JP2022049902A - キシロース誘導性プロモーター及びその使用 - Google Patents
キシロース誘導性プロモーター及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022049902A JP2022049902A JP2020156191A JP2020156191A JP2022049902A JP 2022049902 A JP2022049902 A JP 2022049902A JP 2020156191 A JP2020156191 A JP 2020156191A JP 2020156191 A JP2020156191 A JP 2020156191A JP 2022049902 A JP2022049902 A JP 2022049902A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- xylose
- base sequence
- mutant
- inducible promoter
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 33
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 32
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 22
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 9
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 claims description 5
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 2
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 abstract description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 17
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 6
- 241000002270 Pinguicula antarctica Species 0.000 abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 16
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 229920009537 polybutylene succinate adipate Polymers 0.000 description 8
- 239000004630 polybutylene succinate adipate Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 4
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 2
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- -1 polybutylene succinate adipate Polymers 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 2
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 1
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000519593 Pseudoalteromonas antarctica Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241001360088 Zymoseptoria tritici Species 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000004688 heptahydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】本発明は、Ｐ．アンタクティカ由来のキシロース誘導性プロモーター（キシラナーゼプロモーター）の塩基配列を改変することで、下流の遺伝子の転写を促進する能力が向上したキシロース誘導性プロモーターを提供することを目的としている。【解決手段】Ｐ．アンタクティカ由来のキシラナーゼプロモーター中の特定の配列を削除したキシロース誘導性プロモーターを使用することにより、下流の遺伝子の発現効率を向上することができる。【選択図】なし
Description
本発明は、キシロース誘導性プロモーター及びその使用に関し、より具体的には、変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーター、それを含むベクター、核酸分子、及び微生物、並びに、それらを使用して目的のタンパク質を生産する方法に関する。
微生物はタンパク質を生産するために使用されている。一般的には、遺伝子の発現を促すプロモーター配列の下流に目的のタンパク質をコードする遺伝子を連結して作製した組換え遺伝子を、微生物に導入して培養することにより、当該目的のタンパク質を取得する。ここで、タンパク質の種類によって、その大量生産に適した宿主株が異なることが分かっているため、様々な宿主株を取り揃えておくことにより、多様なタンパク質の大量生産が可能となる。
これまでに実用化されている微生物を宿主に用いたタンパク質発現系には、原核微生物を用いる系と、真核微生物を用いる系があり、前者においては、大腸菌、ブレビバチルス、及びコリネバクテリウムなど、多様な原核微生物が使用されている。一方、後者においては、酵母及び糸状菌などの子嚢菌やシュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）などの担子菌（特許文献１及び２並びに非特許文献１）を目的のタンパク質の生産のために使用することは知られているものの、その種類は限られており、特にＰ．アンタクティカなどの担子菌のプロモーター配列を改変して、その遺伝子発現能力を向上させる研究は進んでいない。
Sameshima-Yamashita Y, et al. (2019), Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 83:8, 1547-1556
Ｐ．アンタクティカ由来のキシロース誘導性プロモーター（キシラナーゼプロモーター）は、生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥなどのタンパク質を、Ｐ．アンタクティカによって生産するために使用されている。本発明は、当該キシラナーゼプロモーターの塩基配列を改変することで、下流の遺伝子の転写を促進する能力が向上したキシロース誘導性プロモーターを提供することを目的としている。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｐ．アンタクティカ由来のキシラナーゼプロモーター中の特定の配列を削除すると、下流の遺伝子の発現効率が向上することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下に示すキシロース誘導性プロモーター、それを含むベクター、核酸分子、及び微生物、並びに、それらを使用して目的のタンパク質を生産する方法を提供するものである。
〔１〕配列番号１に示される塩基配列の変異塩基配列を含む、キシロース誘導性プロモーターであって、前記変異塩基配列が、以下の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域に少なくとも１種の変異を有しており、かつ配列番号１に示される塩基配列と比較して転写抑制作用が抑制されている、キシロース誘導性プロモーター。
