JP2022095001A - マイクロプレート - Google Patents

Abstract

【課題】ウェル内で細胞が会合しやすく、細胞塊が形成されやすいマイクロプレートを提供することを目的とする。【解決手段】複数のウェル１４を有するマイクロプレート１において、ウェル１４の底面１６を下方に凹む凹面とし、底面１６に細胞接着抑制剤からなる低接着コート膜を形成し、ウェル１４の平面視で、ウェル１４の底面１６の半径をＲ（ｍｍ）としたとき、ウェル１４の底面１６の中心を中心とする半径ｒ（ただし、ｒ＝０．４×Ｒ）の円形領域内の低接着コート膜の表面の表面粗さＲａを０．１μｍ以下とする。【選択図】図２

Description

本発明は、マイクロプレートに関する。

生命現象を解明する基礎研究、創薬研究等においては、培養細胞が広く利用されている。特に３次元培養で得られる細胞が凝集した３次元細胞塊（スフェロイド）は、生体内と同様に立体的な構造を有しているため、２次元培養で得た細胞に比べて試験精度が向上することが期待されている。３次元培養に用いる培養容器としては、複数のウェルが縦横にマトリックス状に配列されたマイクロプレートが知られている（特許文献１）。

各ウェルに細胞を懸濁した培養液を分注して培養すると、各ウェルの中で細胞が会合して細胞塊が形成される。ウェルの底面が下方に凹んだ凹面であると、各ウェル内の細胞が会合しやすい。また、ウェルの底面に細胞が接着することを抑制する目的で、ウェルの底面に細胞接着抑制剤を塗布して低接着コート膜を形成することが行われている。また、ウェル凹面の開き角度や曲率半径などのウェル形状は、スフェロイドの形成性に影響を与える（例えば特許文献１）。

特開２０１９－２２５２７号公報

しかし、ウェルの凹部がスフェロイド形成に適している形状であっても、ウェル表面の表面粗さが粗いと、細胞がウェルの途中に引っかかり不完全なスフェロイドを形成したり、会合速度が遅くなるため、細胞塊の形成性が低下する。

本発明は、ウェル内で細胞が会合しやすく、細胞塊が形成されやすいマイクロプレートを提供することを目的とする。

本発明は、以下の態様を有する。
［１］複数のウェルを有するマイクロプレートであって、
前記ウェルの底面は下方に凹む凹面であり、
前記底面に細胞接着抑制剤からなる低接着コート膜が形成され、
前記ウェルの平面視で、前記ウェルの底面の半径をＲ（ｍｍ）としたとき、前記ウェルの底面の中心を中心とする半径ｒ（ただし、ｒ＝０．４×Ｒ）の円形領域内の前記低接着コート膜の表面の表面粗さＲａが０．１μｍ以下である、マイクロプレート。
［２］前記円形領域内において、前記ウェルの最底部の前記表面粗さＲａが最大である、［１］に記載のマイクロプレート。
［３］前記円形領域内の前記表面粗さＲａが前記最底部に向かうにつれて大きくなっている、［２］に記載のマイクロプレート。
［４］前記ウェルの底面が下方に半球状に凹んだ凹面であり、
前記ウェルの底面の最底部を通るように前記ウェルを高さ方向に切断した断面における、前記底面の円弧の曲率半径が０．５ｍｍ以上５ｍｍ以下である、［１］～［３］のいずれかに記載のマイクロプレート。
［５］前記ウェルの底面が下方に円錐状に凹んだ凹面であり、
前記ウェルの底面の最底部を通るように前記ウェルを高さ方向に切断した断面における、前記ウェルの高さ方向に対する前記底面の傾斜角度が２０°以上７０°以下である、［１］～［３］のいずれかに記載のマイクロプレート。
［６］前記細胞接着抑制剤が、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、又は含フッ素重合体である、［１］～［５］のいずれかに記載のマイクロプレート。

本発明によれば、ウェル内で細胞が速やかに凹面である底面の最底部に移動することで、素早く会合し、細胞塊が形成されやすいマイクロプレートを提供できる。

実施形態のマイクロプレートの断面図である。 図１のマイクロプレートのウェルを拡大して示した断面図である。 他の実施形態のマイクロプレートの断面図である。 図２のマイクロプレートのウェルを拡大して示した断面図である。 例１の培養開始から２時間、６時間、４８時間後のウェル底面の観察結果を示した図である。

