JP2022061035A - Ｉｌ－１０およびインスリンを安定的に発現する遺伝子改変された細菌 - Google Patents

Ｉｌ－１０およびインスリンを安定的に発現する遺伝子改変された細菌 Download PDF

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Abstract

【課題】安定な、１つより多くの生物活性ポリペプチドを構成的に発現し、かつ臨床的使用のために好適な、遺伝子改変された細菌株を提供する。【解決手段】ヒトインターロイキン－１０（ｈＩＬ－１０）をコードする外因性核酸、およびヒトプロインスリン（ｈＰＩＮＳ）をコードする外因性核酸を含み、ｈＩＬ－１０をコードする前記外因性核酸およびｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、染色体に組み込まれている、微生物、例えば、乳酸菌（lactic acid bacterium）（ＬＡＢ）などのグラム陽性菌を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月２日に出願された米国仮特許出願第６２／３８３，０７９号
の出願日の利益を主張する。
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、この配列表は、参照
することによりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年８月３０日に作成された
前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０５３５０＿００３２＿ＷＯ＿５６７０２０＿ＳＴ２５．ｔ
ｘｔという名称であり、４３，０２７バイトの大きさである。
粘膜組織に治療用分子を送達するために、遺伝子改変された微生物（例えば、細菌）が
使用されてきた。例えば、Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-
789；およびRobert S. and Steidler L., Microb. Cell Fact. 2014, 13 Suppl. 1: S11
を参照。
インターロイキン１０（ＩＬ－１０）を産生する乳酸菌が以前に記載され、また１型糖
尿病（Ｔ１Ｄ）の治療のためにＩＬ－１０および／またはインスリンもしくはプロインス
リンを粘膜に投与することが記載されている。例えば、国際特許出願公開第２００７／０
６３０７５号パンフレット；Robert S. et al., Diabetes 2014, 63: 2876-2887；Steidl
er et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789；およびTakiishi T. et al., J. C
lin. Invest. 2012, 122(5): 1717-1725を参照。
しかしながら、安定な、１つより多くの生物活性ポリペプチドを構成的に発現し、かつ
、例えばＴ１Ｄの治療といった臨床的使用のために好適な、遺伝子改変された細菌株の必
要性が当該技術分野において依然として存在する。本開示はこれらの必要性に応えるもの
である。
本開示は、ＩＬ－１０およびプロインスリン（ＰＩＮＳ）をコードする染色体に組み込
まれた核酸を含有する遺伝子改変された微生物、そのような微生物を調製する方法、およ
びそのような微生物を使用する方法を提供する。これらの遺伝子改変された微生物は、糖
尿病、例えばＴ１Ｄの治療を含むがこれに限定されない、ヒトの治療にとって好適であり
得る。
微生物および組成物
本開示は、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）ポリペプチドをコードする外因性核
酸、およびプロインスリン（ＰＩＮＳ）ポリペプチドなどのＴ１Ｄ特異的抗原をコードす
る外因性核酸を含有し、ＩＬ－１０ポリペプチドをコードする外因性核酸およびＴ１Ｄ特
異的抗原（例えば、ＰＩＮＳポリペプチド）をコードする外因性核酸の両方が染色体に組
み込まれている、すなわち、細菌染色体に組み込まれている（または細菌染色体上に位置
する）、微生物、例えば、乳酸菌（lactic acid bacterium）（ＬＡＢ）などのグラム陽
性菌を提供する。
微生物は、ＬＡＢなどのグラム陽性菌であり得る。ＬＡＢは、ラクトコッカス（Lactoc
occus）種の細菌であり得る。他の実施形態では、ＬＡＢは、ラクトバチルス（Lactobaci
llus）種、またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種である。一部の実施形態
では、ＬＡＢは、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）であり得る。ＬＡＢ
は、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）亜種クレモリス（cremoris）であ
り得る。別の例示的なＬＡＢは、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株Ｍ
Ｇ１３６３である。例えば、Gasson, M.J., J. Bacteriol. 1983, 154: 1-9を参照。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、ＩＬ－１０ポリペプチドは、ヒトＩＬ－
１０（ｈＩＬ－１０）である。他の例では、ＩＬ－１０は、ＩＬ－１０バリアントポリペ
プチドであり、例えば、例えば細菌によるＩＬ－１０ポリペプチドの発現を増加させる、
少なくとも１つの点変異を含むＩＬ－１０バリアントポリペプチドである。これらの実施
形態による一部の例では、ＩＬ－１０は、「成熟」ヒトＩＬ－１０（ｈＩＬ－１０）であ
り、すなわち、そのシグナルペプチドを含まない。一部の実施形態では、ｈＩＬ－１０は
、成熟ペプチド中のアミノ酸を数えた時に２位において、プロリン（Ｐｒｏ）からアラニ
ン（Ａｌａ）への置換を含む。例えば、配列番号１を参照。そのようなポリペプチドは、
例えば、Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789（その開示は、参照
することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の例では、
ＩＬ－１０ポリペプチドは、野生型ヒトＩＬ－１０である。他の例では、ＩＬ－１０ポリ
ペプチドは、それ自身のシグナルペプチドを含まず、かつ配列番号１に対して少なくとも
９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、
少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する、野生型ヒトＩ
Ｌ－１０である。他の例では、ＩＬ－１０ポリペプチドをコードする外因性核酸は、配列
番号２に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９
６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のヌクレオチ
ド配列を有する。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、Ｔ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドは、ＰＩ
ＮＳポリペプチドであり、例えば、野生型ヒトＰＩＮＳなどのヒトＰＩＮＳ（ｈＰＩＮＳ
）である。一部の例では、ＰＩＮＳポリペプチドは、配列番号５に対して少なくとも９０
％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少な
くとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。野生型ＰＩＮＳは
、配列番号６または配列番号７に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくと
も９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも
９９％同一のヌクレオチド配列によってコードされたものであってよい。他の例では、Ｐ
ＩＮＳポリペプチドは、そのシグナルペプチドを含まず、かつ配列番号３に対して少なく
とも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７
％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する、ヒトＰＩ
ＮＳである。他の例では、ＰＩＮＳポリペプチドをコードする外因性核酸は、配列番号４
に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、
少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列
を有する。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、ＩＬ－１
０ポリペプチドを発現する（例えば、構成的に発現する）。他の例では、微生物（例えば
、ＬＡＢ）は、ＩＬ－１０ポリペプチド（例えば、ｈＩＬ－１０）を構成的に発現しかつ
分泌する。上記実施形態のいずれかによる他の例では、ＬＡＢは、Ｔ１Ｄ特異的抗原ポリ
ペプチド（例えば、ＰＩＮＳポリペプチド）を構成的に発現する。他の例では、微生物（
例えば、ＬＡＢ）は、Ｔ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポリペプチドを構成的に発
現しかつ分泌する。さらに他の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、ＩＬ－１０ポリペ
プチド（例えば、ｈＩＬ－１０）およびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポリペプ
チド（例えば、ｈＰＩＮＳ）を構成的に発現しかつ分泌する。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、ＩＬ－１０ポリペプチドをコードする外
因性核酸は、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）のｈｌｌＡプロモーター
（ＰｈｌｌＡ）などのＰｈｌｌＡの３’に位置する。この実施形態による一部の例では、
ＩＬ－１０ポリペプチドをコードする外因性核酸は、ＰｈｌｌＡによって転写調節される
。他の例では、ＬＡＢは、ＰｈｌｌＡプロモーター（例えば、ラクトコッカス・ラクチス
（Lactococcus lactis）のＰｈｌｌＡ）、ＩＬ－１０分泌配列（例えば、ＰｈｌｌＡの３
’に位置する）、およびＩＬ－１０ポリペプチドをコードする外因性核酸（例えば、ＩＬ
－１０分泌配列の３’に位置する）を含有するＩＬ－１０発現カセットを含む。一部の例
では、ＩＬ－１０発現カセットは、染色体に組み込まれている。一部の例では、ＩＬ－１
０発現カセットは、染色体に組み込まれており、それによって、別の遺伝子を置き換えま
たは部分的に置き換えている。この実施形態による一部の例では、ＩＬ－１０発現カセッ
トは、例えば、Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789に記載される
ように、ｔｈｙＡ遺伝子座において染色体に組み込まれており、例えば、内因性ｔｈｙＡ
遺伝子を置き換えている。上記実施形態のいずれかによる一部の例では、ＩＬ－１０分泌
配列は、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質（unidentified secreted 45-kDa protein）（
Ｕｓｐ４５）の分泌リーダーをコードするヌクレオチド配列である。そのような分泌配列
は、本明細書ではＳＳｕｓｐ４５と称される。一部の例では、ＳＳｕｓｐ４５は、配列番
号１０に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９
６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配
列を有する。他の例では、ＳＳｕｓｐ４５は、配列番号１１または配列番号１２に対して
少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくと
も９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の核酸配列によってコードさ
れる。一部の例では、ＩＬ－１０発現カセット中のＳＳｕｓｐ４５は、配列番号１１に対
して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少な
くとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の核酸配列によってコー
ドされる。一部の例では、ＩＬ－１０発現カセットは、ＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞
＞ｈＩＬ－１０によって表される。例示的なＩＬ－１０発現カセットのヌクレオチド配列
は、図１１に示される。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、Ｔ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）
ポリペプチドをコードする外因性核酸は、ｇａｐＢプロモーター、例えば微生物（例えば
、ＬＡＢ）に内因性のｇａｐＢプロモーターの３’に位置する。この実施形態による他の
例では、Ｔ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポリペプチドをコードする外因性核酸は
、ｇａｐＢプロモーターによって転写調節される。他の例では、Ｔ１Ｄ特異的抗原（例え
ば、ＰＩＮＳ）ポリペプチドをコードする外因性核酸は、ｇａｐＢ遺伝子（ｇａｐＢ）お
よびそのｇａｐＢプロモーターの３’に位置する。他の例では、ＬＡＢは、ｇａｐＢ遺伝
子の５’に位置するｇａｐＢプロモーター、Ｔ１Ｄ特異的抗原分泌配列（例えば、ＰＩＮ
Ｓ分泌配列）（例えば、ｇａｐＢの３’に位置する）、およびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば
、ＰＩＮＳ）ポリペプチドをコードする外因性核酸（例えば、ＰＩＮＳ分泌配列の３’）
を含む第１のポリシストロン性発現カセット（例えば、二シストロン）を含む。この実施
形態による一部の例では、ポリシストロン性発現カセットは、例えばｇａｐＢとＰＩＮＳ
分泌配列との間の、遺伝子間領域をさらに含む。上記実施形態のいずれかによる一部の例
では、ｇａｐＢプロモーターおよびｇａｐＢ遺伝子は、微生物（例えば、ＬＡＢ）に内因
性である。一部の例では、ＰＩＮＳ分泌配列は、ＳＳｕｓｐ４５である。上記実施形態に
よる他の例では、第１のポリシストロン性発現カセットは、染色体に組み込まれている。
他の例では、第１のポリシストロン性発現カセットは、ＰｇａｐＢ＞＞ｇａｐＢ＞＞遺伝
子間領域＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ＰＩＮＳによって表される。上記実施形態のいずれかに
よる一部の例では、第１のポリシストロン性発現カセット中の遺伝子間領域は、ｒｐｍＤ
遺伝子の５’の遺伝子間領域（すなわち、ｒｐｍＤに先行する領域）である。上記実施形
態のいずれかによる一部の例では、ｒｐｍＤは、配列番号８（これは、第１の遺伝子の終
止コドン、および第２の遺伝子の開始コドンを含む）によるヌクレオチド配列を有する。
開始コドンおよび終止コドンなしでは、遺伝子間領域ｒｐｍＤは、配列番号９による核酸
配列を有する。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、トレハロ
ース－６－リン酸ホスファターゼ、例えば、大腸菌（Escherichia coli）ｏｔｓＢなどの
ｏｔｓＢをコードする外因性核酸をさらに含む。これらの実施形態による一部の例では、
トレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸は、染色体に組み込ま
れている。一部の例では、トレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする外因性
核酸は、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５）の３’において染色体に
組み込まれている。この実施形態による一部の例では、ＬＡＢは、ｕｓｐ４５プロモータ
ー、ｕｓｐ４５遺伝子（例えば、プロモーターの３’）、およびトレハロース－６－リン
酸ホスファターゼをコードする外因性核酸（例えば、ｕｓｐ４５遺伝子の３’）を含む第
２のポリシストロン性発現カセットを含む。一部の例では、第２のポリシストロン性発現
カセットは、ｕｓｐ４５遺伝子とトレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする
外因性核酸との間の遺伝子間領域をさらに含む。一部の例では、第２のポリシストロン性
発現カセットは、Ｐｕｓｐ４５＞＞ｕｓｐ４５＞＞遺伝子間領域＞＞ｏｔｓＢによって表
される。これらの実施形態による一部の例では、遺伝子間領域は、本明細書に上記される
ｒｐｍＤ（例えば、配列番号８または配列番号９を有する）である。したがって、第２の
ポリシストロン性発現カセットは、Ｐｕｓｐ４５＞＞ｕｓｐ４５＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｏｔｓ
Ｂによって表され得る。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、トレハロース－６－リン酸ホスホリラー
ゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ）は、微生物（例えば、ＬＡＢ）において破壊または不活性化され
ている。例えば、ｔｒｅＰＰは、ｔｒｅＰＰ遺伝子もしくはその断片を除去することによ
って不活性化されているか、または、ｔｒｅＰＰは、終止コドンを挿入することによって
破壊されている。したがって、これらの実施形態による一部の例では、微生物（例えば、
ＬＡＢ）は、ｔｒｅＰＰ活性を欠いている。
上記実施形態のいずれかによる他の例では、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポ
ーネント遺伝子（cellobiose-specific PTS system IIC component gene）（ｐｔｃＣ）
は、微生物（例えば、ＬＡＢ）において破壊または不活性化されている。例えば、ｐｔｃ
Ｃは、終止コドンを挿入することによって破壊されているか、または、ｐｔｃＣは、ｐｔ
ｃＣもしくはその断片を除去することによって不活性化されている。したがって、これら
の実施形態による一部の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、ｐｔｃＣ活性を欠いてい
る。
上記実施形態のいずれかによる他の例では、ＬＡＢは、１つまたは複数のトレハロース
トランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。一部の例では、１
つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子は、
ＬＡＢに内因性である。一部の例では、ＬＡＢは、１つまたは複数のトレハローストラン
スポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子を過剰発現する。これらの実施形態によ
る一部の例では、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまた
は複数の遺伝子は、外因性プロモーター、例えばｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）の
３’に位置する。例えば、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする
１つまたは複数の遺伝子は、ＰｈｌｌＡによって転写調節される。これらの実施形態によ
る一部の例では、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまた
は複数の遺伝子は、ｌｌｍｇ＿０４５３、ｌｌｍｇ＿０４５４、および任意のこれらの組
合せから選択される。一部の例では、ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４は、
ＰｈｌｌＡによって転写調節される。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、１つまたは複数のトレハローストランス
ポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子は、２つのトレハローストランスポーター
をコードする２つの遺伝子を含み、遺伝子間領域が該２つの遺伝子の間に配置されている
。一部の例では、遺伝子間領域は、例えば配列番号８または配列番号９を有する、ｒｐｍ
Ｄである。一部の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、２つの異なるトレハローストラ
ンスポーターをコードする２つの核酸配列（例えば、遺伝子）（トランスポーター１およ
びトランスポーター２の配列）および該２つの異なるトレハローストランスポーターをコ
ードする２つの核酸の間の遺伝子間領域を含むポリシストロン性発現カセットを含む。そ
のような発現カセットは、ＰｈｌｌＡ＞＞トランスポーター１＞＞遺伝子間領域＞＞トラ
ンスポーター２によって表され得る。これらの実施形態による一部の例では、遺伝子間領
域は、本明細書に上記されるｒｐｍＤ（例えば、配列番号８または配列番号９を有する）
である。したがって、ポリシストロン性発現カセットは、ＰｈｌｌＡ＞＞トランスポータ
ー１＞＞ｒｐｍＤ＞＞トランスポーター２によって表され得る。
したがって、一部の実施形態では、ＬＡＢは、単一株において、いくつもの有用な特色
を含む。一実施形態では、ＬＡＢは、
（Ａ）染色体に組み込まれたプロモーター＞＞分泌シグナル＞＞治療用タンパク質（イン
ターロイキン、抗原、または酵素など）、
（Ｂ）染色体に組み込まれたプロモーター＞＞分泌シグナル＞＞任意選択で第２の治療用
タンパク質、
（Ｃ）トレハロースの蓄積を促進し、胆汁塩および乾燥に対するＬＡＢの生存能力を増進
させる、変異および挿入の組合せ
を含む、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である。該変異は、
（ｉ）トレハロースの取込みのための、ｌｌｍｇ＿０４５３および／またはｌｌｍｇ＿０
４５４などの、染色体に組み込まれたトレハローストランスポーター（ＰｈｌｌＡ＞＞ト
ランスポーター１＞＞遺伝子間領域＞＞トランスポーター２など）、
（ｉｉ）トレハロース－６－リン酸のトレハロースへの変換を促進する、ｕｓｐ４５（遺
伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流に位置する、染色体に組み込まれたトレハロース－６
－リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）、
（ｉｉｉ）（例えば、遺伝子の欠失を通じて）不活性化されたトレハロース－６－リン酸
ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）、および
（ｉｖ）不活性化されたセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（遺伝子ＩＤ
：４７９６８９３）ｐｔｃＣ（例えば、４４６のうちコドン位置３０のｔｇａ；ｔｇａ３
０）
から選択される。
ＬＡＢはまた、ｔｈｙＡなどの、生物学的封じ込めのための栄養要求性変異を含有して
もよい。
一実施形態では、ＬＡＢは、
（Ａ）ＬＡＢから成熟ｈＩＬ－１０を分泌するための、染色体に組み込まれたプロモータ
ー＞＞分泌シグナル＞＞ｈＩＬ－１０（ＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ｈＩＬ－１０
など）、
（Ｂ）ＬＡＢから成熟ＰＩＮＳを分泌するための、染色体に組み込まれたプロモーター＞
＞分泌シグナル＞＞ＰＩＮＳ（ＰｇａｐＢ＞＞ｇａｐＢ＞＞遺伝子間領域＞＞ＳＳｕｓｐ
４５＞＞ＰＩＮＳなど）（遺伝子間領域は、例えばｒｐｍＤであってよい）、
（Ｃ）トレハロースの蓄積を促進し、胆汁塩および乾燥に対するＬＡＢの生存能力を増進
させる、変異および挿入の組合せ
を含む、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である。該変異は、
（ｉ）トレハロースの取込みのための、ｌｌｍｇ＿０４５３および／またはｌｌｍｇ＿０
４５４などの、染色体に組み込まれたトレハローストランスポーター（ＰｈｌｌＡ＞＞ト
ランスポーター１＞＞遺伝子間領域＞＞トランスポーター２など）、
（ｉｉ）トレハロース－６－リン酸のトレハロースへの変換を促進する、ｕｓｐ４５（遺
伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流に位置する、染色体に組み込まれたトレハロース－６
－リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）、
（ｉｉｉ）（例えば、遺伝子の欠失を通じて）不活性化されたトレハロース－６－リン酸
ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）、および
（ｉｖ）不活性化されたセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（遺伝子ＩＤ
：４７９６８９３）ｐｔｃＣ（例えば、４４６のうちコドン位置３０のｔｇａ；ｔｇａ３
０）
から選択される。
ＬＡＢはまた、ｔｈｙＡなどの、生物学的封じ込めのための栄養要求性変異を含有して
もよい。
一実施形態では、ＬＡＢは、
（Ａ）生物学的封じ込めのための、ｔｈｙＡの変異、
（Ｂ）ＬＡＢから成熟ｈＩＬ－１０を分泌するための、染色体に組み込まれたＰｈｌｌＡ
＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ｈＩＬ－１０、
（Ｃ）ＬＡＢから成熟ＰＩＮＳを分泌するための、染色体に組み込まれたＰｇａｐＢ＞＞
ｇａｐＢ＞＞遺伝子間領域＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ＰＩＮＳ（遺伝子間領域は、ｒｐｍＤ
から選択される）、
（Ｄ）トレハロースの取込みのための、ｌｌｍｇ＿０４５３および／またはｌｌｍｇ＿０
４５４などの、染色体に組み込まれたトレハローストランスポーター（ＰｈｌｌＡ＞＞ト
ランスポーター１＞＞遺伝子間領域＞＞トランスポーター２など）、
（Ｅ）（例えば、遺伝子の欠失を通じて）不活性化されたトレハロース－６－リン酸ホス
ホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）、
（Ｆ）トレハロース－６－リン酸のトレハロースへの変換を促進する、ｕｓｐ４５（遺伝
子ＩＤ：４７９７２１８）の下流に位置する、染色体に組み込まれたトレハロース－６－
リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）、および
（Ｇ）不活性化されたセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（遺伝子ＩＤ：
４７９６８９３）ｐｔｃＣ（例えば、４４６のうちコドン位置３０のｔｇａ；ｔｇａ３０
）
を含む、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である。
本開示は、本明細書に記載される微生物（例えば、ＬＡＢ）、例えば、上記実施形態の
いずれかによる微生物（例えば、ＬＡＢ）を含有する組成物をさらに提供する。
本開示は、本明細書に記載される微生物（例えば、ＬＡＢ）、例えば、上記実施形態の
いずれかによる微生物（例えば、ＬＡＢ）を含有し、かつ薬学的に許容される担体をさら
に含有する医薬組成物をさらに提供する。
本開示は、上記実施形態のいずれかによる微生物（例えば、ＬＡＢ）を含有し、かつ溶
媒、および安定化剤をさらに含有する微生物懸濁液（例えば、細菌懸濁液）をさらに提供
する。この実施形態による一部の例では、溶媒は、水、油、および任意のこれらの組合せ
から選択される。例えば、本開示は、本開示のＬＡＢ、水性混合物（例えば、飲料）、お
よび安定化剤を含有する細菌懸濁液を提供する。例示的な安定化剤は、タンパク質もしく
はポリペプチド（例えば、糖タンパク質）、ペプチド、単糖、二糖もしくは多糖、アミノ
酸、ゲル、脂肪酸、ポリオール（例えば、ソルビトール、マンニトール、もしくはイノシ
トール）、塩（例えば、アミノ酸塩）、または任意のこれらの組合せから選択される。
本開示は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療において使用するための、本明細書に記載され
る微生物（例えば、上記実施形態のいずれかによるＬＡＢ）、本明細書に記載される組成
物、または本明細書に記載される医薬組成物をさらに提供する。
本開示は、医薬、例えば、疾患（例えば、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）などの自己免疫疾患）
の治療のための医薬の調製において使用するための、本明細書に記載される微生物（例え
ば、上記実施形態のいずれかによるＬＡＢ）、本明細書に記載される組成物、または本明
細書に記載される医薬組成物をさらに提供する。
方法１：疾患を治療する方法
本開示は、それを必要とする対象においてＴ１Ｄを治療する方法をさらに提供する。例
示的な方法は、治療有効量の本明細書に開示される微生物（例えば、ＬＡＢ）（例えば、
上記実施形態のいずれかによるＬＡＢ）、本明細書に開示される組成物、または本明細書
に開示される医薬組成物を対象に投与することを含む。これらの実施形態のいずれかによ
る一部の例では、対象は、ヒト、例えばヒト患者である。これらの実施形態のいずれかに
よる一部の例では、方法は、免疫調節剤（例えば、抗ＣＤ３抗体）を対象に投与すること
をさらに含む。例えば、免疫調節剤（例えば、抗ＣＤ３抗体）は、併用療法レジメンを使
用して対象に投与され、すなわち、対象（例えば、ヒト）は、抗ＣＤ３抗体などの別の免
疫調節剤を併用して治療される。したがって、一部の例では、本開示は、それを必要とす
るヒト対象においてＴ１Ｄを治療する方法を提供する。例示的な方法は、治療有効量の本
明細書に開示されるＬＡＢ（例えば、上記実施形態のいずれかによるＬＡＢ）、本明細書
に開示される組成物、または本明細書に開示される医薬組成物をヒト対象に投与すること
を含み、ヒト対象は、抗ＣＤ３抗体またはその断片をさらに投与される（例えば、抗ＣＤ
３抗体を併用して治療される）。
一部の例では、抗ＣＤ３抗体は、モノクローナル抗体である。他の例では、抗ＣＤ３抗
体は、ヒト化モノクローナル抗体である。他の例では、抗ＣＤ３抗体は、オテリキシズマ
ブまたはテプリズマブである。一部の例では、ＬＡＢとの併用療法として投与される場合
に、抗ＣＤ３抗体は、単剤療法のために通常使用される用量とは異なる用量で対象に投与
される。併用療法において使用するための抗ＣＤ３の最適な用量は、動物モデルおよび臨
床試験を通じて決定することができる。好ましくは、抗ＣＤ３の用量は、抗ＣＤ３抗体を
用いる効果的な単剤療法のために通常必要とされる用量より少ない、すなわち治療用量未
満である。単剤療法に効果的な用量は、動物モデルおよび臨床試験を参照することによっ
て、および当業者の実施によって、決定することができ、また、規制により認可された用
量であり得る。一部の例では、ＬＡＢを用いる併用療法を受けている対象は、単剤療法に
おける抗ＣＤ３の標準的な用量よりも少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なく
とも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なく
とも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％少ない用量の抗ＣＤ３を
投与される。他の例では、併用療法において投与される抗ＣＤ３の用量は、単剤療法にお
ける抗ＣＤ３の用量よりも約１０～１００％、約１０～９０％、約１０～７０％、約１０
～６０％、約１０～５０％、約５０～１００％、または約２０～５０％少ない。４８また
は６４ｍｇのオテリキシズマブの６日間の連日投与は、治療群が３６カ月時にプラセボ対
照よりも８０％大きいベータ細胞機能を保持するのに充分にＴ細胞活性を抑制できること
を実験は示した。しかしながら、そのような用量は、潜伏性エプスタイン・バー感染の再
活性化に関連した。８日間の３．１ｍｇ／日の用量は、ベータ細胞機能を保存しなかった
。したがって、４８ｍｇより少なくとも１０％少ない（すなわち、４３ｍｇ）治療は「治
療未満」と考えられるであろう。
一部の実施形態では、上記方法における哺乳動物対象は、Ｔ１Ｄと診断された直後であ
る（すなわち、発症直後のＴ１Ｄを有する）。これらの実施形態による一部の例では、対
象は、微生物（例えば、ＬＡＢ）を投与されるよりも前の１２カ月以内、２４カ月以内、
または３６カ月以内に、Ｔ１Ｄを有すると診断された対象である。
方法１の実施形態のいずれかによる一部の例では、方法は、対象中の、例えば対象の臓
器または血液中の、臨床マーカー（例えば、免疫バイオマーカー）を測定することをさら
に含む。例えば、方法は、対象の血液中のＴ１Ｄ関連抗体を測定することをさらに含んで
よい。一部の例では、方法は、対象の血液中のインスリン自己抗体（ＩＡＡ）を測定する
ことをさらに含み得る。一部の例では、対象の血液中のＩＡＡの量は、Ｔ１Ｄの疾患進行
の指標となり、例えば、対象は発症直後のＴ１Ｄを有すると分類できるかどうかの指標と
なり、かつ、対象は治療から利益を得る可能性があるかどうかの指標となることもある。
したがって、ＩＡＡを測定することは、微生物を対象に投与する前に行われ得る。一部の
例では、疾患発症時のＩＡＡ陽性は、治療転帰良好の予測因子となる。しかしながら、Ｉ
ＡＡを測定することはまた、治療の転帰をモニターしかつ測定するために使用されること
もあり、したがって、治療の間に（例えば、治療期間の全体を通じて間隔を置いて）治療
有効性または転帰をモニターするために、かつ／または、治療期間の後に、例えば、対象
が治療を中止した後に治療結果（例えば、正常血糖）を維持するかどうかをモニターする
ために、使用され得る。一部の例では、ＩＡＡ陽性の減少は、治療転帰良好の指標となる
。他の例では、方法は、対象において制御性Ｔ細胞を測定することをさらに含む。制御性
Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ１７、Ｔｒ１ Ｔｈ３、ＣＤ８＋ＣＤ２８－、Ｑａ－１拘束Ｔ細胞、
ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋および／またはＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５－ Ｔ細
胞を含む。好ましくは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋および／またはＣＤ４＋Ｆｏｘ
ｐ３＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞である。他の例では、方法は、対象において初期血中グルコー
ス濃度を測定することをさらに含む。他の例では、方法は、対象においてＣペプチドレベ
ルを測定することをさらに含む。
関連する実施形態では、本発明は、Ｔｒｅｇ細胞の活性を増加させて、ベータ細胞およ
び／またはＴ１Ｄ関連抗原に対する自己免疫反応を抑制し、好ましくは、全てのＴ１Ｄ関
連抗原に対する自己免疫反応を抑制する方法である。他の実施形態では、本発明は、ベー
