JP2022512762A - 治療用送達プラットフォームを生成するための方法 - Google Patents

Abstract

マイクロ流体デバイスにおいて操作されたエクソソームおよび他の小胞様生物学的標的を生成するための方法であって、標的小胞様構造が免疫磁性粒子と反応および結合することを可能にすること；その免疫磁性粒子／小胞複合体を、磁場を印加することにより捕捉すること；それらの捕捉された小胞を、追加の活性部分で表面修飾することまたは活性薬剤を内部に搭載することによりさらに操作すること；およびそれらの操作された小胞様構造を、その粒子と操作された小胞様構造の間の結合を光分解的に切断することなどにより放出し、それにより治療的処置のための送達ビヒクルとして作用することができる無傷の小胞様構造を放出することを含む方法。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１０月２１日に出願された「ワクチン送達プラットフォームとしての細胞外小胞およびエクソソームのマイクロ流体オンデマンド捕捉、搭載、および光放出」という名称の米国仮特許出願第６２／７４８，４７０号の優先権の利益を主張するものであり、その全内容は本明細書の一部として援用される。

連邦政府資金による研究開発
本発明は、ＵＳＤＡ国立食品農業研究所によって授与された助成金番号２０１７－６７０２１－２６６００および国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＧＭ１０３６３８の下で政府支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

配列表
以下の出願には、２０１９年１０月２１日に作成された「Sequence_Listing」という名称の、１２ＫＢのＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルとして提出された、コンピューター読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表を含む。ＣＲＦの内容は、本明細書の一部として援用される。

発明の分野
本開示は、全体として、ペプチドまたはタンパク質、ヌクレオチド、および他の活性薬剤（例えば、化学物質および薬物）などの生物活性治療薬の送達のための無傷担体または送達ビヒクルを採取するためのマイクロ流体デバイスおよび方法に関する。

関連技術の説明
総ての送達可能な細胞およびナノ粒子の中で、生細胞由来の細胞外小胞、特に、３０～１５０ｎｍのナノサイズ範囲のエクソソームは、ここ数十年で細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を示されている。免疫細胞由来のエクソソームは、免疫刺激または免疫抑制の調節において文書により十分に立証されており、炎症性、自己免疫性および感染性疾患の病理を駆動する。エクソソームの形成は、細胞内小胞としてエンドソームが生成することから始まる。エクソソームは、細胞分泌のための多小胞体（ＭＶＢ）に由来するという点で、他の膜由来微小小胞体とは異なる(4, 9)。従って、エクソソームは、特定のタンパク質と核酸を含み、親細胞での形成時のそれらの親細胞の状態と機能を表す。エクソソームの多くのサブタイプの中で、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子と他の共刺激分子の内在性のペイロードを有する免疫原性エクソソームは免疫応答を媒介することができ、このことは、癌ワクチンに使用することができる新規な送達プラットフォームの開発、免疫療法の送達、およびイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）輸送に関連するその他の送達の機会を開く。

脂質、ポリマー、金およびシリカ材料などの他のナノサイズの送達システムと比較して、エクソソームは、内在性のペイロードを有する生細胞由来の生体適合性の高いナノ担体であり、効果的な送達のために所望の抗原を搭載する際にはるかに高い柔軟性を示す。エクソソームはまた、病原因子を運搬する懸念なくアレルゲン反応を排除し、送達時の分解または損失を回避する。しかしながら、エクソソームに基づくワクチンの開発は、純粋な免疫原性エクソソームを取得する際の実質的な技術的問題によって妨げられている。エクソソームの多様なサブタイプは、異なる細胞メッセージの区別に関する調査を混乱させる可能性があった。他方、膜表面または内部搭載のいずれかによるエクソソームの分子操作は、新規な抗原性エクソソームを開発するための未開発の供給源を提供する可能性があった。

生物工学によって作出された、新たな送達ビヒクルとしてのエクソソームは、非小細胞肺癌患者におけるＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に基づく免疫応答を促進するためのＭＨＣ Ｉ／ＩＩ拘束性癌抗原を搭載したＩＦＮ－ＤＣ由来エクソソームを使用した最近の第二相試験を含む、新世代の癌ワクチンの開発において多大な注目を集めている。残念なことに、親細胞のトランスフェクションまたは押し出し、および分泌されたエクソソームの膜透過化などの現在のエクソソーム工学的アプローチは、収率が低く、純度が低く、操作に時間がかかるという問題を抱える。このボトルネック問題を解決するためにエクソソームを生産する方法が必要である。自動化および高効率物質輸送における固有の特徴により、マイクロ流体システムは、ベンチトップシステムの多くの欠点を克服し、エクソソームの分離、検出および分子プロファイリングにおいて優れた性能を示す。しかしながら、マイクロ流体プラットフォームを使用したエクソソームの分子操作は、調査されていない。現在、エクソソームの処理に関して最も多く報告されている研究は、質が低いかまたは固体表面／粒子に拘束されるものであり、それらは下流の治療用製剤のために無傷のままではあり得ない。

細胞、細胞外小胞およびエクソソーム、ならびに膜粒子または脂質粒子、ならびにポリマー粒子などの様々な生物学的担体または送達ビヒクルを操作するための方法およびマイクロ流体デバイスが本明細書に記載される。これらの担体は、本発明の方法およびデバイスを使用して、捕捉し、活性薬剤を搭載し（表面修飾または封入のいずれか）、次いで、様々な治療化合物および生物活性薬剤を送達するための無傷の操作された担体として放出され得る。操作された担体は、診断、予後、コンパニオンアッセイ、薬学および治療学、免疫療法およびワクチン送達、および組織送達、ならびに活性薬剤のｉｎ ｖｉｖｏ輸送に関連する他の用法に使用することができる。本明細書に記載される実施形態は、エクソソームに関する例示である。しかしながら、このプラットフォームが細胞（Ｔ細胞を含む）、ミクロソームなどを含む他の同様の構造－液体コアおよび膜または二重層を特徴とする小胞構造または小胞様構造－に適用できることが想定されるように、エクソソームが特にチャレンジングな生物学的標的を表すことは理解されよう。これらの生物学的標的は、その後、担体または送達ビヒクルとして操作され、ナノ担体として特徴付けることもできる。

本明細書で提供されるのは、オンデマンドで捕捉し、搭載し、無傷の操作されたナノ担体を光放出するマイクロ流体分析デバイスおよび方法である。マイクロ流体デバイスは、細胞外小胞、特に、エクソソームのリアルタイム採取および抗原修飾を可能にし、その後、オンデマンドで無傷のエクソソームを下流に放出する。また、捕捉するためおよび光トリガーを介してＭＨＣ－Ｉ陽性エクソソームをオンデマンドで放出するための光切断可能な親和性プローブ（活性部分）で官能化された磁性ナノ粒子も開示される。親和性プローブには、抗原性ペプチド、抗体、アプタマー、ナノボディおよび他の親和性に基づくプローブを含めることができる。マイクロ流体デバイス内での修飾／搭載エクソソームの光放出は、９５％以上の効率で空間的におよび時間的に十分に制御することができる。このような機能的な合理化されたマイクロ流体細胞培養システムは、刺激を用いてそれらの親細胞の成長を媒介することにより、または生成されたエクソソームの表面での直接分子操作により、エクソソームの抗原操作を可能にする。エクソソームのサブタイプの不均一性は、同じ親細胞集団から見出されている。放出されるエクソソームサブタイプは、種々の細胞調節のための異なる分子特性および生物学的特性を有する。開示される方法は、捕捉し、搭載し、より多くの標的治療機能を有する特定のサブタイプのエクソソームを放出することができる。捕捉、搭載および放出のためのこの開示される方法で使用することができる担体には、細胞、細胞外小胞およびエクソソーム、ならびに膜粒子または脂質粒子、ならびに薬物（小分子化合物）、遺伝子および生物活性治療薬を封入することができるポリマーが含まれる。癌ワクチンの開発に一般的に使用されているが分解のための送達が困難ないくつかの腫瘍抗原性ペプチド（例えば、ｇｐ－１００、ＭＡＧＥ－Ａ３、およびＭＡＲＴ－１）による概念実証が本明細書において示されている。マイクロ流体デバイスは、免疫原性エクソソーム（ＭＨＣ Ｉ＋）の操作において高効率を示し、一方では、無傷の機能的なエクソソームを下流に光放出する。抗原提示細胞による操作されたエクソソームの細胞取り込みも実証されており、これは、操作されていないエクソソームと比較して大幅に改善された内部移行能を示した。特に、操作されたエクソソームは、２個体のＰｍｅｌ１トランスジェニックマウスの脾臓から精製されたＣＤ８ Ｔ細胞で刺激することにより、Ｔ細胞の活性化について、操作されていないエクソソームよりも有意に高い活性化率（少なくとも３０％）を示す。本発明者らは、また、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）感染症を治療するためにトランスジェニックマウスを使用してエクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）でのＴ細胞刺激についての抗菌性ペプチド操作免疫原性エクソソームの効力の程度も評価した。ＢＲＳＶ標的ペプチド（ペプチド４：Ｍ１８７－１９５ペプチド ＮＡＩＴＮＡＫＩＩ、配列番号４）で操作されたエクソソームは、活性化樹状細胞の存在下でＢＲＳＶ Ｍ特異的Ｔ細胞を活性化する能力を有する。

よって、操作されたエクソソームは、癌免疫療法および感染症のワクチン接種における適用に実行可能であり、機能し得る。操作された小胞を生成するための簡単で低コストのマイクロ流体プラットフォームは、精製された高密度治療小胞の高効率生産を可能にする戦略を提供するだけでなく、抗腫瘍免疫応答、癌免疫療法、および感染症を治療するためのワクチン接種における可変のペプチド操作エクソソームの役割を理解するための調査ツールとしても役立つ。

特定の態様において、本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスは、生物学的材料を三次元構成に維持するような寸法の細胞培養チャンバー；混合チャネルに沿って配置された複数のサンプル入口チャネルを含んでなる、前記細胞培養チャンバーに流体接続された混合チャネルであって（ここで、前記細胞培養チャンバーの幅と前記混合チャネルの最大断面寸法の比は少なくとも５：１である）；前記混合チャネルから分離出口までの流体の流れの経路を規定する分離チャネル；収集チャンバー内で磁場を生成するために、前記収集チャンバーに作動可能に連結された磁石を含んでなる、前記分離出口に流体接続された収集チャンバーとを含んでなり得る。

他の態様において、前記マイクロ流体デバイスは、細胞培養入口および細胞培養出口を含んでなる細胞培養チャンバー；流体入口チャネルおよび粒子入口チャネル（ここで、前記細胞培養出口、前記流体入口チャネル、および前記粒子入口チャネルは混合交差点で流体収束する）；前記混合交差点から混合出口までの流体の流れの経路を規定する、前記混合交差点に流体接続された混合チャネル（ここで、前記細胞培養チャンバーの幅と前記混合チャネルの最大断面寸法の比は少なくとも５：１である）；収集チャンバー内で磁場を生成するために、前記収集チャンバーに作動可能に連結された磁石を含んでなる、前記混合出口に流体接続された収集チャンバーとを含んでなり得る。これらの態様において、前記混合チャネルは、前記混合交差点と前記混合出口の間に配置された分離チャネルを含んでなり得る。

前記マイクロ流体デバイスにおける分離チャネルは、このデバイス内を流れる流体を混合するように乱流を誘導する形状を有し得る。例えば、前記マイクロ流体デバイスにおける分離チャネルは、蛇行形状を有し得る。この分離チャネルは、局所的な渦流プロフィールを作出するための１以上の、幅が減少するチャネル狭窄領域をさらに含み得る。特定の実施形態では、この分離チャネルは、複数のチャネル狭窄領域、好ましくは、少なくとも５つのチャネル狭窄領域を含んでなり得る。

本明細書に記載されるように、前記マイクロ流体デバイスは、細胞チャンバーおよび混合チャネルを含んでなる。この細胞チャンバーおよび混合チャネルは、高さおよび幅を有し得る。混合チャネルの高さおよび幅は、それぞれ、少なくとも５０ミクロン、好ましくは、５０～５００ミクロンであり得る。細胞培養チャンバー幅と混合チャネルの最大断面寸法の比は、５：１～５００：１、５：１～２００：１、５：１～１００：１、５：１～２０：１、好ましくは、６：１～１２：１であり得る。細胞培養チャンバーは、約２００マイクロリットル以上、好ましくは、約２００マイクロリットル～約１ミリリットルの容積を有し得る。

本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスは、このデバイスに作動可能に連結されたポンプをさらに含んでなり得る。

また、サンプル溶液中の標的の捕捉、搭載、およびオンデマンド光放出のための前記デバイスを使用する方法を、無傷の送達担体を採取するために使用することができることも開示される。そのような担体は、細胞、細胞外小胞およびエクソソーム、ならびに膜粒子または脂質粒子、薬物、遺伝子および生物活性治療薬を封入することができるポリマー粒子であり得る。具体的には、捕捉、搭載および光放出からなるこの統合された連続的な方法は、マイクロ流体デバイスにおいて操作されたエクソソームを生成することができる。この方法は、エクソソーム（または別の標的）を含む生物学的サンプルを混合チャネルに導入し、エクソソームを免疫磁性粒子および洗浄バッファーと混合して混合物を形成すること；エクソソームが免疫磁性粒子と反応および親和性結合することを可能にすること；および免疫磁性粒子に結合したエクソソームを、収集チャンバー内に磁場を印加することにより収集することを含んでなる。操作されたエクソソームを生成するための方法は、前記マイクロ流体デバイスの細胞培養チャンバーに細胞を導入することおよび最初に前記細胞を、エクソソームの放出を可能にする条件下で培養することを含み得る。これは、捕捉および搭載のために使用される同じマイクロ流体デバイスにおいて、インラインで実施することができる。

エクソソームが放出される前記細胞は、樹状細胞、幹細胞、免疫細胞、巨核球前駆細胞、マクロファージ、または他の生細胞から選択することができる。

エクソソームに結合した免疫磁性粒子は、光切断可能なリンカーを含んでなる部分を介してエクソソームを捕捉するための親和性プローブに結合した磁性粒子を含んでなり得る。本明細書に記載されるように、エクソソームを捕捉するための親和性プローブは、エクソソームを捕捉するための抗原ペプチド、抗体、アプタマー、またはその抗原性エピトープを含み得る。抗原ペプチドの好適な例としては、ＭＡＧＥ－Ａ３、ｇｐ－１００、ＨＥＲ－２、ｐ５３、ＰＳＡ－１、またはＭＡＲＴ－１が挙げられる。光切断可能なリンカーを含んでなる部分は、免疫磁性粒子に結合し、かつ、もう一方の端で光切断可能なリンカーを介して親和性プローブに付着されたビオチンを含み得る。この親和性プローブは、標的の表面タンパク質（例えば、免疫刺激性分子またはマーカー）を標的とする。好適な免疫刺激性分子としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、インターロイキン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ－７８、ＧＲＯ、Ｉ－３０９、ＰＦ－４、ＩＰ－１０、ＬＤ－７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１βおよびそれらの組合せが挙げられる。好ましくは、この親和性プローブは、それ自体が標的の表面タンパク質に優先的に結合する抗原性部分（ペプチド）である。

