BR112021009498A2 - nanofibras derivadas de tecido de planta - Google Patents

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BR112021009498A2
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BR
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nanofiber
plant tissue
nanoparticles
individual
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Application number
BR112021009498-9A
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Gopinadhan Paliyath
Krishnaraj Tiwari
Renu Chandrasekaran
Julieta Correa-Betanzo
Priya Padmanabhan
Jayasankar Subramanian
Original Assignee
Psigryph Inc.
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Filing date
Publication date
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Abstract

NANOFIBRAS DERIVADAS DE TECIDO DE PLANTA. A presente invenção se refere a nanofibras incluindo componentes celulares automontados derivados de um tecido de planta homogeneizado. Também são descritos métodos para preparar tais nanofibras, bem como seus usos no tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios em um indivíduo e/ou como veículos de distribuição.

Description

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NANOFIBRES DERIVADAS DE TECIDO DE PLANTA CAMPO DE INVENÇÃO
[0001] A presente invenção se refere geralmente a nanofibras e seus usos. Mais especificamente, a presente invenção se refere a nanofibras derivadas de tecidos de plantas e seus usos.
FUNDAMENTOS
[0002] As frutas são fontes ricas de componentes alimentares que variam de moléculas simples, como açúcares que fornecem energia à macromoléculas complexas, como celulose e pectina, que servem como fibras alimentares, vitaminas, minerais e nutracêuticos que têm funções variadas de prevenção de doenças e regulação da saúde (Paliyath et al., 2011). Polifenóis, especialmente flavonóides e derivados, ganharam recentemente um interesse crescente por causa de seus inúmeros efeitos biológicos, como eliminação de radicais livres, modulação de atividades enzimáticas, inibição da proliferação celular, bem como sua utilidade potencial como antibiótico, antialérgico e agentes anti-inflamatórios (Clifford e Brown, 2006). Foi demonstrado que os polifenóis têm papéis potenciais na prevenção de doenças cardiovasculares, cânceres e outras doenças degenerativas (Scalbert et al., 2005, Paliyath et al., 2011). Devido à sua ampla distribuição em alimentos e bebidas de origem vegetal (incluindo sucos, chá, café e vinho), os polifenóis podem ser considerados micronutrientes comuns na dieta humana. O consumo de alimentos ricos em polifenóis tem sido promovido como forma de prevenir o desenvolvimento de doenças crônicas, bem como reduzir as taxas de mortalidade por doenças crônicas.
[0003] A atividade biológica dos polifenóis in vivo depende da absorção e metabolismo dos mesmos, bem como da sua distribuição no corpo após a ingestão (Clifford e Brown, 2006). No caso do trato gastrointestinal (GIT), as células epiteliais estão em contato com esses componentes ou seus metabólitos. O nível de polifenóis nos alimentos pode variar de 100-5000 mg/kg (Manach et al., 2004), no entanto, a extensão da absorção de polifenóis alimentares no intestino é relativamente pequena (Spencer e Rice Evans, 2003). Os níveis plasmáticos e teciduais de componentes fenólicos livres em geral estão na faixa micromolar baixa. Além disso, foi proposto que nem todos os componentes fenólicos consumidos são biodisponíveis devido às interações da matriz alimentar (Saura-Calixto e Diaz-Rubio, 2007; Saura-Calixto et al., 2007; Del Rio
2 /209 et al., 2010). Compreender a natureza e o papel das estruturas derivadas da dieta é importante, uma vez que seu estudo impacta a compreensão da influência dos nanomateriais derivados de alimentos na saúde humana.
[0004] A influência dos nanomateriais na saúde humana está cada vez mais sendo examinada, à medida que o uso de nanomateriais projetados está aumentando em todo o mundo (Maynard, 2006). Nanomateriais projetados podem escapar para o ambiente como aglomerados nanoestruturados aerotransportados (por exemplo, nanopartículas de prata, TiO2) ou SWNT (nanotubos de carbono de parede única) e entrar no corpo por inalação, ingestão e penetração através da pele e, subsequentemente, ser mobilizados em outros órgãos. Nanopartículas de titânio e zinco são cada vez mais utilizadas na indústria cosmética. Nanomateriais projetados a partir de componentes biológicos também estão sendo explorados na distribuição de medicamentos, cosméticos, ingredientes alimentícios, revestimentos, embalagens de alimentos, etc. (Azeredo et al., 2009; Ramasamy et al., 2009; Zhao et.al., 2011; Sessa et al., 2011; Zhang et al., 2012). Os nanomateriais também podem entrar no corpo através da cadeia alimentar, especialmente através do consumo de alimentos derivados de plantas que acumularam tais materiais do solo, da água e do ar (Rico et al., 2011). A presença de macromoléculas em alimentos com potencial de automontagem em nanoestruturas seria especialmente significativa (IOM, 2009). Foi observada a existência de formação potencial de nanopartículas de carbono amorfo em alimentos caramelizados, por exemplo (Palashuddin et al., 2012).
[0005] Nanomateriais e/ou métodos alternativos, adicionais e/ou aperfeiçoados para a sua produção são desejáveis.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0006] É um objetivo da presente divulgação fornecer nanofibras, deriváveis de fontes naturais (ou seja, tecido de planta), para uso como um suplemento alimentar, no tratamento e/ou prevenção de certas doenças ou distúrbios e/ou na distribuição de um agente bioativo para um indivíduo em necessidade. Métodos para a sua produção também são fornecidos.
[0007] Em uma modalidade, é fornecida aqui uma nanofibra compreendendo componentes celulares auto-montados derivados de um tecido de planta homogeneizado, os componentes celulares compreendendo um ou
3 /209 mais carboidratos estruturais ou produtos de clivagem dos mesmos, em que lipídios e polifenóis não são componentes estruturais da nanofibra.
[0008] Em outra modalidade da nanofibra acima, a nanofibra pode ser substancialmente livre de lipídios, pode ser substancialmente livre de polifenol, ou ambos.
[0009] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, a nanofibra pode compreender: uma fibra alongada que compreende um ou mais fios compreendendo ou feitos de pelo menos um carboidrato estrutural.
[0010] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, a nanofibra pode compreender pectina, hemicelulose, peptídeo e/ou proteína, um ácido orgânico, produtos de clivagem dos mesmos ou qualquer combinação dos mesmos.
[0011] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, o ácido orgânico pode compreender ácido málico, ácido ascórbico ou ambos.
[0012] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, os componentes celulares podem compreender aqueles liberados do tecido da planta durante o amadurecimento ou durante a homogeneização da fruta amadurecida, que são capazes de se automontar na nanofibra.
[0013] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, um ou mais carboidratos estruturais podem compreender um ou mais dentre pectina, ácido péctico, éster metílico de pectina, um derivado de pectina, ácido poligalacturônico, rhamnogalacturonanos, xilogucanos, hemiceluloses, xiloglucanos possuindo estruturas principais ligadas por -(14) de glicose, manose ou xilose e/ou arabinogalactanos e/ou produtos de clivagem dos mesmos.
[0014] Em outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, a nanofibra pode ter um formato de fibra com um diâmetro de cerca de 5-10 nm.
[0015] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, a nanofibra pode ser estabilizada por interações de ligação de hidrogênio e formada entre macromoléculas derivadas do catabolismo de
4 /209 componentes celulares do tecido de planta e possuindo grupos hidroxila e/ou grupos amino e/ou grupos de ácidos orgânicos.
[0016] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, a nanofibra pode ser não cristalina.
[0017] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, a nanofibra pode ainda compreender um agente biologicamente ativo.
[0018] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, o agente biologicamente ativo pode ser uma droga farmaceuticamente ativa, proteína, enzima, nutracêutico ou nutriente.
[0019] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, a nanofibra pode estar em solução aquosa.
[0020] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, a nanofibra pode estar na forma de pó.
[0021] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, a nanofibra pode estar na forma desidratada, liofilizada, seca por congelamento, seca por pulverização ou seca por nanopulverização.
[0022] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, o tecido de planta pode compreender uma fruta ou tecido de planta de legume e/ou polifenóis podem ter sido removidos do tecido de planta antes da homogeneização.
[0023] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, o tecido da planta pode compreender uma fruta em envelhecimento, um legume em maturação ou qualquer combinação destes; de preferência, em que o tecido da planta compreende cereja, mirtilo, uva, pêssego, nectarina, ameixa, damasco, mamão, tomate ou qualquer combinação dos mesmos.
[0024] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, o tecido da planta pode compreender um tecido da fruta ginja.
[0025] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para preparar nanofibras a partir de tecido d planta homogeneizado, o referido método compreendendo:
5 /209 preparar um tecido de planta homogeneizado em solução com baixo teor de polifenol, compreendendo componentes celulares liberados do tecido d planta; remover detritos do tecido de planta homogeneizado, se presente; e opcionalmente, dialisar o tecido de planta homogeneizado para remover compostos não complexados ou remover os compostos não complexados por exclusão de tamanho, proporcionando assim uma solução compreendendo as nanofibras que são formadas por automontagem dos componentes celulares.
[0026] Em outra modalidade do método acima, o método pode compreender ainda uma etapa de desidratação, liofilização, secagem por congelamento, secagem por pulverização ou secagem por nanopulverização da solução que compreende a nanofibra.
[0027] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, as nanofibras podem ser formadas por automontagem em um meio substancialmente aquoso.
[0028] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de preparação do tecido d planta homogeneizado em solução pode compreender a homogeneização de um tecido de planta em um meio aquoso, orgânico ou aquoso-orgânico misto.
[0029] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de preparação do tecido d planta homogeneizado em solução pode compreender submeter um tecido de planta a homogeneização de alto cisalhamento e/ou sonolação em um meio aquoso, orgânico ou aquoso- orgânico misto compreendendo qualquer um ou mais dentre água, etanol, metanol ou acetona.
[0030] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender uma etapa de branqueamento do tecido d planta para remover polifenóis do mesmo antes da homogeneização do tecido de planta.
[0031] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o branqueamento pode compreender a realização de uma extração de polifenóis do tecido de planta com um solvente de extração.
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[0032] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o solvente de extração pode compreender etanol.
[0033] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de remoção de detritos pode compreender diálise, filtrar o tecido de planta homogeneizado, centrifugar o tecido de planta homogeneizado ou realizar filtração de fluxo tangencial ou filtração de fluxo contínuo no tecido de planta homogeneizado, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0034] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o método pode ser para a preparação de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima.
[0035] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para preparar uma nanofibra a partir de tecido de planta homogeneizado, o referido método compreendendo: preparar um tecido de planta homogeneizado em solução com baixo teor de polifenol, compreendendo componentes celulares liberados do tecido de planta; remover detritos do tecido de planta homogeneizado, se presente; permitir que a nanofibra se forme por automontagem dos componentes celulares; e secagem por congelamento, secagem por pulverização ou secagem por nanopulverização para formar um pó compreendendo a nanofibra.
[0036] Em outra modalidade do método acima, a automontagem pode ocorrer em um meio substancialmente aquoso.
[0037] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender a homogeneização de um tecido de planta em um meio aquoso, orgânico ou aquoso-orgânico misto.
[0038] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender submeter um tecido de planta a homogeneização de alto cisalhamento e/ou sonolação em um meio aquoso, orgânico ou aquoso- orgânico misto compreendendo qualquer um ou mais dentre água, etanol, metanol ou acetona.
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[0039] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender uma etapa de branqueamento do tecido de planta para remover polifenóis do mesmo antes da homogeneização do tecido de planta.
[0040] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o branqueamento pode compreender a realização de uma extração de polifenóis do tecido de planta com um solvente de extração.
[0041] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o solvente de extração pode compreender etanol.
[0042] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de remoção de detritos pode compreender diálise, filtrar o tecido de planta homogeneizado, centrifugar o tecido de planta homogeneizado ou realizar filtração de fluxo tangencial ou filtração de fluxo contínuo no tecido de planta homogeneizado, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0043] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o tecido da planta pode compreender tecido da planta extraído com um solvente de extração para remover polifenóis do mesmo.
[0044] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o solvente de extração pode compreender etanol.
[0045] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o método pode ser para a preparação de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima.
[0046] Em outra modalidade, é fornecida aqui uma nanofibra preparada por qualquer um dos métodos ou métodos acima.
[0047] Em outra modalidade, é fornecido aqui um pó alimentício preparado a partir de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, opcionalmente em que o pó alimentício é fornecido em uma forma de pó fino em microescala.
[0048] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método de administração de um agente biologicamente ativo a um indivíduo ou célula em necessidade, o referido método compreendendo:
8 /209 a administração de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, que é complexada ou conjugada com o agente biologicamente ativo, para o indivíduo.
[0049] Em outra modalidade do método acima, o agente biologicamente ativo pode ser um elemento como selênio, zinco, ferro ou magnésio.
[0050] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o agente biologicamente ativo pode ser uma droga anticâncer e o indivíduo pode ser um indivíduo com câncer.
[0051] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o fármaco anticâncer pode ser paclitaxel, vincristina ou qualquer composto natural ou sintético usado para o tratamento do câncer.
[0052] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o agente biologicamente ativo pode ser introduzido na nanofibra durante a formação da nanofibra, ou o agente biologicamente ativo pode ser complexado ou conjugado com nanofibras já formadas em um meio de base aquosa opcionalmente compreendendo um álcool ou outro componente orgânico.
[0053] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o meio de base aquosa pode compreender DMSO, ou um tampão, ou ambos.
[0054] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um método para tratar ou prevenir o câncer em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima ao indivíduo.
[0055] Em outra modalidade do método acima, a nanofibra pode ser simultânea ou sequencialmente coadministrada com um medicamento anticâncer.
[0056] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a nanofibra pode ser complexada com, ou conjugada com, uma droga anticâncer.
[0057] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o fármaco anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
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[0058] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para fornecer fibra alimentar solúvel a um indivíduo, o referido método compreendendo: administrar qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima ao indivíduo.
[0059] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um aditivo alimentar aumentador de viscosidade compreendendo qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima.
[0060] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para atenuar os níveis de açúcar pós-prandial no sangue de um individuo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima ao individuo.
[0061] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um produto cosmético que compreende qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima.
[0062] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecida uma composição para administração tópica a um individuo em necessidade, a composição compreendendo qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima e, opcionalmente, um agente biologicamente ativo.
[0063] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para prevenir queimaduras de sol em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: a aplicação de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima na pele do indivíduo.
[0064] Em ainda outra modalidade do método acima, a nanofibra pode compreender, ou pode ser aplicada com, antocianina ou outro agente protetor de UV.
[0065] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para reduzir a proliferação celular, o referido método compreendendo: o tratamento de uma célula ou tecido ou órgão com qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima.
[0066] Em ainda outra modalidade do método acima, a nanofibra pode ser simultaneamente ou sequencialmente usada com uma droga anticâncer.
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[0067] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a nanofibra pode ser complexada com, ou conjugada com, uma droga anticâncer.
[0068] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0069] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para reduzir o acúmulo de triglicerídeos no fígado de um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima ao indivíduo.
[0070] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima para a administração de um agente biologicamente ativo a um indivíduo ou célula em necessidade do mesmo.
[0071] Em outra modalidade do uso acima, o agente biologicamente ativo pode ser um elemento como selênio, zinco, magnésio ou ferro.
[0072] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, o agente biologicamente ativo pode ser uma droga anticâncer e o indivíduo pode ser um indivíduo com câncer.
[0073] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0074] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, o agente biologicamente ativo pode ser introduzido na nanofibra durante a formação da nanofibra, ou o agente biologicamente ativo pode ser complexado ou conjugado com nanofibras já formadas em um meio de base aquosa.
[0075] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, o meio de base aquosa pode compreender DMSO, ou um tampão, ou ambos.
[0076] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima para tratar ou prevenir o câncer em um indivíduo em necessidade.
[0077] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, a nanofibra pode ser para co-administração simultânea ou sequencial com uma droga anticâncer.
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[0078] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, a nanofibra pode ser complexada com, ou conjugada com, uma droga anticâncer.
[0079] Em outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0080] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima para fornecer a um indivíduo fibra alimentar solúvel.
[0081] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima como um aditivo alimentar ou substituto de fibra para aumento de viscosidade.
[0082] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima para atenuar os níveis de açúcar pós- prandial no sangue de um indivíduo em necessidade.
[0083] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima em um produto cosmético.
[0084] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima para administração tópica a um indivíduo em necessidade, em que a nanofibra é opcionalmente complexada ou conjugada com um agente biologicamente ativo.
[0085] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima como um veículo de distribuição de drogas para administração tópica.
[0086] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima para prevenir queimaduras solares em um indivíduo em necessidade, em que a nanofibra é para aplicação na pele do indivíduo.
[0087] Em outra modalidade do uso acima, a nanofibra pode compreender, ou pode ser aplicada com, antocianina ou outro agente protetor de UV.
[0088] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima para reduzir a proliferação celular.
[0089] Em outra modalidade do uso acima, a nanofibra pode ser para uso simultâneo ou sequencialmente com uma droga anticâncer.
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[0090] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, a nanofibra pode ser complexada com, ou conjugada com, uma droga anticâncer.
[0091] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0092] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima para reduzir o acúmulo de triglicerídeos no fígado de um indivíduo em necessidade.
[0093] Em outra modalidade, é fornecida aqui uma nanofibra orientada compreendendo qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, conjugada com um anticorpo de direcionamento específico para um marcador de câncer.
[0094] Em outra modalidade da nanofibra orientada acima, o anticorpo de direcionamento pode compreender o anticorpo PD-L1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para direcionamento da nanofibra orientada para células cancerosas.
[0095] Em ainda outra modalidade da nanofibra orientada ou nanofibras orientadas acima, a nanofibra orientada pode ser complexada com, ou conjugada com, pelo menos um medicamento citotóxico ou anticâncer.
[0096] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras orientadas ou nanofibras orientadas acima, a nanofibra orientada pode ser complexada com, ou conjugada com, paclitaxel, doxorrubicina ou ambos.
[0097] Em outra modalidade, é fornecida aqui uma nanofibra antibacteriana, compreendendo qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima, complexadas ou conjugadas com um agente antibacteriano.
[0098] Em outra modalidade da nanofibra antibacteriana acima, o agente antibacteriano pode compreender lisozima, uma tetraciclina ou Nisin, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0099] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanofibras antibacterianas ou nanofibras antibacterianas acima, a nanofibra antibacteriana pode ser para uso no tratamento ou prevenção de infecção bacteriana MDR.
[0100] Em outra modalidade, é fornecida aqui uma nanopartícula que compreende componentes celulares auto-montados derivados de um tecido de planta homogeneizado, os componentes celulares compreendendo um ou mais carboidratos estruturais ou produtos de clivagem dos mesmos, em que os lipídios não são um componente estrutural da nanopartícula.
13 /209
[0101] Em outra modalidade da nanopartícula acima, a nanopartícula pode ser substancialmente livre de lipídios.
[0102] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, a nanopartícula pode compreender pectina, hemicelulose, peptídeo e/ou proteína, um ácido orgânico, pelo menos um polifenol, produtos de clivagem dos mesmos ou qualquer combinação dos mesmos.
[0103] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, a nanopartícula pode compreender: um núcleo interno à base de pectina; uma camada intermediária envolvendo o núcleo interno, a camada intermediária compreendendo macromoléculas de pectina e hemicelulose e/ou seus produtos de clivagem, polifenol e ácido orgânico; e, uma camada externa fibrilada compreendendo carboidrato macromolecular e proteína, opcionalmente formada a partir do catabolismo durante a maturação e/ou durante a homogeneização do tecido de planta.
[0104] Em outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, o ácido orgânico pode compreender ácido málico, ácido ascórbico ou ambos.
[0105] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, o polifenol pode compreender uma antocianina.
[0106] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, os componentes celulares podem compreender aqueles liberados do tecido da planta durante a maturação ou durante a homogeneização da fruta amadurecida, que são capazes de se automontar na nanopartícula.
[0107] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, um ou mais carboidratos estruturais podem compreender um ou mais dentre pectina, ácido péctico, éster metílico de pectina, um derivado de pectina, ácido poligalacturônico, rhamnogalacturonanos, xilogucanos, hemiceluloses, xiloglucanos possuindo estruturas principais ligadas por -(14) de glicose, manose ou xilose e/ou arabinogalactanos e/ou produtos de clivagem dos mesmos.
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[0108] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, a nanopartícula pode ter uma estrutura substancialmente esférica com um diâmetro de cerca de 50-250nm.
[0109] Em outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, a nanopartícula pode compreender: um núcleo interno à base de pectina; uma camada intermediária envolvendo o núcleo interno, a camada intermediária compreendendo uma ou mais estruturas de fibrila em espiral compreendendo pectina ou um derivado desta, e uma ou mais moléculas derivadas de hemicelulose ou um derivado desta; e, uma camada externa fibrilada compreendendo hemicelulose ou um produto de clivagem da mesma, e um ou mais peptídeos derivados de proteínas celulares.
[0110] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, a nanopartícula pode ser estabilizada por interações de ligação de hidrogênio presentes em um pH variando de cerca de 3 a cerca de 7 e formadas entre macromoléculas derivadas do catabolismo de componentes celulares do tecido de planta e possuindo grupos hidroxila e/ou grupos amino e/ou grupos de ácido orgânico.
[0111] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, a nanopartícula pode ser não cristalina.
[0112] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, a nanopartícula pode compreender ainda um agente biologicamente ativo.
[0113] Em outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, o agente biologicamente ativo pode ser um fármaco farmaceuticamente ativo, proteína, enzima, nutracêutico ou nutriente.
[0114] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, a nanopartícula pode estar em solução aquosa.
[0115] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, a nanopartícula pode estar na forma de pó.
[0116] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, a nanopartícula pode estar na forma desidratada,
15 /209 liofilizada, seca por congelamento, seca por pulverização ou seca por nanopulverização.
[0117] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, o tecido de planta pode compreender uma fruta ou tecido de planta de legume.
[0118] Em outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, o tecido da planta pode compreender uma fruta em envelhecimento, um legume em maturação ou qualquer combinação dos mesmos; de preferência, em que o tecido da planta compreende cereja, mirtilo, uva, pêssego, nectarina, ameixa, damasco, mamão, tomate ou qualquer combinação dos mesmos.
[0119] Em ainda outra modalidade de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, o tecido da planta pode compreender um tecido de fruta de ginja.
[0120] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para preparar nanopartículas de tecido de planta homogeneizado, o referido método compreendendo: preparar um tecido de planta homogeneizado em solução, compreendendo componentes celulares liberados do tecido de planta; remover detritos do tecido de planta homogeneizado, se presente; e, opcionalmente, dialisar o tecido de planta homogeneizado para remover compostos não complexados ou remover os compostos não complexados por exclusão de tamanho, proporcionando assim uma solução compreendendo as nanopartículas que são formadas por automontagem dos componentes celulares.
[0121] Em outra modalidade do método acima, o método pode compreender ainda uma etapa de desidratação, liofilização, secagem por congelamento, secagem por pulverização ou secagem por nanopulverização da solução que compreende a nanopartícula.
[0122] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, as nanopartículas podem ser formadas por automontagem em um meio substancialmente aquoso.
[0123] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em
16 /209 solução pode compreender a homogeneização de um tecido de planta em um meio aquoso, orgânico ou um meio aquoso-orgânico misto.
[0124] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender submeter um tecido de planta a homogeneização de alto cisalhamento e/ou sonolação em um meio aquoso, orgânico ou um meio aquoso-orgânico misto compreendendo qualquer um ou mais dentre água, etanol, metanol ou acetona.
[0125] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de remoção de detritos pode compreender diálise, filtrar o tecido de planta homogeneizado, centrifugar o tecido de planta homogeneizado ou realizar filtração de fluxo tangencial ou filtração de fluxo contínuo no tecido de planta homogeneizado, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0126] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o método pode ser para a preparação de uma nanopartícula como aqui descrito.
[0127] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para preparar uma nanopartícula a partir de tecido de planta homogeneizado, o referido método compreendendo: preparar um tecido de planta homogeneizado em solução, compreendendo componentes celulares liberados do tecido de planta; permitir que a nanopartícula se forme por automontagem dos componentes celulares; remover detritos do tecido de planta homogeneizado, se presente; e, liofilização, secagem por pulverização ou secagem por nanopulverização para formar um pó compreendendo a nanopartícula.
[0128] Em outra modalidade do método acima, a automontagem pode ocorrer em um meio substancialmente aquoso.
[0129] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender submeter um tecido de planta a homogeneização de alto cisalhamento em um meio aquoso, orgânico ou um meio aquoso-orgânico misto.
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[0130] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de remoção de detritos pode compreender filtrar o tecido de planta homogeneizado ou centrifugar o tecido de planta homogeneizado, ou ambos.
[0131] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o método pode ser para a preparação de uma nanopartícula como aqui descrito.
[0132] Em outra modalidade, é fornecida aqui uma nanopartícula preparada por qualquer um dos métodos ou métodos acima.
[0133] Em outra modalidade, é fornecido aqui um pó alimentício preparado a partir de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, opcionalmente em que o pó alimentício é fornecido em uma forma de pó fino em microescala.
[0134] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método de distribuição de um agente biologicamente ativo a um indivíduo, uma célula ou um organismo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, que é complexado com, ou conjugado com, o agente biologicamente ativo usando um processo químico ou físico, para o indivíduo, célula ou organismo.
[0135] Em outra modalidade do método acima, o agente biologicamente ativo pode ser um elemento como selênio, zinco, ferro ou magnésio.
[0136] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o agente biologicamente ativo pode ser uma droga anticâncer e o indivíduo pode ser um indivíduo com câncer.
[0137] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel, vincristina ou qualquer composto natural ou sintético usado no tratamento do câncer.
[0138] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o agente biologicamente ativo pode ser introduzido na nanopartícula durante a nanopartícula de formação, ou o agente biologicamente ativo pode ser complexado ou conjugado com nanopartículas já formadas em um meio de base aquosa opcionalmente compreendendo um álcool ou outro componente orgânico.
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[0139] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o meio de base aquosa pode compreender DMSO, ou um tampão, ou ambos.
[0140] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método de tratamento de uma doença ou distúrbio associado a níveis aumentados de espécies reativas de oxigênio que levam à inflamação em um indivíduo em necessidade, compreendendo: administrar qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima ao indivíduo.
[0141] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para tratar ou reduzir a inflamação em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima ao indivíduo.
[0142] Em outra modalidade do método acima, a nanopartícula pode compreender, ou ser coadministrada com, um agente anti-inflamatório.
[0143] Em ainda outra modalidade do método ou métodos acima, o agente anti-inflamatório pode compreender curcumina.
[0144] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para tratar ou reduzir a obesidade em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima ao indivíduo.
[0145] Em outra modalidade do método acima, a nanopartícula pode compreender componentes derivados, pelo menos em parte, de nozes, leguminosas, ervas, especiarias, legumes ou tecidos de plantas fúngicas, tradicionalmente usados para fins alimentares ou médicos.
[0146] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para tratar ou prevenir o câncer em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima ao indivíduo.
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[0147] Em outra modalidade do método acima, a nanopartícula pode ser simultaneamente ou sequencialmente coadministrada com uma droga anticâncer.
[0148] Em ainda outra modalidade do método ou métodos acima, a nanopartícula pode ser complexada com, ou conjugada com, uma droga anticâncer.
[0149] Em ainda outra modalidade do método ou métodos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0150] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para fornecer fibra alimentar solúvel a um indivíduo, o referido método compreendendo: administrar qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima ao indivíduo.
[0151] Em outra modalidade, é fornecido aqui um aditivo alimentício de aumento de viscosidade compreendendo qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima.
[0152] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para atenuar os níveis de açúcar pós-prandial no sangue de um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima ao indivíduo.
[0153] Em outra modalidade, é fornecido aqui um produto cosmético compreendendo qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima.
[0154] Em ainda outra modalidade, é fornecida neste documento uma composição para administração tópica a um indivíduo em necessidade, a composição compreendendo qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima e, opcionalmente, um agente biologicamente ativo.
[0155] Em ainda outra modalidade, é fornecido neste documento um método para prevenir queimaduras de sol em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: a aplicação de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima na pele do indivíduo.
[0156] Em outra modalidade do método acima, a nanopartícula pode compreender, ou pode ser aplicada com, antocianina adicional ou outro agente protetor de UV.
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[0157] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para reduzir a proliferação celular, o referido método compreendendo: o tratamento de uma célula ou tecido ou órgão com qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima.
[0158] Em outra modalidade do método acima, a nanopartícula pode ser simultaneamente ou sequencialmente usada com uma droga anticâncer.
[0159] Em ainda outra modalidade do método ou métodos acima, a nanopartícula pode ser complexada com, ou conjugada com, uma droga anticâncer.
[0160] Em ainda outra modalidade do método ou métodos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0161] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para reduzir o acúmulo de triglicerídeos no fígado de um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima ao indivíduo.
[0162] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima para a distribuição de um agente biologicamente ativo a um indivíduo ou célula em necessidade do mesmo.
[0163] Em outra modalidade do uso acima, o agente biologicamente ativo pode ser um elemento como selênio, zinco, magnésio ou ferro.
[0164] Em outra modalidade do uso ou usos acima, o agente biologicamente ativo pode ser uma drogao anticâncer e o indivíduo pode ser um indivíduo com câncer.
[0165] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0166] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, o agente biologicamente ativo pode ser introduzido na nanopartícula durante a formação da nanopartícula, ou o agente biologicamente ativo pode ser complexado ou conjugado com nanopartículas já formadas em um meio de base aquosa.
[0167] Em outra modalidade do uso ou usos acima, o meio de base aquosa pode compreender DMSO, ou um tampão, ou ambos.
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[0168] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima para o tratamento de uma doença ou distúrbio associado a espécies reativas de oxigênio em um indivíduo em necessidade.
[0169] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima para tratar ou reduzir a inflamação em um indivíduo em necessidade.
[0170] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, a nanopartícula pode compreender ou pode ser para administração com um agente anti- inflamatório.
[0171] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, o agente anti- inflamatório pode compreender curcumina.
[0172] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima para o tratamento ou redução da obesidade em um indivíduo em necessidade.
[0173] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, a nanopartícula pode ser derivada, pelo menos em parte, de nozes, leguminosas, ervas, especiarias, legumes ou tecidos de plantas fúngicas.
[0174] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima para tratar ou prevenir o câncer em um indivíduo em necessidade.
[0175] Em ainda uma modalidade do uso ou usos acima, a nanopartícula pode ser para co-administração simultânea ou sequencial com uma droga anticâncer.
[0176] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, a nanopartícula pode ser complexada com, ou conjugada com, uma droga anticâncer.
[0177] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0178] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima para fornecer fibra alimentar solúvel a um indivíduo.
[0179] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima como um aditivo alimentício de aumento de viscosidade ou substituto de fibra.
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[0180] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima para atenuar os níveis de açúcar pós-prandial no sangue de um indivíduo em necessidade.
[0181] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima em um produto cosmético.
[0182] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima para administração tópica a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0183] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima como um veículo de distribuição de droga para administração tópica.
[0184] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima para prevenir queimadura solar em um indivíduo em necessidade, em que a nanopartícula é para aplicação na pele do indivíduo.
[0185] Em ainda outra modalidade do uso acima, a nanopartícula pode compreender, ou pode ser aplicada com, antocianina adicional ou outro agente protetor de UV.
[0186] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima para reduzir a proliferação celular.
[0187] Em outra modalidade do uso acima, a nanopartícula pode ser para uso simultâneo ou sequencialmente com uma droga anticâncer.
[0188] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, a nanopartícula pode ser complexada com, ou conjugada com, uma droga anticâncer.
[0189] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0190] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima para reduzir o acúmulo de triglicerídeos no fígado de um indivíduo em necessidade.
[0191] Em outra modalidade, é fornecida aqui uma nanopartícula orientada compreendendo qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, conjugada com um anticorpo de direcionamento específico para um marcador de câncer.
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[0192] Em outra modalidade da nanopartícula direcionada acima, o anticorpo de direcionamento pode compreender o anticorpo PD-L1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para direcionamento da nanopartícula orientada para células cancerosas.
[0193] Em ainda outra modalidade da nanopartícula orientada ou nanopartículas orientadas acima, a nanopartícula orientada pode ser complexada com, ou conjugada com, pelo menos uma droga citotóxica ou anticâncer.
[0194] Em ainda outra modalidade da nanopartícula orientada ou nanopartículas orientadas acima, a nanopartícula orientada pode ser complexada com, ou conjugada com, paclitaxel, doxorrubicina ou ambos.
[0195] Em outra modalidade, é fornecida aqui uma nanopartícula antibacteriana, compreendendo qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, complexadas ou conjugadas com um agente antibacteriano.
[0196] Em outra modalidade da nanopartícula antibacteriana acima, o agente antibacteriano pode compreender lisozima, uma tetraciclina ou Nisin, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0197] Em ainda outra modalidade da nanopartícula antibacteriana ou nanopartículas antibacterianas acima, a nanopartícula antibacteriana pode ser para uso no tratamento ou prevenção de infecção bacteriana MDR.
[0198] Em outra modalidade, é fornecido aqui um pó alimenticio compreendendo componentes celulares auto-montados derivados de um tecido de planta homogeneizado, os componentes celulares compreendendo um ou mais carboidratos estruturais ou produtos de clivagem dos mesmos, e compreendendo ainda pelo menos um agente nutricional, em que os lipídeos não são um componente estrutural do pó alimenticio.
[0199] Em outra modalidade do pó alimenticio acima, o pó alimenticio pode compreender: estruturas fibrosas que se enrolam em torno ou em torno de si mesmas para formar uma estrutura semelhante a uma nanosfera.
[0200] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos alimentos em pó ou pós alimentícios acima, o alimento em pó pode ainda compreender um componente hidrofóbico.
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[0201] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos alimentos em pó ou alimentos em pó acima, o componente hidrofóbico pode compreender ou pode ser fornecido em leite de amêndoa, leite de coco e/ou leite derivado de uma noz comestível.
[0202] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos alimentos em pó ou alimentos em pó acima, o agente nutricional pode compreender um ingrediente ativo de ocorrência natural com um benefício para a saúde.
[0203] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos alimentos em pó ou alimentos em pó acima, o agente nutricional pode compreender um ou mais carotenóides, anonacinas, Boswelia, Ashwagandha, membros da família Ginger, canabinodióis, fruto-oligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos, inulina, alcachofra de Jerusalém, membros da família Piperaceae, Piper nigrum ou um parente silvestre contendo piperina e/ou derivados do mesmo, ou qualquer ingrediente ativo do mesmo tendo um benefício à saúde, ou qualquer extrato, derivado ou produto isolado do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos
[0204] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos pós alimenticios ou pós alimentícios acima, o pó alimentício pode compreender: ginja, ou um extrato aquoso da mesma; leite de amêndoa ou outro homogenato de amêndoas; leite de soja, ou outro homogenato de soja; brócolis, ou um extrato aquoso do mesmo; e, cúrcuma, ou um pó da mesma.
[0205] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima, o pó alimentício pode compreender: cerca de 25-30 v/v% de extrato de ginja (pelo menos cerca de 0,1 mg/ml de equivalente de polifenol); cerca de 25-30% v/v% de leite de amêndoa ou outro homogenato de amêndoas; cerca de 10-18% v/v% de leite de soja ou outro homogenato de soja; cerca de 25-30% v/v% de extrato de brócolis; e, cerca de 0,5-2,5% p/v% de cúrcuma ou pó deste.
[0206] Em outra modalidade de qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima, o extrato de ginja pode ser cerca de 1-2 mg/ml de equivalente de polifenol.
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[0207] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para preparar pó alimentício a partir de tecido de planta homogeneizado, o referido método compreendendo: preparar um tecido de planta homogeneizado em solução, compreendendo componentes celulares liberados do tecido de planta, os componentes celulares compreendendo um ou mais carboidratos estruturais ou produtos de clivagem dos mesmos e o tecido de planta homogeneizado em solução compreendendo ainda pelo menos um agente nutricional; opcionalmente, remover detritos do tecido de planta homogeneizado em solução, se presente; e, secagem por congelamento, liofilização, secagem por pulverização ou secagem por nanopulverização do tecido de planta homogeneizado em solução para formar o pó alimentício.
[0208] Em outra modalidade do método acima, o tecido da planta pode compreender uma fruta, legume ou outro tecido da planta.
[0209] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o tecido da planta pode compreender uma fruta em envelhecimento, um legume em maturação ou qualquer combinação dos mesmos; de preferência, em que o tecido da planta compreende cereja, mirtilo, uva, pêssego, nectarina, ameixa, damasco, mamão, tomate, frutas e/ou frutas de origem silvestre, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0210] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender ainda um componente hidrofóbico.
[0211] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o componente hidrofóbico pode compreender ou pode ser fornecido em leite de amêndoa, leite de coco e/ou leite derivado de uma noz comestível.
[0212] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o agente nutricional pode compreender um ingrediente ativo de ocorrência natural com um benefício para a saúde.
[0213] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o agente nutricional pode compreender um ou mais carotenóides, anonacinas, Boswelia, Ashwagandha, membros da família Ginger, canabinodióis, fruto-oligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos, inulina,
26 /209 alcachofra de Jerusalém, membro da família Piperaceae membros, Piper nigrum ou um parente silvestre contendo piperina e/ou derivados da mesma, ou qualquer ingrediente ativo dos mesmos tendo um benefício para a saúde, ou qualquer extrato, derivado ou produto isolado dos mesmos, ou quaisquer combinações dos mesmos.
[0214] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender: ginja ou um extrato aquoso da mesma; leite de amêndoa ou outro homogenato de amêndoas; leite de soja, ou outro homogenato de soja; brócolis, ou um extrato aquoso do mesmo; e, cúrcuma, ou um pó da mesma.
[0215] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender: cerca de 25-30 v/v% de extrato de ginja (pelo menos cerca de 0,1 mg/ml de equivalente de polifenol); cerca de 25-30% v/v% de leite de amêndoa ou outro homogenato de amêndoas; cerca de 10-18% v/v% de leite de soja ou outro homogenato de soja; cerca de 25-30% v/v% de extrato de brócolis; e, cerca de 0,5-2,5% p/v% de cúrcuma ou pó deste.
[0216] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o extrato de ginja pode ser cerca de 1-2 mg/ml de equivalente de polifenol.
[0217] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado pode compreender a homogeneização do tecido de planta em um meio aquoso, um meio orgânico ou um meio aquoso-orgânico misto.
[0218] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o tecido da planta pode compreender um ou mais materiais contendo nutrientes, que podem ser materiais frescos, pré-processados ou concentrados, ou qualquer combinação dos mesmos.
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[0219] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado pode compreender homogeneizar o tecido de planta com um misturador, de preferência operando em alta rpm e gerando forças de cisalhamento elevadas, um sonolador ou outro dispositivo misturador de alto desempenho.
[0220] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a etapa de remoção de detritos pode compreender a remoção de detritos com um dispositivo centrífugo, com um dispositivo de filtração, por filtração por membrana, por filtração de fluxo tangencial ou qualquer combinação dos mesmos.
[0221] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o tecido da planta pode compreender um tecido da planta obtido a partir de ou compreendendo ginja, amêndoa ou leite de amêndoa, soja ou leite de soja, brócolis, cúrcuma ou qualquer combinação dos mesmos.
[0222] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o tecido de planta homogeneizado pode compreender extrato de ginja, leite de amêndoa, leite de soja, extrato de brócolis e cúrcuma em pó.
[0223] Em outra modalidade, é fornecido aqui um pó alimenticio produzido por qualquer um dos métodos ou métodos acima.
[0224] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um método de distribuição de um agente biologicamente ativo a um indivíduo, uma célula ou um organismo em necessidade do mesmo, o referido método compreendendo: administrar qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima, que está complexado com, ou conjugado com o agente biologicamente ativo usando um processo químico ou físico, para o indivíduo ou célula ou organismo.
[0225] Em outra modalidade do método acima, o agente biologicamente ativo pode ser um elemento como selênio, zinco, ferro ou magnésio.
[0226] Em ainda outra modalidade do método ou métodos acima, o agente biologicamente ativo pode ser uma droga anticâncer e o indivíduo pode ser um indivíduo com câncer.
[0227] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel, vincristina ou qualquer composto natural ou sintético usado para o tratamento do câncer.
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[0228] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o agente biologicamente ativo pode ser introduzido no pó alimentício durante a formação do pó alimentício, ou o agente biologicamente ativo pode ser complexado ou conjugado com o pó alimentício já formado em um meio de base aquosa opcionalmente compreendendo um álcool ou outro componente orgânico.
[0229] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o meio de base aquosa pode compreender DMSO, ou um tampão, ou ambos.
[0230] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um método de tratamento de uma doença ou distúrbio associado a níveis aumentados de espécies reativas de oxigênio que levam à inflamação em um indivíduo em necessidade, compreendendo: administrar qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima ao indivíduo.
[0231] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um método para tratar ou reduzir a inflamação em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima ao indivíduo.
[0232] Em outra modalidade do método acima, o pó alimentício pode compreender, ou pode ser coadministrado com, um agente anti-inflamatório.
[0233] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o agente anti-inflamatório pode compreender curcumina.
[0234] Em ainda outra modalidade, é fornecido neste documento um método para tratar ou reduzir a obesidade em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimenticios acima ao indivíduo.
[0235] Em outra modalidade do método acima, o pó alimentício pode conter ou compreender componentes derivados, pelo menos em parte, de nozes, leguminosas, ervas, especiarias, legumes ou tecidos de plantas fúngicas, usados para fins alimentares ou médicos.
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[0236] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para tratar ou prevenir o câncer em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer um dos pós alimentcios ou pós alimenticios acima ao indivíduo.
[0237] Em ainda outra modalidade do método acima, o pó alimentício pode ser simultaneamente ou sequencialmente coadministrado com uma droga anticâncer.
[0238] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, o pó alimentício pode ser complexado com, ou conjugado com, uma droga anticâncer.
[0239] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos métodos ou métodos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0240] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um método para fornecer fibra alimentar solúvel a um indivíduo, o referido método compreendendo: administrar qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima ao indivíduo.
[0241] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um aditivo alimentício que aumenta a viscosidade compreendendo qualquer um dos pós alimentícios pó ou pós alimentícios acima.
[0242] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para atenuar os níveis de açúcar pós-prandial no sangue de um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer um dos pós alimenticios ou pós alimenticios acima ao indivíduo.
[0243] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para reduzir a proliferação celular, o referido método compreendendo: o tratamento de uma célula ou tecido ou órgão com qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima.
[0244] Em outra modalidade do método acima, o pó alimenticio pode ser simultaneamente ou sequencialmente usado com ums droga anticâncer.
[0245] Em ainda outra modalidade do método acima, o pó alimentício pode ser complexado com, ou conjugado com, uma droga anticâncer.
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[0246] Em ainda outra modalidade do método ou métodos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0247] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para reduzir o acúmulo de triglicerídeos no fígado de um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimenticios acima ao indivíduo.
[0248] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer um dos pós alimenticios ou pós alimentícios acima para a distribuição de um agente biologicamente ativo a um indivíduo ou célula em necessidade do mesmo.
[0249] Em outra modalidade do uso acima, o agente biologicamente ativo pode ser um elemento como selênio, zinco, magnésio ou ferro.
[0250] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, o agente biologicamente ativo pode ser uma droga anticâncer e o indivíduo é um indivíduo com câncer.
[0251] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0252] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, o agente biologicamente ativo pode ser introduzido no pó alimentício durante a formação do pó alimentício, ou o agente biologicamente ativo pode ser complexado com ou conjugado com pó alimentício já formado em um meio de base aquosa, opcionalmente compreendendo um álcool ou outro componente orgânico.
[0253] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, o meio de base aquosa pode compreender DMSO, ou um tampão, ou ambos.
[0254] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima para o tratamento de uma doença ou distúrbio associado a espécies reativas de oxigênio em um indivíduo em necessidade.
[0255] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima para tratar ou reduzir a inflamação em um indivíduo com necessidade do mesmo.
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[0256] Em outra modalidade do uso acima, o pó alimenticio pode compreender ou pode ser para administração com um agente anti-inflamatório.
[0257] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, o agente anti- inflamatório pode compreender curcumina.
[0258] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimenticios acima para tratar ou reduzir a obesidade em um indivíduo com necessidade do mesmo.
[0259] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, o pó alimentício pode ser derivado, pelo menos em parte, de nozes, leguminosas, ervas, especiarias, legumes ou tecidos de plantas fúngicas.
[0260] Em outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimenticios acima para tratar ou prevenir o câncer em um indivíduo em necessidade.
[0261] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, o pó alimentício pode ser para co-administração simultânea ou sequencial com uma droga anticâncer.
[0262] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, o pó alimenticio pode ser complexado com, ou conjugado com, uma droga anticâncer.
[0263] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0264] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um uso de qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima para fornecer a um indivíduo fibra alimentar solúvel.
[0265] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima como um aditivo alimentício para aumento de viscosidade ou substituto de fibra.
[0266] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima para atenuar os níveis de açúcar pós-prandial no sangue de um indivíduo em necessidade.
[0267] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima para reduzir a proliferação celular.
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[0268] Em outra modalidade do uso acima, o pó alimenticio pode ser para uso simultâneo ou sequencialmente com uma droga anticâncer.
[0269] Em ainda outra modalidade do uso ou usos acima, o pó alimenticio pode ser complexado com, ou conjugado com, uma droga anticâncer.
[0270] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos usos ou usos acima, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0271] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um uso de qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima para reduzir o acúmulo de triglicerídeos no fígado de um indivíduo em necessidade.
[0272] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um pó alimentício antibacteriano, compreendendo qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima, complexado com ou conjugado com um agente antibacteriano.
[0273] Em outra modalidade do pó alimentício antibacteriano acima, o agente antibacteriano pode compreender lisozima, uma tetraciclina ou Nisin, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0274] Em ainda outra modalidade de qualquer um dos pós alimenticios antibacterianos ou pós alimenticios antibacterianos acima, o pó alimentício antibacteriano pode ser para uso no tratamento ou prevenção de infecção bacteriana MDR.
[0275] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para carregar qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima com um agente biologicamente ativo ou carga, o referido método compreendendo: fornecer uma amostra desidratada, liofilizada ou seca por congelamento das nanopartículas; misturar o agente biologicamente ativo ou carga com a amostra das nanopartículas para fornecer uma mistura; e, adicionar água ou solução de base aquosa à mistura de modo a encolher as nanopartículas, retendo o agente biologicamente ativo ou a carga nele.
[0276] Em certas modalidades, é fornecida aqui uma composição compreendendo qualquer uma das nanopartículas ou nanopartículas acima, qualquer um dos pós alimentícios ou pós alimentícios acima, qualquer uma das nanofibras ou nanofibras acima ou quaisquer combinações dos mesmos. Em certas modalidades, a composição pode compreender ainda um excipiente,
33 /209 carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, é contemplado que as misturas de quaisquer duas ou três das nanopartículas, nanofibras e/ou pós alimentícios, conforme descrito neste documento, podem ser utilizadas para usos e/ou métodos conforme descrito neste documento. Em certas modalidades, por exemplo, uma mistura de nanopartículas e nanofibras pode ser usada; uma mistura de nanopartículas e pó alimentício pode ser usada; uma mistura de nanofibras com pó alimentar pode ser usada; ou uma mistura de nanopartículas, nanofibras e pó alimentar pode ser usada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0277] A Figura 1 mostra imagens de microscopia eletrônica de transmissão de nanopartículas preparadas de ginja (A). As nanopartículas foram absorvidas a uma grade de níquel revestida de carbono por 1 minuto flutuando as grades em uma gota de 50µl do extrato. A grade foi removida, seca com papel absorvente flutuada sobre uma gota de acetato de uranila a 1%. Após 30 segundos, a grade foi removida, seca com papel absorvente e diretamente examinada usando um microscópio Leo Electron. Em um meio líquido, as nanopartículas variam em tamanho entre 50-100nm de diâmetro. O painel B mostra uma visão ampliada das nanopartículas. As setas indicam estruturas do tipo fibrila emanando das nanopartículas.
[0278] A Figura 2 mostra visões ampliadas de nanopartículas conforme observadas sob EM. Painel A- Duas nanopartículas que tinham sido despidas das estruturas exteriores (seta 2) expondo uma casca interior muito mais lisa (seta1). Painéis B, C- Painéis mostrando morfologia detalhada do revestimento externo contendo fibrilas. A seta 1 mostra regiões das fobrilas tendo uma estrutura filamentosa em espiral. As estruturas filamentosas em espiral são revestidas com fibrilas (seta 2). Painel C mostra uma região com estrutura de fibrila simples despida dos filamentos em espiral. Painel D mostra um tapete de fibrilas (seta), formado durante a dissociação natural potencial dos complexos quando armazenado como uma solução.
[0279] A Figura 3 mostra o efeito do tratamento com pectinase (poligalacturonase) na estabilidade das nanopartículas. Um ml de extrato dialisado contendo nanopartículas (0,8-1 mg de polifenol equivalente/ml) foi tratado com pectinase (1 unidade/ml do extrato) por 15 minutos. As nanopartículas foram deixadas a absorver a grades de níquel revestidas de
34 /209 carbono e visualizadas após a coloração com acetato de uranila, conforme descrito anteriormente. Painel A- Dissolução de complexos esféricos em estruturas vesiculares e filamentosas menores podem ser vistas (região em caixa) após submeter o extrato ao tratamento com poligalacturonase, indicando a presença de estruturas macromoleculares contendo ligação α-1,4- glicosídica de ácido poligalacturônico. O painel B mostra uma versão ampliada da região em caixa. Os painéis C e D mostram o efeito do tratamento das nanopartículas com celulase (β-1,4-glucanase) que separa os complexos do revestimento filamentoso deixando um núcleo interno indicando a presença de componentes do tipo β-1, 4-glucano nos filamentos.
[0280] A Figura 4 mostra o efeito do tratamento com tripsina na estrutura de nanopartículas preparadas a partir de ginja. O extrato dialisado (1 ml) foi tratado com 1 unidade de tripsina por 15 min, e as nanopartículas foram examinadas conforme descrito acima. O tratamento com tripsina resulta na dissolução da estrutura filamentosa externa (Painel A, tingido com Vermelho de Rutênio) visto como áreas tingidas de escuro ao redor da concha de pectina interna globular das nanopartículas. As estruturas em forma de concha tendem a se fundir, conforme também observado após o tratamento com celulase (ver Figura 3). A dissolução da concha externa pela tripsina sugere que o revestimento filamentoso externo também é feito de proteína (isto é, glicoproteínas do tipo de extensão encontradas na parede celular) e, potencialmente, peptídeos derivados de sua degradação que ocorrem durante o amadurecimento e a senescência. O painel B mostra uma visão ampliada de uma estrutura semelhante a uma concha. O painel C mostra uma nanopartícula parcialmente digerida mostrando o revestimento filamentoso se dispersando em fibrilas/estruturas fibrilares. O painel D mostra uma nanopartícula que foi despida das estruturas fibrilares. A seta mostra a concha globular deixada após a dissolução das estruturas fibrilares. O painel E mostra uma visão ampliada das fibrilas/estruturas fibrilares mostrando um conjunto entrelaçado que potencialmente forma as fibrilas/estruturas fibrilares. As fibrilas/estruturas fibrilares não são filamentosas e parecem não ter simetria bilateral, e aparecem como moléculas dispostas em espiral em torno de seu próprio eixo para formar estruturas fibrilares com formas primárias, secundárias e terciárias semelhantes a cordas.
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[0281] A Figura 5 mostra uma micrografia eletrônica de varredura de extrato de ginja dialisado e liofilizado mostrando as nanopartículas. A remoção de água parece aumentar o tamanho das nanopartículas, com frações fibrilares externas potencialmente colapsadas. Sem desejar ser limitado pela teoria, em um ambiente aquoso, as porções externas das nanopartículas parecem ser livres e estendidas, as estruturas podem ser mantidas juntas pelo menos em parte por meio de ligações de hidrogênio. Quando a água é removida, as estruturas fibrilares tendem a se fundir com o núcleo de pectina das nanopartículas, também se expandindo, uma vez que não há moléculas de água para facilitar a ligação de hidrogênio. Enquanto em solução, as nanopartículas de modo geral mostram uma distribuição de tamanho variando de 25 a 50 nm de diâmetro, após liofilização o tamanho de 200-800 nm, algumas alcançando mais de um micrômetro de diâmetro.
