JP2022002536A - 植物及び真菌由来の脱細胞化された細胞壁構造並びに足場材料としてのその使用 - Google Patents

植物及び真菌由来の脱細胞化された細胞壁構造並びに足場材料としてのその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】外科、臨床、治療、美容、開発、及び／又は他の適切な用途で足場又は移植片として使用することができる生体材料を提供する。【解決手段】組織の細胞物質及び核酸が除去された、脱細胞化された植物組織又は真菌組織であって、セルロース又はキチンベースの三次元多孔質構造を含む脱細胞化された植物又は真菌組織を含む足場生体材料である。そのような足場生体材料を調製する方法、並びに動物細胞増殖のサポート、組織再生の促進、血管新生の促進、組織置換術のための移植可能な足場として、及び／又は美容外科手術用の構造移植片としてのその使用も提供される。そのような足場を使用する治療的処置及び／又は美容方法がさらに記載される。【選択図】なし

Description

本発明は一般に、足場生体材料及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、脱細胞化された植物組織又は真菌組織、及び足場生体材料としてのその使用に関する。
生体材料産業は、９００億米ドルの市場価格を有すると推定され、天然の供給源、合成ポリマー、金属、及びセラミックスに由来する新規の材料によって動かされている。これらの材料は、生体適合性の、生細胞の増殖を促進するナノ／マイクロスケール構造を持つ三次元高多孔性足場を形成することができる。例えば組織工学及び再生医療における潜在的用途のための、生細胞の浸潤及び増殖をサポートする新規の生体材料に対する強い関心がある。
生体材料足場は、歯科及び美容外科手術、臨床及び医学療法（再生医療、創傷治癒、組織工学及び修復等など）、並びに研究開発（生物医学における産業及び学術研究を含む）を含む、複数の部門に用途を有する。
市販の生体材料は、複雑で時間のかかる産生方法をしばしば必要とし、ヒト用として承認されていなくてもエンドユーザーには高額費用につながる。さらに、ほとんどの市販の生体材料はヒト／動物起源に由来し、身体による潜在的拒絶反応及び／又は有害な免疫応答及び／又は感染症伝播のリスクの可能性をもたらす。供給源材料は、負の環境影響も与える可能性があり、非倫理的調達の問題にもつながる可能性がある。また、いくつかの市販の生体材料は、移植後にその形状を失い、組織修復／置換の成功の低下をもたらす可能性がある。
組織工学戦略のための新規の生体材料の開発は、現在熱心に研究されている（Saini M.
Implant biomaterials: A comprehensive review. World J Clin Cases. 2015;3: 52.doi:10.12998/wjcc.v3.i1.52、Pashuck ET, Stevens MM.STATE OF THE ART REVIEW Designing Regenerative Biomaterial Therapies for the Clinic. Sci Transl Med. 2012;4、Athanasiou KA, Reddi AH,Guldberg RE, Revell CM. Special section. 2012;338: 921-927）。生体材料は、標的組織への治療用細胞の局所送達（Kar M, Vernon Shih Y-R, Velez DO, Cabrales P, Varghese S.Poly(ethylene glycol) hydrogels with cell cleavable groups for autonomous cell delivery. Biomaterials. 2016;77: 186-97. doi:10.1016/j.biomaterials.2015.11.018、Gu L, Mooney DJ. Biomaterials and emerging anticancer therapeutics:engineering the microenvironment. Nat Rev Cancer. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved.; 2015;16: 56-66.doi:10.1038/nrc.2015.3）、損傷若しくは病変組織の再生（Maurer M,Rohrnbauer B, Feola A, Deprest J, Mazza E. Prosthetic Meshes for Repair of Hernia and Pelvic Organ Prolapse: Comparison of Biomechanical Properties.Materials (Basel). Multidisciplinary Digital Publishing Institute; 2015;8:2794-2808. doi:10.3390/ma8052794、Mao AS, Mooney DJ.Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci. 2015;112: 201508520. doi:10.1073/pnas.1508520112、Hsu S-H, Hsieh P-S. Self-assembled adult adipose-derived stem cell spheroids combined with biomaterials promote wound healing in a rat skin repair model.Wound Repair Regen. 23: 57-64. doi:10.1111/wrr.12239、Guillaume O, Park J, Monforte X, Gruber-Blum S, Redl H, Petter-Puchner A, et al. Fabrication of silk mesh with enhanced cytocompatibility: preliminary in vitro investigation toward cell-based therapy for hernia repair. J Mater Sci Mater Med. 2016;27: 37.doi:10.1007/s10856-015-5648-3）、又は臓器全体の置換（Soto-GutierrezA, Zhang L, Medberry C, Fukumitsu K, Faulk D, Jiang H, et al. A whole-organregenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng Part CMethods. Mary Ann Liebert, Inc. 140 Huguenot Street, 3rd Floor New Rochelle, NY10801 USA; 2011;17: 677-86. doi:10.1089/ten.TEC.2010.0698、Badylak SF, Taylor D, Uygun K. Whole-Organ Tissue Engineering:Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix
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生体材料足場は、粉末、ゲル、膜、及びペーストなどのいくつかの形態を取ることができる（Saini M.Implant biomaterials: A comprehensive review. World J Clin Cases.
2015;3: 52. doi:10.12998/wjcc.v3.i1.52、Pashuck ET,Stevens MM. STATE OF THE ART REVIEW Designing Regenerative BiomaterialTherapies for the Clinic. Sci Transl
Med. 2012;4）。そのようなポリマー又はヒドロゲル製剤は、治療的価値のある形態を作製するために成形又は３Ｄプリントされ得る（Takebe T, Sekine K, Enomura M, Koike H, Kimura M, Ogaeri T, et al.Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ budtransplant. Nature. Nature Publishing Group, a division of Macmillan PublishersLimited. All Rights Reserved.; 2013;499: 481-4. doi:10.1038/nature12271、Mannoor MS, Jiang Z, James T, Kong YL, Malatesta KA, Soboyejo WO, etal. 3D printed bionic ears. Nano Lett. American Chemical Society; 2013;13:2634-9. doi:10.1021/nl4007744、Raya-Rivera AM,Esquiliano D, Fierro-Pastrana R, Lopez-Bayghen E, Valencia P, Ordorica-FloresR, et al. Tissue-engineered autologous
vaginal organs in patients: a pilot cohort study. Lancet (London, England). Elsevier;2014;384: 329-36. doi:10.1016/S0140-6736(14)60542-0）。これらの合成戦略の代替的アプローチは、臓器全体の脱細胞化である（Soto-Gutierrez A, Zhang L, Medberry C, Fukumitsu K, Faulk D, JiangH, et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.Tissue Eng Part C Methods. Mary Ann Liebert, Inc.
140 Huguenot Street, 3rd Floor New Rochelle, NY 10801 USA; 2011;17: 677-86.doi:10.1089/ten.TEC.2010.0698、Baptista PM, Orlando G,Mirmalek-Sani S-H, Siddiqui
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の細胞のいずれかを欠き、その後、患者又は別の供給源に由来する細胞と共に培養することができる。そのようなアプローチは、欠損組織を修復及び置換するのに既に活用されている（Salzberg CA. Nonexpansive immediate breast reconstruction usinghuman acellular tissue matrix graft (AlloDerm). Ann Plast Surg. 2006;57: 1-5.doi:10.1097/01.sap.0000214873.13102.9f、Lee DK. AchillesTendon Repair with Acellular Tissue
Graft Augmentation in Neglected Ruptures. J Foot Ankle Surg. 2007;46: 451-455.doi:10.1053/j.jfas.2007.05.007、Cornwell KG, Landsman A,James KS. Extracellular
Matrix Biomaterials for Soft Tissue Repair. Clin Podiatr Med Surg. 2009;26:507-523. doi:10.1016/j.cpm.2009.08.001）。過去数年間で、尿道、膣、耳、鼻、心臓、腎臓、膀胱、及び神経組織を含む多くの身体部位が、合成及び脱細胞化アプローチを使用して作製されている（OttHC, Matthiesen TS, Goh SK, Black LD, Kren SM, Netoff TI, et al.Perfusion-decellularized matrix: using nature’splatform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 2008;14: 213-21.doi:10.1038/nm1684、Mannoor MS, Jiang Z, James T, KongYL, Malatesta KA, Soboyejo WO, et al. 3D printed bionic ears. Nano Lett.American Chemical Society; 2013;13: 2634-9. doi:10.1021/nl4007744、Raya-Rivera AM, Esquiliano D, Fierro-Pastrana R, Lopez-Bayghen E,Valencia P, Ordorica-Flores R, et al. Tissue-engineered autologous vaginalorgans in patients:
a pilot cohort study. Lancet (London, England). Elsevier; 2014;384: 329-36.doi:10.1016/S0140-6736(14)60542-0、Ren X, Moser PT,Gilpin SE, Okamoto T, Wu T, Tapias LF, et al. Engineering pulmonary vasculaturein decellularized rat and human
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need reconstruction: an observational study. Lancet (London, England).2011;377: 1175-82. doi:10.1016/S0140-6736(10)62354-9、AtalaA, Bauer SB, Soker S, Yoo JJ, Retik AB. Tissue-engineered autologous bladdersfor patients needing cystoplasty. Lancet. 2006;367: 1241-6.doi:10.1016/S0140-6736(06)68438-9、Hattori N. Cerebralorganoids model human brain development and microcephaly. Mov Disord. NaturePublishing Group; 2014;29: 185-185. doi:10.1002/mds.25740）。
しかし、これらのアプローチはいくつかの不都合がないわけではない（Gottenbos B, BusscherHJ, Van Der Mei HC, Nieuwenhuis P. Pathogenesis and prevention of biomaterialcentered infections. J Mater Sci Mater Med. 2002;13: 717-722.doi:10.1023/A:1016175502756）。合成手法は動物産物を必要とすることがあり、脱細胞化戦略は依然
としてドナー組織及び臓器を必要とする。吸収性生体材料の開発も熱心に研究されている
（Bohner M. Resorbable biomaterials as bone graftsubstitutes. Mater Today. 2010;13: 24-30. doi:10.1016/S1369-7021(10)70014-6）。これらの場合、目的は、その上に
健康な組織が形成され得る一時的な３Ｄ足場を身体に提供することである。数週間又は数カ月後、移植された足場は、完全に天然の健康な組織を残して吸収されるであろう（Lemons JE, Lucas LC. Properties of biomaterials. J Arthroplasty.1986;1: 143-147. doi:10.1016/S0883-5403(86)80053-5、VacantiJP, Lal B, Grad O, Darling EM, Hu JC, Wiesmann HP, et al. Special section.2012;338: 921-926、Ratner BD, Hoffman AS, Schoen FJ,Lemons JE. Biomaterials science: an introduction to materials in medicine. ChemicalEngineering. 2004、Bae H, Puranik AS, Gauvin R, EdalatF, Peppas NA, Khademhosseini A. Building Vascular Networks. 2012;4: 1-6）。これは魅力的なアプローチであるが、多くの非吸収性生体材料（セラミック、チタン）が、臨床の場で使用するに成功しており、数々の療法において重要な役割を果たしている（Pashuck ET, Stevens MM. STATE OF THE ART REVIEW Designing Regenerative Biomaterial Therapies for the Clinic. Sci Transl Med. 2012;4、Bohner M. Resorbable biomaterials as bone graft substitutes. Mater Today. 2010;13: 24-30.doi:10.1016/S1369-7021(10)70014-6、Dong W, Hou L, Li T,Gong Z, Huang H, Wang G, et al. A Dual Role of Graphene Oxide Sheet Depositionon Titanate Nanowire Scaffolds for Osteo-implantation: Mechanical Hardener andSurface Activity Regulator. Sci Rep. Nature Publishing Group; 2015;5:18266.doi:10.1038/srep18266、Zhou L, Pomerantseva I, BassettEK, Bowley CM, Zhao X, Bichara D a, et al. Engineering ear constructs with acomposite scaffold to maintain dimensions. Tissue Eng Part A. 2011;17:1573-1581. doi:10.1089/ten.tea.2010.0627、Temenoff JS,Mikos AG. Injectable biodegradable materials for orthopedic tissue engineering. Biomaterials. 2000;21: 2405-2412.doi:10.1016/S0142-9612(00)00108-3、Comprehensive Biomaterials: Online Version, Volume 1 [Internet]. Newnes; 2011. Available:https://books.google.com/books?id=oa8YpRsD1kkC&pgis=1、Bao G, Suresh S. Cell and molecular mechanics of biological materials.
Nat Mater. 2003;2: 715-25. doi:10.1038/nmat1001、Place ES, Evans ND, Stevens MM. Complexity in biomaterials for tissue engineering.Nat Mater. Nature Publishing Group; 2009;8: 457-470. doi:10.1038/nmat2441）。重要なことに、吸収性生体材料は、再生された組織がしばしば崩壊し、構造の喪失により変形するようになるという事実に悩まされている（Pomerantseva I, Bichara DA, Tseng A, Cronce MJ, Cervantes TM, Kimura AM, et al. Ear-Shaped Stable Auricular Cartilage Engineered from Extensively Expanded Chondrocytes in an Immunocompetent Experimental Animal Model. Tissue Eng Part A. 2015;00: ten.tea.2015.0173. doi:10.1089/ten.tea.2015.0173、Xu J-W, Johnson TS, Motarjem PM, Peretti GM, Randolph MA, Yaremchuk MJ. Tissue-engineered
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び臓器工学の分野で根強く残っている。
最近の補完的アプローチは、セルロースの様々な形態を含む、ヒト臓器ドナー又は動物産物に由来しない足場材料を活用している（Pertile RAN, Moreira S, Gil RM, Correia A, Guardao L. Bacterial Cellulose : Long-Term Biocompatibility Studies. J Biomater Sci Polym Ed.2012;23: 1339-1354、Entcheva E, Bien H, Yin L, Chung CY,Farrell M, Kostov Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 2004;25: 5753-62.doi:10.1016/j.biomaterials.2004.01.024、Ishihara K,Miyazaki H, Kurosaki T, Nakabayashi N. Improvement of blood compatibility on cellulose dialysis membrane. 111. Synthesis and performance of water-soluble cellulose grafted with phospholipid polymer as coating material on cellulose dialysis membrane. J Biomed Mater Res. 1995;29: 181-188、Backdahl H, Helenius G, Bodin A, Nannmark U, Johansson BR, Risberg B, et al. Mechanical properties of bacterial cellulose and interactions with smooth muscle cells. Biomaterials. 2006;27: 2141-9.doi:10.1016/j.biomaterials.2005.10.026、Svensson a,Nicklasson E, Harrah T, Panilaitis B, Kaplan DL, Brittberg M, et al. Bacterial cellulose as a potential scaffold for tissue engineering of cartilage.Biomaterials. 2005;26: 419-31. doi:10.1016/j.biomaterials.2004.02.049、Helenius G, Backdahl H, Bodin A, Nannmark U, Gatenholm P, Risberg B.In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. J Biomed Mater Res Part A.2006;76A: 431-438. doi:10.1002/jbm.a.30570、Tischer PCSF, Sierakowski MR, Westfahl H, Tischer CA. Nanostructural reorganization of bacterial cellulose by ultrasonic treatment. Biomacromolecules. 2010;11:1217-24. doi:10.1021/bm901383a、Klemm D, Schumann D,Udhardt U, Marsch S. Bacterial synthesized cellulose artificial blood vessels for microsurgery. Prog Polym Sci. 2001;26: 1561-1603、Klemm D, Heublein B, Fink HP, Bohn A. Cellulose: fascinating biopolymer andsustainable raw material. Angew Chem Int Ed Engl. 2005;44: 3358-93.doi:10.1002/anie.200460587、Ishihara K, Nakabayashi N,Fukumoto K AJ. Improvement of blood compatibility on cellulose dialysismembrane. Biomaterials. 1992;13: 145-149、Gibson LJ. Thehierarchical structure and mechanics of plant materials. J R Soc Interface.2012;9: 2749-2766. doi:10.1098/rsif.2012.0341、Derda R,Laromaine A, Mammoto A, Tang SKY, Mammoto T, Ingber DE, et al. Paper-supported3D cell culture for tissue-based bioassays. PNAS. 2009;106: 18457-62.doi:10.1073/pnas.0910666106）。ナノ結晶、ナノファイバー及び細菌セルロースコンストラクト及びヒドロゲルも研究されている（Bhattacharya M, Malinen MM, Lauren P, Lou Y-RR, Kuisma SW, Kanninen L, et al. Nanofibrillar cellulose hydrogel promotesthree-dimensional liver cell culture. J Control Release. Elsevier B.V.;2012;164: 291-298. doi:10.1016/j.jconrel.2012.06.039、BrownEE, Hu D, Abu Lail N, Zhang X. Potential of Nanocrystalline Cellulose-FibrinNanocomposites for Artificial Vascular Graft Applications. Biomacromolecules.American Chemical Society; 2013;14: 1063-1071. doi:10.1021/bm3019467、Dugan JM, Collins RF, Gough JE, Eichhorn SJ. Oriented sur
faces of adsorbed cellulose nanowhiskers promote skeletal muscle myogenesis.Acta Biomater. 2013;9: 4707-15. doi:10.1016/j.actbio.2012.08.050、Lin N, Dufresne A. Nanocellulose in biomedicine: Current status andfuture prospect. Eur Polym J.
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臓器脱細胞化及び合成セルロース戦略に対する直交性の、けれども補完的なアプローチも調査されている。これらの予備的インビトロ試験は、脱細胞化リンゴ花托筒組織由来のセルロース生体材料を調査した（Modulevsky DJ, Lefebvre C, Haase K, Al-Rekabi Z, Pelling AE. AppleDerived Cellulose Scaffolds for 3D Mammalian Cell Culture. Kerkis I, editor.PLoS One. 2014;9: e97835. doi:10.1371/journal.pone.0097835）。
インビボでの生体適合性、代替的生体材料、及び生体材料産生のさらなる方法の課題が残っている。全体として、代替となる追加の、及び／又は改善された生体材料、その産生方法、及び／又はその使用の必要性が業界に残っている。
Saini M. Implant biomaterials: Acomprehensive review. WorldJ Clin Cases. 2015;3: 52. doi:10.12998/wjcc.v3.i1.52 Pashuck ET, Stevens MM. STATE OF THE ARTREVIEW Designing Regenerative Biomaterial Therapies for the Clinic. Sci TranslMed. 2012;4 Athanasiou KA, Reddi AH, Guldberg RE, RevellCM. Special section. 2012;338: 921-927 Kar M, Vernon Shih Y-R, Velez DO, Cabrales P,Varghese S. Poly(ethylene glycol) hydrogels with cell cleavable groups forautonomous cell delivery. Biomaterials. 2016;77: 186-97.doi:10.1016/j.biomaterials.2015.11.018 Gu L, Mooney DJ. Biomaterials and emerginganticancer therapeutics: engineering the microenvironment. Nat Rev Cancer.Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All RightsReserved.; 2015;16: 56-66. doi:10.1038/nrc.2015.3 Maurer M, Rohrnbauer B, Feola A, Deprest J,Mazza E. Prosthetic Meshes for Repair of Hernia and Pelvic Organ Prolapse:Comparison of Biomechanical Properties. Materials (Basel). 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したがって、外科、臨床、治療、美容、開発、及び／又は他の適切な用途を含み得るが、これらに限定されない様々な用途で足場又は移植片として使用することができる生体材料を提供することが、本発明の目的である。
