JP2022024329A - メラニン生成抑制剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、ｍｍｐ－２阻害剤及び内用剤 - Google Patents

Abstract

【課題】メラニン生成抑制作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用及びＭＭＰ－２阻害作用に優れた新規な外用剤または内用剤の提供。【解決手段】チョウセンゴヨウの種子の抽出物を、化粧品、医薬部外品、医薬品、食品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、化粧水、クリーム、洗浄剤、浴用剤、軟膏、パップ剤、錠菓、チョコレート、ガム、飲料、散剤、顆粒剤、錠剤、注射用溶液等が挙げられる。外用の場合、上記抽出物の含有量は、固形物に換算して０．０００１重量％以上が好ましく、０．００１～１０重量％がより好ましい。【選択図】なし

Description

本発明は、メラニン生成抑制剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、ＭＭＰ－２阻害剤及び内用剤に関する。

一般に、シミ、ソバカス、日焼け等に見られる皮膚の色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線の刺激により、皮膚内に存在するメラニン色素生成細胞がメラニン色素を過剰に生成し、これが皮膚内に沈着することが原因と考えられている。このような色素沈着を防ぐ方法の一つに、メラニンの過剰な生成を抑制する方法が知られている。従来、色素沈着の治療には、内用や外用において、アスコルビン酸（ビタミンＣ）等が美白剤として用いられてきた（特許文献１）。

また、皮膚は紫外線の他、乾燥、寒冷、熱、薬物等の様々な物理的及び化学的ストレスに日々曝されている。その結果、皮膚の機能低下が引き起こされ、様々な皮膚の老化現象が顕在化する。皮膚の老化現象の一つにシワがある。シワには、表皮性のシワと、真皮性のシワの二種類が存在することが知られている。表皮性のシワは小ジワと呼ばれ、皮膚の乾燥により、表皮角質中の水分量が低下することによって一時的に生じるシワである。一方、真皮性のシワは、太陽光線に含まれる紫外線や加齢によって形成されるシワである。その形成メカニズムとしては、紫外線や加齢による真皮線維芽細胞におけるコラーゲン合成能の低下や、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の増加によるコラーゲンの分解促進が挙げられる。

乾燥に起因する表皮性のシワと真皮性のシワでは、組織学的形態、発症メカニズム、治療方法が異なり、紫外線や加齢により生じる真皮性のシワは、保湿効果を有する化粧品の使用によって改善することは困難である。

これまでに、紫外線によって生じる真皮性のシワを改善することを目的として、加水分解アーモンドを有効成分とする皮膚のシワ形成防止・改善剤（特許文献２）、ジョチョウケイ、テンキシ及びキセンソウの抽出物を有効成分とする紫外線照射に起因するシワの改善剤（特許文献３）が報告されている。

また、真皮には線維芽細胞やコラーゲンが存在し、Ｉ型コラーゲンが全体の８０％を占める。Ｉ型コラーゲンの他には、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩＩ及びＸＩＶ型コラーゲンの存在が知られている。シワやたるみの原因の一つとして、Ｉ型コラーゲンの減少が挙げられる。従って、Ｉ型コラーゲンの産生を促進させることがシワ・たるみの予防・改善に有効であると考えられる。また、Ｉ型コラーゲンの産生促進は皮膚の創傷治癒の改善にも有効である。

また、線維芽細胞はコラーゲン等のタンパク質及びヒアルロン酸等のグリコサミノグリカンを産生して真皮結合組織を形成し、皮膚のハリを保っている。この結合組織が収縮力を失い、更に弾性力を失う結果として、皮膚のシワやたるみが発生すると考えられている。

特にヒアルロン酸は結合組織に広く分布する高分子多糖体として知られており、真皮中でゲル状の形態を呈し、肌の弾力を維持している。従って、ヒアルロン酸の変質や減少が皮膚老化において重要であると考えられている。また、ヒアルロン酸は高分子であるため、それを含有した化粧料を皮膚に直接塗布しても吸収されにくいという問題点があった。そこで、これまで、線維芽細胞を活性化することで、細胞自らのコラーゲンやヒアルロン酸の産生を促進させることができる皮膚外用剤が模索されてきた。オウボウシバナの抽出物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤（特許文献４）や、発芽焙煎ハトムギの抽出物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤（特許文献５）、シロキクラゲ子実体の抽出物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤（特許文献６）が報告されている。