[0282] A Figura 6 mostra uma micrografia eletrônica de varredura do extrato dialisado de ginja mostrando a formação de múltiplas estruturas compreendendo folhas (seta 1), regiões tubulares (seta 2) e fibrilas (seta 3). A formação de nanopartículas pode ser vista em algumas regiões (seta 4). Essas estruturas representam estágios intermediários na formação de nanopartículas;
[0283] A Figura 7 mostra a micrografia eletrônica de varredura (Painel A) e a Micrografia Eletrônica de Transmissão de nanofibras isoladas de ginja branqueada com etanol. Frutos de ginja foram incubados em 50% de etanol para remoção de polifenóis (antocianinas) (3x), lavados e homogeneizados em água. O homogeneizado foi dialisado contra água após a remoção dos detritos e o extrato dialisado foi liofilizado para SEM e usado diretamente para TEM. O painel A mostra a estrutura de nanofibras e nanofilmes das nanofibras (seta 1, 2). Após a coloração com acetato de uranila, as nanofibras aparecem como estruturas longas (micrômetro ou mais) (seta 1), que têm 5 a 10 nm de diâmetro (Painel B). Essas fibras ainda retêm a capacidade de formar estruturas espirais (seta 2) em solução. Conforme mostrado, em comparação, nanofibras e nanopartículas têm estruturas diferentes.
[0284] A Figura 8 mostra o efeito dos detergentes na estabilidade das nanopartículas. O extrato dialisado de ginja foi incubado na presença de concentrações crescentes de detergentes desestabilizadores de lipídios, como Triton-X 100 e desoxicolato de sódio em sacos de diálise de corte de 6-8 kDa e
36 /209 dialisado contra água ajustada a um pH de 4, por 12 h. A absorbância dos polifenóis dentro da bolsa de diálise foi medida em 520 nm (benzopirano) e 260 nm (anel fenólico). Os tratamentos com detergente não resultaram na ruptura dos complexos, uma vez que nenhuma perda no conteúdo de polifenóis pode ser observada após extensa diálise. Se as nanopartículas contivessem lipídios como entidades/componentes estruturais, o tratamento com detergente teria resultado em um vazamento de polifenóis da bolsa de diálise para o dialisado, com uma diminuição correspondente na absorbância do extrato dentro da bolsa de diálise. O aumento da absorbância com Triton-X 100 a 260 nm pode originar- se devido à absorção da porção fenil do Triton-X 100 a 260 nm conforme sua concentração aumenta na solução.
[0285] A Figura 9 mostra a composição orgânica de nanopartículas que foram obtidas após filtragem do homogeneizado através de uma coluna de exclusão de tamanho (PD 10). Tanto as nanopartículas quanto as nanofibras foram isoladas e liofilizadas em pó. O pó (400 ug) foi dissolvido em 100 ul de piridina e foram adicionados 100 ul de mistura de BSTFA: TMCS (99:1). A solução foi incubada a 80°C durante 1 hora. Um ul foi injetado diretamente para análise de GC-MS. A trimetilsililação (TMS) não hidrolizante de padrões de ácido orgânico (A), nanopartículas (B) e nanofibras (C) e sua separação usando GC- MS, indicando a presença de ácido málico, é mostrada. Conforme mostrado, em comparação, nanofibras e nanopartículas são diferentes tipos de estruturas com diferentes composições, enquanto o ácido málico é um componente comum. O painel inferior mostra o espectro de massa do derivado trimetilsililo de ácido málico de referência.
[0286] A Figura 10 mostra derivados trimetilsilil de açúcares nas nanopartículas (referido como nano complexo na Figura) e nanofibras (referido como Nano-filamento na Figura) (painel superior) e padrões de açúcar (painel inferior). Nanopartículas e nanofibras foram submetidas a digestão com ácido trifluoroacético (TFA), antes da derivatização com BSTFA. Os principais açúcares nas nanopartículas são manose, galactose/ácido galacturônico e glicose. As nanofibras são enriquecidas em arabinose e pequenas quantidades de glicose e galactose/ácido galacturônico. As quantidades são relativas, pois a digestão com TFA é difícil e pode degradar alguns componentes. Galactose e ácido galacturônico fornecem distribuição de pico semelhante, portanto, o pico
37 /209 pode representar ambos os compostos. Os resultados indicam principalmente a predominância de hexoses nas nanopartículas e pentoses nas nanofibra.
[0287] A Figura 11 mostra a análise SDS-PAGE de proteínas isoladas de frações de ginja e tingidas com azul de Coomassie. A proteína do fruto inteiro foi isolada por extração de trizol. Em condições onde a atividade da protease é inibida (como na presença de fenol, isotiocianato de guanidínio), a degradação das proteínas é mínima e as proteínas existem na fase orgânica (fenol:clorofórmio) após a adição de água e separação de fases. Faixa 1- marcadores de massa molecular; Faixa 2 - Proteína isolada do fruto inteiro; Faixa 3- Proteína do homogeneizado de fruta em água; Faixa 4 - Proteína de suco de restos celulares obtida após centrifugação a 15000xg; Faixa 5 - Proteína em suco claro obtida após centrifugação a 15000xg; Faixa 6 - pó liofilizado de extrato dialisado dissolvido e carregado em tampão de amostra; Faixa 7 - Proteína extraída de pó liofilizado com reagente trizol, fase orgânica. Após a extração de água da fruta, o suco contém principalmente peptídeos de baixa massa molecular (25 kD) que ainda estão na fase orgânica. O pó liofilizado de extrato dialisado (faixa 6) não mostra bandas discretas de proteínas, mas mostra uma mancha (faixa 6) de peptídeos quando visualizado após SDS-PAGE e coloração com azul de coomassie. A extração de trizol e a separação de fases do extrato com água deveriam teoricamente levar à migração da proteína para a fase rica em orgânicos (fase fenol:clorofórmio). Nenhuma coloração pôde ser observada com azul brilhante de Coomassie (faixa 7), sugerindo que os peptídeos podem ter migrado para a fase aquosa devido à hidrofilicidade aumentada (associação com carboidratos, polifenóis) (faixa 7). Quantidades equivalentes de amostras (15 µg de proteína) foram carregadas em cada faixa com base no peso fresco.
[0288] A Figura 12 mostra a análise SDS-PAGE de peptídeos em nanopartículas. A extração e a diálise foram conduzidas em água e também em tampão (citrato de potássio, 300mM, pH, 6, pH final após a homogeneização era pH 5) para aumentar a estabilidade dos polifenóis (antocianinas). O painel A mostra o gel antes da coloração para revelar a cor rosa devido aos polifenóis (antocianinas) quando o gel é incubado em ácido acético a 10% em água (v/v). O painel B mostra o mesmo gel que foi tingido com azul brilhante de Coomassie para revelar os peptídeos. Faixa 1 - Marcadores moleculares; A faixa 2 mostra a associação de polifenóis (antocianinas) e polipeptídeos em nanopartículas de pó
38 /209 liofilizado de extrato de água dialisada carregado em tampão de amostra. Após a extração do Trizol, o sobrenadante (fase aquosa, faixa 3) mostra a presença de peptídeos e sua associação com polifenóis (antocianinas). Faixa 4- Extrato em pó dialisado tamponado carregado no tampão de amostra. As faixas 5, 6 e 7 correspondem ao sobrenadante, interfase e fase orgânica do pó do extrato dialisado obtido após a extração do trizol. Observe-se que a maior parte dos peptídeos e polifenóis (antocianinas) estão na fase aquosa (hidrofílica) do extrato de trizol (faixa 5). A faixa 7 correspondente à fase orgânica não mostra tingimento com antocianina ou peptídeo. As faixas 8, 9 e 10 correspondem ao sobrenadante, interfase e a fase orgânica obtidos após a extração do trizol do pó do extrato dialisado de cerejas branqueadas com etanol, onde a maioria dos polifenóis (antocianinas) foram removidos. A faixa 8, painel B mostra o tingimento com azul Coomassie. A interfase e a fase orgânica do extrato dialisado de cereja branqueada mostraram coloração mínima para os peptídeos (faixas 9, 10; painel B). Associação de pectina e polipeptídeos nas nanopartículas conforme revelado pela similaridade no tingimento com iodeto de propídio e azul brilhante de Coomassie após SDS-PAGE do pó de extrato dialisado (Painéis C e D). O painel C mostra o padrão de tingimento com iodeto de propídio (10 µg em água, 0,2% em água). A faixa 1 corresponde a uma amostra padrão de pectina disponível comercialmente. A faixa 2 representa o pó dialisado do extrato dialisado; A faixa 3 corresponde ao dialisado, e esta fração mostra tingimento relativamente mais intenso para polipeptídeos. A faixa 4 corresponde a um padrão de ácido poligalacturônico que mostra tingimento com iodeto de propídio, e não para polipeptídeos. O pellet gelatinoso de homogeneizado de ginja também mostra a presença de pectina e polipeptídeos (faixa 5);
[0289] A Figura 13 mostra o extrato dialisado de cereja branqueada com etanol e cereja não branqueada contendo nanofibras e nanopartículas, respectivamente, que foram submetidas a SDS-PAGE e imunolocalização com anticorpos monoclonais específicos de estrutura (IgM de rato, www. Plant Probes.net). Os anticorpos ligados foram detectados com IgG de cabra anti-rato conjugado com fosfatase alcalina. O painel A mostra o tingimento de polipeptídeos em nanofibras (faixa 2) e nanopartículas (faixa 3) por azul brilhante de coomassie. As nanofibras de cereja branqueada são muito higroscópicas e tornam-se uma geleia que não penetra facilmente no gel. O painel B mostra a
39 /209 reatividade de anticorpos contra homogalacturonano (oligo de ésteres metílicos de ácido galacturônico ligados 1,4; LM 20). O extrato dialisado de cereja branqueada mostra reatividade em relação a este anticorpo, indicando unidades de homogalacturonana expostas nas nanofibras. No entanto, a reatividade em relação ao extrato dialisado de cereja não branqueada (contendo nanopartículas esféricas) é muito menor (Painel B, faixa 3). Isso é novamente refletido na intensidade dos dot blots mostrados abaixo do painel B. Em nanopartículas esféricas, as porções pécticas formam as conchas e são potencialmente mascaradas por peptídeos, hemiceluloses e polifenóis (antocianinas). Estes podem dificultar a acessibilidade do anticorpo anti-homogalacturonano para o interior. Enquanto em nanofibras, as porções pécticas são potencialmente expostas, o que permite uma forte interação com o anticorpo anti- homogalacturonano. Tanto as nanofibras quanto as nanopartículas mostraram apenas uma reatividade moderada para a anti-extensina (que reconhece o epítopo LM1 que é transportado por uma gama de HRGP [glicoproteínas ricas em hidroxiprolina]), sugerindo que a extensina, que é a principal proteína da parede celular em frutas (Painel C) pode não estar intacta, mas pode conter peptídeos derivados da extensina. Uma reação muito forte foi observada contra a proteína anti-arabinogalactan (glicoproteína; epítopo LM14) (proteína- hemicelulose) em ambos os complexos e fibras, sugerindo que este pode ser um componente principal da estrutura básica de nanopartículas ou nanofibras (Painel D). O painel inferior abaixo do painel A mostra a reatividade cruzada de nanopartículas e nanofibras contra anti-xiloglucano (LM 15; reconhece o motivo XXXG de xiloglucano). Não houve reação entre os anticorpos e as moléculas transferidas do gel durante o blot. Dot blots revelaram forte reação das nanofibras contra o anti-xiloglucano, mas não contra as nanopartículas.
[0290] A Figura 14 mostra a SDS-PAGE redutora de nanopartículas (Faixa 2) e Nanofibras (Faixa 3). 100 µg cada foram resolvidos em gel a 10%. (A) O gel A foi incubado em ácido acético a 10% e posteriormente tingido com azul brilhante de Coomassie (gel B). As faixas de gel destacadas em números foram identificadas por LC/MS/MS como se segue: Banda 1: fragmento de proteína PR; Glucan endo-1, 3-beta-glucosidase (Nº de Acesso P50694) de Cereja; Banda 2: fragmento de proteína PR; Pru al alérgeno da cereja principal (Nº de Acesso 024248); Banda 3: provavelmente um fragmento da banda 1. Os painéis B e C
40 /209 mostram as sequências de aminoácidos da beta-glucosidase (número de acesso P50694) e Prual (número de acesso 024248), respectivamente;
[0291] A Figura 15 mostra o espectro FT-IR de pós liofilizados dos extratos dialisados de cereja branqueada com etanol e não branqueada (painel superior) em comparação com vários componentes com semelhanças estruturais (painel inferior). Devido à natureza complexa dos componentes do extrato, é difícil obter atribuições precisas de estruturas e grupos funcionais. Uma comparação com espectros de padrões sugere a presença de alongamento OH (carboidratos, polifenóis, 3000-3500 cm-1), e vários picos devido a CH-, COO, CN, etc., estendendo-se de 500 a 2000 cm-1. São evidentes as semelhanças com a pectina, proteína, estrutura principal de peptídeo autênticos (C-N-C-N). BSA e PGA são incluídos como padrões na Figura para comparação.
[0292] A Figura 16 mostra a difração de raios-X de grande ângulo de pós liofilizados de extrato dialisado (nanopartículas) e dialisado (pectina) obtido após a extração aquosa de ginjas. Os picos agudos surgem de deflexões do suporte de amostra. Tanto o extrato dialisado quanto os pós dialisados mostram uma banda muito difusa que se estende de 2θ 10° a 30°, indicando a ausência de estruturas cristalinas no extrato dialisado (DE) e dialisado (DZ). A celulose (β- 1,4-glucano) é o único carboidrato que existe como uma estrutura cristalina nas paredes celulares. Este resultado sugere que não há produtos de celulose (porções β-1,4-glucano) nas nanopartículas como componentes principais. As pectinas têm uma estrutura amorfa que lhes permite formar folhas, vesículas e filamentos, e não apresentam um padrão de difração nítido e claro.
[0293] A Figura 17 mostra os resultados que sugerem um modelo estrutural proposto para a nanopartícula. Uma visão ampliada de uma nanopartícula conforme observada por TEM em homogenato de ginja é fornecida no Painel A e uma região ampliada é mostrada em B. O homogenato aquoso de ginja foi centrifugado (15000xg) por 15 minutos a 4°C para sedimentar os detritos e material pectináceo tipo gel. O homogenato foi passado através de uma coluna de exclusão de tamanho PD 10 recheada com Sephadex G 25 (limite de exclusão 5 kD, volume de leito de 7,5 ml, Amersham Biosciences) e as frações de volume vazio foram coletadas. A fração contendo nanopartículas foi submetida à microscopia eletrônica de transmissão. A figura mostra uma região colapsada em torno do núcleo interno mostrando uma estrutura em forma de
41 /209 anel (Painel A, seta 1), rodeada por uma região menos densa de elétrons composta por estruturas filamentosas helicoidais potencialmente contendo pectina e proteína (Painel A, seta 2), às vezes em organização em espiral (seta 2) como visto anteriormente. Circundando esta camada, há uma região semelhante a fibra ligeiramente mais densa de elétrons formando a parte externa da nanopartícula (Painel A, seta 3), potencialmente compreendendo filamentos contendo proteína arabinogalactano e pode conter polifenóis (isto é, antocianinas). Uma visão ampliada da nanopartícula é mostrada no Painel B. Os elementos helicoidais são indicados por setas.
[0294] A Figura 18 mostra o efeito da alimentação de camundongos com uma solução de nanopartículas (NP) nas mudanças de peso corporal em camundongos do tipo selvagem e ETKO. Os camundongos (6-7 meses de idade) foram divididos em quatro grupos de 5-6 cada (tipo selvagem não tratado (WT U), tipo selvagem tratado (WT T), Knockout não tratado (KO U) Knockout tratado (KO T)) Os camundongos tratados receberam uma dose de 133 g equiv. Solução NP/40g de peso corporal/dia (100mg de extrato/kg de peso corporal) por gavagem 5 vezes por semana. Camundongos não tratados receberam água. O experimento durou 4 semanas. A primeira semana do tratamento com NP não teve efeito sobre o peso corporal dos camundongos entre os grupos testados, no entanto, após as semanas 2, 3 e 4, a continuação do tratamento com NP preveniu o ganho de peso nos camundongos ETKO. Embora não tenha havido mudança significativa na perda de peso entre WT não tratado e tratado nessas doses/condições particulares, a redução do ganho de peso entre KO não tratado e KO tratado foi estatisticamente significativa (P <0,05).
[0295] A Figura 19 mostra o efeito do tratamento com nanopartículas (NP) nas alterações nos níveis de triglicerídeos no fígado. O tecido teve origem no ensaio descrito no Exemplo 2. Os níveis de triglicerídeos do tecido hepático foram estimados por procedimentos descritos no kit de ensaio Wako L-type TG M (Wako Life Sciences, CA, EUA). Houve uma redução significativa nos níveis de triglicerídeos nos camundongos ETKO submetidos ao tratamento com NP. O painel superior mostra os dados obtidos de camundongos machos e fêmeas. O painel inferior mostra os dados obtidos de camundongos machos. Uma redução nos triglicerídeos do fígado pelo tratamento com NP apoia o uso de NP para a prevenção da deposição de lipídios no fígado e sintomas patológicos
42 /209 associados, conforme definido pela atividade da enzima marcadora, como a da alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase, e uma reversão da estrutura mais próxima daquela da estrutura de fígado de camundongo de tipo selvagem, por exemplo. Abonormalidades semelhantes também são observadas em humanos em esteatose não alcoólica e/ou NASH, sugerindo que nanopartículas e/ou pó alimenticio, conforme aqui descrito neste, podem fornecer uma opção para tratar e/ou reverter tais condições.
[0296] A Figura 20 mostra a histopatologia de seções de fígado de camundongos submetidos a tratamentos conforme descrito no Exemplo 2. As seções congeladas foram coradas com coloração Oil-red-O (Sigma -Aldrich) para tornar as gotículas de lipídios contendo triglicerídeos visíveis como gotículas vermelhas. Os dois painéis/filas superiores representam as imagens das seções de fígado manchadas de camundongos do tipo selvagem (não tratado-topo; tratado com nanopartículas, fundo). A quantificação das áreas manchadas de vermelho mostra muito pouca mudança no controle e nos conjuntos de camundongos tratados. Cada painel/fila representa seções de 3 ratos independentes. Os dois painéis/filas inferiores mostram a aparência de seções de fígado de camundongos não tratados com ETKO (superior) e tratados com NP (inferior). Em geral, as seções de fígado de camundongos ETKO mostram várias áreas vazias. Essas áreas são reduzidas em ratos ETKO tratados. Além disso, a estrutura do fígado tende a ser semelhante à do WT (relativamente mais áreas vermelhas do que o controle). A área das regiões coradas de Oil Red são significativamente reduzidas após o tratamento (painel inferior da figura). Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT-U), tipo selvagem tratado (WT-T), Knockout não tratado (KO-U) e Knockout Tratado (KO- T). “SC” que aparece nos rótulos das figuras indica “Ginja”.
[0297] A Figura 21 mostra os parâmetros do soro sanguíneo de camundongos tratados com nanopartículas (NP) e não tratados. Não houve grandes mudanças nos níveis de albumina, globulina e suas proporções. Parece haver uma ligeira diminuição nos níveis de proteína total no soro. Os valores são a média ± SEM de 3 tratamentos independentes. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knockout não tratado (KO/U) e Knockout tratado (KO/T).
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[0298] A Figura 22 mostra as mudanças nos níveis de marcadores de função fisiológica sérica (ALT, AST, Colesterol e CK) de camundongos de controle e tratados com NP. As análises foram conduzidas por procedimentos padrão usando kits de teste no laboratório de Patologia, Divisão de Serviços de Laboratório da Universidade de Guelph. A alanina aminotransferase e a aspartato aminotransferase são enzimas que indicam o estado funcional do fígado. Se a função hepática for deficiente ou se o fígado estiver inflamado, mais dessas enzimas são secretadas para o sangue. Houve uma queda significativa e substancial nos níveis de ALT e AST em resposta ao tratamento com NP em camundongos obesos. Mesmo em camundongos de tipo selvagem, onde esses níveis de enzima eram baixos, o tratamento com NP resultou em declínio. O tratamento com NP parece normalizar a função hepática em camundongos obesos. Os níveis de colesterol no soro também foram reduzidos em resposta ao tratamento com NP em camundongos selvagens e obesos. Níveis elevados de creatina quinase são um indicador de dano muscular, que também mostrou um grande declínio em camundongos obesos tratados com NP. Esses resultados suportam uma função antiinflamatória do NP. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knockout não tratado (KO/U) e Knockout tratado (KO/T).
[0299] A Figura 23 mostra os níveis de glicose e fósforo no sangue de camundongos não tratados e tratados com nanopartículas. Não houve grandes mudanças nos níveis de fósforo no soro de ambos os camundongos tipo selvagem não tratados e tratados e ETKO. Os níveis de glicose foram semelhantes no tipo selvagem e mostraram uma tendência de declínio no camundongo obeso após o tratamento com a solução NP.
[0300] A Figura 24 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene STAT4 em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas, conforme descrito no Exemplo 2. A quantificação foi feita por eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR e coloração com brometo de etídio. Não há mudanças significativas nos níveis de STAT4 entre camundongos de tipo selvagem não tratados e tratados. Há uma tendência de declínio na expressão de STAT 4 nos camundongos ETKO alimentados com solução NP. Os valores não foram significativamente diferentes dos níveis em camundongos ETKO não tratados neste teste, mas uma tendência de declínio foi observada. Os valores
44 /209 são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. STAT4 (Transdutor de Sinal e Ativador de transcrição 4) é um fator de transcrição da família STAT de proteínas. STAT 4 é fosforilado por Janus Quinases, o que permite sua dimerização e translocação para o núcleo durante a sinalização de citocinas e aumenta a expressão gênica. O aumento na expressão gênica relacionada a Stat 4 é uma indicação de vias inflamatórias ativadas.
[0301] A Figura 25 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene NF-kB em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas, conforme descrito no Exemplo 2. A intensidade da banda de NF-kB foi quantificada por Western blot e detecção por quimioluminescencia. A expressão de NF-kB foi suprarregulada em camundongos obesos, sugerindo aumento da função da via inflamatória. O tratamento com solução de nanopartículas não resultou em uma mudança significativa nos níveis de NF-kB em camundongos selvagens ou obesos. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. O fator nuclear -kB (NF-kB) é uma proteína-chave envolvida na iniciação da sinalização da inflamação por meio de citocinas, como as interleucinas e o fator- de necrose tumoral. A via é complicada e pode ter papéis pró-inflamatórios e antiinflamatórios com base nas condições. Uma sinalização NF-kB reduzida é considerada uma indicação de grau reduzido de inflamação.
[0302] A Figura 26 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene TNF- em resposta ao tratamento de camundongos com solução de nanopartículas, conforme descrito no Exemplo 2. A quantificação foi feita por RT- PCR e a separação dos produtos por eletroforese em gel de agarose e coloração com brometo de etídio. Não há mudanças significativas nos níveis de expressão do gene TNF- entre camundongos de tipo selvagem não tratados e tratados. Há uma diminuição significativa na expressão de TNF- nos camundongos ETKO alimentados com solução de NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. O TNF- é uma proteína-chave envolvida nas vias de sinalização relacionadas à inflamação, causada por infecção, bem como por ativação autoimune. Uma infraregulação de TNF- é tipicamente desejável para controlar doenças autoimunes crônicas, por exemplo. Uma redução do TNF- é desejável na redução da obesidade, que também está ligada ao estado de inflamação no corpo.
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[0303] A Figura 27 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene IL6 em resposta ao tratamento de camundongos com solução de nanopartículas, conforme descrito no Exemplo 2. Não há mudanças significativas nos níveis de IL6 entre camundongos de tipo selvagem não tratados e tratados. Há uma diminuição significativa na expressão de IL6 nos camundongos ETKO alimentados com solução de NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. IL6 é uma citocina que medeia as vias pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. A ativação da IL6 é conhecida por levar ao desenvolvimento de um estado inflamatório crônico que leva a vários distúrbios. A infraregulação de IL6 pode ajudar a reduzir a inflamação e as condições crônicas, como a obesidade.
[0304] A Figura 28 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene FASN em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas, conforme descrito no Exemplo 2. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose e coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Houve uma redução significativa no nível de FAS em camundongos de tipo selvagem tratados com NP. Houve uma tendência de declínio na expressão de FAS nos camundongos ETKO alimentados com solução NP. Os valores não foram significativamente diferentes dos níveis em camundongos ETKO não tratados neste teste. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. FAS (Fatty Acid Synthase) é uma enzima envolvida na biossíntese de ácidos graxos. Os ácidos graxos são convertidos em triglicerídeos, e os níveis aumentados de ácidos graxos podem causar deposição de gordura levando à obesidade. Assim, uma redução neste nível de enzima pode favorecer a biossíntese e deposição de triglicerídeos reduzidas.
[0305] A Figura 29 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene ATGL em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas, conforme descrito no Exemplo 2. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose e coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Não houve diferença significativa no nível de ATGL entre o controle e os camundongos do tipo selvagem tratados com NP. Da mesma forma, os níveis de expressão de ATGL foram os mesmos nos camundongos ETKO não tratados e tratados com NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo; ATGL (Adipose Triglyceride Lipase) é uma
46 /209 enzima envolvida na iniciação do catabolismo dos triglicerídeos em ácidos graxos. A função ATGL está potencialmente envolvida no desenvolvimento da síndrome metabólica.
[0306] A Figura 30 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene HSL em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas, conforme descrito no Exemplo 2. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose e coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Houve um aumento significativo nos níveis de transcrição de HSL entre o controle e os camundongos do tipo selvagem tratados com NP. Os níveis de expressão de HSL foram os mesmos nos camundongos ETKO não tratados e tratados com NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. HSL (Hormone Sensitive Lipase) é uma enzima chave envolvida na hidrólise de triglicerídeos no tecido adiposo, e uma enzima chave envolvida na geração de energia. HSL atua em conjunto com ATGL para liberar ácidos graxos livres de triglicerídeos. A enzima é tipicamente ativada em resposta às catecolaminas quando a energia é necessária, como durante o jejum, e, portanto, funciona na mobilização de lipídios armazenados. Também libera ácidos graxos de ésteres de colesterol na biogênese de esteroides.
[0307] A Figura 31 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene LPL em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas, conforme descrito no Exemplo 2. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose, coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Não houve alteração no nível de transcritos de LPL em resposta ao tratamento com NP em camundongos de tipo selvagem. Em contraste, houve uma diminuição significativa nos níveis de expressão de LPL nos camundongos ETKO tratados com NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. A LPL (lipoproteína lipase) é uma enzima que hidrolisa os triglicerídeos ligados às lipoproteínas, liberando ácidos graxos livres e monoacil glicerol. A LPL é semelhante a outras lipases, como as lipases pancreáticas e hepáticas. A LPL está presente em vários tecidos, como coração, músculo e tecido adiposo, e estão presentes nas camadas de células próximas ao lúmen nos capilares. A LPL pode influenciar o metabolismo das lipoproteínas nos capilares. A atividade da LPL é regulada diferencialmente por hormônios como a insulina e a adrenalina. O nível de LPL é conhecido por aumentar após uma
47 /209 dieta rica em gorduras ou uma dieta rica em carboidratos e pode ter uma função no desenvolvimento da obesidade.
[0308] A Figura 32 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene PGC1- em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas, conforme descrito no Exemplo 2. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose, coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Não há alteração no nível de transcritos de PGC1-alfa em resposta ao tratamento com NP em camundongos de tipo selvagem. Em contraste, houve uma diminuição significativa nos níveis de expressão de PGC1- alfa nos camundongos ETKO tratados com NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. PGC1- (coativador de receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma) pertence a uma família de coativadores de transcrição, envolvidos na regulação do metabolismo energético relacionado a carboidratos e lipídios. PGC1- é ativado sob condições de estresse. Esta proteína também é conhecida por ativar o NF-kB, que está envolvido no aumento da via da inflamação. Um declínio nos níveis de PGC1- pode, portanto, infraregular a inflamação.
[0309] A Figura 33 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene PPAR- em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas, conforme descrito no Exemplo 2. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose e coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Não houve alteração no nível de transcritos de PPAR- em resposta ao tratamento com NP em camundongos do tipo selvagem, bem como nos camundongos obesos ETKO. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. PPAR- (Peroxisome Proliferator Activated Receptor-Alpha) pertence a um grupo de fatores de transcrição localizados no núcleo. PPAR-Alfa tem uma função regulatória chave no metabolismo lipídico no fígado, incluindo a estimulação de genes envolvidos na captação, transporte e catabolismo de ácidos graxos.
[0310] A Figura 34 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene PPAR- em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas, conforme descrito no Exemplo 2. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose, coloração com brometo de etídio para
48 /209 visualização da banda. Há uma redução significativa de transcritos PPAR-gama, em camundongos de tipo selvagem tratados com NP. Não houve nenhuma alteração importante no nível de transcritos PPAR gama em camundongos obesos após o tratamento com NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. PPAR-gama (Peroxisome Proliferator Activated Receptor-gamma) é outro fator de transcrição localizado no núcleo. Essa proteína está envolvida na proliferação de adipócitos, potencializando o desenvolvimento da obesidade. O PPAR gama é expresso no tecido adiposo e em um nível inferior nos músculos. O PPAR gama é conhecido por influenciar o desenvolvimento de obesidade e diabetes tipo II.
[0311] A Figura 35 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene CTL1 em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas, conforme descrito no Exemplo 2. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose, coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Não há alteração no nível de transcritos de CTL-1 em resposta ao tratamento com NP em camundongos de tipo selvagem. Em contraste, houve uma diminuição significativa nos níveis de expressão de CTL1 nos camundongos ETKO tratados com NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. CTL-1 (Choline Transporter Like Protein 1) é uma enzima ligada à membrana e é encontrada na membrana plasmática das células cerebrais e na mitocôndria. Está envolvida no transporte de colina na mitocôndria, que é usada na biossíntese da fosfatidilcolina e na biogênese da membrana. A produção aumentada de macrófagos por inflamação resultou na superexpressão de CTL- 1 e parece estar relacionada ao aumento da inflamação. Uma redução nos altos níveis de biogênese da membrana pode ajudar a reduzir o aumento das células e as alterações relacionadas à obesidade.
[0312] A Figura 36 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene PSS 2 em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas conforme descrito no Exemplo 2. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose e coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Não houve alteração no nível de transcritos de PSS 2 em resposta ao tratamento com NP em camundongos de tipo selvagem; mas mostrou uma redução baixa, mas significativa em camundongos ETKO. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. PSS 2 (CDP-diacilglicerol—serina
49 /209 O-fosfatidiltransferase 2; fosfatidilserina sintase 2) é uma enzima envolvida na biossíntese de fosfatidilserina. Esta proteína está localizada na mitocôndria. Os camundongos Knockout PSS 2 mostraram uma vida normal. Os resultados sugerem que o efeito do tratamento com solução de nanopartículas pode ser direcionado a genes específicos e não a todos os genes envolvidos nas vias envolvidas na biossíntese de lipídios.
[0313] A Figura 37 mostra micrografias eletrônicas de transmissão (TEMs) de nanofibras de 2 preparações independentes de nanofibras. O painel esquerdo mostra as nanofibras isoladas de ginja branqueada com etanol usando secagem por congelamento (liofilização). O painel direito mostra as nanofibras isoladas por secagem por nanopulverização.
[0314] A Figura 38 mostra complexos de nanofibras com ferro. A preparação de nanofibra (2 mg) foi dissolvida em 2 ml de água e misturada com cloreto ferroso ImM. A solução foi incubada por 2 horas e dialisada durante a noite contra água (2X) para remover o ferro não ligado. A solução dialisada foi examinada sob um microscópio eletrônico sem coloração de metal pesado (isto é, sem coloração com acetato de uranila, que é normalmente usado para aumentar o contraste). Os complexos de nanofibras foram corados com ferro (em vez de acetato de uranila), mostrando o potencial das nanofibras para serem utilizadas como carreadores de ferro.
[0315] A Figura 39 mostra a absorção de nanofibras carregadas de calceína em células de mamíferos (aduto de nanofibra de calceína). A calceína (Ex 494 nm/Em 517 nm) por si só é impermeável através da membrana e pode ser captada em baixo nível por endocitose (A, C). A cereja branqueada com etanol foi homogeneizada em água, também contendo 1 mg/g de peso fresco equivalente de calceína, e o sobrenadante dialisado contra água. Calceína complexada com nanofibras é retida dentro da bolsa de diálise e usada para medições de captação por microscopia confocal. A absorção de calceína sozinha foi comparativamente muito baixa (Painéis A e C) em ambas as células HT 29 (painel superior esquerdo) e células intestinais normais (painel esquerdo inferior). As nanofibras carregadas de calceína são recolhidas em compartimentos discretos em ambas as células da linhagem celular de câncer colorretal HT 29 (canto superior direito, B) e células intestinais humanas normais CRL 1790 (canto inferior direito, D). (Barra de tamanho – 10 m). Os painéis B e
50 /209 D mostram a captação aumentada do complexo de nanofibra-calceína em ambos os tipos de células.
[0316] A Figura 40 mostra uma demonstração da absorção de nanopartículas (A, C, E) isoladas de ginja não branqueada e nanofibras (B, D, F) isoladas de ginja branqueada com etanol em células humanas (HT-29, CRL 2158, CRL1790) As nanopartículas e nanofibras foram quimicamente conjugadas com Dylight 650 e dialisadas contra água extensivamente (3x) para remover o corante não conjugado. Dylight foi conjugado às nanopartículas e nanofibras usando um método semelhante ao que é normalmente usado para marcar o grupo amino de anticorpos e descrito em detalhes na folha de SOP fornecida (Thermofisher). Resumindo, o Dylight foi ativado com ésteres de N- hidroxisuccinimida, que reagem com aminas primárias, que formam uma ligação amida covalente estável. A nanopartícula e a nanofibra conjugadas com Dylight foram removidas usando uma coluna de exclusão de tamanho. Os produtos conjugados foram armazenados no escuro a -20°C, protegidos da luz. As células foram semeadas e cultivadas por 48 horas. As nanopartículas e nanofibras conjugadas (~ 5M Dylight equivalente em 3ml de meio de cultura) foram adicionadas ao meio e as células foram incubadas por mais 24h. As células foram mantidas em placas de petri (3,5 cm de diâmetro) e observadas em microscópio confocal (Leica) com excitação a 633 nm e emissão monitorada a 680 nm. Os painéis A e B, respectivamente, mostram a absorção de nanopartículas e nanofibras conjugadas com Dylight por células HT 29 (linhagem de células de câncer colorretal). Os painéis C e D, respectivamente, mostram a absorção de nanopartículas e nanofibras conjugadas com Dylight pelas células CRL 2158 (linhagem celular colorretal MDR); e os painéis E e F, respectivamente, mostram a absorção das nanopartículas conjugadas pelas células CRL 1790 (células intestinais humanas normais), respectivamente. As inserções nos painéis são imagens compostas aumentadas de células. (Barra de tamanho - 10 m).
[0317] A Figura 41 mostra a citotoxicidade de Nanofibra-Paclitaxel para células de câncer colorretal humano (HT 29). É mostrada a análise de células vivas-mortas de células de câncer colorretal HT 29 conforme foram visualizadas sob microscopia confocal. O kit de ensaio (Invitrogen) contém dois corantes fluorescentes, éster de calceína AM (Ex 494 nm, Em 517 nm) que entra
51 /209 especificamente nas células vivas, fica desesterificado e tinge as células vivas de verde. Tanto as células agonizantes quanto as células mortas estão comprometidas com a membrana (membrana plasmática com vazamento) e permitem a entrada do homodímero de etídio (Ex 517 nm/Em 617), que tinge o núcleo de vermelho. As células foram observadas a 517 nm (canal verde), que diferenciava as células vivas, e a 617 nm, que possibilitava a visualização das células mortas. A imagem composta dos dois comprimentos de onda mostra as células em transição para a perda de viabilidade celular (A, D, G; amarelo). Os painéis B, C representam células de controle visualizadas a 617 nm (vermelho, células mortas) e a 517 nm (verde, células vivas), respectivamente. O painel A é uma imagem composta de células não tratadas. Os painéis E, F representam as imagens de células tratadas com paclitaxel (32 nM) registradas nos dois comprimentos de onda 617 e 517 nm, respectivamente. O painel D é uma imagem composta. Os painéis H e I mostram as células tratadas com paclitaxel + nanofibras (32 nM + 4 µg/ml de nanofibras). O painel G é uma composição das imagens vermelhas e verdes.
[0318] A Figura 42 mostra a citotoxicidade de Nanofibra-Paclitaxel para Células de câncer MDR colorretal Humano (CRL 2158). É mostrada a análise de células vivas-mortas de células de câncer de cólon multirresistentes a drogas CRL 2158 conforme foram visualizadas em um microscópio confocal. O kit de ensaio (Invitrogen) contém dois corantes fluorescentes, éster de calceína AM (Ex 494 nm, Em 517 nm) que entra especificamente nas células vivas, fica desesterificado e tinge as células vivas de verde. Tanto as células agonizantes quanto as células mortas estão comprometidas com a membrana (membrana plasmática com vazamento) e permitem a entrada do homodímero de etídio (Ex 517 nm/Em 617), que tinge o núcleo de vermelho. As células foram observadas a 517 nm (canal verde), que diferenciava as células vivas, e a 617 nm, que possibilitava a visualização das células mortas. A imagem composta dos dois comprimentos de onda mostra as células em transição para a perda de viabilidade celular (A, D, G; amarelo). Os painéis B, C representam células de controle visualizadas a 617 nm (vermelho, células mortas) e a 517 nm (verde, células vivas), respectivamente. O painel A é uma imagem composta de células não tratadas. Os painéis E, F representam as imagens de células tratadas com paclitaxel (32 nM) registradas nos dois comprimentos de onda 617 e 517 nm,
52 /209 respectivamente. O painel D é uma imagem composta. Os painéis H e I mostram as células tratadas com paclitaxel + nanofibras (32 nM + 4 µg/ml de nanofibras). O painel G é uma composição das imagens vermelhas e verdes.
[0319] A Figura 43 mostra a citotoxicidade de Nanofibra-Paclitaxel para células intestinais humanas normais (CRL 1790). É mostrada a análise de células vivas-mortas de células epiteliais normais do cólon humano CRL 1790 conforme foram visualizadas sob um microscópio confocal. O kit de ensaio (Invitrogen) contém dois corantes fluorescentes, éster de calceína AM (Ex 494 nm, Em 517nm) que entra especificamente nas células vivas, fica desesterificado e tinge as células vivas de verde. Tanto as células agonizantes quanto as células mortas estão comprometidas com a membrana (membrana plasmática com vazamento) e permitem a entrada do homodímero de etídio (Ex 517 nm/Em 617), que tinge o núcleo de vermelho. As células foram observadas a 517 nm (canal verde), que diferenciava as células vivas, e a 617 nm, que possibilitava a visualização das células mortas. A imagem composta dos dois comprimentos de onda mostra as células em transição para a perda de viabilidade celular (A, D, G; amarelo). Os painéis B, C representam células de controle visualizadas a 617 nm (vermelho, células mortas) e a 517 nm (verde, células vivas), respectivamente. O painel A é uma imagem composta de células não tratadas. Os painéis E, F representam as imagens de células tratadas com paclitaxel (32 nM) registradas nos dois comprimentos de onda 617 e 517 nm, respectivamente. O painel D é uma imagem composta. Os painéis H e I mostram as células tratadas com paclitaxel + nanofibras (32 nM + 4 g/ml de nanofibras). O painel G é uma composição das imagens vermelhas e verdes.
[0320] A Figura 44 mostra uma micrografia eletrônica de varredura de pó alimentício preparado a partir de ginja, brócolis e outros ingredientes alimentícios. O pó alimentício foi preparado misturando uma mistura de soluções homogeneizadas de componentes individuais e secagem por nanopulverização da mistura combinada, conforme descrito no Exemplo 4.
[0321] A Figura 45 mostra uma micrografia eletrônica de transmissão de uma solução aquosa do pó alimentício mostrando características ultraestruturais. O pó alimentício aparece como oblongo a massas esféricas de estruturas de fibra firmemente enroladas (ver seta designada como A). A estrutura se assemelha a uma nanopartícula sem uma organização estrutural, conforme
53 /209 observado nas nanopartículas de ginja (ver Figura 17). No entanto, uma estrutura globular semelhante a um núcleo esférico (seta designada como B) pode ser observada com estruturas de fibra emanando dela. As estruturas organizadas em espiral (seta C) são análogas às fibras espirais observadas nas nanopartículas. Uma alíquota de cinquenta microlitros da suspensão do pó alimentício foi colocada em uma lâmina de vidro e uma grade revestida de carbono foi colocada na solução com o lado revestido voltado para baixo, por 30 segundos. A grade foi seca com papel absorvente nas bordas e tingida com uma solução de 0,1% de acetato de uranila. A imagem mostra um macroagregado de partícula de pó alimentício que está se dissolvendo em nanopartículas muito menores (seta designada como A). A seta designada por B mostra o núcleo da nanopartícula com fibras desenroladas. A natureza espiral das fibras enroladas pode ser vista conforme indicada pela seta C.
[0322] A Figura 46 mostra a avaliação da capacidade antioxidante do pó alimentício. O pó foi dissolvido em água e a capacidade antioxidante da solução foi determinada estimando a capacidade sequestradora do radical DPPH da solução como equivalente de polifenol (estimado pelo reagente de Folin- Ciocalteau) em microgramas. Um reagente 0,1mM Folin-Ciocateau foi preparado em metanol, e a solução de pó alimentício foi adicionada nas quantidades especificadas. Os antioxidantes foram deixados reagir com 1 ml de reagente DPPH, e a absorbância (roxo, 517 nm de absorção) foi monitorada. O declínio na absorbância de 517 nm foi observado e expresso como % de resfriamento brusco em comparação com um controle sem polifenol. Trolox foi usado como um controle positivo nas mesmas concentrações dos polifenóis e apresentou um valor TEAC de 1. Cada ponto em uma concentração representa uma amostra individual de pó alimentício preparado.
[0323] A Figura 47 mostra a avaliação das mudanças na massa corporal em camundongos selvagens (WT) e camundongos Knockout em etanolamina (KO) tratados com pó alimentício e água. Os experimentos foram realizados com camundongos knockout (KO) Pcyt2 de 24 semanas de idade e controles de ninhada. Grupos não tratados (U) de KO e camundongos de tipo selvagem (n=4- 6 cada) receberam 100uL de água por gavagem no momento do tratamento. Os grupos tratados (T) de camundongos KO e de tipo selvagem (WT) (n=4-6 cada) foram administrados com 100 ug do pó alimentício (em 100 uL de água) 5 vezes
54 /209 por semana. A gavagem oral para todos os grupos durou 8 semanas. No final do período de tratamento, os camundongos foram sacrificados e amostras de sangue e tecido foram coletadas para análise. As estrelas indicam valores significativamente diferentes (*- P<0,05; **- P<0,01).
[0324] A Figura 48 mostra o efeito do tratamento com pó alimentício nas alterações dos níveis de triglicerídeos no fígado. O tecido teve origem no ensaio descrito no Exemplo 4. Os níveis de triglicerídeos do tecido hepático foram estimados por procedimentos descritos no kit de ensaio Wako L-type TG M (Wako Life Sciences, CA, EUA). Não há redução significativa nos níveis de triglicerídeos em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO submetidos ao tratamento com pó alimentício. Os valores são a média ± SEM de três amostras separadas. Parece haver uma tendência na redução dos triglicerídeos nos camundongos obesos tratados com pó alimentício. A redução dos triglicerídeos hepáticos pelo tratamento com pó alimentício pode ser benéfica em indivíduos com síndrome metabólica. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0325] A Figura 49 mostra os parâmetros do soro sanguíneo de camundongos tratados com pó alimentício e de tipo selvagem não tratado e de camundongos ETKO. Não houve grandes mudanças nos níveis de albumina, globulina e suas proporções. Não houve diferença significativa entre o grupo de controle e de tratamento em termos de proteína total. Os valores são a Média ± SEM de 3 tratamentos independentes. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0326] A Figura 50 mostra os parâmetros do soro sanguíneo de camundongos tratados com pó alimentício e de tipo selvagem não tratado e de camundongos ETKO. Não há grandes mudanças nos níveis de glicose, fósforo e ureia. Parece haver uma ligeira diminuição nos níveis de triglicerídeos em camundongos obesos tratados com pó alimentício. Os valores são a Média ± SEM de 3 amostras independentes. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT-U), tipo selvagem tratado (WT-T), Knock out não tratado (KO-U) e Knock out Tratado (KO-T).
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[0327] A Figura 51 mostra mudanças nos níveis de transcrição de quimiocinas (citocinas quimiotáticas) em camundongos do tipo selvagem e ETKO tratados com o pó alimentício. As quimiocinas do tipo CCL são pequenas glicoproteínas secretadas por células T ativadas que causam atração de monócitos para o local da inflamação. CCL1 (quimiocina de motivo C-C ligante 1) e seus membros da família (CCL2, CCL3, CCL5 ...) estão envolvidos em processos de inflamação. Uma redução significativa em CCL2 e CCL5 foi observada em camundongos do tipo selvagem em resposta ao tratamento com pó alimentício. Há uma tendência de redução dessas quimiocinas após o tratamento com pó alimentício em camundongos ETKO, mas não são significativamente diferentes neste teste. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. O CCL1 se liga ao CCR8 para sua função. CCL2 (Monocyte Chemoattractant Protein 1; MCP1) também está envolvido na atração de monócitos para locais de inflamação e se liga aos receptores CCR2 e CCR4. CCL3 (Macrophage inflammatory protein -Alfa; MIP1-α) está envolvido na inflamação aguda e é um atrativo de células brancas do sangue. Liga-se aos receptores CCR1, CCR4 e CCR 5). O CCL5 se liga ao receptor de superfície CCR5 e está envolvido na inflamação e na progressão do câncer. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0328] A Figura 52 mostra mudanças nos níveis de transcrição de quimiocinas (citocinas quimiotáticas) em camundongos do tipo selvagem e ETKO tratados com o pó alimentício. As quimiocinas do tipo CCL são pequenas glicoproteínas secretadas por células T ativadas que causam atração de monócitos para o local da inflamação. A figura mostra as mudanças nos níveis de transcrição de CCL6, CCL7, CCL17 e CCL19. O CCL6 é exclusivo para roedores e pode se ligar ao CCR 1 durante sua ação. O CCL6 é expresso em macrófagos durante a diferenciação das células mieloides. Uma redução significativa em CCL6, CCL 7 e CCL17 foi observada em camundongos do tipo selvagem em resposta ao tratamento com pó alimentício. Uma redução significativa em CCL7 foi observada em camundongos ETKO. CCL 19 não mostrou nenhuma alteração nos transcritos em ambos os camundongos tipo selvagem e ETKO. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em
56 /209 amostras de três camundongos independentes. O CCL6 se liga ao CCR1 para sua função. O CCL7 também está envolvido na atração de monócitos para locais de inflamação e se liga ao receptor CCR2. Níveis anormais de expressão de CCL7 estão relacionados à tumorigênese e ativação e metástase de MMP-2. Assim, a infraregulação de CCL7 é provavelmente altamente benéfica na prevenção do câncer. O CCL17 está envolvido na quimioatração de linfócitos e na indução de doenças inflamatórias, como aterosclerose e doenças inflamatórias intestinais. O CCL19 está envolvido na recirculação de linfócitos. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0329] A Figura 53 mostra as alterações nos níveis de transcrição da quimiocina CCL22 (citocinas quimiotáticas) em camundongos do tipo selvagem e ETKO tratados com o pó alimentício. O CCL22 é produzido por tumores e células T que se infiltram no tumor, causando imunossupressão e evasão de células do sistema imunológico pelo tumor, ajudando na progressão do tumor. A superexpressão de CCL22 nas células do sistema imunológico é causada pela Interleucina-alfa. Não houve alterações nos níveis de CCL22 em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO em resposta ao tratamento com pó alimentício. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0330] A Figura 54 mostra a avaliação das mudanças nos níveis de transcrição de receptores do tipo CCR em camundongos do tipo selvagem e ETKO submetidos a tratamento com pó alimentício. Os receptores de quimiocinas da família CCR são expressos em células sanguíneas, como eosinófilos, basófilos, linfócitos, macrófagos e células dendríticas, e o aumento em sua expressão/atividade está relacionado ao aumento da inflamação. Uma série de vias de transdução de sinal são ativadas quando o CCR se liga a uma quimiocina ligante (família CCL). O tratamento com pó alimentício não alterou os níveis de expressão de CCR1 e CCR6 em ambos os camundongos de tipo selvagem e ETKO. CCR2 e CCR 8 em camundongos de tipo selvagem mostraram infrarregulação significativa em resposta ao tratamento com pó alimentício, sugerindo que o pó alimentício pode diminuir os níveis de CCRs que
57 /209 causam inflamação. Da mesma forma, houve infrarregulação significativa de CCR8 em camundongos ETKO alimentados com o pó alimentício. Assim, uma diminuição tanto nos níveis de quimiocinas quanto em seus receptores parece ocorrer como uma resposta ao tratamento com pó alimentício. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0331] A Figura 55 mostra a avaliação das alterações nos níveis de transcrição de CSF (Colony Stimulating Factor) em camundongos do tipo selvagem e ETKO submetidos a tratamento com pó alimentício. Os CSFs são citocinas produzidas por granulócitos/macrófagos (GM-CSF), macrófagos (M- CSF) e granulócitos (G-CSF). O aumento de sua expressão/atividade está relacionado ao aumento da inflamação, e a infrarregulação ajuda a reduzir doenças inflamatórias e autoimunes. Os níveis de CSF foram semelhantes no camundongo do tipo selvagem e naqueles tratados com o pó alimentício. O CSF3 foi supraregulado no camundongo ETKO, um elo potencial para o desenvolvimento de obesidade. O tratamento com pó alimentício aproximou os níveis de CSF dos observados em camundongos selvagens. Uma diminuição nos níveis de quimiocinas bem como de seus receptores parece ocorrer em resposta ao tratamento com pó alimentício. O CD40LG é um ligante da proteína CD40 localizado na superfície das células do sistema imunológico e um aumento na expressão dessa proteína tem sido associado ao aumento da inflamação, em relação ao desenvolvimento de diversos cânceres. No endotélio vascular, um aumento na secreção do ligante CD40 pelas plaquetas parece aumentar a produção de ROS que leva à formação de células de placa e ao bloqueio das artérias. Houve redução significativa na expressão do ligante CD40 em camundongos tratados com o pó alimentício, aproximando seu nível ao do tipo selvagem. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0332] A Figura 56 mostra a avaliação das alterações das quimiocinas do motivo CXC em resposta ao tratamento com pó alimentício em camundongos do tipo selvagem e ETKO. Quimiocinas do tipo CXC1: as quimiocinas CXCL ligam-
58 /209 se aos receptores do tipo CXCR na superfície das células imunogênicas e induzem sua ação. CXCL1 (ligante 1 do motivo CXC) e atua por meio de seu receptor CXCR-2 desempenha um papel fundamental na inflamação. CXCL 1 foi infrarregulado em camundongos do tipo selvagem significativamente, enquanto os camundongos ETKO não mostraram uma mudança significativa na resposta ao tratamento com pó alimentício. CXCL 10 e seu receptor CXCR3 estão implicados em patologias que ocorrem durante o desenvolvimento de doenças autoimunes, incluindo doenças específicas de órgãos (diabetes tipo 1) e doenças autoimunes sistemáticas, como artrite reumatóide. Os interferons e o TNF ativam a produção de CXCL10 resultando na ativação de linfócitos TH1. CXCL 10 foi infrarregulado em camundongos do tipo selvagem significativamente, enquanto os camundongos ETKO não mostraram qualquer mudança na resposta ao tratamento alimentar. CXCL-12 (ligante-12 do motivo-CXC; fator 1 derivado de célula do estroma ou SDF 1) é uma quimiocina que se liga ao seu receptor CXC- R 4. CXCL-12 é expresso em uma variedade de tecidos e é importante no desenvolvimento. A superexpressão de CXCL-12 leva à inflamação e é altamente quimiotática para os leucócitos (neuroinflamação). CXCL 12 é um marcador clínico para câncer pancreático, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, etc. CXCL-12 foi infrarregulado em camundongos do tipo selvagem em resposta ao tratamento com pó alimentício. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de 3 camundongos independentes. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0333] A Figura 57 mostra a avaliação do efeito do tratamento alimentar nos níveis de transcrição de ligante de CXC. O CXCl-5 é produzido durante a inflamação estimulada por interleucinas e TNF alfa. Ele se liga ao receptor CXC
2. Acredita-se que desempenhe um papel na proliferação celular, aumentando a motilidade e a angiogênese. Não houve alterações no CXCL 5 entre camundongos do tipo selvagem e ETKO não tratados e tratados com pó alimentício. CXCL 15 é uma quimiocina expressa nas células epidérmicas do pulmão, células intestinais, etc. e está ligada à inflamação. Não houve alterações nos níveis de transcrição de CXL15 entre camundongos do tipo selvagem e ETKO não tratados e tratados com pó alimentício. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes.