混合後、免疫磁性粒子は、サンプル中のエクソソーム（または他の標的）を捕捉／結合する。免疫磁性粒子は、前記デバイス内に、例えば、収集チャンバーに隣接して配置された磁石を使用して固定される。次に、固定されたビーズ／エクソソーム複合体は、以下でより詳細に記載するように、捕捉されたエクソソームへの表面搭載または内部封入のために、活性部分を含有するバッファー溶液で洗浄し、インキュベートする。前記方法は、捕捉された修飾エクソソームを免疫磁性粒子から光分解的に切断し、活性薬剤（抗原ペプチドまたはその抗原性エピトープ）を含んでなる無傷の操作されたエクソソームを放出することをさらに含んでなり得る。

エクソソームなどの操作された生物学的標的を生成するための前記方法は、本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスを使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、前記方法は、リアルタイムで実施される。１以上の実施形態において、前記方法は、生物学的標的の捕捉、搭載、および放出が同じデバイス／容器（すなわち、容器間または反応管間を移動する必要なく、むしろマイクロ流体チャネルに沿ってインラインのおよびインラインの捕捉／操作チャンバー）内で行われるように、合理化されている（「連続的である」ともいう）。従って、それぞれの工程は、単一のマイクロ流体チャネルに収束する様々な入口を使用して順々に、好ましくは、実質的にすぐに順々に、連続して実施することができる。言い換えれば、前記方法は、サンプルの搭載の直後またはほぼ同時の免疫磁性ビーズの搭載と、それに続く、捕捉された標的に付着または搭載される活性薬剤の搭載を含む。このマイクロ流体デバイスに搭載される各成分は、それぞれの入口から単一のマイクロ流体チャネルに収束し、その後、入口から下流の捕捉／操作チャンバー内に、このチャンバーに隣接して配置された磁石によって「自動」保持される。この流体混合物がこのチャネルを流れ、次にこのチャンバーを流れる際に、それぞれの反応（すなわち、捕捉および搭載）がリアルタイムで起こっている。チャンバーに光を当てると、操作された標的を放出することができる。この合理化されたプロセスは従来のベンチトップ法よりもはるかに高速であることは理解されよう。好ましくは、それぞれの入口でのサンプル／ビーズ搭載から出口で放出される操作された標的の収集までのこのプロセスは、合計およそ２時間以内、より好ましくは、およそ９０分以内、より好ましくは、およそ１時間以内に完了することができる。

また、操作されたエクソソーム、特に、免疫原性エクソソーム複合体を含んでなる組成物も開示される。この免疫原性エクソソーム複合体は、エクソソームの表面にコンジュゲートされた抗原性ペプチドまたはその抗原性エピトープを含んでなり得る（ここで、前記免疫原性エクソソーム複合体は、天然のエクソソームと比較して少なくとも３０％Ｔ細胞を活性化する）。このような抗原性ペプチドまたは抗原性エピトープの抗原搭載は、エクソソーム表面を抗原性ペプチドで完全にコーティングするために、エクソソームを混合および捕捉した後に行うことができる。前記組成物は、本明細書に開示される方法を使用して調製することができる。よって、免疫原性エクソソーム複合体は、マイクロ流体デバイスの細胞培養チャンバーに細胞を導入すること；前記細胞を、操作されたエクソソームの放出を可能にする条件下で培養すること；前記操作されたエクソソームを混合チャネルに導入し、前記操作されたエクソソームを免疫磁性粒子および洗浄バッファーと混合してエクソソーム捕捉／結合のための混合物を形成すること；次いで、収集チャンバー内に磁場を印加して分離されたエクソソームを収集し、抗原性ペプチドを含有するローディングバッファーと反応させて免疫原性エクソソーム複合体を形成すること；ならびにマイクロ流体デバイスの出口で免疫原性エクソソーム複合体を収集するために、紫外線を当てて前記光切断可能なリンカーを破断することを含んでなるプロセスによって調製される。

また、前記免疫原性エクソソーム複合体を含んでなる医薬組成物も開示される。前記搭載標的は、薬物、遺伝子および生物活性治療薬であり得る。免疫原性エクソソーム複合体を含んでなる医薬組成物を対象に投与することを含んでなる、対象の疾患を治療する方法が開示される。特定の実施形態では、この疾患は感染症であり得る。いくつかの例では、この疾患は癌であり得る。治療される疾患が癌である場合、前記方法は、化学療法薬を投与することをさらに含むことができる。

本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、請求し必要な手数料を支払うことによって特許庁から提供される。

図１は、（Ａ）サンプル溶液と混合された免疫磁性ビーズ、（Ｂ）免疫磁性ビーズを使用したサンプル溶液中の標的の捕捉；および（Ｃ）捕捉された標的上またはその内部への抗原性薬剤または活性薬剤の搭載を示す。 図２Ａは、（Ａ）ビーズ／標的複合体への光または活性化放射線の適用、および（Ｂ）活性薬剤または抗原性部分で表面修飾された操作標的（担体）の光放出を示す。 図２Ｂは、（Ａ）ビーズ／標的複合体への光または活性化放射線の適用、および（Ｂ）内部に活性薬剤が搭載された操作標的（担体）の光放出を示す。 図３は、抗腫瘍応答の活性化に使用される抗原性エクソソームの合理化された操作のための３Ｄ印刷成形ＰＤＭＳマイクロ流体培養チップのプロセス概要の説明である。 図４は、マイクロ流体デバイスのある実施形態を示す。 図５は、（ａ）マイクロ流体チャネルおよび流れ；（ｂ）マイクロビーズとの混合；（ｄ）細胞の形態；ならびに（ｅ）放出されたエクソソームのＳＥＭ画像を示す。 図６は、マイクロ流体デバイスのある実施形態を示す。 図７Ａは、ＭＨＣ－Ｉ陽性免疫原性エクソソームの免疫磁性捕捉およびオンデマンド光放出の説明図を示す。 図７Ｂは、光切断可能な免疫磁性ビーズとコンジュゲートされた３つの腫瘍標的ペプチド抗原の、蛍光標識免疫原性エクソソームの結合および光放出についての特性評価を示す。ＭＨＣ－Ｉ抗体は、ＭＨＣ－Ｉ陽性エクソソームと腫瘍標的ペプチド間で結合強度を比較するために陽性対照として使用される。 図８Ａは、免疫磁性捕捉ビーズからの、捕捉されたエクソソームのオンデマンド光放出の性能の特性評価を示す。陽性対照は、光放出免疫磁性ビーズにより捕捉された蛍光標識抗体である。陰性対照は、光切断可能なリンカーのない免疫磁性ビーズである。 図８Ｂは、エクソソームによって捕捉された光放出免疫磁性ビーズの表面のＳＥＭ画像を示す。エクソソーム粒子は、真空サンプルを調製したため、カップ形状として見られた。 図８Ｃは、光切断後の光放出免疫磁性ビーズの表面のＳＥＭ画像を示す。 図８Ｄは、光切断効率に対するＵＶ照射時間の影響の特性評価を示す。 図８Ｅは、操作されたエクソソームと操作されていないエクソソーム間でのエクソソームサイズ分布のナノ粒子追跡分析を示す。 図９Ａは、腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）ペプチド、ｇｐ－１００表面操作エクソソームの、操作されていないエクソソームと比較したＤＣ取り込みの共焦顕微鏡画像を示す。ＤＣによる緑色蛍光標識エクソソーム取り込みを追跡するために１時間ごとに画像を撮影した（細胞核はＤＡＰＩで染色された）。 図９Ｂは、操作されていないエクソソームとｇｐ－１００操作エクソソームとの間で比較した、４８時間のモニタリングの間にＥＬＩＳＡによって測定されたＤＣ培養物からのサイトカインＩＦＮ－γの放出を示す。 図１０Ａは、Ｔ細胞＋活性化ＪＡＷＳ細胞を漸増濃度のｇｐ１００操作エクソソームとともに含むウェルからの代表的なフロープロットを示す。 図１０Ｂは、刺激下でのＣＤ８＋Ｔ細胞分化率を示す３つの培養条件総てからの累積データを示す。結果は、培養条件につき２連のウェルを用いた２つの独立した実験を表している。 図１１は、免疫原性を示すための、Ｔ細胞および活性化ＪＡＷＳ細胞を漸増濃度のウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）抗菌性ペプチド操作エクソソームとともに含むウェルからのフローサイトメトリープロットを示す。 図１２Ａは、細胞培養および下流のエクソソーム分離、表面操作、ならびにオンデマンド光放出と統合された、３Ｄ型を作製するための３Ｄ印刷アプローチを示す。 図１２Ｂは、ＰＤＭＳマイクロ流体デバイスの反復からの結果を示す。 図１３は、タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡの観点からエクソソーム分子含量に対するＵＶ照射の副作用の調査からの結果を示す。 図１４は、異なる刺激条件下での樹状単球培養を示す：刺激しない場合の樹状単球（陰性対照；最初の画像）；ＰＷＭタンパク質刺激（陽性対照；２番目の画像）；およびｇｐ－１００操作エクソソーム刺激（最後の画像）。

発明の具体的説明

本開示の以下の説明は、その最良の、現在知られている実施形態における本開示の権能を付与する教示として提供される。この目的のために、関連技術の当業者は、本開示の有益な結果をなお得ながら、本明細書に記載される本発明の様々な実施形態に多くの変更を加えることができることを認識し、理解するであろう。本開示の所望の利益のいくつかは、本開示の特徴のいくつかを選択することによって、他の特徴を利用することなく得られることも明らかであろう。よって、当業者は、本開示に対する多くの改変および適合が可能であり、特定の状況においては望ましくさえあり得、本開示の一部であることを認識するであろう。従って、以下の説明は、本開示の原理の例示として提供され、それに限定されない。

用語
別段の定義がない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を有する。以下の定義は、本明細書で使用される用語を完全に理解するために提供される。

開示される組成物を調製するために使用される成分、ならびに本明細書に開示される方法の範囲内で使用される組成物自体が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個別的および集合的な組合せと順列の具体的な言及は明示的に開示されないことがあるが、それぞれが本明細書に具体的に企図され、記載されていると理解される。例えば、特定の流体チャネルが開示および議論され、流体チャネルに対して行い得る複数の改変が議論される場合、流体チャネルのありとあらゆる組合せおよび順列、ならびに相反する具体的な指示がない限り可能な改変が具体的に企図される。従って、流体チャネルＡ、Ｂ、およびＣのクラスが開示され、同様に流体チャネルＤ、Ｅ、およびＦのクラス、および組合せ流体チャネルの一例、または、例えば、Ａ－Ｄを含んでなる組合せ流体チャネルが開示される場合、それぞれが個別に列挙されていなくても、それぞれが個別的および集合的に企図され、組合せ、Ａ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ、およびＣ－Ｆが開示されていると見なされることを意味する。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも開示される。従って、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－ＦおよびＣ－Ｅのサブセットが開示されていると見なされることになる。この概念は、限定されるものではないが、開示される組成物を作製および使用する方法における工程を含む、本出願の総ての態様に適用される。従って、行われ得る様々な追加の工程が存在する場合、これらの追加の工程のそれぞれは、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組合せによって行われ得ることが理解される。

本明細書に開示されるデバイスは、ある特定の機能を有することが理解される。開示される機能を果たすためのある特定の構造的要件が開示され、開示される構造に関係付けられた同じ機能を果たし得る様々な構造が存在すること、およびこれらの構造が最終的に同じ結果を達成することは理解される。

特に明記しない限り、本明細書に記載されるいずれの方法もその工程を特定の順序で行う必要があると解釈されることを決して意図するものではない。従って、方法クレームに、従うべき工程の順序が明示的に列挙されずまたは工程が特定の順序に限定されることが特許請求の範囲または本明細書に具体的に記述されていない場合、いかなる観点でも順序が推測されることを決して意図するものではない。これは、工程の配列または操作フローに関する論理の事項；文法構成または句読法から導かれる明瞭な意味；および本明細書に記載される実施形態の数または種類を含めて、解釈のあらゆる可能性のある非明示的な根拠にも適用できる。

本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が別段のことを明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「薬剤」という用語は、それらの混合物を含む複数の薬剤を含む。

本明細書で使用する場合、「できる(can)」、「してよい(may)」、「所望により(optionally)」、「所望によりできる(can optionally)」、および「所望によりしてよい(may optionally)」という用語は、互換的に使用され、状態が発生する場合だけでなく状態が発生しない場合も含むことを意味する。従って、例えば、製剤は「賦形剤を含んでよい」という言明は、製剤が賦形剤を含む場合だけでなく製剤が賦形剤を含まない場合を含むことを意味する。

範囲は、「約」ある特定の値からおよび／または「約」別の特定の値までとして表すことができる。このような範囲が表される場合、別の実施形態は、ある特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、先行語「約」を使用することにより、値が近似として表される場合、その特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。また、範囲のそれぞれの端点は、他の端点に関連しておよび他の端点とは独立しての両方で重要であることも理解される。さらに、本明細書には複数の値が開示されていることおよびそれぞれの値もまた、その値自体に加えて、「約」その特定の値として本明細書に開示されていることも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示される。

「上流」および「下流」という用語は、相対的な別の位置であるデバイス内の位置と流体の流れの方向を指す。本明細書で使用する場合、「上流」という用語は、第２の位置に対して流体の流れの方向と反対の方向に位置する第１の位置を指す。逆に、本明細書で使用する場合、「下流」という用語は、第１の位置に対して流体の流れの方向に沿った方向に位置する第２の位置を指す。

