(Greiner)에 시딩하였다. 시딩 다음날, 생장 배지를, 25 μM의 고정된 최종 용량으로 표시된 펩트-인을 함유하는 완전 생장 배지로 교체하였다. 모든 실험적 펩트-인 조건에 대해 기술적 중복실험물을 포함시켰다. 처리 후 2일째 날 및 4일째 날, 다음과 같이 조정된 셀타이터 블루(CellTiter Blue) 시약(Promega)을 제조사의 설명서에 따라 사용하여 생존율을 평가하였다: 셀타이터 블루 시약을 PBS에 2분의 1로 희석하였다. 클라리오스타(Clariostar) 플레이트 판독기(BMG)에서 판독을 수행하였다. 다음과 같이 조정된 용량-반응 어세이를 수행하였다: 2분의 1 연속 희석을 이용하는 용량-반응에서 펩트-인을 시험하였고, 이때 50 μM이 사용된 가장 높은 최종 농도이었다. 나아가, 다음과 같이 조정된 셀타이터 글로(Celltiter Glo) 시약(Promega)을 제조사의 설명서에 따라 사용하여 처리 후 3일째 날에 단일 생존율 판독을 수행하였다: 셀타이터 글로 시약을 PBS에 1/4로 희석하였다.

모든 시험 플레이트는 다수의 정상 생장 및 비히클 대조군들뿐만 아니라, 양성 대조군 화합물 SAH-SOS-1A(CAS 번호 1652561-87-9)의 용량-반응의 중복실험물도 함유하였다.

스페로이드 생존율 어세이

스페로이드 배양물에 대한 일회 용량 생존율 스크린을 위해, 75 ㎕ 완전 생장 배지에서 웰당 1000개의 세포를 검정색 초저 부착(Ultra-Low Attachment; ULA) 환저 96웰 플레이트(Corning)에 시딩하였다. 시딩 다음 날, 첨가 후 최종 농도가 25 μM이 되도록 표시된 시험 화합물을 함유하는 50 ㎕의 완전 생장 배지를 첨가함으로써 스페로이드를 처리하였다. 모든 실험적 펩트-인 조건에 대해 기술적 중복실험물을 포함시켰다. 처리 후 5일째 날, 다음과 같이 조정된 셀타이터 글로 3D 시약(Promega)을 제조사의 설명서에 따라 사용하여 생존율을 평가하였다: 웰당 80 ㎕의 시약을 첨가하였다. 클라리오스타 플레이트 판독기(BMG)에서 판독을 수행하였다. RASless MEF를 사용한 용량-반응 어세이의 경우, 24시간 후, 처리 시작 시 동등하게 생존 가능한 스페로이드를 수득하기 위해 세포를 매트리겔(Matrigel) 함유 배지에 1000(G12V 및 G12C) 또는 2000(야생형 및 BRAF V600E)으로 시딩하였다. 다음과 같이 조정된 용량-반응 어세이를 수행하였다: 2분의 1 연속 희석을 이용하여 용량-반응에서 펩트-인을 시험하였고, 이때 50 μM이 가장 높은 최종 농도이었다.

모든 시험 플레이트는 다수의 정상 생장 및 비히클 대조군들뿐만 아니라, 양성 대조군 화합물 SAH-SOS-1A(Merck)의 용량-반응의 중복실험물도 함유하였다.

착색 시험관내 응집 어세이

아밀로이드 센서 염료인 티오플라빈 T(ThT)와 오량체성 포르밀 티오펜 아세트산(p-FTAA)을 사용하여 착색 응집 어세이를 수행하였다. PBS 중의 6 M 우레아 중의 5 mM 스톡 용액으로부터 100 μM의 최종 농도까지 펩트-인을 희석하였다. 22시간 동안 동역학적으로 클라리오스타 플레이트 판독기(BMG)에서 37℃의 검정색 절반 면적 96웰 플레이트에서 측정을 수행하였다.

KRAS 응집 시딩 어세이

낮은 결합 튜브에서 PBS 중의 6 M 우레아 중의 5 mM 스톡으로부터 100 μM의 최종 농도까지 펩트-인을 희석하고 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 이 용액을 후속 시딩 어세이에 직접 사용하였거나, 액체 질소를 사용하여 분취액을 급속 냉동하고 추후 시딩 어세이를 위해 -80℃에서 저장하였다.

성숙 펩트-인 응집체를 사용한 시딩 어세이를 위해, 200 mM의 아르기닌 및 글루타민을 함유하는 헤페스(Hepes) 완충제에서 5 μM의 성숙 펩트-인 용액을 1 mg/㎖ 재조합 돌연변이체 KRAS G12V와 혼합하였다. 클라리오스타 플레이트 판독기(BMG) 상에서 37℃에서 응집/아밀로이드 센서 염료로서 ThT를 사용하여 검정색 384웰 플레이트(웰당 30 ㎕ 최종 부피)에서 시딩을 모니터링하였다.

펩트-인 시드를 사용한 시딩 어세이를 위해, 성숙 펩트-인 용액을 PBS에 3분의 1로 희석하고 3초 중단에 의해 분리된 5초의 주기를 이용하여 5분 동안 초음파처리하였다. 그 다음, 5 μM의 초음파처리된 펩트-인 용액을, 200 mM의 아르기닌 및 글루타민을 함유하는 헤페스 완충제에서 1 mg/㎖ 재조합 돌연변이체 KRAS G12V와 혼합하였다. 37℃의 클라리오스타 플레이트 판독기(BMG)에서 아밀로이드 센서 염료로서 ThT를 사용하여 검정색 384웰 플레이트(웰당 30 ㎕ 최종 부피)에서 시딩을 모니터링하였다.

시험관내 번역 어세이

제조사의 설명서에 따라 PURExpress^® 시험관내 단백질 합성 키트(New England Biolabs)를 사용하여 시험관내 번역 어세이를 수행하였다. 간단히 말해서, PCR을 이용하여 KRAS 코딩 서열을 플랭킹하는 T7 프로모터 및 터미네이터 서열을 함유하는 선형 DNA 단편을 생성하고 민일루트(MinElute) PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 그 후, 250 ng의 선형 DNA를 진탕하면서(1000 rpm) 37℃에서 2시간 동안 수행된 시험관내 번역 반응에 사용하였다. 표시된 바이오티닐화된 펩트-인을, 번역 반응에서 6 M 우레아 중의 5 mM 스톡 용액으로부터 10 μM의 최종 농도까지 혼합하였다. 번역 반응이 완료되었을 때, 실온에서 90분 동안 스트렙타비딘 코팅 비드(Pierce)를 사용하여 반응 혼합물로부터 바이오티닐화된 펩트-인을 포획하였다. 다음으로, 0.1% Tween 20을 함유하는 TBS로 비드를 세척하고 결합된 단백질을 TBS 완충제 중의 1X SDS 로딩 염료(Bio-Rad)에서 최종적으로 끓였다. SDS-PAGE 동안 Any kD 15웰 Mini-PROTEAN 겔(Bio-Rad)을 사용하여 단백질을 분리하였고, 바이오-라드(Bio-Rad) 케미독(Chemidoc) MP 영상화 기계에서 화학발광을 이용함으로써 HRP-커플링된 항-마우스 2차 항체에 의해 검출되는 마우스 단일클론 KRAS 특이적 항체(SC-30, Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 웨스턴 블롯팅 후 KRAS에 대해 상기 단백질을 프로빙하였다.