〔２〕前記変異塩基配列が、配列番号１の（ａ）～（ｅ）の２つ以上の領域に変異を有している、前記〔１〕に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔３〕前記変異塩基配列が、配列番号１の（ａ）～（ｅ）以外の領域に追加の変異を有している、前記〔１〕又は〔２〕に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔４〕前記変異塩基配列において、配列番号１の１番目～７１３番目の領域のすべて又は一部が欠失している、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔５〕前記変異が、配列番号１の
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、
（ｄ’）１０６１番目～１１１３番目、
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目、及び
（ｅ’）１２２４番目～１３０３番目
の少なくとも１つの領域のすべて又は一部の欠失である、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔６〕前記（ａ）～（ｅ’）の５’側又は３’側に連なる塩基配列も欠失している、前記〔５〕に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔７〕前記変異が、配列番号１の
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域のすべて又は一部の置換である、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔８〕前記〔１〕～〔７〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーターを含む、ベクター又は核酸分子。
〔９〕前記キシロース誘導性プロモーターの下流に、目的のタンパク質をコードする塩基配列をさらに含む、前記〔８〕に記載のベクター又は核酸分子。
〔１０〕前記〔１〕～〔７〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター、又は、前記〔８〕又は〔９〕に記載のベクター又は核酸分子を含む、微生物。
〔１１〕担子菌である、前記〔１０〕に記載の微生物。
〔１２〕目的のタンパク質の生産方法であって、
配列番号１に示される塩基配列の変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターを含み、かつ、前記キシロース誘導性プロモーターの下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む微生物を用意する工程と、
前記微生物を培養して、目的のタンパク質を発現させる工程と
を含み、前記変異塩基配列が、以下の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域に少なくとも１種の変異を有しており、かつ配列番号１に示される塩基配列と比較して転写抑制作用が抑制されている、生産方法。
〔１〕配列番号１に示される塩基配列の変異塩基配列を含む、キシロース誘導性プロモーターであって、前記変異塩基配列が、以下の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域に少なくとも１種の変異を有しており、かつ配列番号１に示される塩基配列と比較して転写抑制作用が抑制されている、キシロース誘導性プロモーター。
〔２〕前記変異塩基配列が、配列番号１の（ａ）～（ｅ）の２つ以上の領域に変異を有している、前記〔１〕に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔３〕前記変異塩基配列が、配列番号１の（ａ）～（ｅ）以外の領域に追加の変異を有している、前記〔１〕又は〔２〕に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔４〕前記変異塩基配列において、配列番号１の１番目～７１３番目の領域のすべて又は一部が欠失している、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔５〕前記変異が、配列番号１の
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、
（ｄ’）１０６１番目～１１１３番目、
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目、及び
（ｅ’）１２２４番目～１３０３番目
の少なくとも１つの領域のすべて又は一部の欠失である、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔６〕前記（ａ）～（ｅ’）の５’側又は３’側に連なる塩基配列も欠失している、前記〔５〕に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔７〕前記変異が、配列番号１の
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域のすべて又は一部の置換である、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔８〕前記〔１〕～〔７〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーターを含む、ベクター又は核酸分子。
〔９〕前記キシロース誘導性プロモーターの下流に、目的のタンパク質をコードする塩基配列をさらに含む、前記〔８〕に記載のベクター又は核酸分子。
〔１０〕前記〔１〕～〔７〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター、又は、前記〔８〕又は〔９〕に記載のベクター又は核酸分子を含む、微生物。
〔１１〕担子菌である、前記〔１０〕に記載の微生物。
〔１２〕目的のタンパク質の生産方法であって、
配列番号１に示される塩基配列の変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターを含み、かつ、前記キシロース誘導性プロモーターの下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む微生物を用意する工程と、
前記微生物を培養して、目的のタンパク質を発現させる工程と
を含み、前記変異塩基配列が、以下の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域に少なくとも１種の変異を有しており、かつ配列番号１に示される塩基配列と比較して転写抑制作用が抑制されている、生産方法。
本発明に従えば、Ｐ．アンタクティカ由来のキシラナーゼプロモーター中の特定の配列を削除したキシロース誘導性プロモーターを使用することにより、下流の遺伝子の発現効率を向上することができる。したがって、本発明のキシロース誘導性プロモーターが機能する微生物を、目的のタンパク質の大量生産に有用な宿主株の１つとして用いることが可能となる。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本明細書に記載の「シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐ．アンタクティカ）」とは、イネやムギなどのイネ科植物の葉面に生息し得るシュードザイマ属菌（酵母）の一種であり、生分解性プラスチック分解酵素などを産生し得るものである。Ｐ．アンタクティカに由来するキシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１は、配列番号１で示される以下の配列を有している。
本明細書に記載の「シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐ．アンタクティカ）」とは、イネやムギなどのイネ科植物の葉面に生息し得るシュードザイマ属菌（酵母）の一種であり、生分解性プラスチック分解酵素などを産生し得るものである。Ｐ．アンタクティカに由来するキシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１は、配列番号１で示される以下の配列を有している。
