JP2022153109A - Bacteriostatic composition - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、トリプタンスリンを含有する、食中毒の原因となるカンピロバクター属菌に対する静菌用組成物に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a bacteriostatic composition containing tryptanthrin against Campylobacter that causes food poisoning.
カンピロバクター（Campylobacter）属菌、特にCampylobacter jejuni（C. jejuni）又はCampylobacter coli（C. coli）によって引き起こされる食中毒は、日本のみならず世界的にも最も発生数の多い細菌性食中毒である。特に、C. jejuni及びC. coliは家畜の腸管内に高率に保菌されていることから、と畜場や食鳥処理場から出荷される食肉、特に鶏肉がこれら細菌で汚染されて食中毒の原因となる事故例が多い。このため、家畜、特に鶏へのカンピロバクター属菌の感染、又はこれらの細菌による食鳥処理場での鶏と体汚染を低減する有効な対策が、強く求められている。 Food poisoning caused by Campylobacter spp., particularly Campylobacter jejuni (C. jejuni) or Campylobacter coli (C. coli), is the most frequently occurring bacterial food poisoning not only in Japan but also worldwide. In particular, since C. jejuni and C. coli are carried in the intestinal tract of livestock at high rates, meat, especially chicken, shipped from slaughterhouses and poultry slaughterhouses is contaminated with these bacteria and causes food poisoning. There are many cases of accidents. Therefore, there is a strong demand for effective measures to reduce the infection of livestock, especially chickens, with Campylobacter, or the contamination of chickens and bodies with these bacteria at poultry slaughterhouses.
家畜を対象としたカンピロバクター属菌の感染への対処として、鞭毛のないカンピロバクター株に対して惹起された抗血清を含むことを特徴とするワクチン（特許文献１）、クロストリジウム・ブチリクムを有効成分とする家禽類または家畜類におけるカンピロバクターの増殖抑制剤（特許文献２）、乳酸菌とオリゴ糖を含む鶏のカンピロバクター感染を制御するための飲用水（特許文献３）、桑葉または桑葉とオリゴ糖を混合することを特徴とする鶏のカンピロバクター感染を制御するための飼料（特許文献４）等が、提唱されている。 A vaccine characterized by containing an antiserum raised against a Campylobacter strain without a flagellum (Patent Document 1) and containing Clostridium butyricum as an active ingredient as a countermeasure against Campylobacter infection in livestock. Campylobacter growth inhibitor in poultry or livestock (Patent Document 2), drinking water for controlling Campylobacter infection in chickens containing lactic acid bacteria and oligosaccharides (Patent Document 3), mulberry leaves or mixture of mulberry leaves and oligosaccharides A feed (Patent Document 4) and the like for controlling Campylobacter infection in chickens characterized by
トリプタンスリン（tryptanthrin、インドロ［2,1-b］キナゾリン-6,12-ジオン）は、青色色素インディゴの原料となる含藍植物（以下、藍草と称する）に含まれる、インドロキナゾリンアルカロイドの１種である。トリプタンスリンは、Bacillus subtilis、Escherichia coli、メチシリン耐性Staphylococcus aureus、Plasmodium falciparum、Leishmania donovani、Trypanosoma brucei、Toxoplasma gondii、Helicobacter pylori等に対して抗菌活性を有しており、藍草が示す抗菌作用の科学的な根拠とされている（非特許文献１）。またトリプタンスリン及びこれを含む藍草抽出物が、Campylobacter rectusやStreptococcus mutansその他の口腔内細菌に対しても抗菌活性を有することが報告されている（特許文献５）。しかし、食中毒の主な原因とされるC. jejuni及びC. coliに対するトリプタンスリンの生理活性は知られていない。 Tryptanthrin (indolo[2,1-b]quinazoline-6,12-dione) is an indoloquinazoline alkaloid contained in indigo plants (hereinafter referred to as indigo plants), which is the raw material for the blue pigment indigo. It is one type. Tryptanthrin has antibacterial activity against Bacillus subtilis, Escherichia coli, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Plasmodium falciparum, Leishmania donovani, Trypanosoma brucei, Toxoplasma gondii, Helicobacter pylori, etc. (Non-Patent Document 1). In addition, it has been reported that tryptanthrin and blue herb extracts containing it have antibacterial activity against Campylobacter rectus, Streptococcus mutans and other oral bacteria (Patent Document 5). However, the physiological activity of tryptanthrin against C. jejuni and C. coli, which are major causes of food poisoning, is unknown.