59 /209 Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0334] A Figura 58 mostra CXCR (receptores de quimiocinas do motivo CXC, ligam-se a ligantes CXC da família das quimiocinas e interleucinas atraindo células sanguíneas imunoativas e induzindo inflamação). Os níveis de CXCR-2 foram significativamente reduzidos pelo tratamento com pó alimentício em camundongos do tipo selvagem. Nenhuma mudança foi observada em camundongos ETKO. Não houve diferenças em CXCR-5 e 3 e CXCR5 em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO. Os resultados sugerem que, além dos ligantes (C-C; C-X-C-motivo), os receptores também podem ser modulados pelo tratamento com o pó alimentício, que pode proporcionar melhor infrarregulação da inflamação. Os receptores da família do fator de necrose tumoral são outro grupo de receptores envolvidos na inflamação, e vários produtos naturais são conhecidos por infrarregular a via de transdução de sinal ligado a TNF alfa. O ligante FAS (FAS L) pertence à superfamília do TNF e a ligação ao seu receptor inicia a apoptose. Não há diferença significativa nos níveis de FAS L após o tratamento com pó alimentício, em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0335] A Figura 59 mostra a avaliação das mudanças nas interleucinas como uma resposta ao tratamento com pó alimentício em camundongos de tipo selvagem e ETKO. As interleucinas são citocinas envolvidas na função imunológica, algumas interleucinas são pró-inflamatórias (IL17) e outras têm função antiinflamatória (IL10). Elas medeiam a função imunológica em condições normais e quando desafiadas com organismos causadores de doenças. Foi observada uma redução significativa nos níveis de expressão de IL 1A, IL 1B e IL 7, em camundongos selvagens tratados com pó alimentício. Os níveis dessas interleucinas permaneceram semelhantes em resposta ao tratamento com pó alimentício. Os níveis de expressão de IL4 permaneceram semelhantes em camundongos do tipo selvagem e ETKO não tratados e tratados com pó alimentício. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado
60 /209 (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0336] A Figura 60 mostra a avaliação das mudanças nas interleucinas como uma resposta ao tratamento com pó alimentício em camundongos de tipo selvagem e ETKO. As interleucinas medeiam a função imunológica em condições normais e quando desafiadas com organismos causadores de doenças. Não houve mudanças nos níveis de expressão de IL11, IL13, IL2rb e IL17f não mudou após o tratamento com pó alimentício em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0337] A Figura 61 mostra a avaliação das mudanças nas interleucinas como uma resposta ao tratamento com pó alimentício em camundongos tipo selvagem e ETKO. Não houve mudanças nos níveis de expressão de IL21 após o tratamento com pó alimentício em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO. O interferon gama (IFNG) é outra citocina que está envolvida nas respostas contra agentes virais. Não houve alteração nos níveis de IFNG em resposta ao tratamento com pó alimentício em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out tratado (KO/T).
[0338] A Figura 62 mostra a avaliação das alterações nos níveis de transcrição dos membros da superfamília do Fator de Necrose Tumoral em relação às suas respostas durante o tratamento com pó alimentício em camundongos do tipo selvagem e ETKO. LTB (Linfotoxina B: Linfotoxina Beta (Superfamília TNF, Membro 3) é uma proteína de membrana e um indutor da resposta inflamatória. Os níveis de transcritos de LTB foram infrarregulados em camundongos do tipo selvagem em resposta ao tratamento com pó alimentício. Não houve alterações nos níveis de transcrição de LTB em camundongos ETKO tratados com pó alimentício. Os níveis de transcrição de outros membros da superfamília TNF, como TNFSF11, TNFSF11b e TNFS113b, não se alteraram após o tratamento com pó alimentício em camundongos do tipo selvagem e
61 /209 ETKO. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Abreviaturas: Tipo selvagem não tratado (WT/U), tipo selvagem tratado (WT/T), Knock out não tratado (KO/U) e Knock out Tratado (KO/T).
[0339] A Figura 63 mostra os resultados histopatológicos de seções de fígado em camundongos com e sem tratamento com pó alimentício. O painel (A) ilustra a seção de fígado de camundongo selvagem não tratada (WT), corada com hematoxilina e eosina; muito poucos corpos lipídicos são visíveis. O painel (B) ilustra a seção de fígado de camundongo do tipo selvagem (WT), tratado com pó alimentício e corado com hematoxilina e eosina; muito poucos corpos lipídicos são visíveis. O painel (C) ilustra a seção de fígado de camundongo obeso não tratado (KO) corado com hematoxilina e eosina; as áreas circulares claras são corpos lipídicos amplamente distribuídos no fígado. O painel (D) ilustra seção de fígado de camundongo (KO), tratado com pó alimentício e corado com Hematoxilina e Eosina; as áreas circulares claras são corpos lipídicos. As áreas potenciais de regeneração do tecido são mostradas por setas.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0340] São aqui descritas nanofibras derivadas de tecidos de plantas, métodos para a sua produção e seus usos. Para comparação, também são descritos nanopartículas e pós alimentícios, e métodos para a sua produção. Será apreciado que as modalidades e exemplos são fornecidos para fins ilustrativos destinados aos versados na técnica e não se destinam a ser limitantes de qualquer forma.
[0341] Conforme descrito em detalhes a seguir, nanopartículas, pós alimenticios e nanofibras foram agora desenvolvidos, os quais podem apresentar várias propriedades interessantes. Embora as nanopartículas e as nanofibras possam ser preparadas a partir de tecido de planta, essas duas nanoestruturas foram preparadas aqui usando métodos notavelmente diferentes, e essas duas nanoestruturas foram aqui encontradas adotar estruturas notavelmente diferentes, apresentar diferenças significativas em termos de composição e apresentar diferenças interessantes (e semelhanças) em termos de função e/ou efeitos biológicos.
[0342] A título de exemplo, são descritos aqui nanopartículas incluindo componentes celulares automontados derivados de um tecido de planta
62 /209 homogeneizado, os componentes celulares incluindo uma ou mais parede celular e/ou outros componentes celulares. Também são descritas, em comparação, nanofibras incluindo componentes celulares auto-montados derivados de um tecido de planta homogeneizado do qual os polifenóis foram extraídos, os componentes celulares incluindo uma ou mais paredes celulares e/ou outros componentes celulares. Métodos e protocolos para preparar tais nanopartículas e nanofibras (indicando diferenças entre elas), bem como os usos de tais nanopartículas e nanofibras em, por exemplo, o tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios em um indivíduo e/ou como veículos de distribuição também são descritos. Pós alimentícios relacionados a (mas distintos de) as nanopartículas e nanofibras presentemente descritas, e particularmente as presentes nanopartículas, também são descritos em detalhes neste documento. Nanopartículas e Métodos para a Produção das mesmas Nanopartículas:
[0343] Em uma modalidade, é aqui fornecida uma nanopartícula compreendendo componentes celulares automontados derivados de um tecido de planta homogeneizado, os componentes celulares compreendendo uma ou mais paredes celulares e/ou outros componentes celulares. Em certas modalidades, os componentes celulares podem incluir componentes liberados do tecido de planta por homogeneização, que se automontam na nanopartícula, por exemplo.
[0344] Em certas modalidades, um ou mais componentes da parede celular podem incluir pectina e/ou seus derivados.
[0345] Em certas modalidades, é fornecido aqui uma nanopartícula compreendendo componentes celulares automontados derivados de um tecido de planta homogeneizado, os componentes celulares compreendendo um ou mais carboidratos estruturais ou produtos de clivagem dos mesmos, em que os lipídios não são um componente estrutural da nanopartícula.
[0346] Em certas modalidades, as nanopartículas podem ser substancialmente ou totalmente livres de lipídios ou podem conter apenas quantidades mínimas, residuais ou traços de lipídios. Em certas modalidades, os lipídios, como fosfolipídios, diacilgliceróis, triacilgliceróis, ácidos graxos livres ou aldeídos e alcanos, não são componentes estruturais da nanopartícula (ou seja, lipídios e as nanopartículas como um todo, não formam vesículas uni ou multi-
63 /209 lamelares de natureza membranosa). Em certas modalidades, se alguma quantidade de lipídio estiver presente, a quantidade de lipídio está abaixo de um nível de concentração micelar crítica (CMC) e não forma micelas ou vesículas. Em certas modalidades, o lipídio não contribui substancialmente para a estrutura terciária ou quaternária das nanopartículas e/ou não contribui para a automontagem das nanopartículas. Em certas modalidades, o tecido da planta pode ser selecionado de modo a fornecer pouco ou nenhum lipídio e/ou lipídios podem ser removidos antes da automontagem das nanopartículas.
[0347] Em certas modalidades, os componentes celulares podem compreender aqueles liberados do tecido da planta durante a maturação ou durante a homogeneização da fruta amadurecida, que são capazes de se automontar na nanopartícula.
[0348] Em certas modalidades, o tecido de planta pode compreender, por exemplo, um tecido de planta ou material da planta de uma fruta, legume, folha, flor, semente (geralmente em qualquer estágio de desenvolvimento) ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, podem ser utilizadas misturas de dois ou mais tecidos. Em certas modalidades, uma pluralidade de tecidos pode ser usada, cada um enriquecido em um ou mais componentes das nanopartículas, de modo que a homogeneização da mistura forneça os componentes para automontagem para formar as nanopartículas. Em certas modalidades, o tecido de planta ou material da planta pode compreender ginja, mirtilo, porções dos mesmos ou misturas dos mesmos, por exemplo. Em certas modalidades, o material da planta ou tecido de planta pode compreender uma fruta madura. Em certas modalidades, os frutos em desenvolvimento (antes da maturação) podem não conter componentes de nanopartículas suficientes, mas ainda podem ser usados por mistura com outros materiais ou tecidos de plantas e/ou componentes de nanopartículas particulares para compensar e/ou onde os frutos imaturos são tratados com enzimas para gerar componentes de nanopartículas suficientes para permitir a montagem das nanopartículas após a homogeneização. Em certas modalidades, a homogeneização do tecido da planta pode ser realizada de maneira a aumentar a maturação através do aumento a exposição dos componentes celulares às enzimas de amadurecimento sob condições nas quais as enzimas de amadurecimento estarão ativas. Em certas modalidades, o tecido de planta pode fornecer pectina,
64 /209 uma ou mais hemiceluloses, proteína/peptídeo, um ou mais carboidratos, ácido málico (ou outro ácido orgânico capaz de formar ligações de hidrogênio), pelo menos uma antocianina e/ou ácido ascórbico, ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o tecido de planta pode fornecer, pelo menos, pectina, uma ou mais hemiceluloses, proteína/peptídeo, um ou mais carboidratos, ácido málico (ou outro ácido orgânico capaz de formar ligações de hidrogênio), pelo menos uma antocianina e ácido ascórbico. Em certas modalidades, a nanopartícula pode compreender pectina, hemicelulose, peptídeo e/ou proteína, um ácido orgânico, pelo menos um polifenol, produtos de clivagem dos mesmos ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o ácido orgânico pode compreender ácido málico, ácido ascórbico ou ambos. Em certas modalidades, o polifenol pode compreender uma antocianina. Em certas modalidades, os componentes celulares compreendem aqueles liberados do tecido da planta durante a maturação e/ou durante a homogeneização da fruta amadurecida, que são capazes de se automontar na nanopartícula. Em certas modalidades, a homogeneização pode aumentar a exposição dos componentes celulares à(s) enzima(s) de amadurecimento formando produtos de clivagem que podem contribuir para a nanopartícula.
[0349] Em certas modalidades, as nanopartículas, conforme aqui descrito, podem ser livres ou substancialmente livres de amido (como alfa e beta-amilose). O amido tende a formar estruturas do tipo dendrômero e, portanto, a presença de níveis mais elevados de amido no tecido da planta usado para gerar as nanopartículas pode interferir na geração das nanopartículas. Em certas modalidades, se os tecidos vegetais contendo amido forem usados, eles podem ser usados com moderação para manter o teor de amido baixo. Por exemplo, se uma banana for usada como parte do tecido da planta, a proporção do tecido da planta representada pela banana pode ser comparativamente baixa em relação a outros componentes do tecido da planta que está sendo usado. Em certas modalidades, considerações semelhantes também podem ser aplicadas a pós alimenticios e/ou nanofibras, como também aqui descrito em detalhes.
[0350] Em certas modalidades, o tecido de planta pode estar em um estado parcialmente degradado (por exemplo, amadurecido) com parede celular parcialmente degradada ou pode ser gerado a partir de tecidos de planta com a
65 /209 adição de carboidratos e/ou enzimas catabolizantes de proteínas a um tecido durante a homogeneização que catabolizam os componentes da parede celular. Em certas modalidades, o tecido de planta inicial pode ser parcialmente processado, como por fixação em um agente de preservação, como álcool ou ácido acético (vinagre), e reidratado antes de ser submetido à homogeneização. Em certas modalidades, o tecido de planta pode ser misturado com ácido ascórbico e ácido málico para facilitar a integridade estrutural e/ou rendimento de nanopartículas, por exemplo.
[0351] Em certas modalidades, o tecido de planta pode compreender uma fruta ou tecido de planta de legume. Em certas modalidades, o tecido da planta pode compreender uma fruta em envelhecimento, um legume em maturação ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades preferidas, o tecido da planta pode compreender cereja (como ginja, por exemplo), mirtilo, uva, pêssego, nectarina, ameixa, damasco, mamão, tomate ou quaisquer combinações dos mesmos. A título de exemplo, em certas modalidades preferidas, o tecido da planta pode compreender um tecido da fruta ginja. Em certas modalidades, o tecido da planta pode compreender cascas de frutas e/ou tecido externo de frutas, como no cacau, por exemplo.
[0352] Em certas modalidades, a nanopartícula pode compreender pectina, hemicelulose, peptídeo e/ou proteína, um ácido orgânico, pelo menos um polifenol, produtos de clivagem dos mesmos ou quaisquer combinações dos mesmos. Em certas modalidades, o ácido orgânico pode compreender ácido málico, ácido ascórbico ou ambos. Em certas modalidades, o polifenol pode compreender uma antocianina.
[0353] Em certas modalidades, um ou mais carboidratos estruturais da nanopartícula podem compreender um ou mais de pectina, ácido péctico, éster metílico de pectina, um derivado de pectina, ácido poligalacturônico, ramnogalacturonanos, hemiceluloses, tais como xiloglucanos (que podem em certas modalidades ser nem celulose nem pectina) e possuindo estruturas principais ligadas por -(14) de glicose, manose ou xilose e/ou arabinogalactanos e/ou produtos de clivagem dos mesmos.
[0354] Em certas modalidades, a nanopartícula pode ter uma estrutura substancialmente esférica com um diâmetro de cerca de 50 a cerca de 250 nm, por exemplo. Em certas modalidades, a nanopartícula pode ser não cristalina.
66 /209 Em certas modalidades, a nanopartícula pode ser fornecida em solução aquosa, na forma de pó seco ou na forma desidratada, liofilizada, seca por congelamento, seca por pulverização ou seca por nanopulverização.
[0355] Em certas modalidades, a nanopartícula pode compreender: um núcleo interno à base de pectina; uma camada intermediária envolvendo o núcleo interno, a camada intermediária compreendendo macromoléculas de pectina e hemicelulose e/ou seus produtos de clivagem, polifenóis e ácidos orgânicos; e uma camada externa fibrilada compreendendo carboidratos estruturais macromoleculares e proteínas (peptídeos), opcionalmente formados a partir de produtos de catabolismo formados durante a maturação e/ou durante a homogeneização do tecido de planta. A Figura 17, descrita em mais detalhes abaixo, representa um exemplo de tal organização estrutural. Em certas modalidades, o núcleo interno à base de pectina pode ser uma estrutura em forma de esfera geralmente oca ou sólida e o tratamento da nanopartícula com uma enzima degradante de pectina, como poligalacturonase/pectinase pode resultar na quebra do núcleo interno em glóbulos menores (indicando que o núcleo interno pode ser à base de pectina). Em certas modalidades, a camada intermediária pode compreender uma camada formada por macromoléculas de origem de pectina e hemicelulose, hidrogênio ligado através de antocianinas, ácidos ascórbico e málico e peptídeos originários de várias proteínas celulares, por exemplo. Em certas modalidades, a camada externa fibrilada pode compreender carboidratos estruturais macromoleculares e/ou proteínas originadas do catabolismo que ocorre durante a maturação do tecido da planta, por exemplo.
[0356] Em certas modalidades, as nanopartículas podem compreender um ou mais peptídeos originários da degradação da proteína que ocorre no tecido da planta durante a maturação e/ou durante a homogeneização. Em certas modalidades, as nanopartículas podem compreender um ou mais catabólitos de carboidratos estruturais, ocorrendo no tecido da planta durante a maturação e/ou durante a homogeneização.
[0357] Em certas modalidades, a nanopartícula pode compreender: um núcleo interno à base de pectina; uma camada intermediária envolvendo o núcleo interno, a camada intermediária compreendendo uma ou mais estruturas de fibrila em espiral compreendendo pectina ou um derivado desta, e uma ou
67 /209 mais moléculas derivadas de hemicelulose ou um derivado desta; e uma camada externa fibrilada compreendendo hemicelulose ou um produto de clivagem da mesma, e um ou mais peptídeos derivados de proteínas celulares.
[0358] Em certas modalidades, a nanopartícula pode ser estabilizada por interações de ligações de hidrogênio presentes em um pH variando de cerca de 3 a cerca de 7 e formadas entre macromoléculas derivadas do catabolismo de componentes celulares do tecido de planta e possuindo grupos hidroxila (como encontrado em açúcares, por exemplo) e/ou grupos amino (como encontrados em peptídeos, por exemplo) e/ou grupos de ácido orgânico (como encontrados em ácido ascórbico e/ou ácido málico, por exemplo). Em certas modalidades, as interações por ligação de hidrogênio também podem envolver grupos hidroxila de pequenas moléculas, como polifenóis (como antocianinas, por exemplo cianidina-3-glucosídeo e/ou cianidina-3-rutinósido). Em certas modalidades, as nanopartículas podem ser formadas/automontadas sob condições ácidas um tanto neutras (como em um pH de cerca de 3 a cerca de 7) e em uma solução que não é um tampão ou outra solução com uma alta resistência iônica que pode interferir na ligação de hidrogênio. Em certas modalidades, os íons de cálcio podem atuar como pontes entre as cadeias de ácido poligalacturônico, permitindo a estabilização de nanopartículas. Como será entendido, sais como potássio, sódio e/ou cálcio podem estar presentes na solução, tendo se originado do tecido da planta, por exemplo.
[0359] Como será entendido, as condições sob as quais os componentes celulares liberados do tecido da planta por homogeneização podem se automontar na nanopartícula podem variar dependendo da aplicação particular e dos materiais usados. Em certas modalidades, as condições podem ser a uma temperatura variando entre cerca de 4°C a cerca de 40°C, de preferência de cerca de 15°C a cerca de 35°C. Em certas modalidades, as condições podem ser em água ou em uma mistura de água com um solvente orgânico miscível em água, tal como (mas não limitado a) metanol ou etanol. Em certas modalidades, as condições sob as quais os componentes celulares liberados do tecido da planta por homogeneização podem se automontar na nanopartícula podem estar em solução que é cerca de 15 a 100% v/v de água, mais preferencialmente cerca de 30 a cerca de 100% v/v de água, e mais preferencialmente cerca de 100% v/v de água. Quando a automontagem ocorre em uma solução aquosa ou
68 /209 substancialmente aquosa, é contemplado que, em certas modalidades, enzimas normalmente presentes em um ambiente de maturação, como poligalactouronase, podem ser adicionadas à mistura, especialmente para auxiliar a automontagem ao usar frutas não amadurecidas como, ou como parte do tecido da planta. Em certas modalidades, as condições sob as quais a automontagem pode ocorrer podem ser em um meio substancialmente aquoso, por exemplo. Em certas modalidades, a produção de nanopartículas pode ser alcançada por procedimentos como aqui descritos usando um meio adequado. Normalmente, o meio pode ser água ou um meio aquoso, mas pode em certas modalidades ser ou compreender água e um solvente orgânico miscível, tal como, mas não limitado a, um ou mais álcoois que podem incluir etanol e/ou metanol, um ou mais cetonas, tais como acetona, um ou mais solventes que podem incluir dimetilsulfóxido, separadamente ou em quaisquer combinações adequadas dos mesmos. Em certas modalidades, a automontagem das nanopartículas pode ocorrer em um dos meios descritos acima. As condições para automontagem podem compreender quaisquer condições termodinamicamente viáveis. Em certas modalidades, as condições para automontagem podem, por exemplo, compreender temperatura de cerca de 4°C a cerca de 30°C, concentrações de íons que estão geralmente de acordo com aquelas encontradas fisiologicamente (ou seja, níveis micromolares a milimolares), concentração de açúcar em uma faixa de cerca de 5-10 por cento p/v e ácidos orgânicos naturais presentes na faixa milimolar, por exemplo.
[0360] Em certas modalidades, um método preferido pode incluir um método no qual o tecido da fruta é homogeneizado em um meio aquoso ou alcoólico (ou uma combinação de ambos), a cerca de 4°C, usando um misturador, polytron ou qualquer outro dispositivo que pode interromper organização. Depois de fazer um homogenato liso do material de estratificação, o homogenato pode ser filtrado para remover os detritos e centrifugado a cerca de 10.000 x g para sedimentar os detritos finos. O homogenato resultante pode ser dialisado usando um saco de diálise de corte de 100kD durante cerca de 15 horas a cerca de 4°C. A solução do saco de diálise pode ser recolhida e submetida a uma forma de remoção de água e/ou liofilização/secagem por pulverização, secagem por nanopulverização, etc. para fornecer as
69 /209 nanopartículas. Estas podem ser armazenadas secas a cerca de -20°C no escuro onde o armazenamento de longo prazo é desejado, por exemplo.
[0361] Em certas modalidades, a homogeneização pode incluir qualquer método adequado de maceração de tecido de planta, como trituração, mistura, homogeneização de alto cisalhamento ou homogeneização usando um dispositivo, como um polytron, de tecidos de plantas.
[0362] Em certas modalidades, os tecidos vegetais podem incluir uma ou mais frutas e/ou legumes, que podem ou não estar em combinação com outros tecidos de plantas. Em exemplos onde um produto nutracêutico é desejado, um transportador (como uma fruta) e uma planta contendo nutracêuticos (como, por exemplo, rizomas de Acafrão da Terra) podem ser usados como tecido de planta. Em certas modalidades, pode ser usado um tecido de planta (como uma fruta) juntamente com um produto purificado ou parcialmente purificado (como cúrcuma em pó ou curcumina, por exemplo).
[0363] Alguns exemplos de compostos nutracêuticos e famílias de plantas podem incluir: (a) Carotenóides (beta-caroteno, licopeno, luteína e/ou outras xantofilas, astaxantina, etc); (b) Anonacinas (policetídeos derivados de frutas Annona com propriedades anticâncer); (c) Boswellia (que pode atuar em conjunto com a curcumina fornecendo função anti-inflamatória, por exemplo); (d) Ashwagandha (um componente à base de ervas contendo withanolides com propriedades antiestresse e preventivas do câncer), principalmente com uma estrutura esteróide; (e) Membros da família Ginger que incluem gengibre comestível (Zingiber officinalis), mango ginger (Curcuma amada) e outros contendo vários ingredientes bioativos, incluindo gingerols e shogaols; (f) Curcuma longa (cúrcuma, contendo curcumina); (g) Os canabinodióis, que são os ingredientes ativos medicinais da Cannabis sp. sem atividade alucinógena; (h) Fruto-oligossacarídeos e galacto-oligossacarídeos, bem como inulina de alcachofra de Jerusalém, para aumentar o conteúdo prebiótico;
70 /209 (i) Membros da Piperaceae, como Piper nigrum e seus parentes selvagens contendo piperina e vários derivados; e/ou, (j) Quaisquer outros ingredientes adequados de plantas não listados acima.
[0364] Em outras modalidades, as nanopartículas podem compreender pelo menos um polifenol. Em certas modalidades, o polifenol pode ser, ou compreender, uma antocianina ou várias antocianinas. Em ainda outras modalidades, as nanopartículas podem compreender ainda um ácido orgânico, como ácido málico, ácido ascórbico ou ambos. Em certas modalidades, as nanopartículas podem compreender mais de um polifenol. Como será entendido, a composição de polifenol da nanopartícula pode refletir a composição de polifenol do tecido da planta (por exemplo, a fruta) sendo usada, e qualquer polifenol adicional sendo fornecido (se polifenol externo estiver sendo adicionado). Onde ginja está sendo usada, por exemplo, os polifenóis podem incluir rutinósido ou glucosídeo de Cianidina 3. Quando o mirtilo é usado, os polifenóis podem incluir vários fenólicos e antocianinas encontrados no mirtilo. Exemplos de polifenóis (antocianina e fenólico) são indicados na seguinte Tabela: Componente de Antocianina Componente Fenólico Delpinidin 3-galactosideo Ácido cafeico Delphinidin 3-glucosideo Ácido ferúlico Delpinidin 3-arabinosideo Ácido gálico Cyanidin 3-glucosideo Ácido Cinâmico Petunidin 3-galactosideo Ácido Fenil acético Peonidin 3-galactosideo Catequinas/Epicatequinas Petunidin 3-arabinosideo Isoharmetina Malvinidin 3-galactosideo Miricetina Peonidin 3-arabinosideo Ácido Clorogenico Malvidin 3-glucosideo Ácido quinico 4-O-feruloil
71 /209 Malvidin 3-arabinosideo Quercetin 3- arabinosideo Delpinidin 6-acetyl-3- glucosideo Syringetin 3-O-galactosideo Malvidin 6-acetyl 3-glucosideo
[0365] Em certas modalidades, as nanopartículas podem ter uma estrutura substancialmente esférica com um diâmetro de cerca de 50-250 nm. Em certas modalidades, as nanopartículas podem compreender um núcleo à base de pectina, rodeado por uma ou mais estruturas de fibrilas espirais compreendendo componentes de pectina (por exemplo, Rhamnogalacturonanos), uma ou mais moléculas derivadas de hemicelulose (por exemplo, Xiloglucanos) e um ou mais peptídeos derivados de proteínas da parede celular, tais como glicoproteínas ricas em hidroxiprolina (HRGPs).
[0366] Em certas modalidades, a nanopartícula pode compreender ainda um ou mais agentes biologicamente ativos. Os agentes biologicamente ativos podem ser complexados, conjugados ou misturados com as nanopartículas em certas modalidades. A título de exemplo, o agente biologicamente ativo pode ser uma droga farmaceuticamente ativa, um nutracêutico ou um nutriente. O versado na técnica, tendo em conta os ensinamentos aqui contidos, estará ciente de uma variedade de drogas farmacêuticas, nutracêuticos e/ou nutrientes adequados que podem ser usados dependendo da aplicação particular. Em certas modalidades, uma droga farmaceuticamente ativa pode incluir qualquer droga adequada desenvolvida para controlar doenças crônicas, tais como aquelas usados na terapia do câncer (por exemplo, vincristina, vinblastina, paclitaxel, doxorrubicina, policetídeos, canabinodióis, etc.). Em certas modalidades, um nutracêutico pode compreender carotenóides (por exemplo, licopeno, zeaxantina, astaxantina, que pode ter potencial para uso em colírios, por exemplo), antiinflamatórios (como cúrcuma/curcumina, Boswellia, Ashwagandha e/ou outros herbáceos bioativos), nutrientes (como Fe2+, Zn, Se, cobalaminas (Vit B12)) e/ou enzimas antioxidantes como superóxido dismutase, catalase para áreas-alvo, isquemia/reperfusão, etc.
[0367] Em certas modalidades, a nanopartícula pode ser fornecida em solução aquosa, na forma de pó ou na forma desidratada, liofilizada, seca por
72 /209 congelamento, seca por pulverização ou seca por nanopulverização, por exemplo. Em certas modalidades, as nanopartículas podem ser formuladas para administração oral. Em certas modalidades, as nanopartículas podem ser fornecidas em uma forma adequada para ingestão com alimentos. Em certas modalidades, as nanopartículas podem ser fornecidas em cápsulas, na forma injetável, na forma de spray para áreas mucosas e/ou na forma de administração tópica (como uma pomada) para aplicação cutânea.
[0368] Em certas modalidades, é fornecida aqui uma composição compreendendo uma nanopartícula, conforme aqui descrito. Em certas modalidades, as nanopartículas ou composição podem compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável, excipiente ou diluente adicionado durante ou após a preparação da nanopartícula. Em certas modalidades, a composição pode compreender ainda um agente biologicamente ativo, como um fármaco, biomolécula, proteína, enzima, anticorpo ou qualquer outro agente farmacêutico.
[0369] Em ainda outras modalidades, o tecido de planta a partir do qual as nanopartículas são preparadas pode compreender uma fruta ou tecido de planta de legume. Em certas modalidades, o tecido da planta pode compreender uma fruta, como cereja, mirtilo, uva, independentemente ou em combinações, e pode, em certas modalidades, incluir, adicionalmente, outros produtos de importância nutricional, como brócolis, amêndoa, soja ou cúrcuma, ou como tecido ou como um produto processado, ou qualquer combinação dos mesmos. A título de exemplo, o tecido da planta pode compreender uma fruta ginja. Em certas modalidades, o tecido da planta pode compreender ainda um veículo nutriente ou nutracêutico de origem vegetal. Em certas modalidades, o tecido da planta pode compreender, por exemplo, uma fruta ginja em combinação com tecido de legume (por exemplo, brócolis, cogumelos, nozes ou produtos de nozes (ou seja, amêndoa, avelã), raízes (ou seja, Ashwagandha, ginseng, cyperus, etc ...)).
[0370] Estudos extensivos foram realizados, indicando que a estrutura organizacional das nanopartículas aqui descritas é complexa. Com base na evidência experimental obtida (ver a seção de Exemplos definida abaixo), e sem desejar ser limitado pela teoria de qualquer forma, é proposto o seguinte modelo estrutural de certas modalidades de nanopartículas aqui descritas:
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A partir de dados EM, a nanopartícula pode compreender um núcleo interno distinto, rodeado por uma camada intermediária distinta, sobre a qual uma camada externa mais fibrilada com estruturas semelhantes a fibras salientes pode ser fornecida.
As três regiões distintas (núcleo interno, camada intermediária e camada externa) são distinguíveis com base em sua capacidade de se ligar ao metal pesado (por exemplo, Acetato de urânio). Os íons de urânio podem se ligar a porções carregadas negativamente, como a dos ácidos de açúcar (ácidos glucurônicos, galacturônicos) de cadeias poliméricas, tornando essa região densa de elétrons.
Assim, a distinção entre as três camadas pode refletir diferenças na composição dos polímeros nessas camadas.
O tratamento enzimático das nanopartículas resultou na fragmentação da estrutura, revelando estruturas intermediárias.
O tratamento com pectinase (poligalacturonase) resultou na ruptura de toda a nanopartícula em estruturas vesiculares, sugerindo que porções de ácido poligalacturônico podem estar dispersas por toda a nanopartícula.
O tratamento com beta-1,4-glucanase resultou na dissolução das estruturas externas da nanopartícula, deixando um núcleo interno.
Uma vez que não havia níveis apreciáveis de moléculas de celulose de cadeia longa presentes na estrutura (difração de raios-X), parece que esta atividade pode ser direcionada para frações de hemicelulose com estrutura de beta- 1,4-glucano.
Portanto, é contemplado que as hemiceluloses podem formar a maior parte dos constituintes que estão dispostos nas camadas do meio/intermediária e externa das nanopartículas.
A estrutura do núcleo foi observada após o tratamento com tripsina.
O tratamento com tripsina também resultou na dissolução das camadas externa e intermediária, deixando o núcleo interno à base de pectina esférico.
Portanto, as camadas externa e intermediária também podem conter proteínas/peptídeos.
Anticorpos produzidos contra homogalacturonana mostraram uma forte reação às nanofibras durante SDS-PAGE.
O SDS-PAGE revela a presença de antocianinas, peptídeos e pectina nas nanopartículas, enquanto a nanofibra é desprovida de antocianinas.
Especula-se que os anticorpos podem ter sido incapazes de atingir o interior da nanopartícula e, portanto,
74 /209 deram uma reação fraca. Isso também mostra que os homogalacturonanos podem ser expostos nas nanofibras e resultou em forte reatividade cruzada com os anticorpos (dot blots, Figura 12). A reatividade cruzada com anticorpos criados contra extensina foi muito baixa em ambas as nanopartículas e nanofibras (dot blots, Figura 12), sugerindo que os peptídeos originados da extensina não estão presentes em níveis apreciáveis em qualquer das nanopartículas e nanofibras. Em contraste, uma forte reatividade foi observada contra os anticorpos produzidos contra a hemicelulose-proteína (arabinogalactana-proteína), sugerindo que esta pode ser um componente principal das camadas externas das nanopartículas e como um constituinte das nanofibras.
[0371] Em certas modalidades, as nanopartículas, conforme aqui descrito, podem compreender ainda um ou mais agentes biologicamente ativos, como um fármaco, nutriente, biomolécula (isto é, proteína, enzima, ácido nucleico), nutracêutico ou outro agente farmacêutico. Em certas modalidades, o agente biologicamente ativo pode ser complexado ou quimicamente conjugado com a nanopartícula. Em certas modalidades, o agente biologicamente ativo pode ser introduzido (e complexado ou conjugado com) a nanopartícula durante ou após a formação da nanopartícula.
[0372] Em outra modalidade, é fornecida aqui uma nanopartícula orientada compreendendo uma nanopartícula, conforme descrito neste documento, conjugada com um anticorpo de orientação específico para um marcador de câncer. Em certas modalidades, o anticorpo de orientação pode compreender anticorpo PD-L1 para direcionamento da nanopartícula orientada para células cancerosas. Em certas modalidades, a nanopartícula orientada pode ser complexada ou conjugada com pelo menos uma droga citotóxica ou anticâncer. Em certas modalidades, a nanopartícula orientada pode ser complexada com, ou conjugada com, paclitaxel, doxorrubicina ou ambos.
[0373] Em outra modalidade, é fornecida aqui uma nanopartícula antibacteriana, compreendendo uma nanopartícula como aqui descrito, complexada ou conjugada com um agente antibacteriano. Em certas modalidades, o agente antibacteriano pode compreender lisozima, uma tetraciclina ou Nisin ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas
75 /209 modalidades, a nanopartícula antibacteriana pode ser para uso no tratamento ou prevenção de infecção bacteriana MDR. Métodos de preparação de nanopartículas:
[0374] Em uma modalidade, é fornecido aqui um método para preparar uma nanopartícula (tal como aquelas aqui descritas, por exemplo) a partir de tecido de planta homogeneizado, o referido método compreendendo: fornecer um tecido de planta homogeneizado em solução, compreendendo componentes celulares liberados do tecido de planta; remover detritos do tecido de planta homogeneizado, se presente; e, opcionalmente, dialisar o tecido de planta homogeneizado para remover compostos não complexados ou remover os compostos não complexados por exclusão de tamanho, proporcionando assim uma solução compreendendo a nanopartícula que é formada por automontagem dos componentes celulares.
[0375] Em certas modalidades, a solução pode compreender qualquer meio adequado. Normalmente, a solução pode compreender água ou um meio aquoso, mas pode em certas modalidades ser ou compreender água e um solvente orgânico miscível, tal como, mas não limitado a, um ou mais álcoois que podem incluir etanol e/ou metanol, um ou mais cetonas, tais como acetona, um ou mais solventes que podem incluir dimetilsulfóxido, separadamente ou em quaisquer combinações adequadas dos mesmos.
[0376] Em certas modalidades, os detritos podem ser removidos por diálise, filtrando o tecido de planta homogeneizado, centrifugando o tecido de planta homogeneizado ou realizando filtração de fluxo tangencial ou filtração de fluxo contínuo no tecido de planta homogeneizado ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, a etapa de remoção de detritos pode compreender filtrar o tecido de planta homogeneizado ou centrifugar o tecido de planta homogeneizado, ou ambos. Em certas modalidades, os detritos podem ser removidos por uma ou combinações de técnicas, que podem incluir centrifugação (por exemplo, centrifugação de fluxo simples ou contínuo) e/ou filtração por membrana (por exemplo, diálise, separação centrífuga usando membranas de corte apropriado, por exemplo 1 -100m), filtração de fluxo tangencial, separação de coluna para exclusão de tamanho, etc..., individualmente ou envolvendo uma combinação de tais técnicas. Em certas
76 /209 modalidades, a centrifugação em ~ 9000-12000g pode sedimentar a maioria dos detritos, ou a filtração através de um filtro de 100 mícrons pode fornecer a remoção adequada de detritos.
[0377] Em certas modalidades, a etapa de diálise (se realizada) pode ser realizada usando uma diálise simples contra água (ou outra solução aquosa, embora a água seja preferível), embora isso possa ser mais facilmente usado em escala de laboratório em vez de produto comercial em grande escala. Assim, em certas modalidades, a diálise/separação pode ser realizada usando separação centrífuga contínua, uma filtração de fluxo tangencial ou pode ser omitida tornando as partículas suficientemente finas de modo que a separação de diálise possa ser omitida (usando equipamento como um homogeneizador de alto cisalhamento (por exemplo. Sonolator) ou um microfluidizador, por exemplo).
[0378] Em certas modalidades, o homogenato clarificado removido de detritos pode ainda ser purificado usando uma técnica de filtração por membrana onde moléculas menores que não são incorporadas às nanopartículas podem ser removidas. Isso pode incluir, por exemplo, uma diálise simples usando (por exemplo) um saco de diálise de corte de 100.000 MW contra água, ou submeter o homogenato a filtração tangencial (filtração de fluxo cruzado) através de uma membrana adequada de tamanho de corte semelhante, ou uma filtração através de uma membrana usando uma célula agitada (por exemplo, Amicon, ou instalação semelhante) por meio da qual as nanopartículas podem ser concentradas. Alternativamente, colunas de exclusão de tamanho de limites de exclusão semelhantes (100.000 MW) podem ser usadas, onde as nanopartículas são eluídas no volume vazio usando um solvente (água ou um tampão de baixa molaridade (por exemplo, 1mM, por exemplo) em pH de cerca de 4-5). Tais operações podem ser preferencialmente conduzidas a cerca de 4°C.
[0379] Em certas modalidades, o método pode compreender ainda uma etapa de submeter a solução compreendendo a nanopartícula à desidratação, liofilização, secagem por congelamento, secagem por pulverização ou secagem por nanopulverização da solução que compreende a nanopartícula.
[0380] Em certas modalidades, o método pode envolver a formação de nanopartículas por automontagem sob condições adequadas. Em certas modalidades, por exemplo, as condições podem ser a uma temperatura variando
77 /209 entre cerca de 4°C a cerca de 40°C, de preferência de cerca de 15°C a cerca de 35°C. Em certas modalidades, as condições podem ser em água ou em uma mistura de água com um solvente orgânico miscível em água, tal como (mas não limitado a) metanol ou etanol. Em certas modalidades, as condições sob as quais os componentes celulares liberados do tecido da planta por homogeneização podem se automontar na nanopartícula podem estar em solução que é cerca de 15 a 100% v/v de água, mais preferencialmente cerca de 30 a cerca de 100% v/v água, e mais preferencialmente cerca de 100% v/v água. Quando a automontagem ocorre em uma solução aquosa ou substancialmente aquosa, é contemplado que em certas modalidades as enzimas normalmente presentes em um ambiente de maturação, como poligalactouronase, podem ser adicionadas à mistura, especialmente para auxiliar na automontagem ao usar frutas não amadurecidas como, ou como parte do, tecido da planta. Em certas modalidades, as condições sob as quais a automontagem pode ocorrer podem ser em um meio substancialmente aquoso, por exemplo. Em certas modalidades, a produção de nanopartículas pode ser alcançada por procedimentos como aqui descritos usando um meio adequado. Normalmente, o meio pode ser água ou um meio aquoso, mas pode em certas modalidades ser ou compreender água e um solvente orgânico miscível, tal como, mas não limitado a, um ou mais álcoois que podem incluir etanol e/ou metanol, um ou mais cetonas, tais como acetona, um ou mais solventes que podem incluir dimetilsulfóxido, separadamente ou em quaisquer combinações adequadas dos mesmos. Em certas modalidades, a automontagem das nanopartículas pode ocorrer em um dos meios descritos acima. As condições para automontagem podem compreender quaisquer condições termodinamicamente viáveis. Em certas modalidades, as condições para automontagem podem, por exemplo, compreender temperatura de cerca de 4°C a cerca de 30°C, concentrações de íons que estão geralmente de acordo com aquelas encontradas fisiologicamente (ou seja, níveis micromolar a mili molar) e concentração de açúcar em uma faixa de cerca de 5-10 por cento (p/v) e ácidos orgânicos naturais presentes na faixa milimolar, por exemplo.
[0381] Em certas modalidades, o método pode envolver a formação da nanopartícula por automontagem em um meio substancialmente aquoso. Normalmente, no método descrito acima, a diálise pode ser realizada a cerca de
78 /209 4°C durante a noite para facilitar a montagem das nanopartículas. Se a diálise for conduzida em temperatura ambiente, o risco de contaminação por contaminantes atmosféricos pode aumentar. Em certas modalidades, as nanopartículas podem ser preparadas sob condições de GMP para fornecer nanopartículas puras, particularmente em aplicações farmacêuticas, tais como aplicações onde fármaco(s) farmacêutico(s) devem ser adicionados às nanopartículas. Em certas modalidades, o tecido de planta homogeneizado (ou seja, homogenatos) pode ser preparado em uma razão de cerca de 1g de tecido para 1 ou 2 ml de água. O tecido normalmente já contém 80-90% de água. Estas condições podem variar com base nas propriedades do material de partida. As nanopartículas podem, em certas modalidades, ser formadas, ou começar a se formar, durante o processo de homogeneização, e também podem, subsequentemente, por exemplo, durante a diálise (se realizada). Em certas modalidades, pode ser obtida uma solução de nanopartículas contendo cerca de 80% de nanopartículas, ou mais. Em certas modalidades, as temperaturas podem ser geralmente mantidas baixas, por exemplo, a cerca de 4°C, para evitar degradação indesejável.
[0382] Em outra modalidade do método acima, a etapa de fornecer o tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender a homogeneização de um tecido de planta em um meio aquoso ou orgânico (tal como, mas não limitado a, um meio aquoso ou orgânico (ou mistura dos mesmos) compreendendo água, etanol, metanol ou acetona, ou uma mistura dos mesmos, por exemplo). Em certas modalidades, o tecido de planta homogeneizado pode ser preparado por um polytron ou sonicação usando, por exemplo, um sonolador. Em ainda outra modalidade, a etapa de fornecer o tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender submeter um tecido de planta a homogeneização de alto cisalhamento e/ou sonolação em um meio aquoso ou orgânico compreendendo, por exemplo, qualquer um ou mais dentre água, etanol, metanol ou acetona. Em certas modalidades, a homogeneização de alto cisalhamento pode compreender a homogeneização a cerca de 3000- 5000 rpm, com uma lâmina tendo um diâmetro de cerca de 20 cm, a cerca de 80 kN, por exemplo (o especialista na técnica tendo em conta os ensinamentos deste documento estará ciente de condições de homogeneização de alto cisalhamento adequadas para atender a aplicação particular). Se, por exemplo,
79 /209 sonicação e/ou cavitação puderem ser usados, as forças de cisalhamento podem ser selecionadas de modo que as nanopartículas não sejam separadas pelas condições usadas. Em certas modalidades, a faixa de tamanho a ser alcançada para o tecido de planta homogeneizado em solução pode ser de cerca de 50 a cerca de 250 nm, por exemplo. Em certas modalidades, um polytron definido para uma taxa de cerca de 6-7, usando pulsos de 30 segundos, por cerca de 3 ciclos pode ser usado, por exemplo.
[0383] A título de exemplo, o tecido de planta homogeneizado pode, em certas modalidades ilustrativas, compreender um tecido de planta, como uma cereja, que foi homogeneizado com um misturador a cerca de 4500 rpm por cerca de 5 minutos e, em seguida, submetido a homogeneização fina com um polytron por cerca de 5 minutos. A pasta resultante pode então ser filtrada através de cerca de 4 camadas de gaze e centrifugada a cerca de 10.000 xg para remover resíduos, e o sobrenadante pode ser coletado. O sobrenadante pode ser dialisado em um saco de diálise com corte de 10.000 D contra água para remover componentes de pequena massa molecular. Após a diálise, a solução pode ser liofilizada ou seca por pulverização, para obter nanopartículas na forma de pó.
[0384] Em certas modalidades, pode ser usado um Sonolator, que emprega fluxo de fluido acelerado, cavitação ultrassônica e turbulência para fazer dispersões. No caso de nanopartículas, é contemplado que um sistema de pressão relativamente baixa pode ser preferido, de modo que a seleção da bomba pode ser realizada em conformidade. Sonolator é um produto da Sonic Corporation, Stratford, Connecticut (www.sonicmixing.com).
[0385] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um método para preparar uma nanopartícula, conforme aqui descrito, a partir de tecido de planta homogeneizado, o referido método compreendendo: preparar um tecido de planta homogeneizado em solução, compreendendo componentes celulares liberados do tecido de planta; permitir que a nanopartícula se forme por automontagem dos componentes celulares; remover detritos do tecido de planta homogeneizado, se presente; e liofilização, secagem por pulverização ou secagem por nanopulverização para formar um pó compreendendo a nanopartícula.
80 /209
[0386] A título de exemplo, em certas modalidades, a etapa de secagem por pulverização pode empregar, por exemplo, um sistema de secagem por pulverização de bico 4 Fujisaki, que pode evaporar água em diferentes capacidades (DAIICHI JITSUGYO (AMERICA), Inc. (DJA) 939 A.E.C. Drive, Wood Dale, IL 60191, EUA). Um tal modelo em escala piloto (MDL 150) pode evaporar ~10 kg de água por hora, com uma capacidade projetada de secagem por pulverização de ~200 litros de homogenato por dia com uma recuperação de ~ 0 kg de NP ou pó alimentício por dia, por exemplo.
[0387] Em certas modalidades, o método acima pode ser usado onde o tecido da planta compreende, por exemplo, ginja. Foi descoberto que ginja funciona particularmente bem com o método descrito acima, que não requer a realização de uma etapa de diálise antes de formar o pó que compreende a nanopartícula.
[0388] Em certas modalidades do método acima, a automontagem pode ocorrer em um meio substancialmente aquoso. Em certas modalidades, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender submeter um tecido de planta a homogeneização de alto cisalhamento em um meio aquoso ou orgânico. Em certas modalidades, a etapa de remoção de detritos pode compreender filtrar o tecido de planta homogeneizado ou centrifugar o tecido de planta homogeneizado, ou ambos.
[0389] Em certas modalidades, é contemplado que as nanopartículas, conforme aqui descrito, podem ser usadas para a distribuição de uma carga, como um agente bioativo ou outro agente de interesse. Foi observado que as nanopartículas, conforme aqui descrito, podem expandir em tamanho quando congeladas ou secas por pulverização, por exemplo, e podem, então, encolher em tamanho quando colocadas em solução aquosa ou água. Por conseguinte, em certas modalidades, é contemplado que pós secos ou substancialmente secos ou outras preparações de nanopartículas podem ser misturados com uma carga particular e, em seguida, adicionada água ou solução aquosa para encolher as nanopartículas, prendendo assim a carga nas nanopartículas para distribuição das mesmas. Em estudos experimentais, uma solução de nanopartículas deu estruturas de diâmetro de 50-250 nm, e quando observadas em SEM (efeito de secagem a vácuo), estas foram observadas como tendo uma
81 /209 estrutura em forma de concha ~4-5 vezes maior em diâmetro de acordo com dados de TEM e SEM, fornecendo um exemplo de tal expansão de tamanho na secagem.
[0390] Em certas modalidades, onde é desejável que a nanopartícula seja complexada com, ou conjugada com, outra fração, tal como um agente biologicamente ativo, qualquer um dos métodos descritos neste documento pode compreender ainda uma etapa adicional de introdução da fração (isto é, o agente biologicamente ativo) no o tecido de planta homogeneizado em solução ou na nanopartícula já formada sob condições adequadas para a fração complexar com, ou ser quimicamente acoplada ou conjugada com, a nanopartícula.
[0391] Em certas modalidades, por exemplo, a conjugação química pode ser alcançada usando procedimentos adaptados aos grupos funcionais que estão presentes nas nanopartículas (isto é, -NH2, -COOH, -OH) e no agente de conjugação. Por exemplo, ao usar Dylight no Exemplo 3 abaixo, o corante foi ativado usando ésteres de N-hidroxissuccinimida (NHS), que é um grupo reativo usado para marcar frações -NH2 de proteínas. Ésteres NHS de compostos reagem com aminas primárias de um aceitador (isto é, nanopartículas, nanofibras contendo peptídeos) formando ligações amida covalentes estáveis e liberando os grupos NHS. Como será entendido, outros agentes de acoplamento ou reticulação para ligação no mesmo ou em diferentes grupos funcionais também estão disponíveis (por exemplo, da Thermofisher Scientific).
[0392] Em uma modalidade preferida, nanopartículas e/ou nanofibras podem ser dissolvidas em solução salina tamponada com fosfato e misturadas com tampão Borato, 0,67 M, conforme recomendado (Thermofisher científico) para fornecer um nível de concentração de 2 mg/ml. Depois de misturar completamente com o agente de marcação ativado (éster NHS), a mistura pode ser incubada a 25°C por uma hora. A mistura contendo o produto conjugado (NP/NF) pode ser separada usando uma coluna de exclusão de tamanho ou uma coluna Spin fornecida pelo fabricante. A NP/NF conjugada pode ser eluída no volume vazio. O produto conjugado pode ser liofilizado e armazenado como um pó seco a -20°C, por exemplo (ver, por exemplo, Nour Karra e Simon Benita* (2012) The Ligand Nanoparticle Conjugation Approach for Targeted Cancer Therapy; Current Drug Metabolism, 2012, 13, 22-41, aqui incorporado por referência).
82 /209 Nanofibras e métodos para a produção das mesmas Nanofibras
[0393] Nanofibras também foram desenvolvidas e são aqui descritas. Embora as nanopartículas e as nanofibras possam ser preparadas a partir de tecido de planta, essas duas nanoestruturas foram preparadas aqui usando métodos notavelmente diferentes, e essas duas nanoestruturas foram encontradas aqui para adotar estruturas notavelmente diferentes, apresentar diferenças significativas em termos de composição e apresentar diferenças interessantes (e semelhanças) em termos de função e/ou efeitos biológicos.
[0394] Por conseguinte, também é aqui descrita uma nanofibra compreendendo componentes celulares auto-montados derivados de um tecido de planta homogeneizado. Em comparação com as nanopartículas descritas acima, as nanofibras diferem de várias maneiras, particularmente no fato de que as nanofibras são derivadas de um tecido de planta homogeneizado do qual os polifenóis foram extraídos ou que já é naturalmente baixo em teor de polifenol. Em certos exemplos, os componentes celulares podem incluir componentes liberados do tecido de planta por homogeneização, que se automontam na nanofibra. Em certos exemplos, o um ou mais componentes celulares podem incluir pectina. Em certos exemplos, as nanofibras podem compreender uma ou mais moléculas derivadas de hemicelulose, um ou mais peptídeos derivados de proteína de parede celular, ou ambos.
[0395] Em uma modalidade, é fornecida aqui uma nanofibra compreendendo componentes celulares auto-montados derivados de um tecido de planta homogeneizado, os componentes celulares compreendendo um ou mais carboidratos estruturais ou produtos de clivagem dos mesmos, em que lipídios e polifenóis não são componentes estruturais da nanofibra.
