JP2022116275A - 新規なａａｖ８変異カプシド及びそれを含有する組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】より有効なＡＡＶベクターを提供する。【解決手段】本明細書は、ＡＡＶ８変異カプシド及びそれを含むｒＡＡＶを提供する。一実施形態では、ＡＡＶ８変異体カプシドを用いるベクターは、ＡＡＶ８と比較して選択組織における高い形質導入を示す。【選択図】図１Ａ

Description

電子形式で提出した資料の参照による組み込み
出願人は、本明細書と共に提出した電子形式の配列表資料を参照により本明細書に組み込むものとする。このファイルには「ＵＰＮ－１６－７７２６ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイル名が付いている。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトの遺伝子治療において非常に有望であり、このウイルスが遺伝子を長期発現できること、及び病原性が欠落していることから、肝臓、筋肉、心臓、脳、眼、腎臓及び他の組織を標的にするため、さまざまな試験で広く使用されてきている。ＡＡＶはパルボウイルス科に属し、各々２つの末端逆位反復配列が隣接する一本鎖ＤＮＡを含有する。天然に生じる数十のＡＡＶカプシドは、その固有のカプシド構造のため、異なる細胞型及び器官を認識して形質導入できることが報告されている。

１９８１年に開始された第１回目の治験以降、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いた遺伝子治療の臨床試験におけるベクター関連の毒性はこれまで報告されていない。臨床試験でこれまでに蓄積されたＡＡＶベクターの安全性の記録は、実証された有効性と合わせると、ＡＡＶが取り扱いに良好なプラットフォームであることを示している。別の魅力的特徴は、ＡＡＶはゲノムサイズが小さく（約４．７ｋｂ）、遺伝子構成成分がシンプルである、すなわち、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、Ｒｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子からなる一本鎖ＤＮＡウイルスであることから、ＡＡＶの操作が比較的容易なことである。ＡＡＶベクターで必要とされるのはＩＴＲとＡＡＶカプシドタンパク質のみであり、ＩＴＲは、ベクター作製用の複製シグナル及びパッケージングシグナルとして機能し、カプシドタンパク質は、ベクターゲノムＤＮＡを収容するカプシドを形成し、組織指向性を決定し、標的細胞内へベクターゲノムＤＮＡを送達して中心的役割を果たす。ＡＡＶカプシド遺伝子を得るには主に４つの方法、すなわち、培養試料または組織試料からのＡＡＶ単離、ＡＡＶ定向進化、シャッフリング、及び合理的設計があった。

ＡＡＶ８は、肝臓、筋肉に効率的に形質導入されることが示されている。さらに、単回末梢静脈内注入によるＡＡＶ８介在性ｈＦＩＸ遺伝子導入は、重度の血友病Ｂ患者に、急性または長期持続性の毒性を示すことなくＦＩＸ導入遺伝子を治療的レベルで長期間、確実に発現させる。

ＡＡＶベクターには遺伝子導入における多くの利点があるが、依然として解決すべき問題がある。したがって、より有効なＡＡＶベクターが必要とされている。

一態様ではアデノ随伴ウイルスを提供する。ウイルスは、ＡＡＶ８変異カプシドを含む。一実施形態では、カプシドは配列番号１８の配列を有し、これをＡＡＶ３Ｇ１と呼ぶ。別の実施形態では、カプシドは配列番号２０の配列を有し、これをＡＡＶ８．Ｔ２０と呼ぶ。さらに別の実施形態では、カプシドは配列番号２２の配列を有し、これをＡＡＶ８．ＴＲ１と呼ぶ。別の態様では、本明細書に記載するカプシドをコードする核酸を提供する。一実施形態では、カプシドは、配列番号１７またはそれと少なくとも９５％の同一性を共有する配列によってコードされる。別の実施形態では、カプシドは、配列番号１９またはそれと少なくとも９５％の同一性を共有する配列によってコードされる。別の実施形態では、カプシドは、配列番号２１またはそれと少なくとも９５％の同一性を共有する配列によってコードされる。

別の実施形態では、ＡＡＶ８変異カプシドを含むＡＡＶには、天然型ＡＡＶ８（配列番号３４）と比較した場合に、以下の領域：ｉ．アミノ酸２６３～２６７（配列番号７８）；ｉｉ．アミノ酸４５７～アミノ酸４５９；ｉｉｉ．アミノ酸４５５～アミノ酸４５９（配列番号８１）；またはｉｖ．アミノ酸５８３～アミノ酸５９７（配列番号６９）の少なくとも１つの領域に変異を有する少なくとも１つのｖｐ３カプシドが含まれる。一実施形態では、ＡＡＶ８変異カプシドを有するＡＡＶは、ＡＡＶ８と比べて標的組織における形質導入率が高い。一実施形態では、標的組織は筋肉、肝臓、肺、気道上皮、ニューロン、眼、または心臓である。別の実施形態では、ＡＡＶ８変異カプシドを有するＡＡＶは、天然型ＡＡＶ８と比べてＡＡＶ中和抗体に対する回避能力が高い。

一実施形態では、ｖｐ１ユニーク領域及び／またはｖｐ２ユニーク領域は、ｖｐ３ユニーク領域を供給するＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ８）とは異なるＡＡＶに由来する。一実施形態では、ｖｐ１配列及びｖｐ２配列を供給するＡＡＶはｒｈ．２０である。一実施形態では、ｒｈ．２０ ｖｐ１配列は配列番号８８である。

別の実施形態では、ＡＡＶにはさらに、ＡＡＶ末端逆位反復配列、及び制御配列に機能的に連結されている異種核酸配列が含まれ、ここで制御配列は、標的細胞において前記異種核酸配列がコードする産物の発現を導く。

別の態様では、標的組織に形質導入する方法を提供する。一実施形態では、方法には、本明細書に記載するようなカプシドを有するＡＡＶの投与が含まれる。一実施形態では、肝組織に形質導入する方法を提供し、ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するＡＡＶの投与を含む。別の実施形態では、筋組織に形質導入する方法を提供し、ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するＡＡＶの投与を含む。さらに別の実施形態では、気道上皮に形質導入する方法を提供し、ＡＡＶ３Ｇ１またはＡＡＶ８．Ｔ２０カプシドを有するＡＡＶの投与を含む。別の実施形態では、肝組織に形質導入する方法を提供し、ＡＡＶ８．ＴＲ１カプシドを有するＡＡＶの投与を含む。さらに別の実施形態では、眼細胞に形質導入する方法を提供し、ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するＡＡＶの投与を含む。

さらに別の態様では、標的組織に対する形質導入率が野生型カプシドよりも高い変異ＡＡＶカプシドを作製する方法を提供する。方法には、野生型カプシドに対する中和抗体の接触領域にて変異誘発させること、及びモノクローナル抗体存在下でインビトロ選択を実施することが含まれる。一実施形態では、方法には、カプシドの超可変領域においてさらなる変異を実施することが含まれる。別の実施形態では、方法にはさらに、ｖｐ１ユニーク配列及び／またはｖｐ２ユニーク配列を、異なるＡＡＶカプシド由来のｖｐ１配列及び／またはｖｐ２配列で置換することが含まれる。

別の態様では、ＡＡＶカプシドを含む組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を作製する方法を提供する。一実施形態では、方法には、（ａ）天然型ＡＡＶ８（配列番号３４）と比較した場合に、カプシドが以下の領域、すなわち、ｉ．アミノ酸２６３～２６７（配列番号７８）；ｉｉ．アミノ酸４５７～アミノ酸４５９；ｉｉｉ．アミノ酸４５５～アミノ酸４５９（配列番号８１）；またはｉｖ．アミノ酸５８３～アミノ酸５９７（配列番号６９）のうち少なくとも１つの領域において変異を有するＡＡＶカプシドタンパク質をコードする分子と、（ｂ）機能性ｒｅｐ遺伝子と、（ｃ）ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及び導入遺伝子を含むミニ遺伝子と、（ｄ）ＡＡＶカプシドタンパク質内へのミニ遺伝子のパッケージングを可能にする十分なヘルパー機能とを含有している宿主細胞を培養することが含まれる。

さらに別の態様では、組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。一実施形態
では、ｒＡＡＶには、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、及び３２から選択されるアミノ酸配列を有するＡＡＶカプシドが含まれる。そのようなカプシドを、本明細書では「ＡＡＶ８変異カプシド（複数可）」と呼ぶ場合がある。ｒＡＡＶにはさらに非ＡＡＶ核酸配列が含まれる。別の態様では、ＡＡＶカプシド配列をコードする核酸分子を提供する。一実施形態では、核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択される。

別の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。ＡＡＶカプシドは、天然型ＡＡＶ８（配列番号３４）と比較した場合に、以下の領域、すなわち、ｉ．アミノ酸２６３～２６７（配列番号７８）；ｉｉ．アミノ酸４５７～アミノ酸４５９；ｉｉｉ．アミノ酸４５５～アミノ酸４５９（配列番号８１）；またはｉｖ．アミノ酸５８３～アミノ酸５９７（配列番号６９）のうち少なくとも１つの領域において変異を有する。別の態様では、本明細書に記載するようなＡＡＶカプシドをコードする核酸配列を提供する。

さらに別の態様では、本明細書に記載するようにアデノ随伴ウイルスでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。

別の態様では、本明細書に記載するようなＡＡＶを少なくとも１つ、ならびに生理学的に適合性のある担体、緩衝剤、アジュバント、及び／または希釈剤が含まれる組成物を提供する。

さらに別の態様では、細胞に導入遺伝子を送達する方法を提供する。方法には、細胞を本明細書に記載するようなＡＡＶと接触させるステップが含まれ、ここで、前記ｒＡＡＶは導入遺伝子を含む。

ＡＡＶ変異体ライブラリーの構築に使用するプラスミドのマップを提供する。 ＡＡＶ変異体ライブラリーの構築の選択工程を例示する。 インビトロにおいて、抗体－カプシド接触部位における変異誘発によりＮａｂに対する耐性が付与されることを示す棒グラフである。ＨＥＫ２９３細胞を、ＣＭＶ．ｅＧＦＰを担持する変異体ＡＡＶ８に感染させ、培地（Ａｂなし）、抗体ＡＤＫ８、ＡＤＫ８／９またはＡＤＫ９と混合した。Ｍ．Ｏ．Ｉ．は約１ｅ４であった。２日後、ＧＦＰ画像を取得して分析した。実施例２Ｂ２を参照のこと。 インビボにおいて、抗体－カプシド接触部位における変異誘発によりＮａｂに対する耐性が付与されるを示す散布図である。ＡＡＶ８変異体にＴＢＧ．イヌＦ９－ＷＰＲＥカセットをパッケージングし、ｉ．ｖ．注射による抗体ＡＤＫ８の存在下／非存在下、Ｂ６で試験した。ベクター注射２時間前に１００ｕＬの希釈ＡＤＫ８をｉ．ｖ．注射した。ＡＡＶ８を対照として使用した。投与から１週間後に採取した血漿によりイヌＦ９レベルをＥＬＩＳＡで測定した。ＡＤＫ８無し動物のＦ９に対するＡＤＫ８有り動物のＦ９の割合（％）及びｐ値（ｔ－検定）を上方に示す。実施例２Ｂ６を参照のこと。 本明細書に記載するＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｇ１、ＡＡＶ８．Ｔ２０及びＡＡＶ８．ＴＲ１のタンパク質アラインメントである。 本明細書に記載するＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｇ１、ＡＡＶ８．Ｔ２０及びＡＡＶ８．ＴＲ１のタンパク質アラインメントである。 ＡＡＶ８と比べてＡＡＶ３Ｇ１はプールしたヒトＩＶＩＧ（ｈＩＶＩＧ）に対し耐性であることを示す。ＣＢ７．ＣＩ．ルシフェラーゼカセットを担持するＡＡＶ８（塗りつぶし棒）またはＡＡＶ３Ｇ１（中抜き棒）を、さまざまな希釈度のプールしたヒトＩＶＩＧと共にインキュベートしてから、９６ウェルプレートに入れたＨｕｈ７細胞に塗布した（Ｍ．Ｏ．Ｉ．、約１ｅ４）。感染から７２時間後、ルシフェラーゼレベルを読み取った。ｘ軸はｈＩＶＩＧの希釈倍率である。ｙ軸は、「ベクター単独」対照と比較したルシフェラーゼ発現の割合（％）を表す。灰色の点線は、５０％発現レベルを指す。 ＡＡＶ３Ｇ１の３変異全てがＮａｂ耐性に寄与していることを示す。ＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｇ１、及びＡＡＶ３Ｇ１を構成する３変異の組み合わせ全てを担持する変異体を、ヒト血漿（４試料）及び抗ＡＡＶ８サル血清（４試料）を用いてインビトロで試験した。ＡＡＶ８及び変異型を、希釈した血清／血漿（抗ＡＡＶ８Ｎａｂ含有混合物の最終滴定、１：４）と共にインキュベートしてから、９６ウェルプレートに入れたＨｕｈ７細胞に塗布した。７２時間後、ルシフェラーゼ発現を読み取り、各「ベクター単独」対照の発現レベルのパーセンテージに変換した。各血清／血漿について、その残存発現に従って各ベクターに順番を付けた（残存発現の最も高いものを順番１、最も低いものを８とした）。実施例２Ｃを参照のこと。 ＣＢ７．ＣＩ．ルシフェラーゼカセットを担持するＡＡＶ８またはＡＡＶ３Ｇ１のｉ．ｍ．注射を受けたマウスの写真である。マウス４匹／群で、ベクターを用量３ｘ１０^１０ｇｃ／マウスでＢ６の筋肉に投与した。ルシフェラーゼ活性を投与から２週間及び４週間監視した。これらの知見は、筋肉内注射により、ＡＡＶ３Ｇ１は、ＡＡＶ８と比べると肝臓よりも筋肉に選択的であることを示している。実施例２Ｃを参照のこと。 図５ａに示すカセットとは異なる導入遺伝子カセットを担持するＡＡＶベクターをｉ．ｍ．注射した後の筋組織の写真である。これらの実験は、Ｂ６マウスにおいてＡＡＶ３Ｇ１が同様に筋選択性であることを示している。用量１ｘ１０^９ｇｃ／動物、５ｘ１０^８ｇｃ／２５ｕＬ／脚を両脚に実施。ベクター注射後の第３週、筋肉切片、Ｘ－ｇａｌ染色、各群の最良切片、４倍。 第３の導入遺伝子カセットｔＭＣＫ．ヒトＦ９を担持するＡＡＶベクターのＩ．ｍ．注射では、Ｂ６マウスにおいてＡＡＶ３Ｇ１が同様に筋選択性であることが示されている。ｔＭＣＫは筋特異的プロモーターである。用量３ｅ１０ｇｃ／マウス、マウス３匹／群。血漿及び筋肉をそれぞれ投与から２８日後及び３０日後に採取した。血漿及び筋肉の溶解物からＥＬＩＳＡによってヒトＦ９を測定した。ＡＡＶ３Ｇ１では筋肉Ｆ９発現レベルはＡＡＶ８の１１．２倍であった。実施例２Ｂ６を参照のこと。 第２８日の血漿の中和抗体価は、ＡＡＶ８とＡＡＶ３Ｇ１の抗原性は異なることを示している。血漿試料は図５ｃの試験で得たものであった。実施例２Ｂ６を参照のこと。 ＡＡＶ８ベクターまたはＡＡＶ３Ｇ１ベクターの投与を受けたマウスの心臓、筋肉及び肝臓から得たＸ－ｇａｌ染色した切片の概要。ＭＰＳ ３Ａ Ｈｅｔマウス（Ｂ６バックグラウンド）に５ｅ１１ｇｃのＡＡＶ．ＣＭＶ．Ｌａｃ／マウスをｉ．ｖ．投与した。１４日後、組織を採取した。各動物の代表的筋肉切片の４倍像。実施例２Ｃを参照のこと。 ＣＢ７．ＣＩ．ｆｆルシフェラーゼ導入遺伝子カセットを有するＡＡＶ８とＡＡＶ３Ｇ１とを比較する、ｉ．ｖ．を受けたＢ６マウスにおけるルシフェラーゼイメージングの代表的インビボ画像である。用量３ｅ１１ｇｃ／マウス、ベクター注射後の第２週。左はＡＡＶ８、右はＡＡＶ３Ｇ１である。実施例２Ｃを参照のこと。 ＡＡＶ３Ｇ１は、マウス気道上皮細胞への形質導入率が高く、形質導入率はＶＰ１２領域をｒｈ．２０で置き換えることによりさらに改善される。Ｂ６マウスにＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ルシフェラーゼを１ｅ１１ｇｃ／マウス、ｉ．ｎ．で与えた。ルシフェラーゼ活性をベクター投与後２週間、３週間及び４週間監視した。右のパネルは試験の代表画像（第４週）である。左のパネルはＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）３．２を用いて定量し、第２週のＡＡＶ８群の平均値で正規化したものである。実施例２Ｃを参照のこと。 ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．Ｔ２０、ＡＡＶ９及びＡＡＶ６．２の気道上皮細胞への形質導入の比較。Ｂ６マウスにＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ルシフェラーゼを１ｅ１１ｇｃ／マウス、ｉ．ｎ．、マウス４匹／ベクターで与えた。ルシフェラーゼ活性をベクター投与後１週間、２週間及び３週間監視した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）３．２を使用して定量し、第１週のＡＡＶ８群の平均値で正規化した。実施例２Ｃを参照のこと。 ＡＡＶ３Ｇ１のヘパリン親和性が高まる。ＡＡＶベクターをＤＰＢＳに希釈し、２ｅ１１ｇｃのベクターをヘパリンカラムに担持させ、その後、ＤＰＢＳ及びさまざまな濃度のＮａＣｌを含むＤＰＢＳを用いて洗浄した。抗体Ｂ１を用いてＰＶＤＦ膜でドットブロット法を実施した。 ＡＡＶ８．ＴＲ１の電荷を減少させるとそのヘパリン親和性が低下する。等しいｇｃのＡＡＶ８．ＴＲ１．ＴＢＧ．ｈＦ９ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨとＡＡＶ３Ｇ１．ＣＢ７．ＣＩ．ルシフェラーゼ．ＲＢＧとを合わせてＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４、０．０１Ｍ）に混合し、ヘパリンカラムに担持させ、さまざまな緩衝液を用いて順次洗浄した。プロセスの間の画分を採取した：ＦＴ＋Ｗ；フロースルー及び洗浄にはＴｒｉｓ緩衝液０．０５Ｍ～２．０Ｍ、Ｔｒｉｓ緩衝液と０．０５～２．０ＭのＮａＣｌを用いた。ベクター分布をｂＧＨ及びＲＢＧプローブを用いてｑＰＣＲにより測定した。 ＡＡＶ３Ｇ１の電荷を減少させると、変異ＡＡＶ８．ＴＲ１において肝臓への形質導入が部分的に回復することを示す。Ｂ６マウスにＡＡＶ．ＴＢＧ．ｈＦ９ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧを用量１ｅ１０ｇｃ／マウス、マウス５匹／群で静脈内投与した。ベクター注射後の第１週、第２週及び第４週に血漿を採取し、ヒトＦ９でＥＬＩＳＡにより測定した。 インビトロでのＨｕｈ７ Ｎａｂアッセイの結果を表す。レポーター：ＣＢ７．ＣＩ．ｆｆルシフェラーゼ；Ｍ．Ｏ．Ｉ．約１ｅ３。試料は、図８Ｃと同一試験の動物３匹／群から得た第４週の血漿であった。 図８Ｃのマウスから得た、ベクターのゲノムコピーの分布を表す。 ｐＡＡＶ．ＤＥ．０のマップを表す。 ｐＡＡＶ．ＤＥ．１のマップを表す。 ｐＡＡＶ．ＤＥ．１．ＨＶＲ．Ｉのマップを表す。 ｐＡＡＶ．ＤＥ．１．ＨＶＲ．ＩＶのマップを表す。 ＡＡＶ．ＴＢＧ．ヒトＦ９を１ｅ１０ｇｃ／マウス、ｉ．ｖ．で注射されたマウス（マウス５匹／群）におけるヒトＦ９の発現（ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。処置から１週間後、２週間後及び４週間後に血漿を採取した。 図１３Ａのマウスで第４週における、ＡＡＶ８に対する中和抗体価を示すグラフである。最終濃度１ｅ９ｇｃ／ｍＬのＡＡＶ８．ＣＢ７．ルシフェラーゼと共にＨｕｈ７細胞を使用した。各群の平均が示されている。 ｐＡＡＶｉｎｖｉｖｏのマップを表す。 ＡＡＶ３Ｇ１．ｔＭＣＫ．ＰＩ．ｆｆｌｕｃ．ｂＧＨを、３ｅ９または３ｅ１０ｇｃ／マウス、脚１本／マウスでｉ．ｍ．注射された雄Ｂ６マウス、マウス３匹／群のｄｄ－ＰＣＲ（ＰＫ）による写真である。第１週の結果を示す。各図とも、左はＡＡＶ８処置、右はＡＡＶ３Ｇ１処置したものである。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いる遺伝子治療は、近年の臨床試験で得られた有望な結果に刺激され、ますます期待が高まっている。現在まで、カプシドを利用するＡＡＶベクターは、げっ歯類で血管内注入後、多くの組織へほぼ完全に形質導入され、インビボ遺伝子送達への大きな可能性を示している。したがって、ＡＡＶ８は、改善ベクターを設計するための論理的開始点である。その基盤を前進させるため、本明細書は、中和抗体に対する耐性、収量、発現、または形質導入率が高いＡＡＶ８変異体を提供する。方法は、さまざまな組織を標的とし、さまざまな病態を治療するＡＡＶの使用を対象とする。