したがって、特定の実施形態において、植物又は真菌種から生成される生体材料が、本
明細書に提供される。生体材料は、例えば、（ｉ）構造物（すなわち、植物若しくは真菌の他の部分、又は生細胞）、薬物、又は人工構造物（再吸収性又は非吸収性材料）の追加；（ii）異なる用途に適するように元の産物の形状又は配合を変更するための、機械的又は化学的手順によるその構造の変更；（iii）細胞接着、又は増殖因子などの細胞科学の
任意の他の有益な要素を修飾するための、元の足場産物（コラーゲン、フィブロネクチン又は任意の他の基質など）へのマトリックスの追加により修飾することができる。
生体材料、調製プロセス及び潜在的使用が、以下により詳細に記載される。特定の実施形態において、生体材料は、比較的低コストとなり得、並びに／又は比較的効率の良い及び／若しくは時間短縮された産生手順を使用し得る。また、機能的足場としての複合体構造を使用することにより、複合体構造を産生するのに幅広い可能性が利用可能となり得る。生体材料は、形状を維持する能力を有することができ、比較的最小限のフットプリントを有し得（すなわち、足場は血管新生前及び／又は後でほぼ不可視となり得る）、高度に生体適合性であり得、迅速な血管形成を誘導し得、及び／又は最小限の免疫原性応答を引き起こす、若しくは免疫原性応答がほとんど存在しない可能性がある。
特定の実施形態において、生体材料は、植物又は真菌に由来してもよく、したがって比較的低い環境影響を示し得、並びに／又は有機的及び／若しくは生分解性と見なされ得る。生体材料は、特定の例において食品廃棄物から産生されてもよく、したがって、廃棄された産物の代替経路を提供し得る。
一実施形態において、組織の細胞物質及び核酸が除去された、脱細胞化された植物又は真菌組織であって、セルロース又はキチンベースの多孔質構造を含む前記脱細胞化された植物又は真菌組織を含む足場生体材料が、本明細書に提供される。
別の実施形態において、組織の細胞物質及び核酸が除去された、脱細胞化された植物又は真菌組織であって、セルロース又はキチンベースの三次元多孔質構造を含む前記脱細胞化された植物又は真菌組織を含む足場生体材料が、本明細書に提供される。
上記の足場生体材料の一実施形態において、脱細胞化された植物又は真菌組織は、熱ショック、界面活性剤による処理、浸透圧ショック、凍結乾燥、物理的溶解、電気的破壊、若しくは酵素消化、又はそれらの任意の組合せにより脱細胞化されている植物又は真菌組織を含んでもよい。
上記の足場材料（material or materials）の別の実施形態において、脱細胞化された
植物又は真菌組織は、界面活性剤又は表面活性物質による処理により脱細胞化されている植物又は真菌組織を含んでもよい。特定の実施形態において、界面活性剤の例には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ、ＥＤＡ、アルカリ処理、酸、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、若しくは双性イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せが含まれ得るが、これらに限定されない。
上記の足場材料（material or materials）の別の実施形態において、脱細胞化された
植物又は真菌組織は、ＳＤＳによる処理により脱細胞化されている植物又は真菌組織を含んでもよい。
上記の足場材料（material or materials）のさらに別の実施形態において、残留ＳＤ
Ｓは、二価塩水溶液による洗浄により、脱細胞化された植物又は真菌組織から除去されてもよい。
上記の足場材料（material or materials）のさらに別の実施形態において、残留ＳＤ
Ｓは、ＳＤＳミセルを含有する塩残留物を溶液／足場から沈殿／崩壊させる二価塩水溶液を使用して除去されていてもよく、ｄＨ２Ｏ、酢酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、又は超音波処理が、塩残留物及び／又はＳＤＳミセルを除去するのに使用されていてもよい。
上記の足場材料（material or materials）のさらに別の実施形態において、二価塩水
溶液の二価塩は、ＭｇＣｌ２又はＣａＣｌ２を含んでもよい。
上記の足場材料（material or materials）の別の実施形態において、植物又は真菌組
織は、水、エタノール、又は別の適切な有機溶媒などの溶媒中、０．０１〜１０％、例えば約０．１％〜約１％、又は例えば、約０．１％ＳＤＳ若しくは約１％ＳＤＳのＳＤＳ溶液による処理により脱細胞化されていてもよく、及び残留ＳＤＳは、約１００ｍＭの濃度のＣａＣｌ２水溶液の使用と、その後のｄＨ２Ｏ中でのインキュベーションとで除去されていてもよい。
特定の実施形態において、ＳＤＳ溶液は０．１％より高い濃度であってもよい。該濃度は、脱細胞化を促進することができ、残留ＳＤＳを除去するための洗浄の増加を伴う可能性がある。
上記の足場材料（material or materials）のさらに別の実施形態において、脱細胞化
された植物又は真菌組織は、官能基化された足場生体材料を提供するために、アシル化、アルキル化、又は他の共有結合修飾により少なくともいくつかの遊離ヒドロキシル官能基で官能基化されてもよい。
上記の足場材料（material or materials）の別の実施形態において、脱細胞化された
植物又は真菌組織は、さらなる構造及び／若しくは微小構造を導入するために処理されてもよく、並びに／又は官能基化された足場生体材料を提供するために、アシル化、アルキル化、若しくは他の共有結合修飾により少なくともいくつかの遊離ヒドロキシル官能基で官能基化されてもよい。
上記の足場材料（material or materials）の別の実施形態において、脱細胞化された
植物又は真菌組織は、マイクロチャネルを導入するために処理されてもよく、及び／又は例えばコラーゲン、細胞特異性促進因子、細胞増殖因子、若しくは薬剤により官能基化されてもよい。
上記の足場材料（material or materials）の別の実施形態において、脱細胞化された
植物又は真菌組織は、コラーゲンにより官能基化されてもよい。
上記の足場材料（material or materials）のさらに別の実施形態において、植物又は
真菌組織は、リンゴ花托筒（セイヨウリンゴ（Malus pumila））組織、シダ（シダ類（Monilophytes））組織、カブ（ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa））根組織、イチョウ枝
組織、ツクシ（トクサ（equisetum））組織、ワスレグサ属（hermocallis）交配葉組織、ケール（ブラッシカ・オレラセア（Brassicaoleracea））茎組織、針葉樹アメリカトガ
サワラ（ベイマツ（Pseudotsuga menziesii））組織、サボテンの実（ピタヤ）の果肉組
織、マキュラータビンカ（Maculata Vinca）組織、水生ハス（ハス（Nelumbo nucifera））組織、チューリップ（チューリッパ・ゲスネリアーナ（Tulipagesneriana））花弁組
織、プランテン（バナナ（Musa paradisiaca））組織、ブロッコリー（ブラッシカ・オレラセア）茎組織、カエデの葉（セイヨウカジカエデ（Acer psuedoplatanus））の茎組織
、ビート（テンサイ（Beta vulgaris））一次根組織、ネギ（タマネギ（Allium cepa））組織、ラン（ラン科（Orchidaceae））組織、カブ（ブラッシカ・ラパ）茎組織、リーキ
（アリウム・アンペロプラスム（Allium ampeloprasum））組織、カエデ（カエデ属（Acer））の木の枝組織、セロリ（アピウム・グラベオレンス（Apiumgraveolens））組織、
ネギ（タマネギ）茎組織、マツ組織、アロエ・ベラ組織、スイカ（シトルラス・ラナタス変種ラナタス（Citrulluslanatus var. lanatus））組織、クリーピングジェニー（コバンコナスビ（Lysimachianummularia））組織、サボテン（cactae）組織、リクニス・ア
ルピナ（Lychnis Alpina）組織、ルバーブ（レウム・ラバルバルム（Rheum rhabarbarum
））組織、カボチャ果肉（ペポカボチャ（Cucurbita pepo））組織、ドラセナ（キジカクシ科（Asparagaceae））茎組織、ムラサキツユクサ（オオムラサキツユクサ（Tradescantiavirginiana））茎組織、アスパラガス（アスパラガス・オフィシナリス（Asparagusofficinalis））茎組織、キノコ（真菌）組織、フェンネル（ウイキョウ（Foeniculumvulgare））組織、バラ（バラ属（Rosa））組織、ニンジン（ダウクス・カロタ（Daucus carota））組織、又はセイヨウナシ（仁果類（Pomaceous））組織を含んでもよい。
特定の実施形態において、植物又は真菌組織は、組織を物理的に模倣し、及び／又は標的組織効果を機能的に促進するように構成された追加の植物又は真菌構造を作製するために、直接ゲノム修飾及び／又は選抜育種により調製された遺伝子改変組織を含んでもよい。本明細書の教示を考慮する当業者は、特定の用途に適するように適切な足場生体材料を選択することができるであろう。
上記の足場材料（material or materials）の別の実施形態において、足場生体材料は
、セルロース又はキチンベースの三次元多孔質構造に接着された動物生細胞をさらに含んでもよい。別の実施形態において、動物生細胞は哺乳動物細胞であってもよい。さらに別の実施形態において、動物生細胞はヒト細胞であってもよい。
別の実施形態において、組織の細胞物質及び核酸が除去された、脱細胞化された植物又は真菌組織であって、セルロース又はキチンベースの三次元多孔質構造を含む前記脱細胞化された植物又は真菌組織を調製する方法であって、
所定のサイズ及び形状を有する植物又は真菌組織を提供するステップと、
熱ショック、界面活性剤による処理、浸透圧ショック、凍結乾燥、物理的溶解、電気的破壊、若しくは酵素消化、又はそれらの任意の組合せにより前記植物又は真菌組織を脱細胞化するステップと、
それにより植物又は真菌組織から細胞物質及び核酸を除去して、セルロース又はキチンベースの三次元多孔質構造を含む脱細胞化された植物又は真菌組織を形成するステップと
を含む前記方法が、本明細書に提供される。
上記の方法の別の実施形態において、脱細胞化するステップは、界面活性剤又は表面活性物質による植物又は真菌組織の処理を含んでもよい。特定の実施形態において、界面活性剤の例には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ、ＥＤＡ、アルカリ処理、酸、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、若しくは双性イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せが含まれ得るが、これらに限定されない。特定の実施形態において、脱細胞化するステップは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）による植物又は真菌組織の処理を含んでもよい。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、脱細胞化された植物又は
真菌組織は、界面活性剤による処理により脱細胞化されている植物又は真菌組織を含んでもよい。界面活性剤の例には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ、ＥＤＡ、アルカリ処理、酸、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せが含まれ得るが、これらに限定されない。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、脱細胞化された植物又は
真菌組織は、ＳＤＳによる処理により脱細胞化されている植物又は真菌組織を含んでもよい。
上記の方法（method or methods）のさらに別の実施形態において、残留ＳＤＳは、二
価塩水溶液による洗浄により、脱細胞化された植物又は真菌組織から除去されてもよい。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、残留ＳＤＳは、ＳＤＳミ
セルを含有する塩残留物を溶液／足場から沈殿／崩壊させる二価塩水溶液を使用して除去されていてもよく、ｄＨ２Ｏ、酢酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、又は超音波処理が、塩残留物及び／又はＳＤＳミセルを除去するのに使用されてもよい。別の実施形態において、二価塩水溶液の二価塩は、ＭｇＣｌ２又はＣａＣｌ２を含んでもよい。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、植物又は真菌組織は、水
、エタノール、又は別の適切な有機溶媒などの溶媒中、０．０１〜１０％、例えば約０．１％〜約１％、又は例えば、約０．１％ＳＤＳ若しくは約１％ＳＤＳのＳＤＳ溶液による処理により脱細胞化されていてもよく、及び残留ＳＤＳは、約１００ｍＭの濃度のＣａＣｌ２水溶液の使用と、その後のｄＨ２Ｏ中でのインキュベーションとで除去されていてもよい。
特定の実施形態において、ＳＤＳ溶液は０．１％より高い濃度であってもよい。該濃度は、脱細胞化を促進することができ、残留ＳＤＳを除去するための洗浄の増加を伴う可能性がある。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、脱細胞化するステップは
、水中約０．１％ＳＤＳのＳＤＳ溶液による処理を含んでもよく、残留ＳＤＳは、約１００ｍＭの濃度のＣａＣｌ２水溶液の使用と、その後のｄＨ２Ｏ中でのインキュベーションとで脱細胞化後に除去されてもよい。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、方法は、アシル化、アル
キル化、若しくは他の共有結合修飾により、脱細胞化された植物又は真菌組織の少なくともいくつかの遊離ヒドロキシル官能基を官能基化するステップをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、脱細胞化された植物又は真菌組織のヒドロキシル官能基は、コラーゲンにより官能基化されてもよい。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、方法は、脱細胞化された
植物又は真菌組織を処理してさらなる構造及び／若しくは微小構造を導入するステップ、並びに／又はアシル化、アルキル化、若しくは他の共有結合修飾により、脱細胞化された植物若しくは真菌組織の少なくともいくつかの遊離ヒドロキシル官能基を官能基化するステップをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、脱細胞化された植物又は真菌組織は、マイクロチャネルを導入するために処理されてもよく、及び／又は脱細胞化された植物若しくは真菌組織のヒドロキシル官能基は、例えばコラーゲン、細胞特異性促進因子、細胞増殖因子、若しくは薬剤により官能基化されてもよい。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、方法は、セルロース又は
キチンベースの三次元多孔質構造に動物生細胞を導入するステップと、動物生細胞をセルロース又はキチンベースの三次元多孔質構造に接着させるステップとをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、動物生細胞は哺乳動物細胞であってもよい。特定の実施形態において、動物生細胞はヒト細胞であってもよい。
別の実施形態において、上記の方法のいずれかにより調製された、脱細胞化された植物
又は真菌組織を含む足場生体材料が、本明細書に提供される。
別の実施形態において、動物細胞増殖のサポート、組織再生の促進、血管新生の促進、組織置換術のための移植可能な足場としての、又は美容外科手術用の構造移植片としての、上記の足場生体材料のうちのいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態において、脊髄損傷後の修復又は再生のための構造移植片としての、上記の足場生体材料のうちのいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態において、組織置換手術及び／又は手術後の組織再生のための構造移植片としての、上記の足場生体材料のうちのいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態において、皮膚移植及び／又は皮膚再生手術用の構造移植片としての、上記の足場生体材料のうちのいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態において、標的組織又は領域における血管構造の再生のための構造移植片としての、上記の足場生体材料のうちのいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態において、骨置換、骨充填、若しくは骨移植材として、及び／又は骨の再生を促進するための、上記の足場生体材料のうちのいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態において、皮膚、骨、脊髄、心臓、筋肉、神経、血管、又は他の損傷若しくは奇形組織の組織置換物としての、上記の足場生体材料のうちのいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態において、硝子体液代替物としての、ヒドロゲル形態の上記の足場生体材料のうちのいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態において、足場生体材料が、ヒドロゲル形態の足場生体材料を含有する嚢様構造を形成する、人工嚢としての上記の足場生体材料のうちのいずれかの使用が、本明細書に提供される。
別の実施形態において、美容外科手術用の構造移植片としての上記の足場生体材料のうちのいずれかの使用が、本明細書に提供される。
上記の使用（use or uses）のいずれかのさらに別の実施形態において、足場生体材料
は、足場生体材料の脱細胞化された植物又は真菌組織が対象の組織を物理的に模倣し、及び／又は対象における標的組織効果を機能的に促進するように構成された足場生体材料であってもよい。
別の実施形態において、それを必要とする対象における動物細胞増殖のサポート、組織再生の促進、血管新生の促進、組織の置換、血管新生の促進、又は美容外科手術における構造的足場の提供のための方法であって、
上記に記載された足場生体材料のうちのいずれかによる足場生体材料を提供するステップと、
足場生体材料を対象に移植するステップと
を含む前記方法が、本明細書に提供される。
上記の方法の別の実施形態において、足場生体材料は脊髄で移植されてもよく、脊髄損
傷後の修復又は再生を促進する。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、足場生体材料は、対象に
おける組織置換及び／又は組織再生のための構造移植片を提供してもよい。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、足場生体材料は、対象に
おける皮膚移植及び／又は皮膚再生のための構造移植片を提供してもよい。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、足場生体材料は、標的組
織若しくは領域又は対象における血管構造の再生のための構造移植片を提供してもよい。
上記の方法（method or methods）のさらに別の実施形態において、足場生体材料は、
対象において、骨置換、骨充填、若しくは骨移植材を提供してもよく、及び／又は骨の再生を促進してもよい。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、足場生体材料は、対象に
おける皮膚、骨、脊髄、心臓、筋肉、神経、血管、又は他の損傷若しくは奇形組織の組織置換物を提供してもよい。
上記の方法（method or methods）のさらに別の実施形態において、ヒドロゲル形態の
足場生体材料は、対象における硝子体液代替物を提供してもよい。
上記の方法（method or methods）のさらに別の実施形態において、足場生体材料は、
ヒドロゲル形態の足場生体材料を含有する嚢様構造を形成する、対象における人工嚢を提供してもよい。
上記の方法（method or methods）のさらに別の実施形態において、足場生体材料は、
美容外科手術用の構造移植片を提供してもよい。
上記の方法（method or methods）のさらに別の実施形態において、足場生体材料を提
供するステップは、
足場生体材料の脱細胞化された植物又は真菌組織が対象の組織を物理的に模倣し、及び／又は対象における標的組織効果を機能的に促進するように構成された、上記に記載された足場生体材料を選択するステップ
をさらに含んでもよい。
別の実施形態において、上記に記載された足場生体材料と、上記に記載された外科又は美容方法を行うための容器又は使用説明書の少なくとも１つとを含むキットが、本明細書に提供される。特定の実施形態において、キットは手術キットであってもよい。
別の実施形態において、ＳＤＳ溶液、ＣａＣｌ２溶液、又はＰＢＳ溶液の１又は２以上を含み、上記に記載された脱細胞化された植物又は真菌組織を調製する方法を行うための使用説明書をさらに含んでいてもよいキットが、本明細書に提供される。
これら及び他の特性は、以下の図が参照される以下の記載からさらに明らかになる。
脱細胞化セルロース足場を示す図である。Ａ）脱細胞化リンゴ組織試料中のセルロース細胞壁構造の位相差像（光学顕微鏡技術）。濃い線は、三次元マトリクスを形成する特徴的なセルロース構造に対応する。重なり合っている濃い構造は、脱細胞化足場の３Ｄ多孔質構造を明らかにしている。Ｂ）類似するセルロース足場のＳＥＭ画像は、その三次元的性質及び大きな空洞を明らかにし、足場を形成している内部のポケットの様々な深さを明らかにしている。スケールバー＝２００μｍ； セルロース足場の様々な構造及び起源を示す図である。これらの新たな足場は、脱細胞化プロセスを使用することによって植物（例：リンゴ、アスパラガス、フェンネル）及び真菌（例：白色キノコ）から得られる； マウスモデル（インビボ）でのリンゴ足場移植を示す図である。２つのセルロース足場（５ｘ５ｘ１ｍｍ）はＣ５７ＢＬ／１０マウスの背部セクションに皮下移植された。次いで、背部皮膚は注意深く切除され、手術後１週間（Ａ）及び４週間（Ｂ）に１０％ホルマリン溶液中で固定された。移植片の組織学的分析はヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ａ、haematoxylin and eosin）染色を使用して実行され、各移植片は分析された。１週間後、細胞浸潤を見ることができ、機能的血管（血管新生）の存在を伴う十分な浸潤に４週間後に達する； 足場フットプリント並びに十分な細胞浸潤及び血管新生を示す図である（インビボ）。Ａ）リンゴ由来足場の高多孔性及び薄壁構造（１００ｎｍ未満）は、手術後１週間の移植片の中央で撮られたこの写真において容易に観察できる。Ｂ）移植後４週間以内の十分な細胞浸潤及び機能的血管形成を伴う血管新生。セルロース足場は目に見えず、観察を可能にするために特異的セルロース染色が必要である； ３Ｄセルロース足場内で培養された細胞アクチン細胞骨格の固定及び染色画像並びにＳＥＭの優れた画像を示す図である。Ａ）NIH3T3、Ｂ）C2C12及びＣ）HeLa細胞はアクチン（緑）及び細胞核（青）についての染色前にセルロース足場上で２週間培養された。ガラス上又は足場内で培養した哺乳動物細胞のアクチン細胞骨格及び核は、先のプロトコル（Guolla, Bertrand, Haase, & Pelling, 2012; Modulevsky, Tremblay,Gullekson, Bukoresthliev, & Pelling, 2012）に従って染色された。簡潔には、試料は３．５％パラホルムアルデヒドを用いて固定され、Triton X-100を用いて３７℃で透過処理された。アクチンはAlexa Fluor 488（Invitrogen社）にコンジュゲートしたファロイジンを用いて染色され、核をDAPI（Invitrogen社）を用いてＤＮＡを標識することによって染色された。次いで試料はVecta- shield（Vector Labs社）にマウントされた。NIH3T3及びC2C12細胞は、培養細胞において見出される特徴的なアクチンストレス線維を示している。HeLa細胞も、あまり顕著でないストレス線維及び多量の皮質アクチン局在化を含んで特徴的なアクチン構造を示している。ストレス線維の存在は、哺乳動物細胞が細胞壁足場の表面に接着し、インビボで存在していることを実証している。スケールバー＝２５μｍ、すべてに適用。Ｄ）及びＥ）は、セルロース足場上の細胞接着を明らかにするための優れた細胞着色処置を用いたＳＥＭ画像である； 植物及び菌界において見出される細胞壁構造を示す図である。セルロース足場のこれらの例は、その移植後４週間に動物から切除され、ヘマトキシリン／エオシン染色を用いて染色された。この図は、細胞壁構造及び、生体材料の選択を導くことができる組織機能との関連を示す。植物及び真菌界において見出される細胞壁構造は、骨、皮膚及び神経などの組織と類似し得る多種多様な構造を示す。標的となる組織に応じて、生体材料の植物供給源の決定は、植物の物理的及び化学的特徴に基づくことができる； 移植後１、４及び８週間に細胞浸潤を示す組織学的結果の例を示す図である（ヘマトキシリン／エオシン染色）； Ａ）セルロース生体材料（白）内部のコラーゲン沈着（青）及び血管（赤い細胞は赤血球である）の観察を示す図である。Ｂ）グラフは、足場の血管新生促進特性の定量的表示を示している（移植後４週間以内の機能的血管の観察）； 移植後時間の関数としてのセルロース足場の非吸収性特徴を示す図である； 塩化カルシウム洗浄を使用することによる細胞付着及び増殖の改善を示す図である； セルロース足場調製を示す図である。新鮮切断リンゴ花托筒組織（Ａ）及び、脱細胞化後、すべての天然リンゴ細胞又は細胞デブリ非存在での半透明セルロース足場生体材料（Ｂ）の肉眼的外観。脱細胞化セルロース足場の横断面のＨ＆Ｅ染色（Ｃ）。脱細胞化後の細胞壁厚及び天然リンゴ細胞の非存在が示されている。３Ｄ無細胞性及び高多孔性セルロース足場構造が走査型電子顕微鏡によってはっきり明らかにされている（Ｄ）。スケールバー：Ａ〜Ｂ＝２ｍｍ、Ｃ〜Ｄ＝１００μｍ； セルロース足場移植及び切除を示す図である。セルロース足場生体材料の皮下移植は、小さな皮膚切開（８ｍｍ）によってC57BL/10ScSnJマウスモデルの背部領域に実施された（Ａ）。各移植片は、足場面積比較のためにその移植前に測定された（Ｂ）。セルロース足場は、手術後１週間（Ｄ）、４週間（Ｅ）及び８週間（Ｆ）で切除され、肉眼写真を撮られた（対照皮膚はＣ）。経時的なセルロース足場表面積における変化が示されている（Ｇ）。移植前の足場は、２６．３０±１．９８ｍｍ２の面積を有した。移植後、足場の面積は、１週間後に２０．７４±１．８０ｍｍ２、４週間後に１６．４１±２．４４ｍｍ２及び８週間後に１３．８２±３．８８ｍｍ２に低下した。セルロース足場の表面積は、移植８週間後に約１２ｍｍ２（４８％）顕著に減少した（＊＝Ｐ＜０．００１；ｎ＝１２〜１４）； 生体適合性及び細胞浸潤を示す図である。Ｈ＆Ｅ及び抗ＣＤ４５を用いて染色した代表的なセルロース足場の横断面。これらの全体像は、１週間での急性の中程度から重度の予測された異物反応（Ａ）、４週間での軽度の慢性免疫及び続く浄化プロセス（Ｂ）並びに最終的な、８週間での天然マウス組織へのセルロース足場の同化（Ｃ）を示している。所望の領域のさらに高度な拡大図（Ｄ〜Ｆ）は、生体材料同化プロセス内でのすべての細胞型集団の観察を可能にしている。１週間では、急性の中程度から重度の免疫応答を特徴付ける顆粒球、詳細には；多形核（ＰＭＮ、polymorphonuclear）及び好酸球の集団、移植手順への正常な反応が観察される（Ｄ）。４週間では、免疫応答の減少が観察でき（軽度から低い免疫応答）、足場周囲の表皮内の細胞の集団は、ここで、より高いレベルの単球及びリンパ球を含有し、慢性応答を特徴付けている（Ｅ）。最終的に、８週間で、免疫応答は、表皮組織に完全に再吸収され、ここで正常であると考えられる。Ｈ＆Ｅ染色を用いて観察された免疫応答は、白血球の周知のマーカー、抗ＣＤ４５抗体を使用して確認される（Ｇ〜Ｉ）。足場内の細胞の集団は、ここで主にマクロファージ、多核細胞及び活性線維芽細胞である。スケールバー：Ａ〜Ｃ＝１ｍｍ、Ｄ〜Ｆ＝１００μｍ及びＧ〜Ｉ＝５００μｍ； 細胞外マトリクス沈着を示す図である。マッソントリクロームを用いて染色した代表的なセルロース足場の横断面（Ａ〜Ｃ）。移植後１週間後、（Ａ）の所望の領域の拡大図は、コラーゲン足場内のコラーゲン構造の欠如を示している（Ｄ、Ｇ）。線維芽細胞が足場に侵入し始めることから、セルロース足場内のコラーゲン沈着は４週間後にまばらに観察できる（Ｅ、Ｈ）。セルロース足場内の活性化線維芽細胞（紡錘状細胞）の観察と一致して、コラーゲンネットワークは、８週間後に空洞内に明らかに見ることができる（Ｆ、Ｉ）。スケールバー：Ａ〜Ｃ＝１ｍｍ、Ｄ〜Ｆ＝１００μｍ及びＧ〜Ｉ＝２０μｍ。＊＝コラーゲン繊維；黒色矢印＝セルロース細胞壁；白色矢印＝線維芽細胞； 血管形成及び血管新生を示す図である。セルロース足場近くの周囲の組織の血管の肉眼での直接観察（Ａ）。Ｈ＆Ｅ染色（Ｂ）及びマッソントリクローム染色（Ｃ）の顕微鏡写真における複数の血管横断面の観察によるセルロース足場内の血管新生の確認。血管新生工程は、セルロース足場内の内皮細胞を同定するための抗ＣＤ３１染色を用いても確認された（Ｄ）。スケールバー：Ａ＝１ｍｍ、Ｂ＝５０μｍ及びＣ〜Ｄ＝２０μｍ。白色矢印＝血管； 天然３Ｄセルロース足場上で培養した、固定及び染色NIH3T3、C2C12及びHeLa細胞を示す図である。天然未修飾セルロース足場内での（Ａ）NIH3T3、（Ｂ）C2C12及び（Ｃ）HeLa哺乳動物細胞の特異的蛍光染色。哺乳動物細胞及び天然セルロース細胞壁は、標的特異的蛍光染色を用いて染色され、セルロース構造（赤）、哺乳動物細胞膜（緑）及び核（青）を明らかにしている。細胞は、染色及び画像化の前に脱細胞化セルロース足場内で４週間培養された。セルロース足場及び哺乳動物細胞を同時に染色するために、本発明者らは、上に記載のとおり試料を最初に固定し、次いで４週間培養した試料をＰＢＳを用いて３回洗浄した。細胞壁を標識するために、確立されたプロトコル（Truernit & Haseloff, 2008）が使用された。試料は水を用いてリンスされ、１％過ヨウ素酸（Sigma-Aldrich社）中、室温で、４０分間インキュベートされた。組織は水を用いて再度リンスされ、１００ｍｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（Invitrogen社）を含むSchiff試薬（１００ｍＭメタビスルファイトナトリウム及び０．