KR20030021167A - 폼페병 및 다른 당원축적병들에 대한 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 테트라당을 생마커로 사용하여 피험체로부터 리소솜 축적병들, 바람직하게는, 당원축적병들을 스크리닝하는 방법들을 제공한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 피험체들은 폼페병 (즉, 당원축적병 Ⅱ형)에 대하여 스크린된다. 또한, 본 발명은 신생아 스크리닝 분석법들을 제공한다. 더 나아가, 본 발명은 질병을 앓고 있는 피험체들에서 임상적 조건 및 치료적 처리의 효율성을 모니터링하는 방법들을 제공한다. 또한, 본 발명은, 바람직하게는 폼페병에 대한 신생아 스크리닝 분석법의 일부로서, 탠덤 질량 스펙트로메트리에 의하여 테트라당 생마커를 측정하는 방법들을 제공한다.

Description

폼페병 및 다른 당원축적병들에 대한 진단 방법 {Diagnostic methods for pompe disease and other glycogen storage diseases}

관련 출원 정보

본 출원은 2000년 6월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 60/209,920호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 가출원은 그 전체로서 인용되어 여기에 통합되어 있다.

당원축적병 Ⅱ형 (Glycogen Storage Disease type Ⅱ, GSD-Ⅱ) 또는 산 말타아제 결핍증으로도 알려진 폼페병은, 글리코겐 분해 효소인, 리소솜 산 α-글루코시다아제 (GAA)의 활성 결함으로부터 야기되는, 글리코겐 대사의 유전적 질병이다 (Hirschorn, R. (1995) in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7th Edition, Volume 2 (Scriver, C.R., Beaudet, A.L., Sly, W.S., andValle, D. Eds), pp. 2443-2464, McGraw-Hill, New York). 가장 심각한 형태에서, 본 질병은 초기 영아기에 심비대 (massive cardiomegaly), 대설증 (macroglossia), 진행성 근육 약화증 (progressive muscle weakness) 및 현저한 저혈압증 (hypotonia)을 특징으로 한다. 대부분의 영아 환자들은 생후 3 내지 6 개월 사이에 진단되며, 1살 이전에 사망한다.

최근에, 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary, CHO) 세포주 (Van Hove JLK, 등. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci.,USA.93:65-70), 및 형질전환 생쥐 및 토끼 젖 (Bijvoet AGA, 등. (1998)Hum Mol Genet. 7:1815-24; Bijvoet AGA,등.(1999)Hum Mol Genet. 8:2145-53)으로부터 재조합 인간 전구체인 rhGAA가 제조되었다. rhGAA는 동물 모델 및 환자 세포들에서 결함을 시정하는 것으로 나타났고 (Kikuchi T, 등. (1998) J Clin Invest 101, 827-833; Bijvoet AGA,등.(1999)Hum Mol Genet. 8:2145-53), 유전자 치료 벡터는 생쥐 모델에서 결함을 가진 모든 근육들을 바로 잡는 데에 적용되었다 (Amalfitano, A.등.(1999)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96,8861-8866). 인간 폼페병 환자들에 대한 예비적 연구는 rhGAA가 이러한 환자들에서 심장 및 골격 근육 기능을 향상시킬 수 있는 것으로 나타났다 (Amalfitano, A.등.(2001)Genet. Med. 3:132). 이러한 유망한 새로운 치료법은 초기 진단 및 치료 모니터링 모두에 대해 적절한, 생마커 어세이에 대한 필요성을 야기시키게 되었다.

현재, 폼페병의 진단에 사용될 수 있는 것으로서, 용이하게 이용 될 수 있는 (그리고, 비-침습성인 (non-invasive)) 생마커는 알려진 바가 없다. 폼페병에 대한스크리닝 분석의 개발은, 특히 영아의 질병 형태에서 도움이 된다. 폼페병을 앓고 있는 신생아들 또는 영아들의 조기 진단 및 치료는 이러한 환자들의 예후 (prognosis)를 향상시킬 수 있다. 더욱이, 모니터링 요법은 폼페병 환자들에 대한 치료 및 예후의 효율성을 향상시킬 수 있다.

크로마토그래피 방법들을 사용하여, Hallgren 등 ((1974)Eur. J. Clin. Invest. 4,429-433)은 폼페병을 앓고 있는 10세 환자의 뇨에서 농도가 상승된, Glcα1-6Glcα1-4Glcα1-4Glc(Glc₄)로 추정되는 구조를 갖는 글루코오즈 테트라머를 확인하고 특성화하였다.

또한, 뇨당인 (Glc)₄는, 당원축적병 Ⅲ형 및 Ⅵ형 (Lennarston, G., 등. (1976)Biomed. Mass Spectrum. 3,51-54; Oberholzer, K. 및 Sewell, A. C. (1990)Clin. Chem. 36,1381), 뒤시엔느 근육 이영양증 (Duchenne muscular dystrophy) (Lennarston, G.,등.(1976)Biomed. Mass Spectrum. 3, 51-54; Kikuchi T,등.(1998)J Clin Invest 101,827-833), 급성 췌장염 (Kumlien 등., (1988)Clin. Chim. Acta 176:39; Kumlien 등., (1989)Int. J. Pancreatol. 4:139; Wang, W.T.,등.(1989)Anal. Biochem. 182,48-53), 특정 악성 종양에서 (Kumlien 등., (1988)Clin. Chim. Acta 176:39), 및 임신 중에 (Zopf, D.A.,등.(1982)J. Immunol. Methods 48,109-119; Hallgren, P.,등.(1977) J.Biol. Chem. 252,1034-1040) 상승하는 것으로 나타났다.

Lennarston 등은 (1978)Eur. J. Biochem. 83:325에서, GSD Ⅱ형 또는 Ⅲ형을 앓고 있는 두 명의 어린이에게서 분비되는 뇨 올리고당들을 기체 크로마토그래피 (GC)/질량 스펙트로스코피 (MS)에 의하여 특성화하였다. 이러한 두가지 조건 하에 분비되는 주된 올리고당은 (Glc)₄이었다. 더 큰 올리고당들도 또한 존재하였다. 유사하게, Chester 등은 (1983)Lancet 1:994에서, GSD Ⅱ형 및 Ⅲ형을 앓고 있는 환자들에서 뇨 (Glc)₄분비가 4 내지 60배 상승함을 보고하였다. 상기 연구자들은 또한, 임상적으로 정상인 이형접합체들 (heterozygotes)에서는 뇨 (Glc)₄가 완만하게 상승하였음을 보고하였다. 올리고당의 확인 및 정량은 방사면역분석법 (radioimmunoassay) 및 기체 크로마토그래피/질량 스펙트로메트리에 의하여 수행되었다. 이는 또한, Peelen 등, (1994)Clin. Chem. 40:914, 및 Klein 등, (1998)Clin Chemistry 44:2422를 참조할 수 있다.

Oberholzer 등은 (1990)Clin. Chem. 36:1381에서, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 GSD를 앓고 있는 환자들에서의 뇨 (Glc)₄분비를 분석하였다. 이 연구에 의해, 뇨 내의 (Glc)₄분비가, GSD를 앓고 있는 환자들에서 단순히 근육 증상들에만 관련되는 것이 아니라, 간 증상들에도 관련되는 것이 발견되었다.

상기 서술한 어떠한 연구에서도 GSD 환자들에서 (Glc)₄의 혈장 농도를 평가하지 못하였다. 더욱이, 이러한 연구들은 (Glc)₄의 농도가 건강한 피험체와 비교할 때, 신생아 시기 동안에 상승하는 것인지에 대해 설명하지 않고 있다. 더 나아가, 상기 참조 문헌들은 (Glc)₄가 폼페병을 진단하거나, 질병의 심각성을 평가하거나,또는 폼페병의 임상적 상태를 모니터링 하는 데에, 예를 들어 치료적 요법의 효율성을 분석하는 데에 이용될 수 있다는 점을 제안하지 않고 있다.

(Glc)₄를 분석하기 위하여 다양한 방법들이 개발되었으며, 이는 분별화된 뇨 올리고당들의 과메틸화 (permethylation)에 이은 기체-질량 스펙트로메트리 분석 (Lennartson, G.,등.(1976)Biomed. Mass Spectrom. 3, 51-54.), 방사면역분석법 (Zopf, D.A.,등.(1982)J. Immunol. Methods 48,109-119), 효소-연결 면역흡착 분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay) (Kumlien, J.등.(1986)Glycoconjugate J. 3,85-94), (Glc)₄에 대한 단일 클론 항체를 이용한 HPLC (Wang, W.T.,등.(1989)Anal. Biochem. 182,48-53) 및 과벤조일화 올리고당들의 분석을 포함하는 HPLC 방법들 (Oberholzer, K. 및 Sewell, A.C. (1990)Clin. Chem. 36,1381), 또는 펄스화된 전류측정 검출 (pulsed amperometric detection) 또는 포스트 컬럼 유도체화 (post column derivatization)에 의한 음이온-교환법을 이용하는 것 (Peelen, G.O.H.,등.(1994)Clin. Chem. 40,914-921)을 포함한다. 본 발명의 발명자들이 인식하는 한, 탠덤 질량 스펙트로메트리를 사용한 (Glc)₄의 검출과 정량은 이전에 보고된 바가 없다. 더욱이, 폼페병 환자들에서의 (Glc)₄의 혈장 농도는 이전에 보고된 바가 없다. 더 나아가, 신생아 시기 동안 폼페병에 대한 생마커로서 (Glc)₄를 사용한 프로토콜은 이전에 제안된 바가 없다.

Meikle 등은 (1997)Clin. Chem. 43:1325 및 WO 97/44668에서, 리소조말 막 단백질인 LAMP-1을 리소솜 축적병들에 대한 일반적 진단 마커로서 이용하는 것을서술하고 있다. LAMP-1 농도들은 혈장 시료들 내에서 시간-분해 형광 면역분석법 (time-resolved fluorescence immunoassay)을 사용하여, 25 가지 리소솜 축적병들 중의 하나를 앓고 있는 피험체들뿐만 아니라 건강한 피험체들에서 측정되었다. LAMP-1은 평가된 25 가지 질병들 중 17 가지를 앓고 있는 피험체들의 혈장 시료들에서 상승하였다. 그러나, 폼페병을 앓고 있는 스크린된 4 명의 피험체들에서 4 명의 피험체 모두가 심각한 임상 증후군들을 보였음에도 불구하고, 이들 중 오직 한 명만이 혈장 LAMP-1 농도의 상승을 보여 주었다. LAMP-1 및 리소솜 효소 활성들은 폼페병을 앓고 있는 환자로부터 확립된 섬유아세포 (fibroblast) 세포주에서 또한 특성이 분석되었다.

Hua 등은 (1998) Clin. Chemistry 44:2094에서, 리소솜 축적병들을 스크리닝하기 위한 생마커로서 제2 리소솜 막 단백질인, LAMP-2를 사용하였다. LAMP-2는 형광-면역정량법 (fluorescence-immunoquantification)을 사용하여 건강한 피험체 및 질병을 앓고 있는 피험체로부터의 혈장에서 측정되었다. 평가된 25 가지 리소솜 축적병들 중 14 가지 질병들을 앓고 있는 피험체들에서 혈장 내 LAMP-2의 농도가 상승하는 것으로 나타났다. 그러나, 폼페병을 앓고 있는 4 명의 피험체들 중 어느 피험체도 LAMP-2의 상승을 나타내지 않았다. LAMP-1 및 LAMP-2의 농도는 또한 "비분할된 (unpartitioned)" 신생아 집단으로부터의 신생아 혈반들 (blood spots)에서도 측정되었다. 신생아에서의 LAMP-1 및 LAMP-2 농도는 더 나이든 피험체들의 수준과 비교하여 상승하였다. 이러한 보고는 이러한 리소솜 막 생마커들에 의한 일차 스크리닝이 높은 비율의 위양성 (false positives)을 야기할 수도 있다는 것을 암시한다. 상기 연구자들은 신생아 집단의 1 내지 5 %에 대해서는 2 차적 (second-tier) 진단 방법들로 더 검사할 것을 제안한다.

따라서, 특히, 신생아 시기 중에 폼페질병을 앓고 있는 피험체들을 확인하는 방법에 대한 필요성이 당업계에 존재한다. 또한 폼페병을 앓고 있는 개인들을 확인하고 모니터링하는 비-침습성인 방법들에 대한 필요성이 당업계에 존재한다. 또한 다른 유전성 대사 질병들을 스크리닝하는 기존의 방법들과 양립 가능한, 폼페병에 대한 신생아 스크리닝 방법들에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.

본 발명은 리소솜 축적병 (lysosomal storage disease)들을 앓고 있는 피험체들을 진단하고 모니터링하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는, 본 발명은 생체 유체 및 조직 내 생마커(biomarker)의 존재에 기초를 둔, 폼페병 (Pompe disease) (즉, 당원축적병 Ⅱ형) 및 그외 당원축적병들 (glycogen storage diseases)을 진단하고 모니터링하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 뇨 시료 내에서 BAB-표지된 (Glc)₄에 대한 HPLC 분리 크로마토그램을 나타낸 것이다. Y 축은 304 nm에서의 자외선 흡광도이다. X 축은 용출 시간을 분 단위로 나타낸 것이다. I.S.는 내부 표준물로서, 10 mg/mL의 셀로펜토오즈 (C5)이다.패널 A는 정상 개체로부터 얻은 뇨의 용출 프로파일이다.패널 B는 GSD Ⅱ형 환자로부터 얻은 뇨의 용출 프로파일이다.

도 2는 혈장 시료 내의 BAB-표지된 (Glc)₄에 대한 HPLC 분리 크로마토그램을 나타낸 것이다. Y 축은 304 nm에서의 자외선 흡광도이다. X 축은 용출 시간을 분 단위로 나타낸 것이다. I.S.는 내부 표준물로서, 1 mg/mL에서의 셀로펜토오즈 (C5)이다.패널 A는 정상 개체로부터 얻은 뇨의 용출 프로파일이다.패널 B는 GSD Ⅱ형 환자로부터 얻은 뇨의 용출 프로파일이다.

도 3은 PMP-표지된 올리고당, 말토헥소오즈 (M₆), 말토펜토오즈 (M₅), 말토테트라오즈 (M₄), (Glc)₄,말토트리오즈 (M₃), 말토오즈 (Mlt), 및 글루코오즈 (Glc)의 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다. Y 축은 304 nm에서의 자외선 흡광도이다. X 축은 용출 시간을 분 단위로 나타낸 것이다.패널 A는 (Glc)₄및 말토-올리고당 표준물들의 용출 프로파일이다.패널 B는 GSD Ⅱ형 환자 뇨 내의 (Glc)₄의 용출 프로파일이다. 화살표는 M₄의 부존재를 나타낸다.

도 4는 BAB-표지된 말토테트라오즈 나트륨 부가생성물 이온 (adduct ion) (M₄-BAB) Na+, m/z 866.4(패널 A); BAB-표지된 (Glc)₄나트륨 부가생성물 이온 (Glc₄-BAB) Na+, m/z 866.4(패널 B); 및 GSD Ⅱ형 환자 뇨 시료 내에 존재하는 헥소오즈 테트라머, m/z 866.4(패널 C)의 생성물 이온 스펙트럼을 나타낸다. m/z 704.4, m/z 542.3, 및 m/z 509.2 생성물 이온들은 각각, 하나의 헥소오즈, 두 개의 헥소오즈, 및 BAB-표지된 글루코오즈의 결실에 해당한다. Y 축은 단편들의 % 강도이다. X 축은 m/z 수치이다.

도 5는 당원축적병 Ⅱ형 환자의 뇨 내 BAB-표지된 올리고당에 대한 ESI-MS-MS 스펙트럼을 나타낸다. 유도체 시료는 C18 카트리지 정제 이후에 ESI-MS-MS로 직접 주입되었다. 이온들은 사중극자 질량 스펙트로미터 (quadrupole mass spectrometer)에 의하여 스캐닝 되었다 (실험적 상세 사항들은 본문 참조). Y 축은 단편들의 % 강도이다. X 축은 m/z 수치이다.

도 6은 환자 1(패널 A), 환자 2(패널 B), 환자 3(패널 C)으로부터의 뇨 내 (Glc)₄수준을 나타낸다. (Glc)₄수준은 mmol/mol 크레아틴 (Cr)으로 나타나 있다. 점선은 20개의 정상 대조군들 (1살 미만)에서 주된 (Glc)₄수준에 표준 편차값을 더한 값을 나타낸다. 개방형 화살표는 효소 요법 치료의 개시점을 나타낸다. 점선으로 된 폐쇄형 화살표는 2배 효소 투여의 개시점을 나타낸다. 실선으로 된 폐쇄형 화살표는 면역치료법의 개시점을 나타낸다.

도 7은 환자 1(패널 A), 환자 2(패널 B), 환자 3(패널 C)으로부터의 혈장 내 (Glc)₄수준을 나타낸다. (Glc)₄수준은 mg/mL단위로 표시되어 있다. 점선은 20개의 정상 대조군들 (1살 미만)에서 주된 (Glc)₄수준에 표준 편차값을 더한 값을 나타낸다. 개방형 화살표는 효소 요법 치료의 개시점을 나타낸다. 점선으로 된 폐쇄형 화살표는 2배 효소 투여의 개시점을 나타낸다. 실선으로 된 폐쇄형 화살표는 면역치료법의 개시점을 나타낸다.

도 8은 HPLC에 의하여 분리된 내부 표준물 반응 혼합물의 테트라당 부분의 BAB-유도체들을 그래프로 나타낸 것이다.

도 9는 HPLC 또는 ESI-MS/MS에 의한 대조군 및 환자 뇨 시료 내의 Glc₄분석에 대한 비교 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 HPLC 또는 ESI-MS/MS에 의한 대조군 및 환자 혈장 내의 Glc₄분석에 대한 비교 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 ESI-MS/MS에 의한, 액상(liquid) 및 반점화된(spotted) 뇨 시료 내의 Glc₄분석의 비교 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 Glc₄테트라당의 추정되는 구조를 나타낸 것이다.

이하 더욱 상세하게 서술된 바와 같이, 본 발명은 질병을 앓고 있는 환자들로부터 수집된 생물학적 시료들에서, (Glc)₄로 표시되는 헥소오즈 테트라머 생마커의 축적 (즉, 상승된 농도)에 의하여 특징화되는 질병들을 스크리닝하고 모니터링하는 방법을 제공한다. (Glc)₄테트라머는 당원축적병들, 예를 들어 GSD-Ⅱ (폼페병)를 스크리닝 및 모니터링하기 위한 생마커로서 특히 유용하다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법들은 건조 혈반 (예를 들어, 신생아 스크리닝 카드 상의)에서 (Glc)₄농도의 분석에 의하여 신생아를 스크리닝하는 데에 이용될 수 있다.

헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 추정 구조는: α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc로 결정되었다.

본 발명은 (Glc)₄생마커의 상승된 수준을 분석하기 위하여, 빠르고 신뢰성 있는 방법들 (예를 들어, HPLC 또는 탠덤 질량 스펙트로메트리 (TMS))을 사용하여폼페병을 객관적 방식으로 진단, 검출 및/또는 모니터할 수 있는 능력을 제공한다. 본 발명은 종래 방법들에 비하여 그 민감성, 반복재현성, 고해상도, 단순성, 및 저비용 면에서 유리하다. 더욱이, 여기에 개시된 신생아 스크리닝 분석법들은 다른 유전성 대사 질병들에 대한 종래의 신생아 스크리닝 방법들과 양립 가능하다.

따라서, 첫 번째 태양으로서, 본 발명은, 피험체로부터 얻어진 생물학적 시료에서 헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 농도를 결정하는 단계 및, 상기 농도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하는, 피험체에서 당원축적병을 스크리닝하는 방법을 제공하며, 상기 두 번째 단계에서 생물학적 시료 내의 (Glc)₄가 기준치보다 높은 농도로 검출되면 피험체가 당원축적병을 앓고 있는 것으로 확인된다. 바람직하게는, (Glc)₄테트라당은 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc로 추정되는 구조를 갖는다. 상기 당원축적병은 당원축적병 Ⅱ형 (GSD-Ⅱ 또는 폼페병), GSD Ⅲ, 또는 GSD Ⅳ인 것이 바람직하고; 더욱 바람직하게는 GSD-Ⅱ이다.

다른 태양으로서, 본 발명은 신생아 피험체로부터 얻어진 생물학적 시료에서 헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 농도를 결정하는 단계, 및 상기 농도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하는, 신생아 피험체에서 폼페병 (당원축적병 Ⅱ형)을 스크리닝하는 방법을 제공하며; 상기 두 번째 단계에서 생물학적 시료 내의 (Glc)₄가 기준치보다 높은 농도로 검출되면 신생아 피험체가 폼페병을 앓고 있는 것으로 확인된다. 바람직하게는, (Glc)₄는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc로 추정되는 구조를 갖는다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장 또는 뇨 시료 (더욱 바람직하게는, 건조 혈액, 혈청, 혈장 또는 뇨 시료)인 것이 바람직하다.

또 다른 태양으로서, 본 발명은, 피험체로부터 얻어진 생물학적 시료에서 헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 농도를 결정하는 단계 및, 상기 농도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하는, 폼페병 (당원축적병 Ⅱ형)을 앓고 있는 피험체의 임상적 상태를 모니터링하는 방법을 제공하며; 상기 두 번째 단계에서 생물학적 시료 내의 (Glc)₄가 기준치보다 높은 농도로 검출되면 피험체의 임상적 상태의 지표가 된다. 바람직하게는, (Glc)₄생마커는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc로 추정되는 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 피험체에서 치료적 요법의 효율성을 평가하기 위하여 수행된다.

또 다른 태양으로서, 본 발명은, 신생아 피험체로부터 얻어진 건조 혈반에서 탠덤 질량 스펙트로메트리에 의하여 헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 농도를 결정하는 단계 및, 상기 농도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하는, 신생아 피험체에서 폼페병 (당원축적병 Ⅱ형)을 스크리닝하는 방법을 제공하며; 상기 두 번째 단계에서 생물학적 시료 내의 (Glc)₄가 기준치보다 높은 농도로 검출되는 것은 신생아 피험체가 폼페병을 앓고 있는 것으로 확인된다. 바람직하게는, (Glc)₄생마커는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc로 추정되는 구조를 갖는다.

(Glc)₄테트라당은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 탠덤 질량 스펙트로메트리, 질량 스펙트로메트리, HPLC, 면역정제 방법들, 액상 크로마토그래피 등에 의하여 정량화 또는 결정될 수 있다. HPLC 및 탠덤 질량 스펙트로메트리가 바람직하며, 탠덤 질량 스펙트로메트리가 가장 바람직하다.

본 발명의 또 다른 태양은, 탠덤 질량 스펙트로메트리에 의하여, 피험체로부터 얻어진 생물학적 시료 내의 헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 농도를 정량화 또는 결정하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내에서 올리고당의 농도를 정량화 또는 결정하는 방법이다. 바람직하게는, (Glc)₄는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc로 추정되는 구조를 갖는다. 또한, [U-¹³C] 글루코오즈 표지된 헥소오즈 테트라머가 TMS 프로토콜을 위한 내부 표준물로서 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 또한, GSD-Ⅱ를 앓고 있는 환자에게 축적되는 다른 올리고당들 (예를 들어, 리미트 덱스트린)을 생마커로서 사용하여 수행될 수도 있다.

본 발명의 이러한 태양들 및 다른 태양들은 하기 발명의 상세한 설명에서 더욱 상세하게 서술된다.

본 발명은, 부분적으로, 헥소오즈 테트라머 (이하, (Glc)₄)가 당원축적병 Ⅱ형 (GSD-Ⅱ)을 검출하는 스크리닝 방법을 위한 생마커로서 사용될 수 있다는 발견에 기초를 두고 있다. (Glc)₄는 글루코오즈 테트라당으로서 추정적으로 확인되었다.

증거는 더 나아가 (Glc)₄올리고당이 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc 구조를 갖는다는 것을 나타낸다 (Hallgren등.(1974)Eur. J.Clin. Invest.4:429;도 12참조).

본 발명은, (Glc)₄농도, 특히 혈장 (Glc)₄농도가 폼페병 환자들을 모니터하는 데에 사용될 수 있으며 (예를 들어, 치료 요법의 효율성을 평가하는 데에); 질병을 앓고 있는 환자들에서 (Glc)₄농도는 질병의 임상적 경과와 상당한 상호연관성을 가질 수 있다.

본 발명의 상세한 설명에 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용된, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는, 문맥에서 명백히 다르게 지시하고 있지 않는 한, 복수형도 또한 포함하기 위하여 사용된 것이다.

"폼페병" 및 "당원축적병 Ⅱ형" (즉, GSD-Ⅱ)이라는 용어는, 비록 "폼페병"이 통상적으로 영아들의 질병 형태를 지칭하는 것으로 보다 흔히 사용되지만, 여기에서 상호 대치가능하게 사용된다.

여기에서 사용된, (Glc)₄라는 용어는, 폼페병 환자들의 생물학적 유체 (예를 들어, 뇨 및 혈장) 내에 축적되는 헥소오즈 테트라머 ((hex)₄) 생마커를 의미한다. (Glc)₄는 GAA 효소의 결핍으로 인한 불완전한 글리코겐 분해의 결과로서 축적되는 글루코오즈 테트라당 (예를 들어, 리미트 덱스트린)으로 추정적으로 확인되었다. (Glc)₄의 추정 구조는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc이다(도 12).

당업자라면, (Glc)₄의 추정 구조는, 그의 부틸-파라-아미노벤조에이트 (butyl-para-aminobenzoate) 유도체의 탠덤 질량 스펙트로메트리 (TMS)에 의하여 결정되는 바와 같이, 헥소오즈 테트라머의 구조임을 알 수 있다. 헥소오즈 구성 요소와 그들 간의 연결의 확인은 TMS 분석에 의하여 결정될 수는 없다. 따라서, 당업자라면, (Glc)₄가 헥소오즈 모노머들 (예를 들어, 글루코오즈, 갈락토오즈, 만노오즈)의 임의의 조합을 포함할 수 있으며, 그와 같은 모노머들 간에는 임의의 가능한 글리코시드 결합들 (예를 들어, 1→2, 1→3, 1→4, 1→6)에 의하여 연결될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

문헌에 보고된 종래의 관찰들뿐만 아니라, (Glc)₄와 폼페병 사이의 연관성이, 글루코오즈 테트라당이 (Glc)₄의 중요한 구성 성분이라는 것을 강하게 암시한다.

여기에 사용된 "스크리닝"이라는 용어는, 상기 서술된 바와 같이, (Glc)₄의 축적에 의하여 특징화되는 질병의 존재에 대하여 피험체를 평가하는 데에 사용되는 방법을 의미한다. 스크리닝 방법이 군 또는 개체 집단 내의 어떠한 개체들이 특정 질병을 앓고 있는가를 결정하는 데에 있어서 유용하고 유익하기만 하다면, 스크리닝 방법에 위양성 (false positives) 또는 위음성 (false negatives)이 없어야 될 필요는 없다. 여기에 개시된 스크리닝 방법들은 진단적 (diagnotic) 및/또는 예후적 (prognostic) 방법들이고/또는 환자 치료법을 모니터하기 위하여 사용될 수 있다.

여기에 사용된 "진단 방법"이라는 용어는, 특정 질병을 앓고 있는 피험체들을 확인하기 위하여 수행되는 스크리닝 방법을 의미하는 것이다.

"예후적 방법"은, 최소한 부분적으로나마, 질병의 방법을 예측할 수 있도록 돕는데 사용되는 방법을 의미한다. 달리 말하면, 예후적 방법은 질병의 심각성을 평가하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 여기에 개시된 스크리닝 방법은 질병의 심각성을 평가하기 위하여 질병을 앓고 있는 개체를 확인하는 것, 및/또는 질병의 장래 과정을 예측하는 것 양자 모두를 위하여 수행될 수 있다. 그와 같은 방법들은 치료적 처치에 대한 필요성, 어떠한 타입의 치료를 수행할 것인가 등을 평가하는 데에 있어서 유용할 수 있다. 부가하여, 예후적 방법은 질병이 특정 피험체에 대하여 어떻게 진전될 것인가에 대한 더 많은 정보를 얻고자 하는 경우에 (예를 들어, 특정 환자가 특정 약물 치료에 우호적으로 반응할 것인가에 관한 개연성, 또는 그에 대한 임상적 시도의 수행 목적을 위하여 환자들을 구별되는 다른 부-집단들 (sub-populations)로 분류 또는 분리하고자 하는 경우에), 이전에 특정 질병을 갖는 것으로 진단된 피험체에 대하여 수행될 수 있다.

여기에 사용된 "농도를 정량 (quantifying the concentration)" 또는 "농도를 결정 (determining the concentration)"이라는 용어는, 해당 시료에서 분석물의 농도 또는 수준을 측정하는 것을 의미한다. 통상적으로는, 정량 또는 결정 단계의 결과로서 절대적 또는 상대적인 수치가 시료 내 분석물의 농도로 주어질 것이다. 하기에 더욱 상세하게 서술된 바와 같이, 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법이 본 발명에 따른 생물학적 시료 내에서 (Glc)₄의 농도를 정량 또는 결정하는 데에 사용될 수 있다. 또한, 하기에 더욱 상세하게 서술된 바와 같이, (Glc)₄의 농도를 "정량" 또는 "결정"하는 방법들은 정량적 및/또는 준-정량적 (semi-quantitative)방법론들 모두를 포괄한다.

"정량적" 방법은 생물학적 시료 내의 분석물의 농도에 절대적 또는 상대적 수치를 부여하는 방법을 의미한다.

"준-정량적" 방법은 분석물의 농도가 역치 (threshold) 수준 이상인 것을 나타내기는 하지만, 절대적 또는 상대적 수치를 부여하지는 않는 방법을 의미한다. 통상적으로 "딥스틱 (dipstick)" 방법들로 알려진 분석적 방법들은 준-정량적 분석들의 예들이다.

본 발명에 대한 하기 서술은 (Glc)₄올리고당에 관한 것이다. 본 발명의 방법들은 또한 폼페병을 검출하기 위하여 더 긴 올리고당들 (예를 들어, GAA 효소의 결핍으로 인한 불완전 글리코겐 분해에 의해 생성되는 임의의 리미트 덱스트린)을 사용하는 데에도 적용될 수 있다.

예를 들어, (Glc)₆, (Glc)₇및 (Glc)₈이 폼페병을 앓고 있는 환자들의 뇨와 관련하여 서술되었다 (Lennartson 등., (1978)Eur. J. Biochem. 83:325; Kumlien 등., (1989)Arch. Biochem. Biophys. 269:678). 다음과 같은 추정 구조들을 갖는 최소한 3 가지의 (Glc)₆이소머들이 존재한다: α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc(1→4)-D-Glc, α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc(1→4)-D-Glc 및

α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc(1→4)-D-Glc. (Glc)₇이소머들의 추정 구조는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)(α-D-Glc(1→6))-D-Glc(1→4)-D-Glc-α-D-Glc(1→4)-D-Glc 및 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc-α-D-Glc(1→4)-D-Glc로 결정되었다. (Glc)₈올리고당의 추정 구조는: α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc로 결정되었다. 미지 구조(들)를 갖는 (hex)₅올리고당 (또는 올리고당들)이 TMS에 의해 폼페병 환자들 및 TMS에 의한 대조군들의 뇨 및 혈장에서 검출되었으며, 이는 글리코겐의 리미트 덱스트린으로 보인다. 11개 까지의 잔기들을 갖는 헥소오즈 올리고머들이, MALD-TOF MS (Matrix Assited Laser Desorption-Time Of Flight Mass Spectrometry)에 의하여 폼페병 환자의 뇨에서 검출되었다 (Klein 등., (1998)Clin. Chem. 44:2422).

당업자라면, 비환원 말단에서 α-(1→6) 글리코시드 결합을 갖는 올리고당들이 더욱 안정하고 바람직하다는 사실을 알 수 있을 것이다. 마찬가지로, 긴 올리고당들은 짧은 올리고당들에 비하여 덜 안정한 경향이 있다. 폼페병 환자와 비교하여 건강한 피험체로부터의 생물학적 시료들에서 특정 올리고당이 축적되는 정도가 또한 고려 사항이 된다. 마지막으로, 방해 물질들 (interfering substances)의 존재가 본 발명에 따라 생마커로서 사용할 올리고당을 선택하는 기준이 된다.

일반적으로, (Glc)₄에 대한 대체 물질로서, (Glc)₅, (Glc)₆, (Glc)₇, (Glc)₈및 더 긴 헥소오즈 올리고당들이 바람직한 생마커들이며, 특히, 신생아 피험체에 사용된다. 다른 한편으로, 이러한 더 긴 올리고당들은, 예를 들어 (Glc)₄어세이를 사용하여 위양성을 확인하기 위한, 2차 생마커로서 이용될 수 있다. 이러한 더 긴 헥소오즈 올리고머들은 (Glc)₄의 검출을 위한 유사한 프로토콜을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 탠덤 질량 스펙트로메트리에 있어서, 동일한 유도체화 및 스캔 기능이 이용될 수 있으나, 다른 질량들 (m/z)이 검출된다.

(Glc) ₄ : 폼페병 및 그외 대사 질병들에 대한 생마커.

(Glc)₄테트라당은 글리코겐으로부터 유래되며, 폼페병 환자들에게서 산 리소솜 α-글루코시다아제 (GAA) 결핍의 결과로 야기되는 불완전한 글리코겐 분해의 부산물 (예를 들어, 리미트 덱스트린)을 나타내는 것으로 알려져 있다. 리미트 덱스트린은, 아마도 리소좀 내 글리코겐 축적에 의하여 야기되는 세포 용해 (cell lysis)의 결과로서 글리코겐이 순환계로 방출되는 경우에 형성되는 것임을 암시하는 증거가 있다. 순환계 내에서, 글리코겐은 α-아밀라아제 및 중성 α1-4 글루코시다아제의 작용을 받아 리미트 덱스트린의 생산을 야기하게 된다 (Ugorski, (1983)J. Exp. Pathol. 1:27). (Glc)₄는 생체 유체 (예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 양막 유체 (amniotic fluid) 등) 내에서 상승된 농도로 발견된다.

뇨 내 (Glc)₄테트라당의 축적은 또한, 다른 당원축적병 및 질병들, 예를 들어, GSD-Ⅲ 및 GSD-Ⅳ, 뒤시엔느 근육 이영양증, 급성 췌장염 및 다른 특정 질병들과 관련되어 있다. GSD-Ⅲ는 글리코겐 가지제거 효소 (debranching enzyme) 활성의 결핍에 의하여 야기된다. GSD-Ⅳ는 간 인산화 효소 (liver phosphorylase) 시스템의 결핍에 의하여 야기되는 이형 (heterogenous) 질병군이다. 결핍은 간 인산화 효소 자체의 결핍 또는 인산화 효소 키나아제 (kinase)의 결핍일 수 있다.

따라서, 본 발명은 피험체로부터 수집된 생물학적 시료 내의 (Glc)₄의 축적 (예를 들어, 상승된 농도)에 의하여 특징화되는 질병을 피험체에서 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 생물학적 시료는 피험체로부터 수집되고, 시료 내에서 (Glc)₄의 존재 또는 부존재가 결정되며, 시료 내의 (Glc)₄의 존재는 피험체가 그 질병을 가지고 있다는 것을 추정적으로 확인시켜 준다.

다른 한편으로, 바람직하게는, 본 발명은 본질적으로 정량적 또는 준-정량적일 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 생물학적 시료는 피험체로부터 얻어지며, 생물학적 시료 내의 (Glc)₄의 농도가 정량 또는 결정된다. 생물학적 시료 내의 (Glc)₄의 수준이 기준치 (즉, 기준 농도) 이상인 경우에는, 피험체가 질병을 앓고 있다는 것을 추정적으로 확인시켜 준다. 통상적으로, 기준치는 스크린되는 피험체에 대하여 적절한 건강 집단 (healthy populations) 및 질병 집단 (affected populations)에 대한 (Glc)₄의 공지의 농도에 기초할 것이다 (예를 들어, 신생아 피험체는, 일반적으로, 건강한 및/또는 질병이 있는 신생아 집단과 비교될 수 있다).

예를 들어, 피험체는 대응되는, 비선택된 (unselected) 집단과 비교될 수 있다. 다른 한편으로, 피험체는 질병을 앓지 않는 (즉, 건강한) 피험체의 대응 집단 및/또는 질병을 앓는 피험체의 대응 집단과 비교될 수도 있다.

건강한 피험체들에서 연령에 따라 (Glc)₄수준이 감소하는 경향이 있으므로, 피험체들은 연령-대응 집단 (age-matched population)과 비교되는 것이 바람직하다 (표 4 및 5 참조). 또한 당업자라면, 폼페병이 나중에 발병하는 형태들과 비교하여 초기에 발병하는 환자들에 있어서 (Glc)₄의 수준이 높을 수 있다는 것을 이해할 것이다.

기준치는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라서 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 기준치는 미리 정해진 값일 수 있다. 다른 한편으로, 기준치는 분석 과정 중에 결정될 수도 있다. 예를 들어, 공지의 질병을 앓지 않는 피험체들 및/또는 질병을 앓는 피험체들로부터의 시료들을 테스트 시료들과 동시에 실험하고, 기준치를 그로부터 결정할 수 있다.

