JP2023007747A

JP2023007747A - Ｍｍｐ阻害剤、ヒアルロン酸産生促進剤及び内用剤

Info

Publication number: JP2023007747A
Application number: JP2021110789A
Authority: JP
Inventors: 真緒瀬岡; Mao Seoka; 祐子村上; Yuko Murakami; 勉坂井田; Tsutomu Sakaida
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2021-07-02
Filing date: 2021-07-02
Publication date: 2023-01-19

Abstract

【課題】ＭＭＰ阻害作用及びヒアルロン酸産生促進作用に優れた新規な外用剤又は内用剤を提供する。【解決手段】ジュニパーベリーの抽出物は、優れたＭＭＰ阻害作用及びヒアルロン酸産生促進作用を有し、安定性にも優れていた。ジュニパーベリーの抽出物は、皮膚の老化予防といった美容分野だけではなく、老化による機能低下の抑制、ガンの予防、治療等といった医療分野にも利用でき、化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品等への応用が期待される。【選択図】なし

Description

本発明は、ＭＭＰ阻害剤、ヒアルロン酸産生促進剤及び内用剤に関する。

真皮には線維芽細胞やコラーゲンが存在し、Ｉ型コラーゲンが全体の８０％を占める。Ｉ型コラーゲンの他には、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩＩ及びＸＩＶ型コラーゲンの存在が知られている。シワやたるみの原因の一つとして、Ｉ型コラーゲンの減少が挙げられる。従って、Ｉ型コラーゲンの産生を促進させることがシワ・たるみの予防・改善に有効であると考えられる。また、Ｉ型コラーゲンの産生促進は皮膚の創傷治癒の改善にも有効である。

また、皮膚は紫外線の他、乾燥、寒冷、熱、薬物等の様々な物理的及び化学的ストレスに日々曝されている。その結果、皮膚の機能低下が引き起こされ、様々な皮膚の老化現象が顕在化する。皮膚の老化現象の一つにシワがある。シワには、表皮性のシワと、真皮性のシワの二種類が存在することが知られている。表皮性のシワは小ジワと呼ばれ、皮膚の乾燥により、表皮角質中の水分量が低下することによって一時的に生じるシワである。一方、真皮性のシワは、太陽光線に含まれる紫外線や加齢によって形成されるシワである。その形成メカニズムとしては、紫外線や加齢による真皮線維芽細胞におけるコラーゲン合成能の低下や、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の増加によるコラーゲンの分解促進が挙げられる。

乾燥に起因する表皮性のシワと真皮性のシワでは、組織学的形態、発症メカニズム、治療方法が異なり、紫外線や加齢により生じる真皮性のシワは、保湿効果を有する化粧品の使用によって改善することは困難である。

これまでに、紫外線によって生じる真皮性のシワを改善することを目的として、加水分解アーモンドを有効成分とする皮膚のシワ形成防止・改善剤（特許文献１）、ジョチョウケイ、テンキシ及びキセンソウの抽出物を有効成分とする紫外線照射に起因するシワの改善剤（特許文献２）が報告されている。

また、コラーゲンは、哺乳動物組織の約１／３を占める主要な構造タンパク質であり、軟骨、骨、腱、及び皮膚等の、多くのマトリックス組織の必須な成分である。ＭＭＰに属するコラゲナーゼ（ＭＭＰ－１）により一箇所を切断されると、通常の組織内では安定なコラーゲン分子は、変性して一本鎖のゼラチンとなり、他の様々なプロテアーゼにより分解されるようになる。その結果、マトリックス組織の構造の完全性が失われてしまう。

コラゲナーゼの阻害活性を有する素材として、例えば、カカオ豆皮であるカカオハスク抽出物（特許文献３）、バラ科オニイチゴ抽出物（特許文献４）、ラクトフェリン（特許文献５）等が提案されている。皮膚老化や口腔衛生にますます関心が高まっている状況下で、副作用がなく、安全性が高い、コラゲナーゼ活性阻害作用の優れた素材を見出すことが求められている。