本発明のキシロース誘導性プロモーターは、配列番号１に示される塩基配列の変異塩基配列を含んでおり、当該変異塩基配列は、配列番号１の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域に少なくとも１種の変異を有しており、かつ配列番号１に示される塩基配列と比較して転写抑制作用が抑制されている。本明細書に記載の「変異」とは、配列番号１に示される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加されていることをいう。特定の理論に拘束されるものではないが、配列番号１の（ａ）～（ｅ）の領域には転写抑制因子が結合すると考えられ、当該領域内の１又は複数個の塩基が欠失若しくは置換されるか、又は、当該領域内に１又は複数個の塩基が付加されることより、当該転写抑制因子の結合が妨げられて、結果として下流の遺伝子の転写及び発現が亢進すると考えられる。
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域に少なくとも１種の変異を有しており、かつ配列番号１に示される塩基配列と比較して転写抑制作用が抑制されている。本明細書に記載の「変異」とは、配列番号１に示される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加されていることをいう。特定の理論に拘束されるものではないが、配列番号１の（ａ）～（ｅ）の領域には転写抑制因子が結合すると考えられ、当該領域内の１又は複数個の塩基が欠失若しくは置換されるか、又は、当該領域内に１又は複数個の塩基が付加されることより、当該転写抑制因子の結合が妨げられて、結果として下流の遺伝子の転写及び発現が亢進すると考えられる。
ある態様では、前記変異塩基配列は、配列番号１の（ａ）～（ｅ）の２つ以上の領域に変異を有している。すなわち、本発明のキシロース誘導性プロモーターは、多重変異型のプロモーターであってもよく、転写抑制作用を有する領域が複数箇所で障害されることで、下流の遺伝子の転写及び発現が一層亢進し得る。
ある態様では、前記変異塩基配列は、配列番号１の（ａ）～（ｅ）以外の領域に追加の変異を有している。前記追加の変異の種類は、特に制限されないが、例えば、本発明のキシロース誘導性プロモーターのプロモーター活性に影響を与えない塩基配列の削除、置換、又は付加であってもいいし、当該プロモーター活性をさらに高めるような変異であってもよい。具体的には、前記変異塩基配列において、配列番号１の１番目～７１３番目の領域、１番目～５１３番目の領域、又は１番目～２１３番目の領域のすべて又は一部が欠失していてもよい。前記追加の変異を有する変異塩基配列は、配列番号１の７１４番目～１５１３番目の領域において、前記追加の変異を有さない変異塩基配列と約８０％以上、約８５％以上、又は約９０％以上の配列同一性を有し、かつキシロース誘導性プロモーター活性を示す。
ある態様では、前記変異は、配列番号１の
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、
（ｄ’）１０６１番目～１１１３番目、
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目、及び
（ｅ’）１２２４番目～１３０３番目
の少なくとも１つの領域のすべて又は一部の欠失である。さらなる態様では、前記変異塩基配列においては、前記（ａ）～（ｅ’）の５’側又は３’側に連なる塩基配列も連続して欠失されていてもよく、例えば、前記領域のすべて又は一部を含む全体で約１００塩基以内又は約８０塩基以内の領域が欠失されていてもよい。より具体的には、前記変異は、配列番号１の
（ａ）８２２番目～８２７番目、並びに、その３’末端側４５塩基以内若しくは３５塩基以内及び／又はその５’末端側４５塩基以内若しくは３５塩基以内の塩基配列、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、並びに、その３’末端側２０塩基以内若しくは１０塩基以内及び／又はその５’末端側２０塩基以内若しくは１０塩基以内の塩基配列、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、並びに、その３’末端側２５塩基以内若しくは１５塩基以内及び／又はその５’末端側２５塩基以内若しくは１５塩基以内の塩基配列、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、並びに、その３’末端側４５塩基以内若しくは３５塩基以内及び／又はその５’末端側４５塩基以内若しくは３５塩基以内の塩基配列、
（ｄ’）１０６１番目～１１１３番目、並びに、その３’末端側２５塩基以内若しくは１５塩基以内及び／又はその５’末端側２５塩基以内若しくは１５塩基以内の塩基配列、
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目、並びに、その３’末端側４５塩基以内若しくは３５塩基以内及び／又はその５’末端側４５塩基以内若しくは３５塩基以内の塩基配列、及び／又は、
（ｅ’）１２２４番目～１３０３番目、並びに、その３’末端側１０塩基以内及び／又はその５’末端側１０塩基以内の塩基配列
の欠失であってもよい。好ましくは、前記変異は、前記（ａ）、（ｄ）、（ｄ’）、（ｅ）、及び／又は（ｅ’）の領域全体の欠失であり、特に好ましくは、前記（ｄ）又は（ｄ’）の領域全体と、（ｅ）又は（ｅ’）の領域全体との欠失である。
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、
（ｄ’）１０６１番目～１１１３番目、
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目、及び
（ｅ’）１２２４番目～１３０３番目
の少なくとも１つの領域のすべて又は一部の欠失である。さらなる態様では、前記変異塩基配列においては、前記（ａ）～（ｅ’）の５’側又は３’側に連なる塩基配列も連続して欠失されていてもよく、例えば、前記領域のすべて又は一部を含む全体で約１００塩基以内又は約８０塩基以内の領域が欠失されていてもよい。より具体的には、前記変異は、配列番号１の
（ａ）８２２番目～８２７番目、並びに、その３’末端側４５塩基以内若しくは３５塩基以内及び／又はその５’末端側４５塩基以内若しくは３５塩基以内の塩基配列、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、並びに、その３’末端側２０塩基以内若しくは１０塩基以内及び／又はその５’末端側２０塩基以内若しくは１０塩基以内の塩基配列、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、並びに、その３’末端側２５塩基以内若しくは１５塩基以内及び／又はその５’末端側２５塩基以内若しくは１５塩基以内の塩基配列、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、並びに、その３’末端側４５塩基以内若しくは３５塩基以内及び／又はその５’末端側４５塩基以内若しくは３５塩基以内の塩基配列、
（ｄ’）１０６１番目～１１１３番目、並びに、その３’末端側２５塩基以内若しくは１５塩基以内及び／又はその５’末端側２５塩基以内若しくは１５塩基以内の塩基配列、
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目、並びに、その３’末端側４５塩基以内若しくは３５塩基以内及び／又はその５’末端側４５塩基以内若しくは３５塩基以内の塩基配列、及び／又は、
（ｅ’）１２２４番目～１３０３番目、並びに、その３’末端側１０塩基以内及び／又はその５’末端側１０塩基以内の塩基配列
の欠失であってもよい。好ましくは、前記変異は、前記（ａ）、（ｄ）、（ｄ’）、（ｅ）、及び／又は（ｅ’）の領域全体の欠失であり、特に好ましくは、前記（ｄ）又は（ｄ’）の領域全体と、（ｅ）又は（ｅ’）の領域全体との欠失である。
ある態様では、前記変異は、配列番号１の
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域のすべて又は一部の置換である。置換後の塩基配列は、キシロース誘導性プロモーター活性が向上する限り特に制限されないが、例えば、「５’－ＳＹＧＧＲＧ－３’」（「Ｓ」はＣ又はＧ、「Ｙ」はＣ又はＴ、「Ｒ」はＡ又はＧを表す。）の条件を満たさない配列が好ましい。
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域のすべて又は一部の置換である。置換後の塩基配列は、キシロース誘導性プロモーター活性が向上する限り特に制限されないが、例えば、「５’－ＳＹＧＧＲＧ－３’」（「Ｓ」はＣ又はＧ、「Ｙ」はＣ又はＴ、「Ｒ」はＡ又はＧを表す。）の条件を満たさない配列が好ましい。