１５Ｎ ＨＣｌ）中で２時間インキュベートされた。次いで試料はＰＢＳを用いて洗浄された。植物組織内の哺乳動物細胞を可視化するために、試料はＨＢＳＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１２０ｍＭ ＮａＣｌ；５．３ｍＭ ＫＣｌ；０．８ｍＭ ＭｇＳＯ４；１．８ｍＭ ＣａＣｌ２；及び１１．１ｍＭブドウ糖）中の５ｍｇ／ｍＬコムギ胚アグルチニン（ＷＧＡ、wheat germ agglutinin）488（Invitrogen社）及び１ｍｇ／ｍＬ Hoechst 33342（Invitrogen社）の溶液と共にインキュベートされた。ＷＧＡ及びHoechst 33342は、それぞれ哺乳動物細胞膜及び核を標識する生細胞色素である。次いで細胞壁足場は、顕微鏡スライドに移され、抱水クロラール溶液（４ｇ抱水クロラール、１ｍＬグリセロール及び２ｍＬ水）にマウントされた。スライドは、脱水を防ぐために閉環境において、室温で一晩保たれた。次いで試料は画像化の準備までＰＢＳ中に置かれた。明らかに哺乳動物細胞は、生体材料の表面全体に分布している。詳細には哺乳動物細胞は、細胞壁空洞内のコロニーにおける増殖が観察される。直交図（ＺＹ平面）は、生体材料内の哺乳動物細胞貫入の深度を示している。緑（細胞膜）及び青（核）が生体材料内深くに見られ、顕微鏡の画像化貫入深度まで観察される。共焦点体積は取得され、ＸＹ及びＺＹ平面に投影された。ＺＹ直交図は、セルロース足場内の細胞増殖の深度を実証している。足場の上面及び底面が示されている。スケールバー：ＸＹ＝３００ｍｍ、ＺＹ＝１００ｍｍ。Ｄ）では、生体材料は、共焦点顕微鏡の貫入画像化深度制限を超える生体材料の内部構造を明らかにするために薄片化された。４週間増殖可能であったC2C12細胞を用いて播種された後のセルロース足場横断面のＳＥＭ画像。細胞とセルロース構造との間の対比を増加させるために細胞をデジタルにより着色した（スケールバー：５０ｍｍ）。内部薄片は、ＳＥＭを用いて画像化され、表面だけでなく生体材料全体の哺乳動物細胞を明らかにしている。哺乳動物細胞を含有する足場は、上に示したとおり最初に３．５％パラホルムアルデヒドで固定され、次いでＰＢＳを用いて繰り返し穏やかに洗浄された。次いで試料は、エタノールの連続グラジエント（５０％、７０％、９５％及び１００％）を通じて脱水され、凍結乾燥機内で乾燥された。次いで試料は１５ｍＡの電流で、３分間、Hitachi E-1010 イオンスパッタデバイスを用いて金でコートされた。ＳＥＭ画像化を２．００〜１０．０ｋＶの電圧でJEOL JSM-7500F FESEM上で実行した； 経時的細胞増殖及び生存率を示す図である。Ａ）NIH3T3、C2C12及びHeLa細胞は、セルロース足場中、ｎ＝３で１、８及び１２週間、個々に培養され、次いでHoechst33342を用いて染色された後に共焦点顕微鏡を用いて画像化された。細胞はImageJオープンアクセスソフトウェア（http://rsbweb. nih.gov/ij/）を使用して各時点で定量された。細胞集団の増加は３種すべての細胞型において観察される。実験の開始時に足場がそれぞれの細胞型によってだけ播種されていることから、細胞数の増加が増殖の結果だけであり得ることは注目されるべきである。Ｂ）１２週間培養後、C2C12細胞は、固定され、Hoechst33342（青：生存細胞）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Propidium iodide）（赤：アポトーシス性／壊死細胞）を用いて染色された。共焦点体積が取得され、ＸＹ及びＺＹ平面に投影され、１２週間培養の際に細胞が構造全体にわたって増殖したことを明らかにしている。アポトーシス性／壊死性である細胞は、足場のより深い領域において見出される。足場の上面及び底面が示されている。生（Hoechst（＋））及び死（Hoechst/PI（＋））細胞の数は計数され、足場内の９８％の細胞が生存していることが見出された。データは、C2C12細胞について示されているが、NIH3T3及びHeLa細胞についても同様である（データは示さず）。スケールバー：Ｂは、ＸＹについて２００ｍｍ及びＺＹについて１００ｍｍ； 〜 ＣａＣｌ２最適化を示す図である。位相差画像：Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｏ。Hoechst（核染色）蛍光画像：Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ、Ｎ、Ｐ。ＣａＣｌ２不含有：Ａ〜Ｄ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２：Ｅ〜Ｈ、１００ｍＭ ＣａＣｌ２：Ｉ〜Ｌ、１０００ｍＭ ＣａＣｌ２：Ｍ〜Ｐ。細胞不含有：Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、Ｍ、Ｎ。細胞（C2C12筋芽細胞）：Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｏ、Ｐ。細胞増殖の改善は、１００ｍＭ ＣａＣｌ２以上で生じた。１００ｍＭ及び１０００ｍＭ ＣａＣｌ２試料中のセルロース上の濃いスポットは、蛍光画像における核局在性の違い、及び細胞非存在下でのそれらの存在によって証明されるとおり析出した塩である。細胞は、画像化の前に足場上で増殖された。スケールバー：２００μｍ。この図は、いかなる培養細胞及びＣａＣｌ２も含まない脱細胞化足場の（Ａ、Ｂ）；ＣａＣｌ２を含まない足場内で培養されたC2C12筋芽細胞の（Ｃ、Ｄ）；１０ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて処置された足場の（Ｅ、Ｆ）；１０ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて処置された足場内で培養されたC2C12筋芽細胞の（Ｇ、Ｈ）；１００ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて処置された足場の（Ｉ、Ｊ）；１００ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて処置された足場内で培養されたC2C12筋芽細胞の（Ｋ、Ｌ）；１０００ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて処置された足場の（Ｍ、Ｎ）；並びに１０００ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて処置された足場内で培養されたC2C12筋芽細胞の（Ｏ、Ｐ）、位相差（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｏ）及びHoechst蛍光染色（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ、Ｎ、Ｐ）を示している； 塩残留物の除去を示す図である。１００ｍＭ ＣａＣｌ２が残留ＳＤＳをセルロース足場から除去するために使用された。（Ａ）ＣａＣｌ２塩／ＳＤＳミセルは、生体材料の表面上に析出した；位相差画像。（Ｂ）塩残留物はｄＨ２Ｏインキュベーションを用いて効果的に除去された。超音波処置、酢酸インキュベーション及びＤＭＳＯインキュベーションが同じ結果をもたらすことは注目されるべきである（図２０参照）。スケールバー＝２００μｍ； 塩除去後の細胞増殖を示す図である。細胞は、それぞれの塩除去処置に関して十分に増殖した。ｄＨ２Ｏインキュベーション：Ａ、Ｂ；ｄＨ２Ｏ及び超音波処理：Ｃ、Ｄ；酢酸インキュベーション：Ｅ、Ｆ；並びにＤＭＳＯインキュベーション：Ｇ、Ｈ。位相差画像（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）は、塩残留物不含有の足場を示している。Hoechst（核染色）蛍画像光（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）は、２日間の培養後に実質的な細胞増殖を示している。スケール：２００μｍ。この図は、異なる塩を用いて洗浄した、培養物の２日間のC2C12細胞増殖を伴う脱細胞化リンゴ足場の位相差（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）及びHoechst蛍光染色（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）を示している。Ａ及びＢでは、足場はｄＨ２Ｏと共にインキュベートされた。Ｃ及びＤでは、足場はｄＨ２Ｏと共にインキュベートし、超音波処理された。Ｅ及びＦでは、足場は酢酸と共にインキュベートされた。Ｇ及びＨでは、足場はＤＭＳＯと共にインキュベートされた； 種々の塩が残留ＳＤＳの除去のために使用できることを示す図である。様々な塩化合物は、生体材料から残留ＳＤＳを除去する同じタスクを達成するために使用できる。ＰＢＳ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２（すべて１００ｍＭ）は、生体材料を清浄化するための塩洗浄として使用された。C2C12核は、様々な塩を用いて洗浄された脱細胞化リンゴ上でHoechstを用いて染色された。各塩処置は、細胞増殖を許容した；しかし、二価カチオンを有する塩（ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２）は、より大きく細胞増殖を促進した。この図は、脱細胞化リンゴ足場上でHoechstを用いて染色し、１００ｍＭのＰＢＳ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣｕＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＣＯ３及びイブプロフェンナトリウムを用いて洗浄したC2C12核（２日増殖）の組織学的画像を示している。様々な塩化合物が生体材料から残留ＳＤＳを除去するタスクを達成するために使用できる。ＰＢＳ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣｕＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＣＯ３及びイブプロフェンナトリウム（すべて１００ｍＭ）は、生体材料を清浄化し、残留ＳＤＳを除去するための塩洗浄として使用された。この図に示される各塩処置は、細胞増殖を許容した；しかし、二価カチオン（ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２）並びに炭酸アニオン基を含む塩は、より大きく細胞増殖を促進する； リンゴ足場及びアスパラガス足場の二次壁染色を示す図である。細胞壁の様々な要素を生体材料のために利用できる。リグニンの桂皮アルデヒド基は、Wiesner染色を用いて染色（薄い紫色）された。ペクチン及びリグニンは、トルイジンブルーＯを用いて染色された。セルロース及びβ（１−４）−グルカンはコンゴレッドを用いて染色された； 天然セルロースが、C2C12筋芽細胞、3T3線維芽細胞及びヒト上皮HeLa細胞を含む哺乳動物細胞を支持できることを示す図である。しかし、機能性生体材料は、特定の使用目的に合わせて化学的に及び機械的にさらに調整することができる。２つの異なる技術が脱細胞化セルロース足場の堅さを変更するためにこれらの実験において使用された。加えて位相差画像は、生体材料が化学的及び物理的修飾後にも哺乳動物細胞培養をさらにサポートすることを実証している。Ａ）天然組織、脱細胞化（ＳＤＳ）、コラーゲン官能化（ＳＤＳ＋Ｃｏｌｌ）及びグルタルアルデヒド（ＳＤＳ＋ＧＡ）架橋セルロース足場の局所的機械的弾性。天然組織及び未修飾足場は、機械的特性においていかなる顕著な差異も示さない。コラーゲン官能化及び化学的架橋足場の両方がＤＭＥＭ足場と比較して弾性における顕著な増加を示した（＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。（Ｂ）脱細胞化（ＳＤＳ）、（Ｃ）コラーゲン官能化（ＳＤＳ＋Ｃｏｌｌ）及び（Ｄ）グルタルアルデヒド架橋（ＳＤＳ＋ＧＡ）足場は、すべてC2C12細胞の増殖をサポートした。スケールバー＝２００ｍｍ； 逆型技術を示す図である。脱細胞化リンゴ足場由来のセルロース環状コンストラクトは、生検パンチを使用して切断された。C2C12筋芽細胞は、足場上で２週間培養された。生体材料は、細胞によって十分侵入された。環は、ゼラチンを使用する一時的な逆型（Ｂ）、及びコラーゲンを使用する持続性の逆型（Ｃ）との組合せにおいても使用された。両者は、むきだしのセルロース足場と同等の細胞増殖をもたらした（Ａ）。C2C12核はHoechst（青）を用いて染色され、C2C12細胞膜はＷＧＡ（緑）を用いて染色され、セルロースはSchiff試薬及びヨウ化プロピジウム（赤）を用いて染色された。スケールバー＝１０００μｍ。第１カラムはHoechstを用いて染色されたC2C12核を示している。第２カラムはＷＧＡを用いて染色され、ゼラチンを使用する一時的な逆型との組合せで使用されたC2C12細胞膜を示している。第３カラムは、Schiff試薬及びヨウ化プロピジウムを用いて染色され、コラーゲンを使用する持続性の逆型との組合せで使用された、培養C2C12細胞からのセルロースを示している。第４カラムは、列Ａ、Ｂ及びＣのそれぞれの画像の併合を示している； 細胞増殖及び逆型を示す図である。天然生体材料（Ａ）、ゼラチンを使用する一時的な逆型生体材料（Ｂ）及びコラーゲンを使用する持続性の逆型生体材料（Ｃ）上のC2C12細胞の共焦点画像化。ｘｙ及びｚｙの最大投影が示されている。３つの異なる条件は同じ結果をもたらしている：十分な侵入及び高度な増殖。セルロースは、Schiff試薬をヨウ化プロピジウムと共に用いて染色（赤）され、細胞核はHoechstを用いて染色（青）された。スケール：２００μｍ； 細胞の侵入及び増殖及び逆型技術を示す図である。細胞増殖は、各型技術について合計核面積を算出することによって概算された（対照は天然セルロース）（Ａ）。天然セルロース、ゼラチン型及びコラーゲン型試料の間に顕著な差異はなかった。細胞侵入は、上面：底面の核面積の比を使用して概算された（Ｂ）。３つの条件の間に顕著な差異はなかった。結果としてこれらの実験条件において逆型は、細胞侵入及び増殖を変化させなかった； 人工マイクロ構造がリンゴ由来セルロース足場中に作製されたことを示す図である。２つの異なるマイクロ構造が脱細胞化セルロース足場内に作製され、セルロース足場への宿主細胞移動を増加させるなどの具体的な目的のために生体材料を含む様々なマイクロ構造を作製する実現可能性を実証している。Ａ）では、人工マイクロ構造の最初の例として、リンゴ由来セルロース足場内に５つのネガティブ円柱状スペースを作製するために１ｍｍ生検パンチが使用された。反対にＢ）では、単一の中央のネガティブスペースを作製するために３ｍｍ生検パンチが使用された。移植のほんの４週間後に血管形成の増加が、１ｍｍ及び３ｍｍの例の両方において人工由来ネガティブスペースから直接始まって観察できた（Ｃ及びＤ）。Ｃ）では、血管が生体材料の四隅それぞれにあり、人工由来ネガティブスペース内の血管形成の増加を示唆している。同様にＤ）では、血管をセルロース足場の上面に観察することができ、血管がセルロース足場を通ったことを示唆している。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色された代表的なセルロース足場の横断面（Ｅ〜Ｆ）； 〜 種々の供給源由来のセルロース足場、それらの切除及び表示する４週間及び８週間後の組織像を示す図である。種々の植物由来セルロース足場を、生体適合性を評価するために４週間及び／又は８週間マウス内に皮下移植した。種々の植物の選択組織を、インビボでの宿主細胞移動についての植物由来セルロース及び植物構造の生体適合性を実証するために４又は８週間の期間移植した。すべての例において、セルロース足場への細胞移動及び増殖が観察され、これらの実験において植物由来セルロース足場の生体適合性を明らかにしている。セルロース足場生体材料の皮下移植は、小さな皮膚切開（８ｍｍ）によってC57BL/10ScSnJマウスモデルの背部領域に実施された。各移植片は、その移植前に足場面積比較のために測定された（第１カラム：セルロース足場）。セルロース移植片は、表示する４又は８週間で切除された（第２カラム：切除）。セルロース足場内１ｍｍから開始する一連の５μｍ厚の薄片を切断し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した（第３カラム：組織像）。細胞浸潤の評価のために、４０ｘ対物レンズを備えたZeiss MIRAX MIDI Slide Scanner（Zeiss社、Toronto、Canada）を使用して顕微鏡写真を捕捉し、Pannoramic Viewer（3DHISTECH社、Budapest、Hungary）及びImageJソフトウェアを使用して分析した； セルロース足場移植及び切除を示す図である。セルロース足場生体材料の皮下移植は、小さな皮膚切開（８ｍｍ）によってC57BL/10ScSnJマウスモデルの背部領域に実施された（Ａ）。各移植片は、その移植前に足場面積比較のために測定された（Ｂ）。セルロース足場は、手術後１週間（Ｄ）、４週間（Ｅ）及び８週間（Ｆ）で切除され、肉眼写真を撮られた（対照皮膚はＣ）。各時点で血管は、セルロース移植片に明確に一体化されており、生体適合性を実証している。同様に移植片周囲の組織に急性又は慢性炎症はない。経時的なセルロース足場表面積における変化が示されている（Ｇ）。移植前の足場は、２６．３０±１．９８ｍｍ２の面積を有した。移植後、足場の面積は、１週間後に２０．７４±１．８０ｍｍ２、４週間後に１６．４１±２．４４ｍｍ２及び８週間後に１３．８２±３．８８ｍｍ２に低下した。セルロース足場の表面積は、移植８週間後に約１２ｍｍ２（４８％）顕著に減少した（＊＝Ｐ＜０．００１；ｎ＝１２〜１４）； 生体適合性及び細胞浸潤を示す図である。Ｈ＆Ｅ及び抗ＣＤ４５を用いて染色した代表的なセルロース足場の横断面。これらの全体像は、１週間での急性の中程度から重度の予測された異物反応（Ａ）、４週間での軽度の慢性免疫及び続く浄化プロセス（Ｂ）並びに最終的な、８週間での天然マウス組織に同化したセルロース足場（Ｃ）を示している。所望の領域のさらに高度な拡大図（Ｄ〜Ｆ）、差し込み図も参照（Ａ〜Ｃ）は、生体材料同化プロセスでの細胞型集団の観察を可能にしている。１週間では、本発明者らは、急性の中程度から重度の免疫応答を特徴付ける顆粒球、詳細には；多形核（ＰＭＮ）及び好酸球の集団、移植手順への正常な反応を観察できる（Ｄ）。４週間では、免疫応答の減少が観察でき（軽度から低い免疫応答）、足場周囲の表皮内の細胞の集団は、ここで、慢性応答を特徴付けるより高いレベルの単球及びリンパ球を含有している（Ｅ）。最終的に、８週間で、免疫応答は、表皮組織に完全に再吸収され、ここで正常であると考えられる（Ｆ）。Ｈ＆Ｅ染色を用いて観察された免疫応答は、白血球の周知のマーカー、抗ＣＤ４５抗体を使用して確認される（Ｇ〜Ｉ）。足場内の細胞の集団は、ここで主にマクロファージ、多核細胞及び活性線維芽細胞である。スケールバー：Ａ〜Ｃ＝１ｍｍ、Ｄ〜Ｆ＝１００μｍ及びＧ〜Ｉ＝５００μｍ； 細胞外マトリクス沈着を示す図である。マッソントリクロームを用いて染色した代表的なセルロース足場の横断面（Ａ〜Ｃ）。移植後１週間後、（Ａ）の所望の領域の拡大図は、差し込み図を参照、コラーゲン足場内のコラーゲン構造の欠如を示している（Ｄ、Ｇ）。線維芽細胞が足場に侵入し始めると、セルロース足場内のコラーゲン沈着は４週間後に低密度に観察できる（Ｅ、Ｈ）。セルロース足場内の活性化線維芽細胞（紡錘状細胞）の観察と一致して、コラーゲンネットワークは、８週間後に空洞内に明らかに見られる（Ｆ、Ｉ）。スケールバー：Ａ〜Ｃ＝１ｍｍ、Ｄ〜Ｆ＝１００μｍ及びＧ〜Ｉ＝２０μｍ。＊＝コラーゲン繊維；黒色矢印＝セルロース細胞壁；白色矢印＝線維芽細胞； 血管形成及び血管新生を示す図である。セルロース足場近くの周囲の組織の血管の肉眼での直接観察（Ａ）。Ｈ＆Ｅ染色（Ｂ）及びマッソントリクローム染色（Ｃ）の顕微鏡写真における複数の血管横断面の観察によるセルロース足場内の血管新生の確認。血管新生プロセスは、セルロース足場内の内皮細胞を同定するための抗ＣＤ３１染色を用いても確認された（Ｄ）。スケールバー：Ａ＝１ｍｍ、Ｂ＝５０μｍ及びＣ〜Ｄ＝２０μｍ。白色矢印＝血管； Ａ）脱細胞化アスパラガス中の木部構造（＊）の２光子共焦点画像（バー＝０．１ｍｍ）、セルロース特異的染色（赤）が植物内の微細構造を観察するために使用される。Ｂ）植物木部中の単一の連続的木部マイクロチャネル（＊）の位相差画像（バー＝０．１ｍｍ）。Ｃ）凍結破砕木部マイクロチャネルのＳＥＭ画像（バー＝２０μｍ）。Ｄ）移植のために準備された脱細胞化植物プラグの全体像； Ａ）インビトロでの脱細胞化植物足場中の木部マイクロチャネルの壁に沿って増殖している初代ニューロン（細胞膜色素を用いて緑色に染色された）を示す図である。この横断面画像（２μｍ厚）は、３ｍｍ長プラグ内の深さ１ｍｍで得られた（バー＝０．１ｍｍ）。Ｂ）４週間後の皮下移植脱細胞化植物足場のＨ＆Ｅ染色（バー＝１ｍｍ）。差し込み図：木部マイクロチャネルの横断面（バー＝０．２ｍｍ）。Ｃ）脊髄に移植された３ｍｍ脱細胞化植物移植片（矢印）の全体像； Ａ）（ii）移植片（矢印）の（ｉ）上方及び（iii）下方のＭＲＩ軸方向像である。（ii）Ｔ８／９での椎弓切除は、（ｉ）及び（iii）において見られる神経根の喪失を生じる。Ｂ）８週間後、脊髄及び脳は除去される。移植片（矢印）は、感染、石灰化又は線維症の徴候を有さずに良好に組み込まれたと考えられる。Ｃ）移植後８週間後の自発運動回復が、トレッドミルでの（ｉ〜iii）協調足踏み及び荷重負荷（図示）及び平坦なＢＢＢ活動領域において示された。Ｄ）平坦なＢＢＢ活動領域での対照（赤、ｎ＝４）及び移植（青、ｎ＝７）ラットについてのＢＢＢスコア。Ｅ）染色は、生体材料のマイクロチャネルへ増殖している脊髄（ｓｃ）由来のミエリン化神経を明らかにしている（ｂｍ）（バー＝２００μｍ）。境界面は点線で示されている； 脊椎のＴ８〜Ｔ９領域に移植された脊髄移植片全体の全体像を示す図である。組織は、核を濃い紫として及びミエリン化組織を薄い青として示すＨ＆Ｅ−ＬＦＢを用いて染色される。重要なことに、移植片全体の長さにわたるマイクロチャネルが両方の宿主細胞で浸潤されていることが見られる； 離断部位周囲の腹側薄片（上−頭蓋；下−尾）を対照及び脊髄移植片移植ラットの両方において染色し、神経フィラメントマーカー（NF200緑）及び核（Hoechst青）について染色したことを示す図である。Ａ）では、濃い領域は生体材料の位置を表している。興味深いことに、脊髄移植片周囲は、緑フィラメントが腹側方向（赤色矢印）に伸びて観察できる。これらのフィラメントは、１２週間後のインビボでラットの離断部位内の成熟ニューロンを表している。反対に対照Ｂ）内では組織化された神経フィラメントは観察できず、対照離断部位内の成熟フィラメントの欠如を示している。加えてHoechst染色は、対照と比較して、離断部位内の脊髄移植片周囲の核、及びそのような細胞として、の数の顕著な増加を明らかにしている； リンゴ花托筒組織は脱細胞化され、皮膚移植のために処理されたことを示す図である。C57BL/10ScSnJマウスは、それらの背部皮膚を剃られ、外科的に準備された。（Ａ）外径１０ｍｍのラバーパッドは、創傷が閉じることを避けるために背部皮膚に縫合された。（Ｂ）直径５ｍｍの脱細胞化リンゴ花托筒組織をラバーパッドの中央に置き、半透過性接着剤を用いて覆った。（Ｃ）写真は、創傷治癒プロセスの際の宿主細胞浸潤の程度を測定するために４日後に撮られた； 骨移植のための植物由来セルロース足場を示す図である。各円柱状（直径５ｍｍ、厚さ１ｍｍ）移植片は、移植の前に足場面積比較のために測定された（Ａ）。セルロース足場移植片は、ラット頭蓋欠損に移植され、頭蓋欠損内に残るように位置付けられた。次いで皮膚は、移植片を覆って位置付けられ、足場を所定の位置に保つように縫合された。（Ｂ）足場及び周囲の骨組織は、移植４週間後に単離され、肉眼写真を撮られた（Ｃ）。次いで単離された組織は、脱灰され、パラフィンに処理／包埋された。セルロース足場内１ｍｍから開始する一連の５μｍ厚の薄片は切断され、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色された（Ｄ）。骨再生の評価のために、４０ｘ対物レンズを備えたZeiss MIRAX MIDI Slide Scanner (Zeiss社、Toronto、Canada)を使用して顕微鏡写真が捕捉され、Pannoramic Viewer (3DHISTECH社、Budapest、Hungary)及びImageJソフトウェアを使用して分析された； 様々なセルロース製剤、物理的特性及び官能化を示す図である。セルロースは、様々な形を有するブロック（Ａ）として、又は脱水され、ゲル（Ｃ、Ｄ）若しくはペースト（Ｅ、Ｆ）を産生する望ましい稠度に再水和できる粉末形態に挽かれて使用することができる。セルロースがカルボキシメチルセルロースを含有する場合、クエン酸及び熱を用いて容易に架橋することができる（Ｂ）。様々な植物から供給されたセルロースは、組み合わされ、混合され、架橋されてよい； （Ａ）生体材料（種々の供給源由来）の移植後の、移植後１週間、４週間及び８週間でのマウス（ｎ＝１９０）及びラット（ｎ＝１２）の生存率を示すグラフである。（Ｂ）本図は、（Ａ）においてこれらの同じ時点での生体材料拒絶率を示している。
本明細書に記載されるのは、組織の細胞物質及び核酸が除去された、脱細胞化された植物又は真菌組織であって、セルロース又はキチンベースの多孔質構造を含む脱細胞化された植物又は真菌組織を含む足場生体材料である。そのような足場生体材料を調製する方法、並びに動物細胞増殖のサポート、組織再生の促進、血管新生の促進、組織置換術、血管新生の促進のための移植可能な足場として、及び／又は美容外科手術用の構造移植片としてのその使用も提供される。そのような足場を使用する治療的処置及び／又は美容方法が、例えば獣医学的用途を含み得る他の用途のみならず、さらに記載される。実施形態及び実施例は、当業者を対象とする例示目的のために提供され、いかなる形でも限定を意味するものではないことが理解されるであろう。
特定の実施形態において、例えば、生物医学実験研究及び／又は臨床再生医療に用途を有し得る生体材料が本明細書に記載される。そのような生体材料は、産業／学術系生物医学研究者の調査ツールとして、生物医学的移植用に、感知デバイス及び医薬送達媒体において、並びに／又は足場が使用され得る他の適切な用途において使用できる足場として有効となり得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載される生体材料は、細胞浸潤、細胞増殖、血管新生、組織修復、及び／又は組織再建等を促進することができる複雑な３Ｄ足場を作製するために、植物及び真菌界で見出される細胞壁構造に由来してもよい（例えば、図１参照）。当然のことながら、本明細書に記載された生体材料は、例えば種、根、皮、葉、茎、果実、髄、芯を含む、植物又は真菌生物の任意の適切な部分から産生されてもよく、特定の実施形態において、種々の形状（シート、管、ブロック、カニューレ挿入、通気孔等の）又は剤形（例えば、ペースト、粒子、ブロック等を含む）で産生されてもよい（例えば、図２参照）。生体材料は、例えば、これらの生物において天然に見出されるセルロース、キチン及び／又は任意の他の適切な生化学物質／バイオポリマーなどの物質を含むことができる。
特定の実施形態において、得られた足場は、カスタムな界面化学を導入；固体ブロック、注射可能／押し出し可能なペースト、及び／若しくはスラリーとしてカットするために化学的に修飾することもでき；並びに／又は数種類の生組織環境を置換／模倣し得る一連の構造可能性を、マイクロメートルからセンチメートルのスケールで提供することができ
る。
本明細書に記載されているように、そのような植物／真菌由来生体材料の使用は、著しく薄い壁（＜１００ｎｍ）を有し得る高多孔性足場をもたらすことができる（例えば、図１参照）。これは、特定の実施形態において、足場材料の最小限のフットプリントをもたらし得る（すなわち、生細胞により十分に侵入される場合、細胞対足場容積比は著しく高い可能性がある）。
特定の実施形態において、本明細書に記載された足場生体材料は生体適合性であってもよい。以下にさらに詳細に記載されるように、マウスモデルにおいて例となる足場生体材料の皮下移植後、十分な細胞浸潤及び機能的血管形成を伴う血管新生が、移植後４週間以内に観察された（例えば、図３及び４参照）。以下に詳述される実験にも記載されているように、足場がインビボで移植された場合、最小限のフットプリントは細胞浸潤、血管新生及び組織修復を促進し、ほんの最小限の炎症反応（足場よりむしろ手術自体により主に引き起こされた）が試験条件下で観察された。
本明細書で以下に記載される実験は、本明細書に記載された植物／真菌由来生体材料が、試験条件下、インビボで十分に生体適合性であったことを示している。該生体材料はまた、図５、及びModulevsky, D.J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z. andPelling, A.E. “Apple Derived Cellulose Scaffolds for 3DMammalian Cell Culture.” Plos One, 9, e97835 (2014)（参照により本明細書に組み込まれる）に示されているように、インビトロ試験とも十分に適合した。
特定の実施形態において、多くの市販の生体材料と異なり、本明細書に記載された植物／真菌由来生体材料は、非吸収性又は難吸収性であってもよい（すなわち、該生体材料は実質的に分解せず、生体に吸収されない）。これらの足場の非吸収特性は、特定の利益を提供することができる。例えば、特定の実施形態において、本明細書に記載される生体材料は形状変化に抵抗性であり得、及び／又は長期間にわたってその意図された幾何学的形状をとどめ得る。特定の実施形態において、本明細書に記載される生体材料は、特定の他の産物と比べて最小限のフットプリントを有し得るため、生体では事実上見えず、免疫応答をほとんど誘発しないと見なすことができる。吸収性生体材料が分解するとき、その副産物は酸化ストレスを誘導するだけでなく、有害な免疫応答をしばしば誘発し、回復中の組織にｐＨの増加をもたらす。これは、非吸収性生体材料を使用することにより回避することができる。
当然のことながら、別段の指示がない限り、本明細書で使用される植物及び真菌界の意味／定義は、Cavalier-Smith分類（１９９８）に基づいている。
足場生体材料
一実施形態において、組織の細胞物質及び核酸が除去された、脱細胞化された植物又は真菌組織であって、セルロース又はキチンベースの三次元多孔質構造を含む前記脱細胞化された植物又は真菌組織を含む足場生体材料が、本明細書に提供される。当然のことながら、特定の実施形態において、足場生体材料は、宿主細胞が浸潤、侵入、及び／又は増殖するための基礎となる構造、支持体及び／又は基盤を提供することができる、宿主にとって異物を含んでもよい。
特定の実施形態において、足場生体材料は、実質的に固体形態、ブロック若しくは他の剛性形状を含んでもよく、脱水され、粉末若しくは粒子形態に粉砕されてもよく、架橋形態であってもよく（特に、足場生体材料が、クエン酸及び熱により容易に架橋することができる、カルボキシメチルセルロースを含有するセルロースベースの組織を含む場合）、