また、ヒアルロン酸は関節にも存在しており、関節の荷重の衝撃を和らげたり、関節の動きを滑らかにしたりする機能を果たしていることが知られている。正常人間関節液中のヒアルロン酸濃度は約２．３ｍｇ／ｍＬであるが、慢性関節リウマチの場合、関節液中のヒアルロン酸濃度は約１．２ｍｇ／ｍＬと低下し、同時に関節液の粘度も著しく低下する（非特許文献１）。また、化膿性関節炎や痛風性関節炎等でも、慢性関節リウマチの場合と同様、ヒアルロン酸含量の低下が起こることが知られている（非特許文献２）。上記疾患において、潤滑機能の改善、関節軟骨の被覆・保護、疼痛抑制及び病的関節液の改善のために、関節液中のヒアルロン酸量を増加させることが考えられる。例えば、慢性関節リウマチの患者にヒアルロン酸ナトリウムの関節注入法を行うと、上記の症状の改善が認められることが知られている（非特許文献３）。しかしながら、上記疾患の治療は長期に渡る。従って、日常生活の中で手軽に予防や治療等ができるように、ヒアルロン酸産生促進剤を含有させた皮膚外用剤や食品、医薬品が望まれている。

飛蚊症とは、視界内に糸くずや蚊のように見える薄い影が現れる症状で、目の内部を満たす硝子体内の混濁が網膜上に影を落とすことで発生する。飛蚊症は大きく２種類に分けることができ、加齢や紫外線、活性酸素等の影響で発症する生理的飛蚊症と網膜剥離、網膜裂孔、硝子体出血、ぶどう膜炎等の疾患の一症状として現れる病的飛蚊症がある。生理的飛蚊症は、硝子体の主要成分であるヒアルロン酸の減少による液状化と、それに伴うコラーゲン線維の崩壊で硝子体内が混濁することで生じる。治療法として、硝子体切除手術やレーザー治療があるが、これらの施術は安全性の観点から日本ではあまり行われていないという実情があり、外国で治療を行うには多額の費用が必要となる。そのため、生理的飛蚊症を予防改善するためには、日常的に利用可能なヒアルロン酸産生促進剤を含有させた食品や医薬品が望まれている。

ＭＭＰに属するゼラチナーゼ（ＭＭＰ－２）は、線維芽細胞や内皮細胞、ガン細胞等が産生する酵素であり、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン（動脈、腱、皮膚等の弾性組織の特殊成分をなす構造タンパク質）等の基質を分解する。従って、ゼラチナーゼに対して阻害活性を有する物質は、ガン組織における血管新生やガンの転移を抑制する効果が期待され、ガン疾患の予防、治療に有用であると考えられる。更にＭＭＰの阻害はガン疾患のみならず、潰瘍形成、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、歯周炎等のＭＭＰの亢進が原因で起こる疾患の予防、治療及び改善に有用である。

チョウセンゴヨウ（学名：Ｐｉｎｕｓ ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ）は、マツ目マツ科マツ属に属する常緑針葉樹である。日本では本州中部、四国の山地に自生する他、朝鮮半島、中国東北部、アムール、ウスリーに自生する。成木は樹高３０ｍ以上、直径１．５ｍに達する。針葉は五葉であり、短枝に５本の針葉が束生する。球果（松かさ）の大きさが、長さ９～１５ｃｍ、直径５～７ｃｍと大きく、球果の一つの鱗片には約１．２ｃｍの２つの種子が入っている。生薬の海松子（かいしょうし）は、この種子を乾燥させたもので、脂肪油が６０～７０％含まれている。種子は食用としても利用されている。これまでチョウセンゴヨウは、その種子油にコレステロール低下作用があること（特許文献７）や、その葉、樹皮、球果の抽出物に育毛作用があること（特許文献８）、その球果、樹皮及び葉の抽出物に血液流動性改善作用があること（特許文献９）が報告されている。しかしながら、チョウセンゴヨウの種子の抽出物が、メラニン生成抑制作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用及びＭＭＰ－２阻害作用を有することは知られていなかった。

特開平５－２２９９３１号公報 特開２０００－１１９１２５号公報 特開２００６－１９９６１１号公報 特開２００７－１９２４号公報 特開２０１２－１５３６６９号公報 特開２０１９－９９５３０号公報 特開昭６１－２３８７２９号公報 特開２００４－２２４７８３号公報 特開２００８－１６１０７７号公報

Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，ｖｏｌ．１０，ｐｐ ３５７，１９６７ 「結合組成」、金原出版、４８１項、１９８４年 「炎症」、日本炎症学会、１１巻、１６項、１９９１年