또 다른 대체 방법으로서, 혼합 집단으로부터의 테스트 시료들을 분석하고, 예를 들어, 당업계에 공지된 통계 방법들을 사용함으로써 결과들의 분포에 기초하여 기준치를 결정할 수 있다.

따라서, 기준치는 질병을 앓고 있는 피험체들을 확인하기 위한 역치 수치를 나타낸다. 기준치의 선택이 절대적인 것은 아니다. 예를 들어, 상대적으로 낮은 수치는 위음성의 발생을 감소시키는 데에 유리할 수 있으나, 위양성의 개연성을 또한 증가시킬 수도 있다. 따라서, 다른 스크리닝 기술에서와 같이, 기준치는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 비용, 조기 진단 및 치료의 이익, 위양성 결과를 갖는 개체들에 대한 후속 진단 방법들의 침습성 (invasiveness), 및 스크리닝 분석 방법을 설계하는 데에 있어서 통상적으로 고려하여야 하는 다른 요인들을 포함하는 여러 요인들에 기초할 수 있다.

피험체들은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 질병을 앓는 것으로 추정적으로 확인될 수 있다. 예를 들어, (Glc)₄수치가 적당하게 대응되는 대조군과 비교하여, 약 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 보다 높은 경우에는 질병을 앓는 것으로 추정적으로 확인될 수 있다. 다른 한편으로, 적당한 비질병 집단에 대한 평균 (average) (다른 한편으로, 평균값 (mean) 또는 중앙값 (median)) 수치보다 약 2, 3, 4, 5, 8, 10 또는 20배 높은 (Glc)₄농도를 갖는 피험체들은 질병을 앓는 것으로 추정적으로 확인될 수 있다.

2차 생마커들은 (Glc)₄어세이에서 개연성 있는 위양성을 확인하는 데에 선택적으로 사용될 수 있다. 2차 생마커들의 예는 폼페병 환자들의 체액에서 발견되는 긴 사슬 올리고당 (상기에 서술)을 포함한다. 그 이외의 가능한 2차 생마커들은 LAMP-1 및 LAMP-2 마커들을 포함한다 (Meikle 등., (1997)Clin. Chem. 43:1325 및 WO 97/44668; Hua 등., (1998)Clin. Chemistry 44:2094).

바람직한 구현예에서, 전술한 방법들이 피험체들에서 리소솜 축적병 (예를 들어, 당원축적병들) 또는 뒤시엔느 근육 이영양증, 더욱 바람직하게는, 당원축적병들 (GSD-Ⅰ제외), 더더욱 바람직하게는 GSD-Ⅱ (폼페병), GSD-Ⅲ 또는 GSD-Ⅳ를스크린하기 위하여 수행될 수 있다. 가장 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 피험체에서 폼페병 (GSD-Ⅱ)을 스크린하는 데에 이용될 수 있다.

당업계에 공지된 다수의 리소솜 축적병들이 존재한다. 리소솜 축적병의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, GM1 강글리오시드 축적증 (gangliosidosis), 테이삭스병 (Tay-Sachs disease), GM2 강글리오시드 축적증 (AB 변이체), 산드호프 (Sandhoff) 병, 파브리 (Fabry) 병, 가우셔 (Gaucher) 병, 이염성 백질이영양증 (metachromatic leukodystrophy), 크라베 (Krabbe) 병, 님만-픽 (Niemann-Pick) 병 (A-D 형), 파버 (Farber) 병, 울만 (Wolman) 병, 헐러 증후군 (Hurler Syndrome) (MPS Ⅲ), 쉐이에 (Scheie) 증후군 (MPS IS), 헐러-쉐이에 (Hurler-Scheie) 증후군 (MPS IH/S), 헌터 (Hunter) 증후군 (MPS Ⅱ), 산필리포 (Sanfilippo) A 증후군 (MPS ⅢA), 산필리포 B 증후군 (MPS ⅢB), 산필리포 C 증후군 (MPS ⅢC), 산필리포 D 증후군 (MPS ⅢD), 모르퀴오 (Morquio) A 병 (MPS ⅣA), 모르퀴오 B 병 (MPS ⅣB), 마로토-라미 (Maroteaux-Lamy) 병 (MPS Ⅵ), 슬라이 (Sly) 증후군 (MPS Ⅶ), α-만노오즈 축적증 (mannosidosis), β-만노오즈 축적증, 푸코시드 축적증 (fucosidosis), 아스파르틸글루코사미뉴리아 (aspartylglucosaminuria), 시알산증 (sialidosis) (뮤코리피드증 Ⅰ(mucolipidosis Ⅰ)) , 갈락토시알산증 (galactosialidosis) (골드버그 (Goldberg) 증후군), 쉰들러 (Schindler) 병, 뮤코리피드증 Ⅱ (I-세포 병), 뮤코리피드증 Ⅲ (가성-헐러 다발성이영양증 (pseudo-hurler polydystrophy)), 시스틴 축적증 (cystinosis), 살라 (Salla) 병, 유아성 시알산 축적 질병 (infantile sialic acid storage disease), 바텐 (Batten) 질병(유년성 신경 지방 갈색소증 (juvenile neronal ceroid lipofuscinosis), 유아성 (infantile) 신경 지방 갈색소증, 뮤코리피드증 Ⅳ, 및 프로사포신 (prosaposin)을 포함한다.

본 발명에 따른 리소솜 축적병과 관련된 효소 결핍은, 이에 제한되는 것은 아니지만, β-갈락토시다아제 (galactosidase), β-헥소오즈아미니다아제 (hexosaminidase) A, β-헥소오즈아미니다아제 B, GM₂활성인자 (activator) 단백질, 글루코세레브로시다아제 (glucocerebrosidase), 아릴술파타아제 (arylsulfatase) A, 갈락토실세라미다아제 (galactosylceramidase), 산 스핑고미엘리나아제 (sphingomyelinase), 산 세라미다아제 (ceramidase), 산 리파아제 (lipase), α-L-이루로니다아제 (iduronidase), 이두론산 술파타아제 (sulfatase), 헤파란 (heparan) N-술파타아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제 (acetylglucosaminidase) 아세틸-CoA, 글루코사미나이드 (glucosaminide) 아세틸트랜스퍼라아제 (acetyltransferase), N-아세틸글루코사민-6-술파타아제, 아릴술파타아제 B, β-글루쿠로니다아제 (glucuronidase), α-만노시다아제, β-만노시다아제, α-L-푸코시다아제 (fucosidase), N-아스파르틸-β-글루코사미니다아제, α-뉴라미니다아제 (neuraminidase), 리소솜 보호 단백질, α-N-아세틸-갈락토사미니다아제 (galactosaminidase), N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라아제, 시스테인 수송 단백질, 시알산 수송 단백질, CNL3 유전자 산물, 팔미토일-단백질 티오에스터라아제 (thioesterase), 사포신 (saposin) A, 사포신 B, 사포신 C, 또는 사포신 D의 결핍을 포함한다.

수 많은 당원축적병들이 알려져 있으며, 이에 대해서는, Y.T. Chen & A. Burchell, Glycogen storage diseases. In: C.R. Scriver 등. (Eds.). The metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7th ed. New York: McGraw-Hill. 1995, pp. 935-965를 참조할 수 있다. 당원축적병들의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, Ⅰa 형 GSD (폰 기에르케 (von Gierke) 질병), Ⅰb 형 GSD, Ⅰc 형 GSD, Ⅰd 형 GSD, Ⅱ 형 GSD (폼페병 또는 유아성 Ⅱ 형 GSD를 포함), Ⅲa 형 GSD, Ⅲb 형 GSD, Ⅳ 형 GSD, Ⅴ 형 GSD (맥아들 (McArdle) 질병), Ⅵ형 GSD, Ⅶ 형 GSD, 글리코겐 신타제 (glycogen synthase) 결핍증, 신장 판코니 (Fanconi) 증후군을 갖는 간 글리코겐 합성, 포스포글루코이소머라아제 (phosphoglucoisomerase) 결핍증, 근육 포스포글리세레이트 (phosphoglycerate) 키나아제 결핍증, 포스포글리세레이트 뮤타아제 (mutase) 결핍증, 및 젖산 탈수소화효소 (lactate dehydrogenase) 결핍증을 포함한다.

당원축적병들과 관련된 효소 결핍들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 글루코오즈 6-포스파타아제, 리소솜 산 α글루코시다아제, 글리코겐 가지제거 (debranching) 효소, 가지화 (branching) 효소, 근육 포스포릴라아제 (phosphorylase), 포스포릴라아제 키나아제, 근육 포스포프럭토키나아제 (phosphofructokinase), 글리코겐 신타아제, 포스포글루코이소머라아제 (phosphoglucoisomerase), 근육 포스포글리세레이트 키나아제, 포스포글리세레이트 뮤타아제, 또는 젖산 탈수소화효소의 결핍을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명은 폼페병 (즉, GSD-Ⅱ)의 대사 장애인, 리소솜 산α-글루코시다아제 (GAA) 결핍증을 갖는 피험체들을 검출하는 데에 사용된다.

다른 태양으로서, 본 발명은 피험체로부터 얻어진 생물학적 시료 내의 (Glc)₄농도를 정량 또는 결정하는 것을 포함하는, 피험체에서 폼페병을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 피험체로부터 수집한 생물학적 시료 내의 (Glc)₄농도는 기준치 (본 용어는 상기 정의된 바와 같다)와 비교된다. 생물학적 시료 내의 (Glc)₄농도가 이러한 기준치 (이는 미리 정해진 값일 수 있다) 이상으로 검출되는 것은 피험체가 폼페병을 앓고 있는 것을 추정적으로 확인시켜 준다.

일반적으로, 여기에 개시된 방법들은 수의학적 및 의학적 응용이 가능하다. 따라서, 피험체들은 인간 (humans), 유인원 (simians), 개 (canines), 고양이 (felines), 말 (equines), 소 (bovines), 양 (ovines), 염소 (caprines), 돼지 (porcines), 토끼 (lagomorphs), 설치류 (rodents), 조류 (avians) 등일 수 있다. 그러나, 통상적으로, 본 발명에 따른 피험체들은, 예를 들어 신생아 (즉, 출생 시부터 출생 후 약 1 주 사이의), 영아, 어린이, 청소년 또는 어른 피험체들과 같은 인간 피험체가 될 것이다. 이 중에서, 신생아 피험체들이 바람직하다. 여기 사용된 바와 같이 "신생아" 피험체들은, 그러한 용어가 당업계에서 사용되는 바와 같이, 미숙아 (premature infants)를 포함한다.

피험체들은, 예를 들어 광범위한 스크리닝 어세이 (broad-based screening assay)와 같은 일반 집단 (general population)의 부분일 수도 있다. 다른 한편으로, 피험체들은 상기 서술된 바와 같이 (예를 들어, 당원축적병, 더욱 구체적으로는, GSD-Ⅱ) (Glc)₄의 축적에 의하여 특징화되는 대사 질병 (예를 들어, 피험체가 임상적 증상을 갖는 것)을 갖는 것으로 의심되는 것일 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 피험체들은 (Glc)₄의 축적에 의하여 특징화되는 질병을 갖는 것으로 이미 진단되었을 수도 있다 (예를 들어, 환자의 임상적 상태 또는 치료의 효율성을 모니터하기 위하여). 이러한 구현예에 따르면, 피험체는 당원축적병 (더욱 구체적으로는, GSD-Ⅱ)을 갖는 것으로 진단되었던 것이 바람직하다.

여기에 사용된, "생물학적 시료"라는 용어는, 여기에 기재된 질병들 (예를 들어, GSD-Ⅱ, GSD-Ⅲ 및 GSD-Ⅳ와 같은 당원축적병들)에서 (Glc)₄의 축적이 검출될 수 있는 임의의 적당한 체액 (body fluid), 세포들, 또는 조직 (배양된 세포들 및 조직들을 포함한다)을 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 생물학적 시료는, 피험체에 대하여 외상이 적고, 광범위한 스크리닝 어세이에 보다 적합한, 상대적으로 비-침습적인 방법들 (즉, 외과적인 방법 또는 생체 검사 (biopsy)를 포함하지 않는 방법들)에 의하여 얻어질 수 있다. 또한 생물학적 시료는 체액 시료인 것이 바람직하다. 체액 시료들의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 혈장, 혈청, 혈액 (제대 혈액 (cord blood)을 포함한다), 뇨, 타액, 양수 등을 포함한다. 이 중에서, 혈액, 혈장, 혈청 및 뇨 시료들이 더욱 바람직하다.

다른 한편으로, 생물학적 시료는, 배양된 세포들 (예를 들어, 섬유아세포) 또는 조직들을 포함하여 세포 또는 조직 시료, 및 세포들 또는 조직들로부터 수집된 조절된 매체(conditioned medium) 또는 유출물 (effusions)일 수 있다. 세포들또는 조직들의 예로는, 근육 (예를 들어, 골격근, 평활근, 심장근 및 횡격막근), 간, 피부, 포피 (foreskin), 배꼽 (umbilical) 세포 또는 조직 등을 포함한다. 이 중에서, 간 및 근육 세포들 및 조직들이 바람직하다.

또 다른 한편으로, 생물학적 시료는, 예를 들어, 필터 페이퍼, 면봉, 솜 등의 고체 매개체 상에 제공될 수도 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 생물학적 시료는, 예를 들어 신생아 스크리닝 카드 (즉, "구트리 (Guthrie)" 카드) 상의 건조된 혈액 스폿들과 같은, 신생아 피험체로부터의 건조 혈액 시료이다. 더욱 바람직한 예로서, 생물학적 시료는 건조 뇨 시료일 수 있다 (예를 들어, 기저귀의 필터 페이퍼 또는 라이닝 (lining)).

피험체들은 여기에 기재된 본 발명의 스크리닝 방법들에 의하여 특정 질병 (예를 들어, 폼페병)을 앓고 있는 것으로 추정적으로 확인될 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 피험체들에서의 진단을 확신하기 위하여 추가적이고, 2차적인 진단 테스트가 수행될 것이다. 통상적으로, 그와 같은 2차적 방법론들 (예를 들어, 조직 생체 검사에 대한 효소 분석들)은 여기에 기재된 스크리닝 방법들보다 더 많은 비용과 시간이 소요되며, 침습적이다. 예를 들어, 기준 농도보다 더 높은 (Glc)₄수준을 갖는 피험체들은 폼페병을 앓는 것으로 추정적으로 확인될 수 있으며, 이러한 진단을 확신하고, 피험체가 다른 질병 (예를 들어, GSD-Ⅲ)을 앓고 있는지 또는 스크리닝 분석에서 위양성 결과를 내는 건강한 피험체인지를 분석하기 위한 부가적인 진단 테스트를 수행하기 위해서 선택될 수 있다.

본 발명은, 이러한 용어가 상기 정의된 바와 같이, (Glc)₄의 축적에 의하여 특징화되는 질병을 가진 것으로 이전에 양성으로 진단된 피험체의 임상적 경과를 모니터링하는 방법들에서 또 다른 유용성을 찾을 수 있다. 본 연구자들은 질병을 앓는 피험체로부터의 생물학적 시료들 내 (특히, 혈장, 혈액 및 혈청)의 증가된 (Glc)₄농도들이 질병을 앓는 피험체의 임상적 상태와 상관관계가 있다는 사실을 발견하였다. 실제로, (Glc)₄의 농도는 질병을 앓는 피험체에서 다른 증상으로의 악화 (exacerbation)에 선행하여 증가될 수 있으며, 퇴행 (regression)의 조기 지표로 사용될 수 있다. 따라서, (Glc)₄는 치료 효율 및 환자의 임상적 상태의 지표로서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 (Glc)₄의 축적에 의하여 특징화되는 질병을 앓는 피험체의 임상적 상태를 모니터링하는 방법들을 더 포함한다. 바람직하게는, 피험체는 당원축적병, 더욱 바람직하게는 GSD-Ⅱ를 앓는 것으로 이전에 진단된 피험체이다. 피험체의 임상적 상태는, 예를 들어, 효소 치환 요법, 유전자 치료법, 및/또는 식이 요법과 같은 치료 요법의 효율성을 결정하기 위하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 만일 생마커의 수준이 현 치료 요법이 효율적이지 않다는 것을 암시한다면, 다른 치료 과정을 개시하도록 결정될 수 있다. 다른 한편으로, 피험체의 상태는 피험체의 치료를 개시해야 할지 또는 재개시해야 할지를 결정하기 위하여 모니터링될 수 있다.

여기에 기재된 본 발명의 스크리닝 방법들은, 생물학적 시료 내 (상기 서술한 바와 같은) (Glc)₄의 존재 또는 부존재를 검출하는 (바람직하게는, (Glc)₄의 농도를 결정하는) 임의의 적당한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방법들의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 크로마토그래피 방법들 (예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC)), 면역분석법 (immunoassay) (예를 들어, 면역친화 (immunoaffinity) 크로마토그래피, 면역결정화 (immunoprecipitation), 방사성면역분석법 (radioimmunoassay), 면역형광 분석법 (immunofluorescence assay), 면역세포화학 분석법 (immunocytochemical assay), 면역블럿팅 (immunoblotting), 효소-연결 면역흡착제 분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 등), 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로메트리; 기체 크로마토그래피-질량 스펙트로메트리, TOF MS, 탠덤 질량 스펙트로메트리 (tandem mass spectrometry, TMS) 및 이러한 질량 스펙트로메트리 기술들과 면역정제법 (immunopurification)과의 조합들을 포함한다.

바람직한 방법들은 간단하며, 신속, 정확하고, 상대적으로 비침습적 (예를 들어, 외과적이 아닌)이며, 민감하고, 바람직하게는 (Glc)₄이외의 분자들로부터의 간섭 신호들을 최소화한다. 신생아 스크리닝의 방법으로 사용되는 경우에는, 상기 방법들이 기존의 스크리닝 분석법들과 양립 가능하고, 자동화 및 시료의 고효율 (high throughput) 스크리닝이 가능한 것이 더욱 바람직하다.

이 방법들은 전적으로 수동적일 수 있고, 다른 한편으로 바람직하게는, 부분적 또는 전적으로 자동화될 수 있다. 많은 수의 시료들을 평가하기 위한 스크리닝프로그램들 (예를 들어, 신생아 스크리닝 프로그램들)은 일반적으로 시료의 고효율 처리를 용이하게 하기 위하여 최소한 부분적으로 자동화된다. 통상적으로, 예를 들어, 데이터는 자동화 시스템을 사용하여 수집되고 분석된다. 다른 바람직한 고효율 처리 방법들에 의해 스폿팅된 생물학적 시료 (예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨 등) 배열들 또는 미세-배열들은 동시에 분석될 수 있다. 그와 같은 배열들 또는 미세배열들은 약 10, 50, 100, 200, 300, 500, 800, 1000, 2000, 5000 개 또는 그 이상의 시료들을 포함할 수 있다.