特に明記しないかぎり、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって、また本出願で使用する多くの用語に対する一般指針を当業者に提
供する公開済みテキストの参照によって、共通して理解される意味と同一の意味を持つ。以下の定義は、あくまで明確にするために提供するものであり、特許請求する発明を限定するものではない。本明細書で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「眼細胞（ａｎ ｏｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ）」は、１つ以上の眼細胞を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。本明細書で使用する場合、用語「約」は、特に明記しない限り、所与の参照値から１０％の変動性を意味する。本明細書のさまざまな実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という表現を使用して提示されているが、他の状況下、関連する実施形態も「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という表現を使用して解釈され記載されるものとする。

以下の記載に関して、本明細書に記載される組成物の各々は、別の実施形態、本発明の方法において有用であることが意図される。さらに、かかる方法において有用な、本明細書に記載される組成物の各々はそれ自体が、別の実施形態においては、本発明の実施形態であることも意図される。

本明細書で使用する場合、用語「標的組織」は、対象ＡＡＶベクターによる形質導入が意図される任意の細胞または組織を指し得る。かかる用語は、筋肉、肝臓、肺、気道上皮、ニューロン、眼（眼細胞）、または心臓のいずれか１つ以上を指してよい。一実施形態では、標的組織は肝臓である。別の実施形態では、標的組織は眼である。

本明細書で使用する場合、用語「眼細胞」は、眼内にあるかまたは眼の機能に関連している任意の細胞を指す。かかる用語は、杆体、錐体を含む視細胞、及び光感受性神経節細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、ミュラー細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞のいずれか１つ以上を指してよい。一実施形態では、眼細胞は双極細胞である。別の実施形態では、眼細胞は水平細胞である。別の実施形態では、眼細胞は神経節細胞である。

本明細書で使用する場合、「哺乳類の対象」または「対象」という用語には、本明細書に記載の処置または予防をする方法を必要とする任意の哺乳類、特にヒトなどが含まれる。そのような処置または予防を必要とする他の哺乳類には、非ヒト霊長類等などを含めた、イヌ、ネコ、または他の飼育動物、ウマ、家畜、実験動物が挙げられる。対象は雄でも雌でもよい。

本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、その内部でプラスミドからｒＡＡＶが産生されるパッケージング細胞株を指してよい。別の場合には、用語「宿主細胞」は、その内部で導入遺伝子の発現が所望される標的細胞を指してよい。

Ａ．ＡＡＶカプシド
本明細書に記載する組換え型ＡＡＶカプシドタンパク質は、天然型完全長（ｖｐ１）ＡＡＶ８カプシド配列（配列番号３４）と比較して、以下の領域、すなわち、ｉ．アミノ酸２６３～２６７（配列番号７８）；ｉｉ．アミノ酸４５７～アミノ酸４５９；ｉｉｉ．アミノ酸４５５～アミノ酸４５９（配列番号８１）；またはｉｖ．アミノ酸５８３～アミノ酸５９７（配列番号６９）のうち少なくとも１つの領域において変異を有する可変タンパク質３（ｖｐ３）を特徴とする。そのようなカプシドを有するＡＡＶは、ＡＡＶ８に比べて標的組織における形質導入率が高い。本明細書に記載する新規なＡＡＶ、カプシド、及びその断片をコードする核酸配列も本発明によって包含される。

本明細書で使用する場合、用語「天然型」は、カプシドタンパク質のｉ．アミノ酸２６３～２６７；ｉｉ．アミノ酸４５７～アミノ酸４５９；ｉｉｉ．アミノ酸４５５～アミノ
酸４５９；またはｉｖ．アミノ酸５８３～アミノ酸５９７（ＡＡＶ８の番号付けを使用）に変異のない天然型ＡＡＶ配列を指す。ただし、天然に生じるＡＡＶ８が唯一の野生型配列源ということではない。本明細書で有用なものは天然には生じないＡＡＶであり、それらには、限定することなく、組換え型、修飾または改変型、シャッフル型、キメラ型、ハイブリッド型、進化型、合成、人工等のＡＡＶが含まれる。これには、カプシドのｉ．アミノ酸２６３～２６７；ｉｉ．アミノ酸４５７～アミノ酸４５９；ｉｉｉ．アミノ酸４５５～アミノ酸４５９；またはｉｖ．アミノ酸５８３～アミノ酸５９７（ＡＡＶ８の番号付けを使用）以外の領域に変異を有するＡＡＶが含まれるが、それらの変異は、本明細書に記載する変異カプシド作製用の「開始配列」として使用されるものである。

ＡＡＶカプシドは３つの重複するコード配列からなり、それらは代替的な開始コドンを使用するため長さが異なる。これらの可変タンパク質はＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３と呼ばれ、ＶＰ１が最も長く、ＶＰ３が最も短い。ＡＡＶ粒子は、３つの全てのカプシドタンパク質の比が約１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）で構成される。Ｎ末端でＶＰ１及びＶＰ２に含まれているＶＰ３は、粒子を作る主要構造成分である。カプシドタンパク質は、幾つかの異なる番号付けシステムを使用して参照することができる。便宜上、本明細書では、ＶＰ１の第１残基がアミノ酸１で開始されるＶＰ１番号付けを使用してＡＡＶ配列を参照する。ただし、本明細書に記載するカプシドタンパク質には、タンパク質の対応する領域に変異を有する、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３（本明細書ではｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３と同じ意味で使用されるの）が含まれる。ＡＡＶ８では、可変タンパク質は、完全長ＶＰ１の番号付けを使用したＶＰ１（アミノ酸１～７３８）、ＶＰ２（アミノ酸１３８～７３８）、及びＶＰ３（アミノ酸２０４～７３８）に対応する。天然型ＡＡＶ８ ｖｐ１のアミノ酸配列は配列番号３４で示される。

ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ分離株全体を通して配列相違を最も多く示す９つの超可変領域（ＨＶＲ）を含有している。参照により本明細書に組み込まれるＧｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６ Ｄｅｃ；８０（２３）：１１５５６－７０．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｓｅｐ １３を参照のこと。したがって、新たなベクターを合理的に設計する場合、ＨＶＲは豊富な標的となる。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＨＶＲＶＩＩＩ領域における変異を有する。一実施形態では、ＡＡＶ８天然型配列と比較した場合にアミノ酸５８３～アミノ酸５９７に変異を有するＡＡＶカプシドを提供する。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、下記表１に示すアミノ酸５８３～５９７配列を有する。本明細書には、表１に示すアミノ酸配列のうち１つが含まれるｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の配列を有する、カプシドタンパク質及びカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶが包含される。

ＨＶＲ．１領域及びＨＶＲ．ＩＶ領域でさらなる変異を行った。したがって、一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、アミノ酸２６３～アミノ酸２６７における変異を有する。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、２６３ＮＧＴＳＧ２６７（配列番号７８）－－＞ＳＧＴＨ（配列番号７９）の変異を有する。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、２６３ＮＧＴＳＧ２６７（配列番号７８）－－＞ＳＤＴＨ（配列番号８０）の変異を有する。本明細書には、配列番号７９または配列番号８０のアミノ酸配列のうち１つが含まれるｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の配列を有する、カプシドタンパク質及びカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶが包含される。

一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、アミノ酸４５７～アミノ酸４５９における変異を有する。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、アミノ酸４５５～アミノ酸４５９における変異を有する。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、４５７ＴＡＮ４５９－－＞ＳＲＰの変異を有する。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、４５５ＧＧＴＡＮ４５９（配列番号８１）－－＞ＤＧＳＧＬ（配列番号８２）の変異を有する。本明細書には、配列番号７９または配列番号８０のアミノ酸配列のうち１つが含まれるｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の配列を有する、カプシドタンパク質及びカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶが包含される。

別の実施形態では、ＡＡＶ８カプシド（または本明細書に記載する他のＡＡＶカプシド）のｖｐ１／ｖｐ２ユニーク領域は、異なるカプシド由来のｖｐ１／ｖｐ２領域で置き換えることができる。一実施形態では、ｖｐ１／ｖｐ２ユニーク領域を、ｒｈ．２０のｖｐ１／ｖｐ２ユニーク領域で置き換える。ＡＡＶ８では、ＡＡＶ８ ｖｐ１の番号付けを使用して場合、ｖｐ２はアミノ酸１３８にて、またｖｐ３はアミノ酸２０４にて開始する。したがって、一実施形態では、ＡＡＶ８のｖｐ１／２領域（アミノ酸１～２０３）を別のカプシドの対応する部分（ｖｐ１／２）と交換する。交換されたカプシドのｖｐ１／２領
域は、アミノ酸長が同一であっても異なっていてもよい。例えば、ＡＡＶｒｈ．２０では、ｖｐ１／２領域はその配列（配列番号８８）のアミノ酸１～２０２に及ぶ。Ｌｉｍｂｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ Ｆｅｂ；１７（２）：２９４－３０１（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。別の実施形態では、ｖｐ１／ｖｐ２ユニーク領域を、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、ｒｈ．８、ｒｈ．１０、ｒｈ．２０、ｈｕ．３７、ｒｈ．２Ｒ、ｒｈ．４３、ｒｈ．４６、ｒｈ．６４Ｒ１、ｈｕ．４８Ｒ３、またはｃｙ．５Ｒ４のｖｐ１／ｖｐ２ユニーク領域で置き換える。ｖｐ１／２領域は、当該技術分野で利用可能なアラインメントに基づいて容易に決定することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００６／１１０６８９を参照のこと。

ＡＡＶカプシドのｖｐ１のＯＲＦには第２のＯＲＦが含まれ、ＡＡＶの集合活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードする。ＯＲＦ２のＡＡＰコード配列が先に開始してから、ＶＰ３コード配列が開始される。ＡＡＶ８ ＡＡＰ天然型コード配列は配列番号３５で示される。天然型ＡＡＰアミノ酸配列は配列番号３６で示される。一実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ１のＯＲＦを変異させ、代替的ＡＡＰアミノ酸配列にする。したがって、一実施形態では、ＡＡＶ ｖｐ１核酸配列は、天然型ＡＡＶ８コード配列と少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態では、ＡＡＶ ｖｐ１核酸配列には、配列番号３７で示されるＯＲＦ２（ＡＡＰコード配列）が含まれる。別の実施形態では、ＡＡＶのＡＡＰアミノ酸配列は配列番号３８で示される。参照により本明細書に組み込まれるＳｏｎｎｔａｇ ｅｔ ａｌ，Ａ ｖｉｒａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＡＡＶ２ ｃａｐｓｉｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０ Ｊｕｎ １；１０７（２２）：１０２２０－１０２２５を参照のこと。

下記例に示すように、発明者らは、ＡＡＶ３Ｇ１と呼ぶＡＡＶ（ＡＡＶ８．ＴｒｉｐｌｅまたはＴｒｉｐｌｅと呼ぶ場合もある）は肝臓、筋肉及び気道上皮に効率的に形質導入することを示した。事実、ＡＡＶ３Ｇ１は、ｉ．ｍ．及びｉ．ｖ．のいずれでも天然型ＡＡＶ８と比べて約１０倍増の形質導入率を示し、ＣＢ７．ＣＩ．ｆｆルシフェラーゼ、ＣＭＶ．ＬａｃＺ及びｔＭＣＫ．ヒトＦ９などのさまざまな導入遺伝子カセットを有する。ＡＡＶ３Ｇ１変異体でさらに認められた有益性は、サル及びヒトのさまざまな抗血清、ならびにヒトＩＶＩＧに対する耐性（ヒトＩＶＩＧに関して、ＡＡＶ８の２～４倍レベル）を示すことである。さらに、ＡＡＶ３Ｇ１の鼻腔内投与により、気道上皮への形質導入効率がＡＡＶ８より２～３倍高くなった。したがって、一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、配列番号１８に示すようなＡＡＶ３Ｇ１配列を有する。

下記例に示すように、ＡＡＶ８．Ｔ２０と呼ぶＡＡＶは、ＡＡＶ８より約１０倍高いレベルで気道上皮に形質導入する。したがって、一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、配列番号２０に示すＡＡＶ８．Ｔ２０の配列を有する。

下記例に示すように、ＡＡＶ８．ＴＲ１と呼ぶＡＡＶは肝臓に効率的に形質導入する。したがって、一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、配列番号２２に示すＡＡＶ８．ＴＲ１の配列を有する。

別の実施形態では、配列番号２で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号４で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号６で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号８で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号１０で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号１２で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号１４で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配
列番号１６で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号１８で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号２０で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号２２で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号２４で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号２６で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号２８で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号３０で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、配列番号３２で示される配列を有するＡＡＶカプシドを提供する。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０または３２（ｖｐ１配列を示す）のいずれかに示すようなｖｐ１、ｖｐ２またはｖｐ３タンパク質を有する。

別の態様では、本明細書に記載するＡＡＶウイルス、カプシド及び断片をコードする核酸配列を提供する。したがって、一実施形態では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０または３２をコードする核酸を提供する。一実施形態では、ＡＡＶ３Ｇ１カプシド（配列番号１８）をコードする核酸を提供する。別の実施形態では、ＡＡＶ８．Ｔ２０カプシド（配列番号２０）をコードする核酸を提供する。別の実施形態では、ＡＡＶ８．ＴＲ１カプシド（配列番号２２）をコードする核酸を提供する。一実施形態では、ＡＡＶ３Ｇ１をコードする核酸配列は配列番号１７で示される。一実施形態では、ＡＡＶ８．Ｔ２０をコードする核酸配列は配列番号１９で示される。一実施形態では、ＡＡＶ８．ＴＲ１をコードする核酸配列は配列番号２１で示される。別の実施形態では、カプシドをコードする核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９もしくは３１で示されるか、またはこれらの配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性を共有する配列である。別の実施形態では、核酸分子は機能性ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質もコードする。

Ｂ．ｒＡＡＶベクター及び組成物
別の態様では、異種遺伝子または他の核酸配列を標的細胞に送達する際に有用なウイルスベクターを作製するための本明細書に記載のＡＡＶカプシド配列（その断片を含む）を利用する分子を本明細書に記載する。一実施形態では、本明細書に記載する組成物及び方法において有用なベクターは、本明細書に記載の選択ＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ３Ｇ１カプシド、ＡＡＶ８．Ｔ２０カプシドもしくはＡＡＶ．ＴＲ１カプシド、またはその断片、をコードする配列を最低限含有する。別の実施形態では、有用なベクターは、選択したＡＡＶの血清型のｒｅｐタンパク質、例えば、ＡＡＶ８ ｒｅｐタンパク質、またはその断片をコードする配列を最低限含有する。任意選択で、そのようなベクターは、ＡＡＶのｃａｐとｒｅｐの両タンパク質を含有してよい。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐの両方が提供されるベクターでは、ＡＡＶ ｒｅｐ配列及びＡＡＶ ｃａｐ配列のいずれも１つの血清型に由来する、例えば、全てＡＡＶ８由来などであり得る。別法として、ｒｅｐ配列が、ｃａｐ配列を提供する野生型ＡＡＶとは異なるＡＡＶに由来するベクターを使用してよい。一実施形態では、ｒｅｐ配列及びｃａｐ配列を別々の材料（例えば、別々のベクター、または宿主細胞とベクター）で発現させる。別の実施形態では、これらのｒｅｐ配列を、異なるＡＡＶの血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合させ、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２８２，１９９号に記載のＡＡＶ２／８のようなキメラ型ＡＡＶベクターを形成する。任意選択で、ベクターは、両側でＡＡＶの５’ＩＴＲ及びＡＡＶの３’ＩＴＲが隣接する選択導入遺伝子を含むミニ遺伝子をさらに含有する。別の実施形態では、ＡＡＶは自己相補型（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）ＡＡＶ（ｓｃ－ＡＡＶ）である（参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／０１４１４２２を参照のこと）。自己相補型ベクターには、複数のベクターゲノム間でのＤＮＡ合成また
は塩基対形成を必要とせずにｄｓＤＮＡに折り畳み可能な逆位反復配列ゲノムがパッケージングされている。ｓｃＡＡＶは、発現に先立って一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換する必要がないので、より効率的なベクターである。ただし、この効率と引き替えにベクターのコード能力は半減するため、ＳｃＡＡＶは、低分子タンパク質をコードする遺伝子（最高約５５ｋｄ）及び現在利用可能なＲＮＡによる任意の治療にとって有用である。