本発明は、食中毒の原因となるカンピロバクター属菌、特にC. jejuni及びC. coliの増殖を抑制することのできる新たな手段を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a new means capable of suppressing the growth of Campylobacter, particularly C. jejuni and C. coli, which cause food poisoning.
本発明者らは、トリプタンスリン及びこれを含む藍草が、C. jejuni及びC. coliに対して高い静菌活性を有することを見出し、以下の発明を完成させた。 The present inventors have found that tryptanthrin and Cypress containing it have high bacteriostatic activity against C. jejuni and C. coli, and completed the following invention.
（１） トリプタンスリンを含有する、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）又はカンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）に対する静菌用組成物。
（２） 藍草又は藍草の抽出物を含有する、（１）に記載の組成物。
（３） 藍草が蓼藍である、（２）に記載の組成物。
（４） 非ヒト動物用の飼料又は飲料の形態である、（１）～（３）のいずれか一項に記載の組成物。
（５） 非ヒト動物が牛、豚又は家禽である、（４）に記載の組成物。
（６） 非ヒト動物が鶏である、（４）又は（５）に記載の組成物。
（７） トリプタンスリンを含有する組成物を非ヒト動物に摂取させることを含む、非ヒト動物においてカンピロバクター・ジェジュニ又はカンピロバクター・コリを静菌する方法。
（８） 非ヒト動物が牛、豚又は家禽である、（７）に記載の方法。
（９） 非ヒト動物が鶏である、（７）又は（８）に記載の方法。
(1) A bacteriostatic composition against Campylobacter jejuni or Campylobacter coli containing tryptanthrin.
(2) The composition according to (1), which contains bluegrass or an extract of bluegrass.
(3) The composition according to (2), wherein the indigo plant is Tate indigo.
(4) The composition according to any one of (1) to (3), which is in the form of feed or drink for non-human animals.
(5) The composition according to (4), wherein the non-human animal is bovine, swine or poultry.
(6) The composition according to (4) or (5), wherein the non-human animal is chicken.
(7) A method for bacteriostasis Campylobacter jejuni or Campylobacter coli in a non-human animal, comprising having the non-human animal ingest a composition containing tryptanthrin.
(8) The method according to (7), wherein the non-human animal is cattle, pigs or poultry.
(9) The method according to (7) or (8), wherein the non-human animal is chicken.
本発明による静菌用組成物は、動物の腸内細菌叢に望ましくない影響を与えることなく、食中毒の原因となるカンピロバクター属菌の増殖を選択的かつ強力に抑制することができる。 The bacteriostatic composition according to the present invention can selectively and strongly inhibit the growth of Campylobacter bacteria, which cause food poisoning, without undesirably affecting the intestinal flora of animals.
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態又は具体例に基づくことがあるが、本発明はそのような実施形態又は具体例に限定されるものではない。なお、本明細書において、各数値範囲の上限値及び下限値は任意に組み合わせることができる。また、本明細書において「～」又は「-」を用いて表される数値範囲は、特に断りがない場合、その両端の数値を上限値及び下限値として含む範囲を意味する。 Although the description of the invention that follows may be based on representative embodiments or examples, the invention is not limited to such embodiments or examples. In addition, in this specification, the upper limit value and the lower limit value of each numerical range can be combined arbitrarily. Further, in the present specification, a numerical range represented by "-" or "-" means a range including numerical values at both ends thereof as upper and lower limits, unless otherwise specified.