タ細胞および／または任意のＴ１Ｄ関連抗原に対する自己免疫反応を実質的に減少させ、
好ましくは停止させる方法である。好ましくは、自己免疫反応の実質的な減少は、疾患進
行の実質的な減少または停止に繋がる。
上記方法のいずれかにおける一部の実施形態では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、対象
に経口投与される。例えば、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、微生物（例えば、ＬＡＢ）お
よび薬学的に許容される担体を含む経口投与用の医薬組成物の形態（例えば、カプセル剤
、錠剤、顆粒剤、または液剤）で対象に投与される。他の例では、微生物（例えば、ＬＡ
Ｂ）は、食品の形態で対象に投与され、または食品（例えば、飲料）に加えられる。他の
例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、栄養補助食品の形態で対象に投与される。さらに
他の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、坐剤製品の形態で対象に投与される。一部の
例では、本開示の組成物は、微生物（例えば、ＬＡＢ）によって発現されるポリペプチド
の粘膜送達のために適当である。例えば、組成物は、対象の胃腸管（例えば、腸）中での
効率的な放出のために配合され得る。
上記実施形態のいずれかによれば、本開示は、それを必要とする対象においてＴ１Ｄ特
異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポリペプチドに対する寛容を確立する方法をさらに提供す
る。例示的な方法は、治療有効量の本明細書に開示される微生物（例えば、ＬＡＢ）（例
えば、上記実施形態のいずれかによるＬＡＢ）、本明細書に開示される組成物、または本
明細書に開示される医薬組成物を対象に投与することを含む。これらの実施形態のいずれ
かによる一部の例では、対象は、ヒト、例えばヒト患者である。
上記実施形態のいずれかによれば、本開示は、それを必要とする対象においてＩＡＡを
減少させ、またはそれを必要とする対象においてＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の数を増
加させる方法をさらに提供する。例示的な方法は、治療有効量の本明細書に開示される微
生物（例えば、ＬＡＢ）（例えば、上記実施形態のいずれかによるＬＡＢ）、本明細書に
開示される組成物、または本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与することを含む
。これらの実施形態のいずれかによる一部の例では、対象は、ヒト、例えばヒト患者であ
る。
一部の例では、（例えば、上記方法のいずれかにしたがって）治療有効量の本開示の微
生物（例えば、ＬＡＢ）および本開示の抗ＣＤ３抗体を対象に投与することは、（例えば
、医師によって推奨されるように、または一般に安全であると考えられるように）血中グ
ルコースレベルを制御しまたはある特定の血中グルコースレベルを維持するために対象に
投与される（すなわち、投与されなければならない）インスリンの量を低減させる。例え
ば、（例えば、上記方法のいずれかにしたがって）治療有効量の本開示の微生物（例えば
、ＬＡＢ）および本開示の抗ＣＤ３抗体を対象に投与することは、微生物（例えば、ＬＡ
Ｂ）および抗ＣＤ３抗体を投与されていない対応する対象によって必要とされるインスリ
ンの量と比べた時に、または抗ＣＤ３抗体単独で治療される対応する対象によって必要と
されるインスリンの量と比べた時に、対象において血中グルコースレベルを制御しまたは
ある特定の血中グルコースレベルを維持するために必要とされるインスリンの量を低減さ
せる。
他の例では、（例えば、上記方法のいずれかにしたがって）治療有効量の本開示の微生
物（例えば、ＬＡＢ）および本開示の抗ＣＤ３抗体を対象に投与することは、例えば、当
該技術分野で認識される方法を使用した測定で、対象において対象におけるベータ細胞機
能を保存する（例えば、治療の開始時に測定されたベータ細胞機能を保存する）。（例え
ば、Ｃペプチドレベルを使用して）ベータ細胞機能を測定する例示的な方法もまた、本明
細書に記載される。一部の例では、対象におけるベータ細胞機能は、微生物（例えば、Ｌ
ＡＢ）および抗ＣＤ３抗体の投与の開始後、少なくとも約２カ月、少なくとも約４カ月、
少なくとも約６カ月、少なくとも約８カ月、少なくとも約１０カ月、少なくとも約１２カ
月、少なくとも約１４カ月、少なくとも約１６カ月、少なくとも約１８カ月、少なくとも
約２０カ月、少なくとも約２２カ月、または少なくとも約２４カ月にわたって保存される
。他の例では、（例えば、上記方法のいずれかにしたがって）治療有効量の本開示の微生
物（例えば、ＬＡＢ）および本開示の抗ＣＤ３抗体を対象に投与することは、微生物（例
えば、ＬＡＢ）および抗ＣＤ３抗体を投与されていない対応する対象においてベータ細胞
機能が保存される時間と比べた時に、または抗ＣＤ３抗体単独で治療された対応する対象
と比べた時に、対象においてベータ細胞機能が保存される時間を増加させる。
他の例では、（例えば、上記方法のいずれかにしたがって）治療有効量の本開示の微生
物（例えば、ＬＡＢ）および本開示の抗ＣＤ３抗体を対象に投与することは、例えば、当
該技術分野で認識される方法を使用した測定で、対象において正常血糖を維持する。正常
血糖と関係する血中グルコース範囲は本明細書に記載される。例えば、ヒト対象における
正常血糖は、１２６ｍｇ／ｄＬまたはそれ未満の２回の連続的な空腹時血中グルコース測
定値と関係し得る。血中グルコースレベルを測定する例示的な方法は当該技術分野におい
て公知であり、本明細書に記載される。一部の例では、（治療を受けている）対象におけ
る正常血糖は、微生物（例えば、ＬＡＢ）および抗ＣＤ３抗体の投与の開始後、少なくと
も約２カ月、少なくとも約４カ月、少なくとも約６カ月、少なくとも約８カ月、少なくと
も約１０カ月、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１４カ月、少なくとも約１６カ月、
少なくとも約１８カ月、少なくとも約２０カ月、少なくとも約２２カ月、または少なくと
も約２４カ月にわたって保存される。他の例では、（例えば、上記方法のいずれかにした
がって）治療有効量の本開示の微生物（例えば、ＬＡＢ）および本開示の抗ＣＤ３抗体を
対象に投与することは、微生物（例えば、ＬＡＢ）および抗ＣＤ３抗体を投与されていな
い対応する対象において正常血糖が維持される時間と比べた時に、または抗ＣＤ３抗体単
独で治療される対応する対象において正常血糖が維持される時間と比べた時に、対象にお
いて正常血糖が維持される時間を増加させる。
他の例では、（例えば、上記方法のいずれかにしたがって）治療有効量の本開示の微生
物（例えば、ＬＡＢ）および本開示の抗ＣＤ３抗体を対象に投与することは、例えば、当
該技術分野で認識される方法を使用した測定で、対象において正常ヘモグロビンＡ１ｃ（
ＨｂＡ１ｃ）レベルを維持する。一部の例では、（治療を受けている）対象における正常
ＨｂＡ１ｃレベルは、微生物（例えば、ＬＡＢ）および抗ＣＤ３抗体の投与後、少なくと
も約２カ月、少なくとも約４カ月、少なくとも約６カ月、少なくとも約８カ月、少なくと
も約１０カ月、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１４カ月、少なくとも約１６カ月、
少なくとも約１８カ月、少なくとも約２０カ月、少なくとも約２２カ月、または少なくと
も約２４カ月にわたって維持される。
代替的な実施形態では、本発明の治療方法は、治療された対象において高血糖症の程度
および頻度が治療されていない対象と比べて低減されるように、疾患を改善する。そのよ
うな低減は、治療されていない対象の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０
または９０％であり得る。
治療されていないＴ１Ｄは、時間をかけて発症し、膵臓中のベータ細胞が破壊されるに
つれて進行的に悪化する。したがって、本発明の方法は疾患を停止させることができるの
で、疾患進行のできるだけ早期に対象を治療することが有利である。疾患進行のそのよう
なマーカーとしては、グリセミック指数、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）レベル、Ｃ断片
レベル、および膵島炎が挙げられるがこれらに限定されない。したがって、関連する実施
形態では、本発明の治療方法はまた、治療の前および治療の間に疾患進行を測定すること
も含む。
例えば、ヒト対象は、該対象において以下のいずれか１つが測定された時に発症早期Ｔ
１Ｄを有すると分類され得る：（１）２回の連続的な空腹時血中グルコース試験が１２６
ｍｇ／ｄＬに等しいまたはそれより大きい；（２）任意の無作為な血中グルコース測定値
が２００ｍｇ／ｄＬより大きい時；（３）６．５パーセントに等しいまたはそれより大き
いヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）試験（ＨｂＡ１ｃは血糖の３カ月平均を与える血液
試験である）；または（４）２００ｍｇ／ｄＬを上回る任意の値を有する２時間の経口耐
糖能試験、あるいはこれらの組合せ。したがって、正常血糖は、以下のいずれかによって
特徴付けられ得る：（１）２回の連続的な空腹時血中グルコース試験が１２６ｍｇ／ｄＬ
未満、１２０ｍｇ／ｄＬ未満、または１００ｍｇ／ｄＬ未満；（２）任意の無作為な血中
グルコース測定値が２００ｍｇ／ｄＬ未満、１８０ｍｇ／ｄＬ未満、１６０ｍｇ／ｄＬ未
満、または１４０ｍｇ／ｄＬ未満である時；（３）６．５パーセント未満、または６％未
満のヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）試験；または（４）２００ｍｇ／ｄＬ未満、１８
０ｍｇ／ｄＬ未満、１６０ｍｇ／ｄＬ未満、または１４０ｍｇ／ｄＬ未満の値を有する２
時間の経口耐糖能試験、あるいは任意のこれらの組合せ。
疾患進行が実質的に減少（好ましくは中止、特に発病過程の基礎となる自己免疫に関し
て）したら、ベータ細胞機能を回復させる方法によって対象をさらに治療することができ
る。したがって、さらなる実施形態では、対象は、ベータ細胞移植片を用いて、かつ／ま
たは内因性ベータ細胞の増殖を引き起こす薬物を用いて治療され得る。方法はＴ１Ｄの基
礎となる自己免疫を後退させることができるので、方法は発症早期の糖尿病に限定されな
い。自己免疫を破壊するベータ細胞が取り除かれたら、移植を通じて、かつ／または内因
性ベータ細胞の増殖および発生を促すことによってベータ細胞機能を回復させることがで
きる。したがって、方法は、慢性糖尿病を有する対象に適用することができる。
さらなる実施形態では、本発明の治療方法は、悪化の速度が、治療されていない疾患の
４分の３、半分、４分の１またはそれ未満となるように、疾患進行を改善する。そのよう
な悪化は、例えば、グリセミック指数、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）レベル、Ｃ断片レ
ベル、および膵島炎を通じて評価され得る。
さらなる実施形態では、本発明の治療方法は、いかなる臨床症状の前の投与などによっ
て、Ｔ１Ｄを予防するために与えられる。好ましくは、対象は、家族歴、血中および尿中
の上昇した（が糖尿病ではない）糖レベル、およびＴ１Ｄ関連抗原に対する抗体などのＴ
１Ｄのリスク因子を有するとして、および経時的なこれらのマーカーの進行性の悪化によ
って、特定される。
方法２：Ｔ１Ｄの治療のための遺伝子改変された生物を調製する方法
本開示は、本明細書に開示される遺伝子改変された微生物（例えば、ＬＡＢを調製する
方法をさらに提供する。例示的な方法は、（ｉ）微生物（例えば、ＬＡＢ）を、ＩＬ－１
０ポリペプチドをコードする外因性核酸と接触させること、および（ｉｉ）微生物（例え
ば、ＬＡＢ）を、Ｔ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポリペプチドをコードする外因
性核酸と接触させることを含み、ＩＬ－１０ポリペプチドをコードする外因性核酸および
Ｔ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポリペプチドをコードする外因性核酸は、染色体
に組み込まれている（すなわち、微生物、例えばＬＡＢの染色体に組み込まれている）。
核酸が微生物（例えば、細菌）のゲノム、例えば染色体に組み込まれている場合、遺伝子
改変された微生物（例えば、ＬＡＢ）が形成される。本方法の遺伝子改変に供される微生
物（例えば、ＬＡＢ）は、任意の微生物株であってよく、例えば、野生型細菌株であって
よく、または、それを、ＩＬ－１０ポリペプチドをコードする外因性核酸およびＴ１Ｄ特
異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポリペプチドをコードする外因性核酸と接触させる前に遺
伝子改変されてもよい。
一部の例では、上記方法は、相同組換えを用いて核酸を微生物（例えば、細菌）の染色
体に組み込む。したがって、これらの実施形態による一部の例では、ＩＬ－１０ポリペプ
チドをコードする外因性核酸およびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポリペプチド
をコードする外因性核酸は、相同組換えを使用して（例えば、各々の核酸を含有する１つ
または複数の組込みプラスミドを用いて）染色体に組み込まれる。これらの実施形態のい
ずれかによる一部の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）を、ＩＬ－１０ポリペプチドをコ
ードする外因性核酸（例えば、ＩＬ－１０ポリペプチドをコードする外因性核酸を含有す
る組込みプラスミド）と接触させることは、ＬＡＢを、Ｔ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩ
ＮＳ）ポリペプチドをコードする外因性核酸（例えば、ＰＩＮＳポリペプチドをコードす
る外因性核酸を含有する組込みプラスミド）と接触させる前に行われる。これらの実施形
態のいずれかによる他の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）を、ＩＬ－１０ポリペプチド
をコードする外因性核酸（例えば、ＩＬ－１０ポリペプチドをコードする外因性核酸を含
有する組込みプラスミド）と接触させることは、ＬＡＢを、Ｔ１Ｄ特異的抗原（例えば、
ＰＩＮＳ）ポリペプチドをコードする外因性核酸（例えば、ＰＩＮＳポリペプチドをコー
ドする外因性核酸を含有する組込みプラスミド）と接触させた後に行われる。これらの実
施形態のいずれかによるさらに他の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、ＩＬ－１０ポ
リペプチドをコードする外因性核酸（例えば、ＩＬ－１０ポリペプチドをコードする外因
性核酸を含有する組込みプラスミド）およびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポリ
ペプチドをコードする外因性核酸（例えば、ＰＩＮＳポリペプチドをコードする外因性核
酸を含有する組込みプラスミド）と同時に接触させられるか、またはｈＩＬ－１０および
ＰＩＮＳの両方をコードする外因性核酸と接触させられる。
これらの実施形態のいずれかによる一部の例では、方法は、遺伝子改変された微生物（
例えば、ＬＡＢ）の培養物を少なくとも１つの安定化剤（例えば、凍結保存剤）と合わせ
て微生物（例えば、細菌）混合物を形成することをさらに含む。一部の例では、方法は、
微生物（例えば、細菌）混合物から水を除去して乾燥組成物を形成することをさらに含む
。例えば、方法は、微生物（例えば、細菌）混合物を凍結乾燥して凍結乾燥組成物を形成
することをさらに含み得る。他の例では、方法は、遺伝子改変された微生物（例えば、Ｌ
ＡＢ）または乾燥組成物（例えば、凍結乾燥組成物）を薬学的に許容される担体と合わせ
て医薬組成物を形成することをさらに含んでもよい。方法は、乾燥組成物（例えば、凍結
乾燥組成物）または医薬組成物を医薬剤形に配合することをさらに含んでもよい。
本開示は、本明細書に記載される方法（例えば、方法２の上記実施形態のいずれかによ
る方法）によって調製された遺伝子改変された微生物（例えば、遺伝子改変されたＬＡＢ
）をさらに提供する。
方法３：医薬組成物を調製する方法
本開示は、医薬組成物を調製する方法をさらに提供する。例示的な方法は、本明細書に
開示される微生物（例えば、ＬＡＢ）（例えば、上記実施形態のいずれかによるＬＡＢ）
の培養物を少なくとも１つの安定化剤（例えば、凍結保存剤）と接触させ、それによって
微生物（例えば、細菌）混合物を形成することを含む。一部の例では、少なくとも１つの
安定化剤は、少なくとも１つの凍結保存剤を含む。一部の例では、微生物（例えば、ＬＡ
Ｂ）は、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）ポリペプチドをコードする外因性核酸を
含有し、かつＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポリペプチドをコードする外因性核
酸をさらに含有し、ＩＬ－１０ポリペプチドをコードする外因性核酸およびＴ１Ｄ特異的
抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポリペプチドをコードする外因性核酸の両方は、染色体に組み
込まれており、すなわち、微生物（例えば、細菌）の染色体に組み込まれている（または
該染色体上に位置する）。
そのような方法は、微生物（例えば、細菌）混合物から水を除去し、それによって乾燥
組成物を形成することをさらに含んでもよい。例えば、方法は、微生物（例えば、細菌）
混合物を凍結乾燥し、それによって凍結乾燥組成物を形成することを含んでもよい。
方法３の上記実施形態のいずれかによる一部の例では、方法は、乾燥組成物（例えば、
凍結乾燥組成物）を薬学的に許容される担体と接触させて医薬組成物を形成することをさ
らに含む。方法は、乾燥組成物（例えば、凍結乾燥組成物）を、錠剤、カプセル剤、また
はサシェ剤などの医薬剤形に配合することをさらに含んでもよい。
単位剤形
したがって、本開示は、本開示の微生物（例えば、ＬＡＢ）、本開示の乾燥組成物（例
えば、本開示の凍結乾燥組成物）、または本開示の医薬組成物を含む単位剤形をさらに提
供する。一部の例では、単位剤形は、錠剤、カプセル剤（例えば、粉末を含有するか、ま
たはマイクロペレットもしくはマイクロ顆粒を含有するカプセル剤）、顆粒剤、またはサ
シェ剤（例えば、経口投与用に液体に懸濁するための乾燥細菌を含有する）などの、経口
剤形である。一部の実施形態では、剤形中に含有される非病原微生物（例えば、ＬＡＢ）
は、乾燥粉末形態またはその圧縮形態である。
これらの実施形態による一部の例では、単位剤形は、約１×１０４～約１×１０１２コ
ロニー形成単位（ｃｆｕ）の微生物（例えば、ＬＡＢ）を含有する。他の例では、単位剤
形は、約１×１０６～約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の微生物（例えば、Ｌ
ＡＢ）を含有する。他の例では、単位剤形は、約１×１０８～約１×１０１１ｃｆｕを含
有する。さらに他の例では、単位剤形は、約１×１０９～約１×１０１２ｃｆｕを含有す
る。
キット
本開示は、（１）本明細書に開示される実施形態のいずれかによる微生物（例えば、Ｌ
ＡＢ）、本明細書に記載される実施形態のいずれかによる微生物（例えば、ＬＡＢ）を含
有する組成物、本明細書に記載される実施形態のいずれかによる微生物（例えば、ＬＡＢ
）を含有する医薬組成物、または本明細書に記載される実施形態のいずれかによる微生物
（例えば、ＬＡＢ）を含有する単位剤形、および（２）微生物（例えば、ＬＡＢ）、組成
物、医薬組成物、または単位剤形を哺乳動物、例えばヒト（例えば、ヒト患者）に投与す
るための説明書を含有するキットをさらに提供する。
関連する実施形態では、キットは、疾患の進行および治療の成功を確かめるための試験
（例えば、グリセミック指数、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）レベル、Ｃ断片レベル、お
よび膵島炎についての試験）をさらに含んでもよい。キットは、移植用のベータ細胞をさ
らに提供し得る。
図１Ａは、本開示による例示的な抗原特異的療法が、ＮＯＤマウスにおいて新規発症糖尿病を安定的に後退させることを実証するグラフである。指し示す通りに新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを治療し、治療開始後１４週にわたって血中グルコース濃度を追跡した。治療後に糖尿病のままであったマウスのパーセンテージを示す。「†」は、死亡または瀕死のマウスを指し示す。全てのカプラン・マイヤー生存曲線において、群間の統計的有意性は、マンテル・コックスのログランク検定によって決定した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 図１Ｂは、本開示による例示的な抗原特異的療法が、ＮＯＤマウスにおいて残留ベータ細胞機能を保存することを実証するグラフを描写する。治療終了の１～２週前にＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）に加えて新規発症糖尿病ＮＯＤマウスに対して腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）を行った。２時間にわたる耐糖能曲線（ＡＵＣグルコース；ｍｇ／ｄｌ×１２０分）下の対応する面積を示す。レスポンダーは、治療後に正常血糖（例えば、糖尿なしかつ血中グルコース測定値＞２００ｍｇ／ｄｌ）に戻る対象として本明細書では使用される。 図１Ｃは、本開示による例示的な抗原特異的療法がＮＯＤマウスにおいて膵島炎の進行を停止させることを実証するグラフである。治療の終了時に、指し示す通りに、新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）のパラフィン包埋膵臓切片に対して盲検で膵島炎スコア付けを行った。群間の統計的有意性はマン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊＊Ｐ＜０．０１。 図２Ａは、開始時血中グルコース濃度による糖尿病寛解率を示すグラフである。試験加入時の開始時血糖が３５０ｍｇ／ｄｌより低いのか、それとも高いのかに基づいて新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを層化した。本開示の臨床グレードのＬ．ラクチス（L. lactis）株を用いる併用治療（ＣＴ）後に糖尿病のままであったマウスのパーセンテージを示す。カプラン・マイヤー生存曲線において、群間の統計的有意性をマンテル・コックスのログランク検定によって決定した；＊＊Ｐ＜０．０１。 図２Ｂは、試験加入時のインスリン自己抗体（ＩＡＡ）陽性性に応じた糖尿病寛解率を示すグラフである。試験加入時の開始時血糖が３５０ｍｇ／ｄｌより低いのか、それとも高いのかに基づいて新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを層化した。本開示の臨床グレードのＬ．ラクチス（L. lactis）株を用いる併用治療（ＣＴ）後に糖尿病のままであったマウスのパーセンテージを示す。 図２Ｃは、加入時の開始時血糖およびＩＡＡ陽性性が治療の成功と関係することを示すグラフである。試験加入時の開始時血糖が３５０ｍｇ／ｄｌより低いのか、それとも高いのかおよびＩＡＡ陽性性に基づいて新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを層化した。治療後に寛容化されたマウスのパーセンテージを示す。 図２Ｄは、治療前後の間のＩＡＡ陽性性の変化が治療レスポンダーにおいて有意に異なったことを示すグラフを描写する。治療レスポンダー（上パネル）およびノンレスポンダー（下パネル）における糖尿病診断時およびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用治療の追跡後のＩＡＡレベルを示す。群間の統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊＊Ｐ＜０．０１。１匹のマウスについてＩＡＡの開始レベルは１３９とｙ軸の限度外であったので、示していない。 図３Ａは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の末梢血中のＣＤ４＋ Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋細胞（中央パネル）、および全Ｆｏｘｐ３＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 図３Ｂは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓の灌流リンパ節中のＣＤ４＋ Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋細胞（中央パネル）、および全Ｆｏｘｐ３＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 図３Ｃは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓中のＣＤ４＋ Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋細胞（中央パネル）、および全Ｆｏｘｐ３＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 図３Ｄは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の末梢血中のＣＤ４＋ Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（中央パネル）、およびＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 図３Ｅは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓の灌流リンパ節中のＣＤ４＋ Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（中央パネル）、およびＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊ ＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 図３Ｆは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓中のＣＤ４＋ Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（中央パネル）、およびＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 図４は、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法が、レスポンダーおよびノンレスポンダーにおいて抑制性ＩＬ１０分泌Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのポリクローナルサプレッサーアッセイのために、ＣＤ４＋ＣＤ２５－エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を正常血糖ＮＯＤマウスから単離し、色素標識し、指し示した６週の治療の終了時にＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ｈＣＤ２マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）から単離した、アクセサリー細胞および増加させた比のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋またはＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の存在下で、可溶性抗ＣＤ３を使用して７２時間刺激した。色素希釈のフローサイトメトリー解析によってＴｅｆｆ細胞の増殖を測定し、エフェクターのみの培養物に対して正規化した、２回またはそれより多く分裂したＴｅｆｆ細胞のパーセンテージとして示した。ＣＤ６９のフローサイトメトリー解析によってＴｅｆｆ細胞の活性化を測定し、エフェクターのみの培養物に対して正規化したＭＦＩとして示した。Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆ培養物中のＩＦＮ－γおよびＩＬ１０濃度のＭＳＤ高感度マルチプレックスアッセイ。群間の統計的有意性は、クラスカル・ウォリス検定の後にダネットの多重検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図５Ａは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法で誘導されたＴｒｅｇがＣＴＬＡ４およびＴＧＦ－βに依存してＴエフェクター細胞応答を制御することを示すグラフである。２回またはそれより多く分裂したＴエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞のパーセンテージとして示す、エフェクターのみの培養による増殖に対して正規化したＴｅｆｆの増殖。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ｈＣＤ２マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）から単離したアクセサリー細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋、および指し示した中和抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、色素標識したＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ）を刺激した。群間の統計的有意性は、クラスカル・ウォリス検定の後にダネットの多重検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。図５Ｂは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法で誘導されたＴｒｅｇがＣＴＬＡ４およびＴＧＦ－βに依存してＴエフェクター細胞応答を制御することを示すグラフである。２回またはそれより多く分裂したＴエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞のパーセンテージとして示す、エフェクターのみの培養による増殖に対して正規化したＴｅｆｆの増殖。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ｈＣＤ２マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）から単離したアクセサリー細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋ 細胞（Ｔｒｅｇ）、および指し示した中和抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、色素標識したＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ）を刺激した。群間の統計的有意性は、クラスカル・ウォリス検定の後にダネットの多重検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。図５Ｃは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法で誘導されたＴｒｅｇがＣＴＬＡ４およびＴＧＦ－βに依存してＴエフェクター細胞応答を制御することを示すグラフである。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法で治癒したマウスに抗ＣＴＬＡ４および抗ＴＧＦ－β抗体（ｎ＝５）を注射し、糖尿病の再発（糖尿および血中グルコース測定値＞２００ｍｇ／ｄｌ）について追跡した。 図６Ａは、新規発症糖尿病ＮＯＤマウスにおけるＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）および特異的ＦＯＸＰ３阻害剤Ｐ６０（腹腔内、５０μｇ／日）の同時投与の処理スキームである。 図６Ｂは、Ｔｒｅｇ機能の特異的阻害が治療誘導性の寛容を損なうことを示すグラフである。治療後に糖尿病のままであったマウスのパーセンテージを示す。カプラン・マイヤー生存曲線において、群間の統計的有意性はマンテル・コックスのログランク検定によって決定した；＊Ｐ＜０．０５。 図７Ａは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）で治癒したＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおけるジフテリア毒素（ＤＴ）によるＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞枯渇の処理スキームである。 図７Ｂは、Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞枯渇がＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおいてＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法誘導性の寛容を破壊することを示すグラフである。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ｎ＝７）の間およびＤＴ処理後の新規発症糖尿病ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウス（ｎ＝４）における血中グルコース測定値。無作為の血中グルコース濃度が２００ｍｇ／ｄｌ未満に回復した時にマウスは治癒した（白い記号）と考え、またはマウスが２００ｍｇ／ｄｌより高い血中グルコース濃度を維持した時に治癒されなかった（黒い記号）と考えた。 図７Ｃは、治療で治癒したＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスの膵臓におけるＤＴ処理の前後の膵島炎スコア付けを示すグラフである。 図７Ｄは、治療で治癒したＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスの膵臓におけるＤＴ処理の前後の膵島内Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の定量化を示すグラフである。併用療法寛容化マウスからの膵臓切片をインスリン（赤）、ＣＤ４（紫色）およびＦｏｘｐ３（緑）について染色し、白い矢頭は、一部インスリン陽性のランゲルハンス島内のＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の存在を指し示す。囲った区画のより高倍率はＦｏｘｐ３＋細胞がＣＤ４＋ Ｔ細胞であることを明確に指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 図８Ａは、新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の末梢血中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋（左）、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋（中央）、およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（右）Ｔ細胞集団内のＣＴＬＡ４＋細胞のパーセンテージを示すグラフを描写する。