[0396] Conforme descrito neste documento, as nanofibras presentemente descritas podem ser preparadas com geralmente qualquer tecido de planta adequado, tal como aquele que pode ser usado para preparar nanopartículas, conforme descrito em detalhes neste documento (ver acima, por exemplo), desde que os polifenóis tenham sido primeiro extraídos ou sejam caso contrário, encontrado em níveis baixos ou reduzidos no tecido da planta. Em certas modalidades, a automontagem, componentes celulares, carboidratos estruturais ou produtos de clivagem dos mesmos e teor de lipídios das nanofibras podem
83 /209 ser substancialmente semelhantes ao das nanopartículas, conforme descrito em detalhes aqui, com a exceção de que os polifenóis não desempenham um papel estrutural nas nanofibras, resultando com que as nanofibras adotem estrutura e organização significativamente diferente em relação às nanopartículas.
[0397] Em certas modalidades, a nanofibra pode ser substancialmente livre de lipídios, pode ser substancialmente livre de polifenóis ou ambos.
[0398] Em certas modalidades, a nanofibra pode compreender uma fibra alongada que compreende um ou mais fios compreendendo ou feitos de pelo menos um carboidrato estrutural. Em certas modalidades, uma nanofibra básica pode compreender fibras alongadas que têm micrômetros de comprimento e um diâmetro de cerca de 5 a cerca de 10 nm (ver Figura 37, painéis esquerdo e direito). Essas fibras parecem ser homólogas às fibras que são liberadas das nanopartículas após o tratamento com tripsina (ver Figura 4, painéis, D, E). Essas estruturas semelhantes a fibras também são observadas quando nanofibras secas são examinadas com um microscópio eletrônico de varredura (ver Figura 7, Painel A). Em certas modalidades, a nanofibra pode ser considerada como um produto do branqueamento com etanol de uma nanopartícula. A nanofibra também é observada como uma estrutura espiralada (ver Figura 2, Painel C), indicando sua origem potencial das macromoléculas que circundam o núcleo de pectina das nanopartículas.
[0399] Em certas modalidades, a nanofibra pode compreender pectina, hemicelulose, peptídeo e/ou proteína, um ácido orgânico, produtos de clivagem dos mesmos ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o ácido orgânico pode compreender ácido málico, ácido ascórbico ou ambos.
[0400] Em certas modalidades, os componentes celulares podem compreender aqueles liberados do tecido da planta durante a maturação ou durante a homogeneização da fruta amadurecida, que são capazes de se automontar na nanofibra.
[0401] Em certas modalidades, o um ou mais carboidratos estruturais compreendem um ou mais de pectina, ácido péctico, éster metílico de pectina, um derivado de pectina, ácido poligalacturônico, ramnogalacturonanos, xilogucanos, hemiceluloses, xiloglucanos possuindo estruturas principais ligadas por -(14) de glicose, manose ou xilose e/ou arabinogalactanos e/ou produtos de clivagem dos mesmos.
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[0402] Em certas modalidades, a nanofibra pode ter um formato de fibra com um diâmetro de cerca de 5 a cerca de 10nm, por exemplo. Em certas modalidades, a nanofibra pode ser não cristalina.
[0403] Em certas modalidades, a nanofibra pode ser estabilizada por interações por ligação de hidrogênio e formada entre macromoléculas derivadas do catabolismo de componentes celulares do tecido de planta e possuindo grupos hidroxila e/ou grupos amino e/ou grupos de ácido orgânico.
[0404] Em certas modalidades, a nanofibra pode compreender ainda um agente biologicamente ativo. A título de exemplo, em certas modalidades, as nanofibras aqui descritas podem compreender ainda um ou mais agentes biologicamente ativos, como um fármaco, nutriente, biomolécula (ou seja, proteína, enzima, ácido nucleico), nutracêutico ou outro agente farmacêutico. Em certas modalidades, o agente biologicamente ativo pode ser complexado ou quimicamente conjugado com a nanofibra. Em certas modalidades, o agente biologicamente ativo pode ser introduzido (e complexado ou conjugado com) a nanofibra durante ou após a formação da nanofibra. Em certas modalidades, o agente biologicamente ativo pode ser ou compreender um fármaco, proteína, enzima, nutracêutico ou nutriente farmaceuticamente ativo.
[0405] Em certas modalidades, a nanofibra pode ser fornecida geralmente em qualquer forma adequada, como aquelas descritas com referência às nanopartículas acima. Em certas modalidades, as nanofibras podem ser fornecidas em solução aquosa, na forma de pó ou na forma desidratada, liofilizada, seca por congelamento, seca por pulverização ou seca por nanopulverização, por exemplo.
[0406] Em certas modalidades, o tecido de planta usado para preparar as nanofibras pode compreender uma fruta ou tecido de planta de legume com baixo teor de polifenóis, ou do qual os polifenóis foram extraídos ou removidos. Em certas modalidades, o tecido da planta pode compreender uma fruta em envelhecimento, um legume em maturação ou qualquer combinação dos mesmos; de preferência, em que o tecido da planta compreende cereja (por exemplo, ginja), mirtilo, uva, pêssego, nectarina, ameixa, damasco, mamão, tomate ou qualquer combinação dos mesmos, com baixo teor de polifenol e/ou dos quais os polifenóis foram removidos ou reduzidos. Em certas modalidades,
85 /209 o tecido da planta pode compreender cascas de frutas e/ou tecido externo de frutas, como no cacau, por exemplo, com baixo teor de polifenóis e/ou dos quais os polifenóis foram removidos ou reduzidos.
[0407] Em certos exemplos, a nanofibra pode ter uma estrutura filamentosa ou fibrosa com um diâmetro de cerca de 5 a cerca de 10nm e um comprimento na faixa do micrômetro. Em certos exemplos, a nanofibra pode compreender ainda um ou mais agentes biologicamente ativos. Os agentes biologicamente ativos podem ser complexados, conjugados ou misturados com as nanofibras em certos exemplos. A título de exemplo ilustrativo, o agente biologicamente ativo pode ser um fármaco farmaceuticamente ativo, um nutracêutico ou um nutriente. Em certas modalidades, o agente biologicamente ativo pode compreender um ou mais medicamentos contra o câncer, como paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina, vincristina e/ou vinblastina; um ou mais metais, como ferro, magnésio, selênio e/ou zinco; um ou mais nutracêuticos, como Boswellia, Withanolides, Annonacins, tetraciclinas, como vancomicina e outros agentes antibacterianos, como nicin, lisozima e outras moléculas com propriedades semelhantes usadas para controlar doenças e contaminação alimentar bacteriana.
[0408] Em certos exemplos, a nanofibra pode ser fornecida em solução aquosa, na forma de pó ou na forma desidratada, liofilizada, seca por congelamento, seca por pulverização ou seca por nanopulverização, por exemplo.
[0409] Em certas modalidades, as nanofibras podem ser fornecidas como cápsulas a serem ingeridas com alimentos ou como complexos nanofibra- nutracêuticos (por exemplo Boswellia, Curcumin, Ashwagandha, etc ..., consulte os exemplos aqui fornecidos em conexão com as nanopartículas e/ou pós alimenticios para exemplos adicionais), por exemplo.
[0410] A título de exemplo, o tecido de planta homogeneizado pode, em certas modalidades ilustrativas, compreender um tecido de planta, como uma cereja, que foi submetido a remoção ou esgotamento substancial de componentes de pequena massa molecular (incluindo polifenóis) por imersão em cerca de 95% etanol (1:1 p/v) por cerca de 24-48 horas, após o que a solução pode ser decantada e a fruta ainda incubada em etanol por mais 48 horas de modo que a maioria, ou substancialmente todos, os componentes da cor (ou
86 /209 seja, antocianinas ) estão removidos. O tecido da fruta pode então ser bem lavado com água por cerca de 24 horas (2x-3x em um volume equivalente de água). O tecido da fruta pode então ser homogeneizado com um misturador a cerca de 4500 rpm por cerca de 5 minutos e, em seguida, submetido a homogeneização fina com um polytron por cerca de 5 minutos. A pasta resultante pode então ser filtrada através de cerca de 4 camadas de gaze e centrifugada a cerca de 10.000 x g para remover resíduos, e o sobrenadante pode ser coletado. O sobrenadante pode ser dialisado em um saco de diálise com corte de 10.000 D contra água para remover componentes de pequena massa molecular. Após a diálise, a solução pode ser liofilizada ou seca por pulverização, para obter nanofibras em forma de pó.
[0411] Alternativamente, em certas modalidades, o tecido de fruta pode ser submetido a prensagem a frio para separar o suco. O bagaço assim obtido pode ser submetido à remoção dos componentes da cor e, em seguida, submetido a incubação em etanol a fim de remover os componentes da cor (por exemplo, Antocianinas e outros polifenóis que podem se ligar por hidrogênio aos carboidratos e peptídeos das nanopartículas). Após a hidratação, o tecido pode ser homogeneizado e processado conforme descrito acima.
[0412] Em ainda outros exemplos, o tecido de planta a partir do qual as nanofibras são preparadas pode compreender uma fruta ou tecido de planta de legume. Em certos exemplos, o tecido da planta pode compreender uma cereja, mirtilo, uva ou quaisquer combinações de frutas dos mesmos. A título de exemplo preferido, o tecido da planta pode compreender um tecido de fruta de ginja. Métodos para a produção de nanofibras
[0413] Em outra modalidade, um método para preparar nanofibras (tais como aqueles aqui descritos) a partir de tecido de planta homogeneizado pode compreender: preparar um tecido de planta homogeneizado em solução com baixo teor de polifenol, compreendendo componentes celulares liberados do tecido de planta; remover detritos do tecido de planta homogeneizado, se presente; e,
87 /209 opcionalmente, dialisar o tecido de planta homogeneizado para remover compostos não complexados ou remover compostos não complexados por exclusão de tamanho, proporcionando assim uma solução compreendendo as nanofibras que são formadas por automontagem dos componentes celulares.
[0414] Em certas modalidades, o tecido de planta branqueado pode ser geralmente considerado como um tecido do qual moléculas simples, livres e solúveis são removidas por extração do tecido usando um solvente orgânico que é altamente miscível com água. Isso pode incluir solventes como etanol, metanol, acetona, etc. Esses solventes podem quebrar a compartimentação celular e permitir a lixiviação de moléculas principalmente livres, como antocianinas, açúcares, ácidos orgânicos, etc., para o meio de desidratação. Em contraste, uma desidratação osmótica com solução de sacarose retira quase toda a água, deixando os componentes na fruta. O branqueamento, conforme citado neste documento, refere-se à perda de cor do tecido e não é um processo de oxidação.
[0415] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para preparar uma nanofibra a partir de tecido de planta homogeneizado, o referido método compreendendo: preparar um tecido de planta homogeneizado em solução com baixo teor de polifenol, compreendendo componentes celulares liberados do tecido de planta; remover detritos do tecido de planta homogeneizado, se presente; permitir que a nanofibra se forme por automontagem dos componentes celulares; e, liofilização, secagem por pulverização ou secagem por nanopulverização para formar um pó compreendendo a nanofibra.
[0416] Em certas modalidades, os métodos de preparação de nanofibras e suas etapas, conforme aqui descrito, podem ser substancialmente semelhantes aos aqui descritos para a produção de nanopartículas, com a distinção de que o tecido da planta pode ter baixo teor de polifenol, ou o tecido da planta pode ser um tecido de planta de cujos polifenóis foram extraídos para favorecer a formação de nanofibras.
[0417] Em certos exemplos dos métodos acima, a nanofibra pode se formar por automontagem em um meio substancialmente aquoso. Em certas
88 /209 modalidades, uma temperatura baixa (ou seja, cerca de 4 oC) pode ser usada durante a homogeneização, e é contemplado que uma ampla gama de solventes miscíveis em água pode ser usada para isolar as nanofibras.
[0418] Em certos exemplos dos métodos acima, o método pode compreender uma etapa de desidratação, liofilização, secagem por congelamento, secagem por pulverização ou secagem por nanopulverização da solução que compreende a nanofibra.
[0419] Em certas modalidades, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender a homogeneização de um tecido de planta em um meio aquoso ou orgânico, ou um meio aquoso/orgânico misto. Em certas modalidades, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender submeter um tecido de planta a homogeneização de alto cisalhamento e/ou sonolação em um meio aquoso ou orgânico compreendendo qualquer um ou mais dentre água, etanol, metanol ou acetona.
[0420] Em ainda outros exemplos, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender uma etapa de branqueamento do tecido de planta para remover polifenóis do mesmo antes da homogeneização do tecido de planta. Em outra modalidade, o branqueamento do tecido de planta pode compreender a realização de uma extração de polifenóis do tecido de planta com uma solução de extração. Em certas modalidades, a solução de extração pode compreender etanol.
[0421] Em outro exemplo, a etapa de fornecer o tecido de planta branqueado homogeneizado em solução pode compreender submeter um tecido de planta a homogeneização de alto cisalhamento em um meio aquoso ou orgânico. Em outro exemplo, a etapa de fornecer o tecido de planta branqueado homogeneizado em solução pode compreender a homogeneização do tecido de planta branqueado em um meio aquoso ou orgânico.
[0422] Em certas modalidades, a etapa de remoção de detritos pode compreender diálise, filtrar o tecido de planta homogeneizado, centrifugar o tecido de planta homogeneizado ou realizar filtração de fluxo tangencial ou filtração de fluxo contínuo no tecido de planta homogeneizado ou qualquer combinação dos mesmos.
89 /209 Pós alimentícios e Aditivos e Métodos para a Produção dos mesmos. Pós alimentícios e Aditivos
[0423] Em outra modalidade, é fornecido aqui um pó alimentício ou aditivo alimentar compreendendo as nanopartículas e/ou nanofibras aqui descritas, ou porções ou componentes dos mesmos, ou estruturas relacionadas com os mesmos. Em certas modalidades, o pó alimentício pode compreender os componentes estruturais básicos de nanopartículas e/ou nanofibras formando uma forma de pó fino em escala de mícron, por exemplo.
[0424] Em outra modalidade, é fornecido aqui um pó alimentício compreendendo componentes celulares auto-montados derivados de um tecido de planta homogeneizado, os componentes celulares compreendendo um ou mais carboidratos estruturais ou produtos de clivagem dos mesmos, e compreendendo ainda pelo menos um agente nutricional.
[0425] Em certas modalidades, o pó alimentício pode compreender estruturas fibrosas que se enrolam em torno de si mesmas para formar uma estrutur
[0426] Em certas modalidades, os pós alimentícios, conforme aqui descritos, podem compreender uma estrutura de forma substancialmente esférica ou oblonga variando em tamanho de cerca de 1 m a cerca de 10 m nas condições de preparação. Em certas modalidades, esta grande estrutura pode se dissipar como estruturas esféricas menores na faixa de cerca de 50 a 100 nm quando dissolvida em água. Em certas modalidades, a estrutura do pó alimentício pode compreender fibra enrolada e montada aleatoriamente ou fibras homólogas às observadas em nanopartículas e nanofibras. Em certas modalidades, toda a estrutura do pó alimentício pode ser semelhante ou análoga à de uma nanosfera, onde não há organização precisa das fibras e as fibras podem ser capazes de adsorver vários ingredientes presentes no homogenato de extratos de tecido, por exemplo.
[0427] Em certas modalidades, o um ou mais agentes nutricionais do pó alimentício podem ser complexados com as estruturas de nanoesferas fibrosas descritas acima do pó alimentício e podem contribuir para a formação de pó alimentício e/ou estrutura resultante do mesmo.
[0428] Em certas modalidades, o pó alimentício pode compreender ainda um componente hidrofóbico. Em certas modalidades, o componente hidrofóbico
90 /209 pode compreender ou ser fornecido em leite de amêndoa, leite de coco e / ou leite derivado de uma noz comestível.
[0429] Em certas modalidades, o agente nutricional pode compreender um ingrediente ativo de ocorrência natural com um benefício para a saúde. Em certas modalidades, o agente nutricional pode compreender um ou mais componentes, tais como carotenóides, anonacinas, Boswelia, withanolides de Ashwagandha, gingeróis e shaogaols de membros da família Ginger, canabinodióis, frutooligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos, inulina, Piperina e derivados de membros da família Piperaceae, Piper nigrum e Piper longum ou outros parentes selvagens contendo estes ingredientes e/ou derivados dos mesmos, ou qualquer ingrediente ativo dos mesmos com um benefício para a saúde, ou qualquer extrato, derivado ou produto isolado dos mesmos, ou quaisquer combinações dos mesmos.
[0430] Numa forma de realização preferida, o pó alimentício pode compreender: ginja ou um seu extrato aquoso; leite de amêndoa ou outro homogenato de amêndoas; leite de soja, ou outro homogenato de soja; brócolis, ou um extrato aquoso do mesmo; e, cúrcuma, ou um pó da mesma.
[0431] Em certas outras modalidades preferidas, o pó alimentício pode compreender: cerca de 25-30 v/v% de extrato de ginja (pelo menos cerca de 0,1 mg/ml de equivalente de polifenol); cerca de 25-30 v/v% de leite de amêndoa ou outro homogenato de amêndoas; cerca de 10-18 v/v% de leite de soja ou outro homogenato de soja; cerca de 25-30 v/v% de extrato de brócolis; e, cerca de 0,5-2,5 p/v %de cúrcuma ou pó deste.
[0432] O exemplo de pó alimentício acima foi projetado para fornecer um bom produto estético que não cheira a brócolis ou soja. Será entendido que vários outros componentes, combinações de componentes e porcentagens relativas de componentes também são contemplados neste documento.
[0433] Em certas modalidades adicionais, o extrato de ginja pode ser cerca de 1-2 mg/ml de equivalente de polifenol.
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[0434] Em certas modalidades, o extrato de ginja pode ser combinado com, ou substituído por, um ou mais pós de frutas comercialmente produzidos a partir de frutas inteiras secas, bagaço de frutas ou pós produzidos a partir de sucos de frutas por secagem por pulverização ou outro pó de frutas comercialmente disponível de interesse. Em certas modalidades, frutas que são secas e em pó até o tamanho de um mícron podem ser usadas para reidratar e homogeneizar, em vez de frutas frescas, por exemplo.
[0435] Conforme descrito neste documento, os pós alimentícios presentemente descritos podem ser preparados com geralmente qualquer tecido de planta adequado que pode ser usado para preparar nanopartículas e/ou nanofibras como descrito em detalhes neste documento. Em certas modalidades, o pó alimentício pode ser preparado a partir de uma fruta, legume ou outro tecido de planta ou produto capaz de formar nanopartículas ou nanofibras à base de carboidratos, conforme aqui descrito, mas como será entendido, o pó alimentício pode ter uma organização diferente, como uma estrutura que é mais parecido com uma nanosfera. Pós alimentícios podem ser preparados em qualquer meio adequado compreendendo aquoso, orgânico ou uma combinação dos mesmos.
[0436] Os pós alimentícios podem, em certas modalidades, compreender ainda um agente nutricional ou material contendo nutrientes (ou um nutriente) que se deseja incluir no produto de pó alimentício (que será tipicamente adaptado para a aplicação pretendida do pó alimentício), e podem incluir pós frescos, processados ou concentrados, sozinhos ou em quaisquer combinações desejadas por peso ou volume.
[0437] Em certas modalidades, os alimentos em pó descritos neste documento podem ser preparados a partir de um tecido de planta que é adequado para a preparação de uma nanopartícula e/ou uma nanofibra como já descrito em detalhes neste documento, em combinação com um agente nutricional ou material contendo nutrientes. Como será entendido, o agente nutricional ou material contendo nutrientes será tipicamente adaptado para a aplicação pretendida do pó alimentício e pode incluir pós frescos, processados ou concentrados, sozinhos ou em quaisquer combinações desejadas por peso ou volume. Em certas modalidades, o pó alimentício pode ser desenvolvido com agentes nutricionais ou componentes contendo nutrientes ou com componentes
92 /209 direcionados para abordar uma condição fisiológica particular (tal como uma condição crônica, por exemplo), e tal agente nutricional ou material contendo nutrientes pode ter propriedades preventivas e/ou curativas, por exemplo. Como será entendido, o termo agente nutricional ou nutriente, tal como aqui utilizado pode incluir qualquer agente ativo adequado ou composto apropriado para a indicação particular (ou material compreendendo o referido agente ativo ou composto), e não está limitado às entidades tipicamente consideradas como nutrientes, tais como aqueles encontrados nos alimentos. A título de exemplo, em certas modalidades, um nutriente pode incluir qualquer ingrediente natural (ou não natural) adequado com um benefício para a saúde. Em certas modalidades, o tecido da planta pode compreender cascas de frutas e/ou tecido externo de frutas, como no cacau, por exemplo.
[0438] Em certas modalidades, o pó alimentício pode compreender:
1. Ginja (ou extrato de ginja), ou uma outra fruta ou legume (ou extrato do mesmo) que é capaz de formar nanopartículas ou nanofibras à base de carboidratos como aqui descrito;
2. Um componente hidrofóbico (tal como, mas não limitado a, leite de amêndoa) que pode incorporar moléculas hidrofóbicas das substâncias adicionadas (outros exemplos sendo leite de coco ou leite derivado de nozes comestíveis, por exemplo); e,
3. Um material contendo nutrientes (como um extrato alimentar funcional, por exemplo) que contém um ou mais ingrediente/ingredientes bioativos adaptados para a aplicação desejada do pó alimentício, por exemplo.
[0439] Alguns exemplos não limitativos de materiais contendo nutrientes podem incluir um ou mais dos seguintes compostos ativos e/ou famílias de plantas: Carotenóides (ou seja, beta-caroteno, licopeno, luteína e outras xantofilas, astaxantina, etc.); Anonacinas (isto é, policetídeos derivados de frutas Annona com propriedades anticâncer); Boswellia (que pode atuar em conjunto com a curcumina, proporcionando função antiinflamatória adicional);
93 /209 Ashwagandha (um componente à base de plantas contendo withanoliides com propriedades anti-estresse e preventivas do câncer, principalmente com uma estrutura esteróide); Membros da família Ginger que podem incluir, por exemplo, gengibre comestível (Zingiber officinalis), mango ginger (Curcuma amada) ou outros contendo qualquer um dos vários ingredientes bioativos, incluindo gingeróis e shogaols; Curcuma longa (isto é, cúrcuma, contendo curcumina); Canabinodióis (que são os ingredientes ativos medicinalmente de Cannabis sp. Sem atividade alucinógena); Fruto-oligossacarídeos e galacto-oligossacarídeos, bem como inulina de alcachofra de Jerusalém, para aumentar o conteúdo prebiótico; Membros Piperaceae, como Piper nigrum e seus parentes selvagens contendo piperina e vários derivados; e/ou, qualquer outro ingrediente(s) adequado(s) (tais como, mas não limitado a, aqueles derivados de plantas) não listados acima; e/ou qualquer extrato, derivado, produto isolado do mesmo, ou material ou tecido de planta contendo tal componente. Métodos para a produção de pós alimentícios e aditivos
[0440] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para preparar pó alimentício a partir de tecido de planta homogeneizado, o referido método compreendendo: preparar um tecido de planta homogeneizado em solução, compreendendo componentes celulares liberados do tecido de planta, os componentes celulares compreendendo um ou mais carboidratos estruturais ou produtos de clivagem dos mesmos, e o tecido de planta homogeneizado em solução compreendendo ainda pelo menos um agente nutricional; opcionalmente, remover detritos do tecido de planta homogeneizado em solução, se presente; e, liofilização, secagem por congelamento, secagem por pulverização ou secagem por nanopulverização do tecido de planta homogeneizado em solução para formar o pó alimentício.
[0441] Exemplos de tecido de planta adequado e agentes nutricionais já foram descritos em detalhes acima.
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[0442] Em ainda outra modalidade do método acima, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado pode compreender a homogeneização do tecido de planta em um meio aquoso, um meio orgânico ou um meio aquoso-orgânico misto. Em certas modalidades, o pó alimentício pode ser preparado por homogeneização dos materiais de partida do pó alimentício em solução. Por exemplo, a homogeneização pode ser conseguida usando um misturador, de preferência operando em alta rpm e capaz de gerar forças de cisalhamento elevadas, ou qualquer outra máquina adequada capaz de mistura de alto desempenho, como um sonolador.
[0443] Em certas modalidades, o tecido de planta homogeneizado em solução pode ser filtrado para remover detritos, ou os detritos podem ser removidos da mistura homogeneizada. A título de exemplo, um dispositivo centrífugo ou dispositivo de filtração (por exemplo, um dispositivo de filtração por membrana ou dispositivo de filtração de fluxo tangencial) capaz de filtrar os detritos (ou seja, matéria particulada que não foi para o homogenato e se deposita por gravidade) pode ser usado para remover detritos.
[0444] Em certas modalidades, o pó alimentício pode então ser desidratado, liofilizado, seco por pulverização, seco por nanopulverização ou de outra forma desidratado ou seco. A título de exemplo, pode ser usado equipamento que é capaz de remover água (ou outro solvente sendo usado), que pode incluir um secador de nanopulverização, ou um liofilizador para amostras aquosas, ou mais preferencialmente um secador por pulverização de alta eficiência capaz de secagem por pulverização de grandes volumes podem ser usados, por exemplo. Em certas modalidades, o secador pode operar sob pressão reduzida.
[0445] Em outra modalidade, o tecido da planta pode compreender uma fruta, legume ou tecido da planta. Em ainda outra modalidade, o tecido da planta pode compreender uma fruta em envelhecimento, um legume em maturação ou qualquer combinação dos mesmos; de preferência, em que o tecido da planta compreende cereja, mirtilo, uva, pêssego, nectarina, ameixa, damasco, mamão, tomate ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o tecido da planta pode compreender um tecido da planta obtido de ou compreendendo ginja, amêndoa ou leite de amêndoa, soja ou leite de soja, brócolis, cúrcuma ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o tecido de planta
95 /209 homogeneizado pode compreender extrato de ginja, leite de amêndoa, leite de soja, extrato de brócolis e cúrcuma em pó. Tecidos de plantas adequados já foram descritos em detalhes acima.
[0446] Em certas modalidades, o tecido de planta homogeneizado em solução pode compreender ainda um componente hidrofóbico como já descrito acima.
[0447] Em ainda outra modalidade, o tecido da planta pode compreender um ou mais materiais contendo nutrientes, que podem ser materiais frescos, pré- processados ou concentrados, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0448] Em certas modalidades dos métodos acima, a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado pode compreender homogeneizar o tecido de planta com um misturador, de preferência operando em alta rpm e gerando forças de cisalhamento elevadas, um sonolador ou outro dispositivo de mistura de alto desempenho.
[0449] Em certas modalidades dos métodos acima, a etapa de remoção de detritos pode compreender a remoção de detritos com um dispositivo centrífugo, com um dispositivo de filtração, por filtração por membrana, por filtração de fluxo tangencial ou qualquer combinação dos mesmos.
[0450] Em certas modalidades, o tecido da planta pode compreender um tecido da planta obtido de ou compreendendo ginja, amêndoa ou leite de amêndoa, soja ou leite de soja, brócolis, cúrcuma ou qualquer combinação dos mesmos.
[0451] Numa forma de realização preferida, os materiais de partida para o método podem compreender: ginja ou seu extrato aquoso; leite de amêndoa ou outro homogenato de amêndoas; leite de soja, ou outro homogenato de soja; brócolis, ou um extrato aquoso do mesmo; e, cúrcuma, ou um pó da mesma.
[0452] Em certas outras modalidades preferidas, os materiais de partida para o método podem compreender: cerca de 25-30 v/v% de extrato de ginja (pelo menos cerca de 0,1 mg/ml de equivalente de polifenol); cerca de 25-30 v/v% de leite de amêndoa ou outro homogenato de amêndoas;
96 /209 cerca de 10-18 v/v% de leite de soja ou outro homogenato de soja; cerca de 25-30 v/v% de extrato de brócolis; e, cerca de 0,5-2,5% p/v de cúrcuma ou pó deste.
[0453] Em certas modalidades, o extrato de ginja pode ser cerca de 1-2 mg/ml de equivalente de polifenol, por exemplo.
[0454] O exemplo de pó alimentício acima foi projetado para fornecer um bom produto estético que não cheira a brócolis ou soja. Será entendido que vários outros componentes, combinações de componentes e porcentagens relativas de componentes também são também aqui contemplados.
[0455] Em certas modalidades, os métodos de preparação de pós alimentícios e suas etapas, conforme descrito neste documento, podem ser substancialmente semelhantes aos descritos neste documento para a produção de nanopartículas e/ou nanofibras, com a distinção de que a presença de pelo menos um agente nutricional favorece a produção de estrutura de nanosfera do pó alimentício, em vez de estruturas de nanopartículas e/ou nanofibras. Usos de Nanopartículas, Nanofibras e Pós alimentícios
[0456] Exemplos de usos contemplados de nanopartículas, nanofibras e pós alimentícios, conforme descrito neste documento, são apresentados abaixo. Estes exemplos não se destinam a ser limitativos, mas, em vez disso, fornecem exemplos ilustrativos destinados a pessoas versadas na técnica. Os estudos experimentais apresentados na seção de Exemplos abaixo fornecem mais detalhes sobre métodos e usos exemplares.
[0457] Em certas modalidades, as referências aqui a um indivíduo ou célula podem incluir um indivíduo animal ou uma célula animal. Em certas modalidades, o animal pode ser um mamífero. Em certas modalidades, o animal pode ser humano. Nanopartículas:
[0458] Em uma modalidade, é fornecido aqui um método de distribuição de um agente biologicamente ativo a um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: a administração de uma nanopartícula como aqui descrito, que é complexada com, ou conjugada com, o agente biologicamente ativo, ao individuo.
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[0459] A título de exemplo, em certas modalidades, o agente biologicamente ativo pode ser selênio, zinco, magnésio e/ou ferro. Em certas modalidades, o agente biologicamente ativo pode compreender uma droga anticâncer e o indivíduo pode ser um indivíduo com câncer. Em certas modalidades, o medicamento anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina ou outro composto natural ou sintético usado no tratamento do câncer. Em certas modalidades, o agente biologicamente ativo pode ser introduzido na nanopartícula durante a formação da nanopartícula, ou o agente biologicamente ativo pode ser complexado com nanopartículas já formadas em um meio de base aquosa opcionalmente compreendendo um álcool ou outro composto orgânico. Em certas modalidades, o meio de base aquosa pode compreender DMSO, ou um tampão, ou ambos.
[0460] Em outra modalidade, é aqui fornecido um método de tratamento de uma doença ou distúrbio associado a espécies reativas de oxigênio em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar uma nanopartícula conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0461] Em certas modalidades, a nanopartícula pode atuar como um antioxidante.
[0462] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um método para tratar ou reduzir a inflamação em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar uma nanopartícula conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0463] Em certas modalidades, a nanopartícula pode compreender, ou ser sequencialmente, simultaneamente ou coadministrada com um agente anti- inflamatório. Em certas modalidades, o agente anti-inflamatório pode compreender curcumina.
[0464] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um método para tratar ou reduzir a obesidade em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar uma nanopartícula conforme descrito neste documento ao indivíduo.
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[0465] Em certas modalidades, a nanopartícula pode compreender componentes derivados, pelo menos em parte, de nozes, leguminosas, ervas, especiarias, vegetais ou tecidos de plantas fúngicas, tradicionalmente usados para fins alimentares ou médicos
[0466] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um método para tratar ou prevenir o câncer em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar uma nanopartícula conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0467] Em certas modalidades, a nanopartícula pode ser simultaneamente ou sequencialmente ou coadministrada com uma droga anticâncer. Em certas modalidades, a nanopartícula pode ser complexada ou conjugada com uma droga anticâncer. Em ainda outras modalidades, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0468] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um método para fornecer fibra alimentar solúvel a um indivíduo, o referido método compreendendo: administrar uma nanopartícula conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0469] Em ainda outra modalidade, é fornecido neste documento um aditivo alimentar que aumenta a viscosidade compreendendo uma nanopartícula, conforme descrito neste documento.
[0470] Em ainda outra modalidade, é fornecido neste documento um método para atenuar os níveis de açúcar pós-prandial no sangue de um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar uma nanopartícula conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0471] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um produto cosmético que compreende uma nanopartícula, conforme descrito neste documento.
[0472] Em ainda outra modalidade, é fornecida aqui uma composição para administração tópica a um indivíduo em necessidade, a composição compreendendo uma nanopartícula como aqui descrito e, opcionalmente, um agente biologicamente ativo.
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[0473] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um método para prevenir queimaduras solares em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: a aplicação de uma nanopartícula como aqui descrito na pele do indivíduo.
[0474] Em certas modalidades, a nanopartícula pode compreender, ou ser aplicada com, antocianina adicional ou outro agente protetor de UV.
[0475] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para reduzir a proliferação celular, o referido método compreendendo: o contato de uma célula ou tecido ou órgão com uma nanopartícula, conforme descrito neste documento.
[0476] Em certas modalidades, a nanopartícula pode ser simultaneamente ou sequencialmente usada com uma droga anticâncer. Em ainda outra modalidade, a nanopartícula pode ser complexada ou conjugada com uma droga anticâncer. Em ainda outra modalidade, a droga anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0477] Em ainda outra modalidade, é aqui fornecido um método para reduzir o acúmulo de triglicerídeos no fígado de um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar uma nanopartícula conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0478] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para reduzir um nível de colesterol em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar uma nanopartícula como aqui descrito.
[0479] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para melhorar o metabolismo de lipídeos em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar uma nanopartícula como aqui descrito.
[0480] Em outra modalidade, é fornecida aqui uma nanopartícula orientada compreendendo uma nanopartícula, conforme descrito neste documento, conjugada com um anticorpo de direcionamento específico para um marcador de câncer. Em certas modalidades, o anticorpo de direcionamento pode compreender o anticorpo PD-L1 para direcionamento da nanopartícula para células cancerosas. Em certas modalidades, a nanopartícula orientada
100 /209 pode ser complexada ou conjugada com pelo menos uma droga citotóxica ou anticâncer. Em certas modalidades, a nanopartícula orientada pode ser complexada ou conjugada com paclitaxel, doxorrubicina ou ambos e/ou outro agente anticâncer, como, por exemplo, um ou mais anticorpos direcionados à via (isto é, PI3K (Fosfatidilinositon-3-quinase).
[0481] Em outra modalidade, é fornecida aqui uma nanopartícula antibacteriana, compreendendo uma nanopartícula como aqui descrito, complexada ou conjugada com um agente antibacteriano. Em certas modalidades, o agente antibacteriano pode compreender lisozima, uma tetraciclina ou Nisin ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, a nanopartícula antibacteriana pode ser para uso no tratamento ou prevenção de infecção bacteriana MDR e/ou na esterilização de superfícies, como na indústria de alimentos e/ou em hospitais, por exemplo. Nanofibras:
[0482] Em uma modalidade, é fornecido aqui um método de distribuição de um agente biologicamente ativo a um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar uma nanofibra como aqui descrito, que é complexada com, ou conjugada com, o agente biologicamente ativo ao individuo.
[0483] Em certas modalidades, o agente biologicamente ativo pode compreender Zinco ou Ferro ou Selênio ou Magnésio, ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o agente biologicamente ativo pode compreender uma droga anticâncer e o indivíduo pode ser um indivíduo com câncer. Em certas modalidades, o medicamento anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0484] Em certas modalidades, o agente biologicamente ativo pode ser introduzido na nanofibra durante a formação da nanofibra, ou o agente biologicamente ativo pode ser complexado com nanofibras já formadas em um meio de base aquosa opcionalmente compreendendo um álcool ou outro composto orgânico. Em certas modalidades, o meio de base aquosa pode compreender DMSO, ou um tampão, ou ambos.
[0485] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para tratar ou prevenir o câncer em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo:
101 /209 administrar uma nanofibra conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0486] Em certas modalidades, a nanofibra pode ser simultânea ou sequencialmente ou coadministrada com uma droga anticâncer. Em certas modalidades, a nanofibra pode ser complexada ou conjugada com uma droga anticâncer. Em certas modalidades, o medicamento anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0487] Em outra modalidade, é aqui fornecido um método para fornecer fibra alimentar solúvel a um indivíduo, o referido método compreendendo: administrar uma nanofibra conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0488] Em certas modalidades, é fornecido aqui um aditivo alimentar de aumento de viscosidade compreendendo uma nanofibra, conforme descrito neste documento.
[0489] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para atenuar os níveis de açúcar pós-prandial no sangue de um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar uma nanofibra conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0490] Em outra modalidade, é fornecido aqui um produto cosmético que compreende uma nanofibra, conforme descrito neste documento.
[0491] Em outra modalidade, é aqui fornecida uma composição para administração tópica a um indivíduo em necessidade, a composição compreendendo uma nanofibra conforme descrito neste documento e, opcionalmente, um agente biologicamente ativo.
[0492] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para prevenir queimaduras solares em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: aplicação de uma nanofibra conforme descrito neste documento na pele do indivíduo.
[0493] Em certas modalidades, a nanofibra pode compreender, ou ser aplicada com, antocianina ou outro agente protetor de UV.
[0494] Em ainda outra modalidade, é fornecido aqui um método para reduzir a proliferação celular, o referido método compreendendo:
102 /209 a introdução de uma nanofibra, opcionalmente complexada ou conjugada com um agente citotóxico, em uma célula ou tecido ou órgão.
[0495] Em certas modalidades, a nanofibra pode ser complexada ou conjugada com um anticorpo de direcionamento específico para a célula ou tecido ou órgão.
[0496] Em certas modalidades, a nanofibra pode ser simultânea ou sequencialmente ou coadministrada ou usada com uma droga anticâncer. Em certas modalidades, a nanofibra pode ser complexada ou conjugada com uma droga anticâncer. Em certas modalidades, o medicamento anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0497] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para reduzir o acúmulo de triglicerídeos no fígado de um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar uma nanofibra conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0498] Em outra modalidade, é aqui fornecida uma nanofibra orientada compreendendo uma nanofibra conforme descrito neste documento, conjugada com um anticorpo orientado específico para um marcador de câncer. Em certas modalidades, o anticorpo orientado pode compreender anticorpo PD-L1 para direcionamento da nanofibra orientada para células cancerosas. Em certas modalidades, a nanofibra orientada pode ser complexada ou conjugada com pelo menos uma droga citotóxica ou anticâncer. Em certas modalidades, a nanofibra orientada pode ser complexada com, ou conjugada com, paclitaxel, doxorrubicina ou ambos.
[0499] Em outra modalidade, é fornecida aqui uma nanofibra antibacteriana, compreendendo uma nanofibra como aqui descrito, complexada com ou conjugada com um agente antibacteriano. Em certas modalidades, o agente antibacteriano pode compreender lisozima, uma tetraciclina ou Nisin ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, a nanofibra antibacteriana pode ser para uso no tratamento ou prevenção de infecção bacteriana MDR. Pó alimentício
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[0500] Em uma modalidade, é fornecido aqui um método de distribuição de um agente biologicamente ativo a um indivíduo ou organismo em necessidade, o referido método compreendendo: a administração de um pó alimentício conforme aqui descrito, que é complexado ou conjugado com o agente biologicamente ativo usando um processo químico ou físico, para o indivíduo.
[0501] Em outra modalidade, o agente biologicamente ativo pode ser um elemento como selênio, zinco, ferro ou magnésio. Em outra modalidade, o agente biologicamente ativo pode ser uma droga anticâncer e o indivíduo pode ser um indivíduo com câncer. Em certas modalidades, a droga anticâncer pode ser paclitaxel, vincristina ou qualquer composto natural ou sintético usado no tratamento do câncer.
[0504] Em outra modalidade, o agente biologicamente ativo pode ser introduzido no pó alimentício durante a formação do pó alimentício, ou o agente biologicamente ativo pode complexar com pó alimentício já formado em um meio de base aquosa opcionalmente compreendendo um álcool ou outro composto orgânico. Em certas modalidades, o meio de base aquosa pode compreender DMSO, ou um tampão, ou ambos.
[0505] Em ainda outra modalidade, é fornecido neste documento um método de tratamento de uma doença ou distúrbio associado a níveis aumentados de espécies reativas de oxigênio que levam à inflamação em um indivíduo em necessidade, compreendendo: administrar um pó alimentício conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0506] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para tratar ou reduzir a inflamação em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar um pó alimentício conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0507] Em certas modalidades, o pó alimentício pode compreender, ou ser coadministrado com, um agente antiinflamatório. Em certas modalidades, o agente anti-inflamatório pode compreender curcumina.
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[0508] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para tratar ou reduzir a obesidade em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar um pó alimentício conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0509] Em ainda outra modalidade, o pó alimentício pode compreender componentes derivados, pelo menos em parte, de nozes, leguminosas, ervas, especiarias, legumes ou tecidos de plantas fúngicas, tradicionalmente usados para fins alimentares ou médicos.
[0510] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para tratar ou prevenir o câncer em um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar um pó alimentício conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0511] Em outra modalidade, o pó alimentício pode ser simultanea ou sequencialmente coadministrado com uma droga anticâncer. Em ainda outra modalidade, o pó alimentício pode ser complexado com, ou conjugado com, uma droga anticâncer. Em ainda outra modalidade, o medicamento anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0512] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para fornecer fibra alimentar solúvel a um indivíduo, o referido método compreendendo: administrar um pó alimentício conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0513] Em outra modalidade, é aqui fornecido um aditivo alimentar que aumenta a viscosidade compreendendo um pó alimentício conforme descrito neste documento.
[0514] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para atenuar os níveis de açúcar pós-prandial no sangue de um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar um pó alimentício conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0515] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para reduzir a proliferação celular, o referido método compreendendo:
105 /209 o tratamento de uma célula ou tecido ou órgão com um pó alimentício, conforme descrito neste documento.
[0516] Em outra modalidade, o pó alimentício pode ser simultaneamente ou sequencialmente usado com ums droga anticâncer. Em ainda outra modalidade, o pó alimentício pode ser complexado com, ou conjugado com, uma droga anticâncer. Em ainda outra modalidade, o medicamento anticâncer pode ser paclitaxel ou vincristina.
[0517] Em outra modalidade, é fornecido aqui um método para reduzir o acúmulo de triglicerídeos no fígado de um indivíduo em necessidade, o referido método compreendendo: administrar um pó alimentício conforme descrito neste documento ao indivíduo.
[0518] Em outra modalidade, é fornecido aqui um pó alimentício antibacteriano, compreendendo um pó alimentício como aqui descrito, complexado ou conjugado com um agente antibacteriano. Em certas modalidades, o agente antibacteriano pode compreender lisozima, uma tetraciclina ou Nisin ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o pó alimentício antibacteriano pode ser para uso no tratamento ou prevenção de infecção bacteriana MDR.
[0519] Em outra modalidade, é fornecido aqui um pó alimentício antibacteriano, compreendendo um pó alimentício como aqui descrito, complexado ou conjugado com um agente antibacteriano. Em outra modalidade, o agente antibacteriano pode compreender uma lisozima, uma tetraciclina ou Nisin, ou qualquer combinação das mesmas. Em certas modalidades, o pó alimentício antibacteriano pode ser para uso no tratamento ou prevenção de infecção bacteriana MDR. EXEMPLO 1 - Preparação e Caracterização de Nanopartículas e Nanofibras Montagem espontânea de macromoléculas em frutas de ginja (Prunus cerasus L.) em nanopartículas e nanofibras sob condições de desregulação celular e comparações entre elas
[0520] Foi levantada a hipótese pelos presentes inventores que as nanoestruturas poderiam ser geradas por métodos de processamento de frutas particulares onde ocorre a ruptura celular, proporcionando um ambiente onde as interações moleculares poderiam ocorrer e, potencialmente, resultando na
106 /209 formação de nanoestruturas bem definidas. O presente Exemplo descreve a preparação, isolamento, propriedades físico-químicas e características estruturais de nanopartículas e nanofibras derivadas de fontes biológicas (fruta ginja neste exemplo) usando diferentes métodos, que podem ter papéis benéficos, por exemplo, na função alimentar, prevenção de doenças crônicas e/ou melhoria da distribuição de drogas e/ou bioativos nas células.
[0521] Neste exemplo, foi realizada e estudada homogeneização de frutas ginjas em um meio aquoso (ou um meio alcoólico contendo álcool e água) e montagem espontânea de componentes celulares (por exemplo, pectina, glucanos, oligossacarídeo ligado a proteínas e/ou produtos de degradação dos mesmos), polifenóis e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido málico) para formar nanopartículas (e nanofibras, onde os polifenóis foram extraídos da fruta a ser homogeneizada). As nanopartículas formadas nestes estudos eram estáveis em detergente, estruturas uniformemente esféricas variando em tamanho de cerca de 25 a cerca de 50 nm em solução, e muito maiores em tamanho quando desidratadas após liofilização em um pó. Um tipo morfologicamente diferente de nanoestrutura, aqui referido como nanofibra, também foi preparado, que era distinto das estruturas esféricas e na forma de nanofibras, cerca de 5 a cerca de 10 nm de largura e micrômetros de comprimento, que foram gerados a partir de cereja branqueada com etanol desprovida de polifenóis como tecido de planta usado para homogeneização. Os complexos podem ser completamente destruídos pelo tratamento com pectinase, indicando a natureza de pectina das estruturas constituintes. Além disso, o tratamento com celulase e tripsina resultou na remoção das estruturas fibrilares externas das nanopartículas, expondo um núcleo interno. SDS-PAGE de nanopartículas revelou polipeptídeos de massas variadas, co-migrando com pectina e polifenóis como um esfregaço, enquanto as nanofibras mostraram principalmente polipeptídeos. Tanto as nanopartículas quanto as nanofibras mostraram uma forte afinidade para anticorpos criados contra complexos arabinogalactano-proteína, e uma afinidade muito menor para anti-extensina. As nanopartículas não reagiram com anti- homogalacturonana e anti-xiloglucana, enquanto as nanofibras apresentaram reação muito forte. As nanopartículas foram enriquecidas em açúcares hexose, como glicose, galactose/ácido galacturônico e manose, enquanto as nanofibras foram enriquecidas em pentoses como a arabinose. Os espectros FT-IR das
107 /209 nanopartículas e das nanofibras mostraram semelhanças com os das proteínas e da pectina. Um polipeptídeo de 38 kD, que era visível como uma banda distinta após SDS-PAGE, mostrou semelhanças de sequência com glucano endo-1,3- beta-glucosidase, enquanto um polipeptídeo de 20 kD mostrou semelhanças com proteína semelhante à taumatina. O presente Exemplo descreve as características estruturais de nanopartículas automontadas de frutas de ginja, em comparação com nanofibras também derivadas de frutas de ginja de uma maneira diferente. Materiais e métodos:
[0522] Ginja: Os frutos de ginja usados neste exemplo vieram da Vineland Research Station, Vineland, Ontário, onde são mantidos como germoplasma. Todas as variedades são variedades com alto teor de polifenóis, variando o teor de polifenóis na faixa de 300-500 mg/100 g de peso fresco. A principal variedade utilizada para os presentes estudos foi a V 70151, outras como V 71261, Hymann Conserva e Hymann Rubisn também apresentaram altos níveis de formação de nanopartículas. A ginja usada neste exemplo foi Prunus cerasus L.
[0523] Os produtos químicos foram obtidos na Sigma Chemical Co., St Louis, EUA; Fisher Chemicals; Em Vitrogen; Molecular Probes; entre outros. Preparação e Isolamento de Nanopartículas e Preparação e Isolamento de Nanofibras:
[0524] Para nanopartículas, o método de extração envolveu a homogeneização da fruta ginja usando um homogeneizador polytron com sonda PTA 10 em um meio (de preferência água, como usado neste Exemplo, mas pode, alternativamente, usar metanol ou etanol absoluto ou diluído, por exemplo), em proporção de 1:1 p/p (1 g de tecido para 1 ml de água ou álcool), em um ajuste intermediário (4-5) até que o tecido da fruta estivesse completamente homogeneizado. O homogenato foi filtrado através de 4 camadas de tecido gaze para remover os resíduos. O homogenato resultante foi centrifugado (18.000x g) numa centrífuga Sorvall RC 6 Plus durante 20 minutos. O sobrenadante foi decantado. Cinco ml do sobrenadante foram dialisados (espectros-Por, corte de 6-8 kD) contra água (1 litro) durante 12 horas a 4°C. O extrato dialisado dentro da bolsa de diálise foi armazenado congelado a -20°C, assim como o sobrenadante (denominado extrato bruto). Como o extrato pode conter enzimas que podem degradar as nanopartículas quando em solução
108 /209 aquosa, o extrato dialisado foi mantido em baixa temperatura. Em modalidades onde um meio alcoólico ou substancialmente alcoólico é usado, tais enzimas seriam provavelmente desnaturadas e/ou tendo atividade reduzida, embora a baixa temperatura ainda seja geralmente preferida. Conforme aqui descrito, uma vez liofilizadas ou secas por pulverização (por exemplo), as nanopartículas são estáveis.
[0525] Polifenóis que lixiviaram em água foram diluídos consideravelmente, então, para fins experimentais, este foi concentrado por cromatografia de interação hidrofóbica, passando por um cartucho Sep-Pak C18 e eluindo com metanol.
[0526] Para a liofilização, o homogenato dialisado foi colocado num frasco com um volume de 1 litro (~250 ml) e colocado num envoltório por arrefecimento em N2 líquido. O frasco foi ligado a um liofilizador (operando a -60C, e um vácuo de 3-4 Toricelli, utilizado para este fim). As soluções alcoólicas foram dialisadas contra água para remover o álcool antes de conduzir a liofilização. No caso das nanopartículas, a remoção completa da água não foi alcançada por esse método, potencialmente por causa da água ligada às nanopartículas, mas isso pode fornecer uma solução concentrada. As soluções de nanofibras podem ser dialisadas em um pó fino usando esse método.
[0527] Para nanofibras, frutos de ginja sem caroço foram imersos em etanol 50% por 48 h com 3 mudanças de solvente, e isso resultou na remoção de polifenóis, deixando frutos de cereja com uma cor esbranquiçada (referido como branqueamento aqui). O descaroçamento dos frutos de ginja cria uma superfície de contato com o solvente e está contemplado que, em certas modalidades, os frutos podem até ser fatiados em pedaços de tamanho menor para aumentar ainda mais a remoção de polifenóis. Os frutos/fatias branqueados foram imersos em água e completamente lavados 3 vezes em água para remoção do etanol (3h no total). Esses frutos foram homogeneizados em água ou metanol (1:1 p/p) usando polytron como usado para a extração de cereja não branqueada descrito acima. Após a remoção dos detritos por centrifugação (18000xg) por 15 minutos, o homogenato foi dialisado contra água. O extrato dialisado contendo as nanofibras estava substancialmente livre de polifenóis e poderia ser liofilizado em um pó branco fofo.
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[0528] Para a secagem por nanopulverização, a solução de nanopartículas/nanofibras foi diluída até uma consistência com água, de modo que formará um spray fino (soluções espessas tendem a obstruir o bico do pulverizador utilizado). A secagem por nanopulverização foi conduzida usando um secador de minispray Buchi (B290) (velocidade da bomba-35-50% proporcionando 10-15 ml de fluxo, temperatura de entrada a 180°C, temperatura de saída a 100°C, com um fluxo de ar mantido a 400 litros/hora). O pó resultante foi armazenado em tubos selados a -20°C.
[0529] Microscopia eletrônica: Cerca de 500 a 1000 g de nanopartículas de pó de cereja de tamanho nano processado ou pós de nanofibras foram pulverizadas uniformemente em um lado de uma fita adesiva dupla-face condutora de carbono. A fita foi então montada em um eixo de alumínio de 12 mm de diâmetro. As superfícies das amostras foram observadas em diferentes ampliações e as imagens foram registradas usando o Microscópio Eletrônico de Varredura (Modelo QUANTA 250, FEI, Holanda).
[0529] A microscopia eletrônica de transmissão de nanopartículas foi conduzida usando o extrato dialisado ou pós dissolvidos em água (~100-200g por ml), conforme descrito anteriormente (Jacob e Paliyath, 2008). As grades de níquel revestidas de carbono foram flutuadas em uma gota de 50l da solução e as nanopartículas foram deixadas adsorver para a grade por 30 segundos. A grade foi seca com papel absorvente e flutuada sobre uma gota de acetato de uranila a 1% por 30 segundos. A grade foi seca com papel absorvente e examinada em um microscópio eletrônico de transmissão Leo 912 B.