本発明は、トリプタンスリンを含有する、C. jejuni又はC. coliに対する静菌用組成物を提供する。 The present invention provides a bacteriostatic composition against C. jejuni or C. coli containing tryptanthrin.
トリプタンスリン（tryptanthrin、インドロ［2,1-b］キナゾリン-6,12-ジオン）は、下記式（Ｉ）で表される化合物である。
C. jejuni及びC. coliはいずれも、日本におけるカンピロバクター属菌による食中毒の主要な原因菌であり、遺伝的に多様であることが報告されている。トリプタンスリンは、これらC. jejuni及びC. coliの様々な遺伝子型の株に対して、高い静菌活性を選択的に発揮することができる。したがって、トリプタンスリンを含有する組成物は、C. jejuni及びC. coliの静菌のために用いることができ、ヒト及び非ヒト動物、特に家畜に摂取させた場合、腸内細菌叢に対する影響が少ない選択的な静菌活性を発揮することができると考えられる。なお、本発明では、静菌用組成物とは対象とされる細菌の増殖を抑制する、すなわち静菌するための組成物を意味し、また静菌活性は、増殖抑制活性又は抗菌活性と交換可能に用いられる。 Both C. jejuni and C. coli are major causative organisms of Campylobacter food poisoning in Japan, and are reported to be genetically diverse. Tryptanthrin can selectively exert high bacteriostatic activity against strains of various genotypes of these C. jejuni and C. coli. Therefore, compositions containing tryptanthrin can be used for bacteriostasis of C. jejuni and C. coli and have no effect on the intestinal flora when ingested by humans and non-human animals, especially livestock. It is believed that less selective bacteriostatic activity can be exerted. In the present invention, the bacteriostatic composition means a composition for suppressing the growth of target bacteria, that is, for bacteriostasis, and bacteriostatic activity can be exchanged for growth inhibitory activity or antibacterial activity. used where possible.
一つの実施形態において、静菌用組成物は、トリプタンスリンを含む藍草又は藍草の抽出物を含有する。本発明で利用される藍草は、トリプタンスリンを含むものであればよく、その例としては、タデ科（Polygonaceae）の蓼藍（藍蓼とも称される、Polygonum tinctorium）、キツネノマゴ科（acanthaceae）の琉球藍（Strobilanthes cusia）、マメ科（Leguminosae）のインド藍（ナンバンコマツナギ（indigofera suffruticosa）、キアイ（indigofera tinctoria））、アブラナ科（Brassicaceae）のハマタイセイ（Isatis tinctoria var. yezoensis）、タイセイ（Isatis indigotica）及びウォード（Isatis tinctoria）、ガガイモ科（Asclepiadaceae）のアイカズラ（Marsdenia tinctoria）等を挙げることができる。本発明において好ましく利用される藍草は、蓼藍である。 In one embodiment, the bacteriostatic composition contains blueberry or blueberry extract containing tryptanthrin. The indigo plant used in the present invention may contain tryptanthrin, examples of which include Polygonum tinctorium of Polygonaceae, acanthaceae Ryukyu indigo (Strobilanthes cusia), Leguminosae Indian indigo (indigofera suffruticosa, indigofera tinctoria), Brassicaceae (Isatis tinctoria var. yezoensis), Taisei (Isatis indigotica) ), Ward (Isatis tinctoria), Marsdenia tinctoria of Asclepiadaceae, and the like. The indigo plant preferably used in the present invention is Taterai.
