JP2022183262A

JP2022183262A - Ｃｂｌｂエンドヌクレアーゼバリアント、組成物、および使用方法

Info

Publication number: JP2022183262A
Application number: JP2022166786A
Authority: JP
Inventors: ジャージョルジョーダン; Jarjour Jordan; ヘイヴンズカイル; Havens Kyle; クロスタグアン－レイチェル; Krostag Anne-Rachel
Original assignee: 2Seventy Bio Inc
Current assignee: 2Seventy Bio Inc
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2022-10-18
Publication date: 2022-12-08
Anticipated expiration: 2038-05-25
Also published as: EP3630962A4; KR102590466B1; RU2019141853A3; US20200087653A1; EP3630962A1; AU2018273979A1; MX2019014100A; JP7450683B2; KR20230147767A; JP7191042B2; US20210214714A1; US20210147818A1; MA48797A; KR20200011953A; WO2018218194A1; CN110799644A; JP2024055980A; RU2019141853A; CA3064014A1; JP2020521456A

Abstract

【課題】改善されたゲノム編集組成物、およびＣＢＬＢ遺伝子を編集するための方法を提供すること。【解決手段】本開示は、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全のうちの少なくとも１つの症状の予防、治療、または緩和のためのゲノム編集された細胞をさらに提供する。様々な実施形態において、本開示は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含むポリペプチドを部分的に企図する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
この出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１７年１０月３日に出願された米国仮特許出願第６２／５６７，４１７号、および２０１７年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／５１１，１９４号の利益を主張し、これらの各々はその全体において参照により本明細書に組み込まれる。

配列表に関する説明
本出願に付随する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、ここに参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿０８７＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。本テキストファイルは、１５２ＫＢであり、２０１８年５月２５日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される。

本開示は、改善されたゲノム編集組成物に関する。より具体的には、本開示は、ヒトカシータスＢ系統（Ｃｂｌ）リンパ腫癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）遺伝子を編集するための、ヌクレアーゼバリアント、組成物、およびそれらの使用方法に関する。

癌の世界的な負担は、１９７５年～２０００年の間に２倍となった。癌は、世界中の疾病率および死亡率の２番目に高い要因であり、２０１２年において新たな症例はおよそ１４１０万件、癌関連死は８２０万件となっている。最も一般的な癌は、乳癌、肺および気管支癌、前立腺癌、結腸および直腸癌、膀胱癌、皮膚の黒色腫、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、腎臓および腎盂癌、子宮内膜癌、白血病、ならびに膵臓癌である。新たな癌症例件数は、今後２０年以内で２２００万件に上昇すると予想される。

免疫系は、ヒト癌の検出および撲滅において主要な役割を有する。形質転換細胞の大部分は、免疫センチネルによって迅速に検出され、クローン的に発現されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した抗原特異的Ｔ細胞の活性化を通して破壊される。したがって、癌は、免疫学的障害、すなわち、疾患を恒久的に抑制および排除するために必要な抗腫瘍応答を開始する免疫系の機能障害とみなすことができる。癌をより有効に撲滅するために、過去数十年間にわたって開発されたある特定の免疫療法介入は、Ｔ細胞免疫性を強化することに特に注力してきた。これらの治療は、疾患寛解の孤発例をもたらしてきたのみであり、実質的な全体的奏功は達成していない。

より最近では、Ｔ細胞の単離、修飾、増殖、および再注入に基づく養子細胞療法戦略が探索されており、初期段階の臨床試験で試験されている。Ｔ細胞はしばしば、それらの選択的認識および強力なエフェクター機構に起因して、癌免疫療法のための一般的に好まれるエフェクター細胞となっている。これらの治療は、まちまちな奏効率を示してきたが、少数の患者は、恒久的な寛解を経験しており、Ｔ細胞ベースの免疫療法の未だ理解されていない可能性を強調している。

細胞溶解性Ｔ細胞による腫瘍細胞関連抗原の成功裏の認識は、標的とする腫瘍の溶解を開始し、任意の有効な癌免疫療法アプローチを実証する。腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）は、腫瘍関連抗原に特異的に指向されたＴＣＲを発現するが、実質的な数のＴＩＬは、少数のヒト癌のみに限定される。遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、多くの癌および他の免疫障害に対するＴ細胞ベースの免疫療法の適用性を増加させる可能性がある。

その上、最新技術による遺伝子操作されたＴ細胞は依然として、癌細胞、炎症性細胞、間質細胞、およびサイトカインからなる複合の免疫抑制腫瘍微小環境によって調節される。これらの構成要素のうち、癌細胞、炎症性細胞、および抑制性サイトカインがＴ細胞表現型および機能に不利に影響する。集合的に、腫瘍微小環境は、Ｔ細胞を駆動し、疲弊したＴ細胞へと最終的に分化する。

Ｔ細胞疲弊は、阻害性受容体の増加した発現または阻害性受容体による増加したシグナル伝達、低減されたエフェクターサイトカイン産生、および持続して癌を排除する能力の減少によって特徴付けられる慢性的環境における、Ｔ細胞機能不全の状態である。疲弊したＴ細胞はまた、階層的様態で機能喪失を示す。すなわち、減少したＩＬ－２産生およびエクスビボでの殺傷能力が疲弊の早期段階で失われ、ＴＮＦ－α産生が中間段階で失われ、ＩＦＮ－γおよびＧｚｍＢ産生が疲弊の後期段階で失われる。腫瘍微小環境におけるほとんどのＴ細胞は、疲弊したＴ細胞へと分化し、癌を排除する能力を失い、最終的には取り除かれる。

現在まで、増加した持続性および免疫抑制腫瘍微小環境に対する耐性を有する養子細胞療法の実証可能な臨床例は存在していない。

本開示は、概して、ひとつには、ヒトカシータスＢ系統（Ｃｂｌ）リンパ腫癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）遺伝子中の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびｍｅｇａＴＡＬを含む組成物に関する。

様々な実施形態において、本開示は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含むポリペプチドを部分的に企図する。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＨＥバリアントの生物学的に活性な断片を含む。

ある特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠く。

いくつかの実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠く。

さらなる実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠く。

特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、または６個のＣ末端アミノ酸を欠く。

特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、Ｃ末端アミノ酸を欠く。

追加の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠く。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ－ＣｒｅＩおよびＩ－ＳｃｅＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、およびＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。

いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。

追加の実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントである。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、１個以上のアミノ酸置換を、配列番号１～５に示されるＩ－ＯｎｕＩＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置のＤＮＡ認識インターフェースにおいて含む。

ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を、配列番号１～５に示されるＩ－ＯｎｕＩＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置のＤＮＡ認識インターフェースにおいて含む。

ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、１個以上のアミノ酸置換を、配列番号１～５に示されるＩ－ＯｎｕＩＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。

ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を、配列番号１～５に示されるＩ－ＯｎｕＩＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の位置：２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７８、８０、９２、１１６、１３８、１４３、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２３６、および２３８からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置で含む。

いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｄ、Ｒ２８Ｙ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ａ、Ｎ３２Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｋ３４Ｖ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｖ３７Ｓ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ａ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｄ９２Ｇ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｖ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｋ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１８８Ｎ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｐ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｋ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

さらなる実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ａ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｖ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｋ１９１Ｐ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ａ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｄ９２Ｇ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｖ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｙ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ｓ、Ｋ３４Ｖ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｖ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｖ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｋ１９１Ｐ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

さらなる実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ａ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｄ９２Ｇ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号６～１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号６に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

追加の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号９に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

さらなる実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２０に示されるポリヌクレオチド配列と結合する。

特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む。

追加の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインおよび亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される。

ある特定の実施形態において、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ繰り返し単位～約１５．５個のＴＡＬＥ繰り返し単位を含む。

さらなる実施形態において、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子内のポリヌクレオチド配列と結合する。

特定の実施形態において、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２１に示されるポリヌクレオチド配列と結合する。

特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２２に示されるポリヌクレオチド配列と結合し、それを切断する。

特定の実施形態において、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８個の亜鉛フィンガーモチーフを含む。

追加の実施形態において、ポリペプチドは、ペプチドリンカーおよびエンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む。

ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、ウイルス自己切断型２Ａペプチドおよびエンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む。

さらなる実施形態において、エンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片は、５´－３´エキソヌクレアーゼ、５´－３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´－５´エキソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ＴｄＴ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。

いくつかの実施形態において、エンドプロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む。

さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１３～１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

追加の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２０または２２に示されるポリヌクレオチド配列でヒトＣＢＬＢ遺伝子を切断する。

様々な実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを部分的に提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを部分的に提供する。

特定の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするｃＤＮＡを部分的に提供する。

様々な実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを部分的に提供する。

様々な実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドを含む細胞を部分的に提供する。

追加の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を部分的に提供する。

さらなる実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるベクターを含む細胞を部分的に提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドによって導入された１つ以上のゲノム修飾を含む細胞を部分的に提供する。

特定の実施形態において、細胞は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む。

さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、および負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーのｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される。

追加の実施形態において、ポリヌクレオチドは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、かつ／またはそれらに隣接する１つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする。

特定の実施形態において、自己切断型ウイルスペプチドは、２Ａペプチドである。

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む。

特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む。

追加の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、キヌレニナーゼ活性を含む。

特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインであって、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である細胞外ドメイン、免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン、または免疫抑制因子と結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫抑制シグナルを細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインを含む。

さらなる実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、疫賦活因子は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ膜貫通ドメインのＣ末端終端にインフレームで融合したＴＬＲ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む。

特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインと、ＴＬＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７ポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインのＣ末端終端にインフレームで融合したＴＬＲ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む。

ある特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインのＣ末端終端にインフレームで融合したＴＬＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７ポリペプチドから単離された膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインとを含む。

特定の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはゼータカイン（ｚｅｔａｋｉｎｅ）からなる群から選択される。

追加の実施形態において、遺伝子操作された受容体は、ＣＢＬＢ遺伝子に組み込まれない。

さらなる実施形態において、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドは、ＣＢＬＢ遺伝子に組み込まれる。

さらなる実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含み、本明細書で企図されるポリペプチドによって導入されたＤＮＡ２本鎖の破断部位でＣＢＬＢ遺伝子に組み込まれる。

特定の実施形態において、細胞は、造血細胞である。

いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。

特定の実施形態において、細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋細胞である。

追加の実施形態において、細胞は、免疫エフェクター細胞である。

特定の実施形態において、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。

ある特定の実施形態において、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。

好ましい実施形態において、細胞は、遺伝子操作された受容体を発現するように遺伝子修飾されたＴ細胞である。

好ましい実施形態において、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子修飾されたＴ細胞である。

追加の実施形態において、細胞の源は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。

いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上の修飾されたＣＢＬＢ対立遺伝子を含む。

さらなる実施形態において、１つ以上の修飾されたＣＢＬＢ対立遺伝子は、機能不全であるか、または実質的に低減されたＣＢＬＢ機能および／もしくは活性を有する。

特定の実施形態において、細胞は、１つ以上の修飾されたＣＢＬＢ対立遺伝子内に導入された免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードする核酸を含み、細胞は、１つ以上の修飾されたＣＢＬＢ対立遺伝子内に導入されていない遺伝子操作された抗原受容体をさらに含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で企図される１つ以上の細胞を含む複数の細胞を部分的に提供する。

様々な実施形態において、本開示は、本明細書で企図される１つ以上の細胞を含む組成物を部分的に提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で企図される１つ以上の細胞と、生理学的に許容される担体とを含む組成物を部分的に提供する。

特定の実施形態において、本開示は、細胞内に本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、ポリペプチドの発現が、ヒトＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位で２本鎖の破断を作成する、細胞内のヒトＣＢＬＢ遺伝子を編集する方法を部分的に提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、細胞内に本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、ポリペプチドの発現が、ヒトＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位で２本鎖の破断を作成し、破断が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される、細胞内のヒトＣＢＬＢ遺伝子を編集する方法を部分的に提供する。

ある特定の実施形態において、本開示は、細胞内に本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびドナー修復テンプレートを導入することを含み、ポリペプチドの発現が、ヒトＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位で２本鎖の破断を作成し、ドナー修復テンプレートが、２本鎖の破断（ＤＳＢ）の部位で相同組換え修復（ＨＤＲ）によってヒトＣＢＬＢ遺伝子内に組み込まれる、細胞内のヒトＣＢＬＢ遺伝子を編集する方法を部分的に提供する。

特定の実施形態において、細胞は、造血細胞である。

ある特定の実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。

ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋細胞である。

いくつかの実施形態において、細胞は、免疫エフェクター細胞である。

追加の実施形態において、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。

追加の実施形態において、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。

特定の実施形態において、細胞の源は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。

特定の実施形態において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。

ある特定の実施形態において、５´－３´エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、本細胞内に導入されている。

さらなる実施形態において、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドが、細胞内に導入されている。

いくつかの実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＣＢＬＢ遺伝子、または野生型ＣＢＬＢ遺伝子と比較して、１つ以上の変異を含むその部分をコードする。

特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードする。

いくつかの実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む。

さらなる実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される。

特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、かつ／またはそれらに隣接する１つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする。

追加の実施形態において、自己切断型ウイルスペプチドは、２Ａペプチドである。

ある特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む。

さらなる実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む。

特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、キヌレニナーゼ活性を含む。

いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインであって、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である細胞外ドメイン、免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン、または免疫抑制因子と結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫抑制シグナルを細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインを含む。

ある特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーの細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインは、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインである。

いくつかの実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される。

特定の実施形態において、免疫賦活因子は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される。

追加の実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ膜貫通ドメインのＣ末端終端にインフレームで融合したＴＬＲ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。

特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインと、ＴＬＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７ポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインのＣ末端終端にインフレームで融合したＴＬＲ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。

さらなる実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインのＣ末端終端にインフレームで融合したＴＬＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７ポリペプチドから単離された膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインとを含む。

ある特定の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはゼータカイン（ｚｅｔａｋｉｎｅ）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢのヒトＣＢＬＢ遺伝子配列５´に対して相同な５´相同アームと、ＤＳＢのヒトＣＢＬＢ遺伝子配列３´に対して相同な３´相同アームと、を含む。

さらなる実施形態において、５´および３´相同アームの長さは独立して、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐから選択される。

特定の実施形態において、５´および３´相同アームの長さは独立して、約６００ｂｐ～約１５００ｂｐから選択される。

特定の実施形態において、５´相同アームは約１５００ｂｐであり、３´相同アームは約１０００ｂｐである。

いくつかの実施形態において、５´相同アームは約６００ｂｐであり、３´相同アームは約６００ｂｐである。

ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、細胞内にドナー修復テンプレートを導入するために使用される。

追加の実施形態において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである。

特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来の１個以上のＩＴＲを有する。

追加の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する。

さらなる実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６血清型を有する。

ある特定の実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。

いくつかの実施形態において、レンチウイルスは、インテグラーゼ欠乏レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である。

種々の実施形態において、本開示は、有効量の本明細書で企図される組成物を対象に投与することを含む、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、または緩和する方法を部分的に提供する。

ある特定の実施形態において、本開示は、有効量の本明細書で企図される組成物を対象に投与することを含む、固形癌を治療する方法を部分的に提供する。

特定の実施形態において、固形癌は、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、脳癌、肉腫、頭頸部癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌を含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、有効量の本明細書で企図される組成物を対象に投与することを含む、血液学的悪性腫瘍を治療する方法を部分的に提供する。

ある特定の実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒトカシータスＢ系統（Ｃｂｌ）リンパ腫癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）遺伝子において標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含むポリペプチド。
（項目２）
前記ＨＥバリアントが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記ポリペプチドが、前記ＨＥバリアントの生物学的に活性な断片を含む、項目１、または項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠く、項目３に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠く、項目４に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠く、項目４に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、または６個のＣ末端アミノ酸を欠く、項目３に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、Ｃ末端アミノ酸を欠く、項目７に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠く、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記ＨＥバリアントが、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、およびＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである、項目１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記ＨＥバリアントが、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである、項目１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記ＨＥバリアントが、Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントである、項目１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記ＨＥバリアントが、１個以上のアミノ酸置換を、配列番号１～５に示されるＩ－ＯｎｕＩＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置のＤＮＡ認識インターフェースにおいて含む、項目１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記ＨＥバリアントが、少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を、配列番号１～５に示されるＩ－ＯｎｕＩＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む、項目１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記ＨＥバリアントが、少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の位置：２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７８、８０、９２、１１６、１３８、１４３、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２３６、および２３８からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置で含む、項目１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｄ、Ｒ２８Ｙ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ａ、Ｎ３２Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｋ３４Ｖ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｖ３７Ｓ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ａ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｄ９２Ｇ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｖ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｋ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１８８Ｎ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｐ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｋ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ａ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｖ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｋ１９１Ｐ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ａ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｄ９２Ｇ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｖ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｙ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ｓ、Ｋ３４Ｖ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｖ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｖ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｋ１９１Ｐ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２３）
前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５のいずれか１つまたはその生物学的に活性な断片の以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ａ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｄ９２Ｇ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２４）
前記ＨＥバリアントが、配列番号６～１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２５）
前記ＨＥバリアントが、配列番号６に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２６）
前記ＨＥバリアントが、配列番号７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２７）
前記ＨＥバリアントが、配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２８）
前記ＨＥバリアントが、配列番号９に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２９）
前記ＨＥバリアントが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目３０）
前記ＨＥバリアントが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目３１）
前記ＨＥバリアントが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目３２）
前記ポリペプチドが、配列番号２０に示されるポリヌクレオチド配列と結合する、項目１～３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目３３）
ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、項目１～３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目３４）
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインおよび亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される、項目３３に記載のポリペプチド。
（項目３５）
前記ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインが、約９．５個のＴＡＬＥ繰り返し単位～約１５．５個のＴＡＬＥ繰り返し単位を含む、項目３４に記載のポリペプチド。
（項目３６）
前記ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインが、前記ＣＢＬＢ遺伝子内のポリヌクレオチド配列と結合する、項目３４または項目３５に記載のポリペプチド。
（項目３７）
前記ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインが、配列番号２１に示されるポリヌクレオチド配列と結合する、項目３４～３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目３８）
前記ポリペプチドが、配列番号２２に示されるポリヌクレオチド配列と結合し、それを切断する、項目３７に記載のポリペプチド。
（項目３９）
前記亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインが、２、３、４、５、６、７、または８つの亜鉛フィンガーモチーフを含む、項目３４に記載のポリペプチド。
（項目４０）
ペプチドリンカーおよびエンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む、項目１～３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目４１）
ウイルス性自己切断型２Ａペプチドおよびエンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む、項目１～４０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目４２）
前記エンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片が、５´－３´エキソヌクレアーゼ、５´－３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´－５´エキソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ＴｄＴ、または鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、項目４０または項目４１に記載のポリペプチド。
（項目４３）
前記エンドプロセシング酵素が、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む、項目４０～４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目４４）
前記ポリペプチドが、配列番号１３～１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目１～４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目４５）
前記ポリペプチドが、配列番号１３に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目４４に記載のポリペプチド。
（項目４６）
前記ポリペプチドが、配列番号１４に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目４４に記載のポリペプチド。
（項目４７）
前記ポリペプチドが、配列番号１５に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目４４に記載のポリペプチド。
（項目４８）
前記ポリペプチドが、配列番号１６に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目４４に記載のポリペプチド。
（項目４９）
前記ポリペプチドが、配列番号１７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目４４に記載のポリペプチド。
（項目５０）
前記ポリペプチドが、配列番号１８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目４４に記載のポリペプチド。
（項目５１）
前記ポリペプチドが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目４４に記載のポリペプチド。
（項目５２）
前記ポリペプチドが、配列番号２０または２２に示されるポリヌクレオチド配列で前記ヒトＣＢＬＢ遺伝子を切断する、項目１～５１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目５３）
項目１～５２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目５４）
項目１～５２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ。
（項目５５）
項目１～５２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
（項目５６）
項目１～５２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目５７）
項目１～５２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む細胞。
（項目５８）
項目１～５２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞。
（項目５９）
項目５６に記載のベクターを含む細胞。
（項目６０）
項目１～５２のいずれか一項に記載のポリペプチドによって導入された１つ以上のゲノム修飾を含む細胞。
（項目６１）
前記細胞が、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む、項目５７～６０のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６２）
前記ポリヌクレオチドが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む、項目６１に記載の細胞。
（項目６３）
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、および負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーのｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される、項目６２に記載の細胞。
（項目６４）
前記ポリヌクレオチドが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、かつ／またはそれらに隣接する１つ以上の自己切断型ウイルス性ペプチドをさらにコードする、項目６１～６３のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６５）
前記自己切断型ウイルス性ペプチドが、２Ａペプチドである、項目６４に記載の細胞。（項目６６）
前記ポリヌクレオチドが、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目６１～６５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６７）
前記免疫抑制シグナルダンパーが、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む、項目６１～６６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６８）
前記免疫抑制シグナルダンパーが、キヌレニナーゼ活性を含む、項目６７に記載の細胞。
（項目６９）
前記免疫抑制シグナルダンパーが、
（ａ）免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインであって、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である、細胞外ドメイン、
（ｂ）免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン、または
（ｃ）免疫抑制因子と結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫抑制シグナルを前記細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインを含む、項目６１～６６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７０）
前記免疫力エンハンサーが、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される、項目６１～６６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７１）
前記免疫賦活因子が、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、項目７０に記載の細胞。
（項目７２）
前記フリップ受容体が、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインと、前記ＴＧＦβＲＩＩ膜貫通ドメインのＣ末端終端にインフレームで融合したＴＬＲ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む、項目７０に記載の細胞。
（項目７３）
前記フリップ受容体が、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインと、ＴＬＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７ポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、前記ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインのＣ末端終端にインフレームで融合したＴＬＲ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む、項目７０に記載の細胞。
（項目７４）
前記フリップ受容体が、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインと、前記ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインのＣ末端終端にインフレームで融合したＴＬＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７ポリペプチドから単離された膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと、を含む、項目７０に記載の細胞。
（項目７５）
前記遺伝子操作された抗原受容体が、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはゼータカイン（ｚｅｔａｋｉｎｅ）からなる群から選択される、項目６１～６６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７６）
前記遺伝子操作された受容体が、前記ＣＢＬＢ遺伝子に組み込まれない、項目７５に記載の細胞。
（項目７７）
免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードする前記ポリヌクレオチドが、前記ＣＢＬＢ遺伝子に組み込まれる、項目６１～６６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７８）
免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードする前記ポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートが、項目１～５２のいずれか一項に記載のポリペプチドによって導入されたＤＮＡ２本鎖の破断部位で前記ＣＢＬＢ遺伝子に組み込まれる、項目６１～６６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７９）
前記細胞が、造血細胞である、項目５７～７８のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８０）
前記細胞が、Ｔ細胞である、項目５７～７９のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８１）
前記細胞が、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、および／またはＣＤ８^＋細胞である、項目５７～８０のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８２）
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、項目５７～８１のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８３）
前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、項目５７～８２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８４）
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、項目５７～８２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８５）
前記細胞の源が、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、項目５７～８４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８６）
前記細胞が、１つ以上の修飾されたＣＢＬＢ対立遺伝子を含む、項目４７～８５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８７）
前記１つ以上の修飾されたＣＢＬＢ対立遺伝子が、機能不全であるか、または実質的に低減されたＣＢＬＢ機能および／もしくは活性を有する、項目７２に記載の細胞。
（項目８８）
前記細胞が、前記１つ以上の修飾されたＣＢＬＢ対立遺伝子内に導入された免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードする核酸を含み、前記細胞が、前記１つ以上の修飾されたＣＢＬＢ対立遺伝子内に導入されていない遺伝子操作された抗原受容体をさらに含む、項目４６～５１のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８９）
項目５７～８８のいずれか一項に記載の１つ以上の細胞を含む、複数の細胞。
（項目９０）
項目５７～８８のいずれか一項に記載の１つ以上の細胞を含む、組成物。
（項目９１）
項目５７～８８のいずれか一項に記載の１つ以上の細胞と、生理学的に許容される担体と、を含む、組成物。
（項目９２）
細胞内のヒトＣＢＬＢ遺伝子を編集する方法であって、前記細胞内に項目１～５２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位で２本鎖の破断を作成する、方法。
（項目９３）
細胞内のヒトＣＢＬＢ遺伝子を編集する方法であって、前記細胞内に項目１～５２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位で２本鎖の破断を作成し、前記破断が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される、方法。
（項目９４）
細胞内のヒトＣＢＬＢ遺伝子を編集する方法であって、前記細胞内に項目１～５２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびドナー修復テンプレートを導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位で２本鎖の破断を作成し、前記ドナー修復テンプレートが、前記２本鎖の破断（ＤＳＢ）の前記部位で相同組換え修復（ＨＤＲ）によって前記ヒトＣＢＬＢ遺伝子内に組み込まれる、方法。
（項目９５）
前記細胞が、造血細胞である、項目９２～９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記細胞が、Ｔ細胞である、項目９２～９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記細胞が、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、および／またはＣＤ８^＋細胞である、項目９２～９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、項目９２～９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、項目９２～９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、項目９２～９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記細胞の源が、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、項目９２～１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、項目９２～１０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
５´－３´エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記細胞内に導入される、項目９２～１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドが、前記細胞内に導入される、項目９２～１０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記ドナー修復テンプレートが、ＣＢＬＢ遺伝子、または前記野生型ＣＢＬＢ遺伝子と比較して１つ以上の変異を含むその部分をコードする、項目９４～１０４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記ドナー修復テンプレートが、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードする、項目９４～１０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
前記ドナー修復テンプレートが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、および負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーのｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記ドナー修復テンプレートが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、かつ／またはそれらに隣接する１つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする、項目１０６～１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記自己切断型ウイルスペプチドが、２Ａペプチドである、項目１０９に記載の方法。（項目１１１）
前記ドナー修復テンプレートが、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目１０６～１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記免疫抑制シグナルダンパーが、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む、項目１０６～１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記免疫抑制シグナルダンパーが、キヌレニナーゼ活性を含む、項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
前記免疫抑制シグナルダンパーが、
（ａ）免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインであって、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である、細胞外ドメイン、
（ｂ）免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン、または
（ｃ）免疫抑制因子と結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫抑制シグナルを前記細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインを含む、項目１０６～１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１５）
前記免疫抑制シグナルダンパーの前記細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインが、前記ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインである、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）
前記免疫力エンハンサーが、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される、項目１０６～１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
前記免疫賦活因子が、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記フリップ受容体が、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインと、前記ＴＧＦβＲＩＩ膜貫通ドメインのＣ末端終端にインフレームで融合したＴＬＲ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む、項目１１６に記載の方法。
（項目１１９）
前記フリップ受容体が、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインと、ＴＬＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７ポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、前記ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインのＣ末端終端にインフレームで融合したＴＬＲ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む、項目１１６に記載の方法。
（項目１２０）
前記フリップ受容体が、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインと、前記ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインのＣ末端終端にインフレームで融合したＴＬＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７ポリペプチドから単離された膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと、を含む、項目１１６に記載の方法。
（項目１２１）
前記遺伝子操作された抗原受容体が、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはゼータカインからなる群から選択される、項目１０６～１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
前記ドナー修復テンプレートが、前記ＤＳＢのヒトＣＢＬＢ遺伝子配列５´に対して相同な５´相同アームと、前記ＤＳＢのヒトＣＢＬＢ遺伝子配列３´に対して相同な３´相同アームと、を含む、項目９４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
前記５´および３´相同アームの長さが独立して、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐから選択される、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
前記５´および３´相同アームの長さが独立して、約６００ｂｐ～約１５００ｂｐから選択される、項目１２２または項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記５´相同アームが約１５００ｂｐであり、前記３´相同アームが約１０００ｂｐである、項目１２２～１２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
前記５´相同アームが約６００ｂｐであり、前記３´相同アームが約６００ｂｐである、項目１２２～１２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２７）
ウイルスベクターが、前記細胞内に前記ドナー修復テンプレートを導入するために使用される、項目９４～１２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２８）
前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２由来の１つ以上のＩＴＲを有する、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する、項目１２８または項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６血清型を有する、項目１２８～１３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３２）
前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、項目１２８に記載の方法。
（項目１３３）
前記レンチウイルスが、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、または緩和する、方法であって、有効量の項目９０または項目９１に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
（項目１３５）
有効量の項目９０または項目９１に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、固形癌を治療する方法。
（項目１３６）
前記固形癌が、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、脳癌、肉腫、頭頸部癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌を含む、項目１３５に記載の方法。
（項目１３７）
有効量の項目９０または項目９１に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、血液学的悪性腫瘍を治療する方法。
（項目１３８）
前記血液学的悪性腫瘍が、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である、項目１３７に記載の方法。