方法
図１を参照すると、本明細書に記載される一般的な方法は、複数の免疫磁性粒子（ビーズ）を含み、これらは、標的を含むと疑われるサンプル溶液と混合される。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、対象から収集され、前記方法のために、例えば、バッファーでの希釈、濃縮などにより調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、収集され、拡大培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、収集され、エクソソームまたは他の細胞外小胞もしくは小胞様構造を培養物に放出するための条件下で培養される。いずれにしても、免疫磁性粒子は、標的を捕捉するために、その粒子表面から延伸する光切断可能なリンカーおよび親和性プローブ（および好ましくは、それぞれがそれぞれの親和性プローブを有する複数の光切断可能なリンカー）を含む。免疫磁性粒子は、標的（サンプル中に存在する場合）が、免疫磁性粒子から延伸する親和性プローブと相互作用するのに十分な時間、サンプル溶液と接触させる。図１では、説明し易くするために、単一のビーズを単一のリンカーとともに示している；しかしながら、実際には、それぞれの免疫磁性粒子は、複数のリンカーでコーティングされる（好ましくは、粒子／ビーズの実質的に全表面積がリンカーでコーティングされる）。さらに、図１の相対的なサイズは縮尺どおりではなく、説明のために拡大している。実際には、このビーズ／粒子は、好ましくは、標的より少なくとも５倍大きい（例えば、直径が３０～１５０ｎｍの範囲のエクソソームの場合、ビーズは、好ましくは５００ｎｍ以上である）。このようにして、複数の標的（例えば、エクソソーム）が単一のビーズ／粒子の表面に捕捉される。図１は、参照し易くするために、単一のビーズと標的の相互作用を使用している。図１（Ａ）に示されるように、ビーズとサンプル溶液は十分な時間、混合される（例えば、マイクロ流体デバイスの混合チャンバーまたはチャネル内で）。標的がサンプル溶液に存在する場合、図１（Ｂ）に示すように、標的はビーズによって（具体的には、ビーズからその光切断可能なリンカーを介して延伸する親和性プローによって）捕捉される。例示的な光切断可能なリンカーは、本明細書に記載され、粒子に取り付けるために一端にビオチンまたは同様の部分を含み、親和性プローブに取り付けるためにもう一方の端にアミン部分を含む線状鎖を含み得る。好ましいリンカーは、以下の構造を有し、ここで、破線は、露光中に切断された結合を示し、「結合基」は、リンカーをビーズに（直接または官能化表面コーティング、例えば、アビジンを介して）取り付けるために使用される部分（例えば、ビオチン）を表す：

様々な実施形態が本明細書に記載されているが、親和性「プローブ」は、一般に、標的の表面タンパク質を認識し、それに対する受容体として作用するペプチドなど、標的に対する特異性を有し、その標的を認識するオリゴペプチド配列である。本明細書で使用する場合、「に対する特異性」という句は、親和性プローブを分子間の非特異的結合または反応と区別することを意図しており、親和性プローブが相互作用し得る特定の標的のセットが制限され、場合によっては排他的でさえあるため、標的（および具体的には、その設計された表面タンパク質）以外の他の分子との結合は認め得るほどの割合で起こらないことを意味する。標的に対して高い特異性を有する配列セグメントを含む親和性プローブには、短いオリゴペプチド配列が使用されることが好ましい。より好ましくは、結合すると、親和性プローブと表面タンパク質は、本明細書でより詳細に記載され、実施例で示されるように、標的の免疫原性の可能性を増強する複合体を作出する。

捕捉された標的（例えば、エクソソーム）を有するビーズは、マイクロ流体デバイス内に固定される。ビーズは、標的の捕捉の前または後に固定することができる。本明細書の他所で記載されるように、これは、マイクロ流体デバイスの収集チャンバーまたは操作チャンバーに隣接して磁石を配置することによって達成することができる。サンプル溶液とビーズ溶液がマイクロ流体チャネルを流れると、ビーズと標的が相互作用し、それによって標的を捕捉する。磁気ビーズは、これらの溶液が流れるときに収集チャンバーまたは操作チャンバー内に固定される（これにより、捕捉された標的も固定される）。次に、図１（Ｃ）に示されるように、捕捉された標的は、複数の活性薬剤（例えば、抗原性ペプチド）を標的表面に取り付けるか、または標的に薬物、化学物質、ヌクレオチド、または他の生物活性薬剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９）を搭載することにより操作される。表面修飾の場合、固定されたビーズ／標的複合体をマイクロ流体デバイス中で、標的の表面に提示される表面タンパク質に対して特異性を有する少なくとも１つの部分を有する複数の活性薬剤を含有するバッファー溶液で洗浄し、インキュベートする。好ましくは、表面搭載のための活性薬剤または部分は、免疫磁性粒子で使用される親和性プローブに対して選択された同じ「タイプ」の化合物（例えば、同じオリゴペプチドを含んでなる）のものである。固定されたビーズ／標的複合体は、活性薬剤が捕捉された標的と相互作用するのに十分な時間、活性薬剤とともにインキュベートされる。好ましくは、マイクロ流体デバイスへの活性薬剤の搭載は、標的の実質的に全表面が活性薬剤でコーティングされるような濃度である（例えば、好ましくは、標的表面タンパク質の実質的に総てが活性薬剤によって結合されている）。表面修飾の代わりに、図１（Ｃ）は、活性薬剤を標的に搭載し得る代替案も示している。これは、固定されたビーズ／標的複合体をマイクロ流体デバイス中で、活性薬剤搭載のために標的に細孔形成を誘導する界面活性剤または化学的トランスフェクション試薬とともに、搭載する活性薬剤を含有するバッファー溶液で洗浄し、インキュベートした後、バッファーで洗浄して試薬を除去し、細孔を閉じることにより実施することができる。次に、いずれの実施形態においても、過剰な活性薬剤が洗い流され、操作された標的は免疫磁気ビーズで固定されたままとなる。

図２Ａを参照すると、次に、固定されたビーズ／標的複合体を、光切断可能なリンカーを切断するのに適当な波長の活性化放射線（例えば、光）に曝露することにより、操作された標的を放出することができる。このプロセスにより、標的に結合したままである親和性プローブとともに、操作された標的が放出され、これは標的の表面に装飾された活性薬剤の操作された担体または送達ビヒクルとして機能する。同様に、図２Ｂでは、同じ光放出プロセスを使用して、活性薬剤が内部に搭載された標的を放出することができる。洗浄バッファーをマイクロ流体デバイスに導入して、放出された標的を、マイクロ流体デバイスの出口で収集するために下流に輸送することができる。有利には、本発明の実施形態における光放出工程は、１５分以下、好ましくは、約１３分以下、より好ましくは、約１２分以下の照射時間で実施される。実施例に示されるように、捕捉された標的のおよそ１００％が、照射時間約１０分以内に放出／切断されることが好ましい。

磁性ビーズはすでに操作チャンバー内に固定されているため、溶液中の磁性ビーズから標的を分離するために別個の工程は必要ではないことは理解されよう。むしろ、露光時に、捕捉された標的とビーズとの間のリンカーが切断され、それにより、操作された標的が放出され、これらは、固定されたビーズからマイクロ流体デバイスの出口へと下流に流れる。次に、活性部分で操作された、放出された標的（「操作された担体」ともいう）は、マイクロ流体デバイスの出口から分析および治療的使用のために収集することができ、そうでない場合は、さらなるチャンバーまたは収集デバイスに直接転用することができる。その後、免疫磁性ビーズは、免疫磁性ビーズがもはや磁気的に固定されないようにマイクロ流体デバイスから磁場を除去することによって、再利用するために収集することができることは理解されよう。ビーズは、下流で洗浄され、出口から収集することができる。

前述のように、このプロセスは、有利には、マイクロ流体デバイスにおいて、サンプルからのエクソソームなどの無傷の標的を治療担体または送達ビヒクルとして、分離、捕捉、操作、および放出するための連続的で統合されたインラインアプローチとして行うことができる。

デバイス
細胞外小胞（≦１μｍ）、特に、エクソソーム（３０～１５０ｎｍ）は、細胞シグナル伝達を媒介するための新たな積み荷である。しかしながら、標準的なベンチトップ法（例えば、超遠心分離および濾過）は、時間がかかり（＞１０時間）、非常に手間がかかる分離プロトコールのため、特に、他の微小小胞体サブタイプの中でも、免疫原性エクソソームを処理する能力を欠いている。本開示は、オンチップ培養細胞培地から直接、免疫原性細胞外小胞およびエクソソームの採取、抗原修飾、および光放出のための合理化されたマイクロ流体プラットフォームを導入するデバイスを提供することによって、当技術分野でのニーズに対処する。これらのデバイスは、癌免疫療法などの免疫療法で使用することができる抗原性エクソソームの自動かつ迅速な細胞培養生産を提供する。本明細書に開示されるデバイスは、図３の概要に示されるように、エクソソームのリアルタイムの採取および抗原修飾と、その後の下流でのオンデマンド光放出を可能にする。

次に図４を参照すると、生物学的材料を三次元構成に維持するような寸法の細胞培養チャンバー（２１０）；混合チャネルに沿って配置された複数のサンプル入口チャネル（２２２、２２４、２２６）を含んでなる、前記細胞培養チャンバーに流体接続された混合チャネル（２２０）（ここで、前記細胞培養チャンバー（２１０）の幅と混合チャネル（２２０）の最大断面寸法の比は少なくとも５：１である）；混合チャネル（２２０）から分離出口（２３４）までの流体の流れの経路を規定する分離チャネル（２３０）；および、収集チャンバー（２４０）内で磁場を生成するために、収集チャンバーに作動可能に連結された磁石を含んでなる、分離出口（２３４）に流体接続された収集チャンバー（２４０）とを含んでなるマイクロ流体デバイス（２００）が本明細書に開示される。

本開示のデバイスは、このデバイス内の構成要素のサイズおよびサイズの比較（例えば、比）によって説明することができる。いくつかの実施形態では、細胞培養チャンバー（２１０）は、約２００マイクロリットル以上（例えば、２００マイクロリットル以上、２５０マイクロリットル以上、３００マイクロリットル以上、３５０マイクロリットル以上、４００マイクロリットル以上、４５０マイクロリットル以上、５００マイクロリットル以上、５５０マイクロリットル以上、６００マイクロリットル以上、６５０マイクロリットル以上、７００マイクロリットル以上、７５０マイクロリットル以上、８００マイクロリットル以上、８５０マイクロリットル以上、９００マイクロリットル以上、９５０マイクロリットル以上、または１ミリリットル以上）の容積を有する。いくつかの実施形態では、細胞培養チャンバー（２１０）は、約１０００マイクロリットル以下（例えば、９５０マイクロリットル以下、９００マイクロリットル以下、８５０マイクロリットル以下、８００マイクロリットル以下、７５０マイクロリットル以下、７００マイクロリットル以下、６５０マイクロリットル以下、６００マイクロリットル以下、６５０マイクロリットル以下、５５０マイクロリットル以下、５００マイクロリットル以下、４５０マイクロリットル以下、４００マイクロリットル以下、３５０マイクロリットル以下、３００マイクロリットル以下、２５０マイクロリットル以下、または２００マイクロリットル以下）の容積を有する。いくつかの実施形態では、細胞培養チャンバー（２１０）は、約２００マイクロリットル～約１ミリリットル（例えば、２００マイクロリットル～９００マイクロリットル、２００マイクロリットル～７５０マイクロリットル、２００マイクロリットル～５００マイクロリットル、３００マイクロリットル～７５０マイクロリットル、または３５０マイクロリットル～約５００マイクロリットル）の容積を有する。いくつかの実施形態では、細胞培養チャンバーは、流体交換のためのプラグ（例えば、ＰＤＭＳ製のフィンガープッシュプラグ）を適用し、流体を下流の収集イオンチャネルに押し出すために、上部が開いたままにできるように十分な容積を有する。

いくつかの実施形態では、細胞培養チャンバーは、高さおよび幅を有する。細胞培養チャンバーは、少なくとも５００ミクロン（例えば、５００ミクロン以上、６００ミクロン以上、６５０ミクロン以上、７００ミクロン以上、７５０ミクロン以上、８００ミクロン以上、８５０ミクロン以上、９００ミクロン以上、９５０ミクロン以上、または１０００ミクロン以上）の高さを有し得る。いくつかの実施形態では、細胞培養チャンバーは、１０００ミクロン以下（例えば、９５０ミクロン以下、９００ミクロン以下、８５０ミクロン以下、８００ミクロン以下、７５０ミクロン以下、７００ミクロン以下、６５０ミクロン以下、６００ミクロン以下、または５００ミクロン以下）の高さを有する。いくつかの実施形態では、細胞培養チャンバーは、５００ミクロン～１０００ミクロン（例えば、６００ミクロン～１０００ミクロン、７５０ミクロン～１０００ミクロン、または８００ミクロン～１０００ミクロン）の高さを有する。

細胞培養チャンバーは、少なくとも２００ミクロン（例えば、２５０ミクロン以上、２７５ミクロン以上、３００ミクロン以上、３５０ミクロン以上、４００ミクロン以上、４５０ミクロン以上、５００ミクロン以上、５５０ミクロン以上、または６００ミクロン以上）の幅を有し得る。いくつかの実施形態では、細胞培養チャンバーは、１０００ミクロン以下（例えば、１０００ミクロン未満、７５０ミクロン以下、７５０ミクロン未満、６００ミクロン以下、５５０ミクロン以下、または５００ミクロン以下）の幅を有する。いくつかの実施形態では、細胞培養チャンバーは、２５０ミクロン～１０００ミクロン（例えば、２５０ミクロン～７５０ミクロン、２５０ミクロン～５００ミクロン、３００ミクロン～７５０ミクロン、または３００ミクロン～５００ミクロン）の幅を有する。

本明細書に記載されるように、混合チャネル（２２０）は、細胞培養チャンバーに流体接続し、混合チャネルに沿って配置された複数のサンプル入口チャネル（２２２、２２４、２２６）を含んでなる。複数のサンプル入口チャネルは、細胞培養チャンバーに流体接続し、かつ、細胞培養チャンバーから混合チャネルに流体を導入するための経路を規定する細胞培養入口チャネル（本明細書ではＢ－入口とも呼ばれる、２２２）を含むことができる。複数のサンプル入口チャネルはさらに、混合チャネルに粒子を導入するための経路を規定する粒子入口チャネル（本明細書ではＡ－入口とも呼ばれる、２２４）を含むことができる。複数のサンプル入口チャネルはさらに、混合チャネルに流体（例えば、洗浄バッファー）を導入するための経路を規定する流体入口チャネル（本明細書ではＣ－入口とも呼ばれる、２２６）を含むことができる。複数のサンプル入口チャネルは、任意の配置にすることができる。例えば、細胞培養入口チャネルは、流体入口チャネルの上流にある粒子入口チャネルの上流にあってよい。他の例では、粒子入口チャネルは、流体入口チャネルの上流にある細胞培養入口チャネルの上流にあってよい。

細胞培養入口チャネル、粒子入口チャネル、および流体入口チャネルは、混合交差点で流体収束し得る。細胞培養入口チャネルは、細胞培養チャンバーから混合交差点までの流体の流れの経路を形成する。粒子入口チャネルは、粒子入口から混合交差点までの流体の流れの経路を形成する。流体入口チャネルは、流体入口から混合交差点までの流体の流れの経路を形成する。本明細書で使用する場合、流体の流れの経路は、図面では流体の流れの経路を流れる流体の方向を示す矢印によって絵を用いて表すことができる。