ＭＭＰに属するゼラチナーゼ（ＭＭＰ－２）は、線維芽細胞や内皮細胞、ガン細胞等が産生する酵素であり、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン（動脈、腱、皮膚等の弾性組織の特殊成分を成す構造タンパク質）等の基質を分解する。従って、ゼラチナーゼに対して阻害活性を有する物質は、ガン組織における血管新生やガンの転移を抑制する効果が期待され、ガン疾患の予防、治療に有用であると考えられる。更にＭＭＰの阻害はガン疾患のみならず、潰瘍形成、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、歯周炎等、ＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防、治療及び改善に有用である。

また、線維芽細胞はコラーゲン等のタンパク質及びヒアルロン酸等のグリコサミノグリカンを産生して真皮結合組織を形成し、皮膚のハリを保っている。この結合組織が収縮力を失い、更に弾性力を失う結果として、皮膚のシワやたるみが発生すると考えられている。

特にヒアルロン酸は結合組織に広く分布する高分子多糖体として知られており、真皮中でゲル状の形態を呈し、肌の弾力を維持している。従って、ヒアルロン酸の変質や減少が皮膚老化において重要であると考えられている。また、ヒアルロン酸は高分子であるため、それを含有した化粧料を皮膚に直接塗布しても吸収されにくいという問題があった。そこで、これまで、線維芽細胞を活性化することで、細胞自らのコラーゲンやヒアルロン酸の産生を促進させることができる皮膚外用剤が模索されてきた（特許文献６）。

また、ヒアルロン酸は関節にも存在しており、関節の荷重の衝撃を和らげたり、関節の動きを滑らかにしたりする機能を果たしていることが知られている。正常人間関節液中のヒアルロン酸濃度は約２．３ｍｇ／ｍＬであるが、慢性関節リウマチの場合、関節液中のヒアルロン酸濃度は約１．２ｍｇ／ｍＬと低下し、同時に関節液の粘度も著しく低下する（非特許文献１）。また、化膿性関節炎や痛風性関節炎等でも、慢性関節リウマチの場合と同様、ヒアルロン酸含量の低下が起こることが知られている（非特許文献２）。上記疾患において、潤滑機能の改善、関節軟骨の被覆・保護、疼痛抑制及び病的関節液の改善のために、関節液中のヒアルロン酸量を増加させることが考えられる。例えば、慢性関節リウマチの患者にヒアルロン酸ナトリウムの関節注入法を行うと、上記の症状の改善が認められることが知られている（非特許文献３）。しかしながら、上記疾患の治療は長期に渡る。従って、日常生活の中で手軽に予防や治療等ができるように、ヒアルロン酸産生促進剤を含有させた皮膚外用剤や食品、医薬品が望まれている。

飛蚊症とは、視界内に糸くずや蚊のように見える薄い影が現れる症状で、目の内部を満たす硝子体内の混濁が網膜上に影を落とすことで発生する。飛蚊症は大きく２種類に分けることができ、加齢や紫外線、活性酸素等の影響で発症する生理的飛蚊症と、網膜剥離、網膜裂孔、硝子体出血、ぶどう膜炎等の疾患の一症状として現れる病的飛蚊症がある。生理的飛蚊症は、硝子体の主要成分であるヒアルロン酸の減少による液状化と、それに伴うコラーゲン線維の分解で硝子体内が混濁することで生じる。治療法として、硝子体切除手術やレーザー治療があるが、これらの施術は安全性の観点から日本ではあまり行われていないという実情があり、海外で治療を行うには多額の費用が必要となる。そのため、生理的飛蚊症を予防改善するためには日常的に利用可能なヒアルロン酸産生促進剤を含有させた食品や医薬品が望まれている。

特開２０００－１１９１２５号公報特開２００６－１９９６１１号公報特開平３－４４３３１号公報特開２００３－１３７８０１号公報特開平５－１８６３６８号公報特開２００７－１９２４号公報

"ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍａｔｉｓｍ"，ｖｏｌ．１０，ｐｐ３５７，１９６７「結合組成」、金原出版、４８１項、１９８４年「炎症」、日本炎症学会、１１巻、１６項、１９９１年