一態様では、本明細書に記載するベクターは、本明細書に記載する無傷のＡＡＶカプシドをコードする核酸配列を含有する。一実施形態では、カプシドは、配列番号１８、２０または２２のアミノ酸１～７３８を含む。別の実施形態では、ＡＡＶは、天然型ＡＡＶ８（配列番号３４）と比較した場合に、以下の領域、すなわち、ｉ．アミノ酸２６３～２６７（配列番号７８）；ｉｉ．アミノ酸４５７～アミノ酸４５９；ｉｉｉ．アミノ酸４５５～アミノ酸４５９（配列番号８１）；またはｉｖ．アミノ酸５８３～アミノ酸５９７（配列番号６９）のうち少なくとも１つの領域において変異を含む組換え型ＡＡＶカプシドを有する。一実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ８に比べて標的組織における形質導入率が高い。一実施形態では、ＡＡＶは、２６３ＮＧＴＳＧ２６７（配列番号７８）－－＞ＳＧＴＨ（配列番号７９）、または２６３ＮＧＴＳＧ２６７（配列番号７８）－－＞ＳＤＴＨ（配列番号８０）を含む変異を有する。別の実施形態では、ＡＡＶは、４５７ＴＡＮ４５９－－＞ＳＲＰ、または４５５ＧＧＴＡＮ４５９（配列番号８１）－－＞ＤＧＳＧＬ（配列番号８２）を含む変異を有する。さらに別の実施形態では、ＡＡＶは、５８３ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩＧＴ５９７（配列番号６９）－－＞ＧＤＮＬＱＬＹＮＴＡＰＧＳＶＦ（配列番号７０）を含む変異を有する。別の実施形態では、ＡＡＶは、以下の変異、すなわち、２６３ＮＧＴＳＧ２６７（配列番号７８）－－＞ＳＧＴＨ（配列番号７９）、４５７ＴＡＮ４５９－－＞ＳＲＰ、及び５８３ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩＧＴ５９７（配列番号６９）－－＞ＧＤＮＬＱＬＹＮＴＡＰＧＳＶＦ（配列番号７０）を有する。

別の実施形態では、ＡＡＶはカプシドタンパク質を有し、ここで、前記ＶＰ１／ＶＰ２ユニーク領域は、ＡＡＶ８とは異なるカプシドに由来するＶＰ１／ＶＰ２ユニーク領域で置き換えられている。一実施形態では、ＶＰ１／ＶＰ２ユニーク領域は、ＡＡＶｒｈ．２０由来である。一実施形態では、ｒｈ．２０ ｖｐ１配列は配列番号８８である。

１つのＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質で置き換えられているシュードタイプ化ベクターは、本明細書において有用である。例示するため、ＡＡＶ２のＩＴＲを有する、本明細書に記載するＡＡＶ８変異カプシドを用いるＡＡＶベクターを、以下に記載の例で使用する。Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ，上記引用を参照のこと。特に明記しない限り、ＡＡＶのＩＴＲ、及び本明細書に記載する他の選択ＡＡＶ成分は、限定することなく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９または既知及び不明の他のＡＡＶ血清型など、ＡＡＶの任意の血清型から個別に選択されてよい。望ましい一実施形態では、血清型が２型のＡＡＶのＩＴＲを使用する。ただし、他の好適な血清型由来のＩＴＲを選択してよい。これらのＩＴＲまたは他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能になっている技術を使用して、ＡＡＶの血清型から容易に単離され得る。そのようなＡＡＶは、単離しても、または学術、商用、または公共の供給源（例えば、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手してもよい。別法として、ＡＡＶ配列は、合成を介して得ても、または文献、もしくは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄ等のようなデータベースにて利用可能なものなど、公開済み配列の参照による他の好適な手段を介して得てもよい。一実施形態では、ＡＡＶは配列番号１７の配列を含み、これはＡＡＶ３Ｇ１の完全長ＤＮＡコード配列に対応する。別の実施形態では、ＡＡＶは配列番号１９の配列を含み、これはＡＡＶ８．Ｔ２０の完全長ＤＮＡ配列に対応する。別の実施形態では、ＡＡＶは配列番号２１の配列を含み、これはＡＡＶ８．ＴＲ１の完全長ＤＮＡ配
列に対応する。

本明細書に記載するｒＡＡＶは、ミニ遺伝子も含む。ミニ遺伝子は、最低限、以下に記載のような異種核酸配列（導入遺伝子）、及びその制御配列、ならびに５’及び３’の各ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）で構成される。カプシドタンパク質にパッケージングされ、選択標的細胞まで送達されるのは、このミニ遺伝子である。

導入遺伝子は、それに隣接するベクター配列とは異種の核酸配列であり、これは、関心対象のポリペプチド、タンパク質、または他の産物をコードする。核酸コード配列は、標的細胞において導入遺伝子の転写、翻訳、及び／または発現が可能になる様態で制御成分に機能的に連結されている。異種核酸配列（導入遺伝子）は、いかなる生物に由来してもよい。ＡＡＶは、１つ以上の導入遺伝子を含んでよい。

導入遺伝子配列の組成は、得られるベクターをどの用途に置くかに依存することになる。例えば、ある種の導入遺伝子配列には、レポーター配列が含まれ、発現と同時に検出可能なシグナルを発する。そのようなレポーター配列には、限定することなく、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、膜結合型タンパク質、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ヘマグルチニンタンパク質、及び当該技術分野で周知のもので、それに指向する高親和性抗体が存在するかまたは従来の手段で作製可能なものなど、ならびに抗原タグドメイン、なかでも、ヘマグルチニンまたはＭｙｃに由来するものと適切に融合された膜結合型タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれる。

これらのコード配列は、かかる配列の発現を誘導してくれる調節エレメントと会合すると、酵素、Ｘ線、比色法、蛍光または他の分光法によるアッセイ、蛍光標示式細胞分取法、ならびに酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び免疫組織化学を含む免疫学的測定法など、従来の手段で検出可能なシグナルを発する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、そのシグナルを持っているベクターの存在がベータ－ガラクトシダーゼ活性用アッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、そのシグナルを持っているベクターを、ルミノメーターで得られる色または光によって目視で測定してよい。

しかしながら、導入遺伝子は、生物学及び医学において有用な産物、例えば、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、ドミナントネガティブ変異体、または触媒ＲＮＡなどをコードする非マーカー配列であることが望ましい。望ましいＲＮＡ分子には、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームリボ核酸、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡが挙げられる。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置を受けた動物において標的とした核酸配列の発現を阻害するかまたは消失させる配列である。典型的に、好適な標的配列には、腫瘍学的標的及びウイルス性疾患が含まれる。そのような標的の例は、下記の免疫原に関連する項で特定されている腫瘍学的な標的及びウイルスを参照のこと。

導入遺伝子を使用して遺伝子欠損を修正または改善してよく、かかる欠損には、正常遺伝子が正常レベルより少ないレベルで発現している欠損、または機能性遺伝子産物が発現していない欠損が含まれ得る。別法として、導入遺伝子は、その細胞型または宿主において天然では発現されない産物をかかる細胞に提供してよい。好ましい型の導入遺伝子配列は、宿主細胞に発現させる治療用のタンパク質またはポリペプチドをコードする。本発明には、複数の導入遺伝子を使用することがさらに含まれる。特定の状況では、異なる導入
遺伝子を使用して、タンパク質の各サブユニットをコードさせても、または異なるペプチドまたはタンパク質をコードさせてもよい。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡサイズが大きい場合、例えば、免疫グロブリン、血小板由来成長因子、またはジストロフインタンパク質の場合に望ましい。細胞がマルチサブユニットタンパク質を産生するために、細胞を、各種サブユニットの各々を含有する組換え型ウイルスに感染させる。別法として、タンパク質の各種サブユニットは、同一の導入遺伝子によりコードされてよい。この場合、単一導入遺伝子には、サブユニットの各々をコードするＤＮＡが含まれ、各サブユニットに対するＤＮＡは配列内リボザイム進入部位（ＩＲＥＳ）により区切られている。これは、サブユニットの各々をコードするＤＮＡサイズが小さい場合、例えば、サブユニット及びＩＲＥＳをコードするＤＮＡの合計サイズが５キロ塩基未満の場合に望ましい。ＩＲＥＳの代替として、翻訳後イベントにおいて自己切断する２Ａペプチドをコードする配列によりＤＮＡを区切ってよい。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ
ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（Ｐｔ １）：１３－２１（Ｊａｎ １９９７）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４－８７３（Ｊｕｎｅ ２００１）；Ｋｌｕｍｐ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１０）：８１１－８１７（Ｍａｙ ２００１）を参照のこと。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳよりはるかに小さく、空間が制限要因となる場合の使用に非常に適している。より頻度が多いのは、導入遺伝子が、大きい場合、マルチサブユニットからなる場合、または２つの導入遺伝子を同時送達する場合に、所望の導入遺伝子（複数可）またはサブユニットを担持するｒＡＡＶを同時投与し、生体内でコンカタマー化して単一ベクターゲノムを形成するようにすることである。そのような実施形態では、第１のＡＡＶは単一導入遺伝子を発現する発現カセットを担持してよく、第２のＡＡＶは宿主細胞での共発現用の異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを担持してよい。ただし、選択導入遺伝子は、任意の生物学的に活性な産物または他の産物、例えば、試験に望ましい産物をコードしてよい。

導入遺伝子によってコードされる有用な治療用産物には、ホルモンならびに増殖因子及び分化因子が含まれ、これには、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、トランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリー（ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、または任意の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１～ＢＭＰ１５を含む）のいずれか１つ、成長因子のヘレグルイン（ｈｅｒｅｇｌｕｉｎ）／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３とＮＴ－４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか１つ、ネトリン－１及びネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニック・ヘッジホッグならびにチロシンヒドロキシラーゼが挙げられるが、これに限定されない。

他の有用な導入遺伝子産物には、サイトカインとリンホカイン、例えば、トロンボポチエン（ＴＰＯ）、ＩＬ－１からＩＬ－２５までのインターロイキン（ＩＬ）（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１８を含む）など、単球走化性タンパク質、白血病抑制性因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αと腫瘍壊死因子β、インターフェロンのα、β、及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ
３リガンドを含むが、これに限定されない免疫系制御タンパク質が含まれる。免疫系により産生される遺伝子産物もまた本発明では有用である。これらには、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）、キメラ型免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラ型Ｔ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ分子、ならびに工学的に操作された免疫グロブリン及びＭＨＣ分子が含まれるが、これに限定されない。有用な遺伝子産物には、補体調節タンパク質、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２及びＣＤ５９などの補体調節タンパク質も含まれる。

他に有用なさらなる遺伝子産物には、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質及び免疫系タンパク質に対する各受容体のいずれか１つが挙げられる。本発明は、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低比重リボタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体、及びスカベンジャー受容体など、コレステロール調節のための受容体を包含する。本発明は、遺伝子産物、例えば、グルココルチコイド受容体及びエストロゲン受容体を含むステロイドホルモン受容体スーパーファミリーメンバー、ビタミンＤ受容体ならびに他の核内受容体も包含する。さらに、有用な遺伝子産物には、転写因子、例えば、ｊｕｎ、ｆｏｓ、最大、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤとミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えば、ＧＡＴＡ－３、ならびにウィングドヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリーなどが含まれる。

他の有用な遺伝子産物には、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸合成酵素、アルギニノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１抗トリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータ合成酵素、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリルｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラート（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフインｃＤＮＡ配列が含まれる。他に有用なさらなる遺伝子産物には、酵素補充療法で有用であり得る酵素が挙げられ、これは、酵素作用の欠乏に起因するさまざまな状態に有用である。例えば、マンノース－６－リン酸を含有する酵素はリソソーム蓄積症の治療に用いられ得る（例えば、好適な遺伝子には、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードする遺伝子が含まれる）。

他の有用な遺伝子産物には、天然には生じないポリペプチド、例えば、挿入、欠失またはアミノ酸置換が含有される天然には生じないアミノ酸配列を有するキメラ型またはハイブリッド型ポリペプチドが含まれる。例えば、一本鎖の工学的に操作された免疫グロブリンは特定の免疫不全患者において有用となり得るであろう。他の種類の天然には生じない遺伝子配列には、アンチセンス分子及び触媒核酸、例えばリボザイムなどが含まれ、それを使用して標的の過剰発現を抑制することができるであろう。

遺伝子の発現の抑制及び／または調節は、がん及び乾癬のような高増殖細胞を特徴とする高増殖性病態の治療に特に望ましい。標的ポリペプチドには、正常細胞と比較した場合に、高増殖細胞で排他的に産生されるかまたは高レベルで産生されるポリペプチドが含ま
れる。標的抗原には、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのようながん遺伝子ならびに転座遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ及びＥＧＲＦによってコードされるポリペプチドが挙げられる。標的抗原としてのがん遺伝子産物に加え、抗がん治療及び保護レジメンの標的ポリペプチドには、Ｂ細胞リンパ腫により作られる抗体の可変領域及びＴ細胞性リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域が含まれ、これらも、いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の標的抗原として使用される。他の腫瘍関連ポリペプチドを標的ポリペプチドとして使用することができ、例えば、モノクローナル抗体１７－１Ａによって認識されるポリペプチド及び葉酸結合ポリペプチドを含め、腫瘍細胞に高レベルで見られるポリペプチドなどを標的ポリペプチドとして使用できる。

他の好適な治療用のポリペプチド及びタンパク質には、自己を対象にする抗体を産生する細胞受容体及び細胞など、自己免疫に関連した標的に対し、広範な防御免疫応答を付与することによって自己免疫性の疾患及び障害に苦しむ個人を治療するのに有用であり得るものが含まれる。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患には、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発（性）筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。これらの疾患の各々は、自己免疫疾患に関連する内在性抗原に結合して炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により特徴付けられる。

別法として、または追加として、本発明のベクターは、本発明のＡＡＶ配列、及び選択免疫原に対する免疫応答を誘導する、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする導入遺伝子を含有してよい。例えば、免疫原は、多種多様なウイルスファミリーから選択されてよい。それに対する免疫応答が望ましいと考えられる望ましいウイルスファミリーの例には、ピコルナウイルス科が含まれ、これには、感冒の約５０％の症例の原因となっているライノウイルス属；ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、及びヒトエンテロウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルスを含むエンテロウイルス属；及び主に非ヒト動物における口蹄疫の原因である口蹄疫ウイルス属が含まれる。ウイルスのピコルナウイルス科内では、標的抗原にはＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びＶＰＧが含まれる。別のウイルス科には、流行性胃腸炎の主要病原体であるノーウォーク群のウイルスを包含するカリシウイルス科が含まれる。ヒト及び非ヒト動物に免疫応答を誘発させるために抗原指向で使用するのに望ましいさらに別のウイルス科はトガウイルス科であり、この科には、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、及びベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎＆西部ウマ脳炎のウイルスを含むアルファウイルス属、ならびにルビウイルス（風疹ウイルスを含む）が含まれる。Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科には、デングウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス及びダニ媒介性脳炎ウイルスが含まれる。他の標的抗原は、Ｃ型肝炎ウイルスまたはコロナウイルス科から生じるものであってよく、これには、多数の非ヒトウイルス、例えば、感染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）、及びヒト呼吸器コロナウイルスなどが含まれ、それらは、感冒及び／またはＡ型、Ｂ型もしくはＣ型以外の肝炎を引き起こし得る。コロナウイルス科内では、標的抗原には、Ｅ１（Ｍまたは基質タンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓまたはスパイクタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥまたはヘマグルチン－エルテロース（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ－ｅｌｔｅｒｏｓｅ）とも呼ばれる）糖タンパク質（全てのコロナウイルスに存在するわけではない）、またはＮ（ヌクレオカプシド）が含まれる。ラブドウイルス科に対しては、さらに他の抗原を標的としてよく、それらには、ベシクロウイルス属（例えば、水胞性口炎ウイルス）、及びリッサウイルス全般（例えば、狂犬病）が含まれる。ラブドウイルス科内では、好適な抗原はＧタンパク質またはＮタンパク質に由来してよい。Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科にはマールブルグなどの出血熱ウイルスが含まれ、エボラウイ
ルスは好適な抗原供給源であり得る。パラミクソウイルス科には、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、モルビリウイルスが含まれ、このモルビリウイルスには、麻疹及びイヌジステンパー、及びニューモウイルスが含まれ、ニューモウイルスには呼吸器合胞体ウイルスが含まれる。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科に分類され、好適な抗原供給源である（例えば、ＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）。ブニヤウイルス科には、ブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス（リフトバレー熱）、ハンタウイルス（プレマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハギン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルス）、ナイロウイルス（ナイロビ羊病）及びさまざまな未割当のブンガウイルス（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓ）が含まれる。アレナウイルス科は、ＬＣＭ及びラッサ熱ウイルスに対する抗原供給源を提供する。レオウイルス科には、レオウイルス属、ロタウイルス属（小児急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルス属、及びクルチウイルス（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）（コロラドダニ熱、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）が含まれる。

レトロウイルス科には、亜科オンコリウイルス（ｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）が含まれ、ネコ科白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）、のようなヒト疾患及び獣医疾患を包含する（これらには、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、及びスプマウイルス（ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｌ）、が含まれる）。ＨＩＶとＳＩＶの間で、多くの好適な抗原が記載されており、容易に選択することができる。好適なＨＩＶ及びＳＩＶ抗原の例には、限定することなく、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ及びＲｅｖといったタンパク質、ならびにその各種断片が含まれる。さらに、これらの抗原に対するさまざまな修飾が記載されている。これを目的とした好適な抗原は当業者に公知である。例えば、他のタンパク質の中でもｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、及びＶｐｒ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ及びＲｅｖをコードする配列を選択してよい。例えば、米国特許第５，９７２，５９６号に記載の修飾ｇａｇタンパク質を参照のこと。また、Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（５）：２４６２－２４６７（Ｍａｒｃｈ ２００１）、及びＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔ
ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９－７４（６ Ａｐｒｉｌ ２００１）に記載のＨＩＶタンパク質及びＳＩＶタンパク質を参照のこと。これらのタンパク質またはそのサブユニットは、単独で送達するか、または別々のベクターにして組み合わせるか、もしくは組み合わせた単一ベクターにして送達してよい。