本発明で利用される藍草は、野生種であっても栽培品種であってもよい。本発明において好ましく利用される蓼藍の栽培品種としては、小上粉の白花種及び赤花種、赤茎小千本、青茎小千本、千本、大千本、宮城、松江、広島神辺、紺葉、那賀椿、百貫等を挙げることができる。また、藍草は、その栽培方法に制限はなく、従来、藍草の栽培に用いられている方法によって栽培した藍草であっても、天然に自生している藍草であってもよい。 The indigo plant used in the present invention may be a wild species or a cultivated variety. Cultivars of Tateai that are preferably used in the present invention include white flower seeds and red flower seeds of Kojo powder, red stem Kosenbon, green stem Kosenbon, Senbon, Osenbon, Miyagi, Matsue, Hiroshima Kannabe, Konba, Naka Tsubaki, Hyakkan, etc. can be mentioned. In addition, there is no restriction on the method of cultivating indigo grass, and it may be indigo grass cultivated by a method conventionally used for cultivating indigo grass, or indigo grass growing naturally.
藍草は、植物体の全体を用いることも可能であるが、トリプタンスリンが多く存在する葉部分を用いることが好ましい。また、藍草のトリプタンスリン含有量は乾燥により増加することが知られているため、乾燥させた藍草を使用することが好ましい。乾燥は、天日乾燥、熱風乾燥その他の、当業者に知られた方法によって行うことができる。 Although it is possible to use the whole plant body as the indigo plant, it is preferable to use the leaf part where tryptanthrin is abundant. Also, it is known that the tryptanthrin content of indigo grass is increased by drying, so it is preferable to use dried indigo grass. Drying can be done by sun drying, hot air drying, or other methods known to those skilled in the art.
静菌用組成物に含有される藍草は、細断、破砕、磨砕等の処理によって細かくされたもの、特に粉末であることが好ましい。 The indigo plant contained in the bacteriostatic composition is preferably pulverized by a treatment such as chopping, crushing, or grinding, particularly powder.
本発明で利用される藍草の抽出物は、好ましくは乾燥されている藍草を、溶媒で抽出することによって調製することができる。抽出処理に用いられる溶媒としては、水、低級アルコール（例としてメタノール、エタノール）、多価アルコール（例としてプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール）等を単独で又は２種以上を適宜混合して使用することができる。蓼藍からの抽出のための好ましい溶媒としては、水、低級アルコール、又は水と低級アルコールを挙げることができ、ここで低級アルコールとしては特にエタノールが好ましい。 The blueberry extract utilized in the present invention can be prepared by extracting the blueberry, which is preferably dried, with a solvent. Solvents used in the extraction process include water, lower alcohols (eg methanol, ethanol), polyhydric alcohols (eg propylene glycol, 1,3-butylene glycol), etc. alone or in combination of two or more. can be used. Preferred solvents for the extraction from Tara indigo include water, lower alcohols, or water and lower alcohols, wherein ethanol is particularly preferred as the lower alcohol.
抽出処理は、藍草と溶媒とを接触させることを含む、植物抽出物を製造する一般的な方法により、行うことができる。使用する溶媒の量、抽出時間、抽出温度等の抽出条件は、当業者によって適宜設定される。例えば、抽出溶媒として水、又は含水率の高い水と低級アルコールとの混合溶媒を用いる場合、抽出効率を上げるため、抽出温度を室温よりも高温にすること、例えば60℃以上、80℃以上、90℃以上にすることが好ましい。なお、本発明における静菌活性を損なわない範囲で、抽出溶媒に界面活性剤等の添加剤を適宜添加してもよい。抽出後、濾過、遠心分離、デカンテーション等の一般的な方法で抽出液を回収することができる。 The extraction treatment can be carried out by a common method for producing plant extracts, including contacting blueberry grass with a solvent. Extraction conditions such as the amount of solvent used, extraction time, and extraction temperature are appropriately set by those skilled in the art. For example, when water or a mixed solvent of water with a high water content and a lower alcohol is used as the extraction solvent, the extraction temperature should be higher than room temperature, for example, 60°C or higher, 80°C or higher, in order to increase the extraction efficiency. It is preferable to set the temperature to 90°C or higher. Additives such as surfactants may be appropriately added to the extraction solvent as long as the bacteriostatic activity in the present invention is not impaired. After extraction, the extract can be recovered by general methods such as filtration, centrifugation, decantation and the like.
