JP2022079533A - リソソーム蓄積障害の試験に関連する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年9月2日に出願された米国特許出願第14/474,524号に従属しかつ優先権を主張するものであり、この出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
多くにおいて患者は、出生時は健康であるが、後に進行性の神経学的増悪が発症する。臨床表現型は、生化学的欠損の種類および重症度によって決まる。ポンペ病およびクラッベ病などのこれらの一部のリソソーム障害は、主に乳児期に発症する。臨床症状が発症する前に治療的介入を開始することができるように、このような障害を検出する方法の開発が継続的に取り組まれている。
使用すると、合成基質に対する標的酵素活性が改善される。
と関連して記述される。これらの定義および専門用語は、アッセイもしくはアッセイシステムの範囲または実施の限定として機能するよう意図するものではなく、実例的かつ記述的な目的のみを示すものである。本方法または本組成物は、個々のステップの順番または特定の材料の使用を記述するが、当業者によって容易に理解されるよう、説明がさまざまに配置された複数の部分またはステップを含むことができるように、ステップまたは材料は交換可能としてよいことを理解されたい。
ることが可能な条件下で行う、ステップと、酵素反応生成物を検出するステップとを含む。本発明者らは、オレイン酸とは異なるオレイン酸の塩の使用により、酵素活性の改善、少量の酵素の検出、および優れた再現性が得られることを驚くべきことに発見した。オレイン酸が9.85のpKaを有するということは特に驚くべきことである(Kanicky JRおよびShah DO、J Colloid Interface Sci.2002 Dec 1;256(1):201~7ページ)。したがって、1つの方法では、アッセイを準備するかまたは実施する任意の時点において、オレイン酸を任意で添加しない。
2/0190043号、国際公開第2007/106816号、Gelbら、J Inherit.Metab.Dis.、(2006)29:397~404ページ、Liら、Clinical Chemistry、50;10:1785~1796ページ(2004)にとりわけ記載される。
ため、単一の反応混合物中に複数の相違する粒子を存在させることができ、複数の異なる試料または異なる酵素を同時にアッセイすることが可能になる。粒子上のコードは、例えば、試料の起源、アッセイされる特定の酵素、存在する特定の基質、および類似のものに、使用者の実験目標に応じて対応させることができる。
ルを使用してよい。単一の乾燥血液試料または他の種類の試料を抽出し、その後の多重アッセイ反応に分配するユニバーサルアッセイ溶液(universal assay solution)の使用は、自動ハイスループットスクリーニング(automatic and high throughput screening)に使用することができる。乾燥試料の単一の抽出により、同じ試料からいくつかの試料パンチを得る必要性、または他の試料供給源のアリコートを収集する必要性が回避され、それにより、ろ紙上での血液の不均質な分布および試料の移動における誤差によって生じる変動が減少する。乾燥試料を使用する場合、抽出効率は分析する酵素の違いで変動する可能性がある。これらの種類の試料および他の種類の試料において、異なるアッセイ溶液中に含まれる場合、標的酵素は異なるレベルの活性を有する可能性がある。ユニバーサルアッセイ溶液の組成は、試験される各酵素が作用するように任意に選ばれる。
基質へ作用し、生成物を生成する。粒子へ結合したままの生成物もあれば、溶液中に放出される他の生成物(切断された部分)もあり、またはその逆もあるであろう。次いで、特異的な生成物を識別する抗体を、アッセイ溶液と接触させる。粒子のコード化が、どの基質が粒子に付着しているのかを示すため、抗体は特定の生成物に対して特異的である必要はなく、このため1つの種類の抗体を使用して、複数の異なる基質から得られる生成物を検出することができる。そのような非特異的抗体は、生成物が酵素反応アッセイ中に生成された場合は、そこに結合し、結合した抗体を有する粒子を生成する。次いで、結合した抗体を有する粒子は、例えば、抗体上のタグまたは粒子の物理的性質を検出することによって、抗体を含まない粒子と区別する。抗体が結合した粒子上に含まれる異なる生成物は、各粒子のコード化に基づいて測定することができる。
される蛍光分子を生成することによって、検出する。適切なペルオキシダーゼの例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたは当技術分野で既知の他のペルオキシダーゼである。グルコースオキシダーゼによって放出された過酸化水素は、検出基質分子と相互作用する。ペルオキシダーゼは、この基質の蛍光生成物への変換を触媒する。この基質との使用に適した検出分子としてはAmplex Redがあり、これが酸化されると蛍光生成物であるレゾルフィンが生成される。Amplex Redおよび遊離グルコースを検出するためのキットは、Invitrogen Corp.から入手可能である。赤色蛍光生成物の増加は、励起波長571nm、発光波長585nmに設定し、バンドパスを5nmに設定した、蛍光光度計で検出する。グリコシダーゼ活性の量が多いほど、より迅速に赤色蛍光生成物が生成される。
、蛍光検出器ファミリーによって行うことができる。他の検出方法は同様に適切であり、当技術分野において既知である。
るISの濃度であって、VISは使用されるISの容積であって、tはインキュベート時間であって、かつVDBSはアッセイに使用されるDBSから得られた血液の容積である。3mmのDBSパンチの場合、VDBS=3μLである。
5%の標的酵素活性が得られるようにさらに希釈した。オレイン酸ナトリウムを添加すると、低濃度対照DBSと中濃度対照DBSの間のセラミドの差が約25%まで広げられる。この改善により、6-プレックスアッセイにおいて、LSD陽性(低活性)試料が健常新生児から区別される。
〔態様1〕
in vitroで酵素活性を検出する方法であって、
標的酵素を含む試料を基質および1つまたは複数のオレイン酸塩と接触させるステップであって、標的酵素が基質に作用して酵素反応生成物を生成することが可能な条件下で行う、ステップと、
前記酵素反応生成物を検出するステップ
とを含む、方法。
〔態様2〕
前記オレイン酸塩が一価塩を含む、態様1に記載の方法。
〔態様3〕
前記一価塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、またはリチウム塩である、態様2に記載の方法。
〔態様4〕
前記オレイン酸塩が二価塩を含む、態様1に記載の方法。
〔態様5〕
前記二価塩が、マグネシウム塩、カルシウム塩、または亜鉛塩である、態様4に記載の方法。
〔態様6〕
前記オレイン酸塩が、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸マグネシウム、オレイン酸カルシウム、およびオレイン酸リチウムからなる群より選択される、態様1から5のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様7〕
前記標的酵素が、酸α-ガラクトシダーゼA、酸β-グルコセレブロシダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸α-グルコシダーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、α-L-イズロニダーゼ、またはそれらの組み合わせである、態様1から5のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様8〕