パポーバウイルス科には、亜科のポリオーマウイルス（ＢＫＵ及びＪＣＵウイルス）及び亜科のパピローマウイルス（がんまたは乳頭腫の悪性進行に関連する）が含まれる。アデノウイルス科には、呼吸器疾患及び／または腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）が含まれる。パルボウイルス科のネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス、及びブタパルボウイルスがある。ヘルペスウイルス科には、単純ウイルス属（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセロウイルス属（仮性狂犬病ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス）を包含するアルファヘルペスウイルス亜科、ならびにサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス（ｍｕｒｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））を含むベータヘルペスウイルス亜科、ならびにリンフォクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、感染性鼻気管炎ウイルス、マレック病ウイルス、及びラジノウイルスを含むガンマヘルペスウイルス亜科が含まれる。ポックスウイルス科には、オルソポックスウイルス属（痘瘡（天然痘）及びワクシニア（牛痘）属、パラポックスウイルス属、トリポックスウイルス属、カプリポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属、スイポックスウイルス属を包含するコルドポックスウイルス亜科、ならびにエントモポックスウイルス亜科が含まれる。ヘパドナウイルス科には、Ｂ型肝炎
ウイルスが含まれる。抗原供給源として好適であり得る未割当のウイルスの一つはデルタ肝炎ウイルスである。さらなる他のウイルス供給源には、トリ鷄伝染性ファブリキウス嚢病及びブタ呼吸・繁殖障害症候群ウイルスが含まれ得る。アルファウイルス科には、ウマ動脈炎ウイルス及び各種脳炎ウイルスが含まれる。

本発明は、ヒト及び非ヒト脊椎動物を感染させる細菌、真菌類、寄生微生物もしくは多細胞性寄生虫を含む他の病原体、またはがん細胞または腫瘍細胞由来の病原体に対してヒトまたは非ヒト動物を免疫するのに有用な免疫原も包含し得る。細菌病原体の例には、肺炎球菌；ブドウ球菌；及びレンサ球菌を含む病原性グラム陽性球菌が含まれる。病原性グラム陰性球菌には、髄膜炎菌、淋菌が含まれる。病原性腸溶性グラム陰性桿菌には、ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ；ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、アシネトバクター及びｅｉｋｅｎｅｌｌａ；類鼻疽；ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；ｓｈｉｇｅｌｌａ；ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ；ｍｏｒａｘｅｌｌａ；Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ（軟性下疳を引き起こす）；ｂｒｕｃｅｌｌａ；Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病を引き起こす）；ｙｅｒｓｉｎｉａ（パスツレラ属）；ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ及びｓｐｉｒｉｌｌｕｍが含まれ、グラム陽性桿菌には、ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ジフテリア）；ｃｈｏｌｅｒａ；Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）；ｄｏｎｏｖａｎｏｓｉｓ（鼠径肉芽腫）；及びバルトネラ症が含まれる。病原性嫌気性菌によって生じる疾患には、破傷風；ボツリヌス中毒；他のクロストリジウム；結核；らい病；及び他のマイコバクテリアが含まれる。病原性スピロヘータによる疾患には、梅毒；トレポネーマ症：イチゴ腫、ピンタ及び地方病性梅毒；及びレプトスピラ症が含まれる。病原性の高い細菌及び病原性真菌類によって生じる他の感染症には、アクチノミセス症；ノカルジア症；クリプトコッカス症、醸母菌症、ヒストプラスマ症及びコクチジオイデス真菌症；カンジダ症、アスペルギルス症、及びムコール症；スポロトリクム症；パラコクシジオイデス症、ペトリエリジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫及びクロモミコーシス；及び皮膚糸状菌症が含まれる。リケッチア感染には、チフス熱、ロッキー山紅斑熱、Ｑ熱、及びリケッチア痘症が含まれる。マイコプラズマ感染及びクラミジア感染の例には、肺炎マイコプラズマ；性病性リンパ肉芽腫；オウム病；及び周産期クラミジア感染が含まれる。病原性真核生物は、病原性の原虫及び蠕虫ならびにそれにより生じる感染を包含し、それには、アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ；Ｔｒｉｃｈａｎｓ；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ
ｇｏｎｄｉｉ；バベシア症；ジアルジア症；施毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅ）または吸虫（ｆｌｕｋｅ）；及び条虫（ｃｅｓｔｏｄｅ）（条虫（ｔａｐｅｗｏｒｍ））による感染が含まれる。

これらの生物及び／またはその産生毒素の多くは、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ［（ＣＤＣ）、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ］により、生物攻撃で使用される可能性を秘める病原体として同定されている。例えば、これらの生物病原体には、いずれも現在カテゴリＡ病原体に分類されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ及びその毒素（ボツリヌス中毒）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、大痘瘡（天然痘）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病）、及びウイルス性出血熱；Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ（Ｑ熱）；いずれも現在カテゴリＢ病原体に分類されているＢｒｕｃｅｌｌａ種（ブルセラ症）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ（鼻疽）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ及びその毒素（リシン毒素）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ及びその毒素（イプシロン毒素）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種及びその毒素（エンテロトキシンＢ）；ならびに現在カテゴリＣ病原体に分類されているニパン（Ｎｉｐ
ａｎ）ウイルス及びハンタウイルスが含まれる。さらに、そのように分類されているか、または異なって分類されている他の生物は、今後そのような目的のために同定及び／または使用され得る。本明細書に記載するウイルスベクター及び他の構成体は、これらの生物、ウイルス、その毒素または他の副生成物に由来する抗原を送達するために有用であり、それにより、これらの生物病原体との感染または他の有害反応が予防及び／または治療されるであろうことを容易に理解されるであろう。

本発明のベクターを投与してＴ細胞の可変領域に対する免疫原を送達することにより、ＣＴＬなど免疫応答を誘発してそれらのＴ細胞を排除する。関節リウマチ（ＲＡ）では、疾患に関与する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の幾つかの特定の可変領域が明らかにされている。これらのＴＣＲには、Ｖ－３、Ｖ－１４、Ｖ－１７及びＶα－１７が含まれる。したがって、これらのポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達により、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答が誘発されることになる。多発性硬化症（ＭＳ）では、疾患に関与するＴＣＲの幾つかの特定の可変領域が明らかにされている。これらのＴＣＲには、Ｖ－７及びＶα－１０が含まれる。したがって、これらのポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達により、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答が誘発されることになる。強皮症では、疾患に関与するＴＣＲの幾つかの特定の可変領域が明らかにされている。これらのＴＣＲには、Ｖ－６、Ｖ－８、Ｖ－１４及びＶα－１６、Ｖα－３Ｃ、Ｖα－７、Ｖα－１４、Ｖα－１５、Ｖα－１６、Ｖα－２８及びＶα－１２が含まれる。したがって、これらのポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸分子の送達により、強皮症に関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答が誘発されることになる。

望ましい一実施形態では、光遺伝学的治療を提供するよう導入遺伝子を選択する。光遺伝学的治療では、網膜神経回路に残存する生存細胞型に光活性化チャネルまたはポンプを遺伝子送達することによって人工視細胞を構築する。これは、視細胞機能の相当量を喪失しているが、神経節細胞への双極細胞回路及び視神経は無傷で残っている患者に特に有用である。一実施形態では、異種核酸配列（導入遺伝子）はオプシンである。オプシン配列は、ヒト、藻類及び細菌を含め、任意の好適な単細胞生物または多細胞生物に由来してよい。一実施形態では、オプシンはロドプシン、フォトプシン、Ｌ／Ｍ波長（赤／緑）のオプシン、または短波長（複数可）オプシン（青色）である。別の実施形態では、オプシンはチャネルロドプシンまたはハロロドプシンである。

別の実施形態では、遺伝子増強療法、すなわち、欠損または欠陥のある遺伝子の交換コピーを提供する療法での使用について導入遺伝子を選択する。この実施形態では、導入遺伝子は、必要な交換遺伝子を提供するため、当業者により容易に選択され得る。一実施形態では、欠損遺伝子／欠陥遺伝子は眼障害に関連する。別の実施形態では、導入遺伝子はＮＹＸ、ＧＲＭ６、ＴＲＰＭ１ＬまたはＧＰＲ１７９であり、眼障害は先天性停止性夜盲症である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＺｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１３ Ｊａｎ １０；９２（１）：６７－７５．Ｅｐｕｂ
２０１２ Ｄｅｃ １３を参照のこと。別の実施形態では、導入遺伝子はＲＰＧＲである。

別の実施形態では、遺伝子抑制療法、すなわち、天然型遺伝子の１つ以上の発現を転写レベルまたは翻訳レベルで分断または抑制する療法での使用について導入遺伝子を選択する。これは、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または当該技術分野において周知の他の技術を使用して達成可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｕｎ ｅｔ
ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０ Ｆｅｂ １；１２６（３）：７６４－７４及びＯ’Ｒｅｉｌｌｙ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００７ Ｊｕｌ；８１（１）：１２７－３５を参照のこと。この実施形態では、導入遺伝子は、サ
イレンシングが所望される遺伝子に基づいて当業者により容易に選択され得る。

別の実施形態では、導入遺伝子は２つ以上の導入遺伝子を含む。これは、２つ以上の異種配列を担持する単一ベクターを使用して、または各々が１つ以上の異種配列を担持する２つ以上のＡＡＶを使用して達成してよい。一実施形態では、ＡＡＶを遺伝子抑制（またはノックダウン）と遺伝子増強の併用療法に使用する。ノックダウン／増強併用療法では、関心対象の遺伝子の欠陥コピーをサイレンシングし、非変異コピーを供給する。一実施形態では、これは、同時投与する２つ以上のベクターを使用して達成される。参照により本明細書に組み込まれるＭｉｌｌｉｎｇｔｏｎ－Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｐｒｉｌ ２０１１，１９（４）：６４２－６４９を参照のこと。導入遺伝子は、所望の結果に基づいて当業者により容易に選択され得る。

別の実施形態では、遺伝子修正療法での使用について導入遺伝子を選択する。これは、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に誘導されるＤＮＡ二本鎖切断と外因性ＤＮＡドナー基質とを併せて使用し達成してよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＥｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（ｅｐｕｂ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１２）２０：３５－４２を参照のこと。導入遺伝子は、所望の結果に基づいて当業者により容易に選択され得る。

一実施形態では、本明細書に記載するカプシドは、各々が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／１５３，４７０号、第６２／１８３，８２５号、第６２／２５４，２２５号及び第６２／２８７，５１１号に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓデュアルベクター系で有用である。カプシドは、ホーミングエンドヌクレアーゼまたは他のメガヌクレアーゼの送達にも有用である。

別の実施形態では、本明細書で有用な導入遺伝子には、発現と同時に検出可能シグナルを発するレポーター配列が含まれる。そのようなレポーター配列には、限定することなく、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、膜結合型タンパク質、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ヘマグルチニンタンパク質、及び当該技術分野で周知のもので、それに指向する高親和性抗体が存在するか、または従来の手段で作製可能なものなど、ならびに抗原タグドメイン、なかでも、ヘマグルチニンまたはＭｙｃに由来するものと適切に融合された膜結合型タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれる。

これらのコード配列は、かかる配列の発現を誘導してくれる調節エレメントと会合すると、酵素、Ｘ線、比色法、蛍光または他の分光法によるアッセイ、蛍光標示式細胞分取法、ならびに酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び免疫組織化学を含む免疫学的測定法など、従来の手段で検出可能なシグナルを発する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、そのシグナルを持っているベクターの存在がベータ－ガラクトシダーゼ活性用アッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、そのシグナルを持っているベクターを、ルミノメーターで得られる色または光によって目視で測定してよい。

望ましくは、導入遺伝子は、生物学及び医学において有用な産物、例えば、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、または触媒ＲＮＡなどをコードする。望ましいＲＮＡ分子には、ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームリボ核酸、触媒ＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡが含まれる。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置を受けた動物において標的とした核酸配列の発現を消失させる配列である。

制御配列には、従来の制御エレメントが含まれ、これらは、ベクターでトランスフェクトした細胞または本明細書に記載のように作製されたウイルスに感染した細胞において、導入遺伝子の転写、翻訳及び／または発現を可能にするよう、かかる導入遺伝子に機能的に連結されている。本明細書で使用する場合、「機能的に連結されている」配列には、対象遺伝子に隣接する発現制御配列、及びトランスまたは遠隔で作用して対象遺伝子を制御する発現制御配列の両方が含まれる。

発現制御配列には、適切な転写開始の配列、終結配列、プロモーターとエンハンサーの各配列；スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなど効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を高める配列；及び所望に応じ、コード産物の分泌を高める配列が含まれる。プロモーター配列を含め、非常に多数の発現制御配列が当該技術分野で公知であり、それらを利用してよい。

本明細書で提供する構成体で有用な制御配列は、イントロン、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と遺伝子との間に位置するイントロンも含有し得る。望ましいイントロン配列の一つはＳＶ－４０に由来し、１００ｂｐの小型のイントロンのＳＤ－ＳＡと呼ばれるスプライスドナー／スプライスアクセプターである。別の好適な配列には、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後エレメントが含まれる。（例えば、Ｌ．Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｉ．Ｖｅｒｍａ，１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６：３９０６－３９１０を参照のこと）。ポリＡシグナルは、ＳＶ－４０、ヒト及びウシを含むがこれに限定されない好適な多くの種に由来してよい。

本明細書に記載する方法で有用なｒＡＡＶの別の制御成分は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列、または他の好適な系を使用して、単一の遺伝子転写産物から２つ以上のポリペプチドを産生させてよい。ＩＲＥＳ（または他の好適な配列）を使用して、２本以上のポリペプチド鎖を含有するタンパク質を産生させるか、または２つの異なるタンパク質を同一細胞から、または同一細胞内に発現させる。例示的なＩＲＥＳはポリオウイルスの配列内リボソーム進入配列であり、視細胞、ＲＰＥ及び神経節細胞での導入遺伝子の発現を支持する。好ましくは、ＩＲＥＳは、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子の３’に位置する。

一実施形態では、ＡＡＶは、プロモーター（またはプロモーターの機能性断片）を含む。ｒＡＡＶで採用すべきプロモーターの選択は、所望の標的細胞で選択導入遺伝子を発現させることができる、多数の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの中から行ってよい。一実施形態では、標的細胞は眼細胞である。プロモーターは、ヒトを含め、任意の種に由来してよい。望ましくは、一実施形態では、プロモーターは「細胞特異的」である。用語「細胞特異的」とは、組換え型ベクター用に選択された特定のプロモーターが、特定の細胞組織において選択導入遺伝子の発現を導くことができることを意味する。一実施形態では、プロモーターは、導入遺伝子の筋細胞での発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは肺での発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、導入遺伝子の肝細胞での発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、導入遺伝子の気道上皮での発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、導入遺伝子のニューロンでの発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、導入遺伝子の心臓での発現に特異的である。

発現カセットは典型的にプロモーター配列を発現制御配列の一部として含有し、例えば、選択された５’ ＩＴＲ配列と免疫グロブリン構成体コード配列との間に位置する。一実施形態では、肝臓での発現が望ましい。したがって、一実施形態では、肝臓特異的プロ
モーターを使用する。組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、調節可能プロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照のこと］、または生理学的合図に応答するプロモーターを本明細書に記載するベクターで使用してよい。別の実施形態では、筋肉での発現が望ましい。したがって、一実施形態では、筋特異的プロモーターを使用する。一実施形態では、プロモーターは、ＭＣＫを用いるプロモーター、例えば、ｄＭＣＫ（５０９ｂｐ）またはｔＭＣＫ（７２０ｂｐ）プロモーターである（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｎｏｖ；１５（２２）：１４８９－９９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２００８．１０４．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｊｕｎ １９を参照のこと）。別の有用なプロモーターはＳＰｃ５－１２プロモーターである（参照により本明細書に組み込まれるＲａｓｏｗｏ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｊｕｎｅ ２０１４ ｅｄｉｔｉｏｎ ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１８を参照のこと）。一実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターはＴＢＧプロモーターである。別の実施形態では、ＣＢ７プロモーターを使用する。ＣＢ７は、サイトメガロウイルスのエンハンサーエレメントを有するニワトリβ－アクチンプロモーターである。別法として、他の肝臓特異的プロモーターを使用してよい［例えば、Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ，ａｌｐｈａ １ ａｎｔｉ－ｔｒｙｐｓｉｎ（Ａ１ＡＴ）；ｈｕｍａｎ ａｌｂｕｍｉｎ Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４ ３２（１９９７），ｈｕｍＡｌｂ；及びｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２
９（１９９６）を参照のこと］。ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、アルファ－アンチトリプシンプロモーター、ＬＳＰ（８４５ｎｔ）２５（要イントロン－ｓｃＡＡＶ少量）。

プロモーター（複数可）は、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモウイルス（ｐｏｌｙｍｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏感染関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックスメタロプロテインプロモーター（ＭＰＰ）、及びニワトリベータ－アクチンプロモーターから選択することができる。

発現カセットは、少なくとも１つのエンハンサー、すなわち、ＣＭＶエンハンサーを含有してよい。さらに他のエンハンサーエレメントとして、例えば、アポリポタンパク質エンハンサー、ゼブラフィッシュエンハンサー、ＧＦＡＰエンハンサーエレメント、及びＷＯ２０１３／１５５５２２２に記載があるような脳特異的エンハンサー、ウッドチャック肝炎後転写後調節エレメントが含まれ得る。追加として、または別法として、他に、例えば、ハイブリッドヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期（ＩＥ）ＰＤＧＲプロモーターまたは他のプロモーター－エンハンサーエレメントを選択してよい。本明細書で有用な他のエンハンサー配列には、ＩＲＢＰエンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄ ２００７，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２００７ Ｄｅｃ；９（１２）：１０１５－２３）、前初期サイトメガロウイルスエンハンサー、免疫グロブリン遺伝子またはＳＶ４０エンハンサー由来のもの、マウス近位プロモーターで同定されたシス作用性エレメント等が含まれる。

プロモーターに加え、発現カセット及び／またはベクターは、他の適切な転写開始配列、終結配列、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル
など効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を高める配列；及び所望に応じ、コード産物の分泌を高める配列を含有してよい。多種多様な好適なポリＡが公知である。一例では、ポリＡはウサギベータグロビン、例えば、１２７ｂｐウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｖ００８８２．１）である。他の実施形態では、ＳＶ４０ポリＡシグナルを選択する。さらに他の好適なポリＡ配列を選択してよい。ある実施形態では、イントロンが含まれる。好適なイントロンの一つはニワトリベータ－アクチンイントロンである。一実施形態では、イントロンは８７５ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｘ００１８２．１）である。別の実施形態では、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なキメラ型イントロンを使用する。ただし、他の好適なイントロンを選択してよい。一実施形態では、ベクターゲノムが天然型ＡＡＶベクターゲノムとほぼ同サイズ（例えば、４．１～５．２ｋｂ）となるようスペーサーが含まれる。一実施形態では、ベクターゲノムが約４．７ｋｂとなるようスペーサーが含まれる。参照により本明細書に組み込まれるＷｕ ｅｔ ａｌ，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｉｚｅ ｏｎ ＡＡＶ
Ｖｅｃｔｏｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｊａｎ；１８（１）：８０－８６を参照のこと。