安全で安定性に優れ、メラニン生成抑制作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用及びＭＭＰ－２阻害作用に優れた素材が望まれているが、未だ十分満足し得るものが提供されていないのが現状である。

このような事情により、本発明者らは鋭意検討した結果、チョウセンゴヨウの種子の抽出物が優れたメラニン生成抑制作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用及びＭＭＰ－２阻害作用を持ち、安定性においても優れていることを見出した。更に、その抽出物を含有する外用剤または内用剤が、安全で安定であり、メラニン生成抑制作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用及びＭＭＰ－２阻害作用に優れており、多機能性美容・健康用素材、医薬品と成り得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含有することを特徴とするメラニン生成抑制剤。
（２）チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
（３）チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
（４）チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰ－２阻害剤。
（５）チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含有することを特徴とする美白剤。
（６）チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防改善用食品組成物。

本発明によれば、チョウセンゴヨウの種子の抽出物を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤（美白剤）、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＭＭＰ－２阻害剤が提供される。また、チョウセンゴヨウの種子は、食用として食べられているため、副作用がなく安全性が高い。よって、チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含む外用剤または内用剤は安心して使用することができる。

本発明に用いるチョウセンゴヨウ（学名：Ｐｉｎｕｓ ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ、生薬名：海松子（かいしょうし））は、マツ目マツ科マツ属に属する常緑針葉樹で、日本では本州中部、四国の山地に自生する他、朝鮮半島、中国東北部、アムール、ウスリーに自生するが、産地は特に限定されない。本発明において、チョウセンゴヨウの種子の抽出には、種子をそのまま使用しても良く、乾燥、粉砕等の処理を行っても良い。

抽出方法は、特に限定されないが、水もしくは熱水、または水と有機溶媒の混合溶媒を用い、撹拌またはカラム抽出する方法等により行うことができる。抽出溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコール等の極性溶媒が良く、特に好ましくは、水、エタノール、１，３－ブチレングリコール及びプロピレングリコールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。特に好ましい抽出溶媒としては、水、水－エタノールの混合極性溶媒または水－１，３－ブチレングリコールの混合極性溶媒が挙げられる。溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えばチョウセンゴヨウの種子（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であれば良いが、抽出後に濃縮を行ったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、用いる溶媒の種類や抽出時の圧力等によって適宜選択できる。

上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良いが、必要に応じて、本発明の効果を奏する範囲で、濃縮（減圧濃縮、膜濃縮等による濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いても良い。更には、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。

本発明は、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲で、化粧品、医薬部外品、医薬品または食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分が含有されていても良い。

本発明は、化粧品、医薬部外品、医薬品、食品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、錠菓、チョコレート、ガム、飴、飲料、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、坐剤、注射用溶液等が挙げられる。

外用の場合、本発明に用いる上記抽出物の含有量は、固形物に換算して０．０００１重量％以上が好ましく、０．００１～１０重量％がより好ましい。更に、０．０１～５重量％が最も好ましい。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を超えると、効果の増強は認められにくく不経済である。

内用の場合、摂取量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なる。通常、成人１人当たりの１日の摂取量としては、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ～５ｇがより好ましい。更に、２０ｍｇ～２ｇが最も好ましい。

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、実験例及び処方例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。製造例に示す％とは重量％を、処方例に示す含有量の部とは重量部を示す。

チョウセンゴヨウの種子の抽出物の製造例
チョウセンゴヨウの種子の抽出物を以下の通り製造した。

（製造例１）チョウセンゴヨウの種子の熱水抽出物の調製
チョウセンゴヨウの種子の乾燥物１０ｇに２００ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してチョウセンゴヨウの種子の熱水抽出物を１．１ｇ得た。

（製造例２）チョウセンゴヨウの種子の５０％エタノール抽出物の調製
チョウセンゴヨウの種子の乾燥物１０ｇに２００ｍＬの５０％エタノール水溶液を加え、７日間室温で、１８０ｒｐｍで撹拌抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してチョウセンゴヨウの種子の５０％エタノール抽出物を０．６ｇ得た。

（製造例３）チョウセンゴヨウの種子のエタノール抽出物の調製
チョウセンゴヨウの種子の乾燥物１０ｇに２００ｍＬのエタノールを加え、７日間室温で、１８０ｒｐｍで撹拌抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してチョウセンゴヨウの種子のエタノール抽出物を０．２ｇ得た。