HPLC, TOF MS, 탠덤 질량 스펙트로메트리 (TMS)를 이용한 방법들이 바람직하며, TMS를 이용하는 방법이 가장 바람직하다.

생물학적 시료들 내의 (Glc)₄및 다른 글리칸들의 분석을 위한 바람직한 HPLC 방법은 C18 역상 (reversed-phase) 컬럼을 이용한다. 이러한 방법에 따르면, 모노머 (글루코오즈) 내지 헵타머 (말토헵타오즈 (maltoheptaose)) 표준물들의 기저선 (baseline) 분리는 파라-아미노-벤조산 (PABA)의 유도체를 사용하여 자외선 검출기로 304 nm의 파장에서 모니터링함으로써 용이하게 달성될 수 있다.

TMS를 사용하여 생물학적 시료들 내의 (Glc)₄및 다른 글리칸들을 정량 또는 결정하는 바람직한 방법들은 아래에 더욱 상세하게 서술되어 있다.

(Glc)₄분석물의 농도가 검출 기술의 한계에 대하여 상대적으로 낮은 생물학적 시료들에 대해서는, 시료 내에서 (Glc)₄를 검출 (다른 한편으로는, 정량)하는 단계 이전에 농축 단계를 이용하는 것이 바람직하다. 예시적이고, 바람직한 농축 기술의 예로서, 면역친화 방법들이 검출/정량 단계 이전에 시료 내에서 (Glc)₄의 농도를 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 자화된 비드들 (magnetized beads)에 접합된 (conjugated) (Glc)₄를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 면역결정화가 수행될 수 있다. 특이적인 항-(Glc)₄항체들은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Zopf 등., (1982)J. Immunological Methods 18:109; Lundblad 등., (1984)J. Immunological Methods 68:217; Lundblad 등., (1984)J. Immunological Methods 68:227). 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography) 또한 시료 내에서 (Glc)₄를 농축시키는데 사용될 수 있다.

이러한 농축 방법들은 또한 오염물 또는 간섭 물질들로부터 (Glc)₄분석물을 분리하는 데에도 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 태양은 (Glc)₄를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 항체에 관한 것이다. 여기에 사용된 "항체"라는 용어는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 포함하는 모든 타입의 면역글로불린을 포함하는 것을 의미한다. 이들 중에서, IgM 및 IgG가 특히 바람직하다. 항체들은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있으며, (예를 들어) 생쥐, 랫트, 토끼, 말, 또는 인간을 포함하는 임의의 종에 기원을 둔 것일 수 있으며, 또는 키메릭 (chimeric) 항체들일 수 있다. 예를 들어, M. Walker 등., Molec. Immunol. 26, 403-11 (1989)을 참조할 수 있다. 항체들은 Reading의 U.S. Patent No. 4,474,893, 또는 Cabilly 등의, U.S. Patent No. 4,816,567에 개시된방법들에 따라 제조된 재조합 모노클로날 항체들일 수 있다. 항체들은 또한 SegAl 등., U.S. Patent No. 4,676,980에 개시된 방법에 따라 제조된 특이적 항체들에 의하여 화학적으로 구성될 수도 있다.

(Glc)₄에 대한 특이적 결합 부위들을 갖는 항체 단편들이 또한 제조될 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 단편들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 항체 분자의 펩신 분해에 의하여 제조될 수 있는 F(ab')₂단편들 및 F(ab')₂단편들의 이황화 (disulfide) 브릿지를 환원시킴으로써 제조될 수 있는 Fab 단편들일 수 있다. 다른 한편으로, Fab 발현 라이브러리들은 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편들의 빠르고 쉬운 확인이 가능하도록 구성될 수도 있다 (W. D. Huse 등.,Science 254,1275-1281 (1989)).

항체의 제조를 위하여, 염소, 토끼, 랫트, 생쥐, 인간 및 다른 것들을 포함하는 다양한 숙주들에 면역원적 특성들(예를 들어, 합텐 (hapten) 또는 옵소닌 (opsonin)에 접합되는 성질)을 갖는 (Glc)₄또는 그 유도체를 주사함으로써 면역화시킬 수 있다. 숙주의 종들에 따라서, 다양한 보강제들 (adjuvants)이 면역학적 반응을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 그와 같은 아주반트들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 프로인트 보강제 (Freund's adjuvants), 알루미늄 히드록시드와 같은 무기 겔들, 및 리소레시틴 (lysolecithin), 플루론 폴리올들 (pluronic polyols), 폴리음이온들 (polyanions), 펩티드들, 오일 에멀젼들, 키홀 림페트 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin) 및 디니트로페놀 (dinitrophenol)과 같은표면 활성 물질들 (surface avtive substances)을 포함한다. 인간에게서 사용되는 보강제들 중에서, BCG (bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리아 파르붐 (Corynebacterium parvum)이 특히 바람직하다.

(Glc)₄에 대한 단일 클론 항체들은 배양시 무한증식성 세포주 (continuous cell lines)에 의하여 항체 분자를 생산하는 임의의 기술을 사용함으로써 제조될 수 있다. 이들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하이브리도마 (hybridoma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술, 및 EBV-하이브리도마 기술을 포함한다 (Kohler, G. 등. (1975)Nature 256:495-497; Kozbor, D. 등. (1985)J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R. J.등.(1983)Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole, S. P. 등. (1984)Mol. Cell Biol. 62:109-120). 간단히 설명하면, 그 과정은 다음과 같다: 동물을 (Glc)₄또는 면역원성 유도체 또는 (예를 들어, 합텐 또는 옵소닌에 접합된) 그 접합체로 면역화한다. 다음으로 면역화된 동물로부터 림프 세포 (예를 들어, 지라 (splenic) 림프구들)를 얻어서, 불멸성 (immortalized) 세포들 (예를 들어, 미엘로마 (myeloma) 또는 헤테로미엘로마 (heteromyeloma))과 융합시켜 혼성 세포들을 제조한다. 혼성 세포들을 스크리닝하여 원하는 항체를 생산하는 혼성 세포들을 확인한다.

인간 항체를 분비하는 인간 하이브리도마는 Kohler 및 Milstein의 기술에 의하여 제조될 수 있다. 비록 인간 항체들이 인간 치료에 특히 적합하지만, 일반적으로, 인간 단일 클론 항체의 장기간 생산을 위한 안정한 인간-인간 하이브리도마의제조는 어려울 수도 있다. 설치류, 특히 생쥐에서의 하이브리도마 제조는 잘 알려진 방법이며, 따라서, 안정한 쥐과 동물의 하이브리도마들은 선택 특성들을 갖는 항체의 무제한적인 근원을 제공할 수 있다. 인간 항체들에 대한 대체 방법으로서, 생쥐 항체들은 유전 공학 기술에 의하여 키메릭 쥐/인간 항체들로 변환될 수 있다. 이에 대해서는 V. T. Oi 등, Bio Techniques 4(4):214-221 (1986); L. K. Sun 등, Hybridoma 5(1986)을 참조할 수 있다.

(Glc)₄에 특이적인 단일 클론 항체들은 항-유전형 (anti-idiotypic) (항원결합부위-특이적 (paratope-specific)) 항체들을 제조하는 데에 사용될 수 있다. 이에 대해서는 McNamara 등.,Science 220, 1325-26 (1984), R. C. Kennedy, 등.,Science 232, 220 (1986)을 참조할 수 있다.

부가하여, "키메릭 항체"를 제조하기 위하여 개발된 기술들, 즉 적당한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 가진 분자를 얻기 위하여 생쥐 항체 유전자들을 인간 항체 유전자들에 스플라이싱 (splicing)하는 기술들이 사용될 수 있다 (S. L. Morrison, 등.Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855 (1984); M. S. Neuberger 등.,Nature 312:604-608 (1984); S. Takeda, S. 등.,Nature 314:452-454 (1985)). 다른 한편으로, 당업계에 공지된 방법들을 사용하여, (Glc)₄-특이적 단일 사슬 항체들을 제조하기 위하여, 단일 사슬 항체들의 제조를 위하여 서술된 기술들이 채택될 수도 있다. 연관된 특이성을 갖지만, 구별되는 유전형 조성을 갖는 항체들은 무작위 조합형 면역글로불린 라이브러리 (random combinatorialimmunoglobulin libraries)로부터 사슬 셔플링 (shuffling)에 의하여 제조될 수도 있다 (D. R. Burton,Proc. Natl. Acad. Sci. 88,11120-3 (1991)).

항체들은 문헌에 개시된 바와 같이, 림프구 집단에서 in vivo 생산을 유도하거나, 또는 매우 특이적인 결합 시약들의 면역글로불린 라이브러리 또는 패널들을 스크리닝함으로써 제조할 수도 있다 (R. Orlandi 등.,Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833-3837 (1989); G. Winter 등.,Nature 349, 293-299 (1991)).

신생아 스크리닝

여기에 기재된 방법들은 조기 치료를 가능하게 하기 위하여 신생아 시기에 질병을 앓고 있는 개체들을 확인하는 신생아 스크리닝 프로그램의 일부로서 바람직하게 이용될 수 있다. 많은 신생아 스크리닝 프로그램들은 발 뒤꿈치로부터 얻은 혈액을 신생아 스크리닝 카드 (예를 들어, 면-섬유 필터 페이퍼) 상에 흡수시키는 독특한 표본 수집 방식에 의존한다. 페닐케톤뇨증 (phenylketouria, PKA)를 야기하는 페닐알라닌 히드록실라아제 (phenylalanine hydroxylase) 결핍, 및 단풍시럽뇨병 (maple syrup urine disease, MSUD)을 야기하는 곁사슬 케토산 데히드로게나아제 (branched-chain ketoacid dehydrogenase) 결핍과 같은 아미노산 대사의 결함에 의하여 야기되는 사망율 (mortality)과 이환율 (morbidity) 증가는 이러한 건조 신생아 혈반에서의 상승된 아미노산 수준에 대한 간단한 생화학적 테스트의 개발로 인하여 회피할 수 있다.

여기에 기재된 스크리닝 방법들은 더 나아가, 예를 들어, 신생아 스크리닝 카드 상의 신생아 혈액 시료들 또는 건조 혈반들에 대한 다른 신생아 스크리닝 분석법들과 동시에 또는 병행하여 (즉, 동일한 시료이지만 동일한 분석법일 필요는 없는) 유리하게 수행될 수도 있다.

신생아 스크리닝 카드는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 면, 셀룰로오즈, 아세테이트, 및 그 조합을 포함하는 임의의 적당한 천연 재료 또는 합성 재료로 이루어질 수 있다.

다른 한편으로, 신생아 스크리닝 프로그램은 전술한 바와 같이, 임의의 다른 생물학적 시료 내에서 (Glc)₄를 측정하는 것에 기초를 둘 수도 있다. 예를 들어, (Glc)₄는 혈액 (예를 들어, 제대 혈액 (cord blood)), 혈장, 혈청, 또는 뇨에서 측정될 수도 있다. 특정 구현예들에서, 뇨는 기저귀 재료로부터 추출될 수도 있다.

따라서, 본 발명의 다른 태양은, 신생아 피험체로부터 수집한 생물학적 시료 내에서 (Glc)₄의 농도를 정량 또는 결정하는 단계를 포함하는, 신생아 피험체에서 (전술한 바와 같이) (Glc)₄의 축적에 의하여 특징화되는 질병을 스크리닝하는 방법이며, 생물학적 시료 내에서 참조 농도 이상으로 (Glc)₄가 검출되면 신생아 피험체가 질병을 앓는 것으로 확인된다.

신생아 피험체에서 폼페병을 스크리닝하는 바람직한 방법은, 신생아 피험체로부터 수집한 혈액 시료 내에서 (Glc)₄의 농도를 정량 또는 결정하는 단계를 포함하는데, 생물학적 시료 내에서 기준치 이상으로 (Glc)₄가 검출되면 신생아 피험체가 폼페병을 앓는 것으로 확인된다. 바람직하게는, 혈액 시료는 신생아 스크리닝 카드로부터 수집된다. 전술한 바와 같이, 이러한 방법은 GSD-Ⅲ 및 다른 당원축적병들과 같은 다른 질병들을 앓는 신생아 피험체들을 확인할 수도 있다. 본 발명의 방법들의 이러한 특징은 이러한 스크리닝 방법론들의 응용을 손상시키는 것은 아니며, 실제로, 유익한 잇점으로 고려될 수 있다. 다른 한편으로, 예를 들어, 뇨 (예를 들어, 기저귀 재료 조각에서 수집된)와 같은 신생아 피험체로부터의 다른 생물학적 시료들이 이용될 수도 있다.

아래에 더욱 상세하게 서술된, 또 다른 바람직한 구현예에서, 탠덤 질량 스펙트로메트리를 포함하는 방법들이, 질병의 존재에 대한 생마커로서 (Glc)₄를 이용하는, GSD-Ⅱ (및/또는 다른 당원축적병들)에 대한 신생아 스크리닝 프로그램의 일부분으로서 이용된다.

전술한 바와 같이, 신생아 스크리닝의 방법들이 최소한 부분적으로 (전술한 바와 같이) 자동화되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 시료가 일단 HPLC 컬럼 또는 탠덤 질량 스펙트로미터로 로딩되면, 자동화 시스템을 이용하여 데이터가 입력되고 분석되는 것이 바람직하다.

탠덤 질량 스펙트로메트리 (TMS)에 기초한 방법들

TMS는 여기에 서술된 본 발명의 방법들을 수행하는 데에 바람직한 방법이다. 삼중 사중극자 (triple quadrupole) 질량 스펙트로미터를 이용한 혼합물들의 분석을 위한 TMS의 개념은 Yost 및 Enke에 의한 탠덤 사중극자 질량 스펙트로메트리로부터 비롯되었다 (In: Tandem Mass Spectrometry, F.W. McLafferty (Ed.), Wiley & Sons, New York, (1983), pp. 175-195). 유사한 구조형의 화합물들을 선택적으로검출하기 위하여, 통상적인 생성물 이온으로 단편화되는 분자 종들을 확인하기 위한 전구체 이온 스캔 기능 (precursor ion scan function) 또는 통상적인 단편을 상실하는 이온들을 확인하기 위한 일정 중성자 상실 스캔 기능 (constant neutral loss scan function), 또는 선택된 전구체 및 생성물 이온들만이 검출되는 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring)이 이용된다. 정밀 검사 및 분석 이전에 생물학적 기질에 안정한 동위 원소-표지된 유사체들과 같은, 적당한 내부 표준물들을 첨가하는 것은 타겟 분석물들의 정확한 정량을 용이하게 한다.

이에 제한되는 것은 아니지만, 삼중 사중극자 질량 스펙트로메트리 및 사중극자와 TOF MS를 조합한 혼성 질량 스펙트로메트리 방법들을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 적당한 TMS 방법이 이용될 수 있다. 이온 트랩들 (ion traps) 및 이온 시클로트론 공명 질량 스펙트로미터들 (ion cyclotron resonance mass spectrometers)이 또한 이용될 수 있다.

TMS는 신생아 스크리닝 프로그램들에 특히 적합하다. 아미노산들 및 아실카르니틴들 (acylcarnitines)을 정량할 수 있는 능력 하나만으로도 20 가지 이상의 대사 질병들을 인식할 수 있다. 과거의 합동 연구에서, PKU (Chace 등., (1993)Clin. Chem. 39:66), MSUD (Chace 등., (1995)Clin. Chem. 41:62), 고메티오닌혈증 (hypermethioninemias) (Chace 등., (1996)Clin. Chem. 43:2106), 및 중간-사슬 아실-coA 데히드로게나아제 결핍증 (medium-chain acyl-coA dehydrogenase deficiency) (MCAD) (Chace 등., (1997)Clin. Chem. 43:2106) 모두가 신생아 시기에 TMS에 의하여 신뢰성 있게 검출될 수 있는 것으로 확인되었다 (Sweetman,(1996)Clin. Chem. 42:345 참조). 분석물들은 시료 혼합물이 유동 용매로 주입됨에 따라 비월 스캔 기능 (interlaced scan function)을 이용하는 TMS에 의하여 동시에 정량된다. 96-웰 형태로 시료들을 준비 및 분석하고, 자동화된 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결과들을 해석하는 뱃치 (batch) 방법이 보고되었으며, 이는 하루에 1000개까지의 시료들을 분석할 수 있는 능력을 보여 주었다 (Rashed 등, (1997)Clin. Chem. 43:1129). TMS를 이용한 신생아 스크리닝은 다양한 분야에서 시행되고 있다.

본 발명자들이 인식하는 한도 내에서는, 여기에 기재된 HPLC 및 TMS 연구들은 폼페병을 앓고 있는 피험체들로부터의 혈장 (또는 다른 혈액-유래) 시료들에서 증가된 (Glc)₄의 농도를 보고하는 최초의 것이다. 또한 여기에 기재된 사항들은, (Glc)₄를 생마커로 사용하여 폼페병을 스크리닝하는 최초의 TMS 프로토콜, 특히, 최초의 그러한 신생아 스크리닝 프로그램이다.

따라서, 본 발명은 또한 TMS에 의하여 생물학적 시료 내에서 (Glc)₄의 농도를 정량 또는 결정하는 방법을 제공한다. 시료 내의 올리고당들은 분석 이전에 당업계에 공지된 임의의 방법에 의하여, 바람직하게는, 파라-아미노벤조산 (PABA) 유도체들 (예를 들어, 부틸-PABA) 또는 2-아미노아크리돈으로 유도체화될 수 있다. 유도체들의 단편화를 조사하여 TMS에 대한 가장 특이적이고 민감한 스캔 기능을 결정한다. 예를 들어, 본 발명자들은 (Glc)₄의 부틸-PABA 유도체들이, 부틸-삼중 사중극자 질량 스펙트로미터를 구비한 일렉트로스프레이 이온화-TMS (electrosprayionization-TMS, ESI-TMS)를 이용한 다중 반응 모니터링에 의하여 m/z 866에서 m/z 509로의 전이를 관찰함으로써 검출될 수 있다는 것을 밝혀 내였다. 당업자라면 다른 유도체화 방법들이 사용될 수 있고, 적당한 스캔 기능들이 이러한 대체 (Glc)₄유도체들을 검출하는 데에 사용될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 마찬가지로, ESI에 대한 대체 방법으로서 많은 대체 이온화 방법들이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Matrix Assisted Laser Desorption Ionization; MALDI).

