JP2022513081A - 植物組織由来ナノファイバー - Google Patents

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Abstract

均質化した植物組織に由来する自己組織化した細胞成分を含むナノファイバーが、本明細書に提供される。そのようなナノファイバーを調製するための方法、並びに対象の疾患又は障害の治療又は予防におけるその使用及び／又は送達ビヒクルとしての使用も記載される。

Description

本発明は、一般にナノファイバー及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、植物組織由来ナノファイバー及びその使用に関する。
果実は、単純な分子、例えば、エネルギーを提供する糖から複雑な高分子、例えば、セルロース及びペクチン（これは食物繊維、ビタミン、ミネラル、及び栄養補助食品として貢献し、様々な疾患予防及び健康調節機能を有する）に及ぶ食物成分の豊富な供給源である（Paliyath, G., Bakovic, M. and Shetty, K. (2011). Functional foods, nutraceuticals and degenerative disease prevention, Wiley-Blackwell, Oxford, UK, 392 pages）。ポリフェノール（特にフラボノイド及び誘導体）に関しては最近関心が増しており、その理由は、それらの多数の生物学的効果にあり、例えば、フリーラジカルスカベンジング、酵素活性のモジュレーション、細胞増殖の阻害、並びにそれらに抗生物質、抗アレルギー及び抗炎症剤として潜在的な有用性があるからである（Clifford, M. and Brown, J.E. (2006) Dietary flavonoids and health- Broadening the perspective In Flavonoids Chemistry biochemistry and applications, Andersen OM, Markham KR (Eds.); Taylor and Francis, New York, NY: 320-370）。ポリフェノールは、心血管疾患、がん及び他の変性疾患（degenerative diseases）の予防に潜在的な役割を担うことが示されている（Scalbert, A., Manach, C., Morand, C., Remesy, C. and Jimenez, L. (2005). Dietary polyphenols and the prevention of diseases. Crit Rev Food Sci Nutr 45(4): 287-306、Paliyath, G., Bakovic, M. and Shetty, K. (2011). Functional foods, nutraceuticals and degenerative disease prevention, Wiley-Blackwell, Oxford, UK, 392 pages）。ポリフェノールが植物起源の食物及び飲料（ジュース、茶、コーヒー、及びワインを含む）に広く行き渡っているために、ポリフェノールは、ヒトの食物の共通の微量栄養素と考えられ得る。ポリフェノールリッチ食の消費は、慢性疾患の発生を予防する並びに慢性疾患による死亡率の減少させる手段として、促進されている。
インビボでのポリフェノールの生物活性は、その吸収及び代謝並びに摂取後の身体内のそれらの分布に依存的である（Clifford, M. and Brown, J.E. (2006) Dietary flavonoids and health- Broadening the perspective In Flavonoids Chemistry biochemistry and applications, Andersen OM, Markham KR (Eds.); Taylor and Francis, New York, NY: 320-370）。胃腸管（ＧＩＴ）の場合では、上皮細胞が、これらの成分又はそれらの代謝産物と接触する。食物中のポリフェノールのレベルは、１００～５０００ｍｇ／ｋｇの範囲にあり得るが（Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C. and Jimenez, L. (2004). Polyphenols: food sources and bioavailability. Amer. J. Clin. Nutr., 79:727-747）、腸内の食物ポリフェノールの吸収の程度は相対的に小さい（Spencer, J.P.E. and Rice-Evans, C.A. (2003) Metabolism in the small intestine and gastrointestinal tract. In Flavonoids in Health and disease, Rice-Evans C, Packer L (Eds.); Marcel Dekker, Inc. New York: 363-389）。遊離フェノール成分の血漿及び組織レベルは、一般に低マイクロモル範囲にある。同様に、消費される全てのフェノール成分が、食物マトリックス相互作用のため生物学的に利用可能であるわけではないことが提唱されている（Saura-Calixto, F. and Diaz-Rubio, M.E. (2007a). Polyphenols associated with dietary fibre in wine- A wine polyphenols gap? Food Res Int.; 40: 613-619、Saura-Calixto, F., Serrano, J. and Goni, I. (2007b). Intake and bioaccessibility of total polyphenols in a whole diet. Food Chemistry, 101: 492-501、Del Rio, D., Borges, G. and Crozier, A. (2010) Berry Flavonoids and phenolics: bioavailability and evidence of protective effects. Brit. J. Nutr., 104: S 67-S90）。食物に由来する構造の性質及び役割を理解すること重要であり、その理由は、それらの研究が、ヒトの健康において食物由来ナノマテリアルの影響の理解に影響を与えるからである。
改変ナノマテリアルの使用は世界中で増しているので、ヒトの健康におけるナノマテリアルの影響が検査されることが多くなってきている（Maynard, A. D. (2006) Nanotechnology: Assessing the risks. Nanotoday, 1, 22-33）。改変ナノマテリアルは、空気伝播性のナノ構造の凝集体（例えば、銀ナノ粒子、ＴｉＯ２）又はＳＷＮＴ（単一壁の炭素ナノチューブ）として環境中にエスケープする可能性があり、吸入、摂取及び皮膚を通した浸透を通して身体の内側に入り込み、引き続いて他の器官に移動する。チタン及び亜鉛のナノ粒子は、美容産業において使用されることが多くなってきている。生体成分に由来する改変ナノマテリアルはまた、薬物送達、美容品、食物成分、コーティング、食物パッケージングなどにおいても探求されている（Azeredo, H.M.C., Mattoso, L.H.C., Wood, D., Williams, T.G., Avena-Bustillos, R.J. and McHugh, T.H. (2009) Nanocomposite edible films from mango puree reinforced with cellulose nanofibers. J. Food. Sci., 74, Nr 5, N31-N35、Ramasamy, T., Kandasamy, U, Hinabindhu, R. and Kona, K. (2009) Nanocochleate - A New Drug Delivery System. FABAD J. Pharm. Sci., 34, 91-101；Zhao, N., Bagaria, H.G., Wong, M.S. and Zu, Y. (2011) A nanoparticle that is both tumor cell-selective and cancer gene-specific for anaplastic large cell lymphoma. J. Nanobiotechnol., 9, 1-12、Sessa, M., Tsao, R., Liu, R., Ferrari, G. and Donsi, F. (2011). Evaluation of the stability and antioxidant activity of nanoencapsulated resveratrol during in vitro digestion. J. Agr. Food Chem., 59, 12352-12360、Zhang, H.Y., Arab Tehrany, E., Kahn, C.J.F., Ponc, ot, M. and Cleymand, L.F. (2012) Effects of nanoliposomes based on soya, rapeseed and fish lecithins on chitosan thin films designed for tissue engineering. Carbohydrate Polymers., 88, 618-627）。ナノマテリアルは、食物連鎖を通して（特に土壌、水及び空気からそのような材料に蓄積されている植物由来食の消費を通して）身体に入る可能性もある（Rico, C.M., Majumdar, S., Duarte-Gardea, M., Peralta-Videa, J.R. and Gardea -Torresdey, J.L. (2011) Interaction of Nanoparticles with Edible Plants and Their Possible Implications in the Food Chain. J. Agr. Food. Chem., 59, 3485-3498）。ナノ構造に自己組織化する潜在力を有する食物中の高分子の存在が、特に重大であろう（IOM (Institute of Medicine) (2009) Nanotechnology in food products: Workshop Summary. Washington, DC: The National Academies Press）。アモルファス炭素ナノ粒子が潜在的に形成され、例えば、カラメル化した食物に存在することが観察されている（Palashuddin, Md. S.K., Jaiswal, A., Paul, A., Ghosh, S.S. and Chattopadhyay, A. (2012) Presence of amorphous carbon nanoparticles in food caramels. Nature Scientific Reports, 2, Article number: 383. doi:10.1038/srep00383）。
代替の、追加の、及び／又は改善されたナノマテリアル及び／又はそれを作製する方法が望まれる。
Paliyath, G., Bakovic, M. and Shetty, K. (2011). Functional foods, nutraceuticals and degenerative disease prevention, Wiley-Blackwell, Oxford, UK, 392 pages Clifford, M. and Brown, J.E. (2006) Dietary flavonoids and health- Broadening the perspective In Flavonoids Chemistry biochemistry and applications, Andersen OM, Markham KR (Eds.); Taylor and Francis, New York, NY: 320-370 Scalbert, A., Manach, C., Morand, C., Remesy, C. and Jimenez, L. (2005). Dietary polyphenols and the prevention of diseases. Crit Rev Food Sci Nutr 45(4): 287-306 Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C. and Jimenez, L. (2004). Polyphenols: food sources and bioavailability. Amer. J. Clin. Nutr., 79:727-747 Spencer, J.P.E. and Rice-Evans, C.A. (2003) Metabolism in the small intestine and gastrointestinal tract. In Flavonoids in Health and disease, Rice-Evans C, Packer L (Eds.); Marcel Dekker, Inc. New York: 363-389 Saura-Calixto, F. and Diaz-Rubio, M.E. (2007a). Polyphenols associated with dietary fibre in wine- A wine polyphenols gap? Food Res Int.; 40: 613-619 Saura-Calixto, F., Serrano, J. and Goni, I. (2007b). Intake and bioaccessibility of total polyphenols in a whole diet. Food Chemistry, 101: 492-501 Del Rio, D., Borges, G. and Crozier, A. (2010) Berry Flavonoids and phenolics: bioavailability and evidence of protective effects. Brit. J. Nutr., 104: S 67-S90 Maynard, A. D. (2006) Nanotechnology: Assessing the risks. Nanotoday, 1, 22-33 Azeredo, H.M.C., Mattoso, L.H.C., Wood, D., Williams, T.G., Avena-Bustillos, R.J. and McHugh, T.H. (2009) Nanocomposite edible films from mango puree reinforced with cellulose nanofibers. J. Food. Sci., 74, Nr 5, N31-N35 Ramasamy, T., Kandasamy, U, Hinabindhu, R. and Kona, K. (2009) Nanocochleate - A New Drug Delivery System. FABAD J. Pharm. Sci., 34, 91-101 Zhao, N., Bagaria, H.G., Wong, M.S. and Zu, Y. (2011) A nanoparticle that is both tumor cell-selective and cancer gene-specific for anaplastic large cell lymphoma. J. Nanobiotechnol., 9, 1-12 Sessa, M., Tsao, R., Liu, R., Ferrari, G. and Donsi, F. (2011). Evaluation of the stability and antioxidant activity of nanoencapsulated resveratrol during in vitro digestion. J. Agr. Food Chem., 59, 12352-12360 Zhang, H.Y., Arab Tehrany, E., Kahn, C.J.F., Ponc, ot, M. and Cleymand, L.F. (2012) Effects of nanoliposomes based on soya, rapeseed and fish lecithins on chitosan thin films designed for tissue engineering. Carbohydrate Polymers., 88, 618-627 Rico, C.M., Majumdar, S., Duarte-Gardea, M., Peralta-Videa, J.R. and Gardea -Torresdey, J.L. (2011) Interaction of Nanoparticles with Edible Plants and Their Possible Implications in the Food Chain. J. Agr. Food. Chem., 59, 3485-3498 IOM (Institute of Medicine) (2009) Nanotechnology in food products: Workshop Summary. Washington, DC: The National Academies Press Palashuddin, Md. S.K., Jaiswal, A., Paul, A., Ghosh, S.S. and Chattopadhyay, A. (2012) Presence of amorphous carbon nanoparticles in food caramels. Nature Scientific Reports, 2, Article number: 383. doi:10.1038/srep00383
特定の疾患又は障害の治療及び／又は予防において、及び／又は生物活性薬剤の、それを必要とする対象への送達において、食物サプリメントとして使用するための、天然の供給源（すなわち、植物組織）から誘導可能なナノファイバーを提供することが、本開示の目的である。その作製のための方法も提供される。
一実施形態では、均質化した植物組織に由来する自己組織化した細胞成分を含むナノファイバーであって、細胞成分が１又は２以上の構造炭水化物又はその切断産物を含み、脂質及びポリフェノールがナノファイバーの構造成分ではない、ナノファイバーが本明細書に提供される。
上記ナノファイバーの別の実施形態では、ナノファイバーが、実質的に脂質を含まない（lipid-free）か、実質的にポリフェノールを含まない（polyphenol-free）か、又はその両方であってもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが：
少なくとも１つの構造炭水化物を含む、或いは少なくとも１つの構造炭水化物から構成されている１又は２以上の鎖(strands)を含む伸長した繊維を含んでもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、ペクチン、ヘミセルロース、ペプチド及び／又はタンパク質、有機酸、その切断産物、又はその任意の組合せを含んでもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、有機酸が、リンゴ酸、アスコルビン酸、又はその両方を含んでもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、細胞成分が、ナノファイバーに自己組織化することができる、熟成の間又は熟成した果実の均質化の間の植物組織から遊離される細胞成分を含んでもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、１又は２以上の構造炭水化物が、ペクチン、ペクチン酸、ペクチンのメチルエステル、ペクチン誘導体、ポリガラクツロン酸、ラムノガラクツロナン、キシログルカン、ヘミセルロース；グルコース、マンノース、又はキシロースのβ－（１→４）－連結骨格を保持するキシログルカン；及び／又はアラビノガラクタン、及び／又はその切断産物のうちの１又は２以上を含んでもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかの別の実施形態では、ナノファイバーが、直径約５～１０ｎｍの繊維形状を有してもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、水素結合相互作用によって安定化され、植物組織の細胞成分の異化作用に由来する高分子の間で形成され、ヒドロキシル基及び／又はアミノ基及び／又は有機酸基を保持してもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、非結晶性であってもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、生物学的に活性な薬剤をさらに含んでもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、薬学的な活性薬、タンパク質、酵素、栄養補助食品、又は栄養分であってもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、水溶液中にあってもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、粉末形態であってもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、脱水、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライ形態であってもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、植物組織が果実又は野菜植物組織を含んでもよい及び／又はポリフェノールが均質化前に植物組織から除去されていてもよい。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、植物組織が、老化果実、熟成野菜、又はその任意の組合せを含んでもよい；好ましくは、植物組織が、サクランボ、ブルーベリー、ブドウ、モモ、ネクタリン、プラム、アンズ、パパイア、トマト、又はその任意の組合せを含む。
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、植物組織が、スミノミザクラ果実組織を含んでもよい。
さらに別の実施形態では、均質化した植物組織からナノファイバーを調製するための方法が本明細書に提供され、前記方法が：
植物組織から遊離される細胞成分を含む、低ポリフェノール含有量の溶液中で均質化した植物組織を調製すること；
存在する場合、細片を均質化した植物組織から除去すること；及び
任意で、均質化した植物組織を透析して、複合体を形成していない化合物を除去すること、又はサイズ排除によって複合体を形成していない化合物を除去すること、
を含み、それによって、細胞成分の自己組織化によって形成される、ナノファイバーを含む溶液を提供する。
上記方法の別の実施形態では、方法は、ナノファイバーを含む溶液を脱水、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライするステップをさらに含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、実質的に水性の媒体中での自己組織化によって形成されてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を水性、有機性、又は混合された水性－有機性媒体中で均質化することを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を、水、エタノール、メタノール、又はアセトンのいずれか１又は２以上を含む、水性、有機性、又は混合された水性－有機性媒体中での高剪断均質化及び／又はソノレーションに供することを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織の均質化前に、植物組織を脱色して、そこからポリフェノールを除去するステップを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、脱色することは、抽出溶媒での植物組織からのポリフェノールの抽出を行うことを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、抽出溶媒が、エタノールを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、細片を除去するステップが、透析、均質化した植物組織を濾過すること、均質化した植物組織を遠心分離すること、又は均質化した植物組織にタンジェンシャルフロー濾過又は連続フロー濾過を行うこと、又はその任意の組合せを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、方法は、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかを調製するためであってもよい。
別の実施形態では、均質化した植物組織からナノファイバーを調製するための方法が本明細書に提供され、前記方法が：
植物組織から遊離される細胞成分を含む、低ポリフェノール含有量の溶液中で均質化した植物組織を調製すること；
存在する場合、細片を均質化した植物組織から除去すること；
細胞成分の自己組織化によるナノファイバーの形成を可能にすること；及び
フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライして、ナノファイバーを含む粉末を形成することを含む。
上記方法の別の実施形態では、自己組織化が、実質的に水性の媒体において生じ得る。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を水性、有機性、又は混合された水性－有機性媒体中で均質化することを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を、水、エタノール、メタノール、又はアセトンのいずれか１又は２以上を含む、水性、有機性、又は混合された水性－有機性媒体中の高剪断均質化及び／又はソノレーションに供することを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織の均質化前に、植物組織を脱色して、そこからポリフェノールを除去するステップを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、脱色することは、抽出溶媒での植物組織からのポリフェノールの抽出を行うことを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、抽出溶媒が、エタノールを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、細片を除去するステップが、透析、均質化した植物組織を濾過すること、均質化した植物組織を遠心分離すること、又は均質化した植物組織にタンジェンシャルフロー濾過又は連続フロー濾過を行うこと、又はその任意の組合せを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、植物組織が、抽出溶媒で抽出されて、そこからポリフェノールが除去された植物組織を含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、抽出溶媒が、エタノールを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、方法は、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかを調製するためであってもよい。
別の実施形態では、上記方法又は複数の方法のいずれかによって調製されるナノファイバーが本明細書に提供される。
別の実施形態では、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかから調製される食物粉末であって、任意で食物粉末がマイクロスケールの微細粉末形態として提供される、食物粉末が本明細書に提供される。
別の実施形態では、それを必要とする対象又は細胞に生物学的に活性な薬剤を、送達する方法が本明細書に提供され、前記方法が：
生物学的に活性な薬剤と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかを、対象に投与することを含む。
上記方法の別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、セレン、亜鉛、鉄、及びマグネシウム等の元素であってもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が抗がん薬であってもよく、対象ががんを有する対象であってもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、抗がん薬がパクリタキセル、ビンクリスチン、又はがんの治療に使用される任意の天然又は合成の化合物であってもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、ナノファイバーの形成の間にナノファイバーに導入されているか、或いは、生物学的に活性な薬剤が任意でアルコール又は他の有機成分を含む水性ベースの媒体中の既に形成されたナノファイバーと複合体を形成していても又はコンジュゲートされていてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、水性ベースの媒体が、ＤＭＳＯ、若しくは緩衝液、又はその両方を含んでもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療する又は予防するための方法が本明細書に提供され、前記方法が：
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかを対象に投与することを含む。
上記方法の別の実施形態では、ナノファイバーが、抗がん薬と同時に又は順次に共投与されてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、抗がん薬と複合体を形成していても又はコンジュゲートされていてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
さらに別の実施形態では、対象に可溶性食物繊維を提供するための方法が本明細書に提供され、前記方法が：
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかを対象に投与することを含む。
さらに別の実施形態では、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかを含む、粘性を増強させる食品添加物が本明細書に提供される。
別の実施形態では、それを必要とする対象において食後の血糖値を低減させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が：
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかを対象に投与することを含む。
さらに別の実施形態では、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかを含む化粧品が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象に対する局所投与のための組成物であって、組成物が上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれか及び任意で生物学的に活性な薬剤を含む、組成物が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において日焼けを予防するための方法が本明細書に提供され、前記方法が：
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかを対象の皮膚に塗布することを含む。
上記方法のさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、アントシアニン又は別のＵＶ保護剤を含んでもよい、又はアントシアニン又は別のＵＶ保護剤と共に適用されてもよい。
さらに別の実施形態では、細胞増殖を減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が：
細胞又は組織又は器官を、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかで処置することを含む。
上記方法のさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、抗がん薬と同時に又は順次に使用されてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、抗がん薬と複合体を形成しても又はコンジュゲートされてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において肝臓におけるトリグリセリド蓄積を減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が：
上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかを対象に投与することを含む。
さらに別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤を、それを必要とする対象又は細胞に送達するための上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかの使用が本明細書に提供される。
上記使用の別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、セレン、亜鉛、マグネシウム又は鉄等の元素であってもよい。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が抗がん薬であってもよく、対象ががんを有する対象であってもよい。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤がナノファイバーの形成の間にナノファイバーに、導入されてもよく、又は生物学的に活性な薬剤が水性ベースの媒体中の既に形成されたナノファイバーと複合体を形成していても又はコンジュゲートされていてもよい。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、水性ベースの媒体が、ＤＭＳＯ、若しくは緩衝液、又はその両方を含んでもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療する又は予防するための上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかの使用が本明細書に提供される。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、抗がん薬と同時に又は順次に共投与されてもよい。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、抗がん薬と複合体を形成していても又はコンジュゲートされていてもよい。
上記使用又は複数の使用のいずれかの別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
別の実施形態では、可溶性食物繊維を対象に提供するための上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかの使用が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、粘性を増強させる食品添加物又は繊維代用物としての、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかの使用が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において食後の血糖値を低減させるための上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の実施形態では、化粧品における、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかの使用が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象に局所投与するための上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかの使用であって、ナノファイバーが生物学的に活性な薬剤と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい、使用が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、局所投与のための薬物送達ビヒクルとしての、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかの使用が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において日焼けを予防するための、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかの使用であって、ナノファイバーは対象の皮膚に塗布するためのものである、使用が本明細書に提供される。
上記使用の別の実施形態では、ナノファイバーが、アントシアニン又は別のＵＶ保護剤を含んでもよい、又はアントシアニン又は別のＵＶ保護剤と共に適用されてもよい。
さらに別の実施形態では、細胞増殖を減少させるための、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかの使用が本明細書に提供される。
上記使用の別の実施形態では、ナノファイバーが、抗がん薬と同時又は順次の使用のためであってもよい。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、ナノファイバーが、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象において肝臓におけるトリグリセリド蓄積を減少させるための上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の実施形態では、がんマーカーに特異的なターゲティング抗体とコンジュゲートされている、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかを含む標的化ナノファイバーが本明細書に提供される。
上記標的化ナノファイバーの別の実施形態では、ターゲティング抗体が、標的化ナノファイバーをがん細胞にターゲティングするため、ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片を含んでもよい。
上記標的化ナノファイバー又は複数の標的化ナノファイバーのさらに別の実施形態では、標的化ナノファイバーが、少なくとも１つの細胞傷害性又は抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記標的化ナノファイバー又は複数の標的化ナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、標的化ナノファイバーが、パクリタキセル、ドキソルビシン、若しくはその両方と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
別の実施形態では、抗菌剤と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、上記ナノファイバー又は複数のナノファイバーのいずれかを含む、抗菌性ナノファイバーが本明細書に提供される。
上記抗菌性ナノファイバーの別の実施形態では、抗菌剤が、リゾチーム、テトラサイクリン、又はナイシン、又はその任意の組合せを含んでもよい。
上記抗菌性ナノファイバー又は複数の抗菌性ナノファイバーのいずれかのさらに別の実施形態では、抗菌性ナノファイバーが、ＭＤＲ細菌感染の治療又は予防に使用するためのものであってもよい。
別の実施形態では、均質化した植物組織に由来する自己組織化した細胞成分を含むナノ粒子であって、細胞成分が１又は２以上の構造炭水化物又はその切断産物を含み、脂質がナノ粒子の構造成分ではない、ナノ粒子が本明細書に提供される。
上記ナノ粒子の別の実施形態では、ナノ粒子が、実質的に無脂質（lipid-free）であってもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、ペクチン、ヘミセルロース、ペプチド及び／若しくはタンパク質、有機酸、少なくとも１つのポリフェノール、その切断産物、又はその任意の組合せを含んでもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、
ペクチンベースの内側コア；
内側コアの周囲の中間層であって、ペクチン及びヘミセルロースの高分子及び／又はその切断産物、ポリフェノール、及び有機酸を含む中間層；及び
熟成の間及び／又は植物組織の均質化の間の異化作用から形成されていてもよい高分子の炭水化物及びタンパク質を含むフィブリル化外層を含んでもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの別の実施形態では、有機酸が、リンゴ酸、アスコルビン酸、又はその両方を含んでもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、ポリフェノールが、アントシアニンを含んでもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、細胞成分が、熟成の間又は熟成した果実の均質化の間の植物組織から遊離されるものを含んでもよく、これはナノ粒子に自己組織化することができる。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、１又は２以上の構造炭水化物が、１又は２以上のペクチン、ペクチン酸、ペクチンのメチルエステル、ペクチン誘導体、ポリガラクツロン酸、ラムノガラクツロナン、キシログルカン、ヘミセルロース；グルコース、マンノース、若しくはキシロースのβ－（１→４）－連結骨格を保持するキシログルカン；及び／又はアラビノガラクタン、及び／又はその切断産物を含んでもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、実質的に球状構造で直径約５０～２５０ｎｍを有してもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの別の実施形態では、ナノ粒子が：
ペクチンベースの内側コア；
内側コアの周囲の中間層であって、ペクチン又はその誘導体、及び１又は２以上のヘミセルロース由来分子又はその誘導体を含む、１又は２以上のらせん状のフィブリル構造を含む中間層；並びに
ヘミセルロース又はその切断産物、及び細胞タンパク質に由来する１又は２以上のペプチドを含むフィブリル化外層を含んでもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、約３～約７の範囲のｐＨで存在する水素結合相互作用によって安定化され、植物組織の細胞成分の異化作用に由来する高分子の間で形成され、ヒドロキシル基及び／又はアミノ基及び／又は有機酸基を保持していてもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、非結晶性であってもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、生物学的に活性な薬剤をさらに含んでもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、薬学的な活性薬、タンパク質、酵素、栄養補助食品（nutraceutical）、又は栄養分であってもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、水溶液中にあってもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、粉末形態であってもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、脱水、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライ形態にあってもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、植物組織が、果実又は野菜植物組織を含んでもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの別の実施形態では、植物組織が、老化果実（senescing fruit）、熟成野菜、又はその任意の組合せを含んでもよい；好ましくは、植物組織が、サクランボ、ブルーベリー、ブドウ、モモ、ネクタリン、プラム、アンズ、パパイア、トマト、又はその任意の組合せを含む。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかのさらに別の実施形態では、植物組織が、スミノミザクラ果実組織を含んでもよい。
別の実施形態では、均質化した植物組織からナノ粒子を調製するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
植物組織から遊離される細胞成分を含む、溶液中で均質化した植物組織を調製すること；
存在する場合、細片を均質化した植物組織から除去すること；及び
任意で、均質化した植物組織を透析して、複合体を形成していない化合物を除去すること、又はサイズ排除によって複合体を形成していない化合物を除去すること、
それによって、細胞成分の自己組織化によって形成される、ナノ粒子を含む溶液を提供することを含む。
上記方法の別の実施形態では、方法は、ナノ粒子を含む溶液を脱水、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライするステップをさらに含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、ナノ粒子が、実質的に水性の媒体中での自己組織化によって形成されてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を水性、有機性、又は混合された水性－有機性媒体中で均質化することを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を、高剪断均質化及び／又は水、エタノール、メタノール、又はアセトンのいずれか１又は２以上を含む、水性、有機性、又は混合された水性－有機性媒体中でのソノレーションに供することを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、細片を除去するステップが、透析、均質化した植物組織を濾過すること、均質化した植物組織を遠心分離すること、又は均質化した植物組織にタンジェンシャルフロー濾過又は連続フロー濾過を行うこと、又はその任意の組合せを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、方法は、本明細書に記載のナノ粒子を調製するためであってもよい。
別の実施形態では、均質化した植物組織からナノ粒子を調製するための方法が本明細書に提供され、前記方法が：
植物組織から遊離される細胞成分を含む、溶液中で均質化した植物組織を調製すること；
細胞成分の自己組織化によるナノ粒子の形成を可能にすること；
存在する場合、細片を均質化した植物組織から除去すること；及び
フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライして、ナノ粒子を含む粉末を形成することを含む。
上記方法の別の実施形態では、自己組織化が、実質的に水性の媒体において生じ得る。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を水性、有機性、又は混合された水性－有機性媒体中での高剪断均質化に供することを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、細片を除去するステップが、均質化した植物組織を濾過すること、又は均質化した植物組織を遠心分離すること、又はその両方を含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、方法は、本明細書に記載のナノ粒子を調製するためであってもよい。
別の実施形態では、上記方法又は複数の方法のいずれかによって調製されるナノ粒子が、本明細書に提供される。
別の実施形態では、上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかから調製される食物粉末が本明細書に提供され、食物粉末がマイクロスケールの微細粉末形態で提供されてもよい。
別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤を、それを必要とする対象、細胞、又は生物に送達する方法が本明細書に提供され、前記方法が、
化学的又は物理的な方法の使用により生物学的に活性な薬剤と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、いずれかの上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子を、対象、細胞、又は生物に投与することを含む。
上記方法の別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、セレン、亜鉛、鉄、及びマグネシウム等の元素であってもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が抗がん薬であってもよく、対象が、がんを有する対象であってもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、抗がん薬がパクリタキセル、ビンクリスチン、又はがんの治療に使用される、任意の天然又は合成の化合物であってもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤がナノ粒子にナノ粒子の形成の間に導入されてもよく、又は生物学的に活性な薬剤がアルコール又は他の有機成分を含んでいてもよい水性ベースの媒体中の既に形成されたナノ粒子と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、水性ベースの媒体が、ＤＭＳＯ、若しくは緩衝液、又はその両方を含んでもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象において炎症をもたらす活性酸素種のレベルの増加に関連する疾患又は障害を治療する方法であって、
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかを対象に投与することを含む方法が、本明細書に提供される。
別の実施形態では、それを必要とする対象において炎症を治療する又は減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかを対象に投与することを含む。
上記方法の別の実施形態では、ナノ粒子が、抗炎症剤を含んでもよい、又は抗炎症剤と共投与されてもよい。
上記方法又は複数の方法のさらに別の実施形態では、抗炎症薬が、クルクミンを含んでもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象において肥満を治療する又は減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかを対象に投与することを含む。
上記方法の別の実施形態では、ナノ粒子が、食物又は医学的な目的のために伝統的に使用される、ナッツ、マメ科植物、ハーブ、香辛料、野菜、又は真菌性の植物組織に少なくとも部分的に由来する成分を含んでもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療する又は予防するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかを対象に投与することを含む。
上記方法の別の実施形態では、ナノ粒子が、抗がん薬と同時に又は順次に共投与されてもよい。
上記方法又は複数の方法のさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記方法又は複数の方法のさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
別の実施形態では、対象に可溶性食物繊維を提供するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかを対象に投与することを含む。
別の実施形態では、上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかを含む、粘性を増強させる食品添加物が、本明細書に提供される。
別の実施形態では、それを必要とする対象において食後の血糖値を低減させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかを対象に投与することを含む。
別の実施形態では、上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかを含む化粧品が、本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象への局所投与のための組成物であって、組成物が上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれか及び生物学的に活性な薬剤を含んでいてもよい組成物が、本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において日焼けを予防するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかを対象の皮膚に塗布することを含む。
上記方法の別の実施形態では、ナノ粒子が、追加のアントシアニン又は別のＵＶ保護剤を含んでもよい、又は追加のアントシアニン又は別のＵＶ保護剤と共に適用されてもよい。
別の実施形態では、細胞増殖を減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
細胞又は組織又は器官を、上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかで処置することを含む。
上記方法の別の実施形態では、ナノ粒子が、抗がん薬と同時に又は順次に使用されてもよい。
上記方法又は複数の方法のさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記方法又は複数の方法のさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象において肝臓におけるトリグリセリド蓄積を減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかを対象に投与することを含む。
別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤を、それを必要とする対象又は細胞に送達するための上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
上記使用の別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、セレン、亜鉛、マグネシウム又は鉄等の元素であってもよい。
上記使用又は複数の使用の別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が抗がん薬であってもよく、対象が、がんを有する対象であってもよい。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、ナノ粒子の形成の間にナノ粒子に導入されてもよく、又は生物学的に活性な薬剤が水性ベースの媒体中の既に形成されたナノ粒子と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記使用又は複数の使用の別の実施形態では、水性ベースの媒体が、ＤＭＳＯ、若しくは緩衝液、又はその両方を含んでもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象において活性酸素種に関連する疾患又は障害を治療するための上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態では、それを必要とする対象において炎症を治療する又は減少させるための上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が本明細書に提供される。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、抗炎症剤を含んでもよい、又は抗炎症剤の投与用であってもよい。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、抗炎症薬が、クルクミンを含んでもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象において肥満を治療する又は減少させるための上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、ナッツ、マメ科植物、ハーブ、香辛料、野菜、又は真菌性の植物組織に少なくとも部分的に由来してもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療する又は予防するための上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、抗がん薬と同時に又は順次に共投与されてもよい。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
別の実施形態では、可溶性食物繊維を対象に提供するための上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、粘性を増強させる食品添加物又は繊維代用物としての、上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において食後の血糖値を低減させるための上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態では、化粧品における、上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象に局所投与するための上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態では、局所投与のための薬物送達ビヒクルとしての、上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の実施形態では、それを必要とする対象において日焼けを予防するための、上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用であって、ナノ粒子は対象の皮膚に塗布するためのものである使用が、本明細書に提供される。
上記使用のさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、追加のアントシアニン又は別のＵＶ保護剤を含んでもよい、又は追加のアントシアニン又は別のＵＶ保護剤と共に適用されてもよい。
別の実施形態では、細胞増殖を減少させるための、上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