別の態様では、本発明は、前記変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターを含む、ベクター又は核酸分子にも関している。前記ベクター又は核酸分子は、前記キシロース誘導性プロモーターの下流に、目的のタンパク質をコードする塩基配列をさらに含んでいてもよい。
また別の態様では、本発明は、前記変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーター、又は、当該キシロース誘導性プロモーターを含むベクター又は核酸分子を含む、微生物にも関している。前記微生物は、前記キシロース誘導性プロモーターがプロモーターとして機能する限り特に制限されないが、例えば、担子菌であってもよく、好ましくはＰ．アンタクティカ、Ｐ．アフィディス、Ｐ．ルグローサ、Ｐ．パラアンタクティカ、Ｐ．グラミニコラ、Ｐ．ツクバエンシス、Ｐ．フロキュロッサ、Ｐ．ヒューピエンシス、及びＰ．シャンシエンシスなどのシュードザイマ属の菌である。なお、最近の分類変更により、Ｐ．アンタクティカは、モエスジオマイセス・アンタクティクス（Ｍｏｅｓｚｉｏｍｙｃｅｓ ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）と呼ばれることもある。
また別の態様では、本発明は、目的のタンパク質の生産方法にも関しており、当該生産方法は、
前記変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターを含み、かつ、前記キシロース誘導性プロモーターの下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む微生物を用意する工程と、
前記微生物を培養して、目的のタンパク質を発現させる工程と
を含んでいる。前記目的のタンパク質は、特に制限されず、例えば、前記微生物自体に由来するタンパク質であってもいいし、異種タンパク質であってもよい。前記キシロース誘導性プロモーターの活性により前記目的のタンパク質の発現効率が向上するため、本発明の方法は、当該目的のタンパク質の大量生産に有用である。
前記変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターを含み、かつ、前記キシロース誘導性プロモーターの下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む微生物を用意する工程と、
前記微生物を培養して、目的のタンパク質を発現させる工程と
を含んでいる。前記目的のタンパク質は、特に制限されず、例えば、前記微生物自体に由来するタンパク質であってもいいし、異種タンパク質であってもよい。前記キシロース誘導性プロモーターの活性により前記目的のタンパク質の発現効率が向上するため、本発明の方法は、当該目的のタンパク質の大量生産に有用である。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
１．内部配列に変異を有するキシロース誘導性プロモーター
（１）内部配列に欠失変異を有するプロモーター及びレポーターカセット導入株の作製
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のゲノムＤＮＡから取得した野生型キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１の配列をｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ ＴＡベクターへサブクローニングした。これを鋳型とし、以下の表１に示す各プライマーセットを用いてインバースＰＣＲを行い、増幅された各断片を再環化することで、Ｐｘｙｎ１内の内部配列を削除した変異型プロモーターを含むサブクローニングプラスミドを複数種類作製した。
（１）内部配列に欠失変異を有するプロモーター及びレポーターカセット導入株の作製
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のゲノムＤＮＡから取得した野生型キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１の配列をｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ ＴＡベクターへサブクローニングした。これを鋳型とし、以下の表１に示す各プライマーセットを用いてインバースＰＣＲを行い、増幅された各断片を再環化することで、Ｐｘｙｎ１内の内部配列を削除した変異型プロモーターを含むサブクローニングプラスミドを複数種類作製した。
プライマーセット１～６による変異型プロモーター（変異型Ｐ１～Ｐ６）を含むサブクローニングプラスミドから制限酵素で変異型プロモーターを含む核酸断片を切り出し、レポーター遺伝子としてＰ．アンタクティカのＰａＥ遺伝子、その上流配列及び下流配列、遺伝子導入の選抜マーカーとしてＰ．アンタクティカのＵＲＡ３遺伝子（ウラシル合成遺伝子）、並びに、キシラナーゼターミネーターを組み合わせて、レポーターカセットを作製した。具体的には、以下の順序で核酸断片を接続した。
＊レポーターカセットの構造
５’－［ＰａＥ遺伝子上流配列］－［ＵＲＡ３（マーカー）］－［変異型プロモーター］－［ＰａＥ］－［キシラナーゼターミネーター］－［ＰａＥ遺伝子下流配列］－３’
＊レポーターカセットの構造
５’－［ＰａＥ遺伝子上流配列］－［ＵＲＡ３（マーカー）］－［変異型プロモーター］－［ＰａＥ］－［キシラナーゼターミネーター］－［ＰａＥ遺伝子下流配列］－３’
このレポーターカセットを、ウラシル要求性相補を指標として、ＰａＥを産生しないＰ．アンタクティカのウラシル要求性変異株（ＰＧＢ０５０株；要すれば特開２０１８－１５７８１４号公報を参照）の染色体上のＰａＥ遺伝子相当部位に、常法により１コピーだけ導入した。コントロールとして、変異型プロモーターに代えて野生型キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１を含むレポーターカセットを導入した細胞株及びＰａＥ遺伝子を含まないレポーターカセットを導入したＰａＥ非産生株を作出した。
（２）プロモーター活性の評価
上記（１）で作製したレポーターカセット導入株又はＰａＥ遺伝子を含まないレポーターカセットを導入したＰａＥ非産生株を、ＹＭ液体培地（グルコース２％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、及び麦芽エキス０．３％を含む）を用いて３０℃で２４時間振盪培養し、種母培養液を作製した。この種母培養液を、９６穴２ｍＬ容ディープウェルプレートに分注した８００μＬの３ｘＦＭＭＸ液体培地（酵母エキス０．３％、硝酸ナトリウム０．２％、リン酸二水素カリウム０．０６％、硫酸マグネシウム七水和物０．０６％、及びキシロース８％を含む）中に植菌し、ディープウェルプレートミキサー（タイテック株式会社製）を用いて３０℃、１５００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。そして、培養液を遠心分離して、菌体及び培養上清を取得した。
上記（１）で作製したレポーターカセット導入株又はＰａＥ遺伝子を含まないレポーターカセットを導入したＰａＥ非産生株を、ＹＭ液体培地（グルコース２％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、及び麦芽エキス０．３％を含む）を用いて３０℃で２４時間振盪培養し、種母培養液を作製した。この種母培養液を、９６穴２ｍＬ容ディープウェルプレートに分注した８００μＬの３ｘＦＭＭＸ液体培地（酵母エキス０．３％、硝酸ナトリウム０．２％、リン酸二水素カリウム０．０６％、硫酸マグネシウム七水和物０．０６％、及びキシロース８％を含む）中に植菌し、ディープウェルプレートミキサー（タイテック株式会社製）を用いて３０℃、１５００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。そして、培養液を遠心分離して、菌体及び培養上清を取得した。