공-면역침전 어세이

KRAS 야생형 또는 돌연변이체 G12V를 발현하는 RASless MEF(다른 곳 참조) 또는 인간 NCI-H441 폐 선암종 종양 세포 및 N-말단 바이오티닐화된 펩트-인을 사용하여 세포 공-면역침전 어세이를 수행하였다. 세포를 투명한 6웰 플레이트(Cellstar, Greiner)에 300,000개 세포의 밀도로 시딩하였다. 시딩 다음날, 세포를 25 μM의 최종 농도에서 표시된 펩트-인으로 처리하고 20시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 세포를 NP-40 용해 완충제(150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 8, 1% IGEPAL(NP40), 1xHalt 포스파타제/프로테아제 억제제(Thermo), 1 U/㎕ 유니버설 뉴클레아제(Pierce))로 용해시키고, 바이오티닐화된 펩트-인을 실온에서 1시간 동안 스트렙타비딘 코팅 자기 비드(Pierce)로 포획하였다. 비드를 NP40 용해 완충제로 적어도 3회 세척한 후, 결합된 단백질을 NP40 용해 완충제 중의 1X SDS 로딩 염료(Bio-Rad)에서 끓였다. SDS-PAGE 동안 Any kD 15웰 Mini-PROTEAN 겔(Bio-Rad)을 사용하여 단백질을 분리하였고, 토끼 다중클론 KRAS 특이적 항체(12063-1-AP, Proteintech)를 사용하여 웨스턴 블롯팅 후 KRAS에 대해 상기 단백질을 프로빙하였다.

유세포분석

NCI-H441 세포를 175 k 세포/웰의 밀도로 12웰 플레이트에 시딩하였다. 다음날, 세포를 비히클 또는 12.5 μM의 RAS 표적화 펩트-인 또는 음성 대조군 펩트-인으로 처리하였다. 6시간, 16시간 및 24시간의 처리 후, 세포를 PBS로 세척하고 TrypLE Express(Thermo Fisher)를 사용하여 세포를 탈착시켰다. 그 다음, 사이톡스 블루(Thermo Fisher) 및 아미트랙커 레드(Ebba Biotech AB)를 사용하여 세척된 세포를 염색한 후, 갈리오스(Gallios) 유세포분석기(Beckman Coulter)에서 분석하였다.

세포 형광 영상화

N-말단에서 mCherry로 표지된 KRAS G12V를 발현하는 구축물을 운반하는 렌티바이러스 입자가 형질도입된 HeLa 세포를 사용하여 형광 세포 영상화를 수행하였다. 세포를 100 ㎕ 완전 생장 배지에서 검정색 μclear^® Cellstar^® F-바닥 96웰 플레이트(Greiner)에 시딩하였다. 하루 후, 세포를 20분 동안 정상 생장 배지 중의 표시된 FITC-표지된 펩트-인으로 처리한 후, 펩트-인 용액을 세척하고 정상 생장 배지로 다시 교체하고 추가 2시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 세포를 고정시키고 세척하고 핵 염료 NucBlue^TM(Hoechst 33342 함유)로 대조염색하였다. 영상을 레이카(Leica) 공초점 현미경으로 포착하였다.

생체내 SW620 이종이식편 모델

50% 매트리겔 중의 1x10⁶개 SW620 종양 세포를 암컷 NCr nu/nu 마우스(8주 내지 12주)의 뒤쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 세포 주입 부피는 0.1 ㎖/마우스이었다. 종양의 평균 크기가 100 내지 150 mm³에 도달하였을 때, 쌍 일치를 수행하였고 치료를 시작하였다. 군 크기는 비치료 군의 경우 N=6, 비히클 군의 경우 N=5, 및 펩트-인 군과 양성 대조군의 경우 N=8이었다. 종양 성장을 주당 2회 캘리퍼 측정으로 모니터링하였다. 모델 반응을 3주 동안 100 mg/kg으로 매주 1회 복강내 투여된 이리노테칸으로 모니터링하였다.

실시예 1: RAS 특이적 응집 분자('펩트-인')의 디자인

본 발명자들은 통계학적 열역학 알고리즘 TANGO를 이용하여 인간 RAS 패밀리 단백질(HRAS, NRAS 및 KRAS)의 1차 아미노산 서열에서 응집 성향 영역(APR)을 식별하였다. 이 분석은 3개의 RAS 패밀리 구성원 모두가 동일한 TANGO 프로파일을 갖고, 이들 각각이 적어도 5개 아미노산 길이를 가진 5개의 APR을 보유하고 이들 중 2개의 APR이 적어도 20%의 TANGO 점수를 가짐을 보여주었다(표 6). 표 6에 표시된 바와 같이 주어진 APR의 시작 위치('시작')는 RAS 서열에서 각각의 응집 성향 영역 그 자체에 앞서는 첫 번째 N-말단 게이트키퍼의 위치에 상응하는 반면, 본 명세서의 다른 곳에서 APR의 시작 위치는 N-말단 게이트키퍼 없이 제공될 수 있다. 따라서, 예를 들어, RAS의 N-말단 최외각 APR은 RAS의 위치 1에 있는 M 게이트키퍼에서 시작하도록 표 6에 언급되어 있는 반면, 이 APR은 본 명세서의 다른 곳에서 위치 2에서 T로 시작하는 것으로 언급될 수 있다. 또한, 표 6에서, 'N-GKs'는 RAS에서 예측된 APR의 N-말단에 인접한 천연 게이트키퍼 잔기를 표시하고, 'C-GKs'는 RAS에서 예측된 APR의 C-말단에 인접한 천연 게이트키퍼 잔기를 표시하고, 'APR 서열'은 APR 서열을 표시하고, '점수'는 % 단위의 TANGO 점수를 의미하고, '길이'는 임의의 게이트키퍼를 제외한 APR 길이(aa)를 표시한다.

[표 6]

RAS 패밀리 구성원의 활성화 돌연변이는 인간 암에서 흔한 종종 초기 사건이고, 모든 인간 종양의 최대 1/3은 RAS 패밀리 구성원 중 한 구성원의 미스센스 돌연변이를 갖는 것으로 보고되었다. 이 돌연변이의 99% 이상은 소위 핫스팟 돌연변이 부위에서 발생하는데, 이 부위는 RAS 패밀리 구성원 사이에 공유되고 코돈 12, 13 및 61에 위치한다. 흥미롭게도, 코돈 12는 APR의 C-말단에 위치하고, 코돈 13은 APR의 C-말단에 바로 인접하여 위치하므로, 이 위치들 중 한 위치에서의 미스센스 돌연변이는 응집 성향뿐만 아니라 응집 과정의 서열 선택성도 변경할 것이다(표 6). 전자를 연구하기 위해, 본 발명자들은 코돈 12 또는 13에서 우세한 한 세트의 돌연변이(모든 KRAS 돌연변이체 암들에 걸쳐 >1%)가 서열의 TANGO 결과물을 어떻게 변경하는지를 분석하였다(표 7). 표 7에서 '점수'는 TANGO 점수(%)를 의미하고, '길이'는 임의의 게이트키퍼를 제외한 APR 길이(aa)를 표시하고, '빈도'는 COSMIC 데이터베이스에 기반한, 모든 KRAS 돌연변이체 암에서의 특정 G12 또는 G13 돌연변이의 빈도(%)를 표시한다.

[표 7]

위치 G12에서 가장 우세한 돌연변이는 G12D이다. 이 돌연변이는 TANGO가 게이트키퍼 잔기로서 식별하는 음으로 하전된 아스파르테이트를 도입하여, TANGO 점수가 증가된 약간 더 짧은 APR을 생성한다. 그러나, APR에 대한 두 번째로 가장 우세한 돌연변이 G12V의 영향은 이 돌연변이가 APR 서열의 길이 및 TANGO 점수 둘 다를 증가시키기 때문에 가장 엄청나다. 다른 우세한 G12 돌연변이는 APR 서열을 단축하거나 연장하나, TANGO 점수를 유의미하게 변경하지 않는다. G13D 돌연변이도 매우 우세하고 APR의 서열을 변경하지 않으면서 APR의 응집 성향을 증가시킨다. 따라서, 야생형 APR에 상응하는 스트레치를 가진 펩트-인은 야생형 RAS에 비해 G13D RAS의 하향조절에 대한 선호도를 나타낼 수 있다는 것이 가능하다. APR에 대한 G13V의 영향도 이 G13V가 APR 서열의 길이 및 TANGO 점수 둘 다를 증가시키기 때문에 매우 엄청나다.