本明細書における用語の意味及び定義は以下である。
「～」で表される数値範囲は、～の前後の数値を下限値及び上限値とする数値範囲を意味する。
「ウェルの底面の中心」とは、ウェルの底面の平面視形状が正円でない場合、ウェルの底面の平面視形状に対する内接円の中心とする。

［マイクロプレート］
以下、本発明のマイクロプレートの実施形態の一例を示し、図面に基づいて説明する。なお、以下の説明において例示される図の寸法等は一例であって、本発明はそれらに必ずしも限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することが可能である。

図１及び図２に示すように、本実施形態のマイクロプレート１は、上面部１０と、上面部１０の外縁部から垂直に垂下された周壁部１２と、上面部１０の上面１０ａに円形の開口が形成される有底筒状の複数のウェル１４と、を備えている。

マイクロプレート１では、各ウェル１４の底面１６が培養面となる。この例のウェル１４は、底面１６が下方に半球状に凹んだ凹面になっている。これにより、ウェル１４内で細胞が最底部１８に向かって移動しやすくなるため、細胞同士が会合して細胞塊が形成されやすくなる。なお、ウェル１４の底面１６は、半球状の凹面には限定されず、例えば、下方に円錐状に凹む凹面等であってもよい。

ウェル１４の平面視の開口形状は、円形には限定されず、例えば、矩形であってもよい。ウェル１４の数は、特に限定されず、例えば、４～１５３６個を例示できる。例えば、平面視で縦横に８×１２個の矩形のマトリックス状に配列された９６個のウェル１４としてもよく、１６×２４の３８４個のウェル１４としてもよく、３２×４８の１５３６個のウェル１４としてもよい。

ウェル１４の底面１６には、細胞接着抑制剤からなる、細胞の接着を抑制する低接着コート膜が形成されている。低接着コート膜が形成されることで、細胞がウェル表面に接着することが抑制され、ウェルの最底部で会合しスフェロイドを形成できる。低接着コート膜は、例えば、細胞接着抑制剤を塗布することによって形成できる。細胞接着抑制剤としては、リン脂質ポリマー（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等）、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、フッ素含有化合物、ポリエチレングリコールを例示できる。なかでも、細胞との親和性が高いことから、細胞接着抑制剤は、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン又は含フッ素重合体が好ましい。細胞接着抑制剤としては、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

ウェル１４の平面視で、ウェル１４の底面１６の半径をＲ（ｍｍ）とし、ｒ＝０．４×Ｒとする。このとき、マイクロプレート１では、平面視で、ウェル１４の底面１６の中心を中心とする半径ｒの円形領域（以下、「円形領域Ａ」とも記す。）内の低接着コート膜の表面の表面粗さＲａが０．１μｍ以下になっている。なお、円形領域Ａ内の低接着コート膜の表面の表面粗さＲａが０．１μｍ以下であるとは、円形領域Ａ内のどの位置でも表面粗さＲａが０．１μｍ以下であることを意味する。

底面１６の円形領域Ａ内の表面粗さＲａが０．１μｍ以下であれば、ウェル１４内で細胞が最底部１８に向かって移動しやすくなるため、細胞同士が会合して細胞塊が形成されやすくなる。底面１６の円形領域Ａ内の表面粗さＲａは、０．０７μｍ以下が好ましく、０．０５μｍ以下がより好ましい。円形領域Ａ内の表面粗さＲａは、小さいほど良く、実質的な下限値は０．０２μｍ程度である。
なお、前記表面粗さＲａは、算術平均粗さのことであり、粗さ曲線をｙ＝ｆ（ｘ）で表したときに、下式１によって求められる値（ただし、単位はマイクロメートル（μｍ）であり、Ｌは測定長さである。）である。表面粗さＲａは、ＪＩＳ Ｂ０６０１：２００１（ＩＳＯ４２８７：１９９７）に記載された方法によって測定される。

底面１６の円形領域Ａ内では、表面粗さＲａは０．１μｍ以下であれば、均一になっていてもよく、不均一になっていてもよい。円形領域Ａ内では、ウェル１４の底面１６の最底部１８の表面粗さＲａが最大になっていることが好ましい。また、円形領域Ａ内では、表面粗さＲａがウェル１４の底面１６の最底部１８に向かうにつれて大きくなっていることがより好ましい。これにより、ウェル１４内の最底部１８では相対的に細胞が動きにくく、ウェル１４内で細胞が最底部１８に集まりやすくなるため、細胞塊がさらに形成されやすくなる。