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊ ＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 図８Ｂは、新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓の灌流リンパ節中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋（左）、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋（中央）、およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（右）Ｔ細胞集団内のＣＴＬＡ４＋細胞のパーセンテージを示すグラフを描写する。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 図８Ｃは、新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋（左）、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋（中央）、およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（右）Ｔ細胞集団内のＣＴＬＡ４＋細胞のパーセンテージを示すグラフを描写する。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 図９は、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法寛容化マウスでは病的Ｔエフェクター細胞が枯渇されていないことを示すグラフである。明白に糖尿病（白の菱形）、併用療法（ＣＴ）レスポンダー（白丸）またはノンレスポンダー（クロスした丸）から単離した全脾臓細胞（１×１０７）の養子移入。統計計算はマンテル・コックスのログランク検定を使用して行った；「ｎｓ」：有意でない。 図１０Ａは、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおいてＤＴを用いてＦｏｘｐ３＋細胞を枯渇させる図式的なスキームである。４回の連続的な腹腔内ＤＴ注射（１、２、５および７日目（ｄ））（４０μｇ／ｋｇ体重／ｄ）をスキーム中に指し示す。 図１０Ｂは、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおけるＤＴを用いたＦｏｘｐ３＋細胞の枯渇を示すグラフを描写する。末梢血のフローサイトメトリー解析は、ＤＴ処理ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおけるＦｏｘｐ３＋細胞の効率的な枯渇を実証した。膵臓切片のＦｏｘｐ３染色は、ＤＴ処理ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおいて膵島内Ｆｏｘｐ３＋細胞の効果的な枯渇を示した。 図１０Ｃは、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウス（左パネル）の２回の連続的なＤＴ注射の前（ｄ０）および後（ｄ３およびｄ５）のＦｏｘｐ３およびＤＴＲ－ＧＦＰ融合タンパク質について陽性のＣＤ４＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示す代表的なフローサイトメトリープロファイルを描写する。 図１０Ｄは、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおける急性Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇ枯渇時の急速な糖尿病の発症を実証するグラフである。 図１１は、ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、ＩＬ－１０分泌配列（ＳＳｕｓｐ４５）、およびヒトＩＬ－１０をコードする例示的な核酸配列を含む例示的なＩＬ－１０発現カセット（配列番号１３）（および対応するアミノ酸配列）を表したものであり、該配列は、その天然のシグナルペプチドなしで使用され、指し示したＩＬ－１０配列の２位において（ＰｒｏからＡｌａへの）点変異を含む（ｈＩＬ１０ａＰｘＡ）。配列番号１４は、ヒトＩＬ－１０配列に連結されたＩＬ－１０分泌配列のアミノ酸配列である。 図１２Ａおよび図１２Ｂは合わせて、ｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）、ｇａｐＢ遺伝子、例示的な遺伝子間領域（ｒｐｍＤ）、ヒトＰＩＮＳをコードする例示的な核酸配列に翻訳上連結された例示的なＰＩＮＳ分泌配列（ＳＳｕｓｐ４５）を含有する例示的なＰＩＮＳポリシストロン性発現カセット（配列番号１５）を表したものである。配列番号１６は、ｇａｐＢ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列である。配列番号１７は、ＰＩＮＳ分泌配列によってコードされるアミノ酸配列、および翻訳上連結されたヒトＰＩＮＳ配列である。 図１２Ａおよび図１２Ｂは合わせて、ｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）、ｇａｐＢ遺伝子、例示的な遺伝子間領域（ｒｐｍＤ）、ヒトＰＩＮＳをコードする例示的な核酸配列に翻訳上連結された例示的なＰＩＮＳ分泌配列（ＳＳｕｓｐ４５）を含有する例示的なＰＩＮＳポリシストロン性発現カセット（配列番号１５）を表したものである。配列番号１６は、ｇａｐＢ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列である。配列番号１７は、ＰＩＮＳ分泌配列によってコードされるアミノ酸配列、および翻訳上連結されたヒトＰＩＮＳ配列である。 図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃ（配列番号１８）は合わせて、トレハロース－６－リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）の欠失、トレハロースオペロン中の推定上のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＴＳ；ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４；ｐｔｓＩおよびｐｔｓＩＩ；それぞれ、遺伝子ＩＤ：４７９７７７８および遺伝子ＩＤ：４７９７０９３）に先行するＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の挿入、ｐｔｓＩとｐｔｓＩＩとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入を表したものである。 図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃ（配列番号１８）は合わせて、トレハロース－６－リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）の欠失、トレハロースオペロン中の推定上のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＴＳ；ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４；ｐｔｓＩおよびｐｔｓＩＩ；それぞれ、遺伝子ＩＤ：４７９７７７８および遺伝子ＩＤ：４７９７０９３）に先行するＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の挿入、ｐｔｓＩとｐｔｓＩＩとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入を表したものである。 図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃ（配列番号１８）は合わせて、トレハロース－６－リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）の欠失、トレハロースオペロン中の推定上のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＴＳ；ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４；ｐｔｓＩおよびｐｔｓＩＩ；それぞれ、遺伝子ＩＤ：４７９７７７８および遺伝子ＩＤ：４７９７０９３）に先行するＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の挿入、ｐｔｓＩとｐｔｓＩＩとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入を表したものである。 図１４Ａおよび図１４Ｂ（配列番号１９）は合わせて、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５；遺伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流のトレハロース－６－リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）の挿入を表したものである。ｕｓｐ４５とｏｔｓＢとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入。 図１４Ａおよび図１４Ｂ（配列番号１９）は合わせて、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５；遺伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流のトレハロース－６－リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）の挿入を表したものである。ｕｓｐ４５とｏｔｓＢとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入。 図１５Ａおよび図１５Ｂ（配列番号２０、２１および２５）は合わせて、４４６のうちのコドン位置３０におけるｔｇａ（ｔｇａ３０）の挿入と共に、その傍らの、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネントをコードする遺伝子（ｐｔｃＣ；遺伝子ＩＤ：４７９６８９３）を破壊するためのＥｃｏＲＩ制限部位の導入を表したものである。 図１５Ａおよび図１５Ｂ（配列番号２０、２１および２５）は合わせて、４４６のうちのコドン位置３０におけるｔｇａ（ｔｇａ３０）の挿入と共に、その傍らの、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネントをコードする遺伝子（ｐｔｃＣ；遺伝子ＩＤ：４７９６８９３）を破壊するためのＥｃｏＲＩ制限部位の導入を表したものである。 図１６（配列番号２２）は、高発現されるグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇａｐＢ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７７）の下流の、ヒトプロインスリン（ＰＩＮＳ；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１３０８、アミノ酸２５～１１０）をコードする、ｐｉｎｓ遺伝子とのｕｓｐ４５分泌リーダー（ＳＳｕｓｐ４５）の融合物をコードする遺伝子の挿入を表したものである。ｇａｐＢとｐｉｎｓとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入。 図１７（配列番号２３）は、チミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ；遺伝子ＩＤ：４７９８３５８）の欠失を表したものである。ＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の下流に、ヒトインターロイキン－１０（ｈＩＬ－１０；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２２３０１、ａａ １９～１７８、バリアントＰ２Ａ、Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789）をコードするｈｉｌ－１０遺伝子とのＳＳｕｓｐ４５の融合物（配列番号２４）をコードする遺伝子の挿入物を挿入してｈＩＬ－１０の発現および分泌を可能にする。 図１８は、記載された通りのｓＡＧＸ０４０７の関連する遺伝子座：ｔｒｅＰＴＳ、ΔｔｒｅＰＰ；ｏｔｓＢ；ｐｔｃＣ－；ｇａｐＢ＞＞ｐｉｎｓおよびΔｔｈｙＡ、ｈＩＬ－１０の図式的な概要であり、関連するオリゴヌクレオチド結合部位（ｏＡＧＸｎｏ）、ＥｃｏＲＩ制限部位、（／切断／）遺伝子の特徴、遺伝子間領域（ＩＲ）、ＰＣＲ増幅産物の大きさ（ｂｐ）を指し示している。
詳細な説明
対象においてＴ１Ｄを治療し、かつ／またはＴ１Ｄ特異的抗原（すなわち、ＰＩＮＳ）
に対する寛容を回復させるための組成物および方法が提供される。
定義
本明細書および実施形態において使用される場合、文脈が明らかにそうでないことを規
定しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数への言及を包含する。
例えば、「細胞」（a cell）という用語は、その混合物などの、複数の細胞を包含する。
同様に、本明細書に記載される治療または医薬の調製のための「化合物」（a compound）
の使用は、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り、そのような治療または調製
のために１つまたは複数の本発明の化合物を使用することを想定する。
本明細書で使用される場合、「～を含む」（comprising）という用語は、組成物および
方法が記載された要素を含むが、他のものを除外しない意味であることを意図する。組成
物および方法を定義するために使用される場合、「～から本質的になる」は、組合せに対
して何らかの本質的な意義を持つ他の要素を除外することを意味する。したがって、本明
細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量の汚染
物、および、リン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などの薬学的に許容される担体を除外しない
。「～からなる」は、他の成分の微量元素、および本発明の組成物を投与する実体的な方
法ステップを超えるものを除外することを意味する。これらの移行句（transition terms
）のそれぞれによって定義される実施形態は本発明の範囲内にある。
本明細書で使用される場合、遺伝子またはポリペプチドを「発現する」、またはポリペ
プチド（例えば、ＩＬ－１０ポリペプチドまたはＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチド）を「産
生する」、またはポリペプチドを「分泌する」という用語は、それぞれ、「発現できる」
および「産生できる」または「分泌できる」ことを包含する意味である。例えば、外因性
核酸を含有する微生物は、充分な条件下（例えば、充分な含水および／または栄養分の存
在下）で、外因性核酸によってコードされたポリペプチドを発現しかつ分泌することがで
きる。しかしながら、微生物は、コードされたポリペプチドを必ずしも活動的に発現しな
くてもよい。微生物（例えば、細菌）は、乾燥（例えば、凍結乾燥）されていてもよく、
その状態では休眠している（すなわち、ポリペプチドを活動的に産生していない）と考え
ることができる。しかしながら、微生物が充分な条件に供されると、例えば、対象に投与
されて（例えば、対象の胃腸管中で）放出されると、微生物はポリペプチドの発現および
分泌を開始することがある。したがって、本開示の遺伝子またはポリペプチドを「発現し
」、ポリペプチドを「産生し」、またはポリペプチドを「分泌する」微生物は、その「休
眠」状態の微生物を包含する。本明細書で使用される場合、「～を分泌する」は、タンパ
ク質が細胞外かつ培養培地／上清中または他の細胞外環境中に輸送されることを意味する
。
本明細書で使用される場合、プロモーターの文脈での（または遺伝子発現もしくはポリ
ペプチドの分泌に関するものに拡張された）「構成的」という用語は、それが関連する遺
伝子の絶え間ない転写を可能とするプロモーターを指す。構成的プロモーターは、「誘導
性」プロモーターと対比される。
参照数値に関する「約」という用語、およびその文法的同等物は、本明細書で使用され
る場合、参照数値それ自体およびその参照数値からプラスまたはマイナス１０％の値の範
囲を包含できる。例えば、「約１０」という用語は、１０、および９～１１を含めて９～
１１からの任意の値を包含する。一部の場合には、参照数値に関する「約」という用語は
、その参照数値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％
、３％、２％、または１％の値の範囲も包含し得る。一部の実施形態では、特定の方法に
よって測定された数または範囲と関連する「約」は、所与の数値がその方法のばらつきに
よって決定される値を包含することを指し示す。
「ＩＬ－１０遺伝子」は、「ＩＬ－１０ポリペプチド」をコードするインターロイキン
１０遺伝子を指す。「ＩＬ－１０遺伝子」という用語は、「ＩＬ－１０バリアントポリペ
プチド」をコードする「ＩＬ－１０バリアント遺伝子」を包含する。ＬＡＢ中のＩＬ－１
０をコードするＤＮＡ配列は、ＬＡＢ中での発現を促進するように最適化されたコドンで
あってよく、そのため、天然生物（例えば、ヒト）中のものとは異なってよい。
「ＩＬ－１０」または「ＩＬ－１０ポリペプチド」という用語は、少なくとも成熟型（
すなわち、その分泌シグナルを含まない）のアミノ酸配列を有する機能的なＩＬ－１０ポ
リペプチド（例えば、ヒトＩＬ－１０ポリペプチド）を指すが、膜結合型および可溶型の
他に「ＩＬ－１０バリアントポリペプチド」も包含する。
「ＩＬ－１０バリアント」または「ＩＬ－１０バリアントポリペプチド」は、改変（例
えば、切断または変異）されているが、機能的なＩＬ－１０ポリペプチドを指し、例えば
、切断型または変異型のヒトＩＬ－１０である。「ＩＬ－１０バリアントポリペプチド」
という用語は、対応する野生型ＩＬ－１０ポリペプチドと比べた時に増進された活性また
は減少された活性を有するＩＬ－１０ポリペプチドを包含する。「ＩＬ－１０バリアント
ポリペプチド」は、少なくとも一部のＩＬ－１０活性（機能的なポリペプチド）を保持す
る。
ポリペプチド配列間の「同一性パーセンテージ」は、参照配列をクエリ配列と比較する
市販のアルゴリズムを使用して算出することができる。一部の実施形態では、ポリペプチ
ドは、（例えば、ＢＬＡＳＴＰもしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他のアライメントソフト
ウェアによる測定で）デフォルトのパラメーターを使用して、参照ポリペプチド、または
その断片に対して７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少な
くとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９２％、少なく
とも９２％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくと
も９８％、９９％、または少なくとも９９％または１００％同一である。同様に、核酸は
また、出発核酸を参照して記載することもでき、例えば、核酸は、（例えば、デフォルト
のパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＮもしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他のアライメン
トソフトウェアによる測定で）参照核酸またはその断片に対して５０％、少なくとも５０
％、６０％、少なくとも６０％、７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％
、８０％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、
９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９
９％、少なくとも９９％、または１００％同一であり得る。ある分子がより大きい分子と
ある特定のパーセンテージの配列同一性を有すると言われる場合、それは、２つの分子が
最適にアライメントされた時に、２つの分子が最適にアライメントされた順序にしたがっ
てより小さい分子中の該パーセンテージの残基がより大きい分子中の残基とマッチし、「
％」（パーセント）同一性がより小さい分子の長さにしたがって算出されることを意味す
る。
「染色体に組み込まれた」もしくは「染色体中に組み込まれた」という用語またはその
任意の変形は、核酸配列（例えば、遺伝子；オープンリーディングフレーム；ポリペプチ
ドをコードする外因性核酸；プロモーター；発現カセットなど）が、微生物（例えば、細
菌）の染色体上に位置すること（該染色体中に組み込まれていること）、すなわち、プラ
スミドなどのエピソームベクター上には位置しないことを意味する。核酸配列が染色体に
組み込まれる一部の実施形態では、そのような染色体に組み込まれた核酸によってコード
されたポリペプチドは、構成的に発現される。
「自己抗原」または「自家抗原」という用語は、本明細書において交換可能に使用され
る。これらの用語は、自己抗原または自家抗原の当該技術分野で認識される意味にしたが
って本明細書において使用され、一般に、対象自身の身体に起因する（対象自身の身体に
よって産生された）ポリペプチド／タンパク質を指し、該抗原は、対象自身の免疫系によ
って認識され、そのような抗原に対する抗体を典型的に産生する。自己免疫疾患は、一般
に、ある特定の疾患特異的な自己抗原に関連する。例えば、Ｔ１Ｄにおいて、対象の免疫
系は、ベータ細胞破壊プロセスに関連する少なくとも１つの抗原に対する抗体を産生する
ことがある。そのような自己抗原としては、プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸
デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ－２）、膵
島特異的グルコース－６－ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ
）および亜鉛トランスポーター（ＺｎＴ）８が挙げられる。臨床的なＴ１Ｄは、クロモグ
ラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリンお
よびシトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）などのベータ細胞によって発現さ
れる追加の候補標的分子にさらに関連することがある。
「Ｔ１Ｄ特異的抗原遺伝子」という用語は、上記「Ｔ１Ｄ特異的抗原」をコードする遺
伝子を指す。「Ｔ１Ｄ特異的抗原遺伝子」という用語は、「Ｔ１Ｄ特異的抗原バリアント
ポリペプチド」をコードする「Ｔ１Ｄ特異的抗原バリアント遺伝子」を包含する。ＬＡＢ
中のＴ１Ｄ抗原をコードするＤＮＡ配列は、ＬＡＢ中での発現を促進するように最適化さ
れたコドンであってよく、そのため、天然生物（例えば、ヒト）中のものとは異なってよ
い。
「Ｔ１Ｄ特異的抗原ポリペプチド」という用語は、対応する野生型ポリペプチドと比べ
た時に増進された活性または減少された活性を有し得る、機能的な、例えば、全長の、ポ
リペプチドの他に、「Ｔ１Ｄ特異的抗原バリアントポリペプチド」を指す。Ｔ１Ｄ特異的
抗原はまた、真核性シグナル配列を欠くこともある。
「Ｔ１Ｄ特異的抗原バリアント」または「Ｔ１Ｄ特異的抗原バリアントポリペプチド」
という用語は、改変（例えば、切断または変異）されているが、機能的なポリペプチドを
指し、例えば、切断型または変異型のヒトＰＩＮＳを指す。「バリアントポリペプチド」
という用語は、対応する野生型ポリペプチドと比べた時に増進された活性または減少され
た活性を有するポリペプチドを包含する。「バリアントポリペプチド」は、少なくとも一
部の生物学的活性（機能的なポリペプチド）を保持する。ＧＡＤ６５およびＩＡ－２の例
示的なバリアントとしては、抗原特性を保持するその切除型（例えば、ＮＣＢＩ受託番号
ＮＰ＿０００８０９．１およびＮＰ＿００２８３７．１に関して、それぞれＧＡＤ６５３
７０～５７５、およびＩＡ－２６３５～９７９が挙げられ、したがって、例えば、対象に
おけるＴｒｅｇの刺激および寛容の誘導において、本開示の組成物および方法において有
用である。一般に、切除型または切断型のＴ１Ｄ特異的抗原は、微生物（例えば、ラクト
コッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））によって効率的に発現および分泌される。
「作動可能に連結された」という用語は、記載された複数のコンポーネントが、意図し
た様式で機能することを可能とする関係性で並置されていることを指す。コーディング配
列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列に適合性の条件下でコーディング配
列の発現が達成されるようにライゲートされている。例えば、プロモーターは、連結また
は接続が遺伝子の転写を可能としまたはもたらす場合に、前記遺伝子、オープンリーディ
ングフレームまたはコーディング配列に作動可能に連結されていると言われる。さらなる
例では、５’および３’の遺伝子、シストロン、オープンリーディングフレームまたはコ
ーディング配列は、連結または接続が少なくとも３’の遺伝子の翻訳を可能としまたはも
たらす場合に、ポリシストロン性発現ユニット中で作動可能に連結されていると言われる
。例えば、例えばプロモーターおよびオープンリーディングフレームなどのＤＮＡ配列は
、配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を結果としてもたらさない、
（２）オープンリーディングフレームの転写を導くプロモーターの能力に干渉しない、ま
たは（３）オープンリーディングフレームがプロモーター領域配列によって転写される能
力に干渉しない場合に、作動可能に連結されていると言われる。
抗ＣＤ３抗体
「抗ＣＤ３抗体」は、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３受容体に結合する任意の抗体であってよ
く、例えば、ＣＤ３のイプシロン鎖（ＣＤ３Ｅ）を標的化する抗体である。「抗ＣＤ３抗
体」という用語は、Ｆａｂ断片、単一ドメイン抗体、ナノボディなどの、そのような抗体
の任意の断片を包含する。一部の例では、抗ＣＤ３抗体またはその断片は、モノクローナ
ル抗体である。他の例では、抗ＣＤ３抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、例えば、キメ
ラまたはヒト化ハイブリッド抗体である。一部の例では、抗ＣＤ３抗体は、単一ドメイン
抗体またはナノボディである。他の例では、抗ＣＤ３抗体は、ムロモナブ－ＣＤ３である
。他の公知のモノクローナル抗ＣＤ３抗体としては、オテリキシズマブ、テプリズマブお
よびビジリズマブ、およびこれらの断片が挙げられる。これらの抗体は、クローン病、潰
瘍性大腸炎および１型糖尿病のような状態の治療（例えば、Herold K.C. and Taylor L.;
“Treatment of Type 1 diabetes with anti-CD3 monoclonal antibody: induction of
immune regulation?”. Immunologic Research 2003, 28 (2): 141-50を参照）および免
疫寛容の誘導について研究されている。例えば、Bisikirska et al. “TCR stimulation
with modified anti-CD3 mAb expands CD8+ T cell population and induces CD8+CD25+
Tregs” (2005)、およびBisikirska et al., “Use of Anti-CD3 Monoclonal Antibody t
o Induce Immune Regulation in Type 1 Diabetes”. Annals of the New York Academy
of Sciences 2004, 1037: 1-9を参照。一部の例では、抗ＣＤ３抗体は、エフェクターＴ
細胞（例えば、インスリン産生性ベータ細胞を攻撃し、壊す）の機能を阻害し、かつ／ま
たは制御性Ｔ細胞を刺激する。したがって、一部の例では、抗ＣＤ３抗体は、エフェクタ
ーＴ細胞による損傷から対象を保護し、例えば、インスリンを産生するベータ細胞の能力
を守る。一部の例では、抗ＣＤ３抗体は、ヒトへの投与のために好適であり、例えば、臨
床試験の対象であるか、または規制機関によって既に認可されている。一部の例では、抗
ＣＤ３抗体は、オテリキシズマブまたはテプリズマブである。
発症直後のＴ１Ｄ
本発明者らは、ある特定の最小量の残留ベータ細胞機能を有する対象が、本明細書に記
載される治療方法に特によく反応することを発見した。残留ベータ細胞機能は、当該技術
分野で認識され本明細書に記載される方法にしたがって測定することができる。しかしな
がら、充分な残留ベータ細胞機能は、典型的に、対象のベータ細胞を標的化する有害な自
己免疫機能への長すぎる曝露を受けていない対象において見出される。したがって、一部
の実施形態では、上記方法における哺乳動物対象は、Ｔ１Ｄを有すると診断された直後の
対象である。例えば、そのような対象は、「発症直後のＴ１Ｄ」または「新規発症Ｔ１Ｄ
」（本明細書において交換可能に使用される）を有すると称することができる。これらの
実施形態による一部の例では、対象は、本開示による組成物を投与する前の１２カ月以内
、１８カ月以内、または２４カ月以内にＴ１Ｄを有すると診断された対象である。他の例
では、対象は、約１２週未満、約８週未満、約６週未満、または約４週未満にわたってイ
ンスリンを用いて治療された対象である。他の例では、上記実施形態のいずれかによれば
、対象は、少なくとも１つの自家抗体についての試験で陽性、例えば、インスリン自己抗
体（ＩＡＡ）、膵島細胞自家抗体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（例えば、ＧＡＤ６
５）自家抗体、および／またはＩＣＡ５１２抗体についての試験で陽性であった対象であ
る。他の例では、上記実施形態のいずれかによれば、対象は、約１００ｍｇ／ｄＬより高
い、または約１２０ｍｇ／ｄＬより高い、または約１２６ｍｇ／ｄＬより高い空腹時血漿
グルコースレベルを有する。他の例では、上記実施形態のいずれかによれば、対象は、約
１８０～約２５０ｍｇ／デシリットル（ｍｇ／ｄＬ）、または約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１
４ｍｍｏｌ／Ｌの空腹時血漿グルコースレベルを有する。他の例では、上記実施形態のい
ずれかによれば、対象は、約１００～約５００ｍｇ／ｄＬの血漿グルコースレベルを有す
る。他の例では、上記実施形態のいずれかによれば、対象は、約８カ月未満、約６カ月未
満、または約４カ月未満にわたって多尿症であった対象である。
一部の例では、ヒト対象は、該対象において以下のいずれか１つが測定された時に発症
早期Ｔ１Ｄを有すると分類され得る：（１）２回の連続的な空腹時血中グルコース試験が
１２６ｍｇ／ｄＬに等しいまたはそれより大きい；（２）任意の無作為な血中グルコース
測定値が２００ｍｇ／ｄＬより大きい時；（３）６．５パーセントに等しいまたはそれよ
り大きいヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）試験（ＨｂＡ１ｃは血糖の３カ月平均を与え
る血液試験である）；または（４）２００ｍｇ／ｄＬを上回る任意の値を有する２時間の
経口耐糖能試験、あるいはこれらの組合せ。したがって、正常血糖は、以下のいずれかに
よって特徴付けられ得る：（１）２回の連続的な空腹時血中グルコース試験が１２６ｍｇ
／ｄＬ未満、１２０ｍｇ／ｄＬ未満、または１００ｍｇ／ｄＬ未満；（２）任意の無作為
な血中グルコース測定値が２００ｍｇ／ｄＬ未満、１８０ｍｇ／ｄＬ未満、１６０ｍｇ／
ｄＬ未満、または１４０ｍｇ／ｄＬ未満である時；（３）６．５パーセント未満、または
６％未満のヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）試験；または（４）２００ｍｇ／ｄＬ未満
、１８０ｍｇ／ｄＬ未満、１６０ｍｇ／ｄＬ未満、または１４０ｍｇ／ｄＬ未満の値を有
する２時間の経口耐糖能試験、あるいは任意のこれらの組合せ。
治療後に正常血糖（例えば、糖尿なしかつ血中グルコース測定値＞２００ｍｇ／ｄｌ）
に戻る対象は、治療に対する「レスポンダー」と考えることができる。実質的な正常血糖
に戻らない対象は「ノンレスポンダー」である。
対象の血液または尿中のＣペプチドの濃度を使用して対象のベータ細胞機能およびＴ１
Ｄ疾患ステージを評価することができ、Ｃペプチドのより高い濃度はより高いベータ細胞
機能を指し示す。一部の例では、対象（例えば、ヒト患者）は、約１ｎｍｏｌ／Ｌ未満で
あるが少なくとも約０．２ｎｍｏｌ／Ｌの空腹時血中Ｃペプチド濃度を有することによっ
て特徴付けられる、発症直後のＴ１Ｄを有する。他の実施形態では、発症直後の対象（例
えば、ヒト患者）は、例えば、約５ｎｍｏｌ／Ｌ未満であるが少なくとも約０．２ｎｍｏ
ｌ／Ｌ、または約４ｎｍｏｌ／Ｌ未満であるが少なくとも約０．５ｎｍｏｌ／Ｌの、４時
間の混合食負荷試験（ＭＭＴＴ）の間に刺激された血中Ｃペプチド濃度を有する。他の好
適なＣペプチド範囲は、本明細書に記載される。したがって、刺激されたＣペプチドは、
ＭＭＴＴ曲線下面積Ｃペプチド（ＡＵＣ ＣＰ）を使用して測定することができ、または
代替的に、９０分のＭＭＴＴで刺激されたＣＰ（ＭＭＴＴ後９０ＣＰまたは９０ＣＰ）を
使用して測定することができる。
プロモーター
「プロモーター」は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始させる、核酸
分子上、例えばＤＮＡ分子上の領域を意味する。プロモーターは、例えば、プロモーター
が転写を制御する配列の上流、すなわち５’に位置する。プロモーターは、追加の天然調
節配列または領域、例えばオペレーターに関連してもよいことを当業者は理解するであろ
う。発現のために必要とされる調節領域の精密な性質は生物ごとに異なることがあるが、
一般に、原核生物において、（ＲＮＡ転写の開始を導く）プロモーターの他に、ＲＮＡに
転写された時に、タンパク質合成の開始のシグナルを送るＤＮＡ配列の両方を含有するプ
ロモーター領域を含む。そのような領域は、通常、プリブノーボックス（ＴＡＴＡボック
スを参照）、シャイン・ダルガノ配列などの、転写および翻訳の開始に関与する５’－非
コーディング配列を含む。
発現カセット
「発現カセット」または「発現ユニット」という用語は、当該技術分野において一般に
認められる意味にしたがって使用され、１つまたは複数の遺伝子および該１つまたは複数
の遺伝子の発現を制御する配列を含有する核酸を指す。例示的な発現カセットは、少なく
とも１つのプロモーター配列および少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含
有する。
ポリシストロン性発現カセット
「ポリシストロン性発現カセット」、「ポリシストロン性発現ユニット」または「ポリ
シストロン性発現システム」という用語は、当該技術分野において一般に認められる意味
にしたがって本明細書において交換可能に使用される。それらは、２つまたはそれより多
くの遺伝子の発現が、プロモーター、オペレーターなどの共通の調節機構によって調節さ
れる核酸配列を指す。本明細書で使用されるポリシストロン性発現ユニットという用語は
、マルチシストロン性発現ユニットと同義である。ポリシストロン性発現ユニットの例は