[0530] Análise de proteínas: Para avaliar a degradação da proteína durante o processamento, a proteína foi extraída de cada etapa usando TRIzol® conforme sugerido pelo fabricante (Invitrogen). Em resumo, 100 g de equivalente de proteína da amostra (conforme determinado pelo reagente de Bradford) foram homogeneizados ou bem misturados em reagente TRIzol (1 ml) e incubados à temperatura ambiente por 5 min. O homogenato foi centrifugado a 12000xg durante 15 min a 4°C. Para a separação de fases, 200ul de clorofórmio foram adicionados e agitados em vórtex para misturar bem e centrifugados a 12000xg por 15 min a 4°C. As fases aquosa e orgânica foram separadas. A fase aquosa foi seca por liofilização. O resíduo seco foi redissolvido
110 /209 por aquecimento (90°C) em tampão de carregamento de amostra para SDS- PAGE. Para precipitar a proteína da fração orgânica, 1,5 ml de isopropanol foi adicionado e incubado por 10 min em temperatura ambiente seguido por centrifugação a 12000xg por 10 min a 4°C. O grânulo obtido após centrifugação foi lavado três vezes usando cloridrato de guanidina 0,3 M em etanol 95% seguido por uma lavagem final usando 2 ml de etanol 100%. O grânulo foi redissolvido por aquecimento em tampão de carregamento de amostra. As amostras de proteínas foram separadas em géis de poliacrilamida a 10% sob condições de desnaturação e redução. O gel foi fixado em ácido acético a 10% e corado com azul brilhante de Coomassie.
[0531] Associação de polifenóis e peptídeos em nanopartículas: A formação de nanopartículas durante a homogeneização da ginja em água foi um processo espontâneo. O homogenato resultante era altamente ácido com pH tipicamente em torno de 3,0. Para testar se a homogeneização em pH quase neutro tem efeito na formação de nanopartículas e na associação de proteínas e polifenóis, a ginja também foi homogeneizada em tampão de citrato de sódio 300 mM em pH 6,0. No método de extração de proteína TRIzol™, as proteínas livres transitam para a fase orgânica, enquanto as proteínas fortemente associadas a moléculas hidrofílicas, como carboidratos, podem se dividir na fase aquosa. Para avaliar a associação de polifenóis e proteínas nas nanopartículas, proteínas das fases aquosa e orgânica obtidas após extração com TRIzol ™ foram analisadas por SDS-PAGE. A fase aquosa diluída foi concentrada por liofilização, enquanto as proteínas da fase orgânica foram precipitadas usando isopropanol como descrito anteriormente. A interfase precipitada foi solubilizada diretamente em tampão de carregamento de amostra de proteína. As proteínas foram separadas em géis de poliacrilamida a 10% sob condições de desnaturação e redução. Após a eletroforese, o gel foi incubado em ácido acético a 10% por 5 min e uma imagem foi tomada destacando a distribuição dos polifenóis coloridos. Posteriormente, o gel foi corado com azul brilhante Coomassie para detecção de proteínas.
[0532] Nestes testes, a formação de nanopartículas foi favorecida em um pH baixo, variando de 3-6. A associação de polifenóis com peptídeos pode ser entendida pela comigração de peptídeos e antocianinas conforme observado no
111 /209 gel não corado (Figura 12 A) e o mesmo gel corado com Coomassie Brillian Blue (Figura 12 B).
[0533] Associação de ácidos pécticos em nanopartículas: A pectina de maçã e o ácido poligalaturônico foram dissolvidos em NaOH 0,1 N e usados como padrões. A nanopartícula e os polifenóis livres juntamente com essas amostras pécticas foram resolvidos em géis de poliacrilamida a 10% sob condição de desnaturação/redução. Após a eletroforese, o gel foi corado com iodeto de propídio (10 g/ml em água) por uma hora e fotografado. O mesmo gel foi novamente corado com azul brilhante Coomassie.
[0534] Análise de Western e spot blot de componentes estruturais em nanopartículas: Para identificar a natureza dos principais componentes estruturais de carboidratos da nanopartícula, spot blot e western blot foram realizados usando três anticorpos monoclonais (www.Plantprobes.net) criado contra homogalacturonan (LM20), extensina (LM1) e arabinogalactan-proteína (LM14). Pó liofilizado de nanopartículas e nanofibras de ginja não branqueada e branqueada, respectivamente, foi aquecido em água fervente por 5 min em tampão de carregamento de amostra e resolvido usando 10% SDS-PAGE sob condição de redução. Os polipeptídeos resolvidos do gel foram eletrotransferidos para a membrana de nitrocelulose durante a noite. Para a análise de dot blot, 2ul da amostra fervida foram aplicados diretamente na membrana de nitrocelulose. Estas membranas de nitrocelulose foram bloqueadas com solução de leite em pó magro a 5% em tampão PBS (solução salina tamponada com fosfato) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem três vezes com PBS-T (PBS com 0,1% Tween-20) e uma lavagem final com PBS, as membranas foram incubadas em solução de anticorpo primário (20x diluído) em PBS por 2 h em temperatura ambiente. Após a incubação, as membranas foram lavadas três vezes com PBS- T e uma lavagem final em PBS antes da incubação no anticorpo secundário anti- camundongo conjugado a AP por 1 hora em temperatura ambiente. Após incubação em anticorpo secundário, as membranas foram lavadas três vezes em PBS-T e uma lavagem final em PBS. O desenvolvimento da cor foi obtido usando o kit de substrato conjugado com fosfatase alcalina Bio-Rad, conforme recomendado pelo fabricante.
[0535] A análise foi feita no sistema Varian Saturn 2000 equipado com armadilha de íons. GC foi programado a uma taxa de fluxo constante de 1 ml/min
112 /209 na coluna Sil-CB8 (0,25 mm x 30 m). A temperatura do injetor foi mantida constante a 250°C no modo dividido (20:1). A temperatura do forno foi mantida constante a 100°C por 4 min durante a injeção, em seguida, aumentada para 250°C a uma taxa de 8°C/min e mantida a 250°C por 3 min adicionais. A armadilha de íons foi programada para analisar a massa entre 40-650 m/z com segmento de retardo inicial de 3 min.
[0536] Derivatização de açúcares: derivados trimetilsilil (TMS) de vários açúcares pentose e hexose foram preparados para determinar seu respectivo tempo de retenção nos parâmetros de GC-MS dados. Vários padrões de açúcar (2 mg) foram dissolvidos em 100 I de piridina anidra e 100 I de BSTFA:TMCS (N,O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida:trimetilclorosilano; 99:1) foi adicionado à solução em um frasco de vidro. A derivatização foi realizada utilizando procedimentos descritos pelo fornecedor (Sigma). A mistura reacional foi incubada a 80°C durante 2 horas. 1l de açúcar derivatizado foi injetado em GC- MS para análise.
[0537] Derivatização de nanopartículas: As nanopartículas foram preparadas frescas por homogeneização de 10 gm de fruta ginja em 10 ml de água destilada, geralmente como descrito acima. O homogenato foi centrifugado a 15000g durante 20 min. O suco clarificado do sobrenadante foi passado por uma coluna de dessalinização PD-10 de 10ml e posteriormente dialisado contra água destilada com membrana de corte de 6-8 kDa. 100 l de nanopartícula purificada foram misturados com 200 l de TFA concentrado para uma concentração final de 8,6 M e incubados a 90°C por 2 horas. A amostra hidrolisada foi seca sob corrente de nitrogênio. A amostra seca foi ressuspensa em 100l de piridina e 100l de BSTFA:TMCS (99:1) foi adicionado à solução. A derivatização foi feita incubando a 80°C durante 1 hora. Para análise de GC-MS, 1l da amostra foi injetado.
[0538] Derivatização da nanofibra: A solução de nanofibra foi preparada dissolvendo 4mg de nanofibra liofilizada em 1ml de água. 100l de nanofibra foi hidrolisado em TFA 8,6 M a 90°C por 2 horas. A amostra hidrolisada foi filtrada através de um filtro de fibra de vidro e seca sob uma corrente de nitrogênio. A amostra seca foi ressuspensa em 100l de piridina e 100l de BSTFA:TMCS
113 /209 (99:1) foi adicionado à solução. A derivatização foi feita incubando a 80°C durante 1 hora. Para análise de GC-MS, 1l da amostra foi injetado.
[0539] Análise FT-IR de nanopartículas: a análise FT-IR de nanopartículas e nanofibras foi conduzida usando um espectrômetro Bruker Tensor 27 InfraRed. Quantidades iguais de pós (1%) foram misturadas com KBr e transformadas em um disco transparente que foi escaneado para aquisição dos espectros.
[0540] Difração de raios-X de nanopartículas: A difração de raios-X de pequeno ângulo das nanopartículas foi conduzida usando um difratômetro Bruker Nanostar SAXS. Pós liofilizados de nanopartículas de extrato dialisado de cereja não branqueada e o dialisado foram usados para a análise de difração.
[0541] Análise estatística: as análises estatísticas foram realizadas com o GraphPad Prism versão 4. Os resultados com duas médias foram comparados usando um teste t de Student. Os resultados com múltiplas médias foram comparados usando ANOVA de uma via seguida pelo "teste de Tukey" para avaliar o nível de significância. Médias significativamente diferentes (p <0,05) são denotadas por sobrescritos diferentes. Resultados e discussão:
[0542] Caracterização de Nanopartículas: Nestes estudos, a homogeneização de frutos em meio aquoso interrompeu a organização natural de macromoléculas celulares e moléculas simples, resultando em sua montagem aleatória, porém estruturada, levando à geração de estruturas com características físico-químicas e estruturais distintas. Diferenças de tamanho entre polifenóis e nanoestruturas complexadas com polifenóis foram usadas para separar essas estruturas por meio de diálise, usando uma membrana de corte de baixa massa molecular ou uma coluna PD-10 que permitiu a separação por exclusão de tamanho. Os conteúdos de polifenol do extrato bruto de ginja, extrato dialisado contendo nanopartículas e o dialisado (contendo moléculas excluídas pela membrana com massas moleculares de ~6kD e inferiores) são mostrados na Tabela 1. Quase 80% dos polifenóis no extrato foram retidos dentro da membrana de diálise, sugerindo que os polifenóis existem em um estado complexado. Em comparação com outras frutas, como uva e mirtilo, a formação de complexos foi muito maior na ginja (embora nanopartículas também tenham se formado na uva e no mirtilo). A separação dos componentes
114 /209 polifenólicos por HPLC-MS revelou a presença de cianidina-3-rutinósido como a principal antocianina com peonidina 3-rutinósido em menor abundância. Os ácidos fenólicos, como o ácido clorogênico e o ácido para-coumaroilquínico, estavam presentes em níveis muito menores (ver Tabela 2). As atividades antioxidantes do extrato bruto, do extrato dialisado (nanopartícula; NP) e do dialisado dos extratos aquoso e metanólico são fornecidas na Tabela 3. Todos os extratos mostraram altos níveis de atividades sequestrantes de radicais superóxido, hidroxila e DPPH. O extrato bruto apresentou a maior capacidade antioxidante nas duas condições de extração. O dialisato possui a menor atividade antioxidante. Uma porção significativa da capacidade antioxidante foi associada às nanopartículas (ou seja, o extrato dialisado).
[0543] A extração em metanol (~50% v/v final) também resultou na formação de nanopartículas.
[0544] O extrato dialisado pode ser liofilizado em um pó fofo contendo proteína (10-12%), polifenóis (12-14%), pectina (10%-15%) e outros carboidratos (por exemplo, componentes de hemicelulose, como xiloglucano, componentes de pectina, como arabinogalactanos). Uma vez formados, os polifenóis nas nanopartículas não puderam ser extraídos com etanol (50-100%). Os complexos eram geralmente estáveis em ácido (pH <3). A adição de ácido tricloroacético a 10% resultou na precipitação de complexos como um resíduo avermelhado, entretanto, condições alcalinas (> pH 7) resultaram na clivagem do anel de polifenóis, potencialmente desestabilizando a organização macromolecular. Em comparação, as nanofibras de cereja branqueada com etanol não continham quantidades detectáveis de polifenóis, mas continham proteínas (~15%), pectina (15-20%) e outros carboidratos (hemiceluloses como xiloglucanos, componentes pécticos como arabinoxilanos e pectinas complexadas (60-70%). Uma vez que a formação do complexo é um evento aleatório, uma proporcionalidade estrita entre os tipos de componentes é difícil de alcançar e, portanto, é fornecida uma proporção geral de vários componentes.
115 /209 Tabela 1: Conteúdo total de polifenol no extrato de ginja Conteúdo Total Polifenol (mg ácido gálico/g equivalente em peso fresco) Amostra Extrato Aquoso Extrato Metanólico Extrato Cru 0.88 ± 0.1b,c- 0.94 ± 0.1b,c 1.04 ± 0.1b,c-1.13 ± 0.1b,c Extrato Dializado 0.65 ± 0.1a,c-0.63 ± 0.1a,c 0.70 ± 0.1a,c-0.80 ± 0.1a,c (Nanoparticulas) Dializado 0.03 ± 0.1a,b-0.06 ± 0.1a,b 0.03 ± 0.1a,b-0.05 ± 0.1a,b O sobrescrito “a” denota significância estatística em p <0,05 de CE (Água e Metanol); “b” denota significância estatística em p <0,05 de DE (Água e Metanol); e “c” denota significância estatística em p <0,05 de DZ (Água e Metanol), respectivamente. Os valores de cada conjunto são Média ± Erro Padrão de três estimativas independentes.
Tabela 2: Composição de polifenóis dos extratos dialisados de ginja (mg equivalente de ácido gálico/g de peso fresco) Polifenóis Extrato Aquoso Dializado Extrato Metanólico Dializado Cianidina-3- Sophoroside 0.07 ± 0.1 0.07 ± 0.0 Cianidina-3-Rutinoside 0.71 ± 0.1b 0.55 ± 0.1a Peonidina-3-Rutinoside 0.17 ± 0.1 0.16 ± 0.0 Pelargonidina-3- Rutinoside 0.06 ± 0.1b 0.1 ± 0.1a Àcido p-coumaroilquínico 0.02 ± 0.0 0.01 ± 0.0 Ácido Clorogênico 0.04 ± 0.1 0.04 ± 0.1 O sobrescrito “a” e “b” denotam significância estatística em p <0,05 entre componentes em extrato de água dialisado e extrato de metanol dialisado, respectivamente para cada componente fenólico. ND: Não detectado. A quantificação foi conduzida por análise HPLC-MS e comparação da área do pico.
116 /209 Tabela 3: Capacidade antioxidante do extrato bruto, extrato dialisado e dialisado da ginja Atividade Antioxidante (% Taxa resfriamento/µg polifenol) Extrato Aquoso Extrato Metanol Ensaio Extrato Extrato Dializado Extrato Extrato Dializado Antioxidade Cru Dializado Cru Dializado (Nanoparticulas) Sequestrador 2.6 ± 1.8 ± 0 .1a 1.4 ± 3.6 ± 2.5 ± 1.6 ± Superoxide 0.2b,c 0.1a 0.1b,c 0.1a,c 0.2a,b Sequestrador 4.9 ± 2.1 ± 0.2a,c 1.5 ± 6.5 ± 3.9 ± 1.8 ± Radical 0.2b,c 0.1a,b 0.3b,c 0.3a,c 0.1a,b Hidroxil Sequestrador 8.2 ± 4.4 ± 0.5a 4.7 ± 8.8 ± 6.2 ± 3.3 ± Radical 0.3b,c 0.1a 0.2b,c 0.2a,c 0.4a,b
DPPH Capacidade sequestrante (RSC) de radicais DPPH, hidroxila e superóxido de extratos de ginja. O sobrescrito "a" denota significância estatística em p <0,05 do extrato bruto (CE) (Água e Metanol); "b" denota significância estatística em p <0,05 do extrato dialisado (DE) (Água e Metanol); e "c" denota significância estatística em p <0,05 de dialisado (DL) (Água e Metanol), respectivamente.
[0545] Morfologia de Nanopartidas: Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) do extrato dialisado revelou nanopartículas com diâmetros na faixa de cerca de 25 a cerca de 50 nm (Figura 1A, setas). Os tamanhos variaram consideravelmente, sugerindo que os complexos podem ser potencialmente transformados pela perda de componentes estruturais. As nanopartículas possuíam componentes filamentosos lineares enrolados em torno de uma estrutura central. Essas estruturas podem ser vistas se estendendo entre duas nanopartículas na visão ampliada dos complexos (Figura 1 B, seta).
117 /209
[0546] A variação nos tamanhos das nanopartículas pode surgir de múltiplas fibras enroladas em torno do núcleo central várias vezes. As fibras parecem estar desenroladas (Figura 1B, seta) em várias nanopartículas, sugerindo que elas podem ser mantidas juntas por ligações não covalentes, e mudanças no ambiente externo podem dissociar as nanopartículas em suas unidades de construção. TEM dos componentes estruturais das nanopartículas são mostrados na Figura 2. A Figura 2A mostra a estrutura do núcleo da nanopartícula como uma estrutura esférica que é despojada dos filamentos de enrolamento (seta. As estruturas semelhantes a fibras podem ser observadas no fundo emanando da estrutura esférica central. A subestrutura dos filamentos revelando uma estrutura de fibrila em espiral pode ser vista na Figura 2B e C (setas 1, 2). A Figura 2D mostra estruturas de fibras estendidas (seta) compostas de fibrilas. Assim, as nanopartículas pareciam possuir vários níveis de organização para formar subestruturas com características distintas, o núcleo central, as fibras em torno do núcleo, estruturas de fibra montadas como espirais que podem ser estendidas em fibrilas que podem ser mantidas juntas por meio de ligações não covalentes.
[0547] Componentes estruturais das nanopartículas: No presente exemplo, ginja madura foi usada como o tecido da planta para a preparação das nanopartículas e nanofibras. As macromoléculas presentes nas frutas maduras são principalmente carboidratos, como celulose, hemiceluloses, pectina e glicoproteínas associadas à parede celular (Negi e Handa, 2008). Há muito pouca proteína solúvel nas frutas maduras. Em frutas como a cereja, os ácidos orgânicos são as principais moléculas de armazenamento, que são convertidas em açúcares durante o amadurecimento. O amido, que é o principal componente de armazenamento, existe como estruturas de alta massa molecular e está ausente nos frutos maduros. A biossíntese dos polifenóis aumenta durante o processo de amadurecimento com o acúmulo de polifenóis nos vacúolos conferindo cor vermelha aos frutos.
[0548] Portanto, as nanopartículas de ginja podem ser constituídas por carboidratos da parede celular (carboidratos estruturais) e proteínas como principais componentes estruturais. Nesse caso, foi hipotetizado que as nanopartículas podem ser submetidas à digestão enzimática usando enzimas pectinolíticas e celulolíticas, bem como proteases, e a estabilidade avaliada por
118 /209 meio de exame estrutural para aprender mais sobre a organização estrutural.
O efeito do tratamento com pectinase (poligalacturonase,  1-4-glicosidase) na estabilidade das nanopartículas é mostrado na Figura 3A e uma região ampliada é mostrada em 3B.
Depois de serem submetidas à digestão com pectinase (1 unidade/ml), as nanopartículas foram totalmente desmontadas em pequenas estruturas tubulares/vesiculares intercaladas em uma matriz densa de elétrons potencialmente formada pela ligação de íons de urânio a moléculas carregadas negativamente de ácido galacturônico na pectina (Negi e Handa, 2008 ) É interessante notar que essas estruturas digeridas se assemelhavam às nanovesículas observadas no suco de uva comercial Concord (Jacob e Paliyath, 2008). Os homogenatos de frutas são tipicamente tratados com pectinase para obter maior rendimento de suco durante o processamento industrial.
Esta observação sugere que as nanopartículas contêm um alto nível de oligômeros de carboidratos derivados da pectina.
As nanopartículas também foram tratadas com celulase (-1,4-glucanase, 1 unidade/ml) e as modificações estruturais resultantes estudadas.
Em contraste com a digestão com pectinase, o tratamento com celulase resultou na formação de vesículas e agregados vesiculares muito maiores (Figura 3C e 3D, setas). Como a celulase não pode digerir a pectina, as estruturas que sobraram após a digestão podem ser feitas de pectina, potencialmente o núcleo das nanopartículas.
Portanto, as porções de celulose podem formar a parte da estrutura filamentosa que envolve o núcleo de pectina das nanopartículas.
As nanopartículas também foram submetidas à incubação na presença de tripsina (1 unidade/ml), que novamente digeriu a estrutura filamentosa externa das nanopartículas deixando um núcleo feito de pectina (Figura 4A). Estas estruturas também se assemelhavam à estrutura de casca vazia observada após o tratamento com celulase, indicando que a estrutura filamentosa externa das nanopartículas continham porções de celulose e polipeptídeos (isto é, material proteico). Uma vista ampliada da estrutura da casca após a remoção das estruturas de fibra externas por tratamento com tripsina é mostrada na Figura 4B.
Estruturas intermediárias formadas durante a digestão com tripsina são mostradas nas Figuras 4C, 4D e 4E.
A Figura 4C mostra uma nanopartícula rodeada por anéis concêntricos de estruturas semelhantes à fibras (isto é, organização de fibras em torno do núcleo de pectina) que estão sendo liberadas como resultado do tratamento com tripsina.
119 /209 A Figura 4D mostra uma casca da nanopartícula junto com as fibras que são retiradas do complexo. A Figura 4E mostra a subestrutura dos materiais fibrosos constituídos por longas estruturas fibrilares que são mescladas e tecidas em uma estrutura semelhante a uma corda, mostrando o potencial das fibras para formar grandes entidades tecidas. Essas estruturas semelhantes a fibras são longas, atingindo micrômetros de comprimento, mas com um diâmetro de cerca de 2 a cerca de 3 nm. A resiliência das nanopartículas aos tratamentos químicos pode advir dessa complexidade estrutural que estabiliza a estrutura por meio de interações de diferentes tipos de macromoléculas.
[0549] Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) de pó de nanopartículas secas: As nanopartículas foram liofilizadas e, após a remoção da água, um pó amorfo foi obtido. O exame deste pó por SEM revelou aspectos estruturais potencialmente indicativos de estágios transitórios resultando na formação de nanopartículas. A distribuição de tamanho das nanopartículas é mostrada na Figura 5. Na forma seca, os diâmetros desses complexos variaram de <200 nm a mais de um micrômetro de diâmetro. Isso é quase dez vezes maior do que o observado nas nanopartículas hidratadas em suspensão (Figura 1 A), onde a variação de tamanho foi de cerca de 25 nm a cerca de 50 nm. Isso sugere que, durante a desidratação lenta, a água ligada às nanopartículas é removida, levando a uma expansão do complexo. A reidratação do pó por suspensão em água resultou na sua reversão para pequenas nanopartículas (dados não mostrados). Além das estruturas esféricas, também foram observadas estruturas tubulares no pó liofilizado (Figura 5, seta). Variações estruturais no pó liofilizado podem ainda ser vistas na Figura 6, que mostra a heterogeneidade das estruturas transitórias na forma de folhas (seta 1), filamentos (seta 2), tubos (seta 3) e vesículas, todos os quais podem ser vistos em um estado misturado. Uma região que mostra o brotamento de vesículas de estruturas tubulares é mostrada pela seta 4. Assim, em termos de sua origem, parece que as folhas tendem a formar estruturas tubulares, que podem brotar estruturas vesiculares, que ficam revestidas por oligômeros-polipeptídeos pécticos / celulósicos e outras pequenas moléculas como polifenóis e ácido málico durante a formação de nanopartículas.
[0550] Nanofibras de cereja branqueada: Como os polifenóis estavam fortemente ligados às nanopartículas e eram difíceis de remover por extração com solvente (álcool, DMSO, ácidos), foram feitas tentativas de remover os
120 /209 polifenóis dos frutos pelo etanol antes da geração das nanopartículas. Os frutos foram imersos em etanol 50% por 48 horas com 3 trocas de solvente, o que resultou na remoção dos polifenóis, deixando os frutos cereja com uma cor esbranquiçada. De forma geral, o mesmo procedimento para a preparação das nanopartículas foi então realizado. A remoção dos polifenóis resultou em uma mudança estrutural total do que foi observado para as nanopartículas. O exame do pó liofilizado mostrou filamentos estendidos ou estruturas filamentosas (nanofibras) intercaladas com filmes que eram nanômetros (2-3 nm) de diâmetro que se estendiam por micrômetros de comprimento (Figura 7A). No estado aquoso, as nanofibras retiveram sua morfologia com micrômetros de comprimento e cerca de 5 a cerca de 10 nm de diâmetro (Figura 7B, seta 1). Esses filamentos também mostraram regiões com uma estrutura helicoidal (Figura 7B, seta 2) sugerindo que estas podem ter sido potencialmente originadas das estruturas semelhantes a fibras espirais que revestem as nanopartículas, que aparecem como fibras esticadas após o tratamento (Figura 4E) com tripsina. Assim, parece que os polifenóis têm um papel importante na determinação da organização estrutural das nanopartículas, e essas interações também podem envolver a associação com polipeptídeos.
[0551] Os polifenóis são conhecidos por interagir com proteínas (Dangles e Dufour, 2006). Funcionalmente, sabe-se que a pectina da maçã interage com os polifenóis e aumenta os efeitos benéficos na fermentação do cólon e na remoção de lipídios do corpo (Aprikian et ak, 2003). Estruturalmente, os polifenóis são conhecidos por interagirem com a pectina e a celulose por meio de ligações iônicas e de hidrogênio (Padayachee et ak, 2012). Os polifenóis interagiram com os componentes da celulose e da pectina em um processo bifásico com ligação de até 18%. Compósitos de pectina de celulose mostraram a maior ligação. Assim, uma combinação de polipeptídeos, oligômeros pécticos/celulósicos pode, assim, fornecer um ambiente altamente favorável para a ligação do polifenol, que mesmo após a remoção dos polifenóis ainda retém a estrutura polipeptídeo-pectina-celulose, montado em nanofibras.
[0552] Estabilidade das nanopartículas aos detergentes: A estabilidade das nanopartículas foi examinada posteriormente pelo tratamento do extrato eialisado com detergentes como Trition X-100 e desoxicolato de sódio, que podem romper as estruturas macromoleculares. Quando o extrato dialisado
121 /209 contendo nanopartículas foi incubado com concentrações crescentes desses detergentes, os níveis de polifenol associados às nanopartículas permaneceram quase constantes quando medidos a 520 nm, a característica máxima de absorção para a porção benzopirano das antocianinas (Figura 8). Resultados semelhantes também foram obtidos com desoxicolato de sódio. Quando medido a 260 nm, mostra um aumento, potencialmente indicando a formação de micelas acima da concentração micelar crítica de Triton X-100 que aprisiona polifenóis. Esses resultados também sugerem a ausência de lipídios entre os componentes estruturais das nanopartículas. Composição Química de Nanopartículas e Comparação com Nanofibras:
[0553] Natureza ácida das nanopartículas: as nanopartículas foram altamente estáveis tanto em solução aquosa quanto em pó seco. Durante a cromatografia de exclusão de tamanho de nanopartículas, os polifenóis ligados às nanopartículas foram eluídos no volume vazio, mostrando uma absorção máxima em 520 nm, que é característica dos polifenóis, e um pH de 3. A eluição dos polifenóis livres presentes na solução foi retardada, e o eluato apareceu cinza azulado e apresentou um pH próximo a 7, no qual, a clivagem do anel benzopirano das antocianinas ocorreu com uma perda associada de cor vermelha. Após extensa diálise do extrato de ginja que teria removido os ácidos orgânicos livres nas moléculas do suco, o extrato dialisado ainda apresentava um pH próximo a 3, o que sugeria que pode haver componentes ácidos (ácidos orgânicos) ligados às nanopartículas como componentes estruturais, além das porções oligogalcturônicas de homogalacturonanos (pH 3). Para identificar tais componentes, nanopartículas e nanofibras foram secas e derivados de trimetilsilila preparados e os derivados submetidos à análise por GC-MS. Os resultados são mostrados na Figura 9. O painel superior em (A) mostra o padrão de eluição dos ácidos orgânicos padrão. (B) e (C) mostram os perfis de eluição de compostos das nanopartículas e nanofibras, respectivamente. Tanto as nanopartículas quanto as nanofibras mostraram a presença clara de ácido málico que foi eluído em 13,7 minutos (espectro de massa, derivado de trimetilsilila). O ácido málico é o principal ácido orgânico presente nas frutas de ginja. Por ser um hidroxil-ácido, o ácido málico pode formar ligações de hidrogênio para estabilizar associações moleculares entre componentes das nanopartículas e nanofibras. Os picos eluindo entre 20-25 minutos são de
122 /209 açúcares derivatizados ou oligossacarídeos. O painel inferior da Figura 9 mostra o espectro de massa do derivado trimetilsililico de ácido málico de referência.
[0554] Análise SDS-PAGE de polipeptídeos de ginja: A quantidade de proteínas nas frutas em geral é relativamente baixa e a degradação das proteínas ocorre durante o amadurecimento pela ativação de proteases. A presença de proteínas nas nanopartículas foi confirmada por sua suscetibilidade à tripsina. Proteínas nas frutas e homogenatos foram isolados com TRIzol™, um reagente universal ideal para extração de ácidos nucléicos e proteínas em frutas (Tiwari e Paliyath, 2011). Nessas condições, onde a atividade da protease é inibida (como na presença de fenol, isotiocianato de guanidínio), a degradação das proteínas foi mínima e as proteínas existiam na fase orgânica após a adição de água que resultou na separação de fases do extrato de TRIzol. As proteínas na fruta original, homogenato, e o grânulo do homogenato centrifugado foram submetidos à extração de trizol e a fase orgânica (clorofórmio:fenol) que normalmente contém as proteínas analisadas por SDS-PAGE. Os resultados são mostrados na Figura 11. Uma separação clara de bandas de proteína pode ser vista (ver Figura 11, faixas 2, 3, 4) no gel, que representa as proteínas na fruta (faixa 2), proteínas no homogenato aquoso total (faixa 3) e o grânulo obtido após a centrifugação do homogenato (faixa 4). No entanto, após a extração com trizol do sobrenadante do homogenato de fruta obtido após a centrifugação, a fase orgânica estava quase desprovida de proteínas e continha principalmente peptídeos de baixa massa molecular (25 kD) (faixa 5). O pó liofilizado do extrato dialisado, quando analisado diretamente sem extração de TRIzol, não mostrou bandas discretas de proteínas como na fruta, ou seu homogenato, mas mostrou um esfregaço (faixa 6) de polipeptídeos quando visualizado após SDS-PAGE e coloração com azul de coomassie. No entanto, após a extração com TRIzol do pó do extrato dialisado, a fase orgânica não mostrou coloração com azul brilhante de Coomassie, sugerindo que as proteínas/peptídeos podem ter migrado para a fase aquosa devido à hidrofilicidade aumentada devido à associação com carboidratos e polifenóis (faixa 7).
[0555] Análise SDS-PAGE de polipeptídeos em nanopartículas: Uma vez que as nanopartículas eram constituídas por polipeptídeos de várias massas moleculares (Figura 11, faixa 6), análises adicionais foram conduzidas para delinear a natureza de sua associação com outros componentes, como
123 /209 carboidratos e componentes de polifenol.
Se esses componentes estruturais estivessem fortemente associados na nanopartícula, foi hipotetizado que eles deveriam co-migrar durante o SDS-PAGE.
As ginjas foram extraídas em água ou em tampão (citrato de potássio, 300 mM, pH 6, o pH final após a homogeneização foi pH 5) e dialisadas contra água ou tampão.
Os extratos dialisados foram liofilizados e o pó ressuspenso no tampão de amostra.
Quantidades equivalentes (15 g) de proteína (ressuspensas em 15% de glicerol em água) foram carregadas no gel e submetidas a SDS-PAGE.
Após a eletroforese, o gel foi removido e incubado em ácido acético a 10% (v/v) em água.
O painel A (Figura 12) mostra o gel após a separação dos peptídeos e antes da coloração com azul brilhante de Coomassie para revelar o rastro de cor rosa nas faixas devido à presença de polifenóis.
O painel B mostra o mesmo gel que foi corado com azul brilhante de Coomassie para revelar polipeptídeos.
A faixa 2 mostra o padrão de coloração do pó de extrato dialisado.
Uma comparação da faixa 2 no painel A e B revela a semelhança na migração de peptídeos (faixa 2, painel B) com a dos polifenóis (faixa 2, painel A), sugerindo que os polifenóis estão fortemente ligados aos polipeptídeos nas nanopartículas.
Os polifenóis são moléculas pequenas e sem carga comparadas aos peptídeos, e serão eluídas do gel se não forem complexadas.
O pó de extrato dialisado contendo nanopartículas (obtido do extrato de água) foi submetido à extração de trizol e separação de fases, e a faixa 3 (painel A, B) correspondente à fração de sobrenadante aquoso mostra a presença de polipeptídeos e polifenóis indicando sua forte associação.
Essa propriedade também revelou a natureza hidrofílica dos complexos de peptídeo-carboidrato-polifenol, porque, na ausência de formação de complexo, os polipeptídeos por si próprios teriam se particionado na fase orgânica do extrato de TRIzol (fenol:clorofórmio). No entanto, como mostrado anteriormente (Figura 11, faixa 7), a fase orgânica do extrato de trizol das nanopartículas não possuía nenhum polipeptídeo.
A associação de peptídeos e polifenóis também é clara no pó de extrato de tampão dialisado (Figura 12, faixa 4). As faixas 5, 6 e 7 correspondem ao sobrenadante aquoso, interfase e fase orgânica do pó do extrato do tampão dialisado obtido após a extração do TRIzol.
Os polipeptídeos que são normalmente retidos na fase clorofórmio:fenol, migraram para a fase aquosa (Faixa 5), onde a maior parte dos polipeptídeos e polifenóis pode ser visualizada.
A interfase mostra a presença
124 /209 de polipeptídeos, mas muito pouco dos polifenóis (Faixa 6, painel B, A). A faixa 7 correspondente à fase orgânica não mostra a presença de antocianina nem do peptideo. As faixas 8, 9 e 10 correspondem ao sobrenadante, à interfase e à fase orgânica obtidos após a extração com TRIzol do pó do extrato dialisado de cerejas branqueadas com etanol, onde a maioria dos polifenóis foi removida. Embora a remoção de polifenóis leve a uma transição estrutural de nanopartículas de nanofibras de estrutura esférica para filamentosa, os polipeptídeos ainda são parte integrante das nanofibras (faixa 8, painel B). A interfase e a fase orgânica do extrato dialisado de cereja branqueada mostraram coloração mínima para os peptídeos (faixas 9, 10; painel B).
[0556] Composição de carboidratos de nanopartículas e nanofilamentos: A natureza da pectina dos carboidratos e sua associação com polipeptídeos nas nanopartículas foi revelada pela semelhança na coloração com iodeto de propídio e azul brilhante de coomassie após SDS-PAGE. Foi relatado que o iodeto de propídio é uma mancha para o ácido péctico (Rounds et al., 2011). O painel C (Figura 12) mostra o padrão de coloração de nanopartículas com iodeto de propídio (10 micromolar em água). O painel inferior (D) mostra um gel correspondente corado com azul brilhante de Coomassie. A faixa 1 corresponde a uma amostra padrão de pectina comercialmente disponível, que mostra coloração mínima com iodeto de propídio. A coloração da pectina com iodeto de propídio é devida à presença de grupos de ácido carboxílico livres carregados negativamente. Se os grupos de ácido carboxílico forem bloqueados por metilação, como ocorre naturalmente em algumas amostras de pectina, a coloração será reduzida. A faixa 2 mostra o padrão de migração de componentes no pó liofilizado do extrato dialisado dissolvido em glicerol a 15%, mostrando a distribuição de pectina em nanopartículas (Painel A) e polipeptídeos (Painel B). A faixa 3 corresponde à fração pectina/polifenol/peptídeo obtida após a liofilização da fração dialisada, e esta fração apresenta coloração relativamente mais intensa para polipeptídeos. A faixa 4 corresponde a um padrão de ácido poligalacturônico que mostra coloração com iodeto de propídio, e não para polipeptídeos. O grânulo gelatinoso de homogenato de ginja também mostra a presença de pectina e polipeptídeos (faixa 5).
125 /209
[0557] Uma análise posterior da natureza química das nanopartículas foi conduzida por análise de Western blot (Figura 13). Frutos de ginja foram extraídos em água, antes e após o branqueamento em etanol (remoção de polifenóis) e nanopartículas e nanofibras isoladas por diálise contra água. Os extratos dialisados foram liofilizados e os complexos dissolvidos em glicerol:água e submetidos a SDS-PAGE e imunolocalização com anticorpos monoclonais específicos de estrutura (IgM de rato) produzidos contra homogalacturonano (um 20 mer de ácido -1,4-galacturônico com unidades metiladas intervenientes que formam um estrutura principal da pectina), extensão (a principal glicoproteína da parede celular) e arabinogalactano-proteína (uma importante proteína ligada à pectina). Os anticorpos ligados foram detectados com IgG de cabra anti-rato conjugado com fosfatase alcalina. O painel A mostra a coloração de nanofibras/nanopartículas de cereja branqueada (faixa 2; nanofibras) e cereja não branqueada (faixa 3; nanopartículas), respectivamente, por azul brilhante de coomassie. A coloração com azul brilhante Coomassie é consideravelmente reduzida após a extração de polifenóis com etanol, sugerindo perda potencial de polipeptídeos juntamente com polifenóis (faixa 2). Isso também pode ser devido à menor penetração do gel pelas nanofibras da cereja branqueada. O painel B mostra a reatividade de anticorpos produzidos contra homogalacturonano contra nanofibras/nanopartículas de cereja branqueada (Painel B, faixa 2) e aqueles de cereja não branqueada (faixa 3). Curiosamente, a reatividade para homogalacturonan foi mais intensa em nanofibras de cereja branqueada em comparação com nanopartículas de cereja não branqueada (Painel B, faixa 3). Isso é novamente refletido na intensidade de dot blots mostrado abaixo do painel B. Isso pode potencialmente refletir as diferenças na acessibilidade de frações homogalacturonano pelos anticorpos nas nanopartículas/nanofibras. Uma diferença chave entre as nanopartículas de cereja não branqueada para nanofibras de cereja branqueada é a presença de polifenóis. Pela remoção de polifenóis por meio do branqueamento, as porções homogalacturonana podem ficar expostas em maior extensão, o que pode levar ao aumento da reatividade ao anticorpo. Além disso, esses resultados demonstram que os polifenóis são parte integrante das nanopartículas de cereja não branqueada, enquanto sua remoção pode levar a transformações estruturais. A incubação de nanofibras filamentosas com polifenóis de cereja não reverteu a transformação da forma
126 /209 filamentosa para a esférica (dados não mostrados), no entanto, ambas as formas são estruturalmente estáveis. Tanto as nanopartículas quanto as nanofibras mostraram uma reatividade moderada em relação à anti-extensina, um anticorpo produzido contra a principal proteína da parede celular das frutas (Painel C). Os dot blots contra anti-extensina também mostraram reatividade mínima. No entanto, uma reação muito forte foi observada contra a proteína anti- arabinogalactan (pectina-proteína) por ambos os tipos de nanopartículas/nanofibras, sugerindo que este pode ser um componente importante da estrutura básica das nanopartículas/nanofibras (Painel D, faixas 2, 3; manchas de pontos). Western blots contra anti-xiloglucano não mostraram qualquer reatividade cruzada nos géis, mas mostraram forte reação contra nanofibras (painel inferior, Painel A, formando agregados filamentosos. Parece que os polipeptídeos são retirados das nanopartículas e nanofibras durante a solubilização por SDS, mas os carboidratos podem permanecer como agregados, que não entram efetivamente no gel devido ao grande tamanho e à falta de carga.
[0558] A análise qualitativa da composição de carboidratos das nanopartículas e nanofibras foi realizada após digestão com ácido trifluoroacético (8,6M) e trimetilsililação dos açúcares liberados usando BSTFA:TMCS (Sigma, 99:1). Um perfil qualitativo de açúcares separados e identificados por GC-MS é mostrado na Figura 10 (painel superior), juntamente com os açúcares comuns como padrões (painel inferior). Existem semelhanças, bem como diferenças na composição do açúcar das nanopartículas (azul; marcado como nano-complexo) e nanofibras (vermelho; marcado como nano- filamento). Glicose, galactose/ácido galacturônico e manose foram os principais componentes das nanopartículas, com quantidades relativamente baixas de arabinose. Os açúcares das nanofibras foram enriquecidos em arabinose, com menor quantidade de galactose/ácido galacturônico e glicose. Pode haver outros açúcares presentes nas nanopartículas e nanofibras que não são identificados, e alguns dos picos também podem ser originados de açúcares que foram modificados durante a digestão do TFA. Os resultados sugerem que durante a formação de nanofibras, vários oligômeros enriquecidos em glicose, galactose/ácido galacturônico e manose podem ser removidos, deixando
127 /209 principalmente nanofibras enriquecidas com oligômeros de arabinose, ainda derivados de arabinogalactanos de pectina.
[0559] Identificação de peptídeos derivados de proteínas relacionadas à patogênese em nanofibras: Durante a análise de SDS-PAGE, a ocorrência de peptídeos de várias massas moleculares pode ser detectada em nanopartículas e nanofibras, originados pela ação da atividade de protease nativa durante a homogeneização de cerejas (Figura 14, Painel A; faixas 2, 3; géis A, B). Entre estes, pelo menos duas bandas eram distintas em nanofibras (faixa 3; B) com massas moleculares relativas de 40kD e 20kD (marcado 1, 3, Figura 14; Painel A). Uma banda polipeptídica com intensidade ligeiramente mais forte e uma massa molecular de cerca de 40 kD (marcada 2, gel B) também foi observada. No gel não corado, estes 3 polipeptídeos foram encontrados estar associados com polifenóis (cor roxa) (gel A, faixa 2). Essas bandas foram dissecadas e submetidas a impressão digital do peptídeo após digestão com tripsina e LC-MS/MS. As sequências dos principais péptidos identificados são apresentadas na Figura 14 (Painel B e C). A banda 1 com ~40kD de massa molecular na faixa 3 (Nanofibra) mostrou similaridade de sequência com a proteína PR Glucan endo-1,3-beta-glucosidase (Nº de Acesso P50694) de Cereja (Painel B). As sequências identificadas por LC-MS-MS (indicadas como fragmentos destacados e sequências deduzidas do banco de genes correspondiam a um peptídeo de 246 aminoácidos da proteína. A segunda banda em ~20kD na faixa 3 (nanofibras), mostrou similaridade de sequência com outra proteína PR (principal alérgeno cereja Pru a1 (Nº de Acesso 024248) com um total de 161 aminoácidos no polipeptídeo (Painel B). A banda de 40kD em nanopartículas correspondente à banda 1 em nanofibras não produziu produtos hidrolíticos, potencialmente devido à interferência de polifenóis ligados. Estes fragmentos de peptídeos identificados são uma pequena fração de todos os polipeptídeos separados no gel. Isso sugere potencialmente as altas atividades de proteases que resultam na geração de peptídeos que podem formar componentes integrais de nanopartículas e nanofibras.
[0560] Análise FT-IR das nanopartículas: o espectro FT-IR do pó de nanopartículas/nanofibras de frutos cereja não branqueados e branqueados revelou espectros complexos, com alto grau de similaridade entre si e com semelhança com estruturas macromoleculares, como proteína e polissacarídeos
128 /209 de parede celular (Figura 15; nano-complexo = nanopartícula, nano-filamento = nanofibra). A figura também mostra os espectros de ácido poligalacturônico (PGA) (homogalacturonano, pectina) e albumina (BSA). As principais bandas de absorção das nanopartículas foram observadas como uma banda larga entre 3000 nm a 3600 nm, entre 2600 nm a 3000 nm, e vários picos na região da impressão digital entre 1750 nm a 800 nm.
Devido à natureza macromolecular das nanopartículas, os picos de absorção característicos de grupos funcionais individuais ou características estruturais se fundem.
Comparando as características espectrais de polipeptídeos, pectina e polifenóis, várias características estruturais das nanopartículas podem ser elucidadas.
A proporção de componentes como proteínas (> 10%), carboidratos (~70%) e a presença de polifenóis (~10-15%) nas nanopartículas também podem influenciar os picos e formas dos picos, revelando uma dominância geral dos picos característico dos carboidratos.
A análise FT-IR dos componentes dos carboidratos da parede celular mostrou aspectos característicos da celulose, hemicelulose e pectina (Kacurakova et al, 2000; Urias-Orona, 2010). Na maturação dos frutos, o aumento da atividade das enzimas celulolíticas e pectinolíticas resulta no catabolismo dos componentes da parede celular levando a oligômeros de pequena massa molecular com ligações características.
Entre estas, as pectinas são moléculas complexas com ácido galacturônico ligado em -1,4 com regiões em cabeleira (hairy regions) intermitentes (ou seja, em forma de cerdas) compostas por ramnogalacturonanos, galactanos, arabinanos e arabinogalactanos (Negi e Handa, 2008). Xiloglucanos, xilanos, glucomananos e galactomananos são os componentes hemicelulósicos da parede celular.
Assim, durante a homogeneização dos frutos, qualquer um desses componentes pode se integrar às nanopartículas.
Os estudos de Western blot mostraram a presença de homogalacturonan e arabinogalactan nas nanopartículas, sugerindo o envolvimento predominante da pectina em sua formação.
Os espectros de FT-IR de ambos os tipos de nanopartículas/nanofibras de cereja mostram intensa absorção na região de carboidratos abrangendo 900 cm-1 e 1200 cm-1. Nanofibras de cereja branqueada apresentam um pico agudo em ~1017 cm-1, o que é característico da pectina com uma alta proporção de homogalacturonana (Kacurakova et al., 2000). O ombro entre 1045 cm-1 e 1074
129 /209 cm-1 pode originar-se dos arabinogalactanos -ligados. A absorção de rhamnogalacturonans, bem como hemiceluloses ocorre nesta ampla região.
[0561] Enquanto a absorção na região do carboidrato se origina principalmente das ligações glicosídicas (C-O-C), a região anomérica fornece informações sobre o tipo de ligações entre as porções de açúcar. As ligações- são caracterizadas por uma banda de absorção em 834 cm-1 e as ligações- por banda em 898 cm-1. Ambos os tipos de nanopartículas mostram uma absorção ampla máxima em ~834 nm, sugerindo que os carboidratos dos complexos possuem predominantemente uma ligação do tipo , como comum na pectina, sugerindo novamente que os carboidratos nas nanopartículas são principalmente de origem da pectina (Figura 15).
[0562] As bandas largas observadas entre ~1550 cm-1 e ~1800 cm-1 são características da pectina, conforme observado em outros tecidos vegetais (McCann et al., 1994). Em geral, o padrão espectral FT-IR da pectina isolada de células de tabaco entre 900 cm-1 e 1800 cm-1 incluindo a região da impressão digital é quase idêntico ao observado para as nanopartículas. Dois principais elementos estruturais da pectina são as ligações éster (1740 cm-1) e os grupos de ácido carboxílico (1600 e 1414 cm-1). O pico largo em 1740 cm-1 é distinto em ambos os tipos de nanopartículas, indicando a presença de pectinas esterificadas, com intensidade ligeiramente menor nas nanopartículas de cerejas branqueadas (Figura 15).
[0562] As bandas de absorção de proteínas nas nanopartículas são provavelmente mascaradas em grande parte pelas decorrentes da pectina (Gorinstein et ah, 2009). No entanto, certas características da estrutura secundária podem ser observadas nesses espectros. Os espectros de FT-IR de proteínas são caracterizados por absorções específicas de amida, denominadas bandas amida A, B e amida I a VII. As bandas Amida A (~3500 cm-1) e Amida B (~3100 cm-1) decorrentes do alongamento -NH são potencialmente sobrepostas com o alongamento -OH de hidroxilas de carboidratos (3400 cm-1) formando um pico largo entre 3600 cm-1 e 3000 cm-1 no espectro de nanopartículas. A absorção de amidas I e II surge de vibrações de alongamento dos grupos -C=0 e -C-N (1600-1700 cm-1) que se sobrepõem à absorção de éster de pectinas e alongamento de NH (1510-1580 cm-1), respectivamente. A absorção da amida I
130 /209 é característica da estrutura principal, principalmente folha-beta que absorve a ~1629 cm-1. As glicoproteínas da parede celular, como a extensão, têm um componente maior de folhas , no entanto, a análise Western usando anticorpos de extensão não mostrou uma prevalência de extensina nas nanopartículas (Figura 13). No entanto, uma reatividade altamente positiva para anticorpos criados contra a proteína arabinogalactan foi observada em ambos os tipos de nanopartículas e nanofibras. Isso pode sugerir que as proteínas ligadas a arabinogalactana que são anfifílicas por natureza (Seifert e Roberts, 2007) podem fornecer os componentes de carboidrato-polipeptídeo para as nanopartículas (Figura 15).
[0562] Os polifenóis são parte integrante das nanopartículas. A quantidade relativa de polifenóis está na faixa de 12-15% nas nanopartículas. O espectro FT-IR de nanopartículas contendo polifenóis e as nanofibras isoladas de cerejas branqueadas desprovidas de polifenóis não apresentaram grandes diferenças. Os polifenóis mostram espectros característicos na forma pura, com maior absorvância na região do carboidrato, estiramento -C=H (~2850-3000 cm-1) e estiramento de hidroxila de hidroxilas de polifenóis e os grupos hidroxila do açúcar (livre 3200-3600 cm-1) (David et al, 2009). Uma vez que a quantidade relativa de polifenóis é baixa, a absorção do grupo funcional polifenol é difícil de decifrar daquela dos carboidratos e da proteína (Figura 15).
[0563] Difração de raios-X de nanopartículas: A prevalência de pectina em frutas pode potencialmente dar origem a nanopartículas por meio de transições estruturais, conforme mostrado neste Exemplo. Como as nanopartículas são altamente suscetíveis ao tratamento com pectinase e sofrem dissolução organizacional completa, parece que a pectina é um componente predominante das nanopartículas. A pectina pode formar géis que dependem do grau de metoxilação e da presença de açúcares e baixo pH, e íons divalentes como o cálcio (Fu e Rao, 2001; Strom et al., 2007). Os beta-1,4-glucanos, como a celulose, ocorrem como entidades cristalinas, mas também podem existir em um estado amorfo. A suscetibilidade das nanopartículas ao tratamento de celulose sugere que os componentes que possuem ligações -1,4-glicosídicas também fazem parte da estrutura das nanopartículas e podem incluir celulose amorfa e/ou componentes hemicelulósicos (xiloglucanos) que ligam microfibrilas de celulose. Estudos anteriores sobre xiloglucanos de sementes de tamarindo
131 /209 mostraram que os xiloglucanos podem ser mascarados pela pectina e a dissolução da pectina expõe o xiloglucano (Marcus et al., 2008). Portanto, a presença simultânea de pectina e celulose nas nanopartículas é um evento provável. A difração de raios-X da celulose cristalina mostra picos agudos centrados em um ângulo de difração (2) a 22,5°, enquanto a da celulose amorfa mostra um pico largo característico a 20,7° (Park et al., 2010). A difração de raios-X do pó das nanopartículas (Figura 16) mostra um pico centrado em torno de 20°, sugerindo a presença de celulose amorfa nas nanopartículas. O difractograma do pó de dialisado mostra um pico muito mais amplo centrado em 20°, pois pode conter vários tipos de componentes de carboidratos. O padrão de difração de raios X das nanopartículas e do dialisado também são semelhantes aos dos compósitos de gelatina-pectina (Sharma et al, 2011). À medida que a fruta amadurece, as atividades da celulase e da pectinase aumentam, levando à dissolução dos componentes da parede celular, potencialmente liberando vários tipos de polímeros da parede celular que podem ser integrados às nanopartículas. Assim, parece que as nanopartículas se originam de componentes de pectina, como ácido poligalacturônico contendo grupos carboxi livres e esterificados, arabinogalactanos, xiloglucanos, celulose amorfa, etc. A montagem posterior com peptídeos e polifenóis durante o processo de extração pode resultar na automontagem desses componentes para formar as nanopartículas.