上記使用の別の実施形態では、ナノ粒子が、抗がん薬と同時又は順次の使用のためであってもよい。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、ナノ粒子が、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象において肝臓におけるトリグリセリド蓄積を減少させるための上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態では、がんマーカーに特異的なターゲティング抗体とコンジュゲートされる、上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかを含む標的化ナノ粒子が、本明細書に提供される。
上記標的化ナノ粒子の別の実施形態では、ターゲティング抗体が、がん細胞に標的化ナノ粒子をターゲティングするため、ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片を含んでもよい。
上記標的化ナノ粒子又は複数の標的化ナノ粒子のさらに別の実施形態では、標的化ナノ粒子が、少なくとも１つの細胞傷害性又は抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記標的化ナノ粒子又は複数の標的化ナノ粒子のさらに別の実施形態では、標的化ナノ粒子が、パクリタキセル、ドキソルビシン、若しくはその両方と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
別の実施形態では、抗菌剤と複合体を形成している若しくはコンジュゲートされている、上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかを含む抗菌性ナノ粒子が、本明細書に提供される。
上記抗菌性ナノ粒子の別の実施形態では、抗菌剤が、リゾチーム、テトラサイクリン、若しくはナイシン、又はその任意の組合せを含んでもよい。
上記抗菌性ナノ粒子又は複数の抗菌性ナノ粒子のさらに別の実施形態では、抗菌性ナノ粒子が、ＭＤＲ細菌感染の治療又は予防における使用のためのものであってもよい。
別の実施形態では、均質化した植物組織に由来する自己組織化した細胞成分を含む食物粉末であって、細胞成分が１又は２以上の構造炭水化物又はその切断産物を含み、少なくとも１つの栄養剤をさらに含み、脂質が食物粉末の構造成分ではない食物粉末が、本明細書に提供される。
上記食物粉末の別の実施形態では、食物粉末が、
ナノスフェア様構造を形成するための、互いに巻きつく（又は巻き上がる）繊維構造を含んでもよい。
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかのさらに別の実施形態では、食物粉末が、疎水性成分をさらに含んでもよい。
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかのさらに別の実施形態では、疎水性成分が、アーモンドミルク、ココナツミルク、及び／若しくは食用ナッツに由来するミルクを含んでもよい、又はアーモンドミルク、ココナツミルク、及び／若しくは食用ナッツに由来するミルク中に提供されてもよい。
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかのさらに別の実施形態では、栄養剤が、健康効果を有する天然に存在する活性成分を含んでもよい。
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかのさらに別の実施形態では、栄養剤が、１又は２以上のカロテノイド、アンノナシン、ボスウェリア（Boswelia）、アシュワガンダ（Ashwagandha）、ショウガ科のメンバー、カンナビノジオール、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イヌリン、エレサレムアーティチョーク、コショウ科のメンバー、コショウ（Piper nigrum）若しくはピペリン及び／若しくはその誘導体を含有する野生の類縁体、若しくは健康効果を有するいずれかのその活性成分、それから単離されたいずれかの抽出物、誘導体、若しくは産物、又はその任意の組合せを含んでもよい。
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかのさらに別の実施形態では、食物粉末が、
スミノミザクラ、又はその水性抽出物；
アーモンドミルク又はアーモンドの別のホモジネート；
豆乳、又はダイズの別のホモジネート；
ブロッコリー、又はその水性抽出物；及び
ウコン、又はその粉末を含んでもよい。
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかのさらに別の実施形態では、食物粉末が、
約２５～３０ｖ／ｖ％スミノミザクラ抽出物（少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌのポリフェノール当量）；
約２５～３０ｖ／ｖ％アーモンドミルク又はアーモンドの他のホモジネート；
約１０～１８ｖ／ｖ％豆乳又はダイズの他のホモジネート；
約２５～３０ｖ／ｖ％ブロッコリー抽出物；及び
約０．５～２．５ｗ／ｖ％ウコン又はその粉末を含んでもよい。
上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかの別の実施形態では、スミノミザクラ抽出物が、約１～２ｍｇ／ｍｌポリフェノール当量であってもよい。
別の実施形態では、均質化した植物組織から食物粉末を調製するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
植物組織から遊離される細胞成分を含み、細胞成分が、１又は２以上の構造炭水化物又はその切断産物を含み、溶液中で均質化した植物組織が、少なくとも１つの栄養剤をさらに含む、溶液中で均質化した植物組織を調製すること；
任意で、存在する場合、細片を溶液中で均質化した植物組織から除去すること；及び
溶液中で均質化した植物組織をフリーズドライ、凍結乾燥、スプレードライ、又はナノスプレードライして、食物粉末を形成することを含む。
上記方法の別の実施形態では、植物組織が、果実、野菜、又は他の植物組織を含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、植物組織が、老化果実、熟成野菜、又はその任意の組合せを含んでもよい；好ましくは、植物組織が、サクランボ、ブルーベリー、ブドウ、モモ、ネクタリン、プラム、アンズ、パパイア、トマト、果実及び／又は野生起源のベリー、又はその任意の組合せを含む。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織が、疎水性成分をさらに含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、疎水性成分が、アーモンドミルク、ココナツミルク、及び／若しくは食用ナッツに由来するミルクを含んでもよい、又はアーモンドミルク、ココナツミルク、及び／若しくは食用ナッツに由来するミルク中に提供されてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、栄養剤が、健康効果を有する天然に存在する活性成分を含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、栄養剤が、１又は２以上のカロテノイド、アンノナシン、ボスウェリア、アシュワガンダ、ショウガ科のメンバー、カンナビノジオール、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イヌリン、エレサレムアーティチョーク、コショウ科のメンバー、コショウ若しくはピペリン及び／若しくはその誘導体を含有する野生の類縁体、若しくは健康効果を有するいずれかのその活性成分、それから単離されたいずれかの抽出物、誘導体、若しくは産物、又はその任意の組合せを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織が、
スミノミザクラ、又はその水性抽出物；
アーモンドミルク又はアーモンドの別のホモジネート；
豆乳、又はダイズの別のホモジネート；
ブロッコリー、又はその水性抽出物；及び
ウコン、又はその粉末を含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織が、
約２５～３０ｖ／ｖ％スミノミザクラ抽出物（少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌのポリフェノール当量）；
約２５～３０ｖ／ｖ％アーモンドミルク又はアーモンドの他のホモジネート；
約１０～１８ｖ／ｖ％豆乳又はダイズの他のホモジネート；
約２５～３０ｖ／ｖ％ブロッコリー抽出物；及び
約０．５～２．５ｗ／ｖ％ウコン又はその粉末を含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、スミノミザクラ抽出物が、約１～２ｍｇ／ｍｌポリフェノール当量であってもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を水性媒体、有機性媒体、又は混合された水性－有機性媒体中で均質化することを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、植物組織が、新鮮な、前処理された又は濃縮された物質、又はその任意の組合せであってもよい、１又は２以上の栄養含有物質を含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を、ブレンダーで、好ましくは、高ｒｐｍで操作すること及び高い剪断力を発生させること、ソノレーター、又は別の高性能混合デバイスで均質化することを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、細片を除去するステップが、細片を、遠心デバイスで、濾過デバイスで、膜濾過によって、タンジェンシャルフロー濾過によって、又はその任意の組合せで除去することを含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、植物組織が、スミノミザクラ、アーモンド若しくはアーモンドミルク、ダイズ若しくは豆乳、ブロッコリー、ウコン、若しくはその任意の組合せから得られる、又はスミノミザクラ、アーモンド若しくはアーモンドミルク、ダイズ若しくは豆乳、ブロッコリー、ウコン、若しくはその任意の組合せを含む植物組織を含んでもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、均質化した植物組織が、スミノミザクラ抽出物、アーモンドミルク、豆乳、ブロッコリー抽出物、及びウコン粉末を含んでもよい。
別の実施形態では、上記方法又は複数の方法のいずれかによって作製される食物粉末が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤をそれを必要とする対象、細胞、又は生物に送達する方法が本明細書に提供され、前記方法が、
化学的又は物理的な方法の使用により生物学的に活性な薬剤と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、いずれかの上記食物粉末又は複数の食物粉末を、対象又は細胞又は生物に投与することを含む。
上記方法の別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、セレン、亜鉛、鉄、及びマグネシウム等の元素であってもよい。
上記方法又は複数の方法のさらに別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が抗がん薬であってもよく、対象が、がんを有する対象であってもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、抗がん薬がパクリタキセル、ビンクリスチン、又はがんの治療のために使用される任意の天然又は合成の化合物であってもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、食物粉末の形成の間に食物粉末に導入されてもよく、又は生物学的に活性な薬剤がアルコール又は他の有機成分を含んでいてもよい水性ベースの媒体中の既に形成された食物粉末と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかの別の実施形態では、水性ベースの媒体が、ＤＭＳＯ、若しくは緩衝液、又はその両方を含んでもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において炎症をもたらす活性酸素種のレベルの増加に関連する疾患又は障害を治療する方法であって、
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかを対象に投与することを含む方法が、本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において炎症を治療する又は減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかを対象に投与することを含む。
上記方法の別の実施形態では、食物粉末が、抗炎症剤を含んでもよい、又は抗炎症剤と共投与されてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、抗炎症薬が、クルクミンを含んでもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において肥満を治療する又は減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかを対象に投与することを含む。
上記方法の別の実施形態では、食物粉末が、食物又は医学的な目的のために使用される、ナッツ、マメ科植物、ハーブ、香辛料、野菜、又は真菌性の植物組織に少なくとも部分的に由来する成分を含有してもよい又は含んでもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療する又は予防するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかを対象に投与することを含む。
上記方法のさらに別の実施形態では、食物粉末が、抗がん薬と同時に又は順次に共投与されてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、食物粉末が、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記方法又は複数の方法のいずれかのさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
さらに別の実施形態では、対象に可溶性食物繊維を提供するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかを対象に投与することを含む。
さらに別の実施形態では、上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかを含む、粘性を増強させる食品添加物が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において食後の血糖値を低減させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかを対象に投与することを含む。
さらに別の実施形態では、細胞増殖を減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
細胞又は組織又は器官を、上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかで処置することを含む。
上記方法の別の実施形態では、食物粉末が、抗がん薬と同時に又は順次に使用されてもよい。
上記方法のさらに別の実施形態では、食物粉末が、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記方法又は複数の方法のさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において肝臓におけるトリグリセリド蓄積を減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかを対象に投与することを含む。
さらに別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤を、それを必要とする対象又は細胞に送達するための上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
上記使用の別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、セレン、亜鉛、マグネシウム又は鉄等の元素であってもよい。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が抗がん薬であってもよく、対象が、がんを有する対象である。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、食物粉末の形成の間に食物粉末に導入されてもよく、又は生物学的に活性な薬剤がアルコール又は他の有機成分を含んでいてもよい水性ベースの媒体中の既に形成された食物粉末と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、水性ベースの媒体が、ＤＭＳＯ、若しくは緩衝液、又はその両方を含んでもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において活性酸素種に関連する疾患又は障害を治療するための上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において炎症を治療する又は減少させるための上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
上記使用の別の実施形態では、食物粉末が、抗炎症剤を含んでもよい、又は抗炎症剤の投与用であってもよい。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、抗炎症薬が、クルクミンを含んでもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において肥満を治療する又は減少させるための上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかの使用が、本明細書に提供される。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、食物粉末が、ナッツ、マメ科植物、ハーブ、香辛料、野菜、又は真菌性の植物組織に少なくとも部分的に由来してもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療する又は予防するための上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかの使用が本明細書に提供される。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、食物粉末が、抗がん薬と同時に又は順次に共投与されてもよい。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、食物粉末が、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
さらに別の実施形態では、可溶性食物繊維を対象に提供するための上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかの使用が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、粘性を増強させる食品添加物又は繊維代用物としての、上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかの使用が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において食後の血糖値を低減させるための上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかの使用が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、細胞増殖を減少させるための、上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかの使用が本明細書に提供される。
上記使用の別の実施形態では、食物粉末が、抗がん薬と同時又は順次の使用のためであってもよい。
上記使用又は複数の使用のさらに別の実施形態では、食物粉末が、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
上記使用又は複数の使用のいずれかのさらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において肝臓におけるトリグリセリド蓄積を減少させるための上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかの使用が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、抗菌剤と複合体を形成している若しくはコンジュゲートされている、上記食物粉末又は複数の食物粉末のいずれかを含む抗菌性食物粉末が本明細書に提供される。
上記抗菌性食物粉末の別の実施形態では、抗菌剤が、リゾチーム、テトラサイクリン、若しくはナイシン、又はその任意の組合せを含んでもよい。
上記抗菌性食物粉末又は複数の抗菌性食物粉末のいずれかのさらに別の実施形態では、抗菌性食物粉末が、ＭＤＲ細菌感染の治療又は予防における使用のためのものであってもよい。
さらに別の実施形態では、上記ナノ粒子又は複数のナノ粒子のいずれかに生物学的に活性な薬剤又はカーゴを負荷するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
ナノ粒子の脱水、凍結乾燥、又はフリーズドライしたサンプルを提供すること；
生物学的に活性な薬剤又はカーゴをナノ粒子のサンプルと混合して混合物を提供すること；及び
水又は水性ベースの溶液を混合物に添加してナノ粒子を縮小して、その中に生物学的に活性な薬剤又はカーゴをトラップすることを含む。
特定の実施形態では、上記ナノ粒子若しくは複数のナノ粒子のいずれか、上記食物粉末若しくは複数の食物粉末のいずれか、上記ナノファイバー若しくは複数のナノファイバーいずれか、又はその任意の組合せを含む組成物が本明細書に提供される。特定の実施形態では、組成物が、薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子、ナノファイバー、及び／又は食物粉末のいずれか２つの又はいずれか３つの混合物が、本明細書に記載の使用及び／又は方法のために使用されてもよいことが企図される。特定の実施形態では、例えば、ナノ粒子及びナノファイバーの混合物が使用されてもよい；ナノ粒子及び食物粉末の混合物が使用されてもよい；ナノファイバー及び食物粉末の混合物が使用されてもよい；又はナノ粒子、ナノファイバー、及び食物粉末の混合物が使用されてもよい。
スミノミザクラから調製されたナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像を示す図である（Ａ）。グリッドを５０μｌの抽出物液滴に浮かべることによって、ナノ粒子を１分間、炭素コーティングされたニッケルグリッドに吸着させた。グリッドを取り出し、端から吸い取り紙で吸い取って乾燥させ、そして、１％酢酸ウラニルの液滴に浮かべた。３０秒後、グリッドを取り出し、端から吸い取り紙で吸い取って乾燥させ、そして、Leo Electron顕微鏡を使用して直接調べた。液体培地中で、ナノ粒子は、５０～１００ｎｍの間で直径のサイズが変化している。パネルＢは、ナノ粒子の拡大図を示す。矢印は、ナノ粒子から吐き出されるフィブリル様構造を示す。 ＥＭの下で観察されたナノ粒子の拡大図を示す図である。パネルＡ－表面構造（矢印２）をはぎ取り、はるかに滑らかな内殻（矢印１）を露出している、２つのナノ粒子。パネルＢ、Ｃ－フィブリルを含む表面コーティングの詳細な形態を示すパネル。矢印１は、らせん状のフィラメント構造を有するフィブリルの領域を示す。らせん状のフィラメント構造は、フィブリル（矢印２）でコーティングされている。パネルＣは、らせん状のフィラメントをはぎ取られている単純なフィブリル構造を有する領域を示す。パネルＤは、溶液として保管された場合の複合体の潜在的な自然な解離の間に形成される、フィブリルのもつれ（矢印）を示す。 ナノ粒子の安定性に対するペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ）処理の効果を示す図である。ナノ粒子（０．８～１ｍｇポリフェノール当量／ｍｌ）を含有する透析抽出物１ｍｌを、ペクチナーゼ（抽出物１ｍｌ当たり１単位）で１５分間処理した。ナノ粒子を、炭素コーティングされたニッケルグリッドに吸着させ、以前に記載されている通りに酢酸ウラニルで染色して可視化した。パネルＡ－球状の複合体の、より小さい小胞状のフィラメント構造への分解が、抽出物をポリガラクツロナーゼ処理した後に見られ（四角で囲んだ領域）、このことは、ポリガラクツロン酸のα－１，４－グリコシド結合を有する高分子構造の存在を示している。パネルＢは、四角で囲んだ領域の拡大バージョンを示す。パネルＣ及びＤは、内側コアを残してフィラメント状コーティングの複合体をはぎ取る、セルラーゼ（β－１，４－グルカナーゼ）でのナノ粒子の処理の効果を示し、このことは、フィラメントにおけるβ－１，４－グルカン型の構成要素の存在を示している。 スミノミザクラから調製されたナノ粒子の構造に対するトリプシン処理の効果を示す図である。透析抽出物（１ｍｌ）を１単位のトリプシンで１５分間処理し、ナノ粒子を上記のように試験した。トリプシン処理によって、ナノ粒子の球形のペクチン内殻の周りの暗く染色された区域として見られる、表面フィラメント構造（パネルＡ、ルテニウムレッドで染色されている）の分解が生じる。殻様構造は、セルラーゼ処理の後でも見られたように、共に融合する傾向がある（図３を参照）。トリプシンによる表面殻の分解は、表面フィラメント状コーティングが、タンパク質（すなわち、細胞壁において見られる、伸長したタイプの糖タンパク質）、及び場合によって、熟成及び老化の間に生じるそれらの分解に由来するペプチドによっても構成されていることを示唆している。パネルＢは、殻様構造の拡大図を示す。パネルＣは、フィブリル／フィブリル構造に分散しているフィラメント状コーティングを示す、部分的に消化されたナノ粒子を示す。パネルＤは、フィブリル構造をはぎ取られているナノ粒子を示す。矢印は、フィブリル構造の分解後に残っている球形の殻を示す。パネルＥは、フィブリル／フィブリル構造を潜在的に形成する縒り合わされた組織化物を示す、フィブリル／フィブリル構造の拡大図を示す。フィブリル／フィブリル構造は、フィラメント状ではなく、また左右対称性を欠いているように見え、そして、それ自体の軸の周りに、第１、第２、及び第３のロープ様形態が形成されたフィブリル構造を形成する、らせん状に配置された分子として見える。 ナノ粒子を示すフリーズドライされたスミノミザクラ透析抽出物の走査型電子顕微鏡写真を示す図である。水の除去は、ナノ粒子のサイズを増強させ、潜在的に外部のフィブリル部分は崩壊するようである。理論に拘束されることは望まないが、水性環境において、ナノ粒子の表面部分は遊離し、伸長していると思われ、構造は、水素結合を介して少なくとも部分的にまとまっている可能性がある。水が除去されると、水素結合を促進する水分子が存在しないため、フィブリル構造はナノ粒子のペクチンコアと融合する傾向があり得、また、拡張もし得る。一方、溶液中では、ナノ粒子は通常、直径が２５～５０ｎｍの範囲のサイズ分布を示し、フリーズドライの後には、サイズは２００～８００ｎｍとなり、一部は、１マイクロメートルを超える直径に達する。 シート（矢印１）、管状領域（矢印２）、及びフィブリル（矢印３）を含む複数の構造の形成を示す、スミノミザクラの透析抽出物の走査型電子顕微鏡写真を示す図である。ナノ粒子の芽生えを、一部の領域で見ることができる（矢印４）。これらの構造は、ナノ粒子の形成における中間段階に相当する。 エタノール脱色したスミノミザクラから単離したナノファイバーの走査型電子顕微鏡写真（パネルＡ）及び透過型電子顕微鏡写真を示す図である。スミノミザクラの果実を５０％エタノール中でインキュベートして、ポリフェノール（アントシアニン）を除去し（３回）、洗浄し、そして水中に均質化した。細片を除去した後にホモジネートを水に対して透析し、透析抽出物をＳＥＭではフリーズドライし、ＴＥＭでは直接使用した。パネルＡは、ナノファイバーのナノ繊維構造及びナノフィルム構造を示す（矢印１、２）。酢酸ウラニルで染色した後、ナノファイバーは、直径が５～１０ｎｍの、長い（マイクロメートル又はそれを超える）構造（矢印１）として見える（パネルＢ）。これらの繊維は、溶液中でらせん構造（矢印２）を形成する能力を依然として保持している。示されているように、比較すると、ナノファイバーとナノ粒子とは、異なる構造を有する。 ナノ粒子の安定性に対する界面活性剤の効果を示す図である。スミノミザクラの透析抽出物を、増大濃度の、Triton-X 100及びデオキシコール酸ナトリウムなどの脂質を不安定化させる界面活性剤の存在下で、６～８ｋＤａのカットオフを有する透析バッグの中でインキュベートし、ｐＨ４に調整した水に対して１２時間透析した。透析バッグ内部でのポリフェノールの吸光度を、５２０ｎｍ（ベンゾピラン）及び２６０ｎｍ（フェノール環）で測定した。大規模な透析の後に観察され得るポリフェノール含有量に減少がなかったことから、界面活性剤での処理は複合体の崩壊をもたらさなかった。ナノ粒子が脂質を構造体／構成要素として含有していれば、界面活性剤での処理は、透析バッグから透析液へのポリフェノールの漏出と、それに対応する、透析バッグ内の抽出物における吸光度の減少を生じさせる。Triton-X 100での２６０ｎｍでの吸光度の増大は、溶液中のTriton-X 100濃度の増大に従った、２６０ｎｍでのTriton-X 100のフェニル部分の吸収に起因して生じ得る。 サイズ排除カラム（ＰＤ１０）を通してホモジネートを濾過した後に得られたナノ粒子の有機組成を示す図である。ナノ粒子及びナノファイバーの両方を単離し、凍結乾燥して粉末にした。粉末（４００ｕｇ）を１００ｕｌのピリジンに溶解し、１００ｕｌのＢＳＴＦＡ：ＴＭＣＳ混合物（９９：１）を添加した。溶液を８０℃で１時間インキュベートした。１ｕｌをＧＣ－ＭＳ分析では直接注入した。有機酸標準（Ａ）、ナノ粒子（Ｂ）、及びナノファイバー（Ｃ）の非加水分解性のトリメチルシリル化（ＴＭＳ、trimethylsilylation）と、リンゴ酸の存在を示す、ＧＣ－ＭＳを使用したこれらの分離とが示されている。示されているように、比較すると、ナノファイバー及びナノ粒子は、異なる組成を有する異なるタイプの構造物であり、一方、リンゴ酸は共通の構成要素である。下のパネルは、参照であるリンゴ酸のトリメチルシリル誘導体の質量スペクトルを示す。 ナノ粒子（この図においてナノ複合体と呼ばれる）及びナノファイバー（この図においてナノフィラメントと呼ばれる）における糖のトリメチルシリル誘導体（上のパネル）、並びに糖標準（下のパネル）を示す図である。ナノ粒子及びナノファイバーを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、trifluoroacetic acid）を使用して消化し、その後、ＢＳＴＦＡで誘導体化した。ナノ粒子における主要な糖は、マンノース、ガラクトース／ガラクツロン酸、及びグルコースである。ナノファイバーはアラビノースに富んでおり、微量のグルコース、及びガラクトース／ガラクツロン酸が存在する。ＴＦＡ消化は激しく、一部の構成要素を分解し得るため、量は相対的である。ガラクトース及びガラクツロン酸は類似のピーク分布を示し、そのため、ピークは両化合物に相当し得る。結果は主に、ナノ粒子においてはヘキソースが、そしてナノファイバーにおいてはペントースが多く存在していることを示している。 スミノミザクラ画分から単離し、クマシーブルーで染色したタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。果実全体に由来するタンパク質を、トリゾール抽出によって単離した。プロテアーゼ活性が阻害される条件下では（フェノール、グアニジウムイソチオシアネートの存在下の場合のように）、タンパク質分解は最小であり、タンパク質は、水を添加し、相分離をした後、有機相（フェノール：クロロホルム）中に存在する。レーン１－分子量マーカー。レーン２－果実全体から単離されたタンパク質。レーン３－水中の果実ホモジネートに由来するタンパク質。レーン４－１５０００×ｇで遠心分離した後に得られた細胞細片果汁に由来するタンパク質。レーン５－１５０００×ｇで遠心分離した後に得られた澄明な果汁中のタンパク質。レーン６－溶解され、サンプル緩衝液中にロードされた、透析抽出物の凍結乾燥粉末。レーン７－トリゾール試薬を使用して凍結乾燥粉末から抽出されたタンパク質、有機相。果実を水抽出した後、果汁は主に、低分子量のペプチド（２５ｋＤ）を含有しており、これは依然として有機相にある。透析抽出物の凍結乾燥粉末（レーン６）は、分離したタンパク質バンドを示していないが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色で可視化すると、ペプチドの染みを示している（レーン６）。トリゾール抽出及び抽出物の水での相分離は、理論的には、有機物に富んだ相（フェノール：クロロホルム相）にタンパク質を移動させる。クマシーブリリアントブルーで染色は見られず（レーン７）、このことは、ペプチドが、親水性の増強（糖質、ポリフェノールとの会合）を理由に、水性相に移動した可能性があることを示唆している（レーン７）。等しい量のサンプル（１５μｇのタンパク質）を、新鮮重量に基づいて各レーンにロードした。 ナノ粒子のペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。抽出及び透析を、水及び緩衝液（クエン酸カリウム、３００ｍＭ、ｐＨ６、均質化後の最終ｐＨはｐＨ５であった）中で行って、ポリフェノール（アントシアニン）の安定性を増強させた。パネルＡは、ゲルを水中の１０％酢酸（ｖ／ｖ）においてインキュベートする場合の、ポリフェノール（アントシアニン）に起因するピンク色を顕色させるための染色の前のゲルを示す。パネルＢは、ペプチドを顕色するためのクマシーブリリアントブルーで染色されている同一のゲルを示す。レーン１－分子マーカー。レーン２は、サンプル緩衝液にロードされた、透析された水抽出物の凍結乾燥粉末から得たナノ粒子における、ポリフェノール（アントシアニン）とポリペプチドとの会合を示す。トリゾール抽出の後、上清（水性相、レーン３）は、ペプチドの存在、及びポリフェノール（アントシアニン）とのそれらの会合を示す。レーン４－サンプル緩衝液にロードされた、緩衝された透析抽出物の粉末。レーン５、６、及び７は、トリゾール抽出後に得られた透析抽出物の粉末の上清、中間相、及び有機相に対応する。なお、ペプチド及びポリフェノール（アントシアニン）の大部分がトリゾール抽出物の水性（親水性）相にあることに留意されたい（レーン５）。有機相に対応するレーン７は、アントシアニンもペプチド染色も示していない。レーン８、９、及び１０は、ポリフェノール（アントシアニン）のほとんどが除去されているエタノール脱色したスミノミザクラの透析抽出物粉末をトリゾール抽出した後に得られた、上清、中間相、及び有機相に対応する。レーン８、パネルＢは、クマシーブルーでの染色を示す。脱色したスミノミザクラの透析抽出物の中間相及び有機相は、ペプチドについて最小の染色を示した（レーン９、１０、パネルＢ）。透析抽出物粉末のＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のヨウ化プロピジウム及びクマシーブリリアンントブルーでの染色における類似性によって明らかにされる、ナノ粒子におけるペクチンとポリペプチドとの会合（パネルＣ及びＤ）。パネルＣは、ヨウ化プロピジウム（水中で１０μｇ、水中で０．２％）での染色パターンを示す。レーン１は、市販されているペクチンである標準サンプルに対応する。レーン２は、透析抽出物の透析粉末に相当する。レーン３は透析液に対応し、この画分は、ポリペプチドについての、相対的にさらに強力な染色を示す。レーン４はポリガラクツロン酸である標準に対応し、これは、ヨウ化プロピジウムでの染色を示し、ポリペプチドについては示していない。スミノミザクラホモジネートのゼリー様のペレットもまた、ペクチン及びポリペプチドの存在を示す（レーン５）。 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び構造特異的なモノクローナル抗体（ラットＩｇＭ、www.PlantProbes.net）での免疫局在決定を行った、ナノファイバー及びナノ粒子を含有する、エタノール脱色したスミノミザクラ及び脱色していないスミノミザクラの透析抽出物のそれぞれを示す図である。結合した抗体を、アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗ラットＩｇＧで検出した。パネルＡは、クマシーブリリアントブルーによる、ナノファイバー（レーン２）及びナノ粒子（レーン３）におけるポリペプチドの染色を示す。脱色したスミノミザクラのナノファイバーは非常に吸湿性であり、ゲルに容易に入り込まないゼリー状となる。パネルＢは、ホモガラクツロナン（オリゴ１，４結合型ガラクツロン酸メチルエステル、ＬＭ２０）に対する抗体の反応性を示す。脱色したスミノミザクラの透析抽出物は、この抗体に対する反応性を示し、このことは、ホモガラクツロナン単位がナノファイバーにおいて露出していることを示す。しかし、脱色していないスミノミザクラ（球状のナノ粒子を含有する）の透析抽出物に対する反応性ははるかに低い（パネルＢ、レーン３）。このことは、パネルＢの下に示されているドットブロットの強度においても反映されている。球状のナノ粒子において、ペクチン部分は殻を形成し、ペプチド、ヘミセルロース、及びポリフェノール（アントシアニン）によって場合によっては覆い隠されている。これらは、内側への抗ホモガラクツロナン抗体のアクセシビリティを妨げ得る。一方、ナノファイバーでは、ペクチン部分は場合によって露出しており、このことによって、抗ホモガラクツロナン抗体との強力な相互作用が可能となる。ナノファイバーとナノ粒子との両方は、抗エクステンシン（これは、様々なヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質［ＨＲＧＰ、Hydroxyproline rich Glycoproteins］が有するＬＭ１エピトープを認識する）に対して穏やかな反応性のみを示し、このことは、果実における主要な細胞壁タンパク質であるエクステンシン（パネルＣ）が、インタクトではないかもしれないが、しかしエクステンシンに由来するペプチドを含有し得ることを示唆している。複合体と繊維との両方において、抗アラビノガラクタン－タンパク質（糖タンパク質、ＬＭ１４エピトープ）（ヘミセルロース－タンパク質）に対して非常に強力な反応が見られ、このことは、抗アラビノガラクタン－タンパク質がナノ粒子又はナノファイバーの基本構造の主要な構成要素であり得ることを示唆している（パネルＤ）。パネルＡの下にある、下のパネルは、抗キシログルカン（ＬＭ１５；キシログルカンのＸＸＸＧモチーフを認識する）に対するナノ粒子及びナノファイバーの交差反応性を示す。抗体と、ブロットの間にゲルから移動した分子との間に、反応はなかった。ドットブロットは、抗キシログルカンに対するナノファイバーによる強力な反応を明らかにしたが、ナノ粒子については明らかにしなかった。 ナノ粒子（レーン２）及びナノファイバー（レーン３）の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。それぞれ１００μｇを１０％ゲルに溶解した。（Ａ）ゲルＡを１０％酢酸中でインキュベートし、その後、クマシーブリリアントブルーで染色した（ゲルＢ）。数字で強調されているゲルバンドは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって以下の通りに同定された。バンド１：ＰＲタンパク質断片、スミノミザクラ由来のグルカンエンド－１，３－ベータ－グルコシダーゼ（受託番号Ｐ５０６９４）。バンド２：ＰＲタンパク質断片、主要なスミノミザクラアレルゲンであるＰｒｕａ１（受託番号Ｏ２４２４８）。バンド３：バンド１の断片である可能性が最も高い。パネルＢ及びＣはそれぞれ、ベータ－グルコシダーゼ（受託番号Ｐ５０６９４）及びＰｒｕａ１（受託番号Ｏ２４２４８）のアミノ酸配列を示す。 構造的類似性を有するいくつかの構成要素（下のパネル）と比較した、エタノール脱色したスミノミザクラ及び脱色していないスミノミザクラから得た透析抽出物の凍結乾燥粉末のＦＴ－ＩＲスペクトル（上のパネル）を示す図である。抽出物における構成要素の複雑な性質が理由で、構造及び官能基を正確に指定することは困難である。標準のスペクトルとの比較は、ＯＨ伸縮（糖質、ポリフェノール、３０００～３５００ｃｍ－１）の存在、及び５００～２０００ｃｍ－１延びるＣＨ－、ＣＯＯ、ＣＮなどに起因するいくつかのピークを示唆している。真正のペクチン、タンパク質、ペプチド骨格（Ｃ－Ｎ－Ｃ－Ｎ）に対する類似性は明らかである。ＢＳＡ及びＰＧＡが、比較のために、標準として図に含まれている。 スミノミザクラを水抽出した後に得られる透析抽出物（ナノ粒子）及び透析液（ペクチン）の凍結乾燥粉末の広角Ｘ線回折を示す図である。鋭いピークは、サンプルホルダーからの偏向から生じる。透析抽出物及び透析液の粉末の両方は、２θ１０°～３０°に広がる非常に拡散したバンドを示し、このことは、透析抽出物（ＤＥ、dialyzed extract）及び透析液（ＤＺ、dialysate）に結晶構造が存在しないことを示している。セルロース（β－１，４－グルカン）は、細胞壁内で結晶構造として存在する唯一の糖質である。この結果は、ナノ粒子において、主要な構成要素としてのセルロース産物（β－１，４－グルカン部分）が存在しないことを示唆している。ペクチンは、それによってペクチンがシート、小胞、及びフィラメントを形成し得るようになる非晶質構造を有しており、明らかな鋭い回折パターンは示していない。 ナノ粒子についての提案される構造モデルを示唆している結果を示す図である。スミノミザクラのホモジネートにおいてＴＥＭによって観察されるナノ粒子の拡大図がパネルＡに示されており、拡大された領域がＢに示されている。スミノミザクラの水性ホモジネートを４℃で１５分間遠心分離して（１５０００×ｇ）、細片及びゲル様のペクチン物質を沈殿させた。ホモジネートを、Sephadex G 25（排除限界５ｋＤ、７．５ｍｌのベッドボリューム、Amersham Biosciences社）を詰めたＰＤ１０サイズ排除カラムに通し、空隙容積画分を回収した。ナノ粒子を含有する画分を、透過型電子顕微鏡法にかけた。図は、環状構造を示す内側コアの周りの崩壊した領域を示し（パネルＡ、矢印１）、この周りには、ペクチン及びタンパク質を場合によって含有するヘリックス状のフィラメント構造からなる、時として、以前に見られた通りのらせん状構成の（パネルＡ、矢印２）、電子密度が低い領域がある（矢印２）。この層の周りに、アラビノガラクタン－タンパク質を含有するフィラメントを場合によって含み、ポリフェノール（すなわちアントシアニン）を含有し得る、ナノ粒子の表面部分を形成する、電子密度がわずかに高い繊維様領域がある（パネルＡ、矢印３）。ナノ粒子の拡大図をパネルＢに示す。ヘリックス状のエレメントは矢印によって示されている。 野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおける体重の変化に対する、ナノ粒子（ＮＰ、nanoparticles）溶液をマウスに給餌することの効果を示す図である。マウス（６～７カ月齢）を、それぞれ５～６頭からなる４つの群に分けた（野生型未処置（ＷＴ Ｕ、Wild type Untreated）、野生型処置済（ＷＴ Ｔ、Wild type treated）、ノックアウト未処置（ＫＯ Ｕ、Knock out Untreated）、及びノックアウト処置済（ＫＯ Ｔ、Knock out Treated））。処置マウスに、１日当たり体重４０ｇ当たり１３３μｇ当量の用量のＮＰ溶液（体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの抽出物）を、強制給餌によって週に５回与えた。未処置のマウスには水を与えた。実験は４週間継続した。ＮＰ処置の１週目では、試験対象群の間でマウス体重に対する効果はなかったが、２週目、３週目、及び４週目の後には、ＮＰ処置の継続によって、ＥＴＫＯマウスにおいて体重増加が予防された。これらの特定の用量／条件で、ＷＴ未処置と処置済との間で体重減少に有意な変化はなかったが、ＫＯ未処置とＫＯ処置済との間での体重増加の低減は、統計上有意であった（Ｐ＜０．０５）。 肝臓におけるトリグリセリドレベルの変化に対するナノ粒子（ＮＰ）処置の効果を示す図である。組織は、実施例２において記載されている試験から得られたものである。肝臓組織のトリグリセリドレベルを、Wako L-type TG Mアッセイキット（Wako Life Sciences社製、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、記載されている手順によって推定した。ＮＰ処置をしたＥＴＫＯマウスにおいて、トリグリセリドレベルは有意に低減した。上のパネルは、オスマウス及びメスマウスの両方から得たデータを示す。下のパネルは、オスマウスから得たデータを示す。ＮＰ処置による肝臓トリグリセリドの低減は、例えば、肝臓における脂質の蓄積、並びに、アラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのマーカー酵素活性などのマーカー酵素活性によって規定される、関連する病理学的症候、並びに、構造が逆戻りして野生型マウスの肝臓構造に近づくことを予防するための、ＮＰの使用をサポートする。類似の異常はまた、非アルコール性脂肪肝及び／又はＮＡＳＨのヒトにおいても観察され、このことは、本明細書において記載されるナノ粒子及び／又は食品粉末がこのような症状の治療及び／又は好転のための選択肢を提供し得ることを示唆している。 実施例２において記載されている処置をしたマウスから得た肝臓切片の病理組織学を示す図である。凍結切片をオイルレッドＯ染色（Sigma-Aldrich社）で染色して、赤い液滴として見ることができる、トリグリセリドを含有する脂質液滴を作製した。上２列のパネルは、野生型（未処置－上；ナノ粒子で処置済、下）マウスの染色された肝臓切片の画像である。赤く染色された区域の定量は、対照及び処置されたマウスセットにおける非常にわずかな変化を示す。各パネル／列は、３頭の独立したマウスから得た切片に相当する。下２列のパネルは、ＥＴＫＯ未処置（上）及びＮＰ処置（下）マウスから得た肝臓切片の外見を示す。全体として、ＥＴＫＯマウスから得た肝臓切片は、いくつかの空の区域を示している。これらの区域は、処置ＥＴＫＯマウスにおいては低減している。また、肝臓の構造は、ＷＴ（対照よりも紫が比較的強い区域）に類似している傾向がある。オイルレッドで染色された領域の区域は、処置後に有意に低減している（当該図の一番下のパネル）。略記：野生型未処置（ＷＴ－Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ－Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ－Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ－Ｔ）。当該図のラベルで見られる「ＳＣ」は、「スミノミザクラ」を示す。 ナノ粒子（ＮＰ）で処置した及び未処置のマウスの血清パラメータを示す図である。アルブミン、グロブリン、及びこれらの比率のレベルに大きな変化はなかった。血清中の総タンパク質レベルにおいて、わずかな低下が見られる。値は、３つの独立した処置の平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 対照マウス及びＮＰ処置マウスの血清中の生理学的機能マーカー（ＡＬＴ、ＡＳＴ、コレステロール、及びＣＫ）のレベルにおける変化を示す図である。分析は、ゲルフ大学のLaboratory Services Divisionの病理学研究室で、試験キットを使用して、標準的な手順によって行った。アラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、肝臓の機能的状態を示す酵素である。肝機能が低い場合、又は肝臓が炎症を起こしている場合には、より多くのこれらの酵素が血液中に分泌される。肥満マウスにおいて、ＮＰ処置に応答して、ＡＬＴ及びＡＳＴの両方のレベルが有意に且つ実質的に低下した。これらの酵素レベルが低かった野生型マウスにおいてさえも、ＮＰ処置によって低下が生じた。ＮＰ処置は、肥満マウスにおける肝機能を正常化すると考えられる。血清中のコレステロールレベルもまた、野生型マウス及び肥満マウスの両方において、ＮＰ処置に応答して低減した。高いクレアチンキナーゼレベルは筋肉損傷の指標であり、これはまた、ＮＰで処置した肥満マウスにおいて大きな低下を示した。これらの結果は、ＮＰの抗炎症性機能をサポートする。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 未処置マウス及びナノ粒子で処置したマウスの血液中のグルコース及びリンのレベルを示す図である。未処置の及び処置野生型及びＥＴＫＯマウスの両方の血清中のリンのレベルにおいて、大きな変化はなかった。グルコースレベルは野生型において類似しており、ＮＰ溶液で処置した後の肥満マウスにおいて、低下する傾向を示した。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液での処置に応答した、ＳＴＡＴ４遺伝子発現における変化の評価を示す図である。定量を、ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動、及びエチジウムブロマイドでの染色によって行った。未処置の野生型マウスと処置野生型マウスとの間で、ＳＴＡＴ４のレベルに有意な変化はない。ＮＰ溶液を与えたＥＴＫＯマウスにおいて、ＳＴＡＴ４の発現は低下する傾向がある。値は、この試験での未処置のＥＴＫＯマウスにおけるレベルと有意には異ならなかったが、低下する傾向が見られた。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。シグナル伝達兼転写活性化因子４（ＳＴＡＴ４、Signal Transducer and Activator of transcription 4）は、タンパク質のＳＴＡＴファミリーの転写因子である。ＳＴＡＴ４はヤヌスキナーゼによってリン酸化され、それによって、その二量化、及びサイトカインシグナル伝達の間の核への移動が可能となり、そして遺伝子発現が増大する。Ｓｔａｔ４に関連する遺伝子発現の増大は、活性化した炎症性経路の指標である。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液での処置に応答した、ＮＦ－ｋＢ遺伝子発現における変化の評価を示す図である。ＮＦ－ｋＢのバンドの強度を、ウェスタンブロット及び化学発光検出によって定量した。ＮＦ－ｋＢの発現は肥満マウスにおいて上方調節され、このことは、炎症性経路機能の増大を示唆している。ナノ粒子溶液での処置は、野生型マウスにおいても肥満マウスにおいてもＮＦ－ｋＢのレベルに有意な変化をもたらさなかった。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。核内因子－ｋＢ（ＮＦ－ｋＢ、Nuclear Factor-kB）は、インターロイキン及び腫瘍壊死因子－αなどのサイトカインを介する炎症シグナル伝達の開始に関与する、鍵となるタンパク質である。経路は複雑であり、条件に基づいて炎症誘発性の役割及び抗炎症性の役割の両方を有し得る。低下したＮＦ－ｋＢシグナル伝達は、炎症の程度の低下の指標と見なされる。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液でのマウスの処置に応答した、ＴＮＦα遺伝子の発現における変化の評価を示す図である。定量を、ＲＴ－ＰＣＲ、及びアガロースゲル電気泳動による産物の分離、及びエチジウムブロマイド染色によって行った。未処置の野生型マウスと処置野生型マウスとの間で、ＴＮＦα遺伝子発現のレベルに有意な変化はない。ＮＰ溶液を与えたＥＴＫＯマウスにおいて、ＴＮＦαの発現は有意に低下している。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。ＴＮＦαは、感染によってまた自己免疫の活性化によって生じる炎症に関連するシグナル伝達経路に関与する、鍵となるタンパク質である。ＴＮＦαの下方調節は、例えば慢性的な自己免疫疾患を制御するために典型的には望ましい。ＴＮＦαの低減は、体内の炎症状態にも関連している肥満の低減において望ましい。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液でのマウスの処置に応答した、ＩＬ６遺伝子の発現における変化の評価を示す図である。未処置の野生型マウスと処置野生型マウスとの間で、ＩＬ６のレベルに有意な変化はない。ＮＰ溶液を与えたＥＴＫＯマウスにおいて、ＩＬ６の発現は有意に低下している。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。ＩＬ６は、炎症誘発性経路及び抗炎症性経路の両方を仲介するサイトカインである。ＩＬ６の活性化は、いくつかの障害をもたらす慢性的な炎症状態を発症させることが分かっている。ＩＬ６の下方調節は、炎症、及び肥満などの慢性的状態の低減を促進し得る。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液での処置に応答した、ＦＡＳＮ遺伝子発現における変化の評価を示す図である。定量を、アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の分離、及びバンドを可視化するためのエチジウムブロマイド染色によって行った。ＮＰ処置した野生型マウスにおいて、ＦＡＳのレベルが有意に低減した。ＮＰ溶液を与えたＥＴＫＯマウスにおいて、ＦＡＳの発現が低下する傾向があった。この試験において、値は、未処置のＥＴＫＯマウスにおけるレベルと有意には異ならなかった。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ、Fatty Acid Synthase）は、脂肪酸の生合成に関与する酵素である。脂肪酸はトリグリセリドに変換され、脂肪酸のレベルの増大は、肥満をもたらす脂質の蓄積を生じさせ得る。したがって、この酵素レベルの低減は、トリグリセリドの生合成及び蓄積の低減に有利であり得る。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液での処置に応答した、ＡＴＧＬ遺伝子発現における変化の評価を示す図である。定量を、アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の分離、及びバンドを可視化するためのエチジウムブロマイド染色によって行った。対照野生型マウスとＮＰ処置した野生型マウスとの間で、ＡＴＧＬのレベルに有意差はなかった。同様に、ＡＴＧＬ発現のレベルは、未処置のＥＴＫＯマウス及びＮＰ処置したＥＴＫＯマウスにおいて同一であった。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。脂肪組織トリグリセリドリパーゼ（ＡＴＧＬ、Adipose Triglyceride Lipase）は、脂肪酸へのトリグリセリド異化作用作用の開始に関与する酵素である。ＡＴＧＬの機能は、メタボリックシンドロームの発症に関与する可能性がある。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液での処置に応答した、ＨＳＬ遺伝子発現における変化の評価を示す図である。定量を、アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の分離、及びバンドを可視化するためのエチジウムブロマイド染色によって行った。対照野生型マウスとＮＰで処置した野生型マウスとの間で、ＨＳＬの転写産物レベルが有意に増大した。ＨＳＬ発現のレベルは、未処置のＥＴＫＯマウス及びＮＰで処置したＥＴＫＯマウスで同一であった。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ、Hormone Sensitive Lipase）は、脂肪組織におけるトリグリセリドの加水分解に関与する鍵となる酵素、及びエネルギー生成に関与する鍵となる酵素である。ＨＳＬは、ＡＴＧＬと結合して作用して、トリグリセリドから遊離脂肪酸を遊離させる。この酵素は、典型的には、絶食の間など、エネルギーが必要な場合、カテコールアミンに応答して活性化され、こうして、保存された脂質の動員において機能する。この酵素はまた、ステロイドの生合成において、コレステロールエステルから脂肪酸を遊離させる。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液での処置に応答した、ＬＰＬ遺伝子発現における変化の評価を示す図である。定量を、アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の分離、バンドを可視化するためのエチジウムブロマイド染色によって行った。野生型マウスにおいて、ＮＰ処置に応答したＬＰＬ転写産物のレベルにおける変化はなかった。対照的に、ＮＰで処置したＥＴＫＯマウスにおいて、ＬＰＬ発現のレベルは有意に低下した。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、Lipoprotein lipase）は、リポタンパク質に結合したトリグリセリドを加水分解し、遊離脂肪酸及びモノアシルグリセロールを遊離させる酵素である。ＬＰＬは、膵臓リパーゼ及び肝臓リパーゼなどの他のリパーゼに類似している。ＬＰＬは、心臓組織、筋肉組織、及び脂肪組織などのいくつかの組織に存在し、そしてこれらは、毛細血管腔に近い細胞層に存在する。ＬＰＬは、毛細血管におけるリポタンパク質の代謝に影響し得る。ＬＰＬの活性は、インスリン及びアドレナリンなどのホルモンによって差次的に調節される。ＬＰＬのレベルは、高脂質食又は高糖質食を投与した後に増大することが分かっており、肥満の発症において機能を有し得る。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液での処置に応答した、ＰＧＣ１－α遺伝子発現における変化の評価を示す図である。定量を、アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の分離、バンドを可視化するためのエチジウムブロマイド染色によって行った。野生型マウスにおいて、ＮＰ処置に応答したＰＧＣ１－アルファ転写産物のレベルにおける変化はない。対照的に、ＮＰで処置したＥＴＫＯマウスにおいて、ＰＧＣ１－アルファ発現のレベルは有意に低下した。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体－ガンマコアクチベーター（ＰＧＣ１－α、Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator）は、糖質及び脂質に関するエネルギー代謝の調節に関与する転写コアクチベーターのファミリーに属する。ＰＧＣ１－Ａは、ストレス条件下で活性化される。このタンパク質はまた、炎症性経路の増強に関与するＮＦ－ｋＢを活性化することも分かっている。ＰＧＣ１－Ａのレベルの低下はこうして、炎症を下方調節し得る。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液での処置に応答した、ＰＰＡＲ－α遺伝子発現における変化の評価を示す図である。定量を、アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の分離、及びバンドを可視化するためのエチジウムブロマイド染色によって行った。野生型マウス及びＥＴＫＯ肥満マウスにおいて、ＮＰ処置に応答したＰＰＡＲ－α転写産物のレベルの変化はなかった。