ＣＢＬＢ遺伝子、およびＳＨ２ドメインをコードするエクソン６におけるＨＥ標的部位（配列番号２０および７６）を示す。３回の選別を通して、キメラ型「ハーフ部位」に対するＮＴＤおよびＣＴＤの遺伝子操作を介して、ＣＢＬＢＨＥがどのように再プログラム化され、その後、再プログラム化されたドメインの融合および完全なＣＢＬＢ標的部位に対するスクリーニングを行って、完全に再プログラム化されたＨＥを単離したかを示す。染色体レポーターアッセイにおけるＣＢＬＢＨＥバリアントの活性を示す。ＣＢＬＢ．Ｅ３ＨＥバリアントの酵母表面の親和性力価測定を示す。非同一の位置を強調する、野生型Ｉ－ＯｎｕＩタンパク質（配列番号１）に対するＣＢＬＢＨＥバリアントの整列（配列番号７７～８３）を示す。非同一の位置を強調する、野生型Ｉ－ＯｎｕＩタンパク質（配列番号１）に対するＣＢＬＢＨＥバリアントの整列（配列番号７７～８３）を示す。非同一の位置を強調する、野生型Ｉ－ＯｎｕＩタンパク質（配列番号１）に対するＣＢＬＢＨＥバリアントの整列（配列番号７７～８３）を示す。ＣＢＬＢ．Ｅ３ｍｅｇａＴＡＬを生成するためにＣＢＬＢ．Ｅ３ＨＥバリアントに融合したＴＡＬＲＶＤの結合部位（配列番号２２および８４）を示す。ＣＢＬＢｍｅｇａＴＡＬを使用したＣＡＲＴ細胞における一貫性のＣＢＬＢ遺伝子編集率を示す。ＣＢＬＢｍｅｇａＴＡＬで治療されたＴ細胞の減少した細胞内ＣＢＬＢタンパク質発現を示す。ＣＢＬ編集されたＴ細胞が、抗ＣＤ３抗体によって、またはＣＡＲ特異性抗原によって刺激された場合により多くのＩＦＮγおよびＴＮＦαを生成することを示す。様々なＣＢＬＢｍｅｇａＴＡＬおよびＴＲＥＸ２をコードするｍＲＮＡの同時送達によって編集されたＴ細胞のＴＩＤＥ分析を示す。標的遺伝子座での編集率は、６１～９３％であった。ＣＢＬＢｍｅｇａＴＡＬおよびＡＡＶドナーを使用したＣＢＬＢ標的部位へのＭＮＤ－ＧＦＰ発現カセットを挿入するためのＨＤＲ戦略の図を示す。模倣編集されたＴ細胞と比較して、図１１に示されるＨＤＲ戦略を使用して編集されたＴ細胞におけるＧＦＰ発現の安定した増加を示す。インビボマウス研究の結果を示す。Ａ５４９腫瘍を有するマウスを、ビヒクル処理Ｔ細胞（左上パネル）、ＣＢＬＢｍｅｇａＴＡＬで編集されたＴ細胞（右上パネル）、抗ＥＧＦＲＣＡＲＴ細胞（左下パネル）、およびＣＢＬＢｍｅｇａＴＡＬで編集された抗ＥＧＦＲＣＡＲＴ細胞（右下パネル）で処理した。平均腫瘍体積を経時的に測定した。

配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）のアミノ酸配列である。
配列番号２は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥのアミノ酸配列である。
配列番号３は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
配列番号４は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
配列番号５は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
配列番号６～１２は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子中の標的部位に結合し、それを切断するように再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３～１９は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子中の標的部位に結合し、それを切断するように再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６におけるＩ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアント標的部位である。
配列番号２１は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６におけるＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン標的部位である。
配列番号２２は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６におけるｍｅｇａＴＡＬ標的部位である。
配列番号２３、２５、２７、および２９は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６におけるＩ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントＮ末端ドメイン標的部位を示す。
配列番号２４、２６、および２８は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６におけるＩ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントＣ末端ドメイン標的部位を示す。
配列番号３０は、ＣＢＬＢ．Ｅ３表面ディスプレイプラスミドのポリヌクレオチド配列である。
配列番号３１～３６は、ＣＢＬＢｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡ配列を示す。
配列番号３７は、マウスＴｒｅｘ２をコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号３８は、マウスＴｒｅｘ２をコードするアミノ酸配列である。
配列番号３９～４９は、様々なリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号５０～７４は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。前述の配列において、Ｘは、存在する場合、任意のアミノ酸を指し、またはアミノ酸の不在を指す。

Ａ．概説
本開示は、概して、改善されたゲノム編集組成物およびその使用方法に部分的に関する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、様々な実施形態において企図されるゲノム編集組成物は、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、もしくはそれらに関連する状態を予防もしくは治療するために、またはそれらの少なくとも１つの症状を緩和するために使用され得る。既存の養子細胞療法を悩ませるある限定または問題は、腫瘍微小環境によって媒介された疲弊による免疫エフェクター細胞の低応答性である。疲弊したＴ細胞は、ナイーブ、エフェクターまたはメモリーＴ細胞と著しく異なる固有の分子シグネチャを有する。疲弊したＴ細胞は、減少したサイトカイン発現およびエフェクター機能を有するＴ細胞である。

カシータスＢ系統（Ｃｂｌ）リンパ腫癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）は、ＲＩＮＧフィンガーファミリーまたはＥ３ユビキチン系統のメンバーであり、造血系の細胞を含む幅広い組織および細胞型で発現される。ＣＢＬＢは、酵素をそのＲＩＮＧフィンガードメインに複合体化するＥ２ユビキチンの動員を介して標的基質タンパク質のユビキチン化を促進する。ＣＢＬＢ基質タンパク質のユビキチン化は、タンパク質－タンパク質相互作用でタンパク質分解または干渉を促進し得る。ＣＢＬＢは、そのＳＨ２含有チロシンキナーゼ結合ドメイン、ＳＨ３ドメイン含有タンパク質と相互作用するそのプロリンリッチ配列、またはユビキチンタグ付きタンパク質と相互作用するそのユビキチン関連ドメインを通して基質タンパク質と結合する。

ＣＢＬＢはまた、エフェクターＴ細胞活性および持続性の負の制御に関連する。ＣＢＬＢノックアウトマウスＴ細胞は、過剰増殖性であり、抗原刺激に応答して高められるレベルのＩＬ２およびＩＦＮγを生成し、ＴＧＦβ媒介抑制に対して耐性であり、ＣＢＬＢがＴ細胞活性化を負に制御する役割を果たすことを示すより低い活性化閾値を有する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、遺伝子操作されたヌクレアーゼを使用したＴ細胞におけるＣＢＬＢ遺伝子の撹乱が、より有効かつ耐性の養子細胞免疫療法をもたらすことが企図される。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、ＣＢＬＢ発現、ＣＢＬＢ活性、および／またはＣＢＬＢを介するシグナル伝達を排除、減少、または減衰させることによって疲弊に対してより耐性を有するように作製される。

様々な実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、カシータスＢ系統（Ｃｂｌ）リンパ腫癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）遺伝子における標的部位に結合し、それを切断するように設計された、ヌクレアーゼバリアントを含む。特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントを使用して、標的ポリヌクレオチド配列における２本鎖の破断を導入することができ、これは、ポリヌクレオチドテンプレート、例えば、ドナー修復テンプレートの不在下で非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、またはドナー修復テンプレートの存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）、すなわち相同組換えによって修復され得る。ある特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントはまた、ニッカーゼとして設計され得、これは、ドナー修復テンプレートの存在下で細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）機構または相同組換えを使用して修復され得る、１本鎖ＤＮＡの破断を生成する。ＮＨＥＪは、遺伝子機能を撹乱する小さな挿入および欠失の形成を頻繁にもたらす、エラーの起こりやすいプロセスである。相同組換えは、修復用のテンプレートとして相同ＤＮＡを必要とし、これを活用して、標的部位に隣接する領域に対する相同性を保持する配列が両側に隣接した、標的部位における所望の配列を含有するドナーＤＮＡの導入によって指定される限りなく多様な修飾を作り出すことができる。

１つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬを含む。

１つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬおよびエンドプロセシング酵素、例えば、Ｔｒｅｘ２を含む。

様々な実施形態において、ゲノム編集された細胞が企図される。ゲノム編集された細胞は、編集されたＣＢＬＢ遺伝子を含み、編集戦略はＣＢＬＢ発現を減少または排除するように設計される。特定の実施形態において、ＣＡＲＴ細胞、遺伝子操作されたＴＣＲＴ細胞、またはＤＡＲＩＣＴ細胞は、編集されたＣＢＬＢ遺伝子を含む。

様々な実施形態において、ＤＮＡ破断は、Ｔ細胞、例えば、免疫エフェクター細胞内のＣＢＬＢ遺伝子の標的部位において生成され、切断されたゲノム配列の終端のＮＨＥＪは、細胞にＣＢＬＢ発現をほとんどまたは全くもたらさず、好ましくは、機能的ＣＢＬＢ発現および／またはシグナル伝達を欠くかまたは実質的に欠く、例えば、Ｔ細胞疲弊を増加させる能力を欠くＴ細胞をもたらし得る。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、機能的ＣＢＬＢ発現を欠くＴ細胞は、免疫抑制およびＴ細胞疲弊に対してより耐性を有し、したがって、より持続性があり、かつ療法的に有効である。

様々な他の実施形態において、切断されたＣＢＬＢゲノム配列の修復用のドナーテンプレートが提供される。ＣＢＬＢ遺伝子は、ＤＮＡ破断部位での相同組換えによってテンプレートの配列で修復される。特定の実施形態において、修復テンプレートは、機能的ＣＢＬＢ発現を撹乱、および好ましくは実質的に減少または排除するポリヌクレオチド配列を含む。

特定の実施形態において、ＣＢＬＢ遺伝子は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドで修復される。

特定の実施形態において、ＣＢＬＢ遺伝子は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドで修復され、内因性ＣＢＬＢプロモーターを採用して、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体の発現を転写的に制御するようにＣＢＬＢ遺伝子内に導入される。

好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子を編集するために使用される。

したがって、本明細書で企図される方法および組成物は、既存の養子細胞療法と比較した飛躍的改良を表す。

組換え（すなわち、遺伝子操作された）ＤＮＡ、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド合成、免疫アッセイ、組織培養、形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）、酵素反応、精製、ならびに関連技術および手順は、概して、本明細書全体を通して記載および議論されるような微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学、および免疫学における様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されるように行われ得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、２００８年７月に更新）；ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖ．ＰｒｅｓｓＵＳＡ，１９８５）；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄｂｙ：ＪｏｈｎＥ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡｄａＭ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，ＤａｖｉｄＨ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，ＥｔｈａｎＭ．Ｓｈｅｖａｃｈ，ＷａｒｒｅｎＳｔｒｏｂｅｒ２００１ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）；Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ：ＣｕｒｒｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＥｄｉｔｅｄｂｙＪｕｌｉｅＬｏｇａｎ，ＫｉｒｓｔｉｎＥｄｗａｒｄｓａｎｄＮｉｃｋＳａｕｎｄｅｒｓ，２００９，ＣａｉｓｔｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ；Ａｎａｎｄ，ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｔｈｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｏｍｐｌｅｘＧｅｎｏｍｅｓ，（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２）；ＧｕｔｈｒｉｅａｎｄＦｉｎｋ，ＧｕｉｄｅｔｏＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９１）；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＴｈｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）；ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｎｅｘｔ－ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＧｅｎｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）；ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，２０１０ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ）；ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓＡｎｄＥｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８６）；ｔｈｅｔｒｅａｔｉｓｅ，ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓＦｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒａｎｄＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓｅｄｓ．，１９８７，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）；ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓＩｎＣｅｌｌＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒａｎｄＷａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；ＨａｎｄｂｏｏｋＯｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＶｏｌｕｍｅｓＩ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒａｎｄＣＣＢｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｏｉｔｔ，ＥｓｓｅｎｔｉａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．ＳｈｅｖａｃｈａｎｄＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；ならびにＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの記事の研究論文を参照されたい。

Ｂ．定義
より詳細にこの開示を述べる前に、その理解のためにある特定の用語の定義を提供することが役立ち得る。

別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等のいずれの方法および材料も、特定の実施形態の実践または試験において使用することができるが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示の目的において、次の用語が下記で定義される。追加の定義がこの開示全体を通して記載される。

冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上）を指すように本明細書で使用される。例として、「（ａｎ）要素」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。

二者択一（例えば、「または」）の使用は、その二者択一対象の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するように理解されるべきである。

「および／または」という用語は、その二者択一対象の一方、または両方のいずれかを意味するように理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％異なる、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。

一実施形態において、範囲、例えば、１～５、約１～５、または約１～約５は、その範囲によって包含される各数値を指す。例えば、１つの非限定的かつ単に例示的な実施形態において、範囲「１～５」は、１、２、３、４、５、または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０、または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０という表現と同等である。

本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である、またはそれよりも高い数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとおよそ同じである作用、例えば、生理学的作用を生み出す、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。

本明細書全体を通して、文脈上他の解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、述べられる工程もしくは要素または工程または要素の群を包含するが、任意の他の工程もしくは要素または工程または要素の群は排除することを暗示するように理解されよう。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」とは、何であれ「からなる」という語句に続くものを含み、かつそれらに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、かつ他の要素が何ら存在してはならないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」とは、その語句の後に列挙される任意の要素を含み、かつ、その列挙される要素に関して本開示で指定される活性または作用に干渉しないまたは寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、ただし、列挙される要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素が何ら存在しないことを示す。

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通した様々な箇所での上述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、それらの特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様態で組み合わされてもよい。一実施形態におけるある特徴の肯定的列挙が、特定の実施形態におけるその特徴の排除の根拠としての機能を果たすことも理解される。

「エクスビボ」という用語は、概して、好ましくは自然条件を最小限に改変した生物の外側の人口的環境において、生体組織内もしくは生体組織上で行われる実験または測定などの、生物の外側で起こる活性を指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、実験室装置において、通常は滅菌条件下で、典型的に数時間または最大約２４時間であるが、状況に応じて最大４８もしくは７２時間を含む期間、培養または調節された、生体細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態において、かかる組織または細胞は、収集および凍結され、後にエクスビボ処理のために解凍され得る。生体細胞または組織を使用した数日よりも長く持続する組織培養実験または手順は、典型的に、「インビトロ」とみなされるが、ある特定の実施形態においては、この用語は、エクスビボと交換可能に使用され得る。

「インビボ」という用語は、概して、生物の内側で起こる活性を指す。一実施形態において、細胞ゲノムは、遺伝子操作、編集、または修飾されたインビボである。

「強化する」または「促進する」または「増加する」または「増大させる」または「増強する」は、概して、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞が、ビヒクルまたは対照物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より高い応答（すなわち、生理的応答）を産生するか、引き出すか、または引き起こす能力を指す。測定可能な応答には、当該技術分野における理解から明らかであり、かつ本明細書に記載されるものの中でもとりわけ、触媒活性、結合親和性、結合部位特異性、結合部位選択性、持続性、細胞溶解活性の増加、および／または炎症促進性サイトカインの増加が含まれ得る。「増加した」または「強化された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照によって生み出される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれを超える倍率（例えば、５００、１０００倍）（それらの間の、かつ１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である増加を含み得る。

「減少させる」または「低下させる」または「減らす」または「低減する」または「弱める」または「破壊する」または「阻害する」または「減衰する」は、概して、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞が、ビヒクルまたは対照物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より低い応答（すなわち、生理的応答）を産生するか、引き出すか、または引き起こす能力を指す。測定可能な応答には、目標ではない結合親和性、目標ではない切断特異性、Ｔ細胞疲弊などの減少が含まれ得る。「減少した」または「低減された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、または対照によって生み出される応答（参照応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれを超える倍率（例えば、５００、１０００倍）（それらの間の、かつ１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である減少を含み得る。

「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的な変化なし」、または「実質的な減少なし」は、概して、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞が、ビヒクルまたは対照物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、実質的に類似しているか、または同等の生理的応答（すなわち、下流効果）を産生するか、引き出すか、または引き起こす能力を指す。同等の応答は、参照応答と著しく異なるか、または測定可能な異なり（ｍｅａｓｕｒａｂｌｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）がないものである。

本明細書で使用される「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的結合」または「特異的に標的とする」という用語は、バックグラウンド結合よりもより高い結合親和性での１つの分子の、別の分子への結合、例えば、ＤＮＡへのポリペプチド結合のＤＮＡ結合ドメインを説明する。結合ドメインは、それが、例えば、約１０^５Ｍ^－１以上の親和性またはＫ_ａ（すなわち、１／Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的部位に結合するか、またはそれと会合する場合、標的部位に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態において、結合ドメインは、１０^６Ｍ^－１、１０^７Ｍ^－１、１０^８Ｍ^－１、１０^９Ｍ^－１、１０^１０Ｍ^－１、１０^１１Ｍ^－１、１０^１２Ｍ^－１、または１０^１３Ｍ^－１以上のＫ_ａで標的部位に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１、少なくとも１０^１０Ｍ^－１、少なくとも１０^１１Ｍ^－１、少なくとも１０^１２Ｍ^－１、少なくとも１０^１３Ｍ^－１、またはそれを超えるＫ_ａを有するそれらの結合ドメインを指す。

あるいは、親和性は、特定の実施形態において、Ｍの単位での特定の結合相互作用（例えば、１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍ、またはそれ未満）の平衡解離定数（Ｋ_ｄ）として定義され得る。特定の実施形態において企図されるＤＮＡ標的部位に対する１つ以上のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼバリアントの親和性は、従来の技法、例えば、酵母細胞表面ディスプレイを使用して、または結合会合もしくは標識リガンドを使用する置換アッセイによって容易に決定され得る。

一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合よりも約２倍高いか、バックグラウンド結合よりも約５倍高いか、バックグラウンド結合よりも約１０倍高いか、バックグラウンド結合よりも約２０倍高いか、バックグラウンド結合よりも約５０倍高いか、バックグラウンド結合よりも約１００倍高いか、またはバックグラウンド結合よりも約１０００倍以上高い。

「選択的に結合する」または「選択的に結合された」または「選択的に結合すること」または「選択的に標的とする」という用語、およびは、複数の目的標的外（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）分子の存在下での１つの分子の標的分子への優先的結合（目標結合）を説明する。特定の実施形態において、ＨＥまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＨＥまたはｍｅｇａＴＡＬが目的目標外ＤＮＡ標的結合部位に結合するよりも約５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、または１０００倍多い頻度で目的標的ＤＮＡ結合部位に選択的に結合する。

「目的標的（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ）」は、標的部位配列を指す。

「目的標的外（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）」は、標的部位配列と類似しているが、同一ではない配列を指す。

「標的部位」または「標的配列」は、結合および／または切断に十分な条件が存在することを条件として結合分子が結合するおよび／または切断する核酸の部分を規定する、染色体または染色体外核酸配列である。標的部位または標的配列のただ１つのみの鎖を指すポリヌクレオチド配列または配列番号を参照する場合、ヌクレアーゼバリアントにより結合および／または切断された標的部位または標的配列は、２本鎖であり、かつ、その参照配列およびその相補配列を含むことが理解されるだろう。好ましい実施形態において、標的部位は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子内の配列である。

「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナーキャプチャを含むがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換プロセスを指す。本開示において、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を介した細胞における２本鎖の破断の修復中に起こる、かかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子をテンプレートとして使用して「標的」分子（すなわち、２本鎖の破断を経験したもの）を修復し、それがドナーから標的への遺伝情報の伝播につながることから「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に知られている。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、かかる伝播は、破損した標的とドナーとの間でのヘテロ２本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーを使用して、標的の一部となる遺伝情報を再合成する「合成依存的単鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスを伴い得る。かかる特殊なＨＲはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような標的分子の配列の改変をもたらす。

「ＮＨＥＪ」または「非相同末端結合」は、ドナー修復鋳型または相同配列の非存在下での２本鎖の破断の回復を指す。ＮＨＥＪは、破断の部位に挿入および欠失をもたらし得る。ＮＨＥＪは、いくつかの下位経路によって媒介され、これらの各々は、異なる変異結果を有する。典型的なＮＨＥＪ経路（ｃＮＨＥＪ）は、ＫＵ／ＤＮＡ－ＰＫｃｓ／Ｌｉｇ４／ＸＲＣＣ４複合体を必要とし、最小プロセシングで終端をライゲーションして元に戻し、しばしば破断の精密な修復をもたらす。代替的なＮＨＥＪ経路（ａｌｔＮＨＥＪ）もまた、ｄｓＤＮＡ破断の回復において活性であるが、これらの経路は、著しくより変異原性であり、しばしば、挿入および欠失によって特徴付けられる破断の精密ではない修復をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、例えば、エキソヌクレアーゼ、例えば、Ｔｒｅｘ２などのエンドプロセシング酵素によるｄｓＤＮＡ破断の修飾により、精密ではない修復の可能性が増加され得ることが企図される。

「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合性骨格の破断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素加水分解または化学加水分解を含むがこれらに限定されない、多様な方法によって開始され得る。１本鎖の切断および２本鎖の切断の両方が可能である。２本鎖の切断は、２つの異なる１本鎖の切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑終端または段違い終端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドおよびヌクレアーゼバリアント、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬなどは、標的化された２本鎖のＤＮＡ切断のために使用される。エンドヌクレアーゼ切断認識部位は、いずれかのＤＮＡ鎖上にあり得る。

「外因性」分子は、細胞内に通常は存在しないが、１つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞内に導入される分子である。代表的な外因性分子には、小有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子の任意の修飾された誘導体、または上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体が含まれるが、これらに限定されない。外因性分子を細胞内に導入するための方法は当業者には知られており、脂質媒介移入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含む、リポソーム）、電気穿孔、直接注射、細胞融合、粒子ボンバードメント、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈降、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介移入、およびウイルスベクター媒介移入が含まれるが、これらに限定されない。

「内因性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生段階で特定の細胞内に通常存在するものである。追加の内因性分子は、タンパク質を含み得る。

「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接するか否かにかかわらず遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を指す。遺伝子には、プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、ターミネーター、ポリアデニル化配列、転写後応答要素、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、複製起源、基質結合部位、および遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに限定されない。

「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。

本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝子修飾された」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態での外部遺伝物質の、細胞内の総遺伝物質への染色体付加または染色体外付加を指す。遺伝子修飾は、細胞のゲノム内の特定の部位に対して標的とされても標的とされなくてもよい。一実施形態において、遺伝子修飾は、部位特異的である。一実施形態において、遺伝子修飾は、部位特異的ではない。

本明細書で使用される場合、「ゲノム編集」という用語は、遺伝子または遺伝子産物の発現を回復、補正、撹乱、および／または修飾する、細胞のゲノム内の標的部位での遺伝子物質の置換、欠失、および／または導入を指す。特定の実施形態において企図されるゲノム編集は、細胞のゲノム内の標的部位で、または標的部位に近接してＤＮＡ損傷を生成するために、任意に、ドナー修復テンプレートの存在下で細胞内に１つ以上のヌクレアーゼバリアントを導入することを含む。