[0564] Modelo proposto para organização estrutural de nanopartículas esféricas: A organização das macromoléculas e dos polifenóis para formar as nanopartículas pode ser elucidada a partir de vários resultados. A micrografia eletrônica de uma única nanopartícula da fração dialisada de cereja não branqueada é mostrada na Figura 17 A. Embora a maioria das nanopartículas estejam na faixa de tamanho de cerca de 25 a cerca de 50 nm de diâmetro e sejam estruturas esféricas muito estáveis, ocasionalmente grandes complexos são formados com mais de 100 nm de diâmetro. É provável que o tamanho maior torne esses complexos estruturalmente menos estáveis em comparação com as nanopartículas menores. As grandes nanopartículas que parecem esféricas em condições normais colapsam, revelando detalhes estruturais ocasionalmente. Na micrografia, a área recolhida é mostrada no centro (seta 1; Painel A, Figura 17). Esta observação é consistente com os
132 /209 resultados obtidos após o tratamento com enzimas (tripsina, celulase), em que as nanopartículas são retiradas de suas estruturas externas, revelando um núcleo de pectina esférico e flexível. O núcleo é provavelmente formado por frações de homogalacturonano e não exposto, uma vez que a nanopartícula não apresenta reatividade cruzada com anticorpos criados contra homogalacturonano. A estrutura colapsada sugere que o interior do núcleo pode ser oco. O núcleo é circundado por filamentos montados em uma organização espiral (Figura 17, Painel A, seta 2) constituída por homogalacturonano e proteína, conforme deduzido por sua suscetibilidade à pectinase e tripsina. Os polifenóis podem ter um papel significativo na estabilização da organização helicoidal dos filamentos, uma vez que a remoção dos polifenóis com etanol resulta em uma organização totalmente diferente, desenrolando as estruturas helicoidais em longos filamentos. Esses filamentos mostram forte reatividade aos anticorpos homogalacturonana quando os polifenóis são removidos, o que sugere que os polifenóis podem mascarar as estruturas helicoidais. Externamente aos filamentos espirais que cobrem o núcleo da pectina, parece haver outra camada distinta de fibrilas que parece ser diferente da camada interna de fibrilas (Figura 17, Painel A, seta 3). É provável que a composição desta camada seja diferente daquela da camada interna (seta 2), uma vez que esta pode ser constituída principalmente por arabinogalactanos acoplados a polipeptídeos, já que as nanopartículas de cereja não branqueada apresentam forte reatividade contra anticorpos de proteína arabinogalactana indicando sua localização exterior e melhor acessibilidade aos anticorpos. As proteínas arabinogalactanas também fazem parte das estruturas filamentares isoladas da cereja branqueada. Assim, as nanopartículas isoladas de cereja não branqueada e as nanofibras isoladas de cereja branqueada podem possuir componentes semelhantes, mas estão organizadas como estruturas fisicamente distintas. Uma visão ampliada da nanopartícula (Figura 17, Painel B) mostra as estruturas helicoidais na camada interna da nanopartícula (setas).
[0565] O desenvolvimento de nanomateriais com base em produtos naturais está cada vez mais sendo explorado, uma vez que existem potenciais efeitos citotóxicos emergentes do uso de nanomateriais projetados, como nanopartículas de óxido de ferro, dendrímeros, nanopartículas de ouro e prata, nanotubos de carbono etc., que ainda não foram totalmente avaliados (Maynard,
133 /209 2006). O problema com os nanomateriais projetados é que o corpo humano pode não ter um mecanismo para eliminá-los do sistema. Em estudos de cultura de células, foi observado que a toxicidade dos nanomateriais do tipo fulereno diminui à medida que a hidroxilação da estrutura aumenta (Lewinski et al., 2008). Uma aplicação primária de nanomateriais projetados é em diagnósticos e biomedicina (Kunzmann et al, 2011). Nanopartículas de sílica de 70 nm foram capazes de penetrar na barreira placentária e entrar no feto, enquanto aquelas de 300 nm e 900 nm de tamanho não se acumularam no tecido fetal (Yamashita et al., 2011). Da mesma forma, micelas poliméricas carregadas com droga de 30 nm de diâmetro foram mais eficientes na penetração de tumores com baixa permeabilidade do que micelas de 50 nm, 70 nm ou 100 nm (Cabral et al., 2011). Compreender os mecanismos de absorção, distribuição e eliminação de nanomateriais projetados também pode ajudar a compreender esses mecanismos em nanomateriais de origem biológica.
[0566] Nanomateriais biológicos de diferentes formas e tamanhos têm sido propostos fornecer benefícios na distribuição e retenção de drogas. Nanolipossomos, nanococleados, micelas, filassomas etc., são morfovariantes potenciais de nanoestruturas biológicas com aplicações potenciais em biomedicina (Nishiyama, 2007). Entre estes, micelas poliméricas filamentosas conhecidas como filomicelas que têm 22 a 60 nm de diâmetro e 2-8 m de comprimento, foram observadas permanecer no sangue por mais tempo do que as nanomicelas esféricas (Discher e Eisenberg, 2002). Proteínas como o fibrinogênio circundam as nanopartículas de ouro revestidas com ácido poliacrílico, e isso parece ser uma mudança estrutural que é parte de sua elicitação de inflamação (Deng et al., 2011). Nanopartículas lipídicas sólidas carregadas com daidzeína foram mais eficientes do que a daidzeína sozinha na proteção cardio-cerebrovascular em modelos animais através do aumento da biodisponibilidade e aumento do tempo de circulação (Gao et al., 2008).
[0567] É provável que as nanopartículas sejam absorvidas por mecanismos endocitóticos e, portanto, podem sofrer vários tipos de modificações durante a ligação à superfície celular, internalização, transporte e liberação na célula. Durante a endocitose, as nanopartículas podem se ligar à superfície celular, seguido de internalização por vesiculação da membrana plasmática através de endossomos, fagossomas e macropinossomos. Pode
134 /209 haver diferentes tipos de mecanismos envolvidos nesses processos. As estruturas vesiculares com origem na membrana plasmática podem se tornar corpos multivesiculares e se fundir com os lisossomos. O pH lisossomal é ácido e proporciona uma condição ideal para a degradação das nanopartículas por proteases e hidrolases liberando o conteúdo. A absorção de nanopartículas pelas células depende das características da superfície da célula (Iverson et al., 2011). Nanopartículas com 20 a 50 nm de diâmetro parecem ser absorvidas muito mais do que aquelas maiores ou menores. A captação também pode depender da carga superficial da célula receptora, em geral, nanopartículas carregadas positivamente sendo captadas de forma mais eficiente. As nanoestruturas de ginja podem apresentar ambas as características, sendo carregadas positivamente devido à exposição potencial de grupos amino peptídicos na periferia e ácidos carboxílicos ocultos do ácido poligalacturônico quando na forma de nanopartícula esférica, embora sejam carregadas negativamente como nanofibras com maior abundância de ácidos poligalacturônico (grupos ácidos) expostos ao meio aquoso quase neutro em que estão suspensos. Nanopartículas com frações de poligalacturonato ocultas reagem mal com o anticorpo anti-homogalacturonano. Em comparação, as nanofibras com porções de poligalacturonato altamente expostas reagem muito intensamente contra o anticorpo anti-homogalacturonano, como visto na Figura
13.
[0568] Como uma macromolécula biológica onipresente em plantas, e especialmente abundante em frutas e legumes, as propriedades físico-químicas da pectina foram bem estudadas e sua utilidade potencial na medicina para encapsulação de drogas, distribuição direcionada, desenvolvimento de hidrogéis para aplicações como protetores da pele, tanto isoladamente ou em combinação com proteínas ou moléculas sintéticas, como polivinilpirrolidona, ácido polilático etc., está cada vez mais sendo explorado (Mishra et al., 2012). Uma vantagem dos materiais à base de pectina é que ela tem sido consumida por humanos ao longo da evolução e tem propriedades biológicas confirmadas como uma matriz alimentar para o transporte de materiais encapsulados no cólon, onde os polissacarídeos são digeridos por bactérias probióticas, liberando o conteúdo. A pectina também pode ligar e ajudar a remover o colesterol do sistema gastrointestinal. Sistemas de distribuição baseados em pectina têm sido
135 /209 explorados para entrega de drogas através de raízes múltiplas (Yadav, 2009; Sriamornsak, 2011). A estrutura tridimensional das matrizes de pectina pode ser influenciada pelos grupos de ácido carboxílico livre (homogalacturonanos e ramnogalacturonanos), uma vez que, com base no pH da solução incorporada, as cadeias de pectina podem existir como cadeias aniônicas que podem ser estabilizadas por íons divalentes, como o cálcio adotando várias formas.
Novamente, a proporção de grupos carboxila metilados para carboxilas livres pode influenciar a capacidade da pectina de formar estruturas 3D.
Assim, formulações de pectina, como filmes, hidrogéis, nanoestruturas, etc., têm sido exploradas para múltiplas aplicações médicas.
No entanto, matrizes baseadas exclusivamente em pectina podem ter algumas desvantagens, como baixa resistência mecânica, baixa estabilidade ao cisalhamento, baixa eficácia de carga de droga e liberação prematura da droga.
Por esta razão, alterações químicas e físicas da pectina por mistura ou copolimerização com polímeros biodegradáveis, como quitosana, ácido polilático, amido, gelatina, proteína de soja, -lactoglobulina, albumina de soro humano, etc., podem fornecer uma densidade de carga mais alta (amina primária positiva e grupo carboxila negativo). A produção de nanopartículas de ZnO-pectina variando em tamanho entre 70-200 nm de diâmetro foi alcançada para explorar a possibilidade de aumentar a captação de Zn no segmento da população com deficiência de Zn (Shi e Gunasekaran, 2008). Observou-se que tais moléculas penetram mais profundamente no tecido e são capazes de fornecer uma melhor administração do medicamento.
Nanopartículas tioladas de pectina foram preparadas para uma melhor distribuição ocular de drogas.
SPIONs (nanopartículas à base de ferro superparamagnético) e oxaliplatina foram encapsuladas em Pectina-Ca2+ para formar nanoestruturas esféricas à base de pectina de 100-200 nm de diâmetro com função magnética.
A droga contra o câncer paclitaxel foi conjugada com nanoestruturas de pectina, e o processo foi sugerido como sendo influenciado pela hidrofilicidade da pectina (grupos -OH e -COOH), bem como grupos amida carregados positivamente de asparaginas (Verma et ah, 2011). Também foram feitas tentativas de distribuir várias classes de drogas, como tiazóis com baixa solubilidade, drogas contra o câncer, drogas ativas para neuro e humor e insulina por meio de nanoestruturas à base de pectina (Sharma et ah, 2012).
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[0569] Em contraste com os métodos sintéticos para a produção de nanopartículas à base de pectina, o presente Exemplo indica o potencial do uso de um sistema à base de frutas in vivo para a produção de nanopartículas e nanofibras com características únicas. A fruta serve como uma fábrica independente para a formação de nanopartículas e nanofibras. À medida que a fruta amadurece, processos catabólicos são ativados, o que leva ao amolecimento da fruta e resulta na produção de componentes da parede celular de menor massa molecular, incluindo celulose, pectinas e polipeptídeos derivados de glicoproteínas da parede celular com caráter positivo, negativo e anfifílico, bem como íons de cálcio e baixo pH liberados durante a homogeneização. Uma vez que o tecido é homogeneizado e vários componentes são liberados, observa-se a ocorrência de automontagem de vários componentes. Deve-se notar que, sem influência externa, as nanopartículas formadas neste Exemplo eram substancialmente uniformes em tamanho, forma e características físico-químicas. Frutas com características diferentes, como ginja, mirtilo e uva, todas mostram potencial para essa automontagem dos componentes celulares básicos para formar tipos substancialmente idênticos de nanopartículas.
[0570] Uma característica interessante que se tornou evidente a partir deste Exemplo é o papel das antocianinas e possivelmente do ácido málico na determinação da automontagem dos componentes para formar nanopartículas. Na presença de antocianinas, as nanopartículas são esféricas com um núcleo de pectina central que é entrelaçado com filamentos de polipeptídeo galacturonano-xiloglucano-arabinogalactano. Esses filamentos são de natureza helicoidal na presença de antocianinas e são compostos por estruturas fibrilares. As antocianinas são moléculas anfifílicas e podem servir como estruturas de ponte entre vários componentes. No entanto, uma vez que as antocianinas são removidas, as nanopartículas formam um tipo de filme (estruturas planas da pectina, Figura 7) e estruturas semelhantes a fibras (tipo filomicela), conhecidas como nanofibras. Independentemente de sua forma, as nanopartículas esféricas e as nanofibras foram altamente estáveis e podem ser capazes de se ligar a uma variedade de drogas (Paclitaxel, Vincristina) e/ou minerais com alta eficiência e capacidade de absorção. Em termos de função, as nanopartículas esféricas também podem servir como transportadores de antocianinas para a distribuição
137 /209 direcionada de antocianinas ao cólon, por exemplo, como as antocianinas podem ser protegidas dentro de uma estrutura complexada esférica muito mais em comparação com as antocianinas livres, protegendo-as assim de mudanças de pH durante a transição entre o estômago e o intestino.
[0571] No presente Exemplo, nanopartículas e nanofibras foram preparadas a partir de frutas, e as características físico-químicas e as funcionalidades das nanopartículas e das nanofibras são investigadas e descritas. Essas nanopartículas e nanofibras são únicas em termos de sua enorme área de superfície gerada pela formação de estruturas terciárias a partir de pectina, celulose e proteína, na presença ou ausência de polifenóis. Essas nanopartículas e nanofibras de origem biológica podem fornecer uma alternativa aos nanomateriais projetados em diversas aplicações. Como os componentes de construção foram consumidos por meio de alimentos (sucos, smoothies) e não foram observados efeitos adversos, pode-se sugerir que a eliminação biológica dos componentes estruturais pode ocorrer, assim como qualquer macromolécula alimentar. As nanopartículas e nanofibras são internalizadas por células de mamíferos, indicando seu potencial para serem utilizadas como, por exemplo, sistemas de distribuição de pequenas moléculas, nutrientes, drogas, minerais ou outros agentes/cargas. Apesar de serem derivadas de materiais semelhantes, as nanopartículas e nanofibras apresentam diferenças significativas, conforme descrito em detalhes neste documento. EXEMPLO 2 - Funções e aplicações de nanopartículas Efeito do Tratamento de nanopartículas no Peso Corporal em Camundongos Tipo Selvagem e ETKO Materiais e Métodos:
[0572] Análises In Vivo - Animais e genotipagem - camundongos Pcyt2+/- (também referidos aqui como camundongos ETKO) foram gerados e genotipados conforme descrito anteriormente (Fullerton MD, et al. 2007). O Pcyt2 é um gene responsável pela regulação da produção do fosfolipídeo, fosfatidiletanolamina (PE), importante componente das membranas celulares e organelas. Desativar completamente o gene Pcyt2 (animais nulos) resulta em morte letal embrionária precoce (filhotes morrem antes do nascimento), enquanto os animais heterozigotos (que têm apenas uma cópia do gene) são normais no nascimento e após o nascimento. Os camundongos heterozigotos,
138 /209 entretanto, apresentam um ganho crônico de peso como resultado do metabolismo de fosfolipídios alterado. Há um redirecionamento dos componentes que compõem os fosfolipídios e a maquinaria celular muda a fabricação de PE para triglicerídeo (gordura). Isso significa que os camundongos aumentaram de peso, mais gordura no fígado e no plasma e, em última análise, diminuíram a sensibilidade à insulina (resistência à insulina).
[0573] Camundongos Pcyt2+/- foram cruzados, e a colônia heterozigótica foi mantida na Universidade de Guelph, de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê de Cuidado Animal da Universidade. Os camundongos foram alojados em um ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuridão, tiveram livre acesso a água e foram alimentados com uma dieta de ração padronizada (número de catálogo S-2335; Harlan Teklad). Os camundongos foram divididos em 4 grupos experimentais (n = 3-6/grupos): (i) Tipo selvagem (C57BL/6) - Não tratado (WT-U), (ii) Tipo selvagem (C57BL/6) - Tratado (WT-T), (iii) Pcyt2 Knockout- Não tratado (KO-U), e (iv) Pcyt2 Knockout- Tratado (KO-T). Amostras retiradas para ensaios bioquímicos (soro sanguíneo e tecidos (fígado)) foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C para uso posterior.
[0574] Análise de sangue. Após a morte clínica, o sangue terminal foi coletado do coração. O soro foi separado imediatamente e enviado ao Laboratório de Saúde Animal (Universidade de Guelph; uma instalação credenciada para análise) para análises bioquímicas, como as de Albumina, Globulina, A:G, Proteína total, ALT, AST, Colesterol, CK, Glicose, Fósforo, triglicerídeos e uréia.
[0575] Produtos químicos e reagentes. O kit de triglicerídeo M tipo L foi adquirido na Wako Diagnostics (Osaka, Japão e Neuss, Alemanha). Os anticorpos contra p65 NF-kB e B-Tubulina eram da Santa Cruz Biotechnology e Cell Signaling Technology, respectivamente. O kit RNeasy Plus para isolamento de RNA foi da Qiagen (Valencia, CA, EUA). O kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade para preparação de cDNA foi da Applied Biosystems (Foster city, CA, EUA). Os primers usados estão listados abaixo.
139 /209 Tabela 4: Sequências de Primer usadas para PCT para Estimar os Níveis de Expressão de Genes Particulares após Tratamento com Nanopartículas. F = Forward, R = Reverse.
SEQ ID Tamanho do Primers Sequencia TM (OC) NO: Amplicon (bp) F- 5' AGGTTAAGCTGGCTGTCCTG 3' STAT4 1 62 R- 5'AGATCTCTTGTCTTCTGGTTTGTTG3' 2 150 F- 5' CCGATGGGTTGTACCTTGTC 3' TNF- α 3 60 R- 5' GGGCTGGGTAGAGAATGGAT 3' 4 300 F- 5' CAAGGGTGTTACACTGG 3' IL-6 5 62 R- 5' CTGGTCTCATCCGAACCCTG 3' 6 200 F-5’ CTTCGAGATGTGCTCCCAGCTGC 3’ FAS 11 59 R-5’ CTTAGTGATAAGGTCCACGGAGGC 3’ 12 268 F-5’ CAACGCCACTCACATCTACGG 3’ ATGL 13 57 R-5’ GGACACCTCAATAATGTTGGCAC 3’ 14 106 F-5’ ACGCTACACAAAGGCTGCTT 3’ HSL 15 59 R-5’ TCGTTGCGTTTGTAGTGCTC 3’ 16 125 F-5’ GCTCGCACGAGCGCTCCATT 3’ LPL 17 59 R-5’ CCTCGGGCAGGGTGAAGGGAA 3’ 18 350 PGC1- F- 5' TTGACTGGCGTCATTCGGG 3' 19 59.5 α R- 5' GAAGGACTGGCCTCGTTGTC 3' 20 396 PPAR- F-5’ CGCATGTGAAGGCTGTAAGGGC 3’ 21 57 α R-5’ GTCATCCAGTTCTAAGGCATTG 3’ 22 289 F-5’ CAGAAGTGCCTTGCTGTGGGG 3’ PPAR-Υ 23 57 R-5’ CTTGGCTTTGGTCAGCGGG 3’ 24 157 F-5’ GAACGCTCTGCGAGTGGCTGC 3’ CTL1 25 49 R-5’ TTCTTATGTTCTTGACTGCC 3’ 26 376 F-5’ ATGCACAGAGAGTTCAGCTAAAG 3’ PCYT1 27 50 R-5’ GGGCTTACTAAAGTCAACTTCAA 3’ 28 170
140 /209 F-5’ GAGTGGCTGTCCCTGAAGAC 3’ PSS2 31 59 R-5’ TCGTAGATCTCACGCATGGC 3’ 32 305
[0576] Tratamento de nanopartículas. Os experimentos foram realizados com controles de camundongos Knock out de Pcyt2 e controles de companheiros de ninhada com 24-30 semanas de idade. Grupos não tratados de KO e camundongos de controle (tipo selvagem; n = 3-6 cada) receberam 100uL de água 3 vezes por semana (por gavagem). O grupo de tratamento de KO e camundongo controle (n = 3-6 cada; ~40g de peso médio) foram administrados com 100 mg/kg/4 semanas de equivalente de polifenol da solução de nanopartículas em 100uL de água 3 vezes por semana (133 g de equivalente de polifenol por dose). A gavagem oral para todos os grupos durou 4 semanas. Os testes foram repetidos duas vezes e, no final dos testes, os camundongos foram sacrificados e usados para análises de sangue e tecido.
[0577] Immunoblotting. O NF-kB foi determinado por immunoblotting usando SDS-PAGE 10%, western blotting e detecção da banda por quimioluminescência. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em 1X PBST e incubadas durante a noite a 4°C com anticorpo anti-NF-kB (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Califórnia, EUA). As membranas foram então incubadas com o IgG anti-coelho e visualizadas por quimioluminescência (Sigma-Aldrich). A re-hibridização da membrana com -Tubulina foi realizada para verificar a precisão do carregamento. A densidade das bandas específicas foi quantificada com um densitômetro de imagem (Imagem J).
[0578] Determinação de triglicerídeos hepáticos. O conteúdo de TG do fígado foi medido usando reagentes L-Tipo TG M de acordo com o procedimento do kit (Wako).
[0579] Isolamento de RNA total e Expressão Gênica. O RNA total foi isolado usando o kit RNeasy Plus (Qiagen, Valencia, CA, EUA) e o cDNA foi preparado usando o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems, Foster city, CA, EUA). Os genes de interesse foram analisados na fase exponencial da amplificação por PCR, utilizando a quantidade ideal de cDNA e o número do ciclo da reação. Cada nível de gene é expresso em relação ao controle GAPDH interno. Os genes testados incluem genes pró-inflamatórios
141 /209 (STAT4, TNF- e IL-6) e genes de lipólise (FAS, ATGL, HSL, LPL, PGC1-, PPAR-, PPAR-, CTL1, PCYT1 e PSS2) Os experimentos foram realizados utilizando amostras de fígado coletadas de camundongos Pcyt2 +/- e Pcyt2 +/+, machos e fêmeas. Os produtos da reação foram submetidos à eletroforese e as bandas visualizadas com coloração com brometo de etídio. O software ImageJ
1.46 foi usado para quantificar a densidade de banda e os níveis de genes são expressos como “fold changes” em relação aos controles. Os primers usados estão listados na Tabela acima.
[0580] O NF-kB foi determinado por immunoblotting por SDS-PAGE, western blotting e detecção da banda por quimiluminiscência. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em 1X PBST e incubadas durante a noite a 4°C com anticorpo anti-NF-kB (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Califórnia, EUA). As membranas foram então incubadas com o IgG anti-coelho e visualizadas por quimioluminescência (Sigma-Aldrich). A re-hibridização da membrana com -tubulina foi realizada para verificar a precisão do carregamento. A densidade das bandas específicas foi quantificada com um densitômetro de imagem (Imagem J).
[0581] Análise estatística. A análise estatística foi concluída usando Prism GraphPad. Os dados são expressos como média ± S.E. A significância estatística foi calculada usando o teste t de Student (valores de P <0,05 foram considerados significativos) ou ANOVA multifatorial. Quando um efeito significativo foi encontrado, as comparações post hoc foram realizadas usando o Teste de Tukey da Diferença Honestamente Significativa. As diferenças foram consideradas significativas em P <0,05.
[0582] Resultados e discussão: Os experimentos foram realizados para estudar os efeitos do tratamento com nanopartículas no peso corporal em camundongos do tipo selvagem e em camundongos ETKO. A Figura 18 mostra o efeito da alimentação de camundongos com uma solução de nanopartículas (NP) nas mudanças de peso corporal em camundongos do tipo selvagem e ETKO. Os camundongos (6-7 meses de idade) foram divididos em quatro grupos de 5-6 cada (tipo selvagem não tratado (WT U), tipo selvagem tratado (WT T), Knock out não tratado (KO U) e Knock out tratado (KO T)). Os camundongos tratados com nanopartículas receberam uma dose de 133 g equiv. Solução
142 /209 NP/40g de peso corporal/dia (100mg de extrato/kg de peso corporal) por gavagem 5 vezes por semana. Camundongos não tratados receberam água. O experimento durou 4 semanas. A primeira semana do tratamento com NP não teve efeito sobre o peso corporal dos camundongos entre os grupos testados, no entanto, após as semanas 2, 3 e 4, a continuação do tratamento com NP preveniu o ganho de peso nos camundongos ETKO. Embora não tenha havido mudança significativa na perda de peso entre WT não tratado e tratado nessas doses/condições particulares, a redução do ganho de peso entre KO não tratado e KO tratado foi estatisticamente significativa (P<0,05). Estes resultados apoiam o uso das nanopartículas no tratamento e/ou gerenciamento da obesidade e/ou perda de peso. Efeito do Tratamento com Nanopartículas nos Níveis de Triglicerídeos no Fígado, na Histopatologia do Tecido Hepático, nos Parâmetros Bioquímicos Séricos e na Expressão Gênica Materiais e métodos:
[0583] Análise histológica. Para examinar a histologia do fígado, os tecidos foram fixados em formalina tamponada neutra a 10% + solução salina tamponada com fosfato e incluídos em parafina. As seções do fígado de 10m foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E) e visualizadas por microscopia de luz. Os lipídios dos tecidos foram analisados com um densitômetro de imagem (Image J), conforme descrito anteriormente (Fullerton et al. 2007).
[0584] Determinação de triglicerídeos hepáticos. O conteúdo de TG do fígado foi medido usando reagentes L-tipo-T G M de acordo com o procedimento do kit (Wako).
[0585] Análise de sangue. Após a morte clínica do camundongo, o sangue terminal foi coletado do coração. O soro foi separado imediatamente e encaminhado para análises bioquímicas como Albumina, Globulina, A:G, Proteína Total, ALT, AST, Colesterol, CK, Glicose, Fósforo e Triglicerídeos. Resultados e discussão:
[0586] Estudos foram realizados para investigar o efeito do tratamento com nanopartículas nos níveis de triglicerídeos no fígado de camundongos do tipo selvagem e ETKO. Em condições fisiológicas normais, o nível de triglicerídeos hepáticos é relativamente baixo, pois o fígado não está envolvido no armazenamento da gordura. Os triglicerídeos do fígado gorduroso não
143 /209 alcoólico dependem da taxa de captação de ácidos graxos do plasma para as células e da capacidade hepatocelular (Bradbury MW. 2006, Kawano Y 2013). Devido ao acúmulo de triglicerídeos no tecido hepático de camundongos obesos, o nível dos triglicerídeos foi investigado em camundongos WT e ETKO com ou sem tratamento com nanopartículas (NP). A Figura 19 mostra o efeito do tratamento com nanopartículas (NP) nas alterações nos níveis de triglicerídeos no fígado de camundongo. Os níveis de triglicerídeos do tecido hepático foram estimados por procedimentos descritos no kit de ensaio Wako L-Tipo TG M (Wako Life Sciences, CA, EUA). Houve uma redução significativa nos níveis de triglicerídeos nos camundongos ETKO submetidos ao tratamento com NP. O painel superior mostra os dados obtidos de camundongos machos e fêmeas. O painel inferior mostra os dados obtidos de camundongos machos. Uma redução nos triglicerídeos do fígado por tratamento com nanopartículas (NP) suporta o uso de NP para diminuir os níveis de triglicerídeos no fígado de camundongo obeso ou no fígado de outro animal ou indivíduo em necessidade.
[0587] Estudos também foram realizados para investigar o efeito do tratamento com nanopartículas na histopatologia do tecido hepático. Gotículas de lipídios são consideradas organelas de armazenamento de lipídios de hepatócitos (Mashek DG, 2015). Acredita-se que certas doenças da síndrome metabólica sejam desenvolvidas devido ao acúmulo anormal de lipídios no fígado (Gluchewaski 2017). Assim, estudos foram realizados para investigar o efeito do tratamento com nanopartículas na histopatologia do tecido hepático e nas gotículas de lipídios do fígado em camundongos do tipo selvagem e knockout (ETKO). A Figura 20 mostra a histopatologia de seções de fígado de camundongos (WT e KO) submetidos a tratamento com nanopartículas. As seções congeladas foram coradas com coloração Oil-red-O (Sigma -Aldrich) para tornar as gotículas de lipídios contendo triglicerídeos visíveis como gotículas vermelhas. Os dois painéis/filas superiores representam as imagens das seções de fígado manchadas de camundongos do tipo selvagem (topo não tratado; tratado com nanopartículas, fundo). A quantificação das áreas manchadas de vermelho mostra muito pouca mudança no controle e nos conjuntos tratados de camundongos. Cada painel/fila representa seções de 3 camundongos independentes. Os dois painéis/filas inferiores mostram a aparência de seções de fígado de camundongos ETKO não tratados (superior)
144 /209 e tratados com NP (inferior). Em geral, as seções de fígado de camundongos ETKO mostram várias áreas vazias. Essas áreas são reduzidas em camundongos ETKO tratados. Além disso, a estrutura do fígado tende a ser semelhante à do WT (relativamente mais áreas roxas do que o controle). A área das regiões manchadas de vermelho de óleo são significativamente reduzidas após o tratamento (painel inferior da Figura). Após o tratamento, embora nenhuma mudança significativa tenha sido observada em grupos WT-T/WT-U, houve uma redução significativa na quantidade de gotículas de lipídios em camundongos KO-T (tratados) em comparação com camundongos KO-U (não tratados). Esses dados mostram que o tratamento com NP diminuiu a porcentagem de gotículas de lipídios no fígado de camundongo obeso.
[0588] Considerando a diminuição dos triglicerídeos hepáticos em camundongos obesos após o tratamento com nanopartículas e os resultados do exame histopatológico do fígado, parece que o tratamento com nanopartículas pode ser um meio eficaz de controlar a deposição de lipídeos no fígado. Condições como as observadas sob esteatose não alcoólica (ou seja, NASH) assemelham-se aos observados em camundongos obesos. Consequentemente, a ingestão de produtos de plantas anti-inflamatórios, como nanopartículas, conforme aqui descrito, pode ser uma forma de controlar e/ou gerenciar a NASH em um animal, mamífero ou indivíduo humano, por exemplo.
[0589] Estudos também foram realizados para investigar os efeitos do tratamento com nanopartículas nos parâmetros bioquímicos do soro em camundongos (tipo selvagem, WT e Knock out, KO). Os parâmetros séricos são um importante indicador do estado nutricional de um indivíduo. Um aumento nos níveis de ácidos graxos circulantes pode causar sua ligação à albumina causando alterações conformacionais (Yamato M 2007). Os níveis de globulina podem ser alterados devido à obesidade e doenças hepáticas. Flutuações na quantidade total de proteína podem indicar distúrbios hepáticos e renais, insuficiência cardíaca e desnutrição. As enzimas hepáticas elevadas, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) também são indicadores chave de função hepática anormal, observada em casos de doença hepática gordurosa não alcoólica e obesidade (Marchesini G 2008). Níveis elevados de colesterol e triglicerídeos no sangue são resultados de distúrbios metabólicos lipídicos, hiperlipidemia ou hipercolesterolemia. O aumento da
145 /209 quantidade de creatina quinase (CK) no soro sanguíneo é um indicador de lesão muscular, doença cardíaca, doença renal crônica e insuficiência renal aguda (rim). Os níveis de fósforo no soro estão geralmente associados a desnutrição, má absorção e disfunção renal (fósforo). Altos níveis de glicose geralmente indicam diabetes, no entanto, pode estar associada a muitas outras doenças.
[0590] Para investigar os efeitos do tratamento com NP na concentração sérica de albumina, globulina, A:G, proteína total, ALT, AST, colesterol, CK, glicose, fósforo e triglicerídeos nos quatro grupos experimentais (tipo selvagem tratados e não tratados com nanopartículas - WT-T, WT-U e Knout out tratados e não tratados com nanopartículas, KO-T e KO-U), os camundongos foram tratados com 100 mg/kg de peso corporal de solução de NP ao longo de um período de 4 semanas. A Figura 21 mostra os parâmetros do soro sanguíneo de camundongos tratados com nanopartículas (NP) e não tratados. Não houve grandes mudanças nos níveis de albumina, globulina e suas proporções. Parece haver uma ligeira diminuição nos níveis de proteína total no soro. Os valores são a média ±SEM de 3 tratamentos independentes. A Figura 22 mostra as alterações nos níveis de marcadores de função fisiológica sérica (ALT, AST, Colesterol e CK) de camundongos de controle e tratados com NP. As análises foram conduzidas por procedimentos padrão usando kits de teste no laboratório de Patologia, Divisão de Serviços de Laboratório da Universidade de Guelph. A alanina aminotransferase e a aspartato aminotransferase são enzimas que indicam o estado funcional do fígado. Se a função hepática for deficiente ou se o fígado estiver inflamado, mais dessas enzimas são secretadas para o sangue. Houve uma queda significativa e substancial nos níveis de ALT e AST em resposta ao tratamento com NP em camundongos obesos. Mesmo em camundongos de tipo selvagem, onde esses níveis de enzima eram baixos, o tratamento com NP resultou em declínio. O tratamento com NP parece normalizar a função hepática em camundongos obesos. Os níveis de colesterol no soro também foram reduzidos em resposta ao tratamento com NP em camundongos selvagens e obesos. Níveis elevados de creatina quinase são um indicador de dano muscular, que também mostrou um grande declínio em camundongos obesos tratados com NP. Esses resultados apóiam uma função antiinflamatória do tratamento com NP. A Figura 23 mostra os níveis de glicose e fósforo no sangue de camundongos não tratados e tratados com
146 /209 nanopartículas. Não houve grandes mudanças nos níveis de fósforo no soro de ambos os camundongos não tratados e tratados do tipo selvagem e ETKO. Os níveis de glicose foram semelhantes no tipo selvagem e mostraram uma tendência de declínio no camundongo obeso após o tratamento com a solução NP. Efeito do Tratamento de Nanopartículas na Expressão Gênica Resultados e Discussão:
[0591] Estudos foram realizados para investigar os efeitos do tratamento com nanopartículas nos níveis de expressão de vários genes-chave envolvidos em várias vias e/ou condições biológicas relevantes. Camundongos (tipo selvagem, WT e Knock out ETKO, KO) foram tratados com nanopartículas e as alterações nos níveis de expressão gênica foram analisadas.
[0592] STAT4 (Transdutor de Sinal e Ativador da Transcrição 4) é uma fator de transcrição da família STAT de proteínas. STAT4 é fosforilado por Janus Kinases, o que permite sua dimerização e translocação para o núcleo durante a sinalização de citocinas e aumenta a expressão gênica. O aumento da expressão gênica relacionada a Stat 4 é uma indicação de vias inflamatórias ativadas. A Figura 24 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene STAT4 em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas. A quantificação foi feita por eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR e coloração com brometo de etídio. Não há mudanças significativas nos níveis de STAT4 entre camundongos de tipo selvagem não tratados e tratados. Há uma tendência de declínio na expressão de STAT 4 nos camundongos ETKO alimentados com solução NP. Os valores não foram significativamente diferentes dos níveis em camundongos ETKO não tratados neste teste, mas uma tendência de declínio foi observada. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo. Isso sugere que a solução de nanopartículas pode apresentar potencial na redução do estado de inflamação do corpo.
[0593] O fator nuclear -kB (NF-kB) é uma proteína-chave envolvida na iniciação da sinalização da inflamação por meio de citocinas, como as interleucinas e o fator- de necrose tumoral. A via é complicada e pode ter papéis pró-inflamatórios e antiinflamatórios com base nas condições. Um declínio na sinalização de NF-kB é considerado favorável para a infraregulação de doenças crônicas relacionadas à inflamação. A Figura 25 mostra a avaliação das
147 /209 mudanças na expressão do gene NF-kB em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas. A intensidade da banda de NF-kB foi quantificada por Western blot e detecção quimiluminiscente. Não houve mudanças significativas nos níveis de NF-kB entre camundongos de tipo selvagem não tratados e tratados. Observações semelhantes foram feitas no caso de camundongos obesos. No entanto, houve um aumento nos níveis de expressão de NF-kB nos camundongos obesos quando comparados aos camundongos selvagens. Esses resultados sugerem um aumento no estado inflamatório dos camundongos obesos, em comparação com o tipo selvagem. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo.
[0594] O TNF é uma proteína-chave envolvida nas vias de sinalização relacionadas à inflamação, causada por infecção, bem como por ativação autoimune. Uma infrarregulação do TNF é considerada ideal para controlar doenças autoimunes crônicas, como a artrite. Uma redução do TNF é desejável na redução da obesidade, que também está ligada ao estado de inflamação no corpo. A Figura 26 mostra a avaliação das alterações na expressão do gene TNF em resposta ao tratamento de camundongos com solução de nanopartículas. A quantificação foi feita por RT-PCR e a separação dos produtos por eletroforese em gel de agarose e coloração com brometo de etídio. Não há mudanças significativas nos níveis de expressão do gene TNF entre camundongos de tipo selvagem não tratados e tratados. Há uma diminuição significativa na expressão de TNF nos camundongos ETKO alimentados com solução de NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo.
[0595] A IL6 é uma citocina que medeia as vias pró-inflamatórias e anti- inflamatórias. A ativação da IL6 é conhecida por levar ao desenvolvimento de um estado inflamatório crônico que leva a vários distúrbios. Existem várias funções para IL6. Os anticorpos monoclonais para o receptor IL6 (Tocilizumab) são direcionados para a artrite reumatóide, uma doença inflamatória. A infrarregulação de IL6 pode ajudar a reduzir as condições crônicas, como a obesidade. A Figura 27 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene IL6 em resposta ao tratamento de camundongos com solução de nanopartículas. Não há mudanças significativas nos níveis de IL6 entre camundongos de tipo
148 /209 selvagem não tratados e tratados. Há uma diminuição significativa na expressão de IL6 nos camundongos ETKO alimentados com solução de NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo.
[0596] FAS (Fatty Acid Synthase) é uma enzima envolvida na biossíntese de ácidos graxos. Os ácidos graxos são convertidos em triglicerídeos, e os níveis aumentados de ácidos graxos podem causar deposição de gordura levando à obesidade. Assim, uma redução neste nível de enzima pode favorecer a biossíntese e deposição de triglicerídeos reduzidas. A Figura 28 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene FASN em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose e coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Houve uma redução significativa no nível de FAS em camundongos de tipo selvagem tratados com NP. Houve uma tendência de declínio na expressão de FAS nos camundongos ETKO alimentados com solução NP. Os valores não foram significativamente diferentes dos níveis em camundongos ETKO não tratados neste teste. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo.
[0597] ATGL (Adipose Triglyceride Lipase) é uma enzima envolvida na iniciação do catabolismo dos triglicerídeos em ácidos graxos. A função ATGL está potencialmente envolvida no desenvolvimento da síndrome metabólica. A Figura 29 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene ATGL em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas. A quantificação foi feita separando o s produtos de PCR em gel de agarose e coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Não houve diferença significativa no nível de ATGL entre o controle e os camundongos de tipo selvagem tratados com NP. Da mesma forma, os níveis de expressão de ATGL foram os mesmos nos camundongos ETKO não tratados e tratados com NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo.
[0598] HSL (Hormone Sensitive Lipase) é uma enzima chave envolvida na hidrólise de triglicerídeos no tecido adiposo, e uma enzima chave envolvida na geração de energia. HSL atua em conjunto com ATGL para liberar ácidos graxos livres de triglicerídeos. A enzima é ativada em resposta às catecolaminas quando a energia é necessária, como durante o jejum, e, portanto, funciona na mobilização de lipídios armazenados. Também libera ácidos graxos de ésteres
149 /209 de colesterol na biogênese de esteróides. HSL pode ter uma função na redução da aterosclerose, quebrando ésteres de colesterol nas células espumosas. A Figura 30 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene HSL em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose e coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Houve um aumento significativo nos níveis de transcrição de HSL entre o controle e os camundongos do tipo selvagem tratados com NP. Os níveis de expressão de HSL foram os mesmos nos camundongos ETKO não tratados e tratados com NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo.
[0599] A LPL (Lipoprotein lipase) é uma enzima que hidrolisa os triglicerídeos ligados às lipoproteínas, liberando ácidos graxos livres e monoacil glicerol. A LPL é semelhante a outras lipases, como as lipases pancreáticas e hepáticas. A LPL está presente em vários tecidos, como coração, músculo e tecido adiposo, e estão presentes nas camadas celulares próximas ao lúmen nos capilares. A LPL pode influenciar o metabolismo das lipoproteínas nos capilares. A atividade da LPL é regulada diferencialmente por hormônios como a insulina e a adrenalina. O nível de LPL é conhecido por aumentar após uma dieta rica em gorduras ou uma dieta rica em carboidratos e pode ter uma função no desenvolvimento da obesidade. A Figura 31 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene LPL em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose, coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Não houve alteração no nível de transcritos de LPL em resposta ao tratamento com NP em camundongos de tipo selvagem. Em contraste, houve uma diminuição significativa nos níveis de expressão de LPL nos camundongos ETKO tratados com NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo.
[0600] PGCl- (Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coativator) pertence a uma família de coativadores de transcrição, envolvidos na regulação do metabolismo energético relacionado a carboidratos e lipídios. PGC1-A é ativado sob condições de estresse. Esta proteína também é conhecida por ativar o NF-kB, que está envolvido no aumento da via da inflamação. Um declínio nos níveis de PGC1-A pode, portanto, infrarregular a
150 /209 inflamação. A Figura 32 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene PGCl- em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose, coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Não há alteração no nível de transcritos de PGCl-Alfa em resposta ao tratamento com NP em camundongos de tipo selvagem. Em contraste, houve uma diminuição significativa nos níveis de expressão de PGCl-Alfa nos camundongos ETKO tratados com NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo.
[0601] PPAR- (Peroxisome Proliferator Activated Receptor-Alpha) pertence a um grupo de fatores de transcrição localizados no núcleo. PPAR- Alpha tem uma função regulatória chave no metabolismo lipídico no fígado, incluindo a estimulação de genes envolvidos na captação, transporte e catabolismo de ácidos graxos. Camundongos Knock-out PPR-Alpha têm metabolismo lipídico anormal, levando à doença do fígado gorduroso. A Figura 33 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene PPAR- em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose e coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Não houve alteração no nível de transcritos de PPAR- em resposta ao tratamento com NP em camundongos do tipo selvagem, bem como nos camundongos obesos ETKO. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo.
[0602] PPAR-gama (Peroxisome Proliferator Activated Receptor-gamma) é outro fator de transcrição localizado no núcleo. Essa proteína está envolvida na proliferação de adipócitos, potencializando o desenvolvimento da obesidade. O PPAR gama é expresso no tecido adiposo e em um nível inferior nos músculos. O PPAR gama é conhecido por influenciar o desenvolvimento de obesidade e diabetes tipo II. A Figura 34 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene PPAR- em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose, coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Há uma redução significativa de transcritos PPAR-gama, em camundongos de tipo selvagem tratados com NP. Não houve nenhuma alteração importante no
151 /209 nível de PPAR gama em camundongos obesos após o tratamento com NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo.
[0603] CTL-1 (Choline Transporter Like Protein 1) é uma enzima ligada à membrana e encontrada na membrana plasmática das células cerebrais e na mitocôndria. Está envolvida no transporte de colina na mitocôndria, que é usada na biossíntese da fosfatidilcolina e na biogênese da membrana. A produção aumentada de macrófagos por inflamação resultou na superexpressão de CTL- 1 e parece estar relacionada ao aumento da inflamação. Uma redução nos altos níveis de biogênese da membrana pode ajudar a reduzir o aumento das células e as alterações relacionadas à obesidade. A Figura 35 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene CTL1 em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose, coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Não há alteração no nível de transcritos de CTL-1 em resposta ao tratamento com NP em camundongos de tipo selvagem. Em contraste, houve uma diminuição significativa nos níveis de expressão de CTL1 nos camundongos ETKO tratados com NP. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo.
[0601] PSS 2 (CDP-diacylglycerol--serine O-phosphatidyltransferase 2; phosphatidylserine synthase 2) é uma enzima envolvida na biossíntese de fosfatidilserina. Esta proteína está localizada na mitocôndria. Os camundongos Knockout PSS 2 mostraram uma vida normal. A Figura 36 mostra a avaliação das mudanças na expressão do gene PSS 2 em resposta ao tratamento com solução de nanopartículas. A quantificação foi feita pela separação dos produtos da PCR em gel de agarose e coloração com brometo de etídio para visualização da banda. Não houve alteração no nível de transcritos de PSS 2 em resposta ao tratamento com NP em camundongos de tipo selvagem; mas uma redução baixa, mas significativa, foi observada em camundongos ETKO. Os valores são Média ± SEM, de 4-5 camundongos em cada grupo.
[0602] A natureza funcional (antioxidante, antiinflamatória) e preventiva de doenças de frutas, sucos de frutas e pós de frutas tem sido atribuída à presença de vários ingredientes, como antocianinas, componentes fenólicos, vitamina C, etc., que estão presentes nestes frutas. Em virtude de sua natureza, entretanto, as antocianinas não são absorvidas pelo corpo de maneira eficiente. Da mesma
152 /209 forma, as antocianinas sofrem rearranjos estruturais durante seu trânsito pelo sistema gastrointestinal. Condições alcalinas no intestino causam a quebra do anel das antocianinas. As antocianinas que são complexadas com nanopartículas podem ser mais facilmente transportadas através da epiderme intestinal e podem potencialmente liberar as antocianinas dentro do corpo. As antocianinas internalizadas podem alterar a expressão gênica favorecendo uma redução da inflamação como antioxidantes (por sequestro de ROS), bem como alterar a expressão gênica pela infrarregulação de vias inflamatórias envolvendo proteínas (TNF alfa, STAT, interleucinas e seus receptores), bem como a enzimas efetoras que regulam e participam das vias metabólicas.
[0603] Esses resultados demonstram um efeito direto do tratamento com nanopartículas e redução da obesidade. Os efeitos de suporte incluem uma redução nos triglicerídeos do fígado, uma redução na patologia do fígado (redução nas gotículas de lipídeos), redução nas enzimas marcadoras da função hepática, como ALT e AST, uma redução acentuada na massa corporal (> 10% em 4 semanas), infrarregulação da expressão do gene promotor da inflamação, etc. A redução de doenças crônico-degenerativas tem sido associada ao aumento do consumo de frutas e legumes. Uma vez que a disponibilidade de ingredientes funcionais depende do consumo de uma variedade de produtos, incluindo frutas, legumes, nozes, especiarias, etc., esses estudos visam, pelo menos em parte, fornecer essa combinação de ingredientes através de uma única dose concentrada de alta potência, e a eficácia em termos de redução dos marcadores de inflamação e prevenção do ganho de peso foi observada com uma dose diária de ~2,5 mg/kg de peso corporal (ensaios em camundongos). Uma projeção desses dados para humanos sugere uma dose diária de ~175 mg para uma pessoa com peso de 70kg, por exemplo. EXEMPLO 3 - Funções e Aplicações de Nanofibras Nanofibras (e nanopartículas) como Veículos de Distribuição e Citotoxicidade de Nanopartículas e Nanofibras de Ginja (Prunus cerasus L.) Fruta contra Células de Câncer Colorretal Materiais e métodos:
[0604] Ginja: As frutas usadas neste exemplo vieram da Vineland Research Station, Vineland, Ontário, onde são mantidas como germoplasma. Todas as variedades são variedades com alto teor de polifenóis, variando o teor
153 /209 de polifenóis na faixa de 300-500 mg/100 g de peso fresco. A principal variedade utilizada para os presentes estudos foi a V 70151, outras como V 71261, Hymann Conserva e Hymann Rubisn também apresentaram altos níveis de formação de nanopartículas.
[0605] Isolamento de nanopartículas e nanofibras: O método de extração envolve homogeneizar a fruta usando um homogeneizador polytron e uma sonda PTA 10 em um meio (de preferência água, pode usar metanol ou etanol absoluto ou diluído), na proporção 1:1 p/p (1 g tecido para 1 ml de água ou álcool), em uma configuração intermediária (4-5) até que o tecido da fruta esteja completamente homogeneizado. O homogenato foi filtrado através de 4 camadas de tecido de gaze para remover os resíduos. O homogenato resultante foi centrifugado (18.000x g) numa centrífuga Sorvall RC 6 Plus durante 20 minutos. O sobrenadante foi decantado. Cinco ml do sobrenadante foram dialisados (spectra-Por, corte de 6-8 kD) contra água (1 litro) por 12 horas a 4°C. O extrato dialisado dentro do saco de diálise foi armazenado congelado a -20°C, assim como o sobrenadante (denominado extrato bruto). Polifenóis que lixiviam em água são diluídos consideravelmente, então, para fins experimentais, este foi concentrado por cromatografia de interação hidrofóbica, passando por um cartucho sep-pak C18 e eluindo com metanol.
[0606] Estimativa e análise de polifenóis: Os polifenóis foram estimados pelo método de Folin-Ciocalteau como realizado rotineiramente em nosso laboratório (Jacob e Paliyath, 2008). Uma alíquota adequada do extrato foi diluída para um volume final de 100 l com 50% (v/v) de etanol em água. Água destilada (0,5 ml) e 50 l de reagente Folin Ciocalteau (2N) foram adicionados à solução misturada. Carbonato de sódio (100 l de 5% (p/v)) foi adicionado a cada amostra, misturado por vórtex e incubado no escuro por 1 h. Após misturar as amostras completamente, a absorbância foi medida a max = 725 nm usando um espectrofotômetro Beckman Coulter DU 800 (Beckman Coulter Inc, EUA). Uma curva padrão foi gerada usando ácido gálico com concentrações variando de 0 a 200 g/ml. As concentrações de polifenóis são expressas como ácido gálico equivalente por grama de peso fresco da fruta.
[0607] Os polifenóis foram purificados e concentrados quando necessário usando cromatografia Sep-Pak C18. Normalmente, 1-2 mg de equivalente de
154 /209 polifenol de extrato foram carregados em um cartucho de 1 ml, lavados com 1-2 ml de água e polifenóis eluídos com metanol 100%. O metanol foi removido em uma corrente de nitrogênio a 45°C. Os polifenóis secos resultantes foram dissolvidos em metanol (para análise por HPLC-MS) ou em água para ensaios antioxidantes e estudos de cultura de células após a remoção do metanol e redissolução em água.
[0608] A análise por HPLC-MS das antocianinas isoladas dos extratos brutos, dos extratos dialisados e das frações dialisadas foi realizada usando um HPLC-MS Agilent série 1100. A separação foi conduzida usando uma coluna X- Terra® MS C-18 (5m, 150 x 3,0 mm, Waters Corporation, MA, EUA). As antocianinas foram eluídas com um gradiente de metanol (solvente A) e 2,0% (v/v) de ácido fórmico (solvente B) a um fluxo de 0,8 ml/min. O gradiente usado foi o seguinte: 0-2 min, 93% B; 2 - 30 min, 80% B; 30-45 min, 70% B; 45- 50 min; 65% B, 50-60 min, 50% B; 60-65 min, 20% B; 65-70 min, 93% B. A detecção foi realizada a 520 nm para antocianinas e a 260 nm para ácidos fenólicos. A ionização por eletropulverização (ESI) foi realizada com um espectrômetro de massa API-ES. O nitrogênio foi usado como gás de nebulização e secagem, a uma taxa de fluxo de 12 l/min a 350°C; uma voltagem de spray de íons de 4000 V e uma voltagem de fragmentador de 80 V. Os íons gerados foram varridos de m/z 150 a 700. Os espectros foram adquiridos no modo de íon positivo e negativo. Um volume de injeção de amostra de 20 l (20 m) foi usado para todas as amostras. A identificação da estrutura dos compostos foi obtida combinando seus íons moleculares (m/z) obtidos por LC-ESI-MS com dados da literatura (www.metabolomics.jp). Três amostras independentes foram analisadas e a quantidade de ingredientes expressa como média ± SEM por g. peso fresco de equivalente de tecido. Estimativa da capacidade antioxidante:
[0609] As propriedades antioxidantes (capacidade de sequestrar espécies reativas de oxigênio ou radicais ativados) foram realizadas avaliando a eficiência na eliminação de radicais ânion superóxido, radicais ânion hidroxila e radicais DPPH sob condições de ensaio in vitro (Jacob e Paliyath, 2008). A eficiência na eliminação desses radicais é denotada pela taxa específica de extinção.