安全で安定性に優れ、ＭＭＰ阻害作用及びヒアルロン酸産生促進作用に優れた素材が望まれているが、未だ十分満足し得るものが提供されていないのが現状である。

このような事情により、本発明者らは鋭意検討した結果、ジュニパーベリーの抽出物が優れたＭＭＰ阻害作用及びヒアルロン酸産生促進作用を持ち、安定性においても優れていることを見出した。更に、その抽出物を含有する外用剤又は内用剤が、安全で安定であり、ＭＭＰ阻害作用に優れており、多機能性美容・健康用素材、医薬品と成り得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ジュニパーベリーの抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰ阻害剤。
（２）ジュニパーベリーの抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防改善用食品組成物。
（３）ジュニパーベリーの抽出物を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
（４）ジュニパーベリーの抽出物を含有することを特徴とするシワ改善剤。

本発明によれば、ジュニパーベリーの抽出物を有効成分として含有するＭＭＰ阻害剤及びヒアルロン酸産生促進剤が提供される。

本発明に用いるジュニパーベリー（学名：Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ）は、別名をセイヨウネズという、ヒノキ科ビャクシン属に属する針葉樹である。乾燥耐性があり、寒冷地帯に自生し、日本では北海道などでみられる。果実は黒紫色をした漿果で、葉は常緑の針葉である。本発明において、ジュニパーベリーの抽出物とは、その果実の抽出物をいう。また、抽出には、植物体をそのまま使用しても良く、乾燥、粉砕、細切等の処理を行っても良い。

抽出方法は、特に限定されないが、水もしくは熱水、又は水と有機溶媒の混合溶媒を用い、撹拌又はカラム抽出する方法等により行うことができる。抽出溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコール等の極性溶媒が良く、特に好ましくは、水、エタノール、１，３－ブチレングリコール及びプロピレングリコールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。特に好ましい抽出溶媒としては、水、水－エタノールの混合極性溶媒又は水－１，３－ブチレングリコールの混合極性溶媒が挙げられる。溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えばジュニパーベリーの果実（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であれば良いが、抽出後に濃縮を行ったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、用いる溶媒の種類や抽出時の圧力等によって適宜選択できる。

上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良いが、必要に応じて、本発明の効果を奏する範囲で、濃縮（減圧濃縮、膜濃縮等による濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いても良い。更には、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。

本発明は、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲で、化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分が含有されていても良い。

本発明は、化粧品、医薬部外品、医薬品、食品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、錠菓、チョコレート、ガム、飴、飲料、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、坐剤、注射用溶液等が挙げられる。

外用の場合、本発明に用いる上記抽出物の含有量は、固形物に換算して０．０００１重量％以上が好ましく、０．００１～１０重量％がより好ましい。更に、０．０１～５重量％が最も好ましい。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を超えると、効果の増強は認められにくく不経済である。

内用の場合、摂取量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なる。通常、成人１人当たりの１日の摂取量としては、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ～５ｇがより好ましい。更に、２０ｍｇ～２ｇが最も好ましい。

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。特記していない場合は、実施例に示す％とは重量％を示す。

ジュニパーベリーの抽出物の製造例
ジュニパーベリーの抽出物を以下の通り製造した。製造例１～４において、抽出材料にはジュニパーベリーの果実を用いた。

（製造例１）ジュニパーベリーの熱水抽出物の調製
ジュニパーベリーの乾燥物１０ｇに２００ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してジュニパーベリーの熱水抽出物を３．３ｇ得た。

（製造例２）ジュニパーベリーの５０％エタノール抽出物の調製
ジュニパーベリーの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し、抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してジュニパーベリーの５０％エタノール抽出物を３．７ｇ得た。

（製造例３）ジュニパーベリーのエタノール抽出物の調製
ジュニパーベリーの乾燥物１０ｇを２００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し、抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してジュニパーベリーのエタノール抽出物を２．１ｇ得た。