これら及び他の一般的なベクター及び調節エレメントの選択は慣例的であり、そのような多くの配列が利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、及びその中の例えば、３．１８ページ～３．２６ページ及び１６．１７ページ～１６．２７ページで引用されている参考文献、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと。もちろん、ベクター及び発現制御配列が全て等しく良好に機能して、本明細書に記載する導入遺伝子全てを発現するというわけではないであろう。しかしながら、当業者は、これら及び他の発現制御配列の中から、本発明の範囲を逸脱することなく選択し得る。

別の実施形態では、組換え型アデノ随伴ウイルスを作製する方法を提供する。好適な組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本明細書に記載のようなＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、またはその断片；機能性ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と、望ましい導入遺伝子をコードする異種核酸配列とで最低限構成されるミニ遺伝子；及びＡＡＶカプシドタンパク質内へのミニ遺伝子パッケージングを可能にする十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することによって作製される。ＡＡＶカプシドにＡＡＶミニ遺伝子をパッケージングする宿主細胞で培養が必要な成分は、トランスで提供されてよい。別法として、必要成分の任意の１つ以上（例えば、ミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／またはヘルパー機能）は、当業者に公知の方法を使用して必要成分の１つ以上を含有するよう工学的に操作されている安定宿主細胞により提供されてよい。

また本明細書は、本明細書に記載するようなＡＡＶでトランスフェクトした宿主細胞も提供する。最も好適には、そのような安定宿主細胞は誘導性プロモーターの制御下、必要成分（複数可）を含有するであろう。ただし、必要成分（複数可）は構成的プロモーターの制御下であってよい。好適な誘導性プロモーター及び構成的プロモーターの例は、本明細書の、導入遺伝子との併用に好適な調節エレメントについての下記考察に記載されている。さらに別の代替的方法では、選択した安定宿主細胞は、選択成分（複数可）を構成的プロモーターの制御下で、また他の選択成分（複数可）を１つ以上の誘導性プロモーターのの制御下で含有してよい。例えば、２９３細胞由来である（構成的プロモーター制御下のＥ１ヘルパー機能を含有する）が、誘導性プロモーター制御下でｒｅｐ及び／またはｃａｐタンパク質を含有する安定宿主細胞を作製してよい。さらに他の安定宿主細胞は当業者により作製され得る。別の実施形態では、宿主細胞は本明細書に記載する核酸分子を含
む。

本明細書に記載するｒＡＡＶ作製に必要なミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、そこに含まれている配列を移入させる任意の遺伝子エレメントの形態にしてパッケージング宿主細胞に送達してよい。選択した遺伝子エレメントは、本明細書に記載のものも含め、任意の好適な方法によって送達してよい。本発明の任意の実施形態の構築に使用する方法は、核酸操作における当業者には公知であり、それには、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術が含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと。同様に、ｒＡＡＶウイルス粒子を作製する方法は周知であり、好適な方法の選択が本発明に対する制限要素とはならない。中でも、例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ
ｅｔ ａｌ，１９９３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照のこと。これらの刊行物は参照により本明細書に組み込まれるものとする。

本明細書では、本明細書に記載のベクターを作製する際に使用するプラスミドも提供する。そのようなプラスミドは実施例の項に記載されている。
Ｃ．医薬組成物及び投与

一実施形態では、先に詳述したような、標的細胞で使用するための所望される導入遺伝子及び細胞特異的プロモーターを含有する組換え型ＡＡＶを、任意選択で、従来方法で汚染について評価し、その後、それを必要とする対象への投与が意図される医薬組成物に製剤化する。そのような製剤化では、ｐＨを適切な生理学的濃度に維持する緩衝生理食塩水もしくは他の緩衝剤、例えばＨＥＰＥＳなど、薬理学的及び／または生理学的に許容できるビヒクルもしくは担体、ならびに任意選択で、他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤等を使用する。注射の場合、担体は典型的に液体であろう。例示的な生理学的に許容される担体には、滅菌パイロジェンフリー水及び滅菌パイロジェンフリーリン酸緩衝食塩水が含まれる。多種多様なそのような公知の担体は米国特許公開第７，６２９，３２２号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、担体は等張性塩化ナトリウム溶液である。別の実施形態では、担体は平衡塩溶液である。一実施形態では、担体にはｔｗｅｅｎが含まれる。ウイルスを長期保存する場合は、グリセロールまたはＴｗｅｅｎ２０の存在下で凍結させてよい。別の実施形態では、薬理学的に許容される担体は、界面活性剤、例えばペルフルオロオクタン（Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｎ液）などを含む。ベクターは、ヒト対象への注入に好適な緩衝液／担体に配合する。緩衝液／担体には、ｒＡＡＶの注入チューブへの付着を防ぐが、生体内でのｒＡＡＶの結合活性を妨害しない成分が含まれなければならない。

本明細書に記載する方法のある実施形態では、上記の医薬組成物を対象に筋肉内投与する。他の実施形態では、医薬組成物を静脈内に投与する。本明細書に記載する方法で有用であり得る他の投与形態には、網膜下もしくは硝子体内送達、経口送達、吸入、経鼻送達、気管内送達、静脈内送達、筋肉内送達、皮下送達、皮内送達、及び他の非経口投与経路など、所望臓器（例えば、眼）への直接送達が挙げられるが、これに限定されるものではない。投与経路は、必要に応じて組み合わせてよい。

さらに、ある実施形態では、治療で細胞指向が必要な領域を確認するため、ベクター投与に先立ち特定の検査を実施することが望ましい。眼への送達が所望される一実施形態では、治療で標的とすべき特定の眼細胞の領域を確認する非侵襲的網膜イメージング及び機能検査を行う。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１２４２８２を参照のこと。また、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２
０１３／０２２６２８号を参照のこと。

組成物は、治療すべき領域の大きさ、使用するウイルス価、投与経路、及び方法による所望の効果に応じて、範囲内の全ての数字が含まれる、約０．１μＬ～約１０ｍＬの容量で送達してよい。一実施形態では、容量は約５０μＬである。別の実施形態では、容量は約７０μＬである。別の実施形態では、容量は約１００μＬである。別の実施形態では、容量は約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、容量は約２００μＬである。別の実施形態では、容量は約２５０μＬである。別の実施形態では、容量は約３００μＬである。別の実施形態では、容量は約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は約５００μＬである。別の実施形態では、容量は約６００μＬである。別の実施形態では、容量は約７５０μＬである。別の実施形態では、容量は約８５０μＬである。別の実施形態では、容量は約１０００μＬである。別の実施形態では、容量は約１．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は約２ｍＬである。別の実施形態では、容量は約２．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は約３ｍＬである。別の実施形態では、容量は約３．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は約４ｍＬである。別の実施形態では、容量は約５ｍＬである。別の実施形態では、容量は約５．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は約６ｍＬである。別の実施形態では、容量は約６．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は約７ｍＬである。別の実施形態では、容量は約８ｍＬである。別の実施形態では、容量は約８．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は約９ｍＬである。別の実施形態では、容量は約９．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は約１０ｍＬである。

制御配列の制御下で所望の導入遺伝子をコードする核酸配列を担持する組換え型アデノ随伴ウイルスの有効濃度は、１ミリリットルあたりのベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）（ゲノムコピー／ｍＬ（ＧＣ／ｍＬ）とも呼ばれる）が約１０^７～１０^１４の範囲が望ましい。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムをリアルタイムＰＣＲにより測定する。別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムをデジタルＰＣＲにより測定する。参照により本明細書に組み込まれるＬｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｔｉｔｅｒｓ ｂｙ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照のこと。別の実施形態では、ｒＡＡＶ感染単位は、参照により本明細書に組み込まれるＳ．Ｋ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ，１９８８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３に記載のように測定する。

好ましくは、濃度は約１．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ～約１．５×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、より好ましくは約１．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ～約１．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬである。一実施形態では、有効濃度は約１．４×１０^８ｖｇ／ｍＬである。一実施形態では、有効濃度は約３．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬである。別の実施形態では、有効濃度は約５．６×１０^１１ｖｇ／ｍＬである。別の実施形態では、有効濃度は約５．３×１０^１２ｖｇ／ｍＬである。さらに別の実施形態では、有効濃度は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬである。別の実施形態では、有効濃度は約１．５×１０^１３ｖｇ／ｍＬである。本明細書に記載する全ての範囲にはその端点が含まれる。

一実施形態では、用量は約１．５×１０^９ｖｇ／ｋｇ体重～約１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、より好ましくは約１．５×１０^９ｖｇ／ｋｇ～約１．５×１０^１１ｖｇ／ｋｇである。一実施形態では、用量は約１．４×１０^８ｖｇ／ｋｇである。一実施形態では、用量は約３．５×１０^１０ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は約５．６×１０^１１
ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は約５．３×１０^１２ｖｇ／ｋｇである。さらに別の実施形態では、用量は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は約１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は約３．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。本明細書に記載する全ての範囲にはその端点が含まれる。

一実施形態では、有効用量（送達される総ゲノムコピー数）は約１０^７～１０^１３ベクターゲノムである。一実施形態では、総用量は約１０^８ゲノムコピーである。一実施形態では、総用量は約１０^９ゲノムコピーである。一実施形態では、総用量は約１０^１０ゲノムコピーである。一実施形態では、総用量は約１０^１１ゲノムコピーである。一実施形態では、総用量は約１０^１２ゲノムコピーである。一実施形態では、総用量は約１０^１３ゲノムコピーである。一実施形態では、総用量は約１０^１４ゲノムコピーである。一実施形態では、総用量は約１０^１５ゲノムコピーである。

毒性などの望ましくない作用を抑えるため、最低有効濃度のウイルスを用いることが望ましい。これらの範囲内のさらに他の用量及び投与容量は、処置を受ける対象、好ましくはヒトの身体状態、対象の年齢、特定の障害及び進行性の場合はその障害の進行の程度を考慮に入れ、主治医により選択されてよい。静脈内送達では、例えば、１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ程度の用量を必要とする。
Ｄ．方法

本明細書で論じるように、ＡＡＶ８変異カプシドを含むベクターは、高レベルで標的組織に形質導入することができる。したがって、本明細書は、肝細胞に導入遺伝子を送達する方法を提供する。方法には、細胞と、ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するｒＡＡＶとを接触させることが含まれ、ここで、前記ｒＡＡＶは導入遺伝子を含む。別の実施形態では、方法には、細胞と、ＡＡＶ８．ＴＲ１カプシドを有するｒＡＡＶとを接触させることが含まれ、ここで、前記ｒＡＡＶは導入遺伝子を含む。別の実施形態では、方法には、細胞と、本明細書に記載する任意のカプシドを有するｒＡＡＶとを接触させることが含まれ、ここで、前記ｒＡＡＶは導入遺伝子を含む。別の態様では、導入遺伝子を肝臓に送達するため、ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するｒＡＡＶの使用を提供する。別の態様では、導入遺伝子を肝臓に送達するため、ＡＡＶ８．ＴＲ１カプシドを有するｒＡＡＶの使用を提供する。

本明細書では、導入遺伝子を筋細胞に送達する方法も提供する。方法には、細胞と、ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するｒＡＡＶとを接触させることが含まれ、ここで、前記ｒＡＡＶは導入遺伝子を含む。別の実施形態では、方法には、細胞と、本明細書に記載する任意のカプシドを有するｒＡＡＶとを接触させることが含まれ、ここで、前記ｒＡＡＶは導入遺伝子を含む。別の態様では、導入遺伝子を筋肉に送達するため、ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するｒＡＡＶの使用を提供する。

さらに、導入遺伝子を気道上皮に送達する方法を提供する。方法には、細胞と、ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するｒＡＡＶとを接触させることが含まれ、ここで、前記ｒＡＡＶは導入遺伝子を含む。別の実施形態では、方法には、細胞と、ＡＡＶ８．Ｔ２０カプシドを有するｒＡＡＶとを接触させることが含まれ、ここで、前記ｒＡＡＶは導入遺伝子を含む。別の実施形態では、方法には、細胞と、本明細書に記載する任意のカプシドを有するｒＡＡＶとを接触させることが含まれ、ここで、前記ｒＡＡＶは導入遺伝子を含む。別の態様では、導入遺伝子を気道上皮に送達するため、ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するｒＡＡＶの使用を提供する。別の態様では、導入遺伝子を気道上皮に送達するため、ＡＡＶ８．Ｔ２０カプシドを有するｒＡＡＶの使用を提供する。

さらに、導入遺伝子を眼細胞に送達する方法を提供する。方法には、細胞と、ＡＡＶ３
Ｇ１カプシドを有するｒＡＡＶとを接触させることが含まれ、ここで、前記ｒＡＡＶは導入遺伝子を含む。別の実施形態では、方法には、細胞と、本明細書に記載する任意のカプシドを有するｒＡＡＶとを接触させることが含まれ、ここで、前記ｒＡＡＶは導入遺伝子を含む。別の態様では、導入遺伝子を眼細胞に送達するため、ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するｒＡＡＶの使用を提供する。

下記例に記載のように、インビトロでは、ＡＡＶ３Ｇ１変異体は、サル及びヒトのさまざまな抗血清、ならびにヒトＩＶＩＧに対する耐性（ヒトＩＶＩＧに関して、ＡＡＶ８の２～４倍レベル）を示した。観察された耐性には３つの変異全てが寄与している。マウスでは、ＡＡＶ３Ｇ１の肝臓への形質導入効率はＡＡＶ８と比較して低下したが、筋肉への形質導入率はＡＡＶ８よりも約１０倍高かった。さらに、ＡＡＶ３Ｇ１は、ＡＡＶ８よりも高いヘパリン親和性を示した。興味深いことに、ＨＶＲ．ＩＶ変異の正電荷を減少させると、ベクターのヘパリン親和性が低下したが、肝臓への形質導入は部分的に回復した。筋肉で観察された傾向も同様で、ＡＡＶ３Ｇ１の鼻腔内投与により、ＡＡＶ８より２～３倍高い形質導入効率がもたらされ、これは、ＡＡＶ３Ｇ１のＶＰ１ユニーク領域を別のＡＡＶ血清型のＶＰ１ユニーク領域と交換することにより、ＡＡＶ８より約１０倍高いレベルまでさらに改善された。これらの知見は、筋肉内、眼または鼻腔内への高効率の遺伝子送達及び既存の中和抗体に対する耐性が所望される疾患モデルに関係がある。

本明細書で示されるように、一実施形態では、本明細書に記載するカプシド（例えば、ＡＡＶ３Ｇ１カプシド、ＡＡＶＴ２０カプシドまたはＡＡＶＴＲ１カプシド）は、ＡＡＶ８に対する既存の中和抗体（ＮＡｂ）による中和を回避することができる。一実施形態では、記載のカプシドを有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ８を中和する抗体による中和に対し、天然型ＡＡＶ８と比べて少なくとも約２倍増の耐性を示す。一実施形態では、記載のカプシドを有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ８を中和する抗体による中和に対し、天然型ＡＡＶ８と比べて少なくとも約３倍増の耐性を示す。一実施形態では、記載のカプシドを有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ８を中和する抗体による中和に対し、天然型ＡＡＶ８と比べて少なくとも約４倍増の耐性を示す。一実施形態では、記載のカプシドを有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ８を中和する抗体による中和に対し、天然型ＡＡＶ８と比べて少なくとも約５倍増の耐性を示す。一実施形態では、記載のカプシドを有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ８を中和する抗体による中和に対し、天然型ＡＡＶ８と比べて少なくとも約１０倍増の耐性を示す。一実施形態では、記載のカプシドを有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ８を中和する抗体による中和に対し、天然型ＡＡＶ８と比べて少なくとも約１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、２００倍、２２０倍、２４０倍、２６０倍またはそれ以上高い耐性を示す。抗体による中和を評価する方法は、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＬｏｃｈｒｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，Ｊａｎ ２００６，８０（２）：８２１－３４を参照のこと。一実施形態では、ＡＡＶ８中和抗体はＡＤＫ８である。参照により本明細書に組み込まれるＧｕｒｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，２０１２ Ａｕｇ；８６（１５）：７７３９－５１．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００２１８－１２．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｍａｙ
１６を参照のこと。別の実施形態では、ＡＡＶ８中和抗体はＡＤＫ８／９である。

ＡＡＶ８抗体による中和のこうした低下により、対象に存在し得る既存のＡＡＶ８抗体から逃れるという利点が提供される。これは、対象の特定の病態の治療にＡＡＶ８ベクターを使用しており、追加免疫投与が必要とされる、またはＡＡＶベクターの使用が必要な第２の治療の場合に有用である。

抗体－カプシド構造情報に基づいて、ＡＡＶ８超可変領域（ＨＶＲ）ＶＩＩＩで飽和的変異誘発法を実施した。カプシド変異体はＡＡＶ８中和抗体を回避することができ、肝臓
形質導入を維持することが実証された。ＨＶＲ．Ｉ領域及びＨＶＲ．ＩＶ領域で飽和的変異誘発法を実施し、その際、上記のカプシド変異体の１つであるＡＡＶ８．Ｃ４１を骨格として用いて開始し、その後、マウスの肝臓でのインビボ増殖を３回実施して、ＡＡＶ３Ｇ１（ＡＡＶ８．ＴｒｉｐｌｅまたはＴｒｉｐｌｅとも呼ばれる）と呼ぶＡＡＶ８変異体を得た。ＡＡＶ３Ｇ１は、サル及びヒトのさまざまな抗血清、ならびにヒトＩＶＩＧに対する耐性（ヒトＩＶＩＧに関して、ＡＡＶ８の２～４倍レベル）を示した。全３変異が、観察された耐性に寄与した。意外なことに、ＡＡＶ８３Ｇ１は、ＡＡＶ８天然型と比較して肝臓形質導入率の低下を示した（約１／６×ＡＡＶ８）が、その筋肉への形質導入率は高まった（約１０×ＡＡＶ８）。ＡＡＶ３Ｇ１は、ＡＡＶ８よりも高いヘパリン親和性を示した。ＨＶＲ．ＩＶとＨＶＲ．Ｉの変異の正電荷を減少させると、ベクターのヘパリン親和性が低下し、肝臓形質導入の部分的な回復を伴った（得られる変異体をＡＡＶ８．ＴＲ１と呼ぶ）。ＡＡＶ３Ｇ１の鼻腔内投与により、ＡＡＶ８より２～３倍高い形質導入効率がもたらされた。新たな変異体ＡＡＶ８．Ｔ２０を創製した、高形質導入率メンバーの１つであるｒｈ．２０のＶＰ１／２－ユニーク領域でＡＡＶ３Ｇ１のそれを交換し、ＡＡＶ８．Ｔ２０を得た。すなわち、ＡＡＶｒｈ．２０のアミノ酸１～２０２（配列番号８８）でＡＡＶ３Ｇ１カプシドのアミノ酸１～２０３を交換した。鼻腔内投与によるマウスにおいて、ＡＡＶ８．Ｔ２０の形質導入率はＡＡＶ８より約１０倍高かった。