上記の抽出処理によって得られる藍草の抽出物は、抽出液そのままの形態で、又は抽出液の濃縮物若しくは乾燥物の形態で、本発明の静菌用組成物に含有させることができる。抽出液の濃縮及び乾燥の方法に制限はなく、当業者に公知の方法、例えば、加熱や凍結乾燥等によって行うことができる。 The extract of Cypress radix obtained by the above extraction treatment can be contained in the bacteriostatic composition of the present invention in the form of the extract as it is, or in the form of a concentrate or a dried extract. There are no restrictions on the method for concentrating and drying the extract, and methods known to those skilled in the art, such as heating and freeze-drying, can be used.
また、本発明においては、市販の藍草抽出物、例えば藍草を原料とする茶を用いることもできる。 In addition, in the present invention, a commercially available indigo plant extract, for example, tea made from indigo plant can also be used.
別の実施形態において、静菌用組成物は、合成されたトリプタンスリン、又は上記の藍草抽出物等の混合物から精製されたトリプタンスリンを含有する。トリプタンスリンは、当業者に公知の方法によって合成することができ、例えば、青色色素であるインディゴ（2,2’-ビス(2,3-ジヒドロ-3-オキソインドリリデン)）を無溶媒で熱分解することによって合成することができる（例として特開2017-1969等）。また混合物からのトリプタンスリンの精製は、当業者に公知の方法、例えば、濾過、遠心分離、溶媒分別、分別沈澱、透析、各種クロマトグラフィー等によって行うことができる。 In another embodiment, the bacteriostatic composition contains a synthetic tryptanthrin or a tryptanthrin purified from mixtures such as the above-mentioned bilberry extracts. Triptanthrin can be synthesized by methods known to those skilled in the art. It can be synthesized by decomposing (for example, JP-A-2017-1969). Purification of tryptanthrin from the mixture can be performed by methods known to those skilled in the art, such as filtration, centrifugation, solvent fractionation, fractional precipitation, dialysis, and various types of chromatography.
本発明の静菌用組成物の形態に制限はなく、液体形態であっても、粉末、粒状、塊状その他の固体形態であってもよい。また、静菌用組成物は、静菌活性を妨げるものでない限り、トリプタンスリン以外の生理活性物質（抗菌剤、成長促進剤等）、栄養成分（タンパク質、脂質、ミネラル、ビタミン類等）、又は賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤若しくは担体等の成分を含んでいてもよい。 The form of the bacteriostatic composition of the present invention is not limited, and may be liquid, powder, granules, lumps or other solid forms. In addition, the bacteriostatic composition contains physiologically active substances other than tryptanthrin (antibacterial agents, growth promoters, etc.), nutritional components (proteins, lipids, minerals, vitamins, etc.), or Ingredients such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizers or carriers may be included.
本発明の静菌用組成物は、有効量のトリプタンスリンを含有する。ここで有効量とは、C. jejuni又はC. coliを静菌することができる量であり、静菌用組成物が適用される環境、当該環境中のC. jejuni又はC. coliの存在量、静菌用組成物の適用方法等の要因に応じて、当業者により適宜決定される。鶏に経口摂取させる場合を例にすれば、有効量のトリプタンスリンは、1羽あたり、例えば5～2000μg／日、好ましくは10～1500μg／日、より好ましくは20～1000μg／日、特に好ましくは50～750μg／日である。 The bacteriostatic composition of the present invention contains an effective amount of tryptanthrin. Here, the effective amount is an amount that can bacteriostatic C. jejuni or C. coli, and the environment to which the bacteriostatic composition is applied, and the amount of C. jejuni or C. coli present in the environment. , depending on factors such as the method of application of the bacteriostatic composition and the like, and can be determined as appropriate by those skilled in the art. Taking the case of orally ingesting chickens as an example, an effective amount of tryptanthrin per chicken is, for example, 5 to 2000 μg/day, preferably 10 to 1500 μg/day, more preferably 20 to 1000 μg/day, and particularly preferably 50-750 μg/day.