특정 구현예들에서, 분석물은, 전술한 바와 같이, TMS 분석 이전에 농축된다. (Glc)₄는, (Glc)₄를 특이적으로 인식하는 항체가 접합된 상자성 비드 (paramagnetic beads)와의 면역결정화 (immunoprecipitation)에 의하여 농축되는 것이 바람직하다. 이후 (Glc)₄는 적당한 용매를 사용하여 비드로부터 용출될 수 있다. 통상적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 농축 단계는 유도체화 이전에 수행된다. 다른 바람직한 구현예들에서, 관심 대상이 되는 다른 분석물들이 동일한 시료로부터 면역정제될 수 있다. 예를 들어, 각각의 비드가 대사 질병의 특징인 다른 분석물에 특이적인 항체들을 담지하고 있는, 그러한 비드들의 혼합 집단이 시료에 가해질 수 있다. 이러한 방식으로, 동일한 시료가 여러 가지의 유전성 대사 질병들을 스크린하는 데에 사용될 수 있다.

다른 한편으로, (Glc)₄는 크기 배제에 기초를 둔 방법들을 이용하여 농축될 수 있다.

더욱이, 간섭하거나 또는 바람직하지 못한 물질들을 감소시키거나 제거하기위하여 "클린-업 (clean-up)" 또는 전처리 (pretreatment) 단계가 이용될 수도 있다. 예를 들어, 생물학적 시료 내 (Glc)₄에 대한 글루코오즈의 비율이 상대적으로 높은 경우에는 (예를 들어, 2:1 또는 그 이상인 경우), TMS에 의한 분석 이전에 시료 내의 글루코오즈 농도를 감소시키는 것이 바람직하다. 시료 내 글루코오즈의 농도는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의하여 감소될 수 있다. 한 가지 예로서, 바람직한 방법은, 통상적으로 유도체화 이전에 시료를 효소로 처리하여 글루코오즈를 제거하는 것이다. 예를 들면, 시료는 생물학적 시료로부터 글루코오즈를 감소 또는 제거하기 위하여 글루코오즈 옥시다아제로 처리될 수 있다. 효소에 의한 처리가, 바람직하게는, (Glc)₄테트라당을 분해하여서는 아니되며, 또는 분해하더라도 미소량에 그쳐야 한다. 다른 한편으로, 글루코오즈는 분리 (예를 들어, 크로마토그래피) 기술들을 이용하여 (Glc)₄테트라당으로부터 분리될 수 있으며, 이는 일반적으로 유도체화 단계에 이어서 수행된다. 이를 설명하면, 유도체화 단계 이후에, 유도체화된 글루코오즈는 액상 크로마토그래피 (예를 들어, 역상)를 이용하여 유도체화된 (Glc)₄로부터 분리될 수 있다.

표준물이 분석물과 동일한 조건 하에 놓이도록 하기 위하여, 조작 이전에 내부 표준물 (internal standard)이 일반적으로 시료에 가해진다. 임의의 적당한 내부 표준물이 사용될 수 있다. (실시예에서 서술된 바와 같이) +6 Da의 질량 이동을 제공하기 위하여 글루코오즈 잔기들 중의 하나가 [U-¹³C] 표지된 글루코오즈에 의하여 치환된 (Glc)₄동족체들이 적당하고 바람직하다. 내부 표준물은 기지의 양 만큼 시료에 가해진다. 시료 내의 (Glc)₄와 내부 표준물에 의하여 발생된 신호들의 비율에 따라 보정곡선 (calibration curve)을 이용하여 시료 내 (Glc)₄의 출발량을 결정할 수 있다. 보정곡선은 고정된 동일한 양의 내부 표준물을 이용하여 여러가지 기지의, (Glc)₄표준물 농도들에 대해 얻은 신호 비율 (내부 표준물에 대한 (Glc)₄의 신호 비율)의 그래프 (plot)이다.

다른 바람직한 내부 표준물은 중수소 표지된 글루코오즈 테트라머이다.

생물학적 시료에서 (Glc)₄를 정량 또는 결정하기 위한 본 발명의 바람직한 방법은: (1) 생물학적 시료를 수집하는 단계; (2) 기지량의 적당한, 안정한 동위원소-표지된 표준물을 가하는 단계; (3) 선택적으로, 시료 내의 (Glc)₄를 자화된 비드와의 면역결정화법에 의하여 농축하고, 적당한 용매를 이용하여 비드로부터 용출시키는 단계; (4) 글리칸들을, 예를 들어 부틸-PABA 또는 2-아미노아크리돈으로 유도체화 하는 단계; 및 (5) TMS를 이용하여 (Glc)₄를 정량하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 전술한 바와 같이, 간섭하는 글루코오즈 신호들은 단계 (4) 이전의 효소적 처리 또는 단계 (5) 이전의 크로마토그래피 방법에 의하여 감소될 수 있다.

바람직하게는, [U-¹³C] 표지된 글루코오즈 테트라머가 TMS 분석에 대한 내부 표준물로서 사용된다.

전술한 방법은, 전술한 본 발명의 스크리닝 및 모니터링 방법들의 바람직한구현예들에서 이용될 수 있다. 전술한 바와 같이, 그러한 방법들은 부분적으로 또는 전적으로 자동화되는 것이 바람직하다.

TMS에 기초하는 방법들은 신생아 스크리닝 카드들로부터의 건조 혈반들에서 (Glc)₄를 정량하거나 또는 결정하기에 특히 적합하다. 이러한 구현예에 따르면, 상기 방법은 적당한 용매 (예를 들어, 수성 용매 또는 수성/유기 혼합물)를 이용하여 건조 혈반으로부터 올리고당들을 추출하는 단계를 더 포함한다. 다른 한편으로, TMS는 (예를 들어, 필터 페이퍼 또는 기저귀 재료 상의) 건조 뇨 시료에서 (Glc)₄를 정량하거나 그 존재를 결정하는 데에 이용될 수도 있다.

따라서, 특히 바람직한 구현예로서, 본 발명은: (1) 혈액 시료, 통상적으로 신생아 스크리닝 카드 (예를 들어, 필터 페이퍼) 상의 건조 혈반의 형태인 혈액 시료를 제공하는 단계; (2) 용매를 사용하여 건조 혈반으로부터 올리고당을 추출하는 단계; (3) 각각의 시료에 기지량의 적당한 안정한 동위원소-표지된 내부 표준물을 가하는 단계; (4) 올리고당을 유도체화 하는 단계 (예를 들어, 부틸-PABA로); (5) 특정 스캔 기능을 이용하여 TMS에 의하여 (Glc)₄유도체를 분석하는 단계; (6) 유도체화된 (Glc)₄에 의하여 발생되는 신호와 유도체화된 내부 표준물에 의하여 발생된 신호를 비교함으로써 시료 내의 (Glc)₄를 정량 또는 결정하는 단계; 및 (6) (전술한 바와 같이) 기준치보다 더 높은 시료내 (Glc)₄농도에 기초하여 그러한 피험체들이 폼페병을 앓는 것으로 추정적으로 확인하는 단계를 포함하는, 신생아 피험체에서폼페 질환을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명은 전술한 바와 같이, 선택적으로 분석물 농축 단계들 및 글루코오즈 제거 단계들을 더 포함할 수도 있다.

위에서 본 발명에 대하여 서술한 바와 같이, 본 발명은 특정 실시예들을 참조하여 아래에서 설명될 것이지만, 이러한 실시예들은 오직 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

재료 및 장치

α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc{(Glc)₄}, 말토테트라오즈 (M4), 말토펜타오즈 (M5), 말토헥사오즈 (M6), 말토헵타오즈 (M7), 셀로펜타오즈 (C5), 소듐 시아노보로하이드리드 (NaBH₃CN), 벤조 무수물, 부틸-4-아미노벤조산 (BAB), 1-페닐-3-메틸-5-피라졸론 (PMP), 및 2'-푸코실락토오즈는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 2-아미노아크리돈 (AMAC)은 Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR)로부터 구입하였다. 메탄올, 아세토니트릴 (HPLC 급), 아세트산 및 염산은 VWR Scientific products (Atlanta, GA)로부터 구입하였다. 다른 모든 시약들은 분석급 (analytical grade)이었으며, 상업적으로 입수가능하였다.

모든 HPLC 용매들은 여과되었으며 (0.2㎛ 막), 사용 바로 전에 가스를 제거하였다. PMP는 사용 전에 메탄올로부터 재결정화 되었다. Sep-PakVac C18 카트리지들 (100 mg) 및 YMC-Pack Pro C₁₈컬럼 (250 ×4.6 mm I.D., 5 ㎛)은 Waters (Franklin, MA)로부터 구입하였다. HPLC 시스템은 Waters 626 펌프, 486 튜너블 광도 검출기 (tunable absorbance detector), 717 플러스 자동샘플러 (plus autosampler), 및 600S 콘트롤러 (Waters, Milford, MA)를 구비하였다. 질량 스펙트럼 분석은 Hewlett-Packard 이원 펌프 (binary pump) 및 Gilson 215 액체 조정기 (liquid handler)를 구비한, Quattro-LC 전기스프레이 이온화 삼중 사중극자 탠덤 질량 스펙트로미터 (electrospray ionization triple quadrupole tandem mass spectrometer, ESI-MS/MS), (Micromass Inc., Beverly, MA) 상에서 수행하였다. 내부 표준물의 합성을 위하여 사용된 동결건조된 재조합 TVA Ⅱ는 Takahashi Tonozuka 박사 (Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, Tokyo)로부터 기증 받았다.

실시예 2

(Glc) ₄ 에 대한 HPLC 분석

HPLC 분석을 위한 시료 준비.

효소 치환 치료법 (enzyme replacement therapy)을 받고 있는 환자들로부터 시료를 분리하는데 있어, 혈장 및 6 h 뇨 시료들을 치료법 개시 전 및 치료법 도중 매 2 주 마다 수집하였다. 뇨 및 혈장 시료 모두 (Glc)₄수준을 테스트하기 전에 -20 ℃에서 동결시켰다.

뇨 시료들을 원심분리하였고, 50 ㎕의 상등액을, 내부 표준물로서 10 ㎍의셀로펜타오즈 (C5)를 함유하는 탈이온화된 물 10 ㎕와 혼합하였다. 기지량의 (Glc)₄를 함유하는 탈이온화된 물 10 ㎕를 C5 10 ㎍을 포함하는 대조군 뇨 50 ㎕ 분획에 가함으로써 뇨 표준물을 제조하였다.

혈장 또는 혈청 (200 ㎕)을 원뿔형 유리 테스트 튜브에서 내부 표준물 (C5) 1 ㎍ 및 500 ㎕ 메탄올과 혼합하고, 6,000 rpm에서 4 분간 원심분리시켜 변성된 단백질들을 침전시켰다. 상등액을 질소 하에서 건조시켜, 탈이온화된 물 60 ㎕에 재구성하였다. 혈장 표준물들은 기지량의 (Glc)₄를 혈장 대조군 시료 200 ㎕ 분획에 가함으로써 제조하였다.

(Glc) ₄ 의 HPLC 분석을 위한 올리고당들의 유도체화.

올리고당들은 Poulter 및 Burlingame의 방법 ((1990)Methods Enzymol. 193,661-689)의 변형 방법을 사용하여, 부틸-p-아미노벤조산염 (BAB)으로 유도체화 시켰다. 필요에 따라 새롭게 제조되는, 유도체화 시약은 BAB (54 mg), NaBH₃CN (47 mg), 아세트산 (0.11 mL), 및 메탄올 (1.76 mL)를 포함하였다. 전술한 바와 같이 제조된 각각의 시료에 시약 140 ㎕를 가하였다. 시료 혼합물들을 80℃에서 45 분간 배양한 다음, 실온으로 냉각하였다. 0.9 ml의 15 % 아세토니트릴을 가하고 혼합물을 10 초 동안 혼합 (vortex)하였다. 고체상 추출법을 사용하여 유도체화된 올리고당들로부터 미반응 시약을 제거하였다. 1 ml 메탄올, 다음으로 1 ml 탈이온화된 물로 미리 조절된 (pre-conditioned) C₁₈카트리지에 시료를 로딩하고, 1 ml의 15 % v/v 아세토니트릴/물로 세척하였다. 다음으로, BAB-표지된 올리고당들을 1ml30 % v/v 아세토니트릴/물로 용출시켰다. 뇨 시료에 대하여는, 용출액을 바로 HPLC로 분석하였다. 혈장 시료에 대하여는, 용출액을 질소 기체 하에서 건조시키고, 분석 이전에 150 ㎕ 30 % v/v 아세토니트릴/물에 재구성하였다.

올리고당들의 2-아미노아크리돈 (AMAC), PMP, 및 과벤조일 (perbenzoyl, PB) 유도체들은 공지의 방법들에 따라서 제조하였다 (Okao, G.,등.(1996)Anal. Chem. 68,4424-4430; Zopf, D., and Fu, D., (1999)Anal. Biochem. 269,113-123; Daniel, P. F., 등. (1981)Carbohydr. Res. 97,161-180).

HPLC 분석 및 정량.

BAB-표지된 올리고당들은 YMC-Pack Pro C₁₈컬럼에서 유속을 0.5 ml/min로 하여 분리하였으며, 용출액의 자외선 흡광도를 304 nm에서 모니터 하였다. HPLC 용출은 6 N HCl을 이용하여 pH 4 내지 6으로 조정된, 30 % 아세토니트릴 및 70 % 0.01 mM 테트라부틸암모늄 클로라이드를 이용하여 30 분 동안 등용매 (isocratic)상태로 진행되었다. 32 분이 되는 때에 아세토니트릴을 50%로 증가시키고, 38 분이 되는 때에 초기 조건으로 복귀시킴으로써, 과량의 미반응 BAB 및 다른 불순물들이 컬럼으로부터 세척되었다. 총 분석 시간은 시료 당 45 분이었다. (Glc)₄및 내부 표준물 (C5)의 피크 면적들을, 적절한 곳에서 기저선 보정으로 자동적으로 계산하고, 이러한 면적들의 비율을 (Glc)₄를 정량하는 데에 이용하였다.

표준물들 및 HPLC 분획들의 ESI-MS/MS 분석.

전체 시료 내의, 또는 HPLC 분리 이후에 분획으로서 수집된, BAB 올리고당유도체들에 대해 탠덤 질량 스펙트로미터 상에서 ESI-MS 및 ESI-MS/MS로 분석하였다. 시료 주입은 20 ㎕ Rheodyn 루프를 통하여, 15 ㎕/분의 유속의 아세토니트릴:물 (1:1; v/v)의 캐리어 (carrier) 용매 내로 수행되었다. 캐필러리 (capillary) 및 콘 (cone)의 셋팅은 각각 3.50 kV와 78 - 95 V이었고, 쏘오스 블록 (source block) 및 탈용매화 (desolvation) 온도는 각각 80 및 150 ℃이었다. 충돌-유도 해리 실험 (collision-induced dissociation experiments)을 위해서는 충돌 에너지 45 내지 77 eV 및 기체 세포 압력 3.5 ×10^-3mBar가 이용되었다. 질량 스펙트럼은 100 amu/s의 스캔 속도로 양성 이온 모드로 획득하였다.

실시예 3

HPLC에 의한 (Glc) ₄ 의 분리 및 분석

4가지의 유도체들이, 상기실시예 2에서 서술된 바와 같은, 동일한 고-해상도 액체 크로마토그래피 컬럼을 사용한 HPLC에 의해 올리고당들을 정량하는데 적합한지에 대하여 비교되었다. 그들은 부틸-p-아미노벤조산염 (BAB), 2-아미노아크리돈 (AMAC), 1-페닐-3-메틸-5-피라졸론 (PMP), 및 벤조 무수물이었다. BAB 유도체화가, 그 민감성, 재현성, 고해상도, 단순성 및 저비용의 잇점에 기초하여, 이러한 응용을 위하여 궁극적으로 선택되었다. 이러한 비교 실험에서, AMAC 유도체화는 매우 높은 민감성을 갖지만, 뇨에서 다량으로 발견되는 락토오즈로부터 (Glc)₄를 분리할 수가 없었으며, PMP 유도체화는 좋은 해상도를 갖지만 상대적으로 민감도가 떨어졌다. 과벤조일화는 좋은 해상도 및 우수한 민감도를 갖지만, 너무 시간을 소요하는 것으로 판명되었다. 아노머 (anomer)의 환원 및 완전한 과벤조일화를 포함하는, 전체 공정에 30 시간이 소요되었으며, 이는 단 2 시간이 소요되는 BAB 방법과는 크게 비교되었다. 더욱이, BAB 유도체는 4 ℃에서 수 주일 동안 안정하였으나, PMP 및 AMAC 유도체들은 훨씬 더 불안정하였다.

뇨 및 혈장에서 발견되는 다른 올리고당들로부터의 BAB-표지된 (Glc)₄의 분리는, 용출 용매 및 유속의 적절한 선택 및 아무런 질병도 갖지 않는 것으로 알려진 다양한 연령의 어린이들로부터 많은 수의 시료들을 분석함으로써 (대조군들) 달성되었다. 방법의 특이성은, ESI-MS/MS에 의하여 선택된 환자 시료들로부터의 분획들을 분석함으로써 결정된, (Glc)₄의 잔류 시간 (retention time)에서 기지의 간섭 신호들의 부존재에 의하여, 실질적으로 보장되었다. 다른 올리고당들로부터 (Glc)₄의 분리를 보여 주는 정상 뇨 크로마토그램의 예를도 1 (패널 A)에 도시하였다. 비교를 위하여 (Glc)₄에 대하여 훨씬 더 큰 신호를 보여 주는 GSD-Ⅱ 환자의 뇨를 포함시켰다(도 1, 패널 B). 확인된 다른 뇨 올리고당들은도 1에 표지되어 있다(패널 A 및 패널 B). 환자 뇨에서의 상대적으로 낮은 글루코오즈 신호는 폼페병의 저혈당증 (hypoglycemia) 표현형과 부합되는 것이라는 점은 주목할 만하다 (Chen, Y.T. and Burchell, A., (1995)inThe Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7^thEdition, Volume 2 (Scriver, C.R., Beaudet, A.L., Sly, W.S., and Valle, D. Eds), pp. 935-965, McGraw-Hill, New YORK). 정상 대조군(도 2, 패널 A)및 GSD-Ⅱ 환자(도 2, 패널 B)에서 혈장 (Glc)₄수준의 비교 또한 수행되었다. 간결성을 위하여 커다란 글루코오즈 신호가 배제되었다.

BAB 방법은 말토테트라오즈 (M₄)로부터 (Glc)₄를 분리할 수 없다는 것을 염두에 두어야 한다. 본 발명자들은 PMP 유도체들의 분석에 의하여 선택된 대조군들 및 환자들에서 M₄가 부존재하지 않는다는 것을 입증하였으며, 이는도 3에 나타낸 바와 같이, (Glc)₄로부터 M₄의 완전한 분리를 가능하게 한다. 이 방법에 기초하여, 뇨 내의 M₄함량은 1 ㎍/ml 이하로 평가되었으며, 이는 BAB 방법의 검출 한계 이하이고, 따라서 무시할 수 있는 양으로 여겨진다.