[0610] Cultura de células: Três linhagens de células derivadas do cólon, CRL 1790, uma linhagem de células normal, HT 29, uma linhagem de células de
155 /209 câncer colorretal e CRL 2158 uma linhagem de células de câncer colorretal multirresistente (ATCC) foram usadas para avaliar a citotoxicidade de nanocomplexos. As células foram cultivadas em meios especificamente recomendados para cada linhagem celular. Para HT 29, o meio usado foi DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco, Sigma), para CRL 2158, o meio usado foi RPMI, e para CRL 1790, o meio usado foi EMEM (meio essencial mínimo de Eagle; Cedarlane Labs, Burlington, ON, Canadá). Todos os meios foram suplementados com FBS, penicilina/estreptomicina e L-glutamina. Na confluência (~80%), as células foram lavadas com PBS 1X duas vezes. As células foram incubadas com tripsina-EDTA por 5 minutos e depois diluídas nos respectivos meios suplementados com FBS a 10% antes da coloração com azul de tripano (50 ul de células e 450 ul de azul de tripano) e contagem de células viáveis para avaliar a citotoxicidade. A citotoxicidade foi determinada por exclusão com azul de tripano em células vivas e coloração com azul de células mortas. O número de células mortas em uma área unitária foi contado e expresso como uma porcentagem do total de células na área.
[0611] Estudos confocais: 2 x 105 células foram semeadas em placa de cultura de células (35 mm x 10 mm) e o meio trocado a cada dois dias até a placa atingir a confluência. As células foram examinadas sob um microscópio confocal após coloração com reagentes apropriados. Dylight 650 (Excitação 650 nm. Emissão de 700 nm, Thermo Scientific Pierce Biology Products) foi encontrada fornecer desempenho superior e estabilidade durante os experimentos de absorção. Pó liofilizado do extrato dialisado contendo nanocomplexos (4 mg) foi misturado com uma solução 10 M de éster Dylight 650 dissolvido em dimetilformamida e incubado por 1h a 25°C para conjugação. Após a reação, a mistura foi dialisada contra água (3x) usando uma membrana de diálise de 6-8 kD até que os reagentes livres fossem completamente removidos. A ligação do Dylight aos nanocomplexos foi avaliada pelo monitoramento da fluorescência dos nanocomplexos dialisados.
[0612] Captação de calceína em células HT 29, CRL 1790: Captação de nanopartículas carregadas de calceína em células de mamífero. A calceína por si só é impermeável através da membrana e pode ser absorvida em um nível baixo por endocitose. A cereja branqueada com etanol foi homogeneizada em água, também contendo 1 mg/g de peso fresco equivalente de calceína, e o
156 /209 sobrenadante dialisado contra água. Calceína complexada aos nanofilamentos é retida dentro da bolsa de diálise e usada para medições de captação por microscopia confocal. Nanopartículas carregadas de calceína são recolhidas em compartimentos discretos em ambas as células HT 29 e CRL 1790.
[0613] Conjugação de Dylight com nanocomplexos e nanofilamentos e sua absorção em células HT 29, CRL 1790 e CRL 2158: Demonstração da absorção de nanocomplexos isolados de ginja não branqueada e nanofilamentos isolados de ginja branqueada com etanol em células de mamíferos (HT-29, CRL 2158, CRL1790). Os nanocomplexos e nanofilamentos foram conjugados com Dylight 650 e dialisados contra água extensivamente (3x) para remover o corante não conjugado. As células foram semeadas e cultivadas por 48 horas. Os nanocomplexos e filamentos conjugados (~5mM Dylight equivalente em 3ml de meio de cultura) foram adicionados ao meio e as células foram incubadas por mais 24h. As células foram mantidas em placas de Petri (3,5 cm de diâmetro) e observadas em microscópio confocal (Leica) com excitação em 633 nm e emissão monitorada a 680 nm. Os painéis A e B, respectivamente, mostram a captação de nanocomplexos e nanofilamentos conjugados com Dylight por células HT 29; Os painéis C e D, respectivamente, mostram a captação de nanocomplexos e nanofilamentos conjugados com Dylight pelas células CRL 2158; e os painéis E e F, respectivamente, mostram a absorção dos nanocomplexos conjugados pelas células CRL 1790, respectivamente. As inserções nos painéis são imagens compostas aumentadas de células. (Barra de tamanho).
[0614] Análise de células vivas-mortas: as células foram cultivadas como monocamadas confluentes e subconfluentes por 24 h, conforme descrito anteriormente (Hakimuddin et al., 2004). As células foram tratadas com paclitaxel, ou paclitaxel junto com nanofibras por 12 h (quantidades apropriadas de paclitaxel e nanofibras foram misturadas em DMSO 5% em água e adicionadas às células). As células foram lavadas com tampão fosfato e testes de viabilidade celular realizados em células CRL 1790, CRL 2158 e HT 29 usando um kit de viabilidade de células vivas/mortas (Invitrogen, Mississauga, Ontário) conforme descrito pelo fabricante. As células mortas vivas foram visualizadas sob um microscópio confocal. O kit de ensaio contém dois corantes fluorescentes, éster de calceína AM (Ex 494 nm, Em 517 nm) que entra
157 /209 especificamente nas células vivas, fica desesterificado e tinge as células vivas de verde. Tanto as células agonizantes quanto as células mortas estão comprometidas com a membrana (membrana plasmática com vazamento) e permitem a entrada do homodímero de etídio Ex 517 nm / Em 617), que tinge o núcleo de vermelho. As células foram observadas a 517 nm (canal verde), que diferenciava as células vivas, e a 617 nm, que possibilitava a visualização das células mortas. A imagem composta dos dois comprimentos de onda mostra as células em transição para a perda de viabilidade celular.
[0615] Neste exemplo, as nanofibras foram acopladas ao paclitaxel pela mistura de uma solução 10x de paclitaxel (em DMSO a 50%) com uma quantidade apropriada de nanofibras em um frasco. Quantidades apropriadas foram dispensadas na placa de cultura em condições estéreis.
[0616] Nanopartículas ou nanofibras de natureza esférica ou fibrosa formadas por montagem espontânea foram isoladas de frutos de ginja. As propriedades funcionais dessas nanopartículas/nanofibras constituídas principalmente por carboidratos, proteínas e polifenóis (nanopartículas) foram avaliadas e as diferenças investigadas. A fração enriquecida com nanopartículas de extrato de ginja mostrou forte atividade antioxidante, bem como citotoxicidade aumentada contra células de câncer colorretal HT 29, enquanto as nanofibras de cereja branqueada com etanol sem polifenóis foram inativas neste aspecto nas condições testadas. Tanto as nanopartículas quanto as nanofibras foram internalizadas por células normais do cólon humano e células cancerosas. As análises de citotoxicidade revelaram que as células HT-29 tratadas com paclitaxel na presença ou ausência de nanofibras resultaram em um alto nível de citotoxicidade. Enquanto as células de câncer colorretal multirresistentes foram resistentes ao tratamento com paclitaxel, na presença de nanofibras, o tratamento resultou em citotoxicidade quase completa. Em condições semelhantes de tratamento, as células normais do cólon mostraram muito pouca citotoxicidade na presença de paclitaxel ou paclitaxel misturado com nanofibras. Esses resultados sugerem que as nanofibras podem ser uma ferramenta eficiente para a internalização de fármacos e indução de citotoxicidade em células cancerosas e em células cancerígenas multirresistentes, por exemplo.
[0617] Nanopartículas, bem como nanofibras, conjugadas com Dylight 650 foram localizadas em organelas discretas, mas semelhantes quando as
158 /209 células de mamíferos foram tratadas com essas partículas conjugadas, sugerindo que os componentes conjugados tanto a nanopartícula quanto a nanofibra podem ter chances semelhantes de serem absorvidos e acumulados de maneira semelhante. É contemplado que estes resultados com Dylight podem ser extrapolados para aplicações quando nanopartículas ou nanofibras são conjugadas com outros produtos farmacêuticos, nutracêuticos ou outros agentes biologicamente ativos (em vez de Dylight).
[0618] Estimativa da capacidade antioxidante: as propriedades antioxidantes (capacidade de sequestrar espécies reativas de oxigênio ou radicais ativados) foram realizadas avaliando a eficiência na eliminação de radicais ânion superóxido, radicais ânion hidroxila e radicais DPPH sob condições de ensaio in vitro (Jacob e Paliyath, 2008). A eficiência na eliminação desses radicais é denotada pela taxa específica de extinção. Resultados e discussão:
[0619] Morfologia de Nanopartículas e Nanofibras: Nanopartículas e nanofibras isoladas de frutos de ginja originais e frutos de ginja branqueados com etanol mostraram características distintas (ver discussão nos Exemplos 1 e 3, e Figuras 1 e 17 (nanopartículas) e Figura 37 (Nanofibras)). Nanopartículas do extrato original de cereja foram esféricas na morfologia. A análise detalhada mostra que os complexos esféricos podem, em certas modalidades, ser formados por um núcleo de pectina, rodeado por estruturas semelhantes a fibras compreendendo componentes de pectina, moléculas derivadas de hemicelulose, peptídeos derivados de proteínas de parede celular, antocianina e ácido málico. Esses complexos tinham 50-250 nm de diâmetro em solução. Após o branqueamento com etanol de frutas de ginja, quando as antocianinas e outras moléculas pequenas (ou seja, ácido málico, em certas modalidades) são removidas, as frutas resultantes formaram estruturas semelhantes a fibras durante a homogeneização que tinham vários micrômetros de comprimento e 5- 10 nm de diâmetro (veja a Figura 37). Nanopartículas e nanofibras foram utilizadas para avaliar suas propriedades funcionais.
[0620] Conteúdo de polifenóis nas nanopartículas: Os homogenatos de cereja foram obtidos de linhagens de elite de ginjas contendo altos níveis de polifenóis. Durante as extrações usando diferentes cultivares de cereja, os homogenatos continham 0,88 a 0,94 mg/g de peso fresco de polifenóis em
159 /209 extratos aquosos, enquanto nos extratos de metanol, o teor de polifenol variou de 1,04-1,13 mg/g de peso fresco (ver Exemplo 1, Tabela 1). Submeter homogenatos de ginja preparados em água ou álcool (metanol, ~50% v/v final) a diálise contra água resultou na retenção de quase 80% de polifenóis dentro da bolsa de diálise em um estado complexado (ver Exemplo 1, Tabela 1). A extração dos frutos com metanol aumentou o teor de polifenóis no extrato bruto em quase 20%, porém a quantidade restante no extrato dialisado foi comparável à obtida após a diálise do extrato aquoso. A quantidade de polifenóis livres que saem da bolsa de diálise (Mr de cut off 6000-8000) para o dialisado foi muito baixa (menos de 3%). Em geral, a partir de múltiplas extrações, o teor de polifenóis do extrato dialisado variou de 0,63-0,65 mg/g de peso fresco nos extratos aquosos, enquanto nos extratos dialisados de extratos de metanol, este variou de 0,70- 0,80 mg/g de peso fresco. O teor de polifenóis no dialisado foi muito baixo, variando de 0,03 a 0,06 mg/g de peso fresco em extratos aquosos e de metanol, respectivamente.
[0621] A composição de polifenol do extrato dialisado e do dialisado foi analisada por HPLC-MS (ver Exemplo 1, Tabela 2) e os componentes. Os polifenóis constituíram uma proporção principal de componentes fenólicos (> 90%) com uma proporção menor de ácidos fenólicos (<10%). Cianidina-3- rutinosídeo foi a principal antocianina (~70%), seguido por peonidina-3- rutinosídeo. Pelargonidina-3-rutinosídeo e cianidina-3-soforosídeo estavam presentes em ~10-12%. O ácido clorogênico e o ácido p-coumaroilquínico foram os principais ácidos fenólicos. A composição qualitativa do dialisado foi muito semelhante à do extrato dialisado. Em termos quantitativos, o extrato dialisado apresentou maior teor de cianidina-3-rutinosídeo (~25-30% maior), apresentando enriquecimento específico pela formação de nanopartículas.
[0622] Capacidade antioxidante de polifenóis livres e complexados: As atividades antioxidantes do extrato bruto, do extrato dialisado e do dialisado foram medidas nos extratos de água e metanol. A extinção específica de superóxido, radicais hidroxila e os radicais DPPH é mostrada no Exemplo 1, Tabela 3. Os extratos aquosos ou metanólicos de cereja em bruto mostraram superóxido, radical hidroxila e habilidades de eliminação de DPPH muito fortes. Apesar de fazerem parte das nanopartículas, os polifenóis apresentaram altas atividades antioxidantes, muito superior aos polifenóis livres do dialisado,
160 /209 sugerindo que a formação do complexo não prejudicou as atividades antioxidantes dos polifenóis. Assim, a entrada de nanopartículas contendo polifenóis nos tecidos do corpo cruzando a membrana GIT provavelmente não reduzirá sua função antioxidante com base nesses resultados.
[0623] Neste exemplo, os experimentos foram realizados para estudar a absorção celular de nanofibras (e nanopartículas) e para estudar a aplicação de nanofibras (e nanopartículas) como veículos de distribuição para várias cargas. A Figura 37 mostra exemplos de nanofibras, representativas daquelas usadas nesses experimentos. A Figura 37 mostra micrografias eletrônicas de transmissão (TEMs) de nanofibras de 2 preparações independentes de nanofibras. O painel esquerdo mostra as nanofibras isoladas de ginja branqueada com etanol usando liofilização (freeze drying). O painel direito mostra as nanofibras isoladas por secagem de nano-pulverização. Nanofibras como essas foram usadas para estudar a absorção celular e aplicações como veículos de distribuição, conforme descrito em mais detalhes abaixo.
[0624] Estudos foram realizados para investigar a aplicação de nanofibras para o transporte de uma carga mineral, como o ferro. A Figura 38 mostra complexos de nanofibras formados com ferro. A preparação de nanofibra (2 mg) foi dissolvida em 2 ml de água e misturada com cloreto ferroso 1mM. A solução foi incubada por 2 horas e dialisada durante a noite contra água (2X) para remover o ferro não ligado. A solução dialisada foi examinada ao microscópio eletrônico sem coloração com acetato de uranila. Os complexos de nanofibras foram corados com ferro (em vez de acetato de uranila), mostrando o potencial das nanofibras para serem utilizadas como carreadores de ferro.
[0625] Estudos também foram realizados para investigar o uso de nanofibras como veículos de distribuição para uma carga de interesse, onde a carga foi complexada de forma não-covalente com as nanofibras. Neste estudo, nanofibras foram usadas para distribuição celular de calceína. A Figura 39 mostra a absorção de nanofibras carregadas de calceína em células de mamíferos (aduto de calceína-nanofibra). A calceína (Ex 494 nm / Em 517 nm) por si só é impermeável através da membrana e pode ser absorvida em um nível baixo por endocitose (Figura 39, A, C). A cereja branqueada com etanol foi homogeneizada em água, também contendo 1mg/g de peso fresco equivalente de calceína, e o sobrenadante dialisado contra água. Calceína complexada com
161 /209 nanofibras é retida dentro da bolsa de diálise e usada para medições de captação por microscopia confocal. A absorção de calceína sozinha foi comparativamente muito baixa em células HT 29 (Painel A) e células intestinais humanas normais (Painel C). As nanofibras carregadas com calceína são captadas de forma muito mais eficiente em compartimentos discretos em ambas as células da linhagem de células HT 29 (B) de câncer colorretal e células CRL 1790 (D) intestinais humanas normais. (Barra de tamanho - 10m).
[0626] Citotoxicidade de nanopartículas e nanofibras contra células cancerosas: Estes estudos avaliam os efeitos citotóxicos das nanopartículas purificadas e das nanofibras isoladas de ginja usando células epiteliais do cólon humano normais (CRL 1790), células de câncer colorretal humano (HT 29) e células cancerosas de colorretal humano multirresistente (CRL 2158) na presença ou ausência de paclitaxel. As nanopartículas foram adicionadas como alíquotas de equivalentes de polifenóis, enquanto as nanofibras foram adicionadas com base no peso. As células foram multiplicadas por um período de 48 h e tratadas com paclitaxel (32 nM) e 4 g/ml de nanofibras por placa de petri, e a citotoxicidade avaliada por exclusão de azul de tripano. Os efeitos dos tratamentos são dados na Tabela seguinte como % de células sobreviventes após o tratamento por vários períodos de tempo.
Tabela 5: Citotoxicidade de nanopartículas e nanofibras. Os valores são médias de 3 repetições. A variação de replicar para replicar em geral foi entre 1-2 %. Os dados no Tratamento B foram obtidos contando as células vivas/mortas de 4-6 quadros aleatórios, após coloração com calceína AM/ homodímero Ethidium.
A-Tratamento % Células vivas % Células vivas % Células vivas Linhagem Célula Linhagem HT 29 Linhagem CRL Normal de Células de 2158 de Células CRL 1790 Cancer Colorretal MDR Colorretal Nanoparticula (µg/ml) 100 100 100 0 87.58 75.64 89.65 5 81.50 66.02 83.44 20 72.54 58.33 74.48 80
162 /209 Nanofibra 4 µg/ml 99-100 98-100 100 Paclitaxel (nM) 0 100 100 100 2 86.66 70.93 90.86 8 74.28 59.11 86.17 32 66.79 48.27 83.76 B-Análise Célula Viva/Morta -Paclitaxel-Fibra 100 100 100 Paclitaxel 32 nM, 97.6 10.78 46.00 24 h Paclitaxel+ 117.3 10.57 4.2 Nanofibra (4μg/ml)
[0627] As nanopartículas por si mesmas mostraram toxicidade moderada para as células (Tabela acima). A HT 29 foi a mais sensível às nanopartículas, enquanto as células CRL 1790 normais foram as menos afetadas. A linhagem celular multirresistente CRL 2158 mostrou uma diminuição de quase 25% nas células sobreviventes, a uma concentração de polifenol de 80 g/ml. Um grau semelhante de susceptibilidade também foi observado nas células normais. As células HT 29 tratadas com polifenóis 80 g/ml mostraram uma diminuição de quase 42% nas células sobreviventes. As nanofibras não foram citotóxicas para nenhuma das linhagens celulares na concentração utilizada (4 g/ml). Quando as nanopartículas e as nanofibras foram misturadas, houve um aumento marginal na citotoxicidade nas linhagens de células HT 29 e MDR na concentração de polifenol de 80 g/ml. O paclitaxel por si só foi citotóxico para as células HT 29 (50% de sobrevivência a 32 nM), enquanto as células normais e as células MDR mostraram um baixo nível de citotoxicidade (Tabela acima). Quando as nanopartículas foram incluídas junto com o paclitaxel, a citotoxicidade não se alterou em grande medida nas condições testadas. Quando paclitaxel e nanofibras foram adicionados juntos, a citotoxicidade das células MDR aumentou para quase 50%, com paclitaxel 32 nM. Enquanto as células HT 29 mostraram um alto nível de citotoxicidade ao paclitaxel sozinho, uma combinação de paclitaxel e nanofibras não alterou a taxa de sobrevivência das células nas condições testadas.
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[0628] Captação de moléculas complexadas por nanofibras: As nanofibras são extremamente longas (micrômetros de comprimento, ~5 nm de diâmetro; consulte a Figura 37, por exemplo), e sua capacidade de atravessar a membrana plasmática foi investigada. Neste experimento, a capacidade das nanofibras de formar complexos naturais com um corante fluorescente impermeável à membrana, a calceína, foi investigada. As nanofibras foram preparadas a partir de cereja branqueada com etanol pelos procedimentos descritos acima. Durante a homogeneização, 1 mg/g equivalente em peso fresco de calceína foi misturado com a cereja. Após homogeneização e remoção dos detritos, o homogenato foi dialisado (3x) contra água até que o dialisado não apresentasse fluorescência. Ao mesmo tempo, o extrato dentro da bolsa de diálise mostrou um alto grau de fluorescência. As células HT-29 e CRL-1790 foram incubadas na presença de calceína sozinha e nanofibras complexadas com calceína (de igual intensidade de fluorescência). A absorção de calceína e calceína complexada com nanofibras foi monitorada por microscopia confocal. Os resultados são mostrados na Figura 39. Os painéis A e B mostram a captação de calceína não complexada e de calceína complexada com nanofibras, respectivamente, nas células HT 29. Como pode ser visto na figura, a calceína complexada com nanofibras foi preferencialmente absorvida pelas células (painel B) e estas parecem estar localizadas em estruturas vesiculares. Foi observada uma absorção muito reduzida de calceína, uma vez que a calceína é uma molécula relativamente impermeável à membrana. Enquanto a maior parte da fluorescência foi localizada em regiões próximas à membrana plasmática em células HT 29, a captação foi mais intensa em células CRL 1790 incubadas com complexo calceína-nanofibra (Painel D). Da mesma forma, a distribuição da fluorescência da calceína foi observada nas regiões internas da célula. A absorção de calceína sozinha foi muito baixa pelas células CRL 1790. Experimentos semelhantes também foram realizados com nanopartículas, no entanto, por causa da extinção da fluorescência por polifenóis, a aquisição de imagens com sucesso não foi alcançada. É contemplado que as nanopartículas, conforme descrito neste documento, podem ser tão eficientes na absorção de calceína (ou qualquer outra molécula de uma natureza de fármaco/suplemento), conforme investigado adicionalmente a seguir.
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[0629] Captação de Dylight 650 conjugado por nanopartículas e nanofibras por células: estudos adicionais foram realizados para investigar o uso de nanofibras (e nanopartículas) como veículos de distribuição para uma carga de interesse, onde a carga foi covalentemente complexada com as nanofibras (ou nanopartículas). Neste estudo, nanofibras (e nanopartículas) foram usadas para distribuição celular de Dylight 650. Para avaliar ainda mais a capacidade das nanopartículas e nanofibras para entrar nas células, estas foram isoladas de cereja não branqueada e cereja branqueada com etanol, respectivamente, e quimicamente conjugados com um corante fluorescente Dylight 650 (excitação 650nm, emissão 670 nm). Células HT 29, CRL 2158 e CRL 1790 foram cultivadas e incubadas com a solução de corante e examinadas sob um microscópio confocal (Figura 40).
[0630] Tanto as nanopartículas quanto as nanofibras conjugadas com o corante foram absorvidas pelas células durante a incubação e eram claramente visíveis compartimentadas em estruturas vesiculares no citoplasma e ao redor do núcleo. A Figura 40, Painéis A e B, respectivamente, mostram a absorção de nanopartículas e nanofibras por células HT 29. Ambos os conjugados são absorvidos pelas células conforme revelado na inserção (visão ampliada de uma célula). Células CRL 2158 multirresistentes incubadas com nanopartículas conjugadas (C) e nanofibras (D) mostraram captação igualmente semelhante, conforme mostrado pelas células HT-29, a intensidade relativa pode ser maior nas células incubadas com nanopartículas (painel C). As inserções mostram uma visão ampliada de uma imagem composta de uma célula, novamente mostrando o acúmulo de nanopartículas em organelas ao redor do núcleo. As células CRL 1790 mostraram uma captação muito maior das nanopartículas (E) avaliada pela intensidade visual do que a das nanofibras (F). Esses resultados indicam que as nanopartículas e nanofibras isoladas de cereja não branqueada e branqueada conseguiram atravessar a membrana celular e se acumular em organelas específicas.
[0631] A Figura 40 mostra uma demonstração da absorção de nanopartículas (A, C, E) isoladas de ginja não branqueada e nanofibras (B, D, F) isoladas de ginja branqueada com etanol em células humanas (HT-29, CRL 2158, CRL1790). As nanopartículas e nanofibras foram quimicamente conjugadas com Dylight 650 e dialisadas contra água extensivamente (3x) para
165 /209 remover o corante não conjugado. As células foram semeadas e cultivadas por 48 horas. As nanopartículas e nanofibras conjugadas (~5mM Dylight equivalente em 3ml de meio de cultura) foram adicionadas ao meio e as células foram incubadas por mais 24h. As células foram mantidas em placas de petri (3,5 cm de diâmetro) e observadas em microscópio confocal (Leica) com excitação a 633 nm e emissão monitorada a 680 nm. Os painéis A e B, respectivamente, mostram a absorção de nanopartículas e nanofibras conjugadas com Dylight por células HT 29 (linhagem de células de câncer colorretal); Os painéis C e D, respectivamente, mostram a absorção de nanopartículas e nanofibras conjugadas com Dylight pelas células CRL 2158 (linhagem celular colorretal MDR); e os painéis E e F, respectivamente, mostram a absorção das nanopartículas conjugadas pelas células CRL 1790 (células intestinais humanas normais), respectivamente. As inserções nos painéis são imagens compostas aumentadas de células. (Barra de tamanho - 10m).
[0632] Diferenciando citotoxicidade por análise de células vivas- mortas: Estudos adicionais foram realizados para investigar a distribuição de paclitaxel usando nanofibras em várias linhagens celulares. Para avaliar ainda mais a eficiência das nanofibras no aumento da citotoxicidade do paclitaxel, foi realizada uma análise de células vivas-mortas. Células normais (CRL 1790), células cancerosas (HT-29) e as células MDR (CRL 2158) foram cultivadas e expostas a paclitaxel sozinho e paclitaxel juntamente com nanofibras. As células foram cultivadas por 24h, momento em que, paclitaxel e as nanofibras foram adicionados à cultura. A análise de células vivas-mortas foi realizada 24 horas após a exposição à droga. Os resultados são mostrados nas Figuras 41-43. A Figura 41 mostra a citotoxicidade de Nanofibra-Paclitaxel para células de câncer colorretal humano (HT 29). A análise de células vivas-mortas de células de câncer colorretal HT 29 conforme foram visualizadas em um microscópio confocal é mostrada. O kit de ensaio (Invitrogen) contém dois corantes fluorescentes, éster de calceína AM (Ex 494 nm, Em 517 nm) que entra especificamente nas células vivas, fica desesterificado e tinge as células vivas de verde. Tanto as células agonizantes quanto as células mortas estão comprometidas com a membrana (membrana plasmática com vazamento) e permitem a entrada do homodímero de etídio (Ex 517 nm / Em 617), que tinge o núcleo de vermelho. As células foram observadas a 517 nm (canal verde), que
166 /209 diferenciava as células vivas, e a 617 nm, que possibilitava a visualização das células mortas. A imagem composta dos dois comprimentos de onda mostra as células em transição para a perda de viabilidade celular (A, D, G; amarelo). Os painéis B, C representam células de controle visualizadas a 617 nm (vermelho, células mortas) e a 517 nm (verde, células vivas), respectivamente. O painel A é uma imagem composta de células não tratadas. Os painéis E, F representam as imagens de células tratadas com paclitaxel (32 nM) registradas nos dois comprimentos de onda 617 e 517 nm, respectivamente. O painel D é uma imagem composta. Os painéis H e I mostram as células tratadas com paclitaxel + nanofibras (32 nM + 4 g/ml de nanofibras, as fibras e a quantidade apropriada de paclitaxel foram misturadas em DMSO 5% e adicionadas ao meio de cultura das células e incubadas por 12h). O painel G é uma composição das imagens vermelhas e verdes. Esses resultados mostram o uso de nanofibras para distribuir paclitaxel (complexado com as nanofibras, não conjugado) às células, o que resultou principalmente em citotoxicidade nas células MDR, por exemplo. O paclitaxel sozinho alcançou um efeito, mas apenas na linhagem de células cancerosas HT29, não MDR. As nanofibras proporcionaram um melhor efeito no MDR. É contemplado que as nanopartículas podem ser similarmente eficientes na absorção de um ou mais fármacos (ou qualquer outra molécula de uma natureza de fármaco/suplemento), conforme suportado no exemplo anterior usando calceína e Dylight.
[0633] A Figura 42 mostra a citotoxicidade de Nanofibra-Paclitaxel para células de câncer MDR colorretal humano (CRL 2158). É mostrada a análise de células vivas-mortas de células de câncer de cólon multirresistentes CRL 2158 conforme foram visualizadas em um microscópio confocal. O kit de ensaio (Invitrogen) contém dois corantes fluorescentes, éster de calceína AM (Ex 494 nm, Em 517 nm) que entra especificamente nas células vivas, fica desesterificado e tinge as células vivas de verde. Tanto as células agonizantes quanto as células mortas estão comprometidas com a membrana (membrana plasmática com vazamento) e permitem a entrada do homodímero de etídio (Ex 517 nm / Em 617), que tinge o núcleo de vermelho. As células foram observadas a 517 nm (canal verde), que diferenciava as células vivas, e a 617 nm, que possibilitava a visualização das células mortas. A imagem composta dos dois comprimentos de onda mostra as células em transição para a perda de
167 /209 viabilidade celular (A, D, G; amarelo). Os painéis B, C representam células de controle visualizadas a 617 nm (vermelho, células mortas) e a 517 nm (verde, células vivas), respectivamente. O painel A é uma imagem composta de células não tratadas. Os painéis E, F representam as imagens de células tratadas com paclitaxel (32 nM) registradas nos dois comprimentos de onda 617 e 517 nm, respectivamente. O painel D é uma imagem composta. Os painéis H e I mostram as células tratadas com paclitaxel + nanofibras (32 nM + 4 g/ml de nanofibras). O painel G é uma composição das imagens vermelhas e verdes.
[0634] A Figura 43 mostra a citotoxicidade de Nanofibra-Paclitaxel para células intestinais humanas normais (CRL 1790). É mostrada a análise de células vivas-mortas de células epiteliais normais do cólon humano CRL 1790 conforme foram visualizadas sob um microscópio confocal. O kit de ensaio (Invitrogen) contém dois corantes fluorescentes, éster de calceína AM (Ex 494 nm, Em 517 nm) que entra especificamente nas células vivas, fica desesterificado e tinge as células vivas de verde. Tanto as células agonizantes quanto as células mortas estão comprometidas com a membrana (membrana plasmática com vazamento) e permitem a entrada do homodímero de etídio (Ex 517 nm / Em 617), que tinge o núcleo de vermelho. As células foram observadas a 517 nm (canal verde), que diferenciava as células vivas, e a 617 nm, que possibilitava a visualização das células mortas. A imagem composta dos dois comprimentos de onda mostra as células em transição para a perda de viabilidade celular (A, D, G; amarelo). Os painéis B, C representam células de controle visualizadas a 617 nm (vermelho, células mortas) e a 517 nm (verde, células vivas), respectivamente. O painel A é uma imagem composta de células não tratadas. Os painéis E, F representam as imagens de células tratadas com paclitaxel (32 nM) registradas nos dois comprimentos de onda 617 e 517 nm, respectivamente. O painel D é uma imagem composta. Os painéis H e I mostram as células tratadas com paclitaxel + nanofibras (32 nM + 4 g/ml de nanofibras). O painel G é uma composição das imagens vermelhas e verdes.
[0635] Esses resultados fornecem informações sobre o uso de nanofibras (e potencialmente nanopartículas) para a distribuição de produtos farmacêuticos nas células. No presente exemplo, um modelo de célula cancerígena HT 29, que é uma linhagem celular de câncer colorretal, e uma linhagem celular de câncer colorretal multirresistente CRL 2158, foi usado para estudar a eficácia do
168 /209 paclitaxel complexado com nanofibras. Os efeitos citotóxicos do paclitaxel sozinho e do paclitaxel complexado com nanofibras foram quase os mesmos nas células HT 29. Esta linhagem celular, sendo não multirresistente, é suscetível à citotoxicidade pelo paclitaxel sozinho. Essas células também responderam ao paclitaxel complexado com nanofibras, sugerindo que a droga é liberada do complexo dentro da célula e não retida pela nanofibra. O desenvolvimento de resistência a múltiplas drogas é um grande problema com a quimioterapia do câncer, onde as células bombeiam ativamente as drogas, eliminando assim a citotoxicidade. No caso do CRL 2158, a capacidade de multirresistência foi revelada pela sua resistência ao tratamento com paclitaxel. No entanto, a resistência a múltiplas drogas foi superada pela complexação com as nanofibras, onde quase 100% das células MDR apresentaram citotoxicidade. Assim, a complexação com nanofibras pode fornecer uma via para combater as células multirresistentes. Curiosamente, as células intestinais normais (CRL 1790) não mostraram citotoxicidade para o paclitaxel sozinho ou para o complexo paclitaxel-nanofibra na concentração de paclitaxel usada, indicando a segurança desse tratamento para as células.
[0636] Curiosamente, foi difícil encontrar citotoxicidade em células normais do cólon (CRL 1790), quer na ausência, quer na presença de paclitaxel, mesmo quando tratado com a nanofibra (Figura 43, painéis A-I). Estas células mantiveram sua morfologia na presença de paclitaxel (painéis D, E, F) ou paclitaxel e nanofibras (painéis G, H, I), e nenhuma perda na integridade da membrana pôde ser observada.
[0640] Uma estimativa quantitativa de células vivas em CRL 1790, HT 29 e CRL 2158 durante a cultura de células na presença ou ausência de paclitaxel, bem como paclitaxel e nanofibra, é dada na Tabela acima deste Exemplo. A linha celular normal não mostrou qualquer citotoxicidade ao paclitaxel 32 nM fornecido sozinho ou na presença de nanofibra. As células HT 29 mostraram altos níveis de citotoxicidade ao paclitaxel, bem como ao paclitaxel e à nanofibra fornecidos juntos. As células CRL 2158 mostraram algum grau de resistência ao paclitaxel quando fornecido sozinho (~50% de sobrevivência), enquanto na presença de nanofibras, o grau de sobrevivência foi reduzido para 4%. A análise de células vivas-mortas foi uma forma mais precisa de determinar a sobrevivência das células durante o tratamento com vários componentes.
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[0641] Os resultados acima mencionados fornecem uma visão sobre o uso de nanofibras (e potencialmente nanopartículas por extensão) para a distribuição de produtos farmacêuticos nas células. No presente exemplo, foi usado um modelo de célula cancerígena HT 29 que é uma linhagem celular de câncer colorretal e uma linhagem celular de câncer colorretal multirresistente CRL 2158, para estudar a eficácia do paclitaxel complexado com nanofibras. Os efeitos citotóxicos do paclitaxel sozinho e do paclitaxel complexado com nanofibras foram quase os mesmos nas células HT 29. Esta linha celular, sendo não multirresistente, é suscetível à citotoxicidade pelo paclitaxel sozinho. Essas células também responderam ao paclitaxel complexado com nanofibras, sugerindo que a droga é liberada do complexo dentro da célula, e não retido pela nanofibra. O desenvolvimento de resistência a múltiplos medicamentos é um grande problema com a quimioterapia do câncer, em que as células bombeiam ativamente os medicamentos, eliminando assim a citotoxicidade. No caso do CRL 2158, a capacidade de multirresistência foi revelada pela sua resistência ao tratamento com paclitaxel. No entanto, a resistência a múltiplas drogas foi superada pela complexação com as nanofibras, onde quase 100% das células MDR apresentaram citotoxicidade. Assim, a complexação com nanofibras fornece uma via para combater as células multirresistentes. Curiosamente, as células intestinais normais (CRL 1790) não mostraram citotoxicidade para o paclitaxel sozinho ou para o complexo paclitaxel-nanofibra na concentração de paclitaxel usada, indicando a segurança desse tratamento para as células. Discussão:
[0642] As características composicionais e estruturais das nanopartículas e nanofibras formadas durante a homogeneização de frutos de ginja por meio da automontagem de componentes celulares, incluindo aqueles originários da parede celular (celulose, pectina, proteína) e componentes vacuolares, como antocianinas e ácido málico, são avaliadas. As nanopartículas eram complexos esféricos com cerca de 50 a cerca de 250 nm de diâmetro compreendendo um núcleo de pectina enrolado em estruturas em forma de fibra em espiral. Em contraste, as nanofibras formadas a partir de frutas cereja branqueadas com etanol eram semelhantes a fibras (cerca de 5 a cerca de 10 nm de largura) e micrômetros de comprimento. Antocianinas e ácido málico foram removidos dos frutos para facilitar a formação de nanofibras nesses estudos. Frutos com baixo
170 /209 teor de antocianinas podem, portanto, ter uma tendência preferencial para formar nanofibras de acordo com os métodos aqui descritos. Devido à presença de antocianinas nas nanopartículas, estas apresentam alta atividade antioxidante e, portanto, podem ser um complexo estrutural nutricionalmente relevante. Em testes de citotoxicidade, as nanofibras mostraram atividade muito maior quando complexadas com drogas anticâncer. O presente Exemplo descreve os efeitos funcionais potenciais das nanopartículas e nanofibras em células de mamíferos.
[0643] Polifenóis em alimentos e medicamentos/interações com drogas: Intervenções nutricionais e alimentares tornaram-se recentemente estratégias complementares em potencial para diminuir a infrarregulação de várias doenças inflamatórias (Willcox et al., 2004). A ingestão alimentar de frutas ricas em polifenóis resultou na infrarregulação de vários marcadores de inflamação em modelos animais e humanos (Gonzalez-Galego et al., 2010). O consumo de sucos de frutas e produtos de uva e romã em nível moderado resultou no aumento da função antioxidante e na redução da peroxidação lipídica no plasma (Garcia-Alonso et al., 2006; Jensen et al, 2008). Os resultados de vários estudos mostram uma correlação inversa entre o consumo de frutas e legumes e a expressão de marcadores de inflamação no sangue, como CRP (proteína C-reativa) e IL6 (interleucina 6) e vários outros marcadores de inflamação como CRP, IL-6 e TNF (Holt et al., 2009). Em um grupo de 120 homens e mulheres com idades entre 40-74, a ingestão de extratos de mirtilo ricos em polifenóis (300 mg/dia por 3 semanas) causou uma redução significativa nos níveis plasmáticos de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas (IL-4, IL-13, IL-8 e IFN-) da via NF-B (Karlsen et al., 2007). Da mesma forma, o aumento do consumo de cerejas bing (280g/dia) resultou em níveis reduzidos de CRP e NO (Kelley et al., 2006). Os polifenóis da ginja são fortes inibidores da enzima ciclooxigenase, uma enzima chave envolvida na via inflamatória (Chandra et al., 2002). Em um estudo envolvendo homens idosos de 70 anos, o aumento da ingestão de alimentos ricos em antioxidantes resultou em redução da ciclooxigenase, inflamação mediada por citocinas e estresse oxidativo (Helmersson et al., 2009). Assim, os alimentos que contêm polifenóis têm a propriedade de infrarregular a via inflamatória e, assim, prevenir doenças crônico-degenerativas, como câncer, doenças cardiovasculares e doenças neurodegenerativas.
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[0644] Uma questão importante que foi levantada em relação ao efeito biológico dos polifenóis é que se acredita que eles são muito mal absorvidos (0,5% -1,5%) através do sistema gastrointestinal. Da mesma forma, a alcalinização dos alimentos durante o trânsito do estômago para o intestino, por mistura com suco pancreático e biliar, desestabiliza a estrutura da antocianina, resultando na abertura do anel e degradação parcial.
[0645] No presente Exemplo, é demonstrada a internalização eficaz de nanopartículas (e nanofibras) por células humanas. Uma vez que as antocianinas são estabilizadas nas nanopartículas e podem ser resistentes às mudanças de pH, a internalização das nanopartículas pode ser uma forma alternativa de distribuição de polifenol no GIT. Assim, a formação de nanopartículas contendo polifenóis pode aumentar a biodisponibilidade dos polifenóis, pois eles podem contornar a absorção mediada por carreador típico no jejuno, possibilitando sua absorção em sítios pré-intestinais. A formação de complexos também pode ajudar a transportar os polifenóis para áreas a jusante do intestino, como as partes distais do intestino delgado e do cólon, onde podem exercer efeitos benéficos. Em certas modalidades, é contemplado que estes podem envolver a função antioxidante para proteger o tecido intestinal de espécies reativas de oxigênio geradas pela microbiota colônica, modular a proliferação celular e/ou permitir a formação de metabólitos que podem fornecer benefícios adicionais à saúde.
[0646] Distribuição de drogas, importância das Bionanopartículas: avanços tremendos foram feitos no desenvolvimento de estratégias baseadas em nanotecnologia na medicina e na saúde, utilizando tanto nanomateriais engenheirados quanto aqueles preparados a partir de biomoléculas naturalmente existentes. A detecção de sítios de câncer por direcionamento in vivo de nanoestruturas e conjugados de nanoestruturas é uma área de grande interesse, no entanto, são necessárias mais informações sobre o mecanismo de captação e biodistribuição. Acredita-se que as nanoestruturas e seus conjugados se acumulem por meio de vários mecanismos, incluindo endocitose, entrada não específica, vesiculação, etc. (Iversina et al., 2011). No entanto, estudos recentes também trazem evidências para mecanismos de captação específicos. Descobriu-se que os SWNTs são especificamente sequestrados em um grupo de células imunes, monócitos Ly6c (Smith et al., 2014). A conjugação dos
172 /209 SWNTs com um peptídeo de direcionamento RGD aumentou ainda mais a entrada de nanoestruturas nos monócitos. Os monócitos, portanto, forneceram a distribuição de SWNTs por meio de um mecanismo de cavalo de Tróia no local do tumor, permitindo o acúmulo de quase 25% dos SWNTs no local de destino. Assim, o direcionamento de células tumorais com células imunes pode fornecer uma estratégia eficaz para a distribuição de drogas contra o câncer.
[0647] A mitocôndria é uma organela crítica envolvida na determinação da sobrevivência ou apoptose das células cancerosas. Interromper a geração de energia mitocondrial é um passo fundamental para direcionar as células cancerosas para as vias apoptóticas. O direcionamento de peptídeos indutores de apoptose para mitocôndrias é de grande interesse para matar células cancerosas, no entanto, as limitações incluem a não especificidade de distribuição e a falta de solubilidade. O aumento da distribuição de indução de apoptose, mitocôndrias direcionadas a peptídeos de ancoragem de cauda anfipática (ATAP) a células de câncer maligno e células cancerosas metastáticas por conjugação com nanopartículas de núcleo-revestimento magnético foi considerado uma maneira eficiente de aumentar a eficácia quimioterápica (Shah et al., 2014). A distribuição de siRNAs para silenciamento simultâneo de vários genes que são suprarregulados em células cancerosas pode ser alcançada por meio de nanoestruturas poliméricas sintetizadas a partir de poliaminas de baixo peso molecular e lipídios (Dahlman et al., 2014) em células endoteliais vasculares em modelos de camundongo (Dahlman et al., 2014).
[0648] Características físico-químicas, como composição, tamanho, distribuição de carga superficial, etc., podem afetar a absorção celular de nanoestruturas. Em um estudo recente (Agarwala et al., 2013) relataram que, além dessas características, a própria forma das nanoestruturas pode influenciar sua absorção. Neste estudo, células epiteliais de mamíferos, células endoteliais e células imunes foram observadas para internalizar preferencialmente nanoestruturas em forma de disco hidrofílicas carregadas negativamente. Nanodiscos com uma razão de aspecto alta foram preferidos em relação aos nanodiscos de razão de aspecto mais baixa e nanoestruturas em forma de bastão. As nanoestruturas esféricas também são internalizadas com uma eficiência menor, mesmo quando seus tamanhos são reduzidos. Cabral et al. (2011) também relataram que o acúmulo de nanoestruturas em tumores também
173 /209 depende do tamanho. O processo de internalização da nanoestrutura pode ser complexo envolvendo interações entre as nanoestruturas e a membrana, energia para adesão e deformação da membrana celular, bem como a concentração da nanoestrutura na superfície da membrana celular.
[0649] As nanopartículas e nanofibras aqui descritas isoladas de cereja são estruturalmente complexas. O pó liofilizado da nanopartícula foi resistente a ácido (4M HCl), álcali (1M NaOH) e congelamento. Tanto as nanopartículas quanto as nanofibras formaram complexos com pequenas moléculas (corantes, drogas), que não se dissociaram. Drogas como o paclitaxel também podem ser conjugadas com essas estruturas. O paclitaxel é um medicamento eficaz para o tratamento do câncer. Estes estudos indicam que a eficácia do paclitaxel pode ser aumentada quando fornecido a células de mamíferos juntamente com nanofibras. Além disso, as células cancerosas multirresistentes (CRL 2158) mostraram resistência ao paclitaxel. Quando fornecido junto com as nanofibras, o paclitaxel mostrou citotoxicidade semelhante às células MDR, assim como as células cancerosas HT 29 normais. Assim, a aplicação de drogas junto com nanofibras pode contornar a exclusão do paclitaxel, aumentando sua eficácia. Um aspecto interessante é que o aumento da eficiência pode resultar de associações puras entre nanofibras e paclitaxel. Além da formação de complexos com moléculas orgânicas, nanofibras e nanopartículas podem ser capazes de se ligar a metais como ferro, zinco, Mg, Se e/ou outros. É contemplado que em certas modalidades, com a maior eficiência de internalização das nanopartículas e nanofibras, a eficiência da ingestão de íons metálicos pode ser aumentada, reduzindo assim a dosagem.
[0650] Os resultados do presente Exemplo sugerem que as nanopartículas e estruturas de nanofibras têm aplicações funcionais. As nanopartículas por si só podem ser um antioxidante de alta eficiência e podem ser adequadas para aplicações terapêuticas onde a função antioxidante localizada é desejável.
[0651] As nanofibras foram altamente potentes na internalização de drogas conjugadas ou complexadas. A internalização de complexos de paclitaxel-nanofibras pode contornar a capacidade de eliminação de drogas de cânceres multirresistentes, tornando-os tão suscetíveis a drogas contra o câncer quanto as células cancerosas que são mortas por drogas simples. Assim, os
174 /209 resultados indicam que tanto as nanopartículas quanto as nanofibras podem ter potencial notável para aumentar a eficiência do tratamento do câncer, por exemplo.
[0652] Os resultados descritos em detalhes neste documento indicam que a preparação de nanopartículas, nanofibras e pós alimentícios em particular pode ser alcançada pelo processamento de (por exemplo) frutas maduras envolvendo homogeneização, durante a qual as matrizes da parede celular, como celulose, pectina e proteínas, que estão em um estado parcialmente desmontado, pode se reunir espontaneamente em, por exemplo, nanopartículas bem estruturadas incorporando polifenóis (antioxidantes, moduladores do metabolismo celular e expressão gênica), ácidos orgânicos como o ácido málico e peptídeos resultantes da proteólise. Nanopartículas com estrutura semelhante são formadas durante o processamento semelhante de outras frutas. No mirtilo, por exemplo, as nanopartículas formadas são estruturalmente semelhantes às formadas na ginja. No presente Exemplo, são investigadas as atividades nutricionais e antiproliferativas de nanopartículas e nanofibras de ginja.
[0653] A nanotecnologia tem feito grandes avanços na medicina, especialmente na distribuição direcionada de medicamentos. Embora o uso de nanomateriais projetados tenha sido complicado devido à toxicidade e à incapacidade do sistema de eliminar os nanomateriais de forma eficiente (Maynard, 2006; Lewinski et al., 2008; Kunzman et al., 2011; Yamashita et al., 2011), o uso de nanopartículas derivadas de materiais biológicos que são facilmente degradáveis em sistemas biológicos podem fornecer novos caminhos para a distribuição de drogas direcionadas.
[0654] No presente Exemplo, é descrita a capacidade de nanopartículas (e nanofibras) isoladas de frutos de ginja para internalizar em células normais e cancerosas, e sua capacidade de causar citotoxicidade quando contendo antocianinas, ou a droga anticâncer paclitaxel. As nanofibras eram derivadas de frutas de ginja que eram desprovidas de antocianinas. Como os componentes de construção das nanofibras são componentes derivados de alimentos, uma aplicação farmacêutica dos componentes de alimentos pode ser considerada menos prejudicial às células normais do que quando drogas conjugadas com componentes sintéticos são ingeridas, por exemplo. Da mesma forma, sem desejar estar limitado pela teoria, a internalização dessas estruturas pelas
175 /209 células sugere que os componentes (pectina, peptídeos, antocianinas, ácidos orgânicos, etc.) podem ter uma forma de entrada diferente do GIT. Pode ser que tais nanopartículas possam servir como facilitadores para a absorção de antocianinas que são muito pouco absorvidas como moléculas simples, mas apresentam grande atividade antioxidante e potencial citotóxico em condições in vitro. EXEMPLO 4 - Estudos de preparação, estrutura e aplicações de pós alimentícios Preparação de Pós Alimenticios e Investigação Estrutural
[0655] Neste Exemplo, são descritos pós alimentícios funcionais feitos de extratos de brócolis, ginja, amêndoa, soja e/ou cúrcuma, ou qualquer combinação dos mesmos (e, particularmente, todos estes componentes), por meio de mistura de alto cisalhamento e secagem com nanopulverização. Cada partícula do pó continha uma mistura substancialmente uniforme de nutracêuticos originários das matérias-primas (Sulforafano, indol-3-carbinol, polifenóis, fitoesteróis, isoflavonas, curcumina, etc.); em comparação com uma mistura de pós secos individuais originários de cada componente bruto.
[0656] O pó alimentício, em uma forma com alta atividade antioxidante, proporcionou alta biodisponibilidade dos ingredientes e, em geral, apresentou atividade antiinflamatória de amplo espectro. Assim, o consumo do pó alimentício pode fornecer proteção contra o desenvolvimento de doenças crônicas, particularmente quando usado em conjunto com um estilo de vida saudável adequado.
[0657] O consumo de frutas e legumes nos níveis recomendados, em conjunto com um estilo de vida saudável e ativo, é amplamente reconhecido por reduzir o desenvolvimento de doenças crônicas como obesidade, diabetes tipo II, câncer, inflamações nas articulações, etc. No entanto, o consumo de frutas e legumes em quantidades adequadas está faltando pelo público em geral. Devido ao estilo de vida atual, a incidência de obesidade aumentou, especialmente a obesidade infantil. Em um esforço para aumentar a ingestão alimentar dos componentes ativos comumente disponíveis em frutas e legumes, os presentes alimentos em pó foram desenvolvidos, com ingredientes em uma forma biodisponível. A biodisponibilidade de componentes nutracêuticos é geralmente baixa em frutas e legumes devido a várias razões. Com os pós alimentícios
176 /209 descritos presentemente, pode ser possível aumentar a biodisponibilidade e, assim, aumentar a eficácia destes componentes.
[0658] Os principais componentes alimentares (e alguns agentes nutricionais dos mesmos) usados neste Exemplo incluem o seguinte: Brócolis - Contém os componentes nutracêuticos (ou seja, agentes nutricionais), como precursores de sulforafano e indol-3-carbinol. Ambos os componentes aumentam o sistema antioxidante inato (via KEAP-1/NRF2/ARE) e as enzimas de fase 2 envolvidas na eliminação de xenobióticos. Ginja – Ginja contém cianindina-3glucosídeo/rutinosídeo como o polifenol principal. O extrato de ginja demonstrou ser um forte antiinflamatório para inflamações nas articulações. Amêndoa - A amêndoa contém ácidos graxos insaturados essenciais e fitoesteróis e pode reduzir a biossíntese do colesterol. Também é uma fonte elevada de vitamina E. Leite de soja - A soja é uma fonte de isoflavonas e proteínas. Acafrão da terra – A cúrcuma é uma especiaria e foi reconhecida por sua propriedade antiinflamatória. A cúrcuma contém curcumina, que é um forte inibidor da ciclooxigenase. Pesquisas recentes também confirmaram sua capacidade de reduzir a obesidade em modelos experimentais in vivo.
[0659] Materiais e Métodos: O pó alimentício foi preparado pela mistura de vários componentes, juntamente com os extratos de ginja (que é o principal componente de sua preparação). Extratos de florzinhas de ginja e brócolis foram preparados independentemente misturando-os em água (proporção de 1 g para 2 ml) usando um misturador de alta velocidade Reicht a 4000 rpm por 5 minutos. O homogenato foi filtrado através de 4 camadas de tecido de gaze e os detritos descartados. Os homogeneizados foram armazenados resfriados até o uso.
[0660] Cem ml de extrato de ginja, 100 ml de extrato de brócolis, 100 ml de leite de amêndoa (~8% p/v; marca Silk™; distribuído por Whitewave Foods, Colorado, EUA); 50 ml de leite de soja (~10%) e 5 g de cúrcuma em pó foram misturados em um misturador de alta velocidade Reicht a 5000 rpm durante 5 minutos. A mistura foi armazenada em frio durante 2 horas e decantada. A solução foi ajustada a uma consistência diluída com água e submetida a secagem por nanopulverização conforme descrito anteriormente no Exemplo 1
177 /209 usando configurações semelhantes. O pó seco foi coletado e armazenado frio em atmosfera de nitrogênio a -20°C em garrafas marrons.
[0661] Resultados e discussão: Os experimentos foram realizados para preparar e caracterizar estruturalmente o pós alimentícios.