本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復、補正、もしくは修飾するか、または療法的なポリペプチドを発現させる目的のための細胞内の総遺伝子物質中への余分な遺伝子物質の導入を指す。特定の実施形態において、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復、補正、撹乱、もしくは修飾するか、または療法的なポリペプチドを発現させる目的のためのゲノム編集による細胞のゲノム内への遺伝子物質の導入が、考慮される遺伝子療法である。

「免疫障害」は、免疫系からの応答を喚起する疾患を指す。特定の実施形態において、「免疫障害」という用語は、癌、移植片対宿主疾患、自己免疫疾患、または免疫不全を指す。一実施形態において、免疫障害は、感染性疾患を包含する。

本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、概して、異常な細胞が制限なく分裂し、近隣組織に浸潤し得る、疾患または病態の分類を指す。

本明細書で使用される場合、「悪性」という用語は、腫瘍細胞の群が無制限の成長（すなわち、正常な限度を超えた分裂）、浸潤（すなわち、隣接組織への侵入およびその破壊）、および転移（すなわち、リンパまたは血液を介した体内の他の場所への広がり）のうちの１つ以上を示す癌を指す。

本明細書で使用される場合、「転移する」という用語は、身体の１つの部分から別の部分への癌の広がりを指す。広がった細胞によって形成される腫瘍は、「転移性腫瘍」または「転移」と呼ばれる。転移性腫瘍は、原発（一次）腫瘍と同様である細胞を含む。

本明細書で使用される場合、「良性」または「非悪性」という用語は、より大きく成長し得るが、身体の他の部分には広がらない腫瘍を指す。良性腫瘍は、自己制限的であり、典型的には、浸潤または転移しない。

「癌細胞」または「腫瘍細胞」は、癌性成長または組織の個々の細胞を指す。腫瘍は、概して、良性、前悪性、または悪性であり得る細胞の異常な成長によって形成される腫脹または病変を指す。ほとんどの癌が腫瘍を形成するが、一部、例えば、白血病は、必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成する癌に関して、癌（細胞）および腫瘍（細胞）という用語は、交換可能に使用される。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。

「移植片対宿主疾患」または「ＧＶＨＤ」は、細胞、組織、または固形臓器の移植後に起こり得る合併症を指す。ＧＶＨＤは、移植したドナー細胞が移植受容者の身体を攻撃する幹細胞移植後または骨髄移植後に起こり得る。ヒトにおける急性ＧＶＨＤは、移植後約６０日以内に起こり、細胞溶解性リンパ球の作用によって皮膚、肝臓、および内臓に損傷をもたらす。慢性的なＧＶＨＤは後に起こり、主に皮膚に影響を及ぼす全身性自己免疫疾患であり、Ｂ細胞のポリクローナル活性化、ならびにＩｇおよび自己抗体の過剰産生をもたらす。固形臓器移植片対宿主疾患患（ＳＯＴ－ＧＶＨＤ）は、２つの形態で起こる。より一般的な種類のものは、抗体による媒介であり、血液型がＯであるドナーからの抗体が、血液型がＡ、Ｂ、またはＡＢである受容者における受容者の赤血球細胞を攻撃し、軽度かつ一過性の溶血性貧血をもたらす。ＳＯＴ－ＧＶＨＤの第２の形態は、高い死亡率に関連する細胞型であり、ドナー由来のＴ細胞が、ほとんどの場合、皮膚、肝臓、胃腸管、および骨髄において免疫学的に異種の宿主組織に対する免疫学的攻撃を生み出し、これらの臓器において合併症をもたらす。

「移植片対白血病」または「ＧＶＬ」は、ドナーの移植組織、例えば、骨髄または末梢血液などに存在する免疫細胞による人の白血病細胞に対する免疫応答を指す。

「自己免疫疾患」は、身体がその自己の組織の一部の構成要素に対する免疫原性（すなわち、免疫系）応答を生み出す疾患を指す。換言すると、免疫系は、体内の一部の組織または系を「自己」として認識するその能力を喪失し、それをあたかも異物であるかのように標的とし攻撃する。自己免疫疾患の例示的な例には、関節炎、炎症性腸疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、狼瘡、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫（ａｎｔｉ－ｉｍｍｕｎｅ）甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などが含まれるが、これらに限定されない。

「免疫不全」は、疾患によってまたは化学物質の投与によって免疫系が損なわれた患者の状態を意味する。この病態では、系は、異物に対して防御するのに必要とされる血球の数および種類が欠損するようになる。免疫不全病態または疾患は当該技術分野において知られており、例えば、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全疾患）、選択的ＩｇＡ欠損症、分類不能型免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫性疾患、高ＩｇＭ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、および糖尿病が含まれる。

「感染性疾患」は、人から人へと、または生物から生物へと伝染し得、微生物またはウイルス因子によって引き起こされる疾患（例えば、感冒）を指す。感染性疾患は当該技術分野において知られており、例えば、肝炎、性行為感染症（例えば、クラミジア感染症、淋病）、結核症、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ジフテリア、肝炎Ｂ、肝炎Ｃ、コレラ、およびインフルエンザが含まれる。

本明細書で使用される場合、「個体」および「対象」という用語は、しばしば交換可能に使用され、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、遺伝子療法ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および本明細書の他の箇所で企図される方法を用いて治療され得る免疫障害の症状を呈する任意の動物を指す。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、および飼育動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が挙げられる。非ヒト霊長類、および好ましくは、ヒト対象が含まれる。典型的な対象には、免疫障害を有するか、それを有すると診断されているか、またはそれを有する危険性があるヒト患者が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、遺伝子療法ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および本明細書の他の箇所で企図される方法を用いて治療され得る免疫障害と診断されている対象を指す。

本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、疾患または病理学的状態の症状または病理に対するいずれの有益または望ましい効果も含み、治療されている疾患または病態、例えば、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全のうちの１つ以上の測定可能マーカーにおける最小限の低減さえも含み得る。治療は、任意に、疾患または病態の進行を遅延させることを伴い得る。「治療」は必ずしも、疾患もしくは病態、またはその関連する症状の完全な撲滅または治癒を指すものではない。

本明細書で使用される場合、「予防する」、および「予防」、「予防される」、「予防すること」などといった類似の語は、疾患または病態、例えば、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全の発生または再発の可能性を予防、阻害、または低減するための手法を示す。それはまた、疾患もしくは病態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは病態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用される場合、「予防」および類似の語は、疾患または病態の発症または再発前に疾患または病態の強度、影響、症状、および／または負荷を低減することも含む。

本明細書で使用される場合、「～の少なくとも１つの症状を改善すること」という語句は、対象が治療されている疾患または病態、例えば、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全のうちの１つ以上の症状を減少させることを指す。特定の実施形態において、治療されている疾患または病態は癌であり、緩和される１つ以上の症状には、衰弱、疲労、息切れ、打撲および出血の起こりやすさ、頻繁な感染、腫脹したリンパ節、膨張したまたは痛みのある腹部（肥大した腹部臓器に起因）、骨または関節痛、骨折、意図しない体重減少、食欲不振、寝汗、持続する微熱、ならびに減少した排尿（腎機能不全に起因）が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む有益または所望の予防結果または療法結果を達成するのに十分なヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の「有効な量」または「有効量」を指す。

「予防有効量」は、所望の予防結果を達成するのに十分なヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の量を指す。必須ではないが典型的には、疾患の前またはその早期に予防的用量が対象において使用されるため、予防上有効量は、治療上有効量よりも少ない。

ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を引き出す能力などの要因に応じて異なり得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果が、いずれの毒性効果または有害効果も上回るものでもある。「治療有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療」するのに有効である量を含む。療法量が示されるとき、特定の実施形態において企図される組成物の投与されるべき正確な量は、医師によって、規格に鑑みて、かつ患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および病態における個体差を考慮して決定され得る。

Ｃ．ヌクレアーゼバリアント
本明細書の特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、ＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位を編集するゲノムに好適であり、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインと、１つ以上のＤＮＡ切断ドメイン（例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼドメイン）と、任意に、本明細書で企図される１つ以上のリンカーとを含む。「再プログラム化されたヌクレアーゼ」、「遺伝子操作されたヌクレアーゼ」、または「ヌクレアーゼバリアント」という用語は交換可能に使用され、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインと１つ以上のＤＮＡ切断ドメインとを含むヌクレアーゼを指し、ヌクレアーゼは、ＣＢＬＢ遺伝子内の２本鎖ＤＮＡ標的配列と結合し、それを切断するように親ヌクレアーゼまたは自然発生するヌクレアーゼから設計および／または修飾されている。

特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、ＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６において、好ましくはＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６における配列番号２０で、およびより好ましくはＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６における配列番号２０内の配列「ＡＴＴＣ」で標的配列と結合し、それを切断する。

ヌクレアーゼバリアントは、自然発生するヌクレアーゼからか、または前のヌクレアーゼバリアントから設計および／または修飾され得る。特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５´－３´エキソヌクレアーゼ、５－３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´－５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。

ＣＢＬＢ遺伝子内の標的配列と結合し、それを切断するヌクレアーゼバリアントの例示的な例には、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）バリアントおよびｍｅｇａＴＡＬが含まれるが、これらに限定されない。

１．ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）バリアント
様々な実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、ＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位に２本鎖の破断（ＤＳＢ）を導入するように再プログラム化される。特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、ＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６において、好ましくはＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６における配列番号２０で、およびより好ましくはＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６における配列番号２０内の配列「ＡＴＴＣ」で２本鎖の破断を導入する。

「ホーミングエンドヌクレアーゼ」および「メガヌクレアーゼ」は交換可能に使用され、１２～４５個の塩基対切断部位を認識し、一般的に配列および構造モチーフに基づいて５つのファミリー、すなわちＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ－ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックス、およびＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫに分類される、自然発生するホーミングエンドヌクレアーゼを指す。

「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」または「参照メガヌクレアーゼ」は、自然界で見出される野生型ホーミングエンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼを指す。一実施形態において、「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、修飾されて、基礎活性を増加させる野生型ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。

「遺伝子操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「再プログラム化されたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント」、「遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ」、「再プログラム化されたメガヌクレアーゼ」、または「メガヌクレアーゼバリアント」は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むホーミングエンドヌクレアーゼを指し、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＣＢＬＢ遺伝子内のＤＮＡ標的配列と結合し、それを切断するように親ホーミングエンドヌクレアーゼまたは自然発生するホーミングエンドヌクレアーゼから設計および／または修飾されている。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、自然発生するホーミングエンドヌクレアーゼまたは別のホーミングエンドヌクレアーゼバリアントから設計および／または修飾され得る。特定の実施形態において企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５´－３´エキソヌクレアーゼ、５－３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´－５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。

ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントは、自然界に存在せず、組換えＤＮＡ技術によってまたはランダム変異誘発によって得ることができる。ＨＥバリアントは、自然発生するＨＥまたはＨＥバリアントにおいて、１つ以上のアミノ酸改変を作製することによって、例えば、１つ以上のアミノ酸を変異させる、置換する、付加する、または欠失させることによって、得られてもよい。特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースに対する１つ以上のアミノ酸改変を含む。

特定の実施形態において企図されるＨＥバリアントは、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５´－３´エキソヌクレアーゼ、５－３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´－５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、５´－３´エキソヌクレアーゼ、５´－３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´－５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素と共にＴ細胞内に導入される。ＨＥバリアントおよび３´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、あるいはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。

「ＤＮＡ認識インターフェース」は、核酸標的塩基と相互作用するＨＥアミノ酸残基、ならびに隣接している残基を指す。各ＨＥに関して、ＤＮＡ認識インターフェースは、側鎖－側鎖間および側鎖－ＤＮＡ接触点間の広範囲のネットワークを含み、これらのほとんどは、特定の核酸標的配列を認識するために必然的に固有である。したがって、特定の核酸配列に対応するＤＮＡ認識インターフェースのアミノ酸配列は、著しく異なり、任意の天然またはＨＥバリアントの特徴である。非限定的な例として、特定の実施形態において企図されるＨＥバリアントは、天然ＨＥ（または以前に生成されたＨＥバリアント）のＤＮＡ認識インターフェースに局在する１つ以上のアミノ酸残基が変化に富む、ＨＥバリアントのライブラリを構築することによってもたらされ得る。ライブラリは、開裂アッセイを用いて、各々予測されるＣＢＬＢ標的部位に対する標的切断活性についてスクリーニングされてもよい（例えば、Ｊａｒｊｏｕｒｅｔａｌ．，２００９．Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３７（２０）：６８７１－６８８０を参照されたい）。

ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）は、最も詳細に研究されているホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーであり、主に古細菌においてならびに緑藻類および真菌類のオルガネラＤＮＡにおいてコードされ、最も高い全体的なＤＮＡ認識特異性を示す。ＬＨＥは、タンパク質鎖１つあたり１つまたは２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ触媒モチーフを含み、それぞれホモ二量体または単鎖単量体として機能する。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質の構造的研究により、αββαββα折り畳みを特徴とする、高度に保存されたコア構造が特定され（Ｓｔｏｄｄａｒｄ２００５）、このうちＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフは、この折り畳みの第１のヘリックスに属する。ＬＨＥによる高度に効率的および特異的な切断は、新規の高度に特異的なエンドヌクレアーゼを得るためのタンパク質足場を表す。しかしながら、非天然または非標準的な標的部位に結合し、それを切断するようＬＨＥを遺伝子操作することは、適切なＬＨＥ足場の選択、標的遺伝子座の検査、推定標的部位の選択、ならびに標的部位における塩基対位置のうちの最大３分の２でのそのＤＮＡ接触点および切断特異性を改変するためのＬＨＥの大規模な改変を必要とする。

一実施形態において、再プログラム化されたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントが設計される元となり得るＬＨＥとしては、Ｉ－ＣｒｅＩおよびＩ－ＳｃｅＩが挙げられるが、これらに限定されない。

再プログラム化されたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントが設計される元となり得るＬＨＥの実例としては、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、およびＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、再プログラム化されたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＣｐａＭＩバリアント、Ｉ－ＨｊｅＭＩバリアント、Ｉ－ＯｎｕＩバリアント、Ｉ－ＰａｎＭＩバリアント、およびＩ－ＳｍａＭＩバリアントからなる群から選択される。

一実施形態において、再プログラム化されたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントである。例えば、配列番号６～１２を参照されたい。

一実施形態において、ＣＢＬＢ遺伝子を標的とする再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩ
ＬＨＥまたはＩ－ＯｎｕＩバリアントは、天然のＩ－ＯｎｕＩまたはその生物学的に活性な断片（配列番号１～５）から生成された。好ましい実施形態において、ヒトＣＢＬＢ遺伝子を標的とする再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩＬＨＥまたはＩ－ＯｎｕＩバリアントは、既存のＩ－ＯｎｕＩバリアントから生成された。一実施形態において、再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩＬＨＥは、配列番号２０に示されるヒトＣＢＬＢ遺伝子標的部位に対して生成された。

特定の実施形態において、ヒトＣＢＬＢ遺伝子と結合し、それを切断する再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩＬＨＥまたはＩ－ＯｎｕＩバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＣＢＬＢ遺伝子と結合し、それを切断するＩ－ＯｎｕＩＬＨＥは、Ｉ－ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ
ｅｔａｌ．２０１１．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵ．Ｓ．Ａ．２０１１Ａｕｇ９；１０８（３２）：１３０７７－１３０８２）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェースとの少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。

一実施形態において、ヒトＣＢＬＢ遺伝子と結合しそれを切断するＩ－ＯｎｕＩＬＨＥは、Ｉ－ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉｅｔａｌ．２０１１．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵ．Ｓ．Ａ．２０１１Ａｕｇ９；１０８（３２）：１３０７７－１３０８２）もしくは配列番号６～１２に示されるＩ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェースとの少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を含む。

特定の実施形態において、ヒトＣＢＬＢ遺伝子と結合し、それを切断するＩ－ＯｎｕＩ
ＬＨＥバリアントは、配列番号１～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩ、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェースにおいて１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。

特定の実施形態において、ヒトＣＢＬＢ遺伝子と結合し、それを切断するＩ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェース、特に、位置２４～５０、６８～８２、１８０～２０３、および２２３～２４０に位置するサブドメインにおいて１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、１個以上のアミノ酸置換を、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのバリアントの２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置のＤＮＡ認識インターフェースにおいて含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、１個以上のアミノ酸置換を、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのバリアントの１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。

特定の実施形態において、ヒトＣＢＬＢ遺伝子と結合し、それを切断するＩ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェース、特に、位置２４～５０、６８～８２、１８０～２０３、および２２３～２４０に位置するサブドメインにおいて、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、または４０個以上のアミノ酸置換または修飾を含む。

特定の実施形態において、ヒトＣＢＬＢ遺伝子と結合し、それを切断するＩ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、または４０個以上のアミノ酸置換または修飾を、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのバリアントの２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。

特定の実施形態において、ヒトＣＢＬＢ遺伝子と結合し、それを切断するＩ－ＯｎｕＩ
ＬＨＥバリアントは、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、または４０個以上のアミノ酸置換または修飾を、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのバリアントの１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。

一実施形態において、ヒトＣＢＬＢ遺伝子と結合し、それを切断するＩ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ配列全体のどこにでも位置する追加の位置に１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。置換されかつ／または修飾され得る残基としては、核酸標的に接触する、または直接もしくは水分子を介して核酸骨格もしくはヌクレオチド塩基と相互作用するアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。１つの非限定的な例において、ヒトＣＢＬＢ遺伝子と結合し、それを切断する本明細書で企図されるＩ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、１個以上の置換および／または修飾、好ましくは少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３０個、さらにより好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのバリアントの位置：２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７８、８０、９２、１１６、１３８、１４３、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２３６、および２３８からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置で含む。

ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＣＢＬＢエクソン６標的部位を切断し、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｄ、Ｒ２８Ｙ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ａ、Ｎ３２Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｋ３４Ｖ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｖ３７Ｓ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ａ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｄ９２Ｇ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｖ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｋ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１８８Ｎ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｐ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｋ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、ＣＢＬＢ標的部位を切断し、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ａ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｖ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｋ１９１Ｐ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＣＢＬＢ標的部位を切断し、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ａ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＣＢＬＢ標的部位を切断し、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｄ９２Ｇ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＣＢＬＢ標的部位を切断し、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｖ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＣＢＬＢ標的部位を切断し、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｙ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ｓ、Ｋ３４Ｖ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＣＢＬＢ標的部位を切断し、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｖ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｖ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｋ１９１Ｐ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＣＢＬＢ標的部位を切断し、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ａ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ａ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ａ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｑ、Ｄ９２Ｇ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｍ、Ｎ１８４Ｅ、Ｉ１８６Ｍ、Ｓ１８８Ｎ、Ｓ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ｖ、Ｇ１９３Ｉ、Ｑ１９５Ｒ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｖ、Ｋ２２７Ｎ、Ｆ２３２Ｈ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｉのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。

特定の実施形態において、ヒトＣＢＬＢ遺伝子と結合し、それを切断するＩ－ＯｎｕＩ
ＬＨＥバリアントは、配列番号６～１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、もしくはさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、配列番号６～１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、配列番号６に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、配列番号７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、配列番号９に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。

２．ｍａｇａＴＡＬ
様々な実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むｍｅｇａＴＡＬは、ＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位に２本鎖の破断（ＤＳＢ）を導入するように再プログラム化される。特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６において、好ましくはＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６における配列番号２０で、およびより好ましくはＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６における配列番号２０内の配列「ＡＴＴＣ」でＤＳＢを導入する。

「ｍｅｇａＴＡＬ」は、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと、ＣＢＬＢ遺伝子内のＤＮＡ標的配列と結合し、それを切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むポリペプチドを指し、任意に、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５－３´エキソヌクレアーゼ、５－３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３－５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含む。

特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、５´－３´エキソヌクレアーゼ、５´－３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´－５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素と共に、細胞内に導入され得る。ｍｅｇａＴＡＬおよび３´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、あるいはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。

「ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン」は、植物の転写物を操作するために植物の転写活性化因子を模倣する、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥまたはＴＡＬ－エフェクター）のＤＮＡ結合部分である（例えば、Ｋａｙｅｔａｌ．，２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：６４８－６５１を参照されたい）。特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインは、デノボで、または自然発生するＴＡＬＥ、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｇａｒｄｎｅｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓａｌｆａｌｆａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅ由来のＡｖｒＢｓ３から、ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来のｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７から、遺伝子操作される。ＤＮＡ結合ドメインを誘導し、設計するためのＴＡＬＥタンパク質の例示的な例は、米国特許第９，０１７，９６７号、およびそこで引用される参考文献に開示され、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインの、その対応する標的ＤＮＡ配列への結合に関与する１つ以上の繰り返し単位を含むＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインを含む。単一の「繰り返し単位」（「繰り返し」とも称される）は、典型的には、３３～３５アミノ酸長である。各ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位は、典型的には、繰り返しの位置１２および／または１３に、繰り返し可変Ｄｉ－残基（ＲｅｐｅａｔＶａｒｉａｂｌｅＤｉ－Ｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）を構成する１つまたは２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ認識のための天然（標準的）コードは、位置１２および１３のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように、決定されている。ある特定の実施形態において、非標準的（非典型）ＲＶＤが企図される。

特定の実施形態において企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおいて使用するのに好適な非標準的ＲＶＤの例示的な例には、グアニン（Ｇ）の認識のためのＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、ＳＳ、ＮＮ、ＳＮ、ＫＮ；アデニン（Ａ）の認識のためのＮＩ、ＫＩ、ＲＩ、ＨＩ、ＳＩ；チミン（Ｔ）の認識のためのＮＧ、ＨＧ、ＫＧ、ＲＧ；シトシン（Ｃ）の認識のためのＲＤ、ＳＤ、ＨＤ、ＮＤ、ＫＤ、ＹＧ；ＡまたはＧの認識のためのＮＶ、ＨＮ；およびＡまたはＴまたはＧまたはＣの認識のためのＨ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、Ｓ＊［（＊）は、位置１３にアミノ酸が不在であることを意味する］が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおいて使用するのに好適なＲＶＤの追加の例示的な例としては、米国特許第８，６１４，０９２号に開示されるものがさらに挙げられ、これはその全体において参照により本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３～３０個の繰り返し単位を含むＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５～１５個の繰り返し単位、より好ましくは７～１５個の繰り返し単位、より好ましくは９～１５個の繰り返し単位、およびより好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の繰り返し単位を含むＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインを含む。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３～３０個の繰り返し単位を含むＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと、１組のＴＡＬＥ繰り返し単位のＣ末端に位置する２０個のアミノ酸を含む追加の単一の切断短縮型ＴＡＬＥ繰り返し単位、すなわち、追加のＣ末端ハーフＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位（本明細書の他の箇所で開示される（下記を参照）Ｃキャップのアミノ酸－２０～－１）とを含む。したがって、特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３．５～３０．５個の繰り返し単位を含むＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５個のＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５．５～１５．５個の繰り返し単位、より好ましくは７．５～１５．５個の繰り返し単位、より好ましくは９．５～１５．５個の繰り返し単位、およびより好ましくは９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、または１５．５個の繰り返し単位を含むＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインを含む。

特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドと、１つ以上のＴＡＬＥ繰り返しドメイン／単位と、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドと、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むＴＡＬエフェクター構造を含む。いくつかの実施形態において、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ繰り返し、および／またはＣＴＤドメインは、同じ種に由来する。他の実施形態において、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ繰り返し、および／またはＣＴＤドメインのうちの１つ以上は、異なる種に由来する。

本明細書で使用される場合、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドという用語は、自然発生するＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＮＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも１２０個～少なくとも１４０個以上のアミノ酸を含む（０は、最もＮ末端側の繰り返し単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または少なくとも１４０個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約＋１～＋１２２から少なくとも約＋１～＋１３７のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端側の繰り返し単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＲａｌｓｔｏｎｉａＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸＋１～＋１２１のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端側の繰り返し単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＲａｌｓｔｏｎｉａＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。

本明細書で使用される場合、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドという用語は、自然発生するＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＣＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインの最後の完全繰り返しに対してＣ末端側に少なくとも２０～少なくとも８５またはそれよりも多くのアミノ酸を含む（最初の２０個のアミノ酸は、最後のＣ末端完全繰り返し単位に対してＣ末端側のハーフ繰り返し単位である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインの最後の完全繰り返しに対してＣ末端側に少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または少なくとも８５個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約－２０～－１のＣＴＤポリペプチドを含む（－２０は、最後のＣ末端完全繰り返し単位に対してＣ末端側のハーフ繰り返し単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインの最後の完全繰り返しに対してＣ末端側に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＲａｌｓｔｏｎｉａＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約－２０～－１のＣＴＤポリペプチドを含む（－２０は、最後のＣ末端完全繰り返し単位に対してＣ末端側のハーフ繰り返し単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＲａｌｓｔｏｎｉａＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインの最後の完全繰り返しに対してＣ末端側に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、標的配列と結合するように遺伝子操作されたＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインを含む融合ポリペプチドと、標的配列と結合し、それを切断するように再プログラム化されたホーミングエンドヌクレアーゼと、任意に、本明細書の他の箇所で企図される１つ以上のリンカーポリペプチドと任意に互いに結合するＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドとを含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと、任意に、ＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドとを含むｍｅｇａＴＡＬが、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントにさらに融合されるリンカーポリペプチドに融合されることが企図される。したがって、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントのＤＮＡ結合ドメインが結合した標的配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド以内離れているＤＮＡ標的配列と結合する。このようにして、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ゲノム編集の特異性および効率を増加させる。

一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントと、再プログラム化されたホーミングエンドヌクレアーゼの結合部位の約４、５、または６ヌクレオチド以内、好ましくは、５または６ヌクレオチド上流であるヌクレオチド配列と結合するＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインとを含む。