又はゲル若しくはペースト形態であってもよい。そのようなゲル又はペーストは、例えば、ゲル又はペーストを産生するのに望ましい稠度まで組織の粉末形態を再水和することにより、産生することができる。さらに、特定の実施形態において、架橋を強化する様々な添加物を含んでいてもよい、セルロースベースの生体材料のシートを生成するのに、圧縮成形が使用されてもよい。そのような添加物には、パルプに添加され、又は触媒としてのリン酸二水素ナトリウムと一緒に噴霧され得るシュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸又はクエン酸が含まれ得るが、これらに限定されない。
当然のことながら、脱細胞化された植物又は真菌組織は、適切な植物若しくは真菌派生物又は直接の組織試料に由来する、又はこれから産生される任意の適切な生体材料を含むことができる。特定の実施形態において、基礎となる構造及び／又はメッシュ支持構造を含むことができるそのような材料は、植物又は真菌組織のいずれか由来の天然細胞を除去し、溶解し、又は酵素的に処理するための、適切な組み合わされた又は単一の方法から生じ得る。
上記の足場材料（material or materials）の特定の実施形態において、植物又は真菌
組織は、リンゴ花托筒（セイヨウリンゴ）組織、シダ（シダ類）組織、カブ（ブラッシカ・ラパ）根組織、イチョウ枝組織、ツクシ（トクサ）組織、ワスレグサ属交配葉組織、ケール（ブラッシカ・オレラセア）茎組織、針葉樹アメリカトガサワラ（ベイマツ）組織、サボテンの実（ピタヤ）の果肉組織、マキュラータビンカ組織、水生ハス（ハス）組織、チューリップ（チューリッパ・ゲスネリアーナ）花弁組織、プランテン（バナナ）組織、ブロッコリー（ブラッシカ・オレラセア）茎組織、カエデの葉（セイヨウカジカエデ）の茎組織、ビート（テンサイ）一次根組織、ネギ（タマネギ）組織、ラン（ラン科）組織、カブ（ブラッシカ・ラパ）茎組織、リーキ（アリウム・アンペロプラスム）組織、カエデ（カエデ属）の木の枝組織、セロリ（アピウム・グラベオレンス）組織、ネギ（タマネギ）茎組織、マツ組織、アロエ・ベラ組織、スイカ（シトルラス・ラナタス変種ラナタス）組織、クリーピングジェニー（コバンコナスビ）組織、サボテン組織、リクニス・アルピナ組織、ルバーブ（レウム・ラバルバルム）組織、カボチャ果肉（ペポカボチャ）組織、ドラセナ（キジカクシ科）茎組織、ムラサキツユクサ（オオムラサキツユクサ）茎組織、アスパラガス（アスパラガス・オフィシナリス）茎組織、キノコ（真菌）組織、フェンネル（ウイキョウ）組織、バラ（バラ属）組織、ニンジン（ダウクス・カロタ）組織、若しくはセイヨウナシ（仁果類）組織を含んでもよい。
特定の実施形態において、植物又は真菌組織は、組織を物理的に模倣し、及び／又は標的組織効果を機能的に促進するように構成することができる追加の植物又は真菌構造を作製するために、直接ゲノム修飾又は選抜育種により遺伝子改変されてもよい。本明細書の教示を考慮する当業者は、特定の用途に適するように適切な足場生体材料を選択することができるであろう。
特定の実施形態において、適切な組織は、測定され特定の用途に適合し得る、サイズ、構造（多孔質／管状）、剛性、強度、硬度及び／又は延性などの例えば物理的特性に基づき、特定の用途のために選択されてもよい。さらに、反応性、配位数、生成エンタルピー、燃焼熱、安定性、毒性、及び／又は結合の種類などの化学的特性も、特定の用途に適する選択のために検討され得る。そのような特性（物理的及び化学的）は、特定の用途に対応するように脱細胞化及び／又は官能基化の前後に直接変更することもできる。さらに、特定の実施形態において、セルロースは、異なる植物から供給されてもよく、以下に概説される化学を使用して組み合わされ、及び混合、架橋等されてもよい。
特定の実施形態において、足場生体材料は、足場生体材料の脱細胞化された植物又は真菌組織が対象の組織を物理的に模倣し、及び／又は対象における標的組織効果を機能的に
促進するように構成された足場生体材料であってもよい。本明細書に記載されているような足場生体材料を使用する方法は、特定の実施形態において、足場生体材料の脱細胞化された植物又は真菌組織が対象の組織を物理的に模倣し、及び／又は対象における標的組織効果を機能的に促進するように構成された、本明細書に記載された足場生体材料を選択するステップを含んでもよい。本明細書の教示を考慮する当業者は、特定の用途に適するように適切な足場生体材料を選択することができるであろう。
非限定的な例として、図６は、組織学的細胞壁構造及び特定の組織／組織機能との対応する関係を示す足場生体材料のいくつかの例を提供する。これらは、特定の実施形態において、特定の用途に適する足場生体材料の選択を導くのに使用することができる。当然のことながら、植物及び真菌界で見出される細胞壁構造は、骨、皮膚及び神経などの組織と類似し得る多種多様な構造を示す。標的となる組織に応じて、生体材料の植物又は真菌供給源の決定は、植物の物理的及び／若しくは化学的特性、並びに／又は生成される足場生体材料の物理的及び／又は化学的特性に基づくことができる。
当然のことながら、細胞物質及び核酸は、細胞小器官（例えば、葉緑体、ミトコンドリア）、細胞核、細胞核酸、及び細胞タンパク質などの細胞内内容物を含み得る。これらは、足場生体材料から実質的に除去、部分的に除去、又は完全に除去することができる。微量のそのような成分は、本明細書に記載される脱細胞化された植物又は真菌組織に依然として存在する可能性があることが理解されるであろう。
当然のことながら、特定の実施形態において、三次元（３Ｄ）多孔質構造は、受動拡散により媒体／栄養素を絶えず供給しながら、外来細胞が浸潤、侵入及び／又は内部で増殖するための基礎となる構造、支持体及び／又は基盤を提供する適切な構造を含んでもよい。
様々な方法が、本明細書に記載された足場生体材料を産生するのに使用され得る。例として、上記の足場生体材料の特定の実施形態において、脱細胞化された植物又は真菌組織は、熱ショック、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、トリトンＸ、ＥＤＡ、アルカリ処理、酸、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び双性イオン性界面活性剤）による処理、浸透圧ショック、凍結乾燥、物理的溶解（例えば、静水圧）、電気的破壊（例えば、非熱的不可逆電気穿孔）、若しくは酵素消化、又はそれらの任意の組合せにより脱細胞化されている植物又は真菌組織を含んでもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載された生体材料は、熱ショック（例えば、急速凍結融解）、化学的処理（例えば、界面活性剤）、浸透圧ショック（例えば、蒸留水）、凍結乾燥、物理的溶解（例えば、加圧処理）、電気的破壊及び／又は酵素消化を含むが、これらに限定されないいくつかのアプローチのいずれかを含み得る（個別に又は組み合わせてのいずれか）脱細胞化プロセスを使用することにより、植物及び／又は真菌から得ることができる。
特定の実施形態において、脱細胞化された植物又は真菌組織は、界面活性剤又は表面活性物質による処理により脱細胞化されている植物又は真菌組織を含んでもよい。界面活性剤の例には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ、ＥＤＡ、アルカリ処理、酸、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び双性イオン性界面活性剤が含まれ得るが、これらに限定されない。
さらなる実施形態において、脱細胞化された植物又は真菌組織は、ＳＤＳによる処理により脱細胞化されている植物又は真菌組織を含んでもよい。
さらに別の実施形態において、残留ＳＤＳは、二価塩水溶液による洗浄により、脱細胞化された植物又は真菌組織から除去されてもよい。二価塩水溶液は、ＳＤＳミセルを含有
する塩残留物を溶液／足場から沈殿／崩壊させるのに使用されてもよく、ｄＨ２Ｏ、酢酸若しくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処理、又は超音波処理が、塩残留物又はＳＤＳミセルを除去するのに使用されていてもよい。
特定の実施形態において、二価塩水溶液の二価塩は、例えば、ＭｇＣｌ２又はＣａＣｌ２を含んでもよい。
別の実施形態において、植物又は真菌組織は、水、エタノール、又は別の適切な有機溶媒などの溶媒中、０．０１〜１０％、例えば約０．１％〜約１％、又は例えば、約０．１％ＳＤＳ若しくは約１％ＳＤＳのＳＤＳ溶液による処理により脱細胞化されていてもよく、残留ＳＤＳは、約１００ｍＭの濃度のＣａＣｌ２水溶液の使用と、その後のｄＨ２Ｏ中でのインキュベーションとで除去されていてもよい。
特定の実施形態において、ＳＤＳ溶液は０．１％より高い濃度であってもよい。該濃度は、脱細胞化を促進することができ、残留ＳＤＳを除去するための洗浄の増加を伴う可能性がある。
特定の実施形態において、植物又は真菌組織は、水中約０．１％ＳＤＳのＳＤＳ溶液による処理により脱細胞化されていてもよく、残留ＳＤＳは、約１００ｍＭの濃度のＣａＣｌ２水溶液の使用と、その後のｄＨ２Ｏ中でのインキュベーションとで除去されていてもよい。
本明細書に記載された生体材料の調製のための実験プロトコルの例は、以下の「足場生体材料調製方法」セクション及び実施例１にさらに詳細に提供される。
上記の足場材料（material or materials）のさらに別の実施形態において、脱細胞化
された植物又は真菌組織は、官能基化された足場生体材料を提供するために、アシル化、アルキル化、若しくは他の共有結合修飾により少なくともいくつかの遊離ヒドロキシル官能基で官能基化されてもよい。特定の実施形態において、脱細胞化された植物又は真菌組織は、例えば、コラーゲンにより官能基化されてもよい。
上記の足場材料（material or materials）の別の実施形態において、足場生体材料は
、セルロース又はキチンベースの三次元多孔質構造に接着された動物生細胞をさらに含んでもよい。別の実施形態において、動物生細胞は哺乳動物細胞であってもよい。さらに別の実施形態において、動物生細胞はヒト細胞であってもよい。
足場生体材料調製方法
一実施形態において、組織の細胞物質及び核酸が除去された、脱細胞化された植物又は真菌組織であって、セルロース又はキチンベースの三次元多孔質構造を含む前記脱細胞化された植物又は真菌組織を調製する方法であって、
所定のサイズ及び形状を有する植物又は真菌組織を提供するステップと、
熱ショック、界面活性剤による処理、浸透圧ショック、凍結乾燥、物理的溶解、電気的破壊、若しくは酵素消化、又はそれらの任意の組合せにより、植物又は真菌組織を脱細胞化するステップと、
それにより植物又は真菌組織から細胞物質及び核酸を除去して、セルロース又はキチンベースの三次元多孔質構造を含む脱細胞化された植物又は真菌組織を形成するステップと
を含む前記方法が、本明細書に提供される。
特定の実施形態において、植物又は真菌組織を脱細胞化するステップは、界面活性剤による処理による脱細胞化を含んでもよい。界面活性剤の例には、ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）、トリトンＸ、ＥＤＡ、アルカリ処理、酸、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び双性イオン性界面活性剤が含まれ得るが、これらに限定されない。
さらなる実施形態において、植物又は真菌組織を脱細胞化するステップは、ＳＤＳによる処理により脱細胞化されている植物又は真菌組織を含んでもよい。
さらに別の実施形態において、植物又は真菌組織を脱細胞化するステップは、残留ＳＤＳは、二価塩水溶液による洗浄により、脱細胞化された植物又は真菌組織から除去されてもよい。二価塩水溶液は、ＳＤＳミセルを含有する塩残留物を足場から沈殿／崩壊させるのに使用され、ｄＨ２Ｏ、酢酸若しくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処理、又は超音波処理が、塩残留物又はＳＤＳミセルを除去するのに使用されていてもよい。二価塩水溶液の二価塩は、例えば、ＭｇＣｌ２又はＣａＣｌ２を含んでもよい。
特定の実施形態において、脱細胞化するステップは、水中約０．１％ＳＤＳのＳＤＳ溶液による処理を含んでもよく、残留ＳＤＳは、約１００ｍＭの濃度のＣａＣｌ２水溶液の使用と、その後のｄＨ２Ｏ中でのインキュベーションとで脱細胞化後に除去されてもよい。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、方法は、アシル化、アル
キル化、若しくは他の共有結合修飾により、脱細胞化された植物又は真菌組織の少なくともいくつかの遊離ヒドロキシル官能基を官能基化するステップをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、脱細胞化された植物又は真菌組織のヒドロキシル官能基は、コラーゲンにより官能基化されてもよい。
上記の方法（method or methods）の別の実施形態において、方法は、セルロース又は
キチンベースの三次元多孔質構造に動物生細胞を導入するステップと、動物生細胞をセルロース又はキチンベースの三次元多孔質構造に接着させるステップとをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、動物生細胞は哺乳動物細胞であってもよい。特定の実施形態において、動物生細胞はヒト細胞であってもよい。
足場生体材料用途
特定の実施形態において、本明細書に記載された生体材料は、例えば、ヒト及び／又は獣医学的用途における生物医学実験研究及び／又は臨床再生医療に用途を有し得る。そのような生体材料は、産業／学術系生物医学研究者の調査ツールとして、生物医学的移植用に、感知デバイス及び医薬送達媒体において、並びに／又は足場が使用され得る他の適切な用途において使用できる足場として有効となり得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載された足場生体材料は、動物細胞増殖のサポート、組織再生の促進、血管新生の促進、組織置換術のための移植可能な足場として、又は美容外科手術用の構造移植片として使用されてもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載された足場生体材料は、例えば、脊髄損傷後の修復又は再生のための構造移植片として；組織置換手術及び／又は手術後の組織再生のための構造移植片として；皮膚移植及び／又は皮膚再生手術用の構造移植片として；標的組織又は領域における血管構造の再生のための構造移植片として；骨置換、骨充填、若しくは骨移植材として、及び／又は骨の再生を促進するために；皮膚、骨、脊髄、心臓、筋肉、神経、血管、又は他の損傷若しくは奇形組織の組織置換物として；（ヒドロゲル形態の）硝子体液代替物として；足場生体材料が、ヒドロゲル形態の足場生体材料を含有する嚢様構造を形成する、人工嚢として；及び／又は美容外科手術用の構造移植片として使用されてもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載された足場生体材料は、乳房インプラントとして使用されてもよい。したがって、足場は、ヒト乳房で見出される乳腺／乳房組織に合うように構築され、次いで、例えば、乳房インプラント用の充填材として使用され得る。
特定の他の実施形態において、本明細書に記載された足場生体材料は、軟骨代替物として使用されてもよい。したがって、足場は、軟骨組織を模倣するように構築及び設計され、耳及び鼻などの特定の身体部位を置換するのに使用され得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載された足場生体材料は、皮膚移植片として使用されてもよい。セルロース足場は、皮膚手術（例えば、歯茎等）又は傷害事象（例えば、火傷等）後に、皮膚（上皮／内皮）を保護、修復及び／又は再生するための皮膚移植片として使用することができる。セルロース足場は、特定の実施形態において、外部感染に対して損傷組織を保護し、及び／又は組織を直接再生するのに使用することができる。
特定の実施形態において、本明細書に記載された足場生体材料は、血管構造の再生に使用されてもよい。利用可能なセルロース構造の幅広さは、血管様構造の人工的産生を可能にすることができ、及び／又は血管新生（天然の血管形成）に適した条件を提供することができる。
別の実施形態において、本明細書に記載された足場生体材料は、骨置換又は骨充填に使用されてもよい。したがって、セルロース足場は、骨組織を模倣するように構築及び設計され、次いで歯科などにおける骨及び骨部位、頭蓋骨、骨折骨の置換、人工股関節置換（骨又は義肢用充填剤等）並びに／又は他のそのような用途に使用され得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載された足場生体材料は、単一又は複合組織として使用されてもよい。例として、足場は、事故、奇形、エステティック、傷害、又は組織への他の損傷後に、単一（皮膚、骨）又は複合（脊髄、心臓、筋肉、神経、血管等）組織を置換するのに使用することができる。
他の実施形態において、本明細書に記載された足場生体材料は、硝子体液材料として使用されてもよい。例として、ヒドロゲル形態のセルロース足場は半透明ゲルである。稠度及び透明度は、天然の硝子体液のものに合致するように調整され得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載された足場生体材料は、嚢として使用されてもよい。人工嚢、及びその対応する流体は、本明細書に記載される生体材料から産生することができる。嚢は、例えば、固体セルロースから作製することができるのに対し、流体は、セルロースヒドロゲルから形成することができる。
特定の実施形態において、それを必要とする対象における動物細胞増殖のサポート、組織再生の促進、血管新生の促進、組織の置換、又は美容外科手術における構造的足場の提供のための方法であって、
上記に記載された足場生体材料のうちのいずれかによる足場生体材料を提供するステップと、
足場生体材料を対象に移植するステップと
を含む前記方法が、本明細書に提供される。
特定の実施形態において、足場生体材料は脊髄で移植されてもよく、脊髄損傷後の修復又は再生を促進し；対象における組織置換及び／又は組織再生のための構造移植片を提供
してもよく；対象における皮膚移植及び／又は皮膚再生のための構造移植片を提供してもよく；標的組織若しくは領域又は対象における血管構造の再生のための構造移植片を提供してもよく；対象において、骨置換、骨充填、若しくは骨移植材を提供してもよく、及び／又は骨の再生を促進してもよく；対象における皮膚、骨、心臓、筋肉、神経、血管、又は他の損傷若しくは奇形組織の組織置換物を提供してもよく；対象における硝子体液代替物を提供してもよく（ヒドロゲル形態の場合）；足場生体材料が、ヒドロゲル形態の足場生体材料を含有する嚢様構造を形成する、対象における人工嚢を提供してもよく；及び／又は美容外科手術用の構造移植片を提供してもよい。
特定の実施形態において、足場生体材料は脊髄で移植されてもよく、中枢及び／又は末梢神経系の急性及び／又は慢性脊髄損傷後に、修復及び／又は再生を促進してもよい。
足場生体材料産生のための実験プロトコル例
本実施例では、２つの実験プロトコルが、リンゴ花托筒組織（セイヨウリンゴ）から本明細書に記載される足場生体材料を調製するために記載される。これらのプロトコルが当業者のためを目的に例示及び非限定的例として提供されることは理解されるであろう。本明細書の教示を考慮して当業者は、これらの例示的プロトコルに行うことができる種々の改変、付加、置き換え及び／又は他の変更を認識する。
以下に記載される初期の実験プロトコルは、足場生体材料を調製するために良好に使用された。しかし、このプロトコルは、検査した条件下で十分な細胞浸潤を提供するために数週間かかった。したがって、最初のプロトコルによって調製された足場生体材料と同様の結果をわずか１週間以内でもたらす塩化カルシウム洗浄（ＣａＣｌ２）の使用を含む改変プロトコルが次に開発された（図９及び図１０参照）。
インビボ（動物モデル）での研究のための初期プロトコル：
１．所望の形及びサイズにリンゴ切片を切断
ａ．リンゴを半分に切断
ｂ．半分のリンゴをＰＢＳ中に切断面を下にして浸す
ｃ．マンドリンスライサーを適切な厚さ（本実施例では１．２ｍｍ）を得る ように調節
ｄ．目に見えるリンゴ芯を含まない均一な切片を取り、計量まな板に置く
ｅ．四角形にさらに処理するためにリンゴの一方の側を切り取り、他の片はＰＢＳ中に保存
ｆ．リンゴ組織を四角形に切断するためにガイドライン（５ｍｍＸ５ｍｍ）を使用
ｇ．切断切片を１．５ｍＬ微量遠心管に入れる
ｈ．使用しない切片の切り口を少なくとも１０Ｘで測定し、実験帳簿に記録する
２．１ｍＬの０．１％ＳＤＳ（オートクレーブ処理ｄＨ２Ｏ中）を加え、振とう器上で、２日間（室温）、１８０ＲＰＭ ＲＴでインキュベートする
ａ．四角形のリンゴが浮いていないことを確認する
ｂ．リンゴがなお浮いている場合はＳＤＳ処置を続ける
３．微量遠心管中の処理したリンゴをバイオセイフティーキャビネットに置く
４．パスツールピペットを用いて０．１％ＳＤＳ溶液（室温）を除去する
５．リンゴ切片をオートクレーブ処理ＰＢＳ（室温）を用いて４回洗浄する
ａ．洗浄の際は、パスツールピペットをリンゴに接触せずに可能な限り近づけることを試みる。これは、リンゴ組織に水が流れるように試みるためである。
ｂ．管中に液体が残っていない場合は、リンゴから溶液を引き出すためにパスツールピペットを使用し続ける
ｃ．さらに洗浄するとピペットから引き出されて見られる「セッケン様の泡」残留物の
量は減少するはずである
ｄ．リンゴから引き出される「セッケン様の泡」が見られなくなるまで洗浄を続ける
ｅ．リンゴは浮かないはずである
６．所望の試料を滅菌微量遠心管の反対側にセットする
７．最後のＰＢＳ洗浄液を微量遠心管から除去し、７０％エタノールと置き換える
８．７０％エタノール中に３０分間〜１時間置く
９．７０％エタノールを除去する
１０．既に述べたものと同じ技術を用いて滅菌したＰＢＳを用いるリンゴ切片の洗浄を続ける
ａ．パスツールピペットを必ず交換する
１１．ＰＢＳを用いてリンゴ切片が浮かなくなるまで洗浄を続ける（少なくとも４回）
１２．ＰＢＳを除去し、１％ペニシリン／ストレプトマイシンＰＢＳと置き換える
１３．動物モデルへ移植する
インビボ研究のための改変プロトコル：
１．所望の形及びサイズにリンゴ切片を切断
ａ．リンゴを半分に切断
ｂ．半分のリンゴをＰＢＳ中に切断面を下にして浸す
ｃ．マンドリンスライサーを適切な厚さ（本実施例では１．２ｍｍ）を得るように調節
ｄ．目に見えるリンゴ芯を含まない均一な切片を取り、計量まな板に置く
ｅ．四角形にさらに処理するためにリンゴの一方の側を切り取り、他の片はＰＢＳ中に保存
ｆ．リンゴ組織を四角形に切断するためにガイドライン（５ｍｍＸ５ｍｍ）を使用
ｇ．切断切片を１．５ｍＬ微量遠心管に入れる
ｈ．使用しない切片の切り口を少なくとも１０Ｘで測定し、実験帳簿に記録する
２．１ｍＬの０．１％ＳＤＳ（オートクレーブ処理ｄＨ２Ｏ中）を加え、振とう器上で、２日間（室温）、１８０ＲＰＭ ＲＴでインキュベートする
ａ．四角形のリンゴが浮いていないことを確認する
ｂ．リンゴがなお浮いている場合はＳＤＳ処置を続ける
３．微量遠心管中の処理したリンゴをバイオセイフティーキャビネットに置く
４．パスツールピペットを用いて０．１％ＳＤＳ溶液（室温）を除去する
５．リンゴ切片をオートクレーブ処理ｄＨ２Ｏ（室温）を用いて４回洗浄する
ａ．洗浄の際は、パスツールピペットをリンゴに接触せずに可能な限り近づけることを試みる。これは、それに水が流れるように試みるためである。
ｂ．管中に液体が残っていない場合は、リンゴから溶液を引き出すためにパスツールピペットを使用し続ける
ｃ．さらに洗浄するとピペットから引き出されて見られる「セッケン様の泡」残留物の量は減少するはずである
ｄ．リンゴから引き出される「セッケン様の泡」が見られなくなるまで洗浄を続ける
ｅ．リンゴは浮かないはずである
６．１００ｍＭ ＣａＣｌ２（オートクレーブ処理ｄＨ２Ｏ中）を加え、一晩（室温）置く
７．ＣａＣｌ２溶液（室温）を除去
８．所望の試料を滅菌微量遠心管の反対側にセットする
９．最後の水洗浄液を微量遠心管から除去し、７０％エタノールと置き換える
１０．７０％エタノール中に３０分間〜１時間置く
１１．７０％エタノールを除去する
１２．既に述べたものと同じ技術を用いて水を用いるリンゴ切片の洗浄を続ける
ａ．パスツールピペットを必ず交換する
１４．ＰＢＳを用いてリンゴ切片が浮かなくなるまで洗浄を続ける（少なくとも４回）
１５．ＰＢＳを除去し、１％ Ｐ／Ｓ ＰＢＳと置き換える
１６．動物モデルへ移植する
マウス移植
インビボでのマウス移植研究を本明細書に記載される足場生体材料実施形態のインビボでの効果を研究するために実施した。
結果は、マウスモデルでの皮下移植後に、コラーゲン沈着（図４Ａ）及び重要なことに移植後４週間以内の機能的血管形成を含む血管新生（図４Ｂ及び図８）を伴って十分な細胞浸潤が観察された（図７参照；移植後１、４及び８週間）ことを示している。足場がインビボで移植された場合、最小限のフットプリントは細胞浸潤、血管新生及び組織修復、並びに最小の炎症性応答だけ（足場よりむしろ手術自体によって主に生じた）を促進した。植物／真菌由来足場は、これらの研究においてインビボで十分に生体適合性であった。これらの足場は、（図５）に示されるとおりインビトロでの研究でも十分に適合性であった。
非生分解性生体材料：
本分野は、主として生分解性材料に注目してきた；しかし、実施においてはこのアプローチに伴う多くの問題点がある。多くの商業的生体材料とは異なり、特定の実施形態では現在の生体材料は、吸収性でないと見なされる場合がある（すなわち、身体によって十分に分解されず、吸収されない場合がある）（図９参照）。
そのような足場の非吸収性の特徴は、競合商業製品を超える、ある種の有利点を提供できる。例として、それらは、（ｉ）形の変化にさらに抵抗性である及び／若しくは長期にわたってそれらの意図する幾何学的形状を保持できる；（ii）競合製品と比較して最小限のフットプリントを有する場合があり、それらを身体にほとんど気づかれないようにし、免疫応答をほとんど誘発しない；（iii）それらは、吸収性材料と比較して、その分解が
有害な免疫応答を生じる場合がある副産物の産生を回避できる；並びに／又は（iv）吸収性生体材料が分解された場合、新たに再生された組織が損傷される可能性があり、次いで同様に排除される可能性がある；本明細書に記載される生体材料は、特定の実施形態では、そのような状況を回避できる。
インビトロでの研究：
本明細書に記載されるインビトロでの実験をセルロース足場内での細胞の侵入及び増殖を確認するために実行した。十分な細胞浸潤は、最初のプロトコル（上の実施例１に記載されている）が使用された場合は数週間かかった。同様の結果をわずか１週間以内でもたらす塩化カルシウム洗浄（ＣａＣｌ２）の追加を含む、改変プロトコル（同様に上の実施例１に記載されている）を次に開発した（図９参照）。
インビボでの研究：
前臨床試験を１、４及び８週間の期間で５ｘ５ｘ１ｍｍ足場の皮下移植への応答を研究するためにマウスモデルで実行した。セルロースベースの足場はリンゴ、フェンネル及びアスパラガスに由来し、キチンベースの足場は白色キノコに由来した（図６参照）。
すべての足場は、これらの研究において拒絶を示さず、細胞の侵入及び血管新生（血管の形成）の観察を伴って、同様の生体適合性を示した。
足場生体材料のインビボでの生体適合性
足場生体材料のインビボでの生体適合性の課題に対処するために、身体のリンゴ由来セルロース足場への応答を特徴付けた。肉眼的（約２５ｍｍ３）細胞不含有セルロース生体材料を産生し、マウスモデルに１、４及び８週間、皮下に移植した。ここで、免疫適格性マウスの免疫学的応答、足場への細胞外マトリクスの沈着及び移植したセルロース生体材料中の血管新生（血管形成）の証拠を評価した。注目すべきことに、外科的手技について予測されるとおり、異物反応が移植後直ちに観察された一方で、研究の完了までに低い免疫学的応答だけが、すべての動物群においていかなる致死率も注目すべき感染も伴わずに観察された。周囲の細胞、主に活性化線維芽細胞も足場に侵入し、新たな細胞外マトリクスを沈着することも見出された。同様に足場自体が、８週間の研究にわたってその本来の形及び構造の大半を保持できた。重要なことに、足場は、血管新生促進効果を明らかに有し、移植された生体材料を通る機能的血管の増殖をもたらした。合わせて本研究は、血管新生し、周囲の健康な組織に組み込まれる、生体適合性である３Ｄセルロース足場を産生するための比較的容易な方法があることを実証している。
これらの研究では、リンゴの天然花托筒組織及び移植可能なセルロース足場を作製するための簡便な調製方法を使用した。生体適合性を検討するために、足場を野生型、免疫適格性マウス（オス及びメス；６〜９週齢）に皮下移植した。移植に続いて、足場を１、４及び８週間で切除し、組織学的分析のために処理した（Ｈ＆Ｅ、マッソントリクローム、抗ＣＤ３１及び抗ＣＤ４５抗体）。組織学的分析は、移植１週間後での足場への特徴的異物反応を明らかにした。しかし免疫応答は、移植後８週間までに徐々に消失することが観察された。８週間までに周囲の真皮組織に免疫応答はなく、セルロース足場内の活性線維芽細胞移動があった。これは、新たなコラーゲン細胞外マトリクスの沈着と一致していた。さらに、足場内の活発な血管形成が研究期間全体を通じて観察され、天然足場の血管新生促進特性を示している。最終的に、足場はそれらの元の形のほとんどを保持している一方で、８週間の研究期間にゆっくりと変形を受けている。合わせてこれらの結果は、天然セルロース足場が生体適合性であり、外科用生体材料としての可能性を表していることを示している。
材料及び方法
動物 すべての実験手順は、the University of Ottawaのthe Animal Care and Use Committeeによって承認された。野生型C57BL/10ScSnJマウス（オス及びメス；６〜９週齢；各群ｎ＝マウス７匹）をTheJackson Laboratory社（Bar Harbor、Maine、USA）から購入し、本発明者らの施設で飼育した。すべての動物を一定の室温（±２２℃）及び湿度（約５２％）に保った。それらは通常餌を与えられ、管理された１２時間の明／暗周期下に保たれた。
セルロース足場調製 既に記載のとおり（Modulevsky DJ, Lefebvre C, Haase K,Al-Rekabi Z, Pelling AE. Apple Derived Cellulose Scaffolds for 3D MammalianCell Culture. Kerkis I, editor. PLoS One. 2014;9: e97835.doi:10.1371/journal.pone.0097835）、McIntosh赤リンゴ（カナダ・ファンシー（Canada Fancy））を最大２週間、４℃で、暗所に保存した。リンゴ薄片を調製するために、果実を、ノギスを用いて測定した１．１４±０．０８ｍｍの均一な厚さにマンドリンスライサーを用いて切断した。リンゴの外側の（花托筒）組織だけを使用した。目に見える子房コア組織を含有する切片は使用しなかった。次いで切片を長さ５．１４±０．２１ｍｍ、面積２６．１４±１．７６ｍｍ２を有する四角形のセグメントに、リンゴの小花柄の方向に平行に切断した。次に組織試料から細胞物質及びＤＮＡを除く一方でインタクト及び三次元足場を残すために、参考文献（Ott HC, Matthiesen TS, Goh SK, Black LD, Kren SM, Netoff TI, et al.Perfusion-decellularized matrix: using nature’splatform to engineer a bioartificial heart.