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体－アルファ（ＰＰＡＲ－α、Peroxisome Proliferator Activated Receptor-Alpha）は、核に局在化した転写因子の群に属する。ＰＰＡＲ－アルファは、脂肪酸の取込み、輸送、及び異化作用に関与する遺伝子の刺激を含む、肝臓での脂質代謝における鍵となる調節機能を有する。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液での処置に応答した、ＰＰＡＲ－γ遺伝子発現における変化の評価を示す図である。定量を、アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の分離、バンドを可視化するためのエチジウムブロマイド染色によって行った。ＮＰで処置した野生型マウスにおいて、ＰＰＡＲ－ガンマ転写産物が有意に低減している。ＮＰ処置後の肥満マウスにおいて、ＰＰＡＲガンマのレベルに大きな変化はなかった。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体－ガンマ（ＰＰＡＲ－ガンマ、Peroxisome Proliferator Activated Receptor-gamma）は、核内に位置する別の転写因子である。このタンパク質は、脂肪細胞の増殖、肥満の発症の増強に関与する。ＰＰＡＲガンマは、脂肪組織において発現し、また、筋肉において低レベルで発現する。ＰＰＡＲガンマは、肥満及びII型糖尿病の発症に影響することが分かっている。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液での処置に応答した、ＣＴＬ１遺伝子発現における変化の評価を示す図である。定量を、アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の分離、バンドを可視化するためのエチジウムブロマイド染色によって行った。野生型マウスにおいて、ＮＰ処置に応答したＣＴＬ－１転写産物のレベルの変化はない。対照的に、ＮＰで処置したＥＴＫＯマウスにおいて、ＣＴＬ１発現のレベルは有意に低下した。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。コリン輸送体様タンパク質１（ＣＴＬ－１、Choline Transporter Like Protein 1）は膜結合型酵素であり、脳細胞の原形質膜及びミトコンドリアにおいて見られる。ＣＴＬ－１は、ミトコンドリアにおける、コリンの輸送に関与し、コリンは、ホスファチジルコリンの生合成及び膜生合成において使用される。炎症によるマクロファージの産生の増強は、ＣＴＬ－１の過剰発現をもたらし、炎症の増大に関連していると考えられる。高レベルの膜生合成の低減は、細胞の肥大化、及び肥満に関連する変化の低減を助長し得る。 実施例２において記載されているナノ粒子溶液での処置に応答した、ＰＳＳ２遺伝子発現における変化の評価を示す図である。定量を、アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の分離、及びバンドを可視化するためのエチジウムブロマイド染色によって行った。野生型マウスにおいて、ＮＰ処置に応答したＰＳＳ２転写産物のレベルの変化はなかったが、わずかであるが有意な低減がＥＴＫＯマウスにおいて示された。値は、各群４～５頭のマウスの平均±ＳＥＭである。ホスファチジルセリン合成酵素２（ＰＳＳ２、phosphatidylserine synthase 2）（ＣＤＰ－ジアシルグリセロール－セリンＯ－ホスファチジルトランスフェラーゼ２）は、ホスファチジルセリンの生合成に関与する酵素である。このタンパク質は、ミトコンドリアに局在化している。ＰＳＳ２ノックアウトマウスは、正常な寿命を示した。この結果は、ナノ粒子溶液処置の効果が特定の遺伝子に標的化され得、脂質の生合成に関与する経路に関与する全ての遺伝子に標的化されるわけではないことを示唆している。 ２つの独立したナノファイバー調製物のナノファイバーの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ、transmission electron micrographs）を示す図である。左側のパネルは、フリーズドライ（凍結乾燥）を使用してエタノール脱色したスミノミザクラから単離されたナノファイバーを示す。右側のパネルは、ナノスプレー乾燥によって単離されたナノファイバーを示す。 鉄とのナノファイバー複合体を示す図である。ナノファイバー調製物（２ｍｇ）を２ｍｌの水に溶解し、１ｍＭの塩化第一鉄と混合した。溶液を２時間インキュベートし、水に対して一晩透析して（２回）、未結合の鉄を除去した。透析された溶液を、重金属染色を伴わずに（すなわち、コントラストを増大させるために通常使用される酢酸ウラニルでの染色を伴わずに）電子顕微鏡下で調べた。ナノファイバー複合体は鉄（酢酸ウラニルの代わりに）で染色され、このことは、ナノファイバーが鉄の担体として使用される可能性を示している。 哺乳動物細胞への、カルセインをロードされたナノファイバー（カルセイン－ナノファイバー付加物）の取込みを示す図である。カルセイン（Ｅｘ ４９４ｎｍ／Ｅｍ ５１７ｎｍ）自体は膜に浸透せず、エンドサイトーシスによって低レベルで取り込まれ得る（Ａ、Ｃ）。エタノール脱色したスミノミザクラを、１ｍｇ／ｇの新鮮重量カルセイン当量も含有する水中で均質化し、上清を水に対して透析した。ナノファイバーに複合したカルセインを透析バッグ内で保持し、共焦点顕微鏡法による取込みの測定に使用する。カルセイン単独の取込みは、ＨＴ２９細胞（左上のパネル）及び正常な腸細胞（左下のパネル）の両方においてかなり低かった（パネルＡ及びＣ）。カルセインをロードされたナノファイバーは、結腸直腸がん細胞株ＨＴ２９細胞（右上、Ｂ）及び正常なヒト腸ＣＲＬ１７９０細胞（右下、Ｄ）の両方で個別の区画に取り込まれている（サイズバー－１０μｍ）。パネルＢ及びＤは、両方のタイプの細胞へのナノファイバー－カルセイン複合体の、増強された取込みを示す。 ヒト細胞（ＨＴ－２９、ＣＲＬ２１５８、ＣＲＬ１７９０）への、脱色していないスミノミザクラから単離されたナノ粒子（Ａ、Ｃ、Ｅ）、及びエタノール脱色したスミノミザクラから単離されたナノファイバー（Ｂ、Ｄ、Ｆ）の取込みの実証を示す図である。ナノ粒子及びナノファイバーをDylight 650と化学的にコンジュゲートさせ、水に対して大規模に透析して（３回）、コンジュゲートしていない色素を除去した。抗体のアミノ基を標識するために通常使用されており、また、提供されているＳＯＰシート（Thermofisher社）において詳述されている方法に類似の方法を使用して、Dylightをナノ粒子及びナノファイバーにコンジュゲートさせた。簡潔に述べると、Dylightを、共有結合による安定なアミド結合を形成する第一級アミンと反応するＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化させた。Dylightとコンジュゲートしたナノ粒子及びナノファイバーを、サイズ排除カラムを使用して除去した。コンジュゲートした産物を、光から保護して、－２０℃の暗所で保管した。細胞を播種し、４８時間増殖させた。コンジュゲートしたナノ粒子及びナノファイバー（培養培地３ｍｌ中で≒５μＭのDylight当量）を培地に添加し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。細胞をペトリ皿（３．５ｃｍの直径）内で維持し、６３３ｎｍで励起させて共焦点顕微鏡（Leica社製）下で観察し、そして、発光を６８０ｎｍでモニタリングした。パネルＡ及びＢはそれぞれ、ＨＴ２９細胞（結腸直腸がん細胞株）による、Dylightにコンジュゲートしたナノ粒子及びナノファイバーの取込みを示し、パネルＣ及びＤはそれぞれ、ＣＲＬ２１５８細胞（ＭＤＲ結腸直腸細胞株）による、Dylightにコンジュゲートしたナノ粒子及びナノファイバーの取込みを示し、そして、パネルＥ及びＦはそれぞれ、ＣＲＬ１７９０細胞（正常なヒト腸細胞）による、コンジュゲートしたナノ粒子の取込みを示す。パネル内の挿入画は、細胞の拡大合成画像である（サイズバー－１０μｍ）。 ヒト結腸直腸がん細胞（ＨＴ２９）に対するナノファイバー－パクリタキセルの細胞傷害性を示す図である。共焦点顕微鏡下で可視化したＨＴ２９結腸直腸がん細胞のＬｉｖｅ－Ｄｅａｄ細胞分析が示されている。アッセイキット（Invitrogen社製）は、２つの蛍光色素、すなわち、生細胞に特異的に侵入し、脱エステル化され、そして生細胞を緑色に染色する、カルセインＡＭエステル（Ｅｘ ４９４ｎｍ、Ｅｍ ５１７ｎｍ）を含んでいる。死にかけている細胞及び死細胞は膜に欠陥を有し（漏出性の原形質膜）、核を赤に染めるエチジウムホモダイマー（Ｅｘ ５１７ｎｍ／Ｅｍ ６１７）を侵入させる。細胞を、生細胞を区別する５１７ｎｍ（緑のチャネル）、及び死細胞の可視化を可能にする６１７ｎｍで観察した。２つの波長の合成画像は、生存能力を失いつつある細胞を示している（Ａ、Ｄ、Ｇ；黄色）。パネルＢ、Ｃは、６１７ｎｍ（赤、死細胞）及び５１７ｎｍ（緑、生細胞）で可視化された対照細胞にそれぞれ相当する。パネルＡは、未処理細胞の合成画像である。パネルＥ、Ｆは、２つの波長６１７及び５１７ｎｍでそれぞれ記録された、パクリタキセル（３２ｎＭ）で処理した細胞の画像に相当する。パネルＤは合成画像である。パネルＨ及びＩは、パクリタキセル＋ナノファイバー（３２ｎＭ＋４μｇ／ｍｌのナノファイバー）で処理した細胞を示す。パネルＧは、赤の画像及び緑の画像の合成画像である。 ヒト結腸直腸ＭＤＲがん細胞（ＣＲＬ２１５８）に対するナノファイバー－パクリタキセルの細胞傷害性を示す図である。共焦点顕微鏡下で可視化したＣＲＬ２１５８多剤耐性結腸がん細胞のＬｉｖｅ－Ｄｅａｄ細胞分析が示されている。アッセイキット（Invitrogen社製）は、２つの蛍光色素、すなわち、生細胞に特異的に侵入し、脱エステル化され、そして生細胞を緑色に染色する、カルセインＡＭエステル（Ｅｘ ４９４ｎｍ、Ｅｍ ５１７ｎｍ）を含んでいる。死にかけている細胞及び死細胞は膜に欠陥を有し（漏出性の原形質膜）、核を赤に染めるエチジウムホモダイマー（Ｅｘ ５１７ｎｍ／Ｅｍ ６１７）を侵入させる。細胞を、生細胞を区別する５１７ｎｍ（緑のチャネル）、及び死細胞の可視化を可能にする６１７ｎｍで観察した。２つの波長の合成画像は、生存能力を失いつつある細胞を示している（Ａ、Ｄ、Ｇ；黄色）。パネルＢ、Ｃは、６１７ｎｍ（赤、死細胞）及び５１７ｎｍ（緑、生細胞）で可視化された対照細胞にそれぞれ相当する。パネルＡは、未処理細胞の合成画像である。パネルＥ、Ｆは、２つの波長６１７及び５１７ｎｍでそれぞれ記録された、パクリタキセル（３２ｎＭ）で処理した細胞の画像に相当する。パネルＤは合成画像である。パネルＨ及びＩは、パクリタキセル＋ナノファイバー（３２ｎＭ＋４μｇ／ｍｌのナノファイバー）で処理した細胞を示す。パネルＧは、赤の画像及び緑の画像の合成画像である。 正常なヒト腸細胞（ＣＲＬ１７９０）に対するナノファイバー－パクリタキセルの細胞傷害性を示す図である。共焦点顕微鏡下で可視化したＣＲＬ１７９０ヒト結腸正常上皮細胞のＬｉｖｅ－Ｄｅａｄ細胞分析が示されている。アッセイキット（Invitrogen社製）は、２つの蛍光色素、すなわち、生細胞に特異的に侵入し、脱エステル化され、そして生細胞を緑色に染色する、カルセインＡＭエステル（Ｅｘ ４９４ｎｍ、Ｅｍ ５１７ｎｍ）を含んでいる。死にかけている細胞及び死細胞は膜に欠陥を有し（漏出性の原形質膜）、核を赤に染めるエチジウムホモダイマー（Ｅｘ ５１７ｎｍ／Ｅｍ ６１７）を侵入させる。細胞を、生細胞を区別する５１７ｎｍ（緑のチャネル）、及び死細胞の可視化を可能にする６１７ｎｍで観察した。２つの波長の合成画像は、生存能力を失いつつある細胞を示している（Ａ、Ｄ、Ｇ；黄色）。パネルＢ、Ｃは、６１７ｎｍ（赤、死細胞）及び５１７ｎｍ（緑、生細胞）で可視化された対照細胞にそれぞれ相当する。パネルＡは、未処理細胞の合成画像である。パネルＥ、Ｆは、２つの波長６１７及び５１７ｎｍでそれぞれ記録された、パクリタキセル（３２ｎＭ）で処理した細胞の画像に相当する。パネルＤは合成画像である。パネルＨ及びＩは、パクリタキセル＋ナノファイバー（３２ｎＭ＋４μｇ／ｍｌのナノファイバー）で処理した細胞を示す。パネルＧは、赤の画像及び緑の画像の合成画像である。 スミノミザクラ、ブロッコリー、及び他の食品の成分から調製された食品粉末の走査型電子顕微鏡写真を示す図である。食品粉末は、個々の構成要素の均質溶液の混合物をブレンドすること、及び、実施例４において記載されているように、ブレンドされた混合物をナノスプレー乾燥することによって調製した。 微細構造の特徴を示す食品粉末の水性溶液の透過型電子顕微鏡写真を示す図である。食品粉末は、長楕円形で、きつく巻かれたファイバー構造の球状の塊となっているように見える（Ａと記した矢印を参照）。この構造は、スミノミザクラのナノ粒子で見られる、構造上の構成を有さないナノ粒子に類似している（図１７を参照）。しかし、球状のコア（Ｂと記した矢印）に類似している球形構造を、それから吐き出されるファイバー構造で見ることができる。らせん状に構成された構造（矢印Ｃ）は、ナノ粒子で見られるらせん状の繊維に類似している。５０マイクロリットルの食品粉末懸濁液アリコートをガラススライド上に置き、炭素コーティングされたグリッドを、コーティングされた側を下にして、３０秒間、溶液に浮かべた。グリッドを端から吸い取り紙で吸い取って乾燥させ、０．１％酢酸ウラニル溶液で染色した。写真は、はるかに小さなナノ粒子に分解されている食品粉末粒子の巨大凝集体を示す（Ａと記した矢印）。Ｂと記した矢印は、繊維が巻かれていないナノ粒子のコアを示す。矢印Ｃによって示されるように、巻かれている繊維のらせん状の性質を見ることができる。 食品粉末の抗酸化能力の評価を示す図である。粉末を水中に溶解し、溶液のＤＰＰＨラジカル捕捉能力をマイクログラム単位のポリフェノール当量として推定することによって（フォリン・チオカルト試薬によって推定される）、溶液の抗酸化能力を決定した。０．１ｍＭのフォリン・チオカルト試薬をメタノール中で調製し、食品粉末溶液を特定の量で添加した。抗酸化剤を１ｍｌのＤＰＰＨ試薬と反応させ、吸光度（紫色、５１７ｎｍでの吸光）をモニタリングした。５１７ｎｍでの吸光度の減少を記録し、ポリフェノールを有さない対照と比較したクエンチングの％として表した。トロロックスが、ポジティブ対照として、ポリフェノールと同じ濃度で使用され、ＴＥＡＣ値１を示した。濃度の各点は、調製された食品粉末の個々のサンプルに相当する。 食品粉末及び水で処置された野生型マウス（ＷＴ）及びエタノールアミンノックアウトマウス（ＫＯ）における体重の変化の評価を示す図である。実験は、２４週齢のＰｃｙｔ２ノックアウトマウス（ＫＯ）及び同腹子対照で行った。ＫＯマウス及び野生型マウスの未処置（Ｕ）群（それぞれｎ＝４～６）には、処置の時点で、１００ｕＬの水を強制給餌によって投与した。ＫＯマウス及び野生型（ＷＴ）マウスの処置（Ｔ）群（それぞれｎ＝４～６）には、１００ｕｇの食品粉末（１００ｕＬの水の中）を週に５回投与した。全ての群で、経口強制給餌を８週間継続した。処置期間の終わりにマウスを屠殺し、血液サンプル及び組織サンプルを分析のために回収した。星印は、有意に異なる値を示す（＊－Ｐ＜０．０５、＊＊－Ｐ＜０．０１）。 肝臓におけるトリグリセリドレベルの変化に対する食品粉末処置の効果を示す図である。組織は、実施例４において記載されている試験に由来するものであった。肝臓組織のトリグリセリドレベルは、Wako L-type TG Mアッセイキット（Wako Life Sciences社、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、記載されている手順によって推定した。食品粉末処置をした野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの両方において、トリグリセリドレベルの有意な低減はない。値は、３つの個別のサンプルの平均±ＳＥＭである。食品粉末で処置した肥満マウスにおいて、トリグリセリドが低減する傾向が見られる。食品粉末処置による肝臓トリグリセリドの低減は、メタボリックシンドロームを示す個体において有利であり得る。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 食品粉末で処置した及び未処置の野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの血清パラメータを示す図である。アルブミン、グロブリン、及びこれらの比率のレベルに大きな変化はなかった。総タンパク質の点では、対照群と処置群との間に有意差はない。値は、３つの独立した処置の平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 食品粉末で処置した及び未処置の野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの血清パラメータを示す図である。グルコース、リン、及び尿素のレベルに大きな変化はない。食品粉末で処置した肥満マウスにおいて、トリグリセリドレベルでわずかな低下が見られる。値は、３頭の独立したサンプルの平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ－Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ－Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ－Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ－Ｔ）。 食品粉末で処置した野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおける、ケモカイン（走化性サイトカイン）の転写産物レベルの変化を示す図である。ＣＣＬ型ケモカインは、炎症部位に単球を誘引する活性型Ｔ細胞によって分泌される低分子糖タンパク質である。Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ１、C-C motif chemokine ligand 1）及びそのファミリーメンバー（ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５など）は、炎症プロセスに関与する。ＣＣＬ２及びＣＣＬ５の有意な低減が、食品粉末処置に応答して、野生型マウスにおいて見られた。この試験において、ＥＴＫＯマウスにおいて、食品粉末処置後にこれらのケモカインの低減が示される傾向があるが、有意には異ならない。データは、３頭の独立したマウスのサンプルにおける転写産物レベルの平均±ＳＥＭである。ＣＣＬ１はＣＣＲ８に結合してそれを機能させる。ＣＣＬ２（単球化学誘引物質タンパク質１（ＭＣＰ１、Monocyte chemoattractant Protein 1））もまた、炎症部位への単球の誘引に関与し、受容体ＣＣＲ２及びＣＣＲ４に結合する。ＣＣＬ３（マクロファージ炎症性タンパク質－アルファ（ＭＩＰ１－α、Macrophage inflammatory protein-Alpha））は急性炎症に関与し、白血球の誘引物質である。これは、受容体ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、及びＣＣＲ５に結合する。ＣＣＬ５は、ＣＣＲ５表面受容体に結合し、炎症及びがんの進行に関与する。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 食品粉末で処置した野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおける、ケモカイン（走化性サイトカイン）の転写産物レベルの変化を示す図である。ＣＣＬ型ケモカインは、炎症部位に単球を誘引する活性型Ｔ細胞によって分泌される低分子糖タンパク質である。この図は、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１７、及びＣＣＬ１９の転写産物レベルにおける変化を示す。ＣＣＬ６は齧歯動物に固有であり、その作用の間にＣＣＲ１に結合し得る。ＣＣＬ６は、骨髄細胞の分化の間にマクロファージにおいて発現される。ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、及びＣＣＬ１７における有意な低減が、食品粉末処置に応答して、野生型マウスにおいて見られた。ＣＣＬ７における有意な低減が、ＥＴＫＯマウスにおいて見られた。ＣＣＬ１９は、野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの両方において、転写産物の変化を示さなかった。データは、３頭の独立したマウスのサンプルにおける転写産物レベルの平均±ＳＥＭである。ＣＣＬ６はＣＣＲ１に結合してそれを機能させる。ＣＣＬ７もまた、炎症部位への単球の誘引に関与し、ＣＣＲ２受容体に結合する。異常なレベルのＣＣＬ７発現は、腫瘍形成並びにＭＭＰ－２の活性化及び転移に関連する。したがって、ＣＣＬ７の下方調節は、がんの予防において非常に有利である可能性が高い。ＣＣＬ１７はリンパ球の化学誘引に関与し、また、アテローム性動脈硬化症及び炎症性腸疾患などの炎症性疾患の誘発に関与する。ＣＣＬ１９は、リンパ球の再循環に関与する。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 食品粉末で処置した野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおける、ＣＣＬ２２ケモカイン（走化性サイトカイン）の転写産物レベルにおける変化を示す図である。ＣＣＬ２２は腫瘍及び腫瘍浸潤性Ｔ細胞によって産生され、腫瘍による免疫抑制及び免疫細胞回避を生じさせて、腫瘍の進行を促進する。免疫細胞におけるＣＣＬ２２の過剰発現は、インターロイキン－アルファによって生じる。野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの両方において、食品粉末処置に応答したＣＣＬ２２のレベルの変化はなかった。データは、３頭の独立したマウスのサンプルにおける転写産物レベルの平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 食品粉末で処置した野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおける、ＣＣＲ型受容体の転写産物レベルの変化の評価を示す図である。ＣＣＲファミリーのケモカイン受容体は、好酸球、好塩基球、リンパ球、マクロファージ、及び樹状細胞などの血球において発現し、これらの発現／活性の増強は、炎症の増大に関連している。ＣＣＲがリガンドであるケモカイン（ＣＣＬファミリー）に結合すると、多くのシグナル伝達経路が活性化される。食品粉末処置では、野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの両方において、ＣＣＲ１及びＣＣＲ６の発現レベルは変化しなかった。野生型マウスにおけるＣＣＲ２及びＣＣＲ８は、食品粉末処置に応答して有意な下方調節を示し、このことは、食品粉末が、炎症の原因であるＣＣＲのレベルを下方調節し得ることを示唆している。同様に、食品粉末を給餌したＥＴＫＯマウスにおいて、ＣＣＲ８は有意に下方調節された。したがって、ケモカインのレベル及びこれらの受容体のレベルの両方における低下は、食品粉末処置に対する応答として生じると考えられる。データは、３頭の独立したマウスのサンプルにおける転写産物レベルの平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 食品粉末で処置した野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおける、コロニー刺激因子（ＣＳＦ、Colony stimulating factor）の転写産物レベルにおける変化の評価を示す図である。ＣＳＦは、顆粒球／マクロファージ（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージ（Ｍ－ＣＳＦ）、及び顆粒球（Ｇ－ＣＳＦ）によって産生されるサイトカインである。これらのサイトカインの発現／活性の増強は炎症の増大に関連し、下方調節は、炎症性疾患及び自己免疫疾患の低減を促進する。ＣＳＦレベルは、野生型マウス及び食品粉末で処置されたマウスにおいて類似していた。ＣＳＦ３はＥＴＫＯマウスにおいて上方調節され、これは、肥満の発症に関連している可能性が高い。食品粉末での処置によって、ＣＳＦレベルは、野生型マウスで見られたレベルに近付いた。ケモカインのレベル及びこれらの受容体のレベルの両方における低下は、食品粉末処置に対する応答として生じると考えられる。ＣＤ４０ＬＧは、免疫細胞の表面に局在化しているＣＤ４０タンパク質のリガンドであり、このタンパク質の発現の増大は、いくつかのがんの発症に関して、炎症の増大に関連している。血管内皮では、血小板によるＣＤ４０リガンドの分泌の増大は、プラーク細胞の形成及び動脈の遮断をもたらすＲＯＳの産生を増強させると考えられる。食品粉末で処置したマウスにおけるＣＤ４０リガンドの発現は有意に低減し、そのレベルを野生型のレベルに近付けた。データは、３頭の独立したマウスのサンプルにおける転写産物レベルの平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおける、食品粉末処置に応答したＣＸＣモチーフケモカインの変化における評価を示す図である。ＣＸＣ１型ケモカイン：ＣＸＣＬケモカインは、免疫原性細胞の表面にあるＣＸＣＲ型受容体に結合し、これらの作用を誘発する。その受容体ＣＸＣＲ－２を介して作用するＣＸＣモチーフリガンド１（ＣＸＣＬ１、CXC motif ligand 1）は、炎症において鍵となる役割を有する。ＣＸＣＬ１は野生型マウスにおいて有意に下方調節されたが、ＥＴＫＯマウスは食品粉末処置に応答した有意な変化を示さなかった。ＣＸＣＬ１０及びその受容体であるＣＸＣＲ３は、器官特異的な疾患（１型糖尿病）、及び関節リウマチなどの全身性の自己免疫疾患を含む、自己免疫疾患の発症の際に生じる病理に関与する。インターフェロン及びＴＮＦはＣＸＣＬ１０の産生を活性化させ、ＴＨ１リンパ球を活性化させる。ＣＸＣＬ１０は野生型マウスにおいて有意に下方調節されたが、ＥＴＫＯマウスは、食品処置に応答した変化を全く示さなかった。ＣＸＣ－モチーフリガンド－１２（ＣＸＣＬ－１２（CXC-motif ligand-12）、間質細胞由来因子１又はＳＤＦ１）は、その受容体であるＣＸＣ－Ｒ４に結合するケモカインである。ＣＸＣＬ－１２は様々な組織で発現し、発症において重要である。ＣＸＣＬ－１２の過剰発現は炎症を生じさせ、白血球に対して非常に走化性である（神経炎症）。ＣＸＣＬ１２は、膵臓がん、多発性硬化症、アルツハイマー病などの臨床マーカーである。ＣＸＣＬ－１２は、野生型マウスにおいて、食品粉末処置に応答して下方調節された。データは、３頭の独立したマウスのサンプルにおける転写産物レベルの平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 ＣＸＣ－リガンドの転写レベルに対する食品処置の効果の評価を示す図である。ＣＸＣＬ－５は、インターロイキン及びＴＮＦアルファによって刺激される炎症の間に産生される。ＣＸＣＬ－５は、ＣＸＣ受容体２に結合する。ＣＸＣＬ－５は、細胞増殖において役割を有し、運動性及び血管新生を増強させると考えられている。未処置の及び食品粉末で処置した野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの間で、ＣＸＣＬ５に変化はなかった。ＣＸＣＬ１５は、肺の表皮細胞、腸細胞などにおいて発現するケモカインであり、炎症に関連している。未処置の及び食品粉末で処置した野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの間で、ＣＸＣＬ１５の転写産物レベルに変化はなかった。データは、３頭の独立したマウスのサンプルにおける転写産物レベルの平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 ＣＸＣモチーフケモカイン受容体（ＣＸＣＲ、CXC motif chemokine receptors）（免疫活性な血球を誘引し、炎症を誘発することによって、ケモカインファミリー及びインターロイキンのＣＸＣリガンドに結合する）を示す図である。野生型マウスにおいて、食品粉末処置によってＣＸＣＲ－２のレベルは有意に低減した。ＥＴＫＯマウスにおいて変化は見られなかった。野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの両方において、ＣＸＣＲ－５及びＣＸＣＲ－３及びＣＸＣＲ５に差はなかった。結果は、リガンド（Ｃ－Ｃ、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフ）から離れても、受容体が食品粉末での処置によって調節され得、これにより炎症のより良好な下方調節がもたらされ得ることを示唆している。腫瘍壊死因子ファミリーの受容体は、炎症に関与する別の群の受容体であり、いくつかの天然産物は、ＴＮＦアルファに関連するシグナル伝達経路を下方調節することが知られている。ＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ、FAS Ligand）はＴＮＦスーパーファミリーに属し、その受容体への結合によって、アポトーシスが開始される。食品粉末処置後に、野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの両方において、ＦＡＳＬのレベルに有意差はない。データは、３頭の独立したマウスのサンプルにおける転写産物レベルの平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおける、食品粉末処置に対する応答としてのインターロイキンにおける変化の評価を示す図である。インターロイキンは免疫機能に関与するサイトカインであり、一部のインターロイキンは炎症性であり（ＩＬ１７）、他のインターロイキンは抗炎症機能を有する（ＩＬ１０）。これらは、正常な条件下で、及び疾患の原因となる生物で感作した場合に、免疫機能を仲介する。食品粉末で処置した野生型マウスのＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、及びＩＬ７の発現レベルにおいて、有意な低減が見られた。これらのインターロイキンのレベルは、食品粉末処置に応答して、類似のままであった。ＩＬ４の発現レベルは、未処置の及び食品粉末で処置した野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおいて類似のままであった。データは、３頭の独立したマウスのサンプルにおける転写産物レベルの平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおける、食品粉末処置に対する応答としてのインターロイキンにおける変化の評価を示す図である。インターロイキンは、正常な条件下で、及び疾患の原因となる生物で感作した場合に、免疫機能を仲介する。野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの両方において、食品粉末処置後に、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ２ｒｂ、及びＩＬ１７ｆの発現レベルは変化しなかった。データは、３頭の独立したマウスのサンプルにおける転写産物レベルの平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおける、食品粉末処置に対する応答としてのインターロイキンにおける変化の評価を示す図である。野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの両方において、食品粉末処置後に、ＩＬ２１の発現レベルに変化はなかった。インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ、Interferon gamma）は、ウイルス薬に対する応答に関与する別のサイトカインである。野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの両方において、食品粉末処置に応答したＩＦＮＧのレベルに変化はなかった。データは、３頭の独立したマウスのサンプルにおける転写産物レベルの平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおける、食品粉末での処置の間にこれらの応答に関する、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバーの転写産物レベルの変化の評価を示す図である。リンホトキシンＢ：リンホトキシンベータ（ＬＴＢ、Lymphotoxin Beta）（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー３）は、膜タンパク質であり、炎症応答の誘発因子である。ＬＴＢ転写産物のレベルは、食品粉末処置に応答して、野生型マウスにおいて下方調節された。食品粉末で処置したＥＴＫＯマウスにおいて、ＬＴＢの転写産物レベルに変化はなかった。ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１１ｂ、及びＴＮＦＳ１１３ｂなどのＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバーの転写産物レベルは、野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの両方において、食品粉末処置後に変化しなかった。データは、３頭の独立したマウスのサンプルにおける転写産物レベルの平均±ＳＥＭである。略記：野生型未処置（ＷＴ／Ｕ）、野生型処置済（ＷＴ／Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ／Ｕ）、及びノックアウト処置済（ＫＯ／Ｔ）。 食品粉末処置を受けた及び受けていないマウスにおける肝臓切片の病理組織学的結果を示す図である。パネル（Ａ）は、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した未処置の野生型（ＷＴ）マウスの肝臓切片を示す。ごくわずかな脂質体を見ることができる。パネル（Ｂ）は、食品粉末で処置し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した、野生型（ＷＴ）マウスの肝臓切片を示す。ごくわずかな脂質体を見ることができる。パネル（Ｃ）は、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した未処置の肥満（ＫＯ）マウスの肝臓切片を示す。明確な環状の区域は、肝臓に広く分布している脂質体である。パネル（Ｄ）は、食品粉末で処置し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した、（ＫＯ）マウスの肝臓切片を示す。明確な環状の区域は、脂質体である。組織再生の可能性がある区域が矢印によって示されている。
植物組織由来ナノファイバー、それを作製するための方法、及びその使用が本明細書に記載される。比較のために、ナノ粒子及び食物粉末、及びそれを作製するための方法も記載される。実施形態及び実施例が、当業者用として意図される例示の目的のために提供され、いかなる点においても限定することを意味したものではないことが理解される。
以下に詳細に記載するように、ナノ粒子、食物粉末、及びナノファイバーが今回開発され、これらはいくつかの興味深い特性を特色としている。ナノ粒子及びナノファイバーは両方とも植物組織から調製され得るが、これらの２つのナノ構造は著しく異なる方法を使用して本明細書で調製されており、これらの２つのナノ構造が著しく異なる構造を採ること、組成の点で有意に異なることを特色とすること、機能及び／又は生物学的効果の点で興味深い差（及び類似性）を特色とすることが本明細書で見出されている。
例として、均質化した植物組織に由来する自己組織化した細胞成分を含むナノ粒子、１又は２以上の細胞壁及び／又は他の細胞成分を含む細胞成分が本明細書に記載される。比較として、ポリフェノールが抽出された、均質化した植物組織に由来する自己組織化した細胞成分を含むナノファイバーであって、細胞成分が、１又は２以上の細胞壁及び／又は他の細胞成分を含む、ナノファイバーも記載される。そのようなナノ粒子及びナノファイバーを調製するための方法及びプロトコール（それらの間の差を示す）、並びに、例えば、対象の疾患又は障害の治療又は予防における、そのようなナノ粒子及びナノファイバーの使用及び／又は送達ビヒクルとしての使用も記載される。本発明に記載のナノ粒子及びナノファイバー、並びに特に本発明のナノ粒子に関連する（しかし、別個の）食物粉末も詳細に記載される。
ナノ粒子及びその作製のための方法
ナノ粒子、
一実施形態では、均質化した植物組織に由来する自己組織化した細胞成分を含むナノ粒子であって、細胞成分が１又は２以上の細胞壁及び／又は他の細胞成分を含む、ナノ粒子が本明細書に提供される。特定の実施形態では、細胞成分が、均質化によって植物組織から遊離される成分を含んでもよく、これが、例えば、ナノ粒子に自己組織化する。特定の実施形態では、１又は２以上の細胞壁成分が、ペクチン及び／又はその誘導体を含んでもよい。
特定の実施形態では、均質化した植物組織に由来する自己組織化した細胞成分を含むナノ粒子であって、細胞成分が１又は２以上の構造炭水化物又はその切断産物を含み、脂質がナノ粒子の構造成分ではない、ナノ粒子が本明細書に提供される。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、実質的に若しくは完全に無脂質であってもよい、又はわずか最小量、残留量、若しくは微量の脂質を含有してもよい。特定の実施形態では、脂質、例えば、リン脂質、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、遊離脂肪酸又はアルデヒド及びアルカンが、ナノ粒子の構造成分ではない（すなわち、全体として、脂質、及びナノ粒子が、膜状の性質の単層状ベシクル又は多層状ベシクルを形成しない）。特定の実施形態では、ある量の脂質が存在する場合、脂質量は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）レベル未満である、及びミセル又はベシクルを形成しない。特定の実施形態では、脂質が、ナノ粒子三次又は四次構造に実質的に寄与しない、及び／又はナノ粒子自己組織化に寄与しない。特定の実施形態では、植物組織が選択されてわずかな脂質が提供されてもよい若しくは脂質が提供されなくてもよい、及び／又は脂質がナノ粒子自己組織化前に除去されてもよい。
特定の実施形態では、細胞成分が、熟成の間又は熟成した果実の均質化の間の植物組織から遊離されるものを含んでもよく、これはナノ粒子に自己組織化することができる。
特定の実施形態では、植物組織が、例えば、果実、野菜、葉、花、種子（一般に、発生の任意の段階）の植物組織又は植物物質、又はその任意の組合せを含んでもよい。特定の実施形態では、２又は３以上の組織の混合物が使用されてもよい。特定の実施形態では、複数の組織が使用され、各々がナノ粒子の１又は２以上の成分で強化され、混合物の均質化が自己組織化のための成分を提供してナノ粒子を形成してもよい。特定の実施形態では、植物組織又は植物物質が、例えば、スミノミザクラ、ブルーベリー、その一部又はその混合物等を含んでもよい。特定の実施形態では、植物物質又は植物組織が、熟した果実を含んでもよい。特定の実施形態では、発育している果実（熟成前）は十分なナノ粒子成分を含有しない場合があるが、補填するために他の植物物質又は組織及び／又は特定のナノ粒子成分と混合することによって、及び／又は未熟成の果実を酵素で処理して、十分なナノ粒子成分が生成し、均質化後にナノ粒子組織化を可能にする場合に、なおも使用され得る。特定の実施形態では、植物組織の均質化を、熟成酵素が活性化する条件下で、熟成酵素に対する細胞成分の曝露を増すことによって、熟成が増加するような、様式で行ってもよい。特定の実施形態では、植物組織が、ペクチン、１又は２以上のヘミセルロース、タンパク質／ペプチド、１又は２以上の炭水化物、リンゴ酸（又は水素結合を形成することができる別の有機酸）、少なくとも１つのアントシアニン、及び／又はアスコルビン酸、又はその任意の組合せを提供し得る。特定の実施形態では、植物組織が、少なくとも、ペクチン、１又は２以上のヘミセルロース、タンパク質／ペプチド、１又は２以上の炭水化物、リンゴ酸（又は水素結合を形成することができる別の有機酸）、少なくとも１つのアントシアニン、及びアスコルビン酸を提供し得る。特定の実施形態では、ナノ粒子が、ペクチン、ヘミセルロース、ペプチド及び／若しくはタンパク質、有機酸、少なくとも１つのポリフェノール、その切断産物、又はその任意の組合せを含んでもよい。特定の実施形態では、有機酸が、リンゴ酸、アスコルビン酸、又はその両方を含んでもよい。特定の実施形態では、ポリフェノールが、アントシアニンを含んでもよい。特定の実施形態では、細胞成分が、熟成の間及び／又は熟成した果実の均質化の間の植物組織から遊離されるものを含み、これはナノ粒子に自己組織化することができる。特定の実施形態では、均質化が、切断産物を形成する熟成酵素に対する細胞成分の曝露を増してもよく、これによりナノ粒子に寄与し得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子が、無デンプン、又は実質的に無デンプン（例えば、アルファ及びベータアミロース）であってもよい。デンプンはデンドロマータイプ構造を形成する傾向があり、したがって、ナノ粒子を生成するために使用される植物組織中のより高いレベルのデンプンの存在がナノ粒子生成に干渉し得る。特定の実施形態では、植物組織含有デンプンが使用される場合に、それらを控え目に使用して、デンプン含有量を低く保ってもよい。例えば、バナナが植物組織が一部として使用される場合に、バナナが対応する植物組織の比率が、使用されている植物組織の他の成分と比較して比較的低くてもよい。特定の実施形態では、類似の考慮はまた、同様に本明細書に詳細に記載される食物粉末及び／又はナノファイバーに対して適用されてもよい。
特定の実施形態では、植物組織が、部分的に分解された状態（例えば、熟成した）にあり、部分的に分解された細胞壁を有してもよく、又は植物組織から、均質化の間に組織に対して炭水化物及び／又はタンパク質カタボライジング酵素（細胞壁成分をカタボライズする）を付加して生成されてもよい。特定の実施形態では、開始時の植物組織は、保存剤、例えば、アルコール又は酢酸（酢）において固定化などにより部分的に処理され、均質化に供される前に再水和されてもよい。特定の実施形態では、植物組織にアスコルビン酸及びリンゴ酸をブレンドして、構造上の統合性及び／又はナノ粒子の収率等を促進してもよい。
特定の実施形態では、植物組織が、果実又は野菜植物組織を含んでもよい。特定の実施形態では、植物組織が、老化果実、熟成野菜、又はその任意の組合せを含んでもよい。特定の好ましい実施形態では、植物組織が、サクランボ（例えば、スミノミザクラ等）、ブルーベリー、ブドウ、モモ、ネクタリン、プラム、アンズ、パパイア、トマト、又はその任意の組合せを含んでもよい。例として、特定の好ましい実施形態では、植物組織が、スミノミザクラ果実組織を含んでもよい。特定の実施形態では、植物組織が、果皮及び／又は果実の外組織（例えば、カカオの場合等）を含んでもよい。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、ペクチン、ヘミセルロース、ペプチド及び／若しくはタンパク質、有機酸、少なくとも１つのポリフェノール、その切断産物、又はその任意の組合せを含んでもよい。特定の実施形態では、有機酸が、リンゴ酸、アスコルビン酸、又はその両方を含んでもよい。特定の実施形態では、ポリフェノールが、アントシアニンを含んでもよい。
特定の実施形態では、ナノ粒子の１又は２以上の構造炭水化物が、１又は２以上のペクチン、ペクチン酸、ペクチンのメチルエステル、ペクチン誘導体、ポリガラクツロン酸、ラムノガラクツロナン、ヘミセルロース、例えば、キシログルカン（特定の実施形態では、セルロースでもペクチンでもない場合がある）を含んでもよく、グルコース、マンノース、若しくはキシロースのβ－（１→４）－連結骨格、及び／又はアラビノガラクタン、及び／又はその切断産物を保持する。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、実質的に球状構造で、例えば直径約５０～約２５０ｎｍを有してもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子が、非結晶性であってもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子が、水溶液、乾燥粉末形態、又は脱水、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライ形態で提供されてもよい。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、ペクチンベースの内側コア；内側コアの周囲の中間層であって、ペクチン及びヘミセルロースの高分子及び／又はその切断産物、ポリフェノール、及び有機酸を含む中間層；並びに熟成の間及び／又は植物組織の均質化の間に形成された異化作用産物から形成されていてもよい、高分子の構造炭水化物及びタンパク質（ペプチド）を含むフィブリル化外層を含んでもよい。図１７は、以下にさらに詳細に記載され、そのような構造上の構成の例を図示している。特定の実施形態では、ペクチンベースの内側コアが、一般に中空（又は中空でない）の球形状構造であってもよく、ナノ粒子のペクチン分解酵素（例えば、ポリガラクツロナーゼ／ペクチナーゼ）での処理が、内側コアのより小さい球体への破壊を生じ得る（内側コアがペクチンベースであってもよいことを示している）。特定の実施形態では、中間層が、ペクチン及びヘミセルロース起源の高分子、アントシアニンによる水素結合、アスコルビン酸及びリンゴ酸、並びに様々な細胞タンパク質等を起源とするペプチドによって形成される層を含んでもよい。特定の実施形態では、フィブリル化外層が、植物組織等の熟成の間に生じる異化作用を起源とする高分子の構造炭水化物及び／又はタンパク質を含んでもよい。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、熟成の間及び／又は均質化の間に植物組織に生じるタンパク質分解を起源とする１又は２以上のペプチドを含んでもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子が、熟成の間及び／又は均質化の間に植物組織に生じる、構造炭水化物の１又は２以上のカタボライトを含んでもよい。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、ペクチンベースの内側コア；内側コアの周囲の中間層であって、ペクチン又はその誘導体、及び１又は２以上のヘミセルロース由来分子又はその誘導体を含む、１若しくは２以上のらせん状のフィブリル構造を含む中間層；並びにヘミセルロース又はその切断産物、及び細胞タンパク質に由来する１又は２以上のペプチドを含むフィブリル化外層を含んでもよい。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、約３～約７の範囲のｐＨで存在する水素結合相互作用によって安定化され、植物組織の細胞成分の異化作用に由来する高分子の間で形成され、ヒドロキシル基（糖等で見出される）及び／又はアミノ基（ペプチド等で見出される）及び／又は有機酸基（アスコルビン酸及び／又はリンゴ酸等で見出される）を保持していてもよい。特定の実施形態では、水素結合相互作用が、低分子、例えば、ポリフェノール（例えば、アントシアニン、例えば、シアニジン－３－グルコシド、及び／又はシアニジン－３－ルチノシド）のヒドロキシル基も伴ってもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子が、幾分か中性－酸性の条件下（例えば、約３～約７のｐＨ）、及び緩衝液ではない溶液又は水素結合に干渉し得る高いイオン強度を有する別の溶液中で形成／自己組織化されてもよい。特定の実施形態では、カルシウムイオンが、ナノ粒子の安定化を可能にするポリガラクツロン酸鎖の間の架橋として作用してもよい。理解されるように、塩、例えば、カリウム、ナトリウム、及び／又はカルシウムが、植物組織等を起源とする溶液中に存在してもよい。
理解されるように、均質化によって植物組織から遊離される細胞成分がナノ粒子に自己組織化する可能性がある条件が、使用される特定の適用及び物質に依存して変動してもよい。特定の実施形態では、条件が、約４℃～約４０℃、好ましくは、約１５℃～約３５℃の範囲の温度であってもよい。特定の実施形態では、条件が、水中、又は水混和性の有機溶媒、例えば、（限定されないが）メタノール若しくはエタノールと水の混合物中であってもよい。特定の実施形態では、均質化によって植物組織から遊離される細胞成分がナノ粒子に自己組織化する可能性がある条件が、約１５～１００％ｖ／ｖの水、より好ましくは約３０～約１００％ｖ／ｖの水、及び最も好ましくは約１００％ｖ／ｖの水である溶液中であってもよい。自己組織化が水性又は実質的に水性の溶液において生じる場合、特定の実施形態では、植物組織として、又は植物組織の一部として、未熟の果実を使用するときに、ポリガラクトウロナーゼなどの熟成環境中に一般に存在する酵素が、特に自己組織化を援助するために、混合物に添加されてもよいことが企図される。特定の実施形態では、自己組織化が生じる可能性がある条件が、例えば、実質的に水性の媒体中であってもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子の作製が、適切な媒体を使用して本明細書に記載の手順によって達成されてもよい。典型的には、媒体が水又は水性媒体であってもよいが、特定の実施形態では、水及び混和性の有機溶媒、例えば、限定されないが、エタノール及び／又はメタノールを含んでもよい１又は２以上のアルコール、１又は２以上のケトン、例えば、アセトン、ジメチルスルホキシドを含んでもよい１又は２以上の溶媒、その別々の又は任意の適切な組合せのいずれかであってもよい又はそれらを含んでもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子の自己組織化が、先に記載の媒体の１つの中で生じてもよい。自己組織化のための条件が、任意の熱力学的に可能な条件を含んでもよい。特定の実施形態では、自己組織化のための条件が、例えば、約４℃～約３０℃の温度、一般に生理的に見出される濃度と一致するイオン濃度（すなわち、マイクロモルからミリモルレベル）、約５～１０パーセントｗ／ｖの範囲の糖濃度、及びミリモル範囲で存在する天然有機酸等を含んでもよい。
特定の実施形態では、好ましい方法には、果実組織が、水性又はアルコール性媒体（又はその両方の組合せ）中、約４℃で、ブレンダー、ポリトロン又は細胞組織を破壊することができる任意の他のデバイスを使用して均質化される、方法が含まれ得る。開始物質の滑らかなホモジネートを作製後、ホモジネートを濾過して細片を除去し、約１００００ｘｇで遠心分離して微細な細片を沈降してもよい。生じるホモジネートを、約１００ｋＤカットオフ透析バッグを使用して約１５時間、約４℃で透析してもよい。透析バッグからの溶液を、収集し、ある形態の水除去及び／又はフリーズドライ／スプレードライ、ナノスプレードライなどに供してナノ粒子を提供してもよい。これらは、例えば長期貯蔵が所望される場合には約－２０℃、暗所で乾燥保存してもよい。
特定の実施形態では、均質化には、植物組織の粉砕、ブレンディング、高い剪断力の均質化、又はポリトロンなどのデバイスを使用する均質化などの植物組織の解離の任意の適切な方法が含まれ得る。
特定の実施形態では、植物組織が、１又は２以上の果実及び／又は野菜を含んでもよく、これを他の植物組織と組み合わせてもよく、又は組み合わせなくてもよい。栄養補助食品産物が所望される例では、担体（例えば、果実）及び栄養補助食品含有植物（例えば、ウコン根茎）を、植物組織として使用してもよい。特定の実施形態では、植物組織（例えば、果実）が、精製された又は部分的に精製された産物（例えば、ウコン粉末、又はクルクミン等）と共に使用されてもよい。
栄養補助食品化合物及び植物ファミリーのいくつかの例には、
ａ．カロテノイド（ベータカロチン、リコペン、ルテイン及び／又は他のキサントフィル、アスタキサンチンなど）；
ｂ．アンノナシン（抗がん特性を有するアンノナ果実に由来するポリケチド）；
ｃ．ボスウェリア（Boswellia）（クルクミンと協同して作用することが可能であり、追加の抗炎症性機能等を提供する）；
ｄ．アシュワガンダ（抗ストレス、及びがん予防特性を有するウィタノライド（withanoliides）を含有するハーブ成分）、主にステロイド構造を有する；
ｅ．食用ショウガ（ショウガ（Zingiber officinalis））、マンゴージンジャー（クルクマアマダ（Curcuma amada））及びジンゲロール及びショウガオールを含む、いくつかの生理活性成分を含有するその他のものを含むショウガ科のメンバー；
ｆ．クルクマロンガ（Curcuma longa）（クルクミンを含有するウコン）；
ｇ．幻覚誘発活性のないアサ属種（Cannabis sp.）の医薬活性成分であるカンナビノジオール；
ｈ．プレバイオティック含有量を増強するための、フラクトオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖並びにエレサレムアーティチョークからのイヌリン；
ｉ．コショウ科のメンバー、例えば、コショウ及びピペリンを含有するその野生の類縁体及びいくつかの誘導体；及び／又は
ｊ．上に列挙されていない植物からの任意の他の適切な成分が含まれ得る。
さらなる実施形態では、ナノ粒子が、少なくとも１つのポリフェノールを含んでもよい。特定の実施形態では、ポリフェノールが、アントシアニン若しくはいくつかのアントシアニンであってもよい、又はアントシアニン若しくはいくつかのアントシアニンを含んでもよい。またさらなる特定の実施形態では、ナノ粒子が、有機酸、例えば、リンゴ酸、アスコルビン酸、又はその両方をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子が、一種を超えるポリフェノールを含んでもよい。理解されるように、ナノ粒子のポリフェノール組成は、使用されている植物組織（例えば、果実）のポリフェノール組成及び供給される任意の追加のポリフェノール（外部ポリフェノールが追加される場合）を反映し得る。スミノミザクラが使用されている場合、例えば、ポリフェノールが、シアニジン３ルチノシド又はグルコシドを含んでもよい。ブルーベリーが使用される場合、ポリフェノールが、ブルーベリーに見出される複数のフェノール及びアントシアニンを含んでもよい。ポリフェノール（アントシアニン及びフェノールの両方）の例は、以下の表に示される。
Figure 2022513081000001
特定の実施形態では、ナノ粒子が、実質的に球状構造で直径約５０～２５０ｎｍを有してもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子が、ペクチン成分（例えば、ラムノガラクツロナン）を含む１又は２以上のらせん状のフィブリル構造によって周りを囲まれるペクチンベースのコア、１又は２以上のヘミセルロース由来分子（例えば、キシログルカン）、及び細胞壁タンパク質、例えば、ヒドロキシプロリンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧＰ）に由来する１又は２以上のペプチドを含んでもよい。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、１又は２以上の生物学的に活性な薬剤をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、ナノ粒子と複合体を形成していてもよい、コンジュゲートされていてもよい又は混合型であってもよい。例として、生物学的に活性な薬剤が、薬学的な活性薬、栄養補助食品、又は栄養分であってもよい。当業者は、本明細書の教示を考慮して、特定の適用に依存して使用され得る、種々の適切な医療薬、栄養補助食品、及び／又は栄養分を認識する。特定の実施形態では、薬学的な活性薬が、慢性疾患の制御、例えば、がん治療に使用するもののために開発された任意の適切な薬物も含んでもよい（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ポリケチド、カンナビノジオールなど）。特定の実施形態では、栄養補助食品が、カロテノイド（例えば、リコペン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、これは点眼液等に使用される可能性がある）、抗炎症剤（例えば、ウコン／クルクミン、ボスウェリア、アシュワガンダ及び／又は他の生理活性ハーブ）、栄養分（例えば、Ｆｅ２＋、Ｚｎ、Ｓｅ、コバラミン（Ｖｉｔ Ｂ１２））、及び／又は抗酸化酵素、例えば、スーパーオキシドジスムターゼ、標的領域に対するカタラーゼ、虚血／再灌流などを含んでもよい。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、水溶液、粉末形態、又は脱水、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライ、若しくはナノスプレードライ形態等で提供されてもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子が、経口投与のために製剤化されてもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子が、食物の摂取に適切な形態で提供されてもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子が、カプセル、注射可能な形態、粘膜領域のためのスプレー形態、及び／又は局所投与のための形態（例えば、皮膚適用のための軟膏）で提供されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子を含む組成物が本明細書に提供される。特定の実施形態では、ナノ粒子又は組成物が、ナノ粒子の調製の間又は後に追加される、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、組成物が、生物学的に活性な薬剤、例えば、薬物、生体分子、タンパク質、酵素、抗体又は任意のかなる他の医薬剤をさらに含んでもよい。
またさらなる実施形態では、ナノ粒子が調製される植物組織が、果実又は野菜植物組織を含んでもよい。特定の実施形態では、植物組織が、果実、例えば、サクランボ、ブルーベリー、ブドウを独立又は組合せのいずれかで含んでもよい、特定の実施形態では、栄養学的に重要な他の産物、例えば、ブロッコリー、アーモンド、ダイズ又はウコンを、組織として又は処理された産物、又はその任意の組合せとしてのいずれかで追加的に含んでもよい。例として、植物組織が、スミノミザクラ果実を含んでもよい。特定の実施形態では、植物組織が、植物起源の栄養分又は栄養補助食品担体をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、植物組織が、例えば、スミノミザクラ果実を野菜組織（例えば、ブロッコリー、キノコ、ナッツ又はナッツ産物（すなわち、アーモンド、ヘーゼルナッツ）、根茎（すなわち、アシュワガンダ、人参、ハマスゲなど））と組み合わせて含んでもよい。
広範な研究が行われて、本明細書に記載のナノ粒子の組織化構造が複雑であることが示されている。いかなる様式でも理論に束縛されることを望まないが、得られた実験の証拠（以下に記される実施例のセクションを参照されたい）に基づいて、本明細書に記載のナノ粒子の特定の実施形態の以下の構造モデルが提唱される。
ＥＭデータから、ナノ粒子は、突出している繊維様構造を有する、よりフィブリル性の外層が提供され得る、別個の中間層によって周りを囲まれる、別個の内側コアを含み得る。３つの別個の領域（内側コア、中間層、及び外層）は、重金属（例えば、酢酸ウラン）に結合するそれらの能力に基づき区別され得る。ウランイオンは、例えば、ポリマー鎖の糖酸（グルクロン酸、ガラクツロン酸）の負に荷電した部分に結合することができ、その領域を電子的に高密度にする。したがって、三層の間の区別は、これらの層のポリマーの組成の差に反映され得る。
ナノ粒子の酵素処理は構造の断片化を生じ、中間構造を明らかにしている。ペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ）処理はナノ粒子全体の小胞構造への破壊を生じ、ポリガラクツロン酸部分がナノ粒子全体に分散し得ることが示唆される。