培養上清中に分泌されたＰａＥの量を、その生分解性プラスチック分解活性に基づき、マイクロプレートを用いたＰａＥ活性測定法（非特許文献１を参照）を用いて、評価した。具体的には、滅菌水で適宜希釈した培養上清１０μＬを、３％ｗ／ｖに希釈されたポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）のエマルジョン（ＥＭ－３０１、昭和電工株式会社製）７．５μＬ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）７５μＬ、及び滅菌水５７．５μＬと、９６穴マイクロプレート（プロテオセーブ(R)ＳＳ、住友ベークライト株式会社製）中で混合して反応液を調製し、ディープウェルプレートミキサーを用いて３０℃、９００ｒｐｍで１５分間振盪した。そして、当該反応液のＯＤ６６０（濁度）を振盪の前後で測定した。
反応液の濁度は、培養上清中のＰａＥによって減少するので、減少の幅が大きいほど、培養上清中にＰａＥが多く含まれており、すなわち、培養されていた細胞株に導入されているレポーターカセットのプロモーター活性が高いことを意味している。野生型プロモーターを含むレポーターカセットを導入された細胞株の培養上清による濁度の減少幅の平均をプロモーター活性の基準値とし、これを１００％としたときの相対プロモーター活性を、各変異型プロモーターについて計算した。結果を表２に示す。
変異型Ｐ１及びＰ５のプロモーター活性は野生型と変わらなかったが、変異型Ｐ２～Ｐ４及びＰ６のプロモーター活性は野生型よりも高くなった。したがって、配列番号１の９０５番目～９６３番目、１０１４番目～１０６０番目、１０６１番目～１１１３番目、及び１２２４番目～１３０３番目の配列は、キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１において転写抑制作用を担っていること、そして、これらの配列を削除することで転写抑制作用を抑制し、結果として全体のプロモーター活性を向上できることが分かった。
（３）二重変異型プロモーターの作製及び評価
変異型Ｐ４に対してプライマーセット６を使用して上記項目（１）の工程を繰り返し、二重変異型プロモーター（変異型Ｐ４Ｐ６）及びそれを含むレポーターカセット導入株を作製した。そして、このレポーターカセット導入株、及び、変異型Ｐ４又は変異型Ｐ６を含むレポーターカセット導入株を培養し、上記項目（２）と同様にしてそれぞれのプロモーター活性を測定した。結果を表３に示す。
変異型Ｐ４に対してプライマーセット６を使用して上記項目（１）の工程を繰り返し、二重変異型プロモーター（変異型Ｐ４Ｐ６）及びそれを含むレポーターカセット導入株を作製した。そして、このレポーターカセット導入株、及び、変異型Ｐ４又は変異型Ｐ６を含むレポーターカセット導入株を培養し、上記項目（２）と同様にしてそれぞれのプロモーター活性を測定した。結果を表３に示す。
変異型Ｐ４及び変異型Ｐ６のプロモーター活性は野生型よりも高かったが、変異型Ｐ４Ｐ６、すなわち、配列番号１の１０６１番目～１１１３番目及び１２２４番目～１３０３番目の両方の配列を削除したプロモーターは、変異型Ｐ４及び変異型Ｐ６よりもさらに高いプロモーター活性を示した。
（４）内部配列に置換変異を有するプロモーターの作製及び評価
プライマーセットとして次の表４に記載のプライマーセット４ａ、６ａ、及び７を使用して部位特異的突然変異導入法により対象塩基配列を別の塩基配列に置換した以外は、上記項目（１）と同様にして変異型プロモーター（変異型Ｐ４ａ、Ｐ６ａ、及びＰ７）及びそれを含むレポーターカセット導入株を作製した。そして、これらのレポーターカセット導入株を培養し、上記項目（２）と同様にしてそれぞれのプロモーター活性を測定した。結果を表５に示す。
プライマーセットとして次の表４に記載のプライマーセット４ａ、６ａ、及び７を使用して部位特異的突然変異導入法により対象塩基配列を別の塩基配列に置換した以外は、上記項目（１）と同様にして変異型プロモーター（変異型Ｐ４ａ、Ｐ６ａ、及びＰ７）及びそれを含むレポーターカセット導入株を作製した。そして、これらのレポーターカセット導入株を培養し、上記項目（２）と同様にしてそれぞれのプロモーター活性を測定した。結果を表５に示す。
変異型Ｐ４ａ及びＰ６ａにおいて置換された配列番号１の１０６４番目～１０６９番目（５’－ＣＣＣＣＧＣ－３’）及び１２９７番目～１３０２番目（５’－ＣＣＣＣＡＧ－３’）の領域は、それぞれ変異型Ｐ４及びＰ６で削除された配列の一部分であり、変異型Ｐ７において置換された配列番号１の８２２番目～８２７番目（５’－ＧＣＧＧＧＧ－３’）の領域は、変異型Ｐ４ａにおいて置換された配列の相補配列と同じ塩基配列で示される。変異型Ｐ４ａ、Ｐ６ａ、及びＰ７は、配列番号１のわずか６塩基だけを他の塩基配列（５’－ＴＣＴＡＧＡ－３’）に置換したものであるが、そのプロモーター活性は野生型よりも高くなった。そのため、これらの領域は、キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１の活性抑制に大きく関与している可能性がある。
なお、一般に、キシラナーゼプロモーターはグルコース不存在下で下流の遺伝子の転写を促進し、グルコース存在下では下流の遺伝子の転写を促進できないことが知られているプロモーターであるが、配列番号１の１０６４番目～１０６９番目、１２９７番目～１３０２番目、及び配列番号１の８２２番目～８２７番目の領域が、グルコース不存在下においてもなお転写抑制作用を担っていることは知られていなかった。そうすると、これらの領域の塩基配列を変異させることで転写抑制作用を抑制してプロモーター活性を向上できることは、従来技術からは予測することのできないことである。
（５）欠失変異を有するプロモーターと置換変異を有するプロモーターの比較
プライマーセットとして次の表６に記載のプライマーセット４ｂを使用して部位特異的突然変異導入法により対象塩基配列を別の塩基配列に置換した以外は、上記項目（１）と同様にして変異型プロモーター（変異型Ｐ４ｂ）及びそれを含むレポーターカセット導入株を作製した。そして、変異型Ｐ４ａ又はＰ４ｂを含むレポーターカセット導入株を培養し、上記項目（２）と同様にしてそれぞれのプロモーター活性を測定した。結果を表７に示す。
プライマーセットとして次の表６に記載のプライマーセット４ｂを使用して部位特異的突然変異導入法により対象塩基配列を別の塩基配列に置換した以外は、上記項目（１）と同様にして変異型プロモーター（変異型Ｐ４ｂ）及びそれを含むレポーターカセット導入株を作製した。そして、変異型Ｐ４ａ又はＰ４ｂを含むレポーターカセット導入株を培養し、上記項目（２）と同様にしてそれぞれのプロモーター活性を測定した。結果を表７に示す。
変異型Ｐ４ａ及びＰ４ｂは、配列番号１の同じ部分を異なる方法で変異させたものである。前者は置換変異を有しており、後者は欠失変異を有しているが、それらのプロモーター活性はいずれも野生型より高くなった。
２．短縮型キシロース誘導性プロモーター
（１）短縮型プロモーターの作製及び評価
プライマーセットとして次の表８に記載のプライマー８～１２のいずれかと共通プライマーの組合せを使用した以外は、上記項目１の（１）と同様にして変異型プロモーター（変異型Ｐ８～Ｐ１２）及びそれを含むレポーターカセット導入株を作製した。そして、これらのレポーターカセット導入株を培養し、上記項目１の（２）と同様にしてそれぞれのプロモーター活性を測定した。結果を表９に示す。
（１）短縮型プロモーターの作製及び評価
プライマーセットとして次の表８に記載のプライマー８～１２のいずれかと共通プライマーの組合せを使用した以外は、上記項目１の（１）と同様にして変異型プロモーター（変異型Ｐ８～Ｐ１２）及びそれを含むレポーターカセット導入株を作製した。そして、これらのレポーターカセット導入株を培養し、上記項目１の（２）と同様にしてそれぞれのプロモーター活性を測定した。結果を表９に示す。
キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１の上流側配列を削除して作製した短縮型プロモーターは、全長が８００ｂｐ程度までは遺伝子発現に許容可能なプロモーター活性を維持していたが、それより短縮するとプロモーター活性が著しく低下した。このことから、キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１の主要な機能調整領域は下流側８００ｂｐ内に存在しており、上流側７１３ｂｐはプロモーター活性には必須ではないことが示唆された。
（２）短縮型プロモーターの内部配列削除