細胞培養入口チャネル、粒子入口チャネル、および流体入口チャネルを含んでなる混合チャネルは、高さおよび幅を有する。いくつかの実施形態では、混合チャネルは、少なくとも５０ミクロン（例えば、７５ミクロン以上、１００ミクロン以上、１２０ミクロン以上、１５０ミクロン以上、１７５ミクロン以上、２００ミクロン以上、２５０ミクロン以上、３００ミクロン以上、３５０ミクロン以上、４００ミクロン以上、または５００ミクロン以上）の高さを有する。いくつかの実施形態では、混合チャネルは、５００ミクロン以下（例えば、５００ミクロン未満、４５０ミクロン以下、４００ミクロン以下、４００ミクロン未満、３５０ミクロン以下、３００ミクロン以下、３００ミクロン未満、２７５ミクロン以下、２５０ミクロン以下、２００ミクロン以下、１５０ミクロン以下、１００ミクロン以下、または５０ミクロン以下）の高さを有する。いくつかの実施形態では、混合チャネルは、５０ミクロン～５００ミクロン（例えば、１００ミクロン～５００ミクロン、２００ミクロン～５００ミクロン、１００ミクロン～３５０ミクロン、または２００ミクロン～５００ミクロン）の高さを有する。

混合チャネルは、少なくとも５０ミクロン（例えば、７５ミクロン以上、１００ミクロン以上、１２０ミクロン以上、１５０ミクロン以上、１７５ミクロン以上、２００ミクロン以上、２５０ミクロン以上、３００ミクロン以上、３５０ミクロン以上、４００ミクロン以上、または５００ミクロン以上）の幅を有し得る。いくつかの実施形態では、混合チャネルは、５００ミクロン以下（例えば、５００ミクロン未満、４５０ミクロン以下、４００ミクロン以下、４００ミクロン未満、３５０ミクロン以下、３００ミクロン以下、３００ミクロン未満、２７５ミクロン以下、２５０ミクロン以下、２００ミクロン以下、１５０ミクロン以下、１００ミクロン以下、または５０ミクロン以下）の幅を有する。いくつかの実施形態では、混合チャネルは、５０ミクロン～５００ミクロン（例えば、１００ミクロン～５００ミクロン、２００ミクロン～５００ミクロン、１００ミクロン～３５０ミクロン、または２００ミクロン～５００ミクロン）の幅を有する。

培養チャンバー幅と混合チャネルの最大断面寸法の比は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも１８：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも５０：１、少なくとも７５：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも３００：１、少なくとも３５０：１、少なくとも４００：１、少なくとも４５０：１、または少なくとも５００：１である。いくつかの実施形態では、培養チャンバー幅と混合チャネルの最大断面寸法の比は、５：１～５００：１、５：１～２００：１、５：１～１００：１、２：１～２５：１、５：１～２０：１、５：１～１５：１、６：１～２５：１、６：１～２０：１、６：１～１２：１、８：１～２５：１、または１０：１～２５：１である。培養チャンバー幅と混合チャネルの最大断面寸法の比が１より大きい（例えば、２：１）場合、混合チャネル入口でのチャネル幅の狭窄を定義する。

マイクロ流体デバイス内の１以上のチャネルは、いくつかの実施形態では、このデバイスを流れる流体の混合を促進する流体混合機構を含んでなり得る。流体混合機構は、流れる流体を混合するように乱流を誘導する。好適な混合機構には、他の既知の機構の中でも、蛇行または屈曲チャネル、チャネルの突起またはくぼみ、チャネルの湾曲が含まれる。

いくつかの実施形態では、流体混合機構は、マイクロ流体デバイスの混合チャネル内および／または分離チャネル内に存在し得る。例えば、マイクロ流体デバイスは、分離出口への混合チャネルに流体接続する分離チャネルを含むことができる。分離チャネルは、混合チャネルの一部を形成することができ、または分離することもできる。いくつかの実施形態では、分離チャネルは、混合チャネルから分離出口までの流体の流れの経路を規定する。分離チャネルは、流体が合流するときに混合を増す蛇行形状を含んでなり得る。図４を参照すると、蛇行形状を有する分離チャネル（２３０）は、流体混合に有利な位置に、例えば、混合交差点と収集チャンバーの間のデバイス内に配置することができる。いくつかの実施形態では、分離チャネルは、混合交差点のすぐ隣に（例えば、すぐ下流）配置される。

分離チャネルは、混合チャネル幅と比較して、同様のまたは狭い幅を有し得る。いくつかの実施形態では、分離チャネルは、少なくともいくつかの手段によって、混合チャネル幅と比較して、狭くなった幅を有し得る。例えば、分離チャネルは、分離チャネル入口と分離チャネル出口の間の分離チャネル内に配置された１以上のチャネル狭窄領域（例えば、図４の分離チャネルの狭い幅を形成するチャネル狭窄領域（２３２）を参照）を含んでなり得る。チャネル狭窄領域は、デバイス中を流れる流体の局所的な渦流プロフィールを作出することができる。いくつかの実施形態では、分離チャネルは、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、または少なくとも１０のチャネル狭窄領域を含んでなる。任意の１以上のチャネル狭窄領域は、チャネル側壁の突起および／またはくぼみであり得る。突起および／またはくぼみは、任意の形状、例えば、円形、線状形、三角形、不規則形などを有し得る。突起および／またはくぼみは、チャネルの内壁を（例えば、リングとして）取り囲むことができ、または１以上の突起および／またはくぼみは、チャネルの１以上の内側壁に配置することができる。チャネル狭窄領域を含めることにより、必要に応じて、流体の流れの乱流および流体混合を増すことができる。

本明細書に開示されるデバイスは、分離出口（２３４）に流体接続された収集チャンバー（２４０）を含むことができる。いくつかの実施形態では、このデバイスは、収集チャンバー内で磁場を生成するために、前記収集チャンバーに作動可能に連結された磁石をさらに含んでなり得る。磁石は、収集チャンバー内で磁場を生成することが可能ないずれの磁石であってもよい。いくつかの実施形態では、磁場は、振動磁場を含むことができる。振動磁場は、時間の経過とともに規則的に（例えば、自動化された周期的な規則性）または不規則に（例えば、ユーザー制御により）変動する磁場である。振動磁場は、磁場の方向が時間とともに変化するように、磁北極と磁南極の空間的配向の動的変化を含む。このような変化は、周期的または不規則であり得る。収集チャンバー内に振動磁場を提供することが可能な振動磁石を含めることにより、収集チャンバー内に磁性プローブ（例えば、磁性ビーズまたは粒子）を誘導して、収集チャンバー内を磁場の方向に沿って動的に移動させることができる。磁場の方向が変わると、収集チャンバー内の磁性粒子の方向性も変化する。これは、磁性粒子と収集チャンバー内の流体に存在する標的との間の相互作用（および会合／結合）を促進するために使用することができる。いくつかの実施形態では、磁場は、永久磁石から得ることができる。永久磁石は、使用しないときは取り外して、例えば、磁場のスイッチを切ることができる。

いくつかの実施形態では、磁石は、トロイダル形状などの任意の形状を有し得る。いくつかの実施形態では、磁石は、ヘルムホルツコイルまたは永久磁石を含んでなる。

磁場は、収集チャンバーの幅全体にわたって存在し得る。いくつかの実施形態では、磁場は、収集チャンバーの一部に及び、例えば、収集チャンバーの全幅の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に及び得る。さらに、磁場は、マイクロ流体デバイスの他の部分にも及び得る。例えば、磁場は、混合チャネル、混合交差点、粒子入口チャネル、または他の構成要素の一部または全体の１以上に及び得る。

いくつかの実施形態では、このマイクロ流体デバイスは、このデバイスに作動可能に連結されたポンプを含んでなり得る。ポンプは、デバイス内に流体の流れを誘導することが可能な当技術分野で公知のいずれのポンプであってもよい。いくつかの実施形態では、ポンプは、デバイス内に陰圧を与えることができ、それによって、チャネルを通して流体を引き出すことができる。好適なポンプの例は、ＵＳ２０１７００６５９７８およびＵＳ２０１７０００１１９７に見出すことができ、それぞれは、それらの全内容が本明細書の一部として援用される。

次に図６を参照すると、細胞培養入口（２１０２）および細胞培養出口（２１０４）を含んでなる細胞培養チャンバー（２１００）、流体入口チャネル（２２０２）および粒子入口チャネル（２２０４）（細胞培養出口（２１０４）、流体入口チャネル（２２０２）、および粒子入口チャネル（２２０４）は混合交差点（２２００）で流体収束する）；混合交差点（２２００）から混合出口までの流体の流れの経路を規定する、混合交差点（２２００）に流体接続された混合チャネル（２３００）（細胞培養チャンバー（２１００）の幅と混合チャネル（２３００）の最大断面寸法の比は少なくとも５：１である）；収集チャンバー（２４００）内で磁場を生成するために、収集チャンバー（２４００）に作動可能に連結された磁石を含んでなる、前記混合出口に流体接続された収集チャンバー（２４００）とを含んでなるマイクロ流体デバイス（２０００）もまた開示される。混合チャネル（２３００）は、混合交差点（２２００）と混合出口の間に配置された分離チャネル（２３０２）を含んでなり得る。

本明細書で提供されるマイクロ流体デバイスの別の態様は、細胞培養チャンバー、混合チャネル、分離チャネル、および収集チャンバーを含む、２以上のチャンバーセットおよび／またはチャネルセットを含む多重化マイクロ流体デバイスに関する。単一のマイクロ流体デバイスに対してそのようなチャネルおよび／またはチャンバー２以上を構成することにより、サンプル処理スループットを向上させ、および／または異なる画分または操作のために少なくとも２つのサンプルまたはサンプルの一部の並列処理を可能にすることができる。２以上のチャンバーおよび／またはチャネルは、直列に、並列に、またはそれらを組み合わせて配置することができる。

並列多重化マイクロ流体デバイスのいくつかの実施形態では、２以上の混合チャネルは、同じマイクロ流体デバイスに配置された別個のサンプル入口を有し得る。このような配置は、複数の流体サンプルに使用することができる。あるいは、複数の混合チャネルは、同じ流体サンプルの並列処理のために同じサンプル入口に接続することができる。加えて、２以上の混合チャネルは、同じマイクロ流体デバイスに配置された別個の出口を有し、または同じ出口に接続することができる。１以上の実施形態において、９６カ所ものサンプル入口を有する多重化マイクロ流体デバイスが企図される。

本開示のマイクロ流体デバイスは本明細書に開示される様々な組成物、デバイス、方法、製品、および用途と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、独立型マイクロ流体デバイスであり得る。いくつかの実施形態では、１以上のマイクロ流体デバイスを、機器、モジュールまたはシステムの一部として統合することができる。他の実施形態では、１以上のマイクロ流体デバイスを、機器、モジュールまたはシステムに流体連結することができる。

ほんの一例として、１以上のマイクロ流体デバイスおよび／または多重化マイクロ流体デバイスを、検出モジュールに流体連結することができる。本明細書で使用する場合、「流体連結」という用語は、流体が一方のデバイスまたはモジュールから他方のデバイスまたはモジュールへと通過しまたは流れることができるような適当な方法で接続された２以上のデバイスおよび／またはモジュールを指す。２以上のデバイスおよび／またはモジュールが同時に流体連結されている場合、その２以上のデバイスおよび／またはモジュールの間に追加のデバイスおよび／またはモジュールが存在し得る。

あるいは、介在するデバイスまたはモジュールなしに第１のデバイスまたはモジュールから第２のデバイスまたはモジュールへと直接、流体が通過しまたは流れることができるように、前記２以上のデバイスおよび／またはモジュールを２つ接続することができる。２以上のデバイスまたはモジュールは、例えば、管形材料、導管、チャネル、配管またはそれらの任意の組合せを使用して、第１のデバイスまたはモジュールの出口を第２のデバイスまたはモジュールの入口に接続することにより流体連結することができる。

検出モジュールは、本明細書に開示される任意の検出方法または他の当技術分野で公知の方法遂行することができる。いくつかの実施形態では、検出モジュールは、分析のためにサンプルが検出される前に、サンプル処置モジュールを含むことができる。例えば、エクソソーム（免疫磁性粒子を含むまたは含まない）は、顕微鏡による検出の前に免疫染色に供することができる。検出モジュールの例には、限定されるものではないが、顕微鏡（例えば、明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡、または共焦顕微鏡）、分光光度計（例えば、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計）、セルカウンター、バイオキャビティレーザー（例えば、Gourley et al., J. Phys. D: Appl. Phys. 36: R228-R239 (2003)参照)、質量分析計、イメージングシステム、アフィニティーカラム、粒子選別機、例えば、蛍光活性化セルソーター、キャピラリー電気泳動、サンプル保存デバイス、およびサンプル調製デバイスが含まれ得る。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムを、例えば、サンプル処置、検出および／または分析のプロセスを促進するために、検出モジュールに接続することができる。

作製方法
本明細書に記載されるデバイスは、流体サンプルと適合性のある任意の材料で作製することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるデバイスを製作するための材料は、磁場が貫通し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるデバイスを製作するための材料は、その中のサンプルがイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で光切断され得、またはそれが、例えば、磁性標識されたエクソソームのイン・サイチュ分析のために、顕微鏡下で見えるように、実質的に透明であり得る。本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスを製作するために使用することができる例示的材料には、限定されるものではないが、ガラス、コポリマー、ポリマーまたはそれらの任意の組合せが含まれ得る。例示的ポリマーには、限定されるものではないが、ポリウレタン、ゴム、成形プラスチック、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（商標））、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスルホン、およびエーテル系脂肪族ポリウレタンが含まれる。

本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスの任意の実施形態の製作に使用される方法は、使用される材料によって異なり得、３Ｄ印刷法、ソフトリソグラフィー法、マイクロアセンブリー、バルクマイクロマシニング法、表面マイクロマシニング法、標準リソグラフィー法、ウェットエッチング、反応性イオンエッチング、プラズマエッチング、ステレオリソグラフィーおよびレーザー化学三次元ライティング法、固体印刷、マシニング、モジュラーアセンブリー法、レプリカ成形法、射出成形法、熱成形法、レーザーアブレーション法、方法組合せ、および当技術分野で公知の他の方法を含む。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスは、３Ｄプリンターを使用して製作することができる。例えば、マイクロ流体デバイスの作製方法は、図７に示されるように、土台、壁、および上部磁石ホルダーを含む、３つのＰＤＭＳ型を提供することを含み得る。型は、３Ｄプリンターで印刷することができる。型は、スポーツラインパラジウムで２０ｎｍ厚にコーティングし、その後、当技術分野で公知の方法を使用して組み立てることができる。ＰＤＭＳ細胞チャンバーは、それが満たされているときに、細胞培養チャンバーがチャンバープラグの開放端を有するようにサイズ設定することができる。ＰＤＭＳは、リンカー試薬と１０：１比でのキャストし、４０℃の温度で６時間インキュベートすることができる。ＰＤＭＳは硬化した後、簡単に剥離することができる。チップの入口および出口は、パンチャーを使用して穴をあけることができる。次に、ＰＤＭＳチップを４０℃の温度のホットパッド上で５分間、後接着することができる。これらのチップは脱イオン水を使用して洗浄し、オートクレーブで滅菌することができる（１２１℃で３０分）。