Nat Med. 2008;14: 213-21. doi:10.1038/nm1684）のものに関連するプロトコルを使用
することによってリンゴ組織を脱細胞化した。個々のリンゴ組織試料を滅菌した２．５ｍ
ｌ微量遠心管に置き、２ｍｌの０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；Sigma-Aldrich社）溶液を各管に加えた。試料を４８時間、１８０ＲＰＭで、室温で振とうした。次い
で得られたセルロース足場を新たな滅菌微量遠心管に移し、洗浄し、１２時間、ＰＢＳ（Sigma-Aldrich社）中でインキュベートした。セルロース足場を滅菌するために、それら
を７０％エタノール中、１時間インキュベートし、次いでＰＢＳを用いて１２回洗浄した。次いで試料を１％ストレプトマイシン／ペニシリン（HyClone社）及び１％アンホテリ
シンＢ（Wisent社、QC、Canada)を含むＰＢＳ中で維持した。この時点で、試料を直ちに
使用した、又は４℃で２週間以内で保存した。
セルロース移植 マウスを２％イソフルランUSP-PPC（Pharmaceuticalpartners of Canada社、Richmond、ON、Canada）を使用して麻酔し、それらの眼を眼科用液体ゲル（Alco
Canada社、ON、Canada）の適用によって保護した。手術部位を準備するために、マウス
背部の毛を剃り、皮膚をENDURE 400 Scrub-Stat4 Surgical Scrub（グルコン酸クロルヘ
キシジン、４％溶液; Ecolab社、Minnesota、USA）及びSoluprep（２％ｗ／ｖクロルヘキシジン及び７０％ｖ／ｖイソプロピルアルコール;3M Canada社、London、ON、Canada）を使用して清浄化し、滅菌した。動物の水分補給を維持するために、１ｍｌの０．９％塩化ナトリウム溶液を皮下投与した（ｓ．ｃ．）（Hospira社、Montreal、QC、Canada）。外
科的手技の際、本発明者らは、生着手術のために求められるすべての無菌処置を適用した。足場を移植するために、２カ所の８ｍｍ切開を各マウスの背部セクションに作製した（上及び下）。２つのセルロース足場試料を別々及び個々に各マウスに移植した。次いで切開をSurgipro II monofilament polypropylene 6-0（Covidien社、Massachusetts、USA）を使用して縫合し、経皮的ブピバカイン２％（一水和物として；Chiron Compounding Pharmacy社、Guelph、ON、Canada）を感染を予防するために手術部位に局所適用した。同様
にブプレノルフィン（ＨＣＬとして）（０．０３ｍｇ／ｍｌ；Chiron Compounding Pharmacy社、Guelph、ON、Canada）を鎮痛剤としてｓ．ｃ．投与した。次いですべての動物を
続く３日間animal care servicesによって注意深くモニターし、同じ薬理学的処置を繰り返して受けさせた。
足場切除 足場移植１、４及び８週間後に、マウスをＣＯ２吸入を使用して安楽死させた。血液採取後、背部皮膚を注意深く切除し、ＰＢＳ溶液に直ちに浸した。次いでセルロース足場を含有する皮膚薄片を撮影し、切断し、１０％ホルマリン中で少なくとも４８時間固定した。次いで試料を、the University of Ottawaのthe PALM HistologyCore Facilityによってパラフィンに包埋する前に７０％エタノール中に保持した。
組織学的分析 セルロース足場内１ｍｍから開始する一連の５μｍ厚の薄片を切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）並びにマッソントリクロームを用いて染色した。免疫細胞化学のために、熱誘発エピトープ修復を１１０℃、１２分間、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて実施した。抗ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ１（１：１００；Novus Biologicals社、NB100-2284、Oakville、ON、Canada）、抗アルファ平滑筋アクチン（１：１０
００、ab5694、abcam社、Toronto、ON、Canada）及び抗ＣＤ４５（１：３０００；ab10558、abcam社、Toronto、ON、Canada）一次抗体を１時間、室温でインキュベートした。ブ
ロッキング試薬（Background Sniper、BiocareMedical社、Concorde、CA、USA）及び検
出系MACH4（Biocare Medical社、Concord、CA、USA）を企業の仕様書に従って適用した。細胞浸潤、細胞外マトリクス沈着及び血管形成（血管新生）の評価のために、４０ｘ対物レンズを備えたZeiss MIRAX MIDI Slide Scanner （Zeiss社、Toronto、Canada）を使用
して顕微鏡像を捕捉し、Pannoramic Viewer（3DHISTECH社、Budapest、Hungary）及びImageJソフトウェアを使用して分析した。炎症のスコア付けは、病理学者によって評価され
た。スコア付けは、全異物反応の規模の定性分析及び異物反応内の細胞集団の割合によって主観的に指定した。
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、Scanning electron microscopy）走査型電子顕微鏡を使用してセルロースの構造を研究した。包括的に、足場をエタノールの連続的グラジエント（５０％、７０％、９５％及び１００％）を通じて脱水した。次いで試料を１５ｍＡの電流、３分間でHitachi E-1010 ion sputter deviceを用いて金でコートした。ＳＥＭ画像化
を２．００〜１０．０ｋＶの範囲の電圧で、JSM-7500F Field Emission SEM（JEOL社、Peabody、MA、USA）上で実行した。
統計解析 本明細書において報告されたすべての値は、平均±標準偏差である。統計解析をSigmaStat 3.5ソフトウェア（Dundas Software社、Germany）を使用して一方向ＡＮＯＶＡを用いて実行した。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意と見なした。
結果
足場調製 セルロース足場を先に記載されたもの（Modulevsky DJ, Lefebvre C,Haase
K, Al-Rekabi Z, Pelling AE. Apple Derived Cellulose Scaffolds for 3D MammalianCell Culture. Kerkis I, editor. PLoS One. 2014;9: e97835.doi:10.1371/journal.pone.0097835）に関連する脱細胞化技術を使用してリンゴ組織から調製した。すべての足場を５．１４±０．２１ｘ５．１４±０．２１ｘ１．１４±０．０８ｍｍ（図１１Ａ）のサイズに切断し、移植のために脱細胞化及び調製した（図１１Ｂ）。足場は、すべての植物細胞物質及びデブリの喪失のために脱細胞化後は半透明に見える。リンゴ細胞の除去は、組織学的観察（図１１Ｃ）及び走査型電子顕微鏡（図１１Ｄ）を用いても確認された。組織学的画像の分析及び平均壁厚（４．０４±１．４μｍ）の測定は、実験条件下でのセルロース足場が高多孔性であり、近くの細胞によって侵入されることがあり、その形を維持している無細胞性セルロース足場をもたらすことを明らかにしている。
セルロース足場の移植 生体材料移植のための小さな袋を作製するために２個の独立した皮膚切開（８ｍｍ）を各マウスの背部に作製した（図１２Ａ）。１つのセルロース足場（図１２Ｂ）を各皮下袋に移植した。研究全体を通じて、セルロース足場移植によって引き起こされる可能性があるいかなる疼痛行動も示したマウスのケースはなく、眼に見える炎症又は感染のいかなる症状も示したものはなかった。セルロース足場をその移植の１週間、４週間及び８週間後に切除し、足場の大きさにおける変化を測定するために撮影した（図１２Ｄ〜Ｆ）。すべての時点で、近位又は直接接触している血管の存在を伴って健康な組織をセルロース足場周囲に観察することができ、足場はその四角形を保持している。移植前の足場は、面積２６．３±１．９８ｍｍ２を有し、皮膚上で裸眼で見られる足場面積に基づいて、それは移植時間の関数としてゆっくり減少したことが観察された（図１２Ｇ）。移植後８週間で、足場の大きさは１３．８２±３．８８ｍｍ２のほとんどプラトーの測定値に達し、本研究の経過でのおよそ１２ｍｍ２（４８％）の変化を実証している。
植物由来セルロース足場における生体適合性及び細胞浸潤 足場生体適合性及び細胞浸潤を固定したセルロース足場の移植後１、４及び８週間でのＨ＆Ｅ染色を用いて検討した（図１３）。代表的なセルロース足場の縦方向の薄片の全体像を図１３Ａ〜Ｃに示す。足場を真皮の筋層下に移植する。移植されていない足場とは対照的に、ピンク色に染色された間質液を移植された足場全体に見ることができ（図１１Ｃ参照）、それらの高多孔性及び浸透性を明らかにしている。全体像では、足場がその一般的形を研究を通じて維持していることが観察された。図１３Ｄ〜Ｆでは、足場周辺の拡大した薄片を各移植後時点で示す。１週間では、移植片周囲の真皮組織は急性の中程度から重度の免疫応答の症状を示している（病理学者によって実施された定性研究）（図１３Ｄ）。さらに、細胞の緻密層がセルロース足場に侵入していることを見ることができる。１週間での足場内の細胞の集団は、主に顆粒球、詳細には；多形核（ＰＭＮ）及び好酸球からなる（図１３Ｄ）。死細胞の集団及び明らかな細胞デブリもある。重要なことに、これらすべての観察は、移植に続く予測される急性異物反応と完全に一致する（Trindade R, Albrektsson T, Tengvall P,
Wennerberg A. Foreign Body Reaction to Biomaterials: On Mechanisms for Buildupand Breakdown of Osseointegration. Clin Implant Dent Relat Res. 2014; 1-12.doi:10.1111/cid.12274、Onuki Y, Bhardwaj U,Papadimitrakopoulos F, Burgess DJ. A review of the biocompatibility ofimplantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Jdiabetes Sci Technol. 2008;2: 1003-1015. doi:10.1016/S0091-679X(07)83003-2、Anderson JM, Rodriguez A, Chang DT. Foreign body reaction to biomaterials.Semin Immunol. 2008;20: 86-100. doi:10.1016/j.smim.2007.11.004）。４週間時点で、周囲の表皮組織において及びセルロース足場に移動している細胞集
団においての両方で明確な差異が観察された（図１３Ｅ）。セルロース足場周囲の表皮組織は、免疫応答が減少しており、ここでは軽度から低いとしてスコア化された。足場周囲の表皮内の細胞の集団は、ここでは高レベルのマクロファージ及びリンパ球を含有している（図１３Ｅ）。これは、移植された生体材料への異物反応の予測された特徴であり、足場清浄化プロセスを実証している（Trindade R, Albrektsson T, Tengvall P, Wennerberg A. Foreign BodyReaction to Biomaterials: On Mechanisms for Buildup and Breakdown ofOsseointegration. Clin Implant Dent Relat Res. 2014; 1-12.doi:10.1111/cid.12274、Onuki Y, Bhardwaj U,Papadimitrakopoulos F, Burgess DJ. A review of the
biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign
body response. J diabetes Sci Technol. 2008;2: 1003-1015.doi:10.1016/S0091-679X(07)83003-2、Anderson JM,Rodriguez A, Chang DT. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol.2008;20: 86-100. doi:10.1016/j.smim.2007.11.004）。炎症
性応答の一部として足場の内側の多核細胞の集団の増加もある（図１３Ｅ）。最終的に、１及び４週間で明らかな免疫応答は、移植後８週間で表皮組織は正常に見えて完全に消失した（図１３Ｆ）。実際にセルロース足場と接触している表皮組織は、正常表皮組織と同じ構造を含有している。セルロース足場周辺では、このとき炎症の減少によって細胞の密度はさらに低く、特に断片化された死細胞は存在しない。その代わり、ここで細胞の集団は、マクロファージ、多核細胞及び活性線維芽細胞のレベルが上昇している。活性線維芽細胞（紡錘状に見える）は、周囲の表皮からセルロース足場への移動を観察できる。実際に、線維芽細胞はセルロース足場全体を通じて見出される。これらの結果は、移植後８週間までに、セルロース足場が宿主によって許容されたことを実証している。Ｈ＆Ｅ炎症分析と並行して、抗ＣＤ４５染色を足場及び周囲の真皮組織の全体の炎症レベルを評価するために実施した（図３Ｇ−Ｉ）。真皮及び足場内全体の炎症が１週間後に上昇していることは明らかである。しかし、白血球の量は、周囲の真皮及び足場において移植時間にわたって顕著に減少し、８週間でほとんど基礎レベルに達する。
セルロース足場中の細胞外マトリクス沈着 活性線維芽細胞の存在は、セルロース足場が新たな細胞外マトリクスの沈着のための基質として作用したかどうかという疑問に本発明者らを導いた。このことは、移植後の各時点で固定されたセルロース足場スライドのマッソントリクローム染色を使用して判定した（図１４）。移植後１週間で組織学的研究は、コラーゲン足場の内部のコラーゲン構造の非存在を示している（図１４Ａ、Ｄ及びＧ）。線維芽細胞が足場に侵入すると、Ｈ＆Ｅ染色によって見られ、抗アルファ平滑筋アクチン染色によって確認されるとおり（データ未記載）、セルロース足場内部のコラーゲン沈着が４週間後に観察できる（図１４Ｂ、Ｅ及びＨ）。８週間では（図１４Ｃ、Ｆ及びＩ）、コラーゲンネットワークはセルロース足場の空洞の内部に明らかに見える。沈着したコラーゲンネットワークの複雑性は、本発明者らがコラーゲンマトリクス内の個々のコラーゲン繊維を検出できる図１４Ｉにおいて明らかにされている。これは、瘢痕組織において見出されるコラーゲンの特徴的な高密度で厚い、ケーブル様の組織とは対照的である。
セルロース足場の血管形成 直径８〜２５μｍの範囲の毛細血管も移植後早くも１週間で足場内に同定された。移植後４週間及び８週間で、血管及び毛細血管が足場内及び周囲の皮膚組織内に広範に観察できた。本発明者らは、切除の際に撮影された肉眼写真におい
てセルロース足場上及び周囲の真皮での血管の存在を観察した（図１５Ａ）。血管の複数の横断面が、赤血球（ＲＢＣ、redblood cell）の存在を伴って、足場移植の４週間以内に同定される（図１５Ｂ；Ｈ＆Ｅ染色）。ＲＢＣ及び内皮細胞を伴う毛細血管が明確に見られる同じ結果が移植後８週間で得られる（図１５Ｃ；マッソントリクローム）。血管形成についてのすべての結果は、足場中の内皮細胞を同定するための抗ＣＤ３１染色を用いても確認された（図１５Ｄ）。
分析
この研究では、リンゴ花托筒組織由来無細胞性セルロース足場のインビボでの生体適合性を評価した。この目的のために無細胞性セルロース足場をそれらの生体適合性を確立するために免疫適格性マウスの皮下に移植した。データは、移植された足場が低い炎症性応答を実証し、細胞の侵入及び細胞外マトリクス沈着を促進し、血管新生促進環境として作用することを明らかにしている。著しくは、この研究では、セルロース足場の良好な移植を示して、本研究の経過の際に死んだ、又は浮腫、滲出物若しくは異常感などのいかなる移植拒絶の症状も示したマウスはなかった。これらの移植された足場は、元の宿主植物細胞が存在した空洞の多孔性ネットワークからなっている（Backdahl H, Helenius G, Bodin A, Nannmark U, Johansson BR, RisbergB, et al. Mechanical properties of bacterial cellulose and interactions withsmooth muscle cells. Biomaterials. 2006;27: 2141-9.doi:10.1016/j.biomaterials.2005.10.026）。この構造は、植物組織を通じた栄養素の移行を効率的に促進する。本明細書及び先の研究で示されるとおり、リンゴ組織は、脱細胞化され得る（Modulevsky DJ, Lefebvre C, Haase K, Al-Rekabi Z, Pelling AE.
Apple Derived Cellulose Scaffolds for 3D Mammalian Cell Culture. Kerkis I,editor. PLoS One. 2014;9: e97835. doi:10.1371/journal.pone.0097835）。この簡単な処置は、花托筒組織の外観を変化させ、それにより細胞物質の除去の結果として透明になる。
移植後に、結果は足場が炎症性細胞で始まる宿主細胞で急速に浸潤されることを示している。先の発見と一致して、宿主動物の免疫応答は、周知のスケジュールに従い（Trindade R, Albrektsson T, Tengvall P, Wennerberg A. Foreign BodyReaction to Biomaterials: On Mechanisms for Buildup and Breakdown of Osseointegration.Clin Implant Dent Relat Res. 2014; 1-12. doi:10.1111/cid.12274、Onuki Y, Bhardwaj U, Papadimitrakopoulos F, Burgess DJ. A review ofthe biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcomeforeign body response. J diabetes Sci Technol. 2008;2: 1003-1015.doi:10.1016/S0091-679X(07)83003-2、Anderson JM,Rodriguez A, Chang DT. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol.2008;20: 86-100. doi:10.1016/j.smim.2007.11.004、JonesKS. Effects of biomaterial-induced inflammation on fibrosis and rejection.Semin Immunol. 2008;20: 130-136. doi:10.1016/j.smim.2007.11.005、Nilsson B, Ekdahl KN, Mollnes TE, Lambris JD. The role of complementin biomaterial-induced inflammation. Mol Immunol. 2007;44: 82-94.doi:10.1016/j.molimm.2006.06.020）、最終的には生体適合性を実証している。予測されるとおり、移植後１週間後の足場内の細胞集団は、主に顆粒球、詳細には；多形核（ＰＭＮ）及び好酸球であり、明らかな炎症性応答を構成している。足場周囲の暫定的なマトリクスの産生も観察され、足場周囲の組織における炎症性の外観を生じている（Trindade R, Albrektsson T, Tengvall P, Wennerberg A. Foreign BodyReaction to Biomaterials: On
Mechanisms for Buildup and Breakdown of Osseointegration. Clin Implant DentRelat Res. 2014; 1-12. doi:10.1111/cid.12274、Onuki Y,Bhardwaj U, Papadimitrakopoulos F, Burgess DJ. A review of the biocompatibilityof implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Jdiabetes Sci Technol. 2008;2: 1003-1015. doi:10.1016/S0091-679X(07)83003-2、Anderson JM, Rodriguez A, Chang DT. Foreign body reaction tobiomaterials. Semin Immunol. 2008;20: 86-100. doi:10.1016/j.smim.2007.11.004、Jones KS. Effects of biomaterial-induced inflammation
on fibrosis and rejection. Semin Immunol. 2008;20: 130-136.doi:10.1016/j.smim.2007.11.005、Nilsson B, Ekdahl KN,Mollnes TE, Lambris JD. The role of complement in biomaterial-inducedinflammation. Mol Immunol. 2007;44: 82-94. doi:10.1016/j.molimm.2006.06.020）。これは、予測外ではなく、外来物質及び外科的手技への応答の結果である（Trindade R, Albrektsson T, Tengvall P, Wennerberg A. Foreign BodyReaction to Biomaterials: On Mechanisms for Buildup and Breakdown ofOsseointegration. Clin Implant Dent Relat Res. 2014; 1-12.doi:10.1111/cid.12274、Onuki Y, Bhardwaj U,Papadimitrakopoulos F, Burgess DJ. A review of the biocompatibility of
implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Jdiabetes Sci Technol. 2008;2: 1003-1015. doi:10.1016/S0091-679X(07)83003-2、Anderson JM, Rodriguez A, Chang DT. Foreign body reaction tobiomaterials. Semin Immunol. 2008;20: 86-100. doi:10.1016/j.smim.2007.11.004、Jones KS. Effects of biomaterial-induced inflammation on fibrosisand rejection. Semin Immunol. 2008;20: 130-136. doi:10.1016/j.smim.2007.11.005、Nilsson B, Ekdahl KN, Mollnes TE, Lambris
JD. The role of complement in biomaterial-induced inflammation. Mol Immunol.2007;44: 82-94. doi:10.1016/j.molimm.2006.06.020）。移植４週間後、足場内の細胞の集団は、発達し、ここではリンパ球、単球、マクロファージ、異物多核細胞及び散在した好酸球である。慢性炎症で典型的なことに、１週間で暫定的なマトリクス中に存在した細胞性デブリは、宿主免疫系によって排除されている（Trindade R, Albrektsson T, Tengvall P, Wennerberg A. Foreign BodyReaction to Biomaterials: On Mechanisms for Buildup and Breakdown ofOsseointegration. Clin Implant Dent Relat Res. 2014; 1-12.doi:10.1111/cid.12274、Onuki Y, Bhardwaj U,Papadimitrakopoulos F, Burgess DJ. A
review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges toovercome foreign body response. J diabetes Sci Technol. 2008;2: 1003-1015.doi:10.1016/S0091-679X(07)83003-2、Anderson JM,Rodriguez A, Chang DT. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol.2008;20: 86-100. doi:10.1016/j.smim.2007.11.004、JonesKS. Effects of biomaterial-induced inflammation on fibrosis and rejection.Semin Immunol. 2008;20: 130-136. doi:10.1016/j.smim.2007.11.005、Nilsson
B, Ekdahl KN, Mollnes TE, Lambris JD. The role of complement inbiomaterial-induced inflammation. Mol Immunol. 2007;44: 82-94.doi:10.1016/j.molimm.2006.06.020）。８週間では、セルロース足場は、すべての暫定的なマトリクス及び細胞性デブリがなく、低レベルのマクロファージ及び異物多核細胞は足場内にまだ見える。セルロース足場内の免疫応答と一致して、周囲の組織はその本来の生理機能に戻っていることが観察される。実際に移植後８週間で、周囲の組織は対照組織とほとんど同様であった。８週間で免疫応答及び炎症は低いが、低レベルのマクロファージは、足場内に観察することができる。伝統的に炎症と関連するが、マクロファージは、本発明者らの発見と一致する有益な役割を有する。具体的にはマクロファージは、増殖及び血管新生促進因子、ＥＣＭタンパク質並びに、組織修復及び再生において線維増殖及び血管新生を積極的に制御する線維形成促進因子を分泌することも周知である（Anderson JM, Rodriguez A, Chang DT. Foreign body reaction tobiomaterials. Semin Immunol. 2008;20: 86-100. doi:10.1016/j.smim.2007.11.004）。それにも関わらず、８週間後の足場内の膨大な細胞の集団は、ここで
反応性線維芽細胞である。これらの細胞は、新たなコラーゲン細胞外マトリクスの分泌を通じて足場の微小環境を変化させる。瘢痕組織において見出されるコラーゲンの特徴的な高密度、ケーブル様の組織とは反対に、新たなマトリクスは、比較して著しい低密度を示し、再生を示唆する（Motegi K, Nakano Y, Namikawa A. Relation between cleavage lines andscar tissues. J Maxillofac Surg. 1984;12: 21-8. Available:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6583292）。
これらのデータも足場が血管新生促進性であり、周囲の組織からの血液輸送を促進できることを実証している（RickertD, Moses MA, Lendlein A, Kelch S, Franke R-P. The
importance of angiogenesis in the interaction between polymeric biomaterialsand
surrounding tissue. Clin Hemorheol Microcirc. 2003;28: 175-81. Available:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12775899）。天然組織と同様に、足場への限定的な血液供給は、虚血及び潜在的な壊死をもたらす場合がある。興味深いことに、４００μｍ未満のポア直径を有するバイオセラミックスは、インビボでの移植において血管の成長の減少及び血管直径のサイズの限定を生じることが実証された。細胞壁構造の多孔質構造は、４．０４±１．４μｍのマニュアル相互接続距離を有する、１００〜３００μｍの範囲の直径を有する重なり合った細胞壁空洞からなる。そのように、セルロース足場の高多孔性サイズ及び低い体積分率は、血管形成の促進と一致する。合わせて、ここでセルロース足場は、暫定的なマトリクスではなく、皮下移植片として十分に許容されると考えられる。
本発明者らは、足場面積の経時的な減少も観察したが、セルロース足場が分解のプロセス中にあるとは考えられていない。むしろ、面積における変化は、マウスの活発な動作から生じた足場の周辺での細胞壁空洞の崩壊によると考えられる。活発な生物学的分解は、哺乳動物が植物合成セルロースを消化するために好適な酵素を欠失していることから、可能であると予測されない（Beguin P. The biological degradation of cellulose. FEMS MicrobiolRev. 1994;13: 25-58. doi:10.1016/0168-6445(94)90099-X、MiyamotoT, Takahashi S, Ito H, Inagaki H, Noishiki Y. Tissue biocompatibility ofcellulose and
its derivatives. J Biomed Mater Res. 1989;23: 125-133.doi:10.1002/jbm.820230110）。さらに、植物組織において見出されるセルロースの高度な結晶形態は、哺乳動物に
おける分解に抵抗性であることも公知である（Miyamoto T, Takahashi S, Ito H,Inagaki H, Noishiki Y. Tissue biocompatibility of cellulose and itsderivatives. J Biomed Mater Res. 1989;23: 125-133. doi:10.1002/jbm.820230110）。代替的に、インビボでのセルロース移植が、より容易に分解されるように化学的に活性化できることが実証された（Dugan JM, Gough JE, Eichhorn SJ. Bacterial Cellulose Scaffolds andCellulose Nanowhiskers for Tissue Engineering. Nanomedicine. 2013;8: 297-298）。しかし