ベータ－１，４－グルカナーゼでの処理はナノ粒子の外側構造の溶解を生じ、内側コアを残す。構造（Ｘ線回折）中には長鎖セルロース分子は顕著なレベルで存在しなかったので、この活性はベータ－１，４－グルカン構造を有するヘミセルロース部分を対象とし得ると考えられる。したがって、ヘミセルロースが、ナノ粒子の中央／中間及び外層に配置される構成要素の主要部を形成し得ることが想定される。
コア構造を、トリプシンで処理した後に観察した。トリプシン処理も外及び中間層の溶解を生じ、球状のペクチンベースの内側コアを残す。したがって、外及び中間層の両方とも、タンパク質／ペプチドを含有し得る。
ホモガラクツロナンに対して上昇した抗体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの間にナノファイバーに対して強い反応を示した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥはナノ粒子におけるアントシアニン、ペプチド、及びペクチンの存在を明らかにしたが、ナノファイバーはアントシアニンを欠く。抗体がナノ粒子の内部に達することができない可能性があり、したがって弱い反応が得られることが推測される。このことは、ホモガラクツロナンがナノファイバー中で曝露される可能性があり、抗体と強い交差反応性を生じることも示す（ドットブロット、図１２）。
エクステンシンに対して上昇した抗体との交差反応性がナノ粒子及びナノファイバーの両方とも非常に低かったことは（ドットブロット、図１２）、エクステンシン起源ペプチドがナノ粒子とナノファイバーのいずれかにおいても顕著なレベルで存在していないことを示唆している。
対照的に、強い反応性がヘミセルロースタンパク質（アラビノガラクタンタンパク質）に対して上昇した抗体に対して観察され、これがナノ粒子の外層の主要な成分である可能性及びナノファイバーの構成要素としての可能性を示唆している。
特定の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、１又は２以上の生物学的に活性な薬剤、例えば、薬物、栄養分、生体分子（すなわち、タンパク質、酵素、核酸）、栄養補助食品、又は他の医薬剤をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、ナノ粒子と複合体を形成していてもよい、又は化学的にコンジュゲートされていてもよい。特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、ナノ粒子形成の間又は後に、ナノ粒子に導入されて（及び複合体を形成する若しくはコンジュゲートされて）いてもよい。
別の実施形態では、がんマーカーに特異的なターゲティング抗体とコンジュゲートされる、本明細書に記載のナノ粒子を含む標的化ナノ粒子が本明細書に提供される。特定の実施形態では、ターゲティング抗体が、がん細胞への標的化ナノ粒子のターゲティングのためのＰＤ－Ｌ１抗体を含んでもよい。特定の実施形態では、標的化ナノ粒子が、少なくとも１つの細胞傷害性薬若しくは抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。特定の実施形態では、標的化ナノ粒子が、パクリタキセル、ドキソルビシン、若しくはその両方と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
別の実施形態では、抗菌剤と複合体を形成している若しくはコンジュゲートされている、本明細書に記載のナノ粒子を含む、抗菌性ナノ粒子が本明細書に提供される。特定の実施形態では、抗菌剤が、リゾチーム、テトラサイクリン、若しくはナイシン、又はその任意の組合せを含んでもよい。特定の実施形態では、抗菌性ナノ粒子が、ＭＤＲ細菌感染の治療又は予防に使用するためであってもよい。
ナノ粒子を調製するための方法：
一実施形態では、均質化した植物組織からナノ粒子（例えば、本明細書に記載されるもの、等々）を調製するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
植物組織から遊離される細胞成分を含む、溶液中で均質化した植物組織を提供すること；
存在する場合、細片を均質化した植物組織から除去すること；及び
任意で、均質化した植物組織を透析して、複合体を形成していない化合物を除去すること、又はサイズ排除によって複合体を形成していない化合物を除去すること、
それによって、細胞成分の自己組織化によって形成される、ナノ粒子を含む溶液を提供することを含む。
特定の実施形態では、溶液が、任意の適切な媒体を含んでもよい。典型的には、溶液が水又は水性媒体を含んでもよいが、特定の実施形態では、水及び混和性の有機溶媒、例えば、限定されないが、エタノール及び／又はメタノールを含んでもよい１又は２以上のアルコール、１又は２以上のケトン、例えば、アセトン、ジメチルスルホキシドを含んでもよい１又は２以上の溶媒、その別々の又は任意の適切な組合せのいずれかであってもよい又は含んでもよい。
特定の実施形態では、細片が、透析、均質化した植物組織を濾過すること、均質化した植物組織を遠心分離すること、又は均質化した植物組織にタンジェンシャルフロー濾過又は連続フロー濾過を行うこと、又はその任意の組合せによって除去されてもよい。特定の実施形態では、細片を除去するステップが、均質化した植物組織を濾過すること、又は均質化した植物組織を遠心分離すること、又はその両方を含んでもよい。特定の実施形態では、細片が１つ又は組合せの技術によって除去されてもよく、これには、遠心分離（例えば、単純又は連続フロー遠心分離）及び／又は膜濾過（例えば、透析、適したカットオフ、例えば、１～１００μｍの膜を使用する遠心分離）、タンジェンシャルフロー濾過、サイズ排除のためのカラム分離などを、個々に又はそのような技術の組合せを関与させることのいずれかが含まれ得る。特定の実施形態では、約９０００～１２０００ｇでの遠心分離がほとんどの細片を沈降させ得る、又は１００ミクロンフィルターを通した濾過が細片の適切な除去を提供し得る。
特定の実施形態では、透析するステップが（行われる場合）、水（又は別の水溶液、ただし水が好ましい）に対する単純な透析を使用して行われてもよいが、これが市販の大規模生産よりも実験室規模に対してより容易に使用され得る。したがって、特定の実施形態では、透析／分離が、連続遠心分離、タンジェンシャルフロー濾過を使用して行われてもよい、又は十分に微細な粒子を作製することによって省略してもよく、透析分離が（例えば、高剪断力ホモジナイザー（例えば、ソノレーター）又はマイクロフリューダイザーなどの機器を使用して）省略されてもよい。
特定の実施形態では、細片の除去された清澄化されたホモジネートが、ナノ粒子に組み込まれないより低分子が除去され得る膜濾過技術を使用してさらに精製されてもよい。これには、例えば、１００，０００ＭＷカットオフ透析バッグを水に対して使用する、又はホモジネートをタンジェンシャル濾過（クロスフロー濾過）に類似するカットオフサイズの適切な膜を通して供する単純な透析、又はナノ粒子が濃縮され得る手段によって撹拌されるセル（例えば、Amicon、又は類似する設定）を使用する膜を通過させる濾過などが含まれ得る。或いは、類似する排除限界（１００，０００ＭＷ）のサイズ排除カラムが使用されてもよく、ここではナノ粒子が溶媒（水又は低モル濃度（例えば、１ｍＭ等）の緩衝液をｐＨ約４～５）を使用して空隙容量に溶出される。そのような操作は、好ましくは約４℃で実施されてもよい。
特定の実施形態では、方法が、ナノ粒子を含む溶液を、脱水、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライに供するステップをさらに含んでもよい。
特定の実施形態では、方法が、適切な条件下で自己組織化によるナノ粒子を形成することを伴ってもよい。特定の実施形態では、例えば、条件が、約４℃～約４０℃、好ましくは、約１５℃～約３５℃の範囲の温度であってもよい。特定の実施形態では、条件が、水中、又は水混和性の有機溶媒、例えば、（限定されないが）メタノール若しくはエタノールと水の混合物中であってもよい。特定の実施形態では、均質化によって植物組織から遊離される細胞成分がナノ粒子に自己組織化する可能性がある条件が、約１５～１００％ｖ／ｖの水、より好ましくは約３０～約１００％ｖ／ｖの水、及び最も好ましくは約１００％ｖ／ｖの水である溶液中であってもよい。自己組織化が水性又は実質的に水溶液において生じる場合、特定の実施形態では、植物組織として、又は植物組織の一部として、未熟の果実を使用するときに、ポリガラクトウロナーゼなどの熟成環境中に一般に存在する酵素が、特に自己組織化を援助するために、混合物に添加されてもよいことが企図される。特定の実施形態では、例えば、自己組織化が生じる可能性がある条件が、実質的に水性の媒体等中であってもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子の作製が、適切な媒体を使用して本明細書に記載の手順によって達成されてもよい。典型的には、媒体が水又は水性媒体であってもよいが、特定の実施形態では、水及び混和性の有機溶媒、例えば、限定されないが、エタノール及び／又はメタノールを含んでもよい１又は２以上のアルコール、１又は２以上のケトン、例えば、アセトン、ジメチルスルホキシドを含んでもよい１又は２以上の溶媒、その別々の又は任意の適切な組合せのいずれかであってもよい又は含んでもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子の自己組織化が、先に記載の媒体の１つに生じてもよい。自己組織化のための条件が、任意の熱力学的に可能な条件を含んでもよい。特定の実施形態では、自己組織化のための条件が、例えば、約４℃～約３０℃の温度、一般に生理的に見出される濃度と一致するイオン濃度（すなわち、マイクロモルからミリモルレベル）、及び約５～１０パーセント（ｗ／ｖ）の範囲の糖濃度、及びミリモル範囲で存在する天然有機酸等を含んでもよい。
特定の実施形態では、方法が、実質的に水性の媒体において自己組織化によるナノ粒子を形成することを伴ってもよい。典型的に、上に記載される方法では、透析を約４℃で一晩行ってナノ粒子組織化を促進してもよい。透析が室温で実施される場合、大気の混入物の混入のリスクが増加し得る。特定の実施形態では、ナノ粒子をＧＭＰ条件下で調製し、純粋なナノ粒子を、特に医療適用に、例えば、医療薬がナノ粒子に添加される適用に提供し得る。特定の実施形態では、均質化した植物組織（すなわち、ホモジネート）が、約１ｇ組織に対して１又は２ｍｌの水の比に調製されてもよい。組織は、典型的には既に８０～９０％が水である。これらの条件は、出発物質の特性に基づいて変動してもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子が、均質化の方法の間に、また引き続いて、例えば、（行われる場合）透析の間に、形成される又は形成し始めてもよい。特定の実施形態では、約８０％ナノ粒子又はそれ以上を含有するナノ粒子溶液が得ることができる。特定の実施形態では、温度を一般に低く、例えば、約４℃で保って、望ましくない分解を予防してもよい。
上記方法の別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を提供するステップが、植物組織を水性又は有機性媒体（例えば、限定されないが、水、エタノール、メタノール、又はアセトン、又はその混合物等を含む、水性又は有機性媒体（又はその混合物））中で均質化することを含んでもよい。特定の実施形態では、均質化した植物組織が、ポリトロン又はソノレーターなどを使用する超音波処理によって調製されてもよい。さらに別の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を提供するステップが、植物組織を、例えば、水、エタノール、メタノール、又はアセトンのいずれか１又は２以上を含む、水性又は有機性媒体中での高剪断均質化及び／又はソノレーションに供することを含んでもよい。特定の実施形態では、高剪断均質化が、例えば、約３０００～５０００ｒｐｍで、直径約２０ｃｍを有するブレードで約８０ｋＮ等での均質化を含んでもよい（当業者は、本明細書の教示を考慮して、特定の適用に合わせるために、適切な高剪断均質化条件を認識する）。例えば、超音波処理及び／又はキャビテーションが使用され得る場合、ナノ粒子が使用される条件によって引き離されないように剪断力を選択してもよい。特定の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織の、達成すべきサイズ範囲が、約５０～約２５０ｎｍ等であってもよい。特定の実施形態では、例えば、ポリトロンを約６～７の割合に設定し、３０秒のパルス、約３サイクルを使用して使用してもよい。
例として、均質化した植物組織が、特定の例示の実施形態では、植物組織、例えば、サクランボ果実を含んでもよく、これはブレンダーで約４５００ｒｐｍで約５分間均質化され、次にポリトロンで約５分間の微細均質化にさらに供されている。結果として生じるスラリーを、次に約４層のチーズクロスを通して濾過し、約１０，０００ｘｇで遠心分離して細片を除去してもよく、上清を収集してもよい。上清を、水に対して約１０，０００Ｄカットオフの透析バッグにおいて透析して低分子量成分を除去してもよい。透析後、溶液をフリーズドライ又はスプレードライしてナノ粒子を粉末形態で得てもよい。
特定の実施形態では、分散剤を作製するために、加速された流体フロー、超音波キャビテーション、及び乱流を用いる、ソノレーターが使用されてもよい。ナノ粒子の場合では、相対的に低圧システムが好ましい場合があるため、これに応じてポンプの選択が行われ得ることが企図される。ソノレーターは、Sonic Corporation社、Stratford、Connecticut (www.sonicmixing.com)の製品である。
さらに別の実施形態では、均質化した植物組織から本明細書に記載のナノ粒子を調製するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
植物組織から遊離される細胞成分を含む、溶液中で均質化した植物組織を調製すること；
細胞成分の自己組織化によるナノ粒子の形成を可能にすること；
存在する場合、細片を均質化した植物組織から除去すること；及び
フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライして、ナノ粒子を含む粉末を形成することを含む。
例として、特定の実施形態では、スプレードライするステップが、例えば、水を異なる能力で蒸発させることができる、Fujisaki4ノズルスプレードライシステム（DAIICHI JITSUGYO (AMERICA)社 (DJA)939 A.E.C.Drive、Wood Dale、IL 60191、USA）を用いてもよい。そのようなパイロットスケールモデルの１つ（MDL150）は、例えば、１時間当たり約１０ｋｇの水を蒸発させることができ、１日当たり約２００リットルのホモジネートをスプレードライすると推定される能力を有し、１日当たり約４０ｋｇのＮＰ又は食物粉末を回収する。
特定の実施形態では、植物組織が、例えば、スミノミザクラを含む、上記方法が使用されてもよい。スミノミザクラが上記方法で特に良好に働き、これがナノ粒子を含む粉末を形成させる前の透析ステップの性能を必要としないことが発見された。
上記方法の特定の実施形態では、自己組織化が、実質的に水性の媒体において生じ得る。特定の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を、水性又は有機性媒体中での高剪断均質化に供することを含んでもよい。特定の実施形態では、細片を除去するステップが、均質化した植物組織を濾過すること、又は均質化した植物組織を遠心分離すること、又はその両方を含んでもよい。
特定の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子が、カーゴ、例えば、生物活性薬剤又は所望の別の剤を送達するため使用されてもよいことが企図される。本明細書に記載のナノ粒子は、例えば、フリーズドライ又はスプレードライした場合にサイズが拡大し得ること、及び次に水溶液又は水中に配置された場合にサイズが縮小し得ることが観察されている。したがって、特定の実施形態では、ナノ粒子の乾燥した又は実質的に乾燥した粉末又は他の調製物が、特定のカーゴと混合され、次に水又は水溶液が添加されてナノ粒子を縮小させ、それによって、カーゴをナノ粒子に、その送達のためにトラップされてもよいことが企図される。実験研究では、ナノ粒子溶液がＳＥＭ下で観察された場合に、５０～２５０ｎｍ直径構造を与え（真空乾燥効果）、これらはＴＥＭ及びＳＥＭからのデータによると約４～５倍大きな直径のシェル形状構造を有することが観察されており、乾燥の際のそのようなサイズ拡大の例を提供している。
特定の実施形態では、別の部分、例えば、生物学的に活性な薬剤と複合体を形成する若しくはコンジュゲートされるナノ粒子について望ましい場合、本明細書に記載のいずれかの方法が、部分（すなわち、生物学的に活性な薬剤）を、溶液中で均質化した植物組織に又は既に形成されたナノ粒子に、ナノ粒子と複合体を形成する部分に対して適切な又はナノ粒子と化学的に連結される又はコンジュゲートされる条件下で、導入する追加のステップをさらに含んでもよい。
特定の実施形態では、例えば、化学的なコンジュゲーションが、ナノ粒子に存在する官能基（すなわち、－ＮＨ２、－ＣＯＯＨ、－ＯＨ）及びコンジュゲート剤に適合される手順を使用して達成されてもよい。例えば、以下の実施例３でDylightを使用したが、色素をタンパク質の－ＮＨ２部分を標識化するため使用される反応基である、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを使用して活性化した。化合物のＮＨＳエステルは、アクセプター（すなわち、ナノ粒子、ナノファイバー含有ペプチド）の第一級アミンと反応し、安定な共有結合アミド結合を形成し、ＮＨＳ基を放出する。理解されるように、同じ又は異なる官能基での結合のための他のカップリング又は架橋剤も、利用可能（例えば、Thermofisher Scientific社）である。
好ましい実施形態では、ナノ粒子及び／又はナノファイバーは、推奨される通り（Thermofisher scientific社）、リン酸緩衝食塩水に溶解及びホウ酸緩衝液（０．６７Ｍ）と混合して、２ｍｇ／ｍｌの濃度レベルを提供してもよい。活性化標識剤（ＮＨＳエステル）と完全に混合した後、混合物を２５℃で１時間インキュベートしてもよい。コンジュゲートされた産物（ＮＰ／ＮＦ）を含有する混合物は、製造者によって供給されるサイズ排除カラム又はスピンカラムを使用して分離してもよい。コンジュゲートされたＮＰ／ＮＦは、空隙容量に溶出され得る。コンジュゲートされた産物は、凍結乾燥され、例えば、乾燥した粉末として－２０℃で保存されてもよい（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Nour Karra and Simon Benita* (2012) The Ligand Nanoparticle Conjugation Approach for Targeted Cancer Therapy; Current Drug Metabolism,2012,13,22-41を参照されたい）。
ナノファイバー及びその作製のための方法
ナノファイバー
ナノファイバーも開発されており、本明細書に記載される。ナノ粒子及びナノファイバーは両方とも植物組織から調製され得るが、これらの２つのナノ構造は著しく異なる方法を使用して本明細書で調製されており、これらの２つのナノ構造が著しく異なる構造を採ること、組成の点で有意に異なることを特色とすること、機能及び／又は生物学的効果の点で興味深い差（及び類似性）を特色とすることが本明細書で見出されている。
したがって、均質化した植物組織に由来する自己組織化した細胞成分を含むナノファイバーも本明細書に記載される。上に記載されるナノ粒子と比較して、ナノファイバーは、いくつかの様式で、特にナノファイバーがポリフェノールが抽出される又は既に天然で低ポリフェノール含有量である均質化した植物組織に由来することで異なる。特定の例では、細胞成分が均質化によって植物組織から遊離される成分を含んでもよく、これがナノファイバーに自己組織化する。特定の例では、１又は２以上の細胞成分には、ペクチンが含まれ得る。特定の例では、ナノファイバーが、１又は２以上のヘミセルロース由来分子、１又は２以上の細胞壁タンパク質に由来するペプチド、又はその両方を含んでもよい。
一実施形態では、均質化した植物組織に由来する自己組織化した細胞成分を含むナノファイバーであって、細胞成分が１又は２以上の構造炭水化物又はその切断産物を含み、脂質及びポリフェノールがナノファイバーの構造成分ではない、ナノファイバーが本明細書に提供される。
本明細書に記載するように、本発明に記載のナノファイバーは、例えば、本明細書に詳細に記載されるナノ粒子を調製するために使用されてもよい（例えば、上記を参照されたい）、一般に任意の適切な植物組織で調製されてもよく、ただし、ポリフェノールは最初に抽出されており、さもなければ低い又は減少したレベルで植物組織中に見出される。特定の実施形態では、ナノファイバーの自己組織化、細胞成分、構造炭水化物又はその切断産物、及び脂質含有量は、本明細書に詳細に記載されるナノ粒子のものと実質的に類似してもよく（ただし、ポリフェノールがナノファイバーにおいて構造上の役割を果たしていない場合を除く）ナノ粒子とは大きく異なる構造及び構成を採るナノファイバーを生じる。
特定の実施形態では、ナノファイバーが、実質的に脂質を含まないか、実質的にポリフェノールを含まないか、又はその両方であってもよい。
特定の実施形態では、ナノファイバーが、少なくとも１つの構造炭水化物を含む、或いは少なくとも１つの構造炭水化物で作製される１又は２以上の鎖を含む伸長した繊維を含んでもよい。特定の実施形態では、基礎のナノファイバーが、マイクロメートルの長さで直径約５～約１０ｎｍを有する伸長した繊維を含み得る（図３７、左及び右パネルを参照されたい）。これらの繊維は、トリプシン処理後のナノ粒子から放出される繊維と相同と考えられる（図４、パネル、Ｄ、Ｅを参照されたい）。そのような繊維様構造は、乾燥したナノファイバーが走査型電子顕微鏡で試験される場合にも観察される（図７、パネルＡを参照されたい）。特定の実施形態では、ナノファイバーは、ナノ粒子のエタノール脱色の産物と考えられ得る。ナノファイバーはらせん状に巻きついた構造としても観察されており（図２、パネルＣを参照されたい）、ナノ粒子のペクチンコアを囲む高分子をその潜在的な起源とすることを示している。
特定の実施形態では、ナノファイバーが、ペクチン、ヘミセルロース、ペプチド及び／若しくはタンパク質、有機酸、その切断産物、又はその任意の組合せを含んでもよい。特定の実施形態では、有機酸が、リンゴ酸、アスコルビン酸、又はその両方を含んでもよい。
特定の実施形態では、細胞成分が、熟成の間又は熟成した果実の均質化の間の植物組織から遊離されるものを含んでもよく、これはナノファイバーに自己組織化することができる。
特定の実施形態では、１又は２以上の構造炭水化物が、１又は２以上のペクチン、ペクチン酸、ペクチンのメチルエステル、ペクチン誘導体、ポリガラクツロン酸、ラムノガラクツロナン、キシログルカン、ヘミセルロース；グルコース、マンノース、若しくはキシロースのβ－（１→４）－連結骨格を保持するキシログルカン；及び／又はアラビノガラクタン、及び／又はその切断産物を含む。
特定の実施形態では、ナノファイバーが、例えば、直径約５～約１０ｎｍを有する繊維形状を有してもよい。特定の実施形態では、ナノファイバーが、非結晶性であってもよい。
特定の実施形態では、ナノファイバーが、水素結合相互作用によって安定化され、植物組織の細胞成分の異化作用に由来する高分子の間で形成され、ヒドロキシル基及び／又はアミノ基及び／又は有機酸基を保持していてもよい。
特定の実施形態では、ナノファイバーが、生物学的に活性な薬剤をさらに含んでもよい。例として、特定の実施形態では、本明細書に記載のナノファイバーは、１又は２以上の生物学的に活性な薬剤、例えば、薬物、栄養分、生体分子（すなわち、タンパク質、酵素、核酸）、栄養補助食品、若しくは他の医薬剤をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、ナノファイバーと複合体を形成している又は化学的にコンジュゲートされていてもよい。特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、ナノファイバー形成の間又は後に、ナノファイバーに導入されて（及び複合体を形成している又はコンジュゲートされて）いてもよい。特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、薬学的な活性薬、タンパク質、酵素、栄養補助食品、若しくは栄養分であってもよい又は含んでもよい。
特定の実施形態では、ナノファイバーが、一般的に任意の適切な形態、例えば、上記ナノ粒子を参照して記載されるもので提供されてもよい。特定の実施形態では、ナノファイバーが、水溶液、粉末形態、又は脱水、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライ、若しくはナノスプレードライ形態等で提供されてもよい。
特定の実施形態では、ナノファイバーを調製するために使用される植物組織が、低ポリフェノールである又はポリフェノールが抽出若しくは除去されている、果実又は野菜植物組織を含んでもよい。特定の実施形態では、植物組織が、老化果実、熟成野菜、又はその任意の組合せを含んでもよい；好ましくは、植物組織が、低ポリフェノール含有量である及び／又はポリフェノールが除去若しくは減少してている、サクランボ（例えば、スミノミザクラ）、ブルーベリー、ブドウ、モモ、ネクタリン、プラム、アンズ、パパイア、トマト、又はその任意の組合せを含む。特定の実施形態では、植物組織が、低ポリフェノール含有量である及び／又はポリフェノールが除去若しくは減少している、果皮及び／又は果実の外組織（例えば、カカオの場合等）を含んでもよい。
特定の例では、ナノファイバーが、直径約５～約１０ｎｍ及びマイクロメートル範囲の長さを有する糸状又は繊維構造を有してもよい。特定の例では、ナノファイバーが、１又は２以上の生物学的に活性な薬剤をさらに含んでもよい。特定の例では、生物学的に活性な薬剤が、ナノファイバーと複合体を形成している、コンジュゲートされている又は混合型であってもよい。例示の例として、生物学的に活性な薬剤が、薬学的な活性薬、栄養補助食品、又は栄養分であってもよい。特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、１又は２以上のがん薬、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及び／若しくはビンブラスチン；１又は２以上の金属、例えば、鉄、マグネシウム、セレン、及び／若しくは亜鉛；１又は２以上の栄養補助食品、例えば、ボスウェリア、ウィタノライド（Withanolides）、アンノナシン、テトラサイクリン、例えば、バンコマイシン、及び他の抗菌剤、例えば、ナイシン（nicin）、リゾチーム、並びに疾患及び細菌性の食品汚染を制御するため使用される類似する特性を有する他の分子を含んでもよい。
特定の例では、ナノファイバーが、水溶液、粉末形態、又は脱水、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライ、若しくはナノスプレードライ形態等で提供されてもよい。
特定の実施形態では、ナノファイバーが、例えば、食物と共に摂取されるカプセルとして又はナノファイバー栄養補助食品複合体（例えば、ボスウェリア、クルクミン、アシュワガンダなど、追加の例についてナノ粒子及び／又は食物粉末に関連して本明細書に提供される例を参照されたい）として提供されてもよい。
例として、均質化した植物組織が、特定の例示の実施形態では、植物組織（例えば、サクランボ果実）を含んでもよく、これが約９５％エタノール（１：１ｗ／ｖ）に約２４～４８時間浸漬されることによって低分子量成分（ポリフェノールを含む）の実質的な除去又は枯渇に供され、その後、溶液がデカントされ、果実がエタノールに別の４８時間さらにインキュベートされ、大多数又は実質的に全ての色成分（すなわち、アントシアニン）が除去されてもよい。果実組織は、次に水で約２４時間（等容量の水において２ｘ～３ｘ）徹底的に洗浄されてもよい。果実組織は、次に、ブレンダーで約４５００ｒｐｍで約５分間均質化され、次にポリトロンでの約５分間の微細均質化にさらに供されてもよい。結果として生じるスラリーを、次に約４層のチーズクロスを通して濾過し、約１０，０００ｘｇで遠心分離して細片を除去してもよく、上清を収集してもよい。上清を、水に対して約１０，０００Ｄカットオフの透析バッグにおいて透析して低分子量成分を除去してもよい。透析後、溶液をフリーズドライ又はスプレードライしてナノファイバーを粉末形態で得てもよい。
或いは、特定の実施形態では、果実組織が、ジュースを分離するための、コールドプレスに供されてもよい。したがって、得られる搾りかすが、色成分の除去に供され、次にエタノール中でのインキュベーションに供され、色成分（例えば、アントシアニン、及びナノ粒子の炭水化物及びペプチドと水素結合し得る他のポリフェノール）が除去されてもよい。水和させた後、組織は、上に記載されるように、均質化され、処理されてもよい。
またさらなる例では、ナノファイバーが調製される植物組織が、果実又は野菜植物組織を含んでもよい。特定の例では、植物組織が、サクランボ、ブルーベリー、ブドウ、又はその果実の任意の組合せを含んでもよい。好ましい例として、植物組織が、スミノミザクラ果実組織を含んでもよい。
ナノファイバーの作製のための方法
別の実施形態では、均質化した植物組織からナノファイバー（例えば、本明細書に記載されるもの）を調製するための方法が、
植物組織から遊離される細胞成分を含む、低ポリフェノール含有量の溶液中で均質化した植物組織を調製すること；
存在する場合、細片を均質化した植物組織から除去すること；及び
任意で、均質化した植物組織を透析して、複合体を形成していない化合物を除去すること、又はサイズ排除によって複合体を形成していない化合物を除去すること、
それによって、細胞成分の自己組織化によって形成される、ナノファイバーを含む溶液を提供することを含む。
特定の実施形態では、脱色した植物組織は、単純な遊離性の可溶性分子が、それらを水と高度に混和性の有機溶媒を使用して組織から抽出することによって除去された組織と一般に考えられ得る。これには、溶媒、例えば、エタノール、メタノール、アセトンなどが含まれ得る。これらの溶媒は、細胞区画を破壊することが可能であり、ほとんどの遊離分子、例えば、アントシアニン、糖、有機酸などの脱水媒体への浸出を可能にする。スクロース溶液を使用する浸透圧脱水は、対照的にほとんどの水を引き出し、成分を果実に残す。本明細書に記載の脱色は、組織の色の欠損を指し、酸化プロセスではない。
別の実施形態では、均質化した植物組織からナノファイバーを調製するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
植物組織から遊離される細胞成分を含む、低ポリフェノール含有量の溶液中で均質化した植物組織を調製すること；
存在する場合、細片を均質化した植物組織から除去すること；
細胞成分の自己組織化によってナノファイバーの形成を可能にすること；及び
フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライして、ナノファイバーを含む粉末を形成することを含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載のナノファイバーを調製する方法及びそのステップは、ナノ粒子の作製のための本明細書に記載のものに実質的に類似してもよく、植物組織は低ポリフェノール含有量であってもよい、又は植物組織はポリフェノールが抽出されており、ナノファイバー形成に優位な植物組織であり得ることで区別される。
上記方法の特定の例では、ナノファイバーが、実質的に水性の媒体中での自己組織化によって形成されてもよい。特定の実施形態では、低温（すなわち、約４℃）が均質化の間に使用されてもよく、広範囲の水混和性溶媒を使用して、ナノファイバーを単離してもよいことが企図される。
上記方法の特定の例では、方法は、ナノファイバーを含む溶液を脱水、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライするステップを含んでもよい。
特定の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を、水性又は有機性媒体、又は混合された水性－有機性媒体中で均質化することを含んでもよい。特定の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を、水、エタノール、メタノール、若しくはアセトンのいずれか１若しくは２以上を含む、水性若しくは有機性媒体中での高剪断均質化及び／又はソノレーションに供することを含んでもよい。
またさらなる例では、溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織の均質化前に、植物組織を脱色して、そこからポリフェノールを除去するステップを含んでもよい。別の実施形態では、植物組織を脱色することは、抽出溶媒を用いて植物組織からポリフェノールの抽出を行うことを含んでもよい。特定の実施形態では、抽出溶液が、エタノールを含んでもよい。
別の例では、溶液中で均質化し脱色した植物組織を提供するステップが、植物組織を、水性又は有機性媒体中での高剪断均質化に供することを含んでもよい。別の例では、溶液中で均質化し脱色した植物組織を提供するステップが、脱色した植物組織を、水性又は有機性媒体中で均質化することを含んでもよい。
特定の実施形態では、細片を除去するステップが、透析、均質化した植物組織を濾過すること、均質化した植物組織を遠心分離すること、又は均質化した植物組織にタンジェンシャルフロー濾過若しくは連続フロー濾過を行うこと、又はその任意の組合せを含んでもよい。
食物粉末及び添加物、並びにその作製のための方法
食物粉末及び添加物
別の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子及び／若しくはナノファイバー、又はその一部又は成分、又はそれに関連する構造を含む食物粉末又は食品添加物が本明細書に提供される。特定の実施形態では、食物粉末が、例えば、ミクロンスケールの微細な粉末形態等を形成するナノ粒子及び／又はナノファイバーの基礎の構造成分を含んでもよい。
別の実施形態では、均質化した植物組織に由来する自己組織化した細胞成分を含む食物粉末であって、細胞成分が１又は２以上の構造炭水化物又はその切断産物を含み、少なくとも１つの栄養剤をさらに含む、食物粉末が本明細書に提供される。
特定の実施形態では、食物粉末が、互いに巻きつくナノスフェア様構造を形成する繊維構造を含んでもよい。
特定の実施形態では、本明細書に記載の食物粉末が、調製の条件下で、約１μｍ～約１０μｍのサイズの範囲の実質的に球状又は楕円形状構造を含んでもよい。特定の実施形態では、この大きい構造が、水に溶解される場合、約５０～１００ｎｍの範囲において、より小さい球状構造として散逸し得る。特定の実施形態では、食物粉末構造が、ナノ粒子及びナノファイバーに観察されるものと相同なランダムに巻きつき組織化した繊維又は複数の繊維を含み得る。特定の実施形態では、食物粉末の全体構造が、繊維の緻密な構成がない、ナノスフェアのものと類似又は相似であってもよく、繊維が、例えば、組織抽出物のホモジネートに存在するいくつかの成分を吸着する能力があり得る。
特定の実施形態では、食物粉末の１又は２以上の栄養剤が、食物粉末の上に記載される繊維性ナノスフェア構造との複合体を形成していてもよく、食物粉末形成及び／又は結果として生じるその構造に寄与し得る。
特定の実施形態では、食物粉末が、疎水性成分をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、疎水性成分が、アーモンドミルク、ココナツミルク、及び／若しくは食用ナッツに由来するミルクを含んでもよい、又はアーモンドミルク、ココナツミルク、及び／若しくは食用ナッツに由来するミルク中に提供されてもよい。
特定の実施形態では、栄養剤が、健康効果を有する天然に存在する活性成分を含んでもよい。特定の実施形態では、栄養剤が、１又は２以上の成分、例えば、カロテノイド、アンノナシン、ボスウェリア、アシュワガンダのウィタノライド、ショウガ科のメンバーのジンゲロール及びショウガオール、カンナビノジオール、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イヌリン、ピペリン、及びコショウ科のメンバー、コショウ及びヒハツ（Piper longum）の誘導体又はこれらの成分及び／又はその誘導体を含有する他の野生の類縁体、若しくは健康効果を有するいずれかのその活性成分、それから単離されたいずれかの抽出物、誘導体、若しくは産物、又はその任意の組合せを含んでもよい。
好ましい実施形態では、食物粉末が、
スミノミザクラ、又はその水性抽出物；
アーモンドミルク又はアーモンドの別のホモジネート；
豆乳、又はダイズの別のホモジネート；
ブロッコリー、又はその水性抽出物；及び
ウコン、又はその粉末を含んでもよい。
特定のさらに好ましい実施形態では、食物粉末が、
約２５～３０ｖ／ｖ％スミノミザクラ抽出物（少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌのポリフェノール当量）；
約２５～３０ｖ／ｖ％アーモンドミルク又はアーモンドの他のホモジネート；
約１０～１８ｖ／ｖ％豆乳又はダイズの他のホモジネート；
約２５～３０ｖ／ｖ％ブロッコリー抽出物；及び
約０．５～２．５ｗ／ｖ％ウコン又はその粉末を含んでもよい。
上記食物粉末例は、ブロッコリー又はダイズのにおいがしない、審美的に良好な産物を提供するために設計された。様々な他の成分、成分の組合せ、及び成分の相対的な割合も、本明細書に企図されることが理解される。
特定のさらなる実施形態では、スミノミザクラ抽出物が、約１～２ｍｇ／ｍｌポリフェノール当量であってもよい。
特定の実施形態では、スミノミザクラ抽出物が、乾燥した果実まるごと、果実搾りかすから商業的に作製された１又は２以上の果実粉末、又はスプレードライによって果実ジュースから作製された粉末、又は所望の別の商業的に利用可能な果実粉末と組み合わされてもよい、又は置き換えられてもよい。特定の実施形態では、例えば、新鮮な果実というよりむしろ、乾燥され、ミクロンサイズに粉末化された果実を使用して再水和及び均質化してもよい。
本明細書に記載するように、本発明に記載の食物粉末は、本明細書に詳細に記載されるナノ粒子及び／又はナノファイバーを調製するために使用されてもよい、一般に任意の適切な植物組織で調製されてもよい。特定の実施形態では、食物粉末が、本明細書に記載される炭水化物ベースのナノ粒子又はナノファイバーを形成することができる果実、野菜又は別の植物組織又は産物から調製されてもよいが、理解されるように、食物粉末は、異なる構成、例えば、よりナノスフェア様の構造を有してもよい。食物粉末は、水性、有機性、又はその組合せを含む、任意の適切な媒体において調製されてもよい。食物粉末は、特定の実施形態では、栄養剤又は栄養含有物質（又は栄養分）をさらに含んでもよく、それは食物粉末製品（典型的には、食物粉末の意図する適用のために調整される）に含まれることが所望され、また重量又は容量で、新鮮な、処理された、又は濃縮された粉末を単独又は任意の所望の組合せのいずれかで含んでもよい。
特定の実施形態では、本明細書に記載される食物粉末が、既に本明細書に詳細に記載されるナノ粒子及び／又はナノファイバーを調製するのに適切な植物組織から、栄養剤又は栄養含有物質と組み合わせて調製されてもよい。理解されるように、栄養剤又は栄養含有物質は、典型的には、食物粉末の意図する適用のために調整され、また重量又は容量で、新鮮な、処理された、又は濃縮された粉末を単独又は任意の所望の組合せで含んでもよい。特定の実施形態では、食物粉末が、栄養剤又は栄養含有成分又は特定の生理的状態（例えば、慢性状態等）に対処するために標的化される成分と共に開発され、そのような栄養剤又は栄養含有物質が予防及び／又は治療特性等を有し得る。理解されるように、本明細書に使用される栄養剤又は栄養分の用語には、特定の適応症に適した、任意の適切な活性薬剤又は化合物（又は前記活性薬剤又は化合物を含む物質）が含まれてもよく、また典型的に栄養分として考えられる実体、例えば、食物に見出されるものに限定されない。例として、特定の実施形態では、栄養分には、健康効果を有する任意の適切な天然（又は非天然）成分が含まれ得る。特定の実施形態では、植物組織が、果皮及び／又は果実の外組織（例えば、カカオの場合等）を含んでもよい。
特定の実施形態では、食物粉末が、以下を含んでもよい。
１．本明細書に記載される炭水化物ベースのナノ粒子又はナノファイバーを形成することができるスミノミザクラ（又はスミノミザクラ抽出物）、又は別の果実又は野菜（又はその抽出物）；
２．疎水性分子を追加の物質から組み込むことができる疎水性成分（例えば、限定されないが、アーモンドミルク）（他の例はココナツミルク、又は食用ナッツに由来するミルク等）；及び
３．例えば、食物粉末の所望の適用のために調整される１又は２以上の生理活性の成分／複数の成分を含有する栄養含有物質（例えば、機能的な食物抽出物等）。
栄養含有物質のいくつかの非限定的な例には、以下の１又は２以上の活性化合物及び／又は植物ファミリーが含まれ得る。
カロテノイド（すなわち、ベータカロチン、リコペン、ルテイン及び他のキサントフィル、アスタキサンチンなど）；
アンノナシン（すなわち、抗がん特性を有するアンノナ果実に由来するポリケチド）；
ボスウェリア（クルクミンと協同して作用することが可能であり、追加の抗炎症性機能を提供する）；
アシュワガンダ（抗ストレス、及びがん予防特性を有するウィタノライドを含有するハーブ成分、主にステロイド構造を有する）；
例えば、食用ショウガ、マンゴージンジャー（クルクマアマダ）及びジンゲロール及びショウガオールを含むいくつかの生理活性成分を含有するその他のものを含み得るショウガ科のメンバー；クルクマロンガ（すなわち、クルクミンを含有するウコン）；
カンナビノジオール（幻覚誘発活性のないアサ属種の医薬活性成分である）；
プレバイオティック含有量を増強するための、フラクトオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖並びにエレサレムアーティチョークからのイヌリン；
コショウ科のメンバー、例えば、コショウ及びピペリンを含有するその野生の類縁体及びいくつかの誘導体；及び／又は
これまで上に列挙されていない、任意の他の適切な成分（例えば、限定されないが、植物に由来するもの）；
及び／又は、それから単離された任意の抽出物、誘導体、産物、又はそのような成分を含有する物質又は植物組織。
食物粉末及び添加物の作製のための方法
別の実施形態では、均質化した植物組織から食物粉末を調製するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
植物組織から遊離される細胞成分を含み、細胞成分が、１又は２以上の構造炭水化物又はその切断産物を含み、溶液中で均質化した植物組織が、少なくとも１つの栄養剤をさらに含む、溶液中で均質化した植物組織を調製すること；
任意で、存在する場合、細片を溶液中で均質化した植物組織から除去すること；及び
溶液中で均質化した植物組織をフリーズドライ、凍結乾燥、スプレードライ、又はナノスプレードライして、食物粉末を形成することを含む。
適切な植物組織及び栄養剤の例は、先に詳細に記載されている。
上記方法のさらに別の実施形態では、均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を水性媒体、有機性媒体、又は混合された水性－有機性媒体中で均質化することを含んでもよい。特定の実施形態では、食物粉末が、溶液中の食物粉末出発物質の均質化によって調製されてもよい。例えば、均質化は、ブレンダー（好ましくは、高ｒｐｍで操作され、高い剪断力を発生することができる）、又は高性能の混合することができる任意の他の適切な機器、例えば、ソノレーターを使用して達成されてもよい。
特定の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織を濾過して細片を除去してもよい、又は細片を均質化した混合物から別のやり方で除去してもよい。例として、細片（すなわち、ホモジネートに入らず、重力下で沈殿する粒子状物質）を濾過することができる遠心デバイス又は濾過デバイス（例えば、膜濾過デバイス、又はタンジェンシャルフロー濾過デバイス）を使用して細片を除去してもよい。
特定の実施形態では、食物粉末が、次に脱水、凍結乾燥、スプレードライ、又はナノスプレードライされてもよい、又は別のやり方で脱水若しくは乾燥されてもよい。例として、水（又は使用されている別の溶媒）を除去することができる機器が使用されてもよく、これには、例えば、水性サンプルのためのナノスプレードライヤー又は凍結乾燥器が含まれ得る、又はより好ましくは大容量をスプレードライすることができる高効率スプレードライヤーが使用されてもよい。特定の実施形態では、ドライヤーが、減圧下で操作されてもよい。
別の実施形態では、植物組織が、果実、野菜又は植物組織を含んでもよい。さらに別の実施形態では、植物組織が、老化果実、熟成野菜、又はその任意の組合せを含んでもよい；好ましくは、植物組織が、サクランボ、ブルーベリー、ブドウ、モモ、ネクタリン、プラム、アンズ、パパイア、トマト、又はその任意の組合せを含む。特定の実施形態では、植物組織が、スミノミザクラ、アーモンド又はアーモンドミルク、ダイズ又は豆乳、ブロッコリー、ウコン、又はその任意の組合せから得られる又はそれらを含む植物組織を含んでもよい。特定の実施形態では、均質化した植物組織が、スミノミザクラ抽出物、アーモンドミルク、豆乳、ブロッコリー抽出物、及びウコン粉末を含んでもよい。適切な植物組織は、既に上に詳細に記載されている。
特定の実施形態では、溶液中で均質化した植物組織が、先に既に記載される疎水性成分をさらに含んでもよい。
さらに別の実施形態では、植物組織が、新鮮な、前処理された又は濃縮された物質、又はその任意の組合せであってもよい、１又は２以上の栄養含有物質を含んでもよい。
上記方法の特定の実施形態では、均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を、好ましくは、高ｒｐｍで操作し高い剪断力を発生させるブレンダー、ソノレーター、又は別の高性能混合デバイスで均質化することを含んでもよい。
上記方法の特定の実施形態では、細片を除去するステップが、細片を、遠心デバイスで、濾過デバイスで、膜濾過によって、タンジェンシャルフロー濾過によって、又はその任意の組合せで除去することを含んでもよい。
特定の実施形態では、植物組織が、スミノミザクラ、アーモンド又はアーモンドミルク、ダイズ又は豆乳、ブロッコリー、ウコン、又はその任意の組合せから得られる又はそれらを含む植物組織を含んでもよい。
好ましい実施形態では、方法のための出発物質が、
スミノミザクラ、又はその水性抽出物；
アーモンドミルク又はアーモンドの別のホモジネート；
豆乳、又はダイズの別のホモジネート；
ブロッコリー、又はその水性抽出物；及び
ウコン、又はその粉末を含んでもよい。
特定のさらに好ましい実施形態では、方法のための出発物質が、
約２５～３０ｖ／ｖ％スミノミザクラ抽出物（少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌのポリフェノール当量）；
約２５～３０ｖ／ｖ％アーモンドミルク又はアーモンドの他のホモジネート；
約１０～１８ｖ／ｖ％豆乳又はダイズの他のホモジネート；
約２５～３０ｖ／ｖ％ブロッコリー抽出物；及び
約０．５～２．５ｗ／ｖ％ウコン又はその粉末を含んでもよい。
特定の実施形態では、スミノミザクラ抽出物が、例えば、約１～２ｍｇ／ｍｌポリフェノール当量であってもよい。
上記食物粉末例は、ブロッコリー又はダイズのにおいがしない、審美的に良好な産物を提供するために設計された。様々な他の成分、成分の組合せ、及び成分の相対的な割合も、本明細書に企図されることが理解される。
特定の実施形態では、本明細書に記載の食物粉末を調製する方法及びそのステップが、ナノ粒子及び／又はナノファイバーを作製するための、本明細書に記載されるものと実質的に類似してもよく、少なくとも１つの栄養剤の存在が、ナノ粒子及び／又はナノファイバー構造というよりむしろ、食物粉末ナノスフェア構造の作製に優位であることで区別される。
ナノ粒子、ナノファイバー、及び食物粉末の使用
本明細書に記載のナノ粒子、ナノファイバー、及び食物粉末の企図される使用の例は、以下に記される。これらの例は、限定される対象とならないが、代わりに当業者用として意図された例示の例を提供する。以下の実施例のセクションに記される実験研究が、例示的な方法及び使用に関するさらなる詳細を提供する。
特定の実施形態では、対象又は細胞に対する本明細書の参照には、動物対象又は動物細胞が含まれ得る。特定の実施形態では、動物が哺乳動物であってもよい。特定の実施形態では、動物がヒトであってもよい。
ナノ粒子：
一実施形態では、生物学的に活性な薬剤をそれを必要とする対象に送達する方法が本明細書に提供され、前記方法が、
生物学的に活性な薬剤と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、本明細書に記載のナノ粒子を、対象に投与することを含む。
例として、特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、セレン、亜鉛、マグネシウム、及び／又は鉄であってもよい。特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、抗がん薬を含んでもよく、対象が、がんを有する対象であってもよい。特定の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル、ビンクリスチン、又はがんの治療に使用される別の天然又は合成の化合物であってもよい。特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、ナノ粒子の形成の間にナノ粒子に導入されているか、或いは生物学的に活性な薬剤がアルコール又は他の有機化合物を含んでもよい水性ベースの媒体中の既に形成されたナノ粒子と複合体を形成していてもよい。特定の実施形態では、水性ベースの媒体が、ＤＭＳＯ、若しくは緩衝液、又はその両方を含んでもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象において活性酸素種に関連する疾患又は障害を治療する方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノ粒子を対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、抗酸化剤として作用し得る。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において炎症を治療する又は減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノ粒子を対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、抗炎症剤を含んでもよい、又は抗炎症剤と順次に、同時に、又は共投与されてもよい。特定の実施形態では、抗炎症薬が、クルクミンを含んでもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において肥満を治療する又は減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノ粒子を対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、食物又は医学的な目的のために伝統的に使用される、ナッツ、マメ科植物、ハーブ、香辛料、野菜、又は真菌性の植物組織に少なくとも部分的に由来する成分を含んでもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療する又は予防するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノ粒子を対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、抗がん薬と同時に又は順次に又は共投与されてもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子が、抗がん薬と複合体を形成していてもよい、又はコンジュゲートされていてもよい。またさらなる実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
さらに別の実施形態では、対象に可溶性食物繊維を提供するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノ粒子を対象に投与することを含む。
さらに別の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子を含む、粘性を増強させる食品添加物が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において食後の血糖値を低減させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノ粒子を対象に投与することを含む。
さらに別の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子を含む化粧品が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象への局所投与のための組成物であって、組成物が本明細書に記載のナノ粒子及び生物学的に活性な薬剤を含んでいてもよい、組成物が本明細書に提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において日焼けを予防するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノ粒子を対象の皮膚に塗布することを含む。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、追加のアントシアニン又は別のＵＶ保護剤を含んでもよい、又は追加のアントシアニン又は別のＵＶ保護剤と共に塗布されてもよい。
別の実施形態では、細胞増殖を減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
細胞又は組織又は器官を、本明細書に記載のナノ粒子と接触させることを含む。
特定の実施形態では、ナノ粒子が、抗がん薬と同時に又は順次に使用されてもよい。さらに別の実施形態では、ナノ粒子が、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。さらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において肝臓におけるトリグリセリド蓄積を減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノ粒子を対象に投与することを含む。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象におけるコレステロールレベルを減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノ粒子を投与することを含む。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象における脂質代謝を改善するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノ粒子を投与することを含む。
別の実施形態では、がんマーカーに特異的なターゲティング抗体とコンジュゲートされる、本明細書に記載のナノ粒子を含む標的化ナノ粒子が本明細書に提供される。特定の実施形態では、ターゲティング抗体が、がん細胞へのナノ粒子のターゲティングのためのＰＤ－Ｌ１抗体を含んでもよい。特定の実施形態では、標的化ナノ粒子が、少なくとも１つの細胞傷害性薬若しくは抗がん薬と複合体を形成していてもよい、又はコンジュゲートされていてもよい。特定の実施形態では、標的化ナノ粒子が、パクリタキセル、ドキソルビシン、又はその両方、及び／又は別の抗がん剤、例えば、１又は２以上の経路指向性抗体（すなわち、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ）と複合体を形成していてもよい、又はコンジュゲートされていてもよい。
別の実施形態では、抗菌剤と複合体を形成している若しくはコンジュゲートされている、本明細書に記載のナノ粒子を含む、抗菌性ナノ粒子が本明細書に提供される。特定の実施形態では、抗菌剤が、リゾチーム、テトラサイクリン、若しくはナイシン、又はその任意の組合せを含んでもよい。特定の実施形態では、抗菌性ナノ粒子が、ＭＤＲ細菌感染の治療又は予防、及び／又は表層部の滅菌、例えば、食物産業、及び／又は病院等において使用するためであってもよい。
ナノファイバー：
一実施形態では、生物学的に活性な薬剤をそれを必要とする対象に送達する方法が本明細書に提供され、前記方法が、
生物学的に活性な薬剤と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、本明細書に記載のナノファイバーを、対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、亜鉛又は鉄又はセレン及びマグネシウム、又はその任意の組合せを含んでもよい。特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、抗がん薬を含んでもよく、対象が、がんを有する対象であってもよい。特定の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
特定の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、ナノファイバーの形成の間にナノファイバーが導入されているか、或いは生物学的に活性な薬剤がアルコール又は他の有機化合物を含んでもよい水性ベースの媒体中の既に形成されたナノファイバーと複合体を形成していてもよい。特定の実施形態では、水性ベースの媒体が、ＤＭＳＯ、若しくは緩衝液、又はその両方を含んでもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療する又は予防するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノファイバーを対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、ナノファイバーが、抗がん薬と同時に又は順次に又は共投与されてもよい。特定の実施形態では、ナノファイバーが、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。特定の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
別の実施形態では、対象に可溶性食物繊維を提供するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノファイバーを対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載のナノファイバーを含む、粘性を増強させる食品添加物が本明細書に提供される。
別の実施形態では、それを必要とする対象において食後の血糖値を低減させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノファイバーを対象に投与することを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載のナノファイバーを含む化粧品が本明細書に提供される。
別の実施形態では、それを必要とする対象への局所投与のための組成物であって、組成物が本明細書に記載のナノファイバー及び生物学的に活性な薬剤を含んでいてもよい、組成物が本明細書に提供される。
別の実施形態では、それを必要とする対象において日焼けを予防するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノファイバーを対象の皮膚に塗布することを含む。
特定の実施形態では、ナノファイバーが、アントシアニン又は別のＵＶ保護剤を含んでもよい、又はアントシアニン又は別のＵＶ保護剤と共に塗布されてもよい。