一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントと、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントが結合および切断するヌクレオチド配列（配列番号２０）の５ヌクレオチド上流である（すなわち、ＴＡＬＥ結合部位とＨＥ結合部位との間に４個のヌクレオチドが存在する）、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列と結合するＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインとを含む。好ましい実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬ標的配列は、配列番号２２である。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、１つ以上のＴＡＬＥＤＮＡ結合繰り返し単位と、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、Ｉ－Ｖｄｉ１４１Ｉ、およびそれらのバリアント、または好ましくはＩ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、およびそれらのバリアント、またはより好ましくはＩ－ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥから設計または再プログラム化されたＬＨＥバリアントとを含む。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤと、１つ以上のＴＡＬＥＤＮＡ結合繰り返し単位と、ＣＴＤと、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、Ｉ－Ｖｄｉ１４１Ｉ、およびそれらのバリアント、または好ましくはＩ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、およびそれらのバリアント、またはより好ましくはＩ－ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥバリアントとを含む。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤと、約９．５個～約１５．５個のＴＡＬＥＤＮＡ結合繰り返し単位と、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、Ｉ－Ｖｄｉ１４１Ｉ、およびそれらのバリアント、または好ましくはＩ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、およびそれらのバリアント、またはより好ましくはＩ－ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥバリアントとを含む。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、約１２２個のアミノ酸～１３７個のアミノ酸のＮＴＤと、約９．５、約１０．５、約１１．５、約１２．５、約１３．５、約１４．５、または約１５．５個の結合繰り返し単位と、約２０個のアミノ酸～約８５個のアミノ酸のＣＴＤと、Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントとを含む。特定の実施形態において、ＮＴＤ、ＤＮＡ結合ドメイン、およびＣＴＤのいずれか１つ、２つ、または全ては、任意の好適な組み合わせで同じ種または異なる種から設計され得る。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、配列番号１３～１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合タンパク質は、配列番号１３～１９および３８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインを含み、Ｉ－ＯｎｕＩＬＨＥバリアントは、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列と結合し、それを切断する。

３．エンドプロセシング酵素
特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセシング酵素の１つ以上のコピーを使用して細胞ゲノムを編集することを含む。特定の実施形態において、単一のポリヌクレオチドは、リンカー、自己切断型ペプチド配列、例えば、２Ａ配列によって、またはＩＲＥＳ配列によって分離されたホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセシング酵素をコードする。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドと、エンドプロセシング酵素をコードする別個のポリヌクレオチドとを含む。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドと、単一の融合ポリペプチド中にエンドプロセシング酵素とを含む。一実施形態において、融合ポリペプチドは、ｍｅｇａＴＡＬと、エンドプロセシング酵素の１つ以上のコピーとを含み、各々が自己切断型ペプチドによって分離される。

「エンドプロセシング酵素」という用語は、ポリヌクレオチド鎖の曝露された終端を修飾する酵素を指す。ポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの２本鎖ハイブリッド、ならびに合成ＤＮＡ（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ以外の塩基を含有する）であり得る。エンドプロセシング酵素は、１つ以上のヌクレオチドを付加すること、１つ以上のヌクレオチドを除去すること、リン酸基を除去するかもしくは修飾すること、および／またはヒドロキシル基を除去するかもしくは修飾することによって、曝露されたポリヌクレオチド鎖終端を修飾し得る。エンドプロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位の終端、または他の化学的もしくは機械的手段、例えば、せん断（例えば、微細ゲージの針を通すこと、加熱すること、超音波処理すること、小型ビーズ振とう、および噴霧することによる）、電離化放射、紫外線照射、酸素ラジカル、化学的加水分解、および化学療法剤によって生成された終端で修飾し得る。

特定の実施形態において、特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、およびＤＮＡエンドプロセシング酵素を使用して細胞ゲノムを編集することを含む。

「ＤＮＡエンドプロセシング酵素」という用語は、ＤＮＡの曝露された終端を修飾する酵素を指す。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、平滑終端または段違い終端（５´または３´の突出を有する終端）を修飾し得る。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、１本鎖または２本鎖ＤＮＡを修飾し得る。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位の終端、または他の化学的もしくは機械的手段、例えば、せん断（例えば、微細ゲージの針を通すこと、加熱すること、超音波処理すること、小型ビーズ振とう、および噴霧することによる）、電離化放射、紫外線照射、酸素ラジカル、化学的加水分解、および化学療法剤によって生成された終端で修飾し得る。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、１つ以上のヌクレオチドを付加すること、１つ以上のヌクレオチドを除去すること、リン酸基を除去するかもしくは修飾すること、および／またはヒドロキシル基を除去するかもしくは修飾することによって、曝露されたＤＮＡ終端を修飾し得る。

本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なＤＮＡエンドプロセシング酵素の例示的な例は、５´－３´エキソヌクレアーゼ、５´－３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´－５´エキソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なＤＮＡエンドプロセシング酵素の追加の例示的な例には、Ｔｒｅｘ２、Ｔｒｅｘ１、膜貫通ドメイン無しのＴｒｅｘ１、Ａｐｏｌｌｏ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ２、Ｅｘｏ１、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＩＩＩ、Ｆｅｎ１、Ｆａｎ１、ＭｒｅＩＩ、Ｒａｄ２、Ｒａｄ９、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ＰＮＫＰ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｓｏｘ、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ＮＤＫ１、ＮＤＫ５、ＮＤＫ７、ＮＤＫ８、ＷＲＮ、Ｔ７－エキソヌクレアーゼ遺伝子６、トリ骨髄芽球症ウイルス組み込みタンパク質（ＩＮ）、Ｂｌｏｏｍ、南極ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＡｐｅＩ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｈｅｘ１、ＴＴＲＡＰ（ＴＤＰ２）、Ｓｇｓ１、Ｓａｅ２、ＣＵＰ、Ｐｏｌｍｕ、Ｐｏｌラムダ、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＥＭＥ２、ＳＬＸ１、ＳＬＸ４、およびＵＬ－１２が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物および細胞ゲノムを編集するための方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、およびエキソヌクレアーゼを含むポリペプチドを含む。「エキソヌクレアーゼ」という用語は、３´または５´終端のいずれかでホスホジエステル結合を破断する加水分解反応を介してポリヌクレオチド鎖の終端でホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。

本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なエキソヌクレアーゼの例示的な例には、ｈＥｘｏＩ、酵母ＥｘｏＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＥｘｏＩ、ｈＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ２、ラットＴＲＥＸ２、ｈＴＲＥＸ１、マウスＴＲＥＸ１、およびラットＴＲＥＸ１が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、３´または５´エキソヌクレアーゼ、好ましくはＴｒｅｘ１またはＴｒｅｘ２、より好ましくはＴｒｅｘ２、さらにより好ましくはヒトまたはマウスＴｒｅｘ２である。

Ｄ．標的部位
特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、任意の好適な標的配列に結合するように設計され得、かつ自然発生するヌクレアーゼと比較して、新規の結合特異性を有し得る。特定の実施形態において、標的部位は、プロモーター、エンハンサー、抑制要素などを含むがこれらに限定されない遺伝子の調節領域である。特定の実施形態において、標的部位は、遺伝子のコード領域またはスプライス部位である。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、遺伝子の発現を下方調節または減少するように設計される。特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよびドナー修復テンプレートは、所望の標的配列を修復または欠失するように設計され得る。

様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、ヒトカシータスＢ系統（Ｃｂｌ）リンパ腫癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）遺伝子内の標的配列と結合し、それを切断する。ＣＢＬはまた、ＣＢＬ２；若年性骨髄単球性白血病（ＮＳＬＬ）を伴うかまたは伴わないヌーナン症候群類縁疾患；Ｃ－ＣＢＬ；ＲＩＮＧフィンガータンパク質５５（ＲＮＦ５５）；脆弱部位、葉酸型、稀な、ｆｒａ（１１）（ｑ２３．３）（ＦＲＡ１１Ｂ）；Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＣＢＬ；Ｃａｓ－Ｂｒ－Ｍ（マウス）エコトロピックレトロウイルス形質転換配列；Ｃｂｌ癌原遺伝子、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ；ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチントランスフェラーゼＣＢＬ；カシータスＢ系統リンパ腫癌原遺伝子；癌遺伝子ＣＢＬ２；癌原遺伝子ｃ－Ｃｂｌ；およびシグナル伝達タンパク質ＣＢＬとも称される。

この遺伝子は、ＲＩＮＧフィンガーＥ３ユビキチンリガーゼをコードする癌原遺伝子である。コードされたタンパク質は、プロテアソームによる分解のために基質を標的とするのに必要とされる酵素のうちの１つである。このタンパク質は、酵素（Ｅ２）を複合体化するユビキチンから特定の基質へのユビキチンの移動を媒介する。このタンパク質はまた、多数のチロシンリン酸化基質と相互作用することを可能し、かつプロテアソーム分解のためにそれらを標的とするＮ末端ホスホチロシン結合ドメインを含む。ＣＢＬＢは、Ｔ細胞活性化および持続性を含む、多くのシグナル伝達経路の負の調節因子として機能する。

特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位に２本鎖の破断（ＤＳＢ）を導入する。特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６において、好ましくはＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６における配列番号２０で、およびより好ましくはＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６における配列番号２０内の配列「ＡＴＴＣ」でＤＳＢを導入する。

好ましい実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、２本鎖ＤＮＡを開裂し、ＤＳＢを配列番号２０または２２に示されるポリヌクレオチド配列に導入する。

好ましい実施形態において、ＣＢＬＢ遺伝子は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子である。

Ｅ．ドナー修復テンプレート
ヌクレアーゼバリアントは、標的配列にＤＳＢを導入するために使用され得、ＤＳＢは、１つ以上のドナー修復テンプレートの存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を通して修復され得る。

様々な実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。

様々な実施形態において、異なる免疫抑制経路を標的とする免疫力エンハンサーおよび／または免疫抑制シグナルダンパーを独立してコードする複数のドナー修復テンプレートの存在下で、細胞に遺伝子操作されたヌクレアーゼを提供することによって、療法的有効性および持続性の増加を有するゲノム編集されたＴ細胞をもたらすことが企図される。例えば、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ３、ＩＬ－１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、およびＴＧＦβＲＩＩ経路の組み合わせを標的とする免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルは、特定の実施形態において好ましい場合がある。

特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ゲノムに配列を挿入するために使用される。特定の好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ゲノム内の配列を修復または修飾するために使用される。

様々な実施形態において、ドナー修復テンプレートは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、ＩＤＬＶなど、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、またはドナー修復テンプレートを含むワクシニアウイルスベクターで細胞を形質導入することによって、造血細胞、例えば、Ｔ細胞内に導入される。

特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢ部位に隣接する１つ以上の相同アームを含む。

本明細書で使用される場合、「相同アーム」という用語は、標的部位でヌクレアーゼによって導入されたＤＮＡ破断に隣接するＤＮＡ配列と同一、またはほぼ同一であるドナー修復テンプレート内の核酸配列を指す。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＮＡ破断部位のＤＮＡ配列５´と同一またはほぼ同一である核酸配列を含む５´相同アームを含む。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＮＡ破断部位のＤＮＡ配列３´と同一、またはほぼ同一である核酸配列を含む３´相同アームを含む。好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５´相同アームおよび３´相同アームを含む。ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢ部位と直接隣接するゲノム配列に対する相同性、またはＤＳＢ部位から任意の塩基対数内のゲノム配列に対する相同性を含んでもよい。特定の実施形態において、一対の相同アームは、標的部位の再切断を最小化するために標的部位において変異を有する２本鎖の破断の標的部位を含むポリヌクレオチド配列を含む相同アームを含む。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、相同配列の任意の介在する長さを含む、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２５ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約５０００ｂｐ、約１００００ｂｐ以上のゲノム配列または相同アームに対して相同な核酸配列を含む。

特定の実施形態において企図される相同アームの好適な長さの例示的な例は、独立して選択され得、相同アームの全ての介在する長さを含む、５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２５ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約２６００ｂｐ、約２７００ｂｐ、約２８００ｂｐ、約２９００ｂｐ、または約３０００ｂｐ以上の相同アームが含まれるが、これらに限定されない。

好適な相同アーム長さの追加の例示的な例には、相同アームの全ての介在する長さを含む、約１００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約２００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約３００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約４００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ～約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ～約１５００ｂｐ、または約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐが含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、５´および３´相同アームの長さは、独立して、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐから選択される。一実施形態において、５´相同アームは約１５００ｂｐであり、３´相同アームは約１０００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約２００ｂｐ～約６００ｂｐであり、３´相同アームは約２００ｂｐ～約６００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約２００ｂｐであり、３´相同アームは約２００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約３００ｂｐであり、３´相同アームは約３００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約４００ｂｐであり、３´相同アームは約４００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約５００ｂｐであり、３´相同アームは約５００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約６００ｂｐであり、３´相同アームは約６００ｂｐである。

ドナー修復テンプレートは、特定の実施形態において、１つ以上の発現カセットを含み得る。ある特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、１つまたは相同アームと、これらに限定されないが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにエピトープタグを含む１つ以上のポリヌクレオチドとを含み得る。

様々な実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５´相同アームと、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、３´相同アームとを含む。

様々な実施形態において、標的部位は、５´相同アームと、自己切断型ウイルスペプチド、例えば、Ｔ２Ａ、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体、任意に、ポリ（Ａ）シグナルもしくは自己切断型ペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、３´相同アームとを含むドナー修復テンプレートで修飾され、ここで、１つ以上のポリヌクレオチドの発現は、内因性ＣＢＬＢプロモーターによって支配される。

１．免疫力エンハンサー
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、免疫力エンハンサーをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートの存在下でＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによって免疫抑制因子に対してより強力かつ／または耐性を有するように作製される。本明細書で使用される場合、「免疫力エンハンサー」という用語は、Ｔ細胞の活性化および／または機能を刺激および／または増強する非天然分子、免疫賦活因子、ならびにＴ細胞または他の免疫細胞内に腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルを免疫刺激シグナルに変換する非天然ポリペプチドを指す。

特定の実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子；サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、および／またはサイトカイン受容体を含むがこれらに限定されない免疫賦活因子；ならびにフリップ受容体からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、免疫力エンハンサー、免疫賦活因子、またはフリップ受容体は、タンパク質不安定化ドメインを含む融合ポリペプチドである。

ａ．二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子をコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートの存在下で、ＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによってより強力になるように作製される。ＢｉＴＥ分子は、本明細書の他の箇所で企図される、標的抗原、リンカー、またはスペーサーに結合する第１の結合ドメインと、免疫エフェクター細胞上の刺激または共刺激分子に結合する第２の結合ドメインとを含む二分分子である。第１および第２の結合ドメインは、独立して、リガンド、受容体、抗体またはその抗原結合断片、レクチン、および炭水化物から選択され得る。

特定の実施形態において、第１および第２の結合ドメインは、抗原結合ドメインである。

特定の実施形態において、第１および第２の結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態において、第１および第２の結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。

特定の実施形態において第１の結合ドメインによって認識および結合され得る標的抗原の例示的な例には、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ－Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、ラムダ、ルイス－Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ－１が含まれるが、これらに限定されない。

標的抗原の他の例示的な実施形態は、ＭＨＣ－ペプチド複合体を含み、任意に、ここで、ペプチドは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＭＡＧＥ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、ラムダ、ルイス－Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ－１から処理される。

特定の実施形態において第２の結合ドメインによって認識および結合される免疫エフェクター細胞上の刺激または共刺激分子の例示的な例には、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７８が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、ＤＳＢは、遺伝子操作されたヌクレアーゼによってＣＢＬＢ遺伝子において誘導され、ＢｉＴＥをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートは細胞内に導入され、相同組換えによってＣＢＬＢ遺伝子内に挿入される。

ｂ．免疫賦活因子
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、ゲノム編集された細胞または腫瘍微小環境における細胞のいずれかにおいて免疫賦活因子を増加させることによってより強力になるように作製される。免疫賦活因子は、免疫エフェクター細胞における免疫応答を増強する特定のサイトカイン、ケモカイン、サイトキシン、およびサイトカイン受容体を指す。一実施形態において、Ｔ細胞は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、またはサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートの存在下で、ＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。

特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＩＬ－２、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＴＮＦ－αからなる群から選択されるサイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む。

特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－３、およびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるケモカインをコードするポリヌクレオチドを含む。

特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢからなる群から選択される細胞毒素をコードするポリヌクレオチドを含む。

特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、およびＩＬ－２１受容体からなる群から選択されるサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。

ｃ．フリップ受容体
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、腫瘍微小環境によって誘発される免疫抑制因子による免疫抑制シグナルを陽性免疫刺激シグナルに「フリップすること」または「逆にすること」による疲弊に対してより強力になるように作製される。一実施形態において、Ｔ細胞は、フリップ受容体をコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートの存在下で、ＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。本明細書で使用される場合、「フリップ受容体」という用語は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをＴ細胞内の免疫刺激シグナルに変換する非天然ポリペプチドを指す。好ましい実施形態において、フリップ受容体は、免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫刺激シグナルをＴ細胞に伝達する細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。

一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫抑制サイトカインと結合する細胞外ドメインまたは細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫賦活サイトカイン受容体の細胞内ドメインとを含むフリップ受容体をコードする。

特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－８受容体、ＩＬ－１０受容体、ＩＬ－１３受容体、ＴＧＦβ受容体１、またはＴＧＦβ受容体２の細胞外サイトカイン結合ドメインである免疫抑制サイトカインと結合する細胞外ドメインと、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、またはＩＬ－２１受容体から単離される膜貫通と、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、またはＩＬ－２１受容体から単離される細胞内ドメインとを含む。

特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＧＦβ受容体１、またはＴＧＦβ受容体２に結合する抗体またはその抗原結合断片である免疫抑制サイトカインと結合する細胞外ドメインと、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＴＧＦβ受容体１、またはＴＧＦβ受容体２、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、またはＩＬ－２１受容体から単離される膜貫通と、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、またはＩＬ－２１受容体から単離される細胞内ドメインとを含む。

一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または主要シグナル伝達ドメインとを含むフリップ受容体を含む。

特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態において使用するのに好適な細胞外ドメインの例示的な例としては、ＩＴＩＭおよび／またはＩＴＳＭを含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインが挙げられるが、これに限定されない。

特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態において使用するのに好適な細胞外ドメインのさらなる例示的な例としては、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２、ＴＲＡＩＬＲ１、ＲＣＡＳ１Ｒ、およびＦＡＳの細胞外リガンド結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、細胞外ドメインは、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲＩ、およびＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。

一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫抑制サイトカインと結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または主要シグナル伝達ドメインとを含むフリップ受容体を含む。

特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態において使用するのに好適な膜通ドメインの例示的な例としては、タンパク質：ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲＩ、およびＴＧＦβＲＩＩＴ細胞受容体、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４のアルファまたはベータ鎖膜貫通ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。

様々な実施形態において、フリップ受容体は、免疫刺激シグナルを誘発する細胞内ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「細胞内ドメイン」という用語は、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、共刺激シグナル伝達ドメイン、主要シグナル伝達ドメイン、またはＴ細胞において免疫刺激シグナルを誘発することと関連する、別の細胞内ドメインが挙げられるが、これらに限定されない、免疫刺激モチーフまたはドメインを指す。

特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態において使用するのに好適な細胞内ドメインの例示的な例としては、ＩＴＡＭモチーフを含むドメインが挙げられるが、これに限定されない。

特定の実施形態で企図されるフリップ受容体の特定の実施形態において使用するのに好適な細胞内ドメインの追加の例示的な例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、またはＺＡＰ７０から単離される共刺激シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態において使用するのに好適な細胞内ドメインの追加の例示的な例としては、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、またはＩＬ－２１受容体から単離される細胞内ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態において使用するのに好適な細胞内ドメインのさらなる例示的な例としては、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄから単離される主要シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲＩ、またはＴＧＦβＲＩＩからの細胞外ドメインを含む細胞外ドメインと、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、またはＩＬ－２１受容体から単離された細胞内ドメインとを含む。

特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲＩ、またはＴＧＦβＲＩＩからの細胞外ドメインを含む細胞外ドメインと、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＧＦβＲＩ、およびＴＧＦβＲＩＩからの膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。

特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、またはＴＧＦβＲＩＩからの細胞外ドメインを含む細胞外ドメインと、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７からの膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。

２．免疫抑制シグナルダンパー
既存の養子細胞療法を悩ませるある限定または問題は、腫瘍微小環境によって媒介された疲弊による免疫エフェクター細胞の低応答性である。疲弊したＴ細胞は、ナイーブ、エフェクターまたはメモリーＴ細胞と著しく異なる固有の分子シグネチャを有する。それらは、減少したサイトカイン発現およびエフェクター機能を有するＴ細胞として定義される。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、免疫抑制因子によるシグナル伝達を減少または減衰することによって疲弊に対してより耐性を有するように作製される。一実施形態において、Ｔ細胞は、免疫抑制シグナルダンパーをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートの存在下で、ＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。

本明細書で使用される場合、「免疫抑制シグナルダンパー」という用語は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルのＴ細胞への伝達を減少させる非天然ポリペプチドを指す。一実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子と結合する抗体またはその抗原結合断片である。好ましい実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ダンパーが、免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインと、任意選択で、膜貫通ドメインと、任意選択で、修飾細胞内ドメイン（例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含むため、特定の免疫抑制因子またはシグナル伝達経路への抑制する、抑える、または優性ネガティブ効果を誘発するポリペプチドを指す。

特定の実施形態において、細胞外ドメインは、免疫抑制因子を認識および結合する細胞外結合ドメインである。

特定の実施形態において、修飾細胞内ドメインは、免疫抑制シグナルを減少または阻害するように変異される。好適な変異戦略には、アミノ酸置換、付加、または欠失が含まれるが、これらに限定されない。好適な変異には、さらに、シグナル伝達ドメインを除去するための細胞内ドメイン切断短縮、シグナル伝達モチーフ活性にとって重要な残基を除去するための変異細胞内ドメイン、および受容体循環を遮断するための変異細胞内ドメインが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、細胞内ドメインは、存在するとき、免疫抑制シグナルを伝達しないか、または実質的に低減されたシグナル伝達を有する。

したがって、いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、腫瘍微小環境から１つ以上の免疫抑制因子のためのシンクの役割を果たし、Ｔ細胞において対応する免疫抑制シグナル伝達経路を阻害する。

１つの免疫抑制シグナルは、トリプトファン異化によって媒介される。癌細胞においてインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）によるトリプトファン異化は、腫瘍微小環境におけるＴ細胞への免疫抑制効果を有することが示されているキヌレニンの産生をもたらす。例えば、Ｐｌａｔｔｅｎｅｔａｌ．（２０１２）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７２（２１）：５４３５－４０を参照されたい。

一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、キヌレニナーゼ活性を有する酵素を含む。

特定の実施形態において使用するのに好適なキヌレニナーゼ活性を有する酵素の例示的な例には、Ｌ－キヌレニンヒドロラーゼが含まれるが、これに限定されない。

一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫抑制因子によって媒介される免疫抑制シグナル伝達を減少または遮断する免疫抑制シグナルダンパーをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。

特定の実施形態において企図される免疫抑制シグナルダンパーによって標的とされる免疫抑制因子の例示的な例には、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、マクロファージコロニー刺激因子１（Ｍ－ＣＳＦ１）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＳｉＳｏ細胞リガンド上で発現される受容体結合癌抗原（ＲＣＡＳ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ４７、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、およびインターロイキン－１３（ＩＬ－１３）が含まれるが、これらに限定されない。

様々な実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子と結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。

様々な実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインを含む。

特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとを含む。

別の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子と結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを伝達しないかまたは免疫抑制シグナルを伝達する実質的に低減された能力を有する修飾細胞内ドメインとを含む。

本明細書で使用される場合、「細胞外ドメイン」という用語は、抗原結合ドメインを指す。一実施形態において、細胞外ドメインは、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをＴ細胞に伝達する免疫抑制受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。特定の実施形態において、細胞外ドメインは、免疫受容体阻害性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）および／または免疫受容体チロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインを指す。

免疫抑制シグナルダンパーの特定の実施形態において使用するのに好適な細胞外ドメインの例示的な例には、抗体もしくはその抗原結合断片、または以下のポリペプチド：プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球減弱因子（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容体チロシン依存性阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、形質転換成長因子β受容体１（ＴＧＦβＲＩ）、形質転換成長因子β受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）、インターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）受容体１（ＣＸＣＲ１）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）受容体２（ＣＸＣＲ２）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０Ｒ）、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ１３Ｒα２）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬＲ１）、ＳｉＳｏ細胞上で発現される受容体結合癌抗原（ＲＣＡＳ１Ｒ）、ならびにＦａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）から単離された細胞外リガンド結合ドメインが含まれるが、これらに限定されない。

一実施形態において、細胞外ドメインは、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＴＧＦβＲＩＩ、およびＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。

多くの膜貫通ドメインは、特定の実施形態において使用され得る。特定の実施形態において企図される免疫抑制シグナルダンパーの特定の実施形態において使用するのに好適な膜貫通ドメインの例示的な例には、以下のタンパク質：Ｔ細胞受容体、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ－１のアルファまたはベータ鎖の膜貫通ドメインが含まれるが、これらに限定されない。

３．遺伝子操作された抗原受容体
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作された抗原受容体を含む。一実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むＴ細胞は、ＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによって編集される。一実施形態において、Ｔ細胞は、遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートの存在下で、ＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。

特定の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体である。

ａ．遺伝子操作されたＴＣＲ
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含むＴ細胞は、ＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによって編集される。一実施形態において、Ｔ細胞は、遺伝子操作されたＴＣＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、ＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲは、単一のＣＢＬＢ対立遺伝子においてＤＳＢで挿入される。別の実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖は、あるＣＢＬＢ対立遺伝子においてＤＳＢに挿入され、遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖は、他のＣＢＬＢ対立遺伝子においてＤＳＢに挿入される。

一実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたＴ細胞は、ＣＢＬＢ遺伝子で挿入されていない遺伝子操作されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ／または免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよび／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの１つ以上が、１つ以上のＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢに挿入される。

自然発生するＴ細胞受容体は、２つのサブユニットであるアルファ鎖およびベータ鎖サブユニットを含み、これらの各々は、各Ｔ細胞のゲノムにおいて組換え事象によって産生される固有のタンパク質である。ＴＣＲのライブラリは、特定の標的抗原に対するそれらの選択性に関してスクリーニングされ得る。このように、標的抗原に対して高い結合活性および反応性を有する天然ＴＣＲは、選択され、クローン化され、その後、養子免疫療法に対して使用されるＴ細胞の集団に導入され得る。

