JP2022500061A - コリネバクテリウム宿主細胞における操作した分解タグ変異体による制御可能なタンパク質分解 - Google Patents
コリネバクテリウム宿主細胞における操作した分解タグ変異体による制御可能なタンパク質分解 Download PDFInfo
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Abstract
Description
この出願は、2018年9月19日出願の米国仮特許出願第62/733,521号の優先権を主張するものであり、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、微生物の遺伝子及び組換えDNA技術の分野に関する。本教示は、細菌細胞、具体的にはコリネバクテリウム種においてタンパク質分解を制御可能に誘導及び調節するのに有用なポリヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、ベクター、微生物、及び方法を提供する。
改変されていない細胞において、細胞生活環の異なる点で存在するタンパク質の量は、タンパク質合成のみならず、タンパク質分解の関数である。これを念頭に置いて、細胞内のタンパク質の半減期は数分から数日まで広く変化すること、及びタンパク質分解の差動的な速度は細胞調節装置の重要な態様であることは驚くことではない。例えば、転写因子などの調節分子は急速に分解されて、細胞がその環境において状態を変化させるために迅速に応答するのを可能にする。他のタンパク質は、特異的な代謝シグナルに応答して急速に分解され、細胞内酵素活性の調節のための別の機構を提供する。加えて、欠陥又は損傷したタンパク質が認識され細胞内で迅速に分解され、それによりタンパク質合成中に生じる誤りの結果を排除又は制限する。
黄色ブドウ球菌のTrfA。黄色ブドウ球菌のTrfAは、複数の役割、特に、タンパク質分解及び遺伝的能力に関与するアダプタータンパク質をコードする枯草菌のタンパク質分解アダプタータンパク質mecAに関連するアダプター遺伝子である。その欠失は、メチシリン感受性若しくはメチシリン耐性(MRSA)の臨床又は実験室の単離物のグリコペプチド中間体黄色ブドウ球菌(GISA)誘導体においてオキサシリン及びグリコペプチド抗生物質に対する耐性のほぼ完全な喪失をもたらす。重要なことに、TrfAアダプタータンパク質は、ClpCPと相互作用して、黄色ブドウ球菌におけるタンパク質分解を制御するのを助けることが見出されている。
本発明のある重要な特徴は、ssrA及びtrfAタンパク質分解タグの使用を含む。これらのタグの両方は、2つの配列モチーフを含む。第1は、配列の第1の部分に含まれる、SsrA及びTrfAアダプタータンパク質の認識モチーフである。第2は、ClpXPなどの細胞プロテアーゼによって認識される分解モチーフを含むC末端の3個のアミノ酸である。3個の末端残基の正確なアミノ酸配列は、標的タンパク質の分解速度に影響する。以前に、DAS+4タグは、タンパク質分解速度のバランスに必須であることが証明された。本発明者らは、DAS+4タグよりも優れた活性を有する、QPS、KPS及びDQAタグを含む新規タグを特定した。
アダプタータンパク質SspB及びTrfAを、既知のISエレメントの代替物としてC.グルタミカムの染色体に組込んだ。これらの部位を、天然のコリネバクテリウム代謝経路の破壊を最小にするように特異的に選択した。アダプターの遺伝子をいくつかの組込み部位の1つに配置し、レポータータンパク質に対するそれらの活性について試験した。使用した部位は、ISCg2c、ISCg2e、及びISCg6cであった。最終的に、部位ISCg6cを、最良の独立した調節を有する部位として選択した。2つのプロモーターをsspBアダプター、具体的には、C.グルタミカムのリン酸誘導性プロモーター及びC.グルタミカム最適化した大腸菌のTacプロモーターについて試験した。Tacプロモーターはまた、sspBアダプターオープンリーディングフレームの反対方向に配向されたlacIリプレッサーのC.グルタミカム最適化バージョンを含む。trfAアダプターを組込み、Tacプロモーターの制御下で、ISCg6c染色体遺伝子座で試験した。ゲノム組込みは、隣接する相同性領域に基づく単一の交差ノックインを用いて先に記載したように行った。所望のノックインクローンをカナマイシン上での増殖を介して選択した。第2の単一の交差事象を、スクロース選択を用いて強制し、得られたコロニーを所望の変異体の存在についてスクリーニングした。最終的なC.グルタミカム株は、いかなる選択マーカーも含まなかった。
より良好に機能する分解タグを発見するために、本発明者らは、ssrA−DAS+4タグに取って代わる潜在的なc末端アミノ酸のライブラリーをスクリーニングした。ライブラリーは、以下の表2からの、カラム1+カラム2+カラム3中のアミノ酸の可能な組み合わせの各々を含む。以下の実施例により示されるように、本発明は、コリネバクテリウムにおけるタグ付きタンパク質の初期レベルと誘導分解速度の両方の独立した個別制御を可能にする分解タグバリアントを提供する。
方法及び材料:
以下の実施例では、以下の株を使用した。
(1)全ての実験について、C.グルタミカムATCC13032を、元となるコリネバクテリウム株として使用した。