、セルロースの高度な結晶形態は、報告された最も低い免疫学的応答のいくつかを有する（Miyamoto T,Takahashi S, Ito H, Inagaki H, Noishiki Y. Tissue biocompatibility
of cellulose and its derivatives. J Biomed Mater Res. 1989;23: 125-133.doi:10.1002/jbm.820230110）。
多種多様な臨床的に承認された生体材料が患者における具体的な状態を治療するために使用されている（SainiM. Implant biomaterials: A comprehensive review. World J Clin Cases. 2015;3:52. doi:10.12998/wjcc.v3.i1.52）。そのような生体材料は、ヒト
及び動物組織、合成ポリマー並びにチタン及びセラミクスなどの材料由来である場合がある（Saini M.Implant biomaterials: A comprehensive review. World J Clin Cases. 2015;3: 52.doi:10.12998/wjcc.v3.i1.52、Pashuck ET, Stevens MM.STATE OF THE ART REVIEW Designing Regenerative Biomaterial Therapies for theClinic. Sci Transl Med. 2012;4、Lemons JE, Lucas LC.Properties of biomaterials. J Arthroplasty. 1986;1: 143-147.doi:10.1016/S0883-5403(86)80053-5、Bohner M. Resorbablebiomaterials as bone graft substitutes. Mater Today. 2010;13: 24-30.doi:10.1016/S1369-7021(10)70014-6、Ratner BD, HoffmanAS, Schoen FJ, Lemons JE. Biomaterials science: an introduction to materials in medicine. Chemical Engineering. 2004、Zhou L, Pomerantseva I, Bassett EK, Bowley CM, Zhao X, Bichara D a,et al. Engineering ear constructs with a composite scaffold to maintaindimensions. Tissue Eng Part A. 2011;17: 1573-1581. doi:10.1089/ten.tea.2010.0627、Temenoff JS, Mikos AG. Injectable biodegradable materials fororthopedic tissue engineering. Biomaterials. 2000;21: 2405-2412.doi:10.1016/S0142-9612(00)00108-3、Bao G, Suresh S. Celland
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魅力的なシナリオであるが、新たに形成された構造は、足場分解として崩壊することも見出されている（Zhou L,Pomerantseva I, Bassett EK, Bowley CM, Zhao X, Bichara D a, et al. Engineeringear constructs with a composite scaffold to maintain dimensions. Tissue EngPart A. 2011;17: 1573-1581. doi:10.1089/ten.tea.2010.0627、Liao
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Vascularized tissue-engineered ears. Plast Reconstr Surg. 2006;117: 116-22.Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16404257、IsogaiN, Asamura S, Higashi T, Ikada Y, Morita S, Hillyer J, et al. Tissueengineering of an auricular cartilage model utilizing culturedchondrocyte-poly(L-lactide-epsilon-caprolactone)
scaffolds. Tissue Eng. 10: 673-87. doi:10.1089/1076327041348527）。近年の戦略は、生物学的マトリクスに包埋されたチタンフレームの両方からなる生物学的複合材料を作製することをいまや選択している（Zhou L, Pomerantseva I, Bassett EK, Bowley CM, Zhao X, Bichara D a,et al. Engineering ear constructs with a composite scaffold
to maintain dimensions. Tissue Eng Part A. 2011;17: 1573-1581.doi:10.1089/ten.tea.2010.0627）。
本明細書で提供する結果は、植物由来セルロース生体材料が移植可能な足場の産生のための１つの将来性があるアプローチを提供できることを示唆している。このアプローチは、細菌セルロース戦略を補完できる（Pertile RAN, Moreira S, Gil RM, Correia A, Guardao L. BacterialCellulose : Long-Term Biocompatibility Studies. J Biomater Sci
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においてインビボで生体適合性であり、例えば、組織再生のための新たな戦略として検討することができる。
追加的脱細胞化プロトコル例
追加的脱細胞化プロトコルは、本明細書に記載されている。本実施例では、軟組織を固めるために植物を−２０℃冷凍庫で５分間冷却した。冷却した植物組織を、ノギスを用いて測定した均一の厚さに薄片化するためにマンドリンスライサーを利用した。次いで切片をセグメントに切断し、次いで細胞物質及びＤＮＡを組織試料から除去する一方で、インタクトの三次元足場を残すために改変哺乳動物組織プロトコルを使用することによって脱細胞化した。プロトコルは、哺乳動物組織のためのプロトコルから改変した（Ott et al., 2008）。個々の組織試料を滅菌した２．５ｍＬ微量遠心管に置き、２ｍＬの０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；Sigma-Aldrich社）溶液を各管に加えた。試料を１２時
間、１６０ＲＰＭで、室温で振とうした。次いで得られたセルロース足場を新たな滅菌微量遠心管に移し、洗浄し、６時間、１％ストレプトマイシン／ペニシリン（HyClone社）
及び１％アンホテリシンＢ（Wisent社）を含むＰＢＳ（Sigma-Aldrich社）中でインキュ
ベートした。この時点で試料を直ちに使用した、又はＰＢＳ中、４℃で２週間以内で保存した。得られた脱細胞化セルロース足場は図１Ａ及びＢで観察できる。
インビトロでの二次元（２Ｄ）及び三次元（３Ｄ）細胞培養−足場移植、細胞接着及び細胞増殖
C2C12マウス筋芽細胞、NIH3T3マウス線維芽細胞及びHeLaヒト上皮細胞株をこの研究に
おいて使用した（すべてthe American Type Culture Collection （ＡＴＣＣ）から得た
）。細胞を、細胞生物学実験で使用される最も一般的な細胞型を表すものとして選択した。２Ｄの従来の細胞培養を、足場移植のために上に述べた細胞を採取するために使用した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（HyClone社）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（HyClone社）及び１％アンホテリシンＢ（Wisent社）を補充した標準的細胞培養培地（high
glucose DMEM（HyClone社））中、３７℃で、５％ＣＯ２、Ｔ７５フラスコ（Thermo Scientific社）中で培養した。培養培地を１日おきに交換し、細胞を８０％コンフルエンス
で継代した。
足場播種手順を２４ウェル組織培養プレートで実行した。セルロース足場を唯一の接着可能な表面にする疎水性表面を作製するために、ウェルをポリジメチルシロキサン（ＰＤＭ、polydimethylsiloxane）を用いて個々にコートした。硬化剤：エラストマー（Sylgard 184、Ellsworth Adhesives社）の１：１０溶液を各ウェル表面にコートした。ＰＤＭＳを２時間、８０℃で硬化させた。ＰＤＭＳ−２４ウェルプレートを室温に冷却し次いで滅菌ＰＢＳを用いてリンスした。足場を０．５ｘ０．５ｃｍの片に切断し、各ウェル内に置いた。C2C12、NIH3T3及びHeLaを接着させ、それらの正確な濃度にアリコートした。細胞
６ｘ１０６個を含有する液滴４０μＬを各足場上に注意深く形成した。試料をインキュベーター内に６時間、細胞を足場に接着させるように置いた。次に２ｍＬのＤＭＥＭを各ウェルに加え、試料を４８時間インキュベートした。この時点で、哺乳動物細胞を含有する試料を次に、新たな２４ウェルＰＤＭＳコート組織培養プレートに注意深く移した。継続的な細胞増殖のために、培養培地を毎日交換し、足場を２週間ごとに新たな２４ウェルプレートに移した。
哺乳動物細胞の接着及び増殖を免疫蛍光顕微鏡を使用してモニターし、決定した。図５Ａ〜Ｃ、１６及び１７は、使用した細胞株の接着及び継続的増殖を実証している。
塩前処置効果及び足場生体材料官能化
天然細胞及び核酸を含まない３Ｄセルロース足場を得るために脱細胞化を使用した。表面活性物質ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を脱細胞化を達成するために使用した。そうでないと細胞が死ぬことから、足場が新たな細胞で再配置される前にＳＤＳを除去した。小さな足場では、ＳＤＳの濃度は低くてよい；しかし対象物が大きいほど、完全な脱細胞化を受けるためにより高い濃度のＳＤＳが使用される場合がある。残余ＳＤＳは、十分な洗浄によって、特に低濃度のＳＤＳが使用される場合に除去できる。より高い濃度のＳＤＳは、特定のケースでは洗浄だけを介して除去することが困難で時間がかかるようになる場合がある。本明細書に記載されるとおり、ＣａＣｌ２の添加は、脱細胞化足場からの残留ＳＤＳの容易な除去を可能にできる。理論に束縛されることなく、この概念の背後にある原理はＳＤＳをミセルにするために塩緩衝剤を使用することであると考えられている。十分高い塩濃度が適切なミセル形成を刺激するために使用でき、高すぎる塩濃度は生体材料上に塩を析出させる場合がある。塩残留物は、ｄＨ２Ｏ、酢酸又はＤＭＳＯと共にインキュベートすることなどのいくつかの技術によって除去することができる。超音波処理も堅固に結合したデブリを除去するために使用できる。ＣａＣｌ２の濃度は、残留ＳＤＳの量に依存する場合がある。本研究では脱細胞化は、水中の０．１％ＳＤＳを使用することによって達成された。ＣａＣｌ２の濃度は、図１８に示されるとおり、脱細胞化のために使用されたＳＤＳの量に依存する場合がある。１００ｍＭの濃度では、中程度の量の塩／ミセルが足場上に析出した（図１９Ａ）。塩残留物は、ｄＨ２Ｏ中で足場をインキュベートすることによって効果的に除去された（図１９Ｂ）。
細胞増殖の改善は、残留ＳＤＳ及び塩の除去後に得られた（図２０）。塩の添加は、残留ＳＤＳの容易な除去を可能にできる；しかし、生体材料上に析出する塩も浸透圧の課題を回避するために除去されるべきである。塩がＳＤＳをミセルにした後、次のステップは塩を除去することである。塩残留物は、超音波処置、水インキュベーション、酢酸インキュベーション及びＤＭＳＯインキュベーションなどの種々の技術を用いて除去できる（図２０）。
ＣａＣｌ２に加えて、他の塩も生体材料から残留ＳＤＳを除去するために使用できる（図２１）。二価カチオンを有する塩を用いて生体材料を洗浄することは、二価カチオンがさらに堅固なＳＤＳミセル形成を促進したことから、それらの一価対応物よりも大きな細胞増殖を導いた（図２１）。
特定の実施形態では、塩の添加は、表面活性物質の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ、critical
micelle concentration）を変更できる。曇り点として公知の特定の濃度で、相転移が生じる場合があり、ミセルは不溶性になり、容易に洗浄除去することができる。
様々な塩化合物を生体材料から残留ＳＤＳを除去する課題を達成するために使用することができる。ＰＢＳ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣｕＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＣＯ３及びイブプロフェンナトリウム（すべて１００ｍＭ）を生体材料を清浄化し、残留ＳＤＳを除去するための塩洗浄として使用した。図２１に示す各塩処置は、細胞増殖を可能にする；しかし、二価カチオン（ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２）並びに炭酸アニオン基を含む塩は、より大きく細胞増殖を促進した。
生体材料官能化
セルロース構造は、生体材料の使用目的に応じて生化学的に官能化される場合がある。理解されるとおり、そのような修飾は潜在的使用及び適用を拡張できる。セルロースは、例えば、材料を様々な分子にコンジュゲートするために使用できる遊離ヒドロキシル基を有する。
この種類の修飾のための反応の２つの一般的に使用されるクラスは、アシル化及びアルキル化反応である。これらの反応は、種々の長さの炭化水素鎖を遊離ヒドロキシル基を介してセルロース構造に付着できるようにする。様々な鎖長及び形は、例えば立体障害が要因である場合は有用である可能性がある。より長い鎖の使用は、立体障害を減少できる可能性があり、また逆も同様である。ジカルボン酸を使用するアシル化反応は、生体材料の官能化の可能性を提供できる。使用できるジカルボン酸の一部のクラスとして、これだけに限らないが、直鎖状飽和ジカルボン酸、分枝状ジカルボン酸、不飽和ジカルボン酸、置換ジカルボン酸及び芳香族ジカルボン酸が挙げられる。アシル化及びアルキル化反応に加えて、例えばホウ素、イオウ、窒素及び／又は亜リン酸を含有する化合物などの他の化合物も官能基とセルロースとの間の連結を媒介するために使用できる。
様々な官能基が、特定の機能を満たすために鎖の他方の末端に付加される場合がある。これらの官能基として、これだけに限らないが、炭化水素、酸素、窒素、イオウ、亜リン酸、ホウ素及び／又はハロゲンを含有する基が挙げられる。官能基の選択は、目的とする用途に依存する場合がある。例えば、目的とする用途が特定の領域での細胞増殖を予防することである場合、立体的な非極性炭化水素官能基を使用することができる；反対に、目的とする用途が細胞増殖を促進することである場合、コラーゲンなどの細胞外マトリクスタンパク質がセルロースに結合できることから、カルボン酸が選択される場合がある。
細胞壁の様々な要素は、生体材料の特定の構造特性を増強することを可能にする。アスパラガス及びリンゴ組織の二次細胞壁構造は、生体材料に強度を与えるために例えばペクチン及びリグニン（図２２）を含有できる。
理解されるとおり、足場生体材料はセルロースに限定されない。多数の他の細胞壁構造を生体材料のために使用することができる。図２２では、示されるセルロースに加えて桂皮アルデヒド、ペクチン及びリグニンもある。これらの追加的な第２の細胞壁構造も官能化することができる。
セルロースの化学修飾は、生体材料の化学的及び物理的特性の調節を可能にできる。結果として、生体材料は、特定の目的に特化することができる。例えば、パターン形成された細胞増殖は、特定の領域における細胞増殖を阻害すること（一時的又は持続的に）及び他において促進することによって達成できる。さらに細胞型特異的分子は、特定の細胞型の増殖／侵入／分化を促進するためのこれらの官能化方法を通じて生体材料に導入することができる。生体材料の官能化は、適切な細胞機能及び組織工学に関与する生物学的に関連する微小環境の改造も可能にする。
表面の生物学的修飾
天然セルロースは、C2C12筋芽細胞、3T3線維芽細胞及びヒト上皮HeLa細胞を含む哺乳動物細胞をサポートできる。しかし、機能的生体材料は、特定の使用目的に合わせて化学的に及び機械的にさらに調整することができる。２つの異なる技術が脱細胞化セルロース足場の堅さを変更するためにこれらの実験において使用された。加えて位相差画像は、生体材料が化学的及び物理的修飾後にも哺乳動物細胞培養をさらにサポートすることを実証している。
コラーゲンを含む足場を官能化するために、試料を１０％酢酸及び１ｍｇ／ｍＬラットテールコラーゲンＩ型（Invitrogen社）の溶液中で６時間インキュベートし、その後使用前にＰＢＳで洗浄した。足場を化学的に架橋するために、試料を１％ＥＭグレードグルタルアルデヒド溶液（Sigma-Aldrich社）中で６時間インキュベートした。次いで足場をＰ
ＢＳ中でリンスし、いかなる未反応グルタルアルデヒドも減らすために１％水素化ホウ素
ナトリウム（Sigma-Aldrich社）の溶液中で一晩インキュベートした。細胞を足場に播種
する前に、すべての試料（天然、コラーゲンコート又は架橋）を３７℃で、５％ＣＯ２に維持された標準的組織培養インキュベーターにおいて哺乳動物細胞培養培地（以下に記載）中で１２時間インキュベートした。結果を図２３Ａ〜Ｄに示す。天然組織及び未修飾足場は、機械的特性においていかなる顕著な差異も示さない。コラーゲン官能化及び化学的架橋足場の両方はＤＭＥＭ足場と比較して弾性における顕著な増加を示した。脱細胞化（ＳＤＳ）、コラーゲン官能化（ＳＤＳ＋Ｃｏｌｌ）及びグルタルアルデヒド架橋（ＳＤＳ＋ＧＡ）足場は、実験条件下ですべてC2C12細胞の増殖をサポートした。
セルロース足場及び型技術、コーティング剤
本発明者らは、セルロース足場が独立型３Ｄ生体材料としてどのように作用できるかを以前示した。本明細書において本発明者らは、脱細胞化セルロースがどのように様々な肉眼的形に切断できるかを示している（図２４：環状）。C2C12マウス筋芽細胞を生体材料
上に播種し、細胞を２週間、増殖及び足場に侵入させた。２週間後、構造は細胞で満ちていた（図２４）。生体材料は、従来の型技術との組合せでも同様に使用できる。本研究では本発明者らは、それぞれゼラチン及びコラーゲンを使用する一時的及び持続性両方の逆型のために、どのようにセルロースコンストラクトが使用できるかを示している（図２４Ｂ〜Ｃ）。ゼラチンは、３２℃の融解温度を有する。一時的な逆型のために、細胞は、３７℃で細胞培養培地中の１０％ゼラチン溶液に再懸濁された。細胞が生体材料に播種されたすぐ後に、ゼラチン溶液をその融解温度以下に冷却し、凝固させた。ゼラチンゲルの形成は、基質に付着する時間を細胞に与える。インキュベーター中に置かれた後にゼラチンゲルが３７℃に加熱されると、ゼラチンは溶け、一方細胞は生体材料上に残った。反対にセルロースは、ゲルが望ましい場合に持続性ゲルのための逆型としても作用できる。持続性逆型のために、セルロースは細胞を含有するコラーゲン溶液で覆われた（図２４Ｃ）。コラーゲン溶液は、急速に凝固し、生体材料及び細胞を含有する持続性ゲルを形成した。
型技術は、ゼラチン及びコラーゲンだけでなく他のハイドロゲルにさらに適用できる。他の可能なゲルとして、これだけに限らないが、例えばアガロース、ポリウレタン、ポリエチレングリコール、キサンタン、メチルセルロース、アルギン酸、ヒアルロナン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリエステル、親水コロイド、アラビアゴム、ペクチン及び／又はデキストランが挙げられる。ハイドロゲルは、増殖因子、薬物などの他の化合物でも同様に含浸されてよい。そのようなゲルは、活性側鎖を用いても官能化することができる。結果として、例えばセルロースが第１の機能性を有し、ハイドロゲルが第２の機能性を有することが検討される。さらに、特定の実施形態では複数の機能を有する複数のハイドロゲルを組合せで使用することができる。最終的にこれらのゲルは、一時的で、経時的に融解してよく、及び／又は時間依存的又は時間非依存的である場合がある２つ以上の機械的／化学的特性を有する多機能材料を作製するために、元のセルロース又はキチン足場に架橋されてよい。
追加的要素／化合物は、表面をコートするために使用でき、又は官能化を通じて生体材料に結合できる。追加的要素の選択は、目的の用途に依存する。例えば生体材料が神経再生を促進するためである場合、神経増殖因子（ＮＧＦ、Nerve Growth Factor）タンパク
質を追加できる。反対に生体材料が薬物送達のためである場合、薬物を含有するウイルスカプセルは使用できる。さらに生体材料は、例えば免疫応答が問題になる場合、イブプロフェン塩を用いてコートされてよい。種々の要素を生体材料に加える可能性は検討される。これらの要素として、これだけに限らないが、タンパク質（例えばコラーゲン、エラスチン及びインテグリン）、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）、脂肪酸（例えばステアリン酸、パルミチン酸及びリノール酸）、代謝物（例えばアスパラギン酸、ビタミンＢ２及びグリセロール）、リガンド（例えばビタミンＤ、テストステロン及びインス
リン）、抗原（例えばペプチド、多糖及び脂質）、抗体（例えばＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＧ）、ウイルス（例えばＨＩＶ、ＨＥＰ Ｃ及びウシポックス）、合成ポリマー（例えばナイロン、ポリエステル及びテフロン）、官能基（カルボン酸、エステル及びイミド）、薬物（例えば例としてヒドロコドン、アモキシシリン、プラビックス）、小胞（例えば液胞、輸送小胞及び分泌小胞）、有機分子（例えば炭水化物、リガーゼ及びビタミン）、並びに／又は無機分子（例えば鉄、チタン及び金）が挙げられる。付加的に、細菌（これだけに限らないがビフィドバクテリウム属など）は、マイクロバイオームを変更／調節するために加えることができる。細胞特異性が望ましい場合、例えば細胞動員因子が挙げられる。
生体材料のためのサポート構造
追加的要素／化合物は、生体材料のためのサポート構造として使用できる。追加的要素の選択は、目的の用途に依存する。例えば、生体材料が一定の負荷を支え、その形を維持するためである場合、チタン構造を含むことができる。例として、そのような要素／構成成分として、チタン、低Ｃ鋼、アルミニウム、Ｃｏ−Ｃｒ合金、３１６型ステンレススチール、ＰＭＭＡセメント、超高ＭＷ ＰＥなどが挙げられる。特定の実施形態では、そのような要素は、生体材料内（内側）、生体材料の外側又は両方に加えることができる。特定の実施形態では、そのような要素／化合物としてＦＤＡ承認を既に通過したものが挙げられる。
細胞の侵入及び増殖
共焦点レーザー走査顕微鏡をセルロースコンストラクトの上面及び底面の約３００μｍ
ｚ薄片を画像化するために使用した。視野の深度が厚さ約１．２ｍｍ未満のリングであったことから、両側が画像化された。図２５は、セルロース生体材料上の細胞のｘｙ及びｚｙ投影を示している。細胞の核（青）は、セルロース細胞壁（赤）に沿って見出された（図２５ ｘｙ投影）。共焦点走査の直交図は、細胞が足場に侵入したことを明らかにした（図２５ ｚｙ投影）。共焦点画像化は、細胞の侵入及び増殖を定量できるようにした（図２６）。細胞核画像は、ImageJ adaptive threshold pluginを使用して閾値化され、分析粒子プラグインを合計核面積を測定するために使用した。最初に、細胞を試料の上面に播種した。生体材料の上面及び底面を覆った核面積の比を細胞侵入を測定するために使用した。細胞侵入について３つの異なる条件間に統計的差異はなかった（図２６）。実際に、上面：底面の比は、１に近かった（図２６）。画像化した薄片の合計核面積を各条件での細胞の増殖を比較するために算出した。合計核面積が３つの条件間で有意に異ならなかったことが見出された。結果として、一時的及び持続性逆型は、検査した条件下で、細胞増殖に影響を与えなかった。
型技術及び官能化技術は、異なる構造を合わせて接合するために使用できる。結果として特定の実施形態では、例えば大きな複合体構造をインビボ組織を模倣するように作製することができる。
植物由来脱細胞化セルロース足場内の人工的に作られた構造
植物セルロース足場内の構造の人工的作製を、セルロース足場への宿主細胞の移動を増加させるなどの具体的な目的のための様々な構造を作製する実行可能性を実証するために実施した。結果は、そのような人工構造がリンゴ由来セルロースベースの足場内に作製された図２７に示されている。
これらの研究では、マウスを、眼を眼科用液体ゲル（Alco Canada社、ON、Canada）の
適用によって保護して２％イソフルランUSP-PPC（Pharmaceuticalpartners of Canada社
、Richmond、ON、Canada）を使用して麻酔した。マウス背部の毛を剃り、その下の皮膚をENDURE400 Scrub-Stat4 Surgical Scrub（グルコン酸クロルヘキシジン、４％溶液;Ecolab社、Minnesota、USA）及びSoluprep（２％ ｗ／ｖクロルヘキシジン及び７０％ ｖ
／ｖイソプロピルアルコール;3M Canada社、London、ON、Canada）を使用して清浄化し、滅菌した。動物の水分補給は、１ｍｌの０．９％塩化ナトリウム溶液（Hospira社、Montreal、QC、Canada）の皮下投与（ｓ．ｃ．）を介して維持された。外科的手技を通じて、
厳密に無菌性のすべての手段が生着手術のために支持された。足場を移植するために、２カ所の８ｍｍ切開を各マウスの背部セクションに作製した（上及び下）。２つのセルロース足場試料を別々及び独立に各マウスに移植した。次いで切開をSurgipro II monofilament polypropylene 6-0（Covidien社、Massachusetts、USA）を使用して縫合し、経皮的ブピバカイン２％（一水和物として；Chiron Compounding Pharmacy社、Guelph、ON、Canada）を感染を予防するために手術部位に局所適用した。加えてブプレノルフィン（ＨＣＬ
として）（０．０３ｍｇ／ｍｌ；Chiron Compounding Pharmacy社、Guelph、ON、Canada
）を鎮痛剤としてｓ．ｃ．投与した。次いですべての動物を続く３日間animal care servicesによって注意深くモニターし、同じ薬理学的処置の追加的処置を受けさせた。足場移植後１及び４週間で、マウスをＣＯ２吸入を使用して安楽死させた。背部皮膚を注意深く切除し、ＰＢＳ溶液に直ちに浸した。次いでセルロース足場を含有する皮膚薄片を撮影し、切断し、１０％ホルマリン中で少なくとも４８時間固定した。次いで試料を、the University of Ottawaのthe PALM HistologyCore Facilityによってパラフィンに包埋する前に７０％エタノール中に保った。
結果は図２７に示されている。２つの異なる構造が脱細胞化セルロース足場内に作製され、セルロース足場への宿主細胞移動を増加させるなどの具体的な目的のために生体材料を含む様々な構造を作製する実現可能性を実証している。図２７Ａでは、セルロース足場内に５つのネガティブ円柱状スペースを作製するために１ｍｍ生検パンチを使用した。反対に図２７Ｂでは、単一の中央のネガティブスペースを作製するために３ｍｍ生検パンチを使用した。移植のほんの４週間後に血管形成の増加が、人工由来ネガティブスペースから直接始まって観察できた（図２７Ｃ及びＤ）。２８Ｃでは、血管が生体材料の四隅それぞれにあり、人工由来ネガティブスペース内の血管形成の増加を示唆している。同様に２７Ｄでは、セルロース足場の上面に血管を観察することができ、血管がセルロース足場を通ったことを示唆している。Ｈ＆Ｅを用いて染色した代表的なセルロース足場の横断面（図２７Ｅ〜Ｆ）。
植物界におけるセルロースベースの起源の組織及び構造の種々の例
図２８は、４週間及び／又は８週間で示される植物界から選択されるセルロースベースの起源の組織及び構造の種々の例を提供している。この図は、種々の供給源由来のセルロース足場、それらの切除及び表示の４週間及び８週間後の組織像を示す図である。
これらの研究では、種々の植物由来セルロース足場を、生体適合性を評価するために４週間及び／又は８週間マウス内に皮下移植した。種々の植物の選択組織を、インビボでの宿主細胞移動についての植物由来セルロース及び植物構造の生体適合性を評価するために４又は８週間の期間移植した。すべての例において、セルロース足場への細胞移動及び増殖が観察され、これらの実験において植物由来セルロース足場の生体適合性を明らかにしている。セルロース足場生体材料の皮下移植を、小さな皮膚切開（８ｍｍ）によってC57BL/10ScSnJマウスモデルの背部領域に実施した。各移植片を、その移植前に足場面積比較
のために測定した（第１カラム：セルロース足場）。セルロース移植を、表示する４又は８週間で切除した（第２カラム：切除）。セルロース足場内１ｍｍから開始する一連の５μｍ厚の薄片を切断し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した（第３カラム：組織像）。細胞浸潤の評価のために、４０ｘ対物レンズを備えたZeiss MIRAX MIDI
Slide Scanner（Zeiss社、Toronto、Canada）を使用して顕微鏡写真を捕捉し、Pannoramic Viewer （3DHISTECH社、Budapest、Hungary）及びImageJソフトウェアを使用して分析した；
皮下移植された植物由来セルロース生体材料の生体適合性（プロステーシス−審美的）
本明細書上記の実施例３に基づいて、セルロース足場移植及び切除を、皮下移植片を評価するために実施した。実験結果を図２９に示す。セルロース足場生体材料の皮下移植を小さな皮膚切開（８ｍｍ）によって、C57BL/10ScSnJマウスモデルの背部領域に実施した
（図２９Ａ）。各移植片をそれらの移植の前に足場面積比較のために測定した（図２９Ｂ）。セルロース足場を手術後１週間（図２９Ｄ）、４週間（図２９Ｅ）及び８週間（図２９Ｆ）後に切除し、肉眼写真を撮った（対照皮膚は図２９Ｃ）。各時点で、血管は、セルロース移植片に明確に一体化されており、生体適合性を実証している。同様に移植片周囲の組織に急性又は慢性炎症はない。経時的なセルロース足場表面積における変化は図２９Ｇに示されている。移植前の足場は、２６．３０±１．９８ｍｍ２の面積を有した。移植後、足場の面積は、１週間後に２０．７４±１．８０ｍｍ２、４週間後に１６．４１±２．４４ｍｍ２及び８週間後に１３．８２±３．８８ｍｍ２に低下した。セルロース足場の表面積は、移植８週間後に約１２ｍｍ２（４８％）顕著に減少した（＊＝Ｐ＜０．００１；ｎ＝１２〜１４）；
組織学的分析のために、次の実験を実施した。