一実施形態において、Ｔ細胞は、１つ以上のＣＢＬＢ対立遺伝子において、ＤＳＢでＴＣＲのサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートに導入することによって修飾され、ＴＣＲサブユニットは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対してＴ細胞への特異性を与えるＴＣＲを形成する能力を有する。特定の実施形態において、サブユニットは、サブユニットがＴＣＲを形成する能力を保持し、トランスフェクトされたＴ細胞が標的細胞に誘導される能力を付与し、免疫学的に関連するサイトカインシグナル伝達に関与する限り、自然発生するサブユニットと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、または修飾を有する。遺伝子操作されたＴＣＲはまた、好ましくは、高い活性を有する関連のある腫瘍関連ペプチドを表示する標的細胞に結合し、および任意に、インビボで関連ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷を媒介する。

遺伝子操作されたＴＣＲをコードする核酸は、好ましくは、Ｔ細胞の（自然発生する）染色体においてそれらの天然の状況から単離され、本明細書の他の箇所で記載される、好適なベクター内に組み込まれ得る。それらを含む核酸およびベクターの両方が、細胞に、好ましくは、特定の実施形態において、Ｔ細胞内に移入され得る。次いで、修飾Ｔ細胞は、形質導入された核酸（複数可）によってコードされるＴＣＲのうちの１つ以上の鎖を発現することができる。好ましい実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲは、特定のＴＣＲを正常に発現しないＴ細胞内に導入されるため、外因性ＴＣＲである。遺伝子操作されたＴＣＲの本質的態様は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または類似の免疫学的構成要素によって提示される腫瘍抗原に対して高い結合力を有することである。遺伝子操作されたＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、ＭＨＣの独立した様式で標的抗原に結合するように遺伝子操作される。

ＴＣＲは、結合した追加のポリペプチドが、機能的Ｔ細胞受容体およびＭＨＣ依存性抗原認識を形成するアルファ鎖またはベータ鎖の能力に干渉しない限り、ＴＣＲの本発明のアルファ鎖またはベータ鎖のアミノ末端またはカルボキシル末端部分に結合する追加のポリペプチドで発現され得る。

特定の実施形態において企図される遺伝子操作されたＴＣＲによって認識される抗原には、血液癌および固形腫瘍の両方における抗原を含む、癌抗原が含まれるが、これに限定されない。例示的な抗原には、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ－Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ－１が含まれるが、これらに限定されない。

一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたは第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、１つの修飾および／または機能不全ＣＢＬＢ遺伝子に組み込まれた遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖および／またはベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。

一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたは第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、１つの修飾および／または機能不全ＣＢＬＢ遺伝子に組み込まれた遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖およびベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。

特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５´～３´の、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドと、第２の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、１つの修飾および／または機能不全ＣＢＬＢ遺伝子に組み込まれた遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。このような場合には、他のＣＢＬＢ遺伝子は、機能的であり得るか、またはＤＳＢによって機能を減少させるかもしく機能不全を与えられ、ＮＨＥＪによって修復され得る。一実施形態において、他のＣＢＬＢ遺伝子は、本明細書で企図される遺伝子操作されたヌクレアーゼによって修飾され、機能を減少させるかまたは機能不全を与えられる。

ある特定の実施形態において、両方のＣＢＬＢ遺伝子が修飾され、機能を減少するかまたは機能不全であり、第１の修飾されたＣＢＬＢ遺伝子は、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む核酸を含み、第２の修飾されたＣＢＬＢ遺伝子は、第２の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。

ｂ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
特定の実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一実施形態において、１つ以上のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むＴ細胞は、ＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによって編集される。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、ＣＡＲは、単一のＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢで挿入される。

一実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたＴ細胞、ＣＢＬＢ遺伝子で挿入されていないＣＡＲ、ならびに免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよび／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの１つ以上が、１つ以上のＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢに挿入される。

様々な実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を再指向するＣＡＲを発現する。ＣＡＲは、特異的抗腫瘍細胞性免疫活性を呈するキメラタンパク質を生成するために、Ｔ細胞受容体を活性化する細胞内ドメインを有する標的抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体系特異性を組み合わせる分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なるタンパク質の部分または異なる起源からのＤＮＡからなっていることを説明する。

様々な実施形態において、ＣＡＲは、特異的標的抗原（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される）に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。ＣＡＲの主な特性は、免疫エフェクター細胞特異性を再指向するそれらの能力であり、それによって、主要組織適合性（ＭＨＣ）の独立した様式で、標的抗原を発現する細胞の細胞死を媒介し得る、分子の増殖、サイトカイン産生、食作用、または産生を引き起こし、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的標的能力を利用する。

特定の実施形態において、ＣＡＲは、標的ポリペプチド、例えば、腫瘍細胞上で発現される標的抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は、互換的に使用され、キメラ受容体、例えば、目的となる標的抗原に特異的に結合する能力を有するＣＡＲまたはＤａｒｉｃを提供する。結合ドメインは、生物学的分子（例えば、細胞表面受容体または腫瘍タンパク質、脂質、多糖、または他の細胞表面標的分子もしくはその構成要素）に特異的に認識および結合する能力を有する、任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを含み得る。結合ドメインは、目的となる生物学的分子に対する、任意に自然発生する、合成、半合成、または組換え技術によって産生された結合パートナーを含む。

特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。

「抗体」は、ペプチド、脂質、多糖、または抗原決定基を含有する核酸、例えば、免疫細胞によって認識されるものなどの、標的抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合剤を指す。抗体には、抗原結合断片、例えば、ラクダＩｇ（ラクダ科抗体またはそのＶＨＨ断片）、ＩｇＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ´断片、Ｆ（ａｂ）´２断片、Ｆ（ａｂ）´３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ）またはその他の抗体断片が含まれる。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役抗体（二重特異性抗体など）、およびそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。ＰｉｅｒｃｅＣａｔａｌｏｇａｎｄＨａｎｄｂｏｏｋ，１９９４－１９９５（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄＥｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９７も参照されたい。

１つの好ましい実施形態において、結合ドメインは、ｓｃＦｖである。

別の好ましい実施形態において、結合ドメインは、ラクダ科抗体である。

特定の実施形態において、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ－Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ－１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。

特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外結合ドメイン、例えば、抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで、抗原は、クラスＩＭＨＣ－ペプチド複合体またはクラスＩＩＭＨＣ－ペプチド複合体などのＭＨＣ－ペプチド複合体である。

ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、様々なドメイン間のリンカー残基を含む。「可変領域連結配列」は、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に接続し、得られるポリペプチドが、同じ軽鎖および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対して特異的結合親和性を保持するように、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合性のあるスペーサー機能を提供するアミノ酸配列である。特定の実施形態において、ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上のリンカーを含む。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約１～約２５のアミノ酸、約５～約２０のアミノ酸、もしくは約１０～約２０のアミノ酸、またはアミノ酸の任意の介在する長さである。いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上のアミノ酸長である。

特定の実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインの後ろに、１つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して適切な細胞／細胞接触、抗原結合および活性化を可能にする領域を指す（Ｐａｔｅｌｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２－４１９）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ある特定の実施形態において、スペーサードメインは、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３を含むが、これらに限定されない、免疫グロブリンの部分である。スペーサードメインは、自然発生する免疫グロブリンヒンジ領域または改変した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。

一実施形態において、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３を含む。

一実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインは、エフェクター細胞表面から離して抗原結合ドメインを位置決めて、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、および活性化を可能にする役割を果たす、１つ以上の「ヒンジドメイン」に連結される。ＣＡＲは、概して、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間に１つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、自然発生する免疫グロブリンヒンジ領域または改変した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。

本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用するのに好適な例示的なヒンジドメインは、ＣＤ８α、およびＣＤ４などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域であり得るか、または改変され得る。別の実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。

一実施形態において、ヒンジは、ＰＤ－１ヒンジまたはＣＤ１５２ヒンジである。

「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分および細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の形質膜に固定するＣＡＲの部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。

例示的なＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ－１のアルファまたはベータ鎖の少なくとも膜貫通領域（複数可）に由来し得る（すなわち、それらを含み得る。

一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインと、好ましくは、ＴＭドメインおよびＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーとを含む。グリシン－セリンリンカーは、特定の好適なリンカーを提供する。

特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、標的抗原への有効なＣＡＲ結合のメッセージを、免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、ＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害性因子の放出、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合で引き出される他の細胞応答を含む、活性化、サイトカイン産生、増殖、および細胞傷害性活性を引き出すことに関与するＣＡＲの部分を指す。

「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解性活性もしくは補助、またはサイトカインの分泌を含む活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊な機能を行うように細胞を指向するタンパク質の部分を指す。通常は、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断短縮部分を使用する範囲内で、かかる切断短縮部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限り、それをドメイン全体の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断短縮部分を含むことを意味する。

ＴＣＲ単独によって生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化に不十分であること、および二次または共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの固有のクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン：ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存性一次活性化を惹起する主要シグナル伝達ドメイン、および抗原非依存性様式で作用して、二次または共刺激シグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインによって媒介されると言うことができる。好ましい実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「主要シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

主要シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性に、または阻害性に調節する。刺激性に作用する主要シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシン依存性モチーフまたはＩＴＡＭとして公知であるシグナル伝達モチーフを含み得る。

特定の実施形態において企図されるＣＡＲにおいて使用するのに好適な主要シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの例示的な例には、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。特に好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインと１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。細胞内主要シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結され得る。

特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および増大を強化するための１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」、または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。

特定の実施形態において企図されるＣＡＲにおいて使用するのに好適なかかる共刺激分子の例示的な例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が含まれる。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインとを含む。

様々な実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインと、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１５４、およびＰＤ－１からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択されるポリペプチドから単離された１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインとを含む。

ｃ．Ｄａｒｉｃ受容体
特定の実施形態において、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のＤａｒｉｃ受容体を含む。本明細書で使用される場合、「Ｄａｒｉｃ受容体」という用語は、多鎖遺伝子操作された抗原受容体を指す。一実施形態において、１つ以上のＤａｒｉｃ受容体をコードするポリヌクレオチドを含むＴ細胞は、ＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによって編集される。一実施形態において、Ｔ細胞は、Ｄａｒｉｃの１つ以上の構成要素をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＣＢＬＢ対立遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃまたはその１つ以上の構成要素は、単一のＣＢＬＢ対立遺伝子においてＤＳＢで挿入される。

一実施形態において、遺伝子操作されたＴ細胞は、ＣＢＬＢ遺伝子、ならびに免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよび／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のうちの１つ以上で挿入されないＤａｒｉｃを含むか、またはＤａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素は、１つ以上のＣＢＬＢ対立遺伝子においてＤＳＢに挿入される。

Ｄａｒｉｃ構造および構成要素の例示的な例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／０１７２１４および米国特許公開第２０１５０２６６９７３号に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、以下のＤａｒｉｃ構成要素：第１の多量体化ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、ならびに１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または主要シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ポリペプチドと、結合ドメイン、第２の多量体化ドメイン、および任意に、第２の膜貫通ドメインを含む結合ポリペプチドとを含む。機能的Ｄａｒｉｃは、シグナル伝達ポリペプチドおよび結合ポリペプチドの多量体化ドメインに関連し、かつそれらの間に配置される架橋因子を有する細胞表面上にＤａｒｉｃ受容体複合体の形成を促進する架橋因子を含む。

特定の実施形態において、第１のおよび第２の多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログ、クーママイシンまたはその誘導体、ジベレリンまたはその誘導体、アブシジン酸（ＡＢＡ）またはその誘導体、メトトレキサートまたはその誘導体、シクロスポリンＡまたはその誘導体、ＦＫＣｓＡまたはその誘導体、ＦＫＢＰ（ＳＬＦ）のためのトリメトプリム（Ｔｍｐ）－合成リガンドまたはその誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される架橋因子と関連する。

ラパマイシン類似体（ラパログ）の例示的な例は、米国特許第６，６４９，５９５号に開示されるものを含み、ラパログ構造は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、架橋因子は、ラパマイシンと比較して、実質的に低減された免疫抑制効果を有するラパログである。「実質的に低減された免疫抑制効果」は、臨床的にソフトバンクまたはヒト免疫抑制活性の適切なインビトロ（例えば、Ｔ細胞増殖の阻害）もしくはインビボでのサロゲートで測定される、等モル量のラパマイシンに観察されるかまたは期待される免疫抑制効果を少なくとも０．１未満～０．００５倍有するラパログを指す。一実施形態において、「実質的に低減された免疫抑制効果」は、同じアッセイにおいてラパマイシンに関して観察されるＥＣ５０値よりも少なくとも１０～２５０倍大きいかかるインビトロアッセイにおいてＥＣ５０値を有するラパログを指す。

ラパログの他の例示的な例には、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、およびゾタロリムスが含まれるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態において、多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログである架橋因子と関連があるであろう。例えば、第１および第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰおよびＦＲＢから選択される対である。ＦＲＢドメインは、ＦＫＢＰタンパク質およびラパマイシンまたはそのラパログと共に三部分複合体を形成することができるポリペプチド領域（タンパク質「ドメイン」）である。ＦＲＢドメインは、ヒトおよび他の種からのｍＴＯＲタンパク質（文献においてＦＲＡＰ、ＲＡＰＴ１、またはＲＡＦＴとも称される）、Ｔｏｒ１およびＴｏｒ２を含む酵母タンパク質、ならびにカンジダＦＲＡＰホモログを含む、多くの自然発生するタンパク質中に存在する。ヌクレオチド配列、クローニング、およびこれらのタンパク質の他の態様に関する情報は、既に当該技術分野において知られている。例えば、ヒトｍＴＯＲにおけるタンパク質配列受託番号は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３４０７５．１である（Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６９：７５６，１９９４）。

本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なＦＲＢドメインは、概して、少なくとも約８５～約１００個のアミノ酸残基を含む。ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質で使用するＦＲＢアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３４０７５．１のアミノ酸配列に基づいて、９３アミノ酸配列Ｉｌｅ－２０２１～Ｌｙｓ－２１１３およびＴ２０９８Ｌの変異を含むであろう。特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃにおいて使用するためのＦＲＢドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合したＦＫＢＰタンパク質の複合体に結合することができるであろう。ある特定の実施形態において、ＦＲＢドメインのペプチド配列は、（ａ）相同タンパク質のヒトｍＴＯＲの少なくとも示された９３アミノ酸領域または対応する領域に及ぶ自然発生するペプチド配列、（ｂ）自然発生するペプチドの、最大約１０個のアミノ酸、または約１～約５個のアミノ酸もしくは約１～約３個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態において、わずか１個のアミノ酸が、欠失、挿入、または置換されている自然発生するＦＲＢのバリアント、あるいは（ｃ）自然発生するＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子によって、または遺伝子コードの縮重がなかったら、自然発生するＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができ得るＤＮＡ配列によってコードされるペプチドを含む。

ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）は、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、およびラパマイシンなどのマクロライドの細胞質受容体であり、種線にわたって高度に保存される。ＦＫＢＰは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、ＦＲＢを含有するタンパク質または融合タンパク質を用いて三部分複合体をさらに形成することができるタンパク質またはタンパク質ドメインである。ＦＫＢＰドメインはまた、「ラパマイシン結合ドメイン」とも称され得る。ヌクレオチド配列、クローニング、および種々のＦＫＢＰ種の他の態様に関連する情報は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓｔａｅｎｄａｒｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４６：６７１，１９９０（ヒトＦＫＢＰ１２）、Ｋａｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：３６１，１９９６を参照されたい）。他の哺乳動物種、酵母、および他の生物における相同ＦＫＢＰタンパク質もまた、当該技術分野において知られており、本明細書に開示される融合タンパク質において使用され得る。特定の実施形態において企図されるＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、ＦＲＢを含有するタンパク質を用いて三部分複合体に関与することができるであろう（かかる結合を検出するために、任意の手段によって、直接または間接的に決定され得るように）。

特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃにおいて使用するのに好適なＦＫＢＰドメインの例示的な例としては、好ましくはヒトＦＫＢＰ１２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５８４７６．１）から、またはそこから単離されたペプチド配列、別のヒトＦＫＢＰから、マウスもしくは他の哺乳動物ＦＫＢＰから、またはいくつかの他の動物、酵母、もしくは真菌ＦＫＢＰから単離された天然に存在するＦＫＢＰペプチド配列、天然に存在するペプチドの、最大約１０個のアミノ酸、または約１～約５個のアミノ酸または約１～約３個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態において、わずか１個のアミノ酸が、欠失、挿入、または置換されている天然に存在するＦＫＢＰのバリアント、あるいは天然に存在するＦＫＢＰドメインをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子によって、または遺伝コードの縮重がなかったら、天然に存在するＦＫＢＰをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができ得るＤＮＡ配列によってコードされるペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃにおいて使用するのに好適な多量体化ドメイン対の他の例示的な例には、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、またはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはそれらのバリアントが含まれるが、これらから含まれることに限定されない。

さらに他の実施形態において、抗架橋因子は、シグナル伝達ポリペプチドおよび結合ポリペプチドと架橋因子との会合を遮断する。例えば、シクロスポリンまたはＦＫ５０６は、ラパマイシンを滴定するための抗架橋因子として使用され、したがって、１つの多量体化ドメインのみが結合するため、シグナル伝達を停止し得る。ある特定の実施形態において、抗架橋因子（例えば、シクロスポリン、ＦＫ５０６）は、免疫抑制剤である。例えば、免疫抑制抗架橋因子は、特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃ構成要素の機能を遮断または最小限に抑え、同時に、臨床設定において望ましくないかまたは病理学的炎症応答を阻害または遮断するために使用され得る。

一実施形態において、第１の多量体化ドメインはＦＲＢＴ２０９８Ｌを含み、第２の多量体化ドメインはＦＫＢＰ１２を含み、架橋因子はラパログＡＰ２１９６７である。

別の実施形態において、第１の多量体化ドメインはＦＲＢを含み、第２の多量体化ドメインはＦＫＢＰ１２を含み、架橋因子はラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。

特定の実施形態において、シグナル伝達ポリペプチド、第１の膜貫通ドメイン、および結合ポリペプチドは、第２の膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカーを含む。第１および第２の膜貫通ドメインの例示的な例は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ－１からなる群から独立して選択されるポリペプチドから単離される。

一実施形態において、シグナル伝達ポリペプチドは、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または主要シグナル伝達ドメインを含む。

特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃシグナル伝達構成要素において使用するのに好適な主要シグナル伝達ドメインの例示的な例には、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。特定の好ましい実施形態において、Ｄａｒｉｃシグナル伝達構成要素は、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインと、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。細胞内主要シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結され得る。

特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃシグナル伝達構成要素において使用するのに好適なかかる共刺激分子の例示的な例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が含まれる。一実施形態において、Ｄａｒｉｃシグナル伝達構成要素は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインとを含む。

特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃ結合構成要素は、結合ドメインを含む。一実施形態において、結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片である。

抗体またはその抗原結合断片は、ペプチド、脂質、多糖、または抗原決定基を含有する核酸、例えば、免疫細胞によって認識されるものなどの標的抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含む。抗体には、抗原結合断片、例えば、ラクダＩｇ（ラクダ科抗体またはそのＶＨＨ断片）、ＩｇＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ´断片、Ｆ（ａｂ）´２断片、Ｆ（ａｂ）´３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ）またはその他の抗体断片が含まれる。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役抗体（二重特異性抗体など）、およびそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。ＰｉｅｒｃｅＣａｔａｌｏｇａｎｄＨａｎｄｂｏｏｋ，１９９４－１９９５（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄＥｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９７も参照されたい。

特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃ結合構成要素は、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ－Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ－１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。

一実施形態において、Ｄａｒｉｃ結合構成要素は、細胞外ドメイン、例えば、クラスＩ
ＭＨＣ－ペプチド複合体またはクラスＩＩＭＨＣ－ペプチド複合体などのＭＨＣ－ペプチド複合体に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるＤａｒｉｃ構成要素は、２つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ドメイン、領域、またはモチーフを接続するリンカーまたはスペーサーを含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、約２～約３５個のアミノ酸、または約４～約２０個のアミノ酸、または約８～約１５個のアミノ酸、または約１５～約２５個のアミノ酸を含む。他の実施形態において、スペーサーは、抗体ＣＨ２ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメインなどの特定の構造を有し得る。一実施形態において、スペーサーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるＤａｒｉｃ構成要素は、ドメインを位置決めて、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、および活性化を可能にする役割を果たす、１つ以上の「ヒンジドメイン」を含む。Ｄａｒｉｃは、結合ドメインと、多量体化ドメインおよび／もしくは膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間、または多量体化ドメインと膜貫通ドメインとの間に１つ以上のヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、自然発生する免疫グロブリンヒンジ領域または改変した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８αヒンジまたはＣＤ４ヒンジである。

一実施形態において、Ｄａｒｉｃは、シグナル伝達ポリペプチドを含み、ＦＲＢＴ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメインと、ＣＤ８膜貫通ドメインと、４－１ＢＢ共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインとを含み、結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖと、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインと、ＣＤ４膜貫通ドメインとを含み、架橋因子は、ラパログＡＰ２１９６７である。

一実施形態において、Ｄａｒｉｃは、シグナル伝達ポリペプチドを含み、ＦＲＢの第１の多量体化ドメインと、ＣＤ８膜貫通ドメインと、４－１ＢＢ共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインとを含み、結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖと、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインと、ＣＤ４膜貫通ドメインとを含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。

ｄ．ゼータカイン
特定の実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のキメラサイトカイン受容体を含む。一実施形態において、ゼータカインをコードするポリヌクレオチドを含むＴ細胞は、ＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢを導入することによって編集される。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＣＢＬＢ対立遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、単一のＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢで挿入される。

一実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたＴ細胞、ＣＢＬＢ遺伝子で挿入されていないキメラサイトカイン受容体、ならびに免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよび／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの１つ以上が、１つ以上のＣＢＬＢ遺伝子においてＤＳＢに挿入される。

様々な実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を再指向するキメラサイトカイン受容体を発現する。ゼータカインは、細胞外ドメインを細胞表面に連結することができる支援領域に連結された可溶性受容体リガンドを含む細胞外ドメインと、膜貫通領域と、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ膜貫通免疫受容体である。ゼータカインは、Ｔリンパ球の表面上で発現されるとき、可溶性受容体リガンドが特異的である受容体を発現するような細胞に、Ｔ細胞活性を指向する。ゼータカインキメラ免疫受容体は、様々な癌の治療への適用と共に、特に、ヒト悪性腫瘍によって利用される自己分泌／傍分泌サイトカイン系を介してＴ細胞の抗原特異性を再指向する。

特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、免疫抑制サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアント、リンカー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

特定の実施形態において、サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアントは、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、およびインターロイキン－１３（ＩＬ－１３）からなる群から選択される。

ある特定の実施形態において、リンカーは、ＣＨ２ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメインなどを含む。一実施形態において、リンカーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。一実施形態において、リンカーは、ＣＤ８αまたはＣＤ４ヒンジドメインを含む。

特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ－１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択される。

特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、主要シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激ドメインを含有するＩＴＡＭからなる群から選択される。

特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択される。

特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択される。

一実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインとを含む。

Ｆ．ポリペプチド
ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および融合ポリペプチドを含むがこれらに限定されない様々なポリペプチドが本明細書で企図される。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～１９および３８に示されるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として交換可能に使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、多様な周知の組換えおよび／または合成技法のうちのいずれかを使用して調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含み得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに自然発生するかまたは自然発生しない両方の、当該技術分野において既知の他の修飾を含み得る。

本明細書で使用される「単離されたタンパク質」、「単離されたペプチド」、または「単離されたポリペプチド」および同様の用語は、ペプチドまたはポリペプチド分子の、細胞環境からの、および細胞の他の構成要素との関連からのインビトロ合成、単離、および／または精製を指し、すなわち、それは、インビボ物質と有意に関連していない。

特定の実施形態において企図されるポリペプチドの例示的な例には、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、ＢｉＴＥ、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、およびサイトカイン受容体、フリップ受容体、免疫抑制シグナルダンパー、ＣＡＲ、ＤＡＲＩＣ、ＴＣＲ、ならびにゼータカインが含まれるが、これらに限定されない。

ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入において天然ポリペプチドとは異なり得る。かかるバリアントは、自然発生し得るか、または例えば、上述のポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって合成的に生成され得る。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチド内に１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入を導入することによって、ヒトＣＢＬＢ遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するホーミングエンドヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬなどの生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書で企図される参照配列のいずれかに対して少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、ここで、バリアントは、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。

ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。生物学的に活性なポリペプチド断片の例示的な例には、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなどが含まれる。本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」は、少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％の自然発生するポリペプチド活性を保持するポリペプチド断片を指す。好ましい実施形態において、生物学的活性は、標的配列に対する結合親和性および／または切断活性である。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５～約１７００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態において、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００またはそれ以上のアミノ酸長であることが認識されよう。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、「Ｘ」として示される１つ以上のアミノ酸を含み得る。「Ｘ」は、アミノ酸配列番号に存在する場合、任意のアミノ酸を指す。１つ以上の「Ｘ」残基は、特に本明細書で企図される配列番号に記載されるアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端に存在し得る。「Ｘ」アミノ酸が存在しない場合、配列番号に記載される残りのアミノ酸配列は、生物学的に活性な断片とみなされる。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片、例えば、配列番号３～１２、またはｍｅｇａＴＡＬ（配列番号１３～１９）を含む。生物学的に活性な断片は、Ｎ末端切断短縮および／またはＣ末端切断短縮を含み得る。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸の欠失、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４個のＮ末端アミノ酸の欠失を欠いているかまたは含む。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸の欠失、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの２個のＣ末端アミノ酸の欠失を欠いているかまたは含む。特に好ましい実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４個のＮ末端アミノ酸および２個のＣ末端アミノ酸の欠失を欠いているかまたは含む。

特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失、および／または１、２、３、４、もしくは５個の以下のＣ末端アミノ酸：Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖの欠失を含む。