使用方法
本明細書で論じられるように、開示されるマイクロ流体デバイスは、操作された細胞外小胞および様々な小胞様生物学的構造を分離、捕捉、操作、および放出するために使用することができる。特定の実施形態では、操作された細胞外小胞は免疫原性エクソソームである。本明細書で使用する場合、「エクソソーム」という用語は、一般に、エンドソームコンパートメントまたはあらゆる細胞、例えば、腫瘍細胞（例えば、前立腺癌細胞）、および免疫細胞（例えば、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、マクロファージ、肥満細胞、Ｔリンパ球またはＢリンパ球）に由来する外部に放出される小胞を指す。エクソソームは、一般に、腫瘍細胞、赤血球、血小板、リンパ球、および樹状細胞を含む様々な異なる細胞種から放出される約２０～１５０ｎｍのサイズの膜小胞である。エクソソームは、後期エンドソームの膜からの陥入および出芽により形成され得る。それらは、サイトゾルの多小胞体（ＭＶＢ）に蓄積し、そこから原形質膜との融合によって放出され得る。特定の理論に縛られることを望むものではないが、小胞放出のプロセスは、癌細胞などの増殖細胞において特に活発であり、そこでは放出が継続的に起こり得ると考えられる。エクソソームは、腫瘍細胞から放出されると、浸潤と移動を促進し得る。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される免疫磁性粒子を使用して、癌細胞に由来するエクソソームを捕捉することができる。エクソソームは、細胞の起源に応じて、ＭＨＣ分子、テトラスパニン、接着分子およびメタロプロテイナーゼを含む、原形質膜とは異なる可能性がある様々な細胞タンパク質を動員することができる。エクソソームの多くのサブタイプの中で、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子と他の共刺激分子の内在性のペイロードを有する免疫原性エクソソームは、免疫応答を媒介することができ、このことは、新規な癌ワクチンの開発および免疫療法における送達の機会を開く。

よって、本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスにおいて免疫原性エクソソームを生成する方法もまた本明細書で提供される。免疫原性エクソソーム複合体を生成する方法は、マイクロ流体デバイスの細胞培養チャンバーに細胞を導入することを含んでなり得る。細胞培養チャンバー内の細胞は、細胞外小胞を得ることができる任意の細胞を含むことができる。そのような細胞には、樹状細胞、幹細胞、免疫細胞、巨核球前駆細胞、マクロファージ、またはそれらの組合せが含まれる。

免疫原性エクソソームを生成するための方法は、エクソソームの放出を可能にする条件下で細胞を培養することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、この方法は、当技術分野で公知の刺激を用いてそれらの親細胞の成長を媒介することにより、細胞サンプル中に存在するエクソソームの数を高密度にしまたは拡大培養することを含むことができる。エクソソームを生成するために親細胞を培養するための従来の方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に開示される方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、ある期間、例えば、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４０時間、または少なくとも約４８時間培養され得る。

免疫原性エクソソーム複合体を生成するための方法は、エクソソームを含んでなる細胞培養物を、エクソソームを捕捉するための免疫磁性粒子および洗浄溶液と混合して混合物を形成することをさらに含んでなり得る。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞培養物からのエクソソームを混合チャネルに導入することおよびエクソソームを免疫磁性粒子および洗浄バッファーと混合して混合物を形成することを含む。免疫磁性粒子は、粒子入口チャネルを介して混合チャネルに導入し得、洗浄バッファーは、流体入口チャネルを介して混合チャネルに導入し得る。

免疫磁性粒子は、細胞培養物中に存在するエクソソームに選択的に結合してエクソソーム結合免疫磁性粒子を形成することができる。よって、この方法は、エクソソームが免疫磁性粒子と反応することを可能にすることを含み得る。免疫磁性粒子は、磁性粒子を含むことができ、限定されるものではないが、球形、棒状、楕円形、円筒形、および円盤形を含むいずれの形状のものでもよい。いくつかの実施形態では、実質的に球形であり、定義された表面化学を有する磁性粒子を使用して、化学的凝集および非特異的結合を最小限に抑えることができる。本明細書で使用する場合、「磁性粒子」という用語は、磁場勾配によって引き付けられるかもしくは反発される、または非ゼロ磁化率を有するナノスケールまたはマイクロスケールの粒子を指し得る。磁性粒子は、強磁性、常磁性または超常磁性であり得る。いくつかの実施形態では、磁性粒子は、超常磁性であり得る。

磁性粒子のサイズは、１ｎｍ～５ミクロンの範囲であり得る。例えば、磁性粒子のサイズは、約５００ｎｍ～約５ミクロンであり得る。いくつかの実施形態では、磁性粒子のサイズは、約１ミクロン～約５ミクロンであり得る。いくつかの実施形態では、磁性粒子のサイズは、約１ミクロン～約３ミクロンであり得る。磁性粒子は、磁場および／または磁場勾配を使用して操作し得る粒子のクラスである。そのような粒子は、一般に、鉄、ニッケルおよびコバルトなどの磁性元素とそれらの酸化物化合物で構成される。磁性粒子（ナノ粒子または微粒子を含む）は、よく知られており、それらの調製方法は、当技術分野で記載されている。また、磁性粒子は広く市販もされている。特に好ましい粒子は、その全内容が本明細書の一部として援用される、２０１７年１０月９日に出願されたＵＳ２０１８／０１００８５３に記載されているような、酸化グラフェンナノシートからなる酸化グラフェン層またはコーティングを有する磁性粒子である。

磁性粒子は、磁気特性に悪影響を及ぼさない標的（例えば、抗原ペプチドまたはその抗原性エピトープ）を捕捉するためのそれぞれの親和性プローブ（分子）を含んでなる複数のリンカーでコーティングすることができる。これに関して、磁性粒子は、エクソソームを捕捉するためのそれぞれの親和性プローブに磁性粒子を接続することができる有機部分または官能基および光切断可能なリンカーで官能化することができる。そのような有機部分または官能基は、一般に、直接結合または酸素もしくは硫黄などの原子、アミノ基、カルボン酸基、エポキシ基、トシル基、シリカ様基、カルボニル基、アミド基、ＳＯ、ＳＯ_２、ＳＯ_２ＮＨ、ＳＳなどの単位、または原子鎖を含んでなり得る。

特定の実施形態では、磁性粒子は、エクソソームを捕捉するための親和性プローブへの磁性粒子のコンジュゲーションを促進し得る親和性結合対の一方のメンバーでコーティングすることができる。「親和性結合対」または「結合対」という用語は、互いに特異的に結合する第１の分子と第２の分子を指す。結合対の一方のメンバーは、連結される第１の部分とコンジュゲートされており、第２のメンバーは、連結される第２の部分とコンジュゲートされている。例示的な結合対には、対応する抗体またはその結合部分もしくはフラグメントと組み合わせた任意のハプテン化合物または抗原性化合物（例えば、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン；マウス免疫グロブリンおよびヤギ抗マウス免疫グロブリン）および非免疫学的結合対（例えば、ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジン、ビオチン－ニュートラアビジン、ホルモン［例えば、チロキシンおよびコルチゾール－ホルモン結合タンパク質］、受容体－受容体アゴニスト、受容体－受容体アンタゴニスト（例えば、アセチルコリン受容体－アセチルコリンまたはそれらの類似体）、ＩｇＧ－プロテインＡ、ＩｇＧ－プロテインＧ、ＩｇＧ－合成タンパク質ＡＧ、レクチン－炭水化物、酵素－酵素補因子、酵素－酵素阻害剤、および核酸二重鎖を形成可能な相補的オリゴヌクレオチド対）などが含まれる。結合対はまた、負に帯電している第１の分子、正に帯電している第２の分子も含み得る。

結合対コンジュゲーションを使用する一例は、ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジンまたはビオチン－ニュートラアビジンコンジュゲーションである。よって、いくつかの実施形態では、磁性粒子は、捕捉分子として使用するためにビオチン化結合にコンジュゲートされ得るアビジン様分子（例えば、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジン）でコーティングすることができる。

いくつかの実施形態では、磁性粒子は、エクソソームを捕捉するための親和性プローブに磁性粒子を連結することができ、かつ、外部から適用される切断剤／条件、例えば、紫外線、ｐＨ、酸化還元電位または酵素などの分解分子の存在の影響を受けやすい切断可能な化学的部分でさらに官能化することができる。特定の例では、切断可能なリンカーは、磁性粒子に連結するための一方の機能的末端で結合対の一方のメンバー（例えば、ビオチン）にコンジュゲートすることができ、もう一方の機能的末端は、エクソソームを捕捉するための親和性プローブを提供する。従って、エクソソームに結合した磁性粒子が流体サンプルから分離された後、必要に応じて、磁性粒子と親和性プローブの間の切断可能な化学的部分を切断することにより、エクソソームを磁性粒子から分離することができる。

例示的な切断可能な連結基には、限定されるものではないが、光切断可能な連結基および酸化還元切断可能な連結基（例えば、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｓ－Ｓ－、および－Ｃ（Ｒ）_２－Ｓ－Ｓ－（ＲはＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルである））；リン酸系の切断可能な連結基（例えば、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲ）－Ｏ－、および－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－（Ｒは所望により置換されていてよい直鎖または分岐Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルである））；酸切断可能な連結基（例えば、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステル、－Ｃ＝ＮＮ－および－ＯＣ（Ｏ）－）；エステル系の切断可能な連結基（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－）；ペプチド系の切断可能な連結基(例えば、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される連結基、例えば、－ＮＨＣＨＲ_AＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ_BＣ（Ｏ）－（Ｒ_AおよびＲ_Bは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である））が含まれる。

いくつかの実施形態では、切断可能な連結基は、紫外線によって切断され得る光切断可能な基である。光切断可能な基の特定の例には、オルトニトロベンジル誘導体およびベンジルスルホニル、例えば、６－ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）、２－ニトロベンジルオキシカルボニル（ＮＢＯＣ）、α，α－ジメチル－ジメトキシベンジルオキシカルボニル（ＤＤＺ）、オルト－ニトロベンジル（ＯＮＢ）、１－（２－ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）、アルファ－カルボキシ－２－ニトロベンジル（ＣＮＢ）、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）、ｌ－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチル（ＤＭＮＰＥ）、５－カルボキシメトキシ－２－ニトロベンジル（ＣＭＮＢ）、および（５－カルボキシメトキシ－２－ニトロベンジル）オキシ）カルボニル（ＣＭＮＣＢＺ）が含まれる。芳香族コアの置換基は、吸収の波長に合わせるように選択され、電子供与基（例えば、メトキシ）は、一般に、より長い波長吸収をもたらすことは理解されよう。例えば、ニトロベンジル（ＮＢ）およびニトロフェニルエチル（ＮＰＥ）は、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジルおよび１－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチルそれぞれに２つのメトキシ残基を付加することによって修飾され、それによって、吸収波長範囲が３４０～３６０ｎｍへと増大する。光分解性保護基の追加の例には、ニトロ基に対してオルトのベンジル水素を含有する多重置換ニトロ芳香族化合物が含まれる（置換基には、アルコキシ、アルキル、ハロ、アリール、アルケニル、ニトロ、ハロ、または水素が含まれ得る）。使用し得る他の材料には、ｏ－ヒドロキシ－α－メチルシンナモイル誘導体、ＢＨＣなどのクマリン系に基づく光切断可能な基（例えば、米国特許第６，４７２，５４１号に記載されおり、この開示は、明細書の一部と援用される）、ｐＨＰ基を含んでなる光切断可能な基（例えば、Givens et al., J. Am. Chem. Soc. 122 2687-2697 (2000)に記載されており、この開示は、本明細書の一部として援用される）、ケトプロフェン由来のリンカー、ヘテロディールス・アルダー反応のニトロソ副生成物を捕捉するものを含む他のオルト－ニトロ芳香族コア骨格（米国特許出願第２０１０／０１０５１２０号で一般に議論されており、この開示は、本明細書の一部として援用される）、ニトロジベンゾフラン（ＮＤＢＦ）発色団、またはジアゾ－アジドが含まれる。光切断可能な基のさらなる例は、例えば、Patchornik, J. Am. Chem. Soc. (1970) 92:6333およびAmit et al., J. Org. Chem. (1974) 39:192に見出すことができ、これらの開示は、本明細書の一部として援用される。

上で論じたように、光切断可能な基は、分子（例えば、一方の機能的末端では結合対例の一方のメンバービオチン、およびもう一方の機能的末端では親和性プローブ）との共有結合が、適当な波長の光への曝露により切断されるものである。一態様において、親和性プローブおよび／または結合対の放出は、コンジュゲートが紫外線または近紫外線を受けたときに起こる。例えば、親和性プローブの光放出は、約２００～３８０ｎｍの範囲の波長で起こり得る（正確な波長または波長範囲は、使用される特定の光切断可能な基によって決まり、例えば、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、または３８０またはそれらの間のいくつかの範囲であり得る）。別の態様では、親和性プローブの放出は、コンジュゲートが可視光を受けたときに起こり得る。例えば、親和性プローブの光放出は、約３８０～７８０ｎｍの範囲の波長で起こり得る（正確な波長または波長範囲は、使用される特定の光切断可能な基によって決まり、例えば、３８０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、または７８０、またはそれらの間のいくつかの範囲であり得る）。

本明細書に記載されるように、磁性粒子は、親和性プローブ（本明細書ではエクソソームを捕捉するための分子または捕捉分子とも呼ばれる）をさらに含んでなる。本明細書で使用する場合、「親和性プローブ」または「捕捉分子」という用語は、任意の分子、細胞または粒状材料を指す。磁性粒子を含んでなる好適な親和性プローブは、ＵＳ２０１７００６５９７８およびＵＳ２０１７０００１１９７に記載されており、これらのそれぞれは、それらの全内容が本明細書の一部として援用される。親和性プローブは、目的の標的（エクソソームまたは他の細胞外小胞）に特異的に結合する結合要素を含んでなり得る。例えば、結合要素は、核酸オリゴマー、抗体、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン（例えば、炎症性サイトカイン）、タンパク質、ペプチド、プリオン、レクチン、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、分子および化学毒素または標的に対して高親和性および高特異性を有し、標的の設計された表面タンパク質に対して特異性を有する他の結合要素であり得る。１以上の結合要素（例えば、ペプチド）を、当技術分野で公知の方法によって、切断可能なリンカーを介して磁性粒子に取り付けることができる。一般に、結合要素は、標的、特に、エクソソームまたは他の細胞外小胞に関する親和性定数（Ｋａ）が約１０^５Ｍ^－１より大きい（例えば、１０^６Ｍ^－１、１０^７Ｍ^－１、１０^８Ｍ^－１、１０^９Ｍ^－１、１０^１０Ｍ^－１、１０^１１Ｍ^－１、および１０^１２Ｍ^－１以上）。