간섭제 기술을 이용하여 G12 또는 G13 돌연변이체 인간 RAS를 특이적으로 표적화하는 것의 실현 가능성을 예증하는 실시양태로서, 본 발명자들은 이 데이터를 기반으로 RAS WT 또는 G12V 선택적 펩트-인의 디자인을 위해 RAS WT 및 G12V APR을 선택하였다.

이를 위해, 본 발명자들은 슬라이딩 윈도우 접근법을 이용하여 APR의 서열을 기반으로 모든 가능한 6-mer 내지 10-mer(본 실험에서, 10개 아미노산의 길이 제한은 고체상 합성의 길이 용량에 의해 알려졌음)를 생성하였다. 다음으로, 생성된 'APR 윈도우'를 전체 인간 프로테옴과 정렬하여 RAS 패밀리 구성원 이외의 다른 단백질에서 정확한 일치를 가진 서열을 배제함으로써, 이 서열을 함유하는 펩트-인의 오프-표적 활성을 제한하였다. 이 여과 단계는 본 발명자들의 펩트-인 디자인에서 더 사용된 38개의 윈도우를 생성하였다. 디자인을 위해, 본 발명자들은 APR 윈도우가 한 번 반복되고 링커에 의해 분리되는 이전에 고안된 직렬 반복부 구성(국제 특허출원 공개 제WO2012/123419호(A1) 참조)을 이용하였다. 초기 스크리닝 라이브러리의 디자인을 위해, 본 발명자들은 GS 링커 및 PP 링커를 가진 변이체를 포함시켰다. 나아가, 이 응집 서열의 콜로이드 안정성을 증가시키기 위해, APR 윈도우의 각각의 반복부를 플랭킹하는 게이트키퍼 잔기를 펩트-인에 도입하였다. 2개의 양으로 하전된 아미노산(아르기닌(R) 및 라이신(K)) 및 1개의 음으로 하전된 아미노산(아스파르테이트(D))을 선택하고 스크리닝 라이브러리에 도입하였다. 상이한 게이트키퍼 잔기 및 링커를 가진 생성된 펩트-인 주형의 개요는 표 8에 제공되어 있다. K-APR-KGSK-APR-K 주형은 모든 APR 윈도우에 적용된 반면, 다른 주형은 최대 8개 아미노산 길이를 가진 모든 APR 윈도우에 적용되었다.

[표 8]

고체상 합성을 이용하여 디자인된 모든 펩트-인을 생성하였으나, 몇몇 서열의 경우 합성 또는 정제가 품질 표준(순도 >95%)을 충족하지 못하였으므로 추가 분석으로부터 배제되었다. 합성 및 정제가 성공적인 펩트-인을 6 M 우레아에 5 mM 스톡으로 용해시키고 이의 생물학적 활성을 시험하였다.

실시예 2: RAS 표적화 펩트-인의 활성 스크리닝

RAS 돌연변이체 종양 세포의 생존율에 대한 펩트-인 활성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 KRAS에서 G12V 돌연변이를 보유하는 부착 NCI-H441 폐 선암종 세포를 사용하였다. 이 세포주가 실제로 그의 생장을 위해 KRAS에 의존하는지를 검증하기 위해, 본 발명자들은 SAH-SOS-1A를 양성 대조군으로서 사용하였다. SAH-SOS-1A는 KRAS에 대한 정규 구아닌 교환 인자인 세븐리스(sevenless) 1의 자손으로부터의 안정화된 나선을 기반으로 디자인된 펩타이드성 화합물이다(Leshchiner et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015, vol. 112(6), 1761-6). SAH-SOS-1A를 사용한 NCI-H441 세포의 처리는 4일 노출 후 약 15 μM의 IC₅₀으로 용량 의존적 생존율 감소를 야기하였고, 이것은 다른 세포주에 대해 보고된 값과 일치하였고 NCI-H441 세포주에 대한 KRAS 의존성을 확립하였다. 본 발명자들은 또한 NCI-H441 세포의 우레아 내성을 시험하였고 4일의 노출 후 60 mM의 우레아까지 생존율에 대한 유의미한 영향이 없음을 발견하였다.

펩트-인을 25 μM의 일회 용량(30 mM 우레아의 최종 농도에 상응함)으로 스크리닝하였고, 셀타이터 블루 시약을 사용하여 2일 및 4일의 노출 후 생존율을 측정하였다. 4일의 노출 후, 시험된 모든 K-APR-KGSK-APR-K 펩트-인의 대략 절반(약 52%)은 비히클 처리 세포(30 mM 우레아, 도 1A)에 비해 생존율의 적어도 25% 감소를 유도하였다. 시험된 다른 주형에 대한 히트율 및 효능은 상당히 더 낮았다. 추가 특징규명을 위해 강력한 히트를 선택하기 위해, 본 발명자들은 4일의 노출 후 생존율의 적어도 75% 감소를 보인 모든 펩트-인을 선택하였다. 이 컷오프는 K-APR-KGSK-APR-K 주형의 사용 시 5개의 펩트-인의 선택을 야기하였다: 04-004-N001, 04-006-N001, 04-014-N001, 04-015-N001 및 04-033-N001. 이 펩트-인들 중 하나(04-004-N001)는 RAS의 또 다른 APR로부터 유래한 APR 윈도우 서열을 보유하므로, G12 돌연변이체 및 야생형 RAS 둘 다에 존재하는 반면, 나머지 4개의 펩트-인(04-006-N001, 04-014-N001, 04-015-N001 및 04-033-N001)은 G12V 돌연변이체 부위로부터 유래하고 이 부위를 함유하는 APR 윈도우 서열을 보유한다. 또한, 본 발명자들은 추후 어세이에서 음성 대조군으로서 사용될 1개의 생물학적 불활성 펩타이드(04-016-N001)를 선택하였다. 이 펩트-인은 RAS G12V를 표적화하도록 디자인되었으나 NCI-H441 세포의 생존율을 변경하지 못한 7-mer APR 윈도우를 가진다.

상기 언급된 펩트-인의 서열은 표 9에 표시되어 있다.

[표 9]

본 명세서의 다른 곳에도 기재된 바와 같이, 표 9에 나타낸 펩트-인 04-004-N001의 아미노산 서열은 서열번호 80을 배정받는 반면, 펩트-인 04-006-N001, 04-014-N001, 04-015-N001 및 04-033-N001의 아미노산 서열은 각각 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로서 표시된다. 표 9에서 'Ac'는 N-말단 아세틸화를 표시하고, 표 9에서 'NH2'는 C-말단 아미드화를 표시한다.

이 6개의 펩트-인을 재합성하고 정제하여, 용량-반응에서 부착 생장('2D 생존율 어세이') NCI-H441 세포의 생존율을 감소시키는 데 있어서 이들의 효능을 시험하였다. 이를 위해, 부착 생장 NCI-H441 세포에서 최대 용량인 50 μM부터 시작하는 2분의 1 연속 희석을 이용하여 펩트-인을 5점 용량-반응에서 시험하였다. 시험 화합물에 노출시킨 지 3일 후에 셀타이터 글로 생존율 어세이를 이용하여 생존율을 평가하였다. 이 분석은 5개의 활성 화합물이 모두 약 10 μM의 IC₅₀을 보임을 보여주었다(도 2).