特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失もしくは置換、および／または１、２、３、４、もしくは５個の以下のＣ末端アミノ酸：Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖの欠失もしくは置換を含む。

上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断短縮、および挿入を含む種々の方法で改変され得る。かかる操作のための方法は、概して、当該技術分野において知られている。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列改変のための方法が当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８－４９２）、Ｋｕｎｋｅｌｅｔａｌ．，（１９８７，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７－３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＧｅｎｅ，ＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、およびそこで引用されている参考文献を参照されたい。目的となるタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に対するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆｅｔａｌ．，（１９７８）ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出され得る。

ある特定の実施形態において、バリアントは、１つ以上の保存的置換を含むであろう。「保存的置換」は、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換され、そのためペプチド化学分野の当業者によってポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー特性が実質的に変化しないことが予期されるような置換である。修飾は、特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において行われ得、ポリペプチドは、少なくとも約を有し、依然として望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を含むポリペプチドを含む。同等の、またはさらに改善された、バリアントポリペプチドを作成するためポリペプチドのアミノ酸配列を改変することが所望されるとき、当業者は、例えば、表１に従って、例えば、コードするＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変化させ得る。

どのアミノ酸残基が、生物学的活性を廃止することなく、置換、挿入、または欠失され得るかを決定するためのガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＧＣＧ、ＤＮＡＳｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃベクター、またはベクターＮＴＩソフトウェアなどの当該技術分野において周知のコンピュータプログラムを使用して見出され得る。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したまたは非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を伴う。自然発生するアミノ酸は、概して、４つのファミリー：酸性（アスパルテート、グルタメート）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸に分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換が当業者に知られており、概して、得られる分子の生物学的活性を改変することなく行われ得る。当業者は、概して、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に改変しないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＧｅｎｅ，４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，１９８７，ＴｈｅＢｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕｍｍｉｎｇｓＰｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。

一実施形態において、２つ以上のポリペプチドの発現が所望される場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の他の箇所で開示されるＩＲＥＳ配列によって分離され得る。

特定の実施形態において企図されるポリペプチドには、融合ポリペプチドが含まれる。特定の実施形態において、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。

別の実施形態において、２つ以上のポリペプチドは、本明細書の他の箇所で開示される１つ以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。

一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインと、１つ以上のヌクレアーゼと、１つ以上のリンカーおよび／または自己切断型ポリペプチドと含む。

一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、ヌクレアーゼバリアント；リンカーまたは自己切断型ペプチド；ならびに５´－３´エキソヌクレアーゼ、５´－３´アルカリエキソヌクレアーゼおよび３´－５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）を含むがこれらに限定されないエンドプロセシング酵素を含む。

融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、細胞透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなど、エピトープタグ（例えば、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＩＳ６、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、およびＨＡ）、ポリペプチドリンカー、およびポリペプチド切断シグナルを含むが、これらに限定されない１つ以上のポリペプチドドメインまたはセグメントを含み得る。融合ポリペプチドは、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端、またはＮ末端からＣ末端に連結することも可能であるが、それらは、典型的には、Ｃ末端からＮ末端に連結される。特定の実施形態において、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順番であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の活性が保存されている限り、保守的に修飾されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、部分配列、および種間ホモログも含み得る。融合ポリペプチドは、化学的な合成方法によって、もしくは２つの部分間の化学結合によって産生され得るか、または、概して、他の標準の技法を使用して調製され得る。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で開示されるように、好適な転写または翻訳制御要素に作動可能に連結されている。

融合ポリペプチドは、任意に、１つ以上のポリペプチドまたはポリペプチド内のドメインを連結させるために使用され得るリンカーを含む。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮することができるように、各ポリペプチドがその適切な二次および三次構造に折り畳むのを確実にするのに十分な距離によって、任意の２つ以上のポリペプチド構成要素を分離するために用いられ得る。かかるペプチドリンカー配列は、当該技術分野において標準的な技法を使用して融合ポリペプチドに組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、以下の要因：（１）可撓性延長配座を採用する能力、（２）第１および第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を採用できない能力、ならびに（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基の欠如、に基づいて選択され得る。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒ残基を含有する。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の近い中性アミノ酸もまた、リンカー配列において使用され得る。リンカーとして有用に使用され得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ４０：３９－４６，１９８５、Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：８２５８－８２６２，１９８６、米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるものを含む。リンカー配列は、特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能的ドメインを分離し、立体干渉を防ぐために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を含むとき、必要とされない。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。リンカーポリペプチドは、１～２００アミノ酸長、１～１００アミノ酸長、または１～５０アミノ酸長であり得、その間の全ての整数値を含む。

例示的なリンカーは、以下のアミノ酸配列：グリシンポリマー（Ｇ）_ｎ；グリシン－セリンポリマー（Ｇ_１－５Ｓ_１－５）_ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５個の整数である）；グリシン－アラニンポリマー；アラニン－セリンポリマー；ＧＧＧ（配列番号３９）；ＤＧＧＧＳ（配列番号４０）；ＴＧＥＫＰ（配列番号４１）（例えば、Ｌｉｕｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ５５２５－５５３０（１９９７）を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号４２）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚｅｔａｌ．１９９５、上記参照）；（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４、または５である（配列番号４３）（Ｋｉｍｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ９３，１１５６－１１６０（１９９６．）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号４４）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙｅｔａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６－１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号４５）（Ｂｉｒｄｅｔａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号４６）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号４７）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号４８）；ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）_２ＥＲＰ（配列番号４９）を含むが、これらに限定されない。あるいは、可撓性リンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデリングすることができるコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ９０：２２５６－２２６０（１９９３）、ＰＮＡＳ９１：１１０９９－１１１０３（１９９４）を使用して、またはファージディスプレイ方法によって理性的に設計され得る。

融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドドメインの各々の間または内在性オープンリーディングフレームとドナー修復テンプレートによってコードされるポリペプチドとの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。その上、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。代表的なポリペプチド切断シグナルには、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、希な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位）、および自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が含まれる（ｄｅＦｅｌｉｐｅａｎｄＲｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６－２６を参照されたい）。

好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断型ペプチドは、当業者に既知である（例えば、Ｒｙａｎｅｔａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９－７２２；Ｓｃｙｍｃｚａｋｅｔａｌ．（２００４）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．５，５８９－５９４を参照されたい）。代表的なプロテアーゼ切断部位には、ポチウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポチウイルスＨＣプロテアーゼ、ポチウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ－２エンコードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロスフェリカルウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が含まれるが、これらに限定されない。その高い切断厳密性により、ＴＥＶ（タバコｅｔｃｈウイルス）プロテアーゼ切断部位は、一実施形態において、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号５０）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号５１）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号５２）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧまたはＱとＳとの間に生じる）が好ましい。

ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙｅｔａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。特定の実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポチウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。

一実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（Ｆ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）（Ｅ２Ａ）ペプチド、ゾーシーアシグナウイルス（ＴａＶ）（Ｔ２Ａ）ペプチド、ブタテッショウウイルス－１（ＰＴＶ－１）（Ｐ２Ａ）ペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。

２Ａ部位の例示的な例を表２に提供する。

Ｇ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本明細書で企図される１つ以上のホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシング酵素、および融合ポリペプチドまたは１つ以上の生物学的に活性な断片もしくはバリアントをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、１本鎖もしくは２本鎖、および組換え、合成、または単離のいずれかであり得る。ポリヌクレオチドには、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレ－ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（－））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、合成ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、１つ以上の生物学的に活性な断片またはバリアントをコードするポリヌクレオチド断片である。ポリヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００以上のヌクレオチド長、ならびに全ての中間の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド、もしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの多量体型、またはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、６、７、８、９などの、１０１、１０２、１０３などの、１５１、１５２、１５３などの、２０１、２０２、２０３などの引用された値の間の任意の長さを意味することは容易に理解されよう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。本明細書で使用される場合、「コドン最適化される」という用語は、ポリペプチドの発現、安定性、および／または活性を増加させるためにポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいてコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響を及ぼす要因には、（ｉ）２つ以上の生物もしくは遺伝子もしくは合成的に構築されたバイアステーブル間のコドンバイアスの変形、（ｉｉ）生物、遺伝子、もしくは遺伝子の組におけるコドンバイアスの角度の変動、（ｉｉｉ）文脈を含むコドンの系統的変形、（ｉｖ）それらのデコードｔＲＮＡに応じたコドンの変形、（ｖ）三つ組の全体もしくは１つの位置のいずれかにおけるＧＣ％に従ったコドンの変形、（ｖｉ）参照配列、例えば、自然発生する配列に対する類似性の程度の変動、（ｖｉｉ）コドン周波数遮断の変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの構造特性、（ｉｘ）コドン置換セットの設計が基になる際のＤＮＡ配列の機能に関する予備知識、（ｘ）各アミノ酸に関するコドンセットの系統的変形、および／または（ｘｉ）偽の翻訳惹起部位の単離除去のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、リン酸化糖とのＮ－グリコシド連結における複素環窒素塩基を指す。ヌクレオチドは、天然塩基、および幅広く多様な当該技術分野において認識された修飾塩基を含むと理解される。かかる塩基は、概して、ヌクレオチド糖部分の１´位に位置する。ヌクレオチドは、概して、塩基、糖、およびリン酸基を含む。リボ核酸（ＲＮＡ）において、糖はリボースであり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）において、糖はデオキシリボース、すなわち、リボースに存在するヒドロキシル基を欠いている糖である。代表的な天然窒素塩基には、プリン、アデノシン（Ａ）およびグアニジン（Ｇ）、ならびにピリミジン、シチジン（Ｃ）、およびチミジン（Ｔ）（または、ＲＮＡの文脈で、ウラシル（Ｕ））が含まれる。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合される。ヌクレオチドは、通常、モノ、ジ、またはトリホスフェートである。ヌクレオチドは、修飾されていなくてもよく、あるいは糖、リン酸、および／または塩基部分で修飾されていてもよい（交換可能に、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、修飾されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、および非標準ヌクレオチドとも称され、例えば、ＷＯ９２／０７０６５およびＷＯ９３／１５１８７を参照されたい）。修飾された核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈｅｔａｌ．，（１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２，２１８３－２１９６）によって要約されている。

ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルとも認識され得、エステル化は、糖のＣ－５に結合したヒドロキシル基上で起こる。本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、糖とのＮ－グリコシド連結における複素環窒素塩基を指す。ヌクレオシドは、当該技術分野において、天然塩基を含み、かつ周知の修飾塩基を含むとも認識される。かかる塩基は、概して、ヌクレオシド糖部分の１´位に位置する。ヌクレオシドは、概して、塩基および糖基を含む。ヌクレオシドは、糖および／または塩基部分で修飾されていなくても、修飾されていてもよい（互換的に、ヌクレオシド類似体、ヌクレオシド誘導体、修飾ヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、または非標準ヌクレオシドとも称される）。上にも記載されるように、修飾された核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈｅｔａｌ．，（１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２，２１８３－２１９６）によって要約されている。

ポリヌクレオチドの例示的な例としては、配列番号１～１９および３８をコードするポリヌクレオチド、ならびに配列番号２０～３７に示されるポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。

様々な例示的な実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドには、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシング酵素、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および発現ベクター、ウイルスベクター、および本明細書で企図されるポリヌクレオチドを含む移入プラスミドが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、以下に定義される厳密な条件下で、参照配列とハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語には、１つ以上のヌクレオチドが、付加もしくは欠失されるか、または修飾されるか、または異なるヌクレオチドで置き換えられるポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、変異、付加、欠失、および置換を含む、ある特定の改変が、参照ポリヌクレオチドに対して行われ得、それによって、改変されたポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することが当該技術分野において十分に理解される。

ポリヌクレオチドバリアントは、生物学的に活性な断片またはバリアントをコードするポリヌクレオチド断片を含む。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド断片」という用語は、少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％の自然発生するポリペプチド活性を保持するポリペプチドバリアントをコードする少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００以上のヌクレオチド長のポリヌクレオチド断片を指す。ポリヌクレオチド断片は、天然に存在するまたは組換え技術によって産生されたポリペプチドの１つ以上のアミノ酸のアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失もしくは置換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

一実施形態において、ポリヌクレオチドは、厳密な条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「厳密な条件」下でハイブリダイズすることは、互いに少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列がハイブリダイズされたままである、ハイブリダイゼーションプロトコルを説明する。概して、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特異的な配列に対して熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）である。概して、標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有されている。

本明細書で使用される場合、「配列同一性」または、例えば、「～に対して５０％の配列同一性」を含む記述は、配列が比較ウィンドウ上のヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ上の２つの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列中に生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）中の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じることによって計算し、配列同一性のパーセンテージを得ることができる。典型的には、ポリペプチドバリアントが、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する場合に、本明細書に記載される参照配列のうちのいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。

２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも１２個、しばしば、１５～１８個、多くの場合、少なくとも２５個のモノマー単位である。２つのポリヌクレオチドは各々、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似性がある配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で多様性がある配列を含み得るため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を特定および比較するために、「比較ウィンドウ」上の２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、配列が同数の連続した位置の参照配列と比較される少なくとも６個の連続した位置、一般的には約５０～約１００個、より一般的には約１００～約１５０個の概念セグメントを指す。比較ウィンドウは、２つの配列の最適な整列のために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、アルゴリズム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＧＣＧ、ＤＮＡＳｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、またはＶｅｃｔｏｒＮＴＩソフトウェアのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ実装によって、または検査、および選択された種々の方法のいずれかによって生成された最良の整列（すなわち、比較ウィンドウ上で最も高いパーセンテージの相同性をもたらすこと）によって行われ得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９によって開示されるようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照することができる。配列分析の詳細な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＩｎｃ．，１９９４－１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ１５のユニット１９．３に見出すことができる。

本明細書で使用される場合、「単離ポリヌクレオチド」は、自然発生する状態でそれに隣接する配列から精製されているポリヌクレオチド、例えば、通常、断片に隣接する配列から除去されているＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、自然には存在せず、人間の手によって作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または他のポリヌクレオチドを指す。

様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、およびエンドプロセシング酵素を含むがこれらに限定されない、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップ、１つ以上のヌクレオチド、およびポリ（Ａ）尾部を含む。

本明細書で使用される場合、「５´キャップ」または「５´キャップ構造」または「５´キャップ部分」という用語は、ｍＲＮＡの５´終端で組み込まれている化学的修飾を指す。５´キャップは、核外搬出、ｍＲＮＡ安定性、および翻訳に関与する。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５´末端転写センスヌクレオチドとの間に５´－ｐｐｐ－５´－トリホスフェート連結を含む５´キャップを含む。次いで、この５´－グアニレートキャップは、Ｎ７－メチル－グアニレート残基を生成するためにメチル化され得る。

本明細書で企図されるｍＲＮＡポリヌクレオチドの特定の実施形態において使用するのに好適な５´キャップの例示的な例には、未メチル化５´キャップ類似体、例えば、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ；メチル化５´キャップ類似体、例えば、ｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、およびｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ；ジメチル化５´キャップ類似体、例えば、ｍ^２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ^２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、およびｍ^２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ；トリメチル化５´キャップ類似体、例えば、ｍ^{２，２，７}Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ^{２，２，７}Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、およびｍ^{２，２，７}Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ；ジメチル化対称５´キャップ類似体、例えば、ｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐｍ^７（５´）Ｇ、ｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐｍ^７（５´）Ｃ、およびｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐｍ^７（５´）Ａ；ならびに抗逆５´キャップ類似体、例えば、抗逆キャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップ、指定３´Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、２´Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、２´Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、２´Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、ｍ^７２´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ^７２´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、ｍ^７２´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、３´Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、３´Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、ｍ^７３´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ^７３´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、ｍ^７３´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、およびそれらのテトラホスフェート誘導体）（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙｅｔａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８－１１２２（２００３）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、トリホスフェート架橋を介して、第１の転写ヌクレオチドの５´終端に連結されて、ｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｎ（式中、Ｎは、任意のヌクレオシドである）をもたらす７－メチルグアニレート（「ｍ^７Ｇ」）である５´キャップを含む。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、５´キャップを含み、キャップは、Ｃａｐ０構造（Ｃａｐ０構造は、塩基１および２に結合したリボースの２´－Ｏ－メチル残基を欠いている）、Ｃａｐ１構造（Ｃａｐ１構造は、塩基２で２´－Ｏ－メチル残基を有する）、またはＣａｐ２構造（Ｃａｐ２構造は、塩基２および３の両方に結合した２´－Ｏ－メチル残基を有する）である。

一実施形態において、ｍＲＮＡは、ｍ^７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇキャップを含む。

一実施形態では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含む。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。

一実施形態では、ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。

一実施形態において、ｍＲＮＡは、シュードウリジン、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、および４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。

一実施形態において、ｍＲＮＡは、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、および４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。

一実施形態において、ｍＲＮＡは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、および２－メトキシ－アデニンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。

一実施形態において、ｍＲＮＡは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。

一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のシュードウリジン、１つ以上の５－メチル－シトシン、および／または１つ以上の５－メチル－シチジンを含む。

一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のシュードウリジンを含む。

一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上の５－メチル－シチジンを含む。

一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上の５－メチル－シトシンを含む。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護し、ｍＲＮＡを安定化させ、翻訳を促進するのを補助するためのポリ（Ａ）尾部を含む。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、３´ポリ（Ａ）尾部構造を含む。

特定の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さは、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは少なくとも約５００以上のアデニンヌクレオチド、または任意の介在する数のアデニンヌクレオチドである。特定の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さは、少なくとも約１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、または２７５以上のアデニンヌクレオチドである。

特定の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さは、約１０～約５００アデニンヌクレオチド、約５０～約５００アデニンヌクレオチド、約１００～約５００アデニンヌクレオチド、約１５０～約５００アデニンヌクレオチド、約２００～約５００アデニンヌクレオチド、約２５０～約５００アデニンヌクレオチド、約３００～約５００アデニンヌクレオチド、約５０～約４５０アデニンヌクレオチド、約５０～約４００アデニンヌクレオチド、約５０～約３５０アデニンヌクレオチド、約１００～約５００アデニンヌクレオチド、約１００～約４５０アデニンヌクレオチド、約１００～約４００アデニンヌクレオチド、約１００～約３５０アデニンヌクレオチド、約１００～約３００アデニンヌクレオチド、約１５０～約５００アデニンヌクレオチド、約１５０～約４５０アデニンヌクレオチド、約１５０～約４００アデニンヌクレオチド、約１５０～約３５０アデニンヌクレオチド、約１５０～約３００アデニンヌクレオチド、約１５０～約２５０アデニンヌクレオチド、約１５０～約２００アデニンヌクレオチド、約２００～約５００アデニンヌクレオチド、約２００～約４５０アデニンヌクレオチド、約２００～約４００アデニンヌクレオチド、約２００～約３５０アデニンヌクレオチド、約２００～約３００アデニンヌクレオチド、約２５０～約５００アデニンヌクレオチド、約２５０～約４５０アデニンヌクレオチド、約２５０～約４００アデニンヌクレオチド、約２５０～約３５０アデニンヌクレオチド、もしくは約２５０～約３００アデニンヌクレオチドまたは任意の介在する範囲のアデニンヌクレオチドである。

ポリヌクレオチドの配向を説明する用語には、５´（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３´（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５´から３´の方向または３´から５´の方向で注記され得る。ＤＮＡおよびｍＲＮＡに関して、５´から３´の鎖は、「センス」、「プラス」、または「コード」鎖と呼ばれ、これは、その配列が、［ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除いて］プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるからである。ＤＮＡおよびｍＲＮＡに関して、ＲＮＡポリメラーゼによって転写される鎖である相補的な３´から５´の鎖は、「テンプレート」、「アンチセンス」、「マイナス」、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「逆方向」という用語は、３´から５´の方向で書かれた５´から３´の配列または５´から３´の方向で書かれた３´から５´の配列を指す。

「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５´ＡＧＴＣ
ＡＴＧ３´の相補的鎖は、３´ＴＣＡＧＴＡＣ５´である。後者の配列は、左に５´終端および右に３´終端を有する逆補体、５´ＣＡＴＧＡＣＴ３´として書かれることが多い。その逆補体に等しい配列は、回文配列と言われる。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従って一致している、「部分的」であり得る。または、核酸の間に「完璧な」または「完全な」相補性が存在し得る。

本明細書で使用される「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ＲＮＡを発現し、その後ポリペプチドを発現することができるベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的となる遺伝子（複数可）、例えば、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含有する。別の実施形態において、核酸カセットは、１つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および目的となる遺伝子（複数可）、例えば、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含有する。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要であればタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性のために必要な適切な翻訳後修飾を受け、かつ、適切な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって生物学的活性のために適した区画にトランスロケーションされ得るような位置および配列でベクター内に方向付けられる。好ましくは、いくつかの実施形態において、カセットは、ベクターおよび／またはゲノムへの即座の挿入に適合されたその３´および５´終端を有し、例えば、それは、各終端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態において、核酸カセットは、遺伝的障害を治療、予防、または改善するために使用される療法遺伝子の配列を含有する。カセットは除去され、単一ユニットとしてプラスミドまたはウイルスベクターに挿入され得る。

ポリヌクレオチドは、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。本明細書で使用される場合、「目的となるポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で企図されるように、ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または阻害性ポリヌクレオチドの転写のためのテンプレートとして機能するポリペプチドを指す。

さらに、本明細書で企図されるように、遺伝子コードの縮重の結果として、ポリペプチドをコードし得る多くのヌクレオチド配列またはそのバリアントの断片があることが、当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、いかなるネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用における相違に起因して異なるポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび／または霊長類コドン選択に最適化されるポリヌクレオチドは、特定の実施形態で具体的に企図される。一実施形態において、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つ以上の変異の結果として改変される内因性ポリヌクレオチド配列である。

ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ドナー修復テンプレートを含む。

ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、または別の阻害性ＲＮＡを含むがこれらに限定されない阻害性ポリヌクレオチドを含む。

一実施形態において、阻害性ＲＮＡを含むドナー修復テンプレートは、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば、強力な構造的なｐｏｌＩＩＩ、例えば、ヒトもしくはマウスＵ６ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトおよびマウスＨ１ＲＮＡプロモーター、またはヒトｔＲＮＡ－ｖａｌプロモーター、または強力な構造的なｐｏｌＩＩプロモーターなどの１つ以上の調節配列を含む。

コード配列それ自体の長さにかかわらず、特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所で開示されるか、または当該技術分野において知られているように、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、翻訳後応答要素、および自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされ得、それにより、それらの全体的な長さが、著しく異なり得る。したがって、ほとんどのいかなる長さのポリヌクレオチド断片も用いられ得、合計の長さは、好ましくは調製の容易さおよび意図される組換えＤＮＡプロトコルの使用によって制限されることが特定の実施形態において企図される。

ポリヌクレオチドは、当該技術分野において既知の入手可能な多様な十分に確立された技法のいずれかを使用して、調製、操作、発現、および／または送達され得る。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、適切なベクターに挿入され得る。所望のポリペプチドはまた、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを細胞内に送達することによっても発現され得る。

ベクターの例示的な例には、プラスミド、自律的に複製する配列、および置き換え可能な要素、例えば、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃが含まれるが、これらに限定されない。

ベクターの追加の例示的な例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。

ベクターとして有用なウイルスの例示的な例には、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が含まれるが、これらに限定されない。

発現ベクターの例示的な例には、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子移入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためのかかる発現ベクターにライゲーションされ得る。

特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外で維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡに組み込むことなしに、および宿主細胞の分裂により徐々に喪失されることなく複製することができるベクターを指し、該ベクターは染色体外またはエピソームで複製することも意味する。

発現ベクター中に存在する「発現制御配列」、「制御要素」、または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する、複製のベクター起点のそれらの非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（ＳｈｉｎｅＤａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）イントロン、転写後調節要素、ポリアデニル化配列、５´および３´非翻訳領域である。かかる要素は、それらの強度および特異性が異なり得る。利用されるベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写および翻訳要素を使用され得る。

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されないベクターを含む。ベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの１つ以上の外因性、内因性、または異種制御配列を含み得る。「内因性制御配列」は、ゲノムにおいて所与の遺伝子と自然に連結するものである。「外因性制御配列」は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指向されるように、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子と並立に配置されるものである。「異種制御配列」は、遺伝子操作されている細胞とは異なる種からの外因性配列である。「合成」制御配列は、もう１つの内在性および／もしくは外因性配列、ならびに／または特定の療法のための最適なプロモーターおよび／またはエンハンサー活性を提供することがインビトロもしくはインシリコで決定された配列の要素を含んでもよい。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを惹起および転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞において作動されるプロモーターは、転写が惹起される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴが豊富な領域を含み、かつ／または転写の開始から７０～８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、式中、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る。

「エンハンサー」という用語は、強化された転写を提供することができる配列を含有し、いくつかの場合において、別の制御配列に対するその方向とは独立して機能し得るＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサー要素と協同的または相加的に機能し得る。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。

「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成要素が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列（プロモーター、および／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的となるポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指し、ここで、発現制御配列によって、第２の配列に対応する核酸の転写が指向される。

本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、幅広い多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーであり得るか、または制限された多様な細胞および組織型それぞれにおける発現を可能にする、「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、もしくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーであり得る。

特定の実施形態において使用するのに好適な例示的な遍在発現制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最早期プロモーター、ウイルスシリアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、早期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルスからのＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、短伸長因子１－アルファ（ＥＦ１ａ－短）プロモーター、長伸長因子１－アルファ（ＥＦ１ａ－長）プロモーター、早期成長応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳惹起因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（β－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２５，１４７７－１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失した、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ．６９（２）：７４８－５５（１９９５））が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、細胞系列特異的、または組織特異的な発現を達成するために（例えば、ポリペプチドをコードする特定の核酸を細胞型、細胞系列、もしくは組織のサブセットにおいてのみ、または特定の発生段階に発現させるために）細胞、細胞型、細胞系列、または組織特異的発現制御配列を使用することが望ましい場合がある。