Ｅ．実施例
実施例１：試験計画
ＨＶＲ．ＶＩＩＩ領域に変異を有する幾つかのＡＡＶ８変異体、ｃ４１、ｃ４２、ｃ４６、ｇ１１０、ｇ１１３、ｇ１１５及びｇ１１７を作製した。上記で引用されているＧｕｒｄａ ｅｔ ａｌで考察されているように、主なＡＤＫ８エピトープはＨＶＲ．ＶＩＩＩ領域（ＡＡＶ８ ｖｐ１番号付けを使用したアミノ酸５８６～５９１）にある。それらの変異体をＡＤＫ８耐性についてインビトロで試験し、その一部をＡＤＫ８耐性についてインビボで試験した。例えば、上記引用Ｌｏｃｈｒｉｅ ２００６を参照のこと。

ＨＶＲ．Ｉ及びＨＶＲ．ＩＶ領域におけるさらなる変異誘発用の骨格として変異体ｃ４１を選んだ。変異体ｃ４１は、配列番号２で示される配列を有する（配列番号１で示されるＤＮＡ配列）。ｃ４１アミノ酸配列は、ＨＶＲ．ＶＩＩＩ領域に以下の変異、すなわち、５８３ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩＧＴ５９７（配列番号６９）－－＞ＧＤＮＬＱＬＹＮＴＡＰＧＳＶＦ（配列番号７０）を有するＡＡＶ８のアミノ酸配列である。

ＨＶＲ．ＩまたはＨＶＲ．ＩＶ変異誘発では、３回のインビボ選択を行った。その後、ＨＶＲ．Ｉ変異ＳＧＴＨ及びＨＶＲ．ＩＶ変異ＧＧＳＲＰをｃ４１骨格クローンに組み込みＡＡＶ３Ｇ１を作製した。インビトロでのＮａｂ試験から、ＡＡＶ３Ｇ１はある程度の
ｈＩＶＩＧ耐性を示したことが示され、３変異（ｃ４１、ＳＧＴＨ及びＧＧＳＲＰ）は全て耐性に寄与する。

ＡＡＶ３Ｇ１は、ＣＢ７．ＣＩ．ｆｆルシフェラーゼ、ＣＭＶ．ＬａｃＺ及びｔＭＣＫ．ヒトＦ９などのさまざまな導入遺伝子カセットのｉ．ｍ．及びｉ．ｖ．のいずれでも、ＡＡＶ８よりも筋肉への高い形質導入を示す。

ＡＡＶ３Ｇ１はまた、マウス気道上皮細胞においてＡＡＶ８より高い形質導入も示す。ＶＰ１／２領域をｒｈ．２０のそれと置き換えることにより、得られる変異体ＡＡＶ８．Ｔ２０はＡＡＶ８の約１０倍の形質導入率を示す。Ｂ６マウスへの鼻投与では、ＡＡＶ８を基準として正規化（１００％、ＣＢ７．ＣＩ．ルシフェラーゼ）すると、ＡＡＶ３Ｇ１は３７５％形質導入し、ＡＡＶ８．Ｔ２０は９８８％形質導入した。

ＡＡＶ３Ｇ１は、ＡＡＶ８よりも高いヘパリン親和性を有する。ＨＶＲ．Ｉ及びＨＶＲ．ＩＶに負に荷電した残基が導入されるよう新たな変異体を設計した（ＨＶＲＩ：ＳＧＴＨ→ＳＤＴＨ）。ＨＶＲ．ＩＶ：ＧＧＳＲＰを、選択工程の際に現われた別の変異ＤＧＳＧＬ（配列番号８２）で置き換える。得られる変異体ＡＡＶ８．ＴＲ１は、低いヘパリン親和性を示し、その肝臓形質導入は部分的に回復した。ＡＡＶ８（１００％、ＴＢＧ．ヒトＦ９）と比較すると、ＡＡＶ３Ｇ１は肝臓に１８％形質導入し、ＡＡＶ．ＴＲ１は５２％形質導入した。

実施例２：材料及び方法
Ａ．ライブラリー構築用プラスミド．
１．ｐＡＡＶ．ＤＥ．０
ＡＡＶの２つのＩＴＲの間に構成要素のＺｓＧｒｅｅｎ発現カセット、続くＣＭＶプロモーター、続くＡＡＶ２ゲノムの断片１８８３～２２０７（ＮＣ＿００１４０１）、続く制限部位ＡａｒＩとＳｐｅＩ（ＡＡＶ ＶＰ１ ＯＲＦ挿入用）を置いてプラスミドｐＡＡＶ．ＤＥ．０を構築した。ｐＡＡＶ．ＤＥ．０は配列番号３９及び図９で示されている。

２．ｐＡＡＶ．ＤＥ．１
プラスミドｐＡＡＶ．ＤＥ．１はｐＡＡＶ．ＤＥ．０に基づいたものであり、変更点は、１）ＮｈｅＩ断片を除去したこと、２）３’ ＩＴＲとＳｐｅＩ制限認識部位との間にウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル配列を挿入したことである。ｐＡＡＶ．ＤＥ．１は配列番号４０及び図１０で示されている。

３．ｐＡＡＶ．ＤＥ．１．ＨＶＲ．Ｉ
プラスミドは、ｐＡＡＶ．ＤＥ．１に基づいたものであり、それに、１）ＡＡＶ８．ｃ４１のＶＰ１ ＯＲＦを、ｐＡＡＶ．ＤＥ．１のＡａｒＩとＳｐｅＩの間に挿入し、２）２つのＢｓｍＢＩ制限認識部位をサイレント変異誘発により除去し、３）２つのＢｓｍＢＩ部位を両末端に担持しているＤＮＡ小断片をＡＡＶ８．ｃ４１ ＶＰ１ ＯＲＦのＨＶＲ．Ｉ領域に挿入して、ＨＶＲ．Ｉ変異誘発用のクローニング部位を創製した。ｐＡＡＶ．ＤＥ．１．ＨＶＲＩは配列番号４１及び図１１で示されている。

４．ｐＡＡＶ．ＤＥ．１．ＨＶＲ．ＩＶ
プラスミドはｐＡＡＶ．ＤＥ．１に基づいたものであり、それに、１）ＡＡＶ８．ｃ４１のＶＰ１ ＯＲＦを、ｐＡＡＶ．ＤＥ．１のＡａｒＩとＳｐｅＩの間に挿入し、２）２つのＢｓｍＢＩ制限認識部位をサイレント変異誘発により除去し、３）２つのＢｓｍＢＩ部位を両末端に担持しているＤＮＡ小断片を、ＡＡＶ８．ｃ４１ ＶＰ１ ＯＲＦのＨＶＲ．ＩＶ領域に挿入して、ＨＶＲ．ＩＶ変異誘発用のクローニング部位を創製した。ｐＡ
ＡＶ．ＤＥ．１．ＨＶＲＩＶは配列番号４２及び図１２で示されている。

５．ｐＲｅｐ
プラスミドはｐＡＡＶ２／８プラスミド（配列番号４３）に基づいた。プラスミドｐＡＡＶ２／８をＡｆｅＩで消化させ、その後、ＢｂｓＩで部分的に消化させ、末端ポリシングを行った後、セルフライゲーションさせる。

Ｂ．ＡＡＶ３Ｇ１、ＡＡＶ８．Ｔ２０及びＡＡＶ８．ＴＲ１のライブラリー構築、選択及び作製。
１．ＨＶＲ．ＶＩＩＩライブラリー
ＰＣＲを以下のように３つ設定した。ＰＣＲ１：プライマー０３１（配列番号４９）、プライマー０３２（配列番号５０）及びプライマー００９（配列番号４５）；ＰＣＲ２：プライマー０１６（配列番号４６）及びプライマー０３０（配列番号４８）、プラスミドｐＡＡＶ２／８を鋳型として使用；ＰＣＲ３：プライマー０３３（配列番号４９）及びプライマー０１７（配列番号４７）、プラスミドｐＡＡＶ２／８を鋳型として使用。各プライマーを下記表２に示す。３つのＰＣＲによる産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、併せてＢｓｍＢＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化させた後、再度精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて１６℃でライゲーションを行った。４２８ｂｐ断片をゲルで抽出し、ｐＡＡＶ２／８の６９０８ｂｐのＢｓｍＢＩ断片を用いてライゲーションを行った。ライゲーション産物は、プライマー．ＡＡＶ８ｓｔａｒｔ及びプライマーＡＡＶ８ ＥＮＤ ｎｄ５Ｒを有するＰＣＲ鋳型として使用した。ＰＣＲ産物を精製し、ＡａｒＩとＳｐｅＩを介してｐＡＡＶ．ＤＥ．０にクローニングし、Ｓｔｂｌ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換を一晩培養したものからプラスミドを抽出し、それをＡＡＶ８ ＨＶＲ．ＶＩＩＩ変異誘発のプラスミドライブラリーとした。

プラスミドライブラリーをヘルパープラスミド（ｐＡｄΔＦ６）及びｐＲｅｐと混合し、その後、リン酸カルシウム法により２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション３日後、細胞溶解物を採取し、ＤＰＢＳに再懸濁させ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）で処理した。その後、溶解物を遠沈し、残屑を除去した。上清をＡＡＶ変異誘発ライブラリーとし、以降で使用するため－２０℃で保存した。リアルタイムＰＣＲで滴定を行った。

１ｘ１０^９ゲノムコピー（ｇｃ）のＡＡＶ変異誘発ライブラリーを、０．５μＬのＡＤＫ８（ＡＡＶ８ Ｎａｂ力価－１：２５６０）と混合し、完全培地と合わせて加え１ｍＬとした。混合物を３７℃で３０分インキュベートし、その後、２９３細胞（ＭＯＩ、約１ｘ１０^４）に塗布した。２日後、細胞を継代比１：５で継代した。２日後、細胞をプラスミドｐＡｄΔＦ６及びｐＲｅｐでトランスフェクトした。２日後、ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡを細胞から抽出し、ＲＴ－ＰＣＲまたはＰＣＲ用の鋳型とした。ＰＣＲ用プライマーはプライマー０１６（配列番号４６）及びプライマー０１７（配列番号４７）であった。ＰＣＲ産物をＴｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。ＡＡＶ断片をＴｏｐｏプラスミドから切り出し、ｐＡＡＶ２／８のＢｓｍＢＩ部位にクローニングしｔｒａｎｓプラスミドを作製した。個々のｔｒａｎｓプラスミドを、ｃｉｓ－プラスミドとしてｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ｅＧＦＰを有する通常のＡＡＶベクターにパッケージングし、さらなる分析用とした。

２．インビトロＮａｂアッセイ
ｅＧＦＰカセットを担持するＡＡＶ変異体各々の１ｘ１０^９ｇｃを、異なるモノクローナル抗体（ＡＤＫ８、［Ｎａｂ］ＡＡＶ８＝１：２５６０、０．５μＬ／ウェル；ＡＤＫ８／９、［Ｎａｂ］ＡＡＶ８＝１：２５６０、０．５μＬ／ウェル；ＡＤＫ９、［Ｎａｂ］ＡＡＶ８＝５、０．５μＬ／ウェル；Ａｂなし：培地）と混合し、培地と合わせて１００μＬとし、３７℃で３０分インキュベートした後、２９３細胞に塗布した（感染前日に５ｘ１０^４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種）。ＧＦＰ発現を監視し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量した。図２ａ。

３．ＨＶＲ．Ｉ及びＨＶＲ．ＩＶライブラリー
インビボでの選択を３回実施した。各回ごとに、プールしたヒトＩＶＩＧ（ｈＩＶＩＧ）存在下でｉ．ｖ．によりＢ６マウスにＡＡＶライブラリーを注射した。

１回目、ＨＶＲ．Ｉ：
ＰＣＲにより２つの断片を作製し、鋳型としてのｐＡＡＶ２／８．ｃ４１、及びプライマー０９８（配列番号５５）＋プライマー１５６（配列番号５８）、プライマー１５５（配列番号５７）＋プライマーのそれぞれのプライマーセットを用いた。プライマー０９８（配列番号５５）＋プライマー．ＡＡＶ８ｅｎｄ（配列番号６８）を用いてＰＣＲで２つの断片を共に組み立てた。その後、得られる断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｅＩ部位を介してｐＡＡＶ．ＤＥ．１にクローニングし、ＡＡＶライブラリー作製用のプラスミドライブラリーとした。ライブラリー作製は、イオジキサノール勾配を用いて精製したことを除いてはＨＶＲ．ＶＩＩＩライブラリーの場合と類似しており、通常のＡＡＶベクターの場合と同様であった。

１回目、ＨＶＲ．ＩＶ：
工程は、プライマーセットがプライマー０９８（配列番号５５）＋プライマー１５８（配列番号６０）、プライマー１５７（配列番号５９）＋プライマー．ＡＡＶ８ｅｎｄ（配列番号６８）であったことを除いてはＨＶＲ．Ｉの場合と非常に類似していた。

その後、ヒトＩＶＩＧの存在下でｉ．ｖ．によりマウスにライブラリーを注射した。２週間後、肝臓を採取した。ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡを抽出した。ＡＡＶのＤＮＡ断片をＰＣＲにより回収し、新しいライブラリー作製用にプラスミドにクローニングした。

２回目及び３回目は、以下の点を除いては１回目と類似していた。

ＨＶＲ．Ｉでは、プライマー１７５（配列番号６３）及びプライマー２００（配列番号６４）を使用し、クローニングベクターはｐＡＡＶ．ＤＥ．１．ＨＶＲ．Ｉであり、ＨＶＲ．ＩＶでは、プライマー２０１（配列番号６５）及びプライマー２０２（配列番号６６）を使用し、クローニングベクターはｐＡＡＶ．ＤＥ．１．ＨＶＲ．ＩＶであった。

３回目終了後、ゲノムＤＮＡはマウス肝臓の抽出物であり、ＰＣＲで増幅し、ｔｒａｎｓプラスミド骨格にクローニングし、さらなる分析用とした。

４．ＡＡＶ３Ｇ１、ＡＡＶ８．Ｔ２０及びＡＡＶ８．ＴＲ１の作製
ｔｒａｎｓプラスミドｐＡＡＶ２／８．ＴｒｉｐｌｅはｐＡＡＶ２／８．ｃ４１（配列番号４４）に基づいたものであり、これは、ＨＶＲ．Ｉ領域がＳＧＴＨをコードするＤＮＡで置き換えられ、ＨＶＲ．ＩＶ領域がＧＧＳＲＰをコードするＤＮＡで置き換えられたものである。

ｔｒａｎｓプラスミドｐＡＡＶ２／８．Ｔ２０はｐＡＡＶ２／８．Ｔｒｉｐｌｅに基づいたものであり、これは、ＶＰ１２領域がＡＡＶｒｈ．２０の対応する領域で置き換えられたものである。

ｔｒａｎｓプラスミドｐＡＡＶ２／８．ＴＲはｐＡＡＶ２／８．Ｔｒｉｐｌｅに基づいたものであり、これは、ＨＶＲ．Ｉ領域がＳＤＴＨ（配列番号８０）をコードするＤＮＡで置き換えられ、ＨＶＲ．ＩＶ領域がＤＧＳＧＬ（配列番号８２）をコードするＤＮＡで置き換えられたものである。

５．ＡＡＶベクター作製
Ｌｏｃｋ，Ｍ，Ａｌｖｉｒａ，Ｍ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，ＬＨ，Ｓａｍａｎｔａ，Ａ，Ｔｏｅｌｅｎ，Ｊ，Ｄｅｂｙｓｅｒ，Ｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｒａｐｉｄ，Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ Ｓｃａｌｅ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１：１２５９－１２７１による記載の方法に従ってＡＡＶベクターを作製した。

６．イヌＦ９及びヒトＦ９のＥＬＩＳＡ
イヌＦ９を測定するＥＬＩＳＡは、Ｗａｎｇ，ＬＬ，Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ，Ｎｉｃｈｏｌｓ，ＴＣ，Ｂｅｌｌｉｎｇｅｒ，ＤＡ，Ｄｉｌｌｏｗ，Ａ，Ｖｅｒｍａ，ＩＭ，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｎａｉｖｅ ａｎｄ ＡＡＶ２－ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｄｏｇｓ：ＡＡＶ２／８－ｍｅｄｉａｔｅｄ，ｌｉｖｅｒ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ １０５：３０７９－３０８６により記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。簡単に言えば、ＡＡＶ８変異体にＴＢＧ．イヌＦ９－ＷＰＲＥカセットをパッケージングし、抗体ＡＤＫ８の存在下／非存在下、ｉ．ｖ．注射によりＢ６マウスで試験した。ベクター注射２時間前に１００ｕＬの希釈ＡＤＫ８をｉ．ｖ．注射した。ＡＡＶ８を対照として使用した。投与から１週間後に採取した血漿によりイヌＦ９レベルをＥＬＩＳＡで測定した。ＡＤＫ８未処置動物に対するＡＤＫ８処置動物のＦ９の割合及びｐ値（ｔ－検定）を図２ｂに示す。

ヒトＦ９を使用して同様の実験を行った。第３の導入遺伝子カセットｔＭＣＫ．ヒトＦ９を担持するＡＡＶベクターのＩ．ｍ．注射では、Ｂ６マウスにおいてＡＡＶ３Ｇ１が同様に筋選択性であることが示されている。ｔＭＣＫは筋特異的プロモーターである。用量は３ｘ１０^１０ｇｃ／マウス、ｎ＝マウス３匹／群であった。血漿及び筋肉をそれぞれ投
与から２８日後及び３０日後に採取した。血漿及び筋肉の溶解物からＥＬＩＳＡによってヒトＦ９を測定した。ＡＡＶ３Ｇ１を用いた形質導入後の筋肉でのＦ９発現レベルは、ＡＡＶ８を用いた形質導入後よりも１１．２倍高かった。図５ｃ。第２８日の血漿の中和抗体価の測定値から、ＡＡＶ８とＡＡＶ３Ｇ１の抗原性は異なることが示される。図５ｄ。

Ｃ．レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを用いたインビトロＮａｂアッセイ
ＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｇ１及びＡＡＶ３Ｇ１を含む３変異の組み合わせ全てを担持する変異体を、ヒト血漿（４試料）及び抗ＡＡＶ８サル血清（４試料）を用いてインビトロで試験した。９６ウェル透明底黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＨｕｈ７細胞を５ｘ１０^４細胞／ウェルで播種した。２日後、ＡＡＶ８及び変異型を、完全培地に希釈し、希釈した血清／血漿（抗ＡＡＶ８Ｎａｂ含有混合物の最終滴定、１：４）と共にインキュベートしてから、９６ウェルプレートに入れたＨｕｈ７細胞に塗布した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートしてから、Ｈｕｈ７プレートに移した。