セルロース足場内１ｍｍから開始する一連の５μｍ厚の薄片を切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）並びにマッソントリクロームを用いて染色した。免疫細胞化学のために、熱誘発エピトープ修復を１１０℃で、１２分間、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて実施した。抗ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ１（１：１００；Novus Biologicals社、NB100-2284、Oakville、ON、Canada）、抗アルファ平滑筋アクチン（１：１０００、ab5694
、abcam社、Toronto、ON、Canada）及び抗ＣＤ４５（１：３０００；ab10558、abcam社、Toronto、ON、Canada）一次抗体を１時間、室温でインキュベートした。ブロッキング試
薬（Background Sniper、BiocareMedical社、Concorde、CA、USA）及び検出系MACH4（BiocareMedical社、Concord、CA、USA）を企業の仕様書に従って適用した。細胞浸潤、細
胞外マトリクス沈着及び血管形成（血管新生）の評価のために、４０ｘ対物レンズを備えたZeiss MIRAXMIDI Slide Scanner （Zeiss社、Toronto、Canada）を使用して顕微鏡像
を捕捉し、Pannoramic Viewer（3DHISTECH社、Budapest、Hungary）及びImageJソフトウ
ェアを使用して分析した。
図３０は、生体適合性及び細胞浸潤の結果を示している。代表的なセルロース足場の横断面をＨ＆Ｅ及び抗ＣＤ４５を用いて染色した。これらの全体像は、１週間での急性の中程度から重度の予測された異物反応（図３０Ａ）、４週間での軽度の慢性免疫及び続く浄化プロセス（図３０Ｂ）並びに最終的な、８週間での天然マウス組織へのセルロース足場の同化（図３０Ｃ）を示している。所望の領域のさらに高度な拡大図（図３０Ｄ〜Ｆ）、差し込み図参照（図３０Ａ〜Ｃ）は、生体材料同化プロセスでの細胞型集団の観察を可能にしている。１週間では、本発明者らは、急性の中程度から重度の免疫応答を特徴付ける顆粒球、詳細には；多形核（ＰＭＮ）及び好酸球の集団、移植手順への正常な反応を観察できる（図３０Ｄ）。４週間では、免疫応答の減少が観察でき（軽度から低い免疫応答）、足場周囲の表皮内の細胞の集団は、ここで、より高いレベルの単球及びリンパ球を含有し、慢性応答を特徴付けている（図３０Ｅ）。最終的に、８週間で、免疫応答は、表皮組織に完全に再吸収され、ここで正常であると考えられる（図３０Ｆ）。Ｈ＆Ｅ染色を用いて観察された免疫応答は、白血球の周知のマーカー、抗ＣＤ４５抗体を使用して確認される（図３０Ｇ〜Ｉ）。足場内の細胞の集団は、ここで主にマクロファージ、多核細胞及び
活性線維芽細胞である。
活性線維芽細胞の存在は、セルロース足場が新たな細胞外マトリクスの沈着のための基質として作用したかどうかという疑問を導く。このことは、移植後の各時点で固定されたセルロース足場切片のマッソントリクローム染色を使用して判定した（図３１）。移植後１週間で組織学的研究は、コラーゲン足場の内部のコラーゲン構造の非存在を示している（図３１Ａ、Ｄ、Ｇ）。４週間後、少量のコラーゲンが足場内に沈着し始め（図３１Ｂ、Ｅ、Ｈ）、８週間までに、多量のコラーゲンが多数の足場空洞内に明らかに見ることができる（図３１Ｃ、Ｆ、Ｉ）。形態（Ｈ＆Ｅ染色、紡錘状）及び抗アルファ平滑筋アクチン染色（データ未記載）を通じて同定された活性線維芽細胞の存在は、８週間で観察された大部分のコラーゲンの沈着と完全に一致している。沈着したコラーゲンネットワークの複雑性は、コラーゲンマトリクス内の個々のコラーゲン繊維を見ることができる図３１Ｉにおいて明らかにされている。これは、瘢痕組織において見出されるコラーゲンの特徴的な高密度で厚い、ケーブル様の組織とは対照的である。
８〜２５μｍの範囲の毛細血管も移植後早くも１週間で足場内に同定された。移植後４週間及び８週間で、血管及び毛細血管が足場内及び周囲の皮膚組織内に広範に観察できた。本発明者らは、切除の際に撮影された肉眼写真においてセルロース足場上及び周囲の真皮に存在する血管を観察した（図３２Ａ）。血管の複数の横断面が、赤血球（ＲＢＣ）の存在を伴って、足場移植の４週間以内に同定される（図３２Ｂ；Ｈ＆Ｅ染色）。ＲＢＣ及び内皮細胞を含む毛細血管が明確に見られる同じ結果が移植後８週間で得られる（図３２Ｃ；マッソントリクローム）。
脊髄損傷の修復のためのバイオインスパイアード及び生体機能性移植
本明細書に記載されるプロセスは、滅菌セルロース移植片をその形及び機械的強度を保って産生するために使用できる。本発明者らの施設内のバルク機械検査装置を利用して、本発明者らの天然セルロース移植片の弾性係数は、移植片が直線のマイクロチャネルに平行な方向に圧縮される場合、約２ＭＰａと記録された。移植片がマイクロチャネルに直角に交わる方向に圧縮される場合、係数はおよそ一桁小さく観察される。これらの値は、硬膜及び軟膜の弾性係数と高度に一致し、これらの移植片が周囲の脊髄組織の大部分の機械的特性の範囲内にあることを意味している。図３３は、脱細胞化アスパラガス木部構造及びマイクロチャネルの画像を示している。
成体ラットの脳解剖及び切除は、初代ラットニューロスフェアの誘導を可能にした。背部領域を清浄化し、髄質を露出させる。マリウスニッパーを使用して、後部頭蓋骨を前頭葉までずっと除去し、頭蓋骨の一部を除去して脳を露出させる。嗅球を最後に切断して脳を頭蓋骨から穏やかに外した。外した脳を氷上の解剖培地（MEM Alpha medium (Life Technologies社）１％Ｌ−グルタミン（Life Technologies社）及び１％ペニシリン（LifeTechnologies社）を用いて満たしたペトリ皿に浸した。次いで脳を脳マトリクス及び海馬
を含有する薄片に薄片化した。第３脳室のすぐ側の灰白質を解剖培地を含む試験管に採取した。解剖培地中の灰白質組織を連続的に遠心分離し、上清を採取した。すべての上清を除去したら、最後の管を遠心分離し、沈殿を２ｍＬの培養培地（Advanced DMEM/F12 medium（Life Technologies社）、１％ Ｌ−グルタミン（Life Technologies社）及び１％N2
supplement（CEDARLANE LABORATORIES LTD））に再懸濁した。再懸濁細胞溶液を初代ラ
ットニューロスフェアの増殖を可能にするために０．００１％ヒト上皮増殖因子及び塩基性線維芽細胞増殖因子（PEPROTECH社）を含む６ウェル超低接着プレートにアリコートし
た。特注生産された細胞培養チャンバーで、ニューロスフェアを個々の移植片の上に局所的に播種した。ニューロスフェアを培養し、２週間、５％ＣＯ２インキュベーターで維持した。培養培地は、毎日交換した。足場試料を４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し
た。セルロース細胞を先に使用したプロトコルを用いて染色した。ニューロスフェアをコムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）４８８（Invitrogen社）を用いて染色し、共焦点蛍光顕微鏡を用いて検討した（図３４Ａ）。
実施例３の研究において検討したものに類似のプロトコルに従って、脱細胞化維束管植物をマウスに皮下移植した。組織学的結果は、移植４週間後、維束管構造がインタクトのままであり、足場全体に見えることを実証している（図３４Ｂ）。構造と一致して、宿主細胞は、セルロース足場の５ｍｍ全長全体にわたって観察できる。インビトロ及びインビボでの良好な最初の結果に続いて、脱細胞化植物足場を脊髄損傷移植に適用した。メスSprague Dawleyラットをイソフルランを用いて麻酔した。覆っている皮膚を剃り、ベタダインを用いて準備した。無菌条件下で、滅菌した機器を使用して、椎骨Ｔ７〜Ｔ１０を露出させた。背部及び肋間の筋肉の切開に続いて、椎弓切除をＴ８及びＴ９に行う。硬膜をマイクロシザーズを用いて露出させた。Ｔ８脊髄をマイクロシザーズを用いて１回の明快な動作で離断する。離断から生じる出血はすべて、サージフォーム（surgifoam）を用いて
管理する。脊髄を退縮させ、セルロース足場を移し、尾側及び頭側断端を連結するように置く（図３４Ｃ）。足場設置に続いて、Tisseel fibrin glue（Baxter社）をセルロース
移植片を固定するために使用した。切開の筋肉層を３−０バイクリル縫合材料を用いて閉じ、表皮及び真皮をミシェルクリップを用いて閉じる。ブプレノルフィンを、ラットが麻酔から回復するときまで有効に作用することを確実にするために閉じる前に投与した。
ＢＢＢスコアは、８週間の経過にわたって増加することが観察された。
移植８週間後、ラット（ｎ＝７）は、協調足踏み及び体重を支える能力を示して自発運動活性の改善を示した（ＢＢＢ＝９．２±２．５）（図３５）。加えて、８週間で、第２の脊髄離断（移植片下）を実施し、ＢＢＢスコアを０に戻した。対照ラット（ｎ＝７、フィブリンのみ）は、０〜１の範囲のＢＢＢスコアを示した。結果は、自発運動回復が反射による可能性は低いことを示唆している。次いで脊髄を８週間で解剖し、移植部位で薄片化した。切片をミエリン化ニューロンを示すために、ヘマトキシリン、エオシン及びルクソールファストブルー（Ｈ＆Ｅ−ＬＦＢ、hematoxylin, eosin and luxol fast blue）の組合せで染色した。データは、移植のマイクロチャネルを通った宿主細胞について陽性染色を明らかにし、自発運動の改善と一致した（図３５Ｄ）。加えて本発明者らは、動物を犠牲にすることなく、脊髄の連続性及び移植片が崩壊したかどうかの観察を可能にするＭＲＩプロトコルを実証し、最適化することができた。頭側及び尾側断端境界面（図３５Ａ−ｉ、３Ａ−iii）は、足場移植から、明確に識別できる（図３５Ａ−ii）。図３６及び
図３７は、脊椎のＴ８〜Ｔ９領域に移植された脊髄移植片の全体像、及び離断部位周囲の腹側薄片をそれぞれ示している。図３７に示すとおり、緑フィラメントは、腹側方向に伸びている脊髄移植片周囲に観察できる（赤色矢印）。これらのフィラメントは、インビボでの１２週間後にラットの離断された部位内の成熟ニューロンを表している。反対に、対照Ｂ）内で組織化された神経フィラメントは観察できず、対照離断部位内の成熟フィラメントの欠如を示している。加えてHoechst染色は、対照と比較して、離断部位内の脊髄移
植片周囲の核、及びそのような細胞の数の顕著な増加を明らかにしている。
これらの研究では、離断された脊髄断端の間への足場生体材料の挿入に続く、フィブリングルー適用及び創傷修復は、研究のほんの８週間後に、対照ラット（ｎ＝４、移植片不含有）が運動機能において改善を示さず、完全に麻痺したままであった（ＢＢＢ ０〜１の間）ことを示した。注目すべきことに、アスパラガス由来移植片を有するラット（ｎ＝７）は、９．２±２．５のＢＢＢを示し、これらの研究において自発運動機能における劇的な改善を実証している。これらの動物は、協調足踏み及び体重を支える能力を示している。アスパラガス由来移植片それ自体が、ラットモデルにおいてＳＣＩを処置するために有望であることを示している。特定の実施形態では、本明細書に記載される足場生体材料
は、運動機能の改善のために、損傷された脊髄組織において神経前駆細胞を動員するために使用できる。
皮膚移植のための植物脱細胞化足場
マウスを、それらの眼を眼科用液体ゲル（Alco Canada社、ON、Canada）の適用によっ
て保護して、２％イソフルランUSP-PPC（Pharmaceuticalpartners of Canada社、Richmond、ON、Canada）を使用して麻酔した。マウス背部の毛を剃った。次いで剃った皮膚をNairゲルを用いて２分間処置した。Nairを皮膚から注意深く除去し、その下の皮膚をENDURE
400 Scrub-Stat4 Surgical Scrub（グルコン酸クロルヘキシジン、４％溶液；Ecolab社
、Minnesota、USA）及びSoluprep（２％ ｗ／ｖクロルヘキシジン及び７０％ ｖ／ｖイソプロピルアルコール；3MCanada社、London、ON、Canada）を使用して清浄化し、滅菌
した。動物の水分補給は、１ｍｌの０．９％塩化ナトリウム溶液（Hospira社、Montreal
、QC、Canada）の皮下投与（ｓ．ｃ．）を介して維持された。外科的手技を通じて、厳密に無菌性の手段が生着手術のために支持された。５ｍｍの円形の皮膚生検を除去する。ゲル強力接着剤を含むラバー絶縁パッドを生検上に皮膚生検が露出するように注意深く置く。次いでラバーパッドをマウスにSurgipro II monofilament polypropylene 6-0（Covidien社、Massachusetts、USA）を使用して８点で縫合する。次いで皮膚移植片を除去した皮膚と置き換えて置き、２つの吸収性透明接着テープを用いて密封する。経皮的ブピバカイン２％（一水和物として；Chiron Compounding Pharmacy社、Guelph、ON、Canada）を感
染を予防するために手術部位に局所適用した。加えてブプレノルフィン（ＨＣＬとして）（０．０３ｍｇ／ｍｌ；ChironCompounding Pharmacy社、Guelph、ON、Canada）を鎮痛
剤としてｓ．ｃ．投与した。次いですべての動物を続く３日間animal care servicesによって注意深くモニターし、同じ薬理学的処置の追加的処置を受けさせた。透明接着箇所は毎日交換し、皮膚移植片を撮影した。
図３８は、皮膚移植のために処理された脱細胞化リンゴ花托筒組織を示している。写真を創傷治癒プロセスの際の宿主細胞浸潤の程度を測定するために４日後に撮った（図３８Ｃ）；足場移植２週間後、マウスをＣＯ２吸入を使用して安楽死させた。背部皮膚を注意深く切除し、ＰＢＳ溶液に直ちに浸した。次いでセルロース足場を含有する皮膚薄片を撮影し、切断し、１０％ホルマリン中で少なくとも４８時間固定した。次いで試料を、the University of Ottawaのthe PALM HistologyCore Facilityによってパラフィンに包埋する前に７０％エタノール中に保持した。
骨移植のための植物脱細胞化足場
本研究は、骨再生のために本明細書に記載される生体材料の効率を示すために実施した。本明細書で、臨界サイズ頭蓋冠欠損ラットをセルロース足場が５ｍｍ円形欠損において骨再生を良好にサポートできることを実証するために使用した。
Sprague Dawleyラットを酸素中イソフルランを用いて麻酔し、外科的手技の前にブプレノルフィン及び滅菌生理食塩水の皮下注射を受けさせた。ラットを眼の間の鼻筋から頭蓋冠の尾方端までの間を剃り、眼を眼科用液体ゲルを適用することによって保護した。ラットを定位固定フレームに置き、温水ウォームパッド上でイヤーバーによって固定した。切開（１．５ｃｍ）を頭皮を超えて骨膜に、まさに鼻骨から尾側に中央矢状稜（ブレグマ）まで作製した。骨膜を矢状正中線下方へ分け、解剖した。頭蓋冠に５ｍｍトレフィン及び外科用ドリルを用いて、右（又は左）側頭頂骨に穴をあけた。スコア骨を硬膜から剥離し、ラットの頭蓋に５ｍｍ円形欠損を残す。欠損を滅菌正常生理食塩水を用いて慎重に洗浄し、５ｍｍ直径の円柱状（厚さ１ｍｍ）セルロース足場（図３９Ａ）を欠損に移植した（図３９Ｂ）。皮膚を皮膚層を縫合することによって閉じた。ラットを二酸化炭素吸入及び
全採血を使用して手術後４週間で安楽死させ、セルロース足場を組織学的分析（図３９Ｄ）のために周囲の骨組織（図３９Ｃ）に沿って回収した。組織を緩衝ホルマリン溶液中で固定し、メチルメタクリレート中に包埋する前にエタノール中で脱水した。種々の５μｍ厚の試料を細胞成分（核及び細胞質）の存在を明らかにするためにヘマトキシリン／エオシンを用いて染色した（図４０Ｄ）。セルロース足場の効率を定量的に測定するために、本発明者らは、表１に示すスコア化法を使用した−定量的組織学的スコア化パラメーター（Kretlow et al. 2010）を使用した。
Figure 2022002536
図３９に示す実験では、骨移植のための植物由来セルロース足場を評価した。記載の通り各円柱状（直径５ｍｍ、厚さ１ｍｍ）移植片を移植前に足場面積比較のために測定した（図３９Ａ）。セルロース足場移植片は、ラット頭蓋欠損に移植され、頭蓋欠損内に残るように位置付けた。次いで皮膚を移植片を覆って位置付け、足場を所定の位置に保つように縫合した（図３９Ｂ）。足場及び周囲の骨組織を移植４週間後に単離し、肉眼写真を撮った（図３９Ｃ）。次いで単離された組織は、脱灰し、パラフィンに処理／包埋した。セルロース足場内１ｍｍから開始する一連の５μｍ厚の薄片を切断し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した（図３９Ｄ）。骨再生の評価のために、４０ｘ対物レンズを備えたZeiss MIRAX MIDI Slide Scanner（Zeiss社、Toronto、Canada）を使用して顕微鏡写真を捕捉し、Panoramic Viewer（3DHISTECH社、Budapest、Hungary）及びImageJソフトウェアを使用して分析した；
組織学的結果は、欠損部と生体材料足場との境界面での骨と足場との直接接触を示している。
足場生体材料の例示形態
図４０Ａ〜４０Ｆは、セルロースベースの足場生体材料の様々な製剤例、物理的特性及び官能化を示している。図４０Ａは、セルロースが、様々な形に切断されたブロックとして使用できることを示している。図４０Ｂは、セルロースを脱水し、粉末形態に挽くことができることを示している。図４０Ｂは、セルロースがカルボキシメチルセルロースを含有する場合、クエン酸及び熱を用いて容易に架橋できることも示している。図４０Ｃは、粉末形態のセルロースがゲル（図４０Ｄ）又はペースト（図４０Ｅ、図４０Ｆ）を産生する望ましい稠度に再水和できることを示している。
移植後の生存率
図４１Ａは、生体材料（種々の供給源由来）の移植後の、移植後１週間、４週間及び８週間でのマウス（ｎ＝１９０）及びラット（ｎ＝１２）の実験的生存率を示すグラフである。図４１Ｂは、図４１Ａにおいてと同じ時点での生体材料拒絶率を示している。すべての動物（マウス及びラット）は、生体材料移植後生存し、すべてが各治験の期間を完全に生存し、これらの実験において移植拒絶の徴候を示したものはなかった。
植物及び真菌組織の例
様々な分類植物系が、植物分類において使用されており、これらのシステムのいくつかのバージョンが存在する（例：クロンキスト系及びＡＰＧ系）。
本明細書に記載される実験では様々な植物群、科、属及び種に分類される広範な植物を使用することによって、本発明者らのデータは、多種多様な植物を足場生体材料の調製において使用できることを示している。
一般に述べると、植物界は４つの主な群に分けられる：
− 顕花植物（被子植物）；
− 針葉樹、ソテツ及び同類（裸子植物）；
− シダ及びシダ類（羊歯植物）；
− 蘚類及び苔類（蘚苔類）
これらの４つの主な群は、多数の植物科を含有し、それは多数の属に分類され、さらに種に分類される。以下は、セルロース足場を生成できる主な植物科のリストである：
キツネノマゴ科（Acanthaceae）、アカリア科（Achariaceae）、アカトカルプス科（Achatocarpaceae）、ショウブ科（Acoraceae）、チチブイチョウゴケ科（Acrobolbaceae）、
マタタビ科（Actinidiaceae）、ケハネゴケモドキ科（Adelanthaceae）、レンプクソウ科（Adoxaceae）、アエクストキシコン科（Aextoxicaceae）、ハナミズナ科（Aizoaceae）
、アカニア科（Akaniaceae）、オモダカ科（Alismataceae）、アリソニア科（Allisoniaceae）、アルセウオスミア科（Alseuosmiaceae）、アルストロメリア科（Alstroemeriaceae）、フウ科（Altingiaceae）、ヒユ科（Amaranthaceae）、ヒガンバナ科（Amaryllidaceae）、ヤナギゴケ科（Amblystegiaceae）、アムボレラ科（Amborellaceae）、アナカンプロセス科（Anacampserotaceae）、ウルシ科（Anacardiaceae）、アナルトリア科（Anarthriaceae）、アミバゴケ科（Anastrophyllaceae）、ツクバカネズラ科（Ancistrocladaceae）、クロゴケ科（Andreaeaceae）、クロマゴケ科（Andreaeobryaceae）、アネミア科（Anemiaceae）、スジゴケ科（Aneuraceae）、アニソフィレア科（Anisophylleaceae）、バ
ンレイシ科（Annonaceae）、カサナリゴケ科（Antheliaceae）、ツノゴケ科（Anthocerotaceae）、アファノペタルム科（Aphanopetalaceae）、アフロイア科（Aphloiaceae）、セリ科（Apiaceae）、アプレニア科（Apleniaceae）、キョウチクトウ科（Apocynaceae）、
アポダンテス科（Apodanthaceae）、レースソウ科（Aponogetonaceae）、モチノキ科（Aquifoliaceae）、サトイモ科（Araceae）、ウコギ科（Araliaceae）、ナンヨウスギ科（Araucariaceae）、ツチゴケ科（Archidiaceae）、ヤシ科（Arecaceae）、アルゴフィルム科（Argophyllaceae）、ウマノスズクサ科（Aristolochiaceae）、アルネルゴケ科（Arnelliaceae）、アスパラガス科（Asparagaceae）、チャセンシダ科（Aspleniaceae）、アステリア科（Asteliaceae）、アステロペイア科（Asteropeiaceae）、アセロスペルマ科（Atherospermataceae）、メシダ科（Athyriaceae）、ヒモゴケ科（Aulacomniaceae）、アウストロバイレヤ科（Austrobaileyaceae）、ジンガサゴケ科（Aytoniaceae）、バラノプス科（Balanopaceae）、ツチトリモチ科（Balanophoraceae）、ヤクシマゴケ科（Balantiopsaceae）、ツリフネソウ科（Balsaminaceae）、バルベウイア科（Barbeuiaceae）、バルベ
ヤ科（Barbeyaceae）、タマゴケ科（Bartramiaceae）、ツルムラサキ科（Basellaceae）
、バティス科（Bataceae）、シュウカイドウ科（Begoniaceae）、メギ科（Berberidaceae）、ベルベリドプシス科（Berberidopsidaceae）、カバノキ科（Betulaceae）、ビーベルステイニア科（Biebersteiniaceae）、ノウセンカズラ科（Bignoniaceae）、ベニノキ科
（Bixaceae）、ブランドフォルディア科（Blandfordiaceae）、ウスバゼニゴケ（Blasiaceae）、シシガシラ科（Blechnaceae）、ヤチモクコク科（Bonnetiaceae）、ムラサキ科（Boraginaceae）、ボリア科（Boryaceae）、アオギヌゴケ科（Brachytheciaceae）、アブ
ラナ科（Brassicaceae）、ソコマメゴケダマシ科（Brevianthaceae）、パイナップル科（Bromeliaceae）、ブルッフゴケ科（Bruchiaceae）、ブルネリア科（Brunelliaceae）、ブルニア科（Bruniaceae）、カサゴケ科（Bryaceae）、ホオズキゴケ科（Bryobartramiaceae）、エビゴケ科（Bryoxiphiaceae）、ヒナノシャクジョウ科（Burmanniaceae）、カンラン科（Burseraceae）、ハナイ科（Butomaceae）、ツゲ科（Buxaceae）、キセルゴケ科（Buxbaumiaceae）、ビブリス科（Byblidaceae）、ホゴロモモ科（Cabombaceae）、サボテン科（Cactaceae）、カルセオラリア科（Calceolariaceae）、ウツクシチョウチンゴケ科（Calomniaceae）、テリハボク科（Calophyllaceae）、ロウバイ科（Calycanthaceae）、カリケラ科（Calyceraceae）、カタシロゴケ科（Calymperaceae）、ツキヌキゴケ科（Calypogeiaceae）、キキョウ科（Campanulaceae）、カンピネマ科（Campynemataceae）、カネ
ラ科（Canellaceae）、アサ科（Cannabaceae）、カンナ科（Cannaceae）、フウチョウソ
ウ科（Capparaceae）、スイカズラ科（Caprifoliaceae）、ヤマイモモドキ科（Cardiopteridaceae）、パパイヤ科（Caricaceae）、カルレマンニア科（Carlemanniaceae）、バタ
ーナット（Caryocaraceae）、ナデシコ科（Caryophyllaceae）、モクマオウ科（Casuarinaceae）、フナバハイゴケ科（Catagoniaceae）、ゴルフクラブゴケ科（Catoscopiaceae）、ニシキギ科（Celastraceae）、カツマダソウ科（Centrolepidaceae）、ケントロプラスク科（Centroplacaceae）、フクロフキノシタ科（Cephalotaceae）、ヤバネゴケ科（Cephaloziaceae）、コヤバネゴケ科（Cephaloziellaceae）、マツモ科（Ceratophyllaceae）
、桂科（Cercidiphyllaceae）、トゲバゴケ科（Chaetophyllopsaceae）、センリョウ科（Chloranthaceae）、コヤバネゴケモドキ科（Chonecoleaceae）、クリソバラヌス科（Chrysobalanaceae）、タカワラビ科（Cibotiaceae）、キンクリドタ科（Cinclidotaceae）、
キルカエアステル科（Circaeasteraceae）、ハンニチバナ科（Cistaceae）、フクチョウ
ソウ科（Cleomaceae）、リョウブ科（Clethraceae）、ジンチョウゴケ科（Cleveaceae）
、コウヤノマンネングサ科（Climaciaceae）、オトギリソウ科（Clusiaceae）、イヌサフラン科（Colchicaceae）、コルメリア科（Columelliaceae）、シクンシ科（Combretaceae）、ツユクサ科（Commelinaceae）、キク科（Compositae）、マメモドキ科（Connaraceae）、ジャゴケ科（Conocephalaceae）、ヒルガオ科（Convolvulaceae）、ドクウツギ科（Coriariaceae）、ミズキ科（Cornaceae）、コルシア科（Corsiaceae）、ゼニゴケモドキ科（Corsiniaceae）、コリノカルプス科（Corynocarpaceae）、オオホザキアヤメ科（Costaceae）、ベンケイソウ科（Crassulaceae）、クロッソソマ科（Crossosomataceae）、ツルゴケ科（Cryphaeaceae）、クテノロフォン科（Ctenolophonaceae）、ウリ科（Cucurbitaceae）、クルキタ科（Culcitaceae）、クノニア科（Cunoniaceae）、ヒノキ科（Cupressaceae）、カーティシア科（Curtisiaceae）、ヘゴ科（Cyatheaceae）、ソテツ科（Cycadace
ae）、パナマソウ科（Cyclanthaceae）、シオニラ科（Cymodoceaceae）、キノモリア科（Cynomoriaceae）、カヤツリグサ科（Cyperaceae）、キリラ科（Cyrillaceae）、ユガミイタチゴケ科（Cyrtopodaceae）、キストディウム科（Cystodiaceae）、ナヨシダ科（Cystopteridaceae）、キティヌス科（Cytinaceae）、ホソバツガゴケ科（Daltoniaceae）、ユ
ズリハ科（Daphniphyllaceae）、ダシポゴン科（Dasypogonaceae）、ダティスカ科（Datiscaceae）、シノブ科（Davalliaceae）、デゲネリア科（Degeneriaceae）、キノボリツノゴケ科（Dendrocerotaceae）、コバノイシカグマ科（Dennstaedtiaceae）、イワウメ科（Diapensiaceae）、カイナンボク科（Dichapetalaceae）、ディクソニア科（Dicksoniaceae）、ミナミオオミゴケ科（Dicnemonaceae）、シッポゴケ科（Dicranaceae）、カナボウ
ノキ科（Didiereaceae）、ビワモドキ科（Dilleniaceae）、ディオンコフィルム科（Dioncophyllaceae）、ヤマノイモ科（Dioscoreaceae）、ディペントドン科（Dipentodontaceae）、イクビゴケ科（Diphysciaceae）、イワヤシダ科（Diplaziopsidaceae）、ヤブレガ
サウラボシ科（Dipteridaceae）、フタバガキ科（Dipterocarpaceae）、ディラクマ科（Dirachmaceae）、ヨレエゴケ科（Disceliaceae）、キンシゴケ科（Ditrichaceae）、ドリ
アンテス科（Doryanthaceae）、モウセンゴケ科（Droseraceae）、ドロソフィルム科（Drosophyllaceae）、ドリオプテリダ科（Dryopteridacae）、オシダ科（Dryopteridaceae）、カキノキ科（Ebenaceae）、エクダイオコレア科（Ecdeiocoleaceae）、コワバゴケ科（Echinodiaceae）、グミ科（Elaeagnaceae）、ホルトノキ科（Elaeocarpaceae）、ミゾハ
コベ科（Elatinaceae）、エンブリンギア科（Emblingiaceae）、ヤリカツギ科（Encalyptaceae）、ツヤゴケ科（Entodontaceae）、マオウ科（Ephedraceae）、カゲロウゴケ科（Ephemeraceae）、トクサ科（Equisetaceae）、ツツジ科（Ericaceae）、ホシクサ科（Eriocaulaceae）、ヒナノハイゴケ科（Erpodiaceae）、コカノキ科（Erythroxylaceae）、エ
スカロニア科（Escalloniaceae）、トチュウ科（Eucommiaceae）、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）、エウフロニア科（Euphroniaceae）、エウポマティア科（Eupomatiaceae）
、フサザクラ科（Eupteleaceae）、エビゴケモドキ科（Eustichiaceae）、ジャゴケモド
キ科（Exormothecaceae）、コゴメゴケ科（Fabroniaceae）、ブナ科（Fagaceae）、ホウ
オウゴケ科（Fissidentaceae）、イイギリ科（Flacourtiaceae）、トウツルモドキ科（Flagellariaceae）、カワゴケ科（Fontinalaceae）、ウロコゼニゴケ科（Fossombroniaceae）、フーキエリア科（Fouquieriaceae）、フランケニア科（Frankeniaceae）、ヒョウタ
ンゴケ科（Funariaceae）、ガリア科（Garryaceae）、ゲイッソロマ科（Geissolomataceae）、ゲルセミウム科（Gelsemiaceae）、リンドウ科（Gentianaceae）、ウロコゴケ科（Geocalycaceae）、フウロソウ科（Geraniaceae）、ゲラルディナ科（Gerrardinaceae）、
イワタバコ科（Gesneriaceae）、ハイツボゴケ科（Gigaspermaceae）、イチョウ科（Ginkgoaceae）、ギセキア科（Gisekiaceae）、ウラジロ科（Gleicheniaceae）、グネツム科（Gnetaceae）、ゲーベルゴケ科（Goebeliellaceae）、ゴモルテガ科（Gomortegaceae）、