本明細書で使用される場合、「条件発現」は、誘導性発現、抑圧可能な発現、特定の生理学的、生物学的、または疾患の状態を有する細胞または組織における発現などが挙げられるが、これらに限定されない、任意の種類の条件発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を除外することを意図しない。ある特定の実施形態は、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理もしくは条件、または目的となるポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現の増大もしくは減少を引き起こす処理もしくは条件に供することによって発現が制御される、目的となるポリヌクレオチドの条件発現を提供する。

誘導性プロモーター／系の例示的な例には、ステロイド誘導性プロモーター、例えば、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなど（対応するホルモンで処理することによって誘導される）、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（種々の重金属で処理することによって誘導される）、ＭＸ－１プロモーター（インターフェロンによって誘導される）、「遺伝子スイッチ」ミフェプリストン調節可能系（Ｓｉｒｉｎｅｔａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが含まれるが、これらに限定されない。

条件発現はまた、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。ある特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも１つの（典型的に、２つの）部位（複数可）を含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であり得る、１つ以上の組換え部位（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個以上）を伴う組換え反応に関与する切除的または組み換え的なタンパク質、酵素、補因子もしくは関連するタンパク質（Ｌａｎｄｙ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：６９９－７０７（１９９３）を参照されたい）、またはそれらの変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質）、断片、およびバリアントを含む。特定の実施形態において使用するのに好適なリコンビナーゼの例示的な例には、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが含まれるが、これらに限定されない。

ポリヌクレオチドは、幅広い多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１つ以上の組換え部位を含み得る。部位特異的リコンビナーゼの標的部位が、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みのために必要とされる任意の部位（複数可）に加えたものであることが理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。

例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの組換え部位は、８塩基対コア配列と隣接した２つの１３塩基対の逆方向繰り返し（リコンビナーゼ結合部位としての機能を果たす）を含む３４塩基対の配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：５２１－５２７（１９９４））。他の例示的なｌｏｘＰ部位としては、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓｅｔａｌ．，１９９６、ＢｅｔｈｋｅａｎｄＳａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（ＬｅｅａｎｄＳａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（ＬｅｅａｎｄＳａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔｅｔａｌ．，１９９５）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔｅｔａｌ．，１９９５）が挙げられるが、これらに限定されない。

ＦＬＰリコンビナーゼのために好適な認識部位には、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔａｌ．，１９９６）、Ｆ_１、Ｆ_２、Ｆ_３（ＳｃｈｌａｋｅａｎｄＢｏｄｅ，１９９４）、Ｆ_４、Ｆ_５（ＳｃｈｌａｋｅａｎｄＢｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆｅｔａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆｅｔａｌ．，１９８８）が含まれるが、これらに限定されない。

認識配列の他の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列であり、これらは、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ－ｃ３１によって認識される。φＣ３１ＳＳＲは、ヘテロタイプの部位ａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さ３９ｂｐ）との間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈｅｔａｌ．，２０００）。ａｔｔＢおよびａｔｔＰは、それぞれ細菌ゲノムおよびファージゲノムに対するファージインテグラーゼの付着部位に対して名づけられ、どちらも、φＣ３１ホモ二量体が結合する可能性が高い不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈｅｔａｌ．，２０００）。産物の部位であるａｔｔＬおよびａｔｔＲは、さらなるφＣ３１媒介性組換えに対して有効に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉｅｔａｌ．，２００３）、それによって反応が不可逆的になる。挿入を触媒するために、ゲノムのａｔｔＰ部位へのａｔｔＢを有するＤＮＡの挿入が、ゲノムのａｔｔＢ部位へのａｔｔＰ部位の挿入よりも容易であることが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎｅｔａｌ．，２００１；Ｂｅｌｔｅｋｉｅｔａｌ．，２００３）。したがって、典型的な戦略では、相同組換えによってａｔｔＰを有する「ドッキング部位」を定義された遺伝子座に位置付け、次いで、それを挿入のために、ａｔｔＢを有する入ってくる配列とパートナーにする。

一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、一対のリコンビナーゼ認識部位に隣接したドナー修復テンプレートポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、修復テンプレートポリヌクレオチドは、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、またはａｔｔ部位に隣接する。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の目的となるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断型ポリペプチドをコードする１つ以上のＩＲＥＳ配列またはポリヌクレオチド配列によって分離され得る。

本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＡＴＧなどの惹起コドンへのシストロン（タンパク質をコードする領域）の直接内部リボソーム侵入を促進し、それによって、キャップに依存しない遺伝子の翻訳をもたらす要素を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，１９９０．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ１５（１２）：４７７－８３）およびＪａｃｋｓｏｎａｎｄＫａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ１（１０）：９８５－１０００を参照されたい。当業者によって一般に用いられるＩＲＥＳの例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されるものを含む。当該技術分野で既知の「ＩＲＥＳ」のさらなる例としては、ピコルナウイルスから得られるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，１９９０）およびウイルスまたは細胞ｍＲＮＡ源から得られるＩＲＥＳ、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚｅｔａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８－６１９０）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ、ならびに酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販の脳心筋炎（ｅｎｃｅｐｈｅｌｏｍｙｃａｒｄｉｔｉｓ）ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅｅｔａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６６（３）：１６０２－９）、およびＶＥＧＦＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚｅｔａｌ．，１９９８．ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１８（１１）：６１７８－９０）が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳはまた、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ種のウイルスゲノム、ならびにＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）において報告されている。

一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドで使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶＩＲＥＳである。

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を有し、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、リボソームの小さなサブユニットに対するｍＲＮＡの初期結合を大幅に促進し、翻訳を増加させる、短ヌクレオチド配列を指す。コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号７５）であり、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３－９２およびＫｏｚａｋ，１９８７．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５（２０）：８１２５－４８）。

異種核酸転写物の効率的な終止およびポリアデニル化を指向する要素は、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは、概して、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される場合、「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって発生期のＲＮＡ転写物の終止およびポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリＡ尾部からコード配列の３´終端の付加によってｍＲＮＡの安定性を促進し、したがって、翻訳効率の増加に寄与し得る。切断およびポリアデニル化は、ＲＮＡにおいてポリ（Ａ）配列によって指向される。哺乳動物ｐｒｅ－ｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断－ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識要素を有する。典型的には、ほとんどのインバリアントなＡＡＵＡＡＡ六量体は、ＵまたはＧＵ残基が豊富なより可変性である要素の２０～５０ヌクレオチド上流にある。発生期の転写物の切断は、これらの２つの要素間で起こり、５´切断産物への最大２５０アデノシンの付加に連結する。特定の実施形態において、コアポリ（Ａ）配列は、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態において、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、そのバリアント、または当該技術分野において既知の別の好適な異種もしくは内因性ポリＡ配列を含む。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む細胞は、直接毒性および／または制御されていない増殖の危険性を低減させるために、誘導性自殺遺伝子を含む、自殺遺伝子を利用する。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を含む宿主に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ－９またはカスパーゼ－８またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ－９は、二量化の特定の化学誘導物質（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、インビボで負の選択の影響を受けやすい本明細書で企図される遺伝子修飾細胞を引き起こす遺伝子セグメントを含む。「負の選択」は、個体のインビボでの状態の変化の結果として排除され得る注入された細胞を指す。負の選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入から生じ得る。負の選択遺伝子は当該技術分野において知られており、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＩＴＫ）遺伝子；細胞ヒポキサンチンホスフリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、および細菌シトシンデアミナーゼが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、遺伝子修飾細胞は、インビトロで負の選択可能表現型の細胞の選択を可能にする正のマーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含む。正の選択可能マーカーは、宿主細胞内に導入されたとき、その遺伝子を運搬する細胞の正の選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。この型の遺伝子は当技術分野において知られており、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与する、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。

一実施形態において、正の選択可能マーカーおよび負の選択可能要素は、負の選択可能要素の喪失がまた必ず、正の選択可能マーカーの喪失を伴うように連結される。特定の実施形態において、正のおよび負の選択可能マーカーは、一方の喪失が、義務的に、他方の喪失をもたらすように融合される。発現産物として、上述の所望の正の選択特徴および負の選択特徴の両方を付与するポリペプチドをもたらす融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでの正の選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、およびインビボでの負の選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドもたらす。優性の正の選択可能マーカーを負の選択可能マーカーと融合することに由来する二機能性選択可能融合遺伝子の使用に関して記載する、Ｓ．Ｄ．ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の刊行物も参照されたい。

好ましい正の選択可能マーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましい負の選択可能マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ－ＩＴＫ、ＶＺＶＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来する。特定の実施形態において企図される代表的な二機能性選択可能融合遺伝子には、正の選択可能マーカーが、ｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、負の選択可能マーカーが、シトシンデアミナーゼ、またはＴＫ遺伝子もしくは選択可能マーカーに由来する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシング酵素、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルス方法およびウイルス方法の両方によって、造血細胞、例えば、Ｔ細胞内に導入され得る。特定の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートの送達は、同じ方法によってもしくは異なる方法によって、および／または同じベクターもしくは異なるベクターによって提供され得る。

「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指すように本明細書で使用される。移入された核酸は、概して、ベクター核酸分子に連結され、例えば、それに挿入される。ベクターは、細胞中に自律複製を指向する配列を含み得るか、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書で企図される１つ以上のポリヌクレオチドをＴ細胞に送達するために使用される。

非ウイルスベクターの例示的な例には、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法には、電気穿孔、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ウイロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオン、または脂質：核酸共役体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介移入、遺伝子銃、および熱ショックが含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において企図される特定の実施形態において使用するのに好適なポリヌクレオチド送達系の例示的な例には、ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃによって提供されるものが含まれるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質が文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕｅｔａｌ．（２００３）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．１０：１８０－１８７およびＢａｌａｚｓｅｔａｌ．（２０１１）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１－１２を参照されたい。抗体標的のバクテリア由来の非生存のナノ細胞系送達もまた、特定の実施形態において企図される。

特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、以下に記載されるように、個別の患者への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所適用によって、インビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、個別の患者から外植された細胞（例えば、動員された末梢血液、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）などの細胞にエクスビボで、または万能ドナー造血幹細胞に送達され得、続いて、患者に細胞を再移植することができる。

一実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび／またはドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターが、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与される。あるいは、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔が含まれるが、これらに限定されない、血液または組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常使用される任意の経路による。かかる核酸を投与する好適な方法は、利用可能でかつ当業者に良く知られており、１つを超える経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、別の経路よりもより即時的かつより有効な反応を提供し得る場合が多い。

本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なウイルスベクター系の例示的な例には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。

様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）で細胞を形質導入することによって、造血細胞、例えば、Ｔ細胞内に導入される。

ＡＡＶは、小さな（約２６ｎｍ）複製欠損、主に、エピソーム非エンベロープで覆われたウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、典型的には、最低限でも、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに５´および３´ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）から構成される。ＩＴＲ配列は、長さが約１４５ｂｐである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０から単離される、ＩＴＲおよびカプシド配列を含む。

いくつかの実施形態において、キメラｒＡＡＶが使用され、ＩＴＲ配列は、１つのＡＡＶ血清型から単離され、カプシド配列は、異なるＡＡＶ血清型から単離される。例えば、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来するカプシド配列を有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と称される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からのＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のいずれか１つからのカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来するカプシド配列を含む。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ２に由来するカプシド配列を含む。

いくつかの実施形態において、遺伝子操作方法および選択方法を、ＡＡＶカプシドに適用して、それが目的となる細胞を形質移入させる可能性を高める。

ｒＡＡＶベクターの構築、産生、およびその精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号、第９，１６９，４９２号、第９，０１２，２２４号、第８，８８９，６４１号、第８，８０９，０５８号、および第８，７８４，７９９号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、１つ以上のポリヌクレオチドを含むレトロウイルス、例えば、レンチウイルスで細胞を形質導入することによって、造血細胞内に導入される。

本明細書で使用されるとき、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖２本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態における使用に好適な例示的なレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、ならびにレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または族）を指す。例示的なレンチウイルスには、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、ビスナ－マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶを基にしたベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列要素）が好ましい。

様々な実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、本明細書の他の箇所で議論されるように、１つ以上のＬＴＲ、および以下のアクセサリー要素：ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、プシー（Ψ）パッケージングシグナル、搬出要素、ポリ（Ａ）配列のうちの１つ以上または全てを含み、任意に、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、絶縁体要素、選択可能なマーカー、および細胞自殺遺伝子を含み得る。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、組み込み的または非組み込みまたは組み込み欠損レンチウイルスであり得る。本明細書で使用される場合、「組み込み欠損レンチウイルス」または「ＩＤＬＶ」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む能力を欠いているインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組み込み－インコンピテントウイルスベクターは、特許出願第ＷＯ２００６／０１０８３４号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

インテグラーゼ活性を低減させるために好適なＨＩＶ－１ｐｏｌ遺伝子における例示的な変異には、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、およびＫ２６４Ｈが含まれるが、これらに限定されない。

一実施形態において、ＨＩＶ－１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１５２Ｇ、もしくはＥ１５２Ａ変異；Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、およびＥ１５２Ｇ変異；またはＤ６４Ｖ、Ｄ１１６Ａ、およびＥ１５２Ａ変異を含む。

一実施形態において、ＨＩＶ－１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ変異を含む。

「長い末端繰り返し（ＬＴＲ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの終端に位置する塩基対のドメインを指し、それらの天然の配列の状況では、直接繰り返しであり、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域を含む。

本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰ要素」または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、配列が、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２の中央ポリプリン区域および中央終止配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。好適なＦＬＡＰ要素は、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴおよび／またはＣＴＳ要素内で１つ以上の変異を有するＦＬＡＰ要素を含む。さらに別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴまたはＣＴＳ要素のいずれかを含む。さらに別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴまたはＣＴＳ要素を含まない。

本明細書で使用されるとき、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子へのウイルスＲＮＡの挿入に必要とされるレトロウイルスゲノム内に位置するプシー［Ψ］配列を指し、例えば、Ｃｌｅｖｅｒｅｔａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１－２１０９を参照されたい。

「搬出要素」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節要素を指す。ＲＮＡ搬出要素の例には、ヒト免疫不全ウィルスウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎｅｔａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎｅｔａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ５８：４２３を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＰＲＥ）が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節要素、効率的なポリアデニル化部位、および任意に、転写終止シグナルをベクターに組み込むことによって増加される。多様な転写後調節要素は、タンパク質での異種核酸の発現、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節要素（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）、および同等物（Ｌｉｕｅｔａｌ．，１９９５，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，９：１７６６）を増加し得る。

レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲの修飾の結果としていくつかの安全性の強化を含む。「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、例えば、１回目のウイルス複製を上回ってウイルスが転写されることを防ぐために、Ｕ３領域として既知の右側の（３´）ＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域が修飾された（例えば、欠失または置換によって）複製欠損性ベクターを指す。追加の安全性の強化は、ウイルス粒子の産生時にウイルスゲノムの転写を駆り立てるために、５´ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換えることによって提供される。使用され得る異種プロモーターの例には、例えば、ウイルスサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、早期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最早期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが含まれ得る。

本明細書で使用される場合、「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧ－タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングされ得、これにより、ＨＩＶがより広い範囲の細胞に感染することが可能になるが、これは、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）が、通常、ウイルスの標的をＣＤ４^＋提示細胞とするためである。

ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、既知の方法に従って産生される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒｅｔａｌ．，ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－９－１０、Ｋｕｔｎｅｒｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５－５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。

本明細書で企図されるある特定の実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のほとんどまたは全てが、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ－１に由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび／もしくはレンチウイルス配列の多くの異なる源を使用することができるか、またはある特定のレンチウイルス配列の組み合わせられた多数の置換および改変が、移入ベクターの本明細書に記載される機能を行う能力を損なうことなく適応され得ることが理解されるべきである。さらに、多様なレンチウイルスベクターが当該技術分野で知られており、Ｎａｌｄｉｎｉｅｔａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、および１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌｅｔａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号、および第５，９９４，１３６号を参照されたく、これらの多くは、本明細書で企図されるウイルスベクターまたは移入プラスミドを産生するために適合され得る。

様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで細胞を形質導入することによって、造血細胞内に導入される。

アデノウイルスを基にしたベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に産生され得る。ほとんどのアデノウイルスベクターが、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように遺伝子操作され、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見出されるものなどの非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入し得る。従来のＡｄベクターは、高い運搬能力を有する。

複製欠損である現行のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ａｄ５ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎臓細胞から形質転換されて、Ｅ１タンパク質を構造的に発現する２９３と呼ばれる固有のヘルパー細胞株を利用し得る（Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムには不必要であるため（Ｊｏｎｅｓ＆Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、現行のアデノウイルスベクターは、２９３細胞を利用して、Ｅ１、Ｄ３、または両方のいずれかの領域に外来ＤＮＡを運搬する（Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核性遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏｅｔａｌ．，１９９１、Ｇｏｍｅｚ－Ｆｏｉｘｅｔａｌ．，１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ＆Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２、Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）において使用されている。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与した研究には、気管点滴（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔａｌ．，１９９１、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔｅｔａｌ．，１９９３）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ＆Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳内への定位接種（ＬｅＧａｌＬａＳａｌｌｅｅｔａｌ．，１９９３）が含まれる。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を伴った（Ｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：１０８３－９（１９９８））。

様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペスウイルス、例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２で細胞を形質導入することによって、造血細胞内に導入される。

成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである直鎖２本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを含むエンベロープで覆われた二十面体カプシドからなる。一実施形態において、ＨＳＶを基にしたウイルスベクターは、１つ以上の必須または非必須ＨＳＶ遺伝子において欠損している。一実施形態において、ＨＳＶを基にしたウイルスベクターは、複製欠損である。ほとんどの複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を防ぐために１つ以上の最早期、早期、または後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含有する。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される最早期遺伝子において欠損であり得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期間のＤＮＡ発現をもたらし得る潜伏期に入る能力、および最大２５ｋｂの外因性ＤＮＡを収容し得るその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶを基にしたベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、第５，８４６，７８２号、および第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願第ＷＯ９１／０２７８８号、第ＷＯ９６／０４３９４号、第ＷＯ９８／１５６３７号、および第ＷＯ９９／０６５８３号において記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Ｈ．ゲノム編集された細胞
特定の実施形態において企図される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、ＣＢＬＢ遺伝子において１つ以上の遺伝子編集を含み、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも１つの症状の予防、治療、または緩和のための改善された細胞を基にした療法を提供する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図される組成物および方法は、部分的に、療法的な細胞を免疫抑制シグナルおよび疲弊に対してより持続性およびより耐性を有するようにすることによって、養子細胞療法の有効性を増加させると考えられる。

特定の実施形態において企図されるゲノム編集された細胞は、自己移植／自源（「自己（ｓｅｌｆ）」）または非自己移植（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であり得る。本明細書で使用される場合、「自己移植」は、同じ対象からの細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同種」は、相対的に遺伝的に細胞とは異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同系」は、相対的に遺伝的に細胞と同一である異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「異種」は、相対的に細胞に対して異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物対象から得られる。より好ましい実施形態において、細胞は、霊長類対象、任意に、非ヒト霊長類から得られる。最も好ましい実施形態において、細胞は、ヒト対象から得られる。

「単離された細胞」は、インビボ組織または臓器から得られたもので、細胞外マトリックスを実質的に含まない、自然発生しない細胞、例えば、自然には存在しない細胞、修飾細胞、遺伝子操作された細胞などを指す。

本明細書で使用される場合、「細胞の集団」という用語は、本明細書の他の箇所に記載される同種または異種細胞型の任意の数および／または組み合わせから構成され得る複数の細胞を指す。例えば、Ｔ細胞の形質導入のために、細胞の集団は、末梢血液から単離され得るか、または得ることができる。細胞の集団は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％の編集される標的細胞型を含み得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、当該技術分野において既知の方法を使用して、異種細胞の集団から単離または精製され得る。

ゲノムが本明細書で企図される組成物および方法を使用して編集され得る細胞型の例示的な例には、細胞株、初代細胞、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞、ならびにそれらの混合細胞が含まれるが、これらに限定されない。

好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物および方法は、造血細胞、より好ましくは免疫細胞、およびさらにより好ましくはＴ細胞を編集するために使用される。

「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野で認識されており、胸腺細胞、免疫エフェクター細胞、調節Ｔ細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことを意図する。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）ＣＤ４^＋Ｔ細胞、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、腫瘍湿潤細胞障害性Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^－ＣＤ８^－Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットである。一実施形態において、Ｔ細胞は、免疫エフェクター細胞である。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＮＫＴ細胞である。特定の実施形態において使用するのに好適なＴ細胞の他の例示的な集団には、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞が含まれる。

様々な実施形態において、ゲノム編集された細胞は、本明細書で企図される組成物および方法によって編集されたＣＢＬＢ遺伝子を含む免疫エフェクター細胞を含む。「免疫エフェクター細胞」は、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。特定の実施形態において企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。

「強力なＴ細胞」および「幼若Ｔ細胞」は、特定の実施形態において互換的に使用され、Ｔ細胞が増殖と同時に分化の減少が可能であるＴ細胞表現型を指す。特定の実施形態において、幼若Ｔ細胞は、「ナイーブＴ細胞」の表現型を有する。特定の実施形態において、幼若Ｔ細胞は、以下の生物学的マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの１つ以上、または全てを含む。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、以下の生物学的マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの１つ以上、または全てを含む。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、およびＬＡＧ３の発現を欠いている。

Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含むがこれらに限定されない多くの源から得ることができる。

特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む細胞の集団は、編集されたＣＢＬＢ遺伝子を含み、ここで、編集は、ＮＨＥＪによって修復されたＤＳＢである。特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞は、編集されたＣＢＬＢ遺伝子を含み、ここで、編集は、ＮＨＥＪによって修復されたＤＳＢである。特定の実施形態において、編集は、ＣＢＬＢ遺伝子のコード配列における、好ましくはＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６において、より好ましくはＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６における配列番号２０（または、配列番号２２）での約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上のヌクレオチドの挿入または欠失（ＩＮＤＥＬ）である。

特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む細胞の集団は、ＨＤＲによって修復されたＤＳＢで組み込まれたドナー修復テンプレートを含む編集されたＣＢＬＢ遺伝子を含む。

特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む細胞の集団は、ＣＢＬＢ遺伝子またはその部分を含むドナー修復テンプレートを含む編集されたＣＢＬＢ遺伝子を含み、ゲノムＣＢＬＢ配列において１つ以上の変異を導入して、ＣＢＬＢ発現活性またはシグナル伝達を修飾し、好ましくはＣＢＬＢ発現、活性、および／またはシグナル伝達を減少させるかまたは排除するように設計される。

様々な実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＣＢＬＢ遺伝子における編集を含み、フリップ受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子をコードするポリヌクレオチド；サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＴＮＦ－α）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－３、およびＲＡＮＴＥＳ）、細胞毒素（例えば、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢ）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、およびＩＬ－２１受容体）、または遺伝子操作された抗原受容体（例えば、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体）をさらに含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドおよびヌクレアーゼバリアントを含むドナー修復テンプレートは、細胞内に導入され、ポリヌクレオチドは、ＨＤＲ修復によってＣＢＬＢ遺伝子におけるＤＳＢ部位で細胞のゲノム内に組み込まれる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、ポリヌクレオチドを含むベクターで細胞を形質導入することによって、ＣＢＬＢ遺伝子以外の部位でも細胞内に導入され得る。

Ｉ．組成物および製剤
特定の実施形態において企図される組成物は、本明細書で企図されるような、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、ならびにゲノム編集組成物およびゲノム編集された細胞組成物を含み得る。特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、細胞または細胞の集団におけるヒトＣＢＬＢ遺伝子中の標的部位を編集するのに有用である。好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物は、造血細胞、例えば、Ｔ細胞または免疫エフェクター細胞内のＣＢＬＢ遺伝子を編集するために使用される。

様々な実施形態において、本明細書で企図される組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および任意に、エンドプロセシング酵素、例えば、３´－５´エキソヌクレアーゼ（Ｔｒｅｘ２）を含む。ヌクレアーゼバリアントは、開示されるポリヌクレオチド送達方法（上記参照）、例えば、電気穿孔、脂質ナノ粒子などを介して細胞内に導入されるｍＲＮＡの形態であり得る。一実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、および任意に、３´－５´エキソヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物は、開示されるポリヌクレオチド送達方法（上記参照）を介して細胞において導入される。組成物は、エラープローンＮＨＥＪによってゲノム編集された細胞またはゲノム編集された細胞の集団を生成するために使用され得る。

様々な実施形態において、本明細書で企図される組成物は、ドナー修復テンプレートを含む。組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および任意に、エンドプロセシング酵素を発現させるかまたは発現させるであろう細胞に送達され得る。一実施形態において、組成物は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、および任意に、３´－５´エキソヌクレアーゼを発現させるかまたは発現させるであろう細胞に送達され得る。ドナー修復テンプレートの存在下での遺伝子編集酵素の発現は、ＨＤＲによってゲノム編集された細胞またはゲノム編集された細胞の集団を生成するために使用され得る。

特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、および任意に、ドナー修復テンプレートを含む。特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、末端プロセシング酵素、および任意選択でドナー修復テンプレートを含む。ヌクレアーゼバリアントおよび／またはエンドプロセシング酵素は、開示されるポリヌクレオチド送達方法（上記参照）を介して細胞内に導入されるｍＲＮＡの形態であり得る。

特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、および任意に、ドナー修復テンプレートを含む。特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、３´－５´エキソヌクレアーゼ、および任意に、ドナー修復テンプレートを含む。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および／または３´－５´エキソヌクレアーゼは、開示されるポリヌクレオチド送達方法（上記参照）、例えば、電気穿孔を介して細胞内に導入されるｍＲＮＡの形態であり得る。

特定の実施形態において、細胞の集団は、遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞を含む。

組成物には、薬学的組成物が含まれるが、これらに限定されない。「薬学的組成物」は、単独でまたは療法の１つ以上の他のモダリティと組み合わせて、細胞または動物への投与のために、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液中に製剤化される組成物を指す。所望される場合、組成物が、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法薬プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤などの他の薬剤と組み合わせて投与され得ることも理解されよう。組成物に含めてよい他の構成成分に対する限定は実質的に存在しないが、但し、追加の薬剤が、組成物に悪影響を及ぼさないことを条件とする。