さらに別の実施形態では、細胞増殖を減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
任意で細胞傷害剤と複合体を形成している又はコンジュゲートされているナノファイバーを、細胞又は組織又は器官に導入することを含む。
特定の実施形態では、ナノファイバーが、細胞又は組織又は器官に特異的なターゲティング抗体と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。
特定の実施形態では、ナノファイバーが、抗がん薬と同時に又は順次に又は共投与又は使用されてもよい。特定の実施形態では、ナノファイバーが、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。特定の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象において肝臓におけるトリグリセリド蓄積を減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載のナノファイバーを対象に投与することを含む。
別の実施形態では、がんマーカーに特異的なターゲティング抗体とコンジュゲートされる、本明細書に記載のナノファイバーを含む標的化ナノファイバーが本明細書に提供される。特定の実施形態では、ターゲティング抗体が、がん細胞への標的化ナノファイバーのターゲティングのためのＰＤ－Ｌ１抗体を含んでもよい。特定の実施形態では、標的化ナノファイバーが、少なくとも１つの細胞傷害性又は抗がん薬と複合体を形成していてもよい、又はコンジュゲートされていてもよい。特定の実施形態では、標的化ナノファイバーが、パクリタキセル、ドキソルビシン、若しくはその両方と複合体を形成していてもよい、又はコンジュゲートされていてもよい。
別の実施形態では、抗菌剤と複合体を形成している若しくはコンジュゲートされている、本明細書に記載のナノファイバーを含む、抗菌性ナノファイバーが本明細書に提供される。特定の実施形態では、抗菌剤が、リゾチーム、テトラサイクリン、若しくはナイシン、又はその任意の組合せを含んでもよい。特定の実施形態では、抗菌性ナノファイバーが、ＭＤＲ細菌感染の治療又は予防に使用するためであってもよい。
食物粉末：
一実施形態では、生物学的に活性な薬剤を、それを必要とする対象又は生物に送達する方法が本明細書に提供され、前記方法が、
化学的又は物理的な方法の使用により生物学的に活性な薬剤と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、本明細書に記載の食物粉末を、対象に投与することを含む。
別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、セレン、亜鉛、鉄、及びマグネシウム等の元素であってもよい。別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、抗がん薬であってもよく、対象が、がんを有する対象であってもよい。特定の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル、ビンクリスチン、又はがんの治療に使用される任意の天然又は合成の化合物であってもよい。
別の実施形態では、生物学的に活性な薬剤が、食物粉末の形成の間に食物粉末に導入されてもよく、又は生物学的に活性な薬剤がアルコール又は他の有機化合物を含んでいてもよい水性ベースの媒体中の既に形成された食物粉末と複合体を形成していてもよい。特定の実施形態では、水性ベースの媒体が、ＤＭＳＯ、若しくは緩衝液、又はその両方を含んでもよい。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象において炎症をもたらす活性酸素種のレベルの増加に関連する疾患又は障害を治療する方法であって、
本明細書に記載の食物粉末を対象に投与することを含む方法が、本明細書に提供される。
別の実施形態では、それを必要とする対象において炎症を治療する又は減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載の食物粉末を対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、食物粉末が、抗炎症剤を含んでもよい、又は抗炎症剤と共投与されてもよい。特定の実施形態では、抗炎症薬が、クルクミンを含んでもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象において肥満を治療する又は減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載の食物粉末を対象に投与することを含む。
さらに別の実施形態では、食物粉末が、食物又は医学的な目的のために伝統的に使用される、ナッツ、マメ科植物、ハーブ、香辛料、野菜、又は真菌性の植物組織に少なくとも部分的に由来する成分を含んでもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療する又は予防するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載の食物粉末を対象に投与することを含む。
別の実施形態では、食物粉末が、抗がん薬と同時に又は順次に又は共投与されてもよい。さらに別の実施形態では、食物粉末が、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。さらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
別の実施形態では、対象に可溶性食物繊維を提供するための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載の食物粉末を対象に投与することを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の食物粉末を含む、粘性を増強させる食品添加物が本明細書に提供される。
別の実施形態では、それを必要とする対象において食後の血糖値を低減させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載の食物粉末を対象に投与することを含む。
別の実施形態では、細胞増殖を減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
細胞又は組織又は器官を、本明細書に記載の食物粉末で処置することを含む。
別の実施形態では、食物粉末が、抗がん薬と同時に又は順次に使用されてもよい。さらに別の実施形態では、食物粉末が、抗がん薬と複合体を形成していてもよい又はコンジュゲートされていてもよい。さらに別の実施形態では、抗がん薬が、パクリタキセル又はビンクリスチンであってもよい。
別の実施形態では、それを必要とする対象において肝臓におけるトリグリセリド蓄積を減少させるための方法が本明細書に提供され、前記方法が、
本明細書に記載の食物粉末を対象に投与することを含む。
別の実施形態では、抗菌剤と複合体を形成している若しくはコンジュゲートされている、本明細書に記載の食物粉末を含む、抗菌性食物粉末が本明細書に提供される。特定の実施形態では、抗菌剤が、リゾチーム、テトラサイクリン、若しくはナイシン、又はその任意の組合せを含んでもよい。特定の実施形態では、抗菌性食物粉末が、ＭＤＲ細菌感染の治療又は予防に使用するためであってもよい。
別の実施形態では、抗菌剤と複合体を形成している若しくはコンジュゲートされている、本明細書に記載の食物粉末を含む、抗菌性食物粉末が本明細書に提供される。別の実施形態では、抗菌剤が、リゾチーム、テトラサイクリン、若しくはナイシン、又はその任意の組合せを含んでもよい。特定の実施形態では、抗菌性食物粉末が、ＭＤＲ細菌感染の治療又は予防に使用するためであってもよい。
ナノ粒子及びナノファイバーの調製及び特徴付け
細胞破壊条件下でのスミノミザクラ（酸果桜桃（Prunus cerasus L.））果実における高分子のナノ粒子及びナノファイバーへの自然組織化並びにそれらの比較
本発明者らは、細胞破壊が行われ、分子相互作用が生じ得る環境を提供し、明瞭なナノ構造の形成を潜在的にもたらす特定の果実加工方法によってナノ構造が生成され得ると仮定した。本実施例は、例えば食物機能、慢性疾患予防、並びに／又は細胞への薬物及び／若しくは生理活性送達の改善における有益な役割を有し得る、異なる方法を使用した生物学的供給源（この実施例ではスミノミザクラ果実）に由来するナノ粒子及びナノファイバーの調製、単離、物理化学特性、及び構造的特徴を記載する。
この実施例では、水性媒体（又はアルコールと水の両方を含有するアルコール媒体）中でのスミノミザクラ果実の均質化と、ナノ粒子（及びポリフェノールが均質化された果実から抽出されたナノファイバー）を形成する細胞成分（例えば、タンパク質に連結したペクチン、グルカン、オリゴ糖、及び／又はそれらの分解産物）、ポリフェノール、並びに有機酸（例えばリンゴ酸）の自然組織化とを実施及び研究した。これらの研究において形成したナノ粒子は、界面活性剤安定性であり、溶液中でサイズが約２５～約５０ｎｍの範囲の一様に球状の構造であり、凍結乾燥後に脱水して粉末にした場合、サイズがはるかに大きくなる。本明細書においてナノファイバーと称す形態学的に異なる型のナノ構造も調製し、これは幅約５～約１０ｎｍ及び長さマイクロメートルのナノファイバーの形態という点で球状構造とは別個のものであり、均質化のために使用した植物組織としてのポリフェノールを欠くエタノール脱色したサクランボから生成した。複合体はペクチナーゼで処理することによって完全に破壊することができ、組成構造体のペクチン性を示した。また、セルラーゼ及びトリプシンでの処理は、ナノ粒子の外側のフィブリル状構造の除去をもたらし、内側コアを露出させた。ナノ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥはスメアとしてペクチン及びポリフェノールと同時移動する多様な質量のポリペプチドを明らかにしたが、ナノファイバーは主にポリペプチドを示した。ナノ粒子とナノファイバーの両方は、アラビノガラクタン－タンパク質複合体に対して産生された抗体に対する強い親和性、及び抗エクステンシンに対するそれよりもはるかに低い親和性を示した。ナノ粒子は抗ホモガラクツロナン及び抗キシログルカンと反応しなかったが、ナノファイバーは非常に強い反応を示した。ナノ粒子はグルコース、ガラクトース／ガラクツロン酸、及びマンノース等のヘキソース糖が富化しており、ナノファイバーはアラビノース等のペントースが富化していた。ナノ粒子及びナノファイバーのＦＴ－ＩＲスペクトルはタンパク質及びペクチンのＦＴ－ＩＲスペクトルとの類似性を示した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後に別個のバンドとして可視であった３８ｋＤのポリペプチドはグルカンエンド－１，３－ベータ－グルコシダーゼとの配列類似性を示し、２０ｋＤのポリペプチドはソーマチン様タンパク質との類似性を示した。本実施例は、スミノミザクラ果実からの自己組織化したナノ粒子の構造的特徴を、こちらもスミノミザクラ果実に由来するナノファイバーと様々に比較して記載する。
材料及び方法：
スミノミザクラ：この実施例において使用したスミノミザクラ果実は、これらを生殖質として維持するVineland Research Station、Vineland、Ontarioのものであった。全ての品種は、ポリフェノール含量が生体重１００ｇ当たり３００～５００ｍｇの範囲に及ぶ高ポリフェノール含有品種である。本研究のために使用した主要な品種はV 70151であり、その他の品種、例えばV 71261、Hymann Conserva、及びHymann Rubisnもまた高レベルのナノ粒子形成を示した。この実施例において使用したスミノミザクラは酸果桜桃であった。
化学物質は、中でもSigma Chemical社、St Louis、USA；Fisher Chemicals社；In Vitrogen社；Molecular Probes社から取得した。
ナノ粒子の調製及び単離、並びにナノファイバーの調製及び単離：
ナノ粒子に関して、抽出方法は、PTA 10プローブを備えるポリトロンホモジナイザーを使用して、１：１ｗ／ｗの割合（水又はアルコール１ｍｌに対して組織１ｇ）の媒体（この実施例において使用する場合、好ましくは水だが、例えば無水又は希釈メタノール又はエタノールを代替的に使用してもよい）中、中間（４～５）設定で、果実組織が完全に均質化するまでスミノミザクラ果実を均質化することを含んだ。ホモジネートを、４層のチーズクロスを介して濾過して、細片を除去した。結果として得たホモジネートをSorvall RC 6 Plus遠心分離機において２０分間遠心分離した（１８，０００×ｇ）。上清をデカントした。５ｍｌの上清を水（１リットル）に対して４℃で１２時間透析した（spectra-Por、６～８ｋＤのカットオフ）。透析バッグ内の透析抽出物を上清（粗抽出物と呼ぶ）と同じように－２０℃で凍結して保存した。抽出物は、水性溶液中に存在する場合、ナノ粒子を分解し得る酵素を含有する場合があるため、透析抽出物は低温で維持した。アルコール媒体又は実質的アルコール媒体を使用する複数の実施形態では、そのような酵素は変性している及び／又は低下した活性を有する可能性が高いが、依然として低温は一般に好ましい。本明細書に記載されるように、（例えば）凍結乾燥又はスプレードライすると、ナノ粒子は安定である。
水に浸出したポリフェノールは相当に希釈されたため、実験目的のためにこれを、sep-pak C18カートリッジに通しメタノールで溶出することによる疎水性相互作用クロマトグラフィーによって濃縮した。
凍結乾燥のために、透析ホモジネートを、１リットル容量を有するフラスコに入れ（約２５０ｍｌ）、液体Ｎ２中で冷却することによってシェルにした。フラスコを凍結乾燥機（この目的のために使用した－６０℃及び３～４トリチェリの真空度で操作）に取り付けた。アルコール溶液を水に対して透析してアルコールを除去した後に凍結乾燥を実行した。ナノ粒子の場合、潜在的にはナノ粒子に結合した水のために、水の完全な除去はこの方法では達成されなかったが、これは濃縮溶液を提供し得る。ナノファイバー溶液は、そのような方法を使用して透析して微細粉末にすることができる。
ナノファイバーに関して、除核したスミノミザクラ果実を５０％エタノールに、３回の溶媒交換を行いながら４８時間浸漬し、これはポリフェノールの除去をもたらし、オフホワイト色のサクランボ果実を残した（本明細書において脱色と称す）。スミノミザクラ果実の除核は溶媒との接触表面を作出し、ある特定の実施形態ではポリフェノールの除去をさらに増強するために果実をより小さなサイズの小片になおスライスし得ることが想定される。脱色した果実／スライスを水に浸漬し、水中で３回徹底的に洗浄して、エタノールを除去した（計３時間）。これらの果実を、上に記載した非脱色サクランボ抽出のために使用したポリトロンを使用して水又はメタノール（１：１ｗ／ｗ）中で均質化した。１５分間の遠心分離（１８０００×ｇ）での細片の除去後、ホモジネートを水に対して透析した。ナノファイバーを含有する透析抽出物はポリフェノールを実質的に含まず、凍結乾燥して白色の飛散性粉末にすることができた。
ナノスプレードライのために、ナノ粒子／ナノファイバー溶液を、微細スプレーを形成することができる濃さまで水で希釈した（濃い溶液は使用する噴霧器のノズルを詰まらせる傾向がある）。ナノスプレードライを、Buchi社製ミニスプレードライヤー（B290）（１０～１５ｍｌの流量を提供する３５～５０％のポンプ速度、１８０℃の入口温度、１００℃の出口温度、気流を４００リットル／時に維持）を使用して実行した。結果として得た粉末を封管に－２０℃で保存した。
電子顕微鏡検査：約５００～１０００μｇの加工したナノサイズのサクランボ粉末ナノ粒子又はナノファイバー粉末を、両面粘着性導電性カーボンテープの一方の面に一様に振りかけた。次いで、テープを直径１２ｍｍのアルミニウムスタブに貼った。サンプル表面を異なる倍率で観察し、画像を、走査型電子顕微鏡（モデルQUANTA 250、FEI社、Netherlands）を使用して記録した。
ナノ粒子の透過型電子顕微鏡検査を、以前に記載されたように（Jacob, J.K. and Paliyath, G. (2008) Physico-chemical characteristics of nanovesicle-carbohydrate complexes in grape juice, J. Agr. Food Chem., 56, 1305-1315）、水に溶解した透析抽出物又は粉末（１ｍｌ当たり約１００～２００μｇ）を使用して実行した。カーボン被覆したニッケルグリッドを溶液の５０μｌの液滴に浮かせ、ナノ粒子をグリッドに３０秒間吸着させた。グリッドをブロット乾燥し、１％酢酸ウラニルの液滴に３０秒間浮かせた。グリッドをブロット乾燥し、Leo 912 B透過型電子顕微鏡下で検査した。
タンパク質の分析：加工中のタンパク質分解を評価するために、タンパク質を、TRIzol（登録商標）を製造業者（Invitrogen社）によって提唱されるように使用して各ステップから抽出した。簡潔に述べると、１００μｇタンパク質当量のサンプル（Bradford試薬によって決定した）をTRIzol試薬（１ｍｌ）中で均質化又は十分に混合し、室温で５分間インキュベートした。ホモジネートを１２０００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離した。相分離のために、２００ｕｌのクロロホルムを添加し、ボルテックスして十分に混合し、１２０００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離した。水性相と有機相を分離した。水性相を凍結乾燥によって乾燥した。乾燥した残渣をＳＤＳ－ＰＡＧＥのために加熱（９０℃）によってサンプルローディング緩衝液に再溶解した。有機画分からのタンパク質を沈殿させるために、１．５ｍｌのイソプロパノールを添加し、室温で１０分間インキュベートし、それに続いて１２０００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離を行った。遠心分離後に取得したペレットを、９５％エタノール中０．３Ｍグアニジン塩酸塩を使用して３回洗浄し、それに続いて２ｍｌの１００％エタノールを使用して最終洗浄を行った。ペレットを加熱によってサンプルローディング緩衝液に再溶解した。タンパク質サンプルを変性及び還元条件下、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを１０％酢酸中で固定し、クマシーブリリアントブルーで染色した。
ナノ粒子におけるポリフェノールとペプチドとの会合：水中でのスミノミザクラの均質化の間のナノ粒子形成は自然な過程であった。結果として生じるホモジネートはｐＨが典型的には３．０前後で高度に酸性であった。中性ｐＨ付近での均質化がナノ粒子形成及びタンパク質とポリフェノールとの会合に対して効果を有するか否かを検証するために、スミノミザクラをｐＨ６．０の３００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中でも均質化した。TRIzol（商標）タンパク質抽出方法において、遊離タンパク質は有機相に移行するが、炭水化物等の親水性分子と密接に会合したタンパク質は水性相に分配され得る。ナノ粒子におけるポリフェノールとタンパク質との会合を評価するために、TRIzol（商標）抽出後に取得した水性及び有機相からのタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分析した。希釈した水性相を凍結乾燥によって濃縮し、有機相からのタンパク質を、以前に記載されたようにイソプロパノールを使用して沈殿させた。沈殿した界面相をタンパク質サンプルローディング緩衝液に直接可溶化した。タンパク質を変性及び還元条件下、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後、ゲルを１０％酢酸中で５分間インキュベートし、有色ポリフェノールの分布を強調する像を得た。その後、ゲルを、タンパク質の検出のためにクマシーブリリアントブルーで染色した。
これらの試験では、ナノ粒子形成は３～６の範囲の低ｐＨで有利であった。ポリフェノールとペプチドとの会合は、非染色ゲル（図１２Ａ）及びクマシーブリリアントブルーで染色した同じゲル（図１２Ｂ）において観察されるペプチドとアントシアニンとの同時移動によって理解され得る。
ナノ粒子におけるペクチン酸の会合：リンゴペクチン及びポリガラクツロン酸を０．１Ｎ ＮａＯＨに溶解し、標準として使用した。ナノ粒子及び遊離ポリフェノールをこれらのペクチンサンプルと共に変性／還元条件下、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分けた。電気泳動後、ゲルを、ヨウ化プロピジウム（水中１０μｇ／ｍｌ）で１時間染色し、写真を撮った。同じゲルを、クマシーブリリアントブルーで再び染色した。
ナノ粒子における構造成分のウェスタン及びスポットブロット分析：ナノ粒子の主要な炭水化物構造成分の性質を同定するために、スポットブロット及びウェスタンブロットを、ホモガラクツロナンに対して産生されたモノクローナル抗体（ＬＭ２０）、エクステンシンに対して産生されたモノクローナル抗体（ＬＭ１）、及びアラビノガラクタン－タンパク質に対して産生されたモノクローナル抗体（ＬＭ１４）の３種類のモノクローナル抗体（www.Plantprobes.net）を使用して実施した。脱色していないスミノミザクラからのナノ粒子及び脱色したスミノミザクラからのナノファイバーの凍結乾燥粉末を、サンプルローディング緩衝液において沸騰水中で５分間加熱し、還元条件下、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分けた。ゲルからの分けたポリペプチドをニトロセルロース膜に一晩電気泳動転写した。ドットブロット分析のために、２ｕｌの煮沸サンプルをニトロセルロース膜に直接塗布した。これらのニトロセルロース膜を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，phosphate buffered saline）緩衝液中５％無脂肪乳粉末溶液で、室温で１時間ブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔ（０．１％Tween-20を含むＰＢＳ）で３回及びＰＢＳでの最終洗浄により洗浄した後、膜をＰＢＳ中一次抗体溶液（２０倍希釈）中で、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、膜を、ＰＢＳ－Ｔで３回及びＰＢＳ中での最終洗浄により洗浄した後に抗ラット－ＡＰコンジュゲート二次抗体へのインキュベーションを室温において１時間行った。二次抗体へのインキュベーション後、膜を、ＰＢＳ－Ｔ中で３回及びＰＢＳ中での最終洗浄により洗浄した。発色を、Bio-Rad社製アルカリホスファターゼコンジュゲート基質キットを製造業者によって推奨されるように使用して達成した。
分析を、イオントラップを備えたVarian Saturn 2000システム上で行った。ＧＣをSil-CB8（０．２５ｍｍ×３０ｍ）カラムにおいて１ｍｌ／分の一定流速としてプログラムした。注入口温度をスプリットモード（２０：１）において２５０℃で一定に保った。オーブン温度を注入の間４分間１００℃で一定に保持し、次いで８℃／分の速度で２５０℃まで上昇させ、さらに３分間２５０℃に維持した。イオントラップをプログラムして、３分の最初の遅延セグメントを含む４０～６５０ｍ／ｚの間の質量を分析した。
糖の誘導体化：様々なペントース及びヘキソース糖のトリメチルシリル（ＴＭＳ，Trimethylsilyl）誘導体を調製して、所与のＧＣ－ＭＳパラメータにおけるそれらのそれぞれの保持時間を決定した。様々な糖標準（２ｍｇ）を１００μｌの無水ピリジンに溶解し、１００μｌのＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド：トリメチルクロロシラン（ＢＳＴＦＡ：ＴＭＣＳ，N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide: trimethylchlorosilane、９９：１）をガラスバイアル中のその溶液に添加した。誘導体化を、供給業者（Sigma社）によって記載された手順を使用して実行した。反応混合物を８０℃で２時間インキュベートした。１μｌの誘導糖を分析のためにＧＣ－ＭＳに注入した。
ナノ粒子の誘導体化：ナノ粒子を、一般に上に記載したように、１０ｍｌの蒸留水中での１０ｇｍのスミノミザクラ果実の均質化によって新たに調製した。ホモジネートを１５０００ｇで２０分間遠心分離した。上清からの清澄化ジュースを１０ｍｌ PD-10脱塩カラムに通し、６～８ｋＤａのカットオフ膜を用いて蒸留水に対してさらに透析した。１００μｌの精製ナノ粒子を８．６Ｍの最終濃度まで濃縮した２００μｌのＴＦＡと混合し、９０℃で２時間インキュベートした。加水分解したサンプルを窒素流下で乾燥させた。乾燥したサンプルを１００μｌのピリジンに再懸濁し、１００μｌのＢＳＴＦＡ：ＴＭＣＳ（９９：１）を溶液に添加した。誘導体化を８０℃で１時間インキュベートすることによって行った。ＧＣ－ＭＳ分析のために１μｌのサンプルを注入した。
ナノファイバーの誘導体化：ナノファイバー溶液を、４ｍｇの凍結乾燥ナノファイバーを１ｍｌの水に溶解することによって調製した。１００μｌのナノファイバーを８．６Ｍ ＴＦＡ中９０℃で２時間加水分解した。加水分解したサンプルを、ガラスファイバー濾紙を介して濾過し、窒素流下で乾燥させた。乾燥したサンプルを１００μｌのピリジンに再懸濁し、１００μｌのＢＳＴＦＡ：ＴＭＣＳ（９９：１）を溶液に添加した。誘導体化を８０℃で１時間インキュベートすることによって行った。ＧＣ－ＭＳ分析のために１μｌのサンプルを注入した。
ナノ粒子のＦＴ－ＩＲ分析：ナノ粒子及びナノファイバーのＦＴ－ＩＲ分析を、Bruker Tensor 27赤外分光計を使用して実行した。等しい量の粉末（１％）をＫＢｒと混合し、透明な円盤を作製し、これを、スペクトルを獲得するために走査した。
ナノ粒子のＸ線回折：ナノ粒子の小角Ｘ線回折を、Bruker Nanostar SAXS回折装置を使用して実行した。脱色していないサクランボの透析抽出物からのナノ粒子及び透析物の凍結乾燥粉末を回折分析のために使用した。
統計分析：統計分析を、GraphPad Prismバージョン４を使用して実行した。２つの平均を有する結果を、スチューデントのｔ検定を使用して比較した。多数の平均を有する結果を、一元配置分散分析とそれに続く「テューキーの検定」とを使用して比較して、有意水準を評価した。有意に異なる平均（ｐ＜０．０５）を異なる上付き文字によって示す。
結果及び考察：
ナノ粒子の特徴付け：これらの研究では、水性媒体中での果実の均質化は、細胞の高分子及び単一分子の天然の構成を破壊し、その結果、別個の物理化学及び構造的特徴を有する構造の生成を引き起こす、それらの無作為だが構造化した組織化をもたらす。ポリフェノールと、ポリフェノールと複合体を形成したナノ構造との間のサイズの差を使用して、サイズ排除分離を可能にする低分子質量カットオフ膜又はPD-10カラムを使用する透析によりこれらの構造体を分離した。スミノミザクラ粗抽出物、ナノ粒子を含有する透析抽出物、及び透析物（膜によって排除された約６ｋＤ以下の分子質量の分子を含有する）のポリフェノール含量を表１に示す。抽出物におけるほぼ８０％のポリフェノールは透析膜内に保持され、ポリフェノールが複合体を形成した状態で存在することを示唆した。ブドウ及びブルーベリー等の他の果実との比較によると、複合体形成はスミノミザクラにおいてはるかに高かった（が、ナノ粒子はブドウ及びブルーベリーにおいても形成された）。ポリフェノール性成分のＨＰＬＣ－ＭＳ分離は、主要なアントシアニンとしてのシアニジン－３ルチノシドとより少ない存在量のペオニジン３－ルチノシドとの存在を明らかにした。クロロゲン酸及びパラ－クマロイルキナ酸等のフェノール酸ははるかに小さいレベルで存在した（表２を参照のこと）。水性抽出物とメタノール抽出物の両方からの粗抽出物、透析抽出物（ナノ粒子；ＮＰ，nanoparticle）、及び透析物の抗酸化活性を表３に示す。全ての抽出物は高レベルのスーパーオキシド、ヒドロキシル、及びＤＰＰＨラジカル捕捉活性を示した。粗抽出物は両方の抽出条件下で最も高い抗酸化能を示した。透析物は最も低い抗酸化活性を有した。有意な一部の抗酸化能はナノ粒子（すなわち透析抽出物）に関連した。
メタノール（約５０％ｖ／ｖ最終）中での抽出もナノ粒子の形成をもたらした。
透析抽出物は、凍結乾燥してタンパク質（１０～１２％）、ポリフェノール（１２～１４％）、ペクチン（１０％～１５％）、及び他の炭水化物（例えばキシログルカン等のヘミセルロース成分、アラビノガラクタン等のペクチン成分）を含有する飛散性粉末にすることができた。形成すると、ナノ粒子中のポリフェノールはエタノール（５０～１００％）で抽出することができなかった。複合体は一般に酸安定（ｐＨ３未満）であった。１０％トリクロロ酢酸の添加は赤みがかった残渣としての複合体の沈殿をもたらしたが、アルカリ性条件（ｐＨ７を超える）は高分子構成を潜在的に不安定化するポリフェノールの環開裂をもたらした。比較において、エタノール脱色したサクランボからのナノファイバーは、検出可能な量のポリフェノールを含有しなかったが、タンパク質（約１５％）、ペクチン（１５～２０％）、並びに他の炭水化物（キシログルカン等のヘミセルロース、アラビノキシラン及び複合体を形成したペクチン等のペクチン性成分（６０～７０％）を含有した。複合体形成は無作為な事象であるため、成分の種類間の厳密な比例関係は達成することが困難であり、したがって様々な成分の全般的な割合を提供する。
Figure 2022513081000002
 上付き文字「ａ」はＣＥ（水及びメタノール）からのｐ＜０．０５における統計的有意性を示し、「ｂ」はＤＥ（水及びメタノール）からのｐ＜０．０５における統計的有意性を示し、「ｃ」はＤＺ（水及びメタノール）からのｐ＜０．０５における統計的有意性をそれぞれ示す。各セットの値は３回の独立した推定の平均±標準誤差である。
Figure 2022513081000003
 上付き文字「ａ」及び「ｂ」は、各フェノール性成分それぞれに関する透析水抽出物における成分と透析メタノール抽出物における成分との間のｐ＜０．０５における統計的有意性を示す。ＮＤ：検出されず。定量はＨＰＬＣ－ＭＳ分析及びピーク面積比較によって実行した。
Figure 2022513081000004
 スミノミザクラ抽出物のＤＰＰＨ、ヒドロキシル、及びスーパーオキシドラジカル捕捉能（ＲＳＣ，radical scavenging capacity）。上付き文字「ａ」は粗抽出物（ＣＥ，crude extract）（水及びメタノール）からのｐ＜０．０５における統計的有意性を示し、「ｂ」は透析抽出物（ＤＥ，dialyzed extract）（水及びメタノール）からのｐ＜０．０５における統計的有意性を示し、「ｃ」は透析物（ＤＬ，dialyzate）（水及びメタノール）からのｐ＜０．０５における統計的有意性をそれぞれ示す。
ナノ粒子の形態学：透析抽出物の透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ，Transmission Electron Microscopy）は、約２５～約５０ｎｍの範囲の直径を有するナノ粒子を明らかにした（図１Ａ、矢印。サイズは相当に変動し、複合体が構造成分の喪失により潜在的に変形し得ることを示唆した。ナノ粒子は中心構造の周りに巻きつく直鎖状フィラメント状成分を有した。これらの構造体は複合体の拡大図において２つのナノ粒子の間に広がっていると考えることができる（図１Ｂ、矢印。ナノ粒子のサイズの変動は、中心コアの周りに数回巻きついている多数のファイバーから生じ得る。ファイバーはいくつかのナノ粒子では巻きついていないようであり（図１Ｂ、矢印）、このことは、これらが非共有結合によって一緒に保持される場合があり、外部環境の変化がナノ粒子をそれらの基本単位に解離する場合があることを示唆する。ナノ粒子の構造成分のＴＥＭを図２に示す。図２Ａは、巻きつくフィラメントが取り除かれている球状構造としてのナノ粒子のコア構造を示す（矢印。ファイバー様構造は中心球状構造から発する背景において観察することができる。らせん状のフィブリル構造を明らかにするフィラメントの部分構造は図２Ｂ及びＣにおいて見ることができる（矢印１、２）。図２Ｄは、フィブリルから構成される伸長したファイバー構造を示す（矢印）。したがって、ナノ粒子は、別個の特徴を有する部分構造、すなわち中心コア、コアの周囲のファイバー、非共有結合を介して一緒に保持され得るフィブリルに伸長することができるらせん体として組織化されたファイバー構造を形成する多数のレベルの構成を有するようであった。
ナノ粒子の構造成分：本実施例では、熟成スミノミザクラを、ナノ粒子及びナノファイバーを調製するための植物組織として使用した。熟成果実に存在する高分子は主に、細胞壁に関連する炭水化物、例えばセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、及び糖タンパク質である（Negi, P.S. and Handa, A.K. (2008) Structural deterioration of the produce: The breakdown of cell wall components. In, Post Harvest Biology and Technology of Fruits, Vegetables and Flowers (Eds)）。熟成果実には、可溶性タンパク質はほとんど存在しない。サクランボ等の果実では、有機酸は主な貯蔵分子であり、熟成の間に糖に変換される。主要な貯蔵成分であるデンプンは、高分子質量構造体として存在し、熟成果実には存在しない。ポリフェノール生合成は熟成過程の間に増加し、ポリフェノールの液胞への蓄積は果実に赤色を付与する。
したがって、スミノミザクラからのナノ粒子は、主要な構造成分としての細胞壁炭水化物（構造炭水化物）及びタンパク質によって構成される場合がある。その場合、ナノ粒子を、ペクチン分解性及びセルロース分解性酵素並びにプロテアーゼを使用する酵素消化に供し、安定性を、構造検査を介して評価して、構造上の構成に関してより多くのことを知ることができると仮定した。ナノ粒子の安定性に対するペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ、α１－４－グリコシダーゼ）処理の効果を図３Ａに示し、拡大領域を３Ｂに示す。ペクチナーゼ消化（１単位／ｍｌ）に供した後、ナノ粒子は、ウランイオンとペクチンにおけるガラクツロン酸の負に帯電した分子との結合によって潜在的に形成される高電子密度マトリックス内に散在する小さな管状／小胞構造に完全に解体した（Negi, P.S. and Handa, A.K. (2008) Structural deterioration of the produce: The breakdown of cell wall components. In, Post Harvest Biology and Technology of Fruits, Vegetables and Flowers (Eds)）。これらの消化された構造が商業的なConcordブドウジュースにおいて観察されるナノ小胞に類似していたことに注目することは興味深い（Jacob, J.K. and Paliyath, G. (2008) Physico-chemical characteristics of nanovesicle-carbohydrate complexes in grape juice, J. Agr. Food Chem., 56, 1305-1315）。果実ホモジネートは典型的には、工業的加工の間により高いジュース収量を取得するためにペクチナーゼで処理される。この観察は、ナノ粒子がペクチンに由来する高レベルの炭水化物オリゴマーを含有することを示唆する。ナノ粒子をまた、セルラーゼ（β－１，４－グルカナーゼ、１単位／ｍｌ）で処理し、結果として得た構造修飾体を研究した。ペクチナーゼ消化と対照的に、セルラーゼでの処理は、はるかに大きい小胞及び小胞凝集体の形成をもたらした（図３Ｃ及び３Ｄ、矢印）。セルラーゼはペクチンを消化することができないため、消化後に残った構造はペクチン製であり、潜在的にナノ粒子のコアとなり得る。したがって、セルロース部分は、ナノ粒子のペクチンコアの周囲のフィラメント状構造の部分を形成し得る。ナノ粒子をまたトリプシン（１単位／ｍｌ）の存在下のインキュベーションに供し、これは、ペクチン製のコアを残してナノ粒子の外側のフィラメント状構造を再び消化した（図４Ａ）。これらの構造も、セルラーゼ処理後に観察された空シェル構造に類似しており、ナノ粒子の外側のフィラメント状構造がセルロース部分とポリペプチド（すなわちタンパク質性材料）の両方を含有したことを示した。外側のファイバー構造をトリプシン処理によって取り除いた後のシェル構造の拡大図を図４Ｂに示す。トリプシン消化の間に形成された中間構造を図４Ｃ、４Ｄ、及び４Ｅに示す。図４Ｃは、トリプシン処理の結果として放出されるようになっているファイバー様構造の同心環（すなわちペクチンコアの周りのファイバーの構成）によって囲まれるナノ粒子を示す。図４Ｄは、ナノ粒子のシェルを、複合体から取り除かれるファイバーと共に示す。図４Ｅは、混ざり合い、回りに巻きついて縄に類似した構造になる長いフィブリル状構造によって構成されたファイバー材料の部分構造を示し、ファイバーの大きな巻きついた実体を形成する可能性を示す。これらのファイバー様構造は長く、マイクロメートル長に達するが、直径は約２～約３ｎｍである。ナノ粒子の化学処理に対するレジリエンスは、異なる種類の高分子による相互作用を介して構造を安定化するこの構造的複雑性に起因し得る。
乾燥ナノ粒子粉末の走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ，Scanning Electron Microscopy）：ナノ粒子を凍結乾燥し、水の除去により非晶質粉末を取得した。ＳＥＭによるこの粉末の検査は、ナノ粒子の形成をもたらす一時的な段階を潜在的に示す構造的態様を明らかにした。ナノ粒子のサイズ分布を図５に示す。乾燥形態では、これらの複合体の直径は、直径２００ｎｍ未満～１マイクロメートル超の範囲であった。これは、サイズの変動が約２５ｎｍ～約５０ｎｍであった懸濁液中の水和ナノ粒子において観察されたもの（図１Ａ）よりもほぼ１０倍高かった。このことは、遅い脱水の間に、ナノ粒子に結合した水が除去されて、複合体の拡大を生じることを示唆する。水に懸濁することによる粉末の再水和は、それらの小さなナノ粒子への反転をもたらした（データは示していない）。球状構造に加えて、管状構造も凍結乾燥粉末において観察された（図５、矢印）。凍結乾燥粉末の構造的な変動は、シート（矢印１）、フィラメント（矢印２）、管（矢印３）、及び小胞の形態における一時的な構造の異種性を示し、これらの全てを混ざり合った状態で見ることができる図６にさらに見ることができる。小胞の管状構造からの出芽を示す領域を矢印４によって示す。したがって、起源という観点から見ると、シートは、ナノ粒子の形成の間にペクチン／セルロースオリゴマー－ポリペプチド、並びに他の低分子、例えばポリフェノール及びリンゴ酸で被覆される小胞構造を出芽し得る管状構造を形成する傾向があると考えられる。
脱色したサクランボからのナノファイバー：ポリフェノールはナノ粒子に密接に結合し、溶媒抽出（アルコール、ＤＭＳＯ、酸）によって除去することが困難であったため、ナノ粒子の生成前にエタノールによってポリフェノールを果実から除去する試みを行った。果実を５０％エタノールに、３回の溶媒交換を行いながら４８時間浸漬し、これはポリフェノールの除去をもたらし、オフホワイト色のサクランボ果実を残した。次いで、ナノ粒子を調製するための全般的に同じ手順を実施した。ポリフェノールの除去は、ナノ粒子に関して観察されたものからの全体的な構造的変化をもたらした。凍結乾燥粉末の検査は、直径ナノメートル（２～３ｎｍ）で長さマイクロメートルに伸長した薄膜が散在する伸長したストランド又はフィラメント状構造（ナノファイバー）を示した（図７Ａ）。水性状態では、（ナノファイバーは長さマイクロメートル及び直径約５～約１０ｎｍの形態学を保持した（図７Ｂ、矢印１）。これらのフィラメントはヘリックス構造を有する領域も示し（図７Ｂ、矢印２）、これらが、トリプシンでの処理後に広がったファイバー（図４Ｅ）として現れる、ナノ粒子を被覆するらせん状のファイバー様構造を潜在的に起源とし得ることを示唆する。したがって、ポリフェノールはナノ粒子の構造上の構成を決定することにおいて主要な役割を有し、これらの相互作用はポリペプチドとの会合も含み得ると考えられる。
ポリフェノールはタンパク質と相互作用することが公知である（Dangles, O. and Dufour, C. (2006). Flavonoid-protein interactions. In Flavonoids: Chemistry, biochemistry & applications, ed. Andersen O, Markham K. 443-69. Boca Raton, FL: CRC Press）。機能的に、リンゴペクチンは、ポリフェノールと相互作用し、結腸発酵及び身体からの脂質除去における有益な効果を増強することが公知である（Aprikian, O., Duclos, V., Guyot, S., Besson, C., Manach, C., Bernalier, A., Remesy, C. and Demigne, C. (2003) Apple pectin and a polyphenol-rich apple concentrate are more effective together than separately on cecal fermentations and plasma lipids in rats. J. Nutr., 133, 1860-1865）。構造的に、ポリフェノールは、イオン及び水素結合を介してペクチンとセルロースの両方と相互作用することが公知である（Padayachee, A., Netzel, G., Netzel, M., Day, L., Zabaras, D., Mikkelsen, D. and Gidley, M. (2012) Binding of polyphenols to plant cell wall analogues - Part 1: Anthocyanins. Food Chemistry, 134, 155-161）。ポリフェノールは二相法において１８％と高い結合を伴ってセルロース成分とペクチン成分の両方と相互作用した。セルロースペクチン合成体は最も高い結合を示した。したがって、ポリペプチド、ペクチン／セルロースオリゴマーの組合せは、このように、ポリフェノール結合に高度に有利な環境を提供することができ、ポリフェノールの除去後でさえ依然としてポリペプチド－ペクチン－セルロース骨格を保持し、ナノファイバーに組織化した。
ナノ粒子の界面活性剤に対する安定性：ナノ粒子の安定性を、高分子構造を破壊することができるTriton X-100及びデオキシコール酸ナトリウム等の界面活性剤で透析抽出物を処理することによってさらに検査した。ナノ粒子を含有する透析抽出物を漸増濃度のこれらの界面活性剤と共にインキュベートした場合、ナノ粒子と会合したポリフェノールレベルは、アントシアニンのベンゾピラン部分に特徴的な吸収極大である５２０ｎｍで測定した場合、ほぼ一定のままであった（図８）。類似した結果がデオキシコール酸ナトリウムを用いても取得された。２６０ｎｍで測定した場合は増加を示し、ポリフェノールを内部に捉えるTriton X-100の臨界ミセル濃度を超えるミセル形成を潜在的に示す。これらの結果は、ナノ粒子の構造成分間における脂質の非存在も示唆する。
ナノ粒子の化学組成及びナノファイバーとの比較：
ナノ粒子の酸性性質：ナノ粒子は水性溶液中でも乾燥粉末としても高度に安定であった。ナノ粒子のサイズ排除クロマトグラフィーの間、ナノ粒子に結合したポリフェノールは空隙容量に溶出し、ポリフェノールに関して特徴的な５２０ｎｍにおける極大吸収、及び３のｐＨを示した。溶液に存在する遊離ポリフェノールの溶出は遅延し、溶出液は、青灰色に見え、アントシアニンのベンゾピラン環開裂が関連する赤色の喪失と共に起こる７に近いｐＨを示した。ジュース分子中の遊離有機酸を除去したと思われるスミノミザクラ抽出物の徹底した透析後、透析抽出物は依然として３に近いｐＨを示し、ホモガラクツロナンのオリゴガラクツロン酸部分（ｐＨ３）の他に構造成分としてナノ粒子に結合した酸性成分（有機酸）が存在し得ることを示唆した。そのような成分を同定するために、ナノ粒子及びナノファイバーを乾燥させ、トリメチルシリル誘導体を調製し、その誘導体をＧＣ－ＭＳ分析に供した。結果を図９に示す。上段の（Ａ）のパネルは標準的な有機酸の溶出パターンを示す。（Ｂ）及び（Ｃ）はそれぞれ、ナノ粒子及びナノファイバーからの化合物の溶出プロファイルを示す。ナノ粒子とナノファイバーの両方は、１３．７分で溶出したリンゴ酸の明確な存在を示した（質量スペクトル、トリメチルシリル誘導体）。リンゴ酸はスミノミザクラ果実に存在する主要な有機酸である。ヒドロキシル酸であるリンゴ酸は水素結合を形成して、ナノ粒子及びナノファイバーの成分間の分子会合を安定化し得る。２０～２５分の間に溶出するピークは誘導糖又はオリゴ糖由来である。図９の下側のパネルは参照リンゴ酸トリメチルシリル誘導体の質量スペクトルを示す。
スミノミザクラポリペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析：果実全般におけるタンパク質の量は比較的少なく、タンパク質分解は熟成の間にプロテアーゼの活性化によって行われる。ナノ粒子におけるタンパク質の存在は、それらのトリプシンに対する感受性によって確認された。果実及びホモジネートにおけるタンパク質を、果実における核酸及びタンパク質抽出に理想的な汎用試薬であるTRIzol（商標）で単離した（Tiwari and Paliyath, 2011）。プロテアーゼ活性が阻害されるこれらの条件下では（フェノール、イソチオシアン酸グアニジニウムの存在下の場合のように）、タンパク質分解は最小であり、タンパク質は、TRIzol抽出物の相分離をもたらした水の添加後に、有機相に存在した。起源である果実、ホモジネート、及び遠心分離したホモジネートからのペレットにおけるタンパク質をtrizol抽出に供し、通常ではタンパク質を含有する有機相（クロロホルム：フェノール）をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。結果を図１１に示す。タンパク質バンドの明確な分離は、果実におけるタンパク質（レーン２）、総水ホモジネート（レーン３）及びホモジネートの遠心分離後に取得したペレット（レーン４）におけるタンパク質を表すゲルにおいて見ることができる（図１１、レーン２、３、４を参照のこと）。しかしながら、遠心分離後に取得した果実ホモジネートの上清のtrizol抽出後、有機相はタンパク質をほとんど欠いており、主に低分子質量ペプチド（２５ｋＤ）を含有した（レーン５）。透析抽出物の凍結乾燥粉末は、TRIzol抽出せずに直接分析した場合、果実又はそのホモジネートのようなタンパク質の個別のバンドを示さず、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色後に可視化した場合、ポリペプチドのスメアを示した（レーン６）。しかしながら、透析抽出物粉末のTRIzol抽出後、有機相はクマシーブリリアントブルーによる染色を示さず、タンパク質／ペプチドが炭水化物及びポリフェノールとの会合に起因する増強した親水性のために水性相に移動した可能性があることを示唆した（レーン７）。
ナノ粒子におけるポリペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析：ナノ粒子は様々な分子質量のポリペプチドによって構成されたため（図１１、レーン６）、さらなる分析を実行して、それらと他の成分、例えば炭水化物及びポリフェノール成分との会合の性質を描写した。これらの構造成分がナノ粒子において密接に会合する場合、それらはＳＤＳ－ＰＡＧＥの間に同時移動するはずであると仮定した。スミノミザクラを水又は緩衝液（クエン酸カリウム、３００ｍＭ、ｐＨ６、均質化後の最終ｐＨはｐＨ５）中で抽出し、水又は緩衝液に対して透析した。透析抽出物を凍結乾燥し、粉末をローディング緩衝液に再懸濁した。等量（１５μｇ）のタンパク質（水中１５％グリセロールに再懸濁した）をゲルにローディングし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。電気泳動後、ゲルを取り出し、水中１０％（ｖ／ｖ）酢酸中でインキュベートした。パネルＡ（図１２）は、ペプチドの分離後且つクマシーブリリアントブルーでの染色前のゲルを示し、ポリフェノールの存在に起因する、レーンにおける尾を引くピンク色を明らかにする。パネルＢは、クマシーブリリアントブルーで染色した同じゲルを示し、ポリペプチドを明らかにする。レーン２は透析抽出物粉末の染色パターンを示す。パネルＡ及びＢにおけるレーン２の比較は、ペプチドの移動（レーン２、パネルＢ）とポリフェノールの移動（レーン２、パネルＡ）との類似性を明らかにし、ポリフェノールがナノ粒子においてポリペプチドに密接に結合していることを示唆する。ポリフェノールは、ペプチドと比較して小さい非荷電分子であり、複合体を形成しなかった場合、ゲルから溶出されはずである。ナノ粒子を含有する透析抽出物粉末（水抽出物から取得した）をtrizol抽出及び相分離に供し、水性上清画分に対応するレーン３（パネルＡ、Ｂ）はポリペプチドとポリフェノールの両方の存在を示し、それらの密接な会合を示す。複合体形成の非存在下では、ポリペプチドはTRIzol抽出物の有機相（フェノール：クロロホルム）に単独で分配されるはずなので、この特性は、ペプチド－炭水化物－ポリフェノール複合体の親水性性質も明らかにした。しかしながら、以前に示したように（図１１、レーン７）、ナノ粒子のtrizol抽出物からの有機相はいかなるポリペプチドも有しなかった。ペプチドとポリフェノールとの会合は透析緩衝液抽出物粉末においても明確である（図１２、レーン４）。レーン５、６、及び７は、TRIzol抽出後に取得した透析緩衝液抽出物粉末の水性上清、界面相、及び有機相に対応する。通常ではクロロホルム：フェノール相に保持されるポリペプチドは、大部分のポリペプチド及びポリフェノールを可視化することができる水性相（レーン５）に移動した。界面相はポリペプチドの存在を示すが、ポリフェノールの存在をほとんど示さない（レーン６、パネルＢ、Ａ）。有機相に対応するレーン７は、アントシアニンの存在もペプチドの存在も示さない。レーン８、９、及び１０は、大半のポリフェノールが除去されたエタノール脱色したサクランボからの透析抽出物粉末のTRIzol抽出後に取得した上清、界面相、及び有機相に対応する。ポリフェノールの除去がナノ粒子の球状からフィラメント状構造ナノファイバーへの構造的移行を生じるとしても、ポリペプチドは依然としてナノファイバーの不可欠な部分である（レーン８、パネルＢ）。脱色サクランボ透析抽出物の界面相及び有機相は、ペプチドに関する最小の染色を示した（レーン９、１０；パネルＢ）。
ナノ粒子及びナノフィラメントの炭水化物組成：炭水化物のペクチン性、及びナノ粒子におけるそれらとポリペプチドとの会合は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のヨウ化プロピジウム及びクマシーブリリアントブルーでの染色における類似性によって明らかになった。ヨウ化プロピジウムはペクチン酸のための染料であることが報告されている（Rounds, C.M., Lubeck, E., Hepler, P.K. and Winship, L.J. (2011) Propidium iodide competes with Ca2+ to label pectin in pollen tubes and Arabidopsis root hairs. Plant Physiol., 157, 175-187）。パネルＣ（図１２）は、ヨウ化プロピジウム（水中１０マイクロモル）でのナノ粒子の染色パターンを示す。下側のパネル（Ｄ）は、クマシーブリリアントブルーで染色した対応するゲルを示す。レーン１は、市販のペクチンの標準サンプルに対応し、ヨウ化プロピジウムによる最小の染色を示す。ヨウ化プロピジウムでのペクチンの染色は、負に帯電した遊離カルボン酸基の存在に起因する。カルボン酸基が一部のペクチンサンプルに天然に存在するメチル化によってブロッキングされる場合、染色は減少するはずである。レーン２は、ナノ粒子におけるペクチン（パネルＡ）及びポリペプチド（パネルＢ）の分布を示す、１５％グリセロールに溶解した透析抽出物の凍結乾燥粉末における成分の移動パターンを示す。レーン３は、透析物画分を凍結乾燥した後に取得したペクチン／ポリフェノール／ペプチド画分に対応し、この画分はポリペプチドに関する比較的より強力な染色を示す。レーン４は、ヨウ化プロピジウムでの染色を示し、ポリペプチドに関する染色は示さない、ポリガラクツロン酸の標準に対応する。スミノミザクラホモジネートのゼリー状ペレットもペクチン及びポリペプチドの存在を示す（レーン５）。
ナノ粒子の化学的性質のさらなる分析をウェスタンブロット分析によって実行した（図１３）。スミノミザクラ果実を、エタノール中で脱色する（ポリフェノールを除去する）前後に水中で抽出し、ナノ粒子及びナノファイバーを水に対する透析によって単離した。透析抽出物を凍結乾燥し、複合体をグリセロール：水に溶解し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、並びにホモガラクツロナン（ペクチンの主な骨格構造を形成する、介入メチル化単位を有する２０ｍｅｒのα－１，４－ガラクツロン酸）、エクステンシン（主要な細胞壁糖タンパク質）、及びアラビノガラクタン－タンパク質（主要なペクチン連結タンパク質）に対して産生された構造特異的モノクローナル抗体（ラットＩｇＭ）での免疫局在化に供した。結合した抗体を、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ－抗ラットＩｇＧで検出した。パネルＡは、脱色したサクランボ（レーン２；ナノファイバー）及び脱色していないサクランボ（レーン３；ナノ粒子）それぞれからのクマシーブリリアントブルーによるナノファイバー／ナノ粒子の染色を示す。クマシーブリリアントブルーでの染色は、ポリフェノールのエタノール抽出後相当に低下し、ポリフェノールと一緒になったポリペプチドの潜在的な喪失を示唆する（レーン２）。これは、脱色したサクランボからのナノファイバーによるゲルへの低下した浸透にも起因し得る。パネルＢは、脱色したサクランボからのナノファイバー／ナノ粒子（パネルＢ、レーン２）及び脱色していないサクランボからのナノファイバー／ナノ粒子（レーン３）に対する、ホモガラクツロナンに対して産生された抗体の反応性を示す。興味深いことに、ホモガラクツロナンに対しての反応性は、脱色していないサクランボからのナノ粒子（パネルＢ、レーン３）と比較して、脱色したサクランボからのナノファイバーにおいてより強力であった。このことはパネルＢの下に示すドットブロットの強度においても反映される。これは、ナノ粒子／ナノファイバーにおける抗体によるホモガラクツロナン部分の接触性の差を潜在的に反映し得る。脱色していないサクランボからのナノ粒子と脱色したサクランボからのナノファイバーとの肝要な相違はポリフェノールの存在である。脱色を介したポリフェノールの除去によって、ホモガラクツロナン部分は、抗体への反応性の増加を引き起こすことができるより大きな程度まで曝露されるようになる場合がある。また、これらの結果は、ポリフェノールが脱色していないサクランボからのナノ粒子の不可欠な部分であり、その除去が構造的変形を引き起こし得ることを実証する。サクランボポリフェノールを有するフィラメント状ナノファイバーをインキュベートすることは、その変形をフィラメント状形態から球状形態へ戻さなかったが（データは示していない）、どちらの形態も構造的に安定である。ナノ粒子とナノファイバーの両方は、果実における主要な細胞壁タンパク質に対して産生された抗体である抗エクステンシンに対しての軽度な反応性を示した（パネルＣ）。抗エクステンシンに対するドットブロットも最小の反応性を示した。しかしながら、抗アラビノガラクタン－タンパク質（ペクチン－タンパク質）に対する非常に強い反応がナノ粒子／ナノファイバー型の両方によって観察され、これがナノ粒子／ナノファイバーの基本的な構造の主要な成分であり得ることを示唆した（パネルＤ、レーン２、３；ドットブロット）。抗キシログルカンに対するウェスタンブロットはゲルにおいていかなる交差反応性も示さなかったが、ナノファイバーに対する強い反応を示した（下段のパネル、パネルＡ、フィラメント状凝集体を形成。ポリペプチドはＳＤＳによる可溶化の間にナノ粒子及びナノファイバーから取り除かれるが、炭水化物は、大きなサイズ及び電荷の不足のためにゲルに効果的に進入せず、凝集体として残り得ると考えられる。
ナノ粒子及びナノファイバーの炭水化物組成の定性的分析を、トリフルオロ酢酸（８．６Ｍ）での消化及びＢＳＴＦＡ：ＴＭＣＳ（Sigma社、９９：１）を使用した遊離された糖のトリメチルシリル化後に実行した。ＧＣ－ＭＳによって分離及び同定された糖の定性的プロファイルを図１０（上段のパネル）に、標準としての一般的な糖の定性的プロファイル（下段のパネル）と共に示す。ナノ粒子（青色；ナノ複合体として表示）及びナノファイバー（赤色；ナノフィラメントとして表示）の糖組成には類似点及び相違点が存在する。グルコース、ガラクトース／ガラクツロン酸、及びマンノースはナノ粒子における主要な成分であったが、アラビノースは比較的少ない量であった。ナノファイバーの糖はアラビノースが富化していたが、ガラクトース／ガラクツロン酸、及びグルコースはより少ない量であった。同定されていない他の糖がナノ粒子及びナノファイバーに存在する場合があり、一部のピークはＴＦＡ消化の間に修飾された糖も起源とする場合がある。結果は、ナノファイバー形成の間、グルコース、ガラクトース／ガラクツロン酸、及びマンノースが富化したいくつかのオリゴマーが、依然としてペクチンのアラビノガラクタンに由来するアラビノースオリゴマー富化ナノファイバーを主に残して取り除かれ得ることを示唆する。
ナノファイバーにおける病因関連タンパク質に由来するペプチドの同定：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の間、サクランボの均質化の間に本来のプロテアーゼ活性の作用によって発生する様々な分子質量のペプチドの出現をナノ粒子とナノファイバーの両方において検出することができた（図１４、パネルＡ；レーン２、３；ゲルＡ、Ｂ）。これらのうち、少なくとも２つのバンドは４０ｋＤ及び２０ｋＤの相対的分子質量（１、３と表示、図１４；パネルＡ）のナノファイバー（レーン３；Ｂ）という点で別個であった。わずかにより強い強度及び約４０ｋＤの分子質量を有するポリペプチドバンド（２と表示、ゲルＢ）も観察された。非染色ゲルにおいて、これらの３種類のポリペプチドはポリフェノールと会合していることが見出された（紫に着色）（ゲルＡ、レーン２）。これらのバンドを精査し、トリプシン消化及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ後にペプチドフィンガープリンティングに供した。同定した主要なペプチドの配列を図１４に示す（パネルＢ及びＣ）。レーン３における約４０ｋＤの分子質量を有するバンド１（ナノファイバー）は、サクランボからのＰＲタンパク質グルカンエンド－１，３－ベータ－グルコシダーゼ（受託番号Ｐ５０６９４）との配列類似性を示した（パネルＢ）。ＬＣ－ＭＳ－ＭＳによって同定された（強調された断片及びgenbankから推論した配列として同定された配列は、そのタンパク質の２４６アミノ酸長ペプチドに対応した。レーン３における約２０ｋＤの第２のバンド（ナノファイバー）は、別のＰＲタンパク質（主要なサクランボアレルゲンＰｒｕ ａ１（受託番号Ｏ２４２４８）との配列類似性を示し、そのポリペプチドにおいて総計１６１アミノ酸を有した（パネルＢ）。ナノファイバーにおけるバンド１に対応するナノ粒子における４０ｋＤのバンドは、潜在的には結合したポリフェノールからの干渉のため、加水分解産物を生じなかった。これらの同定されたペプチド断片は、ゲル上で分離した全てのポリペプチドの小さな画分である。このことは、ナノ粒子及びナノファイバーの不可欠な成分を形成し得るペプチドの生成をもたらすプロテアーゼの高い活性を潜在的に示唆する。