（製造例４）チョウセンゴヨウの種子の１，３－ブチレングリコール抽出物の調製
チョウセンゴヨウの種子の乾燥物１０ｇに２００ｍＬの１，３－ブチレングリコールを加え、７日間室温で、１８０ｒｐｍで撹拌抽出を行った。得られた抽出液を濾過して、チョウセンゴヨウの種子の１，３－ブチレングリコール抽出物を１９４ｇ得た。

（製造例５）チョウセンゴヨウの種子のヘキサン抽出物の調製
チョウセンゴヨウの種子の乾燥物１０ｇに２００ｍＬのヘキサンを加え、７日間室温で、１８０ｒｐｍで撹拌抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してチョウセンゴヨウの種子のヘキサン抽出物を０．１ｇ得た。

（処方例１） 化粧水
処方 含有量（部）
１．チョウセンゴヨウの種子の熱水抽出物（製造例１） ２．０
２．１，３－ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６及び１１と、成分７～１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

（比較処方例１） 従来の化粧水
処方例１において、チョウセンゴヨウの種子の熱水抽出物を精製水に置き換えたものを、従来の化粧水とした。

（処方例２） クリーム
処方 含有量（部）
１．チョウセンゴヨウの種子の５０％エタノール抽出物（製造例２） １．０
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．１，３－ブチレングリコール ８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

（比較処方例２） 従来のクリーム
処方例２において、チョウセンゴヨウの種子の５０％エタノール抽出物を精製水に置き換えたものを、従来のクリームとした。

（処方例３） 乳液
処方 含有量（部）
１．チョウセンゴヨウの種子のヘキサン抽出物（製造例５） ０．０１
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１０～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例４） ゲル剤
処方 含有量（部）
１．チョウセンゴヨウの種子の
１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４） １．０
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．香料 適量
６．１，３－ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～５と、成分１及び６～１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

（処方例５） パック
処方 含有量（部）
１．チョウセンゴヨウの種子の熱水抽出物（製造例１） １．０
２．チョウセンゴヨウの種子の
１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４） ５．０
３．ポリビニルアルコール １２．０
４．エタノール ５．０
５．１，３－ブチレングリコール ８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
８．クエン酸 ０．１
９．クエン酸ナトリウム ０．３
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～１１を均一に溶解し製品とする。

（処方例６） ファンデーション
処方 含有量（部）
１．チョウセンゴヨウの種子の５０％エタノール抽出物（製造例２） １．０
２．ステアリン酸 ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．）１．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
５．セタノール １．０
６．液状ラノリン ２．０
７．流動パラフィン ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル ６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
１０．ベントナイト ０．５
１１．プロピレングリコール ４．０
１２．トリエタノールアミン １．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．二酸化チタン ８．０
１５．タルク ４．０
１６．ベンガラ １．０
１７．黄酸化鉄 ２．０
１８．香料 適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０～１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４～１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例７） 浴用剤
処方 含有量（部）
１．チョウセンゴヨウの種子のエタノール抽出物（製造例３） １．０
２．炭酸水素ナトリウム ５０．０
３．黄色２０２号（１） 適量
４．香料 適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１～５を均一に混合し製品とする。

（処方例８） 軟膏
処方 含有量（部）
１．チョウセンゴヨウの種子の熱水抽出物（製造例１） ５．０
２．チョウセンゴヨウの種子の
１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４） １．０
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
４．モノステアリン酸グリセリン １０．０
５．流動パラフィン ５．０
６．セタノール ６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
８．プロピレングリコール １０．０
９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３～６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７～９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例９） 散剤
処方 含有量（部）
１．チョウセンゴヨウの種子の熱水抽出物（製造例１） １．０
２．乾燥コーンスターチ ３９．０
３．微結晶セルロース ６０．０
［製造方法］成分１～３を混合し、散剤とする。

（処方例１０） 錠剤
処方 含有量（部）
１．チョウセンゴヨウの種子のエタノール抽出物（製造例３） ５．０
２．乾燥コーンスターチ ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０．０
４．微結晶セルロース ４０．０
５．ポリビニルピロリドン ７．０
６．タルク ３．０
［製造方法］成分１～４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

（処方例１１） 錠菓
処方 含有量（部）
１．チョウセンゴヨウの種子のエタノール抽出物（製造例３） ２．０
２．乾燥コーンスターチ ４９．８
３．エリスリトール ４０．０
４．クエン酸 ５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル ３．０
６．香料 ０．１
７．精製水 ０．１
［製造方法］成分１～４及び７を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。

（処方例１２） 飲料
処方 含有量（部）
１．チョウセンゴヨウの種子の熱水抽出物（製造例１） ０．０５
２．ステビア ０．０５
３．リンゴ酸 ５．０
４．香料 ０．１
５．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～３を少量の水に溶解する。次いで、成分４及び５を加えて混合する。