「薬学的に許容される」という語句は、適切な医学的判断の範囲内において、妥当な利益／危険性比に釣り合った、過度の毒性、炎症、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症などを伴うことなく、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に好適である化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すように本明細書で用いられる。

「薬学的に許容される担体」は、療法細胞と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的担体の例示的な例は、細胞培養培地、水、ならびに石油、動物、植物、または合成起源の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などを含む油などの滅菌液体であり得る。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注入可能溶液用の液体担体として用いられ得る。特定の実施形態において好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。任意の従来の培地または薬剤が活性な成分と適合しないということを除いて、療法的組成物においてその使用が企図される。補足的活性成分も、組成物中に組み込まれ得る。

一実施形態において、薬学的に許容可される担体を含む組成物は、対象への投与に好適である。特定の実施形態において、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内、または筋肉内投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される担体を含む組成物は、脳室内、脊髄内、または髄腔内投与に好適である。薬学的に許容される担体には、減菌水溶液、細胞培養培地、または分散液が含まれる。薬学的に活性な物質のためのかかる培地および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の培地または薬剤が形質導入された細胞と適合しないということを除いて、薬学的組成物においてその使用が企図される。

特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、遺伝子修飾されたＴ細胞および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で企図される細胞を基にした組成物を含む組成物は、所望の治療ゴールを有効にするために、腸内もしくは非経口投与方法によって別個に、または他の好適な化合物と組み合わせて投与され得る。

薬学的に許容される担体は、治療されるヒト対象への投与にそれを好適にするために、十分に高純度のものおよび十分に低毒のものであるべきである。担体はさらに、組成物の安定性を維持するかまたは増大させるべきである。薬学的に許容される担体は、液体または固形であり得、組成物の他の構成要素と組み合わされたときに所望の嵩、粘度などを提供するために、念頭に計画された投与の様式を以って選択される。例えば、薬学的に許容される担体は、結合薬剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）であり得るが、これらに限定されない。本明細書で企図される組成物のための他の好適な薬学的に許容される担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘着性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。

かかる担体溶液は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤も含み得る。本明細書で使用される場合、「緩衝剤」という用語は、化学的構成物質がｐＨの著しい変化を伴うことなく、酸または塩基を中和する溶液または液体を指す。本明細書で企図される緩衝剤の例には、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンガー溶液、水中の５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）、通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）が含まれるが、これらに限定されない。

薬学的に許容される担体は、約７の組成物のｐＨを維持するのに十分な量で存在し得る。あるいは、組成物は、約６．８～約７．４、例えば、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、および７．４の範囲のｐＨを有する。さらに別の実施形態において、組成物は、約７．４のｐＨを有する。

本明細書で企図される組成物は、非毒性の薬学的に許容される培地を含み得る。組成物は、懸濁液であり得る。本明細書で使用される場合、「懸濁」という用語は、細胞が固形支持体に結合しない非粘着性状態を指す。例えば、懸濁液として維持される細胞は、撹拌または扇動され得、培養皿などの支持体に粘着しない。

特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、懸濁液中で製剤化され、ここで、ゲノム編集されたＴ細胞が静脈注射用（ＩＶ）袋などの中で、許容される液体培地または溶液、例えば、生理食塩水または血清不含培地中に分散される。許容される希釈剤には、水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、リンガー溶液、等張性塩化ナトリウム（生理食塩水）溶液、血清不含細胞培養培地、および極低温保存に好適な培地、例えば、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）培地が含まれるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、ヒトまたは動物起源の天然タンパク質を実質的に含まず、ゲノム編集されたＴ細胞の集団を含む組成物を保存するのに好適である。療法的組成物は、ヒト患者に投与されることが意図され、したがって、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、および胎仔血清などの細胞培養構成成分を実質的に含まない。

いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地中で製剤化される。かかる組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は、血清不含培地である。

血清不含培地は、単純化組成物およびより良好な規定組成物、低度の汚染物質、感染剤の潜在源の排除、およびより低費用を含む、血清含有培地を上回るいくらかの利点を有する。様々な実施形態において、血清不含培地は、動物質を含まず、任意に、タンパク質を含み得ない。任意に、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含有し得る。「動物質を含まない」培地は、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中の天然動物タンパク質に置き換わり、栄養素は、合成、植物、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は、タンパク質を実質的に含まないと定義される。

特定の組成物において使用される血清不含培地の例示的な例には、ＱＢＳＦ－６０（ＱｕａｌｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＸ－ＶＩＶＯ１０が含まれるが、これらに限定されない。

好ましい実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ中で製剤化される。

様々な実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞を含む組成物は、凍結保存培地中で製剤化される。例えば、凍結保存薬剤を有する凍結保存培地は、解凍後に高い細胞生存率の結果を維持するために使用され得る。特定の組成物において使用される凍結保存培地の例示的な例には、ＣｒｙｏＳｔｏｒＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒＣＳ２が含まれるが、これらに限定されない。

一実施形態において、組成物は、５０：５０でＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡ対ＣｒｙｏＳｔｏｒＣＳ１０を含む溶液中で製剤化される。

特定の実施形態において、組成物は、マイコプラズマ、内毒素、および微生物汚染を実質的に含まない。内毒素に対する「実質的に含まない」は、生物製剤に関してＦＤＡによって承認されている内毒素よりも細胞の１用量当たりの内毒素が少なく、これは、総内毒素が１日当たり５ＥＵ／体重ｋｇであり、平均７０ｋｇの人は３５０ＥＵ／総用量の細胞であることを意味する。特定の実施形態において、本明細書で企図されるレトロウイルスベクターで形質導入された造血性幹細胞または前駆細胞を含む組成物は、約０．５ＥＵ／ｍＬ～約５．０ＥＵ／ｍＬ、または約０．５ＥＵ／ｍＬ、１．０ＥＵ／ｍＬ、１．５ＥＵ／ｍＬ、２．０ＥＵ／ｍＬ、２．５ＥＵ／ｍＬ、３．０ＥＵ／ｍＬ、３．５ＥＵ／ｍＬ、４．０ＥＵ／ｍＬ、４．５ＥＵ／ｍＬ、または５．０ＥＵ／ｍＬを含有する。

ある特定の実施形態において、１つ以上の再プログラム化されたヌクレアーゼをコードする１つ以上のｍＲＮＡ、および任意に、エンドプロセシング酵素を含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドの送達に好適な組成物および製剤が企図される。

エクスビボ送達のための代表的な製剤には、リン酸カルシウム、電気穿孔、熱ショック、および種々のリポソーム製剤（すなわち、脂質媒介性トランスフェクション）などの当該技術分野において既知の種々のトランスフェクション薬剤の使用も含まれ得る。下記でより詳細に記載のリポソームは、水性流体の画分を封入する脂質二重層である。ＤＮＡは、カチオン性リポソームの外表面に（その荷電に基づいて）自発的に会合し、これらのリポソームは、細胞膜と相互作用する。

特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体溶液の製剤は、例えば、腸内および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、脳室内、脳内、頭蓋内、脊髄内、髄腔内、および髄内投与および製剤を含む、多様な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するのに好適な投薬および治療レジメンの開発であるとして当業者に良く知られている。本明細書で企図される特定の実施形態が薬学的分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌｕｍｅＩａｎｄｖｏｌｕｍｅＩＩ．２２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ．ＥｄｉｔｅｄｂｙＬｏｙｄＶ．ＡｌｌｅｎＪｒ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ；２０１２に記載されており、それはその全体において本明細書に参照により組み込まれる。

Ｊ．ゲノム編集された細胞療法
本明細書で企図される組成物および方法によって製造された編集されたＣＢＬＢ遺伝子を含む細胞は、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも１つの症状の予防、治療、または緩和において使用するための改善された製剤を提供する。本明細書で使用される場合、「製剤」という用語は、本明細書で企図される組成物および方法を使用して産生された遺伝子修飾された細胞を指す。特定の実施形態において、製剤は、遺伝子的に編集された免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む。好ましい実施形態において、製剤は、ＴＣＲもしくはＣＡＲまたは他の遺伝子操作された抗原受容体を発現する遺伝子的に編集された免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む。さらに、特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、Ｔ細胞疲弊に対して耐性を有し、かつ腫瘍微小環境において増加した耐久性および持続性を示し、持続的な療法をもたらし得るため、より安全かつより有効である養子細胞療法を提供する。

特定の実施形態において、編集されたＣＢＬＢ遺伝子を含む有効量のゲノム編集された免疫エフェクター細胞またはＴ細胞は、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも１つの症状を予防、治療、または緩和するために対象に投与される。

特定の実施形態において、ＣＢＬＢで編集された細胞は、ＣＢＬＢを実質的に発現しないか、またはその発現を欠いており、したがって、機能的ＣＢＬＢ発現および／または活性を欠いているか、または実質的に欠いており、例えば、Ｔ細胞疲弊を増加させ、炎症促進性サイトカインの発現を阻害する能力を欠いている。特定の実施形態において、ＣＢＬＢを欠いているゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルに対してより耐性を有しており、増加した持続性およびＴ細胞疲弊に対する耐性を示す。

特定の実施形態において、癌の少なくとも１つの症状を予防、治療、または緩和する方法は、編集されたＣＢＬＢ遺伝子および遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、もしくはＤａｒｉｃ、または他の療法的な導入遺伝子を含む有効量のゲノム編集された免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を対象に投与して、細胞を腫瘍または癌に再指向させることを含む。遺伝子修飾された細胞は、ＣＢＬＢ遺伝子を編集することに基づいて腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルに対してより耐性を有して、ＣＢＬＢ発現を減少または排除するため、より耐久性および持続性がある製剤である。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、固形腫瘍または癌の治療において使用される。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、副腎癌、副腎皮質癌腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管癌腫、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌腫（ＤＣＩＳ）子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織肉腫、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、頭頸部癌、血管芽細胞腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼内黒色腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌腫、髄芽細胞腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、メルケル細胞癌腫、正中管細胞癌腫、口腔癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口腔癌（ｏｒａｌｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌｃａｖｉｔｙｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌腫、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌腫、腎盂および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、脂腺癌腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌腫、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、汗腺癌腫、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管の癌、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない、固形腫瘍または癌の治療において使用される。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌が含まれるが、これらに限定されない固形腫瘍または癌の治療において使用される。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、膵臓、膀胱、および肺が含まれるが、これらに限定されない種々の癌の治療において使用される。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、液体癌または血液癌の治療において使用される。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が含まれるが、これらに限定されないＢ細胞悪性腫瘍の治療において使用される。

特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞性白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、ならびに髄外性形質細胞腫が含まれるが、これらに限定されない、液体癌の治療において使用される。

本明細書で企図されるゲノム編集方法において使用するのに好ましい細胞には、自己移植／自源（「自己」）細胞、好ましくは造血細胞、より好ましくはＴ細胞、およびより好ましくは免疫エフェクター細胞が含まれる。一実施形態において、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。

特定の実施形態において、治療上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞またはそれを含む組成物を、単独でまたは１つ以上の療法剤と組み合わせてそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。ある特定の実施形態において、本細胞は、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の進展の危険性のある患者の治療において使用される。したがって、特定の実施形態は、治療上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも１つの症状の治療または予防または緩和を含む。

一実施形態において、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全を治療する方法は、それを必要とする対象において、有効量、例えば、治療上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を含む組成物を投与することを含む。適切な投与量が臨床試験によって決定され得るが、投与の量および頻度は、患者の病態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されるであろう。

１つの例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、細胞の全ての介在する用量を含む、少なくとも２ｘ１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも３ｘ１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも４ｘ１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも５ｘ１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも６ｘ１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも７ｘ１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも８ｘ１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも９ｘ１０^６細胞／ｋｇ、または少なくとも１０ｘ１０^６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇである。

別の例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、細胞の全ての介在する用量を含む、約２ｘ１０^６細胞／ｋｇ、約３ｘ１０^６細胞／ｋｇ、約４ｘ１０^６細胞／ｋｇ、約５ｘ１０^６細胞／ｋｇ、約６ｘ１０^６細胞／ｋｇ、約７ｘ１０^６細胞／ｋｇ、約８ｘ１０^６細胞／ｋｇ、約９ｘ１０^６細胞／ｋｇ、または約１０ｘ１０^６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇである。

別の例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、細胞の全ての介在する用量を含む、約２ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約１０ｘ１０^６細胞／ｋｇ、約３ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約１０ｘ１０^６細胞／ｋｇ、約４ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約１０ｘ１０^６細胞／ｋｇ、約５ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約１０ｘ１０^６細胞／ｋｇ、２ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約６ｘ１０^６細胞／ｋｇ、２ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約７ｘ１０^６細胞／ｋｇ、２ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約８ｘ１０^６細胞／ｋｇ、３ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約６ｘ１０^６細胞／ｋｇ、３ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約７ｘ１０^６細胞／ｋｇ、３ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約８ｘ１０^６細胞／ｋｇ、４ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約６ｘ１０^６細胞／ｋｇ、４ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約７ｘ１０^６細胞／ｋｇ、４ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約８ｘ１０^６細胞／ｋｇ、５ｘ１０^６細胞／ｋｇ～６ｘ１０^６細胞／ｋｇ、５ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約７ｘ１０^６細胞／ｋｇ、５ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約８ｘ１０^６細胞／ｋｇ、または６ｘ１０^６細胞／ｋｇ～約８ｘ１０^６細胞／ｋｇである。

当業者は、特定の実施形態において企図される組成物の複数回投与が所望の療法に影響を及ぼすために必要とされ得ることを認識するであろう。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、１年間、２年間、５年間、１０年間以上の間にわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上投与され得る。

ある特定の実施形態において、対象に活性化されたＴ細胞を投与し、その後、再採血し（またはアフェレーシスを行い）、その血液からＴ細胞を活性化し、これらの活性化し、増大させたＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実行され得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血から活性化され得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃ以上の採血から活性化される。理論に拘束されるものではないが、この複数の採血／複数の再注入プロトコルを使用することは、ある特定のＴ細胞の集団を選択するように機能し得る。

特定の実施形態において企図される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋め込み、または移植によるものを含む、任意の都合のよい様式で実行され得る。好ましい実施形態において、組成物は、非経口に投与される。本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口に投与される」という語句は、腸内および局所投与以外の投与形式、通常は注射によるものを指し、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内への注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書で企図される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射することによって対象に投与される。

一実施形態において、癌と診断された対象を治療する方法は、対象から免疫エフェクター細胞を除去することと、該免疫エフェクター細胞のゲノムを編集することと、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞の集団を産生することと、同じ対象にゲノム編集された免疫エフェクター細胞の集団を投与することとを含む。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。

特定の実施形態において企図される細胞組成物を投与するための方法には、エクスビボでゲノム編集された免疫エフェクター細胞の再導入、または対象に導入されると、成熟免疫エフェクター細胞に分化する、免疫エフェクター細胞のゲノム編集された前駆体の再導入をもたらすのに有効である任意の方法が含まれる。１つの方法は、エクスビボにおいて末梢血Ｔ細胞をゲノム編集することと、形質導入された細胞を対象に戻すこととを含む。

本明細書で引用される刊行物、特許出願、および発行特許は全て、個別の刊行物、特許出願、または発行された特許の各々が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。

前述の実施形態は、明瞭な理解のために図解および実施例により少し詳細に記載されているが、本明細書で企図される教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変化および修正を行うことができることが当業者には容易に明らかになるであろう。以下の実施例は、単に例示として提供され、限定としては提供されない。基本的に類似した結果をもたらすために変化または修正され得る多様な重大でないパラメータは当業者には容易に認識されよう。

実施例１
ヒトカシータスＢ系統（ＣＢＬ）リンパ腫癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）遺伝子を撹乱するためのＩ－ＯｎｕＩの再プログラム化
ＤＮＡ認識インターフェースにおいて可変アミノ酸残基を含有するモジュラーライブラリを構築することによって、Ｉ－ＯｎｕＩを、ＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６を標的とするように再プログラム化した（図１）。バリアントを構築するために、オリゴヌクレオチドを使用して縮重コドンをＩ－ＯｎｕＩＤＮＡ結合ドメイン内に組み込んだ。縮重コドンをコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲテンプレートとして使用して、酵母菌株Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるギャップ組換えによってバリアントライブラリを生成した。各バリアントライブラリは、ＮまたはＣ末端Ｉ－ＯｎｕＩＤＮＡ認識ドメインのいずれかにおよび、約１０^７～１０^８の固有の形質転換体を含んだ。図２に示されるように、得られた表面ディスプレイライブラリを、対応するドメインの「ハーフ部位」（配列番号２３～２９）を含む標的部位に対する切断活性に関してフローサイトメトリーによってスクリーニングした。

Ｎ－およびＣ末端ドメインで再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩＨＥを示す酵母を精製し、プラスミドＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ反応を行って、再プログラム化されたドメインを増幅し、これは、後に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに融合および形質転換されて、再プログラム化されたドメインの組み合わせのライブラリを作成した。ＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６に存在する完全な標的部位（配列番号２０）を認識する完全に再プログラミングされたＩ－ＯｎｕＩバリアントをこのライブラリから特定し、精製した。

実施例２
ＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６を標的とする再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ
染色体に一体化された蛍光レポーター系を使用して、ＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６を標的とする再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩＨＥの活性を測定した（Ｃｅｒｔｏｅｔ．ａｌ．，２０１１）。ＣＢＬＢ標的配列（配列番号２０）に結合し、それを切断する完全に再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩＨＥを、哺乳動物発現プラスミドにクローン化し、次いで、蛍光ｉＲＦＰタンパク質をコードするフレーム外遺伝子の上流にＣＢＬＢ標的配列を含んだＨＥＫ２９３Ｔ線維芽細胞細胞株に個別にトランスフェクトした。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介するＤＮＡ修復後のＨＥによって埋め込まれた標的部位および挿入欠失の蓄積の切断は、「インフレーム」の後方に蛍光レポーター遺伝子を配置する３つの修復された遺伝子座のうちのおよそ１つをもたらす。したがって、染色体に埋め込まれた標的配列におけるエンドヌクレアーゼ活性の読み出しに、ｉＲＦＰ蛍光性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のパーセンテージを使用する。ＣＢＬＢ標的配列と結合し、それを切断する完全に再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩＨＥは、細胞染色体コンテクスト（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｃｏｎｔｅｘｔ）において高頻度のｉＲＦＰ発現を示し、それは、ＨＥバリアントが、細胞染色体コンテクストにおいて高い編集効率の所望の特性を有したことを示す。図３。

ＣＢＬＢ．Ｅ３ＨＥバリアントは、エクソン６標的部位に対してサブナノモル親和性を有した。図４。図５は、代表的なＩ－ＯｎｕＩバリアントの相対整列、ならびにＤＮＡ認識インターフェースを含む残基の位置情報を示す。

実施例３
ＣＢＬＢエクソン６を標的とするｍａｇａＴＡＬの特徴付け
メガヌクレアーゼドメインのＮ末端に、１２塩基対ＴＡＬアレイ標的部位（配列番号２１）に対応する、１１．５単位ＴＡＬアレイを付加することによって、ｍｅｇａＴＡＬ（配列番号１３～１９）として、ＣＢＬＢ．Ｅ３、ＣＢＬＢ．Ａ８、ＣＢＬＢ．Ｂ５、ＣＢＬＢ．Ｄ２、およびＣＢＬＢ．Ｆ６ＨＥバリアントをフォーマット化した（Ｂｏｉｓｓｅｌｅｔａｌ．，２０１３に記載）。図６。ｍｅｇａＴＡＬ標的部位配列は、配列番号２２に示される。

ｍｅｇａＴＡＬの編集効率を、４８～７２時間、サイトカインで補足された培地において抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いて刺激前初代ヒトＴ細胞によって評価し、次いで、インビトロで転写し（ＩＶＴ）、キャップし、かつポリアデニル化した、ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡを用いてこの細胞を電気穿孔した。さらに、３´～５´エキソヌクレアーゼＴｒｅｘ２をコードするＩＶＴ－ｍＲＮＡを付加して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって破断プロセスを強化した（Ｃｅｒｔｏｅｔａｌ．，２０１２を参照されたい）。

１つのセットの実験において、細胞を電気穿孔後７日間培養し（合計１０日培養）、編集効果を、培養の５、７、および１０日目にゲノムＤＮＡを単離し、ＣＢＬＢ標的部位にわたってシークエンシングすることによって測定し、挿入欠失を測定した。図７。ＣＢＬＢタンパク質レベルを、ＣＤ３^＋Ｔ細胞の細胞内ＦＡＣＳ分析によって測定した。図８。

ＣＢＬＢｍｅｇａＴＡＬで編集されたＴ細胞またはＣＡＲＴ細胞は、活性なｍｅｇａＴＡＬ（不活性なｍｅｇａＴＡＬで電気穿孔された）を欠くか、またはｍｅｇａＴＡＬを完全に欠いた（ＥＰなし）編集されていないＴ細胞およびＣＡＲＴ細胞と比較して、それぞれ抗ＣＤ３アゴニスト抗体またはＣＡＲ特異的抗原で刺激された場合、サイトカイン産生の増加されたレベルを示した。図９。

別のセットの実験において、細胞を、サイトカインで補足された培地において７～１０日間培養した。電気穿孔後７日目に、ゲノムＤＮＡを単離し、その後、ＣＢＬＢエクソン６標的部位にわたってＰＣＲ増幅した。ＴｒａｃｋｉｎｇｏｆＩｎｄｅｌｓｂｙＤＥｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＩＤＥ、Ｂｒｉｎｋｍａｎｅｔａｌ．，２０１４を参照されたい）を使用して挿入欠失の頻度を測定した。図１０は、代表的なＴＩＤＥ分析を示す。

実施例４
ＣＢＬＢｍａｇａＴＡＬを使用する例示的な相同組換え修復戦略
負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする導入遺伝子に作動可能に連結したｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）の転写後調節要素、およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルを含む導入遺伝子カセットを含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドを設計し、構築した（図１１、ＡＡＶドナー）。ＡＡＶプラスミドの完全性を、ＸｍａＩ消化およびシークエンシングで確認した。導入遺伝子カセットを、ＣＢＬＢｍｅｇａＴＡＬ切断部位（配列番号２０、２２）に隣接する２つの０．３ｋｂ相同性領域の間に配置した。相同性領域のいずれも完全なｍｅｇａＴＡＬ標的部位を含まなかった。

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、必要な複製、カプシド、およびアデノウイルスヘルパー要素を提供する１つ以上のプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一時的に共トランスフェクトすることによって調製した。組換えＡＡＶを、イオジキサノール系勾配における超遠心分離を使用して共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養から精製した。

ｍｅｇａＴＡＬで誘発された相同組換えは、ＣＤ３およびＣＤ２８で活性化され、ＩＬ－２を補充した完全培地中で培養された初代ヒトＴ細胞において評価された。３日後、Ｔ細胞を洗浄し、ＣＢＬＢ．Ａ８ｍｅｇａＴＡＬ（配列番号３２）をコードするインビトロで転写されたｍＲＮＡで電気穿孔し、その後、上記に記載のＭＮＤ－ＧＦＰ導入遺伝子カセットを含むＤＮＡドナー修復テンプレートをコードする精製された組換えＡＡＶを形質導入した。フローサイトメトリーは、蛍光タンパク質を発現するＴ細胞の頻度を測定し、非統合ｒＡＡＶを標的としたベクターから蛍光タンパク質の一時的発現を分化するために複数の時点で使用された。

長期導入遺伝子発現は、ｍｅｇａＴＡＬおよびｒＡＡＶを標的としたベクターの両方で処理されたＴ細胞の２１～２４％で観察された。対照的に、未処理の対照試料は、検出可能なレベルの蛍光タンパク質を発現しなかった。結果を、独立したドナーから単離されたＴ細胞で行われた実験において確認した。

実施例５
ＣＢＬ－Ｂ編集された抗ＥＧＦＲＣＡＲＴ細胞はインビボ腫瘍モデルにおいて増加された抗腫瘍有効性を示す
抗ＥＧＦＲＣＡＲＴ細胞を使用して、マウスのインビボＡ５４９腫瘍モデルにおけるＣＡＲＴ細胞薬理学へのＣＢＬＢ遺伝子編集の効果を試験した。

ヒトＰＢＭＣ（１ｘ１０^６細胞／ｍＬ）を、０日目に可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化した。２４時間のインキュベーション後、１ｘ１０^６細胞を、抗ＥＧＦＲＣＡＲレンチウイルスで形質導入した。刺激から７２時間後、形質導入されたＰＢＭＣまたは形質導入されていない対照ＰＢＭＣを、ＣＢＬＢ．Ｅ３ｍｅｇａＴＡＬ（配列番号３１）をコードするインビトロで転写されたｍＲＮＡありまたはなしで電気穿孔（ＬｏｎｚａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）した。電気穿孔された細胞を、１０日間ＩＬ－２を含む培地で培養した。培養後、７１％のＴ細胞は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）挿入欠失分析によって評価されるように、ＣＢＬＢ陰性であった。

マウスに上皮性癌腫細胞株（Ａ５４９）を皮下投与し、腫瘍増殖をキャリパー測定を使用して監視した。マウスに、平均腫瘍体積が１２０ｍｍ^３に達したときに、同等のＣＡＲ^＋Ｔ細胞用量（３ｘ１０^７ＣＡＲ^＋Ｔ細胞）を注入した。ビヒクル処理Ｔ細胞および形質導入されていない対照Ｔ細胞は、腫瘍増殖に対して最小の影響を有した。ＣＢＬＢ編集なしで抗ＥＧＦＲＣＡＲＴ細胞で処理された動物は、７匹中２匹のマウスが完全な腫瘍抑制を呈した対照群と比較して腫瘍増殖を遅らせることができた。対照的に、ＣＢＬＢ編集された抗ＥＧＦＲＣＡＲＴ細胞を受けている７匹全てのマウスは、Ａ５４９腫瘍を完全に取り除き、研究の間腫瘍を有さないままであった（ＣＡＲＴ細胞注射後３５日間）。

全般に、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定させるものと解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲と共に全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。

Claims

明細書に記載の発明。