ナノ粒子のＦＴ－ＩＲ分析：脱色していない及び脱色したサクランボ果実からのナノ粒子／ナノファイバー粉末のＦＴ－ＩＲスペクトルは、互いとの高い程度の類似性、並びにタンパク質及び細胞壁多糖の構造等の高分子構造との類似性を有する複合スペクトルを明らかにした、（図１５；ナノ複合体＝ナノ粒子、ナノフィラメント＝ナノファイバー）。図は、ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ，polygalacturonic acid）（ホモガラクツロナン、ペクチン）及びアルブミン（ＢＳＡ）のスペクトルも示す。ナノ粒子の主要な吸収バンドは、３０００ｎｍ～３６００ｎｍの間、２６００ｎｍ～３０００ｎｍの間のブロードなバンド、及び１７５０ｎｍ～８００ｎｍの間の指紋領域におけるいくつかのピークとして観察された。ナノ粒子の高分子性のため、個々の官能基又は構造的特色に特徴的な吸収ピークは混合している。ポリペプチド、ペクチン、及びポリフェノールのスペクトルの特徴の比較において、ナノ粒子のいくつかの構造的特色を解明することができる。成分の割合、例えばタンパク質（１０％を超える）、炭水化物（約７０％）、及びナノ粒子におけるポリフェノールの存在（約１０～１５％）もピーク及びピーク形状に影響を与え、炭水化物に特徴的なピークの全体的な優位性を明らかにし得る。細胞壁炭水化物成分のＦＴ－ＩＲ分析は、セルロース、ヘミセルロース、及びペクチンに特徴的な特色を示した（Kacurakova, M., Capek, P., Sasinkova, N., Wellner, A., and Ebrigerova, A. (2000) FT-IR study of plant cell wall model compounds: pectic polysaccharides. Carbohydrate Polym., 43, 195-203、Urias-Orona, V., Rascon-Chu,A., Lizardi-Mendoza, J., Carvajal-Millan, E., Gardea, A.A., and Ramirez-Wong, B. (2010). A Novel Pectin Material: Extraction, Characterization and Gelling Properties, 11, 3686-3695）。熟成中の果実において、セルロース分解性及びペクチン分解性酵素の活性の増加は、特徴的な連結を有する低分子質量オリゴマーを生じる細胞壁成分の異化作用をもたらす。これらのうち、ペクチンは、ラムノガラクツロナン、ガラクタン、アラビナン、及びアラビノガラクタンで構成される、断続的な毛様領域（すなわち刺毛形状）を有するα－１，４－連結ガラクツロン酸を有する複合分子である（Negi, P.S. and Handa, A.K. (2008) Structural deterioration of the produce: The breakdown of cell wall components. In, Post Harvest Biology and Technology of Fruits, Vegetables and Flowers (Eds)）。キシログルカン、キシラン、グルコマンナン、及びガラクトマンナンは細胞壁のヘミセルロース成分である。したがって、果実の均質化の間、いかなるこれらの成分もナノ粒子に一体化され得る。ウェスタンブロット研究は、ナノ粒子におけるホモガラクツロナン及びアラビノガラクタンの存在を示しており、その形成におけるペクチンの支配的な関与を示唆する。サクランボからのナノ粒子／ナノファイバーの両方の型からのＦＴ－ＩＲスペクトルは、９００ｃｍ－１及び１２００ｃｍ－１にまたがる炭水化物領域における強力な吸収を示す。脱色したサクランボからのナノファイバーは、高割合のホモガラクツロナンを有するペクチンに特徴的である（Kacurakova, M., Capek, P., Sasinkova, N., Wellner, A., and Ebrigerova, A. (2000) FT-IR study of plant cell wall model compounds: pectic polysaccharides. Carbohydrate Polym., 43, 195-203）約１０１７ｃｍ－１においてシャープなピークを示す。１０４５ｃｍ－１～１０７４ｃｍ－１の間のショルダーはβ連結アラビノガラクタンを起源とし得る。ラムノガラクツロナン及びヘミセルロースからの吸収はこのブロードな領域において生じる。
炭水化物領域における吸収が主にグリコシド連結（Ｃ－Ｏ－Ｃ）を起源とする一方で、アノマー領域は糖部分間の連結の種類に関する情報を提供する。α連結は８３４ｃｍ－１における吸収バンドを特徴とし、β連結は８９８ｃｍ－１におけるバンドを特徴とする。どちらの型のナノ粒子も約８３４ｎｍにおいてブロードな吸収極大を示し、複合体の炭水化物が大部分、ペクチンに一般的なα型連結を保持することを示唆し、さらにナノ粒子における炭水化物が主にペクチン起源であることを示唆する（図１５）。
約１５５０ｃｍ－１～約１８００ｃｍ－１の間に観察されたブロードなバンドは、他の植物組織において観察されるように、ペクチンに特徴的である（McCann, M.C., Shi, J., Roberts, K. And Carpita, N.C. (1994) Changes in pectin structure and localization during the growth of unadapted and NaCI-adapted tobacco cells. Plant J., 5, 773-785）。全般に、指紋領域を含む９００ｃｍ－１～１８００ｃｍ－１の間のタバコ細胞から単離したペクチンのＦＴ－ＩＲスペクトルパターンは、ナノ粒子に関して観察されたパターンとほぼ同一である。ペクチンの２つの主要な構造要素はエステル連結（１７４０ｃｍ－１）とカルボン酸基（１６００及び１４１４ｃｍ－１）である。１７４０ｃｍ－１におけるブロードなピークは、エステル化ペクチンの存在を示す両方の型のナノ粒子において別個であり、脱色したサクランボからのナノ粒子においてわずかに低い強度であった（図１５）。
ナノ粒子におけるタンパク質の吸収バンドはおそらく、ペクチンから生じる吸収バンドによって大部分遮蔽されている（Gorinstein, S., Haruenkit, R., Poovarodom, S., Park, Y-S., Vearasilp, S., Suhaj, M., Ham, K-S., Heo, B-G., Cho, J.Y., and Jang, H.G. 2009. The comparative characteristics of snake and kiwi fruits. Food and Chem. Toxicol., 47, 1884-1891）。しかしながら、二次構造のある特定の特徴をこれらのスペクトルにおいて観察することができる。タンパク質のＦＴ－ＩＲスペクトルは、アミドＡ、Ｂバンド及びアミドＩ～VIIと呼ばれる特異的なアミド吸収を特徴とする。－ＮＨ伸縮から生じるアミドＡ（約３５００ｃｍ－１）及びアミドＢバンド（約３１００ｃｍ－１）は、ナノ粒子スペクトルにおいて３６００ｃｍ－１～３０００ｃｍ－１の間にブロードなピークを形成する炭水化物ヒドロキシルの－ＯＨ伸縮（３４００ｃｍ－１）と潜在的に重複する。アミドＩ及びII吸収はそれぞれ、ペクチンからのエステル吸収と重複する－Ｃ＝Ｏ及び－Ｃ－Ｎ基の伸縮振動（１６００～１７００ｃｍ－１）、並びにＮＨ伸縮（１５１０～１５８０ｃｍ－１）から生じる。アミドＩ吸収は、主に約１６２９ｃｍ－１において吸収するベータシートである骨格構造に特徴的である。エクステンシン等の細胞壁糖タンパク質はより大きな成分のβシートを有するが、エクステンシン抗体を使用したウェスタン分析はナノ粒子におけるエクステンシンの拡散を示さなかった（図１３）。しかしながら、アラビノガラクタン－タンパク質に対して産生された抗体への高度に陽性な反応性がナノ粒子とナノファイバーの両方の型において観察された。このことは、本来両親媒性であるアラビノガラクタン連結タンパク質（Seifert, G.J. and Roberts, K. (2007) The Biology of Arabinogalactan Proteins. Annu. Rev. Plant Biol., 58, 137-161）が炭水化物－ポリペプチド成分をナノ粒子に提供し得ることを示唆する（図１５）。
ポリフェノールはナノ粒子の不可欠な部分である。ポリフェノールの相対量はナノ粒子中１２～１５％の範囲である。ポリフェノールを含有するナノ粒子及びポリフェノールを欠く脱色したサクランボから単離したナノファイバーのＦＴ－ＩＲスペクトルは、主要な相違を示さなかった。ポリフェノールは純粋な形態において特徴的なスペクトルを示し、主要な吸光度は、炭水化物領域、すなわち－Ｃ＝Ｈ伸縮（約２８５０～３０００ｃｍ－１）、並びにポリフェノールヒドロキシル及び糖ヒドロキシル基からのヒドロキシル伸縮（遊離３２００～３６００ｃｍ－１）に存在する（David, I., Stefanut, M.N., Cata, A,, Ienascu, I., Pop, R., Tanasie, C., and Balcu, I. (2009) Study of polyphenols from Vaccinium Myrtillus L. frozen fruits. J. Agroalimentary Processes and Technol. 15 (3), 348-352）。ポリフェノールの相対量は少ないため、ポリフェノール官能基の吸収は、炭水化物及びタンパク質の吸収から解読することが困難である（図１５）。
ナノ粒子のＸ線回折：果実におけるペクチンの拡散は、この実施例に示す構造的移行を介してナノ粒子を潜在的に生じさせることができる。ナノ粒子はペクチナーゼ処理に高度に感受性であり、構成の完全な溶解を受けるため、ペクチンはナノ粒子の支配的な成分であると考えられる。ペクチンは、メトキシ化の程度、並びに糖及び低ｐＨ、及びカルシウム等の二価イオンの存在に依存するゲルを形成する（Fu, J.T.; Rao, M.A. (2001) Rheology and structure development during gelation of low-methoxyl pectin gels: The effect of sucrose. Food Hydrocolloid., 15, 93-100、Strom, A.; Ribelles, P.; Lundin, L.; Norton, I.; Morris, E.R.; Williams, A.K. Influence of pectin fine structure on the mechanical properties of calcium-pectin and acid-pectin gels. Biomacromolecules 2007, 8, 2668-2674）。セルロース等のベータ－１，４－グルカンは、結晶性実体として生じるが、非晶質状態において存在することもできる。ナノ粒子のセルロース処理に対する感受性は、β－１，４－グリコシド連結を保持する成分がナノ粒子構造の部分でもあり、これらがセルロースミクロフィブリルと連結する非晶質セルロース及び／又はヘミセルロース成分（キシログルカン）を含み得ることを示唆する。タマリンド種子キシログルカンに関する先行研究は、キシログルカンがペクチンによって遮蔽され得、ペクチンの溶解がキシログルカンを露出させることを示している（Marcus, S.E., Verhertbruggen, Y., Herve, C., Ordaz-Ortiz, J.J., Farkas, V., Pedersen, H.L., Willats, W.G.T. and Knox, J.P. (2008). Pectic homogalacturonan masks abundant sets of xyloglucan epitopes in plant cell walls. BMC Plant Biol., 8, 60-72）。したがって、ナノ粒子におけるペクチン及びセルロースの同時存在は起こり得る事象である。結晶性セルロースのＸ線回折は２２．５°の回折角（２θ）を中心とするシャープなピークを示し、非晶質セルロースのＸ線回折は２０．７°において特徴的なブロードなピークを示す（Park, S., Baker, J.O., Himmel, M.E., Parilla, P.A., Johnson, D.K. (2010). Cellulose crystallinity index: measurement techniques and their impact on interpreting cellulase performance. BMC Biotechnol. Fuels, 3, 10-20）。ナノ粒子粉末のＸ線回折（図１６）は２０°付近を中心とするピークを示し、ナノ粒子における非晶質セルロースの存在を示唆する。透析物粉末のディフラクトグラムは、多数の種類の炭水化物成分を含有し得るため、２０°を中心とするはるかによりブロードなピークを示す。ナノ粒子及び透析物のＸ線回折パターンはまた、ゼラチン－ペクチン合成体と類似する（Sharma et al, 2011）。果実が熟成するにつれて、セルラーゼ及びペクチナーゼ活性は増加して細胞壁成分の溶解を引き起こし、ナノ粒子に一体化することができる数種類の細胞壁ポリマーを潜在的に放出する。したがって、ナノ粒子は、遊離カルボキシ基とエステル化カルボキシ基の両方、アラビノガラクタン、キシログルカン、非晶質セルロース等を含有するポリガラクツロン酸等のペクチン成分を起源とすると考えられる。抽出過程の間のペプチド及びポリフェノールとのさらなる組織化は、これらの成分のナノ粒子の形態への自己組織化をもたらし得る。
球状ナノ粒子の構造上の構成に関する提案モデル：ナノ粒子を形成する高分子及びポリフェノールの構成は、いくつかの結果から解明され得る。脱色していないサクランボの透析画分からの単一ナノ粒子の電子顕微鏡写真を図１７Ａに示す。大半のナノ粒子は直径約２５～約５０ｎｍのサイズ範囲であり、非常に安定な球状構造であるが、直径１００ｎｍを超える大きな複合体が形成されることもある。大きなサイズは、小さなナノ粒子との比較において、そのような複合体を構造的に不安定にする可能性が高い。通常の条件下では球状に見える大きなナノ粒子は崩壊することもあり、これは構造的詳細を明らかにする。顕微鏡写真において、崩壊した範囲は中心に示される（矢印１；パネルＡ、図１７）。この観察は、ナノ粒子をその外側の構造から取り除いて球状で柔軟なペクチンコアを明らかにする酵素（トリプシン、セルラーゼ）処理後に取得された結果と一致する。コアは、ナノ粒子がホモガラクツロナンに対して産生された抗体への交差反応性を示さないため、ホモガラクツロナン部分によって形成され、露出していない可能性が高い。崩壊した構造はコアの内部が中空であり得ることを示唆する。コアは、ペクチナーゼ及びトリプシンに対する感受性によって推論されるように、ホモガラクツロナン及びタンパク質によって構成された、らせん状の構成に組織化したフィラメントによって囲まれている（図１７、パネルＡ、矢印２）。ポリフェノールは、エタノールでのポリフェノールの除去がヘリックス構造をほどいて長いフィラメントにする完全に異なる構成をもたらすため、フィラメントのヘリックス構成を安定化することにおいて有意な役割を有し得る。これらのフィラメントは、ポリフェノールが除去される場合、ホモガラクツロナン抗体への強い反応性を示し、ポリフェノールがヘリックス構造を遮蔽し得ることを示唆する。ペクチンコアを覆うらせん状のフィラメントの外側に、内部フィブリル層と異なるようであるフィブリルの別の別個の層が存在するようである（図１７、パネルＡ、矢印３）。この層の組成は、ポリペプチドと結合したアラビノガラクタンによって主に構成され得、また脱色していないサクランボからのナノ粒子がアラビノガラクタン－タンパク質抗体に対する強い反応性を示し、それらが外側に位置すること及び抗体への増強した接触性を示すため、内部層（矢印２）の組成と異なる可能性が高い。アラビノガラクタン－タンパク質は脱色したサクランボから単離したフィラメント構造の部分でもある。したがって、脱色していないサクランボから単離したナノ粒子及び脱色したサクランボから単離したナノファイバーは類似した成分を有し得るが、物理的に別個の構造として構成される。ナノ粒子の拡大した図（図１７、パネルＢ）は、ナノ粒子の内側の層に関するヘリックス構造を示す（矢印）。
天然物に基づくナノ材料の開発は、依然として完全には評価されていない、改変ナノ材料、例えば酸化鉄ナノ粒子、デンドリマー、金及び銀ナノ粒子、カーボンナノチューブ等の使用から生じる潜在的な細胞毒性効果が存在するため、ますます探索されている（Maynard, A. D. (2006) Nanotechnology: Assessing the risks. Nanotoday, 1, 22-33）。改変ナノ材料に関する問題は、人体がその系からこれらを排出する機構を有しない場合があるということである。細胞培養研究では、フラーレン型ナノ材料からの毒性は、構造の水酸化が増加するにつれて減少することが観察されている（Lewinski, N., Colvin, V. and Drezek, R. (2008) cytotoxicity of nanoparticles. Small, 4, 26-49）。改変ナノ材料の最も重要な用途は診断学及び生物医学におけるものである（Kunzmann, A., Andersson, B., Thurnherrm, T., Krug, H,. Scheynius, A. and Fadeel, B. (2011) Toxicology of engineered nanomaterials: Focus on biocompatibility, biodistribution and biodegradation. Biochim. Biophys. Acta., 1810, 361-373）。７０ｎｍのシリカナノ粒子は胎盤関門を通過し、胎児に進入することができたが、サイズが３００ｎｍ及び９００ｎｍのシリカナノ粒子は胎児組織に蓄積しなかった（Yamashita, K. et al. (2011) Silica and titanium dioxide nanoparticles cause pregnancy complications in mice Nature Nanotech., 6, 321-328）。同様に、直径３０ｎｍの薬物担持ポリマーミセルは、低い透過性を有する腫瘍に浸透することにおいて、５０ｎｍ、７０ｎｍ、又は１００ｎｍのミセルよりも効率的であった（Cabral, H., Matsumoto, Y., Mizuno, K., Chen, Q., Murakami, M., Kimura, M., Terada, Y., Kano, M.R., Miyazono, K., Uesaka, M., Nishiyama, N. and Kataoka, K. (2011) Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size., Nature Nanotechnol., 6., 815-823）。改変ナノ材料の取込み、分布、及び排出の機構を理解することは、生物起源のナノ材料におけるこれらの機構を理解することにも役立ち得る。
異なる形状及びサイズの生物学的ナノ材料は薬物送達及び保持における利益を提供することが提唱されている。ナノリポソーム、ナノコキレート、ミセル、フィラソーム等は、生物医学における潜在的な用途を有する生物学的ナノ構造の潜在的な形態学的バリアントである（Nishiyama N (2007) Nanocarriers shape up for long life. Nature Nanotechnol., 2, 203-205）。これらのうち、フィロミセルと称される直径２２～６０ｎｍ及び長さ２～８μｍのフィラメント状ポリマーミセルは、球状ナノミセルよりも長く血中に残留することが観察されている（Discher, D. E. and Eisenberg, A. (2002) Polymer vesicles. Science 297, 967-973）。フィブリノーゲン等のタンパク質はポリアクリル酸で被覆された金ナノ粒子を囲み、これは炎症のその誘発の一部である構造的変化であると考えられる（Deng, Z. J., Liang, M., Monteiro, M., Toth, I. and Minchin, R. F. (2011) Nanoparticle-induced unfolding of fibrinogen promotes Mac-1 receptor activation and inflammation. Nature Nanotech. 6, 39-44）。ダイゼイン担持固体脂質ナノ粒子は、動物モデルにおける生物学的利用能の増強及び循環時間の増加を介した心脳血管保護において、ダイゼイン単独よりも効率的であった（Gao, Y., Gu, W., Chen, L., Xu, Z., Li, Y. (2008). The role of daidzein-loaded sterically stabilized solid lipid nanoparticles in therapy for cardio-cerebrovascular diseases. Biomaterials., 29, 4129-4136）。
ナノ粒子はエンドサイトーシス機構によって吸収される可能性が高く、したがって、細胞において細胞表面への結合、内部移行、輸送、及び放出の間に数種類の修飾を受け得る。エンドサイトーシスの間、ナノ粒子は細胞表面に結合し、続いてエンドソーム、ファゴソーム、及びマクロピノソームによる形質膜の小胞形成によって内部移行し得る。これらの過程に関与する異なる種類の機構が存在し得る。形質膜起源の小胞構造は多胞体になり、リソソームと融合し得る。リソソームｐＨは酸性であり、内容物を放出するプロテアーゼ及び加水分解酵素によるナノ粒子の分解に理想的な条件を提供する。細胞によるナノ粒子の吸収は細胞の表面特徴に依存する（Iversena,T.G., Skotlanda, T. and Sandvig, K. (2011). Endocytosis and intracellular transport of nanoparticles: Present knowledge and need for future studies. Nano Today, 6, 176-185）。直径２０～５０ｎｍのナノ粒子は、より大きい又はより小さいナノ粒子よりもはるかに多く取り込まれるようである。取込みはレシピエント細胞の表面電荷にも依存する可能性があり、全般に、正に帯電したナノ粒子はより効率的に取り込まれる。スミノミザクラからのナノ構造は、球状ナノ粒子形態の場合は周辺におけるペプチドアミノ基及びポリガラクツロン酸の隠れたカルボン酸の潜在的な曝露のために正に帯電しているが、より多い存在量のポリガラクツロン酸（酸性基）が、それらが懸濁される中性付近の水性媒体に曝露されているナノファイバーとしては負に帯電しているため、両方の特徴を示し得る。隠れたポリガラクツロネート部分を有するナノ粒子は抗ホモガラクツロナン抗体とあまり反応しない。それに対し、高度に曝露されたポリガラクツロネート部分を有するナノファイバーは、図１３に見られるように、抗ホモガラクツロナン抗体に対して非常に強力に反応する。
植物に遍在する、とりわけ果実及び野菜に大量に存在する生物学的高分子として、ペクチンの物理化学特性は十分に研究されており、単独又はタンパク質若しくは合成分子、例えばポリビニルピロリドン、ポリ乳酸等との組合せにおける、薬物封入、標的化送達、皮膚保護薬としての用途のためのヒドロゲルの開発のための医学におけるその潜在的な有用性はますます探索されている（Mishra, R.K., Banthia, A.K. and Majeed, A.B.A. (2012) Pectin based formulations for biomedical applications: A Review. Aian J. Pharm. Clin. Res., 5, 1-7）。ペクチンベースの材料の利点は、ペクチンがヒトによって進化の過程にわたって消費されており、封入材料を、多糖がプロバイオティクス細菌によって消化されて内容物を放出する結腸に輸送するための食物マトリックスとしての生物学的特性を確認している点である。ペクチンは、コレステロールと結合してこれを胃腸系から除去するのにも役立ち得る。ペクチンベースの送達系は多数の経路を介した薬物送達に関して探索されている（Yadav, N., Morris, G. A., Harding, S. E., Ang, S. and Adams, G. G. (2009) Various non-injectable delivery systems for the treatment of diabetes mellitus. Endo. Metabol. & Imm. Disord. - Drug Targ. 2009, 9, 1-13、Sriamornsak, P. (2011) Application of pectin in oral drug delivery. Expert Opinion on Drug. Deliv., 8, 1009-1023）。ペクチン鎖は、包埋溶液のｐＨに基づいて、カルシウム等の二価イオンによって安定化して様々な形態を取ることができるアニオン鎖として存在することができるため、ペクチンマトリックスの三次元構造は遊離カルボン酸基（ホモガラクツロナン及びラムノガラクツロナン）によって影響され得る。さらに、メチル化カルボキシル基の遊離カルボキシルに対する比は、ペクチンの３Ｄ構造を形成する能力に影響を与え得る。したがって、ペクチン製剤、例えばフィルム、ヒドロゲル、ナノ構造等は、多数の医学的用途のために探索されている。しかしながら、ペクチンのみをベースとするマトリックスは、いくつかの不都合、例えば低い機械的強度、低い剪断安定性、低い薬物担持有効性、及び時期尚早な薬物放出を有し得る。この理由のため、生分解性ポリマー、例えばキトサン、ポリ乳酸、デンプン、ゼラチン、ダイズタンパク質、β－ラクトグロブリン、ヒト血清アルブミン等と混ぜる又は共重合することによるペクチンの化学的及び物理的変更は、より高い電荷密度（正の第一級アミン及び負のカルボキシル基）を提供し得る。サイズが直径７０～２００ｎｍの間の範囲のＺｎＯ－ペクチンナノ粒子の作製は達成されており、Ｚｎ欠損集団セグメントにおけるＺｎ取込みを増強する可能性を探索している（Shi, L. and Gunasekaran, S. (2008) Preparation of pectin-ZnO nanocomposites. (2008). Nanoscale Research Letters, 3:491-495）。そのような分子は、組織により深く浸透し、より良好な薬物送達を実現できることが観察されている。ペクチンのチオール化ナノ粒子はより良好な眼薬物送達のために調製されている。ＳＰＩＯＮ（超常磁性鉄系ナノ粒子）及びオキサリプラチンをペクチン－Ｃａ２＋に封入して、磁性機能を有する直径１００～２００ｎｍのペクチンベースの球状ナノ構造を形成した。がん薬物のパクリタキセルはペクチンナノ構造とコンジュゲートされ、その過程はペクチン（－ＯＨ及び－ＣＯＯＨ基）並びにアスパラギンの正に帯電したアミド基の親水性によって影響されることが示唆されている（Verma, A. K., Chanchal, A., Kumar, A. (2011) Potential of Negatively charged pectin nanoparticles encapsulating Paclitaxel: Preparation & Characterization. IEEE., 978, 1-8）。いくつかのクラスの薬物、例えば低溶解度を有するチアゾール、がん薬、神経及び気分活性薬、並びにインスリンをペクチンベースのナノ構造を介して送達する試みも行われている（Sharma et al., 2012）。
ペクチンベースのナノ粒子を作製するための合成法と対照的に、本実施例は、特有の特徴を有するナノ粒子及びナノファイバーを作製するためのインビボでの果実ベースの系を使用することの可能性を示す。果実は、ナノ粒子及びナノファイバーを形成するための自己完結型の製造所としての機能を果たす。果実が熟成するにつれて、異化作用過程が活性化して果実軟化を生じ、正、負、及び両親媒性の特質を有する細胞壁糖タンパク質に由来するセルロース、ペクチン、及びポリペプチドを含むより低分子質量の細胞壁成分の産生、並びに均質化の間に放出されるカルシウムイオン及び低ｐＨをもたらす。組織が均質化され様々な成分が放出されると、様々な成分の自己組織化が起こることが観察される。外的影響を受けずに、この実施例において形成されたナノ粒子がサイズ、形状、及び物理化学的特徴の点で実質的に一様であったことは注意されるべきである。スミノミザクラ、ブルーベリー、及びブドウ等の異なる特徴を有する果実は全て、基本的な細胞成分のそのような自己組織化が実質的に同一の型のナノ粒子を形成する可能性を示す。
この実施例から明白となった興味深い特色は、成分のナノ粒子を形成する自己組織化を決定することにおけるアントシアニン及び場合によりリンゴ酸の役割である。アントシアニンの存在下では、ナノ粒子は球状で、ガラクツロナン－キシログルカン－アラビノガラクタン－ポリペプチドフィラメントが周りに巻きついた中心ペクチンコアを有する。これらのフィラメントはアントシアニンの存在下では本来ヘリックス状であり、フィブリル状構造で構成される。アントシアニンは両親媒性分子であり、様々な成分間の架橋構造としての機能を果たし得る。しかしながら、アントシアニンが除去されると、ナノ粒子は代わりにナノファイバーと称される薄膜型（ペクチンの平面構造、図７）及びファイバー様構造（フィロミセル型）を形成する。それらの形状とは無関係に、球状ナノ粒子とナノファイバーの両方は、高度に安定であり、種々の薬物（パクリタキセル、ビンクリスチン）、並びに／又は高効率性及び取込み能を有する無機質と結合する能力があり得る。機能という観点から見ると、球状ナノ粒子は、アントシアニンが複合体を形成した球状構造の内側に、遊離アントシアニンと比較してはるかに多く保護され、したがってこれらを胃と腸との間の移行中のｐＨ変化から守り得るため、例えばアントシアニンの結腸への標的化送達のためのアントシアニンの担体としての機能も果たし得る。
本実施例では、ナノ粒子及びナノファイバーを果実から調製し、ナノ粒子及びナノファイバーの物理化学的特徴及び機能性を調査及び記載する。これらのナノ粒子及びナノファイバーは、ポリフェノールの存在又は非存在下でペクチン、セルロース、及びタンパク質からのターシャリー構造形成を介して生成される巨大な表面積の点で特有である。生物起源のこれらのナノ粒子及びナノファイバーは、いくつかの用途における改変ナノ材料の代替を提供し得る。基本成分は食物（ジュース、スムージー）を通じて消費され、有害作用は観察されないため、構造成分の生物学的排出は任意の食物高分子と同じように生じ得ることが示唆されるだろう。ナノ粒子及びナノファイバーは、哺乳動物細胞によって内部移行され、例えば低分子、栄養分、薬物、無機質、又は他のそのような薬剤／カーゴの送達系として使用される可能性を示す。類似した材料に由来しているにもかかわらず、ナノ粒子とナノファイバーとは、本明細書で詳細に記載されているように、有意な相違点を有する。
ナノ粒子の機能及び用途
野生型及びＥＴＫＯマウスにおける体重に対するナノ粒子処置の効果
材料及び方法：
インビボ分析 － 動物及び遺伝子型同定 － Ｐｃｙｔ２＋／－マウス（本明細書においてＥＴＫＯマウスとも称す）をこれまでに記載されたように生成し、遺伝子型を同定した（Fullerton MD, et al. 2007）。Ｐｃｙｔ２とは、細胞膜及び細胞小器官の重要な成分であるリン脂質、すなわちホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ，phosphatidylethanolamine）の産生の制御を担う遺伝子である。Ｐｃｙｔ２遺伝子を完全にノックアウトすること（ヌル動物）は、早期胚性致死（子が誕生前に死亡する）をもたらすが、ヘテロ接合型動物（１コピーの遺伝子のみを有する）は誕生時及び誕生後に正常である。しかしながら、ヘテロ接合型マウスはリン脂質代謝の変化の結果として慢性的な体重増加を経験する。リン脂質を構成する成分のリダイレクションがあり、細胞機構がＰＥの産生からトリグリセリド（脂肪）の産生へと変化する。このことは、マウスが体重の増加、肝臓及び血漿におけるより多くの脂肪、並びに最終的にインスリンに対する感応性の減少（インスリン抵抗性）を有することを意味する。
Ｐｃｙｔ２＋／－マウスを交雑し、ヘテロ接合型コロニーをゲルフ大学において、大学の動物実験委員会によって承認された手順に従って維持した。マウスを１２時間明／１２時間暗サイクルで収容し、水を自由摂取させ、標準化された固形飼料（カタログ番号Ｓ－２３３５；Harlan Teklad社）を給餌した。マウスを４つの実験群に分けた（ｎ＝３～６／群）：（ｉ）野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）－未処置（ＷＴ－Ｕ，Wild type-Untreated）、（ii）野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）－処置（ＷＴ－Ｔ，Wild type-Treated）、（iii）Ｐｃｙｔ２ノックアウト－未処置（ＫＯ－Ｕ，Knockout-Untreated）、及び（iv）Ｐｃｙｔ２ノックアウト－処置（ＫＯ－Ｔ，Knockout-Treated）。生化学的アッセイのために得たサンプル（血液血清及び組織（肝臓））を液体窒素中で急速凍結し、後の使用のために－８０℃で保存した。
血液分析。臨床死後、終末血液を心臓から収集した。血清を直ちに分離し、生化学的分析、例えばアルブミン、グロブリン、Ａ：Ｇ、総タンパク質、ＡＬＴ、ＡＳＴ、コレステロール、ＣＫ、グルコース、リン、トリグリセリド、及び尿素に関する分析のためにAnimal Health Laboratory（ゲルフ大学；分析のための認定施設）に送った。
化学物質及び試薬。L-typeトリグリセリドMキットをWako Diagnostics社（日本、大阪、及びNeuss、Germany）から購入した。ｐ６５ ＮＦ－ｋＢ及びΒ－チューブリンに対する抗体は、それぞれSanta Cruz Biotechnology社及びCell Signaling Technology社からであった。ＲＮＡ単離のためのRNeasy PlusキットはQiagen社（Valencia、CA、USA）からであった。ｃＤＮＡ調製のためのHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription KitはApplied Biosystems社（Foster city、CA、USA）からであった。使用したプライマーを以下に列挙する。
Figure 2022513081000005
ナノ粒子処置。実験を、２４～３０週齢Ｐｃｙｔ２ノックアウトマウス及び同腹仔対照を用いて実施した。ＫＯ及び対照マウスの未処置群（野生型；それぞれｎ＝３～６）に１００ｕＬの水を１週間当たり３回与えた（強制投与によって）。ＫＯ及び対照マウスの処置群（それぞれｎ＝３～６；平均体重約４０ｇ）に１００ｕＬの水中１００ｍｇ／ｋｇ／４週ポリフェノール当量のナノ粒子溶液を１週間当たり３回投与した（１用量当たり１３３μｇポリフェノール当量）。全ての群に対する強制経口投与は４週間継続した。試行を２回繰り返し、試行の最後にマウスを屠殺し、血液及び組織分析のために使用した。
免疫ブロッティング。ＮＦ－ｋＢを、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、及び化学発光によるバンドの検出を使用する免疫ブロッティングによって決定した。膜を、１倍ＰＢＳＴ中５％ミルクでブロッキングし、抗ＮＦ－ｋＢ（Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、California、USA）抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、膜を抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートし、化学発光（Sigma-Aldrich社）によって可視化した。β－チューブリンでの膜のリハイブリダイゼーションを実行して、担持精度を確かめた。特異的バンドの密度をイメージングデンシトメーター（Image J）で定量した。
肝臓トリグリセリド決定。肝臓のＴＧ含量を、キット（Wako社）手順に従ってL-type TG M試薬を使用して測定した。
総ＲＮＡ単離及び遺伝子発現。総ＲＮＡを、RNeasy Plusキット（Qiagen社、Valencia、CA、USA）を使用して単離し、ｃＤＮＡを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems社、Foster city、CA、USA）を使用して調製した。所望の遺伝子を、ＰＣＲ増幅の対数期において、最適な量のｃＤＮＡ及び反応サイクル数を使用して分析した。各遺伝子レベルを、内部ＧＡＰＤＨ対照を基準として表す。試験した遺伝子としては、炎症誘発性遺伝子（ＳＴＡＴ４、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－６）並びに脂肪分解遺伝子（ＦＡＳ、ＡＴＧＬ、ＨＳＬ、ＬＰＬ、ＰＧＣ１－α、ＰＰＡＲ－α、ＰＰＡＲ－γ、ＣＴＬ１、ＰＣＹＴ１、及びＰＳＳ２）が挙げられる。実験を、Ｐｃｙｔ２＋／－及びＰｃｙｔ２＋／＋雄及び雌マウスから収集した肝臓サンプルを使用することによって実施した。反応産物を電気泳動に供し、バンドを臭化エチジウム染色で可視化した。Image J 1.46ソフトウェアを使用してバンド密度を定量し、遺伝子レベルを、対照を基準とする倍率変化として表す。使用したプライマーは上の表に列挙される。
ＮＦ－ｋＢを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、及び化学発光によるバンドの検出による免疫ブロッティングによって決定した。膜を、１倍ＰＢＳＴ中５％ミルクでブロッキングし、抗ＮＦ－ｋＢ（Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、California、USA）抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、膜を抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートし、化学発光（Sigma-Aldrich社）によって可視化した。β－チューブリンでの膜のリハイブリダイゼーションを実行して、担持精度を確かめた。特異的バンドの密度をイメージングデンシトメーター（Image J）で定量した。
統計分析。統計分析を、Prism GraphPadを使用して完了させた。データを平均±Ｓ．Ｅ．として表す。統計的有意性を、スチューデントのｔ検定（０．０５未満のＰ値を有意と見なした）又は多因子ＡＮＯＶＡのいずれかを使用して計算した。有意な効果が見出された場合、事後比較を、テューキーの真の有意差検定を使用して行った。差をＰ＜０．０５において有意と見なした。
結果及び考察：野生型マウス及びＥＴＫＯマウスにおける体重に対するナノ粒子処置の効果を研究する実験を実施した。図１８は、野生型及びＥＴＫＯマウスにおける体重変化に対する、マウスにナノ粒子（ＮＰ）の溶液を給餌する効果を示す。マウス（６～７月齢）をそれぞれ５～６匹の４つの群（野生型未処置（ＷＴ Ｕ）、野生型処置（ＷＴ Ｔ）、ノックアウト未処置（ＫＯ Ｕ）、及びノックアウト処置（ＫＯ Ｔ））に分けた。ナノ粒子処置マウスは、１３３μｇ当量のＮＰ溶液／４０ｇ体重／日（体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの抽出物）の用量を強制投与によって週に５回与えられた。未処置マウスは水を与えられた。実験は４週間継続した。第１週目のＮＰ処置は試験群間でマウス体重に対する効果を有しなかったが、２、３、及び４週目後、ＮＰ処置の継続はＥＴＫＯマウスにおいて体重増加を予防した。これらの特定の用量／条件において、ＷＴ未処置とＷＴ処置との間に体重減少の有意な変化は存在しなかったが、ＫＯ未処置とＫＯ処置との間の体重増加の低減は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、肥満及び／又は体重減少の治療及び／又は管理におけるナノ粒子の使用を支持する。
肝臓におけるトリグリセリドレベル、肝臓組織の組織病理学、血清生化学的パラメータ、及び遺伝子発現に対するナノ粒子処置の効果
材料及び方法：
組織学的分析。肝臓組織学を検査するために、組織を１０％中性緩衝ホルマリン＋リン酸緩衝生理食塩水中で固定し、パラフィンに包埋した。１０μｍ肝臓切片をヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ，hematoxylin and eosin）で染色し、光学顕微鏡法によって可視化した。組織脂質を、これまでに記載されたように、イメージングデンシトメーター（Image J）で分析した（Fullerton et al. 2007）。
肝臓トリグリセリド決定。肝臓のＴＧ含量を、キット（Wako社）手順に従ってL-type TG M試薬を使用して測定した。
血液分析。マウスの臨床死後、終末血液を心臓から収集した。血清を直ちに分離し、生化学的分析、例えばアルブミン、グロブリン、Ａ：Ｇ、総タンパク質、ＡＬＴ、ＡＳＴ、コレステロール、ＣＫ、グルコース、リン、及びトリグリセリドに関する分析のために送った。
結果及び考察：
野生型及びＥＴＫＯマウスの肝臓におけるトリグリセリドレベルに対するナノ粒子処置の効果を調査する研究を実施した。通常の生理的状態では、肝臓が脂肪の貯蔵に関与していないため、肝トリグリセリドレベルは比較的低い。非アルコール性脂肪性肝臓のトリグリセリドは、血漿から細胞への脂肪酸取込みの速度及び肝細胞の貯蔵容量に依存する（Bradbury MW. 2006、Kawano Y 2013）。肥満マウス肝臓組織におけるトリグリセリドの蓄積のため、トリグリセリドのレベルを、ナノ粒子（ＮＰ）処置を伴う又は伴わないＷＴ及びＥＴＫＯマウスにおいて調査した。図１９は、マウス肝臓におけるトリグリセリドレベルの変化に対するナノ粒子（ＮＰ）処置の効果を示す。肝臓組織のトリグリセリドレベルを、Wako社製L-type TG Mアッセイキット（Wako Life Sciences社、CA、USA）を使用して、記載されている手順によって推定した。ＮＰ処置に供したＥＴＫＯマウスにおいてトリグリセリドレベルの有意な減少が存在した。上段のパネルは、雄マウスと雌マウスの両方から取得したデータを示す。下段のパネルは、雄マウスから取得したデータを示す。ナノ粒子（ＮＰ）処置による肝臓トリグリセリドの減少は、肥満マウス肝臓、又はそれを必要とする別の動物若しくは対象の肝臓におけるトリグリセリドレベルを減少させるためのＮＰの使用を支持する。
肝臓組織の組織病理学に対するナノ粒子処置の効果を調査する研究も実施した。脂質液滴を肝細胞脂質貯蔵細胞小器官と見なした（Mashek DG, 2015）。ある特定のメタボリックシンドローム疾患は、肝臓における異常な脂質蓄積に起因して発症すると考えられる（Gluchewaski 2017）。したがって、野生型及びノックアウト（ＥＴＫＯ）マウスにおける肝臓組織の組織病理学及び肝臓脂質液滴に対するナノ粒子処置の効果を調査する研究を実施した。図２０は、ナノ粒子処置に供したマウス（ＷＴ及びＫＯ）からの肝臓切片の組織病理学を示す。凍結切片を、オイルレッドＯ染色（Sigma-Aldrich社）で染色して、トリグリセリドを含有する脂質液滴を赤色液滴として可視化した。上２段のパネル／列は、野生型（未処置－上段；ナノ粒子処置、下段）マウスからの染色肝臓切片の画像を表す。赤く染色した範囲の定量は、対照及び処置セットのマウスにおいてほとんど変化を示さない。各パネル／列は３匹の独立したマウスからの切片を表す。下２段のパネル／列は、ＥＴＫＯ未処置（上段）及びＮＰ処置（下段）マウスからの肝臓切片の外観を示す。全般に、ＥＴＫＯマウスからの肝臓切片はいくつかの空の範囲を示す。これらの範囲は処置ＥＴＫＯマウスでは減少する。さらに、肝臓の構造はＷＴと類似する傾向がある（対照よりも比較的紫色の範囲である）。オイルレッド染色領域の範囲は処置後有意に減少する（図の下段のパネル）。処置後、ＷＴ－Ｔ／ＷＴ－Ｕ群では有意な変化は観察されなかったが、ＫＯ－Ｔ（処置）マウスではＫＯ－Ｕ（未処置）マウスと比較して脂質液滴の量の有意な減少が存在した。これらのデータは、ＮＰ処置が肥満マウス肝臓において脂質液滴の百分率を減少したことを示す。
ナノ粒子での処置後の肥満マウスにおける肝臓トリグリセリドの減少、及び肝臓の組織病理学的検査からの結果を考慮すると、ナノ粒子処置は肝臓における脂質沈着を制御する効果的な手段となり得ると考えられる。非アルコール性脂肪肝（すなわちＮＡＳＨ，Non-Alcoholic Steatosis）下で観察されるような状態は、肥満マウスにおいて観察される状態に類似している。したがって、本明細書に記載されるナノ粒子等の抗炎症性植物産物の摂取は、例えば動物、哺乳動物、又はヒト対象におけるＮＡＳＨを制御及び／又は管理する手法となり得る。
マウス（野生型、ＷＴ，wild type、及びノックアウト、ＫＯ，knockout）における血清生化学的パラメータに対するナノ粒子処置の効果を調査する研究も実施した。血清パラメータは個体の栄養状況の重要な指標である。循環脂肪酸のレベルの増加は、それらと立体構造変化を引き起こすアルブミンとの結合を引き起こし得る（Yamato M 2007）。グロブリンのレベルは肥満及び肝臓疾患のために変化し得る。総タンパク質量のばらつきは、肝臓及び腎臓障害、心不全、並びに栄養障害を示し得る。肝酵素であるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ，alanine aminotransferase）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ，aspartate aminotransferase）の上昇もまた、非アルコール性脂肪性肝臓疾患及び肥満の場合に観察される異常な肝機能の肝要な指標である（Marchesini G 2008）。高血中レベルのコレステロール及びトリグリセリドは、脂質代謝障害、高脂血症、又は高コレステロール血症の結果である。血液血清におけるクレアチンキナーゼ（ＣＫ，Creatine Kinase）の量の増加は筋損傷、心臓疾患、慢性腎疾患、及び急性腎不全（腎臓）の指標である。血清におけるリンレベルは通例、栄養障害、吸収不良、及び腎機能不全（リン）に関連する。高レベルのグルコースは、通例糖尿病を示すが、多くの他の疾患に関連する場合もある。
４つの実験群（野生型ナノ粒子処置及び未処置－ＷＴ－Ｔ、ＷＴ－Ｕ、並びにノックアウトナノ粒子処置及び未処置、ＫＯ－Ｔ及びＫＯ－Ｕ）におけるアルブミン、グロブリン、Ａ：Ｇ、総タンパク質、ＡＬＴ、ＡＳＴ、コレステロール、ＣＫ、グルコース、リン、及びトリグリセリドの血清濃度に対するＮＰ処置の効果を調査するために、マウスを体重１ｋｇ当たり１００ｍｇのＮＰ溶液で４週間の期間にわたって処置した。図２１は、ナノ粒子（ＮＰ）処置及び未処置マウスの血液血清パラメータを示す。アルブミン、グロブリンのレベル、及びそれらの比の主要な変化は存在しなかった。血清における総タンパク質レベルのわずかな減少が存在するようである。値は３つの独立した処置の平均±ＳＥＭである。図２２は、対照及びＮＰ処置マウスの血清生理機能マーカー（ＡＬＴ、ＡＳＴ、コレステロール、及びＣＫ）のレベルの変化を示す。分析を、ゲルフ大学のLaboratory Services Divisionの病理学研究室において、検査キットを使用する標準的な手順によって実行した。アラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、肝臓の機能状況を示す酵素である。肝機能が不良である場合又は肝臓が炎症を起こしている場合、より多くのこれらの酵素が血液中に分泌される。肥満マウスにおいて、ＮＰ処置に応答したＡＬＴとＡＳＴの両方のレベルの有意且つ実質的な低下が存在した。これらの酵素レベルが低かった野生型マウスにおいてさえ、ＮＰ処置は低減をもたらした。ＮＰ処置は肥満マウスにおいて肝機能を正常化するようである。血清におけるコレステロールレベルもまた、野生型マウスと肥満マウスの両方においてＮＰ処置に応答して減少した。高クレアチンキナーゼレベルは筋損傷の指標であり、これもまたＮＰ処置肥満マウスにおいて大きな低減を示した。これらの結果はＮＰ処置の抗炎症機能を支持する。図２３は、未処置及びナノ粒子処置マウスの血液におけるグルコース及びリンのレベルを示す。未処置及び処置野生型マウスと未処置及び処置ＥＴＫＯマウスの両方の血清におけるリンのレベルにおいて主要な変化は存在しなかった。グルコースレベルは、野生型において類似し、ＮＰ溶液での処置後の肥満マウスにおいて低減する傾向を示した。
遺伝子発現に対するナノ粒子処置の効果
結果及び考察：
様々な関連する生物学的経路及び／又は状態に関与する様々な肝要な遺伝子の発現レベルに対するナノ粒子処置の効果を調査する研究を実施した。マウス（野生型、ＷＴ、及びＥＴＫＯノックアウト、ＫＯ）をナノ粒子で処置し、遺伝子発現レベルの変化を分析した。
シグナル伝達兼転写活性化因子４（ＳＴＡＴ４，Signal Transducer and Activator of transcription 4）は、タンパク質のＳＴＡＴファミリーの転写因子である。ＳＴＡＴ４は、ヤヌスキナーゼによってリン酸化され、サイトカインシグナル伝達の間のその二量体化及び核内への移行を可能となり、遺伝子発現が増加する。Ｓｔａｔ４関連遺伝子発現の増加は炎症性経路の活性化の表れである。図２４は、ナノ粒子溶液での処置に応答したＳＴＡＴ４遺伝子発現の変化の評価を示す。定量を、ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウムでの染色によって行った。未処置野生型マウスと処置野生型マウスとの間にＳＴＡＴ４のレベルの有意な変化は存在しない。ＮＰ溶液を給餌したＥＴＫＯマウスにおいてＳＴＡＴ４発現の低減傾向が存在する。値は、この試験における未処置ＥＴＫＯマウスのレベルと有意には異ならなかったが、低減傾向が観察された。値は、各群において４～５匹の平均±ＳＥＭである。このことは、ナノ粒子溶液が身体の炎症状況を減少させる可能性を示し得ることを示唆する。
核因子－ｋＢ（ＮＦ－ｋＢ，Nuclear Factor-kB）は、インターロイキン及び腫瘍壊死因子－α等のサイトカインを介した炎症シグナル伝達の開始に関与する肝要なタンパク質である。経路は複雑であり、状態に基づいて炎症誘発性と抗炎症性の両方の役割を有し得る。ＮＦ－ｋＢシグナル伝達の低下は炎症関連慢性障害の下方制御に有利であると見なされる。図２５は、ナノ粒子溶液での処置に応答したＮＦ－ｋＢ遺伝子発現の変化の評価を示す。ＮＦ－ｋＢバンド強度をウェスタンブロット及び化学発光検出によって定量した。未処置野生型マウスと処置野生型マウスとの間にＮＦ－ｋＢのレベルの有意な変化は存在しなかった。類似した観察結果が肥満マウスの場合に得られた。しかしながら、野生型マウスと比較した場合、肥満マウスではＮＦ－ｋＢ発現レベルの増加が存在した。これらの結果は、野生型と比較した肥満マウスの炎症性状況の増加を示唆する。値は、各群において４～５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
ＴＮＦαは、感染症及び自己免疫活性化によって引き起こされる炎症と関連するシグナル伝達経路に関与する肝要なタンパク質である。ＴＮＦαの下方制御は関節炎等の慢性自己免疫疾患を制御するのに理想的であると見なされる。ＴＮＦαの減少は、身体における炎症状態とも関連付けられる肥満の減少という点で望ましい。図２６は、ナノ粒子溶液でのマウスの処置に応答したＴＮＦα遺伝子の発現の変化の評価を示す。定量を、ＲＴ－ＰＣＲ、及びアガロースゲル電気泳動による産物の分離、及び臭化エチジウム染色によって行った。未処置野生型マウスと処置野生型マウスとの間にＴＮＦα遺伝子発現のレベルの有意な変化は存在しない。ＮＰ溶液を給餌したＥＴＫＯマウスにおいてＴＮＦα発現の有意な減少が存在する。値は、各群において４～５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
ＩＬ６は、炎症誘発性経路と抗炎症性経路の両方を媒介するサイトカインである。ＩＬ６の活性化は、いくつかの障害を生じる慢性炎症性状態の発症を引き起こすことが公知である。ＩＬ６には多数の役割が存在する。ＩＬ６－受容体に対するモノクローナル抗体（トシリズマブ）は炎症性疾患である関節リウマチを標的とする。ＩＬ６の下方制御は肥満等の慢性状態を減少させるのに役立ち得る。図２７は、ナノ粒子溶液でのマウスの処置に応答したＩＬ６遺伝子の発現の変化の評価を示す。未処置野生型マウスと処置野生型マウスとの間にＩＬ６のレベルの有意な変化は存在しない。ＮＰ溶液を給餌したＥＴＫＯマウスにおいてＩＬ６発現の有意な減少が存在する。値は、各群において４～５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ，Fatty Acid Synthase）は、脂肪酸の生合成に関与する酵素である。脂肪酸はトリグリセリドに変換され、脂肪酸のレベルの増加は肥満を生じる脂肪の沈着を引き起こし得る。したがって、この酵素レベルの減少はトリグリセリド生合成及び沈着の減少に有利であり得る。図２８は、ナノ粒子溶液での処置に応答したＦＡＳＮ遺伝子発現の変化の評価を示す。定量を、ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離すること、及びバンドを可視化するために臭化エチジウム染色することによって行った。ＮＰ処置野生型マウスにおいてＦＡＳのレベルの有意な減少が存在した。ＮＰ溶液を給餌したＥＴＫＯマウスにおいてＦＡＳ発現の低減傾向が存在した。値は、この試験における未処置ＥＴＫＯマウスのレベルと有意には異ならなかった。値は、各群において４～５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
脂肪トリグリセリドリパーゼ（ＡＴＧＬ，Adipose Triglyceride Lipase）は、脂肪酸へのトリグリセリド異化作用の開始に関与する酵素である。ＡＴＧＬ機能はメタボリックシンドロームの発症に潜在的に関与する。図２９は、ナノ粒子溶液での処置に応答したＡＴＧＬ遺伝子発現の変化の評価を示す。定量を、ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離すること、及びバンドを可視化するために臭化エチジウム染色することによって行った。対照とＮＰ処置野生型マウスとの間にＡＴＧＬのレベルの有意差は存在しなかった。同様に、ＡＴＧＬ発現のレベルは未処置及びＮＰ処置ＥＴＫＯマウスにおいて同じであった。値は、各群において４～５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ，Hormone Sensitive Lipase）は、脂肪組織におけるトリグリセリドの加水分解に関与する肝要な酵素、及びエネルギー生成に関与する肝要な酵素である。ＨＳＬはＡＴＧＬと共に作用して、遊離脂肪酸をトリグリセリドから遊離させる。酵素は、空腹時のようなエネルギーが必要とされる場合にカテコールアミンに応答して活性化し、したがって貯蔵された脂質を動員することにおいて機能する。この酵素はまた、ステロイド新生において脂肪酸をコレステロールエステルから遊離させる。ＨＳＬは、泡沫細胞におけるコレステロールエステルを分解することによってアテローム動脈硬化症を軽減する機能を有し得る。図３０は、ナノ粒子溶液での処置に応答したＨＳＬ遺伝子発現の変化の評価を示す。定量を、ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離すること、及びバンドを可視化するために臭化エチジウム染色することによって行った。対照とＮＰ処置野生型マウスとの間にＨＳＬ転写物レベルの有意な増加が存在した。ＨＳＬ発現のレベルは未処置及びＮＰ処置ＥＴＫＯマウスにおいて同じであった。値は、各群において４～５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ，Lipoprotein lipase）は、リポタンパク質に結合したトリグリセリドを加水分解し、遊離脂肪酸及びモノアシルグリセロールを遊離させる酵素である。ＬＰＬは膵及び肝リパーゼ等の他のリパーゼと類似している。ＬＰＬは、心臓、筋肉、及び脂肪組織等のいくつかの組織に存在し、毛細血管における管腔に近い細胞層に存在する。ＬＰＬは、毛細血管におけるリポタンパク質代謝に影響を与え得る。ＬＰＬ活性はインスリン及びアドレナリン等のホルモンによって差次的に制御される。ＬＰＬレベルは、高脂肪食又は高炭水化物食後に増加することが公知であり、肥満の発症における機能を有し得る。図３１は、ナノ粒子溶液での処置に応答したＬＰＬ遺伝子発現の変化の評価を示す。定量を、ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、バンドを可視化するために臭化エチジウム染色することによって行った。野生型マウスにおいてＮＰ処置に応答したＬＰＬ転写物のレベルの変化は存在しなかった。反対に、ＮＰ処置ＥＴＫＯマウスではＬＰＬ発現のレベルの有意な減少が存在した。値は、各群において４～５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ共役因子（ＰＧＣ１－α，Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator）は、炭水化物及び脂質と関連するエネルギー代謝の制御に関与する転写共役因子のファミリーに属する。ＰＧＣ１－Ａはストレス条件下で活性化する。このタンパク質はまた、炎症経路を増強することに関与するＮＦ－ｋＢを活性化することが公知である。したがって、ＰＧＣ１－Ａのレベルの低減は炎症を下方制御し得る。図３２は、ナノ粒子溶液での処置に応答したＰＧＣ１－α遺伝子発現の変化の評価を示す。定量を、ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、バンドを可視化するために臭化エチジウム染色することによって行った。野生型マウスにおいてＮＰ処置に応答したＰＧＣ１－アルファ転写物のレベルの変化は存在しない。反対に、ＮＰ処置ＥＴＫＯマウスではＰＧＣ１－アルファ発現のレベルの有意な減少が存在した。値は、各群において４～５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体－アルファ（ＰＰＡＲ－α，Peroxisome Proliferator Activated Receptor-Alpha）は、核局在転写因子の群に属する。ＰＰＡＲ－アルファは、脂肪酸の取込み、輸送、及び異化作用に関与する遺伝子の刺激を含む、肝臓での脂質代謝における肝要な制御機能を有する。ＰＰＲ－アルファノックアウトマウスは脂肪性肝臓疾患を生じる異常な脂質代謝を有する。図３３は、ナノ粒子溶液での処置に応答したＰＰＡＲ－α遺伝子発現の変化の評価を示す。定量を、ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離すること、及びバンドを可視化するために臭化エチジウム染色することによって行った。野生型マウス及びＥＴＫＯ肥満マウスにおいてＮＰ処置に応答したＰＰＡＲ－α転写物のレベルの変化は存在しなかった。値は、各群において４～５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体－ガンマ（ＰＰＡＲ－ｇａｍｍａ，Peroxisome Proliferator Activated Receptor-gamma）は、核に位置する別の転写因子である。このタンパク質は脂肪細胞の増殖に関与し、肥満発症を増強する。ＰＰＡＲガンマは脂肪組織において発現し、筋肉ではより低いレベルで発現する。ＰＰＡＲガンマは肥満及びII型糖尿病の発症に影響を与えることが公知である。図３４は、ナノ粒子溶液での処置に応答したＰＰＡＲ－γ遺伝子発現の変化の評価を示す。定量を、ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、バンドを可視化するために臭化エチジウム染色することによって行った。ＮＰ処置野生型マウスにおいてＰＰＡＲ－ガンマ転写物の有意な減少が存在する。ＮＰ処置後の肥満マウスではＰＰＡＲガンマのレベルの主要な変化は存在しなかった。値は、各群において４～５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