次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。

実験例１ Ｂ１６マウスメラノーマを用いたメラニン生成抑制試験
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を６０ｍｍ ｄｉｓｈに３×１０^４個播種し、各試料を最終濃度１、１０または１００μｇ／ｍＬとなるように添加した１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下にて５日間培養した。培養後、細胞の剥離を行い、遠心操作をして得られたペレットを超音波操作によりＰＢＳ（－）に溶解させた。タンパク質定量は、Ｌｏｗｒｙ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５－２７５，１９５１）を用いて行った。また、メラニン量を測定する場合、タンパク質定量用に取った残りの細胞破砕溶液に４Ｎ ＮａＯＨを加え、６０℃にて２時間加温した後、分光光度計（島津製作所）を用いて４７５ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線からメラニン量を求め、タンパク質１ｍｇ当たりのメラニン量を算出した。メラニン生成抑制率は、コントロール（試料未添加）群に対する試料添加群のメラニン量の減少量の割合から算出した。

これらの実験結果を表１に示した。本発明のチョウセンゴヨウの種子の抽出物には、優れたメラニン生成抑制作用（美白作用）が認められた。特に、チョウセンゴヨウの種子のエタノール抽出物（製造例３）において顕著に効果が高かった。

実験例２ Ｉ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）及びＭＭＰ－２ ｍＲＮＡ発現量の測定
ＣＯＬ１Ａ１、ＨＡＳ２及びＭＭＰ－２ ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ヒト線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢを６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０^５個播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。コンフルエントになったところで、各試料を最終濃度１０または１００μｇ／ｍＬとなるように添加したＤＭＥＭ（－）培養液にて２４時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ）を用いた。即ち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ＣＯＬ１Ａ１、ＨＡＳ２及びＭＭＰ－２ ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＣＯＬ１Ａ１発現促進率は、コントロール（試料未添加）群のＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。ＨＡＳ２発現促進率及びＭＭＰ－２発現抑制率についても、同様に算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

ＣＯＬ１Ａ１用のプライマーセット
ＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＧＧＴＴ（配列番号１）
ＴＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧ（配列番号２）
ＨＡＳ２用のプライマーセット
ＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＣＧＡＴＴＡ（配列番号３）
ＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧ（配列番号４）
ＭＭＰ－２用のプライマーセット
ＣＣＧＴＣＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡ（配列番号５）
ＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴ（配列番号６）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号７）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号８）

これらの実験結果を表２～４に示した。その結果、本発明のチョウセンゴヨウの種子の抽出物には、優れたＣＯＬ１Ａ１発現促進効果（コラーゲン産生促進作用）、ＨＡＳ２発現促進効果（ヒアルロン酸産生促進作用）及びＭＭＰ－２発現抑制効果（ＭＭＰ－２阻害作用）が認められた。特にチョウセンゴヨウの種子のヘキサン抽出物（製造例５）のＣＯＬ１Ａ１発現促進効果、チョウセンゴヨウの種子の５０％エタノール抽出物（製造例２）のＭＭＰ－２発現抑制効果及びＨＡＳ２発現促進効果において、顕著に効果が高かった。

実験例３ 使用試験
処方例２のクリーム及び比較処方例２の従来のクリームを用いて、シワ、たるみがある５人（２６～６６歳）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、シワ、たるみの程度をアンケートにより判定した。

その結果、本発明の抽出物を含有するクリームにより、シワ、たるみが軽減した。尚、試験期間中、皮膚トラブルは１人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。

また、処方例１の化粧水及び比較処方例１の従来の化粧水を用い、同様に使用試験を行った。その結果、本発明の抽出物を含有する化粧水により、シワ、たるみの軽減が認められた。

以上のことから、本発明のチョウセンゴヨウの種子の抽出物は、優れたメラニン生成抑制作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用及びＭＭＰ－２阻害作用を有し、安定性にも優れていた。よって、本発明のチョウセンゴヨウの種子の抽出物は、皮膚の老化といった美容分野だけではなく、老化による機能低下の抑制、ガンの予防、治療等といった医療分野にも利用でき、化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品への応用が期待される。

Claims (6)

1. チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含有することを特徴とするメラニン生成抑制剤。
2. チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
3. チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
4. チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰ－２阻害剤。
5. チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含有することを特徴とする美白剤。
6. チョウセンゴヨウの種子の抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防改善用食品組成物。