（製造例４）ジュニパーベリーの１，３－ブチレングリコール抽出物の調製
ジュニパーベリーの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの１，３－ブチレングリコールに室温で７日間浸漬し、抽出を行った。得られた抽出液を濾過して、ジュニパーベリーの１，３－ブチレングリコール抽出物を１９２ｇ得た。

（処方例１）化粧水
処方含有量（％）
１．ジュニパーベリーの熱水抽出物（製造例１）２．０
２．１，３－ブチレングリコール８．０
３．グリセリン２．０
４．キサンタンガム０．０２
５．クエン酸０．０１
６．クエン酸ナトリウム０．１
７．エタノール５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）０．１
１０．香料適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６及び１１と、成分７～１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

（比較処方例１）従来の化粧水
処方例１において、ジュニパーベリーの熱水抽出物を精製水に置き換えたものを、従来の化粧水とした。

（処方例２）クリーム
処方含有量（％）
１．ジュニパーベリーの５０％エタノール抽出物（製造例２）１．０
２．スクワラン５．５
３．オリーブ油３．０
４．ステアリン酸２．０
５．ミツロウ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ベヘニルアルコール１．５
９．モノステアリン酸グリセリン２．５
１０．香料０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１２．１，３－ブチレングリコール８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

（比較処方例２）従来のクリーム
処方例２において、ジュニパーベリーの５０％エタノール抽出物を精製水に置き換えたものを、従来のクリームとした。

（処方例３）乳液
処方含有量（％）
１．ジュニパーベリーのエタノール抽出物（製造例３）０．０１
２．スクワラン５．０
３．オリーブ油５．０
４．ホホバ油５．０
５．セタノール１．５
６．モノステアリン酸グリセリン２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
９．香料０．１
１０．プロピレングリコール１．０
１１．グリセリン２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１０～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例４）ゲル剤
処方含有量（％）
１．ジュニパーベリーの
１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４）１．０
２．エタノール５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）０．１
５．香料適量
６．１，３－ブチレングリコール５．０
７．グリセリン５．０
８．キサンタンガム０．１
９．カルボキシビニルポリマー０．２
１０．水酸化カリウム０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～５と、成分１及び６～１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

（処方例５）パック
処方含有量（％）
１．ジュニパーベリーの熱水抽出物（製造例１）１．０
２．ジュニパーベリーの
１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４）５．０
３．ポリビニルアルコール１２．０
４．エタノール５．０
５．１，３－ブチレングリコール８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．）０．５
８．クエン酸０．１
９．クエン酸ナトリウム０．３
１０．香料適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～１１を均一に溶解し製品とする。

（処方例６）ファンデーション
処方含有量（％）
１．ジュニパーベリーの５０％エタノール抽出物（製造例２）１．０
２．ステアリン酸２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．）１．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
５．セタノール１．０
６．液状ラノリン２．０
７．流動パラフィン３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム０．１
１０．ベントナイト０．５
１１．プロピレングリコール４．０
１２．トリエタノールアミン１．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１４．二酸化チタン８．０
１５．タルク４．０
１６．ベンガラ１．０
１７．黄酸化鉄２．０
１８．香料適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０～１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４～１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例７）浴用剤
処方含有量（％）
１．ジュニパーベリーのエタノール抽出物（製造例３）１．０
２．炭酸水素ナトリウム５０．０
３．黄色２０２号（１）適量
４．香料適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１～５を均一に混合し製品とする。

（処方例８）軟膏
処方含有量（％）
１．ジュニパーベリーの熱水抽出物（製造例１）５．０
２．ジュニパーベリーの
１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４）１．０
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．）２．０
４．モノステアリン酸グリセリン１０．０
５．流動パラフィン５．０
６．セタノール６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル０．１
８．プロピレングリコール１０．０
９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３～６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７～９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例９）散剤
処方含有量（％）
１．ジュニパーベリーの熱水抽出物（製造例１）１．０
２．乾燥コーンスターチ３９．０
３．微結晶セルロース６０．０
［製造方法］成分１～３を混合し、散剤とする。