クサトベラ科（Goodeniaceae）、グーピア科（Goupiaceae）、ギボウシゴケ科（Grimmiaceae）、スグリ科（Grossulariaceae）、グルッビア科（Grubbiaceae）、グアマテラ科（Guamatelaceae）、グンネラ科（Gunneraceae）、ミゾゴケ科（Gymnomitriaceae）、ギロステモン科（Gyrostemonaceae）、ネジミゴケ科（Gyrothyraceae）、ハエモドルム科（Haemodoraceae）、ハロフィトゥム科（Halophytaceae）、アリノトウグサ科（Haloragaceae）、マンサク科（Hamamelidaceae）、ハングアナ科（Hanguanaceae）、コマチゴケ科（Haplomitriaceae）、ハプタントゥス科（Haptanthaceae）、ヒジキゴケ科（Hedwigiaceae）、オウムバナ科（Heliconiaceae）、ホゴケモドキ科（Helicophyllaceae）、ハナイカダ科
（Helwingiaceae）、キリシマゴケ科（Herbertaceae）、ハスノハギリ科（Hernandiaceae）、ヒマンタンドラ科（Himantandraceae）、アブラゴケ科（Hookeriaceae）、フア科（Huaceae）、フミリア科（Humiriaceae）、ヒダテラ科（Hydatellaceae）、ヒドノラ科（Hydnoraceae）、アジサイ科（Hydrangeaceae）、トチカガミ科（Hydrocharitaceae）、セイロンハコベ科（Hydroleaceae）、ヒドロスタキス科（Hydrostachyaceae）、イワダレゴケ科（Hylocomiaceae）、コケシノブ科（Hymenophyllaceae）、コケシノブダマシ科（Hymenophytaceae）、オトギリソウ科（Hypericaceae）、ハイゴケ科（Hypnaceae）、キダチゴ
ケ科（Hypnodendraceae）、キンモウワラビ科（Hypodematiaceae）、クジャクゴケ科（Hypopterygiaceae）、キンバイザサ科（Hypoxidaceae）、クロタキカズラ科（Icacinaceae
）、アヤメ科（Iridaceae）、イルウィンギア科（Irvingiaceae）、ミズニラ科（Isoetaceae）、ツバキ科（teaceae）、イキシオリリオン科（Ixioliriaceae）、イクソナンテス
科（Ixonanthaceae）、タカサゴソコマメゴケ科（Jackiellaceae）、ジョインビレア科（Joinvilleaceae）、ヒメウルシゴケ科（Jubulaceae）、ジュブロプサ科（Jubulopsaceae
）、クルミ科（Juglandaceae）、イグサ科（Juncaceae）、シバナ科（Juncaginaceae）、ツボミゴケ科（Jungermanniaceae）、カーキア科（Kirkiaceae）、ケ−ベルリニア科（Koeberliniaceae）、クラメリア科（Krameriaceae）、ラキステマ科（Lacistemataceae）、ラクトリス科（Lactoridaceae）、シソ科（Lamiaceae）、ラナリア科（Lanariaceae）、
アケビ科（Lardizabalaceae）、クスノキ科（Lauraceae）、サガリバナ科（Lecythidaceae）、マメ科（Leguminosae）、クサリゴケ科（Lejeuneaceae）、トラノオゴケ科（Lembophyllaceae）、タヌキモ科（Lentibulariaceae）、ヤクシマスギバゴケ科（Lepicoleaceae）、カタバミノキ科（Lepidobotryaceae）、サワラゴケ科（Lepidolaenaceae）、ムチゴケ科（Lepidoziaceae）、レプトドン
タ科（Leptodontaceae）、ミナミイタチゴケ科（Lepyrodontaceae）、ウスグロゴケ科（Leskeaceae）、イタチゴケ科（Leucodontaceae）、ホソハシゴケ科（Leucomiaceae）、ユ
リ科（Liliaceae）、リメウム科（Limeaceae）、リムナンタ科（Limnanthaceae）、アマ
科（Linaceae）、アゼナ科（Linderniaceae）、ホングウシダ科（Lindsaeaceae）、ロア
サ科（Loasaceae）、マチン科（Loganiaceae）、ツルキジノオ科（Lomariopsidaceae）、ロンキティス科（Lonchitidaceae）、ロフィオカルプス科（Lophiocarpaceae）、ウロコ
ゴケ科（Lophocoleaceae）、ハナミカズラ科（Lophopyxidaceae）、イチョウウロコゴケ
科（Lophoziaceae）、オオバヤドリギ科（Loranthaceae）、ロウイア科（Lowiaceae）、
ロクソマ科（Loxsomataceae）、ミカヅキゼニゴケ科（Lunulariaceae）、ヒカゲノカズラ科（Lycopodiaceae）、カニクサ科（Lygodiaceae）、ミソハギ科（Lythraceae）、モクレン科（Magnoliaceae）、マキノゴケ科（Makinoaceae）、キントラノオ科（Malpighiaceae）、アオイ科（Malvaceae）、クズウコン科（Marantaceae）、リュウビンタイ科（Marattiaceae）、マルクグラビア科（Marcgraviaceae）、ゼニゴケ科（Marchantiaceae）、デンジソウ科（Marsileaceae）、ツノゴマ科（Martyniaceae）、オオサワラゴケ科（Mastigophoraceae）、マトニア科（Matoniaceae）、マヤカ科（Mayacaceae）、ヌマチゴケ科（Meesiaceae）、メランチウム科（Melanthiaceae）、ノボタン科（Melastomataceae）、セン
ダン科（Meliaceae）、メリアンタ科（Melianthaceae）、ツヅラフジ科（Menispermaceae）、ミツガシワ科（Menyanthaceae）、イモイチョウゴケ科（Mesoptychiaceae）、メタキシア科（Metaxyaceae）、ハイヒモゴケ科（Meteoriaceae）、メッテニウサ科（Metteniusaceae）、フタマタゴケ科（Metzgeriaceae）、スジバヒナノハイゴケ科（Microtheciellaceae）、ミソデンドロン科（Misodendraceae）、ヤッコソウ科（Mitrastemonaceae）、ミナミヒカリゴケ科（Mitteniaceae）、ヌエゴケ科（Mizutaniaceae）、チョウチンゴケ科
（Mniaceae）、ザクロソウ科（Molluginaceae）、モニミア科（Monimiaceae）、アワゼニゴケ科（Monocarpaceae）、ミミカキゴケ科（Monocleaceae）、ヤワラゼニゴケ科（Monosoleniaceae）、ヌマハコベ科（Montiaceae）、モンティニア科（Montiniaceae）、クワ科（Moraceae）、ワサビノキ科（Moringaceae）、ナンヨウザクラ科（Muntingiaceae）、バショウ科（Musaceae）、ミドカルプス科（Myodocarpaceae）、ヤマモモ科（Myricaceae）、マイリンゴケ科（Myriniaceae）、ニクズク科（Myristicaceae）、ミロタムヌス科（Myrothamnaceae）、フトモモ科（Myrtaceae）、ナワゴケ科（Myuriaceae）、キンコウカ科
（Nartheciaceae）、ヒラゴケ科（Neckeraceae）、ハス科（Nelumbonaceae）、サワラゴ
ケ科（Neotrichocoleaceae）、ウツボカズラ科（Nepenthaceae）、タマシダ科（Nephrolepidaceae）、ネウラダ科（Neuradaceae）、ニトラリア科（Nitrariaceae）、ナンキョク
ブナ科（Nothofagaceae）、ツノゴケモドキ科（Notothyladaceae）、オシロイバナ科（Nyctaginaceae）、スイレン科（Nymphaeaceae）、オクナ科（Ochnaceae）、オクトブレファ
ラ科（Octoblepharaceae）、イシヅチゴケ科（Oedipodiaceae）、オラクス科（Olacaceae）、モクセイ科（Oleaceae）、ツルシダ科（Oleandraceae）、アカバナ科（Onagraceae）、オンコテカ科（Oncothecaceae）、ミミカキゴケ科（Onocleaceae）、ハナヤスリ科（Ophioglossaceae）、カナビキボク科（Opiliaceae）、ラン科（Orchidaceae）、ナンバンギセル科（Orobanchaceae）、ニセフナバゴケ科（Orthorrhynchiaceae）、タチヒダゴケ科
（Orthotrichaceae）、ゼンマイ科（Osmundaceae）、カタバミ科（Oxalidaceae）、ハタ
ケゴケモドキ科（Oxymitraceae）、ボタン科（Paeoniaceae）、クモノスゴケ科（Pallaviciniaceae）、パンダ科（Pandaceae）、タコノキ科（Pandanaceae）、ケシ科（Papaveraceae）、パラクリフィア科（Paracryphiaceae）、トケイソウ科（Passifloraceae）、キリ科（Paulowniaceae）、ゴマ科（Pedaliaceae）、ミズゼニゴケ科（Pelliaceae）、ペナエア科（Penaeaceae）、ペンナンティア科（Pennantiaceae）、ペンタディプランドラ科（Pentadiplandraceae）、ユガミウチワ科（Pentaphragmataceae）、モッコク科（Pentaphylacaceae）、タコノアシ科（Penthoraceae）、カタシロゴケ科（Peraceae）、ペリジスク
ス科（Peridiscaceae）、ペテナエア科（Petenaeaceae）、ペテルマニア科（Petermanniaceae）、サクライソウ科（Petrosaviaceae）、フェリネ科（Phellinaceae）、フィレシア科（Philesiaceae）、タヌキアヤメ科（Philydraceae）、ハエドクソウ科（Phrymaceae）、コミカンソウ科（Phyllanthaceae）、カタフチゴケ科（Phyllodrepaniaceae）、フナバゴケ科（Phyllogoniaceae）、フィロノマ科（Phyllonomaceae）、フィセナ科（Physenaceae）、ヤマゴボウ科（Phytolaccaceae）、ピクラムニア科（Picramniaceae）、ピクロデ
ンドロン科（Picrodendraceae）、ピロトリカ科（Pilotrichaceae）、マツ科（Pinaceae
）、コショウ科（Piperaceae）、トベラ科（Pittosporaceae）、ハネゴケ科（Plagiochilaceae）、キジノオシダ科（Plagiogyriaceae）、サナダゴケ科（Plagiotheciaceae）、オオバコ科（Plantaginaceae）、プラタヌス科（Platanaceae）、ツヤサワゴケ科（Pleurophascaceae）、ミズゴケモドキ科（Pleuroziaceae）、フジノマンネングサ科（Pleuroziopsaceae）、プロコスペルマ科（Plocospermataceae）、イソマツ科（Plumbaginaceae）、
イネ科（Poaceae）、マキ科（Podocarpaceae）、カワゴケソウ科（Podostemaceae）、ハ
ナシノブ科（Polemoniaceae）、ヒメハギ科（Polygalaceae）、タデ科（Polygonaceae）
、ウラボシ科（Polypodiaceae）、スギゴケ科（Polytrichaceae）、ミズアオイ科（Pontederiaceae）、クラマゴケモドキ科（Porellaceae）、スベリヒユ科（Portulacaceae）、
ポシドニア科（Posidoniaceae）、ヒルムシロ科（Potamogetonaceae）、センボンゴケ科
（Pottiaceae）、サクラソウ科（Primulaceae）、タイワントラノオゴケ科（Prionodontaceae）ヤマモガシ科（Proteaceae）、ニセキンシゴケ科（Pseudoditrichaceae）、マツバウロコゴケ科（Pseudolepicoleaceae）、マツバラン科（Psilotaceae）、イノモトソウ科（Pteridaceae）、ネジレイトゴケ科（Pterigynandraceae）、ヒムロゴケ科（Pterobryaceae）、テガタゴケ科（Ptilidiaceae）チヂレゴケ科（Ptychomitriaceae）、スジイタチ
ゴケ科（Ptychomniaceae）、ツゲモドキ科（Putranjivaceae）、キラヤ科（Quillajaceae）、ホゴケ科（Racopilaceae）、ケビラゴケ科（Radulaceae）、ラフレシア科（Rafflesiaceae）、キンポウゲ科（Ranunculaceae）、ラバテア科（Rapateaceae）、ニセウスグロ
ゴケ科（Regmatodontaceae）、モクセイソウ科（Resedaceae）、サンアソウ科（Restionaceae）、ラブドデンドロン科（Rhabdodendraceae）、ヤスジゴケ科（Rhabdoweisiaceae）、ヌリワラビ科（Rhachidosoraceae）、キブネゴケ科（Rhachitheciaceae）、ラコカルパス科（Rhacocarpaceae）、クロウメモドキ科（Rhamnaceae）、リポゴヌム科（Rhipogonaceae）、ヒノキゴケ科（Rhizogoniaceae）、ヒルギ科（Rhizophoraceae）、ウキゴケ科（Ricciaceae）、リエラゴケ科（Riellaceae）、リゴジアク科（Rigodiaceae）、ロリドゥラ科（Roridulaceae）、バラ科（Rosaceae）、ロウセア科（Rousseaceae）、アカネ科（Rubiaceae）、カワツルモ科（Ruppiaceae）、ミカン科（Rutaceae）、アフリカトラノオゴケ科（Rutenbergiaceae）、アオカズラ科（Sabiaceae）、サッコロマ科（Saccolomataceae
）、ヤナギ科（Salicaceae）、サルバドラ科（Salvadoraceae）、サンショウモ科（Salviniaceae）、ビャクダン科（Santalaceae）、ムクロジ科（Sapindaceae）、アカテツ科（Sapotaceae）、サルコバトゥス科（Sarcobataceae）、サルコラエナ科（Sarcolaenaceae）
、サラセニア科（Sarraceniaceae）、ドクダミ科（Saururaceae）、ユキノシタ科（Saxifragaceae）、ヒシャクゴケ科（Scapaniaceae）、ホロムイソウ科（Scheuchzeriaceae）、マツブサ科（Schisandraceae）、オヤコゴケ科（Schistochilaceae）、ヒカリゴケ科（Schistostegaceae）、フサシダ科（Schizaeaceae）、シューレゲリア科（Schlegeliaceae）、ボロボロノキ科（Schoepfiaceae）、コウヤマキ科（Sciadopityaceae）、スコルピディア科（Scorpidiaceae）、ゴマノハグサ科（Scrophulariaceae）、イワヒバ科（Selaginellaceae）、キヌシッポゴケ科（Seligeriaceae）、ナガハシゴケ科（Sematophyllaceae）
、セルポトルテラ科（Serpotortellaceae）、セチェランツス科（Setchellanthaceae）、ニガキ科（Simaroubaceae）、シンモンドシア科（Simmondsiaceae）、シパルナ科（Siparunaceae）、スラデニア科（Sladeniaceae）、シオデ科（Smilacaceae）、ナス科（Solanaceae）、スケバゴケ科（Sorapillaceae）、ダンゴゴケ科（Sphaerocarpaceae）、スファ
エロセパルム科（Sphaerosepalaceae）、ミズゴケ科（Sphagnaceae）、ナガボノウルシ科（Sphenocleaceae）、キノボリスギゴケ科（Spiridentaceae）、オオツボゴケ科（Splachnaceae）、スプラクノブリア科（Splachnobryaceae）、キブシ科（Stachyuraceae）、ミ
ツバウツギ科（Staphyleaceae）、ステグノスペルマ科（Stegnospermataceae）、ビャク
ブ科（Stemonaceae）、ステモヌラ科（Stemonuraceae）、カタハゴケ科（Stereophyllaceae）、スティルベ科（Stilbaceae）、ストラスブルゲリア科（Strasburgeriaceae）、ゴ
クラクチョウカ科（Strelitziaceae）、スチリジウム科（Stylidiaceae）、エゴノキ科（Styracaceae）、スリアナ科（Surianaceae）、ハイノキ科（Symplocaceae）、ナンジャモンジャゴケ科（Takakiaceae）、ハゼラン科（Talinaceae）、ギョリュウ科（Tamaricaceae）、タピスキア科（Tapisciaceae）、ハマグリゼニゴケ科（Targioniaceae）、イチイ科（Taxaceae）、ティコフェラエラ科（Tecophilaeaceae）、ナナバケシダ科（Tectariaceae）、テトラコンドラ科（Tetrachondraceae）、テトラメレス科（Tetramelaceae）、テトラメリスタ科（Tetrameristaceae）、ヨツバゴケ科（Tetraphidaceae）、オオトラノオゴケ科（Thamnobryaceae）、ツバキ科（Theaceae）、カサナリゴケ科（Theliaceae）、ヒメシダ科（Thelypteridaceae）、トマンデルシア科（Thomandersiaceae）、シノブゴケ科（Thuidiaceae）、トゥルニア科（Thurniaceae）、ジンチョウゲ科（Thymelaeaceae）、テ
ィルソプテリス科（Thyrsopteridaceae）、ティコデンドロン科（Ticodendraceae）、ク
サスギゴケ科（Timmiaceae）、チシマゼキショウ科（Tofieldiaceae）、トリケリア科（Torricelliaceae）、トウァリア科（Tovariaceae）、ムジナゴケ科（Trachypodaceae）、
トロイブゴケ科（Treubiaceae）、ムクムクゴケ科（Trichocoleaceae）、トリコテムノマタ科（Trichotemnomataceae）、トリゴニア科（Trigoniaceae）、トリメニア科（Trimeniaceae）、ホンゴンソウ科（Triuridaceae）、ヤマグルマ科（Trochodendraceae）、ノウ
ゼンハレン科（Tropaeolaceae）、ガマ科（Typhaceae）、ニレ科（Ulmaceae）、イラクサ科（Urticaceae）、バーリア科（Vahliaceae）、スジゴケモドキ科（Vandiemeniaceae）
、ウェロジア科（Velloziaceae）、クマツヅラ科（Verbenaceae）、ムカシウロコゴケ科
（Vetaformaceae）、スミレ科（Violaceae）、エツキカゲロウゴケ科（Viridivelleraceae）、ブドウ科（Vitaceae）、ビビアニア科（Vivianiaceae）、ウォキシア科（Vochysiaceae）、ナガエノカワゴケ（Wardiaceae）、ウェルウィッチア科（Welwitschiaceae）、アズマゼニゴケ科（Wiesnerellaceae）、シキミモドキ科（Winteraceae）、イワデンダ科（Woodsiaceae）、ススキノキ科（Xanthorrhoeaceae）、クセロネマ科（Xeronemataceae）
、トウエンソウ科（Xyridaceae）、ザミア科（Zamiaceae）、ショウガ科（Zingiberaceae）、アマモ科（Zosteraceae）、ハマビシ科（Zygophyllaceae）。
新たな分類のために、藻類の一部の群は、もはや植物界に分類されていない。それにも関わらず、これらの藻類は、本明細書に記載されるセルロース足場産生のための候補である。菌界は、例えばセルロースで作製された細胞壁を含有するメンバーを有する。藻類は、現在、原生生物界に分類されている；しかし、本開示において、藻類が本明細書において使用される用語「植物」によって包含されることを意図されていることは理解されるであろう。好適な藻類として：
− 藻類：植物様単細胞又は多細胞生物；
− 緑藻類：アオミドロ属（Spirogyra）、ウルバ属（Ulva）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、ボルボックス属（Volvox）；
− 紅藻：ポルフィラ属（Porphyra）、ロタルゲン（Rotalgen）；
− 褐藻：ラミナリア属（Laminaria）、Nereocystis；
− 水生菌：ミズカビ（Saprolegnia）；及び／又は
− 繊毛虫門（Phylum Ciliata）:ゾウリムシ（Paramecium）、ツリガネムシ（Vorticella）
が挙げられる。
キチンが、本明細書に記載されるプロトコルを使用して本明細書に記載される足場生体材料において使用できる好適な足場であることも実験的に実証された。菌界は、次のとおり分類される:
− 子嚢菌類（Sac-fungi）:アガリクス属（Agaricus）（キノコ）、黒穂菌属（Ustilago）（黒穂病）及びプクキニア（Puccinia）（さび菌）；
− 接合体形成菌（Zygote-forming fungi）：ケカビ属（Mucor）、リゾプス属（Rhizopus）（パンカビ）及びアルブゴ属（Albugo）；
− 棍棒状菌（Club fungi）:アガリクス属（キノコ）、黒穂菌属（黒穂病）及びプクキ
ニア（さび菌）；並びに
− 不完全菌（Imperfect fungi）: アルテルナリア属（Alternaria）、コレトトリカム
属（Colletotrichum）及びトリコデルマ属（Trichoderma）
そのような真菌も本明細書上記の脱細胞化真菌組織を得るための好適な候補である。
１又は２以上の例示的実施形態は、例として記載されている。多数の異型及び改変が特許請求の範囲に定義の本発明の範囲から逸脱することなく作製できることは、当業者に理解されるであろう。
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本セクション及び本明細書他所に引用するすべての参考文献は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。

Claims (38)

  1. 組織の細胞物質及び核酸が除去された、脱細胞化された真菌組織を含む足場生体材料であって、前記脱細胞化された真菌組織が、キチンベースの三次元多孔質構造を含み、
    前記脱細胞化された真菌組織が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）による処理により脱細胞化されており、かつ二価塩水溶液を使用してＳＤＳミセルを含有する塩残留物を前記足場生体材料から沈殿させることにより、残留ＳＤＳが除去されている、前記足場生体材料。
  2. 脱細胞化された真菌組織が、熱ショック、界面活性剤による処理、浸透圧ショック、凍結乾燥、物理的溶解、電気的破壊、若しくは酵素消化、又はそれらの任意の組合せによりさらに脱細胞化されている真菌組織を含む、請求項１に記載の足場生体材料。
  3. 二価塩水溶液、塩残留物、及び／又はＳＤＳミセルを除去するのに、ｄＨ２Ｏ、酢酸、ＤＭＳＯ、若しくは超音波処理、又はそれらの任意の組合せが使用されている、請求項１に記載の足場生体材料。
  4. 二価塩水溶液の二価塩が、ＭｇＣｌ２又はＣａＣｌ２を含む、請求項１に記載の足場生体材料。
  5. 真菌組織が、水中約１％又は約０．１％ＳＤＳのＳＤＳ溶液による処理により脱細胞化され、残留ＳＤＳが、約１００ｍＭの濃度のＣａＣｌ２水溶液の使用と、その後のｄＨ２Ｏ中でのインキュベーションとで除去されている、請求項４に記載の足場生体材料。
  6. 脱細胞化された真菌組織が、処理されさらなる構造を導入する、及び／又はアシル化、アルキル化、若しくは他の共有結合修飾により少なくとも１つの遊離ヒドロキシル官能基で官能基化され、官能基化された足場生体材料を提供する、請求項１に記載の足場生体材料。
  7. 脱細胞化された真菌組織が、マイクロチャネルを導入するために処理される、及び／又はコラーゲン、細胞特異性促進因子、細胞増殖因子、若しくは薬剤により官能基化される、請求項６に記載の足場生体材料。
  8. 真菌組織が、キノコ（真菌）組織、又は組織を物理的に模倣するように、及び／若しくは標的組織効果を機能的に促進するように構成された追加の真菌構造を作製するために、直接ゲノム修飾若しくは選抜育種により産生された遺伝子改変組織である、請求項１に記載の足場生体材料。
  9. キチンベースの三次元多孔質構造に接着された動物生細胞をさらに含む、請求項１に記載の足場生体材料。
  10. 動物生細胞が哺乳動物細胞である、請求項９に記載の足場生体材料。
  11. 動物生細胞がヒト細胞である、請求項１０に記載の足場生体材料。
  12. 組織の細胞物質及び核酸が除去された、脱細胞化された真菌組織を調製する方法であって、前記脱細胞化された真菌組織が、キチンベースの三次元多孔質構造を含み、
    前記方法が、
    所定のサイズ及び形状を有する真菌組織を提供するステップ；と、
    ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により前記真菌組織を処理することによって、前記真菌組織を脱細胞化するステップ；と、
    二価塩水溶液を使用してＳＤＳミセルを含有する塩残留物を前記真菌組織から沈殿させることにより、前記真菌組織から残留ＳＤＳを除去するステップ；とを含み、
    それにより前記真菌組織から細胞物質及び核酸を除去して、キチンベースの三次元多孔質構造を含む前記脱細胞化された真菌組織を形成する、前記方法。
  13. 二価塩水溶液、塩残留物、及び／又はＳＤＳミセルを除去するのに、ｄＨ２Ｏ、酢酸、ＤＭＳＯ、若しくは超音波処理、又はそれらの任意の組合せが使用される、請求項１２に記載の方法。
  14. 二価塩水溶液の二価塩が、ＭｇＣｌ２又はＣａＣｌ２を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 脱細胞化するステップが、水中０．１％又は１％ＳＤＳのＳＤＳ溶液による処理を含み、残留ＳＤＳが、１００ｍＭの濃度のＣａＣｌ２水溶液の使用と、その後のｄＨ２Ｏ中でのインキュベーションによる脱細胞化後に除去される、請求項１４に記載の方法。
  16. 脱細胞化された真菌組織を処理し、さらなる微小構造を導入するステップ、及び／又はアシル化、アルキル化、若しくは他の共有結合修飾により、脱細胞化された真菌組織の少なくともいくつかの遊離ヒドロキシル官能基を官能基化するステップをさらに含む、請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 脱細胞化された真菌組織が処理され、マイクロチャネルを導入する、及び／又は脱細胞化された真菌組織のヒドロキシル官能基が、コラーゲン、細胞特異性促進因子、細胞増殖因子、若しくは薬剤により官能基化される、請求項１６に記載の方法。
  18. キチンベースの三次元多孔質構造に動物生細胞を導入し、前記動物生細胞を前記キチンベースの三次元多孔質構造に接着させるステップをさらに含む、請求項１２〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 動物生細胞が哺乳動物細胞である、請求項１８に記載の方法。
  20. 動物生細胞がヒト細胞である、請求項１９に記載の方法。
  21. 請求項１２〜２０のいずれかに記載の方法により調製された、脱細胞化された真菌組織を含む足場生体材料。
  22. 動物細胞増殖のサポート、組織再生の促進、血管新生の促進、組織置換術のための移植可能な足場として、又は美容外科手術用の構造移植片として使用するための、請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料。
  23. 脊髄損傷後の修復又は再生のための構造移植片として使用するための、請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料。
  24. 組織置換手術及び／又は手術後の組織再生のための構造移植片として使用するための、請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料。
  25. 皮膚移植及び／又は皮膚再生手術用の構造移植片として使用するための、請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料。
  26. 標的組織又は領域における血管構造の再生のための構造移植片として使用するための、請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料。
  27. 骨置換、骨充填、若しくは骨移植材として使用するための、及び／又は骨の再生の促進に使用するための、請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料。
  28. 皮膚、骨、脊髄、心臓、筋肉、神経、血管、又は他の損傷若しくは奇形組織の組織置換物として使用するための、請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料。
  29. 硝子体液代替物として、ヒドロゲル形態で使用するための、請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料。
  30. 人工嚢として使用するための請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料であって、ヒドロゲル形態の足場生体材料を含有する嚢様構造を形成する、前記足場生体材料。
  31. 美容外科手術用の構造移植片として使用するための、請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料。
  32. 足場生体材料が、前記足場生体材料の脱細胞化された真菌組織が対象の組織を物理的に模倣するように、及び／又は対象における標的組織効果を機能的に促進するように構成された足場生体材料である、請求項２２〜３１のいずれかに記載の使用のための足場生体材料。
  33. それを必要とする対象における、美容外科手術における構造的足場を提供する方法であって、
    請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料を提供するステップと、
    前記足場生体材料を前記対象に移植するステップと
    を含む、前記方法。
  34. 足場生体材料を提供するステップが、
    前記足場生体材料の脱細胞化された真菌組織が対象の組織を物理的に模倣し、及び／又は対象における標的組織効果を機能的に促進するように構成された、請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料を選択するステップ
    を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料と、少なくとも１つの容器又は請求項３３若しくは３４に記載の方法を行うための使用説明書とを含むキット。
  36. 手術キットである、請求項３５に記載のキット。
  37. ＳＤＳ溶液、及びＣａＣｌ２溶液の１又は２以上と、請求項１２〜２０のいずれかに記載の方法を行うための使用説明書とを含む、請求項３５又は３６に記載のキット。
  38. 請求項１〜１１及び２１のいずれかに記載の足場生体材料を含む、予め充填された滅菌不要な移植片と、少なくとも１つの容器とを含むキット。
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