、２シストロン性、３シストロン性、４シストロン性の発現ユニットであるが、これらに
限定されない。タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドなどの個々の発現産物
をコードする、２つまたはそれより多く（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ
、９つ、１０、またはそれより多く）のオープンリーディングフレームまたはコーディン
グ領域を含む任意のｍＲＮＡは、ポリシストロン性という用語に包含される。ポリシスト
ロン性発現カセットは、少なくとも１つのプロモーター、および該プロモーターによって
制御された少なくとも２つのオープンリーディングフレームを含み、該２つのオープンリ
ーディングフレームの間に遺伝子間領域が配置されてもよい。
一部の例では、「ポリシストロン性発現カセット」は、微生物（例えば、ＬＡＢ）に内
因性のプロモーターによって転写制御される１つまたは複数の内因性遺伝子および１つま
たは複数の外因性遺伝子を含む。本明細書に記載されるポリシストロン性発現ユニットま
たはシステムは、微生物（例えば、ＬＡＢ）に外因性のプロモーターによって転写制御さ
れ得る。さらなる実施形態では、本明細書に記載される翻訳上または転写上連結された１
つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子は、前記１つまたは複
数の内因性遺伝子（の１つ）の天然プロモーターによって転写制御される。別の実施形態
では、ポリシストロン性発現ユニットは、前記ポリシストロン性発現ユニットに含まれる
前記１つまたは複数の内因性遺伝子（の１つ）の天然プロモーターによって転写制御され
る。別の実施形態では、ポリシストロン性発現ユニットは、グラム陽性内因性プロモータ
ーに作動可能に連結されている。例示的な実施形態では、プロモーターは、それが作動可
能に連結されるオープンリーディングフレームの上流、すなわち、５’に位置し得る。さ
らなる実施形態では、プロモーターは、ポリシストロン性発現ユニット中の内因性遺伝子
の最も５’、すなわち最も上流の天然プロモーターである。したがって、一部の例では、
ポリシストロン性発現ユニットは、前記１つまたは複数の内因性遺伝子の３’末端に転写
上連結された内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子を含有し、例えば、前記
１つまたは複数の外因性遺伝子は、ポリシストロン性発現ユニットの最も３’の遺伝子で
ある。
本明細書で使用される場合、「翻訳上連結された」（translationally coupled）とい
う用語は、「翻訳上連結された」（translationally linked）または「翻訳上接続された
」と同義である。これらの用語は、本質的に、ポリシストロン性発現カセットまたはユニ
ットに関する。２つまたはそれより多くの遺伝子、オープンリーディングフレームまたは
コーディング配列は、共通の調節エレメント（特に、共通のプロモーター中にあるものな
ど）が、前記２つまたはそれより多くの遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコ
ーディング配列をコードする１つのｍＲＮＡとして前記２つまたはそれより多くの遺伝子
の転写をもたらし、それをその後に２つまたはそれより多くの個々のポリペプチド配列に
翻訳できる時に、翻訳上連結されていると言われる。細菌オペロンは、２つまたはそれよ
り多くの遺伝子が翻訳上または転写上連結された天然に存在するポリシストロン性発現シ
ステムまたはユニットであることを当業者は理解するであろう。
遺伝子間領域
本明細書で使用される場合、「遺伝子間領域」という用語は、「遺伝子間リンカー」ま
たは「遺伝子間スペーサー」と同義である。遺伝子間領域は、隣接する（すなわち、同じ
ポリ核酸配列上に位置する）遺伝子、オープンリーディングフレーム、シストロンまたは
コーディング配列の間のポリ核酸配列として定義される。拡張により、遺伝子間領域は、
前記遺伝子間領域によって連結された５’の遺伝子の終止コドンおよび／または３’の遺
伝子の開始コドンを含み得る。本明細書で定義される通り、遺伝子間領域という用語は、
ポリシストロン性発現ユニット中の隣接する遺伝子間の遺伝子間領域に特に関する。例え
ば、本明細書で定義される遺伝子間領域は、オペロン中の隣接する遺伝子間に見出すこと
ができる。したがって、一実施形態では、本明細書で定義される遺伝子間領域は、オペロ
ンの遺伝子間領域である。
一部の例では、遺伝子間領域、リンカーまたはスペーサーは、グラム陽性菌のｒｐ／Ｗ
、ｒｐｆ Ｐ、ｒｐｍＤ、ｒｐ／８、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥまたはｒｐ／Ｎに先行する、す
なわち５’の、より具体的にはすぐ５’の、遺伝子間領域から選択される。一実施形態で
は、前記グラム陽性菌は、乳酸菌、例えばラクトコッカス（Lactococcus）種、例えば、
ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、およびその任意の亜種または株であ
る。一実施形態では、前記遺伝子間領域は、ｒｐ／Ｗ、ｒｐ／Ｐ、ｒｐｍＤ、ｒｐ／８、
ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥもしくはｒｐ／Ｎの開始コドンおよび／または先行する、すなわち５
’の、遺伝子の終止コドンを包含する。好ましい実施形態では、本発明は、本明細書に記
載されるグラム陽性菌または組換え核酸に関し、内因性遺伝子および１つまたは複数の外
因性遺伝子は、グラム陽性菌中で活性の遺伝子間領域（単数または複数）によって転写上
連結されており、例えば、遺伝子間領域（単数または複数）は前記グラム陽性菌に対して
内因性であり、例えば、内因性遺伝子間領域は、ｒｐ／Ｗ、ｒｐｆ Ｐ、ｒｐｍＤ、ｒｐ
／８、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、ｒｐ／Ｎ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥ、およびｒｐｌＦに先行する
遺伝子間領域から選択される。
遺伝子間領域が５’の終止コドンおよび／または３’の開始コドンを包含する場合、正
しい翻訳の開始および／または終結に影響することがある二重の開始および／または終止
コドンを回避するために、これらの各々のコドンは、一部の場合には、前記遺伝子間領域
によって連結された遺伝子中に存在しないことを当業者は理解するであろう。遺伝子間領
域を同定する方法は当該技術分野において公知である。さらなるガイダンスによって、遺
伝子間領域は、例えば、ソフトウェアが当該技術分野において公知かつ利用可能な、オペ
ロン、および関連するプロモーターおよびオープンリーディングフレームの予測に基づい
て同定することができる。例示的な遺伝子間領域は、国際特許出願公開第２０１２／１６
４０８３号パンフレット（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込
まれる）に記載されている。
対象
「対象」は、例えば本開示の方法にしたがって、本開示の組成物を投与されることから
利益を得る可能性がある生物である。対象は、哺乳動物（「哺乳動物対象」）であり得る
。例示的な哺乳動物対象としては、ヒト、農用動物（ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギな
ど）、愛玩動物または家畜動物（イヌ、ネコ、およびウサギなど）、および、マウス、ラ
ット、および霊長目動物などの他の動物が挙げられる。一部の例では、哺乳動物対象は、
ヒト患者である。
「国際単位」（ＩＵ）という用語は、その当該技術分野で認識される意味にしたがって
本明細書で使用され、物質（例えば、ポリペプチド）の量を表す。ある国際単位を構成す
る質量または体積は、いずれの物質が測定されているかに基づいて変化する。世界保健機
関（ＷＨＯ）は、生物活性ポリペプチドについての単位の特徴付けを提供している。
Ｔ１Ｄ特異的抗原
本開示の少なくとも１つの微生物は、少なくとも１つの疾患特異的（すなわち、Ｔ１Ｄ
特異的）自己抗原遺伝子をコードする外因性核酸を含有し、発現のために充分な条件下で
そのような遺伝子を発現することができる。例示的なＴ１Ｄ特異的自己抗原としては、ベ
ータ細胞破壊プロセスに関連する膵島抗原が挙げられる。一部の実施形態では、上記組成
物および方法のいずれかにおいて、Ｔ１Ｄ特異的抗原は、Ｔ１Ｄに関連する公知の自家抗
原から選択され、プロインスリン（ＰＩＮＳ）；インスリン（ＩＮＳ）；グルタミン酸デ
カルボキシラーゼ（ＧＡＤ）（例えば、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、またはＧＡＤ２）；イ
ンスリノーマ関連タンパク質２（膵島抗原－２；ＩＡ－２）（タンパク質チロシンホスフ
ァターゼ受容体型Ｎ（protein tyrosine phosphatase, receptor type, N）（ＰＴＰＲＮ
）、チロシンホスファターゼ様タンパク質、またはＩＣＡ５１２とも称される）、（例え
ば、Long et al., Diabetes 2013, 62 (6), 2067-2071を参照）；膵島特異的グルコース
－６－ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポ
ーター８（ＺｎＴ８）が挙げられる。他の例としては、クロモグラニンＡ、（プレプロ）
膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、シトルリン化グルコース
調節タンパク質（例えば、ＧＲＰ７８）などの、ベータ細胞によって発現される分子（例
えば、Rondas et al., Diabetes 2015; 64(2):573-586、およびYe et al., Diabetes 201
0, 59(1):6-16を参照）、およびこれらの抗原の２つまたはそれより多くの組合せが挙げ
られる。他の実施形態では、上記組成物および方法において、Ｔ１Ｄ特異的抗原は、ＰＩ
ＮＳ、ＧＡＤ６５、またはＩＡ－２である。他の実施形態では、上記組成物および方法に
おいて、Ｔ１Ｄ特異的抗原は、ＰＩＮＳである。様々な実施形態では、Ｔ１Ｄ特異的抗原
は、全長（例えば、野生型）遺伝子より短いバリアント核酸配列によってコードされ、そ
のため、「切除」型は、多くの場合に、使用される微生物（例えば、ラクトコッカス・ラ
クチス（Lactococcus lactis））によってより効率的に発現および／または分泌される。
分泌はより効率的であるが、多くの「切除」型は、それらの生物学的活性の全て（または
実質的部分）を保持し、例えば、充分なＴｒｅｇ刺激および／または寛容誘導能力を保持
する。
ＰＩＮＳポリペプチドの例としては、野生型ヒトＰＩＮＳ、およびそのような野生型ヒ
トＰＩＮＳと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくと
も約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくと
も約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドが挙げられる
。野生型ヒトＰＩＮＳの例示的なアミノ酸配列は配列番号５であり、例示的な核酸配列は
配列番号６によって表される（受託番号ＮＭ＿０００２０７．２に含有されるＣＤＳを参
照）。一部の例では、ＰＩＮＳポリペプチドは、配列番号４の核酸配列によってコードさ
れる、配列番号３のアミノ酸配列を有する。
追加の例示的なＰＩＮＳヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＡＹ８９９３０４（完
全なＣＤＳ、選択的にスプライスされる；配列番号７）；ＮＭ＿０００２０７（転写物バ
リアント１）；ＮＭ＿００１１８５０９７（転写物バリアント２）；ＮＭ＿００１１８５
０９８（転写物バリアント３）；ＮＭ＿００１２９１８９７（転写物バリアント４）のコ
ーディング配列、およびこれらの部分配列によって表される。例示的なＰＩＮＳアミノ酸
配列としては、上記ＰＩＮＳ核酸配列のいずれか１つによってコードされる配列が挙げら
れる。
配列番号３のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列、またはその少なくと
も約２０個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくと
も約６０個、少なくとも約７０個、または少なくとも約８０個の連続的なアミノ酸をコー
ドする任意のヌクレオチド配列、または配列番号３と少なくとも約６０％、少なくとも約
７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約
９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同
一性を有するポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を使用することができる
。
追加のＰＩＮＳポリペプチドは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｐ０１３０８およ
びそのリンクに記載されている。一部の例では、ＰＩＮＳポリペプチドは、アミノ酸残基
２５～１１０（配列番号５にしたがった番号付け）によって表される。
例示的なＧＡＤ（例えば、ＧＡＤ６５）ポリペプチドとしては、野生型ヒトＧＡＤ６５
、およびそのような野生型ＧＡＤ６５と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少な
くとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少な
くとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する
ポリペプチドが挙げられる。例えば、受託番号Ｍ８１８８２．１に含有されるＣＤＳを参
照。
上記アミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列、またはその少なくとも約１０
０個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、または少
なくとも約５００個の連続的なアミノ酸をコードする任意のヌクレオチド配列、または少
なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少
なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、ま
たは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする任意のヌクレオ
チド配列を使用することができる。
他の例示的なグルタミン酸デカルボキシラーゼ（例えば、ＧＡＤ６５）配列は、例えば
、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｑ０５３２９およびそのリンクに記載されている。一部の例
では、ＧＡＤポリペプチドは、野生型アミノ酸の約５００未満、約４００未満、または約
３００未満を含有する切除されたバリアントである。例示的なポリペプチド断片（切除さ
れたＧＡＤ６５バリアント）は、例えば、Robert et al., Benef. Microbes 2015, 6(4):
591-601（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載
されている。一部の例では、切除されたＧＡＤバリアントは、グラム陽性菌（すなわち、
ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））によって効率的に発現および分泌さ
れる。例示的な切除されたＧＡＤバリアントは、ＧＡＤ６５３７０～５７５（アミノ酸の
番号付けはＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０００８０９．１に関する）である。
他の例示的なＧＡＤヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号Ｍ８１８８２（ＧＡＤ６５
）；Ｍ８１８８３（ＧＡＤ６７）；ＮＭ＿０００８１８（ＧＡＤ２バリアント１）；およ
びＮＭ＿００１１３４３６６（ＧＡＤ２バリアント２）；ならびにそれらに含有されるオ
ープンリーディングフレーム（ＣＤＳ）によって表される。例示的なアミノ酸配列として
は、受託番号Ｍ８１８８２、Ｍ８１８８３、ＮＭ＿００１１３４３６６、およびＮＭ＿０
００８１８の上記ヌクレオチド配列によってコードされる配列が挙げられる。
本開示の方法を使用して対象に送達される自己抗原の最適な量は、例えば、抗原の種類
、抗原を発現する微生物、および遺伝子構築物（例えば、遺伝子構築物において使用され
たプロモーターの強度）と共に変化することを当業者は理解するであろう。典型的に、微
生物は、発現される抗原の具体的な量に相当する量で、または各々の対象において各々の
抗原ポリペプチドについて所望されるＰＫプロファイルを生成する量で、投与される。例
示的な１日の抗原用量は、１日あたり約１０ｆｇ～約１００μｇの活性ポリペプチドであ
る。他の例示的な用量範囲は、１日あたり約１ｐｇ～約１００μｇ、または１日あたり約
１ｎｇ～約１００μｇである。
上記抗原用量は、１日あたりの有効量の微生物を対象に投与することによって実現する
ことができ、該微生物は、上記したものなどの、所望の用量を実現するために充分な量の
生物活性ポリペプチドを発現するように構成されている。抗原ポリペプチドを分泌する微
生物は、１日あたり約１０４コロニー形成単位（ｃｆｕ）～約１０１２ｃｆｕ、例えば、
１日あたり約１０６ｃｆｕ～約１０１２ｃｆｕ、または１日あたり約１０９ｃｆｕ～約１
０１２ｃｆｕの用量で送達され得る。
分泌された抗原ポリペプチドの量は、例えば、Steidler et al., Science 2000; 289(5
483):1352-1355に記載の方法にしたがって、またはＥＬＩＳＡを使用することによって、
ｃｆｕに基づいて決定することができる。例えば、特定の微生物は、１０９ｃｆｕあたり
少なくとも約１ｎｇ～約１μｇの活性ポリペプチドを分泌し得る。それに基づいて、当業
者は、他のｃｆｕ用量で分泌される抗原ポリペプチドの範囲を算出することができる。
上記用量／用量範囲のそれぞれは、本明細書に記載される任意の投薬レジメンとの関連
で投与することができる。活性ポリペプチドの１日の用量は、１日全体を通じて１、２、
３、４、５、または６の部分で投与されてもよい。さらに、１日の用量は、投与期間の間
の任意の回数の休息期間と共に、任意の日数にわたって投与されてもよい。例えば、約０
．０１～約３．０Ｍ ＩＵのＩＬ－１０／日／対象の用量は、２日毎に計６週にわたって
投与され得る。
治療
本明細書で使用される「治療」、「治療する」などの用語は、疾患または状態、例えば
Ｔ１Ｄの特徴的な症状または外徴を改善しまたは軽減することを意味する。例えば、Ｔ１
Ｄの治療は、対象において抗原特異的免疫寛容の回復または誘導を結果としてもたらし得
る。他の例では、治療は、自己免疫糖尿病を阻止すること、または自己免疫糖尿病を後退
させることを意味する。本明細書で使用される場合、これらの用語はまた、疾患もしくは
状態または疾患もしくは状態に関連する症状の発症を予防しまたは遅延させることを包含
し、これには、疾患もしくは状態の重篤度または前記疾患もしくは状態に罹患する前にそ
れに関連する症状を低減させることが含まれる。罹患前のそのような予防または低減は、
投与時において疾患または状態に罹患していない患者に本発明の化合物または組成物を投
与することを指す。「予防する」はまた、例えば、改善期間後の、疾患もしくは状態また
はそれに関連する症状の再発を予防することまたはぶり返しの防止を包含する。「それを
必要とする」対象の治療は、対象が疾患または状態を有し、本発明の治療方法が特定の疾
患または状態を治療する意図的な目的で行われることを表す。
患者部分集団
一部の実施形態では、本開示の方法を使用して治療される対象は、有意な（例えば、測
定可能な）残留ベータ細胞機能を有する。そのような状況下、対象は、治療が中断または
完全に中止された後でさえ、疾患の寛解を維持し得る。新規に診断された患者は、多くの
場合、診断時に残留するある特定の最小数の膵島ベータ細胞（ベータ細胞）を有するため
、そのような患者は、ある特定の最小量の内因性のインスリンを産生することができる。
そのような患者集団は、本開示の組成物および方法（例えば、ＩＬ－１０およびＰＩＮＳ
療法）で治療された時に特によく利益を得ることができる。本明細書に記載される治療は
、ベータ細胞のさらなる破壊を予防することができ、したがって、疾患の寛解を誘導する
ことがある。予想外なことに、本発明者らは、初期ベータ細胞量が治療の有効性にとって
重要であり得ることを見出した。しかしながら、対象のベータ細胞が一旦破壊されると、
そのような対象は、記載された治療から同じようにはもはや利益を得ることができない可
能性がある。
治療されていないＴ１Ｄは、時間をかけて発症し、膵臓中のベータ細胞が破壊されるに
つれて進行的に悪化する。したがって、本発明の方法は疾患を停止させることができるの
で、疾患進行のできるだけ早期に対象を治療することが有利である。したがって、関連す
る実施形態では、本発明の治療方法はまた、治療の前および治療の間に疾患進行を測定す
ることも含む。
治療有効量
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、望ましい治療レジメンにし
たがって投与された時に所望の治療効果または反応を誘発する本開示の非病原微生物また
は組成物の量を指す。一部の場合には、化合物または組成物は、１日あたり１回または複
数回投与された時に治療有効量と同等の活性成分の量を含有する単位剤形、例えば錠剤ま
たはカプセル剤として提供される。
所望の治療効果（例えば、Ｔ１Ｄの効果的な治療のため）を達成するために必要とされ
る組換え微生物の治療有効量は、例えば、微生物によって発現されるＩＬ－１０ポリペプ
チドの性質、微生物によって発現される抗原ポリペプチドの性質、投与経路、ならびにレ
シピエントの年齢、体重、および他の特徴に応じて変化することを当業者は理解するであ
ろう。
粘膜
「粘膜」（mucosa）または「粘膜」（mucous membrane）という用語は、その当該技術
分野で認識される意味にしたがって本明細書で使用される。「粘膜」は、口腔粘膜、直腸
粘膜、胃粘膜、腸粘膜、尿道粘膜、膣粘膜、眼粘膜、頬粘膜、気管支または肺粘膜、およ
び鼻または嗅覚粘膜などの、身体中に見られる任意の粘膜であり得る。
本明細書で使用される「粘膜送達」という用語は、その当該技術分野で認識される意味
にしたがって使用され、すなわち、例えば、粘膜との本開示の組成物の接触を介した、粘
膜への送達である。口腔粘膜送達としては、頬側、舌下および歯肉経路の送達が挙げられ
る。したがって、一部の実施形態では、「粘膜送達」としては、経胃送達、経腸送達、経
直腸送達、経頬送達、経肺送達、経眼送達、経鼻送達、経膣送達および経口送達が挙げら
れる。
「粘膜寛容」という用語は、哺乳動物対象（例えば、ヒト患者）が粘膜経路を介して抗
原に曝露された後の、該対象における抗原への特異的免疫反応性の阻害を指す。一部の場
合には、粘膜寛容は、全身寛容である。低用量経口寛容は、低用量の抗原によって誘導さ
れる経口寛容であり、ナイーブ宿主に寛容を与えることができるシクロホスファミド感受
性制御性Ｔ細胞によって媒介される活性の免疫抑制によって特徴付けられる。高用量経口
寛容は、高用量の抗原によって誘導される経口寛容であり、シクロホスファミド治療に対
して非感受性であり、かつ抗原特異的Ｔ細胞のアネルギーおよび／または欠失を介してＴ
細胞低応答性の誘導に進む。シクロホスファミドへの感受性の違いを使用して、低用量寛
容と高用量寛容とを区別することができる（Strobel et al., 1983）。一部の場合には、
経口寛容は、Mayer and Shao (2004)によって記載される低用量経口寛容である。
免疫調節化合物
「免疫調節化合物」または免疫モジュレーター」という用語は、それらの当該技術分野
で認識される意味にしたがって本明細書で使用される。免疫調節化合物は、当業者に公知
の任意の免疫調節化合物であり得る。
一部の実施形態では、免疫調節化合物は、寛容誘導化合物である。寛容誘導は、例えば
、制御性Ｔ細胞を誘導することによって、または非直接的な方法、例えば、寛容樹状細胞
への未熟樹状細胞の活性化および／または成熟樹状細胞上の「共刺激」因子の発現を誘導
するＴｈ２免疫反応の阻害によって、得ることができる。免疫調節化合物および免疫抑制
化合物は当業者に公知であり、スペルグアリンなどの細菌代謝物、タクロリムスまたはシ
クロスポリンなどの真菌およびストレプトミセス（Streptomyces）属細菌代謝物、ＩＬ－
４、ＩＬ－１０、ＩＦＮα、ＴＧＦβ（制御性Ｔ細胞の選択的なアジュバントとして）Ｆ
ｌｔ３Ｌ、ＴＳＬＰおよびＲａｎｋ－Ｌ（選択的な寛容原性ＤＣの誘導剤として）などの
免疫抑制性サイトカイン、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ２０、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ３
などの抗体および／またはアンタゴニスト、ＣＴＬ－４１ ｇまたはＣＴＬＡ－４アゴニ
スト融合タンパク質などのタンパク質、ペプチドまたは融合タンパク質が挙げられるがこ
れらに限定されない。一部の実施形態では、免疫調節化合物は、免疫抑制化合物である。
他の実施形態では、免疫抑制化合物は、免疫抑制性サイトカインまたは抗体である。他の
実施形態では、免疫抑制性サイトカインは、寛容増強性サイトカインまたは抗体である。
「免疫調節化合物」という用語はまた、これらの機能的なホモログも含むことが当業者に
よって理解されるであろう。機能的なホモログは、意図する目的のために本質的に同じま
たは類似の機能を有する分子であるが、構造的に異なることがある。一部の例では、免疫
調節化合物は、抗ＣＤ３、またはその機能的なホモログである。
微生物
本発明は、少なくとも１つの微生物の使用に関する。一部の実施形態では、微生物は、
非病原性かつ非浸潤性の細菌である。他の実施形態では、微生物は、非病原性かつ非浸潤
性の酵母である。
一部の実施形態では、微生物は、サッカロミセス（Saccharomyces）種、ハンセヌラ（H
ansenula）種、クルイベロミセス（Kluyveromyces）種、シゾサッカロミセス（Schizzosa
ccharomyces）種、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）種、ピキア（Pichia）種、
モナスカス（Monascus）種、ゲオトリクム（Geothchum）種およびヤロウィア（Yarrowia
）種からなる群から選択される酵母株である。一部の実施形態では、酵母は、サッカロミ
セス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。他の実施形態では、Ｓ．セレビ
シエ（S. cerevisiae）は、亜種ブラウディ（boulardii）である。本発明の一実施形態で
は、組換え酵母宿主ベクター系は、生物学的に封じ込められた系である。生物学的封じ込
めは当業者に公知であり、例えば、ＴｈｙＡ変異などの自殺性の栄養要求性変異、または
その同等物といった、栄養要求性変異の導入により実現することができる。
本発明の他の実施形態では、微生物は、非病原性細菌（例えば、食品グレードの細菌株
）などの細菌である。一部の例では、非病原性細菌は、グラム陽性菌、例えば、グラム陽
性の食品グレードの細菌株である。一部の実施形態では、グラム陽性の食品グレードの細
菌株は、乳酸発酵性の細菌株（すなわち、乳酸菌（ＬＡＢ）またはビフィドバクテリウム
（Bifidobacterium））である。
一部の実施形態では、乳酸発酵性の細菌株は、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラク
トバチルス（Lactobacillus）またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の種であ
る。本明細書で使用される場合、ラクトコッカス（Lactococcus）またはラクトバチルス
（Lactobacillus）は、特定の種または亜種に限定されないが、ラクトコッカス（Lactoco
ccus）またはラクトバチルス（Lactobacillus）の種または亜種のいずれかを含むことを
意図する。例示的なラクトコッカス（Lactococcus）種としては、ラクトコッカス・ガル
ビエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラ
クトコッカス・ピスシウム（Lactococcus piscium）、ラクトコッカス・プランタルム（L
actococcus plantarum）、およびラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raff
inolactis）が挙げられる。一部の例では、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lac
tis）は、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremo
ris）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ホルドニエ（Lactococcus lactis subsp. hordnia
e）、またはラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lacti
s）である。
例示的なラクトバチルス（Lactobacillus）種としては、ラクトバチルス・アセトトレ
ランス（Lactobacillus acetotolerans）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobaci
llus acidophilus）、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバチ
ルス・アルジダス（Lactobacillus algidus）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lac
tobacillus alimentarius）、ラクトバチルス・アミロリチカス（Lactobacillus amyloly
ticus）、ラクトバチルス・アミロフィラス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバチ
ルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・アニマリス（Lact
obacillus animalis）、ラクトバチルス・アビアリウス（Lactobacillus aviarius）、ラ
クトバチルス・アビアリウス亜種ラフィノサス（Lactobacillus aviarius subsp. araffi
nosus）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アビアリウス（Lactobacillus aviarius su
bsp. aviarius）、ラクトバチルス・ババリカス（Lactobacillus bavaricus）、ラクトバ
チルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）、ラクトバチルス・ブレビ
ス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）、
ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・カルニ
ス（Lactobacillus carnis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラク
トバチルス・カゼイ亜種アラクトサス（Lactobacillus casei subsp. alactosus）、ラク
トバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Lactobacillus casei subsp. casei）、ラクトバチルス
・カゼイ亜種シュードプランタラム（Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum）、
ラクトバチルス・カゼイ亜種ラムノサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、ラ
クトバチルス・カゼイ亜種トレランス（Lactobacillus casei subsp. tolerans）、ラク
トバチルス・カテナフォルミス（Lactobacillus catenaformis）、ラクトバチルス・セロ
ビオサス（Lactobacillus cellobiosus）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacill
us collinoides）、ラクトバチルス・コンフサス（Lactobacillus confusus）、ラクトバ
チルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフ
ォルミス亜種コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis）、
ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス（Lactobacillus coryniformis sub
sp. torquens）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクト
バチルス・クルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・クルバタス亜種ク
ルバタス（Lactobacillus curvatus subsp. curvatus）、ラクトバチルス・クルバタス亜
種メリビオサス（Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus）、ラクトバチルス・デル
ブルエッキー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキー亜種
ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デ
ルブルエッキー亜種デルブルエッキー（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii
）、ラクトバチルス・デルブルエッキー亜種ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subs
p. lactis）、ラクトバチルス・ジベルゲンス（Lactobacillus divergens）、ラクトバチ
ルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・フェルメンタム
（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・フォルニカリス（Lactobacillus forni
calis）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクト
バチルス・フルクトサス（Lactobacillus fructosus）、ラクトバチルス・ガリナラム（L
actobacillus gallinarum）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラク
トバチルス・グラミニス（Lactobacillus graminis）、ラクトバチルス・ハロトレランス
（Lactobacillus halotolerans）、ラクトバチルス・ハムステリ（Lactobacillus hamste