이전 보고서는 KRAS 돌연변이체 세포주의 부착 생장이 KRAS 억제 또는 넉다운에 대한 이 세포주의 민감성을 약화시킬 것임을 보여주었기 때문에(Fujita-Sato et al. Cancer Res. 2015, vol. 75, 2851-62; Patricelli et al. Cancer Discov. 2016, vol. 6, 316-29; Vartanian et al. J Biol Chem. 2013, vol. 288, 2403-13), 본 발명자들은 동일한 세포주의 현탁 스페로이드 배양물에 대한 스크린으로 부착 생장 NCI-H441 세포에 대한 스크린을 보완하였다. 이를 위해, NCI-H441 세포를 스페로이드의 형성을 허용하는 초저 부착 환저 플레이트에 시딩하였다. 부착 스크린의 경우, 본 발명자들은 25 μM의 각각의 시험 펩트-인을 사용하는 일회 용량 접근법을 채택하였다. 5일의 노출 후, 프로메가(Promega)의 셀타이터 글로 3D 시약을 사용하여 스페로이드 배양물의 생존율을 측정하였다. 이 접근법을 이용하였을 때 히트율은 전술된 부착 스크린에 비해 상당히 더 낮았다(도 1B). 실제로, 부착 환경에서 시험된 모든 K-APR-KGSK-APR-K 펩트-인의 대략 절반은 비히클 처리 세포에 비해 적어도 25%의 생존율 감소를 유도한 반면, 스페로이드 환경에서 이 펩트-인 세트의 17%만이 생존율을 25% 이상 감소시켰다. 더욱이, 시험된 다른 주형에 대한 히트율 및 효능도 더 낮았다. 무엇보다도, 여기서 강력한 히트에 대해 부착 스크린과 동일한 선택 기준을 적용하는 것, 즉 5일의 노출 후 적어도 75%의 생존율 감소를 보인 펩트-인을 선택하는 것은 스페로이드 환경에서 활성을 나타내지 않은 04-014-N001을 제외하고 부착 스크린에서와 동일한 펩트-인의 선택을 야기하였다.

그 다음, 현탁 스페로이드 접근법을 이용하여, 더 큰 세트의 KRAS 돌연변이체 및 야생형 종양 세포주에 대한 4개의 활성 펩트-인의 효능을 평가하였다. 이 세포주에 대해 중앙값 IC₅₀을 보이는 각각의 펩트-인에 대한 폭포 플롯은 도 3에 표시되어 있다.

이어서, 현탁 스페로이드 접근법을 이용하여, NCI-H441 폐 선암종 세포에서 대안적 게이트키퍼 및/또는 링커 부분을 함유하는 04-004, 004-006, 04-015 및 04-033 펩트-인의 다양한 버전의 효능을 평가하였다. 각각의 펩트-인의 용량-반응에 5일 동안 노출시킨 후 셀타이터 글로 3D 어세이(Promega)를 이용하여 세포 생존율에 대한 IC₅₀을 측정하였다. 펩트-인 및 각각의 IC₅₀ 값은 하기 표 12에 나열되어 있다('Ac'는 N-말단 아세틸화를 표시하고; 'NH2'는 C-말단 아미드화를 표시하고; '[Dap]'는 디아미노피멜산을 표시하고; '[Cit]'는 시트룰린을 표시하고; L-아미노산은 대문자 코딩을 사용함으로써 표시되고; D-아미노산은 소문자 코딩으로 표시된다):

[표 12]

표 12는 세포 생존율에 대한 설득력 있는 IC₅₀ 값이 본원에 개시된 펩트-인, 예컨대, 그 자신의 게이트키퍼 스트레치들 중 하나 이상의 게이트키퍼 스트레치 내에 하나 이상의 D-라이신('k'), 디아미노피멜산('[Dap]'), 시트룰린('[Cit]') 또는 L-알라닌('A')을 함유하는 펩트-인; 그 자신의 링커 모이어티 내에 하나 이상의 L-알라닌('A') 또는 L-페닐알라닌('F'), 또는 하나 이상의 D-세린('s')을 함유하거나 심지어 임의의 링커 모이어티를 포함하지 않는 펩트-인; 및/또는 D-아미노산 및 글리신으로만 구성된 펩트-인의 다양한 실시양태를 예시하는 분자에 의해 입증됨을 보여준다. 이 펩트-인들은 단백질 내의 응집 성향 스트레치를 표적화하는 데 초점을 맞춘 본 접근법의 구조적 유연성을 입증한다.

실시예 3: RAS 표적화 펩트-인은 응집 성향을 나타내고 시험관내에서 직접적인 상호작용을 통해 RAS의 응집을 시딩한다.

RAS 표적화 펩트-인의 응집 거동을 연구하기 위해, 본 발명자들은 아밀로이드 응집 센서 염료 티오플라빈 T(ThT)와 오량체성 포르밀 티오펜 아세트산(p-FTAA)을 사용하여 동역학 착색 어세이를 수행하였다. 4개의 대표적인 생물학적 활성 펩트-인 모두가 상기 두 염료의 사용 시 명확한 아밀로이드 응집 동역학을 보인 반면, 불활성 대조군은 유의미한 ThT 신호를 보이지 않았고 시간 경과에 따라 p-FTAA 신호의 약간의 증가만을 보였다(도 4).

예시적인 생물학적 활성 펩트-인이 실제로 그의 표적 단백질인 KRAS G12V를 표적화할 수 있고 이 단백질의 응집을 시딩할 수 있음을 보여주기 위해, 본 발명자들은 상이한 KRAS 표적화 펩트-인의 말기 단계 응집체 또는 초음파처리된 시드를 사용하여 시딩 실험을 수행하였다. 이를 위해, 펩트-인이 착색 동역학 어세이의 경우와 동일한 시간 이내에 응집될 수 있게 하였다. 이어서, 말기 단계 샘플을 재조합적으로 생성된 KRAS G12V와 혼합하고 ThT를 사용하여 응집을 동역학적으로 모니터링하였다. 이 접근법은 KRAS G12V에 대한 이 말기 단계 펩트-인 응집체의 약한 시딩 능력만을 보여주었다. 그러나, 초음파처리를 통한 성숙 응집체의 파괴 시, KRAS G12V의 응집을 효율적으로 유도하는 강력한 시드가 형성된다(도 5).

RAS 표적화 펩트-인이 RAS 단백질과 직접 상호작용함을 보여주기 위해, 본 발명자들은 시험관내 번역 어세이를 설정하였다. 실제로, 이용 가능한 구조 데이터는 RAS APR이 천연 접힘에서 노출되지 않을 수 있음을 보여주기 때문에, 본 발명자들은 단백질이 번역되고 이 APR을 짧게 노출하는 동안 펩트-인과 이의 표적의 초기 상호작용이 리보좀에서 일어난다고 가정한다. 시험관내에서 이를 모방하기 위해, 본 발명자들은 바이오티닐화된 RAS 표적화 펩트-인 존재 하에 야생형 또는 돌연변이체(G12V, G12C, G12D 또는 G13D) KRAS를 생성하는 시험관내 번역 설정을 고안하였다. 이것은 본 발명자들로 하여금 스트렙타비딘 풀-다운을 수행하여 번역 반응으로부터 바이오티닐화된 펩트-인을 포획하고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅을 수행하여 KRAS의 존재에 대해 풀-다운 분획을 프로빙할 수 있게 하였다. 야생형 APR로부터 유래한 APR 윈도우 서열을 보유하는 펩트-인 04-004-N001의 바이오티닐화된 버전, 즉 04-004-N011은 RAS 단백질의 돌연변이 상태와 무관하게 모든 RAS 단백질을 표적화할 것으로 예측된다. 04-004-N011을 사용한 효율적인 풀-다운은 실제로 KRAS 야생형, G12V 및 G12C에 대해 관찰되었지만, G12D 및 G13D 돌연변이체에의 결합은 덜 효율적인 것으로 보였다. 그러나, G12V 돌연변이체 부위를 함유하는 APR 윈도우를 보유하는 생물학적 활성 펩트-인의 바이오티닐화된 버전(04-006-N007, 04-015-N026 및 04-033-N003)을 사용하였을 때, G12V 돌연변이체 KRAS 및 G12C 돌연변이체 KRAS(04-015-N026의 경우)에 대해서만 현저한 풀-다운이 관찰되었다(도 6).

종합하건대, 이 데이터는 이 예시적인 RAS 표적화 펩트-인이 펩트-인에 존재하는 APR 윈도우에 대한 정확한 일치를 함유하는 RAS 단백질과 직접 상호작용할 수 있고 이러한 RAS 단백질의 응집을 시딩할 수 있음을 보여준다.