ウェル１４の底面１６の半径Ｒは、０．２ｍｍ以上２０ｍｍ以下が好ましく、０．５ｍｍ以上１０ｍｍ以下がより好ましく、１ｍｍ以上５ｍｍ以下がさらに好ましい。底面１６の半径Ｒが前記範囲の下限値以上であれば、細胞を播種する際の操作性やスフェロイドの観察性に優れている。底面１６の半径Ｒが前記範囲の上限値以下であれば、１つのマイクロプレートで数多くのスフェロイドを形成できる。
なお、ウェル１４の底面１６の平面視形状が正円でない場合、半径Ｒは、底面１６の平面視形状に対する内接円の半径である。

ウェル１４の底面１６の最底部１８を通るようにウェル１４を高さ方向に切断した断面における、底面１６の円弧の曲率半径は、０．５ｍｍ以上５ｍｍ以下が好ましく、１ｍｍ以上４ｍｍ以下がより好ましく、１．５ｍｍ以上３．５ｍｍ以下がさらに好ましい。前記曲率半径が前記範囲の上限値以下であれば、ウェル１４内で細胞が最底部１８に向かって移動しやすくなるため、細胞同士が会合して細胞塊が形成されやすくなる。前記曲率半径が前記範囲の下限値以上であれば、スフェロイドを効率的に形成できるうえ、観察性に優れている。

マイクロプレート１の材質としては、樹脂又はガラスが好ましい。
樹脂としては、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコーン樹脂を例示できる。樹脂としては、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ塩化ビニル、高密度ポリエチレン、ポリエーテルサルファン、ＰＥＴ共重合体、パーマノックス（サーモフィッシャーサイエンティフィック商標）、シクロオレフィンポリマー樹脂、サイトップ（ＡＧＣ商標）、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂及びシリコーン樹脂から選ばれる１種が好ましく、透明性が高く、薬剤吸着性が低いという点から、ポリスチレン樹脂が特に好ましい。マイクロプレート１を構成する樹脂は、１種でもよく、２種以上でもよい。

ガラスとしては、特に限定されず、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、リン酸ガラス、アルミノシリケートガラスを例示できる。ガラスは、割れ防止のために化学強化されていてもよい。マイクロプレート１を構成するガラスは、１種でもよく、２種以上でもよい。

マイクロプレート１の周壁部１２は、透明でも不透明でもよく、観察性の観点から不透明が好ましい。周壁部１２を不透明とする場合、色調としては黒がより好ましい。周壁部１２を不透明にする方法としては、特に限定されず、例えば、微粒子を添加する方法、顔料を添加する方法等を使用できる。

マイクロプレート１の製造方法は、特に限定されず、例えば、射出成形法、圧縮成形法によって成形できる。なかでも、マイクロプレート１を製造しやすい点から、射出成形法が好ましい。ウェル１４の底面１６の円形領域Ａ内における低接着コート膜の表面の表面粗さＲａは、成形材料の選定、研磨等の金型仕上げ工程、及び成形方法によって、さらに、低接着コート方法によって調節できる。

以上説明したように、マイクロプレート１では、ウェル１４の底面１６が凹面であり、かつ底面１６の円形領域Ａ内における低接着コート膜の表面の表面粗さＲａが０．１μｍ以下に制御されている。そのため、ウェル１４の底面１６に低接着コート膜を形成していても、細胞培養時にウェル１４内で細胞が最底部１８に向かって移動しやすく、細胞同士が会合して細胞塊が形成されやすい。

なお、本発明のマイクロプレートは、前記した態様には限定されない。
例えば、本発明のマイクロプレートは、図３及び図４に例示したマイクロプレート２であってもよい。マイクロプレート２は、ウェル１４が底面１６の代わりに底面１６Ａを有する以外はマイクロプレート１と同様の態様である。図３及び図４における図１及び図２と同じ部分は同符号を付して説明を省略する。

マイクロプレート２のウェル１４の底面１６Ａは、下方に円錐状に凹む凹面である。マイクロプレート２においても、底面１６Ａの円形領域Ａ内における低接着コート膜の表面の表面粗さＲａが０．１μｍ以下に制御されることで、低接着コート膜を形成していても細胞が最底部１８に向かって移動しやすく、細胞同士が会合して細胞塊が形成されやすい。