変異型Ｐ１０に対してプライマーセット４及び６を使用して上記項目１の（１）の工程を順次繰り返し、短縮型二重変異型プロモーター（変異型Ｐ１０＋Ｐ４Ｐ６）及びそれを含むレポーターカセット導入株を作製した。そして、このレポーターカセット導入株、及び、変異型Ｐ１０を含むレポーターカセット導入株を培養し、上記項目１の（２）と同様にしてそれぞれのプロモーター活性を測定した。結果を表１０に示す。
変異型Ｐ１０に対してプライマーセット４及び６を使用して上記項目１の（１）の工程を順次繰り返し、短縮型二重変異型プロモーター（変異型Ｐ１０＋Ｐ４Ｐ６）及びそれを含むレポーターカセット導入株を作製した。そして、このレポーターカセット導入株、及び、変異型Ｐ１０を含むレポーターカセット導入株を培養し、上記項目１の（２）と同様にしてそれぞれのプロモーター活性を測定した。結果を表１０に示す。
上流側の塩基配列が削除された変異型Ｐ１０のプロモーター活性は、野生型よりも低かったが、配列番号１の１０６１番目～１１１３番目及び１２２４番目～１３０３番目に対応する領域を変異型Ｐ１０において削除すると、プロモーター活性が約１．７倍上昇し、野生型と同程度の活性を示すようになった。このように、内部配列の変異によるプロモーター活性の向上は、短縮型プロモーターでも機能する。
３．複数コピーの導入によるタンパク質発現の向上
（１）複数コピー導入株の作製及び評価
次の表１１に示すプライマーセット１３を使用して、上記項目１の（１）で作製した変異型Ｐ４を含むレポーターカセット中のＵＲＡ３（マーカー）からキシラナーゼターミネーターまでの部分を増幅し、ＤｐｎＩによる制限酵素処理及びアガロースゲル抽出によってＰａＥ生産カセットを精製した。
＊ＰａＥ生産カセットの構造
５’－［ＵＲＡ３（マーカー）］－［変異型Ｐ４］－［ＰａＥ］－［キシラナーゼターミネーター］－３’
（１）複数コピー導入株の作製及び評価
次の表１１に示すプライマーセット１３を使用して、上記項目１の（１）で作製した変異型Ｐ４を含むレポーターカセット中のＵＲＡ３（マーカー）からキシラナーゼターミネーターまでの部分を増幅し、ＤｐｎＩによる制限酵素処理及びアガロースゲル抽出によってＰａＥ生産カセットを精製した。
＊ＰａＥ生産カセットの構造
５’－［ＵＲＡ３（マーカー）］－［変異型Ｐ４］－［ＰａＥ］－［キシラナーゼターミネーター］－３’
精製したＰａＥ生産カセットを、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のウラシル要求性変異株であるＰＧＢ３７１株（特許文献２）の染色体上に、常法によってランダムに導入した。得られた形質転換体のうち、ウラシル非要求性となったコロニーを３１３個回収した。これらのコロニーを、ＰＢＳＡを含む平板培地（３ｘＦＭＭ－０．５％ＰＢＳＡエマルジョン・８％キシロース寒天培地；要すれば特許文献２を参照）上に移植して培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）が大きいクローンを選抜した。選抜したクローンについて、さらに２回クリアゾーンを指標とした選抜を繰り返し、２８株のＰａＥ高生産候補株を取得した。
２８株の候補株からＰＢＳＡ分解クリアゾーンの大きさの安定性などを考慮して９株（細胞株ａ～ｉ）を選択し、ＹＭ液体培地２ｍＬに植菌して、３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間振盪培養した。種母培養液２００μＬを、綿栓付き１００ｍＬフラスコに入れた３ｘＦＭＭＸ液体培地２０ｍＬに接種し、３０℃、２００ｒｐｍで振盪培養した。また、上記１（１）で作製した変異型Ｐ４を含むＰａＥ生産カセットを１コピーだけ導入した細胞株（細胞株ｊ）についても、同様に培養した。２４時間、４８時間、及び７２時間培養した時点で各培養液をサンプリングし、遠心分離して培養上清を回収した。そして、常法に従って（非特許文献１を参照）、培養上清中に分泌されたＰａＥの活性を、その生分解性プラスチック分解活性に基づき評価した。具体的には、滅菌水で適宜希釈した培養上清１０μＬを、３％ｗ／ｖに希釈されたポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）のエマルジョン（ＥＭ－３０１、昭和電工株式会社製）３０～６０μＬ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）１ｍＬ、及び滅菌水９３０～９６０μＬを、１３ｍｍ試験管（栄研化学、ＴＢ１３００）中で混合して反応液を調製し、恒温振盪機を用いて３０℃、１５０ｒｐｍで１５分間振盪した。そして、当該反応液のＯＤ６６０（濁度）を振盪の前後で測定した。
図１に示されているように、変異型Ｐ４を含むＰａＥ生産カセットをランダムに導入した細胞株ａ～ｉの培養上清は、細胞株ｊの培養上清と比較して約５～７倍高いＰａＥ活性を示した。また、細胞株ａ～ｉは、従来のＰａＥ高生産株Ｌ１－Ｓ１２株（特許文献２を参照）よりもＰａＥ活性が約５倍高かった。目的のタンパク質生産カセットをランダムに導入すると、複数コピーの生産カセットを含む細胞株が作製されるため、当該タンパク質の高生産株を作製するには有利である。
（２）ジャー培養での評価
上記（１）で取得した細胞株ｈ及び公知のＰａＥ高生産株としてＰＧＢ４７４株（特許文献２）を、常法に従って（非特許文献１を参照）、３Ｌジャーファーメンターで培養した。培養開始後２４時間以降に培養液を適宜サンプリングし、培養上清及び菌体を遠心分離して回収した。そして、上記項目（１）と同様にして、培養上清中のＰａＥ活性を測定した。また、回収した菌体を１０５℃で６時間乾熱処理し、乾燥菌体重量を測定した。
上記（１）で取得した細胞株ｈ及び公知のＰａＥ高生産株としてＰＧＢ４７４株（特許文献２）を、常法に従って（非特許文献１を参照）、３Ｌジャーファーメンターで培養した。培養開始後２４時間以降に培養液を適宜サンプリングし、培養上清及び菌体を遠心分離して回収した。そして、上記項目（１）と同様にして、培養上清中のＰａＥ活性を測定した。また、回収した菌体を１０５℃で６時間乾熱処理し、乾燥菌体重量を測定した。
図２に示されているように、細胞株ｈの乾燥菌体重量（▲）はＰＧＢ４７４株の乾燥菌体重量（△）と同程度であるので、両者の増殖速度に大きな差はないが、細胞株ｈの培養上清中のＰａＥ活性（●）は、ＰＧＢ４７４の培養上清中のＰａＥ活性（○）よりも大きく向上していた。ジャーファーメンター培養は、フラスコ培養よりも工業生産における培養方法に近いので、本発明の変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターは、工業生産における実用性も高いことが示唆された。
４．他のタンパク質の生産及び評価
次の表１２に記載のプライマーセット１４を用いて、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のコドン頻度に応じて塩基配列を最適化したＧＦＰ遺伝子（ＰａＧＦＰ）断片を増幅した。制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＩを使用して、上記項目１の（１）及び（３）で作製した変異型プロモーター（変異型Ｐ４又は変異型Ｐ４Ｐ６）を含むレポーターカセットのＰａＥ遺伝子部分を、増幅したＰａＧＦＰ遺伝子断片で置き換え、ＧＦＰ発現カセットを作製した。そして、このＧＦＰ発現カセットを、前掲のプライマーセット１３を用いて増幅し、制限酵素ＤｐｎＩ処理及びアガロースゲル抽出によって精製した。
＊ＧＦＰ発現カセットの構造
５’－［ＵＲＡ３（マーカー）］－［変異型Ｐ４又は変異型Ｐ４Ｐ６］－［ＧＦＰ］－［キシラナーゼターミネーター］－３’
次の表１２に記載のプライマーセット１４を用いて、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のコドン頻度に応じて塩基配列を最適化したＧＦＰ遺伝子（ＰａＧＦＰ）断片を増幅した。制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＩを使用して、上記項目１の（１）及び（３）で作製した変異型プロモーター（変異型Ｐ４又は変異型Ｐ４Ｐ６）を含むレポーターカセットのＰａＥ遺伝子部分を、増幅したＰａＧＦＰ遺伝子断片で置き換え、ＧＦＰ発現カセットを作製した。そして、このＧＦＰ発現カセットを、前掲のプライマーセット１３を用いて増幅し、制限酵素ＤｐｎＩ処理及びアガロースゲル抽出によって精製した。
＊ＧＦＰ発現カセットの構造
５’－［ＵＲＡ３（マーカー）］－［変異型Ｐ４又は変異型Ｐ４Ｐ６］－［ＧＦＰ］－［キシラナーゼターミネーター］－３’