ri）、ラクトバチルス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・
ヘテロヒオキー（Lactobacillus heterohiochii）、ラクトバチルス・ヒルガルジー（Lac
tobacillus hilgardii）、ラクトバチルス・ホモヒオキー（Lactobacillus homohiochii
）、ラクトバチルス・イネルス（Lactobacillus iners）、ラクトバチルス・インテスチ
ナリス（Lactobacillus intestinalis）、ラクトバチルス・ジェンセニー（Lactobacillu
s jensenii）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバ
チルス・カンドレリ（Lactobacillus kandleri）、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobac
illus kefiri）、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofa
ciens）、ラクトバチルス・ケフィルグラナム（Lactobacillus kefirgranum）、ラクトバ
チルス・クンキー（Lactobacillus kunkeei）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacill
us lactis）、ラクトバチルス・ライヒマンニー（Lactobacillus leichmannii）、ラクト
バチルス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）、ラクトバチルス・マレフェルメンタ
ンス（Lactobacillus malefermentans）、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）
、ラクトバチルス・マルタロミカス（Lactobacillus maltaromicus）、ラクトバチルス・
マニホチボランス（Lactobacillus manihotivorans）、ラクトバチルス・ミノル（Lactob
acillus minor）、ラクトバチルス・ミヌタス（Lactobacillus minutus）、ラクトバチル
ス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）、ラクトバチルス・ムリナス（Lactobacillus m
urinus）、ラクトバチルス・ナゲリー（Lactobacillus nagelii）、ラクトバチルス・オ
リス（Lactobacillus oris）、ラクトバチルス・パニス（Lactobacillus panis）、ラク
トバチルス・パラブクネリ（Lactobacillus parabuchneri）、ラクトバチルス・パラカゼ
イ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactoba
cillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種トレランス（L
actobacillus paracasei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・パラケフィリ（Lactobac
illus parakefiri）、ラクトバチルス・パラリメンタリウス（Lactobacillus paraliment
arius）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクト
バチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ペロレンス（Lact
obacillus perolens）、ラクトバチルス・ピスシコラ（Lactobacillus piscicola）、ラ
クトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ポンチス
（Lactobacillus pontis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラ
クトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・リマエ（Lac
tobacillus rimae）、ラクトバチルス・ロゴサエ（Lactobacillus rogosae）、ラクトバ
チルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus
sakei）、ラクトバチルス・サケイ亜種カモサス（Lactobacillus sakei subsp. camosus
）、ラクトバチルス・サケイ亜種サケイ（Lactobacillus sakei subsp. sakei）、ラクト
バチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サリバリウス
亜種サリシニウス（Lactobacillus salivarius subsp. salicinius）、ラクトバチルス・
サリバリウス亜種サリバリウス（Lactobacillus salivarius subsp. salivarius）、ラク
トバチルス・サンフランシスセンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、ラクトバチ
ルス・シャルペエ（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバチルス・スエビカス（Lactobac
illus suebicus）、ラクトバチルス・トリコデス（Lactobacillus trichodes）、ラクト
バチルス・ウリ（Lactobacillus uli）、ラクトバチルス・バクシノステルカス（Lactoba
cillus vaccinostercus）、ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）、
ラクトバチルス・ビリデスセンス（Lactobacillus viridescens）、ラクトバチルス・ビ
ツリナス（Lactobacillus vitulinus）、ラクトバチルス・キシロサス（Lactobacillus x
ylosus）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ラク
トバチルス・ヤマナシエンシス亜種マリ（Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali）
、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス亜種ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashie
nsis subsp. yamanashiensis）、ラクトバチルス・ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ビフ
ィドバクテリウム・アドレスセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバク
テリウム・アングラタム（Bifidobacterium angulatum）、ビフィドバクテリウム・ビフ
ィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium
breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビ
フィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、およびビフィドバクテリウ
ム・インファンチス（Bifidobacterium infantis）が挙げられる。一部の例では、ＬＡＢ
は、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（ＬＬ）である。
さらなる例では、細菌は、エンテロコッカス・アルセジニス（Enterococcus alcedinis
）、エンテロコッカス・アクイマリナス（Enterococcus aquimarinus）、エンテロコッカ
ス・アシニ（Enterococcus asini）、エンテロコッカス・アビウム（Enterococcus avium
）、エンテロコッカス・カッカエ（Enterococcus caccae）、エンテロコッカス・カメリ
エ（Enterococcus camelliae）、エンテロコッカス・カニンテスチニ（Enterococcus can
intestini）、エンテロコッカス・カニス（Enterococcus canis）、エンテロコッカス・
カセリフラバス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・セコラム（Entero
coccus cecorum）、エンテロコッカス・コランバエ（Enterococcus columbae）、エンテ
ロコッカス・デブリエセイ（Enterococcus devriesei）、エンテロコッカス・ジエストラ
ムメナエ（Enterococcus diestrammenae）、エンテロコッカス・ジスパル（Enterococcus
dispar）、エンテロコッカス・デュランス（Enterococcus durans）、エンテロコッカス
・エウレケンシス（Enterococcus eurekensis）、エンテロコッカス・フェカリス（Enter
ococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテ
ロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・ギルバス（E
nterococcus gilvus）、エンテロコッカス・ヘモペロキシダス（Enterococcus haemopero
xidus）、エンテロコッカス・ヘルマニエンシス（Enterococcus hermanniensis）、エン
テロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・イタリカス（Entero
coccus italicus）、エンテロコッカス・ラクチス（Enterococcus lactis）、エンテロコ
ッカス・レマニー（Enterococcus lemanii）、エンテロコッカス・マロドラタス（Entero
coccus malodoratus）、エンテロコッカス・モラビエンシス（Enterococcus moraviensis
）、エンテロコッカス・ムンドチー（Enterococcus mundtii）、エンテロコッカス・オリ
バエ（Enterococcus olivae）、エンテロコッカス・パレンス（Enterococcus pallens）
、エンテロコッカス・フォエニクリコラ（Enterococcus phoeniculicola）、エンテロコ
ッカス・プランタルム（Enterococcus plantarum）、エンテロコッカス・シュードアビウ
ム（Enterococcus pseudoavium）、エンテロコッカス・クエベセンシス（Enterococcus q
uebecensis）、エンテロコッカス・ラフィノサス（Enterococcus raffinosus）、エンテ
ロコッカス・ラッティ（Enterococcus ratti）、エンテロコッカス・リボラム（Enteroco
ccus rivorum）、エンテロコッカス・ロタイ（Enterococcus rotai）、エンテロコッカス
・サッカロリチカス（Enterococcus saccharolyticus）、エンテロコッカス・シレシアカ
ス（Enterococcus silesiacus）、エンテロコッカス・ソリタリウス（Enterococcus soli
tarius）、エンテロコッカス・スルフレウス（Enterococcus sulfureus）、エンテロコッ
カス・テルミチス（Enterococcus termitis）、エンテロコッカス・タイランジカス（Ent
erococcus thailandicus）、エンテロコッカス・ウレアシチカス（Enterococcus ureasit
icus）、エンテロコッカス・ウレイリチカス（Enterococcus ureilyticus）、エンテロコ
ッカス・ビーキエンシス（Enterococcus viikkiensis）、エンテロコッカス・ビロラム（
Enterococcus villorum）、およびエンテロコッカス・シャンファンゲンシス（Enterococ
cus xiangfangensis）からなる群から選択される。
さらなる例では、細菌は、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalac
tiae）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Streptococcus anginosus）、ストレプト
コッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス・カニス（Streptococc
us canis）、ストレプトコッカス・コンステラタス（Streptococcus constellatus）、ス
トレプトコッカス・ジスガラクチエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカ
ス・エクイナス（Streptococcus equinus）、ストレプトコッカス・イニエ（Streptococc
us iniae）、ストレプトコッカス・インテルメジウス（Streptococcus intermedius）、
ストレプトコッカス・ミレリ（Streptococcus milleri）、ストレプトコッカス・ミチス
（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ムタンス（Streptococcus mutans）、
ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・パラサ
ングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・ペロリス（Strepto
coccus peroris）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、
ストレプトコッカス・シュードニューモニエ（Streptococcus pseudopneumoniae）、スト
レプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ラッテ
ィ（Streptococcus ratti）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus saliv
arius）、ストレプトコッカス・チグリナス（Streptococcus tigurinus）、ストレプトコ
ッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・サング
イニス（Streptococcus sanguinis）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus
sobrinus）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、ストレプトコッカ
ス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ベスチブラリス（Strept
ococcus vestibularis）、ストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridans）
、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）から
なる群から選択される。
本発明の特定の態様では、グラム陽性の食品グレードの細菌株は、ラクトコッカス・ラ
クチス（Lactococcus lactis）、または、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（La
ctococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ホルドニエ（Lact
ococcus lactis subsp. hordniae）、およびラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（La
ctococcus lactis subsp. lactis）などのその亜種のいずれかである。本発明の別の態様
では、組換えグラム陽性菌株は、乳中での正常な増殖および酸産生の能力を喪失した、プ
ラスミドなしのラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株ＭＧ１３６３などの
、生物学的に封じ込められた系（Gasson, M.J. (1983) J. Bacteriol. 154:1-9）；また
はスレオニンおよびピリミジン栄養要求株誘導Ｌ．ラクチス（L. lactis）株（Sorensen
et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:1253-1258、Glenting et al. (2002) 68:
5051-5056）である。
本発明の一実施形態では、組換え細菌宿主ベクター系は、生物学的に封じ込められた系
である。生物学的封じ込めは当業者に公知であり、ＤＮＡ合成を弱くする、栄養要求性変
異、例えばＴｈｙＡ変異などの自殺性の栄養要求性変異、またはその同等物の導入によっ
て実現することができる。栄養要求性変異の他の例は、ＲＮＡ、細胞壁またはタンパク質
の合成を弱くすることができる。あるいは、生物学的封じ込めは、例えば、数世代後に失
われる不安定なエピソーム構築物を使用することなどによって、ＩＬ－１０ポリペプチド
またはＩＬ－１０バリアントをコードする遺伝子を持つプラスミドのレベルで実現するこ
とができる。所望の場合、プラスミドの不安定性および栄養要求性などのいくつものレベ
ルの封じ込めを組み合わせて、高レベルの封じ込めを確実にすることができる。
構築物
本発明では、微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）は、意図する部位、すなわち粘
膜にＩＬ－１０ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）を送達する。
例えば、微生物（例えば、ＬＡＢ）はＩＬ－１０ポリペプチドを発現し、（分泌形態のＩ
Ｌ－１０が使用された場合）その後にＩＬ－１０ポリペプチドは分泌される。したがって
、具体的な実施形態では、Ｌ．ラクチス（L. lactis）などの微生物（例えば、ＬＡＢ）
は、意図する粘膜の部位、例えば胃腸管中でＩＬ－１０およびＰＩＮＳを発現する。
オペロンの使用により、ＩＬ－１０ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチド
（例えば、ＰＩＮＳ）の発現を調和させることが可能となる。細菌宿主細胞中のポリシス
トロン性発現システムは、例えば、Ｖａｎｄｅｎ－Ｂｒｏｕｃｋｅらの米国特許出願第２
０１４／０１０５８６３号明細書（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれ
る）に記載されている。
一実施形態では、本発明は、安定的にトランスフェクトされた微生物、すなわち、ＩＬ
－１０ポリペプチドをコードする遺伝子およびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）遺
伝子が宿主細胞のゲノム中に組み込まれている微生物に関する。安定的にトランスフェク
トされた微生物を確立するための技術は当該技術分野において公知である。例えば、ＩＬ
－１０ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）遺伝子を、相同組換え
を介して宿主のゲノム中、例えば染色体中にクローニングすることができる。一部の実施
形態では、宿主の必須遺伝子は、遺伝子の欠失などの相同組換え事象、必須遺伝子によっ
てコードされたタンパク質の不活性型を生じるか、または必須遺伝子によってコードされ
たタンパク質の切断型を結果としてもたらすフレームシフト変異を生じる１つまたは複数
のアミノ酸置換によって破壊される。一実施形態では、必須遺伝子は、ｔｈｙＡ遺伝子で
ある。好ましい技術は、例えば、国際公開第０２／０９０５５１号パンフレット（参照す
ることによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。プラスミドは、自
己複製性であってよく、例えば、１つまたは複数の目的の遺伝子および１つまたは複数の
抵抗性マーカーを持つ。したがって、形質転換用プラスミドは、破壊される必須遺伝子、
例えばｔｈｙＡ遺伝子を補完できないものである限り、任意のプラスミドであってよい。
あるいは、プラスミドは、組込みプラスミドである。後者の場合、組込みプラスミドそれ
自体を使用して、必須遺伝子の遺伝子座、例えばｔｈｙＡ部位での組込みを引き起こし、
それによって必須遺伝子、例えばｔｈｙＡ遺伝子の機能を破壊することによって、必須遺
伝子を破壊することができる。一部の場合には、ｔｈｙＡ遺伝子などの必須遺伝子は、ｔ
ｈｙＡ標的部位などの必須遺伝子への挿入を標的化する標的化配列が隣接した、目的の遺
伝子（単数または複数）を含むカセットによる二重相同組換えによって置換される。これ
らの標的化配列は、標的部位中への目的の遺伝子の組込みを可能とするために充分に長く
かつ充分に相同的であることが理解されるであろう。一部の例では、本開示のＩＬ－１０
発現カセットは、ｔｈｙＡ遺伝子座に組み込まれる。
ＩＬ－１０ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）をコードする遺
伝子構築物は、微生物のゲノムＤＮＡ中、例えば細菌または酵母の染色体中、例えばラク
トコッカス（Lactococcus）の染色体中に組み込まれ得る。後者の場合、核酸の単一また
は複数コピーを組み込むことができ、組込みは、染色体のランダムな部位において、また
は、上記の通り、その予め定められた部位、例えば、非限定的な例では、ラクトコッカス
（Lactococcus）（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））のｔｈ
ｙＡ遺伝子座中などの、予め定められた部位で起こり得る。
したがって、一実施形態では、ＩＬ－１０ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原（例え
ば、ＰＩＮＳ）をコードする遺伝子構築物は、宿主細胞のゲノム中、例えば染色体中への
遺伝子構築物の挿入をもたらすように構成された配列をさらに含むことができる。
一部の例では、宿主細胞のゲノム内、例えば染色体内の特定の部位への遺伝子構築物の
挿入は、相同組換えによって促進され得る。例えば、本発明の遺伝子構築物（genetic co
nstruct the invention）は、宿主細胞のゲノム内、例えば染色体内の前記組込み部位に
相同な１つまたは複数の領域を含み得る。前記ゲノム（例えば、染色体）の部位の配列は
、天然のもの、すなわち、天然に存在するものであってもよいし、または、先行する遺伝
子操作によって導入された外因性配列であってもよい。例えば、相同性の領域は、少なく
とも５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００
ｂｐ ７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、またはそれより大きいもの
であり得る。
一例では、本発明の遺伝子構築物中に存在する関連する発現ユニットのそれぞれの端部
に隣接した、相同な２つの領域を含めることができる。そのような構成は、有利なことに
、関連配列、すなわち少なくとも、目的の抗原をコードし、宿主細胞中でのその発現をも
たらすものを、挿入し得る。特に細菌宿主中で、相同組換えを行い、かつ組換え体を選択
する方法は、当該技術分野において一般に公知である。
例えばプロトプラスト形質転換およびエレクトロポレーションなどの、微生物の形質転
換法は当業者に公知である。
高度な発現は、相同的発現および／または微生物、例えばＬ．ラクチス（L. lactis）
中に存在する発現ベクター上の分泌シグナルを使用することによって達成することができ
る。発現シグナルは当業者に明らかであろう。発現ベクターは、それが組み込まれる微生
物（例えばＬ．ラクチス（L. lactis））に応じて発現について最適化することができる
。例えば、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus
lactis）、カゼイ（casei）およびプランタルム（plantarum）において充分なレベルの
発現を与えた特定の発現ベクターが公知である。さらに、非病原性、非定着性、非浸潤性
の食品グレードの細菌ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）における異種抗
原の発現用に開発されたシステムが公知である（英国特許第２２７８３５８号明細書（参
照することにより本明細書に組み込まれる）を参照）。本発明にしたがって特に好ましい
構築物は、ＩＬ－１０ポリペプチドおよび／またはＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ
）をコードするヌクレオチド配列が組み込まれた、ＰＣＴ／ＮＬ９５／００１３５（国際
公開第９６／３２４８７号パンフレット）に記載された複数コピーの発現ベクターを含む
。そのような構築物は、高レベルの発現での乳酸菌、特にラクトバチルス（Lactobacillu
s）における所望の抗原の発現のために特に好適であり、そしてまた、発現産物を細菌細
胞の表面に導くためにも有利に使用することができる。（例えば、ＰＣＴ／ＮＬ９５／０
０１３５の）構築物は、ＩＬ－１０ポリペプチドおよび／またはＴ１Ｄ特異的抗原（例え
ば、ＰＩＮＳ）をコードする核酸配列に先行して、リボソーム認識およびＲＮＡ安定化の
ために必要とされる最小配列を少なくとも含む５’非翻訳核酸配列が存在することを特徴
とし得る。これに翻訳開始コドンが後続することができ、該翻訳開始コドンに（直ちに）
、乳酸菌の遺伝子の翻訳される核酸配列の５’末端部分の少なくとも５つのコドンの断片
または該断片の構造的もしくは機能的同等物が後続してもよい。断片はまた、プロモータ
ーによって制御されてもよい。ＰＣＴ／ＮＬ９５／００１３５（それに開示された様々な
実施形態を含む）および本明細書で言及された全ての他の文献の内容は、参照することに
より本明細書に組み込まれる。本発明の一態様は、宿主における異種遺伝子の高レベルの
調節された発現および発現の分泌への連結を可能とする方法を提供する。別の実施形態で
は、国際公開第９３／１７１１７号パンフレット（参照することにより本明細書に組み込
まれる）にしたがって強力な発現システムを開発するためにＴ７バクテリオファージＲＮ
Ａポリメラーゼおよびその同族プロモーターが使用される。一実施形態では、発現プラス
ミドは、ｐＴ１ ＮＸ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＭ５８５３７１．１）に由来する。
本発明にしたがって用いられるプロモーターは、一部の場合には、細菌中で構成的に発
現される。構成的プロモーターの使用は、発現を起こすために誘導剤または他の調節シグ
ナルを供給する必要性を回避する。一部の場合には、プロモーターは、たとえ増殖が維持
されなくても、細菌宿主細胞が生存可能なままである、すなわち、一部の代謝活性を保持
するレベルでの発現を導く。したがって、有利なことに、そのような発現は低いレベルで
あってもよい。例えば、発現産物が細胞内に蓄積する場合、発現のレベルは、細胞内タン
パク質の約１０％未満、約５％または約５％未満、例えば約１～３％での発現産物の蓄積
に繋がり得る。プロモーターは、用いられる細菌に同属的、すなわち、天然でその細菌中
に見られるものであり得る。例えば、ラクトコッカス（Lactococcus）のプロモーターを
ラクトコッカス（Lactococcus）において使用することができる。ラクトコッカス・ラク
チス（Lactococcus lactis）（または他のラクトコッカス（Lactococcus）属細菌）にお
いて使用するための好ましいプロモーターは、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus
lactis）の染色体に由来する「Ｐ１」である（Waterfield, N R, Lepage, R W F, Wilson
, P W, et al. (1995). “The isolation of lactococcal promoters and their use in
investigating bacterial luciferase synthesis in Lactococcus lactis” Gene 165(1)
:9-15）。プロモーターの他の例としては、ｕｓｐ４５プロモーター、ｇａｐＢプロモー
ター、およびｈｌｌＡプロモーターが挙げられる。他の有用なプロモーターは、Ｓｔｅｉ
ｄｌｅｒらの米国特許第８，７５９，０８８号明細書、およびＶａｎｄｅｎ－Ｂｒｏｕｃ
ｋｅらの米国特許出願第２０１４／０１０５８６３号明細書（これらの開示は、参照する
ことによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の例では、ＩＬ
－１０ポリペプチドをコードする核酸は、ｈｌｌＡプロモーター下に配置される。
核酸構築物（単数または複数）は、分泌シグナル配列をコードする核酸を含み得る。し
たがって、一部の実施形態では、ＩＬ－１０および／またはＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、
ＰＩＮＳ）をコードする核酸は、例えば、シグナル配列をコードする核酸配列をポリペプ
チドをコードする核酸配列に適切に連結することによって、ポリペプチドの分泌を提供し
得る。抗原を分泌するための核酸を宿す細菌の能力は、該生物の生存能力を維持する培養
条件においてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができる。好ましい分泌シグナル配列とし
ては、バチルス（Bacillus）、クロストリジウム（Clostridium）およびラクトバチルス
（Lactobacillus）などのグラム陽性生物中で活性を有する任意の分泌シグナル配列が挙
げられる。そのような配列は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliqu
etaciens）のα－アミラーゼ分泌リーダー、またはスタフィロコッカス（Staphylococcus
）の一部の株によって分泌され、グラム陽性およびグラム陰性の両方の宿主において機能
することが公知のスタフィロキナーゼ酵素の分泌リーダー（“Gene Expression Using Ba
cillus,” Rapoport (1990) Current Opinion in Biotechnology 1:21-27を参照）、ある
いは多数の他のバチルス（Bacillus）酵素またはＳ層タンパク質からのリーダー配列（pp
341-344 of Harwood and Cutting, “Molecular Biological Methods for Bacillus,”
John Wiley & Co. 1990を参照）を含み得る。一実施形態では、前記分泌シグナルは、ｕ
ｓｐ４５に由来する（Van Asseldonk et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 240:428-434）。
そのような分泌リーダーは、本明細書では例えばＳＳｕｓｐ４５と称される。一部の実施
形態では、ＩＬ－１０ポリペプチドは、ＳＳｕｓｐ４５を使用して構成的に分泌される。
他の例では、ＰＩＮＳポリペプチドは、ＳＳｕｓｐ４５を使用して分泌される。さらに他
の例では、ＩＬ－１０ポリペプチドおよびＰＩＮＳポリペプチドの両方が、ＳＳｕｓｐ４
５を使用して分泌される。
本開示の方法を使用して対象に送達されるＩＬ－１０およびＰＩＮＳの最適な量は、例
えば、ＩＬ－１０ポリペプチドおよびＰＩＮＳポリペプチドを発現する微生物、および遺
伝子構築物、例えば、遺伝子構築物において使用されたプロモーターの強度と共に、変化
することを当業者は理解するであろう。典型的に、微生物は、発現されるＩＬ－１０ポリ
ペプチドおよびＰＩＮＳポリペプチドの具体的な量に相当する量で、または各々の対象に
おいて各々のＩＬ－１０ポリペプチドまたはＰＩＮＳポリペプチドについて所望されるＰ
Ｋプロファイルを生成する量で、投与される。例示的な１日のＩＬ－１０ポリペプチドま
たはＰＩＮＳポリペプチドの用量は、１日あたり約１０ｆｇ～約１００μｇの活性ポリペ
プチドである。他の例示的な用量範囲は、１日あたり約１ｐｇ～約１００μｇ、または１
日あたり約１ｎｇ～約１００μｇである。
上記用量は、１日あたりの有効量の微生物を対象に投与することによって実現すること
ができ、該微生物は、上記したものなどの、所望の用量を実現するために充分な量のＩＬ
－１０およびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）を発現するように構成されている。
ＩＬ－１０ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳポリペプチド）を分
泌する微生物は、１日あたり約１０４コロニー形成単位（ｃｆｕ）～約１０１２ｃｆｕ、
具体的には、１日あたり約１０６ｃｆｕ～約１０１２ｃｆｕ、より具体的には、１日あた
り約１０９ｃｆｕ～約１０１２ｃｆｕの用量で送達され得る。分泌されたＩＬ－１０およ
びＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳポリペプチド）の量は、例えば、Steidler et al
., Science 2000; 289(5483):1352-1355に記載の方法にしたがって、またはＥＬＩＳＡを
使用することによって、ｃｆｕに基づいて決定することができる。例えば、特定の微生物
は、１０９ｃｆｕあたり少なくとも約１ｎｇ～約１μｇのＩＬ－１０を分泌し得る。それ
に基づいて、当業者は、他のｃｆｕ用量で分泌されるＩＬ－１０ポリペプチドの範囲を算
出することができる。
上記用量／用量範囲のそれぞれは、本明細書に記載される任意の投薬レジメンとの関連
で投与することができる。１日の用量は、１日全体を通じて１、２、３、４、５、または
６の部分で投与されてもよい。さらに、１日の用量は、投与期間の間の任意の回数の休息
期間と共に、任意の日数にわたって投与されてもよい。例えば、対象は、少なくとも約１
週、少なくとも約２週、少なくとも約３週、少なくとも約４週、少なくとも約５週、また
は少なくとも約６週の期間にわたって、１日あたりまたは２日毎に約０．０１～約３Ｍ
ＩＵのＩＬ－１０に相当する用量で微生物を投与され得る。一部の例では、対象は、例え
ば、約５日、約７日、または約１４日にわたって、約０．１～約５ＭＩＵ／日、または約
０．３～約３ＭＩＵに相当する用量で微生物を投与される。例示的な用量は、例えば、Ha
rtemann et al., Lancet Diabetes Endocrinol. 2013, 1(4): 295-305（その開示は、参
照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
配合物およびレジメン
本開示の一部の方法では、ＩＬ－１０ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、