실시예 4

(Glc) ₄ 에 대한 HPLC 방법의 민감성 및 특이성.

신호-대-노이즈 비율 (signal-to-noise ratio)이 3 이상인 것으로 정의되는, (Glc)₄에 대한 방법의 절대적 민감도는, 단일 HPLC 주입에 대하여 3 ng (4.5 pmol)이었다. 뇨 시료에 대하여는, 1 ml의 총 시료 부피로부터 50 ㎕의 주입에 기초할 때, 검출 한계가 1.2 ㎍/ml이었고, 혈장에 대하여는, 총 150 ㎕로부터 100 ㎕의 주입에 기초할 때, 검출 한계가 0.02 ㎍/ml이었다. 이러한 민감도는, 정상 대조군 수치에 기초할 때, 적당한 수준 이상이었다 (표 1 참조).

[표 1}

정상 대조군들의 뇨 및 혈장 내 (Glc) ₄ 농도 ¹

뇨 (mmol/mol 크레아틴)

나이 (연령)	n	평균	S.D.2	최대값3
< 11 - 55 - 1010 - 20> 20	2020181220	8.93.620.90.4	8.23.82.11.00.3	26.912.55.73.81.0

혈장 (㎍/mL)

나이 (연령)	n	평균	S.D.2	최대값3
< 11 - 55 - 1010 - 20>20	2020131112	0.20.150.150.130.08	0.260.100.100.100.06	0.370.350.360.320.18

¹5가지 연령군에 대하여 테스트하였다.

²표준 편차 (Standard Deviation)

³해당하는 연령군에서 측정된 최대 (Glc)₄농도

실시예 5

(Glc) ₄ 에 대한 HPLC 분석의 정확도 (Accuracy) 및 정밀도 (Precision)

시료 준비 및 분석 동안에 발생하는 손실을 고려하여 내부 표준물 (C5)을 도입하였다. 가해진 (Glc)₄농도에 대한 C5 피크 면적 비율에의 (Glc)₄의 뇨 표준물 곡선은 15 ㎍/ml까지 선형이었고, 이는 뇨 시료 중의 300 ㎍/ml 농도에 해당하는 것이었다. 혈장 표준물 곡선은 1 ㎍/ml까지 선형이었고, 이는 혈장 시료 중의 7.5 ㎍/ml 농도에 해당하는 것이었다. 선형 회귀 (linear regression)의 r²값은 > 0.999이었다. 방법의 정확도와 정밀도는 보정기의 중복 분석 (replicate analysis of calibrators)에 따르면 임상 분석에 대해 허용 가능한 한계 이내이었다(표 2). 방법의 재현성은 일주일 간격으로 동일한 품질을 갖는 대조군 시료들을 분석함으로써 결정되었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 결과들은 뇨 및 혈장 대조군 시료들에 대하여 10% 이내의 허용치 안에 있었다.

[표 2]

이일자(interday) (Glc) ₄ 분석의 정확도 및 정밀도

보정기들에 따른 경우
뇨 (n=4)	혈장 (n=4)
참값(㎍)	평균(㎍)	cv(%)	오차(%)	참값(㎍)	평균(㎍)	cv(%)	오차(%)
0.51.02.57.515	0.531.022.577.3815.02	9.347.134.522.421.91	5.21.482.63-1.590.13	0.050.10.20.51.0	0.050.110.210.501.01	8.767.766.583.552.93	-2.566.985.55-0.151.38

품질 관리(Quality Control)들에 따른 경우
뇨 (㎍)	혈장 (㎍)
저 QC (n=12)	고 QC (n=12)	저 QC (n=4)	고 QC (n=10)
평균0.83	cv(%)8.3	평균5.82	cv(%)5.9	평균0.076	cv(%)10.1	평균0.65	cv(%)9.7

cv (%): 100 % * 표준 편차/평균

오차 (%): 100 % * 오차/평균

실시예 6

HPLC에 의해 분리된 올리고당들의 ESI/MS/MS에 의한 확인

HPLC 크로마토그래피 분리가 적당하다고 생각되는 경우에는, 선택된 환자 뇨 시료들에서 (Glc)₄의 존재를 확인하기 위하여 ESI-MS를 이용하였다. 환자 및 대조군 시료들의 HPLC 분석 도중에 수집된, (Glc)₄에 해당하는 분획들은 ESI-MS에 의하여 분석되었다. BAB-표지된 글루코오즈 테트라머의 소듐 부가생성물 (adduct)에 해당하는, 이온 질량 m/z 866이 지배적이라는 것에 의하여 결정된 바와 같이, 대부분은 테트라글루코오즈에 대하여 균질한 것으로 발견되었다. 방법 개발 도중에 몇몇 영아 대조군 뇨 시료들에서 (Glc)₄의 양이 HPLC에 의하여 분석하였을 때, 기대치보다 높게 관찰되었다. ESI-MS에 의한 (Glc)₄분획의 분석은, 그것이 m/z 688의 화합물과 공동-용출 (co-eluted)된다는 것을 나타내었다. ESI-MS/MS 분석을 이용한 결과, 이러한 화합물은 데옥시헥소오즈-헥소오즈-헥소오즈 PAB 유도체의 소듐 부가생성물인 것으로 밝혀졌다. 이러한 화합물이 인간 모유의 성분인, 2'-푸코실-락토오즈일 것이라는 가정은 (Chaturvedi, P, 등. (1997)Anal. Biochem. 251,89-97), 진정 표본 (authentic specimen)의 HPLC 및 ESI-MS/MS 분석에 의하여 확인되었다. 다음으로, HPLC 방법은 (Glc)₄로부터 이러한 화합물을 분리하기 위하여 적당하게 변형되었다. 이것은 분자-특이적 (molecularly-specific)이지 않은 검출기에 의존하는 임상적 HPLC 분석의 개발에 있어서 질량 스펙트로메트리의 가치를 강조하는 것이다.

ESI-MS/MS는 (Glc)₄를 이소머 말토테트라오즈 (M₄)로부터 구별 (differentiate)하는 데에도 사용되는데, 이는 이러한 화합물들이 이 분석 조건 하에서는 HPLC에 의하여 분리되지 않기 때문이다. (Glc)₄및 M₄의 Na⁺부가생성물들의 충돌-유도 해리 (Collision-induced dissociation, CID) 결과는도 4에 도시된 단편화 패턴 (fragmentation pattern)을 얻었다. m/z 704 및 542에서의 이온들은 PAB-변형 글루코오즈 잔기 상에 소듐 양이온을 보유하는 비-환원-말단으로부터 글루코오즈 잔기들을 연속적으로 상실함으로써 발생되는 반면에, m/z 509에서의 이온은 비-환원-말단 상에 소듐 양이온을 보유하는 PAB-글루코오즈 잔기의 상실로부터 발생된다. m/z 542에 대한 단편 m/z 509의 평균 (±2 표준 편차 (SD)) 강도 비율은 (Glc)₄스펙트럼(도 4, 패널 A)에서 1.57 (±0.11)인 것으로 결정되었고, M4 스펙트럼(도 4, 패널 B)에서 0.65 (±0.05)인 것으로 결정되었다. 비율들에서 오차는 3 주간에 걸쳐 수행된 7 번의 반복 분석들에 대하여, (Glc)₄가 3.6 %, M4가 4.3 %로 나타났다. 이러한 데이터들은 (Glc)₄내의 환원-말단으로부터의 잔기의 상실들이 비-환원-말단으로부터의 잔기의 상실들보다 선호된다는 것을 암시하며, 반면에 M₄에대하여는 그 반대임을 암시한다. 6 명의 다른 환자들의 뇨 내 헥소오즈 테트라머로부터의 m/z 542 단편 이온들에 대한 m/z 509의 비율은 1.64 ±0.44 (평균 ±2)이었고, 이는 (Glc)₄표준물의 그것에 견줄 만한 것으로서, 테트라머는 실제로 주로 (Glc)₄라는 것을 나타낸다. 일 예를도 4 (패널 C)에 나타내었다.

ESI-MS/MS는 더 나아가, GSD-Ⅱ를 앓고 있는 일부 환자들의 뇨 내에서 관찰되는 더 큰 올리고당들을 알아내는 데에 이용된다. 그와 같은 환자로부터의 총 BAB-유도체화된 뇨에 대한 ESI-MS 분석의 일 예를도 5에 나타내었다. m/z 866, 1028, 1190 및 1352의 이온들은 각각 4, 5, 6 및 7개의 단위들을 갖는 헥소오즈 올리고머들의 소듐 부가생성물에 해당된다. 이러한 이온들에 대한 신호들은 대조군 뇨 시료들에서 훨씬 더 낮거나 또는 존재하지 않았으며, 이는 그들이 모두 글리코겐으로부터 유래된 것이라는 것을 암시한다. ESI/MS/MS를 이용한 이러한 부가생성물들의 분석은 M₅, M₆및 M₇표준물들로부터 유래된 것들과 동일한 질량들을 갖는 생성물 이온들을 확인시켜 주었으며, 이는 그들이 헥소오즈 올리고머들이라는 것을 확인시켜 준다. 그러나, (Glc)₄및 M₄에 있어서, 특정 이온들의 강도에 있어서 차이가 있었으며, 이를표 3에 요약하였다. 뇨 헥소오즈 올리고머들과 M₅, M₆및 M₇사이의 주된 차이점들은, 각각 m/z 542에 대한 m/z 509, m/z 704에 대한 m/z 671 및 m/z 866에 대한 m/z 833의 비율들이다. 이러한 데이터는 뇨 헥소오즈 올리고머들에서, 환원-말단으로부터의 상실이 선호된다는 것을 나타내며, 이는 이러한 단편화 경로로부터의 생성물 이온들이 비-환원-말단으로부터 유래된 생성물 이온들에 비하여 더 높은 강도를 갖는 것에 의하여 뒷받침된다. 이러한 결과들은, 환자 뇨 내의 헥소오즈 올리고머들이, 6 내지 8개의 잔기를 포함하며, GSD-Ⅱ 및 GSD-Ⅲ를 앓고 있는 환자들의 뇨에서 확인된, 글루코오즈 올리고머들에 대하여 이전에 보고된 바와 같이 (Lennartson,등.(1978)Eur. J. Biochem. 83,325-334), 최소한 하나의 α-1→6 연결을 포함한다는 것을 암시한다.

[표 3]

ESI-MS-MS에 의하여 분석한, GSD-Ⅱ 환자들의 뇨 내에 존재하는 헥소오즈 올리고머들 및 BAB-표지된 말토계열 표준물의 단편 강도 비율

올리고당	m/z 비율 A	강도 비율	m/z 비율 B	강도 비율
M5헥소오즈 펜타머M6헥소오즈 헥사머M7헥소오즈 헵타머	671/866671/866833/1028833/1028995/1190995/1190	0.781.70.693.00.651.2	671/704671/704833/866833/866995/1028995/1028	0.340.960.501.71.01.94

환원 말단에서의 BAB-표지된 헥소오즈의 상실은, 각각, 헥소오즈 펜타머들, 헥사머들, 및 헵타머들의 m/z 671, 833, 및 995 단편 이온들을 생성한다. 이러한 이온들의:

A. 비-환원 말단으로부터 하나의 잔기를 상실함으로써 (각각, m/z 866, 1028, 및 1190),

B. 비-환원 말단으로부터 두개의 잔기들을 상실함으로써 (각각, m/z 704, 866, 및 1028), 생산된 것들에 대한 비율들을 나타내었다.

이 비율들은 말토계열 표준물들에 대한 3 회 반복 주입 평균과, 뇨 올리고머들에 대한 2 명의 다른 환자 시료들의 평균에 의한다.

실시예 7

뇨 및 혈장 내 (Glc) ₄ 의 농도

연령 범위에 의하여 분리된, 정상 대조군들의 뇨 및 혈장 내 (Glc)₄농도들을 표 1에 요약하였다. 연령 증가에 따라 (Glc)₄분비가 감소하는 반비례 관계가 성립하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 혈장 보다는 뇨에서 정량적으로 더욱 뚜렷하였다. GSD-Ⅱ를 앓고 있는 환자들의 뇨 및 혈장 내 (Glc)₄의 농도들 또한 표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 연령-의존적인 것으로 나타났다.

[표 4]

당원축적병 환자들의 뇨 내 (Glc) ₄ 수준들

상태	나이(연령)	(Glc)4(mmol/mol Cr1)	(Glc)4 2(정상 범위)(mmol/mol Cr1)
GSD ⅡGSD ⅡGSD ⅡGSD ⅡGSD ⅡGSD Ⅱ	0.10.20.50.50.80.9	34.445.545.631.517.633.1	8.9 ±8.2
GSD ⅡGSD ⅡGSD ⅡGSD ⅡGSD Ⅱ	2.53.04.04.05.5	54.752.227.292.873.4	3.6 ±3.8
GSD Ⅱ	11	31.0	2.0 ±2.1
GSD ⅡGSD ⅡGSD ⅡGSD ⅡGSD ⅡGSD Ⅱ	203140454561	33.025.02.24.88.86.5	0.4 ±0.3
GSD ⅠaGSD Ⅰa	26	4.84.8	3.6 ±3.8
GSD Ⅰb	19	0.8	2.0 ±2.1
GSD ⅢaGSD ⅢGSD Ⅲb	459	18.297.623.9	3.6 ±3.8
GSD ⅢaGSD ⅢGSD Ⅲb	283946	4.81.82.1	0.4 ±0.3

¹Cr = 크레아틴 (Creatine)

²해당되는 연령군들에서 정상 개체들의 뇨 (Glc)₄수준 (평균 ±표준 편차).

[표 5]

당원축적병 Ⅱ형 환자들의 혈장 내 (Glc) ₄ 수준들

나이	(Glc)4(㎍/mL)	(Glc)4 1(정상 범위)(㎍/mL)
0.10.20.50.80.50.9	0.71.191.134.82.242.0	0.2 ±0.26
2.52.53.04.04.0	0.892.161.470.512.15	0.15 ±0.1
5.5	0.37	0.15 ±0.1
20314044454561	0.870.670.120.660.190.170.08	0.08 ±0.06

¹해당되는 연령군들에서 정상 개체들의 혈장 (Glc)₄수준 (평균 ±표준 편차).

뇨 내 (Glc)₄의 분비가 식이 요법 (diet), 단식 상태 (fasting status), 및 육체적 활동 (physical activity)에 의하여 영향을 받는 것으로 이전에 보고된 바가 있다 (Walker, G. J. and Whelan, W. J. (1960),Biochem. J. 76,257-263). 표 1에서 뇨 (Glc)₄수준들은 뇨 크레아틴 농도들에 대하여 정규화 (normalized) 되었다. 시료 수집 도중에 식이 요법 및 육체적 활동 인자들을 조절하기 위한 어떠한시도도 하지 않았다. 그러나, GSD-Ⅱ를 앓고 있는 21 명의 환자들 (영아, 어린이, 및 성인 형태)로부터의 결과들은 혈장 및 뇨 모두의 (Glc)₄의 농도들이 해당 나이의 정상 대조군들의 그것들보다 최소한 계수 (factor) "2" 이상 높은 것으로 나타났다. 표 4는 또한, GSD-Ⅰ 및 GSD-Ⅲ를 앓고 있는 일부 환자들에 대한 뇨 (Glc)₄의 농도를 보여준다. GSD-Ⅲ를 앓고 있는 환자들은 글리코겐을 축적하며, 더 높은 수준의 (Glc)₄를 분비한다. (Glc)₄는 글리코겐의 α-아밀라아제 분해로부터 야기되는 리미트 덱스트린 (limit dextrin)이라는 사실이 생체 외 (in vitro) 실험에서 밝혀진 바 있다 (Walker, G.J. and Whelan, W.J. (1960),Biochem. J. 76,257-263, Ugorski, M.,등.(1983)J. Exp. Pathol. 1,27-38). 레수스 원숭이 (Rhesus monkey)에 글리코겐을 정맥주사면 (Glc)₄의 분비가 증가되는 것으로 나타났다 (Kumlien, J.,등.(1988)Clin. Chim. Acta 176, 39-48). 산 α-글루코시다아제 (GAA)는 글리코겐을 1→4 연결 및 1→6 연결 부위 (분지 부위) 모두에서 분해하는 것으로 보고되었다 (Brown, B. I.등.(1970) Biochem.9,1423-1428). 따라서, GAA의 결핍 (GSD-Ⅱ) 및 가지제거효소 (de-branching enzyme)의 결핍에 의하여 축적된 글리코겐은 비슷한 구조를 가질 수도 있다. 글리코겐-적재 조직들 (glycogen-laden tissues)의 파괴 (breakdown) 및 전환 (turnover)으로 인한, 순환계 내로의 글리코겐 방출의 증가는 혈장 및 뇨 내의 (Glc)₄농도를 증가시킬 것으로 예상된다. GSD-Ⅰ 환자들의 뇨 내 (Glc)₄의 농도들은 대조군 범위 내에 있다. 이것은 GSD-Ⅰ에있어서는, 주요 저장 물질이 글리코겐이라기 보다는 지방이라는 사실에 기인한 것으로 보인다 (Chen, Y. T. and Burchell, A., (1995)inThe Metbolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7^thEdition, Volume 2 (Scriver, C.R., Beaudet, A.L., Sly, W.S., and Valle, D. Eds), pp. 935-965, McGraw-Hill, New York).

실시예 8

임상적 진단을 위한 HPLC 방법의 응용

GSD-Ⅱ 환자들의 혈장 (Glc)₄수준들은 본 명세서에서 최초로 보고되었다. 모든 유아성 발병 및 유년성 발병 환자들은 현저하게 높은 수준들을 갖는 반면에, 성년-발병 GSD-Ⅱ를 앓는 2 명의 환자들은 정상 범위 내에 있었다. 이 실험에서 GSD-Ⅱ 환자들에 대하여 측정된 뇨 (Glc)₄의 농도는 19 내지 821 nmol/mg 크레아틴 (2.2 내지 92.8 mmol/mol 크레아틴)이었으며, 이는 Oberholzer 및 Sewell에 의하여 보고된 바 있는 5 명의 GSD-Ⅱ 환자들로부터의 수치 범위 ((1990)Clin. Chem. 36,1381)에 견줄 만한 것이다. Peelen 등에 의하여 보고된 수치들 (78 내지 324 mmol/mol 크레아틴)은 훨씬 더 높다 ((1994)Clin. Chem. 40,914-921). Lundblad와 그 공동 연구자들은 (Glc)₄농도들을 mg/24 시간의 분비 속도로서 보고한 바가 있다 ((1976)Biomed. Mass SPectrom. 3,51-54). 이것은 (Glc)₄농도 상태에 대한 가장 정확한 데이터를 제공할 수도 있으나, 24 시간 뇨 시료 수집은 임상적 진단셋팅에 있어서 실용적이지 못하다. 본 연구에서 얻어진 결과를 토대로 하면, 폼페병에 대한 높은 임상적 개연성 또는 위험성을 가지고 있는 환자들로부터의 (기지의 크레아틴 수준을 갖는) 뇨반 시료 (spot urine sample)는, 적당한 대조군 연령 범위가 비교를 위하여 사용된다면, 시료 접수 후 24 시간 이내에 추정적 진단을 내리기에 충분하다. 다음으로, 근육 생체검사 또는 피부 섬유아세포들이 전통적인 효소학에 의하여 질병 진단을 확신하기 위하여 추천될 수 있다.