실시예 4: RASless MEF 시스템에서 돌연변이체 선택적 세포 효능

동종 RASless 마우스 배아 섬유모세포(MEF) 패널을 사용하여 세포 효능에 대한 RAS 돌연변이체 선택성을 평가하였다. 이 MEF는 KRAS 유전자 또한 누락되어 있는(ER-Cre에 의한 제거) NRAS-null 및 HRAS-null 마우스로부터 유래한다. 증식은 내생성 KRAS 유전자의 발현, 또는 -이것이 타목시펜 치료를 통해 제거된 경우- 발현된 형질전이유전자에 의존한다. 평가된 패널은 형질전이유전자(WT, G12V 및 G12C)로서 발현된 통상의 임상 KRAS 변이체 및 증식을 위해 BRAF V600E의 발현에 의존하는 추가 세포주를 포함하였다. 이 추가 세포주는 어떠한 RAS 동형체도 발현하지 않고 이 세포의 증식이 RAS의 다운스트림인 돌연변이체 BRAF에 전적으로 의존하기 때문에 KRAS 표적화 작용제에 대한 불응성을 가져야 한다.

5일의 노출 후, 스페로이드로서 생장하는 MEF에 대한 RAS 표적화 펩트-인의 효능을 평가하였다. 04-004-N001의 표적화 모이어티는 야생형 RAS 서열로부터 유래한 APR 윈도우이기 때문에, 돌연변이 상태와 무관하게 모든 RAS 의존적 생장을 표적화할 것으로 예측된다. 그러나, 놀랍게도, BRAF V600E 발현 RASless MEF와 유사하게 반응하는 KRAS WT 및 G12C 발현 MEF에 비해 KRAS G12V를 발현하는 MEF의 경우 04-004-N001의 현저히 증가된 효능이 관찰되었다.

G12V 표적화 RAS 펩트-인의 경우 G12V 발현 RASless MEF를 평가할 때 가장 높은 효능이 관찰되었고, 이것은 돌연변이체 선택적 결합이 적어도 부분적으로 이 펩트-인에 의해 나타나는 돌연변이체 RAS에 대한 선택성을 유도하고 이 선택성에의 주요 기여자일 수 있음을 시사한다. 데이터는 도 10에 제시되어 있다.

실시예 5: RAS 표적화 펩트-인은 KRAS와 상호작용한다.

RAS 표적화 펩트-인이 세포에서 (돌연변이체) KRAS 단백질과 상호작용할 수 있는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 공-면역침전 어세이를 설정하였다.

먼저, 본 발명자들은 KRAS 야생형 및 돌연변이체 G12V 발현 RASless MEF를 사용하여, (i) RAS 표적화 펩트-인이 세포 환경에서 KRAS 단백질에 결합하는지, 및 (ii) 임의의 결합이 실시예 4에 기재된 시험관내 번역 어세이에서 관찰된 선택성과 유사한 G12V 돌연변이체 선택성을 보이는지를 평가하였다. 이를 위해, 관련 MEF 세포를 하룻밤(16시간) 동안 25 μM 바이오티닐화된 펩트-인으로 처리하였다. 다음으로, 세포를 용해시키고, 스트렙타비딘 코팅 비드를 사용하여 용해물로부터 펩트-인을 면역침전시켰다. 그 다음, SDS PAGE를 이용하여 침전된 분획을 분리하였고 웨스턴 블롯을 이용하여 KRAS 단백질의 존재에 대해 프로빙하였다. 결과는 04-004 유래의 바이오티닐화된 펩트-인이 각각의 RASless MEF 세포의 16시간 처리 후 야생형 및 돌연변이체 G12V KRAS 둘 다를 잘 침전시키는 것으로 보였음을 보여준다. 그러나, G12V 선택적 펩트-인의 바이오티닐화된 버전을 사용한 처리 및 침전은 G12V 돌연변이체 KRAS 단백질에의 우선적인 결합을 보여주었다(도 11).

그 다음, 본 발명자들은 RAS 표적화 펩트-인이 인간 종양 세포에 노출된 후 KRAS에의 결합을 보이는지를 평가하였다. 이를 위해, KRAS G12V 돌연변이체 NCI-H441 폐 선암종 세포를 25 μM 바이오티닐화된 펩트-인으로 하룻밤(16시간) 동안 처리하였다. 다음으로, 세포를 용해시키고, 스트렙타비딘 코팅 비드를 사용하여 용해물로부터 펩트-인을 면역침전시켰다. 그 다음, SDS PAGE를 이용하여 침전된 분획을 분리하였고 웨스턴 블롯을 이용하여 KRAS 단백질의 존재에 대해 프로빙하였다. 이 접근법은 비히클 또는 음성 대조군 펩타이드 처리 조건으로부터의 침전된 분획에서 검출 가능한 KRAS 단백질이 없다는 결과를 제공하였지만, KRAS 단백질은 생물학적 활성 펩트-인으로 처리된 NCI-H441 세포로부터의 침전된 분획에서 용이하게 검출되었다(도 7).

공-면역침전 접근법을 보완하기 위해, 본 발명자들은 또한 세포 영상화 접근법을 이용하여 표적 맞물림을 보여주었다. 이를 위해, 본 발명자들은 mCherry 태그가 부착된 KRAS G12V를 과다발현하는 HeLa 세포주 및 RAS 표적화 펩트-인의 FITC-표지된 버전을 생성하였다. 이 HeLa 세포의 처리는 모든 생물학적 활성 RAS 표적화 펩트-인의 FITC-표지된 버전이 세포에 의해 용이하게 흡수되는 반면, 음성 대조군 펩트-인 04-016-N001의 FITC-표지된 버전의 흡수가 검출될 수 없음을 보여줌으로써, 생물학적 활성의 결여를 설명한다. 더욱이, FITC-표지된 펩트-인으로 처리한 지 75분 후 FITC 및 mCherry 둘 다에 대해 양성을 띠는 봉입체 유사 핵주변 구조물의 발생에 의해 밝혀진 바와 같이, 이 분석은 펩트-인 04-015-N001의 RAS 표적화 FITC-표지된 버전(04-015-N032)이 세포 내로 들어간 후 신속하게 mCherry-표지된 KRAS와 회합함을 보여주었다(도 8).

실시예 6: RAS 표적화 펩트-인은 세포에서 그의 응집 및 분해를 유도한다.

RAS 표적화 펩트-인을 사용한 종양 세포의 처리가 세포 사멸을 유도하기 전에 단백질 응집을 유도하는지를 평가하기 위해, 단백질 응집과 함께 세포 사멸을 모니터링하도록 유세포분석 어세이를 고안하였다. 이를 위해, NCI-H441 세포를 IC₅₀에 가까운 용량의 RAS 표적화 펩트-인(12.5 μM) 또는 대조군 조건(비히클 및 음성 대조군 펩트-인)으로 6시간, 16시간 또는 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 회수하고 사이톡스™ 블루 염료를 사용하여 세포 사멸에 대해 염색하고 아미트랙커™ 레드 염료를 사용하여 (아밀로이드 유사) 단백질 응집체의 존재에 대해 염색하였다. 이 분석은 비히클 및 대조군 펩트-인 처리 세포의 경우 유의미한 세포 사멸 또는 단백질 응집이 실험 과정 동안 관찰되지 않았음을 보여주었다. 그러나, RAS 표적화 펩트-인으로 처리하였을 때, 단백질 응집은 쉽게 검출되었고 시간 경과에 따라 진행하는 것으로 보였다. 더욱이, 단백질 응집의 이 증가는 단백질 응집의 발생에 수반되는 것으로 보이는 세포 사멸의 느린 증가와 동시에 나타났다(도 12).