（処方例１０）錠剤
処方含有量（％）
１．ジュニパーベリーのエタノール抽出物（製造例３）５．０
２．乾燥コーンスターチ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム２０．０
４．微結晶セルロース４０．０
５．ポリビニルピロリドン７．０
６．タルク３．０
［製造方法］成分１～４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

（処方例１１）錠菓
処方含有量（％）
１．ジュニパーベリーのエタノール抽出物（製造例３）２．０
２．乾燥コーンスターチ４９．８
３．エリスリトール４０．０
４．クエン酸５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル３．０
６．香料０．１
７．精製水０．１
［製造方法］成分１～４及び７を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。

（処方例１２）飲料
処方含有量（％）
１．ジュニパーベリーの熱水抽出物（製造例１）０．０５
２．ステビア０．０５
３．リンゴ酸５．０
４．香料０．１
５．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～３を少量の水に溶解する。次いで、成分４及び５を加えて混合する。

次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。

（実験例１）ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２及びヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ－２）ｍＲＮＡ発現量の測定
ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２及びＨＡＳ－２ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ヒト皮膚線維芽細胞を６０ｍｍｄｉｓｈに１×１０^５個播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、各試料を最終濃度１、１０又は１００μｇ／ｍＬとなるように添加したＤＭＥＭ（－）培養液にて２４時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲＳｅｌｅｃｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。即ち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２及びＨＡＳ－２ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるβ－ａｃｔｉｎｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＭＭＰ－１発現抑制率、ＭＭＰ－２発現抑制率及びＨＡＳ－２発現促進率は、Ｃｏｎｔｒｏｌ（試料未添加）群のＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２及びＨＡＳ－２ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２及びＨＡＳ－２ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

ＭＭＰ－１用のプライマーセット
ＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣ（配列番号１）
ＴＧＡＧＣＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＣ（配列番号２）
ＭＭＰ－２用のプライマーセット
ＣＣＧＴＣＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡ（配列番号３）
ＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴ（配列番号４）
ＨＡＳ－２用のプライマーセット
ＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＣＧＡＴＴＡ（配列番号５）
ＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧ（配列番号６）
β－ａｃｔｉｎ用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号７）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号８）

これらの実験結果を表１～３に示した。その結果、本発明のジュニパーベリーの抽出物には、優れたＭＭＰ－１発現抑制効果（ＭＭＰ－１阻害作用）、ＭＭＰ－２発現抑制効果（ＭＭＰ－２阻害作用）及びＨＡＳ－２発現促進効果が認められた。特にジュニパーベリーの５０％エタノール抽出物（製造例２）のＭＭＰ－１発現抑制効果、ＭＭＰ－２発現抑制効果及びＨＡＳ－２発現促進効果において、顕著に効果が高かった。尚、他の抽出方法で得られたジュニパーベリーの抽出物（製造例４）にも同等の効果が認められた。

（実験例２）使用試験
処方例２のクリーム及び比較処方例２の従来のクリームを用いて、シワ、たるみがある５人（２５～６６歳）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、シワ、たるみの程度をアンケートにより判定した。

その結果、本発明の抽出物を含有するクリームにより、シワ、たるみが軽減した。尚、試験期間中、皮膚トラブルは１人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。

また、処方例１の化粧水及び比較処方例１の従来の化粧水を用い、同様に使用試験を行った。その結果、本発明の抽出物を含有する化粧水により、シワ、たるみの軽減が認められた。

以上のことから、本発明のジュニパーベリーの抽出物は、優れたＭＭＰ阻害作用を有し、安定性にも優れていた。よって、本発明のジュニパーベリーの抽出物は、皮膚の老化といった美容分野だけではなく、老化による機能低下の抑制、ガンの予防、治療等といった医療分野にも利用でき、化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品への応用が期待される。

Claims

ジュニパーベリーの抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰ阻害剤。
ジュニパーベリーの抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防改善用食品組成物。
ジュニパーベリーの抽出物を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
ジュニパーベリーの抽出物を含有することを特徴とするシワ改善剤。