前記検出するステップが、マススペクトロメトリーによるものである、態様1から5のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様9〕
前記試料を内部標準と接触させるステップをさらに含む、態様1から5のいずれか一項に記載の方法。
〔態様10〕
前記内部標準が 2 Hを含む、態様9に記載の方法。
〔態様11〕
リソソーム蓄積障害を患う対象を診断するステップをさらに含む、態様1から5のいずれか一項に記載の方法。
〔態様12〕
in vitroで酵素活性を検出する方法であって、
基質およびオレイン酸塩の組み合わせを含む基質成分を調製するステップと、
前記基質成分を乾燥させるステップと、
標的酵素を含む試料を水性緩衝液中の前記基質成分と接触させるステップであって、標的酵素が基質に作用して酵素反応生成物を生成することが可能な条件下で行う、ステップと、
前記酵素反応生成物を検出するステップ
とを含む、方法。
〔態様13〕
前記オレイン酸塩が、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸マグネシウム、オレイン酸カルシウム、およびオレイン酸リチウムからなる群より選択される、態様12に記載の方法。
〔態様14〕
前記標的酵素が、酸α-ガラクトシダーゼA、酸β-グルコセレブロシダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸α-グルコシダーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、α-L-イズロニダーゼ、またはそれらの組み合わせである、態様12に記載の方法。
〔態様15〕
前記水性緩衝液がコハク酸を含む、態様12から14のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様16〕
前記水性緩衝液が4.3~5.0のpHを有する、態様12から14のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様17〕
前記接触させるステップが、内部標準を前記基質および前記オレイン酸塩に添加した後、乾燥させるステップをさらに含む、態様12から14のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様18〕
前記接触させるステップの前に前記基質成分と前記水性緩衝液とを組み合わせるステップをさらに含む、態様12から14のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様19〕
前記検出するステップが、マススペクトロメトリーによるものである、態様12から14のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様20〕
対象を診断するステップをさらに含み、前記試料がリソソーム蓄積障害を有する対象または有しない対象から得られる、態様1から5または態様12から14のいずれか一項に記載の方法。
Claims (20)
- in vitroで酵素活性を検出する方法であって、
標的酵素を含む試料を基質および1つまたは複数のオレイン酸塩と接触させるステップであって、標的酵素が基質に作用して酵素反応生成物を生成することが可能な条件下で行う、ステップと、
前記酵素反応生成物を検出するステップ
とを含む、方法。 - 前記オレイン酸塩が一価塩を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一価塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、またはリチウム塩である、請求項2に記載の方法。
- 前記オレイン酸塩が二価塩を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記二価塩が、マグネシウム塩、カルシウム塩、または亜鉛塩である、請求項4に記載の方法。
- 前記オレイン酸塩が、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸マグネシウム、オレイン酸カルシウム、およびオレイン酸リチウムからなる群より選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的酵素が、酸α-ガラクトシダーゼA、酸β-グルコセレブロシダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸α-グルコシダーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、α-L-イズロニダーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出するステップが、マススペクトロメトリーによるものである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料を内部標準と接触させるステップをさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記内部標準が2Hを含む、請求項9に記載の方法。
- リソソーム蓄積障害を患う対象を診断するステップをさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- in vitroで酵素活性を検出する方法であって、
基質およびオレイン酸塩の組み合わせを含む基質成分を調製するステップと、
前記基質成分を乾燥させるステップと、
標的酵素を含む試料を水性緩衝液中の前記基質成分と接触させるステップであって、標的酵素が基質に作用して酵素反応生成物を生成することが可能な条件下で行う、ステップと、
前記酵素反応生成物を検出するステップ
とを含む、方法。 - 前記オレイン酸塩が、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸マグネシウム、オレイン酸カルシウム、およびオレイン酸リチウムからなる群より選択される、
請求項12に記載の方法。 - 前記標的酵素が、酸α-ガラクトシダーゼA、酸β-グルコセレブロシダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸α-グルコシダーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、α-L-イズロニダーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項12に記載の方法。
- 前記水性緩衝液がコハク酸を含む、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記水性緩衝液が4.3~5.0のpHを有する、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触させるステップが、内部標準を前記基質および前記オレイン酸塩に添加した後、乾燥させるステップをさらに含む、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触させるステップの前に前記基質成分と前記水性緩衝液とを組み合わせるステップをさらに含む、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出するステップが、マススペクトロメトリーによるものである、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
- 対象を診断するステップをさらに含み、前記試料がリソソーム蓄積障害を有する対象または有しない対象から得られる、請求項1から5または請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
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