전술된 유세포분석 어세이는 관찰된 단백질 응집이 KRAS에 영향을 미치는지에 대한 상세한 정보를 제공하지 않기 때문에, 본 발명자들은 용해도 분획화 어세이에서 KRAS 응집을 평가하는 것을 착수하였다. 이를 위해, NCI-H441 세포를 IC₅₀에 가까운 용량(12.5 μM) 및 2XIC₅₀에 가까운 용량(25 μM)으로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 순한 비-변성 완충제를 사용하여 세포를 용해시키고 이 완충제에 용해되지 않는 단백질을 원심분리로 펠렛화하였다. 그 다음, 강한 무질서화제, 즉 6 M 우레아를 사용하여 불용성 단백질을 가용화하였다. 이 접근법을 이용할 때, 아밀로이드 (유사) 응집체는 결국 불용성 분획에 남을 것으로 예상된다. SDS PAGE를 이용하여 가용성 분획 및 불용성 분획 둘 다를 분리하고 후속 웨스턴 블롯에서 KRAS 및 GAPDH에 대해 프로빙하였다. 이 분석은 모든 생물학적 활성 RAS 표적화 펩타이드가 불용성 분획에서 KRAS의 퍼센트를 용량 의존적으로 증가시킨 반면, 불용성 KRAS의 퍼센트가 비히클 처리 샘플과 음성 대조군 펩타이드 처리 샘플 사이에 필적할만하였음을 보여줌으로써, 펩트-인 처리가 실제로 KRAS 표적 단백질의 응집을 야기함을 시사한다. 이 발견을 보완하기 위해, 본 발명자들은 이 샘플에서 총 KRAS 수준(즉, 각각의 처리에 대한 가용성 및 불용성 분획에서 KRAS 수준의 합계)도 정량하였다. 이 데이터의 분석은 생물학적 활성 RAS 표적화 펩트-인으로 처리된 샘플에서 총 KRAS 수준도 용량 의존적으로 감소됨을 보여주었다(도 9).

종합하건대, 펩트-인을 사용한 처리 시 불용성 KRAS 단백질의 증가에 의해 입증된 바와 같이, 이 데이터는 생물학적 활성 RAS 표적화 펩트-인이 세포에서 그의 의도된 표적 단백질 KRAS와 상호작용할 수 있고 이의 응집을 유도할 수 있음을 보여준다. 더욱이, 특정 기작으로의 임의의 제한을 내포하지는 않지만, 추정컨대, 활성 펩트-인으로 처리한 후 응집의 부차적 결과로서 총 KRAS 수준도 감소된다.

실시예 7: RAS 표적화 펩트-인은 KRAS G12V 돌연변이체 암의 이종이식편 모델에서 종양 성장을 감소시킨다.

RAS 표적화 펩트-인이 생체내에서 KRAS G12V 유래의 종양의 성장을 약화시킬 수 있는지를 평가하기 위해, 인간 KRAS G12V 대장암의 피하 이종이식편 모델(SW620)을 사용하였다. 일단 종양 크기가 100 내지 150 mm³에 도달하면, 두 가지 상이한 용량(20 ㎍ 및 200 ㎍)으로 2주 동안 주당 3회 종양내 주사로 펩트-인을 종양 덩어리에 직접 투여하였다. 치료가 시작된 후 22일째 날에 20 ㎍ 투여 군 및 200 ㎍ 투여 군 둘 다에 대한 평균 종양 부피의 유의미한 감소에 의해 입증된 바와 같이, G12V 선택적 RAS APR 윈도우 서열을 보유하는 펩트-인 세트(04-006-N001, 04-015-N001 및 04-033-N001) 중 04-015-N001은 종양 성장의 가장 강한 감소를 유도하였다. 또한, 야생형 RAS APR 윈도우 서열을 보유하는 04-004-N001의 경우에도 유사한 종양 성장 감소가 관찰되었으나, 이것은 200 ㎍ 투여 군의 경우에만 유의미하였다(도 13).