７２時間後、ルシフェラーゼ発現を読み取り、各「ベクター単独」対照の発現レベルのパーセンテージに変換した。各血清／血漿について、その残存発現に従って各ベクターに順番を付けた（残存発現の最も高いものを順番１、最も低いものを８とした）。図４ｂ。これらのデータは、ＡＡＶ３Ｇ１の３変異全てがＮａｂ耐性に寄与することを示す。

１．インビボでのルシフェラーゼアッセイ
ＣＢ７．ＣＩ．ルシフェラーゼカセットを担持するＡＡＶ８またはＡＡＶ３Ｇ１を、用量３ｘ１０^１０ｇｃ／マウス、マウス４匹／群でＣ５７ＢＬ６マウスに筋肉内投与した。ルシフェラーゼ活性を投与から２週間及び４週間監視した。筋肉内注射により、ＡＡＶ３Ｇ１は、ＡＡＶ８と比べると、肝臓よりも筋肉に選択的である。図５ａ。

第２の実験を実施し、ここでは、異なる導入遺伝子を担持するＡＡＶ８ベクター及びＡＡＶ３Ｇ１ベクターを、用量１ｘ１０^９ｇｃ／動物（５ｘ１０^８ｇｃ／２５ｕＬ／脚、両脚）でＣ５７ＢＬ６マウスにｉ．ｍ．投与した。ベクター注射後の第３週の、筋肉切片、Ｘ－ｇａｌ染色、各群の最良切片を図５ｂに示す（４倍拡大）。これらの試験では、別の導入遺伝子カセットを担持するＡＡＶベクターのｉ．ｍ．注射では、Ｂ６マウスにおいてＡＡＶ３Ｇ１が同様に筋選択性を示すことが示されている。

ＭＰＳ ３Ａ Ｈｅｔマウス（Ｃ５７ＢＬ６バックグラウンド）に５ｘ１０^１１ｇｃのＡＡＶ．ＣＭＶ．Ｌａｃ／マウスをｉ．ｖ．で与えた。１４日後、組織を採取した。ＡＡＶ８ベクターまたはＡＡＶ３Ｇ１ベクターの投与を受けたマウスの心臓、筋肉及び肝臓から得たＸ－ｇａｌ染色した切片を作製した（データ図示せず）。これらの試験から、ｉ．ｖ．注射では、ＡＡＶ８と比べてＡＡＶ８Ｔｒｉｐｌｅで高い筋選択性を示すことがわかる。各動物の代表的筋肉切片の４倍像を図６ａに示す。

ＡＡＶ８及びＡＡＶ３Ｇ１をＣＢ７．ＣＩ．ｆｆルシフェラーゼ導入遺伝子カセットを用いて比較した。Ｂ６マウスに用量３ｘ１０^１１ｇｃ／マウスでｉ．ｖ．注射した。ベクター注射の２週間後、ルシフェラーゼを撮像した。図６ｂ。左はＡＡＶ８、右はＡＡＶ３Ｇ１である。

ＡＡＶ３Ｇ１は、マウス気道上皮細胞への形質導入率が高く、形質導入率はＶＰ１／２領域をｒｈ．２０で置き換えることによりさらに改善される。Ｂ６マウスに１ｘ１０^１１ｇｃ／マウスのＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ルシフェラーゼをｉ．ｎ．で与えた。マウス４匹に各ベクターを与えた。ルシフェラーゼ活性をベクター投与後２週目、３週目及び４週目に測定した。図７ａの右パネルは試験の代表画像（第４週）である。左のパネルはＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）３．２を用いて定量し、第２週のＡＡＶ８群の平均値で
正規化したものである。

ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．Ｔ２０、ＡＡＶ９及びＡＡＶ６．２の気道上皮細胞への形質導入の比較。Ｂ６マウスに１×１０^１１ｇｃ／マウスのＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ルシフェラーゼをマウス４匹／ベクターでｉ．ｎ．により与えた。ルシフェラーゼ活性をベクター投与後１週間、２週間及び３週間監視した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）３．２を使用して定量し、第１週のＡＡＶ８群の平均値で正規化した。図７ｂ。

マウスに麻酔をかけた。Ｄ－ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）をマウスの鼻孔内に１５ｕｇ／ｕＬ、１０ｕＬ／鼻孔、２０ｕＬ／マウスで注入した。５分後、発光画像をＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）で取得し、ソフトウェアＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）３．２を用いて定量した。

２．ヘパリン結合アッセイ
ＡＡＶベクターを所望の緩衝液に希釈し、ベクター－希釈液－緩衝液が予め調整されたＡＫＴＡ（商標）ＦＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）製ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷した。その後、ベクター希釈緩衝液及び塩化ナトリウムを増量した緩衝液を用いて順次カラムを洗浄した。全工程での画分を採取した。ドットブロット法の操作手順は、参照により本明細書に組み込まれるＴｅｎｎｅｙ，ＲＭ，Ｂｅｌｌ，ＣＬ，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，ＪＭ（２０１４）．ＡＡＶ８ ｃａｐｓｉｄ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｔ ｔｈｅ ｔｗｏ－ｆｏｌｄ ｓｙｍｍｅｔｒｙ ａｘｉｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｈｉｇｈ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｃａｐｓｉｄ ｕｎｃｏａｔｉｎｇ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５４：２２７－２３６により記載されている。図８ａ～８ｄを参照のこと。各ベクターの収量を以下に示す。

実施例３：詳細研究
ＡＡＶ変異体ライブラリーの調製。ライブラリーの調製ではｐＡＡＶｉｎｖｉｖｏと呼ばれるプラスミドを使用した。プラスミドは、２つのＡＡＶ ＩＴＲの間に、ＣＭＶプロモーター、部分的Ｒｅｐ配列（ＡＡＶ２、ＮＣ＿００１４０１，１８８１－２２０２）１８、ＡＡＶ８ ＶＰ１遺伝子及びウサギベータグロビン（ＲＢＧ）ポリアデニル化シグナルを含有する（図１４）。ＮＮＫ縮重コドンを所望の部位に担持するプライマーを用いて飽和的変異誘発法を行った。ＮＮＳ及びＮＮＫはいずれも全ての２０アミノ酸を包含する。ヒトのコドン使用の場合、ＮＮＳがＮＮＫよりわずかに高い（図１５Ａ）が、ＰＣＲ及び／またはウイルス複製ではＧＣが多すぎるのは良くない場合があり、平均ＧＣ％はＮＮＳが６７％、ＮＮＫが５０％である（図１５Ｂ）。以上を考慮し、ＮＮＫを選択した。ＡＡＶライブラリー作製用に、ｐＡｄΔＦ６（アデノウイルス構成成分を担持）及びｐＲｅｐ（ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子を担持）の２つのヘルパープラスミド、及びプラスミドライブラリーをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。下流のステップでは先に記載のあるＡＡＶベクター製造技術を利用した。プラスミドライブラリーのサイズは１×１０^６～３×１０^７であった。ＡＡＶライブラリーの収量は１．５２×１０^１１～２．５６×１０^１３ｇｃであった。

構造に基づく飽和的変異誘発法では、抗体によるベクターの中和が速やかに消失した。我々は、最初に、変異誘発用に残基５８３、５８８、５８９、５９４～５９７（配列番号３４、ＡＡＶ８ ＶＰ１番号付け）を選んだが、その理由は、Ｇｕｒｄａらによって明らかにされた構造に従うと、これらがモノクローナル中和抗体ＡＤＫ８とＡＡＶ８カプシドとの間の接触領域内にあるためである。ＡＤＫ８存在下、ＨＥＫ２９３細胞でインビトロ
選択を１回行った後、変異体を無作為に選び、Ｎａｂアッセイで試験した。変異配列は、表１に記載されている。図２Ａに示されるように、ＡＡＶ８と比べると、全ての変異体がＡＤＫ８に対し耐性を示した。これらの変異体はまた、ＡＤＫ８／９に対する耐性も示し、２抗体間でエピトープが重複していることを暗示している。Ｃ４２という１つの変異体は、ＡＡＶ８よりかなり高い２９３細胞形質導入を示したが、これは恐らく残基５８９がアルギニンに変更されたためと思われる。Ｈｕｈ７細胞でも同様の結果が示された（データ図示せず）。

Ｂ６マウスで肝臓への形質導入を評価した。マウスにＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰベクターを用量１×１０^１１ＧＣ／動物でｉ．ｖ．投与し、２週間後に肝臓を回収した。Ｇ１１２の用量は動物１匹あたり３．５×１０^１０であった。ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰレポーターを用いたＢ６マウスにおける肝臓への形質導入では、Ｃ４１、Ｇ１１０及びＧ１１２のＧＦＰ発現はＡＡＶ８よりも良好であり、Ｇ１１３及びＧ１１５はＡＡＶ８とほぼ等しかったが、Ｃ４２は、その２９３細胞への高い形質導入とは対照的に、マウス肝臓でのＧＦＰ発現は少なかったことが示された（データ図示せず）。

それらのＡＡＶ８変異体にＬＳＰ．イヌＦ９導入遺伝子カセットをパッケージングし、ＡＤＫ８をｉ．ｖ．注射してから２時間後にマウスに静脈内投与した場合、インビボ試験での耐性はそのままであった（図２Ｂ）。どの変異体も、幾つかのＡＡＶ８ Ｎａｂ－陽性ヒト血漿に対して明らかな耐性を示さなかったが（データ図示せず）、これは、チンパンジーにおけるＡＡＶ Ｎａｂの広域中和スペクトルにより示されるように、上記の変異体は単一エピトープが除去されたものであり、ＡＡＶ抗血清はポリクローナルである可能性が高いためと予測された。

ＡＡＶ３Ｇ１のさらなる変異誘発と作製。
Ｃ４１という１つの変異体は、ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ導入遺伝子カセットを用いてインビボで試験した場合、２つのＡＡＶ８ Ｎａｂ－陽性ヒト血漿に対してある程度の耐性を示した（データ図示せず）。この変異体を、さらなる変異誘発の骨格として使用した。次回の変異誘発用にＨＶＲ．Ｉ及びＨＶＲ．ＩＶ領域をそれぞれ選んだが、その理由は、タンパク質の突起部はより抗原性が高い可能性があるからである。ｐＡＡＶｉｎｖｉｖｏ．Ｃ４１骨格（ｐＡＡＶｉｎｖｉｖｏ．Ｃ４１は、ＡＡＶ８ ＶＰ１がＡＡＶ８．Ｃ４１ ＶＰ１と置き換えられているｐＡＡＶｉｎｖｉｖｏと同一である）の２６３位～２６７位及び４５５位～４５９位それぞれに（ＮＮＫ）を５つ搭載してライブラリーを作製し、その後、マウスでインビボ選択を３回実施した。各回ごとに、プールしたヒト静脈内免疫グロブリン（ｈＩＶＩＧ）注射の２時間後にマウスにＡＡＶライブラリーを静脈内注射した。ベクター注射の２週間後のマウスの肝臓からＰＣＲでＡＡＶ配列を取り出し、ｐＡＡＶｉｎｖｉｖｏ．Ｃ４１に搭載してライブラリーを作製し、増量ｈＩＶＩＧを用いた次回の選択用にした。３回の選択終了後、全てのＰＣＲ陽性動物のうちＩＶＩＧが最も高い群から回収された変異体はＳＧＴＨのみであった。その変異体は３ｂｐ欠失型の変異体であり、これがＶＰ１、２、３の各ＯＲＦ及び集合活性化タンパク質を破壊しないことは興味深い（ＤＮＡの変更：ＡＡＣＧＧＧＡＣＡＴＣＧＧＧＡ（配列番号８３）－－＞ＴＣＴＧＧＴＡＣＴＣＡＴ（配列番号８４）。ＨＶＲ．ＩＶのシグナルは依然として多様であったが、これは、コンホメーションが柔軟であることを暗示しており、プールしたｈＩＶＩＧの優性エピトープではない可能性がある。Ｃ４１（ＨＶＲ．ＶＩＩＩ変異）、ＳＧＴＨ（ＨＶＲ．Ｉ変異）及びＧＧＳＲＰ（ＨＶＲ．ＩＶ変異）の３つの変異をＡＡＶ８骨格内に共に合わせてＡＡＶ３Ｇ１を作製した。ＧＳＲＰを選んだ理由は、これが、全ての被験ＨＶＲ．ＩＶ変異体中、ｈＩＶＩＧに対する最も高い耐性をインビトロＮａｂアッセイで示したからである（データ図示せず）。

ＡＡＶ３Ｇ１はＮａｂ耐性を示し、３つの変異全てがその耐性に寄与した。ＡＡＶ３Ｇ
１は、ｈＩＶＩＧに対する耐性を示した（図４Ａ）。各変異の耐性への寄与を理解するため、我々は、一連のＡＡＶ８変異体の他、ＡＡＶ８及びＡＡＶ３Ｇ１を作製して全組み合わせを網羅し、それらを抗ＡＡＶ霊長類血清または血漿を用いて試験した。図４Ｂに示されるように、ＡＡＶ３Ｇ１を構成する３つの変異全てがＮａｂ耐性に寄与した。

ＡＡＶ３Ｇ１の肝臓への形質導入は低いが、その筋肉への形質導入は高い。我々は、レポーター遺伝子としてＴＢＧ．ヒトＦ９（ｈＦ９）を用いてＡＡＶ３Ｇ１の肝臓への形質導入をマウスで検討した。用量１×１０^１０ｇｃ／動物、ｉ．ｖ．では、ベクター投与後第１週、第２週及び第４週の血漿で発現したＦ９はＡＡＶ８の約１８％であった（図１３Ａ）。ＡＡＶ３Ｇ１注射マウスから得た、ＡＡＶ８に対する中和抗体価はＡＡＶ８注射動物の１２倍少なかった（図１３Ｂ）。Ｆ９発現データと一致して、ＡＡＶ３Ｇ１の肝臓中ベクターゲノムコピー数はＡＡＶ８の２０％であった。いずれの処置の場合も、ベクターゲノムＤＮＡの肝臓／脾臓比は同様であり、ＡＡＶ３Ｇ１が２８５、ＡＡＶ８が２３７であった（図８Ｅ）。次いで、我々は、ＡＡＶ３Ｇ１の筋肉への形質導入をマウスで検討した。３つのレポーター遺伝子カセット：ＣＢ７．ＣＩ．ルシフェラーゼ、ＣＭＶ．ＬａｃＺ及びｔＭＣＫ．ｈＦ９を使用した。図５ａのように、３ｅ１０ｇｃのＣＢ７．ルシフェラーゼの筋肉内注射では、先の試験と一致して、大量のＡＡＶ８ベクターが肝臓に行っており、対照的に、ＡＡＶ３Ｇ１では、ＡＡＶ８より筋肉形質導入がはるかに高く、肝臓に行ったベクターは少量であったことが明確に示された。静脈内注射は同様の結果を示した（図６ｃ）。同様に、ＣＭＶ．ＬａｃＺをｉ．ｍ．及びｉ．ｖの両方で（図５Ｂ、６Ａ）、またｔＭＣＫ．ｈＦ９をｉ．ｍ．で行った（図５Ｃ）。ｔＭＣＫ．ｈＦ９のｉ．ｍ．注射では、ＡＡＶ３Ｇ１注射マウスから得た筋溶解物中のＦ９レベルは、ＡＡＶ８よりも約１０倍高かったが、対照的に、２つのベクターの血漿中Ｆ９レベルは類似しており、筋肉はＦ９発現に理想的な組織ではないという先の報告と一致する。我々は、ｔＭＣＫ．ｈＦ９試験でＮａｂの測定も行った。先の論文に記載の試験と一致して、ＡＡＶ８注射マウスのＡＡＶ８ Ｎａｂは、ＡＡＶ３Ｇ１注射マウスのそれよりも高かった（約１２倍）が、ＡＡＶ８注射マウスのＡＡＶ３Ｇ１ ＮａｂはＡＡＶ３Ｇ１注射マウスのそれよりも低かった（約４倍）（図５Ｄ）。結果から、ＡＡＶ３Ｇ１は筋肉への形質導入がＡＡＶ８よりも優れていることが示され、このことは、２つのカプシドは血清学的に異なったものであることを示す。

ＡＡＶ３Ｇ１のヘパリン親和性は高く、その表面電荷を減少させる合理的設計により、そのヘパリン親和性は首尾よく低下し、及びそのマウス肝臓形質導入は部分的に回復する。ＡＡＶ８．Ｃ４１骨格で、ＡＡＶ３Ｇ１の肝臓への形質導入は、その３変異のうち２変異がマウス肝臓での３回のインビボ選択で確認されたにもかかわらず低くなっている。ヘパリン結合アッセイは、ＡＡＶ３Ｇ１の親和性の増加を示した（図８Ａ）。ヘパリンまたは負に荷電した他の一部の高分子への結合により、ベクターが、肝細胞へ達しないうちにトラップ／捕捉される可能性があるであろう。ヘパリン結合を排除するため、我々は、ＨＶＲ．Ｉ変異であるＳＧＴＨをＳＤＴＨに変更し、かつＨＶＲ．ＩＶ変異であるＧＧＳＲＰを、選択工程の際に現われた、負に荷電した別の変異のＤＧＳＧＬに置き換えることによってＡＡＶ３Ｇ１カプシドに負電荷を導入し、新たな変異体ＡＡＶ８．ＴＲ１を得た。修飾によりヘパリン結合は首尾よく抑制され（図８Ｂ）、肝臓への形質導入は部分的に回復した（図１３Ａ）。ＡＡＶ８ Ｎａｂ力価はＡＡＶ８処置マウスより１９倍少なかった（図１３Ｂ）。驚くべきことに、ＡＡＶ８．ＴＲ１処置を受けたマウスの脾臓のベクターＤＮＡはＡＡＶ８処置を受けたマウスよりも高かった（図８Ｅ）。経鼻ベクター投与を受けたマウスでは、ＡＡＶ３Ｇ１の形質導入はＡＡＶ８よりも高く、そのＶＰ１／２領域をｒｈ．２０で置き換えるという合理的設計により形質導入をさらに改善した。図７ａに示されるように、鼻腔内投与によるマウスでは、ＡＡＶ３Ｇ１の形質導入はＡＡＶ８よりも高かった。先の包括的研究では、各ＡＡＶ間のさまざまな気道形質導入を示した。参照により本明細書に組み込まれるＬｉｍｂｅｒｉｓ，ＭＰ ｅｔ ａｌ，（２００９）．Ｔｒ
ａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｉｌｉａｔｅｄ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：２９４－３０１の表１のデータ分析により、我々は、コドン２４は、ＡＡＶ系統群Ｅの低スコアメンバーと高スコアメンバーの間、特に、ｒｈ．３９とｈｕ．３７間で明確に異なっており（データ図示せず）、これら２つは、アミノ酸が１つしか違わない（Ａ２４Ｄ）が、そのスコアは極めて異なっている（４対１３）。我々は、ＡＡＶの気道への形質導入においてＶＰ１／２領域が何らかの役割を果たしている可能性があると理由付けた。