[0662] Tal como aqui descrito, os pós alimentícios presentemente descritos podem ser preparados com geralmente qualquer tecido de planta adequado que pode ser usado para preparar nanopartículas e/ou nanofibras como aqui descrito. Em certas modalidades, o pó alimentício pode ser preparado a partir de uma fruta, legume ou outro tecido de planta ou produto capaz de formar nanopartículas ou nanofibras à base de carboidratos, conforme descrito neste documento. Pós alimentícios podem ser preparados em qualquer meio adequado compreendendo aquoso, orgânico ou uma combinação dos mesmos. Os pós alimentiicos podem, em certas modalidades, compreender ainda um material contendo nutrientes (ou um nutriente) que se deseja incluir no produto de pós alimentício (que será tipicamente adaptado para a aplicação pretendida do pó alimentício), e pode incluir pós frescos, processados ou concentrados, sozinhos ou em quaisquer combinações desejadas por peso ou volume.
[0663] Em certas modalidades, o pó alimentício pode ser preparado por homogeneização dos materiais de partida do pó alimentício. Por exemplo, a homogeneização pode ser conseguida usando um misturador, de preferência operando em alta rpm e capaz de gerar forças de cisalhamento elevadas, ou qualquer outra máquina adequada capaz de mistura de alto desempenho, como um sonolador.
[0664] Em certas modalidades, o pó alimentício pode ser filtrado para remover detritos, ou os detritos podem ser removidos da mistura homogeneizada. A título de exemplo, um dispositivo centrífugo ou dispositivo de filtração (por exemplo, um dispositivo de filtração por membrana ou dispositivo de filtração de fluxo tangencial) capaz de filtrar os detritos (ou seja, matéria particulada que não foi para o homogenato e se deposita sob a gravidade) pode ser usado para remover detritos.
[0665] Em certas modalidades, o pó alimentício pode então ser desidratado, liofilizado, seco por pulverização, seco por nanopulverização ou de outra forma desidratado ou seco. A título de exemplo, o equipamento que é capaz de remover água (ou outro solvente sendo usado) pode ser usado, que
178 /209 pode incluir um secador de nanopulverização, ou um liofilizador para amostras aquosas, ou mais preferencialmente um secador por pulverização de alta eficiência capaz de secagem por pulverização de grandes volumes podem ser usados, por exemplo. Em certas modalidades, o secador pode operar sob pressão reduzida.
[0666] Em certas modalidades, os pós alimentícios descritos neste documento podem ser preparados a partir de um tecido de planta que é adequado para a preparação de uma nanopartícula e/ou uma nanofibra, conforme já descrito em detalhes neste documento, em combinação com um material contendo nutrientes. Como será entendido, o material contendo nutrientes será tipicamente adaptado para a aplicação pretendida do pó alimentício, e pode incluir pós frescos, processados ou concentrados, sozinhos ou em quaisquer combinações desejadas por peso ou volume. Em certas modalidades, o pó alimentício pode ser desenvolvido com componentes contendo nutrientes ou com componentes direcionados para abordar uma condição fisiológica particular (como uma condição crônica, por exemplo), e tal material contendo nutrientes pode ter propriedades preventivas e/ou curativas, por exemplo. Como será entendido, o termo nutriente, tal como aqui utilizado, pode incluir qualquer agente ativo adequado ou composto apropriado para a indicação particular (ou material compreendendo o referido agente ou composto ativo), e não está limitado às entidades tipicamente consideradas como nutrientes, tais como aqueles encontrados na comida. A título de exemplo, em certas modalidades, um nutriente pode incluir qualquer ingrediente natural (ou não natural) adequado com um benefício para a saúde.
[0667] Em certas modalidades, o pó alimentício pode compreender:
1. Ginja (ou extrato de ginja), ou uma outra fruta ou legume (ou extrato do mesmo) que é capaz de formar nanopartículas ou nanofibras à base de carboidratos como aqui descrito;
2. Um componente hidrofóbico (tal como, mas não limitado a, leite de amêndoa) que pode incorporar moléculas hidrofóbicas das substâncias adicionadas (outros exemplos sendo leite de coco ou leite derivado de nozes comestíveis, por exemplo); e,
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3. Um material contendo nutrientes (como um extrato alimentar funcional, por exemplo) que contém um ou mais ingredientes/ingredientes bioativos adaptados para a aplicação desejada do pó alimentício, por exemplo.
[0668] Alguns exemplos não limitativos de materiais contendo nutrientes podem incluir um ou mais dos seguintes compostos ativos e/ou famílias de plantas: Carotenóides (ou seja, beta-caroteno, licopeno, luteína e outras xantofilas, astaxantina, etc.); Anonacinas (isto é, policetídeos derivados de frutas Annona com propriedades anticâncer); Boswellia (que pode atuar em conjunto com a curcumina, proporcionando função antiinflamatória adicional); Ashwagandha (um componente à base de ervas contendo anoliides com propriedades anti-estresse e preventivas do câncer, principalmente com uma estrutura esteróide); Membros da família Ginger que podem incluir, por exemplo, gengibre comestível (Zingiber officinalis), mango ginger (Curcuma amada) ou outros contendo qualquer um dos vários ingredientes bioativos, incluindo gingeróis e shogaols; Curcuma longa (isto é, cúrcuma, contendo curcumina); Canabinodióis (que são os ingredientes medicinalmente ativos de Cannabis sp. sem atividade alucinógena); Fruto-oligossacarídeos e galacto-oligossacarídeos, bem como inulina de alcachofra de Jerusalém, para aumentar o conteúdo prebiótico; Membros Piperaceae, como Piper nigrum e seus parentes selvagens contendo piperina e vários derivados; e/ou qualquer outro ingrediente(s) adequado(s) (tais como, mas não limitado a, aqueles derivados de plantas) não listados acima; e/ou qualquer extrato, derivado, produto isolado do mesmo, ou material ou tecido de planta contendo tal componente.
[0669] Neste Exemplo, um pó alimentício foi preparado a partir dos seguintes materiais de partida:
1. Um extrato aquoso de ginja;
2. Um homogenato de amêndoas comercialmente disponível como leite de amêndoa;
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3. Um homogenato de soja disponível comercialmente como leite de soja;
4. Um extrato aquoso de brócolis; e
5. Pó de cúrcuma.
[0670] Esses materiais de partida foram misturados em um misturador de alta velocidade (Recht, ATS Scientific, Burlington) a 4500 rpm; e secos por nanopulverização em um secador Buchi Nanospray sob as configurações recomendadas. Os volumes/pesos usados incluíram:
[0671] Cem ml de extrato de ginja (1-2 mg/ml de equivalente de polifenol foram usados, embora seja contemplado que uma concentração variando de cerca de 0,1 mg/ml a uma solução completamente saturada de polifenóis em água ou outro solvente pode ser usada); Cem ml de leite de amêndoa a ~8-10%, p/v; 50 ml de leite de soja a cerca de ~8-10% p/v; Cem ml de extrato de brócolis; e 5 g de pó de cúrcuma.
[0672] Como será entendido, enquanto o volume de extrato de ginja foi mantido em 100 ml neste Exemplo, em outras modalidades é contemplado que o volume/peso de ginja e/ou outros ingredientes podem ser variados conforme desejado, e componentes adicionais podem ser incluídos em quaisquer proporções adequadas.
[0673] A Figura 44 mostra uma micrografia eletrônica de varredura de um pó alimentício preparado a partir de ginja, brócolis e outros ingredientes alimentícios como aqui descrito. O pó alimentício foi preparado misturando uma mistura de soluções homogeneizadas de componentes individuais e secagem por nano-pulverização da mistura combinada. O pó alimentício foi preparado usando a mistura específica descrita imediatamente acima.
[0674] A Figura 45 mostra uma micrografia eletrônica de transmissão de uma solução aquosa do pó alimentício mostrando características ultraestruturais. A Figura 45 representa o mesmo pó alimentício, conforme ilustrado em Figura 44 descrita acima. Uma alíquota de cinquenta microlitros da suspensão de pó alimentício foi colocada em uma lâmina de vidro e uma grade revestida de carbono foi flutuada na solução com o lado revestido voltado para baixo, por 30 segundos. A grade foi seca com papel absorvente nas bordas e tingida com uma solução de 0,1% de acetato de uranila. O pó alimentício aparece como oblongo
181 /209 a massas esféricas de estruturas de fibra firmemente enroladas (ver seta designada como A). A estrutura se assemelha a uma nanopartícula, mas sem uma organização estrutural, conforme observado nas nanopartículas de ginja (ver Figura 17). Na verdade, a estrutura pode ser considerada como uma nanosfera, definida por estruturas fibrosas que se enrolam em torno de si mesmas para formar a estrutura semelhante a uma nanosfera (não muito diferente de um novelo de barbante emaranhado, com uma ou mais fibras emaranhadas em uma estrutura semelhante a um novelo). Uma estrutura globular feita de nanofibras enroladas em torno de si mesmas (seta designada como B) pode ser observada com estruturas de fibra emanando dela. Essa estrutura é análoga à de uma nanosfera, onde as fibras são enroladas e capazes de adsorver vários tipos de ingredientes funcionais. As estruturas organizadas em espiral (seta C) são análogas às fibras espirais observadas nas nanopartículas. Neste exemplo de pó alimentício, o pó alimentício contém agentes nutricionais contribuídos pelo extrato de brócolis e componentes do pó de cúrcuma. Estes agentes nutricionais são complexados com as estruturas fibrosas acima descritas e podem contribuir para a formação de pó alimentício e/ou estrutura resultante. Aplicações de Pó Alimentício usando Modelo de Camundongo Obeso in vivo Materiais e Métodos:
[0675] Análise de expressão - Produtos químicos e reagentes. O kit de triglicerídeo M tipo L foi adquirido na Wako Diagnostics (Osaka, Japão e Neuss, Alemanha). O kit RNeasy Plus para isolamento de RNA foi da Qiagen (Valencia, CA, EUA). O kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade para preparação de cDNA foi da Applied Biosystems (Foster city, CA, EUA). O kit RT2Profiler™ PCR Array Mouse Inflammatory Cytokines & Receptors era da Qiagen (Valencia, CA, EUA). O iQ SYBR Green Supermix era da Bio-rad (Califórnia, EUA).
[0676] Tratamento de Pó Alimenticio. Os experimentos foram realizados com controles de camundongos Knock out Pcyt2 e controles de companheiro de ninhada com 36 a 48 semanas de idade. Grupos não tratados de KO e camundongo de controle (n = 3-6 cada) estavam ingerindo (via gavagem) 100uL de água diariamente e grupos tratados de KO e camundongo de controle (n = 3-
182 /209 6 cada) foram administrados com 100 ug do pó alimentício (em 100uL água) 5 vezes por semana. A gavagem oral para todos os grupos durou 8 semanas. Os testes foram repetidos duas vezes e, no final dos testes, os camundongos foram sacrificados e usados para análises de sangue e tecido.
[0677] Isolamento de RNA total e Expressão Gênica. O RNA total foi isolado usando o kit RNeasy Plus (Qiagen, Valencia, CA, EUA) e o cDNA foi preparado usando o kit de High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems, Foster city, CA, EUA). O RT-qPCR foi feito usando o kit RT2Profiler™ PCR Array Mouse Inflammatory Cytokines & Receptors adequado para a máquina Bio-rad CFX96 RT-qPCR. O RT2 Profiler™ PCR Arrays em placas de 96 poços contêm ensaios de primer para 84 vias ou genes focados em doenças. Os genes de interesse foram analisados na fase exponencial da amplificação por PCR, utilizando a quantidade ideal de cDNA e o número do ciclo da reação. Cada nível de gene é expresso em relação ao controle interno de B2m (Beta-2-Microglobulina). Os experimentos foram realizados usando amostras de fígado coletadas de camundongos fêmeas Pcyt2 +/- e Pcyt2 +/+. Os níveis de genes são expressos como alterações em dobras em relação aos controles. Os resultados do RT-qPCR foram analisados usando o método comparativo ΔΔCt.
[0678] Análise estatística. A análise estatística foi concluída usando Prism GraphPad. Os dados são expressos como média ± S.E. A significância estatística foi calculada usando o teste t de Student (valores de P <0,05 foram considerados significativos) ou ANOVA multifatorial. Quando um efeito significativo foi encontrado, as comparações post hoc foram realizadas usando o teste de Tukey da diferença honestamente significativa. As diferenças foram consideradas significativas em P <0,05.*
[0679] Resultados e Discussão: As experiências foram realizadas para investigar a aplicação de pós alimentícios como aqui descrito. Para estes estudos, foi utilizado o pó alimentício preparado nos estudos descritos imediatamente acima.
[0680] A Figura 46 mostra a avaliação da capacidade antioxidante do pó alimenticio. O pó foi dissolvido em água e a capacidade antioxidante da solução foi determinada estimando a capacidade de sequestro do radical DPPH da solução como equivalente de polifenol (estimado pelo reagente de Folin-
183 /209 Ciocalteau) em microgramas. Um reagente de Folin-Ciocateau 0,1 mM foi preparado em metanol, e a solução de pó alimentício foi adicionada nas quantidades especificadas. Os antioxidantes foram deixados reagir com 1 ml de reagente DPPH, e a absorbância (roxo, 517 nm de absorção) foi monitorada. O declínio na absorbância de 517 nm foi observado e expresso como % de extinção em comparação com um controle sem polifenol. Trolox foi usado como um controle positivo nas mesmas concentrações dos polifenóis e apresentou um valor TEAC de 1. Cada ponto em uma concentração representa uma amostra individual de pó alimentício preparado. Os resultados mostram forte capacidade antioxidante do pó alimentício. Uma vez que a biodisponibilidade dos componentes antioxidantes (ligados à estrutura da nanofibra) provavelmente será maior, esses resultados sugerem que o pó alimentício pode ter um impacto maior em termos de eliminação de radicais livres e redução da inflamação em comparação com os componentes que são livres em solução.
[0681] A Figura 47 mostra a avaliação das mudanças na massa corporal em camundongos selvagens (WT) e Knock out de etanolamina (KO) tratados com pó alimentício e água. Os experimentos foram realizados com camundongos knock out (KO) de Pcyt2 de 24 semanas e controles de ninhada. Grupos não tratados (U) de camundongos KO e do tipo selvagem (n = 4-6 cada) receberam 100uL de água por gavagem no momento do tratamento. Os grupos tratados (T) de camundongos KO e de tipo selvagem (WT) (n = 4-6 cada) foram administrados com 100 µg do pó alimentício (em 100 uL de água) 5 vezes por semana. A gavagem oral para todos os grupos durou 8 semanas. No final do período de tratamento, os camundongos foram sacrificados e amostras de sangue e tecido foram coletadas para análise. As estrelas indicam valores significativamente diferentes (*- P<0,05; **- P <0,01). Esses resultados sugerem que o tratamento com pós alimentícios pode ter um efeito significativo na prevenção do ganho de peso. Em sistemas que podem estar comprometidos geneticamente resultando em obesidade, o consumo de pós alimentícios pode ser uma opção na manutenção do peso. O tratamento com pós alimentícios também pode servir como uma intervenção para quem desenvolve obesidade devido a hábitos alimentares pouco saudáveis.
[0682] A Figura 48 mostra o efeito do tratamento com pós alimentícios nas alterações dos níveis de triglicerídeos no fígado. Os níveis de triglicerídeos do
184 /209 tecido hepático foram estimados por procedimentos descritos no kit de ensaio Wako L-type TG M (Wako Life Sciences, CA, EUA). Não há redução significativa nos níveis de triglicerídeos em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO submetidos ao tratamento com pós alimentícios. Os valores são a média ± SEM de três amostras separadas. Parece haver uma tendência na redução dos triglicerídeos nos camundongos obesos tratados com pó alimentício. A redução dos triglicerídeos no fígado pelo tratamento com pós alimenticios pode ser benéfica em indivíduos que apresentam síndrome metabólica e tendência a desenvolver obesidade. O acúmulo de lipídios no fígado é uma síndrome associada à doença do fígado gorduroso. É possível que os componentes do pó alimenticio possam, pelo menos parcialmente, reverter essa síndrome e problemas de saúde associados.
[0683] A Figura 49 mostra os parâmetros do soro sanguíneo de camundongos do tipo selvagem e ETKO tratados e não tratados com pó alimentício. Não houve grandes mudanças nos níveis de albumina, globulina e suas proporções. Não houve diferença significativa entre o grupo controle e o grupo de tratamento em termos de proteína total. Os valores são a Média ± SEM de 3 tratamentos independentes. Esses dados sugerem que o tratamento com pó alimentício não causa alterações significativas em diversos parâmetros fisiológicos, o que sugere que sua ação pode ser relativamente mais específica para determinadas condições.
[0684] A Figura 50 mostra os parâmetros do soro sanguíneo de camundongos do tipo selvagem e ETKO tratados e não tratados com pó alimentício. Não há grandes mudanças nos níveis de glicose, fósforo e ureia. Parece haver uma ligeira diminuição nos níveis de triglicerídeos em camundongos obesos tratados com o pó alimentício. Os valores são a Média ± SEM de 3 amostras independentes. Esses dados sugerem que o tratamento com pó alimentício não causa alterações significativas em diversos parâmetros fisiológicos, o que sugere que sua ação pode ser relativamente mais específica para determinadas condições.
[0685] A Figura 51 mostra mudanças nos níveis de transcrição de quimiocinas (citocinas quimiotáticas) em camundongos do tipo selvagem e ETKO tratados com o pó alimentício. As quimiocinas do tipo CCL são pequenas glicoproteínas secretadas por células T ativadas que causam atração de
185 /209 monócitos para o local da inflamação. CCL1 (quimiocina de motivo C-C com ligante 1) e seus membros da família (CCL2, CCL3, CCL5 ...) estão envolvidos em processos de inflamação. Uma redução significativa em CCL2 e CCL5 foi observada em camundongos do tipo selvagem em resposta ao tratamento com pó alimentício. Há uma tendência de redução dessas quimiocinas após o tratamento com pó alimentício em camundongos ETKO, mas não são significativamente diferentes neste teste. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. O CCL1 se liga ao CCR8 para sua função. CCL2 (proteína 1 quimioatrativa de monócito; MCP1) também está envolvida na atração de monócitos para locais de inflamação e se liga aos receptores CCR2 e CCR4. CCL3 (proteína inflamatória do macrófago-Alfa; MIPl-a) está envolvida na inflamação aguda e é um atrativo de células brancas do sangue. Liga-se aos receptores CCR1, CCR4 e CCR5). O CCL5 se liga ao receptor de superfície CCR5 e está envolvido na inflamação e na progressão do câncer. Esses dados sugerem que o tratamento com pós alimentícios pode resultar na infrarregulação desses componentes da inflamação.
[0686] A Figura 52 mostra mudanças nos níveis de transcrição de quimiocinas (citocinas quimiotáticas) em camundongos do tipo selvagem e ETKO tratados com o pó alimentício. As quimiocinas do tipo CCL são pequenas glicoproteínas secretadas por células T ativadas que causam atração de monócitos para o local da inflamação. A figura mostra as mudanças nos níveis de transcrição de CCL6, CCL7, CCL17 e CCL19. O CCL6 é exclusivo para roedores e pode se ligar ao CCR1 durante sua ação. O CCL6 é expresso em macrófagos durante a diferenciação das células mieloides. Uma redução significativa em CCL6, CCL7 e CCL17 foi observada em camundongos do tipo selvagem em resposta ao tratamento com pó alimentício. Uma redução significativa em CCL7 foi observada em camundongos ETKO. CCL19 não mostrou nenhuma alteração nos transcritos em ambos os camundongos tipo selvagem e ETKO. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. O CCL6 se liga ao CCR1 para sua função. O CCL7 também está envolvido na atração de monócitos para locais de inflamação e se liga ao receptor CCR2. Níveis anormais de expressão de CCL7 estão relacionados à tumorigênese e ativação e metástase de MMP-2.
186 /209 Assim, a infrerregulação de CCL7 é provavelmente altamente benéfica na prevenção do câncer. O CCL17 está envolvido na quimioatração de linfócitos e na indução de doenças inflamatórias, como aterosclerose e doenças inflamatórias intestinais. O CCL19 está envolvido na recirculação de linfócitos. De modo geral, esses resultados apóiam a redução dos níveis de componentes envolvidos no aumento da inflamação.
[0687] A Figura 53 mostra as alterações nos níveis de transcrição da quimiocina CCL22 (citocinas quimiotáticas) em camundongos do tipo selvagem e ETKO tratados com o pó alimentício. O CCL22 é produzido por tumores e células T que se infiltram no tumor, causando imunossupressão e evasão de células do sistema imunológico pelo tumor, ajudando na progressão do tumor. A superexpressão de CCL22 nas células do sistema imunológico é causada pela Interleucina-alfa. Não houve alterações nos níveis de CCL22 em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO em resposta ao tratamento com pó alimentício. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Esses resultados sugerem que não houve maiores efeitos na expressão de CCL22 pelo tratamento com pó alimentício.
[0688] A Figura 54 mostra a avaliação das mudanças nos níveis de transcrição de receptores do tipo CCR em camundongos do tipo selvagem e ETKO submetidos a tratamento com pó alimentício. Os receptores de quimiocinas da família CCR são expressos em células sanguíneas, como eosinófilos, basófilos, linfócitos, macrófagos e células dendríticas, e o aumento em sua expressão/atividade está relacionado ao aumento da inflamação. Uma série de vias de transdução de sinal são ativadas quando o CCR se liga a uma quimiocina ligante (família CCL). O tratamento com o pó alimentício não alterou os níveis de expressão de CCR1 e CCR6 em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO. CCR2 e CCR8 em camundongos de tipo selvagem mostraram infrarregulação significativa em resposta ao tratamento com pó alimentício, sugerindo que o pó alimentício pode diminuir os níveis de inflamação que causam CCRs. Da mesma forma, houve infrarregulação significativa de CCR8 em camundongos ETKO alimentados com o pó alimentício. Assim, uma diminuição tanto nos níveis de quimiocinas quanto em seus receptores parece ocorrer como uma resposta ao tratamento com o pó alimentício. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos
187 /209 independentes. A Figura 55 mostra a avaliação das alterações nos níveis de transcrição de CSF (fator de estimulação de colônia) em camundongos do tipo selvagem e ETKO submetidos a tratamento com o pó alimentício. CSFs são citocinas produzidas por granulócitos/macrófagos (GM-CSF), macrófagos (M- CSF) e granulócitos (G-CSF). O aumento de sua expressão/atividade está relacionado ao aumento da inflamação, e a infrarregulação ajuda a reduzir doenças inflamatórias e autoimunes. Os níveis de CSF foram semelhantes no camundongo do tipo selvagem e naqueles tratados com o pó alimentício. O CSF3 foi suprarregulado no camundongo ETKO, um elo potencial para o desenvolvimento de obesidade. O tratamento com pó alimentício aproximou os níveis de CSF dos observados em camundongos selvagens. Uma diminuição nos níveis de quimiocinas e de seus receptores parece ocorrer em resposta ao tratamento com o pó alimentício. O CD40LG é um ligante da proteína CD40 localizado na superfície das células do sistema imunológico e um aumento na expressão dessa proteína tem sido associado ao aumento da inflamação, em relação ao desenvolvimento de diversos cânceres. No endotélio vascular, um aumento na secreção do ligante CD40 pelas plaquetas parece aumentar a produção de ROS que levam à formação de células de plaqueta e ao bloqueio das artérias. Houve redução significativa na expressão do ligante CD40 em camundongos tratados com o pó alimentício, aproximando seu nível ao do tipo selvagem. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes.
[0689] A Figura 56 mostra a avaliação das alterações das quimiocinas do motivo CXC em resposta ao tratamento com pó alimentício em camundongos do tipo selvagem e ETKO. Quimiocinas do tipo CXC1: as quimiocinas CXCL ligam- se aos receptores do tipo CXCR na superfície das células imunogênicas e induzem sua ação. CXCL1 (ligante 1 do motivo CXC) atua por meio de seu receptor CXCR-2 desempenha um papel fundamental na inflamação. CXCL 1 foi significativamente infrarregulado em camundongos do tipo selvagem, enquanto os camundongos ETKO não mostraram uma mudança significativa na resposta ao tratamento com o pó alimentício. CXCL 10 e seu receptor CXCR3 estão implicados em patologias que ocorrem durante o desenvolvimento de doenças autoimunes, incluindo doenças específicas de órgãos (diabetes tipo 1) e doenças autoimunes sistemáticas, como artrite reumatóide. Os interferons e o TNF ativam
188 /209 a produção de CXCL10 resultando na ativação de linfócitos TH1. CXCL 10 foi infrarregulado em camundongos do tipo selvagem significativamente, enquanto os camundongos ETKO não mostraram qualquer mudança na resposta ao tratamento com alimento. CXCL-12 (CXC-motivo com ligante-12; fator 1 derivado de célula estromal ou SDF 1) é uma quimiocina que se liga ao seu receptor CXC- R4. CXCL-12 é expresso em uma variedade de tecidos e é importante no desenvolvimento. A superexpressão de CXCL-12 leva à inflamação e é altamente quimiotática para os leucócitos (neuroinflamação). CXCL 12 é um marcador clínico para câncer pancreático, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, etc. CXCL-12 foi infrarregulado em camundongos do tipo selvagem em resposta ao tratamento com pó alimentício. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de 3 camundongos independentes. Estes resultados mostram respostas diferenciais de camundongos de tipo selvagem e de camundongos ETKO ao mesmo tratamento. Sem querer se limitar à teoria, a obesidade como condição pode alterar o padrão de resposta aos agentes antiinflamatórios.
[0690] A Figura 57 mostra a avaliação do efeito do tratamento com alimentos nos níveis de transcrição de CXC-ligante. O CXC1-5 é produzido durante a inflamação estimulada por interleucinas e TNF alfa. Ele se liga ao receptor CXC 2. Acredita-se que desempenhe um papel na proliferação celular, aumentando a motilidade e a angiogênese. Não houve alterações no CXCL 5 entre camundongos do tipo selvagem e ETKO não tratados e tratados com pó alimentício. CXCL 15 é uma quimiocina expressa nas células epidérmicas do pulmão, células intestinais, etc. e está ligada à inflamação. Não houve alterações nos níveis de transcrição de CXL15 entre camundongos do tipo selvagem e ETKO não tratados e tratados com pó alimentício. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Esses genes não responderam ao tratamento com pó alimentíco, indicando uma natureza específica de sua ação.
[0691] A Figura 58 mostra os resultados de CXCR (receptores de quimiocinas do motivo CXC, que se ligam a ligantes CXC da família das quimiocinas e interleucinas atraindo células sanguíneas imunoativas e induzindo inflamação). Os níveis de CXCR-2 foram significativamente reduzidos pelo tratamento com o pó alimentício em pó em camundongos do tipo selvagem.
189 /209 Nenhuma mudança foi observada em camundongos ETKO. Não houve diferenças em CXCR-5 e 3, e CXCR5 em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO. Os resultados sugerem que, além dos ligantes (motivo C-C; C-X-C-), os receptores também podem ser modulados pelo tratamento com o pó alimentício, que pode proporcionar melhor infrarregulação da inflamação. Os receptores da família do fator de necrose tumoral são outro grupo de receptores envolvidos na inflamação, e vários produtos naturais são conhecidos por infrarregular a via de transdução de sinal ligada a TNF alfa. O ligante FAS (FAS L) pertence à superfamília do TNF e a ligação ao seu receptor inicia a apoptose. Não houve diferença significativa nos níveis de FAS L após o tratamento com o pó alimentício, tanto em camundongos do tipo selvagem quanto em ETKO. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. O tratamento com o pó alimentício não pareceu afetar a expressão desses genes nas condições testadas.
[0692] A Figura 59 mostra a avaliação das mudanças nas interleucinas como uma resposta ao tratamento com pó alimentício em camundongos de tipo selvagem e ETKO. As interleucinas são citocinas envolvidas na função imunológica, algumas interleucinas são pró-inflamatórias (IL17) e outras têm função antiinflamatória (IL10). Elas medeiam a função imunológica em condições normais e quando desafiadas com organismos causadores de doenças. Foi observada uma redução significativa nos níveis de expressão de IL 1A, IL IB e IL 7, em camundongos selvagens tratados com o pó alimeticio. Os níveis dessas interleucinas permaneceram semelhantes em camundongos ETKO em resposta ao tratamento com o pó alimentício. Os níveis de expressão de IL4 permaneceram semelhantes em camundongos do tipo selvagem e ETKO não tratados e tratados com pó alimentício. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Os resultados sugerem diferenças no padrão de expressão entre o camundongo do tipo selvagem e o camundongo ETKO.
[0693] A Figura 60 mostra a avaliação das mudanças nas interleucinas como uma resposta ao tratamento com pó alimentício em camundongos de tipo selvagem e ETKO. As interleucinas medeiam a função imunológica em condições normais e quando desafiadas com organismos causadores de doenças. Não houve mudanças nos níveis de expressão de IL11, IL13, IL2rb e
190 /209 IL171 em resposta ao tratamento com pó alimentício em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Estes resultados sugerem que o tratamento com o pó alimentício não causa alterações em todas as expressões gênicas, mas são relativamente mais direcionados, tanto em camundongos selvagens quanto em camundongos ETKO.
[0694] A Figura 61 mostra a avaliação das mudanças nas interleucinas como uma resposta ao tratamento com pó alimentício em camundongos tipo selvagem e ETKO. Não houve mudanças nos níveis de expressão de IL17 após o tratamento com pó alimentício em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO. O interferon gama (IFNG) é outra citocina que está envolvida nas respostas contra agentes virais. Não houve alteração nos níveis de IFNG em resposta ao tratamento com pó alimentício em ambos os camundongos do tipo selvagem e ETKO. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes. Esses resultados sugerem ação direcionada do pó alimentício pó na alteração da expressão gênica.
[0695] A Figura 62 mostra a avaliação das alterações nos níveis de transcrição dos membros da superfamília do Fator de Necrose Tumoral em relação às suas respostas durante o tratamento com pó alimentício em camundongos do tipo selvagem e ETKO. LTB (Linfotoxina B: Linfotoxina Beta (Superfamília TNF, Membro 3) é uma proteína de membrana e um indutor da resposta inflamatória. Os níveis de transcritos de LTB foram infrerregulados em camundongos do tipo selvagem em resposta ao tratamento com pó alimentício. Não houve alterações nos níveis de transcrição de LTB em camundongos ETKO tratados com o pó alimentício. Os níveis de transcrição de outros membros da superfamília TNF, como TNFSF11, TNFSF11b e TNFS113b, não se alteraram após o tratamento com pó alimentício em camundongos do tipo selvagem e ETKO. Os dados são Média ± SEM dos níveis de transcrição em amostras de três camundongos independentes.
[0696] É interessante notar que os camundongos do tipo selvagem também responderam ao tratamento com o pó alimentício infraregulando as citocinas inflamatórias e seus receptores, em alguns casos muito mais do que nos camundongos obesos. Isso sugere que o pó alimentício pode ser particularmente eficaz na infrarregulação da inflamação, mesmo em
191 /209 camundongos normais. Uma vez que a infrarregulação da inflamação é altamente relevante para a prevenção de várias doenças crônicas, tais tratamentos com pó alimentício (ou seja, ingestão) podem ser benéficos para várias dessas doenças crônicas em humanos e/ou outros animais. EXEMPLO 5 - Dependência de pH de Ligação de Moléculas Orgânicas a Nanopartículas e Nanofibras
[0697] Experimentos foram realizados para avaliar a capacidade de ligação de moléculas orgânicas a nanofibras e nanopartículas em condições aquosas. Os principais ingredientes das nanofibras e nanopartículas são polímeros de ácido poligalacturônico (PG) (veja abaixo) junto com outros polímeros de carboidratos menores, como xilanas e arabinanos. A porção de ácido carboxílico de PG fornece uma propriedade altamente ácida para PG em soluções aquosas com um pKa próximo a 4. Nesse pH, a maior parte do ácido carboxílico estará na forma dissociada (COO-). Isso pode tender a repelir fitas individuais em uma estrutura de fitas múltiplas e talvez facilitar o aumento da ligação de moléculas de ligante.
[0698] Para testar essa possibilidade, nanofibras e nanopartículas foram incubadas com corantes, e a capacidade de ligação monitorada. Para nanofibras, foi usado Calceína (Ex 490; Em-515) e para nanopartículas, Dylight natural (Ex 650; Em 680). Como as nanopartículas continham polifenóis, elas tendem a extinguir as emissões na região verde-laranja do espectro. Portanto, foi usado Dylight com características de absorção/emissão além de 600 nm. Ambos os corantes são incorporados por nanopartículas e nanofibras.
[0697] Nanofibras (10 mg) foram dissolvidas em 10 ml de água. As nanopartículas também continham 10 mg de pó em 10 ml de água. (Provavelmente não há equivalência em termos de composição, grupos
192 /209 funcionais, etc. entre essas duas preparações). As nanofibras foram misturadas com 5 mg de calceína (em 10 ml). A solução de nanopartículas foi misturada com 200 g equivalente de Dylight em 10 ml.
[0699] As soluções foram misturadas suavemente durante 3 horas e separadas em frações de 100 l que foram dialisadas durante a noite contra tampões de diferentes pH variando de pH 4 a pH 7. As soluções dialisadas de nanofibras e nanopartículas foram diluídas para 2 ml e a absorbância medida em max para os corantes (calceína a 490 nm; Dylight a 652 nm). As soluções de calceína e Dylight foram diluídas proporcionalmente como nas soluções de nanofibras e nanopartículas para fornecer um controle. Os resultados são apresentados nas seguintes Tabelas 6 e 7.
Tabela 6: Amostra de nanofibras (NF) - Calceína como corante.
ID Amostra λ Max OD % alteração sobre absorbancia branca Calceina + água 491.5 1.121 controle Calceina + tampão pH 4.0 472.5 0.444 controle NF dialisada NF (pH 4.0 + 472.5 1.090 145.5 calceina) Calceina + tampão pH 6.0 491.5 0.927 controle NF Dialisada NF (pH 6.0 + 491 2.010 116.83 calceina) Calceina + tampão pH 6.5 492 1.250 controle NF Dialisada NF (pH 6.5 + 492 2.230 78.4 calceina) Calceina + tampão pH 7.0 492 1.390 controle NF Dialisada NF (pH 7.0 + 491.5 2.474 78 calceina)
[0700] Houve um aumento dependente do pH na absorção de calceína de pH 4 para pH 7. A absorbância da calceína foi a mais alta na região de pH 4-6, acima da qual a conjugação foi provavelmente reduzida. A ligação foi máxima na faixa de pH 4-6, com aumento de 145% e 116% sobre o controle sem nanofibras. A ligação eficaz tende a diminuir à medida que o pH aumenta, quando todos os grupos de ácido carboxílico estão totalmente dissociados. Sem desejar estar
193 /209 limitado pela teoria, isso também pode ser devido à dissociação de ácidos orgânicos estruturais (por exemplo, ácido málico, ácido ascórbico, etc.) na estrutura de nanofibras em pH mais alto.
Tabela 7: Amostra de nanopartículas - Dylight 650 como corante.
ID Amostra λ Max OD % alteração absorbancia branca Dylight + tampão pH 4.0 652.5 0.3154 controle NP Dialisada (pH 4.0 + 652.5 0.2545 80.95 Dylight) Dylight + tampão pH 6.0 652.5 0.3620 controle NP Dialisada (pH 6.0 + 652.5 0.2760 76.24 Dylight) Dylight + tampão pH 6.5 652.5 0.4309 controle NP Dialisada (pH 6.5 + 652.5 0.2504 58.00 Dylight) Dylight + tampão pH 7.0 652.5 0.3788 controle NP Dialisada (pH 7.0 + 652.5 0.3053 80.47 Dylight)
[0701] Soluções aquosas de nanopartículas e Dylight foram misturadas suavemente por 3 horas e separadas em frações de 100l que foram dialisadas durante a noite contra tampões de diferentes pH variando de pH 4 a pH 7. As soluções de nanopartículas dialisadas foram diluídas para 2 ml e a absorbância medida em max (652,5 nm). Soluções de Dylight também foram diluídas proporcionalmente como nas soluções de nanopartículas dialisadas para fornecer um controle para cada conjunto de pH. Na presença de nanopartículas, nas condições testadas, a absorbância de Daylight tende a diminuir independentemente do pH e nenhuma relação clara com o pH foi perceptível. Sem querer se limitar à teoria, isso provavelmente ocorre porque a nanopartícula é uma estrutura fortemente associada e pode não permitir que as partes internas se liguem a certos componentes com alta eficiência, após sua automontagem. Em ambos os casos, no entanto, os corantes foram retidos apesar da extensa diálise, sugerindo que um conjugado químico pode não ser necessário para a distribuição de carga por nanopartículas e nanofibras. Em certas modalidades, a
194 /209 conjugação pode, no entanto, ser preferida quando a carga é grande, como no caso de anticorpos, como anticorpos monoclonais e/ou outras moléculas grandes. EXEMPLO 6 - Estudo de camundongo de seções de fígado tratadas com o Pó Alimentício
[0702] Foi realizado um estudo em camundongo para avaliar o efeito do tratamento de pó alimentício em um modelo de camundongo de obesidade. As condições experimentais são as descritas acima. As secções foram coradas com Eosina/hematoxilina.
[0703] A Figura 63 mostra seções de fígado em camundongos com e sem tratamento com pó alimentício. O painel (A) ilustra a seção de fígado de camundongo do Tipo Selvagem (WT) não tratada. Como pode ser visto, muito poucos corpos lipídicos são visíveis. O painel (B) ilustra a seção de fígado de camundongo do Tipo Selvagem (WT) tratada com pó alimentício. Novamente, muito poucos corpos lipídicos são visíveis. O painel (C) ilustra a seção de fígado de camundongo (KO) obeso não tratado. Neste painel, as áreas circulares claras são corpos lipídicos amplamente distribuídos no fígado. O painel (D) ilustra a seção de fígado de camundongo (KO) tratada com pó alimentício. As áreas circulares claras são corpos lipídicos. As áreas potenciais de regeneração do tecido são mostradas por setas. Estes resultados mostram uma redução clara nos corpos lipídicos em camundongos obesos tratados com o pó alimentício conforme aqui descrito.
[0704] Uma ou mais modalidades ilustrativas foram descritas a título de exemplo. Será entendido por aqueles versados na técnica que uma série de variações e modificações podem ser feitas sem se afastar do escopo da invenção como definido nas reivindicações.
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[0705] Todas as referências citadas neste documento e em outras partes do relatório descritivo são incorporadas a este documento por referência em sua totalidade.

Claims (93)

1 / 11 REIVINDICAÇÕES
1. Nanofibra caracterizado por compreender componentes celulares auto-montados derivados de um tecido de planta homogeneizado, os componentes celulares compreendendo um ou mais carboidratos estruturais ou produtos de clivagem dos mesmos, em que lipídios e polifenóis não são componentes estruturais da nanofibra.
2. Nanofibra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nanofibra é substancialmente livre de lipídios, é substancialmente livre de polifenol, ou ambos.
3. Nanofibra, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a nanofibra compreende: uma fibra alongada que compreende um ou mais fios que compreendem ou são feitos de pelo menos um carboidrato estrutural.
4. Nanofibra, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que a nanofibra compreende pectina, hemicelulose, peptídeo e/ou proteína, um ácido orgânico, produtos de clivagem dos mesmos ou qualquer combinação dos mesmos.
5. Nanofibra, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico compreende ácido málico, ácido ascórbico ou ambos.
6. Nanofibra, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os componentes celulares compreendem aqueles liberados do tecido da planta durante a maturação ou durante a homogeneização da fruta amadurecida, que são capazes de se automontar na nanofibra.
7. Nanofibra, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que um ou mais carboidratos estruturais compreendem um ou mais dentre pectina, ácido péctico, éster metílico de pectina, um derivado de pectina, ácido poligalacturônico, ramnogalacturonanos, xilogucanos, hemiceluloses, xiloglucanos possuindo estruturas principais ligadas por -(14) de glicose, manose ou xilose e/ou arabinogalactanos e/ou produtos de clivagem dos mesmos.
8. Nanofibra, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que tem um formato de fibra com um diâmetro de cerca de 5-10 nm.
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9. Nanofibra, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a nanofibra é estabilizada por interações por ligação de hidrogênio e formada entre macromoléculas derivadas do catabolismo de componentes celulares do tecido de planta e possuindo grupos hidroxila e/ou grupos amino e/ou grupos de ácido orgânico.
10. Nanofibra, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a nanofibra não é cristalina.
11. Nanofibra, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um agente biologicamente ativo.
12. Nanofibra, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o agente biologicamente ativo é um fármaco farmaceuticamente ativo, proteína, enzima, nutracêutico ou nutriente.
13. Nanofibra, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, caracterizado por estar em solução aquosa.
14. Nanofibra, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 caracterizado pelo fato de estar na forma de pó.
15. Nanofibra, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de estar na forma desidratada, liofilizada, seca por congelamento, seca por pulverização ou seca por nanopulverização.
16. Nanofibra, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o tecido de planta compreende uma fruta ou tecido de planta de legume e/ou em que os polifenóis foram removidos do tecido de planta antes da homogeneização.
17. Nanofibra, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o tecido de planta compreende uma fruta em envelhecimento, um legume em maturação ou qualquer combinação dos mesmos; de preferência, em que o tecido de planta compreende cereja, mirtilo, uva, pêssego, nectarina, ameixa, damasco, mamão, tomate ou qualquer combinação dos mesmos.
18. Nanofibra, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o tecido de planta compreende um tecido de fruta de ginja.
19. Método para preparar nanofibras a partir de tecido de planta homogeneizado, o referido método caracterizado pelo fato de compreender:
3 / 11 preparar um tecido de planta homogeneizado em solução com baixo teor de polifenol, compreendendo componentes celulares liberados do tecido de planta; remover detritos do tecido de planta homogeneizado, se presente; e, opcionalmente, dialisar o tecido de planta homogeneizado para remover compostos não complexados ou remover os compostos não complexados por exclusão de tamanho, proporcionando, assim, uma solução compreendendo as nanofibras que são formadas por automontagem dos componentes celulares.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma etapa de desidratação, liofilização, secagem por congelamento, secagem por pulverização ou secagem por nanopulverização da solução que compreende a nanofibra.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que as nanofibras são formadas por automontagem em um meio substancialmente aquoso.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-21, caracterizado pelo fato de que a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução compreende a homogeneização de um tecido de planta em um meio aquoso, orgânico ou orgânico-aquoso misto.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-22, caracterizado pelo fato de que a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução compreende submeter um tecido de planta a homogeneização de alto cisalhamento e/ou sonolação em um meio aquoso, orgânico ou orgânico-aquoso misto compreendendo qualquer um ou mais de água, etanol, metanol ou acetona.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-23, caracterizado pelo fato de que a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução compreende uma etapa de branqueamento do tecido de planta para remover polifenóis do mesmo antes da homogeneização do tecido de planta.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o branqueamento compreende realizar uma extração de polifenóis do tecido de planta com um solvente de extração.
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26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o solvente de extração compreende etanol.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21-26, caracterizado pelo fato de que a etapa de remoção de detritos compreende diálise, filtrar o tecido de planta homogeneizado, centrifugar o tecido de planta homogeneizado ou realizar filtração de fluxo tangencial ou filtração de fluxo contínuo no tecido de planta homogeneizado ou qualquer combinação disso.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-27, caracterizado pelo fato de que o método é para a preparação de uma nanofibra conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18.
29. Método para preparar uma nanofibra a partir de tecido de planta homogeneizado, o referido método caracterizado pelo fato de compreender: preparar um tecido de planta homogeneizado em solução com baixo teor de polifenol, compreendendo componentes celulares libertados do tecido de planta; remover detritos do tecido de planta homogeneizado, se presente; permitir que a nanofibra se forme por automontagem dos componentes celulares; e, secagem por congelamento, secagem por pulverização ou secagem por nanopulverização para formar um pó compreendendo a nanofibra.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a automontagem ocorre em um meio substancialmente aquoso.
31. Método, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução compreende a homogeneização de um tecido de planta em um meio aquoso, orgânico ou orgânico-aquoso misto.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que a etapa de preparação do tecido de planta homogeneizado em solução compreende submeter um tecido de planta a homogeneização de alto cisalhamento e/ou sonolação em um meio aquoso, orgânico ou orgânico-aquoso misto compreendendo qualquer um ou mais de água, etanol, metanol ou acetona.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-32, caracterizado pelo fato de que a etapa de preparação do tecido de planta
5 / 11 homogeneizado em solução compreende uma etapa de branqueamento do tecido de planta para remover polifenóis do mesmo antes da homogeneização do tecido de planta.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o branqueamento compreende realizar uma extração de polifenóis do tecido de planta com um solvente de extração.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o solvente de extração compreende etanol.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-35, caracterizado pelo fato de que a etapa de remoção de detritos compreende diálise, filtrar o tecido de planta homogeneizado, centrifugar o tecido de planta homogeneizado ou realizar filtração de fluxo tangencial ou filtração de fluxo contínuo no tecido de planta homogeneizado ou qualquer combinação disso.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-36, caracterizado pelo fato de que o tecido de planta compreende tecido de planta extraído com um solvente de extração para remover polifenóis do mesmo.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o solvente de extração compreende etanol.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-38, caracterizado pelo fato de que o método é para a preparação de uma nanofibra, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18.
40. Nanofibra caracterizado pelo fato de ser preparada pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 19-39.
41. Pó alimentício caracterizado pelo fato de ser preparado a partir da nanofibra conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40, opcionalmente em que o pó alimentício é fornecido na forma de pó fino em microescala.
42. Método de distribuição de um agente biologicamente ativo a um indivíduo ou célula em necessidade do mesmo, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: a administração de uma nanofibra, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40, que é complexada ou conjugada com o agente biologicamente ativo, para o indivíduo.
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43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o agente biologicamente ativo é um elemento como selênio, zinco, ferro ou magnésio.
44. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o agente biologicamente ativo é uma droga anticâncer e o indivíduo é um indivíduo com câncer.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a droga anticâncer é paclitaxel, vincristina ou qualquer composto natural ou sintético usado para tratamento de câncer.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42-45, caracterizado pelo fato de que o agente biologicamente ativo é introduzido na nanofibra durante a formação da nanofibra, ou em que o agente biologicamente ativo é complexado com ou conjugado com nanofibras já formadas em um meio de base aquosa opcionalmente compreendendo um álcool ou outro componente orgânico.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o meio de base aquosa compreende DMSO, ou um tampão, ou ambos.
48. Método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo em necessidade, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma nanofibra conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40 ao indivíduo.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a nanofibra é simultânea ou sequencialmente coadministrada com uma droga anticâncer.
50. Método, de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizado pelo fato de que a nanofibra é complexada com, ou conjugada com, uma droga anticâncer.
51. Método, de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizado pelo fato de que a droga anticâncer é paclitaxel ou vincristina.
52. Método para fornecer fibra dietética solúvel a um indivíduo, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma nanofibra conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40 ao indivíduo.
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53. Aditivo alimentício que aumenta a viscosidade, caracterizado pelo fato de que compreende uma nanofibra, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40.
54. Método para atenuar os níveis de açúcar pós-prandial no sangue de um indivíduo em necessidade, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma nanofibra conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40 ao indivíduo.
55. Produto cosmético, caracterizado pelo fato de que compreende uma nanofibra, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40.
56. Composição para administração tópica a um indivíduo em necessidade, a composição caracterizado pelo fato de que compreende uma nanofibra conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40 e, opcionalmente, um agente biologicamente ativo.
57. Método para prevenir queimaduras solares em um indivíduo em necessidade, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: a aplicação de uma nanofibra conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40 na pele do indivíduo.
58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a nanofibra compreende, ou é aplicada com, antocianina ou outro agente protetor de UV.
59. Método para reduzir a proliferação celular, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: o tratamento de uma célula ou tecido ou órgão com uma nanofibra, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a nanofibra é simultaneamente ou sequencialmente usada com uma droga anticâncer.
61. Método, de acordo com a reivindicação 59 ou 60, caracterizado pelo fato de que a nanofibra é complexada ou conjugada com uma droga anticâncer.
62. Método, de acordo com a reivindicação 60 ou 61, caracterizado pelo fato de que a droga anticâncer é paclitaxel ou vincristina.
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63. Método para reduzir o acúmulo de triglicerídeos no fígado de um indivíduo em necessidade, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma nanofibra conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40 ao indivíduo.
64. Uso de uma nanofibra como definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40 caracterizado pelo fato de que é para distribuir um agente biologicamente ativo a um indivíduo ou célula em necessidade do mesmo.
65. Uso, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o agente biologicamente ativo é um elemento tal como selênio, zinco, magnésio ou ferro.
66. Uso, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o agente biologicamente ativo é uma droga anticâncer e o indivíduo é um indivíduo com câncer.
67. Uso, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a droga anticâncer é paclitaxel ou vincristina.
68. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64-67, caracterizado pelo fato de que o agente biologicamente ativo é introduzido na nanofibra durante a formação da nanofibra, ou em que o agente biologicamente ativo é complexado ou conjugado com nanofibras já formadas em um meio de base aquosa.
69. Uso, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o meio de base aquosa compreende DMSO, ou um tampão, ou ambos.
70. Uso de uma nanofibra conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40, caracterizado por ser para o tratamento ou prevenção do câncer em um indivíduo que dela necessite.
71. Uso, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a nanofibra é para co-administração simultânea ou sequencial com uma droga anticâncer.
72. Uso, de acordo com a reivindicação 70 ou 71, caracterizado pelo fato de que a nanofibra é complexada com, ou conjugada com, uma droga anticâncer.
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73. Uso, de acordo com a reivindicação 71 ou 72, caracterizado pelo fato de que a droga anticâncer é paclitaxel ou vincristina.
74. Uso de uma nanofibra conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40, caracterizado pelo fato de ser para fornecer fibra dietética solúvel a um indivíduo.
75. Uso de uma nanofibra como definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40 caracterizado pelo fato de ser como um aditivo alimentício aumentador de viscosidade ou substituto de fibra.
76. Uso de uma nanofibra como definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40 caracterizado pelo fato de ser para atenuar os níveis de açúcar pós-prandial no sangue de um indivíduo com necessidade do mesmo.
77. Uso de uma nanofibra conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40 caracterizado pelo fato de ser em um produto cosmético.
78. Uso de uma nanofibra, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40, caracterizado pelo fato de ser para administração tópica a um indivíduo em necessidade, em que a nanofibra é opcionalmente complexada ou conjugada com um agente biologicamente ativo.
79. Uso de uma nanofibra como definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40 caracterizado pelo fato de ser como um veículo de distribuição de droga para administração tópica.
80. Uso de uma nanofibra, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40, caracterizado pelo fato de ser para prevenir queimaduras de sol em um indivíduo com necessidade da mesma, em que a nanofibra é para aplicação na pele do indivíduo.
81. Uso, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a nanofibra compreende, ou é aplicada com, antocianina ou outro agente protetor de UV.
82. Uso de uma nanofibra como definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40 caracterizado pelo fato de ser para reduzir a proliferação celular.
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83. Uso, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a nanofibra é para uso simultâneo ou sequencialmente com uma droga anticâncer.
84. Uso, de acordo com a reivindicação 82 ou 83, caracterizado pelo fato de que a nanofibra é complexada com, ou conjugada com, uma droga anticâncer.
85. Uso, de acordo com a reivindicação 83 ou 84, caracterizado pelo fato de que a droga anticâncer é paclitaxel ou vincristina.
86. Uso de uma nanofibra, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40, caracterizado pelo fato de ser para reduzir o acúmulo de triglicerídeos no fígado de um indivíduo com necessidade do mesmo.
87. Nanofibra orientada, caracterizado pelo fato de que compreende uma nanofibra conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40, conjugada com um anticorpo orientado específico para um marcador de câncer.
88. Nanofibra orientada, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de orientação compreende anticorpo PD-L1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para direcionamento da nanofibra orientada para células cancerosas.
89. Nanofibra orientada, de acordo com a reivindicação 87 ou 88, caracterizado pelo fato de que a nanofibra orientada é complexada com, ou conjugada com, pelo menos uma droga citotóxica ou anticâncer.
90. Nanofibra orientada, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a nanofibra orientada é complexada com, ou conjugada com, paclitaxel, doxorrubicina ou ambos.
91. Nanofibra antibacteriana, caracterizado pelo fato de que compreende uma nanofibra conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 ou 40, complexada com ou conjugada com um agente antibacteriano.
92. Nanofibra antibacteriana, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o agente antibacteriano compreende lisozima, uma tetraciclina ou Nisin ou qualquer combinação dos mesmos.
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93. Nanofibra antibacteriana, de acordo com a reivindicação 91 ou 92, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento ou prevenção de infecção bacteriana MDR.
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