本発明の静菌用組成物は、C. jejuni又はC. coliの静菌が求められる生体外及び生体内の環境に対して適用することができ、特に、C. jejuni又はC. coliを保有している又は保有するおそれのある動物に対して適用することができる。このような動物の例としては、ヒト及び非ヒト動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、家禽（ニワトリ、アヒル、カモ、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ等）、サル等を挙げることができる。静菌用組成物は、好ましくは牛、豚及び家禽等の食用に供される家畜に、特に好ましくは鶏に適用することができる。 The bacteriostatic composition of the present invention can be applied to in vitro and in vivo environments where bacteriostasis of C. jejuni or C. coli is desired, particularly in environments harboring C. jejuni or C. coli. It can be applied to animals that have or are likely to have Examples of such animals include humans and non-human animals such as mice, rats, hamsters, dogs, cats, cows, pigs, poultry (chickens, ducks, ducks, geese, turkeys, quails, etc.), monkeys, and the like. be able to. The bacteriostatic composition can preferably be applied to domestic animals such as cattle, pigs and poultry, and particularly preferably to chickens.
本発明において、静菌用組成物の適用とは、C. jejuni又はC. coliが存在する環境に静菌用組成物を存在させることを意味する。静菌用組成物の動物に対する適用は、静菌用組成物を動物に摂取させることによって行うことができる。例えば、家畜に摂取させるための静菌用組成物は、トリプタンスリン又は藍草若しくは藍草抽出物を含有する家畜用の飼料又は飲料の形態であることが好ましい。このような飼料又は飲料は、一般的な家畜用飼料又は飲用水にトリプタンスリン又は藍草若しくは藍草抽出物を配合することによって調製することができる。家畜用飼料又は飲料の形態とすることで、家畜にストレスを与えることなく簡便に静菌用組成物を摂取させることができ、家畜の腸管内に生息するC. jejuni及びC. coliを静菌することができる。 In the present invention, the application of the bacteriostatic composition means the presence of the bacteriostatic composition in an environment where C. jejuni or C. coli are present. Application of the bacteriostatic composition to animals can be carried out by having the animal ingest the bacteriostatic composition. For example, the bacteriostatic composition for ingestion by livestock is preferably in the form of a livestock feed or drink containing tryptanthrin or blueberry or blueberry extract. Such feeds or beverages can be prepared by incorporating tryptanthrin or blueberry or blueberry extract into common livestock feed or drinking water. By making it in the form of livestock feed or drink, the bacteriostatic composition can be easily ingested without giving stress to livestock, and can bacteriostatic C. jejuni and C. coli living in the intestinal tract of livestock. can do.
家畜用飼料又は飲料の形態の静菌用組成物は、飼育期間の全体にわたって家畜に摂取させることもできるが、効率性の観点から、C. jejuni又はC. coliの静菌が特に望まれる期間、例えば、食肉用の鶏であればこれらの細菌の出現が確認され始める３週齢頃から出荷のおよそ２～３週間前までの期間に摂取させればよい。 Bacteriostatic compositions in the form of livestock feeds or beverages can also be fed to livestock throughout the breeding period, although from an efficiency standpoint, bacteriostasis of C. jejuni or C. coli is particularly desired during periods of time. For example, in the case of chickens for slaughter, ingestion may be performed from around 3 weeks of age when the emergence of these bacteria begins to be confirmed until approximately 2 to 3 weeks before shipping.
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail by the following examples, but the invention is not limited to these.