ＰＩＮＳ）は、ＩＬ－１０ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポ
リペプチドの両方を産生する微生物（例えば、ＬＡＢ）を使用して対象（例えば、ヒトＴ
１Ｄ患者）に投与（送達）される。
一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、医薬組成物）中または本開示の単位剤
形中に含有されていてもよい微生物（例えば、ＬＡＢ）は、例えば、経口配合物を使用し
て１日に１回、２回、３回、４回、５回、または６回投与される。一部の実施形態では、
微生物は、毎日、２日毎、週に１回、週に２回、週に３回、または週に４回投与される。
他の実施形態では、治療は、２週毎に１回行われる。他の実施形態では、治療は、３週毎
に１回行われる。他の実施形態では、治療は、月に１回行われる。
治療サイクルの継続時間は、例えば、Ｔ１Ｄの治療もしくは後退、または再発の予防の
ための必要に応じて、７日から対象の生涯までである。一部の実施形態では、治療サイク
ルは、約３０日から約２年にわたって続く。他の実施形態では、対象は、３０日から１．
５年続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から１年続く治療サ
イクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から１１カ月続く治療サイクルを有
する。他の実施形態では、対象は、３０日から１０カ月続く治療サイクルを有する。他の
実施形態では、対象は、３０日から９カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では
、対象は、３０日から８カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３
０日から７カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から６カ
月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から５カ月続く治療サ
イクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から４カ月続く治療サイクルを有す
る。他の実施形態では、対象は、３０日から３カ月続く治療サイクルを有する。他の実施
形態では、対象は、３０日から２カ月続く治療サイクルを有する。
さらなる実施形態では、治療サイクルは、グリセミック指数、インスリン自己抗体（Ｉ
ＡＡ）レベル、Ｃ断片レベル、および膵島炎などの、疾患の進行を追跡するマーカーのレ
ベルに基づく。好ましくは、対象は、発症早期の糖尿病である。対象はまた、ベータ細胞
に対する免疫反応を抑制するＴｒｅｇ細胞のレベルも評価されてよい。例示的な実施形態
では、対象は、少なくともさらなる疾患進行がなくなるまで、好ましくは正常血糖の回復
があるまで、治療される。患者は、Ｔｒｅｇ細胞の集団が疾患を抑制しかつ後退させるこ
とを確実にするために追加の期間にわたって治療されてもよい。対象はまた、モニターさ
れ、再出現した疾患の任意の徴候が最初に現れた時に治療されてもよい。
連日の維持投与を対象において臨床的に望ましい期間にわたって与えてもよく、該期間
は、例えば、１日から数年まで（例えば、対象の残りの生涯全体にわたって）、例えば約
（２、３もしくは５日、１もしくは２週、または１カ月）以上かつ／または例えば約（５
年、１年、６カ月、１カ月、１週、または３もしくは５日）までである。約３日～約５日
または約１週～約１年にわたる連日の維持用量の投与が典型的である。とはいえ、治療効
果が観察されるまで、単位用量を例えば１日２回から２週毎に１回まで投与するべきであ
る。
ＩＬ－１０ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）ポリペプチドを
産生する微生物は、Ｔ１Ｄの治療のための単剤または（例えば、併用療法レジメンを使用
する）併用療法で対象に投与され得る。「併用療法」、「併用療法的」という用語または
これらの変形は、追加の免疫調節化合物などの少なくとも１つの追加の治療活性剤が対象
に投与される治療レジメンを指す。したがって、一部の実施形態では、本開示の組成物は
、追加の治療活性剤を含む。一部の実施形態では、本開示の組成物は、抗体（例えば、抗
ＣＤ３抗体）などの少なくとも１つの追加の免疫調節物質を含有する。一部の例では、本
開示の方法は、抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）などの追加の免疫調節物質を対象（例えば
、ヒト患者）に投与することをさらに含む。
医薬組成物および担体
微生物（例えば、本明細書に記載されるＬＡＢなどの細菌）は、純粋形態、他の活性成
分との組合せ、および／または薬学的に許容される（すなわち、非毒性の）添加剤または
担体との組合せで投与することができる。「薬学的に許容される」という用語は、その当
該技術分野で認識される意味にしたがって本明細書で使用され、医薬組成物の他の成分と
適合し、かつそのレシピエントにとって有害でない担体を指す。
本開示の組成物は、粘膜への微生物（例えば、細菌）の送達のために好適な任意の公知
またはその他の効果的な投与量または製品形態に調製することができ、該製品形態には医
薬組成物および剤形の他に栄養製品形態が含まれる。
一部の実施形態では、医薬組成物（すなわち、配合物）は、経口医薬組成物である。こ
の実施形態による一部の例では、配合物または医薬組成物は、任意選択で他の乾燥担体と
組み合わせて、乾燥形態（例えば、乾燥粉末形態；例えば、凍結乾燥形態）またはその圧
縮形態で非病原微生物を含む。経口配合物は、通常、不活性希釈担体または食用担体を含
む。
一部の例では、経口配合物は、コーティングを含むか、またはカプセル化戦略を利用し
、これは腸管中への配合物の送達を促進し、かつ／または微生物が腸管（例えば、回腸、
小腸、または結腸）中で放出および含水されることを可能とする。微生物が配合物から放
出され、充分に含水すると、微生物は、生物活性ポリペプチドの発現を開始し、それはそ
の後に周囲環境中に放出されるか、または微生物の表面上に発現される。そのようなコー
ティングおよびカプセル化戦略（すなわち、遅延放出戦略）は当業者に公知である。例え
ば、米国特許第５，９７２，６８５号明細書、国際公開第２０００／１８３７７号パンフ
レット、および国際公開第２０００／２２９０９号パンフレット（これらの開示は、参照
することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照。
一部の実施形態では、本開示は、デキストラン、グルタミン酸ナトリウム、およびポリ
オールなどの他の成分との組合せであってもよい、凍結乾燥（lyophilized）または凍結
乾燥（freeze dried）形態の微生物（例えば、非病原性細菌）を含む医薬組成物を提供す
る。例示的な凍結乾燥組成物は、例えば、Ｃｏｒｖｅｌｅｙｎらの米国特許出願第２０１
２／００３９８５３号明細書（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組
み込まれる）に記載されている。例示的な配合物は、凍結乾燥された細菌（例えば、治療
有効量の細菌）および薬学的に許容される担体を含む。凍結乾燥された細菌は、カプセル
剤、錠剤、顆粒剤および散剤の形態に調製することができ、これらのそれぞれは経口的に
投与され得る。あるいは、凍結乾燥された細菌は、好適な媒体中の水性懸濁液として調製
されてもよいし、または凍結乾燥された細菌は、使用の直前に飲料などの好適な媒体中に
懸濁されてもよい。そのような組成物は、例えば、細菌バイオマスの沈殿、凝集、または
浮遊がない、安定な懸濁液を維持するために有用な安定化剤を追加的に含有してもよい。
経口投与の場合、配合物は、胃耐性経口剤形であり得る。例えば、経口剤形（例えば、
カプセル剤、錠剤、ペレット、マイクロペレット、顆粒剤など）は、胃での溶解または破
壊に耐性であるが腸内では耐性でないことによって、胃を通過して腸（例えば、小腸また
は結腸）での分解、溶解および吸収に有利に働くことを可能とする添加剤（通常、ポリマ
ー、セルロース誘導体および／または親油性材料）の薄層でコーティングすることができ
る。
一部の例では、経口配合物は、微生物の制御放出、持続放出、または長期放出を提供す
ることによって、微生物中でコードされた所望のタンパク質の制御放出を提供する化合物
を含み得る。これらの剤形（例えば、錠剤またはカプセル剤）は、典型的に、親油性、ポ
リマー性、セルロース系、不溶性、かつ／または膨潤性の添加剤などの、従来周知の添加
剤を含有する。制御放出性配合物はまた、腸、結腸などの任意の他の送達部位、生体接着
または舌下送達（すなわち、歯科粘膜送達）および気管支送達のために使用することもで
きる。本発明の組成物が直腸内または経膣的に投与される場合、医薬配合物は、坐剤およ
びクリームを含み得る。この場合、宿主細胞は、脂質も含む一般的な添加剤の混合物中に
懸濁される。上述の配合物のそれぞれは当該技術分野において周知であり、例えば以下の
参照文献に記載されている：Hansel et al. (1990, Pharmaceutical dosage forms and d
rug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins); Chien 1992, Novel drug
delivery system, 2nd edition, M. Dekker); Prescott et al. (1989, Novel drug deli
very, J. Wiley & Sons); Gazzaniga et al., (1994, Oral delayed release system for
colonic specific delivery, Int. J. Pharm. 108:77-83)。
一部の実施形態では、経口配合物は、微生物によって発現される生物活性ポリペプチド
の粘膜送達および／または粘膜吸収を増進できる化合物を含む。他の例では、配合物は、
配合物内、かつ／または放出されてからの微生物の生存能力を増進させる化合物を含む。
本発明の細菌は、治療すべき疾患を有するヒトまたは動物に投与するための医薬配合物
中に懸濁することができる。そのような医薬配合物は、生きたグラム陽性菌および投与の
ために好適な媒体を含むがこれらに限定されない。細菌は、ラクトース、他の糖、ステア
リン酸、炭酸および／または硫酸のアルカリおよび／またはアルカリ土類塩（例えば、ス
テアリン酸マグネシウム、炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウム）、カオリン、シリカ、
香料および芳香剤などの一般的な添加剤の存在下で凍結乾燥することができる。そのよう
に凍結乾燥された細菌は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤および散剤（例えば、マウスウォッ
シュ粉末）の形態に調製することができ、これらのそれぞれを経口経路で投与することが
できる。あるいは、一部のグラム陽性菌は、好適な媒体中の水性懸濁液として調製されて
もよいし、または凍結乾燥された細菌は、本明細書で言及される添加剤およびグルコース
、グリシンおよびサッカリン酸ナトリウムなどの他の添加剤を含む媒体などの、好適な媒
体中に使用の直前に懸濁されてもよい。
一部の例では、微生物は、任意の好適な方法を使用して対象の胃腸管に局所的に送達さ
れる。例えば、ミクロスフェア送達システムを用いて腸への送達を増進させることができ
る。ミクロスフェア送達システムは、対象の胃腸管での局所放出を提供するコーティング
を有するマイクロ粒子を含む（例えば、腸溶性コーティング配合物および結腸用配合物な
どの制御放出性配合物）。
経口投与の場合、胃耐性経口剤形を配合することができ、該剤形はまた、グラム陽性菌
の制御放出を提供することによって該細菌中でコードされた所望のタンパク質（例えば、
ＩＬ－１０）の制御放出を提供する化合物も含むことができる。例えば、経口剤形（カプ
セル剤、錠剤、ペレット、顆粒剤、散剤など）は、胃での溶解または破壊に耐性であるが
腸内では耐性でないことによって、胃を通過して腸での分解、溶解および吸収に有利に働
くことを可能とする添加剤（例えば、ポリマー、セルロース誘導体および／または親油性
材料）の薄層でコーティングすることができる。
経口剤形は、グラム陽性菌および産生される外因性タンパク質の徐放を可能とするよう
に、例えば、制御放出、持続放出、長期放出、持効性の錠剤またはカプセル剤として設計
することができる。これらの剤形は、通常、親油性、ポリマー性、セルロース系、不溶性
、かつ／または膨潤性の添加剤などの、従来周知の添加剤を含有する。そのような配合物
は当該技術分野において周知であり、例えば以下の参照文献に記載されている：Hansel e
t al., Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, Willi
am and Wilkins, 1990; Chien 1992, Novel drug delivery system, 2nd edition, M. De
kker; Prescott et al., Novel drug delivery, J.Wiley & Sons, 1989; and Gazzaniga
et al., Int. J. Pharm. 108: 77-83 (1994)。
医薬剤形（例えば、カプセル剤）は、胃液耐性を得るためならびに回腸終末部および結
腸での意図する送達（そこでポリマーはｐＨ ６．５で溶解する）のために、ｐＨ依存性
のオイドラギットポリマーでコーティングすることができる。他のオイドラギットポリマ
ーまたはポリマー間の異なる比を使用することによって、遅延放出プロファイルを調整し
、例えば十二指腸または空腸（jejenum）で細菌を放出することができる。
医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含有する。好適な添加剤、
希釈剤、および担体の非限定的な例としては、防腐剤、無機塩、酸、塩基、緩衝剤、栄養
分、ビタミン、デンプン、糖、マンニトール、およびケイ酸誘導体などの充填剤および増
量剤；カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギネート、ゼラチ
ン、およびポリビニルピロリドン（polyvinyl pyrolidone）などの結合剤；グリセロール
などの保湿剤／炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；パラフィンなどの
溶解遅延剤；第４級アンモニウム化合物などの再吸収促進剤；アセチルアルコール、モノ
ステアリン酸グリセロールなどの表面活性剤；カオリンおよびベントナイトなどの吸着性
担体；プロピレングリコールおよびエチルアルコールなどの担体、ならびにタルク、カル
シウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および固体ポリエチルグリコール
が挙げられる。
薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含め
ることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、
または類似の性質の化合物を含有することができる：微結晶性セルロース、トラガカント
ゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの添加剤、アルギン酸
、プリモゲル、またはコーンスターチなどの分散剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑
沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；
あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジの香味物質などの香味剤。投
薬単位形態がカプセル剤である場合、投薬単位形態は、上記種類の材料に加えて、脂肪油
などの液体担体を含有することができる。加えて、投薬単位形態は、投薬単位の物理形態
を修飾する様々な他の材料、例えば、糖衣、シェラック、または腸溶剤を含有することが
できる。さらに、シロップ剤は、活性化合物に加えて、甘味剤としてスクロースおよびあ
る特定の防腐剤、色素、着色剤、および香味物質を含有してもよい。薬学的に許容される
担体の形態および特徴は、それと組み合わせる活性成分の量、投与経路および他の周知の
変数によって定められることが理解されるであろう。担体は、配合物の他の成分と適合し
、かつそのレシピエントにとって有害でないという意味で「許容される」ものでなければ
ならない。
投与用の代替的な調製物としては、滅菌された水性または非水性溶液、懸濁液、および
エマルションが挙げられる。非水性溶媒の例は、ジメチルスルホキシド、アルコール、プ
ロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン
酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、アルコールと水との混合
物、緩衝化媒体、および食塩水が挙げられる。静脈内賦形剤としては、リンゲルのデキス
トロースに基づくものなどの、液体および栄養補充液、電解質補充液が挙げられる。例え
ば、抗菌物質、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの防腐剤および他の添加物も存在
することができる。食塩水、アルコール、ＤＭＳＯ、および水性溶液などの様々な液体配
合物がこれらの送達方法のために可能である。
経口水性配合物は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリ
ン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム（sodium saccharine）、セルロース、および
／または炭酸マグネシウムなどの添加剤を含む。これらの組成物は、マウスウォッシュお
よびマウスリンスなどの溶液の形態をとり、例えば、水、アルコール／水溶液、食塩水溶
液、塩化ナトリウム、リンゲルのデキストロースなどの非経口賦形剤などの水性担体をさ
らに含む。
水性マウスウォッシュ配合物は当業者に周知である。マウスウォッシュおよび経口リン
スに関する配合物は、例えば、米国特許第６，３８７，３５２号明細書、米国特許第６，
３４８，１８７号明細書、米国特許第６，１７１，６１１号明細書、米国特許第６，１６
５，４９４号明細書、米国特許第６，１１７，４１７号明細書、米国特許第５，９９３，
７８５号明細書、米国特許第５，６９５，７４６号明細書、米国特許第５，４７０，５６
１号明細書、米国特許第４，９１９，９１８号明細書、米国特許出願第２００４／００７
６５９０号明細書、米国特許出願第２００３／０１５２５３０号明細書、および米国特許
出願第２００２／００４４９１０号明細書（これらのそれぞれは、参照することにより本
明細書のこのセクションおよび本明細書の全ての他のセクションに具体的に組み込まれる
）に詳細に論じられている。
香味物質、甘味剤もしくは着色剤、または防腐剤などの他の添加物が本開示の配合物中
に存在してもよい。ペパーミントまたはミドリハッカなどのミント、シナモン、ユーカリ
、柑橘類、カシア、アニスおよびメントールは好適な香味剤の例である。香味剤は、例え
ば、０～３％の範囲、最大２％、最大０．５％など、例えば液体組成物の場合に約０．２
％といった量で、経口組成物中に存在する。
甘味剤としては、サッカリンナトリウム、スクロース、グルコース、サッカリン、デキ
ストロース、レブロース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、フルクトース、マ
ルトース、キシリトール、ソーマチン、アスパルテーム、Ｄ－トリプトファン、ジヒドロ
カルコン、アセスルファム、および任意のこれらの組合せなどの人工または天然甘味剤が
挙げられ、これらは、経口組成物の０～２％の範囲、例えば、最大１％ｗ／ｗ、０．０５
～０．３％ｗ／ｗなどの量で存在することができる。
着色剤は、二酸化チタンもしくはＣＩ ４２０９０、またはこれらの混合物などの、好
適な天然または合成色素である。着色剤は、好ましくは、０～３％の範囲、例えば最大０
．１％、最大０．０５％など、例えば液体組成物の場合に約０．００５～０．０００５％
の量で組成物中に存在する。通常の防腐剤のうち、組成物のｐＨを変化させるために実質
的に不充分な濃度の安息香酸ナトリウムが好ましく、そうでなければ所望のｐＨに到達す
るために緩衝剤の量の調整が必要なことがある。
他の任意選択の成分としては、保湿剤、界面活性剤（非イオン性、陽イオン性または両
性）、増粘剤、ゴムおよび結合剤が挙げられる。保湿剤は配合物に形を与え、歯磨き剤組
成物中の水分を保持する。加えて、保湿剤は、配合物の貯蔵の間の微生物の劣化の防止を
助ける。保湿剤はまた、相安定性の維持を補助し、かつ透明または半透明の歯磨き剤を配
合する方法を提供する。
好適な保湿剤としては、グリセリン、キシリトール、グリセロール、およびプロピレン
グリコールなどのグリコールが挙げられ、これらは、例えば、それぞれ最大５０％ｗ／ｗ
の量で存在することができるが、一部の場合には、保湿剤全体は組成物の約６０～８０％
ｗ／ｗより多くない。例えば、液体組成物は、最大約３０％のグリセリンおよび最大約５
％、例えば約２％ｗ／ｗのキシリトールを含み得る。界面活性剤は、陰イオン性でないこ
とが好ましく、組成物の最大約６％、例えば約１．５～３％ｗ／ｗの量でポリソルベート
２０またはココアミドベタインなどを含み得る。
本発明の経口組成物が液体形態である場合、経口組成物の最大約３％ｗ／ｗ、０～０．
１％などの範囲内、例えば、経口組成物の約０．００１～０．０１％、約０．００５％ｗ
／ｗなどの膜形成剤を含むことが好ましい。好適な膜形成剤としては、（ヒアルロン酸ナ
トリウムに加えて）Ｇａｎｔｒｅｚという商標名の下で販売されているものが挙げられる
。
経口または経腸投与用の液体栄養配合物は、脂質、炭水化物、タンパク質、ビタミン、
および鉱物などの１つまたは複数の栄養分を含み得る。多くの異なる供給源および種類の
炭水化物、脂質、タンパク質、鉱物およびビタミンが公知であり、そのような栄養分が選
択された配合物中に加えられる成分と適合性であり、安全かつ意図する使用に効果的であ
り、かつ製品の性能を過度に損なわない限り、本発明の栄養液の実施形態において使用す
ることができる。
これらの栄養液は、例えば、充分な粘性、流動性、または他の物理的もしくは化学的特
徴を有するように配合されて、栄養液の飲用または投与の間の粘膜のより効果的かつ鎮静
的なコーティングを提供する。これらの栄養分の実施形態はまた、一部の場合には、個体
の単独の、主要な、または補助的な栄養分の必要性を満たすために好適な均衡の取れた栄
養供給源となる。
好適な栄養液の非限定的な例は、米国特許第５，７００，７８２号明細書（Ｈｗａｎｇ
ら）、米国特許第５，８６９，１１８号明細書（Ｍｏｒｒｉｓら）、および米国特許第５
，２２３，２８５号明細書（ＤｅＭｉｃｈｅｌｅら）（これらの記載は、参照することに
よりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
本明細書での使用のために好適な栄養タンパク質は、加水分解されていてもよいし、部
分的に加水分解されていてもよいし、または加水分解されていなくてもよく、乳汁（例え
ば、カゼイン、乳清）、動物（例えば、肉、魚）、穀物（例えば、米、麦）、野菜（例え
ば、大豆）、または任意のこれらの組合せなどの任意の公知またはその他の好適な供給源
に由来し得る。
栄養液において使用するために好適な脂肪または脂質としては、ココナッツ油、大豆油
、コーン油、オリーブ油、サフラワー油、高オレイン酸サフラワー油、ＭＣＴ油（中鎖ト
リグリセリド）、ヒマワリ油、高オレイン酸ヒマワリ油、構造化トリグリセリド、パーム
油およびパーム核油、パームオレイン、キャノーラ油、海洋油、綿実油、および任意のこ
れらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。栄養液において使用するために好適
な炭水化物は、単純または複合、ラクトース含有またはラクトース非含有、または任意の
これらの組合せであってよい。好適な炭水化物の非限定的な例としては、加水分解された
コーンスターチ、マルトデキストリン、グルコースポリマー、スクロース、コーンシロッ
プ、コーンシロップ固形物、米由来炭水化物、グルコース、フルクトース、ラクトース、
高フルクトースコーンシロップ、およびフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）などの難消化性オリ
ゴサッカリド、ならびに任意のこれらの組合せが挙げられる。
栄養液は、様々なビタミンのいずれかをさらに含んでよく、その非限定的な例としては
、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ピリド
キシン、ビタミンＢ１２、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、ビオチン、ビタミンＣ、コ
リン、イノシトール、その塩および誘導体、ならびに任意のこれらの組合せが挙げられる
。
栄養液は、Ｔ１ＤのリスクがあるまたはＴ１Ｄを患った患者における使用（us）のため
の公知またはそれ以外に好適な様々な鉱物のいずれかをさらに含んでよく、その非限定的
な例としては、カルシウム、リン、マグネシウム 鉄、セレニウム、マンガン、銅、ヨウ
素、ナトリウム、カリウム、塩化物、および任意のこれらの組合せが挙げられる。
本発明の微生物、特に酵母および細菌はまた、簡便な経口または直腸投与用のエリキシ
ルまたは溶液として、あるいは非経口投与、例えば、筋肉内、皮下または静脈内経路によ
る非経口投与のために適切な溶液として配合されてもよい。さらに、ヌクレオシド誘導体
はまた、活性成分のみを放出し、または、一部の場合には、腸管の特定の部分において、
例えば持続的または長期間にわたって、放出して効果をさらに増進させる剤形などの、持
続または長期放出剤形としての配合物のために特によく適する。そのような剤形における
コーティング、エンベロープ、および保護マトリックスは、例えば、製薬の技術分野にお
いて周知のポリマー物質またはワックスから作ることができる。
本発明の組成物は、ロゼンジ剤、トローチ剤またはパステル剤などの医薬剤形を含む。
これらは、通常、好適な香味の基剤中に活性成分を含有する円盤形状の固体である。基剤
は、硬質の氷砂糖、グリセリンゼラチン、または形態を与える充分な粘質物との砂糖の組
合せであってよい。トローチ剤は口の中に入れられるとゆっくりと分解し、粘膜との直接
的な接触のために活性成分を解放する。
本発明のトローチ剤の実施形態は、例えば、柔軟な塊が形成されるまで粉末状の活性物
質、粉末状の砂糖、およびゴムの混合物に水をゆっくり加えることによって調製すること
ができる。７％のアカシア粉末を使用して塊に充分な粘着性を提供することができる。塊
を転がし、トローチ片を扁平状の塊から切り出し、または塊を転がして円柱状にし、分割
することができる。切り出されまたは分割された各片を成形し、乾燥させることによって
トローチ剤形を形成する。
活性成分が熱に不安定な場合、圧縮によってロゼンジ剤調製物にしてもよい。例えば、
調製中の造粒ステップは、任意の圧縮錠剤のために使用される方法と類似の方法で行われ
る。ロゼンジ剤は、剤形が口中でゆっくり溶けまたは崩壊するのに望ましくなるように通
常よりも硬い錠剤を与えるために、強い圧縮の設備を使用して作られる。成分は、一部の
場合には、遅延溶解性の特徴を促進するように選択される。
本発明の特定の配合物では、微生物は、アルファデンプンおよび架橋ポリ（アクリル酸
）を含有する生体接着性担体中に組み込まれて、頬側塗布のために好適（すなわち、長期
の生体接着および持続的な薬物送達を有する）な生体接着性の錠剤および生体接着性のゲ
ルを形成する。
代替的な実施形態では、本発明による非病原性かつ非浸潤性の細菌の粉末混合物、生体
接着性ポリマー（噴霧乾燥を介して一緒に加工されたアルファデンプンおよび架橋ポリ（
アクリル酸））、フマル酸ステアリルナトリウム（滑沢剤）、および二酸化ケイ素（滑剤
）を加工して錠剤（重量：１００ｍｇ；直径：７ｍｍ）にする。これらの錠剤の製造方法
は当業者に周知であり、様々な薬物（ミコナゾール、テストステロン、フッ化物、シプロ
フロキサシン）を含有する生体接着性の錠剤の開発の成功について以前に記載されている
（Bruschi M. L. and de Freitas O., Drug Development and Industrial Pharmacy, 200
5 31:293-310）。全ての添加剤材料は医薬品グレードで市販されている。
配合物を最適化するために、錠剤中の薬物含有量およびデンプンとポリ（アクリル酸）
との比は様々である。先行する研究に基づいて、一緒に加工された生体接着性担体中の最
大の薬物含有量は約６０％（ｗ／ｗ）であり、デンプン／ポリ（アクリル酸）の比は７５
／２５から９５／５（ｗ／ｗ）の間で変化させることができる。最適化の研究において、
錠剤の生体接着特性および錠剤からの薬物放出が主要な評価パラメーターであり、標準的
な錠剤特性（硬度、破砕性）が二次的な評価基準である。
細菌は、アルファデンプンおよび架橋されたポリ（アクリル酸）の水性分散液中に組み
込まれる。このポリマー分散液は、高せん断ミキサーを使用して標準的な手順を介して調
製される。
錠剤と同様に、食道粘膜への最適な接着を有するゲルを得るために、ゲルの薬物含有量
およびデンプン／ポリ（アクリル酸）の比を最適化する必要がある。ゲルの場合、分散液
中のポリマーの濃度は、ゲルの粘度、したがってその粘膜付着特性を決定するので、追加
の変数である。
食道の粘膜へのポリマー分散液の生体接着特性をスクリーニングするモデルは、Batche
lor et al. (Int. J. Pharm., 238:123- 132, 2002)によって詳細に記載されている。
投与の他の経路および形態としては、生きた微生物を含有する食品調製物が挙げられる
。一部の例では、生物活性ポリペプチド発現微生物は、乳製品中に含めることができる。
本発明の医薬組成物は、選択された剤形を配合または製造するための任意の公知または
その他の効果的な方法によって調製することができる。例えば、微生物を、添加剤および
希釈剤などの、一般的な、例えば、薬学的に許容される担体と共に配合し、経口の錠剤、
カプセル剤、噴霧剤、ロゼンジ剤、処理された基材（例えば、経口または外用スワブ、パ
ッド、または本発明の組成物で処理された使い捨ての非消化性の基材）；経口液（例えば
、懸濁液、溶液、エマルション）、粉末、坐剤、または任意の他の好適な剤形を形成する
ことができる。一部の実施形態では、本開示は、医薬組成物を製造する方法を提供する。
例示的な方法は、ＩＬ－１０遺伝子およびＴ１Ｄ特異的抗原遺伝子を含有する（またはＩ
Ｌ－１０およびＴ１Ｄ特異的抗原を発現できる）微生物（例えば、非病原性細菌）を薬学
的に許容される担体と接触させ、それによって医薬組成物を形成することを含む。一部の
例では、方法は、培地中で微生物を増殖させることをさらに含む。方法は、微生物を含有
する液体を凍結乾燥することをさらに含んでもよく、該液体は、薬学的に許容される担体
を含む。
単位剤形
本開示は、食品グレードのまたは薬学的に許容される担体との組合せであってもよいあ
る特定の量の非病原微生物を含む単位剤形をさらに提供し、前記非病原微生物（例えば、
非病原性グラム陽性菌）は、ＩＬ－１０ポリペプチドをコードする外因性核酸、および１
型糖尿病（Ｔ１Ｄ）特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）をコードする外因性核酸を含む。例
示的な単位剤形は、約１×１０３～約１×１０１４コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原
微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含有する。他の例示的な単位剤形は、約１×
１０４～約１×１０１３コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性
グラム陽性菌）、または約１×１０４～約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非
病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含有する。他の実施形態では、単位剤形
は、約１×１０５～約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０６～
約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽
性菌）を含む。他の実施形態では、単位剤形は、約１×１０８～約１×１０１２コロニー
形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０９～約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）
の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。さらに他の実施形態では、単
位剤形は、約１×１０９～約１×１０１１コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１
０９～約１×１０１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グ
ラム陽性菌）を含む。さらに他の実施形態では、単位剤形は、約１×１０７～約１×１０
１１コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０８～約１×１０１０コロニー形成単
位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。
さらに他の実施形態では、単位剤形は、約１×１０９～約１×１０１０コロニー形成単
位（ｃｆｕ）、または約１×１０９～約１００×１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非
病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。
単位剤形は、任意の物理形態または形状を有し得る。一部の実施形態では、単位剤形は
、経口投与のために適当である。これらの実施形態による一部の例では、単位剤形は、カ
プセル剤、錠剤、または顆粒剤の形態である。例示的なカプセル剤としては、マイクロ顆
粒を充填したカプセル剤が挙げられる。一部の実施形態では、剤形中に含有される非病原
微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）は、乾燥粉末形態である。例えば、微生物は、
凍結乾燥粉末形態であり、これは圧縮およびコーティングされていてもよい。
この組成物および方法は、以下の実施例を参照することによってよりよく理解すること
ができるが、これらは、列挙された実施形態および後述の特許請求の範囲においてより完
全に記載される本発明の例示に過ぎないことを当業者は理解するであろう。さらに、本出
願の全体を通じて、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、参照すること
によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[実施例１]
ｈＰＩＮＳおよびｈＩＬ１０を分泌する臨床グレードのラクトコッカス・ラクチス（Lact
ococcus lactis）の構築
ヒトＰＩＮＳおよびヒトＩＬ１０を分泌するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus
lactis）株（ｓＡＧＸ０４０７）は、以前に記載された方法を使用してＭＧ１３６３親株
中の染色体に位置するチミジル酸シンターゼ（ｔｈｙＡ）遺伝子をヒトＰＩＮＳおよびＩ
Ｌ１０用の発現カセットと置換することによって生成した。例えば、Steidler L. et al.