コリントランスポーター様タンパク質１（ＣＴＬ－１，Choline Transporter Like Protein 1）は、膜結合酵素であり、脳細胞の形質膜及びミトコンドリアに見出される。これは、ホスファチジルコリン生合成及び膜新生に使用される、ミトコンドリアにおけるコリンの輸送に関与する。炎症によるマクロファージの産生の増強は、ＣＴＬ－１の過剰発現をもたらし、炎症の増加と関連するようである。高レベルの膜新生の減少は、細胞の肥大及び肥満関連変化を低減することに役立ち得る。図３５は、ナノ粒子溶液での処置に応答したＣＴＬ１遺伝子発現の変化の評価を示す。定量を、ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、バンドを可視化するために臭化エチジウム染色することによって行った。野生型マウスにおいてＮＰ処置に応答したＣＴＬ－１転写物のレベルの変化は存在しない。反対に、ＮＰ処置ＥＴＫＯマウスではＣＴＬ１発現のレベルの有意な減少が存在した。値は、各群において４～５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
ＣＤＰ－ジアシルグリセロール－－セリンＯ－ホスファチジルトランスフェラーゼ２；ホスファチジルセリン合成酵素２（ＰＳＳ２，phosphatidylserine synthase 2）は、ホスファチジルセリン生合成に関与する酵素である。このタンパク質はミトコンドリアに局在する。ＰＳＳ２ノックアウトマウスは通常の寿命を示した。図３６は、ナノ粒子溶液での処置に応答したＰＳＳ２遺伝子発現の変化の評価を示す。定量を、ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離すること、及びバンドを可視化するために臭化エチジウム染色することによって行った。野生型マウスにおいてＮＰ処置に応答したＰＳＳ２転写物のレベルの変化は存在しなかったが、ＥＴＫＯマウスでは少ないが有意な減少が観察された。値は、各群において４～５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
果実、果汁、及び果実粉末の機能的（抗酸化、抗炎症性）及び疾患予防性質は、これらの果実に存在する様々な成分、例えばアントシアニン、フェノール性成分、ビタミンＣ等の存在によると考えられている。しかしながら、それらの性質のため、アントシアニンは身体に効率的には吸収されない。また、アントシアニンは胃腸系を通過する移行の間に構造再編成を受ける。腸におけるアルカリ性条件はアントシアニンの開環を引き起こす。ナノ粒子と複合体を形成するアントシアニンはより容易に腸の表皮を越えて輸送され得、アントシアニンを身体の内部に潜在的に放出し得る。内部移行したアントシアニンは、タンパク質（ＴＮＦアルファ、ＳＴＡＴ、インターロイキン、及びそれらの受容体）と、代謝経路を制御し代謝経路に関わるエフェクター酵素とを伴う炎症性経路を下方制御することによって遺伝子発現を変化させるだけでなく、抗酸化物質として（ＲＯＳを捕捉することによって）炎症の減少が有利となるように遺伝子発現を変化させ得る。
これらの結果は、ナノ粒子での治療の直接的効果、及び肥満の減少を実証する。裏付けとなる効果としては、トリグリセリド肝臓の軽減、肝臓の病態の軽減（脂質液滴の減少）、肝機能マーカー酵素、例えばＡＬＴ及びＡＳＴの減少、身体質量の著しい減少（４週間以内に１０％を超える）、炎症促進遺伝子発現の下方制御等が挙げられる。慢性変性疾患の軽減は果実及び野菜の消費の増加に関連する。機能性成分の利用可能性は果実、野菜、ナッツ、香辛料等を含む種々の製品の消費に依存するため、これらの研究は、少なくとも部分的には、単回濃縮高効力用量を介してそのような成分の組合せを提供することを目的とし、炎症マーカーの減少及び体重増加の予防という観点から見た実効性を体重１ｋｇ当たり約２．５ｍｇ（マウス試行）の１日用量で観察した。このデータのヒトへの投影は、例えば７０ｋｇの体重の人物の場合約１７５ｍｇの１日用量を示唆する。
ナノファイバーの機能及び用途
送達ビヒクルとしてのナノファイバー（及びナノ粒子）、並びに結腸直腸がん細胞に対するスミノミザクラ（酸果桜桃）果実からのナノ粒子及びナノファイバーの細胞毒性
材料及び方法：
スミノミザクラ：この実施例において使用した果実は、これらを生殖質として維持するVineland Research Station、Vineland、Ontarioのものであった。全ての品種は、ポリフェノール含量が生体重１００ｇ当たり３００～５００ｍｇの範囲に及ぶ高ポリフェノール含有品種である。本研究のために使用した主要な品種はV 70151であり、その他の品種、例えばV 71261、Hymann Conserva、及びHymann Rubisnもまた高レベルのナノ粒子形成を示した。
ナノ粒子及びナノファイバーの単離：抽出方法は、ポリトロンホモジナイザー及びPTA 10プローブを使用して、１：１ｗ／ｗの割合（水又はアルコール１ｍｌに対して組織１ｇ）の媒体（好ましくは水だが、無水又は希釈メタノール又はエタノールを使用してもよい）中、中間（４～５）設定で、果実組織が完全に均質化するまで果実を均質化することを含む。ホモジネートを、４層のチーズクロスを介して濾過して、細片を除去した。結果として得たホモジネートをSorvall RC 6 Plus遠心分離機において２０分間遠心分離した（１８，０００×ｇ）。上清をデカントした。５ｍｌの上清を水（１リットル）に対して４℃で１２時間透析した（spectra-Por、６～８ｋＤのカットオフ）。透析バッグ内の透析抽出物を上清（粗抽出物と呼ぶ）と同じように－２０℃で凍結して保存した。水に浸出するポリフェノールは相当に希釈されるため、実験目的のためにこれを、sep-pak C18カートリッジに通しメタノールで溶出することによる疎水性相互作用クロマトグラフィーによって濃縮した。
ポリフェノール推定及び分析：ポリフェノールを、本発明者らの研究室において慣例的に実施されているフォーリン・チオカルト法によって推定した（Jacob, J.K. and Paliyath, G. (2008) Physico-chemical characteristics of nanovesicle-carbohydrate complexes in grape juice, J. Agr. Food Chem., 56, 1305-1315）。抽出物の適切なアリコートを、水中５０％（ｖ／ｖ）のエタノールで１００μｌの最終容量まで希釈した。蒸留水（０．５ｍｌ）及び５０μｌのフォーリン・チオカルト試薬（２Ｎ）を混合溶液に添加した。炭酸ナトリウム（５％（ｗ／ｖ）の１００μｌ）を各サンプルに添加し、ボルテックスすることによって混合し、暗所にて１時間インキュベートした。サンプルを徹底的に混合した後、吸光度を、Beckman Coulter社製DU800分光光度計（Beckman Coulter Inc社、USA）を使用してλｍａｘ＝７２５ｎｍで測定した。標準曲線を、０～２００μｇ／ｍｌの範囲の濃度の没食子酸を使用して生成した。ポリフェノール濃度を、果実の生体重１グラム当たりの没食子酸当量として表す。
必要な場合、ポリフェノールを、Sep-Pak C18クロマトグラフィーを使用して精製及び濃縮した。通例、１～２ｍｇポリフェノール当量の抽出物を１ｍｌカートリッジにローディングし、１～２ｍｌの水で洗浄し、ポリフェノールを１００％メタノールで溶出した。メタノールを窒素流中４５℃で除去した。結果として得た乾燥ポリフェノールを、（ＨＰＬＣ－ＭＳ分析のために）メタノールに、又はメタノールを除去し、水に再溶解した後の抗酸化アッセイ及び細胞培養研究のために水に溶解した。
粗抽出物、透析抽出物、及び透析物画分から単離したアントシアニンのＨＰＬＣ－ＭＳ分析を、Agilent 1100シリーズＨＰＬＣ－ＭＳを使用して実施した。分離を、X-Terra（登録商標）MS C-18カラム（５μｍ、１５０×３．０ｍｍ、Waters Corporation社、MA、USA）を使用して実行した。アントシアニンを、０．８ｍｌ／分の流速のメタノール（溶媒Ａ）及び２．０％（ｖ／ｖ）ギ酸（溶媒Ｂ）の勾配で溶出した。使用した勾配は以下の通りであった：０～２分、９３％Ｂ；２～３０分、８０％Ｂ；３０～４５分、７０％Ｂ；４５～５０分；６５％Ｂ、５０～６０分、５０％Ｂ；６０～６５分、２０％Ｂ；６５～７０分、９３％Ｂ。検出を、アントシアニンに関しては５２０ｎｍ、フェノール酸に関しては２６０ｎｍで行った。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ，Electrospray ionization）をＡＰＩ－ＥＳ質量分析計で実施した。窒素を、３５０℃、１２ｌ／分の流速の噴霧乾燥ガスとして、４０００Ｖのイオンスプレー電圧及び８０Ｖのフラグメンター電圧で使用した。生成したイオンをｍ／ｚ１５０～７００まで走査した。スペクトルを正及び負イオンモードにおいて獲得した。２０μｌ（２０μｇ）のサンプル注入容量を全てのサンプルに関して使用した。化合物の構造同定を、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによって取得したそれらの分子イオン（ｍ／ｚ）を文献データ（www.metabolomics.jp）と適合させることによって達成した。３つの独立したサンプルを分析し、成分の分量を生体重１ｇの組織当量当たりの平均±ＳＥＭとして表した。
抗酸化能の推定：
抗酸化特性（活性酸素種又は活性化ラジカルを捕捉する能力）を、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシルアニオンラジカル、及びＤＰＰＨラジカルの捕捉における効率をインビトロアッセイ条件下で評価することによって実行した（Jacob, J.K. and Paliyath, G. (2008) Physico-chemical characteristics of nanovesicle-carbohydrate complexes in grape juice, J. Agr. Food Chem., 56, 1305-1315）。これらのラジカルを捕捉することにおける効率を具体的な消去率によって示す。
細胞培養：結腸に由来する３種類の細胞株、すなわち正常細胞株であるCRL 1790、結腸直腸がん細胞株であるHT 29、及び多剤耐性結腸直腸がん細胞株であるCRL 2158（ATCC）を使用して、ナノ複合体の細胞毒性を評価した。細胞を、各細胞株に具体的に推奨される培地中で培養した。HT 29に関して、使用した培地はＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Dulbecco's modified Eagle's medium、Sigma社）であり、CRL 2158に関して、使用した培地はＲＰＭＩであり、CRL 1790に関して、使用した培地はＥＭＥＭ（イーグル最小必須培地、Eagle's minimum essential medium；Cedarlane Labs社、Burlington、ON、Canada）であった。全ての培地にＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びＬ－グルタミンを補充した。コンフルエンシー（約８０％）において、細胞を１倍ＰＢＳで２回洗浄した。細胞をトリプシン－ＥＤＴＡと共に５分間インキュベートし、次いで１０％ＦＢＳを補充したそれぞれの培地において希釈した後、トリパンブルー（５０ｕｌの細胞及び４５０ｕｌのトリパンブルー）で染色し、生存している細胞を計数して、細胞毒性を評価した。細胞毒性を、生存細胞によるトリパンブルー排除及び死細胞の青色染色によって決定した。単位面積における死細胞の数を計数し、面積における総細胞の百分率として表した。
共焦点研究：２×１０５個の細胞を細胞培養皿（３５ｍｍ×１０ｍｍ）に播種し、プレートがコンフルエンシーに達するまで２日ごとに培地を交換した。細胞を、適した試薬で染色した後に共焦点顕微鏡下で検査した。Dylight 650（励起６５０ｎｍ。発光７００ｎｍ、Thermo Scientific Pierce Biology Products）は取込み実験の間、優れた性能及び安定性を提供することが見出された。ナノ複合体を含有する透析抽出物の凍結乾燥粉末（４ｍｇ）をジメチルホルムアミドに溶解したDylight 650エステルの１０μＭ溶液と混合し、コンジュゲーションのために２５℃で１時間インキュベートした。反応後、混合物を、６～８ｋＤ透析膜を使用して、遊離試薬が完全に除去されるまで水に対して透析した（３回）。Dylightとナノ複合体との結合を、透析ナノ複合体の蛍光をモニタリングすることによって評価した。
HT 29、CRL 1790細胞へのカルセイン取込み：カルセイン担持ナノ粒子の哺乳動物細胞への取込み。カルセインは単独では膜に不透過性であり、エンドサイトーシスによって低レベルで取り込まれ得る。エタノール脱色したサクランボを生体重１ｇ当たり１ｍｇ当量のカルセインも含有する水中で均質化し、上清を水に対して透析した。ナノフィラメントに対して複合体を形成したカルセインは透析バッグ内に保持され、共焦点顕微鏡検査による取込み測定のために使用される。カルセイン担持ナノ粒子はHT 29細胞とCRL 1790細胞の両方において個別の区画に取り込まれる。
Dylightとナノ複合体及びナノフィラメントとのコンジュゲーション並びにそれらのHT 29、CRL 1790、及びCRL 2158細胞への取込み：脱色していないスミノミザクラから単離したナノ複合体及びエタノール脱色したスミノミザクラから単離したナノフィラメントの哺乳動物細胞（HT-29、CRL 2158、CRL1790）への取込みの実証。ナノ複合体及びナノフィラメントをDylight 650とコンジュゲートし、水に対して徹底して透析して（３回）、非コンジュゲート色素を除去した。細胞を蒔き、４８時間増殖させた。コンジュゲートナノ複合体及びフィラメント（３ｍｌの培養培地中約５μＭ Dylight当量）を培地に添加し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。細胞をペトリ皿（直径３．５ｃｍ）に維持し、６３３ｎｍの励起を用いて共焦点顕微鏡（Leica社）下で観察し、発光を６８０ｎｍでモニタリングした。パネルＡ及びＢはそれぞれHT 29細胞によるDylightコンジュゲートナノ複合体及びナノフィラメントの取込みを示し、パネルＣ及びＤはそれぞれCRL 2158細胞によるDylightコンジュゲートナノ複合体及びナノフィラメントの取込みを示し、パネルＥ及びＦはそれぞれCRL 1790細胞によるコンジュゲートナノ複合体の取込みをそれぞれ示す。パネル中の挿入画像は細胞の拡大した合成画像である。（サイズバー）
生死細胞分析：細胞をこれまでに記載されたようにコンフルエント及びサブコンフルエント単層として２４時間増殖した（Hakimuddin, F, Paliyath, G. and Meckling, K. (2004). Selective cytotoxicity of a red grape wine flavonoid fraction against MCF-7 cells, Breast Cancer Res. Treatment. 85:65-79）。細胞をパクリタキセル、又はナノファイバーと一緒になったパクリタキセル（適した量のパクリタキセルとナノファイバーとを水中５％ＤＭＳＯに混合し、細胞に添加した）で１２時間処理した。細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、細胞生存試験をCRL 1790、CRL 2158、及びHT 29細胞に関して、生／死細胞生存キット（Invitrogen社、Mississauga、Ontario）を製造業者によって記載されているように使用して実施した。生死細胞を共焦点顕微鏡下で可視化した。アッセイキットは２種類の蛍光色素を含有する。カルセインＡＭエステル（Ｅｘ ４９４ｎｍ、Ｅｍ ５１７ｎｍ）は生細胞に特異的に進入し、脱エステル化し、生細胞を緑色に染色する。瀕死細胞及び死細胞は膜が損なわれており（漏出性の形質膜）、核を赤色に染色するエチジウムホモダイマーＥｘ ５１７ｎｍ／Ｅｍ ６１７）の進入を可能にする。細胞を、生細胞を識別する５１７ｎｍ（緑色チャネル）及び死細胞の可視化を可能にする６１７ｎｍで観察した。２つの波長の合成画像は細胞生存性の喪失への移行中である細胞を示す。
この実施例では、ナノファイバーを、パクリタキセルの１０倍溶液（５０％ＤＭＳＯ中）を適した量のナノファイバーとバイアル中で混合することによってパクリタキセルと結合させた。適した量は滅菌条件下で培養プレートに分注した。
自然組織化によって形成した球状又は繊維性の性質を有するナノ粒子又はナノファイバーをスミノミザクラ果実から単離した。主に炭水化物、タンパク質、及びポリフェノール（ナノ粒子）によって構成されるこれらのナノ粒子／ナノファイバーの機能特性を評価し、相違点を調査した。スミノミザクラ抽出物のナノ粒子富化画分は、強い抗酸化活性、及びHT 29結腸直腸がん細胞に対する細胞毒性の増加を示し、ポリフェノールを欠くエタノール脱色したサクランボからのナノファイバーは、この点において、試験された条件下では不活性であった。ナノ粒子とナノファイバーの両方は正常ヒト結腸細胞及びがん細胞によって内部移行された。細胞毒性分析は、ナノファイバーの存在又は非存在下のいずれにおいても、パクリタキセルで処理したHT-29細胞が高レベルの細胞毒性という結果になったことを明らかにした。多剤耐性結腸直腸がん細胞はナノファイバーの存在下でパクリタキセル処理に対して耐性であったが、この処理はほぼ完全な細胞毒性をもたらした。類似した処理条件下で、正常結腸細胞は、パクリタキセルの存在下又はナノファイバーと混合したパクリタキセルの存在下のいずれにおいても非常に少ない細胞毒性を示した。これらの結果は、ナノファイバーが、例えばがん細胞及び多剤耐性がん細胞において薬物の内部移行及び細胞毒性の誘導に効率的な手段となり得ることを示唆する。
Dylight 650とコンジュゲートしたナノ粒子及びナノファイバーは、哺乳動物細胞をこれらのコンジュゲート粒子で処理した場合、別々だが類似した細胞小器官に局在し、ナノ粒子又はナノファイバーのいずれかにコンジュゲートした成分が同様に吸収されて蓄積する類似した可能性を有し得ることを示唆する。Dylightに関するこれらの結果は、ナノ粒子又はナノファイバーが他の医薬品、栄養補助食品、又は他の生物学的に活性な薬剤（Dylightではない）とコンジュゲートする場合の適用に外挿され得ることが想定される。
抗酸化能の推定：抗酸化特性（活性酸素種又は活性化ラジカルを捕捉する能力）を、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシルアニオンラジカル、及びＤＰＰＨラジカルの捕捉における効率をインビトロアッセイ条件下で評価することによって実行した（Jacob, J.K. and Paliyath, G. (2008) Physico-chemical characteristics of nanovesicle-carbohydrate complexes in grape juice, J. Agr. Food Chem., 56, 1305-1315）。これらのラジカルを捕捉することにおける効率を具体的な消去率によって示す。
結果及び考察：
ナノ粒子及びナノファイバーの形態学：起源であるスミノミザクラ果実及びエタノール脱色したスミノミザクラ果実から単離したナノ粒子及びナノファイバーは別個の特徴を示した（実施例１及び３における考察、並びに図１及び１７（ナノ粒子）及び図３７（ナノファイバー）を参照のこと）。起源であるサクランボ抽出物からのナノ粒子は形態学の点で球状であった。詳細な分析は、ある特定の実施形態では球状複合体がペクチン成分、ヘミセルロース由来分子、細胞壁タンパク質に由来するペプチド、アントシアニン、及びリンゴ酸を含む繊維様構造によって囲まれるペクチンコアによって形成され得ることを示す。これらの複合体は溶液中で直径５０～２５０ｎｍであった。アントシアニン及び他の低分子（すなわち、ある特定の実施形態ではリンゴ酸）が除去されるスミノミザクラ果実のエタノール脱色後、結果として得た果実は均質化の間に長さ数マイクロメートル及び直径５～１０ｎｍの繊維様構造を形成した（図３７を参照のこと）。ナノ粒子とナノファイバーの両方を使用してそれらの機能特性を評価した。
ナノ粒子におけるポリフェノール含量：サクランボホモジネートを、高レベルのポリフェノールを含有するスミノミザクラの優良株から取得した。異なるサクランボ栽培品種を使用した抽出の間、ホモジネートは、水性抽出物では生体重１ｇ当たり０．８８～０．９４ｍｇのポリフェノールを含有し、メタノール抽出物では、ポリフェノール含量は生体重１ｇ当たり１．０４～１．１３ｍｇの範囲であった（実施例１、表１を参照のこと）。水又はアルコール（メタノール、最終約５０％ｖ／ｖ）中で調製したスミノミザクラホモジネートを水に対する透析に供することは、透析バッグ内にほぼ８０％のポリフェノールの、複合体を形成した状態での保持をもたらした（実施例１、表１を参照のこと）。メタノールでの果実の抽出は粗抽出物におけるポリフェノール含量をほぼ２０％増加したが、透析抽出物に残っている量は、水抽出物を透析した後に取得した量に匹敵した。透析バッグ（Ｍｒカットオフ６０００～８０００）から透析物へ移る遊離ポリフェノールの量は非常に少なかった（３％未満）。全般に、多回の抽出から、透析抽出物のポリフェノール含量は、水性抽出物では生体重１ｇ当たり０．６３～０．６５ｍｇの範囲であり、メタノール抽出物の透析抽出物では、これは生体重１ｇ当たり０．７０～０．８０ｍｇの範囲であった。透析物中のポリフェノール含量は非常に少なく、水性及びメタノール抽出物においてそれぞれ生体重１ｇ当たり０．０３～０．０６ｍｇの範囲であった。
透析抽出物及び透析物のポリフェノール組成をＨＰＬＣ－ＭＳ（実施例１、表２を参照のこと）及び成分によって分析した。ポリフェノールは大きな割合のフェノール性成分（９０％を超える）と小さな割合のフェノール酸（１０％未満）とを構成した。シアニジン－３－ルチノシドは主要なアントシアニンであり（約７０％）、ペオニジン－３－ルチノシドがそれに続いた。ペラルゴニジン－３－ルチノシド及びシアニジン－３－ソホロシドは約１０～１２％存在した。クロロゲン酸及びｐ－クマロイルキナ酸は主要なフェノール酸であった。透析物の定性的組成は透析抽出物の定性的組成と非常に類似していた。分量という観点から見ると、透析抽出物はより高含量のシアニジン－３－ルチノシド（約２５～３０％高い）を有し、ナノ粒子を形成することによる特異的富化を示した。
遊離ポリフェノール及び複合体を形成したポリフェノールの抗酸化能：粗抽出物、透析抽出物、及び透析物の抗酸化活性を水抽出物とメタノール抽出物の両方から測定した。スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、及びＤＰＰＨラジカルの具体的な消去を実施例１、表３に示す。水性又はメタノール性サクランボ粗抽出物は、非常に強いスーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、及びＤＰＰＨ捕捉能力を示した。ナノ粒子の部分であるにもかかわらず、ポリフェノールは透析物中の遊離ポリフェノールよりもはるかに高い高抗酸化活性を示し、複合体形成がポリフェノールの抗酸化活性を妨げないことを示唆した。したがって、これらの結果に基づくと、ポリフェノールを含有するナノ粒子の身体組織へのＧＩＴ膜を越えての進入がそれらの抗酸化機能を低下させる可能性は低い。
この実施例では、細胞のナノファイバー（及びナノ粒子）の取込みを研究し、様々なカーゴのための送達ビヒクルとしてのナノファイバー（及びナノ粒子）の用途を研究する実験を実施した。図３７は、これらの実験において使用したナノファイバーを代表するナノファイバーの例を示す。図３７は、２回の独立したナノファイバーの調製からのナノファイバーの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を示す。左のパネルはエタノール脱色したスミノミザクラからフリーズドライ（凍結乾燥）を使用して単離したナノファイバーを示す。右のパネルはナノスプレードライによって単離したナノファイバーを示す。これらのようなナノファイバーを使用して、以下にさらに詳細に記載するように、細胞の取込及び送達ビヒクルとしての用途を研究した。
無機質カーゴ、例えば鉄を運搬するためのナノファイバーの用途を調査する研究を実施した。図３８は、鉄と共に形成したナノファイバー複合体を示す。ナノファイバー調製物（２ｍｇ）を２ｍｌの水に溶解し、１ｍＭ塩化第一鉄と混合した。溶液を２時間インキュベートし、水に対して一晩透析して（２回）、未結合鉄を除去した。透析溶液を、酢酸ウラニル染色をせずに電子顕微鏡下で検査した。ナノファイバー複合体を鉄（酢酸ウラニルに代わって）で染色し、これはナノファイバーの、鉄の担体として使用される可能性を示した。
所望のカーゴであって、ナノファイバーと非共有結合により複合体を形成した、カーゴのための送達ビヒクルとしてのナノファイバーの使用を調査する研究も実施した。この研究では、ナノファイバーをカルセインの細胞送達のために使用した。図３９は、カルセイン担持ナノファイバーの哺乳動物細胞への取込み（カルセイン－ナノファイバー付加体）を示す。カルセイン（Ｅｘ ４９４ｎｍ／Ｅｍ ５１７ｎｍ）は単独では膜に不透過性であり、エンドサイトーシスによって低レベルで取り込まれ得る（図３９、Ａ、Ｃ）。エタノール脱色したサクランボを生体重１ｇ当たり１ｍｇ当量のカルセインも含有する水中で均質化し、上清を水に対して透析した。ナノファイバーに対して複合体を形成したカルセインは透析バッグ内に保持され、共焦点顕微鏡検査による取込み測定のために使用される。カルセイン単独の取込みは、比較すると、HT 29細胞（パネルＡ）及び正常ヒト腸細胞（パネルＣ）において非常に少なかった。カルセイン担持ナノファイバーは、結腸直腸がん細胞株HT 29（Ｂ）と正常ヒト腸CRL 1790（Ｄ）細胞の両方において個別の区画にはるかにより効率的に取り込まれる。（サイズバー－１０μｍ）。
ナノ粒子及びナノファイバーのがん細胞に対する細胞毒性：これらの研究は、正常ヒト結腸上皮細胞（CRL 1790）、ヒト結腸直腸がん細胞（HT 29）、及び多剤耐性ヒト結腸直腸がん細胞（CRL 2158）を使用した、パクリタキセルの存在又は非存在下における、スミノミザクラから単離した精製ナノ粒子及びナノファイバーの細胞毒性効果を評価する。ナノ粒子はポリフェノール当量アリコートとして添加し、ナノファイバーは重量ベースで添加した。細胞を４８時間の期間増殖させ、パクリタキセル（３２ｎＭ）及びペトリ皿１つ当たり４μｇ／ｍｌのナノファイバーで処理し、細胞毒性をトリパンブルー排除によって評価した。処理の効果を以下の表において様々な時間期間の処理後の残存細胞％として示す。
Figure 2022513081000006
ナノ粒子は単独では細胞に対して軽度の毒性を示した（上の表）。HT 29はナノ粒子に最も感応性であり、正常CRL 1790細胞は最も影響を受けなかった。多剤耐性細胞株CRL 2158は８０μｇ／ｍｌのポリフェノール濃度において残存細胞のほぼ２５％の減少を示した。同程度の感受性は正常細胞においても観察された。８０μｇ／ｍｌのポリフェノールにて処理したHT 29細胞は残存細胞のほぼ４２％の減少を示した。ナノファイバーは、使用した濃度（４μｇ／ｍｌ）ではいかなる細胞株に対しても細胞毒性ではなかった。ナノ粒子とナノファイバーとを混合した場合、８０μｇ／ｍｌのポリフェノール濃度ではHT 29及びＭＤＲ細胞株において細胞毒性のわずかな増加が存在した。パクリタキセルは単独ではHT 29細胞に対して細胞毒性であった（３２ｎＭで５０％残存）が、正常細胞及びＭＤＲ細胞は低レベルの細胞毒性を示した（上の表）。ナノ粒子をパクリタキセルと共に含めた場合、細胞毒性は試験された条件下では大きくは変化しなかった。パクリタキセルとナノファイバーとを一緒に添加した場合、ＭＤＲ細胞の細胞毒性は、３２ｎＭパクリタキセルでほぼ５０％まで増加した。HT 29細胞はパクリタキセル単独に対して高レベルの細胞毒性を示したが、パクリタキセルとナノファイバーとの組合せは試験された条件下では細胞の残存率を変化させなかった。
ナノファイバーによる複合体を形成した分子の取込み：ナノファイバーは極めて長く（長さマイクロメートル、直径約５ｎｍ；例えば図３７を参照のこと）、それらの形質膜を越える能力を調査した。この実験では、ナノファイバーの膜不透過性蛍光色素であるカルセインとの天然複合体を形成する能力を調査した。ナノファイバーをエタノール脱色したサクランボから本明細書で上に記載した手順によって調製した。均質化している間、生体重１ｇ当たり１ｍｇ当量のカルセインをサクランボと混合した。均質化及び細片の除去後、ホモジネートを透析物が蛍光を示さなくなるまで水に対して透析した（３回）。同時に、透析バッグ内の抽出物は高い程度の蛍光を示した。HT-29及びCRL-1790細胞をカルセイン単独、及びカルセインと複合体を形成したナノファイバー（等しい蛍光強度の）の存在下でインキュベートした。カルセイン及びナノファイバーと複合体を形成したカルセインの取込みを共焦点顕微鏡検査によってモニタリングした。結果を図３９に示す。パネルＡ及びＢはそれぞれ、複合体を形成していないカルセイン、及びナノファイバーと複合体を形成したカルセインのHT 29細胞への取込みを示す。図から分かるように、ナノファイバーと複合体を形成したカルセインは細胞によって優先的に取り込まれ（パネルＢ）、これらは小胞構造に局在するようである。カルセインは比較的膜不透過の分子であるため、カルセインのはるかに減少した取込みが観察された。大半の蛍光がHT 29細胞において形質膜に近い領域に局在したが、取込みはカルセイン－ナノファイバー複合体と共にインキュベートしたCRL 1790細胞においてより強力であった（パネルＤ）。また、カルセイン蛍光の分布は細胞の内部領域に見られた。CRL 1790細胞によるカルセイン単独の取込みは非常に少なかった。類似した実験をナノ粒子に関しても実行したが、ポリフェノールによる蛍光の消去のため、画像の上首尾の獲得は達成されなかった。本明細書に記載されるナノ粒子は、カルセイン（又は薬物／栄養補助剤性質の任意の他の分子）を取り込むことにおいて、以下でさらに調査されるように、同程度に効率的であり得ることが想定される。
ナノ粒子及びナノファイバーによってコンジュゲートしたDylight 650の細胞による取込み：所望のカーゴであって、ナノファイバー（又はナノ粒子）と共有結合により複合体を形成した、カーゴのための送達ビヒクルとしてのナノファイバー（及びナノ粒子）の使用を調査する追加の研究を実施した。この研究では、ナノファイバー（及びナノ粒子）をDylight 650の細胞送達のために使用した。ナノ粒子及びナノファイバーの細胞に進入する能力をさらに評価するために、これらをそれぞれ脱色していないサクランボ及びエタノール脱色したサクランボから単離し、蛍光色素Dylight 650（励起６５０ｎｍ、発光６７０ｎｍ）と化学的にコンジュゲートした。HT 29、CRL 2158、及びCRL 1790細胞を増殖し、色素溶液と共にインキュベートし、共焦点顕微鏡下で検査した（図４０）。
色素とコンジュゲートしたナノ粒子とナノファイバーの両方は、インキュベーションの間に細胞によって取り込まれ、細胞質中の小胞構造に区画化されて核を囲んでいることが明確に可視であった。図４０のパネルＡ及びＢはそれぞれ、HT 29細胞によるナノ粒子及びナノファイバーの取込みを示す。両方のコンジュゲートは、挿入画像（細胞の拡大図）において明らかにされるように、細胞によって取り込まれる。コンジュゲートナノ粒子（Ｃ）及びナノファイバー（Ｄ）と共にインキュベートした多剤耐性CRL 2158細胞は、HT-29細胞によって示されるのと同等に類似した取込みを示し、相対強度はナノ粒子と共にインキュベートした細胞においてより高くなり得る（パネルＣ）。挿入画像は細胞の合成画像の拡大した図を示し、さらに、核の周囲の細胞小器官におけるナノ粒子の蓄積を示す。CRL 1790細胞は、可視強度によって判断して、ナノファイバーの取込み（Ｆ）よりもはるかに高いナノ粒子の取込み（Ｅ）を示した。これらの結果は、脱色していない及び脱色したサクランボから単離したナノ粒子及びナノファイバーが細胞膜を越え、特異的な細胞小器官に蓄積することができたことを示す。
図４０は、脱色していないスミノミザクラから単離したナノ粒子（Ａ、Ｃ、Ｅ）及びエタノール脱色したスミノミザクラから単離したナノファイバー（Ｂ、Ｄ、Ｆ）のヒト細胞（HT-29、CRL 2158、CRL1790）への取込みの実証を示す。ナノ粒子及びナノファイバーをDylight 650と化学的にコンジュゲートし、水に対して徹底して透析して（３回）、非コンジュゲート色素を除去した。細胞を蒔き、４８時間増殖させた。コンジュゲートナノ粒子及びナノファイバー（３ｍｌの培養培地中約５μＭ Dylight当量）を培地に添加し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。細胞をペトリ皿（直径３．５ｃｍ）に維持し、６３３ｎｍの励起を用いて共焦点顕微鏡（Leica社）下で観察し、発光を６８０ｎｍでモニタリングした。パネルＡ及びＢはそれぞれHT 29細胞（結腸直腸がん細胞株）によるDylightコンジュゲートナノ粒子及びナノファイバーの取込みを示し、パネルＣ及びＤはそれぞれCRL 2158細胞（ＭＤＲ結腸直腸細胞株）によるDylightコンジュゲートナノ粒子及びナノファイバーの取込みを示し、パネルＥ及びＦはそれぞれCRL 1790細胞（正常ヒト腸細胞）によるコンジュゲートナノ粒子及びナノファイバーの取込みをそれぞれ示す。パネル中の挿入画像は細胞の拡大した合成画像である。（サイズバー－１０μｍ）。
生死細胞分析による細胞毒性の識別：ナノファイバーを使用したパクリタキセルの様々な細胞株への送達を調査するさらなる研究を実施した。パクリタキセルの細胞毒性を増強することにおけるナノファイバーの効率性をさらに評価するために、生死細胞分析を実行した。正常細胞（CRL 1790）、がん細胞（HT-29）、及びＭＤＲ細胞（CRL 2158）を培養し、パクリタキセル単独、及びナノファイバーと一緒になったパクリタキセルに曝露した。細胞を２４時間培養し、その時点でパクリタキセル及びナノファイバーを培養に添加した。生死細胞分析を薬物への曝露の２４時間後に実施した。結果を図４１～４３に示す。図４１は、ナノファイバー－パクリタキセルのヒト結腸直腸がん細胞（HT 29）に対する細胞毒性を示す。共焦点顕微鏡下で可視化したHT 29結腸直腸がん細胞の生死細胞分析を示す。アッセイキット（Invitrogen社）は２種類の蛍光色素を含有し、カルセインＡＭエステル（Ｅｘ ４９４ｎｍ、Ｅｍ ５１７ｎｍ）は生細胞に特異的に進入し、脱エステル化し、生細胞を緑色に染色する。瀕死細胞及び死細胞は膜が損なわれており（漏出性の形質膜）、核を赤色に染色するエチジウムホモダイマー（Ｅｘ ５１７ｎｍ／Ｅｍ ６１７）の進入を可能にする。細胞を、生細胞を識別する５１７ｎｍ（緑色チャネル）及び死細胞の可視化を可能にする６１７ｎｍで観察した。２つの波長の合成画像は細胞生存性の喪失への移行中である細胞を示す（Ａ、Ｄ、Ｇ；黄色）。パネルＢ、Ｃはそれぞれ、６１７ｎｍで可視化した対照細胞（赤色、死細胞）、及び５１７ｎｍで可視化した対照細胞（緑色、生細胞）を表す。パネルＡは非処理細胞の合成画像である。パネルＥ、Ｆはそれぞれ、２つの波長６１７及び５１７ｎｍで記録した、パクリタキセル（３２ｎＭ）で処理した細胞の画像を表す。パネルＤは合成画像である。パネルＨ及びＩは、パクリタキセル＋ナノファイバー（３２ｎＭ＋４μｇ／ｍｌのナノファイバー、繊維と適した量のパクリタキセルとを５％ＤＭＳＯに混合し、細胞の培養培地に添加し、１２時間インキュベートさせた）で処理した細胞を示す。パネルＧは赤色画像と緑色画像との合成である。これらの結果は、特に例えばＭＤＲ細胞において細胞毒性をもたらした、パクリタキセル（ナノファイバーと複合体を形成し、コンジュゲートしていない）を細胞に送達するナノファイバーの使用を示す。パクリタキセル単独は、HT29がん細胞株においてのみ効果を達成し、ＭＤＲにおいては効果を達成しなかった。ナノファイバーはＭＤＲにおいてより良好な効果を提供した。ナノ粒子は、１又は２以上の薬物（又は薬物／栄養補助剤性質の任意の他の分子）を取り込むことにおいて、カルセイン及びdylightを使用した以前の実施例において支持されるのと同様に効率的であり得ることが想定される。
図４２は、ナノファイバー－パクリタキセルのヒト結腸直腸ＭＤＲがん細胞（CRL 2158）に対する細胞毒性を示す。共焦点顕微鏡下で可視化したCRL 2158多剤耐性結腸がん細胞の生死細胞分析を示す。アッセイキット（Invitrogen社）は２種類の蛍光色素を含有し、カルセインＡＭエステル（Ｅｘ ４９４ｎｍ、Ｅｍ ５１７ｎｍ）は生細胞に特異的に進入し、脱エステル化し、生細胞を緑色に染色する。瀕死細胞及び死細胞は膜が損なわれており（漏出性の形質膜）、核を赤色に染色するエチジウムホモダイマー（Ｅｘ ５１７ｎｍ／Ｅｍ ６１７）の進入を可能にする。細胞を、生細胞を識別する５１７ｎｍ（緑色チャネル）及び死細胞の可視化を可能にする６１７ｎｍで観察した。２つの波長の合成画像は細胞生存性の喪失への移行中である細胞を示す（Ａ、Ｄ、Ｇ；黄色）。パネルＢ、Ｃはそれぞれ、６１７ｎｍで可視化した対照細胞（赤色、死細胞）、及び５１７ｎｍで可視化した対照細胞（緑色、生細胞）を表す。パネルＡは非処理細胞の合成画像である。パネルＥ、Ｆはそれぞれ、２つの波長６１７及び５１７ｎｍで記録した、パクリタキセル（３２ｎＭ）で処理した細胞の画像を表す。パネルＤは合成画像である。パネルＨ及びＩは、パクリタキセル＋ナノファイバー（３２ｎＭ＋４μｇ／ｍｌのナノファイバー）で処理した細胞を示す。パネルＧは赤色画像と緑色画像との合成である。
図４３は、ナノファイバー－パクリタキセルの正常ヒト腸細胞（CRL 1790）に対する細胞毒性を示す。共焦点顕微鏡下で可視化したCRL 1790ヒト結腸正常上皮細胞の生死細胞分析を示す。アッセイキット（Invitrogen社）は２種類の蛍光色素を含有し、カルセインＡＭエステル（Ｅｘ ４９４ｎｍ、Ｅｍ ５１７ｎｍ）は生細胞に特異的に進入し、脱エステル化し、生細胞を緑色に染色する。瀕死細胞及び死細胞は膜が損なわれており（漏出性の形質膜）、核を赤色に染色するエチジウムホモダイマー（Ｅｘ ５１７ｎｍ／Ｅｍ ６１７）の進入を可能にする。細胞を、生細胞を識別する５１７ｎｍ（緑色チャネル）及び死細胞の可視化を可能にする６１７ｎｍで観察した。２つの波長の合成画像は細胞生存性の喪失への移行中である細胞を示す（Ａ、Ｄ、Ｇ；黄色）。パネルＢ、Ｃはそれぞれ、６１７ｎｍで可視化した対照細胞（赤色、死細胞）、及び５１７ｎｍで可視化した対照細胞（緑色、生細胞）を表す。パネルＡは非処理細胞の合成画像である。パネルＥ、Ｆはそれぞれ、２つの波長６１７及び５１７ｎｍで記録した、パクリタキセル（３２ｎＭ）で処理した細胞の画像を表す。パネルＤは合成画像である。パネルＨ及びＩは、パクリタキセル＋ナノファイバー（３２ｎＭ＋４μｇ／ｍｌのナノファイバー）で処理した細胞を示す。パネルＧは赤色画像と緑色画像との合成である。
これらの結果は、医薬品の細胞への送達のためのナノファイバー（及び潜在的にナノ粒子）の使用に関する情報を提供する。本実施例では、結腸直腸がん細胞株であるがん細胞モデルHT 29、及び多剤耐性結腸直腸がん細胞株CRL 2158を使用して、ナノファイバーと複合体を形成したパクリタキセルの有効性を研究した。パクリタキセル単独、及びナノファイバーと複合体を形成したパクリタキセルの細胞毒性効果はHT 29細胞においてほぼ同じであった。非多剤耐性であるこの細胞株はパクリタキセル単独による細胞毒性に感受性である。これらの細胞はナノファイバーと複合体を形成したパクリタキセルにも応答し、薬物が細胞の内側において複合体から放出され、ナノファイバーによって保持されないことを示唆した。多剤耐性発現はがん化学療法に関する主要な課題であり、この場合細胞は薬物を能動的に除外し、したがって細胞毒性を消失させる。CRL 2158の場合、多剤耐性能はパクリタキセルでの処理に対する耐性によって明らかになった。しかしながら、多剤耐性はナノファイバーと複合体を形成することによって克服され、ほぼ１００％のＭＤＲ細胞が細胞毒性を示した。したがって、ナノファイバーと複合体を形成することは多剤耐性細胞に対抗する手段を提供し得る。興味深いことに、正常腸細胞（CRL 1790）は、使用したパクリタキセルの濃度において、パクリタキセル単独に対してもパクリタキセル－ナノファイバー複合体に対しても細胞毒性を示さず、そのような処理の細胞に対する安全性を示した。
興味深いことに、ナノファイバーで処理した場合でさえ、パクリタキセルの非存在又は存在下のいずれにおいても正常結腸細胞（CRL 1790）における細胞毒性を見出すことは困難であった（図４３、パネルＡ～Ｉ）。これらの細胞はパクリタキセルの存在下（パネルＤ、Ｅ、Ｆ）、又はパクリタキセル及びナノファイバーの存在下（パネルＧ、Ｈ、Ｉ）でそれらの形態学を保持し、膜完全性の喪失を観察することはできなかった。
パクリタキセル、並びにパクリタキセル及びナノファイバーの存在又は非存在下での細胞培養の間のCRL 1790、HT 29、及びCRL 2158における生存細胞の定量的推定は、この実施例の上の表に示される。正常細胞株は、単独で提供された３２ｎＭパクリタキセルに対してもナノファイバーの存在下で提供された３２ｎＭパクリタキセルに対しても、いかなる細胞毒性も示さなかった。HT 29細胞は、パクリタキセル、並びに一緒に供給されたパクリタキセル及びナノファイバーに対して高レベルの細胞毒性を示した。CRL 2158細胞は、単独で供給された場合のパクリタキセルに対してある程度の耐性を示したが（約５０％残存）、ナノファイバーの存在下では、残存の程度は４％まで低下した。細胞の生死分析は、様々な成分での処理の間の細胞の残存を決定するより正確な手法であった。
上述の結果は、医薬品の細胞への送達のためのナノファイバー（及び拡張により潜在的にナノ粒子）の使用に関する洞察を提供する。本実施例では、結腸直腸がん細胞株であるがん細胞モデルHT 29、及び多剤耐性結腸直腸がん細胞株CRL 2158を使用して、ナノファイバーと複合体を形成したパクリタキセルの有効性を研究した。パクリタキセル単独、及びナノファイバーと複合体を形成したパクリタキセルの細胞毒性効果はHT 29細胞においてほぼ同じであった。非多剤耐性であるこの細胞株はパクリタキセル単独による細胞毒性に感受性である。これらの細胞はナノファイバーと複合体を形成したパクリタキセルにも応答し、薬物が細胞の内側において複合体から放出され、ナノファイバーによって保持されないことを示唆した。多剤耐性発現はがん化学療法に関する主要な課題であり、この場合細胞は薬物を能動的に除外し、したがって細胞毒性を消失させる。CRL 2158の場合、多剤耐性能はパクリタキセルでの処理に対する耐性によって明らかになった。しかしながら、多剤耐性はナノファイバーと複合体を形成することによって克服され、ほぼ１００％のＭＤＲ細胞が細胞毒性を示した。したがって、ナノファイバーと複合体を形成することは多剤耐性細胞に対抗する手段を提供する。興味深いことに、正常腸細胞（CRL 1790）は、使用したパクリタキセルの濃度において、パクリタキセル単独に対してもパクリタキセル－ナノファイバー複合体に対しても細胞毒性を示さず、そのような処理の細胞に対する安全性を示した。
考察：
スミノミザクラ果実の均質化の間に、細胞壁を起源とする細胞成分（セルロース、ペクチン、タンパク質）、並びにアントシアニン及びリンゴ酸等の液胞成分を含む細胞成分の自己組織化を介して形成されるナノ粒子及びナノファイバーの組成的及び構造的特色を評価する。ナノ粒子は、らせん状の繊維形状構造が周りに巻きついているペクチンコアを含む直径約５０～約２５０ｎｍの球状の複合体である。対照的に、エタノール脱色したサクランボ果実から形成したナノファイバーは、繊維様（横幅約５～約１０ｎｍ）であり、長さマイクロメートルであった。アントシアニン及びリンゴ酸を果実から除去して、これらの研究におけるナノファイバー形成を容易にした。したがって、アントシアニンが少ない果実は、ここに記載される方法に従ってナノファイバーを優先的に形成する傾向を有し得る。ナノ粒子におけるアントシアニンの存在のため、これらは高抗酸化活性を示し、したがって栄養に関連する構造的複合体であり得る。細胞毒性試験において、ナノファイバーは、抗がん薬に対して複合体を形成した場合、はるかに高い活性を示した。本実施例は、哺乳動物細胞におけるナノ粒子及びナノファイバーの潜在的な機能的効果を記載する。
食物及び医薬におけるポリフェノール／薬物との相互作用：栄養及び食事介入は近年、様々な炎症性疾患を下方制御するための潜在的な補完的戦略になってきている（Willcox, J.K., Ash, S.L. and Catignani, G.L. (2004). Antioxidants and prevention of chronic disease. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44: 275-295）。ポリフェノールが豊富な果実の食事摂取は、動物モデル及びヒトにおいていくつかの炎症マーカーの下方制御をもたらした（Gonzalez-Gallego, J., Victoria Garcia-Mediavilla, M., Sanchez-Campos, S. and Tunon, M.J. (2010) Fruit polyphenols, immunity and inflammation. British J. Nutr., 104: S15-S27）。ブドウ及びザクロ由来の果汁及び製品の中等度レベルの消費は抗酸化機能の増加及び血漿における脂質過酸化の低下をもたらした（Garcia-Alonso, J., Rosa, G., Vidal-Guevera, M.L. and Periago, M.J. (2006) Acute intake of phenolic rich juice improves antioxidant status in healthy subjects. Nutr. Res., 26: 330-339、Jensen, G.S., Wu, X, Patterson, K.M, Barnes, J., Carter, S.G., Scherwitz, L.S., Beaman, R., Endres, J.R. and Schauss, A.G. (2008) In vitro and in vivo antioxidant and antiinflammatory capacities of an antioxidant rich fruit and berry juice blend. Results of a pilot and randomized double blind, placebo controlled, crossover study. J. Agric. Food Chem., 56: 8326-8333）。いくつかの研究からの結果は、果実及び野菜消費と、血液における炎症マーカー、例えばＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ，C-Reactive protein）及びインターロイキン６ＩＬ６（ＩＬ６，interleukin 6）、並びにいくつかの他の炎症マーカー、例えばＣＲＰ、ＩＬ－６、及びＴＮＦαの発現との間の逆相関を示す（Holt, E.M., Steffen, L.M., Moran, A., Basu, S., Steinberger, J., Ross, J., Hong, C.P. and Sinaiko, A.R. (2009). Fruit and vegetable consumption and its relation to markers of inflammation and oxidative stress in adolescents. J Am Diet Assoc., 109: 414-421）。４０～７４歳の間の１２０名の男女の群において、ポリフェノール豊富ブルーベリー抽出物の摂取（３００ｍｇ／日を３週間）は、ＮＦ－κＢ経路の炎症誘発性サイトカイン及びケモカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－８、及びＩＦＮ－α）の血漿レベルの有意な減少を引き起こした（Karlsen, A., Retterstol, L., Laake, P., Paur, I., Kjolsrud-Bohn, S., Sandvik, L. and Blomhoff, R. (2007) Anthocyanins inhibit, Nuclear Factor kappa B-activation in monocytes and reduce plasma concentration of pro-inflammatory mediators in healthy adults. Journal of Nutrition, 137, 1951-1954）。同様に、スイートビングチェリーの消費の増加（２８０ｇ／日）は、ＣＲＰ及びＮＯのレベルの低下をもたらした（Kelley, D.S., Rasooly, R., Jacob, R.A., Kader, A.A., and Mackey, B.E. (2006). Consumption of bing sweet cherries lowers circulating concentrations of inflammation markers in healthy men and women. J.Nutr., 136: 981-986）。スミノミザクラポリフェノールは、炎症性経路に関与する肝要な酵素であるシクロオキシゲナーゼという酵素の強い阻害因子である（Chandra et al., 2002）。抗酸化物質が豊富な食物の摂取を増加した高齢の７０歳の男性に関する研究は、シクロオキシゲナーゼ、サイトカイン媒介炎症、及び酸化ストレスの低下をもたらした（Helmersson et al., 2009）。したがって、ポリフェノール含有食物は炎症性経路を下方制御する特性を有し、それによって慢性変性疾患、例えばがん、心血管疾患、及び神経変性疾患を予防する。
ポリフェノールの生物学的効果に関して提起されている主要な問題は、これらが胃腸系を介して非常に吸収されにくい（０．５％～１．５％）と考えられていることである。また、胃から腸への移行の間の食物の膵液及び胆汁と混合することによるアルカリ化は、アントシアニン構造を不安定化し、開環及び部分的分解をもたらす。
本実施例では、ヒト細胞によるナノ粒子（及びナノファイバー）の効果的な内部移行を実証する。アントシアニンは、ナノ粒子において安定化し、ｐＨ変化に対して耐性であり得るため、ナノ粒子の内部移行はＧＩＴにおけるポリフェノール送達の代替的な形態となり得る。したがって、ポリフェノールを含有するナノ粒子の形成は、ナノ粒子が空腸における典型的な担体媒介吸収を回避し、それらの十二指腸部位における吸収を可能にし得るため、ポリフェノールの生物学的利用能を増強し得る。複合体形成は、ポリフェノールが有益な効果を発揮し得る腸の下流域、例えば小腸の遠位部及び結腸等にポリフェノールを輸送するのにも役立ち得る。ある特定の実施形態では、これらは、結腸微生物叢によって生成される活性酸素種から腸組織を保護する抗酸化機能を含み得る、細胞増殖を調節し得る、及び／又は追加の健康効果を提供し得る代謝産物の形成を可能にし得ることが想定される。
薬物送達、生体ナノ粒子の重要性：改変ナノ材料と天然に存在する生体分子から調製したナノ材料の両方を利用する、医薬及び健康におけるナノテクノロジーベースの戦略を開発することは凄まじい進歩を遂げている。ナノ構造及びナノ構造コンジュゲートのインビボでのターゲティングによるがん部位の検出は大いに所望されている分野であるが、取込み及び体内分布の機構に関するより多くの情報が必要である。ナノ構造及びそれらのコンジュゲートは、エンドサイトーシス、非特異的進入、小胞形成等を含む多数の機構を介して蓄積すると考えられている（Iversena,T.G., Skotlanda, T. and Sandvig, K. (2011). Endocytosis and intracellular transport of nanoparticles: Present knowledge and need for future studies. Nano Today, 6, 176-185）。しかしながら、近年の研究は、特異的な取込み機構に関する証拠も提示している。ＳＷＮＴは免疫細胞群、すなわちＬｙ６ｃ単球内に特異的に隔離されることが見出された（Smith, B.R., Ghosn, E.E.B., Rallapalli, H., Prescher, J.A., Larson, T., Herzenberg, L.A. and Gambhir, S.S. (2014) Selective uptake of single-walled carbon nanotubes by circulating monocytes for enhanced tumour delivery. Nature Nanotechnol., 9, 481-487）。ＳＷＮＴとターゲティングペプチドであるＲＧＤとのコンジュゲーションは、ナノ構造の単球への進入をさらに増強した。したがって、単球はトロイの木馬機構を介したＳＷＮＴの腫瘍部位への送達を実現し、標的部位においてほぼ２５％のＳＷＮＴの蓄積を可能にした。したがって、腫瘍細胞に免疫細胞をターゲティングすることはがん薬物送達に効果的な戦略を提供し得る。
ミトコンドリアはがん細胞の残存又はアポトーシスを決定することに関与する重大な細胞小器官である。ミトコンドリアのエネルギー生成を妨害することはがん細胞をアポトーシス経路に導くことにおいて肝要なステップである。アポトーシス誘導ペプチドをミトコンドリアにターゲティングすることはがん細胞を死滅させるために大いに所望されているが、この欠点としては、送達の非特異性及び溶解度の不足が挙げられる。磁性コアシェルナノ粒子とコンジュゲートすることによってアポトーシス誘導ミトコンドリアターゲティング両親媒性尾部アンカーペプチド（ＡＴＡＰ，amphipathic tail-anchoring peptide）の悪性脳及び転移性がん細胞への送達を増加することは、化学療法有効性を増強する効率的な手法であることが見出された（Shah, B.P., Pasquale, N., De, G., Tan, T., Ma, J. and Lee, K-B. (2014). Core shell nanoparticle-based peptide therapeutics and combined hyperthermia for enhanced cancer cell apoptosis）。がん細胞において上方制御するいくつかの遺伝子の同時サイレンシングのためのｓｉＲＮＡを送達することは、マウスモデルの血管内皮細胞において（Dahlman, J.E. Barnes, C. et al. (2014) In vivo endothelial siRNA delivery using polymeric nanoparticles with low molecular weight. Nature Nanotechnol., 2014, 9, 648-654）、低分子量ポリアミン及び脂質から合成したポリマーナノ構造を介して達成することができた（Dahlman, J.E. Barnes, C. et al. (2014) In vivo endothelial siRNA delivery using polymeric nanoparticles with low molecular weight. Nature Nanotechnol., 2014, 9, 648-654）。
物理化学的特徴、例えば組成、サイズ、表面電荷分布等は、細胞のナノ構造の取込みに影響を及ぼすことができる。近年の研究において（Agarwala, R., Singh, V., Jurney, P., Shib, L., Sreenivasan, S.V., and Roya, K. (2013). Mammalian cells preferentially internalize hydrogel nanodiscs over nanorods and use shape-specific uptake mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 110, 17247-17252）、これらの特徴の他に、ナノ構造の形状そのものがそれらの取込みに影響を与えることができることが報告されている。この研究では、哺乳動物上皮細胞、内皮細胞、及び免疫細胞が負に帯電した親水性円盤形状ナノ構造を優先的に内部移行することが観察された。高アスペクト比のナノディスクはより低いアスペクト比のナノディスク及び棒形状ナノ構造よりも好ましかった。球状ナノ構造も、そのサイズが減少する場合でさえ、より低い効率で内部移行する。（Cabral, H., Matsumoto, Y., Mizuno, K., Chen, Q., Murakami, M., Kimura, M., Terada, Y., Kano, M.R., Miyazono, K., Uesaka, M., Nishiyama, N. and Kataoka, K. (2011) Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size., Nature Nanotechnol., 6., 815-823）も、腫瘍におけるナノ構造の蓄積もサイズに依存することを報告している。ナノ構造内部移行過程は、ナノ構造と膜との間の相互作用、細胞接着及び膜変形のためのエネルギー、並びに細胞膜表面におけるナノ構造濃度を伴い、複合的であり得る。
本明細書に記載されるサクランボから単離したナノ粒子及びナノファイバーは構造的に複合的である。ナノ粒子の凍結乾燥粉末は、酸（４Ｍ ＨＣｌ）、アルカリ（１Ｍ ＮａＯＨ）、及び凍結することに対して耐性であった。ナノ粒子とナノファイバーの両方は低分子（色素、薬物）と複合体を形成し、解離しなかった。パクリタキセル等の薬物もこれらの構造とコンジュゲートし得る。パクリタキセルはがんに対する治療に効果的な薬物である。これらの研究は、パクリタキセルの実効性がナノファイバーと共に哺乳動物細胞に提供された場合に増強し得ることを示す。さらに、多剤耐性がん細胞（CRL 2158）はパクリタキセルに対する耐性を示した。ナノファイバーと共に提供された場合、パクリタキセルはＭＤＲ細胞に対して、正常HT 29がん細胞と類似した細胞毒性を示した。したがって、ナノファイバーと一緒になった薬物の適用は、パクリタキセル排除を回避し、その有効性を増強し得る。興味深い側面は、効率性の増加がナノファイバーとパクリタキセルとの間の純粋な会合に起因し得るということである。有機分子との複合体形成の他に、ナノファイバー及びナノ粒子は金属、例えば鉄、亜鉛、Ｍｇ、Ｓｅ、及び／又はその他金属に結合することができてもよい。ある特定の実施形態では、ナノ粒子及びナノファイバーの内部移行効率が高くなるにつれて、金属イオン摂取の効率性が増強し、したがって投与量を減少し得ることが想定される。
本実施例の結果は、ナノ粒子及びナノファイバー構造が機能的用途を有することを示唆する。ナノ粒子は単独では高効率抗酸化物質であり得、局在化抗酸化機能が望ましい治療用途に適切であり得る。ナノファイバーはコンジュゲートした又は複合体を形成した薬物の内部移行において高度に強力であった。パクリタキセル－ナノファイバー複合体の内部移行は、多剤耐性がんの薬物排出能を回避し、それらを単一の薬物によって死滅するがん細胞と同じようにがん薬物に感受性にし得る。したがって、結果は、ナノ粒子とナノファイバーの両方が例えばがん治療の効率性を増強する注目すべき可能性を有し得ることを示す。
本明細書に詳細に記載されている結果は、特定のナノ粒子、ナノファイバー、及び食物粉末の調製が、部分的に解体した状態の細胞壁マトリックス、例えばセルロース、ペクチン、及びタンパク質が例えば、ポリフェノール（細胞代謝及び遺伝子発現の調節因子である抗酸化物質）、リンゴ酸等の有機酸、並びにタンパク質分解から生じるペプチドを組み込む良好に構造化されたナノ粒子にその間に自然に組織化し得る均質化を含む、（例えば）熟成果実の加工によって達成され得ることを示す。類似した構造を有するナノ粒子は他の果実の類似した加工の間に形成される。例えばブルーベリーでは、形成されるナノ粒子は、スミノミザクラにおいて形成されるナノ粒子と構造的に類似している。本実施例では、スミノミザクラからのナノ粒子及びナノファイバーの栄養及び抗増殖活性を調査する。
ナノテクノロジーは医学において、とりわけ標的化薬物送達の点で大きな進展を遂げている。改変ナノ材料の使用は、毒性及び系のナノ材料を効率的に排出する能力の欠如のために複雑であるが（Maynard, A. D. (2006) Nanotechnology: Assessing the risks. Nanotoday, 1, 22-33、Lewinski, N., Colvin, V. and Drezek, R. (2008) cytotoxicity of nanoparticles. Small, 4, 26-49、Kunzmann, A., Andersson, B., Thurnherrm, T., Krug, H,. Scheynius, A. and Fadeel, B. (2011) Toxicology of engineered nanomaterials: Focus on biocompatibility, biodistribution and biodegradation. Biochim. Biophys. Acta., 1810, 361-373、Yamashita, K. et al. (2011) Silica and titanium dioxide nanoparticles cause pregnancy complications in mice Nature Nanotech., 6, 321-328）、生体系において容易に分解可能な生物学的材料に由来するナノ粒子の使用は標的化薬物送達の新規な手段を提供し得る。