SEQUENCE LISTING <110> Aelin Therapeutics VIB VZW Katholieke Universiteit Leuven, K.U. Leuven R&D <120> Molecules targeting mutant RAS protein <130> AEL-006-PCT <150> EP 20158306.9 <151> 2020-02-19 <160> 184 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val 1 5 10 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Val Val Val Gly Ala Val 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu Val Val Val Gly Ala Val 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Val Val Val Gly Ala Val Gly 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly 1 5 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 14 Gly Ser Gly Ser 1 <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 15 Lys Val Val Val Gly Ala Val Lys Gly Ser Lys Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Lys <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 16 Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Lys Gly Ser Lys Leu Val Val Val 1 5 10 15 Gly Ala Val Lys 20 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 17 Lys Val Val Val Gly Ala Val Gly Lys Gly Ser Lys Val Val Val Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Lys 20 <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 18 Lys Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Gly Ser Lys Val Val 1 5 10 15 Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys 20 <210> 19 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys 165 170 175 Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met 180 185 <210> 20 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile 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Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu 165 170 175 Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser 180 185 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gly Ala Gly Gly Val 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly 1 5 10 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val 1 5 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val 1 5 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly 1 5 10 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Val Gly Ala Val Gly Val Gly 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Val Val Val Gly Ala Val Gly Val 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Val Val Gly Ala Val Gly Val 1 5 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Val Gly Ala Val Gly Val 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly 1 5 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Val Val Gly Ala Val Gly 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly 1 5 <210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Val Gly Ala Cys Gly Val Gly 1 5 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Val Val Gly Ala Cys Gly Val 1 5 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Val Gly Ala Cys Gly Val 1 5 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Val Val Val Gly Ala Cys Gly 1 5 <210> 50 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Gatekeeper region <400> 50 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Leu Val Val Val Gly Ala Cys 1 5 <210> 52 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Val Val Val Gly Ala Cys 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Val Gly Ala Ala Gly Val Gly 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Val Val Gly Ala Ala Gly Val 1 5 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Val Gly Ala Ala Gly Val 1 5 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Val Val Val Gly Ala Ala Gly 1 5 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Val Val Gly Ala Ala Gly 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Leu Val Val Val Gly Ala Ala 1 5 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Val Val Val Gly Ala Ala 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly 1 5 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly 1 5 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Val Gly Ala Ser Gly Val Gly 1 5 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val 1 5 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Val Val Gly Ala Ser Gly Val 1 5 <210> 69 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Val Gly Ala Ser Gly Val 1 5 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Val Val Val Gly Ala Ser Gly 1 5 <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Val Val Gly Ala Ser Gly 1 5 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Leu Val Val Val Gly Ala Ser 1 5 <210> 73 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Val Val Val Gly Ala Ser 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> FLAG tag <400> 74 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn 1 5 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Met Val Leu Val Gly 1 5 <210> 78 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Ala Phe Tyr Thr Leu Val 1 5 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala 1 5 10 <210> 80 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 80 Lys Leu Ser Val Phe Ala Ile Lys Gly Ser Lys Leu Ser Val Phe Ala 1 5 10 15 Ile Lys <210> 81 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Cys Val 1 5 10 <210> 82 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Val Val Gly 1 5 10 <210> 83 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 10 <210> 84 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Cys Val Gly 1 5 10 <210> 85 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Ser Val Gly 1 5 10 <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Ser Val 1 5 10 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Ala Gly Gly Val Gly 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser 1 5 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu 1 5 10 <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Leu Val Val Val Gly Ala Gly Val Val Gly 1 5 10 <210> 91 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Cys Val Gly 1 5 10 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Leu Val Val Val Gly Ala Gly Cys Val Gly 1 5 10 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Leu Val Val Val Gly Ala Gly Cys Val 1 5 <210> 94 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Ser Val Gly 1 5 10 <210> 95 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Ser Val 1 5 10 <210> 96 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Leu Val Val Val Gly Ala Gly Ser Val Gly 1 5 10 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Leu Val Val Val Gly Ala Gly Ser Val 1 5 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Leu Val Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Val Val Val Gly Ala Gly Val 1 5 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Leu Val Val Val Gly Ala Gly Val 1 5 <210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Val Val Val Gly Ala Gly Val Val 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Val Val Val Gly Ala Gly Val Val Gly 1 5 <210> 103 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Val Val Gly Ala Gly Val Val Gly 1 5 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Val Gly Ala Gly Val Val Gly 1 5 <210> 105 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Gly Ala Gly Val Val Gly 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Leu Val Val Val Gly Ala Gly Val Val 1 5 <210> 107 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Val Val Val Gly Ala Gly Val Val 1 5 <210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Val Val Gly Ala Gly Val Val 1 5 <210> 109 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Val Gly Ala Gly Val Val 1 5 <210> 110 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Val Val Gly Ala Gly Val 1 5 <210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Val Gly Ala Gly Cys Val Gly 1 5 <210> 112 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Gly Ala Gly Cys Val Gly 1 5 <210> 113 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Val Val Val Gly Ala Gly Cys Val 1 5 <210> 114 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Val Val Gly Ala Gly Cys Val 1 5 <210> 115 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Val Gly Ala Gly Cys Val 1 5 <210> 116 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Leu Val Val Val Gly Ala Gly Cys 1 5 <210> 117 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Val Val Val Gly Ala Gly Cys 1 5 <210> 118 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Val Val Gly Ala Gly Cys 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Val Val Val Gly Ala Gly Ser Val Gly 1 5 <210> 120 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Val Val Gly Ala Gly Ser Val Gly 1 5 <210> 121 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Val Gly Ala Gly Ser Val Gly 1 5 <210> 122 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Gly Ala Gly Ser Val Gly 1 5 <210> 123 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Val Val Val Gly Ala Gly Ser Val 1 5 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Val Val Gly Ala Gly Ser Val 1 5 <210> 125 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Val Gly Ala Gly Ser Val 1 5 <210> 126 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Val Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 <210> 127 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 <210> 128 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 128 Lys Val Val Val Gly Ala Gly Val Lys Gly Ser Lys Val Val Val Gly 1 5 10 15 Ala Gly Val Lys 20 <210> 129 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 129 Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Val Lys Gly Ser Lys Leu Val Val 1 5 10 15 Val Gly Ala Gly Val Lys 20 <210> 130 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 130 Lys Val Val Val Gly Ala Gly Val Val Lys Gly Ser Lys Val Val Val 1 5 10 15 Gly Ala Gly Val Val Lys 20 <210> 131 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 131 Lys Val Val Val Gly Ala Gly Val Val Gly Lys Gly Ser Lys Val Val 1 5 10 15 Val Gly Ala Gly Val Val Gly Lys 20 <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala 1 5 10 <210> 133 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Gatekeeper region <400> 133 Arg Arg Arg Arg 1 <210> 134 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Gatekeeper region <400> 134 Asp Asp Asp Asp 1 <210> 135 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Gatekeeper region <400> 135 Glu Glu Glu Glu 1 <210> 136 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Gatekeeper region <400> 136 Lys Arg Lys Arg 1 <210> 137 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Gatekeeper region <400> 137 Lys Arg Arg Lys 1 <210> 138 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Gatekeeper region <400> 138 Arg Lys Lys Arg 1 <210> 139 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Gatekeeper region <400> 139 Asp Glu Asp Glu 1 <210> 140 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Gatekeeper region <400> 140 Asp Glu Glu Asp 1 <210> 141 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Gatekeeper region <400> 141 Glu Asp Asp Glu 1 <210> 142 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 142 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 143 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 143 Ser Ser Ser Ser 1 <210> 144 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 144 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 145 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 145 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 146 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 146 Gly Ser Gly Gly 1 <210> 147 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 147 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 148 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 148 Gly Gly Ser Ser 1 <210> 149 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 149 Gly Ser Ser Gly 1 <210> 150 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 150 Ser Ser Gly Gly 1 <210> 151 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 151 Ser Gly Ser Gly 1 <210> 152 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 152 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 153 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 153 Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 154 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 154 Pro Pro Pro Pro 1 <210> 155 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Leu Ser Val Phe Ala Ile 1 5 <210> 156 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> D-lysine <400> 156 Xaa Leu Ser Val Phe Ala Ile Lys Gly Ser Lys Leu Ser Val Phe Ala 1 5 10 15 Ile Xaa <210> 157 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> D-lysine <400> 157 Xaa Val Val Val Gly Ala Val Lys Gly Ser Lys Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Xaa <210> 158 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> D-lysine <400> 158 Xaa Val Val Val Gly Ala Val Gly Lys Gly Ser Lys Val Val Val Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Xaa 20 <210> 159 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> D-lysine <400> 159 Xaa Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Gly Ser Lys Val Val 1 5 10 15 Val Gly Ala Val Gly Val Gly Xaa 20 <210> 160 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Dpm <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Dpm <400> 160 Xaa Leu Ser Val Phe Ala Ile Lys Gly Ser Lys Leu Ser Val Phe Ala 1 5 10 15 Ile Xaa <210> 161 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Dpm <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Dpm <400> 161 Xaa Val Val Val Gly Ala Val Lys Gly Ser Lys Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Xaa <210> 162 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Dpm <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Dpm <400> 162 Xaa Val Val Val Gly Ala Val Gly Lys Gly Ser Lys Val Val Val Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Xaa 20 <210> 163 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Dpm <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Dpm <400> 163 Xaa Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Gly Ser Lys Val Val 1 5 10 15 Val Gly Ala Val Gly Val Gly Xaa 20 <210> 164 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> citrulline <400> 164 Xaa Val Val Val Gly Ala Val Lys Gly Ser Lys Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Lys <210> 165 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> citrulline <400> 165 Lys Val Val Val Gly Ala Val Xaa Gly Ser Lys Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Lys <210> 166 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 166 Ala Val Val Val Gly Ala Val Lys Gly Ser Lys Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Lys <210> 167 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 167 Lys Val Val Val Gly Ala Val Ala Gly Ser Lys Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Lys <210> 168 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 168 Lys Val Val Val Gly Ala Val Lys Gly Ser Ala Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Lys <210> 169 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 169 Lys Val Val Val Gly Ala Val Lys Gly Ser Lys Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Ala <210> 170 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 170 Ala Val Val Val Gly Ala Val Lys Gly Ser Ala Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Lys <210> 171 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 171 Lys Val Val Val Gly Ala Val Ala Gly Ser Lys Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Ala <210> 172 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 172 Ala Val Val Val Gly Ala Val Ala Gly Ser Lys Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Lys <210> 173 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 173 Lys Val Val Val Gly Ala Val Lys Ala Ser Lys Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Lys <210> 174 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 174 Lys Val Val Val Gly Ala Val Lys Gly Ala Lys Val Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Val Lys <210> 175 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 175 Lys Val Val Val Gly Ala Val Gly Lys Gly Phe Lys Val Val Val Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Lys 20 <210> 176 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 176 Lys Val Val Val Gly Ala Val Gly Lys Phe Phe Lys Val Val Val Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Lys 20 <210> 177 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 177 Lys Leu Ser Val Phe Ala Ile Lys Lys Leu Ser Val Phe Ala Ile Lys 1 5 10 15 <210> 178 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <400> 178 Lys Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Lys Val Val Val Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Val Gly Lys 20 <210> 179 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> D-leucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> D-serine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> D-phenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> D-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> D-isoleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> D-serine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> D-leucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> D-serine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> D-phenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> D-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> D-isoleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> D-lysine <400> 179 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 180 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> D-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> D-serine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> D-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> D-lysine <400> 180 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 181 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RAS pept-in <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> D-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> D-serine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> D-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> D-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> D-valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> D-lysine <400> 181 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Gly Xaa 20 <210> 182 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> peptide <400> 182 Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val 1 5 10 <210> 183 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> peptide <400> 183 Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr 1 5 10 15 Ile <210> 184 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> peptide <400> 184 Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser 1 5 10