我々は、ＡＡＶ３Ｇ１のＶＰ１／２領域（１～２０２）をｒｈ．２０で置き換えることにより、ＡＡＶ８．Ｔ２０という別の変異体を創製した。事実、ＡＡＶ８．Ｔ２０の形質導入はＡＡＶ８よりも８～１２倍高く（図７Ｂ）、ＡＡＶ９レベルに近づいた（図７Ｂ）。

材料及び方法
動物試験。
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅに認定され、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅが保証する、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの施設で試験用の全マウスを飼育した。動物を用いたすべての手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓにより承認されたプロトコルに従った。全マウスともＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）より購入した。マウスは、特に具体的な記載がない限り、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（オス、６～８週齢）であった。プラスミドライブラリーの構築。

開始用プラスミドのｐＡＡＶｉｎｖｉｖｏを図１４に示す。Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ）及び縮重オリゴ
ＣＴＡＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＴＧＮＮＫＧＡＴＡＡＣＴＴＧＣＡＧＮＮＫＮＮＫＡＡＣＡＣＧＧＣＴＣＣＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＴＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧＧＣＣＴＴＡＣ（配列番号８５）を用いたＰＣＲによってＨＶＲ．ＶＩＩＩ変異誘発ライブラリーを構築し、その後、ｐＡＡＶｉｎｖｉｖｏへクローニングし、電気穿孔法でＳｔｂｌ４コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に形質転換した。ＨＶＲ．Ｉ及びＨＶＲ．ＩＶの初期ライブラリーを同一の方法で構築し、ＨＶＲ．Ｉでは縮重オリゴＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＡＡＴＣＴＣＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴ（配列番号８６）を、またＨＶＲ．ＩＶではＣＴＡＣＴＴＧＴＣＴＣＧＧＡＣＴＣＡＡＡＣＡＡＣＡＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＡ（配列番号８７）を用いた。

クローニングプラスミドは、ＡＡＶ８ ＶＰ１をＡＡＶ８．Ｃ４１ ＶＰ１で置き換えたｐＡＡＶｉｎｖｉｖｏ．Ｃ４１であった。第１回選択後、ＢｓｍＢＩ部位に隣接するプライマーを用いてＡＡＶ配列を取り出し、サイレント突然変異で２つの内在性ＢｓｍＢＩ部位を除去することによってｐＡＡＶｉｎｖｉｖｏ．Ｃ４１で構築した新たな２つのクローニングプラスミド内にクローニングし、その後、２つのＢｓｍＢＩ部位をそれぞれＨＶＲ．Ｉ及びＨＶＲ．ＩＶに隣接させて導入した。ここで使用したコンピテントセルはＭｅｇａＸ ＤＨ１０Ｂ（商標）Ｔ１Ｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ（商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に代えた。通常のＡＡＶベクター作製と同様の方法でウイルスライブラリーを作製した。

ＡＡＶライブラリー作製。
ＨＶＲ．ＶＩＩＩでは、プラスミドライブラリーをｐｄｅｌｔａＦ６及びｐＲｅｐと混合し、リン酸カルシウム法でＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション３日後、細胞溶解物を採取し、ＤＰＢＳに再懸濁させてＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）で処理した。その後、溶解物を遠沈して残屑を除去した。上清がＡＡＶ変異誘発ライブラリーであり、以降で使用するため－２０℃で保存した。ＨＶＲ．Ｉ及びＨＶＲ．ＩＶでは、通常のＡＡＶベクターと同様の方法でライブラリーを作製した（下記を参照のこと）。リアルタイムＰＣＲで滴定を行った。

選択。
ＨＶＲ．ＶＩＩＩにインビトロ選択を１回行った。具体的には、１ｅ９ゲノムコピー（ｇｃ）のＡＡＶ変異誘発ライブラリーを０．５μＬのＡＤＫ８（ＡＡＶ８ Ｎａｂ力価－１：２５６０）と混合し、完全培地と共に加えて１ｍＬとした。混合物を３７℃で３０分インキュベートし、その後、２９３細胞（ＭＯＩ、約１ｅ４）に塗布した。２日後、細胞を継代し、次いで２日後、プラスミドｐＡｄΔＦ６及びｐＲｅｐを用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクション２日後、ＰＣＲにより細胞からＡＡＶ断片を回収し、シークエンシング用にＴｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、その後、ｔｒａｎｓプラスミドにクローニングしてＡＡＶ．ＣＭＶ．ｅＧＦＰベクターを作製し、さらなる分析用とした。

Ｂ６マウスでＨＶＲ．Ｉ及びＨＶＲ．ＩＶの３回のインビボ選択を行い、その際、ＨＶＲ．Ｉについては２．５３ｅ１０ｇｃ／マウスの用量を、ＨＶＲ．ＩＶについては４ｅ１０ｇｃ／マウスの用量をマウス３匹／群でｉ．ｖ．注射した。ライブラリー注射の２時間前、ＤＰＢＳで希釈したｈＩＶＩＧの１００ｕＬを静脈内注射した。１回目では、各ＨＶＲにマウス１群ずつ、ｈＩＶＩＧ力価１：４０を用い、２回目では、各ＨＶＲに２群ずつで、ｈＩＶＩＧ力価１：４０を群１に、１：８０を群２に用い、３回目では、各ＨＶＲに３群ずつで、ｈＩＶＩＧ力価１：８０を群１に、１：１６０を群２に、１：３２０を群３に用いた。ベクター注射の２週間後、ＰＣＲにより肝臓からＡＡＶ配列を取り出し、上記にある次回のライブラリー構築用とした。
ＡＡＶベクター作製
Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，２０１０による記載のようにＡＡＶベクターを作製した。

イヌＦ９及びヒトＦ９のＥＬＩＳＡ。イヌＦ９を測定するＥＬＩＳＡは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５により記載されている。ヒトＦ９のＥＬＩＳＡの操作手順は、やはりＷａｎｇらにより開発された、イヌＦ９のＥＬＩＳＡを改変したバージョンであった。

ｅＧＦＰをレポーター遺伝子に用いたインビトロＮａｂアッセイ。
ｅＧＦＰカセットを担持するＡＡＶ変異体各々の１ｅ９ｇｃを、異なるモノクローナル抗体（ＡＤＫ８、ＡＡＶ８ Ｎａｂ力価１：２５６０、０．５μＬ／ウェル；ＡＤＫ８／９、ＡＡＶ８ Ｎａｂ力価１：２５６０、０．５μＬ／ウェル；ＡＤＫ９、ＡＡＶ８ Ｎａｂ力価１：５、０．５μＬ／ウェル）と混合し、培地と合わせて１００μＬとし、３７℃で３０分インキュベートした後、２９３細胞に塗布した（感染前日に９６ウェルプレートに５ｅ４細胞／ウェルで播種）。ＧＦＰ発現を監視し、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として用いたＩｍａｇｅ Ｊ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｎａｂアッセイで定量した。９６ウェル透明底黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＨｕｈ７細胞を５ｅ４細胞／ウェルで播種した。２日後、ＡＡＶベクターを完全培地に希釈し、その後、血清／血漿試料をさまざまな希釈で混合した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートしてからＨｕｈ７プレートに移した。ベクター感染３日後、Ｃｌａｒｉｔｙ（商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）で発光を読み取った。

インビボでのルシフェラーゼアッセイ
鼻腔内投与による試験用にマウスに麻酔をかけた。Ｄ－ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を、１５ｕｇ／ｕＬ、１０ｕＬ／鼻孔、２０ｕＬ／マウスでマウスの鼻孔内に注入した。５分後、発光画像をＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）で取得し、ソフトウェアＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）３．２を用いて定量した。他の試験では、Ｄ－ルシフェリンを１０ｕＬ／マウス体重（グラム）でｉ．ｐ．投与したこと、及びルシフェリン注射の２０分後に発光を測定したことを除き、マウスを同様に処置した。

ヘパリン結合アッセイ
ＡＡＶベクターを所望の緩衝液（ＤＰＢＳまたはＴｒｉｓ緩衝液）に希釈し、ＡＫＴＡ（商標）ＦＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）によってＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷した。その後、ベクター希釈緩衝液及び希釈緩衝液と増量塩化ナトリウムを合わせたものを用いてカラムを順次洗浄した。全工程での画分を採取した。ドットブロット法の操作手順はＴｅｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ，２０１４により記載されている。

本試験の別の態様は、ＡＡＶ３Ｇ１のＶＰ１／２領域（１～２０２）をｈ．２０で置き換えることである。我々は、Ｌｉｍｂｅｒｉｓらの研究（参照により本明細書に組み込まれるＬｉｍｂｅｒｉｓ，ＭＰ ｅｔ ａｌ，（２００９）．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｉｌｉａｔｅｄ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：２９４－３０１）によるデータと、我々のシークエンス解析とを合わせることにより、ＡＡＶ系統群Ｅ内の肺形質導入の高いメンバーと肺形質導入の低いメンバーとの間でコドン２４に相違があることを見出した。最も高い系統群Ｅの３メンバーであるｒｈ．６４Ｒ１、ｒｈ．１０及びｒｈ．２０の１～２０２領域のアミノ酸は同一であるので、この領域をＡＡＶ３Ｇ１内に置き換えたところ、ＡＡＶ３Ｇ１の鼻への形質導入のさらなる改善がもたらされた。

実施例４：筋肉でのＡＡＶ８とＡＡＶ３Ｇ１の比較
Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにより製造及び用量設定されたＡＡＶ３Ｇ１．ｔＭＣＫ．ＰＩ．ｆｆｌｕｃ．ｂＧＨ、ｄｄ－ＰＣＲ（ＰＫ）を、オスＢ６マウスに、マウス３匹／群、３ｅ９ｇｃ／マウスまたは３ｅ１０ｇｃ／マウス、１脚／マウスでｉ．ｍ．注射した。第１週の結果を図１５に示す。各図とも、左はＡＡＶ８処置、右はＡＡＶ３Ｇ１処置したものである。

ベクターを筋肉内に注射したにもかかわらず、先の試験と一致して、かなりの割合のＡＡＶ８ベクターが肝臓に行っており、導入遺伝子は、筋特異的プロモーターｔＭＣＫで制御された場合でも肝臓に発現した。ＡＡＶ３Ｇ１の筋肉形質導入はＡＡＶ８よりかなり良好である。

実施例５
未処置のＮＨＰから得た血清を使用してＡＡＶ８、ＡＶ８３Ｇ１及びＡＡＶ９について中和抗体価を測定した。結果から、ＡＡＶ８及びＡＡＶ３Ｇ１は、血清学的に別個のものであることが確認される。

（配列表フリーテキスト）
以下の情報を、識別子＜２２３＞下にフリーテキストを含む配列用に提供する。

本明細書で引用した刊行物はいずれも、２０１６年４月１５日に提出された米国仮特許出願第６２／３２３，３８９号同様、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。同様に、本明細書で参照される配列番号、及び添付の配列表に出現する配列番号は、参照により組み込まれる。本発明は特定の実施形態を参照にして記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正が可能であることは認識されよう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。

Claims (35)

1. 配列番号１８（ＡＡＶ３Ｇ１）、配列番号２０（ＡＡＶ８．Ｔ２０）；または配列番号２２（ＡＡＶ８．ＴＲ１）の配列を有するカプシドを含む、アデノ随伴ウイルス。
2. 請求項１に記載のカプシドをコードする、核酸。
3. 前記カプシドは、配列番号１７、配列番号１９もしくは配列番号２１、またはそれと少なくとも８０％の同一性を共有する配列によってコードされる、請求項１に記載のＡＡＶ。
4. 天然型ＡＡＶ８（配列番号３４）と比較した場合に、
   ｉ．アミノ酸２６３～２６７、
   ｉｉ．アミノ酸４５７～アミノ酸４５９、
   ｉｉｉ．アミノ酸４５５～アミノ酸４５９、または
   ｉｖ．アミノ酸５８３～アミノ酸５９７
   の少なくとも１つの領域に変異を有する少なくとも１つのｖｐ３カプシドを含む、アデノ随伴ウイルス。
5. 前記標的組織は、筋肉、肝臓、肺、気道上皮、ニューロン、眼、または心臓である、請求項４に記載のＡＡＶ。
6. 前記変異は、
   ｉ．２６３ＮＧＴＳＧ２６７（配列番号７８）－－＞ＳＧＴＨ（配列番号７９）、またはｉｉ．２６３ＮＧＴＳＧ２６７（配列番号７８）－－＞ＳＤＴＨ（配列番号８０）
   を含む、請求項４に記載のＡＡＶ。
7. 前記変異は、
   ｉ．４５７ＴＡＮ４５９－－＞ＳＲＰ、または
   ｉｉ．４５５ＧＧＴＡＮ４５９（配列番号８１）－－＞ＤＧＳＧＬ
   を含む、請求項４～６のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
8. 前記変異は、５８３ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩＧＴ５９７（配列番号６９）－－＞ＧＤＮＬＱＬＹＮＴＡＰＧＳＶＦ（配列番号７０）を含む、請求項４～７のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
9. 前記ｖｐ３タンパク質は、２６３ＮＧＴＳＧ２６７（配列番号７８）－－＞ＳＧＴＨ（配列番号７９）、４５７ＴＡＮ４５９－－＞ＳＲＰ、及び５８３ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩＧＴ５９７（配列番号６９）－－＞ＧＤＮＬＱＬＹＮＴＡＰＧＳＶＦ（配列番号７０）の変異を含む、請求項４に記載のＡＡＶ。
10. 前記ｖｐ３タンパク質は、２６３ＮＧＴＳＧ２６７（配列番号７８）－－＞ＳＤＴＨ（配列番号８０）、４５５ＧＧＴＡＮ４５９（配列番号８１）－－＞ＤＧＳＧＬ（配列番号８２）、及び５８３ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩＧＴ５９７（配列番号６９）－－＞ＧＤＮＬＱＬＹＮＴＡＰＧＳＶＦ（配列番号７０）の変異を含む、請求項４に記載のＡＡＶ。
11. 前記ｖｐ３領域の残りの部分はＡＡＶ８（配列番号３４）と同一である、請求項４～１０のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
12. 前記ｖｐ１ユニーク領域及び／またはｖｐ２ユニーク領域は、前記ｖｐ３ユニーク領域
    を供給するＡＡＶとは異なるＡＡＶに由来する、請求項４～１１のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
13. 前記ｖｐ１配列及びｖｐ２配列を供給するＡＡＶはｒｈ．２０である、請求項１２に記載のＡＡＶ。
14. ＡＡＶ末端逆位反復配列、及び制御配列に機能的に連結されている異種核酸配列をさらに含み、ここで前記制御配列は標的細胞において前記異種核酸配列によりコードされる産物の発現を導く、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
15. 前記ＩＴＲは、ＡＡＶ８とは異なるＡＡＶに由来する、請求項１４に記載のＡＡＶ。
16. 前記ＩＴＲはＡＡＶ２由来である、請求項１５に記載のＡＡＶ。
17. 前記ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するＡＡＶを投与することを含む、肝組織への形質導入方法。
18. 前記ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するＡＡＶを投与することを含む、筋組織への形質導入方法。
19. 前記ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するＡＡＶを投与することを含む、気道上皮への形質導入方法。
20. 前記ＡＡＶ８．ＴＲ１カプシドを有するＡＡＶを投与することを含む、肝組織への形質導入方法。
21. 前記ＡＡＶ８．Ｔ２０カプシドを有するＡＡＶを投与することを含む、気道上皮への形質導入方法。
22. 前記ＡＡＶ３Ｇ１カプシドを有するＡＡＶを投与することを含む、眼細胞への形質導入方法。
23. （ａ）天然型ＡＡＶ８と比べた場合に、カプシドが、以下の領域
    ｉ．アミノ酸２６３～２６７、
    ｉｉ．アミノ酸４５７～アミノ酸４５９、
    ｉｉｉ．アミノ酸４５５～アミノ酸４５９、または
    ｉｖ．アミノ酸５８３～アミノ酸５９７
    のうち少なくとも１つの領域において変異を有するＡＡＶカプシドタンパク質をコードする分子と、
    （ｂ）機能性ｒｅｐ遺伝子と、
    （ｃ）ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及び導入遺伝子を含むミニ遺伝子と、
    （ｄ）前記ＡＡＶカプシドタンパク質内への前記ミニ遺伝子のパッケージングを可能にする十分なヘルパー機能
    とを含有する宿主細胞を培養するステップを含む、ＡＡＶカプシドを含む組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の作製方法。
24. 請求項１～１６のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスでトランスフェクトされた、宿主細胞。
25. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＡＡＶ、ならびに生理学的に
    適合性のある担体、緩衝剤、アジュバント、及び／または希釈剤を含む、組成物。
26. 細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、前記細胞と、請求項１～１６のいずれか１項に記載のＡＡＶとを接触させるステップを含み、ここで、前記ｒＡＡＶは前記導入遺伝子を含む、前記方法。
27. 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び３４から選択されるアミノ酸配列を有するＡＡＶカプシドを含み、非ＡＡＶ核酸配列をさらに含む、組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
28. ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子であって、前記核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１及び３３から選択される、前記核酸分子。
29. 前記分子は、ＡＡＶカプシドタンパク質及び機能性ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ配列を含む、請求項２８に記載の分子。
30. 前記分子はプラスミドである、請求項２８に記載の分子。
31. 請求項２７に記載のアデノ随伴ウイルスでトランスフェクトされた、宿主細胞。
32. 請求項２８または２９に記載の分子でトランスフェクトされた、宿主細胞。
33. 天然型ＡＡＶ８と比較した場合に、以下の領域
    ｉ．アミノ酸２６３～２６７、
    ｉｉ．アミノ酸４５７～アミノ酸４５９、
    ｉｉｉ．アミノ酸４５５～アミノ酸４５９、または
    ｉｖ．アミノ酸５８３～アミノ酸５９７
    のうち少なくとも１つの領域において変異を有する、アデノ随伴ウイルスカプシドタンパク質。
34. 請求項３３に記載のカプシドタンパク質をコードする核酸配列。
35. 前記配列は、配列番号１７、１９もしくは２１、またはそれと少なくとも８０％の同一性を共有する配列から選択される、請求項３４に記載の核酸配列。

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