実施例１
・トリプタンスリン溶液の調製
ミューラーヒントン液体培地（Becton Dickinson）を用いて、トリプタンスリン（富士フィルム和光純薬）濃度が100μM～0.05μMの2倍段階希釈液を調製した。
・藍粉抽出液の調製
市販藍粉（蓼藍の葉の乾燥粉末）2gをミューラーヒントン液体培地（Becton Dickinson）100mlに加え、室温で3時間、100rpmで振盪した後、13,000rpmで10分遠心し、上清を0.22μmフィルターでろ過することで2%藍抽出液を作製した。抽出液を2倍段階希釈して藍粉濃度が2～0.0156%の希釈液を調製した。
・最少発育阻止濃度（MIC）の測定
96ウェルプレートに各濃度のトリプタンスリン溶液又は藍粉抽出液を100μLずつ分注した。終濃度が10６CFU/mlとなるように供試菌をウェルに接種後、カンピロバクター属菌は37℃、微好気条件下で3日間培養、他の供試菌は37℃、好気条件下で18時間培養した。培養後の試験液の濁りを目視で確認することで、各供試菌に対するトリプタンスリン及び藍粉それぞれのMICを測定した。使用した供試菌とそれぞれに対するトリプタンスリンのMICを表１に示す。カンピロバクター属菌の遺伝子型別は、既報（C. jejuniについてはDingle KE et al., J. Clin Microbiol. 39:14-23 (2001)、C. coliについてはDingle KE et al., J. Clin Microbiol. 43:340-347 (2005)、C. fetusについてはvan Bergen MA et al., J Clin Microbiol, 43:5888-98 (2005)に従って、Multi-Locus Sequence Typing（MLST）法によって実施した。
Example 1
Preparation of tryptanthrin solution Using Mueller Hinton liquid medium (Becton Dickinson), tryptanthrin (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries) concentrations of 100 μM to 0.05 μM 2-fold serial dilutions were prepared.
・Preparation of indigo powder extract Add 2 g of commercially available indigo powder (dried powder of leaves of the indigo plant) to 100 ml of Mueller Hinton liquid medium (Becton Dickinson), shake at room temperature for 3 hours at 100 rpm, and then centrifuge at 13,000 rpm for 10 minutes. Then, the supernatant was filtered through a 0.22 μm filter to prepare a 2% indigo extract. The extract was serially diluted two-fold to prepare dilutions with indigo powder concentrations ranging from 2 to 0.0156%.
・Measurement of minimum inhibitory concentration (MIC)
100 μL of each concentration of tryptanthrin solution or indigo powder extract was dispensed into a 96-well plate. After inoculating the test bacteria into the wells to a final concentration of 10 6 CFU/ml, Campylobacter was cultured under microaerobic conditions at 37°C for 3 days, while other test bacteria were cultured at 37°C under aerobic conditions. cultured for 18 hours under By visually confirming the turbidity of the test solution after culturing, the MICs of tryptanthrin and indigo powder for each test bacterium were measured. Table 1 shows the test bacteria used and the MIC of tryptanthrin for each. Campylobacter genotyping has been previously reported (C. jejuni: Dingle KE et al., J. Clin Microbiol. 39:14-23 (2001), C. coli: Dingle KE et al., J. Clin Microbiol. 43:340-347 (2005), C. fetus was performed by the Multi-Locus Sequence Typing (MLST) method according to van Bergen MA et al., J Clin Microbiol, 43:5888-98 (2005).
トリプタンスリンのC. jejuni及びC. coli に対するMICは、全ての株で0.78～12.5μMであった。一方、トリプタンスリンのC. fetusに対するMICは、1株を除いて>100μMであった。また、鶏に一般的に認められる腸内細菌であるEscherichia coli、Enterobacter cloacae、Enterococcus faecalis、Klebsiella pneumoniae、Proteus mirabili、Salmonella entericaに対するトリプタンスリンのMICは、いずれも>100μMであった。 The MICs of tryptanthrin against C. jejuni and C. coli ranged from 0.78 to 12.5 μM for all strains. On the other hand, the MIC of tryptanthrin against C. fetus was >100 μM except for one strain. The MICs of tryptanthrin against common enteric bacteria in chickens, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabili, and Salmonella enterica, were all >100 μM.