ウェル１４の底面１６Ａの最底部１８を通るようにウェル１４を高さ方向に切断した断面における、ウェル１４の高さ方向に対する底面１６Ａの傾斜角度θ（図４）は、２０°以上７０°以下が好ましく、２５°以上６０°以下がより好ましく、３５°以上５５°以下がさらに好ましい。前記傾斜角度θが前記範囲の上限値以下であれば、ウェル１４内で細胞が最底部１８に向かって移動しやすくなるため、細胞同士が会合して細胞塊が形成されやすくなる。前記傾斜角度θが前記範囲の下限値以上であれば、顕微鏡でのスフェロイド観察がしやすい。

その他、本発明の趣旨に逸脱しない範囲で、前記実施形態における構成要素を周知の構成要素に置き換えることは適宜可能であり、また、前記した変形例を適宜組み合わせてもよい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。例１は実施例であり、例２は比較例である。

［表面粗さＲａ］
表面粗さＲａは、ＪＩＳ Ｂ０６０１：２００１（ＩＳＯ４２８７：１９９７）に記載された方法によって測定される算術平均粗さである。

［例１］
各ウェルの底面が下方に半球状に凹んだ凹面であり、各ウェルの半径Ｒが３．２ｍｍである、図１及び図２に例示したような態様の９６ウェル（８×１２）のマイクロプレートを作製した。各ウェルの底面には、細胞接着抑制剤として含フッ素重合体を塗布し、低接着コート膜を形成した。ｒ＝０．４×Ｒとする。平面視で、ウェル１４の底面１６の中心を中心とする半径ｒの円形領域Ａ内の低接着コート膜の表面の表面粗さＲａは、最底部に向かうにつれて大きくなっており、最底部の表面粗さＲａは０．０４１μｍであった。Ｒａは、白色干渉式三次元形状測定機（Ｚｙｇｏ社製、Ｎｅｗｖｉｅｗ６２００）で測定した。

［例２］
円形領域Ａ内の低接着コート膜の表面の表面粗さＲａが最底部に向かうにつれて大きくなっており、最底部の表面粗さＲａが０．２１８μｍである以外は例１と同様のマイクロプレートを作製した。

［培養試験］
各例で得たマイクロプレートを用い、各ウェルにＨｅｐＧ２細胞を１ウェルあたりの細胞数が２５００個となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２、水蒸気飽和条件のインキュベーターで培養した。顕微鏡（ＺＥＩＳＳ社製、Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ７）を用い、培養開始から２時間、６時間、４８時間後のウェルの底面を顕微鏡で観察した。例１の観察結果を図５に示す。

図５に示すように、ウェルの底面における円形領域Ａ内の表面粗さＲａが０．１μｍ以下である例１では、ウェル内で細胞が最底部に向かって移動しやすく、細胞同士が会合して細胞塊が形成された。一方、ウェルの底面における円形領域Ａ内の表面粗さＲａが０．１μｍ超である例２では、細胞塊の形成が不充分であった。

１，２…マイクロプレート、１０…上面部、１２…周壁部、１４…ウェル、１６，１６Ａ…底面、１８…最底部。

Claims (6)

1. 複数のウェルを有するマイクロプレートであって、
   前記ウェルの底面は下方に凹む凹面であり、
   前記底面に細胞接着抑制剤からなる低接着コート膜が形成され、
   前記ウェルの平面視で、前記ウェルの底面の半径をＲ（ｍｍ）としたとき、前記ウェルの底面の中心を中心とする半径ｒ（ただし、ｒ＝０．４×Ｒ）の円形領域内の前記低接着コート膜の表面の表面粗さＲａが０．１μｍ以下である、マイクロプレート。
2. 前記円形領域内において、前記ウェルの最底部の前記表面粗さＲａが最大である、請求項１に記載のマイクロプレート。
3. 前記円形領域内の前記表面粗さＲａが前記最底部に向かうにつれて大きくなっている、請求項２に記載のマイクロプレート。
4. 前記ウェルの底面が下方に半球状に凹んだ凹面であり、
   前記ウェルの底面の最底部を通るように前記ウェルを高さ方向に切断した断面における、前記底面の円弧の曲率半径が０．５ｍｍ以上５ｍｍ以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載のマイクロプレート。
5. 前記ウェルの底面が下方に円錐状に凹んだ凹面であり、
   前記ウェルの底面の最底部を通るように前記ウェルを高さ方向に切断した断面における、前記ウェルの高さ方向に対する前記底面の傾斜角度が２０°以上７０°以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載のマイクロプレート。
6. 前記細胞接着抑制剤が、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、又は含フッ素重合体である、請求項１～５のいずれか一項に記載のマイクロプレート。

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