特定の実施形態では、親和性プローブは、抗原性ペプチドまたはその抗原性エピトープを含む。本明細書で使用する場合、「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合剤が結合可能であり、加えて、その抗原のエピトープと結合可能な抗体の産生を誘発するために動物に使用可能な分子または分子の一部を指す。抗原は、１以上のエピトープを有し得る。「抗原」という用語はまた、ＭＨＣ分子によって提示される場合に抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が結合可能な分子も指し得る。「抗原」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞エピトープを包含する。加えて、抗原は、免疫系が認識可能であり、かつ／またはＢリンパ球および／もしくはＴリンパ球の活性化につながる体液性免疫応答および／もしくは細胞性免疫応答を誘導可能である。抗原は、１以上のエピトープ（ＢエピトープおよびＴエピトープ）を有し得る。上記の特異的反応は、抗原が、他の抗原により誘発され得る多数の他の抗体またはＴＣＲとではなく、その対応する抗体またはＴＣＲと、一般には、選択性の高い方法で反応することが好ましいことを示すことを意味する。抗原は、本明細書で使用する場合、いくつかの個別の抗原の混合物であり得る。

上記のように、親和性プローブ（抗原）は、タンパク質またはペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質またはペプチドは、本質的に、免疫細胞を活性化し、および／または免疫応答を刺激し、希少細胞、例えば、循環腫瘍細胞、幹細胞および／または微生物に結合することができる任意のタンパク質であり得る。ほんの一例として、標的種が癌である場合、癌－親和性プローブを生成するために使用し得る例示的タンパク質またはペプチドまたは他の分子には、限定されるものではないが、ＭＡＧＥ－Ａ３、ｇｐ－１００、ＨＥＲ－２、ｐ５３、ＰＳＡ－１、またはＭＡＲＴ－１、ＥＧＦＲ、ＥＲＣＣ１、ＣＸＣＲ４、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＥｒｂＢ－２、Ｅ－カドヘリン、ムチン－１、サイトケラチン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＲＭ１、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＩＧＦ１、ｃＭＥＴ、ＥＭＬ４、または白血球関連受容体（ＬＡＲ）が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、親和性プローブは、抗体もしくはその一部、または抗体様分子であり得る。いくつかの実施形態では、捕捉分子は、希少細胞、例えば、循環腫瘍細胞、幹細胞および／または微生物バイオマーカーの検出に特異的な抗体もしくはその一部、または抗体様分子であり得る。いくつかの実施形態では、親和性プローブは、アプタマーであり得る。いくつかの実施形態では、親和性プローブは、ＤＮＡアプタマーまたはＲＮＡアプタマーであり得る。いくつかの実施形態では、親和性プローブは、細胞表面受容体リガンドであり得る。例示的細胞表面受容体リガンドには、例えば、細胞表面受容体結合ペプチド、細胞表面受容体結合糖ペプチド、細胞表面受容体結合タンパク質、細胞表面受容体結合糖タンパク質、細胞表面受容体結合有機化合物、および細胞表面受容体結合薬物が含まれる。追加の細胞表面受容体リガンドには、限定されるものではないが、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、抗体、および血管新生因子が含まれる。いくつかの実施形態では、希少細胞、例えば、循環腫瘍細胞、幹細胞および／または微生物に結合し得る当技術分野で認識されているいずれの細胞表面受容体リガンドも、本明細書に記載される磁性粒子の親和性プローブとして使用することができる。１以上の実施形態では、親和性プローブは、標的（例えば、エクソソーム）の表面に提示される免疫刺激性分子、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、インターロイキン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ－７８、ＧＲＯ、Ｉ－３０９、ＰＦ－４、ＩＰ－１０、ＬＤ－７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１βおよびそれらの組合せを標的とするように選択される。より好ましくは、親和性プローブが結合（およびその後標的を放出）すると、結合した親和性プローブを含んでなる得られた操作された標的は、放出される標的の免疫原性の可能性を増強する。例えば、親和性プローブによるＭＨＣクラスＩ表面タンパク質の結合は、（治療的使用において）免疫系の刺激および活性化のための抗原提示細胞による操作された標的の認識および取り込みを増強する複合体を作出する。ペプチドの長さは、好ましくは、１５アミノ酸残基以下、より好ましくは、１３残基以下、いっそうより好ましくは、１２残基あるいは１１残基以下である。

親和性プローブの例には、以下の表に記載したものが含まれる：

親和性プローブに好適な前述のペプチドもまた、操作された標的への表面搭載のための活性薬剤または部分の例示であることは理解されよう。

免疫磁性粒子（すなわち、親和性プローブに結合した磁性粒子）は、好ましくは、混合プロセスの前に形成される。例えば、親和性プローブ（例えば、切断可能なリンカーを介してビオチンに結合した抗原性ペプチド）およびストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子は、ビオチン化親和性プローブ結合がアビジンでコーティングされた粒子の表面全体を実質的に完全にコーティングするために効果的な期間、一緒に混合される。

よって、親和性プローブは、好ましくは、エクソソーム含有細胞培養物を添加する前に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子にある期間添加される。そのような実施形態では、親和性プローブは、最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子に、親和性プローブの添加量の少なくとも一部がストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子と結合するため（および好ましくは、粒子の表面全体をそこから延伸するプローブ結合でコーティングするための親和性プローブの完全結合のために）十分な期間添加され得る。

次に、エクソソーム含有細胞培養物中に存在するエクソソームを、同じ流体サンプルに添加し、ここで、エクソソームは親和性プローブに結合することができ、これらは、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子とのコンジュゲートをすでに形成している。

いくつかの実施形態では、免疫磁性粒子は、デバイスの混合チャネルに導入される前に別個に形成することができる。

サンプルに添加する必要のある免疫磁性粒子の量は、限定されるものではないが、処理されるサンプルの量、親和性プローブとのコンジュゲーションに利用可能な磁性粒子の価数、存在するエクソソームの予想される存在量、およびそれらの任意の組合せを含む複数の要因に依存し得る。デバイスに添加された免疫磁性粒子の量が多すぎると、マイクロ流体デバイス内で非特異的結合および／または目詰まりを引き起こす可能性がある。免疫磁性粒子の量が少なすぎると、捕捉効率が低下する可能性がある。当業者は、免疫磁性粒子および捕捉分子の濃度を決定することができる。

エクソソームは、任意の期間、例えば、数秒、数分、または数時間、免疫磁性粒子と混合することが可能である。いくつかの実施形態では、エクソソームは、少なくとも約１分、少なくとも約２分、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間以上、免疫磁性粒子と混合することができる。当業者は、限定されるものではないが、免疫磁性粒子のエクソソームとの親和性、濃度、混合温度および／または混合速度を含む複数の要因に基づいて、混合時間の最適時間を容易に決定することができる。しかしながら、１以上の実施形態では、エクソソームは、１時間以下で粒子と混合される。

エクソソームおよび免疫磁性粒子は、混合物が本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスの混合チャネルおよび分離チャネル内に保持されるために十分な滞留時間を提供する任意の流速でマイクロ流体デバイスのサンプル入口に導入することができる。いくつかの実施形態では、サンプルは、０．１μL/分～１μL/分の流速で導入することができる。サンプル流体は、当業者に公知の任意の方法によりマイクロ流体デバイスの入口に導入することができる。例えば、流れ発生装置を、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスの入口および出口の少なくとも一方に接続することができる。流れ発生装置の限定されない例には、蠕動ポンプ、シリンジポンプおよびマイクロ流体デバイスに流体を流すために一般的に使用することができる当技術分野で認められた任意のポンプが含まれ得る。

免疫原性の操作された標的を生成する方法は、免疫磁性粒子に結合したエクソソームを、収集チャンバーまたは操作チャンバー内に磁場を印加することにより捕捉することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、磁石は、磁場勾配を作出して、磁性標識されたエクソソームを収集チャンバー中の流体サンプルから分離させるのに十分な強い磁場強度を有する。固定された磁性標識エクソソームは、さらなる処理のためにマイクロ流体デバイスから取り除くことができる。好ましくは、捕捉されたエクソソームは、本明細書で論じられるように、さらに操作され、表面または内部に追加の活性部分が搭載される。続いて、この方法は、活性部分でコーティングされたまたは活性薬剤が内部に搭載された無傷のエクソソームを放出するために、免疫磁性粒子に結合したエクソソームを光分解的に切断することを含む。

放出された標的（エクソソーム）は、医薬組成物として提供することができる。医薬組成物は、免疫原性エクソソームおよび薬学上許容される賦形剤を含むことができる。活性部分は、対象の状態に対して特定の適応免疫応答を提供するように合わせることができ、またはより一般には、様々な感染または状態に対して自然免疫系を活性化するように選択することができることは理解されよう。

本明細書に記載される方法は、サンプルをリアルタイムで処理するために使用することができる。例えば、これらの方法は、エクソソームのリアルタイムの連続的な採取および抗原修飾と、その後の下流でのオンデマンド光放出を可能にする。

本明細書に記載されるように、これらの方法は、免疫原性エクソソーム複合体または他の免疫原性小胞様構造を生成するために使用することができる。特定の実施形態では、免疫原性エクソソーム複合体は、エクソソームの表面にコンジュゲートされた抗原ペプチドを含んでなり得る。免疫原性エクソソーム複合体を作製するための本明細書に記載される方法は、操作されていないエクソソームよりも有意に高いＴ細胞活性化率を有する複合体を提供する。いくつかの例では、免疫原性エクソソーム複合体は、天然のエクソソームと比較して、Ｔ細胞を少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％活性化することができる。本明細書に記載される免疫原性複合体は、活性化率が改善されたことにより、癌免疫療法で使用することができる。

よって、免疫原性複合体を使用して対象における疾患を治療する方法が開示される。この方法は、免疫原性複合体を含んでなる組成物を対象に投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、疾患は感染症であり得る。いくつかの例では、疾患は癌であり得る。この方法は、標的に搭載された化学療法薬を投与することをさらに含んでなり得る。

本発明の様々な実施形態のさらなる利点は、本明細書の開示および以下の実施例を検討することにより当業者には明らかとなるであろう。本明細書に記載される様々な実施形態は、本明細書において特に断りのない限り、必ずしも相互に排他的ではないことは理解されよう。例えば、一実施形態で説明または描写された特徴は、他の実施形態にも含まれ得るが、必ずしも含まれない。従って、本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態の様々な組合せおよび／または組込みを包含する

本明細書で使用する場合、「および／または」という句は、２つ以上の品目のリストに使用される場合、記載された品目のいずれか１つを単独でまたは記載された品目の２つ以上の任意の組合せを使用できることを意味する。例えば、組成物が成分Ａ、Ｂ、および／またはＣを含むまたは除外するものとして記述されている場合、組成物は、Ａ単独；Ｂ単独；Ｃ単独；ＡおよびＢの組合せ；ＡおよびＣの組合せ；ＢおよびＣの組合せ；またはＡ、Ｂ、およびＣの組合せを含むまたは除外することができる。

本明細書ではまた、本発明の様々な実施形態に関連する特定のパラメータを定量化するために数値範囲も使用する。数値範囲が提供される場合、そのような範囲は、範囲の下限値だけを列挙するクレーム制限も範囲の上限値だけを列挙するクレーム制限も文字通り支持するものとして解釈されるべきであることを理解されたい。例えば、約１０から約１００の開示された数値範囲は、「約１０より大きい」（上限なし）を列挙するクレームおよび「約１００未満」（下限なし）を列挙するクレームを文字通り支持する。

添付の特許請求の範囲のデバイス、システム、および方法は、特許請求の範囲のいくつかの態様の例示として意図されている、本明細書に記載される特定のデバイス、システム、および方法によって範囲は限定されない。機能的に同等であるいずれのデバイス、システム、および方法も特許請求の範囲に含まれることが意図されている。本明細書に示され、記載されたものに加えて、デバイス、システム、および方法の様々な変更は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。さらに、本明細書に開示される特定の代表的なデバイス、システム、および方法工程のみが具体的に記載されているが、デバイス、システム、および方法工程の他の組合せも、具体的に列挙されていない場合でも、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。よって、工程、要素、成分、または構成要素の組合せは、本明細書中に明示的に言及され得るが、工程、要素、成分、または構成要素の他の組合せは、明示的に述べられていなくても含まれる。

本明細書で使用する場合、「含んでなる(comprising)」という用語およびその変形形態は、「含む(including)」という用語およびその変形と同義的に使用され、オープンで非限定的な用語である。本明細書では、「含んでなる(comprising)」および「含む(including)」という用語を使用して様々な実施形態を説明してきたが、本発明のより具体的な実施形態を提供するために「含んでなる(comprising)」および「含む(including)」の代わりに「本質的にからなる(consisting essentially of)」および「からなる(consisting of)」という用語を使用することもでき、また開示される。特に記載のない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される形状、寸法などを表す総ての数字は、少なくとも、均等論の適用を特許請求の範囲に限定しようとするものではなく、有効数字の数および通常の四捨五入のアプローチに照らして解釈されるべきであると理解すべきである。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、開示される発明が属する技術分野の熟練者により共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で引用されている刊行物およびそれらが引用されている資料は、特に、本明細書の一部として援用される。

限定されない例示として、本開示の特定の実施形態の例を以下に示す。

以下、実施例により本発明の方法を説明するが、これらの実施例は例として示されるものであり、本発明の全範囲の限定と見なされるべきではないと理解されるべきである。

例１：癌免疫療法に対するエクソソームのマイクロ流体オンデマンド操作
概要：細胞外ナノ小胞（≦１μｍ）、特に、エクソソーム（３０～１５０ｎｍ）は細胞コミュニケーションを媒介する際の新たな送達システムであり、これは親細胞シグナル伝達タンパク質または腫瘍抗原を免疫細胞に提示することにより免疫応答をプライムすることに関して認められたものである。本例では、１つのワークフローで直接、表面操作されたエクソソームの採取、抗原修飾、および光放出を行うための合理化されたマイクロ流体細胞培養プラットフォームが提供される。ＰＤＭＳマイクロ流体細胞培養プラットフォームは、３Ｄ印刷型から複製される。エクソソーム表面の抗原性ペプチド（例えば、ｇｐ－１００、ＭＡＲＴ－１、ＭＥＧＡ－Ａ３）を操作することにより、効果的な抗原提示およびＴ細胞の活性化が達成され得る。このことは、分泌されたエクソソームをリアルタイムで、黒色腫腫瘍ペプチドで操作するためのヒト血液由来白血球のオンチップ培養を使用することにより実証された。２個体のＰｍｅｌ１トランスジェニックマウスの脾臓から精製されたｇｐ１００特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を試験した。操作されていないエクソソームに比べて有意に高いＴ細胞活性化レベル（～３０％）が操作されたエクソソームにより誘導されることが認められた。このマイクロ流体プラットフォームは、癌免疫療法を進展させ得る治療エクソソームの迅速かつリアルタイムの生産のための自動高集積型細胞培養デバイスとして役立つ。