실시예 9

생마커로서의 (Glc) ₄ 의 사용

연구 피험체들.

피부 섬유아세포들 및/또는 근육 내 정상 GAA 활성의 1 % 이하로 감소된 활성을 가짐으로써 유아성 GSD-Ⅱ를 앓는 것으로 입증된 3 명의 유아들이 효소 치환 치료법의 Ⅰ/Ⅱ형 임상 시험을 위한 연구에서 채택되었다. 효소 공급원은 CHO 세포들을 분비하는 재조합 인간 GAA (recombinant human GAA, rhGAA)의 배양 배지로부터 정제된 rhGAA이었다. 연구는 심사 위원회 (institutional review board)에 의하여 승인을 받았으며, 부모의 서면 동의를 받았다. 상세한 환자 특성 및 심장, 폐, 신경 및 운동 기능들의 임상 평가는 임상 결과들을 보고하는 논문에 서술되어 있다 (Amalfitano A,등.(2001)Genet. Med. 3:132). 이러한 3 명의 환자들은 치료 개시 당시에 심각도의 관점에서 서로 다른 임상적 태위 (clinical presentation)를 갖고 있었다. 환자 1은 (Pt1) 생후 4 개월 된 때에 치료되었고, 발육 부진 (failure to thrive)을 동반한, 광범위 심장비대 (massive cardiomegaly), 심각한운동 지연 (severe motor delay), 및 음식섭취 곤란 (feeding difficulty)에 있어서 가장 진전된 상태에 있었다. Pt2는 생후 3 개월 된 때에 치료를 시작하였고, 광범위 심장비대, 중등도 (moderate) 운동 지연 및 음식섭취 곤란 증상을 나타내었다. Pt3는 생후 2 개월 반이 되는 때에 치료를 시작했을 때 질병의 초기 단계에 있었다. Pt3은 현저한 (significant) 운동 지연을 나타내었지만, 심장 비대 증상은 보이지 않았다.

(Glc) ₄ 측정.

치료의 개시 이전 및 치료 도중 매 2 주 마다 혈장 및 6 시간 뇨를 수집하였다. 뇨 및 혈장 시료들 모두를 테스트 이전에 -20 ℃에서 동결시켰다. 뇨 및 혈장 내 (Glc)₄수준들을 상기실시예 2에 서술된 바와 같이 유도체로 BAB를 사용하고 HPLC에 의하여 측정하였다. 정성 분석을 위하여, C5를 각각의 테스트 시료에 내부 표준물로서 가하였으며, 2 개의 대조군 시료들 ((Glc)₄저함량 및 고함량)은 매일 측정되었다.

HPLC 방법을 이용한 질병 진전 및 치료법에 대한 반응의 모니터링.

치료 이전 및 치료 도중에 있는 3 명의 환자들에 대한 뇨 (Glc)₄수준을도 6에 나타내었다. 혈장 내 (Glc)₄의 수준들을도 7에 나타내었다. 혈장 내 (Glc)₄수준들은 치료 개시 당시의 임상적 심각성과 상관 관계가 있었다. 질병이 가장 진전된 단계에 있던 Pt1은 혈장 및 뇨에서 가장 높은 (Glc)₄수준들을 나타내었으며, 반면에 질병이 중간 정도 심각하였던 Pt2는 (Glc)₄함량에 있어서 중간 정도의 증가된 수준을 나타내었다. 가장 완화된 질병 징후들을 보였던 Pt3는 혈장에서만 (Glc)₄의 증가를 나타내었으며, 뇨에서는 정상이었다. 폼페병에 대한 생마커로서, 혈장 내 (Glc)₄측정이 뇨 내 측정보다 더욱 민감도를 지닌 것으로 보인다. 이는 뇨 내 (Glc)₄수준들보다 혈장 내 (Glc)₄의 상승 정도가 더 높다는 사실 및 Pt3는 정상 뇨 수준을 갖는다는 사실로부터 알 수 있다.

치료의 초기 2 내지 3 개월 동안, 3 명의 환자들 모두에 대하여 뇨 및 혈장에서 (Glc)₄수준들은 감소하였다(도 6 및 7). 또한, 감소는 뇨 보다 혈장에서 더욱 현저하였다. 그러나, Pt1 및 Pt2에서의 (Glc)₄수준들은 뒤이어 상승하였으며, 동시에 임상적 쇠퇴 (clinical decline) 및 rhGAA에 대한 항체의 생산이 수반되었다. 항체를 제거하고 혈장반출법 (plasmaphresis)에 대한 내성을 유도하기 위한 시도로서, IVIG, 시톡산 (cytoxan) 및 10 일 동안의 매일 효소 주입은 일시적인 임상적 호전을 가져왔지만, 뒤이어 다시 임상적 쇠퇴가 수반되었고, Pt1에서는 2차 면역-내성 치료법이 필요하였다. (Glc)₄의 수준들과 임상적 경과 및 Pt1에 대한 면역-내성 치료법에 대한 반응 사이에는 상관성이 있었다(도 6 및 7). 임상적 경과와 면역-내성 치료법에 대한 반응 사이의 비슷한 상관성이 Pt2에서도 관찰되었다. 항-rhGAA 항체를 만들어 내지 않았던 Pt3는 정상 심장, 신경 및 운동 기능들을 유지하였다. Pt3에 대한 (Glc)₄수준들은 치료의 초기 2 개월 동안 정상화되었으며, 그 이후에 거의 정상으로 유지되었다. 3 명의 환자들 모두에서 임상적 경과와 (Glc)₄수준들의 상관성은 다시 한번 뇨보다는 혈장에서 더욱 현저하였다. 상기 결과들은 폼페병 환자들에서 (Glc)₄수준들, 특히 혈장 내 (Glc)₄수준들은 질병의 임상적 상태에 대한 지표가 된다는 사실을 강하게 암시한다. 혈액 내 (Glc)₄의 측정은 폼페병에서 전반적인 질병 상태 및 치료법에 대한 치료적 반응을 분석하는 비-침습적인 방법을 제공할 수 있는 것으로 보이며, 따라서 근육 생체 검사를 피할 수 있을 것으로 보인다.

실시예 10

탠덤 질량 스펙트로메트리에 의한 (Glc) ₄ 분석을 위한 안정한 동위 원소-표지된 내부 표준물(Internal Standard, I.S.)의 합성

Tonozuka 및 공동 연구진들의 방법을 이용하여 안정한, 동위 원소-표지된 내부 표준물을 합성하였다 (Tonozuka at al., (1994)Carbohydrate Research 261; 157; Tonozuka 등., (1996)J. Appli. Glycosci. 43:95). 이 방법에서, 삼당 파노오즈 (trisaccharide panose) (Glcα1-6Glcα1-4Glc)의 폴리머인 풀루란 (pullulan)은, [U-¹³C]글루코오즈의 존재 하에서, α-아밀라아제, TVA Ⅱ에 의하여 분해되었다. TVA Ⅱ는 파노오즈 생성물의 트랜스글리코실레이션 (transglycosilation)을 촉매하며, [U-¹³C]글루코오즈를 α1-4 및 α1-6 연결 모두에 부가함으로써, 환원성 말단에 표지된 잔기를 갖는 글루코오즈 테트라머를 형성한다.

100 mg의 풀루란 및 100 mg의 [U-¹³C₆]글루코오즈를 pH 6.9의 50 mM 소듐 시트르산 2ml에 용해하여, 8 mg TVA Ⅱ를 함유하는 pH 6.0의 NaHPO₄완충용액 100 ㎕와 혼합한 다음, 40 ℃에서 5.5 시간 동안 배양하였다. 혼합물을 얼음 상에서 냉각시키고, Amicon Centrifree 30 kDa 분자량 컷-오프 필터를 통하여 2000g에서 2 시간 동안 원심분리하였다. 여과액을 30 ㎛ 입자 크기의 Toyopearl HW-40S (Sulpeco, Bellefonte, PA)로 충진된 겔 여과 컬럼 (170 ×15 cm) 상에서 분별화시켜, 0.5 ml/min의 유속에서 dH₂O로 용출시켰다. 분별화된 분획들을 65:35 아세토니트릴:H₂O 내의 15 mM 암모늄 아세트산과 혼합하고, 이동상으로서 아세토니트릴:H₂O (1:1, v/v)를 이용하여, 3.5 kV의 캐필러리 및 31 V의 콘 세팅을 이용한 일렉트로스프레이 이온화-질량 스펙트로메트리 (ESI-MS)에 의하여 분석하였다. [¹³C₆]-표지된 헥소오즈 테트라머들을 포함하는 분획들을 모아서 진공하 40 ℃에서 6 시간 동안 Centrivap (Labconco)을 이용하여 건조시켰다. [¹³C₆]-표지된 헥소오즈 테트라머들을 H₂O에 재구성하였다. [¹³C₆]-표지된 헥소오즈 테트라머들의 결합된 농도는, BAB-유도체화된 내부 표준물 (m/z 872)의 [M+Na]⁺의 강도를, 표지되지 않은 BAB-유도체화된 Glc₄표준물 (m/z 866)의 그것과 비교함으로써, ESI-MS를 사용하여 결정되었다. 내부 표준물 (I.S.)의 순도는 자외선 검출기를 구비한 HPLC를 이용하여 BAB 유도체들을 분석함으로써 결정하였다. 유도체화된 올리고당들은, YMC-Pack Pro C₁₈컬럼 (250 ×4.6 mm I.D., 5 ㎛) 상에서 36 분 동안 5:22:73 (v/v/v)의 0.05 mol/L 암모늄 아세트산: 아세토니트릴: H₂O로부터 5:60:35 (v/v/v)의 0.05 mol/L 암모늄 아세트산: 아세토니트릴: H₂O (v/v)에 이르는 농도 구배 용출로 분리하였다. 올리고당들은 진정 표준물들에 대해 잔류 시간들을 비교함으로써 확인되었다. 또한, 분획들은 HPLC 분리로부터 수집되었으며, 질소 기체 하에서 건조되어, 아래에 서술된 혈장 시료들에 대한 조건들과 동일한 조건 하에서 ESI-MS 및 ESI-MS/MS에 의하여 [M+Na]⁺이온들을 분석하였다.

겔 여과에 의하여 반응 혼합물로부터 분리된, 테트라헥소오즈 분획의 HPLC 분석은, 수 많은 성분들의 존재를 설명해 준다 (도 8참조). HPLC 분석으로부터 수집된 분획들은 ESI-MS 및 ESI-MS/MS를 이용하여 분석되었다. BAB 유도체화된 [¹³C₆] 테트라헥소오즈에 대하여 기대되는 m/z 수치와 분별화 패턴을 갖는 네 가지 성분들이 확인되었다 (도 8의 피크 1 내지 4). 이러한 성분들 중의 하나 (도 8의 피크 4)는 그 잔류 시간 및 소듐화된 (sodiated) B₃및 Y₂단편 이온들 (각각 m/z 509 및 548)의 비율로부터 [¹³C₆]Glc₄로 확인되었다. 전술한 바와 같이 (실시예 6: 또한, An 등., (2000)Anal. Biochem. 287:136 참조), 모두 α1-4 연결들을 갖는 Glc₄및 말토테트라오즈에 대한 이러한 2 가지 생성물 이온들의 비율에 있어서 차이가 있었다. m/z 548에 대한 509의 비율 (평균 ±2SD)은 이러한 내부 표준물 성분에 대하여 1.33 ±0.24 (n=10)인 것으로 나타났다. Glc₄표준물의 경우에는, m/z 509의 542 (m/z 548에 대한 표지되지 않은 당량체 (equivalent))에 대한 비율 (평균 ±2SD)은 1.41 ±0.09 (n=5)이었다. 피크 2는 존재하는 주된 이소머이었고, Tonozuka 등에 의하여 트랜스글리코실레이션 반응의 주된 산물들 중의 하나로 확인된 IMIM일 것으로 판단되었다. 이러한 이소머에 대한 m/z 548에 대한 509의 비율은 0.34 ±0.10 (n=10)이었고, 이는 0.48 ±0.16 (n=5)인, 말토테트라오즈의 그것과 유사하였다. 피크 1에 대한 비율은 1.34 ±0.32 (n=8)이었다. 피크 1 및 3의 구조적 실체는 알려지지 않았으며, 피크 3은 테트라머 및 펜타머의 혼합물이었다. 파노오즈 (피크 5) 및 글루코오즈 (피크 6) 또한 표본 (preparation) 내에 존재하였다. 3 가지 주된 이소머들인, 피크 1, 2 및 4는, HPLC 및 MS 분석들에 의하여 결정된 바와 같이, 함께 내부 표준물 혼합물의 84 %를 구성하였다. 피크 1: 피크 2: 피크 4:의 비율은, 0.2: 1.7: 1.0이었다.

실시예 11

혈장 및 뇨 내 Glc ₄ 의 탠덤 질량 스펙트로메트리 분석 방법

-70 ℃ 또는 -20 ℃에서 1 년까지 보관한, 대조군 및 환자의 뇨 및 혈장 시료들이 사용되었다. 정상 인간 혈청 (#1101)은 Biocell Laboratories (Rancho Dominguez, CA)로부터 얻었다. 뇨, 뇨반 및 혈장 시료들은 전술한 방법으로 BAB로유도체화되었다.

뇨:50 ㎕의 뇨를 25 ㎕ 100μmol/L 내부 표준물과 10 초 동안 소용돌이 혼합하였으며, 140 ㎕의 시약 (메탄올 내 149 mmol/L BAB, 400 mmol/L NaBH₃CN 및 6 % 빙초산 함유)으로 80 ℃에서 45 분간 유도체화시켰다. GSD Ⅱ를 앓고 있는 환자들로부터의 뇨 시료들은, 200 ㎕ 뇨를 1.8 mL dH₂O와 혼합함으로써, 분석 이전에 희석시킬 필요가 있었다.

뇨반:뇨를 14000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여, 그 상등액을 클린 튜브로 옮겼다. 그 상등액 (replicate) 30 ㎕를 면 린터 (linter) 페이퍼 (grade 903, Schleicher & Schuell, Keene, NH)에 스폿팅하여, 실온에서 밤새도록 건조시켰다. 남은 뇨는 -70 ℃에서 저장하였다. 2 ×1/4 인치 뇨반을 300 ㎕ dH₂O에 넣고 실온에서 1 시간 동안 흔들어줌으로써 추출하였다. 추출물 100 ㎕를 50 ㎕, 2μM 내부 표준물과 혼합하고, 질소 하에서 건조시킨 다음, 20 ㎕ dH₂0에서 재구성하여 전술한 바와 같이 유도체화 하였다.

혈장 및 혈청:100 ㎕의 혈장 또는 혈청 및 50 ㎕, 2 μmol/L 내부 표준물을 500 ㎕ 메탄올과 소용돌이 혼합하고, 14000g에서 5 분간 원심분리하였다. 상등액을 N₂하에서 건조시키고, 20 ㎕ dH₂O에서 재구성한 다음, 100 ㎕ 시약 (메탄올 내 400 mM BAB, 2.0 mol/L NaBH₃CN 및 7.5 % 빙초산 함유)을 이용하여 80 ℃에서 45 분간 유도체화하였다.

유도체화된 뇨, 뇨반 추출물 및 혈장 시료들은 전술한 바와 같이, C18 카트리지로 고체상 추출법을 이용하여 정제하였다 (실시예 2; 및 An 등.,Anal. Biochem. 287:136 참조). 용출액을 40 ℃, N₂하에서 건조시키고, 80:20 메탄올:H₂O (v/v)에서 재구성한 다음, 96-웰 미소적정 플레이트에 옮겼다.

보정군 (Calibrators):2.5 내지 200 μmol/L 범위의 Glc₄표준물을 가한 대조군 성인 뇨를 사용하여 뇨 보정군을 제조하였다. 뇨반 보정군은 dH₂0를 사용하여 제조하였으며, 0.1 내지 10 μmol/L 범위이었다. 혈장 보정군 및 품질 관리 시료들은 0.1 내지 10 μmol/L 범위의 Glc₄표준물을 가한 Biocell 정상 인간 혈청을 사용하여 제조하였다.

질량 스펙트로메트릭 분석 및 정량:뇨 및 혈장 시료들을 다중 반응 모니터링을 이용하여, 일렉트로스프레이 이온화-탠덤 질량 스펙트로메트리 (ESI-MS/MS)로 분석하였다. (Glc)₄및 내부 표준물은, 각각, m/z 866으로부터 m/z 509로의 전이 및 m/z 872로부터 m/z 509로의 전이 (transition)에 따라 검출되었다. 뇨-유도체화된 올리고당 유도체들은 40 ㎕/min의 유속의 80:20 메탄올:H₂O (v/v) 이동상으로 주입되었다. 혈장 및 뇨반 시료들은, 시료들을 농축하기 위하여, 유속 200 ㎕/min의 80:20 메탄올:H₂O (v/v)를 이동상으로 하는 2 ×100 mm C18 컬럼 (Keystone Scientific Inc.)을 이용한, 부가적인 액체 크로마토그래피 단계를 포함하는 동일한 방법을 사용하여 분석하였다. 총 분석 시간은 뇨 시료들에 대하여 2.5 분이었으며, 혈장 및 뇨반 시료들에 대하여 3.0 분이었다. 90 V의 콘 전압, 3.5 kV의 캐필러리 전압, 40 eV의 충돌 에너지 및 3.1 ×10^-3mBar의 아르곤 충돌 기체 압력이 사용되었다. 시료들은 가해진 (Glc)₄농도에 대한 내부 표준물에 대한, (Glc)₄표준물에 대한 MRM 신호들의 비율을 도시함으로써 유도된 외부 보정 곡선을 이용하여 정량되었다.