, Nat. Biotechnol. 2003; 21:785-789、およびSteidler L, Rottiers P; Annals of the
New York Academy of Sciences 2006; 1072:176-186を参照。Ｌ．ラクチス（L. lactis
）染色体に変化を導入する方法は、二重相同組換えを使用する。ｐＯＲＩ１９に由来し、
エリスロマイシン選択マーカーを含有する条件複製型キャリアープラスミドは、ｒｅｐＡ
＋ Ｌ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８中で構築した。細菌染色体上の野生型配列
に隣接するものと同一の最大１ｋｂの交差（ＸＯ）区画の間に目的のカーゴがクローニン
グされるように、キャリアープラスミドを設計した。このプラスミドをＭＧ１３６３また
はいずれかのその誘導株（ｒｅｐＡ－）中に導入した。エリスロマイシンを含有する寒天
プレート上で耐性コロニーを選択し、５’標的部位または３’標的部位のいずれかにおけ
る第１の相同組換えをＰＣＲスクリーニングによって検証した。エリスロマイシン選択の
解放は、５’標的部位または３’標的部位のいずれかにおける、第２の相同組換えによる
細菌染色体からのキャリアープラスミドの除去を可能とした。臨床グレード株の最終遺伝
子構造をＳａｎｇｅｒおよびＩｌｌｕｍｉｎａの両方の全ゲノムシークエンシングによっ
て大規模に記録した。最終臨床株中にはプラスミドまたは残留エリスロマイシン抵抗性は
存在しない。例えば、Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789
を参照。
ｓＡＧＸ０４０７は、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（Ｌ．ラクチ
ス（L. lactis））ＭＧ１３６３の誘導株である。ｓＡＧＸ０４０７では、
・チミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ；遺伝子ＩＤ：４７９８３５８）が存在せず、
環境的封じ込めを保証する（Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 78
5-789）。
・ｔｈｙＡが欠失された、ＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（Ｐ
ｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の下流の位置において、ヒトインターロイキン
－１０（ｈＩＬ－１０；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２２３０１、ａａ １９～１７８、バリアン
トＰ２Ａ；Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789）をコード
するｈｉｌ－１０遺伝子に融合させた未同定分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４
５；遺伝子ＩＤ：４７９７２１８；ＳＳｕｓｐ４５）の分泌リーダーをコードする遺伝子
が挿入されて、ｈＩＬ－１０の発現および分泌を可能としている。
・トレハロース－６－リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７
１４０）が存在せず、外因的に加えられたトレハロースの蓄積を可能とする。
・トレハロース－６－リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９
１４）がｕｓｐ４５（遺伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流に位置して、トレハロース－
６－リン酸のトレハロースへの変換を促進する。高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis
）ＭＧ１３６３の５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４
７９７８７３）に先行する遺伝子間領域（ＩＲ）の使用によって、ｏｔｓＢ発現ユニット
がｕｓｐ４５に転写上および翻訳上連結された。
・ＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：
４７９７３５３）がトレハロースオペロン中の推定上のホスホトランスフェラーゼ遺伝子
（ｔｒｅＰＴＳ；ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４；それぞれ、遺伝子ＩＤ
：４７９７７７８および遺伝子ＩＤ：４７９７０９３）に先行して、トレハロースの取込
みを増強する。
・セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネントをコードする遺伝子（遺伝子ＩＤ：
４７９６８９３）ｐｔｃＣが破壊されていた（４４６のうちのコドン位置３０のｔｇａ；
ｔｇａ３０）。この変異は蓄積後のトレハロースの保持を確実にする。
・ヒトプロインスリン（ＰＩＮＳ；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１３０８、アミノ酸２５～１１
０）をコードするｐｉｎｓ遺伝子とのｕｓｐ４５分泌リーダー（ＳＳｕｓｐ４５）の融合
物をコードする遺伝子がグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇａｐ
Ｂ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７７）の下流に位置して、ＰＩＮＳの発現および分泌を可能
とする。ｐｉｎｓ発現ユニットは、ＩＲｒｐｍＤの使用によってｇａｐＢに転写上および
翻訳上連結された。
ｓＡＧＸ０４０７の全ての遺伝形質は細菌染色体上に存在する。ｓＡＧＸ０４０７の遺
伝学的背景は以下を提供する：
・ＰＩＮＳおよびｈＩＬ－１０の構成的な分泌。
・増殖および生存のための、外因的に加えられたチミジンに対する厳格な依存性。
・トレハロースを蓄積および保持する能力、およびしたがって胆汁酸の毒性に抵抗する能
力を獲得する。
図１８は、記載された通りのｓＡＧＸ０４０７の関連する遺伝子座：ｔｒｅＰＴＳ、Δ
ｔｒｅＰＰ；ｏｔｓＢ；ｐｔｃＣ－；ｇａｐＢ＞＞ｐｉｎｓおよびΔｔｈｙＡ、ｈＩＬ－
１０の図式的な概要を示し、関連するオリゴヌクレオチド結合部位（ｏＡＧＸｎｏ）、Ｅ
ｃｏＲＩ制限部位、（／切断／）遺伝子の特徴、遺伝子間領域（ＩＲ）、ＰＣＲ増幅産物
の大きさ（ｂｐ）を指し示している。
ｔｒｅＰＴＳ、ΔｔｒｅＰＰ
トレハロース－６－リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７
１４０）の欠失；トレハロースオペロン中の推定上のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（
ｔｒｅＰＴＳ；ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４；ｐｔｓＩおよびｐｔｓＩ
Ｉ；それぞれ、遺伝子ＩＤ：４７９７７７８および遺伝子ＩＤ：４７９７０９３）に先行
するＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ
：４７９７３５３）の挿入、ｐｔｓＩとｐｔｓＩＩとの間の高発現されるＬ．ラクチス（
L. lactis）ＭＧ１３６３ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝
子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入（図１３Ａ、図１３Ｂ、および
図１３Ｃ）。
ｏｔｓＢ
未同定分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５；遺伝子ＩＤ：４７９７２１８）
の下流のトレハロース－６－リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０
３６９１４）の挿入。ｕｓｐ４５とｏｔｓＢとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lac
tis）ＭＧ１３６３ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ
：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入。（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。
ｐｔｃＣ－
４４６のうちのコドン位置３０におけるｔｇａ（ｔｇａ３０）の挿入と共に、その傍ら
の、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネントをコードする遺伝子（ｐｔｃＣ；
遺伝子ＩＤ：４７９６８９３）を破壊するためのＥｃｏＲＩ制限部位の導入（図１５Ａお
よび図１５Ｂ）。
ｇａｐＢ＞＞ｐｉｎｓ
高発現されるグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇａｐＢ；遺伝
子ＩＤ：４７９７８７７）の下流の、ヒトプロインスリン（ＰＩＮＳ；ＵｎｉＰｒｏｔ：
Ｐ０１３０８、アミノ酸２５～１１０）をコードする、ｐｉｎｓ遺伝子とのｕｓｐ４５分
泌リーダー（ＳＳｕｓｐ４５）の融合物をコードする遺伝子の挿入。ｇａｐＢとｐｉｎｓ
との間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３ ５０Ｓリボソームタン
パク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域
の挿入（図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１６）。
ΔｔｈｙＡ、ｈＩＬ－１０
チミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ；遺伝子ＩＤ：４７９８３５８）の欠失。ＨＵ
様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９
７３５３）の下流に、ヒトインターロイキン－１０（ｈＩＬ－１０；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ
２２３０１、ａａ １９～１７８、バリアントＰ２Ａ、Steidler et al., Nat. Biotechn
ol. 2003, 21(7): 785-789）をコードするｈｉｌ－１０遺伝子とのＳＳｕｓｐ４５の融合
物をコードする遺伝子の挿入物を挿入してｈＩＬ－１０の発現および分泌を可能にする（
図１７）。
[実施例２]
マウスにおける糖尿病の治療
尿中のグルコースレベル（Ｄｉａｓｔｉｘ（登録商標）試薬ストリップ、Ｂａｙｅｒ、
Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および静脈血（ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ（登録商標
）、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｖｉｌｖｏｏｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を評
価することによって糖尿病の発症についてＮＯＤマウスをスクリーニングした。糖尿を有
しかつ２回の連続的な血中グルコース測定値が２００ｍｇ／ｄｌを超えている時にマウス
を糖尿病と診断した。糖尿病と判定したら、ＮＯＤまたはＮＯＤトランスジェニックマウ
スをハムスター抗マウスＣＤ３抗体（クローン１４５－２Ｃ１１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、Ｗ
ｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）を用いて５日連続で静脈内（ｉ．ｖ．）（０～４日目；
２．５μｇ／マウス）処置した。この治療は、６週間の週に５回のプラスミド駆動または
臨床グレードのＬ．ラクチス（L. lactis）株（２×１０９ｃｆｕ）のいずれかの経口投
与と組み合わせて与えた。対照マウスは未処置のままとした。治療の開始時の個々の血中
グルコース濃度を記録した。体重および血中グルコース状態について週に３回マウスを試
験した。寛解は、糖尿がなくかつ正常な血中グルコース濃度への復帰として定義した。実
験動物を治療の中止後に直ちにまたは長い時間の後に屠殺した（治療開始の６または１４
週後）。末梢血、リンパ器官および膵臓を回収し、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓに記載された表現型解析について単一
細胞を評価した。血中グルコース濃度が２回の連続的な測定において６００ｍｇ／ｄｌを
超えた時にマウスを１４週のエンドポイント以前に試験から除外した。
耐糖能試験
屠殺の１または２週間前に腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）を行った。マウスを１６時
間絶食させ、グルコース（２ｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、０、１５、３０、
６０、９０および１２０分時に血中グルコース濃度を測定した。
ＩＡＡ測定
治療無作為化の前および治療中止時に新規発症糖尿病ＮＯＤマウスからヘパリン化血漿
を回収し、Robert S. et al., Diabetes 2014, 63: 2876-2887に記載の通りにＵＦ Ｄｅ
ｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｇａｉ
ｎｅｓｖｉｌｌｅ、ＦｌｏｒｉｄａにおいてＩＡＡを解析した。
ＣＴＬＡ４およびＴＧＦ－βのｉｎ ｖｉｖｏでの阻害
Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療によって寛容化されたマウスに治療停止後に
以下の投与レジメンでＣＴＬＡ４（クローンＵＣ１０－４Ｆ１０、Ｂｉｏｃｅｒｏｓ）お
よびＴＧＦ－β（クローン１Ｄ１１．１６．８、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）に対するブロッキン
グ抗体を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した：ＣＴＬＡ４について１および３日目に２５０μｇ
、次いで６、８、１０、１３および１８日目に１００μｇ；ＴＧＦ－βについて３週間に
わたって週に３回２００μｇ。最初の注射後に２５日まで連日血中グルコース濃度を測定
した。
糖尿病の養子移入
Ｔｅｆｆ細胞の糖尿病誘発能力を評価するために、新規発症糖尿病対照、Ｌ．ラクチス
（L. lactis）ベースの治療のレスポンダーおよびノンレスポンダーの脾臓からの全Ｔ細
胞（１×１０７細胞）を６～８週齢の免疫不全ＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスの尾静脈にｉ．ｖ
．（静脈内）移入した。細胞移入の１００日後まで糖尿病の発症についてレシピエントマ
ウスを週に２回モニターした。
ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおけるＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞のＤＴ媒介性の枯渇
ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウス（Ｆｏｘｐ３転写制御エレメントの制御下でヒトジ
フテリア毒素受容体（ＤＴＲ）を発現する）は、ＤＴ（ジフテリア毒素）投与によるＦｏ
ｘｐ３＋ Ｔ細胞の枯渇を可能とする。例えば、Feuerer M. et al., How punctual abla
tion of regulatory T cells unleashes an autoimmune lesion within the pancreatic
islets. Immunity 2009; 31:654-664を参照。Ｔｒｅｇ枯渇のために、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ
３．ＤＴＲマウス（Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療の中止後に未処理または寛
容化）に１、２、４、および７日目に４０μｇ／ｋｇ体重のＤＴ（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内
注射し、８日目に調べた。ＤＴ注射後に、マウスの体重、尿および血中グルコース状態を
モニターした。記載された通りに、フローサイトメトリーおよび組織学によってそれぞれ
末梢血および膵臓中のＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞をモニターした。例えば、Tian L. et al.,
Foxp3(+) regulatory T cells exert asymmetric control over murine helper response
s by inducing Th2 cell apoptosis. Blood 2011; 118:1845-1853を参照。
Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療と組み合わせたＦＯＸＰ３阻害ペプチドＰ６０
Ｐ６０（ＦＯＸＰ３に結合してそれを阻害できる１５－ｍｅｒの合成ペプチド、腹腔内
に１日あたり５０μｇ／投与、１４回までの投与）を以前に記載された通りにＬ．ラクチ
ス（L. lactis）ベースの治療の開始時に与えた。例えば、Casares N. et al., A peptid
e inhibitor of FOXP3 impairs regulatory T cell activity and improves vaccine eff
icacy in mice. Journal of Immunology 2010, 185:5150-5159を参照。
膵臓の組織学および膵島炎のグレード付け
ホルマリン固定のパラフィン包埋膵臓組織からの６μｍの切片を切断し、１００μｍの
間隔で回収した後、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。膵島を光顕微鏡法で２０×ま
たは４０×で観察し、独立した研究者により盲検で数え上げ、グレード付けした。膵臓試
料あたり少なくとも２５個の膵島を膵島浸潤について以下の通りにスコア付けした：０、
浸潤なし；１、膵島周囲炎；２、５０％未満の面積にリンパ球浸潤を伴う膵島、３、５０
％より多くの面積にリンパ球浸潤を伴う、または完全に破壊された膵島。
膵島内Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の検出
膵臓組織を９９％の２－メチル－ブタン中でスナップ冷却し、１２μｍの組織切片に切
断した。Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の検出は記載された通りに行った。例えば、Takiishi T.
et al., Reversal of autoimmune diabetes by restoration of antigen-specific toler
ance using genetically modified Lactococcus lactis in mice. J. Clin. Invest. 201
2, 122:1717-1725を参照。
統計
全てのデータはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ、
Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して解析した。カプラン・マイヤー検定を用いて生存曲
線を算出し、ログランク検定と比較した。ダンの多重比較またはマン・ホイットニーのＵ
検定を適宜用いてＡＮＯＶＡ（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定）によっ
て群を解析した。エラーバーはＳＥＭを表す。別に指し示さない限り、差は有意でない（
ｎｓ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．
０００１。
細菌および培地
Ｌ．ラクチス（L. lactis）－ｐＴ１ＮＸは、エンプティベクターｐＴ１ＮＸを含有す
るＭＧ１３６３株であり、対照として働く。プラスミド駆動Ｌ．ラクチス（L. lactis）
株（プラスミドにコードされたヒトＰＩＮＳおよび染色体に組み込まれたＩＬ１０を分泌
するｓＡＧＸ０３２８）を以前に記載された通りに培養した。例えば、Takiishi T. et a
l., J. Clin. Invest. 2012, 122:1717-17253を参照。ｔｈｙＡ－欠損Ｌ．ラクチス（L.
lactis）株の増殖および生存は増殖培地中のチミジンの存在に依存するので、臨床グレー
ドのＬ．ラクチス（L. lactis）（染色体に組み込まれたヒトＰＩＮＳおよびＩＬ１０を
分泌する）をＧＭ１７Ｔ、すなわち、０．５％のグルコース（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄ
ａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および２００μＭのチミジン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加したＭ１７ブロス（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、
ＮＪ）中で培養した。胃内接種のために、ストック懸濁液を増殖培地で１０００倍に希釈
し、３０℃で１６時間インキュベートして２×１０９ｃｆｕ／ｍｌの飽和密度とした。細
菌を遠心分離によって回収し、ＢＭ９培地で１０倍に濃縮した。治療用量は１００μｌの
この細菌懸濁液からなるものであった。胃内接種のために、ストック懸濁液を増殖培地で
１０００倍に希釈し、３０℃で１６時間インキュベートして２×１０９ｃｆｕ／ｍｌの飽
和密度とした。細菌を遠心分離によって回収し、ＢＭ９培地で１０倍に濃縮した。治療用
量は１００μｌのこの細菌懸濁液からなるものであった。
フローサイトメトリー
末梢血および特定の器官を治療開始の６週後に回収し、加工し、フローサイトメトリー
解析のための蛍光色素標識抗体またはマッチングアイソタイプ対照と共にインキュベート
した。Ｔｒｅｇを２０分間氷上で抗マウスＣＤ３（１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ４（ＧＫ１
．５）、ＣＤ８ａ（５３－６．７）、ＣＤ２５（ＰＣ６１．５または７Ｄ４（ＢＤ、Ｅｒ
ｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ））、およびＦＲ４（ｅＢｉｏ１２Ａ５）（記載が
なければ全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡより）で染色した。Ｆ
ｏｘｐ３（ＦＪＫ－１６ｓ）およびＣＴＬＡ４（ＵＣ１０－４Ｂ９）に対する細胞内染色
抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのものであり、製造者の説明書にしたがって使用した。抗
マウスＣＤ３（１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８ａ（５３－６．７）
、ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ－１４）、ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、およ
びＣＣＲ７（４Ｂ１２）で染色することによってナイーブ、エフェクターメモリーおよび
セントラルメモリーＴ細胞を決定した。Ｋａｌｕｚａ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ
、Ｓｕａｒｌｅｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）またはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａ
ｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いてＧａｌｌｉｏｓ（商標）フローサイトメーターで細
胞を解析した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのサプレッサーアッセイ
ＣＤ２５、ＣＤ８α、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、および
ヒツジ抗ラットＩｇＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓに対する抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｅ
ｒｅｌｂｅｋｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して陰性選択によって１０週齢ＮＯＤマウスの
脾臓細胞から病原性ＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔｅｆｆ細胞を単離した。ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３
．ｈＣＤ２マウスのプールされたリンパ節および脾臓細胞（内因性ｆｏｘｐ３遺伝子座の
３’非翻訳領域中に、内部リボソーム進入部位と共にヒトＣＤ２－ＣＤ５２融合タンパク
質を宿す）からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋
Ｔｒｅｇを単離した。例えば、Culina S. et al., Clin. Dev. Immunol. 2011; 2011:2
86248を参照。簡潔に述べれば、細胞試料を７０μｍの細胞ストレイナーに通し、ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地中に懸濁し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＲＰＭＩ１６４０培
地中に懸濁した。結果として得られた細胞懸濁液を数え、洗浄し、最初にＣＤ８α＋、Ｂ
２２０＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１１ｂ＋およびＭＨＣクラス＋、および接着細胞をパニン
グによって枯渇させ、ビオチンコンジュゲート化抗ＣＤ４および抗ｈＣＤ２抗体で染色し
た。次いで、細胞を抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．
Ｖ．、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と共にインキュベートし、Ｌ
ＳまたはＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で分離した。結果として得ら
れたｈＣＤ２＋またはｈＣＤ２－細胞を、抗ＣＤ２５抗体を用いてさらに精製した。ｉｎ
ｖｉｔｒｏでのポリクローナルサプレッサーアッセイを実行した。無細胞上清中のサイ
トカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ１０およびＴＧＦ－β）を記載された通りにマルチプレック
スイムノアッセイ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍ
Ａ）またはフローサイトメトリービーズアレイ（Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ
ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ（商標）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定した。例えば
、Ludvigsson J. et al., GAD65 antigen therapy in recently diagnosed type 1 diabe
tes mellitus. N. Engl. J. Med. 2012, 366:433-442を参照。
ＣＴＬＡ４（ＵＣ１０－４Ｆ１０）、ＩＬ１０（クローンＪＥＳ５－２Ａ５、ＢｉｏＸ
Ｃｅｌｌ）、およびＴＧＦ－β（クローン１Ｄ１１．１６．８、３つ全ての哺乳動物のＴ
ＧＦ－βアイソフォーム（β１、β２、およびβ３）を中和する、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）に
対するブロッキング抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で培養物に加えた。
結果
低用量の抗ＣＤ３と組み合わせた臨床グレードの自制型（self-contained）Ｌ．ラクチス
（L. lactis）ワクチンはＮＯＤマウスにおいて新規発症糖尿病を安定的に後退させ、残
留ベータ細胞機能を保存し、膵島炎の進行を停止させた
治療用量未満の抗ＣＤ３抗体と組み合わせてＩＬ１０と共にヒトＰＩＮＳを分泌する臨
床グレードの自制型Ｌ．ラクチス（L. lactis）株を使用して、疾患発症後少なくとも１
４週にわたって６６％（３５匹のうちの２３匹）のマウスが正常血糖に戻り、これは抗Ｃ
Ｄ３単独で治療されたマウスでの４３％よりも統計的に有意に優れていた（図１Ａ）。未
処置のままとした動物（ｎ＝２０）またはエンプティベクターの細菌株Ｌ．ラクチス（L.
lactis）－ｐＴ１ＮＸで処置した動物（ｎ＝９）は高血糖のままであり、それらの開始
時の体重の２０％が失われた時に屠殺した。ＰＩＮＳおよびＩＬ－１０を分泌する臨床グ
レードまたはプラスミド駆動Ｌ．ラクチス（L. lactis）株での単剤療法は、抗ＣＤ３と
の組合せよりも有意に効果が低かった（それぞれ０％（ｎ＝８）および１７％（ｎ＝８）
）（図１Ａ）。
追跡の間、新規発症糖尿病対照、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療によって保
護されたマウス、およびそのような治療によって保護されなかったマウスをＩＰＧＴＴに
供し、治療開始の６週後に屠殺し、その時点での膵臓組織を組織学によって評価した。治
療が成功した動物においてのみ、残留ベータ細胞機能（すなわち、耐糖能曲線下の面積（
ＡＵＣグルコース）として評価した）が保存され、重篤な膵島炎を有する膵島の比率がよ
り小さかった（図１Ｂ）。興味深いことに、併用療法の終了時にレスポンダーとノンレス
ポンダーとの間で膵島炎の重篤度の差異は観察されなかった（図１Ｃ）。
開始時血糖およびＩＡＡ陽性性はＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療についての治
療の成功を予測する
Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療についての治療の成功に対してマウスの年齢
または性別の影響は観察されなかった。しかしながら、治療の開始時の血糖濃度は成功を
予測し、開始時血糖が３５０ｍｇ／ｄｌより高いマウス（ｎ＝１３）での３８％と比べて
、３５０ｍｇ／ｄｌより低い血糖で開始したマウスの８２％が治癒された（ｎ＝２２）（
図２Ａ）。加えて、加入時のＩＡＡの陽性性は治療の成功と相関しているようであった（
図２Ｂ）。興味深いことに、治療開始時に血中グルコース濃度＜３５０ｍｇ／ｄｌかつＩ
ＡＡ陽性のマウスは、血中グルコースレベル＞３５０ｍｇ／ｄｌかつＩＡＡ陰性のマウス
（３３％；ｎ＝５；Ｐ＝０．０７）よりも糖尿病寛解率が明確に優れていた（８９％、ｎ
＝８）（図２Ｃ）。さらに、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療は、特に治療に対
して反応性のマウスにおいて、ＩＡＡレベルを有意に減少させた（図２Ｄ）。
Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療は調節的な能力を有するより高レベルのＦｏｘ
ｐ３＋ Ｔ細胞を誘導するがＴｅｆｆ細胞の変化を誘導しない
介入に対して反応性または非反応性のマウスにおける治療的な免疫効果を分けることに
よって、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療によって誘導される疾患寛解の基礎と
なる機序を調べた。末梢血（図３Ａ）、膵臓の灌流リンパ節（図３Ｂ）、および膵臓（図
３Ｃ）において観察されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（ＣＤ２５＋およびＣＤ２５－の両方）
Ｔ細胞のパーセンテージは、非治療対照と比較してＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの
治療で治療されたマウスにおいて有意に高いことが分かった。興味深いことに、ＣＤ４＋
Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の増加頻度は、膵臓の灌流リンパ節および膵臓では、ノンレスポン
ダーよりもレスポンダーにおいて著明でなかったが、末梢血ではそうではなかった。多色
フローサイトメトリーを使用して、ほとんどのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ ＴｒｅｇはＣＴＬ
Ａ４陽性であること、およびこの阻害性マーカーの発現は非治療対照と比べて治療マウス
の膵臓の灌流リンパ節（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）および膵臓（レス
ポンダーのみ）において有意に高いことを特定した（図８Ｂおよび図８Ｃ）。興味深いこ
とに、非治療対照と比べて治療マウスの末梢血ではＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋
Ｔ細胞のパーセンテージの差異は観察されなかった（図３Ｄ）。ナイーブ（ＣＤ４４－Ｃ
Ｄ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリー（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－ＣＣＲ７－）
およびセントラルメモリー（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋）ＣＤ４＋ Ｔ細胞のパ
ーセンテージは、治療の成功または失敗に関していずれのレシピエント群においても変化
しなかった。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療のレスポンダーおよびノンレスポ
ンダーからの脾臓細胞の移入は、非治療の新規発症糖尿病対照から単離された脾臓細胞の
移入と類似の疾患動態を伴う糖尿病をＮＯＤ－ｓｃｉｄレシピエントにおいて引き起こし
、これは、循環性の糖尿病誘発細胞が治療マウスから枯渇されなかったことを示唆する（
図９）。
Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療によって誘導された糖尿病の後退は機能的なＦ
ｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇの生成を伴いかつそれに依存する
Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療によって治療されたＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ｈ
ＣＤ２マウスを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能的な研究のためのＣＤ４＋ＣＤ２５
＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞を単離することができ、該研究において、該細胞は病原性ＣＤ４
＋ＣＤ２５－ Ｔｅｆｆ細胞の増殖、ＣＤ６９活性化およびＩＦＮ－γ産生を抑制した。
これらのＴｒｅｇは、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ γｃ －／－ マウスから単離された脾臓抗原
提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で抗ＣＤ３抗体と共培養して刺激された時に、ＩＬ－１０（
およびＴＧＦ－β）を産生した（図４）。治療レスポンダーとノンレスポンダーとの間で
ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の調節能力において差異は見られなかった。
抗ＣＴＬＡ４ Ｉｇ（クローンＵＣ１０－４Ｆ１０）またはＴＧＦ－β中和抗体（クロ
ーン１Ｄ１１．１６．８）の追加は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞による抑
制を有意に低減させ（図５Ａ）、治癒マウスのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅ
ｇはｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＴＬＡ４およびＴＧＦ－β依存的にＴｅｆｆ増殖を阻害するこ
とを示唆する。抗ＩＬ１０（クローンＪＥＳ５－２Ａ５）の追加は、Ｔｒｅｇの直接的な
抑制効果を変化させなかった。他方、これらの調節的な機序は、治療レスポンダーおよび
ノンレスポンダーからのＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞画分では実証されなか
った（図５Ｂ）。抗ＣＴＬＡ４ Ｉｇ（クローンＵＣ１０－４Ｆ１０）と抗ＴＧＦ－β（
クローン１Ｄ１１．１６．８）との組合せを用いたｉｎ ｖｉｖｏでの安定的に治癒され
たマウスの処置は、５匹のうち２匹のマウスにおいて糖尿病の再発に繋がった（図５Ｃ）
。
最後に、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療についての治療の成功がＦｏｘｐ３
＋ Ｔ細胞の存在および機能性に依存するかどうかを調べた。このために、新規発症糖尿
病ＮＯＤマウスを１４日の期間にわたってＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療およ
びＦＯＸＰ３阻害ペプチドＰ６０で同時に処置した（図６Ａ）。興味深いことに、マウス
（ｎ＝６）のいずれも正常血糖とならなかった一方で、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベー
スの治療および賦形剤で処置したマウス（ｎ＝１１）は糖尿病寛解率が６０％であった。
これは、Ｔｒｅｇが治療誘導性の寛容の誘導にとって決定的に重要であることを指し示す
（図６Ｂ）。
新規発症（自然発生）糖尿病ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスをＬ．ラクチス（L. l
actis）ベースの治療で処置し、安定な糖尿病の後退が観察された後、図７Ａに描写した
スキームに記載された通りにＤＴを使用してＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞を除去した。最初に、
非処理のＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおいて、最初のＤＴ注射後３日以内に末梢
血において、選択されたＤＴレジメンは９０％を超えるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞を
除去し、残りのＴｒｅｇはＣＤ２５の発現が低いかまたは発現しないことを確立した（図
１０Ａ～Ｃ）。これらの細胞の進行性の再増殖は、いくつものＦｏｘｐ３．ＤＴＲ株につ
いて報告された通り、最初のＤＴ注射後５日目から始まった。例えば、Kim J.M. et al.,
Nat. Immunol. 2007, 8:191-197; Suffner J. et al., J. Immunol. 2010, 184:1810-18
20、およびMayer C.T. et al., Immun. Inflamm. Dis. 2014, 2:162-165を参照。このＤ
Ｔレジメンはまた、膵臓中に存在するＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の量を劇的に減少させ、結果
的に自己免疫糖尿病の発症に繋がった（図１０Ｂおよび図１０Ｄ）。次に、野生型ＮＯＤ
マウスと同等に、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療は、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．Ｄ
ＴＲマウスの５７％（７匹のうち４匹のマウス）において自己免疫糖尿病の寛解を誘導し
た（図７Ａおよび図７Ｂ）。一過性のＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞枯渇は、最初のＤＴ注射後２
日目に始まる重篤な高血糖症と共に糖尿の再出現によって実証される通り、治療によって
最初に治癒された全てのマウス（ｎ＝４）において糖尿病状態への完全な後退を結果とし
てもたらした（図７Ｂ）。インスリン産生性ベータ細胞に対する免疫寛容のこの破棄は、
重篤な膵島炎の誘導（図７Ｃ）および膵島内Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇプールの除去も伴っ
た（図７Ｄ）。合わせると、これらのデータは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの介
入からの治療効果はＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇの存在および機能性に依存することを実証し
た。
考察
疾患を阻む介入の手段としての経口寛容は、Ｔ１Ｄを含む自己免疫疾患の動物モデルに
おいて調べられている。例えば、Commins SP, Pediatr. Clin. North. Am. 2015; 62:152
3-1529を参照。
この実施例では、染色体に組み込まれたヒトＰＩＮＳおよびヒトＩＬ－１０を分泌する
経口の臨床グレードの自制型Ｌ．ラクチス（L. lactis）株を調製した。短期間の治療用
量未満の抗ＣＤ３と組み合わせた場合、介入は新規発症糖尿病マウスにおいて安全かつ長
期間の正常血糖の誘導に効果的であった。疾患発症時のＩＡＡ陽性性に加えて初期血中グ
ルコース濃度（＜３５０ｍｇ／ｄｌ）は治療転帰の予測因子であった一方で、残留ベータ
細胞機能の保存およびＩＡＡ陽性性の低下は治療の成功のマーカーであった。
したがって、糖尿病診断時に介入する場合、すなわち血糖代謝異常が存在する場合、あ
る程度の残留ベータ細胞量が治療の成功のために必要であろう。
治療に対して反応性または非反応性のマウスにおけるＬ．ラクチス（L. lactis）ベー
スの介入の免疫効果を分けることによって、治療に付随する免疫プロセスの性質および役
割をさらに特徴付けた。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療は、レスポンダーおよ
びそれにも増してノンレスポンダーの膵臓の灌流リンパ節および膵臓において抑制性ＩＬ
－１０分泌ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（ＣＤ２５＋およびＣＤ２５－の両方）Ｔ細胞を誘導し
、炎症を起こした標的組織へのＴｒｅｇの誘引の増進を示唆した。末梢でも、ＣＤ４＋Ｆ
ｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度が非治療対照と比べて治療マウスで増加し、免疫マーカーとし
てのこの細胞集団の使用が可能であることを示唆する。興味深いことに、様々なＴｒｅｇ
部分集団の間のＣＴＬＡ４＋ Ｔ細胞の頻度は、新規発症糖尿病マウスと比べて、そして
併用療法で治療されたノンレスポンダーマウスとは対照的に、併用療法で治療されたレス
ポンダーマウスの膵臓で有意に高かった。レスポンダーマウスとノンレスポンダーマウス
との間で膵島炎の程度に差異は見られず、Ｔｒｅｇ以外のリンパ球部分集団における変化
を示唆した。
末梢Ｔｒｅｇは、環境的状況および刺激条件にしたがって異なる調節機構を使用するこ
とができる。例えば、Liston A. et al., Nature Reviews Immunology 2014; 14:154-165
を参照。これらの実験では、治療増幅性のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の調
節活性にとってｉｎ ｖｉｔｒｏおよび部分的にｉｎ ｖｉｖｏでＣＴＬＡ４およびＴＧ
Ｆ－βが重要であったが、ＩＬ－１０は重要ではなかった。
ＩＬ－１０は本発明者らのＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療誘導性Ｔｒｅｇの
同定のための良好なマーカーであるようであったが、抗ＩＬ－１０抗体は確立された寛容
をｉｎ ｖｉｖｏで妨げなかったことを他の者が実証している。例えば、Fowler S. and
Powrie F, European Journal of Immunology 2002, 32:2997-3006を参照。
マウスと同様、ヒトＴｒｅｇは、転写因子Ｆｏｘｐ３の持続的な高発現を伴う抑制性の
表現型を有することによって定義され（例えば、Hori S. et al., Science 2003; 299:10
57-1061を参照）、Ｆｏｘｐ３遺伝子の機能喪失／変異は、重篤な致死性の自己免疫障害
に繋がる（例えば、Kim J.M., et al., Nature Immunology 2007; 8:191-197、およびMay
er C.T. et al., European Journal of Immunology 2014, 44:2990-3002を参照）。
Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの治療開始時のＰ６０ペプチドによるＴｒｅｇ機能
の特異的阻害（例えば、Casares N. et al., Journal of Immunology 2010; 185:5150-51
59を参照）は、治療誘導性の寛容の誘導を損なった。さらに、治療寛容化ＮＯＤ．Ｆｏｘ
ｐ３．ＤＴＲマウスからのＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇの一過性の枯渇は、全ての動物におい
て完全な疾患再発を誘導するために充分であり、これは、治療的な寛容を維持し、かつＬ
．ラクチス（L. lactis）ベースの治療に反応性のマウス中にまだ存在する病原性Ｔｅｆ
ｆ細胞を制御するために、Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の存在が重要であることを実証した。
本データは、低用量の抗ＣＤ３とのヒトＰＩＮＳおよびヒトＩＬ－１０を分泌する臨床
グレードの自制型Ｌ．ラクチス（L. lactis）の組合せは、抗ＣＤ３単剤療法と比べて糖
尿病の後退頻度を増加させたことを実証する。治療レスポンダーおよびノンレスポンダー
の両方は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を増加させ、これは、Ｌ．ラクチス（L.
lactis）ベースの治療によって誘導された免疫効果が各個体レシピエントにおいて起こ
ったが、治療の成功（安定な正常血糖に戻ることとして定義される）は、疾患発症時にま
だ存在する機能的なベータ細胞量などの、他のパラメーターに依存することを示唆した。
治療の成功は、開始時血糖とさらに関係した。加入時の初期血中グルコース濃度の次に、
ＩＡＡレベルも抗原としてＰＩＮＳを使用するこのＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの
治療の転帰を予測した。本データは、活性の寛容を誘導および維持し、かつ寛容化マウス
において糖尿病誘発性の免疫反応を制御するためにＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇが必須であっ
たことを実証する。これらの発見は、ヒトにおける介入を試験するためのツール：膵島抗
原を分泌する臨床グレードの自制型Ｌ．ラクチス（L. lactis）、治療の成功を予測する
ためのバイオマーカー、およびＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の誘導がＬ．ラクチス（L. lactis
）ベースの治療の基礎となることの実証を提供する。
一部の実施形態を本明細書に示して記載したが、そのような実施形態は単に例として与
えるものである。本発明から離れることなく、多数の変形、変更、および置換が当業者に
想起されるであろう。本明細書に記載される発明の実施形態に対して様々な代替手段が本
発明の実施において用いられることが理解されるべきである。
例示的な実施形態
１．インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）をコードする外因性核酸、およびプロインス
リン（ＰＩＮＳ）をコードする外因性核酸を含み、ＩＬ－１０をコードする前記外因性核
酸およびＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、染色体に組み込まれている、乳酸菌（
ＬＡＢ）。
２．ラクトコッカス（Lactococcus）種の細菌である、実施形態１のＬＡＢ。
３．ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である、実施形態２のＬＡＢ。
４．ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）亜種クレモリス（cremoris）であ
る、実施形態３のＬＡＢ。
５．ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株ＭＧ１３６３である、実施形態
４のＬＡＢ。
６．前記ＩＬ－１０が、ヒトＩＬ－１０（ｈＩＬ－１０）である、実施形態１～５のいず
れか１つのＬＡＢ。
７．前記ｈＩＬ－１０が、シグナルペプチドを含まない成熟ｈＩＬ－１０として分泌され
た時に、２位においてプロリン（Ｐｒｏ）の代わりにアラニン（Ａｌａ）を含む、実施形
態６のＬＡＢ。
８．前記ＩＬ－１０が、配列番号１に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有す
る、実施形態１～７のいずれか１つのＬＡＢ。
９．ＩＬ－１０をコードする前記外因性核酸が、配列番号２に対して少なくとも９５％同
一のヌクレオチド配列を有する、実施形態１～８のいずれか１つのＬＡＢ。
１０．前記ＰＩＮＳが、ヒトＰＩＮＳ（ｈＰＩＮＳ）である、先行する実施形態のいずれ
か１つのＬＡＢ。
１１．前記ＰＩＮＳが、配列番号３に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有す
る、先行する実施形態のいずれか１つのＬＡＢ。
１２．ＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、配列番号４に対して少なくとも９５％同
一のヌクレオチド配列を有する、先行する実施形態のいずれか１つのＬＡＢ。
１３．前記ＩＬ－１０を構成的に発現する、先行する実施形態のいずれか１つのＬＡＢ。
１４．前記ＩＬ－１０を分泌する、実施形態１３のＬＡＢ。
１５．前記ＰＩＮＳを構成的に発現する、先行する実施形態のいずれか１つのＬＡＢ。
１６．前記ＰＩＮＳを分泌する、実施形態１５のＬＡＢ。
１７．前記ＩＬ－１０および前記ＰＩＮＳを構成的に発現しかつ分泌する、先行する実施
形態のいずれか１つのＬＡＢ。
１８．ＩＬ－１０をコードする前記外因性核酸が、ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）
の３’に位置する、先行する実施形態のいずれか１つのＬＡＢ。
１９．前記ＰｈｌｌＡが、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）のＰｈｌｌ
Ａである、実施形態１８のＬＡＢ。
２０．ＩＬ－１０をコードする前記外因性核酸が、前記ＰｈｌｌＡによって転写調節され
る、実施形態１８のＬＡＢ。
２１．ｈｌｌＡプロモーター、ＩＬ－１０分泌配列、およびＩＬ－１０をコードする前記
外因性核酸を含む発現カセットを含む、先行する実施形態のいずれか１つのＬＡＢ。
２２．前記発現カセットが、染色体に組み込まれている、実施形態２１のＬＡＢ。
２３．前記発現カセットが、ｔｈｙＡ遺伝子座において染色体に組み込まれている、実施
形態２２のＬＡＢ。
２４．前記ＩＬ－１０分泌配列が、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質（Ｕｓｐ４５）の分
泌リーダー（ＳＳｕｓｐ４５）をコードするヌクレオチド配列である、実施形態２１～２
３のいずれか１つのＬＡＢ。
２５．ＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、ｇａｐＢプロモーターの３’に位置する
、先行する実施形態のいずれか１つのＬＡＢ。
２６．ＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、前記ｇａｐＢプロモーターによって転写
調節される、実施形態２５のＬＡＢ。
２７．ｇａｐＢ遺伝子の５’に位置するｇａｐＢプロモーター、ＰＩＮＳ分泌配列、およ
びＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットを含
む、実施形態２５または２６のＬＡＢ。
２８．前記ｇａｐＢ遺伝子と前記ＰＩＮＳ分泌配列との間の遺伝子間領域をさらに含む、
実施形態２７のＬＡＢ。
２９．前記遺伝子間領域が、配列番号８または配列番号９を有するｒｐｍＤである、実施
形態２８のＬＡＢ。
３０．前記ｇａｐＢプロモーターおよび前記ｇａｐＢ遺伝子が、前記ＬＡＢに対して内因
性である、実施形態２７～２９のいずれか１つのＬＡＢ。
３１．前記第１のポリシストロン性発現カセットが、染色体に組み込まれている、実施形
態２７～３０のいずれか１つのＬＡＢ。
３２．前記ＰＩＮＳ分泌配列が、ＳＳｕｓｐ４５をコードするヌクレオチド配列である、
実施形態２７～３１のいずれか１つのＬＡＢ。
３３．前記ＳＳｕｓｐ４５が、配列番号１１または配列番号１２のヌクレオチド配列を有
する、実施形態３２のＬＡＢ。
３４．トレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸をさらに含む、
先行する実施形態のいずれか１つのＬＡＢ。
３５．前記トレハロース－６－リン酸ホスファターゼが、大腸菌（Escherichia coli）Ｏ
ｔｓＢである、実施形態３４のＬＡＢ。
３６．トレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする前記外因性核酸が、染色体
に組み込まれている、実施形態３４または３５のＬＡＢ。
３７．トレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする前記外因性核酸が、未同定
分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５）の３’において染色体に組み込まれてい
る、実施形態３６のＬＡＢ。
３８．ｕｓｐ４５プロモーター、前記ｕｓｐ４５、およびトレハロース－６－リン酸ホス
ファターゼをコードする前記外因性核酸を含む第２のポリシストロン性発現カセットを含
む、実施形態３７のＬＡＢ。
３９．前記第２のポリシストロン性発現カセットが、前記ｕｓｐ４５とトレハロース－６
－リン酸ホスファターゼをコードする前記外因性核酸との間の遺伝子間領域をさらに含む
、実施形態３８のＬＡＢ。
４０．前記遺伝子間領域が、配列番号８または配列番号９を有するｒｐｍＤである、実施
形態３９のＬＡＢ。
４１．トレハロース－６－リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ）が、前記ＬＡＢに
おいて破壊または不活性化されている、先行する実施形態のいずれか１つのＬＡＢ。
４２．前記ｔｒｅＰＰが、前記ｔｒｅＰＰまたはその断片を除去することによって不活性
化されている、実施形態４１のＬＡＢ。
４３．前記ｔｒｅＰＰが、終止コドンの挿入によって破壊されている、実施形態４１のＬ
ＡＢ。
４４．ｔｒｅＰＰ活性を欠いている、実施形態４１～４３のいずれか１つのＬＡＢ。
４５．セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント遺伝子（ｐｔｃＣ）が、前記Ｌ
ＡＢにおいて破壊または不活性化されている、先行する実施形態のいずれか１つのＬＡＢ
。
４６．前記ｐｔｃＣが、終止コドンを挿入することによって破壊されている、実施形態４
５のＬＡＢ。
４７．前記ｐｔｃＣが、前記ｐｔｃＣまたはその断片を除去することによって不活性化さ
れている、実施形態４５のＬＡＢ。
４８．ｐｔｃＣ活性を欠いている、実施形態４５～４７のいずれか１つのＬＡＢ。
４９．１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまたは複数の遺
伝子をさらに含む、先行する実施形態のいずれかのＬＡＢ。
５０．１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする前記１つまたは複数
の遺伝子が、前記ＬＡＢに対して内因性である、実施形態４９のＬＡＢ。
５１．前記１つまたは複数のトレハローストランスポーターを過剰発現する、実施形態４
９または５０のＬＡＢ。
５２．１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする前記１つまたは複数
の遺伝子が、ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）の３’に位置する、実施形態４９～５
１のいずれか１つに記載のＬＡＢ。
５３．１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする前記１つまたは複数
の遺伝子が、前記ＰｈｌｌＡによって転写調節される、実施形態５２のＬＡＢ。
５４．１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする前記１つまたは複数
の遺伝子が、ｌｌｍｇ＿０４５３、ｌｌｍｇ＿０４５４、および任意のこれらの組合せか
らなる群から選択される、実施形態４７～５１のいずれか１つのＬＡＢ。
５５．１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする前記１つまたは複数
の遺伝子が、２つのトレハローストランスポーターをコードする２つの遺伝子を含み、遺
伝子間領域が、前記２つの遺伝子の間に位置する、実施形態５４のＬＡＢ。
５６．前記遺伝子間領域が、配列番号８または配列番号９を有するｒｐｍＤである、実施
形態５５のＬＡＢ。
５７．先行する実施形態のいずれか１つのＬＡＢを含む組成物。
５８．実施形態１～５６のいずれか１つのＬＡＢ、および薬学的に許容される担体を含む
医薬組成物。
５９．１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療において使用するための、実施形態１～５６のいずれ
か１つのＬＡＢ、実施形態５７の組成物、または実施形態５８の医薬組成物。
６０．Ｔ１Ｄの治療用の医薬の調製において使用するための、実施形態１～５６のいずれ
か１つのＬＡＢ、実施形態５７の組成物、または実施形態５８の医薬組成物。
６１．前記Ｔ１Ｄが、発症直後のＴ１Ｄである、実施形態６０のＬＡＢ、組成物、または
医薬組成物。
６２．それを必要とする対象においてＴ１Ｄを治療する方法であって、治療有効量の実施
形態１～５６のいずれか１つのＬＡＢ、実施形態５７の組成物、または実施形態５８の医
薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
６３．前記Ｔ１Ｄが、発症直後のＴ１Ｄである、実施形態６２の方法。
６４．前記対象が、ヒトである、実施形態６２または６３の方法。
６５．治療有効量の抗ＣＤ３抗体を前記対象に投与することをさらに含む、実施形態６２
～６４のいずれか１つの方法。
６６．前記抗ＣＤ３抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態６５の方法。
６７．前記抗ＣＤ３抗体が、オテリキシズマブまたはテプリズマブである、実施形態６５
または６６の方法。
６８．前記抗体が、併用療法レジメンを使用して前記対象に投与される、実施形態６５～
６７のいずれか１つの方法。
６９．前記ＬＡＢを前記投与することおよび前記抗ＣＤ３抗体を前記投与することが、
（ｉ）抗ＣＤ３抗体単独で治療された対応する対象と比べた時に、または前記ＬＡＢおよ
び前記抗ＣＤ３抗体を投与されていない対応する対象と比べた時に、正常血中グルコース
レベルを維持するために前記対象が必要とするインスリンの量を低減させ、
（ｉｉ）Ｃペプチドレベルによる測定で、少なくとも約２カ月にわたって前記対象におい
て初期ベータ細胞機能を保存し、
（ｉｉｉ）少なくとも約２カ月にわたって対象において正常血糖を維持し、
（ｉｖ）少なくとも約２カ月にわたって前記対象において正常ヘモグロビンＡ１ｃ（Ｈｂ
Ａ１ｃ）レベルを維持し、または
（ｖ）任意のこれらの組合せである、
実施形態６５～６８のいずれか１つの方法。
７０．前記対象におけるインスリン自己抗体（ＩＡＡ）を測定することをさらに含む、実
施形態６２～６９のいずれか１つの方法。
７１．（ｉ）ＬＡＢを、ＩＬ－１０をコードする外因性核酸と接触させること、および（
ｉｉ）前記ＬＡＢを、ＰＩＮＳをコードする外因性核酸と接触させることを含み、ＩＬ－
１０をコードする前記外因性核酸、およびＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、染色
体に組み込まれる、遺伝子改変されたＬＡＢを調製する方法。
７２．ＩＬ－１０をコードする前記外因性核酸およびＰＩＮＳをコードする前記外因性核
酸が、相同組換えを使用して染色体に組み込まれる、実施形態７１の方法。
７３．前記ＬＡＢを、ＩＬ－１０をコードする外因性核酸と前記接触させることが、前記
ＬＡＢを、ＰＩＮＳをコードする外因性核酸と前記接触させることの前に行われる、実施
形態７１または７２の方法。
７４．前記ＬＡＢを、ＩＬ－１０をコードする外因性核酸と前記接触させることが、前記
ＬＡＢを、ＰＩＮＳをコードする外因性核酸と前記接触させることの後に行われる、実施
形態７１または７２の方法。
７５．前記遺伝子改変されたＬＡＢの培養物を少なくとも１つの安定化剤と合わせて細菌
混合物を形成することをさらに含む、実施形態７１～７４のいずれか１つの方法。
７６．前記細菌混合物から水を除去して乾燥組成物を形成することをさらに含む、実施形
態７５の方法。
７７．前記細菌混合物を凍結乾燥して凍結乾燥組成物を形成することを含む、実施形態７
６の方法。
７８．前記少なくとも１つの安定化剤が、少なくとも１つの凍結保存剤を含む、実施形態
７７の方法。
７９．前記遺伝子改変されたＬＡＢ、前記乾燥組成物、または前記凍結乾燥組成物を薬学
的に許容される担体と合わせて医薬組成物を形成することをさらに含む、実施形態７１～
７８のいずれか１つの方法。
８０．前記乾燥組成物、前記凍結乾燥組成物または前記医薬組成物を医薬剤形に配合する
ことをさらに含む、実施形態７６～７９のいずれか１つの方法。
８１．実施形態７１～８０のいずれか１つの方法によって調製された、遺伝子改変された
細菌。
８２．実施形態１～５６のいずれか１つのＬＡＢの培養物を少なくとも１つの安定化剤と
接触させて細菌混合物を形成することを含む、医薬組成物を調製する方法。
８３．前記細菌混合物から水を除去し、それによって乾燥組成物を形成することをさらに
含む、実施形態８２の方法。
８４．前記細菌混合物を凍結乾燥し、それによって凍結乾燥組成物を形成することを含む
、実施形態８２または８３の方法。
８５．前記少なくとも１つの安定化剤が、少なくとも１つの凍結保存剤を含む、実施形態
８２～８４のいずれか１つの方法。
８６．前記凍結乾燥組成物を薬学的に許容される担体と接触させて医薬組成物を形成する
ことをさらに含む、実施形態８４または８５の方法。
８７．前記凍結乾燥組成物を医薬剤形に配合することをさらに含む、実施形態８４～８６
のいずれか１つの方法。
８８．前記医薬剤形が、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、およびサシェ剤からなる群から選択
される、実施形態８７の方法。
８９．実施形態１～５６のいずれか１つのＬＡＢ、実施形態５７の組成物、または実施形
態５８の医薬組成物を含む単位剤形。
９０．経口剤形である、実施形態８９の単位剤形。
９１．前記経口剤形が、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、およびサシェ剤からなる群から選択
される、実施形態９０の単位剤形。
９２．約１×１０６～約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の前記ＬＡＢを含む、
実施形態８９～９１のいずれか１つの単位剤形。
９３．約１×１０８～約１×１０１１ｃｆｕを含む、実施形態９２の単位剤形。
９４．（１）実施形態１～５６のいずれか１つに記載のＬＡＢ、実施形態５７に記載の組
成物、実施形態５８の医薬組成物、または実施形態８９～９３のいずれか１つの単位剤形
、および（２）前記ＬＡＢ、前記組成物、前記医薬組成物、または前記単位剤形を哺乳動
物に投与するための説明書を含むキット。
９５．前記哺乳動物が、ヒトである、実施形態９４のキット。
９６．実施形態１～５６のいずれか１つのＬＡＢ、溶媒、および安定化剤を含む細菌懸濁
液。
９７．前記溶媒が、水、油、および任意のこれらの組合せから選択される、実施形態９６
の細菌懸濁液。
一部の実施形態を本明細書に示して記載したが、そのような実施形態は単に例として与えるものである。本発明から離れることなく、多数の変形、変更、および置換が当業者に想起されるであろう。本明細書に記載される発明の実施形態に対して様々な代替手段が本発明の実施において用いられることが理解されるべきである。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
ヒトインターロイキン－１０（ｈＩＬ－１０）をコードする外因性核酸、およびヒトプロインスリン（ｈＰＩＮＳ）をコードする外因性核酸を含み、ｈＩＬ－１０をコードする前記外因性核酸およびｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、染色体に組み込まれている、乳酸菌（ＬＡＢ）。
［２］
ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である、請求項１に記載のＬＡＢ。［３］
前記ｈＩＬ－１０が、シグナルペプチドを含まない成熟ｈＩＬ－１０として分泌された時に、２位においてプロリン（Ｐｒｏ）の代わりにアラニン（Ａｌａ）を含む、請求項１に記載のＬＡＢ。
［４］
前記ｈＩＬ－１０が、配列番号１に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有し、または、ＩＬ－１０をコードする前記外因性核酸が、配列番号２に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のＬＡＢ。
［５］
ｈＩＬ－１０をコードする前記外因性核酸が、ｈＩＬ－１０に連結された分泌配列をさらにコードし、前記分泌配列が、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質（Ｕｓｐ４５）（ＳＳｕｓｐ４５）である、請求項４に記載のＬＡＢ。
［６］
ｈＩＬ－１０をコードする前記外因性核酸が、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）のｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）などのｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）の３’に位置する、請求項４に記載のＬＡＢ。
［７］
ｈＩＬ－１０に連結されたＳＳｕｓｐ４５を転写するｈｌｌＡプロモーターを含む発現カセットを含み、前記発現カセットが、ｔｈｙＡ遺伝子座において染色体に組み込まれている、請求項４に記載のＬＡＢ。
［８］
前記ｈＰＩＮＳが、配列番号３に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有し、または、ｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、配列番号４に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のＬＡＢ。
［９］
ｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、ｈＰＩＮＳに連結された分泌配列をさらにコードし、前記分泌配列が、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質（Ｕｓｐ４５）（ＳＳｕｓｐ４５）である、請求項８に記載のＬＡＢ。
［１０］
ｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、ｇａｐＢ遺伝子の５’に位置するｇａｐＢプロモーター、ｈＰＩＮＳ分泌配列、およびｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットを含む、請求項８に記載のＬＡＢ。
［１１］
前記ｇａｐＢ遺伝子と前記ＰＩＮＳ分泌配列との間の、ｒｐｍＤなどの、遺伝子間領域をさらに含む、請求項１０に記載のＬＡＢ。
［１２］
前記ＳＳｕｓｐ４５が、配列番号１１または配列番号１２のヌクレオチド配列を有する、請求項５または９に記載のＬＡＢ。
［１３］
前記ｈＩＬ－１０および前記ｈＰＩＮＳを構成的に発現しかつ分泌する、請求項１に記載のＬＡＢ。
［１４］
大腸菌（Escherichia coli）ＯｔｓＢなどの、トレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＬＡＢ。
［１５］
トレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする前記外因性核酸が、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５）の３’において染色体に組み込まれている、請求項１４に記載のＬＡＢ。
［１６］
ｕｓｐ４５プロモーター、前記ｕｓｐ４５、およびトレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸、および任意選択で、前記ｕｓｐ４５とトレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする前記外因性核酸との間の、ｒｐｍＤなどの、遺伝子間領域を含む第２のポリシストロン性発現カセットをさらに含む、請求項１４に記載のＬＡＢ。
［１７］
ｌｌｍｇ＿０４５３またはｌｌｍｇ＿０４５４などの、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のＬＡＢ。
［１８］
ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）によって転写調節される、前記ＰｈｌｌＡの３’に位置する２つのトレハローストランスポーターを含み、前記トレハローストランスポーターをコードする前記遺伝子が、ｒｐｍＤなどの、遺伝子間領域によって隔てられている、請求項１７に記載のＬＡＢ。
［１９］
さらに、トレハロース－６－リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ）が、前記ＬＡＢにおいて破壊または不活性化されている、請求項１に記載のＬＡＢ。
［２０］
セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント遺伝子（ｐｔｃＣ）が、前記ＬＡＢにおいて破壊または不活性化されている、請求項１に記載のＬＡＢ。
［２１］
染色体に挿入された、
ａ．ｈＩＬ－１０に連結されたＳＳｕｓｐ４５を転写するｈｌｌＡプロモーターを含み、ｔｈｙＡ遺伝子座において染色体に組み込まれている発現カセット、
ｂ．ｇａｐＢ遺伝子の５’に位置するｇａｐＢプロモーター、ｈＰＩＮＳ分泌配列、およびｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセット、ｃ．大腸菌（Escherichia coli）ｏｔｓＢ、
ｄ．ｕｓｐ４５プロモーター、ｕｓｐ４５、およびトレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸、および任意選択で、前記ｕｓｐ４５とトレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする前記外因性核酸との間の、ｒｐｍＤなどの、遺伝子間領域を含む第２のポリシストロン性発現カセット、
ｅ．ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）の３’に位置する、トレハローストランスポーターｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４を含む第３のポリシストロン性発現カセット、
ｆ．ｔｒｅＰＰの不活性化、および
ｇ．ｐｔｃＣの不活性化
を有するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である、請求項１に記載のＬＡＢ。
［２２］
先行請求項のいずれか１項に記載のＬＡＢを含む組成物。
［２３］
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療における、請求項１から２１に記載のＬＡＢ、または、請求項２２に記載の組成物の使用。
［２４］
Ｔ１Ｄの治療用の医薬を調製するための、請求項１から２１に記載のＬＡＢ、または、請求項２２に記載の組成物の使用。
［２５］
それを必要とする対象においてＴ１Ｄを治療する方法であって、治療有効量の先行請求項のいずれか１項に記載のＬＡＢ、および、オテリキシズマブなどの、ＣＤ３に対する抗体を前記対象に投与することを含む方法。
［２６］
前記ＬＡＢを前記投与することおよび前記抗ＣＤ３抗体を前記投与することが、
ａ．抗ＣＤ３抗体単独で治療された対応する対象と比べた時に、または前記ＬＡＢおよび前記抗ＣＤ３抗体を投与されていない対応する対象と比べた時に、正常血中グルコースレベルを維持するために前記対象が必要とするインスリンの量を低減させ、
ｂ．Ｃペプチドレベルによる測定で、少なくとも約２カ月にわたって前記対象において初期ベータ細胞機能を保存し、
ｃ．少なくとも約２カ月にわたって前記対象において正常血糖を維持し、
ｄ．少なくとも約２カ月にわたって前記対象において正常ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）レベルを維持し、または
ｅ．任意のこれらの組合せである、
請求項２５に記載の方法。

Claims (26)

  1. ヒトインターロイキン－１０（ｈＩＬ－１０）をコードする外因性核酸、およびヒトプ
    ロインスリン（ｈＰＩＮＳ）をコードする外因性核酸を含み、ｈＩＬ－１０をコードする
    前記外因性核酸およびｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、染色体に組み込まれて
    いる、乳酸菌（ＬＡＢ）。
  2. ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である、請求項１に記載のＬＡＢ。
  3. 前記ｈＩＬ－１０が、シグナルペプチドを含まない成熟ｈＩＬ－１０として分泌された
    時に、２位においてプロリン（Ｐｒｏ）の代わりにアラニン（Ａｌａ）を含む、請求項１
    に記載のＬＡＢ。
  4. 前記ｈＩＬ－１０が、配列番号１に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有し
    、または、ＩＬ－１０をコードする前記外因性核酸が、配列番号２に対して少なくとも９
    ５％同一のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のＬＡＢ。
  5. ｈＩＬ－１０をコードする前記外因性核酸が、ｈＩＬ－１０に連結された分泌配列をさ
    らにコードし、前記分泌配列が、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質（Ｕｓｐ４５）（ＳＳ
    ｕｓｐ４５）である、請求項４に記載のＬＡＢ。
  6. ｈＩＬ－１０をコードする前記外因性核酸が、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcu
    s lactis）のｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）などのｈｌｌＡプロモーター（Ｐｈｌ
    ｌＡ）の３’に位置する、請求項４に記載のＬＡＢ。
  7. ｈＩＬ－１０に連結されたＳＳｕｓｐ４５を転写するｈｌｌＡプロモーターを含む発現
    カセットを含み、前記発現カセットが、ｔｈｙＡ遺伝子座において染色体に組み込まれて
    いる、請求項４に記載のＬＡＢ。
  8. 前記ｈＰＩＮＳが、配列番号３に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有し、
    または、ｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、配列番号４に対して少なくとも９５
    ％同一のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のＬＡＢ。
  9. ｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、ｈＰＩＮＳに連結された分泌配列をさらに
    コードし、前記分泌配列が、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質（Ｕｓｐ４５）（ＳＳｕｓ
    ｐ４５）である、請求項８に記載のＬＡＢ。
  10. ｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸が、ｇａｐＢ遺伝子の５’に位置するｇａｐＢ
    プロモーター、ｈＰＩＮＳ分泌配列、およびｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸を含
    む第１のポリシストロン性発現カセットを含む、請求項８に記載のＬＡＢ。
  11. 前記ｇａｐＢ遺伝子と前記ＰＩＮＳ分泌配列との間の、ｒｐｍＤなどの、遺伝子間領域
    をさらに含む、請求項１０に記載のＬＡＢ。
  12. 前記ＳＳｕｓｐ４５が、配列番号１１または配列番号１２のヌクレオチド配列を有する
    、請求項５または９に記載のＬＡＢ。
  13. 前記ｈＩＬ－１０および前記ｈＰＩＮＳを構成的に発現しかつ分泌する、請求項１に記
    載のＬＡＢ。
  14. 大腸菌（Escherichia coli）ＯｔｓＢなどの、トレハロース－６－リン酸ホスファター
    ゼをコードする外因性核酸をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＬＡＢ。
  15. トレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする前記外因性核酸が、未同定分泌
    ４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５）の３’において染色体に組み込まれている、
    請求項１４に記載のＬＡＢ。
  16. ｕｓｐ４５プロモーター、前記ｕｓｐ４５、およびトレハロース－６－リン酸ホスファ
    ターゼをコードする外因性核酸、および任意選択で、前記ｕｓｐ４５とトレハロース－６
    －リン酸ホスファターゼをコードする前記外因性核酸との間の、ｒｐｍＤなどの、遺伝子
    間領域を含む第２のポリシストロン性発現カセットをさらに含む、請求項１４に記載のＬ
    ＡＢ。
  17. ｌｌｍｇ＿０４５３またはｌｌｍｇ＿０４５４などの、１つまたは複数のトレハロース
    トランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の
    ＬＡＢ。
  18. ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）によって転写調節される、前記ＰｈｌｌＡの３’
    に位置する２つのトレハローストランスポーターを含み、前記トレハローストランスポー
    ターをコードする前記遺伝子が、ｒｐｍＤなどの、遺伝子間領域によって隔てられている
    、請求項１７に記載のＬＡＢ。
  19. さらに、トレハロース－６－リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ）が、前記ＬＡ
    Ｂにおいて破壊または不活性化されている、請求項１に記載のＬＡＢ。
  20. セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント遺伝子（ｐｔｃＣ）が、前記ＬＡＢ
    において破壊または不活性化されている、請求項１に記載のＬＡＢ。
  21. 染色体に挿入された、
    ａ．ｈＩＬ－１０に連結されたＳＳｕｓｐ４５を転写するｈｌｌＡプロモーターを含み、
    ｔｈｙＡ遺伝子座において染色体に組み込まれている発現カセット、
    ｂ．ｇａｐＢ遺伝子の５’に位置するｇａｐＢプロモーター、ｈＰＩＮＳ分泌配列、およ
    びｈＰＩＮＳをコードする前記外因性核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセット、
    ｃ．大腸菌（Escherichia coli）ｏｔｓＢ、
    ｄ．ｕｓｐ４５プロモーター、ｕｓｐ４５、およびトレハロース－６－リン酸ホスファタ
    ーゼをコードする外因性核酸、および任意選択で、前記ｕｓｐ４５とトレハロース－６－
    リン酸ホスファターゼをコードする前記外因性核酸との間の、ｒｐｍＤなどの、遺伝子間
    領域を含む第２のポリシストロン性発現カセット、
    ｅ．ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）の３’に位置する、トレハローストランスポー
    ターｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４を含む第３のポリシストロン性発現カ
    セット、
    ｆ．ｔｒｅＰＰの不活性化、および
    ｇ．ｐｔｃＣの不活性化
    を有するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である、請求項１に記載のＬ
    ＡＢ。
  22. 先行請求項のいずれか１項に記載のＬＡＢを含む組成物。
  23. １型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療における、請求項１から２１に記載のＬＡＢ、または、請
    求項２２に記載の組成物の使用。
  24. Ｔ１Ｄの治療用の医薬を調製するための、請求項１から２１に記載のＬＡＢ、または、
    請求項２２に記載の組成物の使用。
  25. それを必要とする対象においてＴ１Ｄを治療する方法であって、治療有効量の先行請求
    項のいずれか１項に記載のＬＡＢ、および、オテリキシズマブなどの、ＣＤ３に対する抗
    体を前記対象に投与することを含む方法。
  26. 前記ＬＡＢを前記投与することおよび前記抗ＣＤ３抗体を前記投与することが、
    ａ．抗ＣＤ３抗体単独で治療された対応する対象と比べた時に、または前記ＬＡＢおよび
    前記抗ＣＤ３抗体を投与されていない対応する対象と比べた時に、正常血中グルコースレ
    ベルを維持するために前記対象が必要とするインスリンの量を低減させ、
    ｂ．Ｃペプチドレベルによる測定で、少なくとも約２カ月にわたって前記対象において初
    期ベータ細胞機能を保存し、
    ｃ．少なくとも約２カ月にわたって前記対象において正常血糖を維持し、
    ｄ．少なくとも約２カ月にわたって前記対象において正常ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１
    ｃ）レベルを維持し、または
    ｅ．任意のこれらの組合せである、
    請求項２５に記載の方法。
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