方法および材料
３Ｄ印刷およびマイクロ流体デバイスの製作：土台、壁、および上部磁石ホルダーを含むＰＤＭＳチップ製作用の３つの型を準備した。この型はＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓ（登録商標）２０１７を使用することにより設計し、３Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓからのＰｒｏｊｅｃｔ １２００の３Ｄプリンターで印刷した。これら複数の部品は５０μｍの精密構造を有し、チャネル高は５０μｍであった。細胞培養チャンバーは直径１０００μｍ、チャンバー高５００μｍで設計した。総ての型にスポーツラインパラジウムで２０ｎｍ厚にコーティングした。３つ総ての部品を、ＰＤＭＳチップを用いて組み立てた。このＰＤＭＳを、細胞培養チャンバーにチャンバープラグのための開放端が残るように高さ５００μｍまで満たした。ＰＤＭＳは、リンカー試薬と１０：１比でキャストし、４０℃の温度で６時間インキュベートした。ＰＤＭＳは硬化した後、簡単に剥離することができた。チップの入口および出口は、０．７５ｍｍパンチャーを使用して穴をあけた。ピラニア処理ガラス及びＰＤＭＳを両方とも、少なくとも３０秒間、高電圧プラズマであった。次に、ＰＤＭＳチップを４０℃の温度のホットパッド上で５分間、後接着した。これらのチップを脱イオン水で洗浄し、オートクレーブで滅菌した（１２１℃で３０分）。

オンチップ細胞培養およびエクソソーム収集、操作、および放出：細胞カートリッジ（８ｍｍカバーガラス）をまず蒸留水で洗浄し、風乾した。次に、それらを１２１℃で３０分間オートクレーブにかけた。これらのカートリッジを２４ウェルプレートに設置し、５００μＬの０．１ｍｇ／ｍＬポリ－Ｄ－リシン臭化水素酸塩（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を各ウェルに加え、室温で５分インキュベートした。１ｍＬのＭＤ水を各ウェルに３分間加え、２回繰り返してセルカートリッジを洗浄した後、風乾のためにバイオフード内に置き、さらなる使用のために保存した。

４μＬのβ２－ミクログロブリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）ならびに１０μＬの各タンパク質（ｇｐ１００、ＭＡＧＥ－Ａ３、およびＭＡＲＴ－１）を１８６μＬの１×ＰＢＳと混合し、終容量２００μＬの修飾溶液とした。Ｂ－入口を遮断したままＡ－入口 から修飾溶液をポンプで送り、チップを経てＣ－入口から１０分、１μＬ／分および１０分、０．１μＬ／分の容量流速で洗浄バッファーを送り、さらに１０分間静止状態とした。洗浄工程はＡ－入口およびＣ－入口の両方から容量流速１μＬ／分で１５分進めた。底部側の磁石を取り外し、近紫外線を点灯して点けて主要チャンバーを１０分間処理した。Ａ－入口およびＣ－入口からのさらなる洗浄工程を、２０分間、１μＬ／分の容量流速で適用し、出口から放出されたエクソソームを約２０μＬ収集した。

超遠心分離およびエクソソームの染色：収集した２０μＬのエクソソームを超遠心管に加え、１，５００ｒｃｆ下で３０分の遠心分離（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｓｏｒｖａｌｌ（商標）ＭＴＸ）向けに希釈して終容量１ｍＬとした。上清を除去し、新しい超遠心管に移した。次に、この混合物を１００，０００の速度で１時間処理した。エクソソームをＰＫＨ６７ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｋｅｒ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって染色した。染色溶液は２μＬのＰＫＨ６７と１ｍＬの希釈剤Ｃで調製した。管に残留している溶液を廃棄し、１ｍＬの希釈剤Ｃを加えて穏やかなピペット操作で再懸濁させた。染色された溶液を超遠心管に移し、ピペットで混合し、室温で３．５分、反応させた。２ｍＬのＦＢＳ（エクソソーム除去）を加えて遊離色素をクエンチした。密度勾配遠心分離のために１．５ｍＬの０．９７１Ｍスクロース溶液を加えた。さらに６．５ｍＬの完全培地を加えて容量を１０ｍＬとした。超遠心機は１００，０００ｒｃｆ、１時間に設定した。上清を廃棄し、色素リングをリングの中心に達しないように注意深く洗浄した。さらに２ｍＬの１×ＰＢＳを加えてこのペレットを再懸濁させた。１００，０００ｒｃｆの速度の超遠心機をさらに１時間作動させた。上清を吸引除去し、さらに１００μＬの１×ＰＢＳを加えてこのペレットを再懸濁させた。総ての工程を無菌条件下で保持し、収集したエクソソームに１μＬのペニシリン－ストレプトマイシン（ＡＴＣＣ（登録商標）、カタログ番号３０－２３００、ロット番号６３５２５４０９）を加えて溶液に残留する細菌を阻害し、死滅させた。収集したエクソソームを１週間までは４℃で保存し、最大１か月－２０℃で保存した。

エクソソームの取り込み：ＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＴＩＢ－２０２（商標）を、ＡＴＣＣが配合したＲＰＭＩ－１６４０培地（ＡＴＣＣ（登録商標）、カタログ番号３０－２００１、ロット番号６４３３１６８３）および１０％エクソソーム除去ＦＢＳを完全培地として用いて培養した。単球細胞を８^＊１０^５／ｍＬの数で、交互培地変化法を用いて継代培養した。これらの細胞を、エクソソーム取り込み実験のために５^＊１０^５／ｍＬの密度で使用した。２００μＬの単球細胞を４８ウェルプレートの合計１１ウェルに移した。２０μＬの通常エクソソーム（ＮＥ）を５ウェルに加え、また、２０μＬの操作エクソソーム（ＥＥ）を別の５ウェルに加え、１ウェルは陰性対照として残した。時間間隔は０時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、および４時間とした。各時間区分で、１００μＬの細胞懸濁液培地を４００ＲＰＭの速度で４分の細胞遠心分離機から取り出した。スライドガラスを回収し、１００μＬのＦｉｘａｔｉｖｅ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）、カタログ番号Ｒ３７８１４、ロット番号１７Ｂ２８５３０１）を細胞スポットに加えた。この混合物を室温で１８分インキュベートし、次いで、溶液を除去した。１００μＬの１×ＰＢＳバッファーを細胞のスポットに加え、室温で３分定着させた。１×ＰＢＳバッファーを除去し、細胞スポットを蒸留水で穏やかに洗浄した。このスライドをスライド上に液滴が残らないように乾燥させ、５０μＬの５００ｎＭ ＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）、カタログ番号Ｄ１３０６、ロット番号１８４４２０２）を細胞スポットに適用し、光が当たらないように覆いをし、室温で４分インキュベートした。次に、ＤＡＰＩ溶液をすぐに除去した後、各回２分ずつ２回、十分な量の１×ＰＢＳバッファーを加えた。細胞スポットを蒸留水で洗浄し、スライド上に液滴が残らないように軽く乾燥させた。１滴のＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）、参照番号Ｐ１０１４４、ロット１８８７４５８）を適用し、そのスライドに２５×２５ ＃１．５のカバーガラスを気泡が入らないようにかけた。このスライドを共焦顕微鏡下でのイメージングの前に室温で２４時間保存した。

結果
エクソソームをオンインライン採取するための３Ｄ印刷成形マイクロ流体細胞培養デバイス：３Ｄ印刷型を用いてＰＤＭＳに基づくオンチップ細胞培養マイクロ流体デバイスを作製するために簡単で低コストのアプローチを開発した。培養チップは細胞をオンチップ増殖させ、下流で培養培地からエクソソームを収集するための、直径１ｍｍおよび高さ０．５ｍｍのオンチップ細胞培養チャンバーを含む。細胞培養チャンバーは、培地交換のためのＰＤＭＳ製のフィンガープッシュプラグを適用し、培地を下流の収集イオンチャネルに押し出すために上部が開いたままとする。細胞培養チャンバーの底部は、免疫磁性分離ビーズと混合するために（Ａ－入口）培養培地を導入するための、幅約２００μｍおよび高さ２００μｍの出口チャネル（Ｂ－入口）を備える。Ｃ－入口は、シリンジポンプにより駆動される、洗浄バッファーを導入するために使用される。図４は、蛍光色素溶液を用いた蛍光顕微鏡観察下での、Ａ－入口およびＢ－入口およびエクソソーム分離チャネル（蛇行チャネル）への出口を介する混合プロセスを説明する。図５（ｂ）は、蛇行チャネル内で混合している免疫磁性ビーズを記録したものである。ヒト血液由来白血球を、図５（ｃ）に示す形態を有する培養デバイスで培養した。わずかな赤血球がなおカップ形状として観察された。分泌されたエクソソームを分離し、捕捉し、チップの出口から光放出させ、図５（ｄ）に示されるＳＥＭイメージングにより特性評価を行った。

光切断可能なリンカーの両末端にビオチンおよびＮＨＳ化学の二官能基をコンジュゲートした。ビオチン基は光切断可能なリンカーをストレプトアビジン免疫磁性ビーズの表面に係留し、ＮＨＳ基は図、７Ａに示されるように、第一級アミンを介してＭＨＣ－Ｉペプチドをコンジュゲートする。ＭＨＣクラスＩ分子は、２本のポリペプチド鎖、αおよびβ２－ミクログロブリンからなるヘテロ二量体である。これら２本の鎖は、ｂ２ｍドメインとα３ドメインの相互作用を介して非共有結合的に連結される。他の２つのドメインα１とα２は、折り畳まれて、アミノ酸８～１０個のペプチド（ＭＨＣ－Ｉ結合ペプチド）に結合するための溝を形成する。ＭＨＣ－Ｉ／ペプチド結合複合体は、結果として免疫系からの即座の応答を誘発するために細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。ＭＨＣ－Ｉ陽性エクソソームがひと度、腫瘍標的抗原性（ＴＴＡ）ペプチドにより捕捉されれば、免疫磁性ビーズにより磁場のかかった捕捉チャンバー内に保持される。飽和ＴＴＡペプチドを含む抗原性ローディングバッファーがＣ－入口から導入されて完全に結合し、残りの利用可能なＭＨＣ－Ｉペプチド結合部位を占有する。この抗原表面操作プロセスは、捕捉されたＭＨＣ－Ｉ陽性エクソソームへのＴＴＡペプチドの搭載量を実質的に高め、Ｔ細胞を活性化する効力を増強する。

図７Ｂに示されるように、ＭＨＣ－Ｉペプチド修飾光放出免疫磁性ビーズと蛍光標識されたＭＣＨ－Ｉ陽性エクソソームの間の結合強度もさらに特徴付けられた。ＭＨＣ－Ｉ抗体は、腫瘍標的抗原ペプチドとＭＨＣ－Ｉ陽性エクソソームの間の結合強度を評価するための陽性対照として役立つ。ＭＨＣ－Ｉ／ペプチド複合体間のより強い結合強度のために、それはより高いＴ細胞抗腫瘍応答活性化能を有する。ｇｐ－１００は、より高いＭＨＣ－Ｉ／ペプチド複合体形成能を有し、その結合強度は、ＭＨＣ－Ｉ抗体よりもはるかに強い（９５％と８４．８％）ことが示された。

オンデマンド光放出の性能は図８Ａ～８Ｅに特徴付けた。陽性対照と陰性対照の間の比較では、倒立蛍光顕微鏡下でのビーズ凝集塊からの蛍光強度を測定することにより、蛍光標識されたエクソソームが捕捉され、放出された。ＳＥＭイメージングアプローチは、光放出プロセスを確認するために使用した。光切断の前後でビーズ表面のＳＥＭイメージングを比較することにより、ビーズ表面に存在する同定可能なエクソソーム粒子は無く、このことは良好な光放出性能を示す。ＵＶ照射時間も同様に、８分のＵＶ照射で９８％の光切断率に達すると特徴付けられた。操作されたエクソソームと操作されていないエクソソームのサイズ分布を評価したところ、５０ｎｍ～２００ｎｍの適当なサイズ範囲のエクソソームを示し、操作されたエクソソームが良好な完全性を維持していることが確認される。

エクソソーム分子含量に対するＵＶ照射の副作用を調査したところ、１０分の紫外線処理下でエクソソームタンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡに関して検出可能な変化を示さない（図１３）。

マイクロ流体細胞培養デバイスからオンデマンド光放出により放出された、操作されたエクソソームの効力および完全性を評価するために、チップ出口からのエクソソームを採取し、緑色蛍光で標識した。１時間間隔で細胞取り込みをモニタリングするために、ｇｐ－１００操作エクソソームおよび操作されていないエクソソームを樹状単球とともにインキュベートした。次に、これらの細胞を固定し、核をＤＡＰＩで染色した。図９Ａに示される緑色のドットは標識されたエクソソームであり、細胞核の周囲に多く分布している。細胞取り込みは１時間以内に始まり、取り込み速度は操作されていないエクソソームよりもはるかに速い。４時間後、操作されたエクソソームおよび操作されていないエクソソームは両方ともリソソーム経路によって取り除かれたことが認められた。この所見は、ｇｐ－１００操作エクソソームは樹状単球の取り込みに関してはるかに有効であることを示した。サイトカインＩＦＮ－γの発現は、ＥＬＩＳＡを用い、ｇｐ－１００操作エクソソームを樹状単球とともにインキュベートすることによりモニタリングした。操作されていないエクソソームのインキュベーションに比べて、ＩＦＮ－γ発現レベルは、連続的なモニタリングの後４８時間はるかに高く、ほぼ２倍の増加であった。図９Ｂのグレーの破線は、刺激剤としてＰＷＭタンパク質を用いる陽性対照を示す。刺激時の樹状細胞の形態を図１４に示した。刺激無しの陰性対照に比べて、ＰＷＭタンパク質およびｇｐ－１００操作エクソソームは両方とも、球形の浮遊樹状細胞への変化に著しい影響を及ぼすした。ｇｐ－１００操作エクソソームは、サイトカインＩＦＮ－γ生産に対して、対照のＰＷＭタンパク質刺激よりも高い刺激率を示した。

さらに、増殖および細胞傷害下のＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化に関するｇｐ－１００操作エクソソームの効力を検討した。ｇｐ－１００操作エクソソームは、活性化樹状細胞の存在下でトランスジェニックＴ細胞を活性化する能力を有することが認められた。ｇｐ１００特異的ＣＤ８ Ｔ細胞は、２個体のＰｍｅｌ１トランスジェニックマウスの脾臓から磁気細胞選別により精製し、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ色素で標識した。精製されたＴ細胞を単独培養し（Ｔ細胞のみ）、およびナイーブＪＡＷＳ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来未熟樹状細胞株）と３：１比で混合した。Ｔ細胞＋ＪＡＷＳ細胞、またはＪＡＷＳ細胞を２００ｎｇ／ｍＬで４８時間活性化した（Ｔ細胞＋活性化ＪＡＷＳ細胞）。ｇｐ１００ペプチドを保持する操作されたエクソソームをＴ細胞培養物に、エクソソーム：樹状細胞比を漸増させて（２５、５０および１００）加えた。図１０Ａ。細胞とエクソソームを５日間、共培養した後、ＣＤ８ Ｔ細胞を、増殖の指標としてのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ希釈に関してフローサイトメトリーにより分析した。陰性対照としてのＴ細胞のみの状態では、ｇｐ－１００エクソソーム活性化ＪＡＷＳとともに培養したＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖速度は３０％より高い増加を示したことが認められ、このことは、ｇｐ－１００操作エクソソームがＴ細胞の細胞傷害性を活性化する強い効力を有することを示した。図１０Ｂ。開発されたエクソソームのマイクロ流体オンデマンド抗原表面操作および光放出は、癌免疫療法を進展させるための効果的なエクソソーム系ワクチンおよび送達システムの開発に有力なツールとなり得る。

免疫原性また、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）についても検討した。Ｔ細胞および活性化ＪＡＷＳ細胞を、漸増濃度のＢＲＳＶ抗菌性ペプチド操作エクソソーム（ペプチド４： Ｍ１８７－１９５ペプチドＮＡＩＴＮＡＫＩＩ、配列番号４で操作されたエクソソーム）とともにインキュベートした。ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の免疫刺激は、その用量の操作されたエクソソームに直線的に応答し、これは高用量ペプチドワクチンを用いるよりも効果的である。ＢＲＳＶ操作エクソソームは、活性化樹状細胞の存在下でＢＲＳＶ Ｍ特異的Ｔ細胞を活性化する能力を有する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＱｕｉｌＡをアジュバントとする２０ｎＭ ＢＲＳＶ Ｍ１８７－１９６を２回皮下免疫した。最後の免疫誘導の少なくとも４週間後に、動物を安楽死させ、脾臓を採取した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ１１ｃ＋脾臓樹状細胞を磁気細胞分離により分離した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ色素で標識した。精製されたＴ細胞を単独培養するか（Ｔ細胞のみ）、またはＣＤ１１ｃ＋脾臓ＤＣと３：１比で混合した（Ｔ細胞＋ＤＣ）。ＤＣ細胞は無刺激のままとするか、またはＤＣの活性化を誘導するために２００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳで処理した。上記のマイクロ流体プラットフォームを用いてＢＲＳＶペプチドを搭載した操作エクソソームをＴ細胞培養物に、エクソソーム：樹状細胞の比を増加させて（２５、５０および１００）加えた。陰性対照ウェルにはエクソソームを施さなかった。陽性対照ウェルは、１ｎＭまたは５ｎＭの純粋Ｍ１８７－１９６ペプチドで処理した。細胞とエクソソームを５日間、共培養した後、ＣＤ８ Ｔ細胞を、増殖の指標としてのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ希釈に関してフローサイトメトリーにより分析した。結果を図１１に示す。総ての結果が、捕捉、抗原搭載、および光放出のための本開示の方法は、抗菌性ペプチド操作エクソソームを効果的に産生することができ、これが高い効力でのＴ細胞の活性化の成功につながることを裏付ける。

例２：操作されたエクソソームのｉｎ ｖｉｖｏ投与
上記の免疫原性試験では、開示されている特許方法を用いて操作されたエクソソームを注射したトランスジェニックマウスを使用した。エクソソームを、上記の合理化された／連続的なマイクロ流体プロセスを用いて表面にｇｐ－１００またはＢＲＳＶ Ｍ１８７－１９６ペプチドで操作し、尾からのｉｎ ｖｉｖｏ腹腔内注射向けにＰＢＳバッファーに懸濁させた。本発明者らは、注射部位の反応も注射を受けたマウスからの有害応答（注射部位の腫脹、刺激作用など）は認めなかった。マウスは、注射後最初の７２時間は１日２回観察し、有害反応は認められず、操作されたエクソソームおよび関連組成物の全般的なｉｎ ｖｉｖｏ安全性を示す。

Claims (50)

1. マイクロ流体デバイスにおいて生物学的標的を操作するための方法であって、
   前記マイクロ流体デバイスのマイクロ流体混合チャネル内で、前記生物学的標的を含むと疑われる生物学的サンプルを流体中の複数の免疫磁性粒子と混合して混合物を形成すること；
   前記生物学的標的が存在する場合、前記生物学的標的が前記混合物中の前記免疫磁性粒子と反応および結合して粒子／標的複合体を形成することを可能にすること；
   前記粒子／標的複合体を、マイクロ流体デバイスのチャンバー内に磁場を印加することにより前記チャンバー内に固定すること；
   前記粒子／標的複合体中の前記標的を、前記標的を複数の活性部分または活性薬剤と接触させることにより操作すること（ここで、前記標的の表面は前記活性部分で表面修飾されてまたは前記複数の活性薬剤は前記標的内に搭載されて、操作された標的を生成する）；および
   前記操作された標的を前記粒子／標的複合体から光分解的に放出すること（ここで、前記粒子は前記チャンバー内に固定されたままであり、かつ、前記操作された標的は前記マイクロ流体デバイスの出口に向かって下流で洗浄される）、
   を含んでなる、方法。
2. 前記生物学的標的が、細胞、細胞外小胞、および小胞様細胞画分からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞外小胞がエクソソームまたはミクロソームである、請求項２に記載の方法。
4. 前記マイクロ流体デバイスの細胞培養チャンバーに細胞を導入すること；
   前記細胞を前記エクソソームの放出を可能にする条件下で培養すること；および
   前記エクソソームを前記複数の免疫磁性粒子と混合するために前記混合チャネルに導入すること
   をさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。
5. 前記細胞が、樹状細胞、幹細胞、免疫細胞、巨核球前駆細胞、およびマクロファージからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記活性部分が生物学的標的上の表面タンパク質を認識し、それらと特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
7. 前記標的が前記活性部分で実質的にコーティングされるように、前記操作工程後に前記表面タンパク質の実質的に総てが活性部分と結合する、請求項６に記載の方法。
8. 前記免疫磁性粒子が５００ｎｍ以上の直径を有する、請求項１に記載の方法。
9. 前記粒子／標的複合体が、単一の中心粒子に結合した複数の前記生物学的標的を含んでなるように、前記免疫磁性粒子のそれぞれが前記サンプル中の複数の前記生物学的標的と反応する、請求項１に記載の方法。
10. 同じタイプの生物学的標的が各粒子に結合するように、各粒子が単一タイプの生物学的標的に一度に結合する、請求項９に記載の方法。
11. 前記光分解的に放出することが、前記粒子／標的複合体を前記マクロ流体チャンバー内で露光することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
12. 前記標的が前記露光後約１５分以内に放出される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記マイクロ流体デバイスにおいて連続的なプロセスで、好ましくは前記混合から前記出口での前記操作された標的の収集まで９０分以内に実施される、請求項１に記載の方法。
14. 前記活性部分が抗原性ペプチドである、請求項１に記載の方法。
15. 前記活性薬剤が薬物、ヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９システム、小分子化合物、化学療法薬などである、請求項１に記載の方法。
16. 前記マイクロ流体デバイス平面基板が、入口とチャンバーとの間に延伸するマイクロ流体チャネルを介して前記チャンバーと流体連通する入口を含んでなり、前記チャンバーは前記入口の下流にあり、出口と流体連通し、前記出口は前記チャンバーの下流にある、請求項１に記載の方法。
17. 前記マイクロ流体デバイスが、前記サンプル、前記免疫磁性粒子、および洗浄バッファーを前記デバイスに導入するための複数の入口を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
18. 前記マイクロ流体チャネルが、前記免疫磁性粒子と前記サンプルの混合を促進するための蛇行流路を有する、請求項１６に記載の方法。
19. 前記デバイスが、前記マイクロ流体チャネルと流体連通する細胞培養チャンバーをさらに含んでなる、請求項１６に記載の方法。
20. 前記免疫磁性粒子はそれぞれ、前記生物学的標的を捕捉するための、その粒子表面から延伸する複数の光切断可能なリンカーを含んでなり、それぞれはその末端にそれぞれの親和性プローブを有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記親和性プローブが抗原性ペプチドまたはその抗原性エピトープを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
22. 前記親和性プローブが、ＭＡＧＥ－Ａ３、ｇｐ－１００、ＨＥＲ－２、ｐ５３、ＰＳＡ－１、およびＭＡＲＴ－１から選択される抗原性ペプチドを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記親和性プローブと前記生物学的標的が結合して免疫刺激性複合体を形成し、これが前記粒子から放出されると免疫細胞の抗原提示および活性化ならびに免疫応答のプライミングを増強する、請求項２０に記載の方法。
24. 前記親和性プローブが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、インターロイキン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ－７８、ＧＲＯ、Ｉ－３０９、ＰＦ－４、ＩＰ－１０、ＬＤ－７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、およびそれらの組合せからなる群から選択される免疫刺激性分子に対する特異性について選択される、請求項２０に記載の方法。
25. 前記光切断可能なリンカーが、ビオチン部分を介して前記粒子表面とコンジュゲートしている、請求項２０に記載の方法。
26. 前記親和性プローブが、前記活性部分と同じクラスまたは同じタイプの化合物に由来する、請求項２０に記載の方法。
27. 請求項１に記載の方法によって調製された操作された生物学的標的を含んでなる組成物。
28. 前記操作された生物学的標的がエクソソームであり、前記エクソソームが、表面に結合した複数の活性部分を含んでなる、請求項２７に記載の組成物。
29. 前記活性部分が抗原性ペプチドまたはその抗原性エピトープである、請求項２８に記載の組成物。
30. 前記抗原性ペプチドが、ＭＡＧＥ－Ａ３、ｇｐ－１００、ＨＥＲ－２、ｐ５３、ＰＳＡ－１、およびＭＡＲＴ－１から選択される、請求項２９に記載の組成物。
31. 前記抗原性ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、インターロイキン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ－７８、ＧＲＯ、Ｉ－３０９、ＰＦ－４、ＩＰ－１０、ＬＤ－７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、およびそれらの組合せからなる群から選択される免疫刺激性分子に対する特異性について選択される、請求項２９に記載の組成物。
32. 前記抗原性ペプチドと前記免疫刺激性分子が結合して、前記エクソソームの表面に免疫刺激性複合体を形成し、これが前記エクソソームの免疫細胞の抗原提示および活性化ならびに免疫応答のプライミングを増強する、請求項３１に記載の組成物。
33. 前記操作された生物学的標的がエクソソームであり、前記エクソソームがその中に搭載された複数の活性薬剤を含んでなる、請求項２７に記載の組成物。
34. 前記活性薬剤が、ヌクレオチド、薬物、化学療法薬、小分子化合物、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９システムなどからなる群から選択される、請求項３３に記載の組成物。
35. 免疫細胞を活性化しおよび／または免疫応答をプライムする方法であって、免疫細胞を請求項２７～３４のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含んでなる、方法。
36. 前記接触が、前記組成物をそれを必要とする対象に投与することを含んでなる、請求項３５に記載の方法。
37. 前記方法が、ある状態に対して前記対象の自然免疫系または適応免疫系を活性化するのに有効である、請求項３６に記載の方法。
38. 前記状態が感染症である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記状態が癌である、請求項３７に記載の方法。
40. 化学療法薬を投与することをさらに含んでなる、請求項３９に記載の方法。
41. 生物学的標的の操作において使用するためのマイクロ流体デバイスであって、
    生物学的材料を三次元構成に維持するために寸法された細胞培養チャンバー；
    混合チャネルに沿って配置された複数のサンプル入口チャネルを含んでなる、前記細胞培養チャンバーに流体接続された混合チャネルであって（ここで、前記細胞培養チャンバーの幅と前記混合チャネルの最大断面寸法の比は少なくとも５：１である）；
    前記混合チャネルから分離出口までの流体の流れの経路を規定する分離チャネル；および
    収集チャンバー内で磁場を生成するための、前記収集チャンバーに作動可能に連結された磁石を含んでなる、前記分離出口に流体接続された収集チャンバー；
    とを含んでなる、デバイス。
42. 生物学的標的の操作において使用するためのマイクロ流体デバイスであって、
    細胞培養入口および細胞培養出口を含んでなる細胞培養チャンバー；
    流体入口チャネルおよび粒子入口チャネル（ここで、前記細胞培養出口、前記流体入口チャネル、および前記粒子入口チャネルは混合交差点で流体収束する）；
    前記混合交差点から混合出口までの流体の流れの経路を規定する、前記混合交差点に流体接続された混合チャネル（ここで、前記細胞培養チャンバーの幅と前記混合チャネルの最大断面寸法の比は少なくとも５：１である）；および
    収集チャンバー内で磁場を生成するための、前記収集チャンバーに作動可能に連結された磁石を含んでなる、前記混合出口に流体接続された収集チャンバー；
    とを含んでなる、デバイス。
43. 前記混合チャネルが、前記混合交差点と前記混合出口の間に配置された分離チャネルを含んでなる、請求項４２に記載のマイクロ流体デバイス。
44. 前記分離チャネルが、蛇行形状を有する、請求項４１～４３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
45. 前記分離チャネルが、幅が減少するチャネル狭窄領域を含んでなる、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
46. 前記分離チャネルが、局所的な渦流プロフィールを作出するための複数のチャネル狭窄領域、好ましくは少なくとも５つのチャネル狭窄領域を含んでなる、請求項４５に記載のマイクロ流体デバイス。
47. 前記細胞培養チャンバー幅と前記混合チャネルの最大断面寸法の比が５：１～５００：１、５：１～２０：１、または６：１～１２：１である、請求項４１～４６のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
48. 前記細胞培養チャンバーが、約２００マイクロリットル以上、好ましくは約２００マイクロリットル～約１ミリリットルの容積を有する、請求項４１～４７のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
49. 前記混合チャネルが、高さおよび幅を有し、前記高さおよび前記幅のそれぞれが少なくとも５０ミクロン、好ましくは５０～５００ミクロンである、請求項４１～４８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
50. マイクロ流体デバイスに作動可能に連結されたポンプをさらに含んでなる、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。

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