크레아틴 측정:뇨 및 뇨반 추출물들에서의 Glc₄농도들은 크레아틴의 농도와 관련이 있었다. 뇨 내 크레아틴은 피크릭 산 (picric acid) 방법 (Jaffe 등., (1886)Physiol. Chem. 10:391)을 사용하여 측정되었고, 대응되는 뇨 및 뇨반 추출물 시료들은, 다른 문헌들에서도 공표되어 있는, 안정한 동위 원소 희석 방법을 사용하여 ESI-MS/MS에 의하여 측정되었다.

ESI-MS/MS에 의한 뇨 및 혈장 분석의 유효성:뇨 및 혈장 분석들은 보정군 (calibrators) 및 품질 관리 (QC) 시료들의 반복 분석 (replicate analysis)에 의하여 그 유효성이 확인되었다. 부가하여, ESI-MS/MS에 의하여 결정된 환자 및 대조군 시료들 내 Glc₄농도들은 HPLC-UV에 의하여 결정된 결과들과 비교되었다. 뇨 보정 곡선들 및 QC들은 4 주 기간에 걸쳐 분석되었으며, 혈장 보정 곡선들 및 QC들은 8 주 기간에 걸쳐 분석되었다.

뇨용 보정 곡선들 및 QC들의 시간에 따른 변화 (interday variation):뇨 보정 곡선은, Glc₄의 농도가 하나 또는 두 자리수 크기만큼 다를 수 있는, 대조군 및환자 시료들을 정량하기 위하여, 2가지 농도 범위들에 걸쳐 분할되었다. 보정 곡선 기울기의 시간에 따른 변화는, 낮은 농도 범위인 2.5 내지 70 μM에 대하여 1.3 %이었으며, 높은 농도 범위인 40 내지 200 μmol/L 범위 (n=5)에 대하여 2.3 %이었다. 평균 ±보정 곡선의 SD 결정 계수 (coefficient of determination) (r²)는, 4 주간에 걸쳐, 저농도 및 고농도 범위에 대하여 각각 (n=5), 0.998 ±0.001 및 0.998 ±0.001이었다. 보정 곡선의 시간에 따른 정밀성 (interday precision)및 평균 정확성 (mean accuracy)이 표 6에 나타나 있다. 31.6 mmol/mol 크레아틴의 평균 Glc₄농도를 갖는 환자 시료의 반복 분석에 의하여 결정된 동일자 (intraday) 및 이일자 (interday) 정밀성 (cv)은, 각각 2.6 % (n=5) 및 5.0 % (n=4)이었다. 0.4 mmol/mol 크레아틴의 평균 Glc₄농도를 갖는 대조군 시료에 대하여는, 동일자 및 이일자 정밀성은, 각각 4.6 % (n=5) 및 24.2 % (n=4)이었다.

[표 6]

농도 (Nominal)μmol/L	평균 농도 (mean)μmol/L	cv(%)	에러 %
저농도 보정 범위 (2.5 내지 70 μmol/L)
2.55204070	2.44.420.540.869.5	36.015.76.11.80.9	3.513.0-2.3-2.00.8
고농도 보정 범위 (40 내지 200 μmol/L)
4070100150200	40.269.0100.3151.3199.2	2.42.23.02.31.1	-0.41.4-0.3-0.90.4

혈장용 보정 곡선들 및 QC들의 시간에 따른 변화:혈장을 0.1 내지 2.5 μmol/L 및 1.0 내지 10 μmol/L에 걸쳐서 정량하였고, 8 주간에 걸친 보정 곡선 기울기의 날짜에 따른 변화는, 각각 20.3 % 및 20.6 %이었다 (n=7). 평균 ±SD r²값은 저농도 범위에 대하여 0.998 ±0.001이었고, 고농도 범위에 대하여 0.994 ±0.009이었다 (n=7). 보정 곡선의 날짜에 따른 정밀성 (interday precision)및 평균 정확성 (mean accuracy)이 표 7에 나타나 있다. 혈장 QC들은 보정군들을 제조하기 위하여 사용된 것과 동일한 정상 인간 혈장 풀 (pool)을 사용하여 제조되었다. 이러한 혈장에서 작은 량의 내생적 Glc₄가 검출 및 결정되었으며, 계산에 고려되었다. 혈장 QC들의 이일자 및 동일자 반복 분석에 대한 결과들이 표 8 및 표 9에 각각 나타나 있다.

[표 7]

농도 (Nominal)μmol/L	평균 농도 (mean)μmol/L	cv(%)	에러 %
저농도 보정 범위 (0.1 내지 2.5 μmol/L)
0.10.250.51.02.5	0.080.260.520.982.50	28.08.69.58.00.9	-18.32.53.3-1.9-0.1
고농도 보정 범위 (1.0 내지 10.0 μmol/L)
1.02.55.010.0	1.072.665.6310.10	11.99.011.99.0	7.16.37.16.3

[표 8]

이일간 분석	농도 (Nominal)μmol/L	평균 농도 (mean)μmol/L	cv(%)(n=5)	평균 에러 %(n=5)
QC 1QC 2QC 3	0.201.258.0	0.181.308.71	21.57.51.8	-8.54.28.9

[표 9]

이일간 분석	농도 (Nominal)μmol/L	평균 농도 (mean)μmol/L	cv(%)(n=7)	평균 에러 %(n=7)
QC 1QC 2QC 3	0.201.258.0	0.241.298.43	36.314.211.2	22.13.35.4

실시예 12

ESI-MS/MS 및 HPLC 분석들의 비교

HPLC 방법들에 의하여 분석된 24개 뇨 시료들과 29개 혈장 시료들 (환자 및 대조군들)의 결과들이 ESI-MS/MS 방법에 의한 결과들과 비교되었다 (도 9및도 10). 뇨 시료들의 경우에는, y = 0.97x - 4.0 ; S_y/x= 6.5 및 r²= 0.82이었다. 혈장 시료들의 경우에는, y = 0.62x + 0.16 ; S_y/x= 0.31 및 r²= 0.502이었다. 데이터에 대한 Bland-Altman 분석 (Bland 등., (1986)Lancet 1:307)을 이용한 결과, 뇨 및 혈장에 대해 일치되는 범위는 (limits of agreement) [평균 차이 (HPLC-ESI-MS/MS) ±차이의 2 SD]은, 각각 3 ±12.4 및 0.1 ±0.72이었다.

실시예 13

액체 및 반점화된 뇨 시료들 내 Glc ₄ 분석의 비교

37쌍의 액체 및 반점 뇨 시료들로부터 Glc₄농도들을 결정하였다. 농도들의 비교 결과를도 11에 나타내었다. y = 0.99x - 0.38 ; S_y/x= 5.36 및 r²= 0.954이었다. Bland-Altman 분석에 대한 일치의 한계들 [평균 차이 (HPLC-ESI-MS/MS) ±차이의 2 SD]은, 0.55 ±10.4이었다.

실시예 14

분석에 방해가 될 수 있는 것들에 대한 조사

[M+Na]⁺이온들의 강도를 최적화하기 위하여 높은 콘 전압 (90V)이 사용되었다. 이러한 전압에서, 일부 인-쏘오스 (in-source) 단편화 (fragmentation)가 발생하며, 따라서 단편화되어 m/z 866 생성물 이온을 만들어 내는, 더 큰 질량의 헥소오즈 올리고머들이 Glc₄분석을 방해할 수 있다. 이러한 사항을 조사하기 위하여, 다른 콘 전압에서 말토펜타오즈 및 말토헥사오즈의 인-쏘오스 단편화 정도를 결정하였다. 부가하여, GSD Ⅱ 환자 시료들 내의 더 큰 질량을 갖는 헥소오즈 올리고머들의 m/z 866에 대한 기여도를 평가하였다. 유속 10 ㎕/분으로 주사 펌프 (모델)을 사용하여, 질량 스펙트로미터에 80:20 메탄올: H₂O (v/v) 내의 12μmol/L 말토펜타오즈 및 말토헥사오즈 BAB-유도체들을 주입하였다. 콘 전압은 30 V부터 100 V까지 증가되었고, m/z 866 및 [M+Na]⁺의 상대 강도들이 결정되었다. 말토펜타오즈의 경우에는, m/z 866의 상대 강도가, 30 V에서 m/z 1028의 강도의 2.5 %부터 100 V에서 4.6 %까지, 콘 전압에 따라 증가되었다. 말토헥사오즈의 경우에는, m/z 866의 상대 강도가 콘 전압에 따라 증가되지 않았다. 90 V에서, 양 표준들에 대한 [M+Na]⁺의 상대 강도는 비교될 만하였다 (4 %). 12 명의 GSD Ⅱ 환자 뇨 시료들의 BAB-유도체들을 100 amu.sec^-1의 속도로, m/z 830 및 1400 사이에서 스캐닝함으로써 MS1 모드에서 분석하였다. 존재하는 헥소오즈 펜타머(들), 헥소오즈 헥사머(들) 및 헥소오즈 헵타머(들)의 m/z 866에 대한 [M+Na]⁺의 평균 상대 강도들은, 각각 5.2, 2.8 및 3.6%로 결정되었다. 따라서, 이러한 헥소오즈 올리고머 올리고당들의 m/z 866 신호에 대한 조합된 기여도는 0.46 %로 결정되었다.

실시예 15

TMS를 사용한 신생아 스크리닝 분석

(Glc)₄를 생마커로 사용하여 폼페병을 앓는 신생아들을 스크리닝하기 위하여 TMS를 기초로 하는 분석법이 이용되었다. (통상적으로, 발꿈치 채혈로 얻어진) 건조 혈액 반점들을 함유하는 신생아 스크리닝 카드들을 제조하였다. 카드로부터 디스크 모향의 혈반을 뚫어 내어 올리고당들을 추출하기 위한 용매를 포함하는 바이알 (vial)에 투입하였다. 내부 표준물을 미리 알고 있는 양만큼 각각의 바이알에 가하였다 (예를 들어, 모노머들 중의 하나가 U-¹³C-글루코오즈 동족체로 치환된 (Glc)₄테트라머). 다음으로, 올리고당들을 부틸-PABA를 사용하여 시료 내에서 유도체화하였다. 유도체화된 시료는실시예 11에 개시된 바와 같이 TMS에 의하여 분석하였다. 데이터들은 컴퓨터에 의하여 수집되어 각각의 시료 내 (Glc)₄의 농도를 결정하기 위하여 분석되었다 (즉, 내부 표준물과 분석물에 의하여 생산된 신호들의 비율을 비교함으로써). 기준치 이상의 수치들은 폼페병의 지표가 될 수 있다.

선택적으로, 분석물은 항-(Glc)₄항체가 화학적으로 접합된 상자성 폴리스티렌 구 (paramagnetized polystyrene spheres) (Dynabeads)와 시료를 배양함으로써 유도체화 이전에 농축된다. 비드들 (beads)은 자석에 의하여 수집되고, 분석물은 적당한 용매를 사용하여 비드들로부터 용출된다.

다른 선택적인 단계로서, 글루코오즈 모노머의 농축물은 TMS 분석 이전에 시료 내에서 환원된다. 한 가지 프로토콜에서, 글루코오즈 옥시다아제가 유도체화 이전에 시료에 가해진다. 다른 대체적인 프로토콜에서는, 유도체화된 글루코오즈 모노머가, TMS 단계 이전에 액체 크로마토그래피 단계 (역상)에 의하여 분리된다.

상기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 본 발명은 하기 청구범위에 기재되어 있으며, 청구범위의 균등물들도 본 발명에 포함된다.

Claims (54)

1. 피험체에서 당원축적병을 스크리닝하는 방법에 있어서, 피험체로부터 얻은 생물학적 시료 중의 헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 농도를 결정하는 단계 및, 상기 농도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하며, 상기 생물학적 시료 중의 (Glc)₄가 기준치보다 높은 값으로 검출되면 피험체가 당원축적병을 앓고 있는 것으로 확인되는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 (Glc)₄는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 (Glc)₄의 농도는 정량적 방법을 사용하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 (Glc)₄는 탠덤 질량 스펙트로메트리 (tandem mass spectrometry), 질량 스펙트로메트리 (mass spectrometry), 액체 크로마토그래피 (liquid chromatography) 및 면역정제법 (immunopurification)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 정량되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 (Glc)₄의 농도는 준-정량적 (semi-quantitative) 방법을 사용하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 당원축적병은 폼페병 (당원축적병 Ⅱ형), 당원축적병 Ⅲ형, 및 당원축적병 Ⅳ형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 피험체는 인간 피험체인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 인간 피험체는 신생아 피험체인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 체액 시료 (body fluid sample)인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 체액 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 타액 (sputum) 및 양막 유체 (amniotic fluid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 체액 시료는 신생아 혈액 시료인 것을 특징으로 하는방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 신생아 혈액 시료는 건조 혈반 (dried blood spot)인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제9항에 있어서, 상기 체액 시료는 건조 뇨 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 세포 또는 조직 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 기준치는 미리 정해진 수치인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 기준치는 대응되는 피험체들의 집단에서 발견되는 (Glc)₄의 농도들에 기초하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 대응되는 피험체들의 집단은 질병을 앓지 않는 피험체들의 집단인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제1항에 있어서, 당원축적병을 앓는 것으로 확인된 피험체에 대하여 부가적인 진단 테스트를 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 피험체에서 폼페병 (당원축적병 Ⅱ형)을 스크리닝하는 방법에 있어서, 피험체로부터 얻은 생물학적 시료 중의 헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 농도를 결정하는 단계 및, 상기 농도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하며, 상기 생물학적 시료 중의 (Glc)₄가 기준치보다 높은 값으로 검출되면 피험체가 폼페병을 앓고 있는 것으로 확인되는, 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 (Glc)₄는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제19항에 있어서, 상기 (Glc)₄의 농도는 정량적 방법을 사용하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제20항에 있어서, 상기 (Glc)₄는 탠덤 질량 스펙트로메트리에 의하여 정량되는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 생물학적 시료 중의 올리고당들은 탠덤 질량 스펙트로메트리 이전에, 부틸-파라-아미노벤조산에 의하여 유도체화되는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제22항에 있어서, 상기 탠덤 질량 스펙트로메트리에 의한 정량은 내부 표준물로서 [U-¹³C]글루코오즈 표지된 헥소오즈 테트라머를 사용하여 표준화되는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 내부 표준물은, α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc의 구조를 갖는 [U-¹³C] 표지된 헥소오즈 테트라머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제19항에 있어서, 상기 (Glc)₄의 농도는 준-정량적 방법을 사용하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제19항에 있어서, 상기 기준치는 미리 정해진 수치인 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 미리 정해진 기준치는 대응되는 피험체들의 집단에서 발견되는 (Glc)₄의 농도들에 기초하는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 대응되는 피험체들의 집단은 질병을 앓지 않는 피험체들의 집단인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제19항에 있어서, 폼페병을 앓는 것으로 확인된 피험체에 대하여 부가적인 진단 테스트를 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 신생아 피험체에서 폼페병 (당원축적병 Ⅱ형)을 스크리닝하는 방법에 있어서, 신생아 피험체로부터 얻은 생물학적 시료 중의 헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 농도를 결정하는 단계로서, 상기 (Glc)₄는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc의 구조를 가지는 단계; 및 상기 농도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하며, 상기 생물학적 시료 중의 (Glc)₄가 기준치보다 높은 값으로 검출되면 신생아 피험체가 폼페병을 앓고 있는 것으로 확인되는, 방법.
32. 폼페병 (당원축적병 Ⅱ형)을 앓고 있는 피험체의 임상적 조건을 모니터링하는 방법에 있어서, 피험체로부터 얻은 생물학적 시료 중의 헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 농도를 결정하는 단계 및, 상기 농도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하며, 상기 생물학적 시료 중의 (Glc)₄가 기준치보다 높은 값으로 검출되면 피험체의 임상적 조건의 지표가 되는, 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 (Glc)₄는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제32항에 있어서, 상기 피험체는 폼페 질환에 대한 치료가 진행 중인 피험체인 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 치료는 효소 치환 요법, 유전자 치료법, 및 식이 요법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제34항에 있어서, 상기 모니터링은 폼페 질환에 대한 상기 피험체의 치료를 개시하거나 또는 재개하는 것을 결정하기 위하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 폼페병 (당원축적병 Ⅱ형)을 앓고 있는 환자에 대한 치료적 요법의 효율성을 평가하는 방법에 있어서, 피험체로부터 얻은 생물학적 시료 중의 헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 농도를 결정하는 단계, 및 상기 농도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하며, 상기 생물학적 시료 중의 (Glc)₄가 기준치보다 높은 값으로 검출되면 피험체에 대한 치료적 요법의 효율성의 지표가 되는, 방법,
38. 제38항에 있어서, 상기 (Glc)₄는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 신생아 피험체에서 폼페병 (당원축적병 Ⅱ형)을 스크리닝하는 방법에 있어서, 탠덤 질량 스펙트로메트리에 의하여 신생아 피험체로부터 얻은 건조 혈반 시료 중의 헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 농도를 결정하는 단계 및, 상기 농도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하며, 상기 시료 중의 (Glc)₄가 기준치보다 높은 값으로 검출되면 신생아 피험체가 폼페병을 앓고 있는 것으로 확인되는, 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 (Glc)₄는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제39항에 있어서, 상기 탠덤 질량 스펙트로메트리에 의한 정량은 내부 표준물로서 [U-¹³C]글루코오즈 표지된 헥소오즈 테트라머를 사용하여 표준화되는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 내부 표준물은, α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc의 구조를 갖는 [U-¹³C] 표지된 헥소오즈 테트라머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 탠덤 질량 스펙트로메트리에 의하여 피험체로부터 얻어진 생물학적 시료 중의 헥소오즈 테트라당 (Glc)₄의 농도를 결정하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 중의 올리고당의 농도를 결정하는 방법.
44. 제43항에 있어서, 상기 (Glc)₄는 α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
45. 제43항에 있어서, 상기 생물학적 시료 중의 올리고당들은 탠덤 질량 스펙트로메트리 이전에, 부틸 파라-아미노벤조산에 의하여 유도체화되는 것을 특징으로 하는 방법.
46. 제43항에 있어서, 상기 정량 단계 이전에 농축 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 농축 단계는 면역결정화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
48. 제43항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 타액 및 양막 유체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
49. 제43항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
50. 제43항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 신생아 혈액 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
51. 제43항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 신생아 뇨 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
52. 제43항에 있어서, 상기 정량 단계 이전에 생물학적 시료 중의 글루코오즈의 농도를 감소시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
53. 제43항에 있어서, 상기 탠덤 질량 스펙트로메트리에 의한 정량은 내부 표준물로서 [U-¹³C]글루코오즈 표지된 헥소오즈 테트라머를 사용하여 표준화되는 것을 특징으로 하는 방법.
54. 제52항에 있어서, 상기 내부 표준물은, α-D-Glc(1→6)-α-D-Glc(1→4)-α-D-Glc(1→4)-D-Glc의 구조를 갖는 [U-¹³C] 표지된 헥소오즈 테트라머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.