Claims

위치 12 또는 13에서 돌연변이된 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 형성하고 야생형 인간 RAS 단백질과 분자간 베타-시트를 실질적으로 형성하지 않도록 구성된 비천연 생성 분자.
제1항에 있어서, 돌연변이체 인간 RAS 단백질이 G12V, G12C, G12A 또는 G12S 돌연변이체 인간 RAS 단백질, 바람직하게는 G12V 돌연변이체 인간 RAS 단백질이거나, G13V, G13C 또는 G13S 돌연변이체 인간 RAS 단백질, 바람직하게는 G13V 돌연변이체 인간 RAS 단백질인 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, RAS 단백질이 KRAS, NRAS 또는 HRAS 단백질, 바람직하게는 KRAS 단백질인 분자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분자간 베타-시트가 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 위치 12 또는 13의 아미노산을 포함하는 것인 분자.
제4항에 있어서, 분자간 베타-시트가
a) G12V 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAVGVG(서열번호 2)의 일부 또는 전부; 또는
b) G12C 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGACGVG(서열번호 6) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGACGV(서열번호 3)의 일부 또는 전부; 또는
c) G12A 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAAGVG(서열번호 7) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAAGV(서열번호 4)의 일부 또는 전부; 또는
d) G12S 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGASGVG(서열번호 8) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGASGV(서열번호 9) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGASG(서열번호 5)의 일부 또는 전부; 또는
e) G13V 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAGVVG(서열번호 82)의 일부 또는 전부; 또는
f) G13C 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAGCVG(서열번호 84) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGCV(서열번호 81)의 일부 또는 전부; 또는
g) G13S 돌연변이체 인간 RAS 단백질의 아미노산 서열 TEYKLVVVGAGSVG(서열번호 85) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGSV(서열번호 86) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGAGS(서열번호 83)의 일부 또는 전부
를 포함하는 것인 분자.
제1항 내제 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 12 또는 13에서 돌연변이된 인간 RAS 단백질의 용해도를 감소시킬 수 있거나 이 단백질의 응집 또는 봉입체 형성을 유도할 수 있는 분자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 분자간 베타-시트에 참여하는 아미노산 스트레치를 포함하는 분자.
제7항에 있어서, 아미노산 스트레치가 각각의 서열 a) 내지 d)의 위치 11의 아미노산, 또는 각각의 서열 e) 내지 g)의 위치 12의 아미노산을 포함하는, 하기 아미노산 서열의 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 것인 분자:
a) TEYKLVVVGAVGVG(서열번호 2); 또는
b) TEYKLVVVGACGVG(서열번호 6) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGACGV(서열번호 3); 또는
c) TEYKLVVVGAAGVG(서열번호 7) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAAGV(서열번호 4); 또는
d) TEYKLVVVGASGVG(서열번호 8) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGASGV(서열번호 9) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGASG(서열번호 5); 또는
e) TEYKLVVVGAGVVG(서열번호 82); 또는
f) TEYKLVVVGAGCVG(서열번호 84) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGCV(서열번호 81); 또는
g) TEYKLVVVGAGSVG(서열번호 85) 또는 바람직하게는 TEYKLVVVGAGSV(서열번호 86) 또는 보다 바람직하게는 TEYKLVVVGAGS(서열번호 83).
제7항 또는 제8항에 있어서, 아미노산 스트레치 VVVGAV(서열번호 10), LVVVGAV(서열번호 11), VVVGAVG(서열번호 12), VVVGAVGVG(서열번호 13), VVVGAGV(서열번호 99), LVVVGAGV(서열번호 100), VVVGAGVV(서열번호 101) 또는 VVVGAGVVG(서열번호 102)를 포함하는 분자.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 스트레치가 하나 이상의 D-아미노산 및/또는 하나 이상의 그의 아미노산의 유사체를 포함하는 것인 분자.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 동일하거나 상이한 2개 이상, 바람직하게는 2개의 상기 아미노산 스트레치를 포함하는 분자.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 스트레치 또는 스트레치들이 독립적으로 각각의 말단에서 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 나타내는 하나 이상의 아미노산에 의해 각각 독립적으로 플랭킹된 것인 분자.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구조를 포함하거나, 본질적으로 하기 구조로 구성되거나, 하기 구조로 구성된 분자:

상기 구조에서,
P1 내지 P4는 각각 독립적으로 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 아미노산 스트레치를 표시하고;
NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4는 각각 독립적으로 낮은 베타-시트 형성력 또는 베타-시트를 파괴하는 성향을 나타내는 1개 내지 4개의 연속 아미노산, 예컨대, R, K, D, E, P, N, S, H, G, Q 및 A, 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 연속 아미노산, 바람직하게는 R, K, D, E, P, N, S, H, G 및 Q, 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 연속 아미노산, 보다 바람직하게는 R, K, D, E 및 P, 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 연속 아미노산을 표시하고;
Z1 내지 Z3은 각각 독립적으로 직접 결합 또는 바람직하게는 링커를 표시한다.
제13항에 있어서, NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4가 각각 독립적으로 R, K, A 및 D, 및 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 연속 아미노산이고, 바람직하게는 NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4가 각각 독립적으로 R, K 및 D, 및 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 연속 아미노산이고, 예컨대, NGK1 내지 NGK4 및 CGK1 내지 CGK4가 각각 독립적으로 K, R, D, A 또는 KK, 바람직하게는 각각 독립적으로 K, R, D 또는 KK이고/이거나;
각각의 링커가 1개 내지 10개의 유닛, 바람직하게는 1개 내지 5개의 유닛의 스트레치로부터 독립적으로 선택되고, 이때 유닛이 각각 독립적으로 아미노산 또는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이고, 예컨대, 각각의 링커가 독립적으로 GS, PP 또는 GSGS(서열번호 14), 바람직하게는 GS, 또는 이들의 D-이성질체 및/또는 유사체인 분자.
제13항 또는 제14항에 있어서, 하기 아미노산 서열의 펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이러한 펩타이드로 구성되거나, 이러한 펩타이드로 구성된 분자:
a) KVVVGAVKGSKVVVGAVK(서열번호 15); 또는
b) KLVVVGAVKGSKLVVVGAVK(서열번호 16); 또는
c) KVVVGAVGKGSKVVVGAVGK(서열번호 17); 또는
d) KVVVGAVGVGKGSKVVVGAVGVGK(서열번호 18); 또는
e) KVVVGAGVKGSKVVVGAGVK(서열번호 128); 또는
f) KLVVVGAGVKGSKLVVVGAGVK(서열번호 129); 또는
g) KVVVGAGVVKGSKVVVGAGVVK(서열번호 130); 또는
h) KVVVGAGVVGKGSKVVVGAGVVGK(서열번호 131);
임의로 이때 아미노산 서열은 하나 이상의 D-아미노산 및/또는 하나 이상의 그의 아미노산의 유사체를 포함하고, 임의로 이때 N-말단 아미노산은 아세틸화되고/되거나, C-말단 아미노산은 아미드화된다.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 표지, 분자의 단리를 허용하는 모이어티, 분자의 안정성 또는 반감기를 증가시키는 모이어티, 분자의 용해도를 증가시키는 모이어티, 분자의 세포 흡수를 증가시키는 모이어티, 및/또는 분자를 세포에 표적화하는 것을 달성하는 모이어티를 포함하는 분자.
의학에 사용하기 위한, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 분자; 또는 분자가 폴리펩타이드인 경우, 의학에 사용하기 위한, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 분자를 코딩하는 핵산.
인간 RAS 단백질의 위치 12 또는 13의 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 분자; 또는 분자가 폴리펩타이드인 경우, 인간 RAS 단백질의 위치 12 또는 13의 돌연변이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 분자를 코딩하는 핵산.
제18항에 있어서, 질환이 신생물성 질환, 특히 암인 분자 또는 핵산.
제18항 또는 제19항에 있어서, 질환이 췌관 선암종, 대장 선암종, 다발성 골수종, 폐 선암종, 피부 흑색종(skin cutaneous melanoma), 자궁체 내막양 암종, 자궁 암육종, 갑상선 암종, 급성 골수성 백혈병, 방광 요로상피 암종, 위 선암종, 자궁경부 선암종, 두경부 편평 세포 암종, 비-소세포 폐암(NSCLC) 또는 대장암인 분자 또는 핵산.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 분자; 또는
분자가 폴리펩타이드인 경우, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 분자를 코딩하는 핵산
을 포함하는 약학 조성물.