本実施例では、スミノミザクラ果実から単離したナノ粒子（及びナノファイバー）の正常及びがん細胞に内部移行する能力、並びにそれらのアントシアニン又は抗がん薬のパクリタキセルを含有する場合に細胞毒性を引き起こす能力を記載する。ナノファイバーはアントシアニンを欠くスミノミザクラ果実に由来した。ナノファイバーの基本成分は食物に由来する成分であるため、食物成分の医薬的適用は、例えば合成成分とコンジュゲートした薬物が経口摂取される場合よりも正常細胞に対する損傷が少ないと見なすことができる。また、理論に拘束されることを望むものではないが、細胞によるこれらの構造の内部移行は、成分（ペクチン、ペプチド、アントシアニン、有機酸等）がＧＩＴからの進入に関する異なる形態を有し得ることを示唆する。そのようなナノ粒子は、単一分子として非常に吸収されにくいがインビトロ条件下では大きな抗酸化活性及び細胞毒性の可能性を示すアントシアニンの吸収の促進剤としての機能を果たす場合があり得る。
食物粉末調製、構造、及び用途の研究
食物粉末調製及び構造調査
この実施例では、ブロッコリー、スミノミザクラ、アーモンド、ダイズ、及び／若しくはウコン、又はその任意の組合せ（並びに特に、これらの成分の全て）の抽出物から高剪断混合及びナノスプレードライにより作製した機能的食物粉末を記載する。粉末の各粒子は、各未処理成分を起源とする個々の乾燥粉末の混和物と比較して実質的に一様な、原材料（スルフォラファン、インドール－３－カルビノール、ポリフェノール、フィトステロール、イソフラボン、クルクミン等）を起源とする栄養補助食品の混和物を含有した。
高抗酸化活性を実証する形態における食物粉末は、成分の高い生物学的利用能を提供し、全般に広域スペクトルの抗炎症性活性を示した。したがって、食物粉末の消費は、特に適した健康な生活習慣と組み合わせて使用する場合、慢性疾患を発症することからの保護を提供し得る。
活動的で健康な生活習慣と組み合わせた果実及び野菜の推奨されるレベルの消費は、慢性疾患、例えば肥満、II型糖尿病、がん、関節炎症等の発症を低減することが十分に認識されている。しかしながら、一般市民において、適当な量の果実及び野菜の消費は不足している。現在の生活習慣のため、肥満、とりわけ小児肥満の罹患率は増加している。果実及び野菜中の一般的に利用可能な活性成分の食事摂取を増強する取組みにおいて、生物学的に利用可能な形態の成分を含む本食物粉末を開発した。果実及び野菜からの栄養補助食品成分の生物学的利用能は、いくつかの理由のために一般に低い。ここに記載される食物粉末の場合、生物学的利用能を増加させ、それによってこれらの成分の有効性を増強することが可能であり得る。
この実施例において使用される主要な食物成分（及び一部のその栄養剤）としては以下のものが挙げられる：
ブロッコリー－栄養補助食品成分（すなわち栄養剤）、例えばスルフォラファン及びインドール－３－カルビノールの前駆体を含有する。両方の成分は、自然抗酸化系（ＫＥＡＰ－１／ＮＲＦ２／ＡＲＥ経路）及び生体異物の排出に関与する第２相酵素を増強する。
スミノミザクラ－スミノミザクラは、シアニジン－３グルコシド／ルチノシドを主要なポリフェノールとして含有する。スミノミザクラ抽出物は関節炎症に対して強く抗炎症性であることが示されている。
アーモンド－アーモンドは、必須不飽和脂肪酸及びフィトステロールを含有し、コレステロールの生合成を減少し得る。これはビタミンＥの高供給源でもある。
豆乳－ダイズはイソフラボン及びタンパク質の供給源である。
ウコン－ウコンは香辛料であり、その抗炎症性特性のために認められた。ウコンは強いシクロオキシゲナーゼ阻害因子であるクルクミンを含有する。近年の研究も、インビボ実験モデルにおいてウコンの肥満を減少させる能力を確認している。
材料及び方法：食物粉末を、いくつかの成分をスミノミザクラ抽出物（その調製物における主な成分である）と共に混合することによって調製した。スミノミザクラ及びブロッコリー小花の抽出物を、これらを水中（１ｇ対２ｍｌの比）で、Reicht高速ブレンダーを４０００ｒｐｍで５分間使用して混ぜることによって独立して調製した。ホモジネートを、４層のチーズクロスを介して濾過し、細片を廃棄した。ホモジネートしたものを使用まで冷やして保存した。
１００ｍｌのスミノミザクラ抽出物、１００ｍｌのブロッコリー抽出物、１００ｍｌのアーモンドミルク（約８％ｗ／ｖ；Silk（商標）ブランド；Whitewave Foods社、Colorado、USAによって販売）；５０ｍｌの豆乳（約１０％）、及び５ｇのウコン粉末をReicht高速ブレンダーにおいて５０００ｒｐｍで５分間一緒に混ぜた。混和物を２時間冷却保存し、デカントした。溶液を水で希釈濃度に調整し、以前に実施例１に記載したように類似した設定を使用してナノスプレードライに供した。乾燥した粉末を収集し、窒素雰囲気中－２０℃で褐色瓶に冷却して保存した。
結果及び考察：食物粉末を調製し、構造的に特徴付ける実験を実施した。
本明細書に記載されるように、ここに記載される食物粉末は、一般に、本明細書に記載されるナノ粒子及び／又はナノファイバーを調製するために使用され得る任意の適切な植物組織で調製することができる。ある特定の実施形態では、食物粉末は、果実、野菜、又は本明細書に記載される炭水化物ベースのナノ粒子若しくはナノファイバーを形成することができる別の植物組織若しくは製品から調製することができる。食物粉末は、水性媒体、有機媒体、又はその組合せを含む任意の適切な媒体中で調製することができる。食物粉末は、ある特定の実施形態では、食物粉末製品（典型的には食物粉末の意図される適用のために調整される）に含まれることが望ましい栄養含有物質（又は栄養分）をさらに含んでもよく、新鮮な、加工された、又は濃縮された粉末を単独で含んでも、重量又は容量での任意の所望の組合せで含んでもよい。
ある特定の実施形態では、食物粉末は食物粉末出発物質の均質化によって調製してもよい。例えば、均質化は、ブレンダー、好ましくは、高ｒｐｍで操作し高い剪断力を発生させることができるブレンダー、又はソノレーター等の高性能混合が可能な任意の他の適切な装置を使用して達成してもよい。
ある特定の実施形態では、食物粉末は濾過して細片を除去してもよく、細片は均質化した混合物からその他の方法で除去してもよい。例として、細片（すなわちホモジネートに入らず、重力下で沈殿する粒子状物質）を濾過することができる遠心デバイス又は濾過デバイス（例えば膜濾過デバイス若しくはタンジェンシャルフロー濾過デバイス）が細片を除去するために使用されてもよい。
ある特定の実施形態では、食物粉末は次いで、脱水、凍結乾燥、スプレードライ、ナノスプレードライ、又はその他の方法で脱水若しくは乾燥され得る。例として、ナノスプレードライヤー又は水性サンプルの場合には凍結乾燥機を挙げることができる、水（又は使用されている別の溶媒）を除去することができる機器が使用され得、より好ましくは、例えば大容量をスプレードライすることができる高効率スプレードライヤーが使用され得る。ある特定の実施形態では、ドライヤーは減圧下で操作してもよい。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される食物粉末は、本明細書に既に詳細に記載されているナノ粒子及び／又はナノファイバーを調製するのに適切な植物組織から、栄養含有物質と組み合わせて調製してもよい。理解されるように、栄養含有物質は、典型的には食物粉末の意図される適用のために調整することができ、新鮮な、加工された、又は濃縮された粉末を単独で含んでも、重量又は容量での任意の所望の組合せで含んでもよい。ある特定の実施形態では、食物粉末は栄養含有成分又は特定の生理的状態（例えば慢性状態等）に対処することを標的とした成分と共に開発されてもよく、そのような栄養含有物質は例えば予防及び／又は治癒特性を有してもよい。理解されるように、栄養分という用語には、本明細書で使用する場合、特定の適応症に適したいかなる適切な活性薬剤若しくは化合物（又は前記活性薬剤若しくは化合物を含む物質）が含まれてもよく、栄養分、例えば食物中に見出される栄養分として典型的に見なされる実体に限定されない。例として、ある特定の実施形態では、栄養分には健康効果を有するいかなる適切な天然（又は非天然）成分が含まれてもよい。
ある特定の実施形態では、食物粉末は：
１．本明細書に記載される炭水化物ベースのナノ粒子又はナノファイバーを形成することができるスミノミザクラ（若しくはスミノミザクラ抽出物）又は別の果実若しくは野菜（若しくはその抽出物）；
２．添加された物質からの疎水性分子を組み込むことができる疎水性成分（例えば、限定されないが、アーモンドミルク）（他の例は、例えばココナツミルク又は食用ナッツに由来するミルクである）；及び
３．例えば食物粉末の所望の適用のために調整された１又は２以上の生理活性成分を含有する栄養含有物質（例えば機能的食物抽出物等）
を含み得る。
栄養含有物質の一部の非限定的な例としては、以下の活性化合物及び／又は植物ファミリーのうちの１又は２以上を挙げることができる：
カロテノイド（すなわちベータカロテン、リコペン、ルテイン及び他のキサントフィル、アスタキサンチン等）；
アンノナシン（すなわち抗がん特性を有するバンレイシ属果実に由来するポリケチド）；
ボスウェリア（追加された抗炎症性機能を提供するクルクミンと共に作用し得る）；
アシュワガンダ（抗ストレス及びがん予防特性を有するウィタノリドを含有するハーブ成分、主にステロイド構造を有する）；
例えば、食用ショウガ（ショウガ）、マンゴージンジャー（クルクマアマダ）、又はジンゲロール及びショウガオールを含むいくつかの生理活性成分のいずれかを含有するその他のものを含み得るショウガ科のメンバー；クルクマロンガ（すなわちクルクミンを含有するウコン）；
カンナビノジオール（幻覚誘発活性を有しないアサ種の医薬的に活性な成分である）；
プレバイオティクス含量を増強するフラクトオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖、及びエルサレムアーティチョークからのイヌリン；
コショウ科のメンバー、例えばコショウ、及びピペリン及びいくつかの誘導体を含有するその野生の類縁体；並びに／或いは
まだ上に列挙されていない任意の他の適切な成分（例えば、限定されないが、植物に由来する成分）；
並びに／或いはそれから単離された任意の抽出物、誘導体、産物、又はそのような成分を含有する材料若しくは植物組織。
この実施例では、食物粉末を以下の出発物質から調製した：
１．スミノミザクラの水性抽出物；
２．アーモンドミルクとして市販されているアーモンドのホモジネート；
３．豆乳として市販されているダイズのホモジネート；
４．ブロッコリーの水性抽出物；及び
５．ウコン粉末。
これらの出発物質を、高速ブレンダー（Recht、ATS scientific社、Burlington）において４５００ｒｐｍで混ぜ、推奨設定下のBuchi社製ナノスプレードライヤーにおいてナノスプレードライした。使用した容量／重量は：
１００ｍｌのスミノミザクラ抽出物（１～２ｍｇ／ｍｌポリフェノール当量を使用したが、水又は他の溶媒中約０．１ｍｇ／ｍｌ～ポリフェノールの完全飽和溶液までの範囲の濃度が使用され得ると想定される）；
約８～１０％ｗ／ｖの１００ｍｌのアーモンドミルク；
約８～１０％ｗ／ｖの５０ｍｌの豆乳；
１００ｍｌのブロッコリー抽出物；及び
５ｇのウコン粉末
を含んだ。
理解されるように、スミノミザクラ抽出物の容量をこの実施例では１００ｍｌに維持したが、他の実施形態では、スミノミザクラ及び／又は他の成分の容量／重量は望まれるように変動してもよく、追加の成分が任意の適切な割合で含まれてもよいことが企図される。
図４４は、スミノミザクラ、ブロッコリー及び本明細書に記載される他の食物成分から調製した食物粉末の走査型電子顕微鏡写真を示す。食物粉末は、個々の成分の均質化した溶液の混合物を混ぜること、及び混ぜた混合物のナノスプレードライによって調製した。食物粉末は直ぐ上に記載した具体的な混合物を使用して調製した。
図４５は、微細構造的特徴を示す食物粉末の水性溶液の透過型電子顕微鏡写真を示す。図４５は、上に記載した図４４に表したのと同じ食物粉末を表す。食物粉末懸濁液の５０マイクロリットルのアリコートをガラススライドに載せ、カーボン被覆したグリッドを、被覆した面を下にして溶液に３０秒間浮かせた。グリッドの縁をブロット乾燥し、グリッドを酢酸ウラニルの０．１％溶液で染色した。食物粉末は密接に巻きついたファイバー構造の楕円形から球状の密集体のようである（Ａと称される矢印を参照のこと）。構造はナノ粒子に類似しているが、スミノミザクラナノ粒子において観察される構造上の構成を有しない（図１７を参照のこと）。実際、構造は、互いに巻きつくナノスフェア様構造を形成する繊維構造（１又は２以上のファイバーがもつれて球様構造になっているもつれた糸玉に非常に似ている）によって定められるナノスフェアと見なすことができた。互いに巻きついたナノファイバーから作製された球形構造（Ｂと称される矢印）を、そこから発するファイバー構造と共に観察することができる。この構造は、ファイバーが一緒に巻きついており数種類の機能性成分を吸着することができるナノスフェアの構造と似ている。らせん状の構成の構造（矢印Ｃ）は、ナノ粒子において観察されたらせん状のファイバーと似ている。この食物粉末の例では、食物粉末はブロッコリー抽出物及びウコン粉末成分によって与えられる栄養剤を含有する。これらの栄養剤は、上記の繊維構造と複合体を形成し、食物粉末形成及び／又は結果として生じる構造に寄与し得る。
肥満マウスモデルを使用するインビボでの食物粉末適用
材料及び方法：
発現分析－化学物質及び試薬。L-typeトリグリセリドMキットをWako Diagnostics社（日本、大阪、及びNeuss、Germany）から購入した。ＲＮＡ単離のためのRNeasy PlusキットはQiagen社（Valencia、CA、USA）からであった。ｃＤＮＡ調製のためのHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription KitはApplied Biosystems社（Foster city、CA、USA）からであった。RT2Profiler（商標）PCR Array Mouse Inflammatory Cytokines & ReceptorsキットはQiagen社（Valencia、CA、USA）からであった。iQ SYBR Green SupermixはBio-rad社（California、USA）からであった。
食物粉末処置。実験を、３６～４８週齢Ｐｃｙｔ２ノックアウトマウス及び同腹仔対照を用いて実施した。ＫＯ及び対照マウスの未処置群（それぞれｎ＝３～６）に１００ｕＬの水を毎日経口摂取させ（強制投与を介して）、ＫＯ及び対照マウスの処置群（それぞれｎ＝３～６）に１００ｕｇの食物粉末（１００ｕＬの水中）を１週間当たり５回投与した。全ての群に対する強制経口投与は８週間継続した。試行を２回繰り返し、試行の最後にマウスを屠殺し、血液及び組織分析のために使用した。
総ＲＮＡ単離及び遺伝子発現。総ＲＮＡを、RNeasy Plusキット（Qiagen社、Valencia、CA、USA）を使用して単離し、ｃＤＮＡを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems社、Foster city、CA、USA）を使用して調製した。ＲＴ－ｑＰＣＲを、Bio-rad社製CFX96 RT-qPCR装置に適切なRT2 Profiler（商標）PCR Array Mouse Inflammatory Cytokines & Receptorsキットを使用して行った。９６ウェルプレート中のRT2 Profiler（商標）PCR Arrayは、経路又は疾患に焦点を当てた８４の遺伝子に関するプライマーアッセイを含有する。所望の遺伝子を、ＰＣＲ増幅の対数期において、最適な量のｃＤＮＡ及び反応サイクル数を使用して分析した。各遺伝子レベルを、内部ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２ｍ，Beta-2-Microglobulin）対照を基準として表す。実験を、Ｐｃｙｔ２＋／－及びＰｃｙｔ２＋／＋雌マウスから収集した肝臓サンプルを使用することによって実施した。遺伝子レベルを、対照を基準とする倍率変化として表す。ＲＴ－ｑＰＣＲ結果を、比較ΔΔＣｔ法を使用することによって分析した。
統計分析。統計分析を、Prism GraphPadを使用して完了させた。データを平均±Ｓ．Ｅ．として表す。統計的有意性を、スチューデントのｔ検定（０．０５未満のＰ値を有意と見なした）又は多因子ＡＮＯＶＡのいずれかを使用して計算した。有意な効果が見出された場合、事後比較を、テューキーの真の有意差検定を使用して行った。差をＰ＜０．０５＊において有意と見なした。
結果及び考察：本明細書に記載される食物粉末の適用を調査する実験を実施した。これらの研究のために、直ぐ上に記載した研究において調製した食物粉末を使用した。
図４６は、食物粉末の抗酸化能の評価を示す。粉末を水に溶解し、溶液の抗酸化能を、溶液のＤＰＰＨラジカル捕捉能をマイクログラム単位のポリフェノール当量（フォーリン・チオカルト試薬によって推定される）として推定することによって決定した。０．１ｍＭフォーリン・チオカルト試薬をメタノール中で調製し、食物粉末溶液を明記した量で添加した。抗酸化物質を１ｍｌのＤＰＰＨ試薬と反応させ、吸光度（紫色、５１７ｎｍの吸収）をモニタリングした。５１７ｎｍの吸光度の低減に注目し、ポリフェノールを含まない対照との比較における消去％として表した。トロロックスを陽性対照として、ポリフェノールと同じ濃度で使用し、これは１のＴＥＡＣ値を示した。ある濃度における各点は、調製した食物粉末の個々のサンプルを表す。結果は食物粉末の強い抗酸化能を示す。抗酸化成分（ナノファイバー骨格に結合した）の生物学的利用能はより高い可能性が高いため、これらの結果は、食物粉末が、フリーラジカルを捕捉し炎症を減少させるという点で、溶液中で遊離している成分と比較してより大きな影響を有し得ることを示唆する。
図４７は、食物粉末及び水で処置した野生型（ＷＴ）及びエタノールアミンノックアウトマウス（ＫＯ）の身体質量変化の評価を示す。実験を、２４週齢Ｐｃｙｔ２ノックアウトマウス（ＫＯ）及び同腹仔対照を用いて実施した。ＫＯ及び野生型マウスの未処置（Ｕ）群（それぞれｎ＝４～６）に１００ｕＬの水を強制投与によって処置の時間に与えた。ＫＯ及び野生型（ＷＴ）マウスの処置（Ｔ）群（それぞれｎ＝４～６）に１００ｕｇの食物粉末（１００ｕＬの水中）を１週間当たり５回投与した。全ての群に対する強制経口投与は８週間継続した。処置期間の最後にマウスを屠殺し、血液及び組織サンプルを分析のために収集した。星印は有意に異なる値を示す（＊－Ｐ＜０．０５、＊＊－Ｐ＜０．０１）。これらの結果は、食物粉末処置が体重増加を予防することにおいて有意な効果を有し得ることを示唆する。遺伝子的に損なわれて肥満をもたらし得る系において、食物粉末消費は体重を維持する場合の選択肢となり得る。食物粉末処置は、不健康な食習慣のために肥満を発症する人々への介入としての機能も果たし得る。
図４８は、肝臓におけるトリグリセリドレベルの変化に対する食物粉末処置の効果を示す。肝臓組織のトリグリセリドレベルを、Wako社製L-type TG Mアッセイキット（Wako Life Sciences社、CA、USA）を使用して、記載されている手順によって推定した。食物粉末処置に供した野生型マウスとＥＴＫＯマウスの両方において、トリグリセリドレベルの有意な減少は存在しなかった。値は３つの別々のサンプルの平均±ＳＥＭである。食物粉末処置肥満マウスにおいてトリグリセリドの減少の傾向が存在するようである。食物粉末処置による肝臓トリグリセリドの減少は、メタボリックシンドローム及び肥満を発症する傾向を示す個体において有益であり得る。肝臓における脂質の蓄積は脂肪性肝臓疾患に関連する症候群である。食物粉末成分はそのような症候群及び関連する健康問題を少なくとも部分的に回復させ得る可能性がある。
図４９は、食物粉末処置及び未処置野生型及びＥＴＫＯマウスの血液血清パラメータを示す。アルブミン、グロブリンのレベル、及びそれらの比の主要な変化は存在しなかった。総タンパク質の点で対照と処置群との間に有意差は存在しなかった。値は３つの独立した処置の平均±ＳＥＭである。このデータは、食物粉末処置がいくつかの生理学的パラメータでは有意な変化を引き起こさないことを示唆し、その作用がある特定の状態に対して比較的より特異的であり得ることを示唆する。
図５０は、食物粉末処置及び未処置野生型及びＥＴＫＯマウスの血液血清パラメータを示す。グルコース、リン、及び尿素のレベルの主要な変化は存在しない。食物粉末で処置した肥満マウスにおいてトリグリセリドレベルのわずかな減少が存在するようである。値は３つの独立したサンプルの平均±ＳＥＭである。これらのデータは、食物粉末処置がいくつかの生理学的パラメータでは有意な変化を引き起こさないことを示唆し、その作用がある特定の状態に対して比較的より特異的であり得ることを示唆する。
図５１は、食物粉末で処置した野生型及びＥＴＫＯマウスにおけるケモカイン（走化性サイトカイン）の転写物レベルの変化を示す。ＣＣＬ型ケモカインは、単球の炎症部位への誘引を引き起こす活性化Ｔ細胞によって分泌される低分子糖タンパク質である。ＣＣＬ１（Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド１）及びそのファミリーメンバー（ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５…）は炎症過程に関与する。ＣＣＬ２及びＣＣＬ５の有意な減少が食物粉末処置に応答した野生型マウスにおいて観察された。ＥＴＫＯマウスでは食物粉末処置後にこれらのケモカインの減少を示す傾向が存在するが、この試験では有意には異ならない。データは３匹の独立したマウスからのサンプルにおける転写物レベルの平均±ＳＥＭである。ＣＣＬ１は機能するためにＣＣＲ８に結合する。ＣＣＬ２（単球走化性タンパク質１；ＭＣＰ１）も単球の炎症部位への誘引に関与し、受容体ＣＣＲ２及びＣＣＲ４に結合する。ＣＣＬ３（マクロファージ炎症性タンパク質－アルファ；ＭＩＰ１－α）は急性炎症に関与し、白血球の誘引物質である。これは受容体ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、及びＣＣＲ５）に結合する。ＣＣＬ５はＣＣＲ５表面受容体に結合し、炎症及びがん進行に関与する。これらのデータは、食物粉末処置が炎症に関するこれらの成分の下方制御をもたらし得ることを示唆する。
図５２は、食物粉末で処置した野生型及びＥＴＫＯマウスにおけるケモカイン（走化性サイトカイン）の転写物レベルの変化を示す。ＣＣＬ型ケモカインは、単球の炎症部位への誘引を引き起こす活性化Ｔ細胞によって分泌される低分子糖タンパク質である。図は、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１７、及びＣＣＬ１９の転写物レベルの変化を示す。ＣＣＬ６はげっ歯類に特有であり、その作用の間にＣＣＲ１に結合し得る。ＣＣＬ６は骨髄細胞分化の間にマクロファージにおいて発現する。ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、及びＣＣＬ１７の有意な減少が食物粉末処置に応答した野生型マウスにおいて観察された。ＣＣＬ７の有意な減少がＥＴＫＯマウスにおいて観察された。ＣＣＬ１９は、野生型マウスとＥＴＫＯマウスの両方において転写物の変化を示さなかった。データは３匹の独立したマウスからのサンプルにおける転写物レベルの平均±ＳＥＭである。ＣＣＬ６は機能するためにＣＣＲ１に結合する。ＣＣＬ７も単球の炎症部位への誘引に関与し、ＣＣＲ２受容体に結合する。異常なレベルのＣＣＬ７発現は、腫瘍発生及びＭＭＰ－２活性化及び転移に関連する。したがって、ＣＣＬ７の下方制御はがん予防において高度に有益である可能性が高い。ＣＣＬ１７は、リンパ球の化学誘引に関与し、アテローム動脈硬化症及び炎症性腸疾患等の炎症性疾患の誘発に関与する。ＣＣＬ１９はリンパ球再循環に関与する。全体としてこれらの結果は、炎症を増加することに関与する成分のレベルを減少させることを支持する。
図５３は、食物粉末で処置した野生型及びＥＴＫＯマウスにおけるＣＣＬ２２ケモカイン（走化性サイトカイン）の転写物レベルの変化を示す。ＣＣＬ２２は、腫瘍及び腫瘍浸潤Ｔ細胞によって産生され、腫瘍による免疫抑制及び免疫細胞回避を引き起こし、腫瘍進行を促進する。免疫細胞におけるＣＣＬ２２過剰発現はインターロイキン－アルファによって引き起こされる。食物粉末処置に応答した野生型マウスとＥＴＫＯマウスの両方において、ＣＣＬ２２のレベルの変化は存在しなかった。データは３匹の独立したマウスからのサンプルにおける転写物レベルの平均±ＳＥＭである。これらの結果は、食物粉末処置によるＣＣＬ２２の発現に対する主要な効果が存在しなかったことを示唆する。
図５４は、食物粉末での処置に供した野生型及びＥＴＫＯマウスにおけるＣＣＲ型受容体の転写物レベルの変化の評価を示す。ＣＣＲファミリーのケモカイン受容体は、好酸球、好塩基球、リンパ球、マクロファージ、及び樹状細胞等の血球において発現し、それらの発現／活性の増強は炎症の増加と関連付けられる。いくつかのシグナル伝達経路は、ＣＣＲがリガンドであるケモカイン（ＣＣＬファミリー）に結合する場合に活性化する。食物粉末処置は、野生型マウスとＥＴＫＯマウスの両方においてＣＣＲ１及びＣＣＲ６の発現レベルを変化させなかった。野生型マウスにおけるＣＣＲ２及びＣＣＲ８は食物粉末処置に応答した有意な下方制御を示し、食物粉末が、炎症を引き起こすＣＣＲのレベルを下方制御し得ることを示唆した。また、食物粉末を給餌したＥＴＫＯマウスにおいてＣＣＲ８の有意な下方制御が存在した。したがって、ケモカインとそれらの受容体の両方のレベルの減少が、食物粉末処置に対する応答として生じるようである。データは３匹の独立したマウスからのサンプルにおける転写物レベルの平均±ＳＥＭである。図５５は、食物粉末での処置に供した野生型及びＥＴＫＯマウスにおけるＣＳＦ（コロニー刺激因子）の転写物レベルの変化の評価を示す。ＣＳＦは、顆粒球／マクロファージ（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージ（Ｍ－ＣＳＦ）、及び顆粒球（Ｇ－ＣＳＦ）によって産生されるサイトカインである。それらの発現／活性の増強は炎症の増加と関連付けられ、下方制御は炎症性疾患及び自己免疫疾患の軽減において役立つ。ＣＳＦレベルは野生型マウス及び食物粉末で処置したマウスにおいて類似した。ＣＳＦ３は、ＥＴＫＯマウスにおいて上方制御し、肥満の発症と関連付けられる可能性を有した。食物粉末での処置は、ＣＳＦレベルを野生型マウスにおいて観察されたレベルにより近付けた。ケモカインとそれらの受容体の両方のレベルの減少が、食物粉末処置に対する応答として生じるようである。ＣＤ４０ＬＧは免疫細胞の表面に局在するＣＤ４０タンパク質のリガンドであり、このタンパク質の発現の増加は、いくつかのがんの発症との関連において、炎症の増加と関連付けられている。血管内皮において、血小板によるＣＤ４０リガンドの分泌の増加は、プラーク細胞の形成及び動脈の遮断を生じるＲＯＳの産生を増強するようである。食物粉末で処置したマウスにおいてＣＤ４０リガンドの発現の有意な減少が存在し、そのレベルを野生型におけるレベルに近付けた。データは３匹の独立したマウスからのサンプルにおける転写物レベルの平均±ＳＥＭである。
図５６は、野生型及びＥＴＫＯマウスにおける、食物粉末処置に応答したＣＸＣモチーフケモカインの変化の評価を示す。ＣＸＣｌ型ケモカイン、すなわちＣＸＣＬケモカインは免疫原性細胞の表面のＣＸＣＲ型受容体に結合し、それらの作用を誘導する。ＣＸＣＬ１（ＣＸＣモチーフリガンド１）、及びその受容体ＣＸＣＲ－２を介した作用は炎症において肝要な役割を果たす。ＣＸＣＬ１は野生型マウスにおいて有意に下方制御したが、ＥＴＫＯマウスは食物粉末処置に応答した有意な変化を示さなかった。ＣＸＣＬ１０及びその受容体ＣＸＣＲ３は、臓器特異的疾患（１型糖尿病）及び全身性自己免疫疾患、例えば関節リウマチを含む、自己免疫疾患発症の間に生じる病態に関係する。インターフェロン及びＴＮＦはＣＸＣＬ１０の産生を活性化し、ＴＨ１リンパ球の活性化をもたらす。ＣＸＣＬ１０は野生型マウスにおいて有意に下方制御したが、ＥＴＫＯマウスは食物処置に応答したいかなる変化も示さなかった。ＣＸＣＬ－１２（ＣＸＣ－モチーフリガンド－１２；間質細胞由来因子１又はＳＤＦ１）はその受容体ＣＸＣ－Ｒ４に結合するケモカインである。ＣＸＣＬ－１２は種々の組織において発現し、発生において重要である。ＣＸＣＬ－１２の過剰発現は炎症を引き起こし、白血球に対して高度に走化性である（神経炎症）。ＣＸＣＬ１２は膵臓がん、多発性硬化症、アルツハイマー病等に関する臨床マーカーである。ＣＸＣＬ－１２は食物粉末処置に応答した野生型マウスにおいて下方制御した。データは３匹の独立したマウスからのサンプルにおける転写物レベルの平均±ＳＥＭである。これらの結果は、同じ処置に対する野生型マウス及びＥＴＫＯマウスの差次的な応答を示す。理論に拘束されることを望むものではないが、状態としての肥満は抗炎症剤に対する応答のパターンを変化させ得る。
図５７は、ＣＸＣリガンド転写レベルに対する食物処置の効果の評価を示す。ＣＸＣｌ－５は、インターロイキン及びＴＮＦアルファによって刺激された炎症の間に産生される。これはＣＸＣ受容体２に結合する。これは、細胞増殖において役割を果たし、運動性及び血管新生を増強すると考えられている。未処置野生型マウスと食物粉末処置野生型マウスとの間、及び未処置ＥＴＫＯマウスと食物粉末処置ＥＴＫＯマウスとの間にＣＸＣＬ５の変化は存在しなかった。ＣＸＣＬ１５は、肺表皮細胞、腸細胞等において発現するケモカインであり、炎症と関連付けられる。未処置野生型マウスと食物粉末処置野生型マウスとの間、及び未処置ＥＴＫＯマウスと食物粉末処置ＥＴＫＯマウスとの間にＣＸＬ１５の転写物レベルの変化は存在しなかった。データは３匹の独立したマウスからのサンプルにおける転写物レベルの平均±ＳＥＭである。これらの遺伝子は食物粉末処置に応答せず、その作用の特異的性質を示した。
図５８は、ＣＸＣＲ（免疫活性な血球を誘引して炎症を誘導することによって、ケモカインファミリーのＣＸＣリガンド及びインターロイキンに結合するＣＸＣモチーフケモカイン受容体）の結果を示す。ＣＸＣＲ－２のレベルは、野生型マウスにおいて食物粉末処置によって有意に減少した。変化はＥＴＫＯマウスでは観察されなかった。ＣＸＣＲ－５及び３、並びに野生型マウスとＥＴＫＯマウスの両方におけるＣＸＣＲ５に差は存在しなかった。結果は、リガンド（Ｃ－Ｃ、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフ）の他に、受容体も食物粉末での処置によって調節される可能性があり、炎症のより良好な下方制御を実現し得ることを示唆する。腫瘍壊死因子ファミリーの受容体は炎症に関与する別の群の受容体であり、いくつかの天然物はＴＮＦアルファ関連シグナル伝達経路を下方制御することが公知である。ＦＡＳリガンド（ＦＡＳ Ｌ）はＴＮＦスーパーファミリーに属し、その受容体との結合はアポトーシスを開始させる。野生型マウスとＥＴＫＯマウスの両方において、食物粉末処置後のＦＡＳ Ｌのレベルに有意差は存在しなかった。データは３匹の独立したマウスからのサンプルにおける転写物レベルの平均±ＳＥＭである。食物粉末処置は、試験された条件下ではこれらの遺伝子の発現に影響を及ぼさないようであった。
図５９は、野生型及びＥＴＫＯマウスにおける、食物粉末処置に対する応答としてのインターロイキンの変化の評価を示す。インターロイキンは免疫機能に関与するサイトカインであり、一部のインターロイキンは炎症誘発性であり（ＩＬ１７）、他のインターロイキンは抗炎症性機能を有する（ＩＬ１０）。これらは、正常な状態下、及び病原生物で感作した場合に、免疫機能を媒介する。食物粉末で処置した野生型マウスのＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、及びＩＬ７の発現レベルにおいて有意な減少が観察された。これらのインターロイキンのレベルは、食物粉末処置に応答したＥＴＫＯマウスでは依然として同等であった。ＩＬ４の発現レベルは、未処置及び食物粉末処置野生型及びＥＴＫＯマウスにおいて依然として同等であった。データは３匹の独立したマウスからのサンプルにおける転写物レベルの平均±ＳＥＭである。結果は、野生型マウスとＥＴＫＯマウスとの間の発現パターンの差を示唆する。
図６０は、野生型及びＥＴＫＯマウスにおける、食物粉末処置に対する応答としてのインターロイキンの変化の評価を示す。インターロイキンは、正常な状態下、及び病原生物で感作した場合に、免疫機能を媒介する。野生型マウスとＥＴＫＯマウスの両方において、食物粉末処置に応答したＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ２ｒｂ、及びＩＬ１７１の発現レベルの変化は存在しなかった。データは３匹の独立したマウスからのサンプルにおける転写物レベルの平均±ＳＥＭである。これらの結果は、食物粉末処置が野生型マウスとＥＴＫＯマウスの両方において全ての遺伝子発現の変化を引き起こすのではなく、比較的より標的を定めるものであることを示唆する。
図６１は、野生型及びＥＴＫＯマウスにおける、食物粉末処置に対する応答としてのインターロイキンの変化の評価を示す。野生型マウスとＥＴＫＯマウスの両方において、食物粉末処置後のＩＬ１７の発現レベルの変化は存在しなかった。インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）はウイルス剤に対する応答に関与する別のサイトカインである。野生型マウスとＥＴＫＯマウスの両方において、食物粉末処置に応答したＩＦＮＧのレベルの変化は存在しなかった。データは３匹の独立したマウスからのサンプルにおける転写物レベルの平均±ＳＥＭである。これらの結果は、遺伝子発現を変化させることにおける食物粉末の標的化作用を示唆する。
図６２は、野生型及びＥＴＫＯマウスにおける、食物粉末での処置の間の応答と関連する腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバーの転写物レベルの変化の評価を示す。ＬＴＢ（リンホトキシンＢ：リンホトキシンベータ（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー３）は膜タンパク質であり、炎症性応答の誘導因子である。ＬＴＢ転写物のレベルは、食物粉末処置に応答した野生型マウスにおいて下方制御した。食物粉末で処置したＥＴＫＯマウスではＬＴＢ転写物レベルの変化は存在しなかった。ＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバー、例えばＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１１ｂ、及びＴＮＦＳ１１３ｂの転写物レベルは、野生型マウスとＥＴＫＯマウスの両方において食物粉末処置後に変化しなかった。データは３匹の独立したマウスからのサンプルにおける転写物レベルの平均±ＳＥＭである。
野生型マウスも炎症性サイトカイン及びそれらの受容体を下方制御することによって食物粉末処置に応答し、場合によっては肥満マウスにおけるよりもはるかに大きく応答したことに注目することは興味深い。このことは、食物粉末が正常マウスにおいてでさえ炎症を下方制御することに特に効果的であり得ることを示唆する。炎症の下方制御はいくつかの慢性疾患の予防に高度に関連するため、類似したそのような食物粉末処置（すなわち摂取）はヒト及び／又は他の動物におけるいくつかのそのような慢性疾患に有益となり得る。
有機分子とナノ粒子及びナノファイバーとの結合のｐＨ依存性
水性条件下での有機分子のナノファイバー及びナノ粒子との結合能を評価する実験を実施した。ナノファイバーとナノ粒子の両方の主要な成分は、キシラン及びアラビナン等の他の主要ではない炭水化物ポリマーと一緒になったポリガラクツロン酸（ＰＧ，polygalacturonic acid）ポリマーである（以下を参照のこと）。ＰＧのカルボン酸部分は、４に近いｐＫａを有する水性溶液中のＰＧに高度に酸性の特性を与える。このｐＨでは、大半のカルボン酸は解離した形態（ＣＯＯ－）において存在することになる。これはマルチストランド構造における個々のストランドと反発する傾向を有することがあり、場合によりリガンド分子の結合の増加を容易にする。
Figure 2022513081000007
この可能性を検証するために、ナノファイバー及びナノ粒子を色素と共にインキュベートし、結合能をモニタリングした。ナノファイバーに関してはカルセイン（Ｅｘ ４９０、Ｅｍ－５１５）を使用し、ナノ粒子に関してはdylightを使用した（Ｅｘ ６５０、Ｅｍ ６８０）。ナノ粒子は、ポリフェノールを含有したため、スペクトルの緑色～オレンジ色の領域における発光を消去する傾向がある。したがって、６００ｎｍ超に吸収／発光特徴を有するdylightを使用した。これらの色素は両方ともナノ粒子及びナノファイバーによって組み込まれる。
ナノファイバー（１０ｍｇ）を１０ｍｌの水に溶解した。ナノ粒子も１０ｍｇの粉末を１０ｍｌの水に含有した。（組成、官能基等の観点から見ると、これらの２種類の調製物の間の同等性は存在しない可能性が高い）。ナノファイバーを５ｍｇのカルセイン（１０ｍｌ中）と混合した。ナノ粒子溶液を１０ｍｌ中２００μｇ当量のdylightと混合した。
溶液を３時間穏やかに混合し、１００μｌの画分に分離し、画分をｐＨ４～ｐＨ７の範囲の異なるｐＨの緩衝液に対して一晩透析した。透析ナノファイバー及びナノ粒子溶液を２ｍｌまで希釈し、吸光度を色素に関するλｍａｘ（カルセインは４９０ｎｍ、dylightは６５２ｎｍ）において測定した。カルセイン及びdylight溶液をナノファイバー及びナノ粒子溶液と同様に比例させて希釈して、対照を得た。結果を以下の表６及び７に示す。
Figure 2022513081000008
ｐＨ４～ｐＨ７のカルセイン吸収においてｐＨに依存した増加が存在した。カルセイン吸光度はｐＨ４～６の領域において最も高く、それを超えるとコンジュゲーションはおそらく減少した。結合はｐＨ４～６の範囲において最大であり、ナノファイバーを含まない対照よりも１４５％及び１１６％増加した。効果的な結合は、全てのカルボン酸基が完全に解離している場合、ｐＨが増加するにつれて減少する傾向がある。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、より高いｐＨでのナノファイバー構造における構造有機酸（例えばリンゴ酸、アスコルビン酸等）の解離にも起因し得る。
Figure 2022513081000009
ナノ粒子及びdylightの水性溶液を３時間穏やかに混合し、１００μｌの画分に分離し、画分をｐＨ４～ｐＨ７の範囲の異なるｐＨの緩衝液に対して一晩透析した。透析ナノ粒子溶液を２ｍｌまで希釈し、吸光度をλｍａｘ（６５２．５ｎｍ）において測定した。dylight溶液も透析ナノ粒子溶液と同様に比例させて希釈して、各ｐＨセットの対照を得た。ナノ粒子の存在下において、試験された条件下では、dylightからの吸光度はｐＨとは無関係に減少する傾向があり、ｐＨとの明確な関係は顕著ではなかった。理論に拘束されることを望むものではないが、これはおそらくは、ナノ粒子が密接に会合した構造であり、自己組織化後では、内部の部分をある特定の成分に高効率に結合させ得ないためである。しかしながら、どちらの場合においても、色素は徹底した透析にもかかわらず保持され、化学的コンジュゲートがナノ粒子及びナノファイバーによるカーゴ送達に必要ではない場合があることを示唆した。しかしながら、ある特定の実施形態では、コンジュゲーションは、カーゴが大きい場合、例えばモノクローナル抗体等の抗体及び／又は他の大きな分子の場合に好ましいことがある。
食物粉末で処置した肝臓切片のマウス研究
肥満のマウスモデルにおける食物粉末処置の効果を評価する研究をマウスにおいて行った。実験の条件は上に記載した通りである。切片を、エオジン／ヘマトキシリンで染色した。
図６３は、食物粉末処置を伴う及び伴わないマウスにおける肝臓切片を示す。パネル（Ａ）は、未処置野生型（ＷＴ）マウス肝臓切片を例示する。見られるように、可視である脂質体はほとんど存在しない。パネル（Ｂ）は、食物粉末で処置した野生型（ＷＴ）マウス肝臓切片を例示する。この場合も、可視である脂質体はほとんど存在しない。パネル（Ｃ）は、未処置肥満（ＫＯ）マウス肝臓切片を例示する。このパネルにおいて、明確な円形の範囲は肝臓に広く分布する脂質体である。パネル（Ｄ）は、食物粉末で処置した（ＫＯ）マウス肝臓切片を例示する。明確な円形の範囲は脂質体である。組織再生の潜在的な範囲を矢印によって示す。これらの結果は、本明細書に記載した食物粉末で処置した肥満マウスにおける脂質体の明確な減少を示す。
１又は２以上の例示的な実施形態を例として記載した。いくつかの変形及び修正を特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく行うことができることは当業者に理解されるだろう。
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ここ及び本明細書の他の箇所に引用された全ての参考文献はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (93)

  1. 均質化した植物組織に由来する自己組織化した細胞成分を含むナノファイバーであって、前記細胞成分が１又は２以上の構造炭水化物又はその切断産物を含み、脂質及びポリフェノールが前記ナノファイバーの構造成分ではない、前記ナノファイバー。
  2. 実質的に脂質を含まないか、実質的にポリフェノールを含まないか、又はその両方である、請求項１に記載のナノファイバー。
  3. 少なくとも１つの構造炭水化物を含む、或いは少なくとも１つの構造炭水化物から構成されている１又は２以上の鎖を含む伸長した繊維を含む、請求項１又は２に記載のナノファイバー。
  4. ペクチン、ヘミセルロース、ペプチド及び／又はタンパク質、有機酸、その切断産物、又はその任意の組合せを含む、請求項１～３のいずれかに記載のナノファイバー。
  5. 有機酸が、リンゴ酸、アスコルビン酸、又はその両方を含む、請求項４に記載のナノファイバー。
  6. 細胞成分が、ナノファイバーに自己組織化することができる、熟成の間又は熟成した果実の均質化の間の植物組織から遊離される細胞成分を含む、請求項１～５のいずれかに記載のナノファイバー。
  7. １又は２以上の構造炭水化物が、ペクチン、ペクチン酸、ペクチンのメチルエステル、ペクチン誘導体、ポリガラクツロン酸、ラムノガラクツロナン、キシログルカン、ヘミセルロース；グルコース、マンノース、若しくはキシロースのβ－（１→４）－連結骨格を保持するキシログルカン；及び／又はアラビノガラクタン、及び／又はその切断産物のうちの１又は２以上を含む、請求項１～６のいずれかに記載のナノファイバー。
  8. 直径約５～１０ｎｍを有する繊維形状を有する、請求項１～７のいずれかに記載のナノファイバー。
  9. ナノファイバーが、水素結合相互作用によって安定化され、植物組織の細胞成分の異化作用に由来する高分子の間で形成され、ヒドロキシル基及び／又はアミノ基及び／又は有機酸基を保持している、請求項１～８のいずれかに記載のナノファイバー。
  10. ナノファイバーが非結晶性である、請求項１～９のいずれかに記載のナノファイバー。
  11. 生物学的に活性な薬剤をさらに含む、請求項１～１０のいずれかに記載のナノファイバー。
  12. 生物学的に活性な薬剤が、薬学的な活性薬、タンパク質、酵素、栄養補助食品、又は栄養分である、請求項１１に記載のナノファイバー。
  13. 水溶液中にある、請求項１～１２のいずれかに記載のナノファイバー。
  14. 粉末形態である、請求項１～１２のいずれかに記載のナノファイバー。
  15. 脱水、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライ形態である、請求項１～１２のいずれかに記載のナノファイバー。
  16. 植物組織が果実又は野菜植物組織を含む及び／又はポリフェノールが均質化前に前記植物組織から除去されている、請求項１～１５のいずれかに記載のナノファイバー。
  17. 植物組織が、老化果実、熟成野菜、又はその任意の組合せを含み；好ましくは、前記植物組織が、サクランボ、ブルーベリー、ブドウ、モモ、ネクタリン、プラム、アンズ、パパイア、トマト、又はその任意の組合せを含む、請求項１～１６のいずれかに記載のナノファイバー。
  18. 植物組織がスミノミザクラ果実組織を含む、請求項１６又は１７に記載のナノファイバー。
  19. 均質化した植物組織からナノファイバーを調製するための方法であって、
    植物組織から遊離される細胞成分を含む、低ポリフェノール含有量の溶液中で均質化した植物組織を調製すること；
    存在する場合、細片を前記均質化した植物組織から除去すること；及び
    任意で、前記均質化した植物組織を透析して、複合体を形成していない化合物を除去すること、又はサイズ排除によって前記複合体を形成していない化合物を除去すること
    を含み、それによって、前記細胞成分の自己組織化によって形成される前記ナノファイバーを含む溶液を提供する、前記方法。
  20. ナノファイバーを含む溶液を脱水、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライするステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
  21. ナノファイバーが、実質的に水性の媒体中での自己組織化によって形成される、請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. 溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を水性、有機性、又は混合された水性－有機性媒体中で均質化することを含む、請求項１９～２１のいずれかに記載の方法。
  23. 溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を、高剪断均質化及び／又は水、エタノール、メタノール、又はアセトンのいずれか１又は２以上を含む水性、有機性、又は混合された水性－有機性媒体中でのソノレーションに供することを含む、請求項１９～２２のいずれかに記載の方法。
  24. 溶液中で均質化した植物組織を調製するステップが、前記植物組織の均質化前に、前記植物組織を脱色して、それからポリフェノールを除去するステップを含む、請求項１９～２３のいずれかに記載の方法。
  25. 脱色することが、抽出溶媒での植物組織からのポリフェノールの抽出を行うことを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 抽出溶媒がエタノールを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 細片を除去するステップが、透析、均質化した植物組織を濾過すること、前記均質化した植物組織を遠心分離すること、又は前記均質化した植物組織にタンジェンシャルフロー濾過又は連続フロー濾過を行うこと、又はその任意の組合せを含む、請求項２１～２６のいずれかに記載の方法。
  28. 請求項１～１８のいずれかに定義されるナノファイバーを調製するための、請求項１９～２７のいずれかに記載の方法。
  29. 均質化した植物組織からナノファイバーを調製するための方法であって、
    植物組織から遊離される細胞成分を含む、低ポリフェノール含有量の溶液中で均質化した植物組織を調製すること；
    存在する場合、細片を前記均質化した植物組織から除去すること；
    前記細胞成分の自己組織化によるナノファイバーの形成を可能にすること；及び
    フリーズドライ、スプレードライ、又はナノスプレードライして、前記ナノファイバーを含む粉末を形成すること
    を含む、前記方法。
  30. 自己組織化が、実質的に水性の媒体中で生じる、請求項２９に記載の方法。
  31. 溶液中の均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を水性、有機性、又は混合された水性－有機性媒体中で均質化することを含む、請求項２９又は３０に記載の方法。
  32. 溶液中の均質化した植物組織を調製するステップが、植物組織を、水、エタノール、メタノール、又はアセトンのいずれか１又は２以上を含む水性、有機性、又は混合された水性－有機性媒体中での高剪断均質化及び／又はソノレーションに供することを含む、請求項２９～３１のいずれかに記載の方法。
  33. 溶液中の均質化した植物組織を調製するステップが、前記植物組織の均質化前に、前記植物組織を脱色して、そこからポリフェノールを除去するステップを含む、請求項２９～３２のいずれかに記載の方法。
  34. 脱色することが、抽出溶媒での植物組織からのポリフェノールの抽出を行うことを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 抽出溶媒がエタノールを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 細片を除去するステップが、透析、均質化した植物組織を濾過すること、前記均質化した植物組織を遠心分離すること、又は前記均質化した植物組織にタンジェンシャルフロー濾過又は連続フロー濾過を行うこと、又はその任意の組合せを含む、請求項２９～３５のいずれかに記載の方法。
  37. 植物組織が、抽出溶媒で抽出されて、そこからポリフェノールが除去された植物組織を含む、請求項２９～３６のいずれかに記載の方法。
  38. 抽出溶媒がエタノールを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 請求項１～１８のいずれかに定義されるナノファイバーを調製するための、請求項２９～３８のいずれかに記載の方法。
  40. 請求項１９～３９のいずれかに定義される方法によって調製されるナノファイバー。
  41. 請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーから調製される食物粉末であって、任意で、前記食物粉末が、マイクロスケールの微細粉末形態として提供される、前記食物粉末。
  42. 生物学的に活性な薬剤を、それを必要とする対象、又は細胞に送達する方法であって、
    前記生物学的に活性な薬剤と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーを、前記対象に投与すること
    を含む、前記方法。
  43. 生物学的に活性な薬剤が、セレン、亜鉛、鉄、及びマグネシウム等の元素である、請求項４２に記載の方法。
  44. 生物学的に活性な薬剤が抗がん薬であり、対象ががんを有する対象である、請求項４２に記載の方法。
  45. 抗がん薬がパクリタキセル、ビンクリスチン、又はがんの治療に使用される任意の天然又は合成の化合物である、請求項４４に記載の方法。
  46. 生物学的に活性な薬剤が、ナノファイバーの形成の間にナノファイバーに導入されているか、或いは生物学的に活性な薬剤が、任意でアルコール又は他の有機成分を含む水性ベースの媒体中の既に形成されたナノファイバーと複合体を形成している若しくはコンジュゲートされている、請求項４２～４５のいずれかに記載の方法。
  47. 水性ベースの媒体が、ＤＭＳＯ、若しくは緩衝液、又はその両方を含む、請求項４６に記載の方法。
  48. それを必要とする対象においてがんを治療する又は予防するための方法であって、
    請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーを前記対象に投与すること
    を含む、前記方法。
  49. ナノファイバーが、抗がん薬と同時に又は順次に共投与される、請求項４８に記載の方法。
  50. ナノファイバーが、抗がん薬と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、請求項４８又は４９に記載の方法。
  51. 抗がん薬がパクリタキセル又はビンクリスチンである、請求項４９又は５０に記載の方法。
  52. 対象に可溶性食物繊維を提供するための方法であって、
    請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーを前記対象に投与すること
    を含む、前記方法。
  53. 請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーを含む、粘性を増強させる食品添加物。
  54. それを必要とする対象において、食後の血糖値を低減させるための方法であって、
    請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーを前記対象に投与すること
    を含む、前記方法。
  55. 請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーを含む化粧品。
  56. それを必要とする対象に局所投与するための組成物であって、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバー、及び任意で生物学的に活性な薬剤を含む、前記組成物。
  57. それを必要とする対象において日焼けを予防するための方法であって、
    請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーを前記対象の皮膚に塗布すること
    を含む、前記方法。
  58. ナノファイバーが、追加のアントシアニン又は別のＵＶ保護剤を含む、又はアントシアニン又は別のＵＶ保護剤と共に塗布される、請求項５７に記載の方法。
  59. 細胞増殖を減少させるための方法であって、
    細胞又は組織又は器官を、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーで処置すること
    を含む、前記方法。
  60. ナノファイバーが、抗がん薬と同時に又は順次に使用される、請求項５９に記載の方法。
  61. ナノファイバーが、抗がん薬と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、請求項５９又は６０に記載の方法。
  62. 抗がん薬がパクリタキセル又はビンクリスチンである、請求項６０又は６１に記載の方法。
  63. それを必要とする対象において肝臓におけるトリグリセリド蓄積を減少させるための方法であって、
    請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーを前記対象に投与すること
    を含む、前記方法。
  64. それを必要とする対象又は細胞に生物学的に活性な薬剤を送達するための、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーの使用。
  65. 生物学的に活性な薬剤が、セレン、亜鉛、マグネシウム、及び鉄等の元素である、請求項６４に記載の使用。
  66. 生物学的に活性な薬剤が抗がん薬であり、対象ががんを有する対象である、請求項６４に記載の使用。
  67. 抗がん薬がパクリタキセル又はビンクリスチンである、請求項６６に記載の使用。
  68. 生物学的に活性な薬剤が、ナノファイバーの形成の間にナノファイバーに、導入されている、又は生物学的に活性な薬剤が、水性ベースの媒体中の既に形成されたナノファイバーと複合体を形成している若しくはコンジュゲートされている、請求項６４～６７のいずれかに記載の使用。
  69. 水性ベースの媒体が、ＤＭＳＯ、若しくは緩衝液、又はその両方を含む、請求項６８に記載の使用。
  70. それを必要とする対象においてがんを治療する又は予防するための、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーの使用。
  71. ナノファイバーが抗がん薬と同時又は順次の共投与用である、請求項７０に記載の使用。
  72. ナノファイバーが、抗がん薬と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、請求項７０又は７１に記載の使用。
  73. 抗がん薬がパクリタキセル又はビンクリスチンである、請求項７１又は７２に記載の使用。
  74. 可溶性食物繊維を対象に提供するための、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーの使用。
  75. 粘性を増強させる食品添加物又は繊維代用物としての、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーの使用。
  76. それを必要とする対象において食後の血糖値を低減させるための、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーの使用。
  77. 美容製品における、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーの使用。
  78. それを必要とする対象に局所投与するための、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーの使用であって、前記ナノファイバーが任意で生物学的に活性な薬剤と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、前記使用。
  79. 局所投与のための薬物送達ビヒクルとしての、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーの使用。
  80. それを必要とする対象において日焼けを予防するための、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーの使用であって、前記ナノファイバーが前記対象の皮膚に塗布するためのものである、前記使用。
  81. ナノファイバーが、追加のアントシアニン又は別のＵＶ保護剤を含む、又はアントシアニン又は別のＵＶ保護剤と共に塗布される、請求項８０に記載の使用。
  82. 細胞増殖を減少させるための、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーの使用。
  83. ナノファイバーが抗がん薬と同時又は順次に使用するためのものである、請求項８２に記載の使用。
  84. ナノファイバーが、抗がん薬と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、請求項８２又は８３に記載の使用。
  85. 抗がん薬がパクリタキセル又はビンクリスチンである、請求項８３又は８４に記載の使用。
  86. それを必要とする対象において肝臓におけるトリグリセリド蓄積を減少させるための、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーの使用。
  87. がんマーカーに特異的なターゲティング抗体とコンジュゲートされている、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーを含む標的化ナノファイバー。
  88. ターゲティング抗体が、標的化ナノファイバーをがん細胞にターゲティングするために、ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項８７に記載の標的化ナノファイバー。
  89. 標的化ナノファイバーが、少なくとも１つの細胞傷害性薬若しくは抗がん薬と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、請求項８７又は８８に記載の標的化ナノファイバー。
  90. 標的化ナノファイバーが、パクリタキセル、ドキソルビシン、若しくはその両方と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、請求項８９に記載の標的化ナノファイバー。
  91. 抗菌剤と複合体を形成している又はコンジュゲートされている、請求項１～１８のいずれか、又は請求項４０に定義されるナノファイバーを含む、抗菌性ナノファイバー。
  92. 抗菌剤が、リゾチーム、テトラサイクリン、又はナイシン、又はその任意の組合せを含む、請求項９１に記載の抗菌性ナノファイバー。
  93. ＭＤＲ細菌感染の治療又は予防に使用するための、請求項９１又は９２に記載の抗菌性ナノファイバー。
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