精製したＧＦＰ発現カセットを、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のウラシル要求性変異株であるＰＧＢ３７１株の染色体上に、常法によってランダムに導入した。得られた形質転換体のうち、ウラシル非要求性となったコロニーを回収した。これらのコロニーを、ＹＭ寒天培地プレート（グルコース２％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、及び寒天２％）上に移植して３０℃で２日間培養し、生育した細胞を滅菌水に懸濁した。この懸濁液を、３ｘＦＭＭＸ寒天培地プレート（酵母エキス０．３％、硝酸ナトリウム０．２％、リン酸二水素カリウム０．０６％、硫酸マグネシウム七水和物０．０６％、キシロース８％、及び寒天２％）及び３ｘＦＭＭＧ寒天培地プレート（酵母エキス０．３％、硝酸ナトリウム０．２％、リン酸二水素カリウム０．０６％、硫酸マグネシウム七水和物０．０６％、グルコース８％、及び寒天２％）に点接種し、３０℃で２日間培養した。コントロールのＧＦＰ非生産株としては、ＰＧＢ３７１株を培養した。培養後の培地プレートを、ＬＥＤトランスイルミネーター（ゲルみえーる、富士フイルム和光純薬株式会社製）にセットし、ＧＦＰを励起して蛍光が発せられる様子を撮影した（励起波長３９５ｎｍ、蛍光波長５０９ｎｍ）。そして、撮影した画像から、画像解析ソフトウェアＷｉｎＲＯＯＦ２０１５およびＩｍａｇｅＪを用いて、ＧＦＰの蛍光強度を、蛍光を発したピクセル数と各ピクセルの輝度の積算値として算出した。コロニー面積で正規化したＧＦＰの蛍光強度を表１３に示す。
変異型キシロース誘導性プロモーター（変異型Ｐ４又は変異型Ｐ４Ｐ６）を含むＧＦＰ発現カセットを含む細胞を、キシロースを含む３ｘＦＭＭＸ寒天培地プレートで培養すると、蛍光が観察された。当該細胞をグルコースを含む３ｘＦＭＭＧ寒天培地プレートで培養しても蛍光は観察されなかった。したがって、本発明の変異型キシロース誘導性プロモーターは、異種タンパク質の生産にも利用可能であることが分かった。
以上より、Ｐ．アンタクティカ由来のキシラナーゼプロモーター中の特定の配列を削除したキシロース誘導性プロモーターを使用することにより、下流の遺伝子の発現効率を向上できることが分かった。したがって、本発明のキシロース誘導性プロモーターが機能する微生物を、目的のタンパク質の大量生産に有用な宿主株の１つとして用いることが可能となる。
Claims (12)
- 配列番号１に示される塩基配列の変異塩基配列を含む、キシロース誘導性プロモーターであって、前記変異塩基配列が、以下の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域に少なくとも１種の変異を有しており、かつ配列番号１に示される塩基配列と比較して転写抑制作用が抑制されている、キシロース誘導性プロモーター。 - 前記変異塩基配列が、配列番号１の（ａ）～（ｅ）の２つ以上の領域に変異を有している、請求項１に記載のキシロース誘導性プロモーター。
- 前記変異塩基配列が、配列番号１の（ａ）～（ｅ）以外の領域に追加の変異を有している、請求項１又は２に記載のキシロース誘導性プロモーター。
- 前記変異塩基配列において、配列番号１の１番目～７１３番目の領域のすべて又は一部が欠失している、請求項１～３のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター。
- 前記変異が、配列番号１の
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、
（ｄ’）１０６１番目～１１１３番目、
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目、及び
（ｅ’）１２２４番目～１３０３番目
の少なくとも１つの領域のすべて又は一部の欠失である、請求項１～４のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター。 - 前記（ａ）～（ｅ’）の５’側又は３’側に連なる塩基配列も欠失している、請求項５に記載のキシロース誘導性プロモーター。
- 前記変異が、配列番号１の
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域のすべて又は一部の置換である、請求項１～４のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター。 - 請求項１～７のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーターを含む、ベクター又は核酸分子。
- 前記キシロース誘導性プロモーターの下流に、目的のタンパク質をコードする塩基配列をさらに含む、請求項８に記載のベクター又は核酸分子。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター、又は、請求項８又は９に記載のベクター又は核酸分子を含む、微生物。
- 担子菌である、請求項１０に記載の微生物。
- 目的のタンパク質の生産方法であって、
配列番号１に示される塩基配列の変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターを含み、かつ、前記キシロース誘導性プロモーターの下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む微生物を用意する工程と、
前記微生物を培養して、目的のタンパク質を発現させる工程と
を含み、前記変異塩基配列が、以下の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）８２２番目～８２７番目、
（ｂ）９０５番目～９６３番目、
（ｃ）１０１４番目～１０６０番目、
（ｄ）１０６４番目～１０６９番目、及び
（ｅ）１２９７番目～１３０２番目
の少なくとも１つの領域に少なくとも１種の変異を有しており、かつ配列番号１に示される塩基配列と比較して転写抑制作用が抑制されている、生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020156191A JP7299623B2 (ja) | 2020-09-17 | 2020-09-17 | キシロース誘導性プロモーター及びその使用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020156191A JP7299623B2 (ja) | 2020-09-17 | 2020-09-17 | キシロース誘導性プロモーター及びその使用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022049902A true JP2022049902A (ja) | 2022-03-30 |
| JP7299623B2 JP7299623B2 (ja) | 2023-06-28 |
Family
ID=80854159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020156191A Active JP7299623B2 (ja) | 2020-09-17 | 2020-09-17 | キシロース誘導性プロモーター及びその使用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7299623B2 (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014109360A1 (ja) * | 2013-01-09 | 2014-07-17 | 独立行政法人農業環境技術研究所 | 高効率な異種タンパク質の製造方法 |
| JP2018157814A (ja) * | 2017-03-21 | 2018-10-11 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 |
-
2020
- 2020-09-17 JP JP2020156191A patent/JP7299623B2/ja active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014109360A1 (ja) * | 2013-01-09 | 2014-07-17 | 独立行政法人農業環境技術研究所 | 高効率な異種タンパク質の製造方法 |