国際公開パンフレットWO2008/062861によると、口腔内細菌の一種であるC. rectusに対するトリプタンスリンのMICは25μg/ml（約100μM）であった。したがって、トリプタンスリンはカンピロバクター属菌やその他の腸内細菌の中でもC. jejuni及びC. coliに対して選択的かつ高い静菌活性を示すことが確認された。 According to the international pamphlet WO2008/062861, the MIC of tryptanthrin against C. rectus, a kind of oral bacteria, was 25 μg/ml (about 100 μM). Therefore, it was confirmed that tryptanthrin exhibits selective and high bacteriostatic activity against Campylobacter and C. jejuni and C. coli among other intestinal bacteria.
また、藍粉のC. jejuni及びC. coli に対するMICは0.5または1%であり、藍粉のC. fetusに対するMICは1または2%であった。一方、Escherichia coli、Enterobacter cloacae、Klebsiella pneumoniae、Proteus mirabili、Salmonella enterica、Enterococcus faecalisに対する藍粉のMICは、いずれも>2%であった。このことから、トリプタンスリンは藍粉の形態であってもC. jejuni及びC. coliに対して選択的な静菌活性を示すことが確認された。
実施例３
1日齢の鶏24羽を6群に分け、4羽ずつ各アイソレーターに入れた。終濃度が100μM、10μM、0μMとなるようトリプタンスリン水溶液を調製し、2日齢から試験期間中、各濃度のトリプタンスリン水溶液をそれぞれ2群ずつに飲水投与した。4日齢の鶏にC. jejuni Cj13の菌液を106または103 CFU/羽となるように胃ゾンデにより経口投与した。投与から2週目に動物用イソフルランにより安楽死させて盲腸内容中の菌数を測定した。
Example 3
Twenty-four one-day-old chickens were divided into six groups, four in each isolator. Aqueous solutions of tryptanthrin were prepared so that the final concentrations were 100 μM, 10 μM, and 0 μM, and the aqueous solutions of tryptanthrin at each concentration were administered to two groups in drinking water from 2 days of age during the test period. Four-day-old chickens were orally administered C. jejuni Cj13 solution at 10 6 or 10 3 CFU/chicken by gastric tube. Two weeks after administration, the animals were euthanized with isoflurane for animals, and the number of bacteria in the contents of the cecum was measured.
C. jejuni Cj13を103 CFU/羽となるよう経口投与した3群の盲腸内容物1g中におけるC. jejuni菌数を比較した結果、トリプタンスリン未投与群の菌数（平均2.6×108 CFU/g）と比較して、トリプタンスリン10μM投与群及び100μM投与群の菌数（平均4.0×106 及び2.9×106 CFU/g）は有意に低かった（p<0.05）。また、C. jejuniを106 CFU/羽となるよう経口投与した3群でも、トリプタンスリン未投与群のC. jejuni菌数（平均3.7×108 CFU/g）と比較して、トリプタンスリン100μM投与群の菌数（平均2.4×107 CFU/g）は有意に低かった（p<0.05）。このことから、トリプタンスリンはin vivoでもin vitro同様にC.jejuniに対する静菌活性を示すことが確認された。
When C. jejuni Cj13 was orally administered to 10 3 CFU/chicken, the number of C. jejuni bacteria in 1 g of cecal contents of the 3 groups was compared. /g), the number of bacteria (mean 4.0×10 6 and 2.9×10 6 CFU/g) in the 10 μM tryptanthrin administration group and 100 μM administration group was significantly lower (p<0.05). In addition, in the three groups in which C. jejuni was orally administered to 10 6 CFU/chicken, the number of C. jejuni bacteria in the group not treated with tryptanthrin (average 3.7 × 10 8 CFU/g) was significantly higher than that of the tryptanthrin-treated group. The bacterial count in the administration group (mean 2.4×10 7 CFU/g) was significantly lower (p<0.05). From this, it was confirmed that tryptanthrin exhibits bacteriostatic activity against C.jejuni both in vivo and in vitro.
Claims (9)
9. The method of claim 7 or 8, wherein the non-human animal is chicken.
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