(2)C.グルタミカム−lacI−sspBを、コドン最適化大腸菌lacI(lacリプレッサー)により提供される抑制を有する大腸菌pTacプロモーターの制御下で染色体組込みされたコドン最適化大腸菌sspB遺伝子配列を用いて組換え操作した。
(3)C.グルタミカム−lacI−trfAを、コドン最適化大腸菌lacIにより提供される抑制を有する大腸菌pTacプロモーターの制御下で染色体組込みされたコドン最適化大腸菌trfA遺伝子配列を用いて組換え操作した。
(4)大腸菌10Gを、標準的なクローニング株として使用した。
CgDVK−mCherryは、pSODプロモーター(強力なプロモーター)又はMin5プロモーター(弱いプロモーター)のいずれかの制御下でレポーター遺伝子(mCherry)を含むコリネバクテリウムシャトルベクターを示す。修飾された分解タグを含む全てのプラスミドを、このプラスミド骨格上のmCherryレポーター遺伝子のc末端を修飾することにより構築した。
C.グルタミカムにおけるSspB機能性の確認
標的タンパク質を選択的に分解する能力は、ssrA配列を結合し、かつ細胞Clpプロテアーゼ複合体を介して標的タンパク質の分解を開始するのを助けるSspBアダプタータンパク質の能力に依存する。SspB/ssrAシステムを大腸菌から単離した場合、まず、異種宿主におけるその機能性を決定することが不可欠であった。
いくつかの宿主において広範に研究されてきたSspB/ssrAシステムとは異なり、TrfAアダプタータンパク質[配列番号4]の活性は、天然宿主の黄色ブドウ球菌においてのみ実証されている。さらに、改変されたClp認識配列を用いる場合のTrfA促進タンパク質分解の効率については、ほとんど研究されていない。いずれかの用途に使用する前に、任意の宿主におけるTrfA活性の広範な検証が必要であった。TrfA機能を、最小限必要な活性のためのガイドとベースラインの両方としてSspB/ssrAシステムを使用して評価した。図4及び図5は、TrfAシステムが、野生型プロテアーゼ認識タグTrfA[配列番号22]を使用する場合に、C.グルタミカムにおけるSspBシステムと比較して同様の様式で挙動することを実証する。2つのシステムは同様に機能するが、以下にさらに示すように、タンパク質分解速度論の効率に関して別々の特性を有するので、TrfAシステム及びSspBシステムは、2つの直交システムとして同じ宿主に組込むことができ、これは次に、少なくとも2つの異なる必須遺伝子の制御を必要とする、生合成生成法におけるタンパク質分解を微調整するための機構を提供する。
タンパク質のC末端アミノ酸組成は、上記タンパク質が細胞プロテアーゼにより認識及び分解されるか否かに大きな役割を果たす。天然ssrA及びtrfAタンパク質分解タグは、それぞれ、標的タンパク質に付加された末端アミノ酸としてアミノ酸LAA及びVAAを特徴とする。これらの配列の両方は、アダプターが存在しなくても、標的タンパク質の迅速な分解をもたらす(図2〜3のmCherry−LAA及び図4〜5のmCherry−LAA参照)。この研究で試験したDAS及びDAS+4配列などの、いくつかのバリアント配列が以前に探索された。しかし、本明細書で実証されるように、これらのタグのいずれかの付加は、アダプタータンパク質の誘導の前でさえ、細胞内の標的タンパク質の量を大幅に低下させるので、これらのタグのいずれも、誘導タンパク質分解の適用に最適ではない。標的タンパク質が細胞成長に必須なタンパク質である場合、存在するベースラインと比較して50%超の低下は、細胞の健全さに対し非常に有害であり得る。
上記のデータがSspB及びTrfAシステムはそれぞれ別々のシグナル配列を認識し、両方ともC.グルタミカム宿主細胞において活性を保持することをまとめて示すことを考慮して、本発明者らは、2つのアダプタータンパク質間にクロストークがあるか否かの調査に進んだ。2つのTrfA及びSspBシステムが、直交タグ化タンパク質の分解を引き起こすことなく、個々に機能できるならば、それは複数の細胞機能にわたり正確な時間制御を可能にする。例えば、第1のタグを使用して所望のバイオマスに到達したら、細胞の適合性において役割を果たす第1のタンパク質の分解を誘発することが可能である。その後、十分な量の中間体に到達したら、後の時点で第2の標的タンパク質の分解を誘発できるであろう。この時間的制御は、所望の生成物を生合成するのに最適な生成条件をうまく微調整するために重要である。この種の制御は、2つのタグが真に直交し、かつ他のタグの認識配列と交差反応しない場合にのみ可能である。これを、TrfAアダプタータンパク質を含む株にssrAタグ付きレポーターを導入し、SspBアダプタータンパク質を含む株にTrfAタグ付きレポーターを導入することにより試験した。WT trfA及びssrA配列に加えて、いくつかの操作された配列も試験した。表5に提示されるデータは、2つのタンパク質分解システム間の重要でないクロストークを示し、その2つを並行して使用できることを示している。
本開示は、食品、医薬、及び薬理学的産業における利用可能性を有する。本開示は一般に、改変された微生物株におけるタンパク質分解の計画的制御のための方法に関する。そのような改変は、関心のある化合物の生成の収率を向上させ、改変された細胞宿主への長期間の損傷を制限しながら、細胞環境全てにおいて最適化された化合物の持続期間を延長させる。
配列番号1−WT SspBのDNA配列:
配列番号7 WT ssrAタグのDNA配列:
GCCGCTAATGACGAAAACTATGCGCTTGCAGCA
配列番号8 WT ssrAタグのアミノ酸配列:
AANDENYALAA
配列番号9 ssrA−DASバリアントタグのDNA配列:
GCGGCGAATGATGAGAATTACGCTGACGCTTCG
配列番号10 ssrA−DASバリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYADAS
配列番号11 ssrA−DAS+4バリアントタグのDNA配列:
GCGGCGAATGATGAGAATTACAGCGAGAACTACGCTGACGCTTCG
配列番号12 ssrA−DAS+4バリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYSENYADAS
配列番号13 ssrA−DQP+4バリアントタグのDNA配列:
GCGGCGAATGATGAGAATTACAGCGAGAACTACGCTGATCAACCG
配列番号14 ssrA−DQP+4バリアントタグのアミノ酸配列:
AAN DENYSENYADQP
配列番号15 mCherry-SsrA−KPS+4DNA:
GCGGCGAATGATGAGAATTACAGCGAGAACTACGCTAAGCCATCG
配列番号16 ssrA−KPS+4バリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYSENYAKPS
配列番号17 ssrA−DGA+4バリアントタグのDNA配列:
GCGGCGAATGATGAGAATTACAGCGAGAACTACGCTGATGGCGCG
配列番号18 ssrA−DGA+4バリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYSENYADGA
配列番号19 ssrA−DGS+4バリアントタグのDNA配列:
GCGGCGAATGATGAGAATTACAGCGAGAACTACGCTGATGGCTCG
配列番号20 ssrA−DGS+4バリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYSENYADGS
配列番号21 WT TrfAタグのDNA配列:
GGCAAATCAAACAATAATTTCGCAGTAGCTGCC
配列番号22 WT trfAタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFAVAA
配列番号23 trfA−DASバリアントタグのDNA配列:
GGCAAATCAAACAATAATTTCGCAGACGCTTCG
配列番号24 trfA−DASバリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFADAS
配列番号25 trfA−DAS+4バリアントタグのDNA配列:
GGCAAATCAAACAATAATTTCAGCAACAATTTCGCAGACGCTTCG
配列番号26 trfA−DAS+4バリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFSNNFADAS
配列番号27 trfA−DQP+4バリアントタグのDNA配列:
GGCAAATCAAACAATAATTTCAGCAACAATTTCGCAGATCAACCG
配列番号28 trfA−DQP+4バリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFSNNFADQP
配列番号29 trfA−KPS+4バリアントタグのDNA配列:
GGCAAATCAAACAATAATTTCAGCAACAATTTCGCAAAGCCATCG
配列番号30 trfA−KPS+4バリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFSNNFAKPS
配列番号31 trfA−DGA+4バリアントタグのDNA配列:
GGCAAATCAAACAATAATTTCAGCAACAATTTCGCAGATGGCGCG
配列番号32 trfA−DGA+4バリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFSNNFADGA
配列番号33 trfA−DGS+4バリアントタグのDNA配列:
GGCAAATCAAACAATAATTTCAGCAACAATTTCGCAGATGGCTCG
配列番号34 trfA−DGS+4バリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFSNNFADGS
配列番号35 ssrA−DQA+4バリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYSENYADQA
配列番号36 ssrA−QPS+4バリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYSENYAQPS
配列番号37 ssrA−HPP+4バリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYSENYAHPP
配列番号38 ssrA−DQS+4バリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYSENYADQS
配列番号39 ssrA−KNP+4バリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYSENYAKNP
配列番号40 ssrA−MKP+4バリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYSENYAMKP
配列番号41 ssrA−DQAバリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYADQA
配列番号42 ssrA−QPSバリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYAQPS
配列番号43 ssrA−HPPバリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYAHPP
配列番号44 ssrA−DQSバリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYADQS
配列番号45 ssrA−KNPバリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYAKNP
配列番号46 ssrA−MKPバリアントタグのアミノ酸配列:
AANDENYAMKP
配列番号47 trfA−DQA+4バリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFSNNFADQA
配列番号48 trfA−QPS+4バリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFSNNFAQPS
配列番号49 trfA−HPP+4バリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFSNNFAHPP
配列番号50 trfA−DQS+4バリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFSNNFADQS
配列番号51 trfA−KNP+4バリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFSNNFAKNP
配列番号52 trfA−MKP+4バリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFSNNFAMKP
配列番号53 trfA−DQAバリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFADQA
配列番号54 trfA−QPSバリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFAQPS
配列番号55 trfA−HPPバリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFAHPP
配列番号56 trfA−DQSバリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFADQS
配列番号57 trfA−KNPバリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFAKNP
配列番号58 trfA−MKPバリアントタグのアミノ酸配列:
GKSNNNFAMKP
Claims (22)
- 第1の分解タグを発現するように組換え操作されたコリネバクテリウム種宿主細胞であって、前記第1の分解タグが、アダプター結合領域、任意のスペーサー領域、及びプロテアーゼ認識領域を含み、前記第1の分解タグの前記アダプター結合領域が、配列番号4と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むTrfAアダプタータンパク質を特異的に結合する、コリネバクテリウム種宿主細胞。
- 前記第1の分解タグの前記プロテアーゼ認識領域が、TrfAアダプタータンパク質が存在する場合にClpCP、ClpXP及びClpAPからなる群から選択されるプロテアーゼにより前記第1の分解タグによりタグ付けされた標的タンパク質が分解されることを可能にする、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記第1の分解タグが、配列番号30又は配列番号32のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記第1の分解タグが、配列番号28、配列番号34、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、又は配列番号58のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記第1の分解タグが、配列番号24又は配列番号26のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の宿主細胞。
- 第2の分解タグを発現するようにさらに組換え操作され、前記第2の分解タグが、アダプター結合領域、任意のスペーサー領域、及びプロテアーゼ認識領域を含み、前記第2の分解タグの前記アダプター結合領域が、配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むSspBアダプタータンパク質を特異的に結合する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記第2の分解タグの前記プロテアーゼ認識領域が、SspBアダプタータンパク質が存在する場合にClpCP、ClpXP及びClpAPからなる群から選択されるプロテアーゼにより前記第2の分解タグによりタグ付けされた標的タンパク質が分解されることを可能にする、請求項6に記載の宿主細胞。
- 前記第2の分解タグが、配列番号16又は配列番号18のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の宿主細胞。
- 前記第1の分解タグが、配列番号14、配列番号20、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記第1の分解タグが、配列番号10又は配列番号12のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の宿主細胞。
- コリネバクテリウム種宿主細胞における第1の標的タンパク質の分解を制御する方法であって、前記宿主細胞が、第1の分解タグを発現するようにかつ第1の異種生合成経路を介し第1の生成物を生成するように組換え操作されており、
前記第1の標的タンパク質をタグ付けするように適合された第1の分解タグを発現すること;
所望の成長速度が達されるまで前記宿主細胞を成長させること;及び
TrfAアダプタータンパク質の発現を誘導することであって、前記TrfAアダプタータンパク質が、配列番号4と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、誘導すること
を含み、
前記宿主細胞中に存在する前記第1の標的タンパク質の量が、TrfAアダプタータンパク質の発現が誘導される後に少なくとも約20%減少し、かつそのような減少が、ClpCP、ClpXP及びClpAPからなる群から選択されるプロテアーゼによる分解により引き起こされる、方法。 - 前記第1の標的タンパク質が、前記宿主細胞の成長に必須なタンパク質である、請求項11に記載の方法。
- 前記第1の標的タンパク質の存在が、前記第1の生成物を生成するための前記第1の異種生合成経路において負のフィードバックとして機能する、請求項11に記載の方法。
- 前記第1の標的タンパク質が、前記第1の生成物を代謝し、それにより前記第1の生成物の収集可能な量を低下させる、請求項11に記載の方法。
- TrfAアダプタータンパク質の発現が、温度変化、pH変化、光への暴露により及び/又は宿主細胞内の所与の分子レベルを変化させることにより誘導される、請求項11に記載の方法。
- 前記第1の分解タグのC末端の最後の3個のアミノ酸配列が、DQP、KPS、DGA、DGS、DQA、KNP、QPS、MKP、DQS、及びHPPからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、第2の分解タグを発現するようにかつ第2の異種生合成経路を介し第2の生成物を生成するようにさらに組換え操作されており、
前記第2の標的タンパク質をタグ付けするために前記第2の分解タグを発現すること;
所望の成長速度が達されるまで前記宿主細胞を成長させること;及び
SspBアダプタータンパク質の発現を誘導することであって、前記SspBアダプタータンパク質が、配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、誘導すること
をさらに含み、
前記宿主細胞中に存在する前記第2の標的タンパク質の量が、前記SspBアダプタータンパク質の発現が誘導される後に少なくとも約20%減少し、かつそのような減少が、ClpCP、ClpXP及びClpAPからなる群から選択されるプロテアーゼによる分解により引き起こされる、請求項11〜16のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第2の標的タンパク質が、前記宿主細胞の成長に必須なタンパク質である、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の標的タンパク質の存在が、前記第2の生成物を生成するための前記第2の異種生合成経路における負のフィードバックとして機能する、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の標的タンパク質が、前記第2の生成物を代謝し、それにより前記第2の生成物の収集可能な量を低下させる、請求項17に記載の方法。
- 前記SspBアダプタータンパク質の発現が、温度変化、pH変化、光への暴露により及び/又は宿主細胞内の所与の分子レベルを変化させることにより誘導される、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の分解タグのC末端の最後の3個のアミノ酸配列が、DQP、KPS、DGA、DGS、DQA、KNP、QPS、MKP、DQS、及びHPPからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
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