| JP2018157814A (ja) * | 2017-03-21 | 2018-10-11 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| APPLIED GENETICS AND MOLECULAR BIOTECHNOLOGY, vol. 100, JPN6023018734, 23 December 2015 (2015-12-23), pages 3207 - 3217, ISSN: 0005056042 * |
| BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, vol. 83, no. 8, JPN6023018735, 2019, pages 1547 - 1556, ISSN: 0005056043 * |
| 日本農芸化学会2015年度大会講演要旨集 （オンライン）, JPN6023018732, 5 March 2015 (2015-03-05), pages 33 - 11, ISSN: 0005056040 * |
| 日本農芸化学会2019年度大会講演要旨集 （オンライン）, JPN6023018733, 5 March 2019 (2019-03-05), pages 7 - 12, ISSN: 0005056041 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7299623B2 (ja) | 2023-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101218348A (zh) | 具有提高的同源重组效率的丝状真菌突变体 | |
| Wang et al. | Mitochondrial fission is necessary for mitophagy, development and virulence of the insect pathogenic fungus Beauveria bassiana | |
| CN112410234B (zh) | 一种多靶点编辑重组曲霉菌株的可视化筛选方法 | |
| Boratto et al. | Niemeyer virus: a new mimivirus group A isolate harboring a set of duplicated aminoacyl-tRNA synthetase genes | |
| Yang et al. | Sulfonylurea resistance reconstitution as a novel strategy for ILV2-specific integration in Magnaporthe oryzae | |
| CN111041029B (zh) | 一种强启动子及其在产维生素b12菌株中的应用 | |
| Han et al. | Functional analysis of the homoserine O-acetyltransferase gene and its identification as a selectable marker in Gibberella zeae | |
| Liu et al. | Identification of the genes involved in growth characters of medicinal fungus Ophiocordyceps sinensis based on Agrobacterium tumefaciens–mediated transformation | |
| Zhang et al. | Reducing the cell lysis to enhance yield of acid-stable alpha amylase by deletion of multiple peptidoglycan hydrolase-related genes in Bacillus amyloliquefaciens | |
| CN107384813B (zh) | 一种可用于蛋白质生产的黑曲霉菌株及其应用 | |
| JP4211603B2 (ja) | シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）宿主の構築方法および異種タンパク質の製造方法 | |
| JP2022049902A (ja) | キシロース誘導性プロモーター及びその使用 | |
| JP4526638B2 (ja) | タンパク質の高発現システム | |
| Jin et al. | Comparative genomic analysis identified a mutation related to enhanced heterologous protein production in the filamentous fungus Aspergillus oryzae | |
| Wang et al. | Engineering for an HPV 9-valent vaccine candidate using genomic constitutive over-expression and low lipopolysaccharide levels in Escherichia coli cells | |
| Wang et al. | Development of Cordyceps javanica BE01 with enhanced virulence against Hyphantria cunea using polyethylene glycol-mediated protoplast transformation | |
| Timofeev et al. | Efficient transformation of the entomopathogenic fungus Lecanicillium muscarium by electroporation of germinated conidia | |
| CN109293756B (zh) | 一个控制水稻稻瘟菌产孢量与侵染能力的蛋白 | |
| JP2011160686A (ja) | 新規枯草菌変異株 | |
| Hasan et al. | Development of transformation system of Verticillium lecanii (Lecanicillium spp.)(Deuteromycotina: Hyphomycetes) based on nitrate reductase gene of Aspergillus nidulans | |
| KR100947376B1 (ko) | 이스트 ｇａｌ８０ 결핍주를 이용한 재조합 단백질의 생산방법 | |
| JP2009060797A (ja) | 異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法 | |
| Bassett et al. | Identification of a gene involved in the regulation of hyphal growth of Epichloë festucae during symbiosis | |
| WO2023190542A1 (ja) | 担子菌酵母及び担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法 | |
| WO2023176835A1 (ja) | キシロース誘導性プロモーター及びその使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230407 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20230407 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230511 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230609 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7299623 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |