BR112018016050B1

BR112018016050B1 - Biomaterial de estrutura tridimensional, método para preparar um tecido vegetal descelularizado, uso do biomaterial de estrutura tridimensional, e, kit

Info

Publication number: BR112018016050B1
Application number: BR112018016050-4A
Authority: BR
Inventors: Andrew Edward Pelling; Charles Michel Cuerrier; Daniel J Modulevsky; Ryan Joseph Hickey
Original assignee: University Of Ottawa
Priority date: 2016-02-12
Filing date: 2017-02-10
Publication date: 2022-04-12
Also published as: EP3413939C0; AU2022200696A1; AU2017218476A1; EP3413939A1; WO2017136950A1; US20190060520A1; IL260993B; CA3014256A1; US11167062B2; US20220016317A1; BR112018016050A2; MX2018009551A; EP3413939A4; JP2019509723A; JP6957486B2; CN109152863A; EP3413939B1; AU2022200696B2; US11045582B2; JP2022002536A

Abstract

A invenção se refere a biomateriais de scaffold compreendendo um tecido vegetal ou fúngico do qual materiais celulares e ácidos nucléicos do tecido são removidos, o tecido vegetal ou fúngico compreendendo uma estrutura porosa tridimensional baseada em celulose ou quitina. A invenção também se refere a métodos para preparar esses biomateriais de scaffold, bem como os usos dos mesmos como um scaffold implantável para suportar o crescimento celular animal, para promover a regeneração do tecido celular, para promover a angiogênese, para um procedimento de substituição de tecido, e/ou como um implante estrutural para cirurgia estética. Adicionalmente são descritos tratamento terapêutico e/ou métodos cosméticos empregando tais scaffolds.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção se refere de modo geral a biomateriais de estrutura tridimensional e usos dos mesmos. Mais especificamente, a presente invenção se refere a tecido vegetal ou fúngico descelularizado, e usos dos mesmos como biomateriais de estrutura tridimensional.

Antecedentes

[0002] Estima-se que a indústria de biomateriais tenha um valor de mercado de 90 bilhões de dólares e seja impulsionada por novos materiais derivados de fontes naturais, polímeros sintéticos, metais, e cerâmica. Esses materiais podem formar estruturas tridimensionais tridimensionais de alta porosidade possuindo estruturas em nano/micro escala que são biocompatíveis e promovem o crescimento de células vivas. Existe um intenso interesse em novos biomateriais que suportem a invasão e proliferação de células vivas para aplicações potenciais em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, por exemplo.

[0003] Estruturas tridimensionais de biomaterial tem aplicação em múltiplos setores, incluindo cirurgia dental e estética, terapias clínicas e médicas (tais como medicina regenerativa, cicatrização de ferimentos, engenharia e reparação de tecidos, etc.), e pesquisa e desenvolvimento (incluindo pesquisa industrial e acadêmica nas ciências biomédicas).

[0004] Biomateriais comerciais muitas vezes requerem métodos de produção complicados e demorados, o que leva a um alto custo para o consumidor final, mesmo se não forem aprovados para uso humano. Além disso, a maior parte dos biomateriais comerciais é de origem humana/animal, resultando em potencial rejeição pelo corpo e/ou respostas imunes adversas e/ou risco de transmissão de doenças. Os materiais de fonte também podem ter impacto ambiental negativo, e também podem levar a problemas relacionados a fontes antiéticas. Também, alguns biomateriais comerciais perdem a sua forma após a implantação, o que pode resultar em sucesso reduzido da reparação/substituição do tecido.

[0005] O desenvolvimento de novos biomateriais para estratégias de engenharia de tecidos está atualmente sob intensa investigação [1-3]. Biomateriais estão sendo desenvolvidos para a liberação local de células terapêuticas para tecidos alvo [4,5], a regeneração de tecidos danificados ou enfermos [6,9], ou a substituição de órgãos inteiros [10-15]. Na sua forma mais geral, biomateriais fornecem uma estrutura tridimensional (3D) que tenta imitar o meio celular in vivo [14,16]. Tem-se desenvolvido abordagens para projetar as propriedades mecânicas [17-24], estruturais [25] e bioquímicas [26-29] dessas estruturas tridimensionais com complexidade variável. Também, estão em andamento esforços significativos para assegurar que esses biomateriais implantados sejam compatíveis e estimulem apenas respostas imunes mínimas. Os esforços na pesquisa de biomateriais estão sendo impulsionados pela significativa necessidade de substituição de órgãos e tecidos. Com a população envelhecendo, a lacuna entre pacientes aguardando por transplantes de órgãos e doadores de órgãos disponíveis está aumentando rapidamente [30]. Enquanto aplicações clínicas de biomateriais tem sido de certa forma limitadas, médicos tem utilizado com sucesso biomateriais sintéticos para tratar vários tecidos e estruturas danificados, tais como pele, gengiva, cartilagem, e ossos [31-36].

[0006] Estruturas tridimensionais de biomaterial podem tomar diversas formas tais como pós, géis, membranas, e pastas [1,2]. Essas formulações de polímero ou hidrogel podem ser moldadas ou impressas em 3D para produzir formas que são de valor terapêutico [37-39]. Uma abordagem alternativa a essas estratégias sintéticas é a descelularização do órgão inteiro [10,12-16]. Na verdade, foi mostrado que é possível dissociar as células de um órgão doado, deixando para trás a matriz de estrutura tridimensional, comumente chamada de órgãos fantasma [14]. Os órgãos fantasma não possuem nenhuma das células do doador e podem ser subsequentemente cultivadas com células derivadas do paciente ou outra fonte. Essas abordagens já foram utilizadas para reparar e substituir tecidos defeituosos [40-42]. No passado, muitas partes corporais foram criadas usando abordagens sintéticas e de descelularização, incluindo o tecido da uretra, vaginal, da orelha, nariz, coração, rim, bexiga, e neurológicos [14,38,39,43-47].

[0007] Entretanto, essas abordagens tem algumas desvantagens [48]. Técnicas sintéticas podem envolver produtos animais e estratégias de descelularização ainda envolvem tecidos e órgãos de doadores. Também tem havido intensa investigação no desenvolvimento de materiais reabsorvíveis [49]. Nesses casos, o objetivo é fornecer ao corpo uma estrutura tridimensional temporária em 3D no qual tecidos saudáveis podem se formar. Após varias semanas ou meses, a estrutura tridimensional implantada será reabsorvida deixando para trás um tecido saudável completamente natural [26,29,50,51]. Embora essa seja uma abordagem atraente, muitos materiais não-reabsorvíveis (cerâmica, titânio) tem sido empregados com sucesso em contextos clínicos e desempenham um papel importante em numerosas terapias [2,49,52-57]. Importantemente, biomateriais reabsorvíveis sofrem do fato de que tecidos regenerados muitas vezes se rompem e se tornam deformados devido à perda de estrutura [58-62]. Por exemplo, durante varias décadas, a pesquisa em reconstrução de orelha a partir de cartilagem projetada mostrou que implantes de biomaterial eventualmente se rompem e se tornam deformados à medida que estruturas tridimensionais implantadas se desagregam e reabsorvem [63]. No entanto, recentes abordagens bem sucedidas basearam-se no uso de estruturas tridimensionais de colágeno reabsorvíveis integrados com suportes de arame de titânio permanentes [53,64,65]. Consequentemente, a necessidade de estruturas tridimensionais não-reabsorvíveis e ainda assim biocompatíveis persiste no campo da engenharia de tecidos e órgãos.

[0008] Recentes abordagens complementares utilizaram materiais de estrutura tridimensional que não são derivados de doadores de órgãos humanos ou produtos animais, incluindo varias formas de celulose [66-77]. Construtos de celulose nanocristalina, nanofibrilar e bacteriana e hidrogéis também tem sido estudados [78-83].

[0009] Uma abordagem ortogonal, mas complementar à descelularização de órgãos e estratégias de celulose sintética também tem sido investigada. Esses estudos preliminares in vitro investigaram biomateriais de celulose do tecido da maçã hypanthium [27].

[0010] As questões de biocompatibilidade in vivo, biomateriais alternativos, e outros métodos de produção de biomateriais permanece. Acima de tudo, permanece uma necessidade na indústria de biomateriais alternativos, adicionais e/ou aperfeiçoados, métodos para a produção dos mesmos, e/ou usos dos mesmos.

Sumário da Invenção

[0011] É então um objeto da invenção fornecer um biomaterial que possa ser usado como uma estrutura tridimensional ou implante em uma variedade de aplicações que podem incluir, mas não estão limitadas a, aplicações cirúrgicas, clínicas, terapêuticas, cosméticas, de desenvolvimento, e/ou outras aplicações apropriadas.

[0012] Consequentemente, em determinadas representações, é fornecido aqui um biomaterial gerado a partir de uma espécie de planta ou fungo. O biomaterial pode ser modificado, por exemplo, por (i) adição de uma estrutura (i.e. outras partes de plantas ou fungos, ou células vivas), drogas, ou estruturas artificiais (materiais reabsorvíveis ou não-reabsorvíveis); (ii) modificação da sua estrutura com procedimentos mecânicos ou químicos para modificar o formato ou formulação do produto original para servir a diferentes aplicações; (iii) com a adição de matrizes sobre ou dentro dos produtos de estrutura tridimensional originais (tais como colágeno, fibronectina ou quaisquer outros substratos) para modificar a adesão celular ou quaisquer outros elementos benéficos da ciência celular como fatores de crescimento.

[0013] Biomateriais, processos para preparação e usos potenciais são descritos mais detalhadamente abaixo. Em determinadas representações, o biomaterial pode ter custo relativamente baixo, e/ou pode usar um procedimento de produção relativamente eficiente e/ou de tempo resumido. Também, através da utilização de estruturas complexas como estruturas tridimensionais funcionais, uma ampla gama de possibilidades pode estar disponível para produzir arquiteturas complexas. Biomateriais podem ter uma capacidade de manter o formato, podem ter um rastro relativamente mínimo (i.e. a estrutura tridimensional pode ser praticamente invisível antes e/ou após a angiogênese), pode ser altamente biocompatível, pode induzir uma rápida vascularização, e/ou pode provocar uma resposta imunogênica mínima ou quase inexistente.

[0014] Em determinadas representações, o biomaterial pode ser derivado de plantas ou fungos e pode consequentemente apresentar um impacto ambiental relativamente baixo, e/ou pode ser considerado orgânico e/ou biodegradável. O biomaterial pode, em certos exemplos, ser produzido a partir de resíduos de alimentos, oferecendo assim um caminho alternativo para produtos descartados.

[0015] Em uma representação, é fornecido aqui um biomaterial de estrutura tridimensional compreendendo um tecido vegetal ou fúngico descelularizado do qual materiais celulares e ácidos nucléicos são removidos, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado compreendendo uma estrutura porosa baseada em quitina.

[0016] Em outra representação, é fornecido aqui um biomaterial de estrutura tridimensional compreendendo um tecido vegetal ou fúngico descelularizado do qual materiais celulares e ácidos nucléicos são removidos, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado compreendendo uma estrutura porosa tridimensional baseada em celulose ou quitina.

[0017] Em uma representação dos biomateriais de estrutura tridimensional acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode compreender um tecido vegetal ou fúngico que foi descelularizado por choque térmico, tratamento com detergente, choque osmótico, liofilização, lise física, interrupção elétrica, ou digestão enzimática, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0018] Em outra representação do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode compreender um tecido vegetal ou fúngico que foi descelularizado por tratamento com um detergente ou surfactante. Em determinadas representações, exemplos de detergentes podem incluir, mas não estão limitados a, dodecil sulfato de sódio (SDS), Triton X, EDA, tratamento alcalino, ácido, detergente iônico, detergentes não-iônicos, ou detergentes zwitteriônicos, ou uma combinação dos mesmos.

[0019] Em outra representação do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode compreender um tecido vegetal ou fúngico que foi descelularizado por tratamento com SDS.

[0020] Em outra representação ainda do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o SDS residual pode ser removido do tecido vegetal ou fúngico descelularizado através de lavagem com uma solução salina bivalente aquosa.

[0021] Ainda em outra representação do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o SDS residual pode ter sido removido usando uma solução salina bivalente aquosa para precipitar/quebrar um resíduo salino contendo micelas de SDS da solução/ estrutura tridimensional, e um tratamento com dH2O, ácido acético, dimetilsulfóxido (DMSO), ou sonicação pode ter sido usado para remover o resíduo salino e/ou micelas de SDS.

[0022] Ainda em outra representação do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o sal bivalente da solução salina bivalente aquosa pode compreender MgCl2 ou CaCl2.

[0023] Em outra representação do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode ter sido descelularizado através de tratamento com uma solução de SDS de entre 0,01% a 10%, por exemplo aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%, o, por exemplo, aproximadamente 0,1% de SDS ou aproximadamente 1% de SDS, em um solvente como água, etanol, ou outro solvente orgânico adequado, e o SDS residual pode ter sido removido usando uma solução aquosa de CaCl2 a uma concentração de aproximadamente 100mM seguido de incubação em dH2O.

[0024] Em determinadas representações, a solução de SDS pode ser em uma concentração acima de 0,1%, que pode facilitar a descelularização, e pode ser acompanhada de maior lavagem para remover o SDS residual.

[0025] Em outra representação ainda do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode ser funcionalizado em pelo menos alguns grupos funcionais de hidroxila livre através de acilação, alquilação, ou outra modificação covalente, para fornecer um biomaterial de estrutura tridimensional funcionalizado.

[0026] Em outra representação ainda do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode ser processado para a introdução de outra arquitetura e/ou microarquitetura e/ou pode ser funcionalizado em pelo menos alguns grupos funcionais de hidroxila livre através de acilação, alquilação, ou outra modificação covalente, para fornecer um biomaterial de estrutura tridimensional funcionalizado.

[0027] Em outra representação do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode ser processado para a introdução de microcanais, e/ou poder ser funcionalizado com colágeno, um fator para promover especificidade celular, um fator de crescimento celular, ou um agente farmacêutico, por exemplo.

[0028] Em outra representação do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode ser funcionalizado com colágeno.

[0029] Em outra representação ainda do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode compreender um tecido de hipanto de maçã (Malus pumila), um tecido de samambaia (Monilophytes), um tecido de raiz de nabo (Brassica rapa), um tecido de ramificação de gingko, um tecido de cavalinha (equisetum), um tecido de folha de hermocallis híbrida, um tecido de caule de couve (Brassica oleracea), um tecido de conífera Douglas Fir (Pseudotsuga menziesii), um tecido da polpa da fruta do cacto (pitaia), um tecido Maculata Vinca, um tecido de Lótus Aquática (Nelumbo nucifera), um tecido de pétala de Tulipa (Tulipa gesneriana), um tecido de Plátano (Musa paradisiaca), um tecido de caule de brócolis (Brassica oleracea), um tecido de caule de folha de bordo (Acer psuedoplatanus), um tecido de raiz primária de beterraba (Beta vulgaris), um tecido de cebola verde (Allium cepa), um tecido de orquídea (Orchidaceae), um tecido de caule de nabo (Brassica rapa), um tecido de alho porro (Allium ampeloprasum), um tecido de ramo de árvore de bordo (Acer), um tecido de aipo (Apium graveolens), um tecido de caule de cebola verde (Allium cepa), um tecido de pinheiro, um tecido de aloe vera, um tecido de melancia (Citrullus lanatus var. lanatus), um tecido de Creeping Jenny (Lysimachia nummularia), um tecido de cactae, um tecido Lychnis Alpina, um tecido de ruibarbo (Rheum rhabarbarum), um tecido de polpa de abóbora (Cucurbita pepo), um tecido de caule de dracena (Asparagaceae), um tecido de caule de Spiderwort (Tradescantia virginiana), um tecido do caule de Asparagus (Asparagus officinalis), um tecido de cogumelo (Fungi), um tecido de funcho (Foeniculum vulgare), um tecido de rosa (Rosa), um tecido de cenoura (Daucus carota), ou um tecido de pereira (Pomaceous).

[0030] Em determinadas representações, o tecido vegetal ou fúngico pode compreender um tecido geneticamente modificado preparado através de modificação direta do genoma e/ou através de reprodução seletiva para criar uma arquitetura vegetal ou fúngica adicional que é configurada para imitar fisicamente um tecido e/ou promover funcionalmente um efeito de tecido alvo. O profissional que levar em conta os ensinamentos aqui contidos será capaz de selecionar um biomaterial de estrutura tridimensional apropriado para servir a uma aplicação em particular.

[0031] Em outra representação do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o biomaterial de estrutura tridimensional pode ainda compreender células animais vivas aderidas à estrutura porosa tridimensional baseada em celulose ou quitina. Em outra representação, as células animais vivas podem ser células de mamíferos. Em outra representação ainda, as células animais vivas podem ser células humanas.

[0032] Em outra representação, é fornecido aqui um método para preparar um tecido vegetal ou fúngico descelularizado do qual materiais celulares e ácidos nucléicos são removidos, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado compreendendo uma estrutura porosa tridimensional baseada em celulose ou quitina, o dito método compreendendo: fornecer um tecido vegetal ou fúngico tendo um tamanho e formato predeterminados; e descelularizar o tecido vegetal ou fúngico por choque térmico, tratamento com detergente, choque osmótico, liofilização, lise física, interrupção elétrica, ou digestão enzimática, ou qualquer combinação dos mesmos, removendo assim materiais celulares e ácidos nucléicos do tecido begetal ou fúngico compreendendo uma estrutura porosa tridimensional baseada em celulose ou quitina.

[0033] Em outra representação do método acima, a etapa de descelularizar pode compreender tratamento do tecido vegetal ou fúngico com um detergente ou surfactante. Em certas representações, exemplos de detergentes podem incluir, mas não estão limitados a, dodecil sulfato de sódio (SDS), Triton X, EDA, tratamento alcalino, ácido, detergente iônico, detergentes não-iônicos, ou detergentes zwitteriônicos, ou uma combinação dos mesmos. Em determinadas representações, a etapa de descelularizar pode compreender tratamento do tecido vegetal ou fúngico com dodecil sulfato de sódio (SDS).

[0034] Em outra representação do método ou métodos acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode compreender um tecido vegetal ou fúngico que foi descelularizado por tratamento com um detergente. Exemplos de detergentes podem incluir, mas não estão limitados a, dodecil sulfato de sódio (SDS), Triton X, EDA, tratamento alcalino, ácido, detergente iônico, detergentes não-iônicos, ou detergentes zwitteriônicos, ou uma combinação dos mesmos.

[0035] Em outra representação do método ou métodos acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode compreender um tecido vegetal ou fúngico que foi descelularizado por tratamento com SDS.

[0036] Em ainda outra representação do método ou métodos acima, o SDS residual pode ser removido do tecido vegetal ou fúngico descelularizado através de lavagem com uma solução salina bivalente aquosa.

[0037] Em ainda outra representação do método ou métodos acima, o SDS residual pode ser removido usando uma solução salina bivalente aquosa para precipitar/quebrar um resíduo salino contendo micelas de SDS da solução/estrutura tridimensional, e um tratamento com dH2O, ácido acético, dimetilsulfóxido (DMSO), ou sonicação pode ser usado para remover o resíduo salino e/ou micelas de SDS. Em outra representação, o sal bivalente da solução salina bivalente aquosa pode compreender MgCl2 or CaCl2.

[0038] Em outra representação do método ou métodos acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode ter sido descelularizado por tratamento com uma solução de SDS de 0,01% a 10%, por exemplo aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%, ou, por exemplo, aproximadamente 0,1% de SDS ou aproximadamente 1% de SDS, em um solvente como água, etanol, ou outro solvente orgânico apropriado, e o SDS residual pode ter sido removido usando uma solução de CaCl2 aquosa a uma concentração de aproximadamente 100mM seguido de incubação em dH2O.

[0039] Em determinadas representações, a solução de SDS pode estar a uma concentração maior que 0,1%, o que pode facilitar a descelularização, e pode ser acompanhada por maior lavagem para remover o SDS residual.

[0040] Em outra representação do método ou métodos acima, a etapa de descelularizar pode compreender tratamento com uma solução de SDS de aproximadamente 0,1% em água, e o SDS residual pode ser removido após a descelularização usando uma solução de CaCl2 aquosa a uma concentração de aproximadamente 100mM seguido de incubação em dH2O.

[0041] Em outra representação do método ou métodos acima, o método pode ainda compreender uma etapa de funcionalizar pelo menos alguns grupos [livres] de hidroxila livre do tecido vegetal ou fúngico descelularizado através de acilação, alquilação, ou outra modificação covalente. Em determinadas representações, os grupos funcionais de hidroxila do tecido vegetal ou fúngico descelularizado podem ser funcionalizados com colágeno.

[0042] Em outra representação do método ou métodos acima, o método pode ainda compreender uma etapa de processar o tecido vegetal ou fúngico descelularizado para introduzir outra arquitetura e/ou micro-arquitetura, e/ou uma etapa de funcionalizar pelo menos alguns grupos [l+vres] de hidroxila livre do tecido vegetal ou fúngico descelularizado através de acilação, alquilação, ou outra modificação covalente. Em determinadas representações, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode ser processado para a introdução de microcanais, e/ou os grupos funcionais de hidroxila do tecido vegetal ou fúngico descelularizado podem ser funcionalizados com colágeno, um fator para promover especificidade celular, um fator de crescimento celular, ou um agente farmacêutico, por exemplo.

[0043] Em outra representação do método ou métodos acima, o método pode ainda compreender uma etapa de introduzir células animais vivas a uma estrutura porosa tridimensional baseada em celulose ou quitina, e permitir às células animais vivas aderirem à estrutura porosa tridimensional baseada em celulose ou quitina. Em determinadas representações, as células animais vivas podem ser células de mamíferos. Em determinadas representações, as células animais vivas podem ser células humanas.

[0044] Em outra representação, é aqui fornecido um biomaterial de estrutura tridimensional compreendendo um tecido vegetal ou fúngico descelularizado preparado através de qualquer um dos métodos acima.

[0045] Em outra representação, é aqui fornecido um uso de qualquer um dos biomateriais de estrutura tridimensional acima como uma estrutura tridimensional implantável para suportar o crescimento celular animal, para promover a regeneração de tecidos, para promover a angiogênese, para um procedimento de substituição de tecido, ou como um implante estrutural para cirurgia estética.

[0046] Em outra representação, é aqui fornecido um uso de qualquer um dos biomateriais de estrutura tridimensional acima como um implante estrutural para reparação ou regeneração após lesão da medula espinhal.

[0047] Em outra representação, é aqui fornecido um uso de qualquer um dos biomateriais de estrutura tridimensional acima como um implante estrutural para cirurgia de substituição de tecido e/ou regeneração de tecido após cirurgia.

[0048] Em outra representação, é aqui fornecido um uso de qualquer um dos biomateriais de estrutura tridimensional acima como um implante estrutural para enxerto de pele e/ou cirurgia de regeneração de pele.

[0049] Em outra representação, é aqui fornecido um uso de qualquer um dos biomateriais de estrutura tridimensional acima como um implante estrutural para regeneração da vascularização sanguínea em um tecido ou região alvo.

[0050] Em outra representação, é aqui fornecido um uso de qualquer um dos biomateriais de estrutura tridimensional acima como uma substituição óssea, preenchimento ósseo, ou material de enxerto ósseo, e/ou para promover a regeneração óssea.

[0051] Em outra representação, é aqui fornecido um uso de qualquer um dos biomateriais de estrutura tridimensional acima como um tecido para substituição de pele, ossos, medula espinhal, coração, músculos, nervos, vasos sanguíneos, ou outro tecido lesionado ou malformado.

[0052] Em outra representação, é aqui fornecido um uso de qualquer um dos biomateriais de estrutura tridimensional acima, na forma de hidrogel, como uma substituição do humor vítreo.

[0053] Em outra representação, é aqui fornecido um uso de qualquer um dos biomateriais de estrutura tridimensional acima como uma bursa artificial, onde o biomaterial de estrutura tridimensional forma uma estrutura tipo saco contendo biomaterial de estrutura tridimensional na forma de hidrogel.

[0054] Em outra representação, é aqui fornecido um uso de qualquer um dos biomateriais de estrutura tridimensional acima como um implante estrutural para cirurgia estética.

[0055] Ainda em outra representação de qualquer um dos usos acima, o biomaterial de estrutura tridimensional pode ser um biomaterial de estrutura tridimensional para o qual o tecido vegetal ou fúngico descelularizado do biomaterial de estrutura tridimensional é configurado para imitar fisicamente um tecido do paciente e/ou promover funcionalmente um efeito de tecido alvo no paciente.

[0056] Em outra representação, é fornecido aqui um método para suportar o crescimento celular animal. Para promover regeneração de tecidos, para promover a angiogênese, para substituição de um tecido, para promover a angiogênese, ou para fornecer uma estrutura tridimensional estrutural em uma cirurgia estética, em um paciente com necessidade do mesmo, o dito método compreendendo: fornecer um biomaterial de estrutura tridimensional de acordo com qualquer um dos biomateriais de estrutura tridimensional acima descritos; e implantar o biomaterial de estrutura tridimensional no paciente.

[0057] Em outra representação do método acima, o biomaterial de estrutura tridimensional pode ser implantado na medula espinhal, e promove a reparação ou regeneração após lesão da medula espinhal.

[0058] Em outra representação do método ou métodos acima, o biomaterial de estrutura tridimensional pode fornecer um implante estrutural para substituição de tecido e/ou regeneração de tecido no paciente.

[0059] Em outra representação do método ou métodos acima, o biomaterial de estrutura tridimensional pode fornecer um implante estrutural para enxerto de pele e/ou regeneração de pele no paciente.

[0060] Em outra representação do método ou métodos acima, o biomaterial de estrutura tridimensional pode fornecer um implante estrutural para regeneração da vascularização sanguínea em um tecido ou região alvo do paciente.

[0061] Em ainda outra representação do método ou métodos acima, o biomaterial de estrutura tridimensional pode fornecer uma substituição óssea, preenchimento ósseo, ou material para enxerto ósseo, e/ou pode promover regeneração óssea no paciente.

[0062] Em outra representação do método ou métodos acima, o biomaterial de estrutura tridimensional pode fornecer um tecido de substituição para a pele, ossos, medula espinhal, coração músculos, nervos, vasos sanguíneos, ou outro tecido lesionado ou malformado no paciente.

[0063] Em ainda outra representação do método ou métodos acima, o biomaterial de estrutura tridimensional, na forma de hidrogel, pode fornecer um substituto do humor vítreo no paciente.

[0064] Em ainda outra representação do método ou métodos acima, o biomaterial de estrutura tridimensional pode fornecer uma bursa artificial no paciente, onde o biomaterial de estrutura tridimensional forma uma estrutura tipo saco contendo biomaterial de estrutura tridimensional na forma de hidrogel.

[0065] Em ainda outra representação do método ou métodos acima, o biomaterial de estrutura tridimensional pode fornecer um implante estrutural para cirurgia estética.

[0066] Em ainda outra representação do método ou métodos acima, a etapa de fornecer um biomaterial de estrutura tridimensional pode incluir ainda: selecionar um biomaterial de estrutura tridimensional conforme descrito acima, para o qual o tecido vegetal ou fúngico do biomaterial de estrutura tridimensional é configurado para imitar fisicamente um tecido do paciente e/ou promover funcionalmente um efeito de tecido alvo no paciente.

[0067] Em outra representação, é aqui fornecido um kit compreendendo um biomaterial de estrutura tridimensional conforme descrito acima e pelo menos um de um recipiente ou instruções para realizar um método cirúrgico ou estético conforme descrito acima. Em determinada representação, o kit pode ser um kit cirúrgico.

[0068] Em outra representação, é aqui fornecido um kit compreendendo um ou mais de uma solução de SDS, uma solução de CaCl2, ou uma solução de PBS, e opcionalmente ainda compreendendo instruções para realizar um método para preparar um tecido vegetal ou fúngico descelularizado conforme descrito acima.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0069] Esses e outros aspectos ficarão mais claros a partir da descrição seguinte na qual é feita referência às seguintes figuras:

[0070] Figura 1: Estrutura tridimensionals de celulose descelularizados. A) Imagem de contraste de fase (técnica de microscopia de luz) da estrutura de parede celular de celulose em uma amostra de tecido de maçã descelularizado. As linhas escuras correspondem a estruturas de celulose distintas que formam uma matriz tridimensional. As estruturas escuras sobrepostas destacam a estrutura porosa em 3D do estrutura tridimensional descelularizado. B) Imagem SEM de uma estrutura tridimensional de celulose similar revelando a sua natureza tridimensional e grandes cavidades, destacando varias profundidades de bolsos internos que formam o estrutura tridimensional. Barra de escala = 200 μm;

[0071] Figura 2: Variedade de estruturas e origens de estrutura tridimensionals de cellulose. Esses novos estrutura tridimensionals são obtidos de plantas (ex: maçã, aspargo, funcho) e fungos (ex: cogumelo branco) empregando processos de descelularização;

[0072] Figura 3: Implantação de estrutura tridimensional de maçã em um modelo camundongo (in vivo). Dois estrutura tridimensionals de celulose (5x5x1mm) foram implantados subcutaneamente na seção dorsal de camundongos C57BL/10. As peles dorsais foram então cuidadosamente ressecadas e fixadas em 10% de solução de formalina em uma (A) e quatro (B) semanas após as cirurgias. Análises histológicas dos implantes foram conduzidas usando coloração com hematoxilina e eosina (H&A) e cada implante foi analisado. Após uma semana, a infiltração celular pode ser vista, e a infiltração total é alcançada após quatro semanas com a presença de vasos sanguíneos funcionais (angiogênese);

[0073] Figura 4: Pegada de estrutura tridimensional e infiltração celular total e angiogênese (in vivo). A) A alta porosidade do estrutura tridimensional derivado da maçã e a estrutura de parede fina (<100nm) pode ser facilmente observada nessa imagem tirada no meio do implante uma semana após a cirurgia. B) Infiltração celular total e angiogênese com formação de vaso sanguíneo funcional nas quatro semanas pós implantação. O estrutura tridimensional de celulose é invisível e coloração de celulose específica é necessária para permitir a observação;

[0074] Figura 5: Imagens fixadas e tingidas de citoesqueleto de actina de células cultivadas dentro do estrutura tridimensional de celulose em 3D e imagens artísticas SEM. Células A) NIH3T3, B) C2C12 e C) HeLa foram cultivadas nos estrutura tridimensionals de celulose por 2 semanas antes do tingimento para actina (verde) e núcleos celulares (azul). O citoesqueleto de actina e núcleos de células de mamíferos, cultivados em vidro ou dentro dos estrutura tridimensionals, foram tingidos de acordo com protocolos prévios (Guolla, Bertrand, Haase, & Pelling, 2012; Modulevsky, Tremblay, Gullekson, Bukoresthliev, & Pelling, 2012). Em resumo, amostras foram fixadas com 3,5% de paraformaldeído e permeabilizadas com Triton X-100 a 37oC. A actina foi tingida com faloidina conjugada com Alexa Fluor 488 (Invitrogen) e os núcleos foram tingidos rotulando o DNA com DAPI (Invitrogen). Amostras foram então montadas em Vecta-shield (Vector Labs). Células NIH3T3 e C2C12 apresentaram fibras de tensão de actina características encontradas em células cultivadas. As células HeLa também apresentaram estruturas de actina características incluindo menos fibras de tensão proeminentes e uma grande quantidade de localização de actina cortical. A presença de fibras de tensão demonstra que as células de mamíferos são aderidas na superfície do estrutura tridimensional de parede celular e estão presentes como in vivo. Barra de escala = 25μm e se aplica a todos. D) e E) são imagens SEM com tratamento de coloração celular artística para destacar a ligação celular no estrutura tridimensional de celulose;

[0075] Figura 6: Arquiteturas de parede celular encontradas nos reinos vegetal e fúngico. Esses exemplos de estrutura tridimensionals de celulose foram ressecados de animais 4 semanas após a sua implantação e foram tingidos com uma coloração hematoxilina/eosina. Essa figura mostra arquiteturas de parede celular e seu relacionamento com a função do tecido, que pode direcionar a escolha de biomateriais. Arquiteturas de parede celular encontradas nos reinos vegetal e fúngico apresentam uma grande variedade de estruturas que podem ser similares a tecidos tais como ossos, pele e nervos. Dependendo do tecido visado, a determinação da fonte da planta do biomaterial pode ser baseada nas características físicas e químicas da planta;

[0076] Figura 7: Exemplos de resultados histológicos mostrando a infiltração celular após 1, 4 e 8 semanas pós-implantação (coloração hematoxilina/eosina);

[0077] Figura 8: A) Deposição de colágeno (azul) no interior do biomaterial de celulose (branco) e a observação de vasos sanguíneos (glóbulos vermelhos e hemácias). B) Gráfico mostrando uma representação quantitativa da propriedade pró-angiogênica do estrutura tridimensional (observação do vaso sanguíneo funcional nas quatro semanas pós-implantação);

[0078] Figura 9: Característica não-reabsorvível do estrutura tridimensional de celulose em função do tempo pós-implantação;

[0079] Figura 10: Melhor conexão e proliferação celular usando lavagens com cloreto de cálcio;

[0080] Figura 11: Preparação do estrutura tridimensional de celulose. Aparência macroscópica de um tecido de hipanto de maçã recém cortado (A) e o biomaterial de estrutura tridimensional de celulose translúcido pós- descelularização e ausência de todas as células nativas da maçã ou fragmentos celulares (B). O tingimento com H&E do estrutura tridimensional de celulose descelularizado em corte transversal (C). A espessura das paredes celulares e a ausência de células nativas da maçã após a descelularização são mostradas. A arquitetura do estrutura tridimensional de celulose em 3D acelular e altamente porosa é claramente revelada por microscopia eletrônica de varredura (D). Barra de escala: A-B = 2mm, C-D = 100μm;

[0081] Figura 12: Implantação e ressecção de estrutura tridimensionals de celulose. As implantações subcutâneas de biomaterial de estrutura tridimensionals de celulose foram realizadas na região dorsal de um modelo camundongo C57BL/10ScSnJ através de pequenas incisões na pele (8mm) (A). Cada implante foi medido antes da sua implantação para comparação da área do estrutura tridimensional (B). Estrutura tridimensionals de celulose foram ressecados em 1 semana (D), 4 semanas (E) e 8 semanas (F) após as cirurgias e imagens macroscópicas foram tiradas (pele controle em C). As alterações na área de superfície do estrutura tridimensional de celulose durante esse tempo foram apresentadas (G). O estrutura tridimensional pré- implantação tinha uma área de 26.30±1.98mm2. Após a implantação, a área do estrutura tridimensional declinou para 20.74±1.80mm2 após uma semana, 16.41±2.44mm2 após 4 semanas e 13.82±3.88mm2 após 8 semanas. A área de superfície do estrutura tridimensional de celulose teve uma diminuição significativa de 12mm2 (48%) após 8 semanas de implantação (* = P<0.001; n= 12-14);

[0082] Figura 13: Biocompatibilidade e infiltração celular. Cortes transversais de estrutura tridimensionals de celulose representativos tingidos com H&E e anti- CD45. Essas visões globais mostram a reação corporal estranha aguda moderada-severa prevista em 1 semana (A), a imune crônica branda e subsequentes processos de limpeza em 4 semanas (B) e finalmente, o estrutura tridimensional de celulose no tecido nativo do camundongo em 8 semanas (C). Regiões de interesse de maior ampliação (D-F) permitem a observação de toda a população de tipo celular nos processos de assimilação de biomaterial. Em uma semana, populações de granulócitos, especificamente; polimorfonuclear (PMN) e eosinófilos que caracterizam a resposta imune aguda moderada a severa são observados, uma reação normal a procedimentos de implantação (D). Em 4 semanas, uma resposta imune diminuída pode ser observada (resposta imune branda a baixa) e a população de células na epiderme ao redor dos estrutura tridimensionals agora contem níveis mais altos de monócitos e linfócitos caracterizando resposta crônica (E). Finalmente, em 8 semanas, a resposta imune foi completamente reabsorvida com o tecido da epiderme agora parecendo normal. A resposta imune observada com a coloração H&E é confirmada usando-se anticorpo anti-CD45, marcadores bastante conhecidos de leucócitos (G-I). A população de células no estrutura tridimensional é agora principalmente de macrófagos, células multinucleadas e fibroblastos ativos. Barras de escala: A-C = 1mm, D-F = 100μm e G-I = 500 μm;

[0083] Figura 14: Deposição de matriz extracelular. Cortes transversais de estrutura tridimensionals de celulose representativos tingidos com Masson’s Trichrome (A-C). Depois de uma semana pós-implantação, a ampliação da região de interesse em (A) mostra a falta de estruturas de colágeno no interior do estrutura tridimensional de colágeno (D,G). Á medida que as células de fibroblasto começam a invadir o estrutura tridimensional, depósitos de colágeno dentro do estrutura tridimensional de celulose podem ser esparsamente observados após 4 semanas (E,H). Concomitantemente com a observação de fibroblasto ativado (células fusiformes) dentro do estrutura tridimensional de celulose, a rede de colágeno é claramente visível dentro das cavidades após 8 semanas (F,I). Barra de escalas: A-C = 1mm, D,F = 100μm e G-I = 20μm. * = fibras de colágeno; setas pretas = parede celular de celulose; seta branca = fibroblasto;

[0084] Figura 15: Vascularização e Angiogênese. Observações macroscópicas de vasos sanguíneos diretamente nos tecidos circundando o estrutura tridimensional de celulose (A). Confirmação de angiogênese no estrutura tridimensional de celulose pela observação de múltiplos cortes transversais de vasos sanguíneos em micrográficos de coloração H&M (B) e Masson’s Trichrome (C). O processo de angiogênese também foi confirmado com coloração anti-CD31 para identificar células endoteliais no estrutura tridimensional de celulose (D). Barras de escala: A = 1mm, B = 50μm e C-D = 20μm. Setas brancas = vasos sanguíneos;

[0085] Figura 16: Células NIH3T3, C2C12 e HeLa cultivadas em estrutura tridimensionals de celulose em 3D nativos. Coloração fluorescente específica de células de mamíferos (A) NIH3T3, (B) C2C12 e (C) HeLa nos estrutura tridimensionals de celulose não-modificados nativos. As células de mamíferos e parede celular de celulose nativa foram tingidas com manchas fluorescentes específicas alvo revelando a estrutura de celulose (vermelho), membranas de células de mamíferos (verde) e núcleos (azul). As células foram cultivadas nos estrutura tridimensionals de celulose descelularizados por quatro semanas antes da coloração e da tomada de imagem. Para tingir simultaneamente o estrutura tridimensional de celulose e as células de mamíferos, primeiramente fixamos as amostras conforme descrito acima, e então lavamos por três vezes as amostras cultivadas por quatro semanas com PBS. Para rotular a parede celular, um protocolo estabelecido (Truernit & Haseloff, 2008) foi empregado. As amostras foram enxaguadas com água e incubadas em 1% de ácido periódico (Sigma-Aldrich) em temperatura ambiente por 40 minutos. O tecido foi enxaguado novamente com água e incubado em reagente Schiff (100 mM de metabissulfito de sódio e 0.15 N HCl) com 100mg/mL de iodeto de propídio (Invitrogen) por 2 horas. As amostras foram então lavadas com PBS. Para visualizar as células de mamíferos no tecido vegetal, as amostras foram incubadas com uma solução de 5 mg/mL de aglutininas de germe de trigo (WGA) 488 (Invitrogen) e 1 mg/mL Hoechst 33342 (Invitrogen) em HBSS (20 mM HEPES em pH 7.4; 120 mM NaCl; 5.3 mM KCl; 0.8 mM MgSO4; 1.8 mM CaCl2; e 11.1 mM de dextrose). WGA e Hoechst 33342 são corantes de células vivas que rotulam a membrana da célula de mamíferos e o núcleo, respectivamente. Os estrutura tridimensionals de parede celular foram então transferidos para slides de microscópio e montados em uma solução de hidrato de cloral (4g de hidrato de cloral, 1mL de glicerol, e 2mL de água). Os slides foram mantidos durante a noite em temperatura ambiente em um ambiente fechado para evitar a desidratação. As amostras foram então colocadas em PBS até que estivessem prontas para a tomada de imagem. Claramente as células de mamíferos foram distribuídas por toda a superfície do biomaterial. Especificamente, observou-se o crescimento das células de mamíferos em colônias nas cavidades da parede celular. A visão ortogonal (plano ZY) mostra a profundidade da penetração da célula de mamíferos no biomaterial. A cor verde (membrana celular) e azul (núcleos) são vistas bem profundas no biomaterial e são observadas até as imagens penetrando na profundidade do microscópio. Volumes confocais foram adquiridos e projetados no plano XY e ZY. As visões ortogonais ZY demonstram a profundidade da proliferação celular no estrutura tridimensional de celulose. As superfícies superior e inferior do estrutura tridimensional são indicadas. Barras de escala: XY = 300mm, ZY = 100mm. Em D) o biomaterial foi seccionado para revelar a estrutura interna do biomaterial após as penetrantes restrições de profundidade de imagem do microscópio confocal. A imagem SEM de um corte transversal de uma estrutura tridimensional de celulose após ser semeado com células C2C12 que são deixadas para proliferar por quatro semanas. As células foram digitalmente colorizadas de modo a aumentar o contraste entre as células e a estrutura de celulose (Barra de escala: 50mm). As seções internas tiveram as imagens tomadas com SEM e revelaram células de mamíferos por todo o biomaterial e não apenas na superfície. Estrutura tridimensionals contendo células de mamíferos foram primeiramente fixadas com 3,5% de para formaldeído conforme apresentado acima, e então gentilmente lavados repetidamente com PBS. As amostras foram então desidratadas através de sucessivos gradientes de etanol (50%, 70%, 95% e 100%) e secadas dentro de um liofilizador. Amostras foram então revestidas de ouro em uma corrente de 15 mA por 3 minutos com um dispositivo de pulverização de íon Hitachi E-1010. A imagem com SEM foi conduzida em voltagens entre 2,00-10,0 kV em um JEOL JSM- 7500F FESEM;

[0086] Figura 17: Proliferação celular e viabilidade ao longo do tempo. A) Células NIH3T3, C2C12 e HeLa foram cultivadas individualmente em n = 3 estrutura tridimensionals de celulose por 1, 2 e 12 semanas e então feitas imagens com microscópio confocal após serem tingidas com Hoechst 33342. As células foram quantificadas a cada ponto de tempo usando o software de acesso aberto ImageJ (http://rsbweb. nih.gov/ij/). Um aumento da população celular é observado em todos os três tipos de células. Deve-se observar que o aumento na contagem de células pode apenas ser um resultado de proliferação já que os estrutura tridimensionals somente foram semeados com o tipo de célula respectivo no início do experimento. B) Após 12 semanas de cultura, as células C2C12 foram fixadas e tingidas com Hoechst 33342 (azul: células viáveis) e iodeto de propídio (PI) (vermelho: células apoptóticas/necróticas). Volumes confocais foram adquiridos e projetados no plano XY e ZY e revelam que células proliferaram por toda a estrutura durante a cultura de 12 semanas. As células que são apoptóticas/necróticas são encontradas em regiões mais profundas do estrutura tridimensional. As superfícies superior e inferior do estrutura tridimensional são indicadas. O número de células vivas (Hoechst (+)) e mortas (Hoechst/PI (+)) foram contadas e descobriu-se que, 98% das células no estrutura tridimensional eram viáveis. São mostrados dados para as células C2C12, mas é similar para as células NIH3T3 e HeLa (dados não mostrados). Barra de escala: B = 200mm para XY e 100mm para ZY;

[0087] Figura 18: Otimização de CaC12. Imagens de contraste de fase: A, C, E, G, I, K, M, O. Hoechst (mancha nuclear) imagens de fluorescência: B, D, F, H, J, L, N, P. Sem CaCl2: A-D, 10 mM CaCl2: E-H, 100 mM CaCl2: I-L, 1000 mM CaCl2: M-P. Sem células: A, B, E, F, I, J, M, N. Células (C2C12 mioblastos): C, D, G, H, K, L, O, P. O maior crescimento celular ocorreu em 100 mM CaCl2 e acima. Os pontos pretos na celulose nas amostras de 100 mM e 1000 mM CaCl2 são sal eliminado conforme evidenciado pela diferente localização dos núcleos nas imagens de fluorescência, e a sua presença na ausência de células. As células foram cultivadas nos estrutura tridimensionals antes da tomada de imagem. Barra de escala: 200μm. Essa figura mostra contraste de fase (A, C, E, G, I, K, M, O) e coloração de fluorescência Hoechst (B, D, F, H, J, L, N, P) de estrutura tridimensional descelularizado sem quaisquer células cultivadas e sem CaCl2 (A, B); de mioblastos C2C12 cultivados no estrutura tridimensional sem CaCl2 (C, D); do estrutura tridimensional tratado com 10 mM CaCl2 (E, F); de mioblastos C2C12 cultivados no estrutura tridimensional tratados com 10 mM CaCl2 (G, H); do estrutura tridimensional tratado com 100 mM CaCl2 (I, J); de mioblastos C2C12 cultivados no estrutura tridimensional tratados com 100 mM CaCl2 (K, L); do estrutura tridimensional tratado com 1000 mM CaCl2 (M, N); e de mioblastos C2C12 cultivados no estrutura tridimensional tratados com 1000 mM CaCl2 (O, P);

[0088] Figura 19: Remoção de resíduo salino. 100mM CaCl2 foram usados para remover SDS residual do estrutura tridimensional de celulose. (A) Micelas de CaCl2 sal/SDS eliminadas sobre a superfície do biomaterial; imagem de contraste de fase. (B) O resíduo de sal foi efetivamente removido com incubação em dH2O. Deve ser observado que tratamento com sonicação, incubação com acido acético, e incubação com DMSO produziram o mesmo resultado (ver Figura 20). Barra de escala: 200μm;

[0089] Figura 20: Crescimento celular após a remoção de sal. As células cresceram bem para cada um dos tratamentos de remoção salina. Incubação com dH2O: A,B; dH2O e sonicação: C,D; incubação com ácido acético: E,F; e incubação com DMSO: G,H. As imagens de contraste de fase (A,C,E,G) mostram que o estrutura tridimensional está livre de resíduo salino. As imagens de fluorescência Hoechst (mancha nuclear) (B,D,F,H) mostram crescimento celular substancial após 2 dias de cultura. Escala: 200μm. Essa Figura mostra contraste de fase (A,C,E,G) e coloração de fluorescência Hoechst (B,D,F,H) dos estrutura tridimensionals de maçã descelularizados com 2 dias de crescimento celular C2C12 em cultura lavados com diferentes sais. Em A e B, os estrutura tridimensionals foram incubados com dH2O. Em C e D os estrutura tridimensionals foram incubados com dH2O e sonicação. Em E e F, os estrutura tridimensionals foram incubados com ácido acético. Em G e H, os estrutura tridimensionals foram incubados com DMSO;

[0090] Figura 21: Vários sais podem ser usados para a remoção do SDS residual. Diferentes compostos salinos podem ser usados para realizar a mesma tarefa de remover o SDS residual do biomaterial. PBS, KCl, CaCl2, e MgCl2 (todos com 100mM) foram usados como uma lavagem salina para limpar o biomaterial. Núcleos de C2C12 foram tingidos com Hoechst em maçãs descelularizadas lavadas com os diferentes sais. Cada tratamento salino permitiu o crescimento celular; entretanto, os sais com cátions bivalentes (CaCl2 e MgCl2) promoveram maior crescimento celular. Essa Figura mostra imagens histológicas de núcleos C2C12 (2 dias de crescimento) foram tingidas com Hoechst em estrutura tridimensionals de maçã descelularizados, lavados com 100mM de PBS, KCl, CaCl2, MgCl2, CuSO4, KH2PO4, MgSO4, Na2CO3, e ibuprofeno de sódio. Diferentes compostos salinos podem ser usados para realizar a tarefa de remover o SDS residual do biomaterial. PBS, KCl, CaCl2, MgCl2, CuSO4, KH2PO4, MgSO4, Na2CO3, e ibuprofeno de sódio (todos com 100mM) foram usados como uma lavagem salina para limpar o biomaterial, e remover o SDS residual. Cada tratamento salino mostrado nessa figura permitiu o crescimento celular; entretanto, os sais com cátions bivalentes (CaCl2 e MgCl2) bem como o grupo ânion carbonato promoveram maior crescimento celular;

[0091] Figura 22: A coloração de parede secundária do estrutura tridimensional de maçã e do estrutura tridimensional de aspargo é mostrada. Diferentes elementos da parede celular podem ser explorados para o biomaterial. Os grupos cinamaldeído da lignina foram tingidos (púrpura clara) com coloração Wiesner. A pectina e a lignina foram tingidas com azul O Toluidina. A celulose e β-(1-4)-glucanos foram tingidos com vermelho Congo;

[0092] Figura 23: É mostrado aqui que a celulose nativa pode suportar células de mamíferos, incluindo mioblasto C2C12, fibroblasto 3T3 e células HeLa epiteliais humanas. No entanto, um biomaterial funcional pode ainda ser capaz de ser química e mecanicamente adaptado para servir ao uso pretendido em particular. Duas técnicas diferentes foram usadas nesses experimentos para mudar a rigidez do estrutura tridimensional de celulose descelularizado. Adicionalmente, imagens de contraste de fase demonstram que os biomateriais ainda suportam a cultura de células de mamíferos após modificação química e física. A) A elasticidade mecânica local dos estrutura tridimensionals de tecido nativo, descelularizado (SDS), funcionalizado com colágeno (SDS+Col) e de celulose reticulado de glutaraldeído (SDS+GA). Os estrutura tridimensionals de tecido nativo e não-modificados não apresentam qualquer diferença significativa em propriedades mecânicas. Tanto os estrutura tridimensionals de colágeno funcionalizado quanto os quimicamente reticulados apresentaram aumento significativo em elasticidade em comparação com estrutura tridimensionals DMEM (*** = p<0.001). Os estrutura tridimensionals B) descelularizados (SDS), C) Funcionalizados com colágeno (SDS+Col) e D) reticulados de glutaraldeído (SDS+GA) todos suportaram o crescimento de células C2C12. Barra de escala = 200mm;

[0093] Figura 24: Técnicas de moldagem inversa. Construtos de anel de celulose de estrutura tridimensional de maçã descelularizado foram cortados usando punção de biópsia. Células de mioblastos C2C12 foram cultivadas nos estrutura tridimensionals por 2 semanas. O biomaterial foi totalmente invadido pelas células. Os anéis também foram usados em combinação com moldagem inversa temporária usando gelatina B), e moldagem inversa permanente usando colágeno (C). Ambos deram crescimento celular comparável ao estrutura tridimensional de celulose simples (A). Os núcleos C2C12 foram tingidos com Hoechst (azul), as membranas de células C2C12 foram tingidas com WGA (verde), e a celulose foi tingida com Schiff Reagent e iodeto de propídio (vermelho). Barra de escala = 1000μm. A primeira coluna mostra núcleos C2C12 tingidos com Hoechst. A segunda coluna mostra membranas de células C2C12 tingidas com WGA usadas em combinação com moldagem inversa temporária usando gelatina. A terceira coluna mostra celulose de células C2C12 cultivadas tingidas com Schiff Reagent e iodeto de propídio usado em combinação com moldagem inversa permanente usando colágeno. A quarta coluna mostra uma fusão das imagens em cada uma das filas A, B e C;

[0094] Figura 25: Crescimento celular e moldagem inversa. Imagem confocal de células C2C12 no biomaterial nativo (A), no biomaterial em moldagem inversa temporária usando gelatina (B), e no biomaterial em moldagem inversa permanente usando colágeno (C). As projeções xy e zy máximas são mostradas. As três diferentes condições deram o mesmo resultado: invasão total e alta proliferação. A celulose foi tingida com Schiff Reagent com iodeto de propídio (vermelho), e os núcleos celulares foram tingidos com Hoechst (azul). Escala: 200μm;

[0095] Figura 26: Invasão e proliferação celular e técnicas de moldagem inversa. A proliferação celular foi estimada através do cálculo da área nuclear total para cada técnica de moldagem (o controle é a celulose nativa) (A). Não houve diferença significativa entre a celulose nativa, a moldada com gelatina, e as amostras moldadas com colágeno. A invasão celular foi estimada usando o índice da área nuclear superior:inferior (B). Não houve diferença significativa entre as três condições. Como resultado, a moldagem inversa não alterou a invasão e proliferação celular nessas condições experimentais;

[0096] Figura 27: Micro-arquitetura artificial foi criada em estrutura tridimensionals de celulose derivados de maçã. Duas diferentes micro- arquiteturas foram criadas nos estrutura tridimensionals de celulose descelularizados para demonstrar a viabilidade de criar diferentes micro- arquiteturas com o biomaterial para objetivos específicos tais como aumentar a migração celular do hospedeiro para o estrutura tridimensional de celulose. Em A) uma punção de biópsia de 1mm foi usada para criar cinco espaços cilíndricos negativos em uma estrutura tridimensional de celulose derivado de maçã como um primeiro exemplo de uma micro-arquitetura artificial. Inversamente, em B) uma punção de biópsia de 3mm foi usada para criar um único espaço negativo centrado. Somente após 4 semanas a formação de vaso sanguíneo de maior implantação pode ser observada tendo origem diretamente dos espaços negativos derivados artificiais (C e D) tanto no exemplo de 1mm quanto no de 3mm. Em C) vasos sanguíneos estão em cada um dos quatro cantos do biomaterial sugerindo o aumento da vascularização no espaço negativo derivado artificial. Similarmente, em D) vasos sanguíneos podem ser observados em cima do estrutura tridimensional de celulose sugerindo que os vasos sanguíneos viajaram através do estrutura tridimensional de celulose. Cortes transversais de estrutura tridimensionals de celulose representativos tingidos com hematoxilina e eosina (H&E) (E-F);

[0097] Figura 28: Mostra imagens descrevendo estrutura tridimensionals de celulose de várias fontes, sua ressecção e histologia após 4 semanas e 8 semanas conforme indicado. Vários estrutura tridimensionals de celulose derivados de plantas foram implantados subcutaneamente em camundongos para avaliar a biocompatibilidade em 4 semanas e/ou 8 semanas. Tecido seletivo de várias plantas foram implantados por um período de 4 ou 8 semanas para demonstrar a biocompatibilidade da celulose derivada de planta e arquitetura da planta em migração celular de hospedeiro in vivo. Em todos os exemplos, a migração e proliferação celular para o estrutura tridimensional de celulose foi observada, destacando a biocompatibilidade dos estrutura tridimensionals de celulose derivados de plantas nesses experimentos. As implantações subcutâneas de biomateriais de estrutura tridimensional de celulose foram realizadas na região dorsal de um modelo camundongo C57BL/10ScSnJ através de pequenas incisões (8mm). Cada implante foi medido antes da sua implantação para comparação de área do estrutura tridimensional (primeira coluna: Estrutura tridimensional de Celulose). Enxertos de celulose foram ressecados (segunda coluna: Ressecção) em 4 ou 8 semanas conforme indicado. Seções de espessura 5μm seriais foram cortadas, começando em 1mm no interior do estrutura tridimensional de celulose, e tingidas com hematoxilina-eosina (H&M) (terceira coluna: Histologia). Para a avaliação da infiltração celular, micro gráficos foram capturados usando Zeiss MIRAX MIDI Slide Scanner (Zeiss, Toronto, Canada) equipados com objetiva de 40x e analisados usando Pannoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Budapeste,

Hungria) e software ImageJ;

[0098] Monilophytes: Implantação e ressecção de estrutura tridimensionals de celulose. As implantações subcutâneas do biomaterial de estrutura tridimensionals de celulose foram realizadas na região dorsal de um modelo camundongo C57BL/10ScSnJ através de pequenas incisões (8mm) (A). Cada implante foi medido antes da sua implantação para comparação de área do estrutura tridimensional (B). Estrutura tridimensionals de celulose foram ressecados em 1 semana (D), 4 semanas (E) e 8 semanas (F) após as cirurgias e foram tiradas imagens macroscópicas (pele controle em C). a cada ponto de tempo os vasos sanguíneos estão claramente integrados com o implante de celulose demostrando a biocompatibilidade. Assim como não há inflamação aguda ou crônica no tecido ao redor do implante. As mudanças na área de superfície do estrutura tridimensional de celulose durante o tempo são apresentadas (G). O estrutura tridimensional pré-implantação tinha uma área de 26.30±1.98mm2. Depois a implantação, a área do estrutura tridimensional declinou para 20.74±1.80mm2 após 1 semana, 16.41±2.44mm2 após 4 semanas e 13.82 ±3.88mm2 após 8 semanas. A área de superfície do estrutura tridimensional de celulose teve uma diminuição significativa de aproximadamente 12mm2 (48%) após 8 semanas de implantação (* = P<0.001; n = 12-14);

[0099] Figura 30: Biocompatibilidade e infiltração celular. Cortes transversais de estrutura tridimensionals de celulose representativos tingidos com H&E e anti- CD45. Essa visão global mostra a prevista reação a um corpo estranho moderada-severa em 1 semana (A), a imune crônica branda e os processos de limpeza subsequentes em 4 semanas (B) e finalmente, o estrutura tridimensional de celulose assimilado ao tecido do camundongo nativo em 8 semanas (C). Regiões de interesse de maior ampliação (D-F), ver inserção (AC), permitem a observação de população do tipo de célula nos processos de assimilação do biomaterial. Em 1 semana, podemos observar populações de granulócitos, especificamente; polimorfonuclear (PMN) e eosinófilos que caracterizam a resposta imune aguda moderada a severa, uma reação normal a procedimentos de implantação (D). Em 4 semanas, uma menor resposta imune pode ser observada (resposta imune branda a baixa) e a população de células na epiderme ao redor dos estrutura tridimensionals agora contem maiores níveis de monócitos e linfócitos caracterizando resposta crônica (E). Finalmente, em 8 semanas, a resposta imune foi completamente reabsorvida com o tecido da epiderme agora parecendo normal (F). A resposta imune observada com a coloração H&E é confirmada usando anticorpo anti-CD45, um conhecido marcador de leucócitos (G-I). A população de células no estrutura tridimensional é agora principalmente de macrófagos, células multinucleadas e fibroblastos ativos. Barras de escala: A-C = 1mm, D-F = 100μm e G-I = 500μm;

[0100] Figura 31: Deposição de matriz extracelular. Cortes transversais de estrutura tridimensionals de celulose representativos tingidos com Masson’s Trichrome (A-C). Após 1 semana pós-implantação, a ampliação da região de interesse em (A), ver inserção, mostra a falta de estruturas de colágeno no estrutura tridimensional de colágeno (D,G). À medida que as células de fibroblastos começam a invadir o estrutura tridimensional, depósitos de colágeno no estrutura tridimensional de celulose podem ser esparsamente observados após 4 semanas (E,H). Concomitantemente com a observação de fibroblasto ativado (células fusiformes) no estrutura tridimensional de celulose, a rede de colágeno é claramente visível dentro das cavidades após 8 semanas (F,I). Barras de escala: A-C = 1mm, D-F = 100μm e G-I = 20μm. * = fibras de colágeno; setas pretas = parede celular de celulose; seta branca = fibroblasto;

[0101] Figura 32: Vascularização e Angiogênese. Observações macroscópicas de vasos sanguíneos diretamente nos tecidos circundantes ao redor do estrutura tridimensional de celulose (A). Confirmação de angiogênese no estrutura tridimensional de celulose pela observação de cortes transversais de múltiplos vasos sanguíneos em micrógrafos de coloração H&E (B) e coloração Masson’s Trichrome (C). O processo de angiogênese também foi confirmado com coloração anti-CD-31 para identificar células endoteliais no estrutura tridimensional de celulose (D). Barras de escala: A = 1mm, B = 50μm e C-D = 20μm. Setas brancas = vasos sanguíneos;

[0102] Figura 33: A) imagem confocal 2-fóton de estruturas xilema (*) em aspargo descelularizado (barra = 0,1mm), a mancha celulose-específica (vermelho) é usada para observar a estrutura fina dentro da planta. B) Imagem de contraste de fase de um único micro canal de xilema contínuo (*) em xilema de planta (barra = 0,1mm). C) Imagem SEM de micro canal de xilema fraturado por congelamento (bar = 20μm). D) Visão bruta de um plugue vegetal descelularizado pronto para implantação;

[0103] Figura 34: Neurônios primários (tingidos de verde com corante de membrana celular) crescendo ao longo das paredes dos micro canais de xilema em uma estrutura tridimensional vegetal descelularizado in-vitro. Essa imagem transversal (2μm de espessura) foi obtida em 1mm de profundidade dentro de um plugue de 3mm (barra = 0,1mm). B) coloração H&E de uma estrutura tridimensional vegetal descelularizado implantado subcutaneamente após 4 semanas (barra = 1mm). Inserção: Corte transversal dos micro canais de xilema (barra = 0,2mm). C) Visão bruta de um enxerto vegetal descelularizado de 3mm (seta) implantado na medula espinhal;

[0104] Figura 35: A) Visões axiais MRI (i) superior e (iii) inferior do (ii) enxerto (seta). Laminectomia em (ii) resultados T8/9 na perda das raízes de nervo que são visíveis em (i) e (iii). B) Após 8 semanas, a medula espinhal e cérebro são removidos. O enxerto (seta) aparece bem integrado sem sinais de infecção, calcificação ou fibrose. C) Recuperação locomotora 8 semanas pós implantação foi exibida em (i-iii) passada coordenada e peso sustentados em uma esteira (mostrado) e em uma arena BBB plana. D) pontuações BBB para ratos controle (vermelho, n = 4) e enxerto- (azul, n = 7) em uma arena BBB plana. E) coloração revela nervos mielinizados da medula espinhal (sc), crescendo nos micro canais do biomaterial (bm) (barra = 200μm). A interface é indicada com uma linha pontilhada;

[0105] Figura 36: Uma visão global de todo o enxerto da medula espinhal implantado na região T8-T9 da espinha. O tecido foi tingido com H&E-LFB que mostra os núcleos como roxo escuro e o tecido mielinizado como azul claro. Importantemente, micro canais cobrindo a extensão de todo o enxerto podem ser vistos infiltrados com ambas as células hospedeiras;

[0106] Figura 37: Seções ventrais do local de transecção adjacente (superior- cranial; inferior-caudal) foram tingidas em ambos os ratos controle e implantados com enxerto espinhal e tingidos para marcador de filamento neural e (NF200 Green) e núcleos (Hoechst Blue). Em A) a área escura representa a locação do biomaterial. Interessantemente enxerto espinhal adjacente, filamentos verdes podem ser observados se esticando na direção ventral (setas vermelhas). Esses filamentos representam neurônios maduros no local do rato cortado transversalmente após 12 semanas in vivo. Por outro lado, no controle B) filamentos neurais organizados não podem ser observados indicando uma falta de filamentos maduros no local de corte transversal do controle. Adicionalmente, a coloração Hoechst revela um número significativamente aumentado de núcleos, e assim como células, circundando o enxerto espinhal no local de corte transversal em comparação com o controle;

[0107] Figura 38: Tecido de hipanto de maçã foi descelularizado e processado para enxertos de pele. Camundongos C57BL/10ScSnJ tiveram a sua pele dorsal raspada e preparada cirurgicamente. (A) tampões de borracha com diâmetro externo de 10mm foram suturados sobre a pele dorsal para evitar que o ferimento fechasse. (B) Um tecido de hipanto de maçã descelularizado com diâmetro de 5mm foi colocado no centro do tampão de borracha e coberto com um adesivo semi-permeável. (C) Foram tiradas fotografias após 4 dias para medir o grau de infiltração celular do hospedeiro durante o processo de cura do ferimento;

[0108] Figura 39: Estrutura tridimensionals de celulose derivados de plantas para enxertos ósseos. Cada implante cilíndrico (5mm de diâmetro, 1mm de espessura) foi medido antes da implantação para comparação da área do estrutura tridimensional (A). Implantes de estrutura tridimensional de celulose foram implantados nos defeitos do crânio do rato e posicionados para permanecer dentro do defeito do crânio. A pele foi então posicionada sobre o enxerto e suturada de modo a manter o estrutura tridimensional no lugar. (B) O estrutura tridimensional e tecidos ósseos adjacentes foram isolados 4 semanas após a implantação e imagens macroscópicas foram tiradas (C). O tecido isolado foi então descalcificado e processado/incorporado em parafina. Seções seriais com espessura de 5μm foram cortadas, começando em 1mm dentro do estrutura tridimensional de celulose, e tingidas com hematoxilina-eosina (H&E) (D). Para a avaliação da regeneração óssea, micrógrafos foram capturados usando Zeiss MIRAX MIDI Slide Scanner (Zeiss, Toronto, Canada) equipado com objetiva 40x e analisados usando Pannoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Budapeste, Hungria) e software ImageJ;

[0109] Figura 40: Diferentes formulações de celulose, propriedades físicas e funcionalização. A celulose pode ser usada como um bloco (A) com diferentes formatos ou desidratada e moída em forma de um pó que pode ser então reidratado até uma consistência desejada para produzir um gel (C,D) ou uma pasta (E,F). Se a celulose contiver carboximetilcelulose, pode ser facilmente reticulada com ácido cítrico e calor (B). Celulose proveniente de diferentes plantas também pode ser combinada, misturada, reticulada, etc.; e

[0110] Figura 41: Essa figura mostra (A) um gráfico mostrando a taxa de sobrevivência de camundongos (n=190) e ratos (n=12) após a implantação do biomaterial (de várias fontes) em 1 semana, 4 semanas e 8 semanas pós- implantação. (B) Essa figura mostra a taxa de rejeição ao biomaterial nesses mesmos pontos de tempo como em (A).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0111] Aqui estão descritos biomateriais de estrutura tridimensional compreendendo um tecido vegetal ou fúngico descelularizado do qual materiais celulares e ácidos nucléicos do tecido foram removidos, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado compreendendo uma estrutura porosa baseada em celulose ou quitina. Métodos para preparar esses biomateriais de estrutura tridimensional, bem como os usos dos mesmos como uma estrutura tridimensional implantável para suportar o crescimento celular animal, para promover regeneração de tecido, para promover angiogênese, para um procedimento de substituição de tecido, para promover angiogênese, e/ou como um implante estrutural para cirurgia estética também são fornecidos. Tratamento terapêutico e/ou métodos cosméticos empregando tais estrutura tridimensionals são adicionalmente descritos, bem como outras aplicações que podem incluir aplicações veterinárias, por exemplo. Há que se assinalar que representações e exemplos são fornecidos com propósitos ilustrativos dirigidos aos especialistas na área, e não pretendem de forma alguma ser limitadores.

[0112] Em determinadas representações, são aqui descritos biomateriais que podem ter aplicações em pesquisa laboratorial biomédica e/ou medicina regenerativa clínica, por exemplo. Esses biomateriais podem ser eficazes como estrutura tridimensionals que podem ser usados como ferramentas investigativas para pesquisadores biomédicos industriais/acadêmicos, para implantes biomédicos, em dispositivos sensores e veículos de administração farmacêutica e/ou em outras aplicações apropriadas nas quais estrutura tridimensionals possam ser usados.

[0113] Em determinadas representações, os biomateriais aqui descritos podem ser derivados de arquiteturas de parede celular encontradas nos reinos vegetal ou fúngico para criar estrutura tridimensionals em 3D complexos que podem promover infiltração celular, crescimento celular, angiogênese, reparação de tecido, e/ou reconstrução de tecido, etc. (ver, por exemplo, Figura 1). Como será observado, biomateriais conforme aqui descritos podem ser produzidos a partir de quaisquer partes de organismos vegetal ou fúngico adequados, incluindo, por exemplo, semente, raiz, casca, folha, caule, fruta, polpa, núcleo, e pode, em certas representações, ser produzidos com diferentes formatos (tais como chapas, vasos, blocos, canulação, orifícios de aeração, etc.) ou formulações (incluindo, por exemplo, pastas, partículas, blocos, etc.) (ver, por exemplo, Figura 2). Biomateriais podem compreender, por exemplo, substancias como celulose, quitina e/ou quaisquer outros bioquímicos/biopolímeros adequados que são naturalmente encontrados nesses organismos.

[0114] Em determinadas representações, estrutura tridimensionals resultantes também podem ser: quimicamente modificados para introduzir química de superfície personalizada; cortados como blocos sólidos, pastas injetáveis/expelíveis, e/ou polpas; e/ou podem oferecer uma gama de possibilidades arquitetônicas na escala de micrometros a centímetros, que podem substituir/imitar vários tipos de ambientes de tecidos vivos.

[0115] Conforme é aqui descrito, o uso desse biomaterial planta/fungo-derivado pode resultar em uma estrutura tridimensional de alta porosidade que pode ter paredes notadamente finas (<100nm) (ver, por exemplo, Figura 1). Isso pode, em determinadas representações, proporcionar uma pegada mínima do material de estrutura tridimensional (i.e., quando totalmente invadido por células vivas, a célula para o índice de volume do estrutura tridimensional pode ser notadamente alta).

[0116] Em determinadas representações, biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descritos podem ser biocompatíveis. Conforme descrito mais detalhadamente abaixo, após a implantação subcutânea de biomateriais de estrutura tridimensional de exemplo em um modelo camundongo, a total infiltração celular e angiogênese com formação de vaso sanguíneo funcional foi observada nas 4 semanas pós-implantação (ver, por exemplo, Figuras 3 e 4). Conforme também descrito nos experimentos detalhados aqui abaixo, quando estrutura tridimensionals são implantados in vivo, a mínima infiltração celular promovida por pegada, angiogênese e reparação de tecido, e apenas uma resposta inflamatória mínima (produzida principalmente pela própria cirurgia e não pelo estrutura tridimensional) foi observada sob as condições testadas.

[0117] Experimentos descritos aqui abaixo indicam que biomateriais derivados de planta/fungo conforme aqui descritos são totalmente biocompatíveis in vivo sob as condições testadas. Eles também são totalmente compatíveis com estudos in vitro conforme mostrado na Figura 5, e em Modulevsky, D.J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z. and Pelling, A.E. “Apple Derived Cellulose Estrutura tridimensionals for 3D Mammalian Cell Culture.” Plos One, 9, e97835 (2014) (aqui incorporados a título de referência).

[0118] Em determinadas representações, diferentemente de muitos biomateriais comerciais, biomateriais derivados de planta/fungo conforme aqui descrito podem ser não-reabsorvíveis ou pouco reabsorvíveis (i.e. eles não vão substancialmente se desagregar e ser absorvidos pelo corpo). A característica não-reabsorvível desses estrutura tridimensionals pode oferecer certos benefícios. Por exemplo, em certas representações, biomateriais aqui descritos podem ser resistentes à mudança de formato, e/ou podem manter a sua geometria pretendida por longos períodos de tempo. Em determinadas representações, como eles podem ter uma pegada mínima em comparação com outros produtos, podem ser considerados efetivamente invisíveis para o corpo, provocando quase nenhuma resposta imune. Quando biomateriais reabsorvíveis se desagregam, os seus subprodutos muitas vezes provocam uma resposta imune adversa, bem como induzem estresse oxidativo e resultam em um aumento do pH no tecido em recuperação, o que pode ser evitado com o uso de um biomaterial não-reabsorvível.

[0119] Como será compreendido, salvo indicação em contrário, o significado/definição dos reinos de planta e fungo aqui usados é baseado na classificação de Cavalier-Smith (1998).

Biomateriais de Estrutura tridimensional

[0120] Em uma representação, é aqui fornecido um biomaterial de estrutura tridimensional compreendendo um tecido vegetal ou fúngico descelularizado do qual materiais celulares e ácidos nucléicos do tecido são removidos, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado compreendendo uma estrutura porosa tridimensional baseada em celulose ou quitina. Como se pode observar, em certas representações, um biomaterial de estrutura tridimensional pode compreender um material estranho ao hospedeiro que pode fornecer uma arquitetura, suporte e/ou infraestrutura subjacente para que células hospedeiras infiltrem, invadam, e/ou proliferem.

[0121] Em determinadas representações, biomateriais de estrutura tridimensional podem compreender uma forma substancialmente sólida, um bloco ou outro formato rígido, podem ser desidratados e moídos em forma de pó ou partícula, podem ser em uma forma reticulada (particularmente onde o biomaterial compreende um tecido baseado em celulose que contem carboximetilcelulose, que pode ser facilmente reticulado com ácido cítrico e calor), ou podem ser em uma forma de gel ou pasta. Esses géis ou pastas podem ser produzidos, por exemplo, através da reidratação de uma forma em pó do tecido até uma consistência desejada para produzir um gel ou pasta. Adicionalmente, em certas representações, a moldagem por compressão pode ser empregada para gerar folhas de biomateriais baseados em celulose, opcionalmente com vários aditivos para aumentar a reticulação. Tais aditivos podem incluir, mas não estão limitados a, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido málico ou ácido cítrico que pode ser ou adicionado à polpa ou pulverizado juntamente com di-hidrogenofosfato de sódio como um catalisador.

[0122] Como será observado, tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode compreender qualquer biomaterial apropriado derivado ou produzido a partir de uma amostra de tecido derivado ou direto de planta ou fungo adequado. Em determinadas representações, tais materiais, que podem compreender uma arquitetura, suporte e/ou infraestrutura subjacente, podem resultar de um método apropriado combinado ou simples para remover, lisar, ou processar enzimaticamente células nativas de um tecido vegetal ou fúngico.

[0123] Em determinadas representações do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o tecido vegetal ou fúngico pode compreender um tecido de hipanto de maçã (Malus pumila), um tecido de samambaia (Monilophytes), um tecido de raiz de nabo (Brassica rapa), um tecido de ramificação de gingko, um tecido de cavalinha (equisetum), um tecido de folha de hermocallis híbrida, um tecido de caule de couve (Brassica oleracea), um tecido de conífera Douglas Fir (Pseudotsuga menziesii), um tecido da polpa da fruta do cacto (pitaia), um tecido Maculata Vinca, um tecido de Lótus Aquática (Nelumbo nucifera), um tecido de pétala de Tulipa (Tulipa gesneriana), um tecido de Plátano (Musa paradisiaca), um tecido de caule de brócolis (Brassica oleracea), um tecido de caule de folha de bordo (Acer psuedoplatanus), um tecido de raiz primária de beterraba (Beta vulgaris), um tecido de cebola verde (Allium cepa), um tecido de orquídea (Orchidaceae), um tecido de caule de nabo (Brassica rapa), um tecido de alho porro (Allium ampeloprasum), um tecido de ramo de árvore de bordo (Acer), um tecido de aipo (Apium graveolens), um tecido de caule de cebola verde (Allium cepa), um tecido de pinheiro, um tecido de aloe vera, um tecido de melancia (Citrullus lanatus var. lanatus), um tecido de Creeping Jenny (Lysimachia nummularia), um tecido de cactae, um tecido Lychnis Alpina, um tecido de ruibarbo (Rheum rhabarbarum), um tecido de polpa de abóbora (Cucurbita pepo), um tecido de caule de dracena (Asparagaceae), um tecido de caule de Spiderwort (Tradescantia virginiana), um tecido do caule de Asparagus (Asparagus officinalis), um tecido de cogumelo (Fungi), um tecido de funcho (Foeniculum vulgare), um tecido de rosa (Rosa), um tecido de cenoura (Daucus carota), ou um tecido de pereira (Pomaceous).

[0124] Em determinadas representações, o tecido vegetal ou fúngico pode ser geneticamente alterado através de modificação direta do genoma ou através de reprodução seletiva, para criar uma arquitetura vegetal ou fúngica adicional que pode ser configurada para imitar fisicamente um tecido e/ou para promover funcionalmente um efeito de tecido alvo. O especialista levando em conta os ensinamentos aqui contidos será capaz de selecionar um biomaterial de estrutura tridimensional apropriado para se adequar a uma aplicação em particular.

[0125] Em determinadas representações, um tecido apropriado pode ser selecionado para uma aplicação em particular com base em, por exemplo, características físicas como tamanho, estrutura (porosa/tubular), rigidez, força, dureza e/ou ductilidade, que podem ser medidas e ajustadas a uma aplicação em particular. Além disso, propriedades químicas tais como reatividade, número de coordenação, entalpia de formação, calor de combustão, estabilidade, toxicidade, e/ou tipos de conexões também podem ser considerados para seleção de modo a servir a uma aplicação em particular. Tais características (físicas e químicas) também podem ser diretamente modificadas antes ou depois da descelularização e/ou funcionalização para responder a uma aplicação específica. Além disso, em certas representações, a celulose pode ser obtida de diferentes plantas e pode ser combinada e misturada, reticulada etc. usando a química abaixo indicada.

[0126] Em determinadas representações, o biomaterial de estrutura tridimensional pode ser um biomaterial de estrutura tridimensional para o qual o tecido vegetal ou fúngico descelularizado do biomaterial de estrutura tridimensional é configurado para imitar fisicamente um tecido do paciente e/ou promover funcionalmente um efeito de tecido alvo no paciente. Métodos de uso desses biomateriais de estrutura tridimensional conforme são aqui descritos podem, em certas representações, incluir uma etapa de selecionar um biomaterial de estrutura tridimensional conforme aqui descrito para o qual o tecido vegetal ou fúngico descelularizado do biomaterial de estrutura tridimensional é configurado para imitar fisicamente um tecido do paciente e/ou promover funcionalmente um efeito de tecido alvo no paciente. O especialista levando em conta os ensinamentos aqui contidos será capaz de selecionar um biomaterial de estrutura tridimensional apropriado para se adequar a uma aplicação em particular.

[0127] A título de exemplo não limitador, a Figura 6 fornece alguns exemplos de biomateriais de estrutura tridimensional demonstrando arquiteturas de parede celular histológicas e relações correspondentes a determinadas funções tecidos/tecido, que podem, em certas representações, ser usadas para direcionar a seleção do biomaterial de estrutura tridimensional para se adequar a aplicação(ões) em particular. Como se poderá observar, arquiteturas de parede celular encontradas nos reinos vegetal e fúngico apresentam uma ampla variedade de estruturas que podem ser similares a tecidos como ossos, pele e nervos. Dependendo do tecido direcionado, a determinação da fonte vegetal ou fúngica do biomaterial pode ser baseada nas características físicas e/ou químicas da planta, e/ou nas características físicas e/ou químicas do biomaterial de estrutura tridimensional gerado.

[0128] Como será observado, materiais celulares e ácidos nucléicos podem incluir conteúdo intracelular tais como organelas celulares (ex., cloroplastos, mitocôndria), núcleos celulares, ácidos nucléicos celulares, e proteínas celulares. Esses podem ser substancialmente removidos, parcialmente removidos, ou totalmente removidos do biomaterial de estrutura tridimensional. Pode-se notar que quantidades de traços desses componentes podem ainda estar presentes nos tecidos vegetal ou fúngico descelularizados aqui descritos.

[0129] Como será observado, em determinadas representações, uma estrutura porosa tridimensional (3D) pode incluir uma estrutura apropriada que proporciona uma arquitetura, suporte, e/ou infraestrutura subjacente para que células estrangeiras se infiltrem, invadam e/ou proliferem no interior ao mesmo tempo proporcionando um suprimento constante de meios/nutrientes através de difusão passiva.

[0130] Vários métodos podem ser usados para produzir biomateriais de estrutura tridimensional conforme descrito aqui. A título de exemplo, em determinadas representações dos biomateriais de estrutura tridimensional acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode compreender um tecido vegetal ou fúngico que foi descelularizado por choque térmico, tratamento com detergente (ex. SDS, Triton X, EDA, tratamento alcalino, ácido, detergente iônico, detergentes não-iônicos, e detergentes zwitteriônicos), choque osmótico, liofilização, lise física (ex. pressão hidrostática), interrupção elétrica (ex. electroporação irreversível não térmica), ou digestão enzimática, ou qualquer combinação dos mesmos. Em determinadas representações, biomateriais conforme aqui descritos podem ser obtidos de plantas e/ou fungos através do emprego de processos de descelularização que podem compreender qualquer uma dentre várias abordagens (seja individualmente ou em combinação) incluindo, mas não limitado a, choque térmico (por exemplo, rápido congelamento degelo), tratamento químico (por exemplo, detergentes), choque osmótico (por exemplo, água destilada), liofilização, lise física (por exemplo, tratamento de pressão), interrupção elétrica e/ou digestão enzimática.

[0131] Em determinadas representações, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode compreender um tecido vegetal ou fúngico que foi descelularizado por tratamento com um detergente ou surfactante. Exemplos de detergentes podem incluir, mas não estão limitados a, dodecilsulfato de sódio (SDS), Triton X, EDA, tratamento alcalino, ácido, detergente iônico, detergentes não-iônicos, e detergentes zwitteriônicos.

[0132] Em outras representações ainda, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode compreender um tecido vegetal ou fúngico que foi descelularizado por tratamento com SDS.

[0133] Em ainda outra representação, o SDS residual pode ser removido do tecido vegetal ou fúngico descelularizado através de lavagem com uma solução salina bivalente aquosa. A solução salina bivalente aquosa pode ser usada para precipitar/quebrar um resíduo salino contendo micelas de SDS para fora da solução/estrutura tridimensional, e um tratamento com dH2O, ácido acético ou dimeteilsulfóxido (DMSO), ou sonicação, pode ter sido usado para remover o resíduo salino ou micelas de SDS.

[0134] Em determinadas representações, o sal bivalente da solução salina bivalente aquosa pode compreender, por exemplo, MgCl2 ou CaCl2.

[0135] Em outra representação, o tecido vegetal ou fúngico pode ter sido descelularizado através de tratamento com solução de SDS de aproximadamente 0,01 a 10%, por exemplo aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%, ou, por exemplo, aproximadamente 0,1% de SDS ou aproximadamente 1% de SDS, em um solvente como a água, etanol, ou outro solvente orgânico apropriado, e o SDS residual pode ter sido removido usando uma solução aquosa CaCl2 a uma concentração de aproximadamente 100mM seguido de incubação em dH2O.

[0136] Em determinadas representações, a solução de SDS pode ter uma concentração acima de 0,1%, o que pode facilitar a descelularização, e pode ser acompanhada do aumento da lavagem para remover o SDS residual.

[0137] Em representações em particular, o tecido vegetal ou fúngico pode ter sido descelularizado por tratamento com uma solução de SDS de aproximadamente 0,1% de SDS em água, e o SDS residual pode ter sido removido usando uma solução CaCl2 aquosa a uma concentração de aproximadamente 100mM seguido de incubação com dH2O.

[0138] Exemplos de protocolos experimentais para a preparação de biomateriais conforme o descrito aqui são fornecidos mais detalhadamente na seção abaixo “Métodos de Preparação de Biomaterial de Estrutura tridimensional”, e no Exemplo 1.

[0139] Ainda em outra representação do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode ser funcionalizado em pelo menos alguns grupos funcionais [livres] de hidroxila livre através de acilação, alquilação, ou outra modificação covalente, para fornecer um biomaterial de estrutura tridimensional funcionalizado. Em certas representações, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode ser funcionalizado com colágeno, por exemplo.

[0140] Em outra representação do material ou materiais de estrutura tridimensional acima, o biomaterial de estrutura tridimensional pode ainda compreender células animais vivas aderidas à estrutura porosa tridimensional baseada em celulose ou quitina. Em outra representação, as células animais vivas podem ser células de mamíferos. Em outra representação ainda, as células animais vivas podem ser células humanas. Métodos de Preparação de Biomaterial de Estrutura tridimensional

[0141] Em uma representação, é aqui fornecido um método para preparar um tecido vegetal ou fúngico descelularizado do qual materiais celulares e ácidos nucléicos do tecido são removidos, o tecido vegetal ou fúngico descelularizado compreendendo uma estrutura porosa tridimensional baseada em celulose ou quitina, o dito método compreendendo: fornecer um tecido vegetal ou fúngico tendo um tamanho e formato predeterminado; e descelularizar o tecido vegetal ou fúngico através de choque térmico, tratamento com detergente, choque osmótico, liofilização, lise física, interrupção elétrica, ou digestão enzimática, ou qualquer combinação dos mesmos, removendo assim materiais celulares e ácidos nucléicos do tecido vegetal ou fúngico para formar o tecido vegetal ou fúngico descelularizado compreendendo uma estrutura porosa tridimensional baseada em celulose ou quitina.

[0142] Em determinadas representações, a etapa de descelularizar o tecido vegetal ou fúngico pode compreender descelularização por tratamento com um detergente. Exemplos de detergentes incluem, mas não estão limitados a, dodecilsulfato de sódio (SDS), Triton X, EDA, tratamento alcalino, ácido, detergente iônico, detergentes não-iônicos, e detergentes zwitteriônicos.

[0143] Em outras representações ainda, a etapa de descelularizar o tecido vegetal ou fúngico pode compreender um tecido vegetal ou fúngico que tenha sido descelularizado por tratamento com SDS.

[0144] Em ainda outra representação, a etapa de descelularizar o tecido vegetal ou fúngico, SDS residual ser removido do tecido vegetal ou fúngico descelularizado por lavagem com uma solução salina bivalente aquosa. A solução salina bivalente aquosa é usada para precipitar/quebrar um resíduo salino contendo micelas de SDS para fora do estrutura tridimensional, e um tratamento ou sonicação com dH2O, ácido acético ou dimetilsulfóxido (DMSO), pode ter sido usado para remover o resíduo salino ou micelas de SDS. O sal bivalente da solução salina bivalente aquosa pode compreender, por exemplo, MgCl2 ou CaCl2.

[0145] Em uma representação em particular, a etapa de descelularizar pode compreender tratamento com uma solução de SDS de aproximadamente 0,1% de SDS em água, e o SDS residual pode ser removido após a descelularização usando uma solução aquosa CaCl2 a uma concentração de aproximadamente 100mM seguido de incubação em dH2O.

[0146] Em outra representação do método ou métodos acima, o método pode ainda compreender uma etapa de funcionalizar pelo menos alguns grupos funcionais [livres] de hidroxila livre do tecido vegetal ou fúngico descelularizado por acilação, alquilação, ou outra modificação covalente. Em determinadas representações, os grupos funcionais hidroxila do tecido vegetal ou fúngico descelularizado pode ser funcionalizado com colágeno.

[0147] Em outra representação do método ou métodos acima, o método pode ainda compreender uma etapa de introduzir células animais vivas à estrutura porosa tridimensional baseada em celulose ou quitina. Em certas representações, as células animais vivas podem ser células de mamíferos. Em certas representações, as células animais vivas podem ser células humanas. Aplicações do Biomaterial de Estrutura tridimensional

[0148] Em determinadas representações, biomateriais conforme aqui descritos podem ter aplicações em pesquisa laboratorial biomédica e/ou medicina regenerativa clínica em aplicações humanas e/ou veterinárias, por exemplo. Esses biomateriais podem ser eficazes como estrutura tridimensionals que podem ser usados como ferramentas investigativas para pesquisadores biomédicos industriais/acadêmicos, para implantes biomédicos, em dispositivos sensores e veículos de administração farmacêutica, e/ou outras aplicações apropriadas nas quais estrutura tridimensionals possam ser usados.

[0149] Em determinadas representações, biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descritos podem ser usados como estrutura tridimensionals implantáveis para suportar o crescimento celular animal, para promover regeneração de tecidos, para promover a angiogênese, para um procedimento de substituição de tecidos, ou como um implante estrutural para cirurgia estética.

[0150] Em determinadas representações, biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descritos podem ser usados como um implante estrutural para reparação ou regeneração após lesão da medula espinhal; como um implante estrutural para cirurgia de substituição de tecido e/ou para regeneração de tecido pós cirurgia; como um implante estrutural para enxerto de pele e/ou cirurgia de regeneração de pele; como um implante estrutural para regeneração de vascularização sanguínea em um tecido ou região alvo; como substituto ósseo; preenchimento ósseo, ou material de enxerto ósseo, e/ou para promover a regeneração óssea; como um tecido substituto para pele, ossos, medula espinhal, coração, músculos, nervos, vasos sanguíneos, ou outro tecido danificado ou malformado; como um substituto do humor vítreo (na forma de hidrogel); como uma bursa artificial, onde o biomaterial de estrutura tridimensional forma uma estrutura tipo saco contendo biomaterial de estrutura tridimensional na forma de hidrogel; e/ou como um implante estrutural para cirurgia estética, por exemplo.

[0151] Em determinadas representações, biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descritos podem ser usados como implantes de mama. O estrutura tridimensional pode então ser formulado para corresponder a glândulas/tecidos mamários encontrados na mama humana e então usado como um material de preenchimento para implantes mamários, por exemplo.

[0152] Em determinadas outras representações, biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descritos podem ser usados como substitutos de cartilagem: O estrutura tridimensional pode então ser formulado e projetado para imitar tecidos de cartilagem e usado para substituir certas partes do corpo, tais como orelhas e narizes.

[0153] Em determinadas representações, biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descritos podem ser usados como enxertos de pele. O estrutura tridimensional de celulose pode ser usado como enxerto de pele para proteger, reparar e/ou regenerar a pele (epitelial/endotelial) após cirurgias cutâneas (ex: gengiva, etc.) ou eventos de lesões (ex: queimaduras, etc.). Pode, em certas representações, ser usado para proteger os tecidos danificados contra infecções externas e/ou para regenerar diretamente os tecidos.

[0154] Em determinadas representações, biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descritos podem ser usados para regeneração da vascularização sanguínea. A ampla gama de estruturas de celulose disponíveis pode permitir a produção artificial de estruturas tipo-vasos sanguíneos, e/ou pode proporcionar condições apropriadas para a angiogênese (formação de vaso sanguíneo natural).

[0155] Em outra representação, biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descritos podem ser usados para substituição de ossos ou preenchimento de ossos. O estrutura tridimensional de celulose pode então ser formulado e projetado para imitar tecidos ósseos, e então usado para substituir ossos e partes de ossos assim como em odontologia, ossos do crânio, ossos fraturados, prótese do quadril (osso ou agente de preenchimento para próteses, etc.) e/ou outras aplicações do tipo.

[0156] Em determinadas representações, biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descritos podem ser usados como tecidos simples ou complexos. A título de exemplo, estrutura tridimensionals podem ser usados para substituir tecidos simples (pele, ossos) ou complexos (medula espinhal, coração, músculos, nervos, vasos sanguíneos, etc.) após acidentes, malformação, estética, lesões, ou outro dano ao tecido.

[0157] Em outras representações, biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descritos podem ser usados como material de humor vítreo. A título de exemplo, estrutura tridimensionals de celulose na forma de hidrogel são um gel translúcido. A consistência e clareza podem ser adaptadas para corresponder às do humor vítreo nativo.

[0158] Em determinadas representações, biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descritos podem ser usados como bursa. Bursas artificiais, e seu fluido correspondente, podem ser feitas de biomateriais conforme o aqui descrito. A bursa pode ser criada a partir de celulose sólida, enquanto que o fluido pode ser formado de hidrogel de celulose, por exemplo.

[0159] Em determinadas representações, são aqui fornecidos métodos para suportar o crescimento celular animal, para promover a regeneração de tecidos, para promover a angiogênese, para substituição de um tecido, ou para fornecer uma estrutura tridimensional estrutural em uma cirurgia estética, em um paciente que necessite da mesma, os ditos métodos compreendendo: fornecer um biomaterial de estrutura tridimensional de acordo com qualquer um dos biomateriais de estrutura tridimensional descritos acima; e implantar o biomaterial de estrutura tridimensional no paciente.

[0160] Em determinadas representações, o biomaterial de estrutura tridimensional pode ser implantado na medula espinhal, e promove reparação ou regeneração após lesão da medula espinhal; pode fornecer um implante estrutural para substituição de tecido e/ou para regeneração de tecido no paciente; pode fornecer um implante estrutural para enxerto de pele e/ou para regeneração de pele no paciente; pode fornecer um implante estrutural para regeneração da vascularização sanguínea em um tecido ou região alvo do paciente; pode fornecer uma substituição óssea, preenchimento ósseo, ou material de enxerto ósseo, e/ou pode promover a regeneração óssea, no paciente; pode fornecer uma substituição de tecido para pele, ossos, coração, músculos, nervos, vasos sanguíneos, ou outro tecido danificado ou malformado no paciente (quando na forma de hidrogel); pode fornecer uma bursa artificial no paciente, onde o biomaterial de estrutura tridimensional forma uma estrutura tipo saco contendo biomaterial de estrutura tridimensional na forma de hidrogel; e/ou pode fornecer um implante estrutural para cirurgia estética.

[0161] Em determinadas representações, o biomaterial de estrutura tridimensional pode ser implantado na medula espinhal, e pode promover reparação e/ou regeneração após lesão da medula espinhal aguda e/ou crônica no sistema nervoso central e/ou periférico.

EXEMPLO 1 - EXEMPLOS DE PROTOCOLO EXPERIMENTAL PARA A PRODUÇÃO DE BIOMATERIAL DE ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL

[0162] Nesse Exemplo, são descritos dois protocolos experimentais para preparar biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descrito a partir de um tecido de hipanto de maçã (Malus pumila). Deve-se observar que esses protocolos são fornecidos como exemplos ilustrativos e não limitadores direcionados aos profissionais da área. O profissional que levar em conta os ensinamentos aqui contidos estará ciente de varias modificações, adições, substituições, e/ou outras alterações que podem ser feitas a esses protocolos exemplares.

[0163] O protocolo experimental inicial descrito abaixo foi usado com sucesso para preparar biomateriais de estrutura tridimensional. Esse protocolo, entretanto, levou muitas semanas para proporcionar a infiltração celular total sob as condições testadas. Um protocolo modificado foi, consequentemente, subsequentemente desenvolvido, que inclui o uso de uma lavagem com cloreto de cálcio (CaCl2), que deu resultados similares aos biomateriais de estrutura tridimensional preparados pelo primeiro protocolo, mas dentro de uma semana (ver Figuras 9 e 10). Protocolo inicial para estudos in vivo (modelo animal): 1. Cortar fatias de maçã em um formato e tamanho desejado a. Cortar a maçã na metade b. Metade da maçã é submergida em PBS com a face cortada para baixo c. Ajustar o fatiador até uma espessura adequada (nesse exemplo, 1,2mm) d. Cortar uma fatia uniforme sem parte do núcleo visível e colocá-la na tabua de corte métrica e. Cortar fora um lado da maçã para posterior processamento em quadrados e manter a outra parte em PBS f. Usar as diretrizes (5mm x 5mm) para cortar o tecido da maçã em quadrados g. Colocar as fatias cortadas nos tubos micro-centrífuga de 1,5 mL h. Medir o lado cortado da fatia não utilizada pelo menos 10x e registrar no livro do laboratório 2. Adicionar 1mL de 0,1% de SDS (em dH2O autoclavado) e incubar no agitador por 2 dias (temperatura ambiente) a 180 RPM RT a. Checar para ver se os quadrados de maçã não estão flutuando. b. Continuar o tratamento com SDS se as maçãs ainda estiverem flutuando. 3. Levar as maçãs processadas nos tubos de micro centrífuga para o gabinete de biossegurança 4. Remover a solução de 0,1% de SDS (temperatura ambiente) com a pipeta Pasteur 5. Lavar as fatias de maçã 4 vezes com PBS autoclavada (temperatura ambiente) a. Durante a lavagem tentar colocar a pipeta Pasteur o mais perto possível da maçã sem tocar. Isso é para tentar fazer com que a água flua através do tecido da maçã. b. Quando não houver mais líquido no tubo continuar a usar a pipeta Pasteur para retirar a solução líquida da maçã. c. À medida que mais lavagens são feitas a quantidade de resíduo de “espuma de sabão” vista sendo retirada através da pipeta deve diminuir. d. Não pare de lavar até que não se possa mais ver “espuma de sabão” sendo retirada da maçã. e. A maçã também não deverá estar flutuando. 6. Colocar as amostras desejadas opostas aos tubos da micro centrífuga Sterile 7. Remover a última lavagem com PBS dos tubos da micro centrífuga e substituir por etanol 70% 8. Deixar em etanol 70% por 30 minutos-1 hora 9. Remover o etanol 70% 10. Continuar a lavar a fatia de maçã com PBS esterilizado com a mesma técnica anteriormente mencionada a. Assegure-se de trocar as pipetas pasteur 11. Continuar a lavar até que as fatias de maçã parem de flutuar (pelo menos 4 vezes) com PBS 12. Remover o PBS e substituir por 1% Penicilina/estreptomicina PBS 13. Implantar no modelo animal. Protocolo modificado para estudos in vivo: 1. Cortar fatias de maçãs no tamanho e formato desejados a. Cortar a maçã na metade b. Metade da maçã é submergida em PBS com a face cortada para baixo c. Ajustar o fatiador até uma espessura adequada (nesse exemplo, 1,2mm) d. Cortar uma fatia uniforme sem parte do núcleo visível e colocá- la na tábua de corte métrica e. Cortar fora um lado da maçã para posterior processamento em quadrados e manter a outra parte em PBS f. Usar as diretrizes (5mm x 5mm) para cortar o tecido da maçã em quadrados g. Colocar as fatias cortadas nos tubos micro-centrífuga de 1,5mL h. Medir a parte cortada da fatia não utilizada pelo menos 10x e registrar no livro do laboratório 2. Adicionar 1mL de 0,1% de SDS (em dH2O autoclavado) e incubar no agitador por 2 dias (temperatura ambiente) a 180 RPM RT a. Checar para ver se os quadrados de maçã não estão flutuando b. Continuar o tratamento com SDS se as maçãs ainda estiverem flutuando 3. Levar as maçãs processadas dos tubos da micro centrífuga para o gabinete de biossegurança 4. Remover a solução de 0,1% de SDS (temperatura ambiente) com a pipeta Pasteur 5. Lavar as fatias de maçã 4 vezes com PBS autoclavada (temperatura ambiente) a. Durante a lavagem tentar colocar a pipeta Pasteur o mais perto possível da maçã sem tocar. Isso é para tentar fazer com que a água flua através do tecido da maçã. b. Quando não houver mais líquido no tubo continuar a usar a pipeta Pasteur para retirar a solução líquida da maçã. c. À medida que mais lavagens são feitas a quantidade de resíduo de “espuma de sabão” vista sendo retirada através da pipeta deve diminuir. d. Não pare de lavar até que não se possa mais ver “espuma de sabão” sendo retirada da maçã. e. A maçã também não deverá estar flutuando. 6. Adicionar 100mM CaCl2 (em dH2O autoclavada) e deixar durante a noite (temperatura ambiente) 7. Remover a solução CaCl2 (temperatura ambiente) 8. Colocar as amostras desejadas opostas aos tubos da micro centrífuga Sterile 9. Remover a última lavagem de água dos tubos da micro centrífuga e substituir por etanol 70% 10. Deixar em etanol 70% por 30 minutos-1 hora 11. Remover o etanol 70% 12. Continuar lavando a fatia de maçã com água com a mesma técnica anteriormente mencionada a. Assegure-se de trocar as pipetas pasteur 13. Continuar lavando até que as fatias de maçã parem de flutuar (pelo menos 4 vezes) 14. Remover o PBS e substituir por 1% P/S PBS 15. Implantar no modelo animal

EXEMPLO 2 - IMPLANTAÇÃO EM CAMUNDONGO

[0164] Estudos de implantação em camundongo in vivo foram realizados para estudar os efeitos in vivo das representações de biomaterial de estrutura tridimensional conforme o aqui descrito.

[0165] Resultados indicam que, após a implantação subcutânea em um modelo camundongo, foi observada a infiltração celular total (ver Figura 7; 1,4 e 8 semanas após a implantação), com deposição de colágeno (Figura 4A) e, importantemente, angiogênese com formação de vaso sanguíneo funcional dentro de 4 semanas pós-implantação (Figuras 4B e 8). Quando estrutura tridimensionals foram implantados in vivo, a pegada mínima promoveu infiltração celular, angiogênese e reparação de tecidos e somente uma resposta inflamatória mínima (principalmente produzida pela própria cirurgia e não pelo estrutura tridimensional). Estrutura tridimensionals derivados de plantas/fungos oram totalmente compatíveis com estudos in vitro conforme mostrado em (Figura 5).

Um biomaterial não-biodegradável:

[0166] O campo se concentrou primariamente em materiais biodegradáveis; entretanto, existem varias questões relativas a essa abordagem na prática. Ao contrário de muitos biomateriais comerciais, em determinadas representações os atuais biomateriais podem ser considerados não-reabsorvíveis (i.e. podem não se degradar totalmente e serem absorvidos pelo corpo) (ver Figura 9).

[0167] A característica não-reabsorvível desses estrutura tridimensionals pode oferecer certas vantagens sobre produtos comerciais concorrentes. A título de exemplo, podem ser (i) mais resistentes à mudança de formato e/ou podem manter a sua geometria pretendida por longos períodos de tempo; (ii) podem ter uma pegada mínima em comparação com produtos concorrentes, tornando- os quase invisíveis para o corpo, produzindo quase nenhuma resposta imune; (iii) podem evitar a produção de subprodutos em comparação com materiais reabsorvíveis, cuja degradação pode criar uma resposta imune adversa; e/ou (iv) quando materiais se degradam, os novos tecidos regenerados podem ser danificados e podem então ser também eliminados; os biomateriais conforme aqui descritos podem, em determinados exemplos, evitar tal situação.

Estudo in vitro:

[0168] Experimentos in vitro aqui descritos foram realizados para confirmar a invasão celular e proliferação no estrutura tridimensional de celulose. A infiltração celular total levou muitas semanas quando o primeiro protocolo (descrito no Exemplo 1 acima) foi usado. Um protocolo modificado (também descrito no Exemplo 1 acima) foi subsequentemente desenvolvido, que compreende a adição de uma lavagem com cloreto de cálcio (CaCl2), que deu resultados similares mas dentro de apenas uma semana (ver Figura 9).

Estudo in vivo:

[0169] Um teste pré-clínico foi realizado em um modelo camundongo para estudar a resposta à implantação subcutânea de estrutura tridimensionals de 5x5x1mm durante um período de 1, 4 e 8 semanas. Estrutura tridimensionals celulose-baseados originados de maçã, funcho, e aspargos, e estrutura tridimensionals quitina-baseados originados de cogumelo branco (ver Figura 6).

[0170] Todos os estrutura tridimensionals apresentaram biocompatibilidade similar, sem rejeição e a observação de invasão celular e angiogênese (formação de vasos sanguíneos) nesses estudos.

EXEMPLO 3 - BIOCOMPATIBILIDADE IN VIVO DE BIOMATERIAIS DE ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL

[0171] Para abordar a questão da biocompatibilidade in vivo dos biomateriais de estrutura tridimensional, a resposta do corpo a estrutura tridimensionals de celulose maçã-derivados foi caracterizada. Biomateriais de celulose livres de células macroscópicos (~25 mm3) foram produzidos e implantados subcutaneamente e um modelo camundongo por 1, 4 e 8 semanas. Aqui, a resposta imunológica de camundongos imunocompetentes, deposição de matriz extracelular nos estrutura tridimensionals e evidência de angiogênese (vascularização) nos biomateriais de celulose foram avaliados. Notadamente, embora tenha sido observada uma resposta a corpo estranho imediatamente pós-implantação, como esperado em um procedimento cirúrgico, foi observada apenas uma baixa resposta imunológica sem fatalidades ou infecções perceptíveis que fossem em todos os grupos animais ao final do estudo. Descobriu-se também que células circundantes invadiram o estrutura tridimensional, principalmente fibroblastos ativados, e depositaram uma nova matriz extracelular. Também, o próprio estrutura tridimensional foi capaz de reter muito do seu formato original e estrutura durante o estudo de 8 semanas. Importantemente, os estrutura tridimensionals claramente tiveram um efeito pró-angiogênico, resultando no crescimento de vasos sanguíneos funcionais por todo o biomaterial implantado. Visto em conjunto, esse trabalho demonstra que existe uma maneira relativamente fácil de produzir estrutura tridimensionals de celulose em 3D que são biocompatíveis, tornando-se vascularizados e integrados aos tecidos saudáveis ao redor.

[0172] Nesses estudos, foram usados o tecido nativo de hipanto de maçãs e uma metodologia de preparação conveniente para criar estrutura tridimensionals de celulose implantáveis. Para examinar a biocompatibilidade, estrutura tridimensionals foram implantados subcutaneamente em camundongos imunocompetentes do tipo selvagem (machos e fêmeas; 6-9 semanas de idade). Após a implantação, os estrutura tridimensionals foram ressecados em 1, 4 e 8 semanas e processados para análise histológica (H&E, Masson’s Trichrome, anticorpos anti-CD31 e anti-CD45). A análise histológica revelou uma resposta a corpo estranho característica ao estrutura tridimensional 1 semana pós-implantação. Entretanto, observou-se que a resposta imune desapareceu gradualmente até 8 semanas pós-implantação. Até 8 semanas, não houve resposta imune no tecido da derme adjacente, e houve migração de fibroblasto ativo no estrutura tridimensional de celulose. Isso foi concomitante com a deposição de uma nova matriz extracelular de colágeno. Além disso, a formação de vasos sanguíneos ativos no estrutura tridimensional foi observada durante todo o período do estudo, indicando as propriedades pró-angiogênicas dos estrutura tridimensionals nativos. Finalmente, enquanto os estrutura tridimensionals retêm muito do seu formato original, eles passam por uma lenta deformação no decurso das 8 semanas do estudo. Tomados em conjunto, esses resultados indicam que estrutura tridimensionals de celulose nativos são biocompatíveis e podem apresentar potencial como biomaterial cirúrgico.

MATERIAL E MÉTODOS

[0173] Animais - Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Animal Care and Use Committee da Universidade de Ottawa. Camundongos C57BL/10ScSnJ tipo selvagem (machos e fêmeas; 6-9 semanas de idade; n=7 camundongos para cada grupo) foram adquiridos do The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA) e criados em nossas instalações. Todos os animais foram mantidos em temperatura ambiente constante (±22°C) e umidade (~52%). Eles foram alimentados com uma dieta de ração e mantidos sob um ciclo controlado de 12 horas de claro/escuro.

[0174] Preparação de estrutura tridimensional de celulose - Conforme descrito anteriormente [27], maçãs McIntosh Red (Canada Fancy) foram armazenadas a 4°C no escuro por um máximo de duas semanas. De modo a preparar seções de maçã, a fruta foi cortada com um fatiador em uma espessura uniforme de 1.14±0.08mm, medida com um calibrador Vernier. Apenas o tecido externo (hipanto) da maçã foi usado. Fatias contendo tecido com o núcleo reprodutor visível não foram usadas. As fatias foram então cortadas paralelamente à direção do pedicelo da maçã em segmentos quadrados de 5.14±0.21mm de comprimento e com uma área de 26.14±1.76mm2. O tecido da maçã foi então descelularizado usando um protocolo relacionado àquele de referência [14] para remover material celular e DNA das amostras de tecido deixando para trás uma estrutura tridimensional intacto e tridimensional. Amostras de tecido de maçã individuais foram colocadas em tubos de microcentrífuga esterilizados de 2,5 ml e foi adicionada uma solução de 2 ml de 0,1% de dodecil sulfato de sódio (SDS; Sigma-Aldrich) a cada tubo. As amostras foram agitadas por 48 horas a 180 RPM em temperatura ambiente. Os estrutura tridimensionals de celulose resultantes foram então transferidos para novos tubos de microcentrífuga estéreis, lavados e incubados por 12 horas em PBS (Sigma-Aldrich). Para esterilizar o estrutura tridimensional de celulose, eles foram incubados em etanol 70% por 1 hora e então lavados 12 vezes com PBS. As amostras foram então mantidas em PBS com 1% de estreptomicina/penicilina (HyClone) e 1% amfotericina B (Wisent, QC, Canada). Nesse ponto, as amostras foram imediatamente usadas ou armazenadas a 4°C por não mais de 2 semanas.

[0175] Implantação de celulose - Os camundongos foram anestesiados usando 2% de Isoflurano USP-PPC (Pharmaceutical partners of Canada, Richmond, ON, Canada) e seus olhos protegidos com a aplicação de gel líquido oftálmico (Alco Canada In., ON, Canada). Para preparar os locais de cirurgia, o pelo traseiro do camundongo foi raspado e as peles foram limpas e esterilizadas usando ENDURE 400 Scrub-Stat4 Surgical Scrub (gluconato de clorhexidina, solução a 4%; Ecolab Inc., Minnesota, USA) e Soluprep (2% w/v de clorhexidina e 70% v/v álcool isopropila; 3M Canada, London, ON, Canada). Para manter a hidratação do animal, foi administrada subcutaneamente solução de 1 ml de 0,9% de cloreto de sódio (s.c.) (Hospira, Montréal, QC, Canada). Durante os procedimentos cirúrgicos, foram aplicadas todas as medidas exigidas para cirurgias de sobrevivência. Para implantar os estrutura tridimensionals, duas incisões de 8 mm foram feitas na seção dorsal de cada camundongo (superior e inferior). Duas amostras de estrutura tridimensionals de celulose foram implantadas separadamente e independentemente em cada camundongo. As incisões foram então suturadas usando Surgipro II monofilamento de polipropileno 6-0 (Covidien, Massachusetts, USA) e 2% de bupivicaina transdérmica (como monoidrato; Chiron Compounding Pharmacy Inc., Guelph, ON, Canada) foi aplicado topicamente nos locais da cirurgia para prevenir infecção. Além disso, buprenorfina (como HCL) (0.03mg/ml; Chiron Compounding Pharmacy Inc. Guelph, ON, Canada) foi administrada s.c. como um paliativo da dor. Todos os animais foram então cuidadosamente monitorados pelos 3 dias seguintes por serviços de cuidados a animais e receberam repetições dos mesmos tratamentos farmacológicos.

[0176] Ressecções do estrutura tridimensional - Em 1, 4 e 8 semanas após a implantação do estrutura tridimensional, os camundongos foram submetidos a eutanásia usando inalação de CO2. Após a coleta de sangue, a pele dorsal foi cuidadosamente ressecada e imediatamente imersa em solução de PBS. As seções da pele contendo estrutura tridimensionals de celulose foram então fotografadas, cortadas e fixadas em 10% de formalina por pelo menos 48 horas. As amostras foram então mantidas em etanol 70% antes de serem incorporadas em parafina pelo PALM Histology Core Facility da University of Ottawa.

[0177] Análise histológica - Seções seriais com 5μm de espessura foram cortadas, começando em 1mm dentro do estrutura tridimensional de celulose, e tingidas com hematoxilina e eosina (H&E) e tricroma de Masson. Para a imunocitoquímica, e recuperação de epitopos induzida por calor foi realizada a 110°C por 12 minutos com citrato tamponado (pH 6.0). Anticorpos primários anti-CD31/PECAM1 (1:100; Novus Biologicals, NB100-2284, Oakville, ON, Canada), actina muscular branda anti-alfa (1:1000, ab5694, abcam, Toronto, ON, Canada) e anti-CD45 (1:3000; ab10558, abcam, Toronto, ON, Canada) foram incubados por uma hora em temperatura ambiente. Reagente de bloqueio (Background Sniper, Biocare, Medical, Concorde, CA, USA) e sistema de detecção MACH 4 (Biocare Medical, Concord, CA, USA) foram aplicados de acordo com as especificações da empresa. Para a avaliação da infiltração celular, deposição de matriz extracelular e vascularização (angiogênese), micrógrafos foram capturados usando Zeiss MIRAX MIDI Slide Scanner (Zeiss, Toronto, Canada) equipado com objetiva 40x e analisados usando Pannoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Budapeste, Hungria)e software ImageJ. O marcador da inflamação foi avaliado por um patologista. A marcação foi atribuída subjetivamente por análise qualitativa da magnitude da resposta externa total bem como, as proporções de população celular na resposta externa.

[0178] Microscopia eletrônica de varredura (SEM) - A estrutura da celulose foi estudada usando um microscópio eletrônico de varredura. Globalmente, os estrutura tridimensionals foram desidratados através de sucessivos gradientes de etanol (50%, 70%, 95% e 100%). As amostras foram então revestidas de ouro a uma corrente de 15mA por 3 minutos com um dispositivo de pulverização iônica Hitachi E-1010. A imagem SEM foi conduzida em voltagens entre 2.00-10.0 kV em um JSM-7500F Field Emission SEM (JEOL, Peabody, MA, USA).

[0179] Análise estatística - Todos os valores relatados aqui são os desvios padrão ± médios. As análises estatísticas foram realizadas com ANOVA descartável usando o software SigmaStat 3.5 (Dundas Software Ltd, Germany). Um valor de p < 0.05 foi considerado estatisticamente significativo.

RESULTADOS

[0180] Preparação do estrutura tridimensional - Estrutura tridimensionals de celulose foram preparados com tecido de maçã usando uma técnica de descelularização relacionada à anteriormente descrita [27]. Todos os estrutura tridimensionals foram cortados em um tamanho de 5.14±0.21 x 5.14±0.21 x 1.14±0.08mm (Figura 11A), deselularizados e preparados para implantação (Figura 11B). Os estrutura tridimensionals parecem translúcidos após a descelularização devido à perda de todo material celular vegetal e fragmentos. A remoção de células de maçã também foi confirmada por observação histológica (Figura 11C) e microscopia eletrônica de varredura (Figura 11D). A análise das imagens histológicas e a medição da espessura média da parede (4.04±1.4μm) revelam que sob as condições experimentais os estrutura tridimensionals de celulose eram altamente porosos, capazes de serem invadidos por células adjacentes e resultam em uma estrutura tridimensional de celulose acelular que mantem o seu formato.

[0181] Implantação de estrutura tridimensionals de celulose - Duas incisões cutâneas independentes (8mm) foram produzidas nas costas de cada camundongo para criar pequenas bolsas para a implantação do biomaterial (Figura 12A). Uma estrutura tridimensional de celulose (Figura 12B) foi implantado em cada bolsa subcutânea. Através de todo o estudo, não houve casos de camundongos apresentando qualquer comportamento doloroso que possa ter sido induzido pela implantação do estrutura tridimensional de celulose e nenhum deles apresentando quaisquer sintomas de inflamação ou infecção visíveis. Os estrutura tridimensionals de celulose foram ressecados em 1, 4 e 8 semanas após a sua implantação e foram fotografados para medir as mudanças nas dimensões do estrutura tridimensional (Figuras 12D-F). Em todos os momentos, tecido saudável pode ser observado ao redor do estrutura tridimensional de celulose com a presença de vasos sanguíneos, que são proximais ou em contato direto, e os estrutura tridimensionals mantem o seu formato quadrado. O estrutura tridimensional pré-implantação tinha uma área de 26.3±1.98mm2 e observou-se que ele diminuiu lentamente como função da sua base de tempo de implantação na área do estrutura tridimensional que é visível a olho nu na pele (Figura 12G). Em 8 semanas pós-implantação, as dimensões do estrutura tridimensional atingiram um novo patamar de medição de 13.82±3.88mm2 demonstrando uma mudança aproximada de 12mm2 (48%) durante o curso desse estudo.

[0182] Biocompatibilidade e infiltração celular em estrutura tridimensionals de celulose derivados de planta - A biocompatibilidade do estrutura tridimensional e a infiltração celular foram examinadas com coloração H&E de estrutura tridimensionals de celulose fixos em 1, 4 e 8 semanas após a sua implantação (Figura 13). As visões globais da seção longitudinal de estrutura tridimensionals de celulose representativos são mostradas nas Figuras 13A-C. Os estrutura tridimensionals são implantados sob a camada muscular da derme. Fluidos intersticiais, tingidos de rosa, podem ser vistos por todo o estrutura tridimensional implantado, em contraste com uma estrutura tridimensional não- implantado (Figura 11C), ressaltando a sua alta porosidade e permeabilidade. Dentro da visão global observou-se que o estrutura tridimensional mantem o seu formato geral durante o estudo. Nas Figuras 13D-F, uma seção ampliada do perímetro do estrutura tridimensional é mostrada a cada ponto de tempo pós-implantação. Em 1 semana, o tecido da derme ao redor do implante apresenta sintomas de uma resposta imune aguda moderada a severa (estudo qualitativo realizado por um patologista) (Figura 13D). Além disso uma densa camada de células pode ser vista se infiltrando nos estrutura tridimensionals de celulose. A população de células no estrutura tridimensional em 1 semana consiste principalmente de granulócitos, especificamente; polimorfonulear (PMN) e eosinófilos (Figura 13D). Há também uma população de células mortas e aparentes fragmentos celulares. Importantemente, todas essas observações são completamente consistentes com uma esperada reação aguda a corpo estranho que segue a implantação [84-86]. Na quarta semana, uma diferença absoluta em ambos os tecidos da epiderme adjacente e na população celular migrando para o estrutura tridimensional de celulose foi observada (Figura 13E). O tecido da epiderme ao redor do estrutura tridimensional de celulose tem uma resposta imune diminuída, agora classificada como branda a baixa. A população de células na epiderme ao redor dos estrutura tridimensionals agora contem níveis mais elevados de macrófagos e linfócitos (Figura 13E). Essa é uma característica prevista da reação ao corpo estranho de um biomaterial implantado, demonstrando o processo de limpeza do estrutura tridimensional [84-86]. Há também um aumento na população de células multinucleadas no interior do estrutura tridimensional como parte de uma resposta inflamatória (Figura 13E). Finalmente, 8 semanas pós-implantação, a resposta imune aparente em 1 e 4 semanas desapareceu completamente (Figura 13F), com o tecido da epiderme agora parecendo normal. Na verdade, o tecido da epiderme em contato com o estrutura tridimensional de celulose contem as mesmas estruturas que o tecido da epiderme normal. No perímetro do estrutura tridimensional de celulose existe agora uma menor densidade de células devido à inflamação diminuída e notadamente, não existem células mortas fragmentadas presentes. Em vez disso, a população de células agora contem um nível elevado de macrófagos, células multinucleadas e fibroblastos. Os fibroblastos ativos (aparentando formato fusiforme), podem ser observados migrando da epiderme adjacente para o estrutura tridimensional de celulose. De fato, fibroblastos foram encontrados por todo o estrutura tridimensional de celulose. Esses resultados demonstram que até 8 semanas pós-implantação, o estrutura tridimensional de celulose tinha sido aceito pelo hospedeiro. Em paralelo à análise de inflamação H&E, foi realizada coloração anti-CD45 para avaliar o nível de inflamação por todo o estrutura tridimensional e tecido da derme adjacente (Figuras 13G-I). Fica claro que a inflamação por toda a derme e no estrutura tridimensional é elevada após 1 semana. Entretanto, a quantidade de leucócitos diminui significativamente na derme adjacente e estrutura tridimensional durante o tempo de implantação atingindo um nível próximo ao basal em 8 semanas.

[0183] Deposição de matriz extracelular nos estrutura tridimensionals de celulose - A presença de fibroblastos ativos nos levou à questão de se o estrutura tridimensional de celulose estava agindo coo um substrato para a deposição de nova matriz extracelular. Isso foi determinado usando coloração de Masson’s Trichrome de slides de estrutura tridimensionals de cellulose fixos a cada ponto de tempo apos a implantação (Figura 14). Em 1 semana pós- implantação, o estudo histológico mostra a ausência de estruturas de colágeno no estrutura tridimensional de colágeno (Figuras 14A, D e G). À medida que as células de fibroblastos invadem o estrutura tridimensional, conforme visto pela coloração H&E e confirmado pela coloração de actina do músculo liso anti-alfa (dados não mostrados) depósitos de colágeno no estrutura tridimensional de celulose podem ser observados após 4 semanas (Figuras 14B, E e H). Em 8 semanas (Figuras 14C, F e I) a rede de colágeno é claramente visível dentro das cavidades do estrutura tridimensional de celulose. A complexidade da rede de colágeno depositada é destacada na Figura 14I, onde podemos detectar fibras de colágeno individuais na matriz de colágeno. Isso é em contraste com a alta densidade, espessura e organização tipo cabo característica do colágeno encontrado em tecido de cicatriz.

[0184] Vascularização dos estrutura tridimensionais de celulose - Capilares com entre 8 e 25μm de diâmetro foram também identificados nos estrutura tridimensionals em até 1 semana pós-implantação. Na quarta e na oitava semana pós-implantação, vasos sanguíneos e capilares podem ser observados extensivamente no estrutura tridimensional e no tecido dérmico adjacente. Foi observada a presença de vasos sanguíneos no estrutura tridimensional de celulose e na derme adjacente nas fotos macroscópicas tiradas durante a ressecção (Figura 15A). Múltiplas seções transversais de vasos sanguíneos, com a presença de glóbulos vermelhos (RBCs), são identificadas nas quatro semanas das implantações do estrutura tridimensional (Figura 15B; coloração H&E). Os mesmos resultados são obtidos 8 semanas após a implantação onde capilares com RBC e células endoteliais são vistas claramente (Figure 15C; Masson’s Trichrome). Todos os resultados na formação de vasos sanguíneos foram também confirmados com coloração anti-CD31 para identificar células endoteliais no estrutura tridimensional (Figura 15D).

ANÁLISE

[0185] Nesse estudo, a biocompatibilidade in vivo de estrutura tridimensionals de celulose acelulares derivados do tecido do hipanto da maçã foi avaliada. Com esse objetivo, estrutura tridimensionals de celulose acelulares foram implantados subcutaneamente em camundongos imunocompetentes para estabelecer a sua biocompatibilidade. Os dados revelam que os estrutura tridimensionals implantados demonstram uma baixa resposta inflamatória, promovem a invasão celular e deposição de matriz extracelular, e atuam como um ambiente pró-angiogênico. Notavelmente, nenhum dos camundongos desse estudo morreu ou demonstrou quaisquer sintomas de rejeição ao implante tal como edema, exsudados ou desconforto durante o curso dessa pesquisa, indicativo de uma implantação de estrutura tridimensionals de celulose bem sucedida. Esses estrutura tridimensionals implantados são compostos de uma rede porosa de cavidades nas quais as células vegetais hospedeiras originais residiam [69]. Essa arquitetura facilita eficientemente a transferência de nutrientes através do tecido vegetal. Conforme mostrado aqui e em um estudo anterior, tecidos de maçã podem ser descelularizados [27]. Esse simples tratamento muda a aparência do tecido de hipanto de modo que ele se torna transparente, como resultado da remoção dos materiais celulares.

[0186] Após a implantação, os resultados indicam que os estrutura tridimensionals são rapidamente infiltrados com as células hospedeiras, que começa com células inflamatórias. Consistente com as descobertas anteriores, a resposta imune dos animais hospedeiros seguiu uma cronologia conhecida [84-88], finalmente demonstrando biocompatibilidade. Como esperado, a população celular no estrutura tridimensional após 1 semana pós-implantação é principalmente de granulócitos, especificamente; polimorfonuclear (PMN) e eosinófilos, constituindo uma clara resposta inflamatória. A produção de uma matriz provisional ao redor do estrutura tridimensional também foi observada resultando em uma aparência inflamada no tecido que circunda o estrutura tridimensional [84-88]. Isso não é inesperado e é resultado do material estranho bem como uma resposta ao procedimento cirúrgico [84-88]. Quatro semanas pós implantação, a população de células no estrutura tridimensional evoluiu e são agora linfócitos, monócitos, macrófagos, células multinucleadas de corpo estranho bem como eosinófilos dispersados. Típica com inflamação crônica, os fragmentos celulares presentes na matriz provisional em 1 semana, estão sendo agora liberados pelo sistema imune hospedeiro [84-88]. Em 8 semanas, o estrutura tridimensional de celulose está agora vazio de toda matriz provisional e fragmentos celulares e baixos níveis de macrófagos e células multinucleadas de corpo estranho ainda estão visíveis no estrutura tridimensional. Consistente com a resposta imune no estrutura tridimensional de celulose, observa-se que o tecido adjacente retorna à sua fisiologia original. Na verdade, em 8 semanas pós-implantação, o tecido adjacente estava quase igual ao tecido controle. Embora a resposta imune e a inflamação em 8 semanas seja baixa, pode-se observar baixos níveis de macrófagos no estrutura tridimensional. Apesar de tradicionalmente associados a inflamação, macrófagos tem papel benéfico consistente com nossas descobertas. Especificamente, macrófagos também são conhecidos por secretar fatores de crescimento e pró-angiogênicos, proteínas ECM e fatores pró-fibrogênicos que regulam ativamente a fibro-proliferação e angiogênese na reparação e regeneração de tecidos [86]. Independentemente, a vasta população de células no estrutura tridimensional após 8 semanas são agora fibroblastos reativos. Essas células estão alterando o micro-ambiente do estrutura tridimensional através da secreção de uma nova matriz extracelular de colágeno. A nova matriz apresentou uma notável baixa densidade em comparação, sugestiva de regeneração em oposição à alta densidade característica organização tipo- cabo do colágeno encontrado nos tecidos de cicatriz [89].

[0187] Esses dados também demonstram que os estrutura tridimensionals são pró-angiogênicos, o que pode facilitar o transporte de sangue do tecido adjacente [90]. Assim como com o tecido nativo, o abastecimento limitado de sangue para o estrutura tridimensional pode resultar em isquemia e potencialmente necrose. Interessantemente, foi demonstrado que biocerâmica com diâmetros de poro menores que 400μm resultou em uma diminuição do crescimento de vasos sanguíneos e limita o diâmetro do vaso sanguíneo em implantações in vivo. A estrutura porosa da arquitetura da parede celular é composta de cavidades de parede celular sobrepostas com diâmetros entre 100-300 μm com distância de interconexão manual de 4.04±1.4μm. Como tal, o tamanho de alta porosidade e baixa fração-volume dos estrutura tridimensionals de celulose são consistentes com a promoção de formação de vasos sanguíneos. Em conjunto, o estrutura tridimensional de celulose agora parece estar vazio da matriz provisional e totalmente aceito como um implante subcutâneo.

[0188] Também foi observada uma diminuição na área do estrutura tridimensional ao longo do tempo, mas não parece que o estrutura tridimensional de celulose está em processos de degradação. Em vez disso, a mudança da área parece ser devida ao colapso das cavidades da parede celular no perímetro do estrutura tridimensional resultando do movimento ativo do camundongo. Não é esperado que a degradação biológica seja possível já que faltam aos mamíferos aas enzimas apropriadas para digerir celulose planta-sintetizada [91,92]. Além disso, a forma altamente cristalina da celulose que é encontrada em tecidos vegetais é também conhecida por ser resistente a degradação em mamíferos [92]. Alternativamente, foi demonstrado que implantes de celulose in vivo podem ser quimicamente ativados de modo a ser mais facilmente degradados [93]. Entretanto, formas altamente cristalinas de celulose tem algumas das mais baixas respostas imunológicas relatadas [92].

[0189] Uma grande variedade de biomateriais clinicamente aprovados são usados para tratar condições especificas em pacientes [1]. Esses biomateriais podem ser derivados de tecidos humanos e animais, polímeros sintéticos, bem como de materiais como titânio e cerâmica [1,2,26,49,50,53,54,56,74,76,94106]. Entretanto, essas abordagens não estão livres de desvantagens que surgem de preocupações sobre a fonte, custos de produção e/ou disponibilidade difundida [48]. Existe hoje em dia um intenso interesse no desenvolvimento de biomateriais reabsorvíveis que se degradarão in vivo e somente agem como uma estrutura tridimensional temporário que promoverá e suportará a reparação ou regeneração de tecido danificado/doente [49]. Embora esse seja um cenário atraente, descobriu-se que estruturas recém- formadas também colapsam à medida que o estrutura tridimensional se degrada [53,64,107-109]. Além disso, os produtos de degradação também podem ter efeitos colaterais tóxicos ou indesejáveis [53,110,111]. Por exemplo, a reconstrução da orelha se tornou um desafio conhecido na engenharia de tecidos. Estudos anteriores empregaram estrutura tridimensionals no formato de uma orelha que são produzidos de cartilagem derivada de animais ou humanos [53,58,59,61,63,64]. Entretanto, após a implantação e eventual degradação do estrutura tridimensional, observou-se que a orelha muitas vezes se colapsa ou deforma [60-62]. Recentes estratégias agora optaram por criar materiais compostos biológicos compostos também de uma estrutura de titânio incorporada em uma matriz biológica [53].

[0190] Os resultados aqui fornecidos sugerem que biomateriais de celulose derivados de plantas podem oferecer uma abordagem potencial para a produção de estrutura tridimensionals implantáveis. Essa abordagem pode ser complementar às estratégias de celulose bacteriana [66,6971,73,80,83,102,106,112-115]. Entretanto, os resultados aqui fornecidos sugerem que materiais derivados de plantas podem ser econômicos, podem ser convenientes para o preparo para implantação, podem apresentar clara biocompatibilidade, podem ter uma capacidade de manter o formato enquanto suporta a produção da matriz extracelular do hospedeiro natural, e/ou pode promover a vascularização. Em trabalho anterior, os inventores mostraram que estrutura tridimensionals podem ser funcionalizados com proteínas antes da cultura in vitro. É previsto aqui que o uso de funcionalização da superfície do estrutura tridimensional com fatores de crescimento e proteínas matriz, por exemplo, pode ser usado para promover a invasão de tipos de células específicos, minimiza ainda a resposta imune precoce, e/ou para promover a vascularização. Além disso, estrutura tridimensionals de celulose podem ser facilmente formados em formatos e tamanhos específicos, oferecendo uma oportunidade para criar novos tecidos com propriedades geométricas específicas. Conforme mostrado aqui, estrutura tridimensionals de celulose acelulares são biocompatíveis in vivo em camundongos imunocompetentes sob as condições testadas, e podem ser considerados como uma nova estratégia para, por exemplo, regeneração de tecidos.

EXEMPLO 4 - EXEMPLO DE PROTOCOLO DE DESCELULARIZAÇÃO ADICIONAL

[0191] Um protocolo de descelularização adicional é descrito aqui. Nesse exemplo, plantas são refrigeradas em um freezer a -20°C durante 5 minutos para permitir que o tecido macio adquira firmeza. Um fatiador foi utilizado para seccionar o tecido vegetal em uma espessura uniforme medida com um calibrador vernier. As fatias foram então cortadas em segmentos e então descelularizadas usando um protocolo de tecido de mamífero modificado para remover material celular e DNA de amostras de tecido deixando para trás uma estrutura tridimensional intacto e tridimensional. O protocolo foi modificado de um protocolo para tecido de mamíferos (Ott et al., 2008). Amostras de tecido individuais foram colocadas em tubos de microcentrífuga de 2,5 mL esterilizados e uma solução de 2 mL de dodecil sulfato de sódio a 0,5% (SDS; Sigma-Aldrich) foi adicionada a cada tubo. As amostras foram agitadas por 12 horas a 160 RPM em temperatura ambiente. Os estrutura tridimensionals de celulose resultantes foram então transferidos para novos tubos de microcentrífuga estéreis, lavados e incubados por 6 horas em PBS (Sigma- Aldrich) com 1% de estreptomicina/penicilina (HyClone) e 1% de anfotericina B (Wisent). Nesse ponto, as amostras foram imediatamente usadas ou armazenadas em PBS a 4°C por não mais de 2 semanas. Os estrutura tridimensionals de celulose descelularizados resultantes podem ser observados na Figura 1A e B.

EXEMPLO 5 - CULTURAS CELULARES IN VITRO BIDIMENSIONAL E TRIDIMENSIONAL - IMPLANTAÇÃO DO ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL, ADESÃO CELULAR, E PROLIFERAÇÃO CELULAR

[0192] Mioblastos de camundongo C2C12, fibroblastos de camundongo NIH3T3 e linhagens celulares epiteliais humanas HeLa foram usados nesse estudo (todos obtidos da American Type Culture Collection (ATCC)). As células foram selecionadas porque representam o tipo de célula mais comum usado em laboratórios de biologia celular. Cultura celular convencional em 2D foi empregada para colher as células acima mencionadas para implantação no estrutura tridimensional. As células foram cultivadas em meios de cultura celular padrão (DMEM de alta glucose (HyClone)), suplementado com 10% de soro fetal bovino (HyClone), 1% de estreptomicina/penicilina (HyClone) e 1% de anfotericina B (Wisent) a 37°C e 5% de CO2 em frascos T75 (Thermo Scientific). Os meios de cultura foram trocados a cada dois dias e as células foram passadas em 80% de confluência.

[0193] O procedimento de semeadura do estrutura tridimensional foi realizado em placas de cultura de tecido de 24 poços. Os poços são individualmente revestidos com polidimetilisiloxano (PDMS) para criar uma superfície hidrofóbica de modo a fazer o estrutura tridimensional de celulose a única superfície aderível. Uma solução 1:10 de agente de cura: elastômero (Sylgard 184, Ellsworth Adhesives) foi revestida em cada superfície de poço. O PDMS foi deixado a curar por 2 horas a 80°C. O PDMS-24 placas sw poços foram deixados esfriar até temperatura ambiente e então enxaguados com PBS estéril. Estrutura tridimensionals foram cortados em pedaços de 0,5 X 0,5 cm e colocados dentro de cada poço. O C2C12, NIH3T3 e HeLa foram aderidos e aliquotados para a sua concentração correta. Uma gotícula de 4μL contendo 6 X 106 células foram cuidadosamente formadas em cima de cada estrutura tridimensional. As amostras foram colocadas no incubador por 6 horas para permitir que as células aderissem aos estrutura tridimensionals. Subsequentemente, 2 mL de DMEM foram adicionados a cada poço e as amostras foram incubadas por 48 horas. Nesse ponto, as amostras contendo células de mamíferos foram então cuidadosamente transferidas para novas placas de cultura de tecido de 24 poços revestidas com PDMS. Para proliferação celular continuada, os meios de cultura foram trocados a cada dia e os estrutura tridimensionals foram movidos para novas placas de 24 poços a cada 2 semanas.

[0194] A adesão e proliferação das células de mamíferos foram monitoradas e determinadas usando microscopia de imunofluorescência. As Figuras 5A-C, 16 e 17 demonstram a adesão e contínua proliferação das linhagens celulares usadas.

EXEMPLO 6 - EFEITOS DE PRÉTRATAMENTO SALINO, E FUNCIONALIZAÇÃO DO BIOMATERIAL DE ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL

[0195] A descelularização foi usada para obter o estrutura tridimensional de celulose em 3D vazio de células nativas e ácidos nucléicos. O surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS) foi usado para realizar a descelularização. O SDS foi removido antes do estrutura tridimensional ser repovoado com novas células; já que as células d outra forma iriam perecer. Com pequenos estrutura tridimensionals, a concentração de SDS pode ser baixa; entretanto, para objetos maiores uma concentração mais alta de SDS pode ser usada para se submeter a completa descelularização. O SDS remanescente pode ser removido com lavagem suficiente, particularmente quando baixas concentrações de SDS são usadas. Concentrações mais altas de SDS podem se tornar difíceis e demoradas para remoção através somente de lavagem em certos casos. Conforme aqui descrito, a adição de CaCl2 pode permitir a fácil remoção do SDS residual do estrutura tridimensional descelularizado. Sem querer ficar preso à teoria, acredita-se que o princípio por trás desse conceito usa o tampão salino para forçar o SDS nas micelas. Uma concentração salina suficientemente alta pode ser usada para estimular a formação adequada de micelas, e uma concentração salina que seja alta demais pode fazer com que o sal se precipite sobre o biomaterial. O resíduo salino pode ser removido através de varias técnicas, tais como incubando com dH2O, ácido acético, ou DMSO. A sonicação também pode ser usada para remover resíduos fortemente ligados. A concentração de CaCl2 pode ser dependente da quantidade de SDS residual. Nesse estudo, a descelularização foi realizada usando 0,1% de SDS em água. A concentração de CaCl2 pode depender da quantidade de SDS usada para a descelularização, conforme mostrado na Figura 18. A uma concentração de 100mM, uma quantidade moderada de sal/micelas se precipitou sobre o estrutura tridimensional (Figura 19A). O resíduo salino foi efetivamente removido incubando-se o estrutura tridimensional em dH2O (Figura 19B).

[0196] Um melhor crescimento celular foi obtido após a remoção do SDS e sal residuais (Figura 20). A adição do sal pode facilitar a remoção do SDS residual; entretanto, o sal que se precipita sobre o biomaterial também deveria ser removido para evitar problemas de tonicidade. Depois que o sal força o SDS para as micelas, a próxima etapa é remover o sal. O resíduo salino pode ser removido através de varias técnicas como o tratamento por sonicação, incubação em água, incubação em ácido acético, e incubação em DMSO (Figura 20).

[0197] Em adição ao CaCl2, outros sais também podem ser usados para remover o SDS residual do biomaterial (Figura 21). A lavagem dos biomateriais com um sal que tem um cátion bivalente levou a um maior crescimento celular do que os seus equivalentes monovalentes, provavelmente porque os cátions bivalentes promoveram uma formação de micelas de SDS mais firme (Figura 21).

[0198] Em determinadas representações, a adição do sal pode alterar a concentração crítica de micelas (CMC) do surfactante. Em uma determinada concentração conhecida como ponto de turvação, uma transição de fase pode ocorrer, e as micelas se tornarem insolúveis e poderem ser facilmente lavadas embora.

[0199] Diferentes compostos salinos podem ser usados para realizar a tarefa de remover o SDS residual do biomaterial. PBS, KCl, CaCl2, MgCl2, CuSO4, KH2PO4, MgSO4, Na2CO3, e ibuprofenato de sódio (todos com 100mM) foram usados como uma lavagem salina para limpar o biomaterial e remover o SDS residual. Cada tratamento salino mostrado na Figura 21 permitiu o crescimento celular; entretanto, os sais com cátions bivalentes (CaCl2 e MgCl2) bem como o grupo de ânion carbonato promoveram maior crescimento celular.

Funcionalização do biomaterial

[0200] A estrutura de celulose pode ser bioquimicamente funcionalizada dependendo do uso pretendido do biomaterial. Conforme será observado, essa modificação pode expandir potenciais usos e aplicações. A celulose, por exemplo, tem grupos [livres] de hidroxila livre que podem ser explorados para conjugar o material com diferentes moléculas.

[0201] Duas classes de reações comumente usadas para esse tipo de modificação são as reações de acilação e alquilação. Essas reações podem permitir que as cadeias de hidrocarbono de vários comprimentos se conectem à estrutura de celulose através dos grupos [livres] de hidroxila livre. Os diferentes comprimentos e formatos das cadeias podem ser uteis quando um obstáculo estérico for um fator, por exemplo. A utilização de cadeias mais longas diminui o obstáculo estérico, e vice versa. As reações de acilação usando ácidos dicarboxílicos podem proporcionar possibilidades de funcionalizar o biomaterial. Algumas classes de ácidos dicarboxílicos que podem ser usadas incluem, mas não estão limitadas a, ácidos dicarboxílicos saturados lineares, ácidos dicarboxílicos ramificados, ácidos dicarboxílicos não- saturados, ácidos dicarboxílicos substituídos, e ácidos dicarboxílicos aromáticos. Em adição às reações de acilalação e alquilação, outros compostos podem ser usados para mediar a conexão entre o grupo funcional e a celulose tais como compostos contendo boro, enxofre, nitrogênio, e/ou fósforo, por exemplo.

[0202] Grupos funcionais diferentes podem ser adicionados à outra extremidade da cadeia de modo a cumprir uma certa função. Esses grupos funcionais podem incluir, mas não estão limitados a, grupos contendo hidrocarbonetos, oxigênio, nitrogênio, enxofre, fosforo, boro, e/ou halógenos. A escolha do grupo funcional pode depender da aplicação pretendida. Por exemplo, se a aplicação pretendida é a de evitar o crescimento celular em certas áreas, um grupo funcional de hidrocarboneto não-polar estérico pode ser usado; por outro lado, se a aplicação pretendida é a de promover o crescimento celular, um ácido carboxílico pode ser escolhido, de modo que proteínas de matriz extracelular, como o colágeno, possam se ligar à celulose.

[0203] Diferentes elementos da parede celular podem permitir o aumento de certas propriedades estruturais do biomaterial. As estruturas de parede celular secundárias do tecido do aspargo e da maçã podem conter, por exemplo, pectina e lignina (Figura 22) para proporcionar força ao biomaterial.

[0204] Como se poderá observar, os biomateriais de estrutura tridimensional não estão limitados à celulose. Muitas outras estruturas de parede celular podem ser usadas para o biomaterial. Na Figura 22, existem também cinamaldeídos, pectina, e lignina, além da celulose mostrada. Essas estruturas de parede celular secundárias adicionais também podem ser funcionalizadas.

[0205] A modificação química da celulose pode permitir o controle sobre as propriedades químicas e físicas do biomaterial. Como resultado, o biomaterial pode ser especializado para objetivos específicos. Por exemplo, o crescimento celular padronizado pode ser alcançado através da inibição do crescimento celular em certas áreas (temporariamente ou permanentemente) e promovendo-o em outras. Além disso moléculas específicas de tipo celular podem ser introduzidas no biomaterial através desses métodos de funcionalização para promover o crescimento/invasão/diferenciação de tipos celulares específicos. A funcionalização do biomaterial também pode permitir a recriação de microambientes biologicamente relevantes, que são envolvidos em função celular adequada e engenharia de tecidos.

EXEMPLO 7 - BIOMODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE

[0206] A celulose nativa pode suportar células de mamíferos, incluindo o mioblasto C2C12, fibroblasto 3T3 e células HeLa epiteliais humanas. No entanto, um biomaterial funcional pode ainda ser capaz de ser afinado quimicamente e mecanicamente para se adequar ao uso pretendido em particular. Duas diferentes técnicas foram usadas nesses experimentos para mudar a rigidez do estrutura tridimensional de celulose descelularizado. Adicionalmente, imagens de contraste de fase demonstram que os biomateriais ainda suportam a cultura de células de mamíferos após modificação química e física.

[0207] De modo a funcionalizar estrutura tridimensionals com colágeno, amostras foram incubadas por 6 horas em uma solução de 10% de ácido acético e 1 mg/mL de colágeno de cauda do rato tipo I (Invitrogen), seguido de lavagem em PBS antes do uso. Para reticular quimicamente os estrutura tridimensionals, as amostras foram incubadas em uma solução de 1% de glutaraldeído EM-grade (Sigma-Aldrich) por 6 horas. Os estrutura tridimensionals foram então enxaguados em PBS e incubados em uma solução de 1% de borohidrato de sódio (Sigma-Aldrich) durante a noite de modo a reduzir qualquer glutaraldeído não-reagido. Antes de semear as células nos estrutura tridimensionals, todas as amostras (nativas, revestidas com colágeno, ou reticuladas) foram incubadas em meio de cultura de células de mamíferos (descrito abaixo) por 12 horas em um incubador de cultura de tecido padrão a 37°C com 5% de CO2. Os resultados são mostrados nas Figuras 23A-D. O tecido nativo e estrutura tridimensionals não modificados não apresentam qualquer diferença significativa em propriedades mecânicas. Tanto os estrutura tridimensionals funcionalizados com colágeno quanto os reticulados quimicamente apresentaram um aumento significativo na elasticidade em comparação com os estrutura tridimensionals de DMEM. Os estrutura tridimensionals descelularizados (SDS), funcionalizados com colágeno (SDS+Coll) e reticulados com glutaraldeído (SDS+GA) todos suportaram o crescimento de células C2C12 sob as condições experimentais.

EXEMPLO 8 - ESTRUTURA TRIDIMENSIONALS DE CELULOSE E TECNICAS DE MOLDAGEM, REVESTIMENTOS

[0208] Foi previamente mostrado como os estrutura tridimensionals de celulose podem atuar como biomateriais em 3D independentes. Aqui mostramos como a celulose descelularizado pode ser cortada em diferentes formatos macroscópicos (Figura 24: anéis). Células de mioblasto de camundongo C2C12 foram semeadas no biomaterial, e as células foram deixadas a proliferar e invadir o estrutura tridimensional por duas semanas. Após duas semanas, as estruturas estavam cheias de células (Figura 24). Os biomateriais podem ser usados também em combinação com técnicas de moldagem convencionais. Nesse estudo, mostramos como um construto de celulose pode ser usado para moldagem inversa, temporária ou permanente, usando gelatina e colágeno respectivamente (Figuras 24B-C). A gelatina tem uma temperatura de fusão de 32°C. Para o molde inverso temporário, as células foram resuspendidas em uma solução de gelatina a 10% em meios de cultura celular a 37°C. Logo após as células serem semeadas no biomaterial, a solução de gelatina resfriou até abaixo da sua temperatura de fusão e se solidificou. A formação do gel de gelatina deu às células tempo para se ligar ao substrato. Uma vez que o gel de gelatina foi aquecido a 37°C após ser colocado no incubador, a gelatina derreteu enquanto as células permaneceram no biomaterial. Por outro lado, a celulose também pode atuar como um molde inverso para géis permanentes quando o gel é desejado. Para o molde inverso permanente, a celulose foi coberta em uma solução de colágeno contendo células (figura 24C). A solução de colágeno rapidamente se solidificou e formou um gel permanente contendo o biomaterial e as células.

[0209] As técnicas de moldagem podem ainda se aplicar a outros hidrogéis, não simplesmente gelatina e colágeno. Outros possíveis géis podem incluir, mas não estão limitados a, por exemplo, agarose, poliuretano, polietileno glicol, xantana, metil celulose, alginato, ácido hialurônico, carbometilcelulose, quitosana, ácido poliacrílico, álcool polivinila, poliéster, hidrocolóides, goma arábica, pectina, e/ou dextrano. Hidrogéis também podem ser impregnados com outros compostos, tais como fatores de crescimento, drogas, etc. Esses géis também podem ser funcionalizados com cadeias laterais ativas. Como resultado, observa-se que, por exemplo, a celulose pode ter uma funcionalidade, e o hidrogel pode ter uma segunda funcionalidade. Além disso, múltiplos hidrogéis com múltiplas funcionalidades podem ser usados em combinação em determinadas representações. Finalmente, esses géis podem ser temporários e se derreter com o tempo, e/ou podem ser reticulados para o estrutura tridimensional de celulose original ou quitina para criar materiais multifuncionais com duas ou mais propriedades mecânicas/químicas que podem ser tempo-dependentes ou tempo-independentes.

[0210] Elementos/compostos adicionais podem ser usados para revestir a superfície, ou podem ser ligados ao biomaterial através de funcionalização. A escolha do elemento adicional depende da aplicação pretendida. Por exemplo, se o biomaterial for para promover regeneração de nervos, a proteína Fator de Crescimento de Nervo (NGF) pode ser adicionada. Por outro lado, se o biomaterial for para administração de droga, uma capsula do vírus contendo a droga pode ser usada. Além disso, o biomaterial pode ser revestido com, por exemplo, um sal de ibuprofeno se uma resposta imune for problemática. Note- se que vários elementos podem ser adicionados ao biomaterial. Esses elementos podem incluir, mas não estão limitados a, proteínas (ex., colágeno, elastina e integrina), ácidos nucléicos (ex. DNA, RNA, e siRNA), ácidos graxos (ex., ácido estereático, ácido palmítico, e ácido linoleico), metabólitos (ex., ácido aspártico, vitamina B2 e glicerol), ligantes (ex., vitamina D, testosterona, e insulina), antígenos (ex., peptídeos, polissacarídeos, e lipídios), anticorpos (ex. IgA, IgE, e IgG), vírus (ex. HIV, HEP C, e varíola bovina), polímeros sintéticos (ex., nylon, poliéster e Teflon), grupos funcionais (ácidos carboxílicos, ésteres, e imidas), drogas (ex. hidrocodona, amoxicilina, Plavix, por exemplo), vesículas (ex., vacúolos, vesículas de transporte, e vesículas de secreção), moléculas orgânicas (ex., carboidratos, ligases, e vitaminas), e/ou moléculas inorgânicas (ex., ferro, titânio, e ouro). Além disso, bactérias (tais como, mas não limitado a bifidobactéria) podem ser adicionadas para alterar/controlar o microbioma. Onde as células forem especificamente desejadas, um fator de recrutamento de células pode ser incluído, por exemplo.

Estruturas de Suporte para o Biomaterial

[0211] Elementos/compostos adicionais podem ser usados como estruturas de suporte para o biomaterial. A escolha do elemento adicional pode depender da aplicação pretendida. Por exemplo, se o biomaterial deve sustentar uma carga constante ou manter o seu formato, uma estrutura de titânio pode ser incluída. A título de exemplo, esses elementos/compostos podem incluir titânio, aço-C baixo, alumínio, ligas Co-Cr, aço inoxidável tipo 316, cimento PMMA, MW PE ultra-alta, etc. Em determinadas representações, esses elementos podem ser adicionados no (no interior) biomaterial, fora do biomaterial, ou ambos. Em determinadas representações, esses elementos/compostos podem incluir aqueles que já passaram pela aprovação da FDA.

EXEMPLO 9 - INVASÃO CELULAR E PROLIFERAÇÃO

[0212] Microscopia de varredura a laser confocal foi usada pata tirar imagens de seções ~300μm z da parte superior e inferior dos construtos de celulose. Ambos os lados tiveram suas imagens tiradas porque a profundidade do campo era de menos do que o anel espesso ~1.2mm. A Figura 25 mostra as projeções xy e zy das células no biomaterial de celulose. Os núcleos das células (azul) foram encontrados ao longo das paredes celulares de celulose (vermelho) (Figura 25 projeções xy). Visões ortogonais das varreduras confocais revelam que as celulas invadiram o estrutura tridimensional (Figura 25 projeções zy). A imagem confocal permitiu que a invasão celular e proliferação fossem quantificadas (Figura 26). As imagens dos núcleos das células foram limitadas usando o plugin de limiar adaptativo ImageJ, e o plugin de partículas de análise foi usado para medir a área nuclear total. Inicialmente, as células foram semeadas na parte superior da amostra. O índice da área nuclear cobrindo a parte superior e inferior do biomaterial foi usado para medir a invasão celular. Não houve diferenças estatísticas entre as três diferentes condições para a invasão celular (Figura 26). Na verdade, o índice superior:inferior foi perto de 1 (Figura 26). A área nuclear total das seções com imagens tiradas foi calculada para comparar a proliferação das células em cada condição. Foi observado que a área nuclear total não era significativamente diferente entre as três condições. Como resultado, a moldagem inversa temporária e permanente não afetou a proliferação celular sob as condições testadas.

[0213] Técnicas de moldagem, bem como técnicas de funcionalização, podem ser usadas para juntar estruturas diferentes. Como resultado, em determinadas representações, grandes estruturas complexas podem ser criadas para imitar tecidos in vivo, por exemplo.

EXEMPLO 10 - ARQUITETURA ARTIFICIALMENTE FABRICADA EM ESTRUTURA TRIDIMENSIONALS DE CELULOSE DESCELULARIZADOS DERIVADOS DE PLANTAS

[0214] A fabricação artificial de arquitetura nos estrutura tridimensional de celulose vegetais foi realizada para demonstrar a viabilidade de se criar arquitetura diferente para propósitos específicos tais como aumentar a migração celular do hospedeiro para o estrutura tridimensional de celulose. Os resultados são mostrados na Figura 27, onde essa arquitetura artificial foi criada em estrutura tridimensionals baseados em celulose derivados de maçã.

[0215] Nesses estudos, camundongos foram anestesiados usando 2% de Isoflurano USP-PPC (Pharmaceutical partners of Canada, Richmond, ON, Canada) com os olhos protegidos com a aplicação de gel líquido oftálmico (Alco Canada In., ON, Canada). Os pelos das costas do camundongo foram raspados com a pele subjacente sendo limpa e esterilizada usando ENDURE 400 Scrub-Stat4 Surgical Scrub (gluconato de clorhexidina, solução a 4%; Ecolab Inc., Minnesota, USA) e Soluprep (2% w/v clorhexidina e 70% v/v álcool isopropila; 3M Canada, London, ON, Canada). A hidratação do animal foi mantida, via injeção subcutânea (s.c.) de i ml de 0,9% de solução de cloreto de sódio (Hospira, Montréal, QC, Canada). Durante todos os procedimentos cirúrgicos, todas as medidas de esterilização estritas foram respeitadas para cirurgias de sobrevivência. Para implantar os estrutura tridimensionals, duas incisões de 8mm foram feitas na seção dorsal de cada camundongo (superior e inferior). Duas amostras de estrutura tridimensionals de celulose oram separadamente e independentemente implantadas em cada camundongo. As incisões foram então suturadas usando Surgipro II monofilamento polipropileno 6-0 (Covidien, Massachusetts, USA) e bupivicaína transdérmica a 2% (como monohidrato; Chiron Compounding Pharmacy Inc., Guelph, ON, Canada) foi aplicada topicamente aos locais da cirurgia para evitar infecção. Adicionalmente, buprenorfina (como HCL) (0.03mg/ml; Chiron Compounding Pharmacy Inc. Guelph, ON, Canada) foi administrada s.c. como um analgésico. Todos os animais foram então cuidadosamente monitorados pelos 3 dias seguintes por serviços de cuidados com animais e receberam tratamento adicional dos mesmos tratamentos farmacológicos. Em 1 e 4 semanas após a implantação do estrutura tridimensional, os camundongos sofreram eutanásia usando inalação de CO2. A pele dorsal foi cuidadosamente ressecada e imediatamente imersa em solução de PBS. As seções da pele contendo estrutura tridimensionals de celulose foram então fotografadas, cortadas e fixadas em 10% de formalina por pelo menos 48 horas. As amostras foram então mantidas em etanol 70% antes de serem incorporadas em parafina pelo PALM Histology Core Facility da University of Ottawa.

[0216] resultados são mostrados na Figura 27. Duas diferentes arquiteturas foram criadas nos estrutura tridimensionals de celulose descelularizados para demonstrar a viabilidade de criar diferentes arquiteturas com o biomaterial com propósitos específicos como o aumento da migração das células hospedeiras para o estrutura tridimensional de celulose. Na Figura 27A uma punção de biópsia de 1 mm foi usada para criar cinco espaços cilíndricos negativos no estrutura tridimensional de celulose. Por outro lado, na Figura 27B uma punção de biópsia de 3 mm foi usada para criar um único espaço negativo centrado. Somente após 4 semanas de implantação pode ser observada a maior formação de vasos sanguíneos proveniente diretamente dos espaços negativos derivados artificiais (Figuras 27C e D). Em 28C vasos sanguíneos estão em cada um dos quatro cantos do biomaterial sugerindo o aumento da vascularização no espaço negativo derivado artificial. Similarmente, em 27D vasos sanguíneos podem ser observados sobre o estrutura tridimensional de celulose sugerindo que os vasos sanguíneos viajaram através do estrutura tridimensional de celulose. Cortes transversais de estrutura tridimensionals de celulose representativos tingidos com H&E (Figura 27E-F).

EXEMPLO 11 - VÁRIOS EXEMPLOS DE TECIDOS DE ORIGEM CELULOSE- BASEADOS E ESTRUTURAS NO REINO VEGETAL

[0217] A Figura 28 fornece vários exemplos de tecidos de origem celulose- baseados e estruturas selecionadas do reino vegetal, mostrados em 4 semanas e/ou 8 semanas. Essa Figura mostra imagens descrevendo estrutura tridimensionals de celulose de várias fontes, sua ressecção e histologia após 4 semanas e/ou 8 semanas, conforme indicado.

[0218] Nesses estudos, vários estrutura tridimensionals de celulose derivada de plantas foram implantados subcutaneamente em camundongos para avaliar a biocompatibilidade em 4 semanas e/ou 8 semanas. Tecidos seletivos de várias plantas foram implantados por um período de 4 ou 8 semanas para avaliar a biocompatibilidade de celulose derivada de plantas e a arquitetura vegetal na migração celular do hospedeiro in vivo. Em todos os exemplos, a migração e proliferação celular para o estrutura tridimensional de celulose foi observada, destacando a biocompatibilidade dos estrutura tridimensionals de celulose derivados de plantas nesses experimentos. As implantações subcutâneas de biomateriais de estrutura tridimensional de celulose foram realizadas na região dorsal de um modelo camundongo C57BL/10ScSnJ através de pequenas incisões na pele (8 mm). Cada implante foi medido antes da sua implantação para comparação da área do estrutura tridimensional (primeira coluna: Estrutura tridimensional de Celulose). Enxertos de celulose foram ressecados (segunda coluna: Ressecção) em 4 ou 8 semanas conforme indicado. Seções seriais com espessura de 5μm foram cortadas, começando em 1 mm dentro do estrutura tridimensional de celulose, e tingidas com hematoxilina-eosina (H&E) (terceira coluna: Histologia). Para a avaliação da infiltração celular, micrógrafos foram capturados usando Zeiss MIRAX MIDI Slide Scanner (Zeiss, Toronto, Canada) equipado com uma objetiva de 40x e analisados usando Pannoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Budapeste, Hungria) e o software ImageJ.

EXEMPLO 12 - BIOCOMPATIBILIDADE DE BIOMATERIAIS DE CELULOSE DERIVADOS DE PLANTAS IMPLANTADOS SUBCUTANEAMENTE (PROTÉTICA-ESTÉTICA)

[0219] Baseado no Exemplo 3 acima, a implantação do estrutura tridimensional de celulose e ressecção foram realizadas para avaliar implantes subcutâneos. Resultados experimentais são mostrados na Figura 29. As implantações subcutâneas de biomateriais de estrutura tridimensional de celulose foram realizadas na região dorsal de um modelo camundongo C57BL/10ScSnJ através de pequenas incisões na pele (8 mm) (Figura 29A). Cada implante foi medido antes da sua implantação para comparação da área do estrutura tridimensional (Figura 29B). Estrutura tridimensionals de celulose foram ressecados em 1 semana (Figura 29D), 4 semanas (Figura 29E) e 8 semanas (Figura 29F) após a cirurgia e as tomadas de imagens macroscópicas (pele controle na Figura 29C). A cada ponto do tempo, vasos sanguíneos foram claramente integrados com o implante de celulose demonstrando a biocompatibilidade. Também não foi detectada inflamação aguda ou crônica no tecido ao redor do implante. As mudanças na área de superfície do estrutura tridimensional de celulose ao longo do tempo são apresentadas na Figura 29G. O estrutura tridimensional pré-implantação tinha uma área de 26.30±1.98mm2. Após a implantação, a área do estrutura tridimensional diminuiu para 20.74±1.80mm2 após 1 semana, 16.41±2.44mm2 após 4 semanas e 13.82 ±3.88mm2 após 8 semanas. A área de superfície do estrutura tridimensional de celulose tem uma redução significativa de aproximadamente 12mm2 (48%) após 8 semanas de implantação (* = P<0.001; n = 12-14).

[0220] Para a análise histológica, os seguintes experimentos foram realizados.

[0221] Seções seriais com espessura de 5μm foram cortadas, começando em 1 mm dentro do estrutura tridimensional de celulose, e tingidas com hematoxilina- eosina (H&E) e tricromo de Masson. Para imunocitoquímica, a recuperação do epítopo induzida por calor foi realizada a 110°C por 12 minutos com citrato tamponado (pH 6.0). Anticorpos primários antiCD31/PECAM1 (1:100; Novus Biologicals, NB100-2284, Oakville, ON, Canada), actina da musculatura lisa anti-alfa (1:1000, ab5694, abcam, Toronto, ON, Canada) e anti-CD45 (1:3000; ab10558, abcam, Toronto, ON, Canada) foram incubados por 1 hora em temperatura ambiente. Reagente de bloqueio (Background Sniper, Biocare, Medical, Concorde, CA, USA) e o sistema de detecção MACH 4 (Biocare Medical, Concord, CA, USA) foram aplicados de acordo com as especificações da empresa. Para a avaliação da infiltração celular, deposição de matriz extracelular e vascularização (angiogênese), micrógrafos foram capturados usando Zeiss MIRAX MIDI Slide Scanner (Zeiss, Toronto, Canada) equipado com uma objetiva de 40x e analisados usando Pannoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Budapeste, Hungria) e o software ImageJ.

[0222] A Figura 30 mostra resultados de biocompatibilidade e infiltração celular. Cortes transversais de estrutura tridimensionals de celulose representativos foram tingidos com H&E e anti-CD45. Essas visões globais mostram a reação a corpo estranho prevista aguda moderada-severa em 1 semana (Figura 30A), a imune crônica branda e subsequentes processos de limpeza em 4 semanas (Figura 30B) e finalmente, o estrutura tridimensional de celulose assimilado no tecido nativo do camundongo em 8 semanas (Figura 30C). Regiões de interesse de maior amplificação (Figura 30D-F), ver inserção (Figura 30A-C), permitem a observação da população do tipo celular dentro dos processos de assimilação do biomaterial. Em 1 semana, podemos observar populações de granulócitos, especificamente; polimorfonuclear (PMN) e eosinófilos que caracterizam a resposta imune aguda moderada a severa, uma reação normal a procedimentos de implantação (Figura 30D). Em 4 semanas, uma resposta imune reduzida pode ser observada (resposta imune branda a baixa) e a população de células na epiderme ao redor dos estrutura tridimensionals agora contem níveis mais elevados de monócitos e linfócitos caracterizando resposta crônica (Figura 30E). Finalmente, em 8 semanas, a resposta imune foi completamente absorvida com o tecido da epiderme agora parecendo normal (Figura 30F). A resposta imune observada com coloração H&E é confirmada usando anticorpo anti-CD45, um conhecido marcador de leucócitos (Figura 30G-I). A população de células no interior do estrutura tridimensional é agora principalmente de macrófagos, células multinucleadas e fibroblastos ativos.

[0223] A presença de fibroblastos ativos levantou uma questão de se o estrutura tridimensional de celulose estava atuando como um substrato para a deposição de nova matriz extracelular. Isso foi determinado usando a coloração do tricromo de Masson de slides de estrutura tridimensionals de celulose fixados a cada ponto de tempo após a implantação (Figura 31). Em 1 semana pós-implantação, o estudo histológico mostra a ausência de estruturas de colágeno no estrutura tridimensional de colágeno (Figura 31A,D,G). Após 4 semanas, pequenas quantidades de colágeno começam a ser depositadas dentro do estrutura tridimensional (Figura 31B,E,H) e em até 8 semanas, grandes quantidades de colágeno são claramente visíveis dentro de muitas cavidades do estrutura tridimensional (Figura 31C,F,I). A presença de fibroblastos ativos identificados através de morfologia (coloração H&E, formato fusiforme) e coloração de actina na musculatura lisa anti-alfa (dados não mostrados) são completamente consistentes com o alto grau de depósitos de colágeno observados em 8 semanas. A complexidade da rede de colágeno depositada é destacada na figura 31I, onde fibras de colágeno individuais dentro da matriz de colágeno são visíveis. Isso é em contraste com a característica alta densidade, espessa, de organização tipo cabo do colágeno encontrado no tecido de cicatriz.

[0224] Capilares entre 8 e 25μm também foram identificados nos estrutura tridimensionals em até uma semana pós-implantação. Em 4 semanas e 8 semanas pós implantação, vasos sanguíneos e capilares podem ser observados extensivamente no estrutura tridimensional e no tecido dérmico circundante. Foi observada a presença de vasos sanguíneos no estrutura tridimensional de celulose e na derme ao redor nas fotos macroscópicas tiradas durante a ressecção (Figura 32A). Múltiplos cortes transversais de vasos sanguíneos, com a presença de glóbulos vermelhos (RBCs), são identificados dentro de 4 semanas das implantações dos estrutura tridimensionals (Figura 32B; coloração H&E). Os mesmos resultados são obtidos 8 semanas após a implantação onde capilares com RBC e células endoteliais são vistas claramente (Figura 32C; Tricromo de Masson).

EXEMPLO 13 - ENXERTOS BIO-INSPIRADOS E BIO-FUNCIONAIS PARA REPARAÇÃO DE LESÃO DA MEDULA ESPINHAL

[0225] Os processos conforme aqui descritos podem ser usados para produzir enxertos de celulose estéreis que mantem o seu formato e força mecânica. Utilizando nosso dispositivo de teste mecânico grosso próprio, o módulo elástico dos nossos enxertos de celulose nativos foi registrado em ~2MPa quando o enxerto é comprimido na direção paralela aos microcanais diretos. Quando os enxertos são comprimidos em uma direção perpendicular aos microcanais observa-se que o modulo é menor em aproximadamente uma ordem de magnitude. Esses valores são altamente consistentes com o módulo elástico da dura mater e pia mater significando que esses enxertos caem dentro do limite das propriedades mecânicas de grande parte do tecido adjacente da medula espinhal. A Figura 33 mostra imagens de estruturas e microcanais da xilema do aspargo descelularizado.

[0226] Dissecções e ressecções do cérebro de ratos adultos permitiu a derivação de neuroesferas de rato primárias. A região dorsal foi limpa expondo a medula. Usando o malleus nippers (pinças-martelo) a parte posterior do crânio foi removida, até chegar no lóbulo frontal, expondo o cérebro à medida que partes do crânio são removidas. O cérebro foi gentilmente removido do crânio com o corte final dos bulbos olfativos. O cérebro removido foi submergido em uma placa de petri preenchida com meios de dissecação em gelo (meio MEM Alpha (Life Technologies Inc) 1% L-Glutamina (Life Technologies Inc) e 1% Penicilina (Life Technologies Inc). O cérebro foi então seccionado na matriz cerebral e seções contendo o hipocampo. A massa cinzenta logo ao lado do 3° ventrículo foi coletada em um tubo de teste com meios de dissecação. O tecido da massa cinzenta nos meios de dissecação foi continuamente centrifugado e o sobrenadante foi coletado. Uma vez que todo o sobrenadante foi removido o tubo final foi centrifugado e o grânulo foi ressuspenso em 2mL de meios de cultura (meio Advanced DMEM/F12 (Life Technologies Inc), 1% L-Glutamina (Life Technologies Inc) e 1% N2 suplemento (CEDARLANE LABORATORIES LTD)). A solução celular ressuspensa foi aliquotada em 6 placas de poços de conexão ultra-baixa com 0,001% de fator de crescimento epidérmico humano e fator de crescimento de fibroblasto básico (PEPROTECH) para permitir que as neuroesferas de rato primárias proliferem. As neuroesferas foram semeadas localmente em cima de câmaras de cultura celular fabricadas personalizadamente de enxertos individuais. As neuroesferas foram cultivadas e mantidas por 2 semanas em incubadores com 5% de CO2. Os meios de cultura foram trocados diariamente. As amostras de estrutura tridimensionals foram fixadas com 4% de paraformaldeído. A parede de celulose foi tingida com o protocolo anteriormente usado. As neuroesferas foram tingidas com aglutinina de germe de trigo (WGA) 488 (Invitrogen) examinadas com microscopia de fluorescência confocal (Figura 34A).

[0227] Após um protocolo similar àquele discutido no estudo do Exemplo 3, planta vascular descelularizada foi implantada subcutaneamente em camundongos. Resultados histológicos demonstram que após 4 semanas de implantação, as estruturas vasculares permaneceram intactas e são aparentes por todo o estrutura tridimensional (Figura 34B). consistente com as estruturas células hospedeiras podem ser observadas através de toda a extensão de 5 mm do estrutura tridimensional de celulose. Com base nos bem sucedidos resultados primários do in vitro e in vivo, o estrutura tridimensional vegetal descelularizado foi formado em um enxerto para lesão da medula espinhal. Ratos fêmeas Sprague Dawley foram anestesiados com isoflurano. A pele suprajacente foi raspada e preparada com Betadina. Sob condições assépticas e usando instrumentos esterilizados, as vertebras T7 a T10 foram expostas. Após a dissecação das costas e músculos intercostais, é feita uma laminectomia na T8 e T9. O dural é exposto com micro tesouras. A medula espinhal T8 é atravessada com micro tesouras em um movimento de corte claro. Qualquer sangramento resultante da transecção é controlado com surgifoam. A medula espinhal é deixada retrair e o estrutura tridimensional de celulose é movido e colocado para conectar os cotos caudal e craniano (Figura 34C). Após a colocação do estrutura tridimensional, a cola de fibrina Tisseel (Baxter) foi usada para fixar o enxerto de celulose. A camada muscular da incisão é fechada com material de sutura 3-0 Vicryl e a epiderme e a derme são fechadas com clips Michel. Buprenorfina foi administrada antes do fechamento para assegurar que esteja trabalhando ativamente no momento em que os ratos recobram da anestesia.

[0228] Observou-se que as pontuações BBB aumentaram durante o curso das 8 semanas.

[0229] Oito semanas pós-implantação, ratos (n=7) apresentaram maior atividade locomotora (BBB=9,2±2.5), apresentando passada coordenada e a capacidade de suportar peso (Figura 35). Em adição, em 8 semanas, uma segunda transecção da medula espinhal (abaixo do enxerto) foi realizada fazendo com que as pontuações BBB retornassem a 0. Ratos controle (n=7, apenas fibrina) apresentaram pontuações BBB entre 0 e 1. Os resultados sugerem que a recuperação locomotora é provavelmente não devida a reflexo. Medulas espinhais foram então dissecadas em 8 semanas e seccionadas no local do enxerto. Slides foram tingidos com uma combinação de hematoxilina, eosina e luxol azul rápido (H&E-LFB) de modo a indicar neurônios mielinizados. Dados revelam coloração positiva para células hospedeiras passando através dos microcanais do enxerto, consistente com a melhora da função locomotora (Figura 35D). Adicionalmente, fomos capazes de demonstrar e otimizar um protocolo MRI que permite observar a continuidade da medula espinhal e se o enxerto entrou em colapso sem sacrificar os animais. A interface do coto cranial e caudal (Figura 35A-i, 3A-iii) pode ser claramente diferenciada do enxerto do estrutura tridimensional (Figura 35A-ii). As Figuras 36 e 37 mostram uma visão global do enxerto da medula espinhal implantado na região T8-T9 da espinha, e seções ventrais do local de transecção adjacente, respectivamente. Conforme mostrado na Figura 37, filamentos verdes podem ser observados ao redor do enxerto espinhal se estendendo na direção ventral (setas vermelhas). Esses filamentos representam neurônios maduros dentro do local atravessado do rato após 12 semanas in vivo. Por outro lado, no controle B) neuro filamentos organizados não podem ser observados indicando uma falta de filamentos maduros no local de transecção controle. Adicionalmente, a coloração Hoechst revela um número significativamente maior de núcleos, e também células, circundando o enxerto espinhal dentro do local de transecção em comparação com o controle.

[0230] Nesses estudos, a inserção do biomaterial de estrutura tridimensional entre os cotos da medula espinhal atravessados, seguido da aplicação de cola de fibrina e reparação de ferimentos, mostrou que após apenas 8 semanas de estudo, ratos controle (n=4, sem enxerto) não apresentaram melhora na função motora e permaneceram completamente paralisados (BBB entre 0-1). Notavelmente, ratos possuindo um implante aspargo-derivado apresentaram um BBB de 9.2 ± 2.5, demonstrando uma dramática melhora da função locomotora nesses estudos. Esses animais apresentam passada coordenada e a capacidade de suportar peso. Como tal, implantes aspargo-derivados apresentam promessa para tratar SCI em um modelo rato. Em determinadas representações, biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descritos, podem ser usados para recrutar células neuroprogenitoras em tecido da medula espinhal lesionado para melhora da função motora.

EXEMPLO 14 - ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DESCELULARIZADO VEGETAL PARA ENXERTO CUTÂNEO

[0231] Camundongos foram anestesiados usando 2% de Isoflurano USP-PPC (Pharmaceutical partners de Canada, Richmond, ON, Canada) com os olhos protegidos com a aplicação de gel líquido oftálmico (Alco Canada In., ON, Canada). Os pelos das costas do camundongo foram raspados. A pele raspada foi tratada com um gel Nair por uma duração de dois minutos. O Nair foi cuidadosamente removido da pele e a pele subjacente foi limpa e esterilizada usando ENDURE 400 Scrub-Stat4 Surgical Scrub (gluconato de clorexidina, solução a 4%; Ecolab Inc., Minnesota, USA) e Soluprep (2% w/v clorexidina e 70% v/v de álcool isopropila; 3M Canada, London, ON, Canada). A hidratação do animal foi mantida, via injeção subcutânea (s.c.) de 1 ml de solução de 0,9% de cloreto de sódio (Hospira, Montréal, QC, Canada). Durante os procedimentos cirúrgicos foram tomadas medidas estritas de esterilidade para cirurgias de sobrevivência. Uma biópsia circular de 5 mm da pele é removida. Uma almofada isolante de borracha com supercola em gel é cuidadosamente posicionada sobre a biópsia enquanto ainda deixa exposta a biopsia da pele. A almofada de borracha é então suturada ao camundongo em 8 pontos usando monofilamento poliprpileno 6-0 Surgipro II (Covidien, Massachusetts, USA). O enxerto de pele é então colocado para substituir a pele removida e selado com uma fita adesiva transparente absorvente dupla. Bupivicaína transdérmica a 2% (como monoidrato; Chiron Compounding Pharmacy Inc., Guelph, ON, Canada) foi aplicada topicamente nos locais de cirurgia para evitar infecção. Adicionalmente, buprenorfina (como HCL) (0.03mg/ml; Chiron Compounding Pharmacy Inc. Guelph, ON, Canada) foi administrada s.c. como um analgésico. Todos os animais foram então cuidadosamente monitorados pelos 3 dias seguintes por serviços de cuidados animais e receberam tratamento adicional dos mesmos tratamentos farmacológicos. O adesivo transparente foi trocado todos os dias e o enxerto de pele foi fotografado.

[0232] A Figura 38 mostra um tecido de hipanto de maçã descelularizado processado para enxertos de pele. Foram tiradas fotografias após 4 dias para medir o grau de infiltração celular do hospedeiro durante o processo de cura do ferimento (Figura 38C); Em duas semanas após a implantação do estrutura tridimensional, os camundongos sofreram eutanásia com inalação de CO2. A pele dorsal foi cuidadosamente ressecada e imediatamente imersa em solução com PBS. As seções da pele contendo estrutura tridimensionals de celulose foram então fotografadas, cortadas e fixadas em 10% de formalina por pelo menos 48 horas. As amostras foram então mantidas em etanol 70% antes de serem incorporadas em parafina pelo PALM Histology Core Facility da University de Ottawa.

EXEMPLO 15 - ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DESCELULARIZADO VEGETAL PARA ENXERTOS ÓSSEOS

[0233] Esse estudo foi realizado para mostrar a eficiência de biomateriais conforme aqui descritos para regeneração óssea. Aqui, um defeito calvarial de tamanho crítico em rato foi usada para demonstrar que o estrutura tridimensional de celulose pode suportar a regeneração óssea com sucesso em um defeito circular de 5 mm.

[0234] Ratos Sprague Dawley foram anestesiados com isoflurano em oxigênio e receberam injeções subcutâneas de buprenorfina e solução salina estéril antes do procedimento cirúrgico. Os ratos raspados da ponte do focinho entre os olhos até a extremidade da cauda do calvário, os olhos foram protegidos com a aplicação de gel líquido oftálmico. Os ratos foram colocados em uma estrutura estereotáxica, seguros por barras de orelhas, sobre uma almofada morna aquecida por água. Uma incisão (1,5 cm) foi feita descendo até o periósteo sobre o escalpo a partir do osso nasal para apenas caudal até a crista sagital média (bregma). O periósteo foi dividido até a linha média sagital e dissecado. O calvário foi perfurado no osso parietal lateral direito (ou esquerdo) com uma trefina de 5 mm e uma broca cirúrgica. O osso da pontuação foi destacado do dura, deixando defeitos circulares de 5 mm no crânio do rato. Os defeitos foram cuidadosamente lavados com solução salina estéril e uma estrutura tridimensional de celulose (1mm de espessura) cilíndrico com diâmetro de 5 mm (Figura 39A) foi implantado nos defeitos (Figura 39B). A pele foi fechada suturando-se as camadas da pele. Os ratos sofreram eutanásia 4 semanas pós-cirurgia usando inalação de dióxido de carbono e sangria, e o estrutura tridimensional de celulose foi recuperado juntamente com o tecido ósseo adjacente (Figura 39C) para análise histológica (Figura 39D). Os tecidos foram então fixados em uma solução de formalina tamponada e desidratados em etanol antes de serem incorporados em metilo metacrilato. Varias amostras com espessura de 5μm foram tingidas com hematoxilina/eosina para destacar a presença de componentes celulares (núcleos e citoplasma) (Figura 40D). Para medir quantitativamente a eficiência dos estrutura tridimensionals de celulose, usamos um método de pontuação mostrado na tabela 1 - parâmetro de pontuação histológica quantitativa (Kretlow et al. 2010) foi usado.

Tabela 1: Parâmetro de Pontuação Histológica Quantitativa (Kretlow et al., 2010)

[0235] Nos experimentos mostrados na Figura 39, estrutura tridimensionals de celulose derivados de plantas foram avaliados para enxertos ósseos. Conforme descrito, cada implante cilíndrico (5mm de diâmetro, 1mm de espessura) foi medido antes da implantação para comparação de área do estrutura tridimensional (Figura 39A). Implantes de estrutura tridimensional de celulose foram implantados nos defeitos do crânio do rato e posicionados para permanecer dentro do defeito do crânio. A pele foi então posicionada sobre o enxerto e suturada de modo a manter o estrutura tridimensional no lugar (Figura 39B). O estrutura tridimensional e os tecidos ósseos ao redor foram isolados 4 semanas após a implantação e imagens macroscópicas foram tiradas (Figura 39C). O tecido isolado foi então descalcificado e processado/incorporado em parafina. Seções seriais com espessura de 5μm foram cortadas, começando em 1mm dentro do estrutura tridimensional de celulose, e tingidas com hematoxilina-eosina (H&E) (Figura 39D). Para a avaliação da regeneração óssea, micrógrafos foram capturados usando MIRAX MIDI Slide Scanner (Zeiss, Toronto, Canada) equipado com objetiva de 40x e analisados usando Panoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Budapeste, Hungria) e software ImageJ.

[0236] Resultados histológicos mostram um contato direto osso-estrutura tridimensional na interface do defeito e os estrutura tridimensionals de biomaterial.

EXEMPLO 16 - FORMAS DE EXEMPLO DE BIOMATERIAIS DE ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL

[0237] As Figuras de 40A a 40F mostram diferentes formulações de exemplos, propriedades físicas e funcionalizações de biomateriais de estrutura tridimensional celulose-baseados. A Figura 40A mostra a celulose pode ser usada como um bloco cortado em diferentes formatos. A Figura 40B mostra que a celulose pode ser desidratada e moída em forma de pó. A Figura 40B também mostra que se a celulose contiver carboximetilcelulose, pode ser facilmente reticulada com ácido cítrico e calor. A Figura 40C mostra que a forma em pó da celulose pode ser reidratada até uma consistência desejada para produzir um gel (Figura 40D) ou uma pasta (Figuras 40E, 40F).

EXEMPLO 17 - TAXA DE SOBREVIVÊNCIA APÓS A IMPLANTAÇÃO

[0238] A Figura 41A é um gráfico mostrando a taxa de sobrevivência experimental de camundongos (n=190) e ratos (n=12) após a implantação do biomaterial (de varias fontes) em 1 semana, 4 semanas e 8 semanas pós- implantação. A Figura 41B mostra a taxa de rejeição ao biomaterial nesses mesmos pontos de tempo que na Figura 41A. Todos os animais (camundongos e ratos) sobreviveram à implantação do biomaterial, e todos sobreviveram à completa duração de cada teste e nenhum apresentou sinais de rejeição ao implante nesses experimentos.

EXEMPLO 18 - EXEMPLOS DE TECIDOS VEGETAIS E FÚNGICOS

[0239] Diferentes sistemas vegetais de taxonomia são usados em classificação de plantas e existem varias versões desses sistemas (ex: sistema Cronquist e sistemas APG).

[0240] Em experimentos conforme os descritos acima, usando um amplo espectro de plantas que são classificadas em grupos, famílias, gêneros e espécies vegetais diferentes, nossos dados indicam que uma ampla variedade de plantas pode ser usada na preparação de biomateriais de estrutura tridimensional.

[0241] Falando de modo geral, o reino vegetal é dividido em quatro grupos principais: - Plantas de florescência (Angiospermas); - Coníferas, cicadáceas e afins (Ginospermas); - Samambaias e afins (Pteridófitas); - Musgos e líquenes (Briófitas).

[0242] Esses quatro grupos principais contem muitas famílias de plantas que são divididas em muitos gêneros que também são divididos em espécies. A seguir está uma lista das principais famílias de plantas das quais estrutura tridimensionals de celulose podem ser gerados: Acanthaceae, Achariaceae, Achatocarpaceae, Acoraceae, Acrobolbaceae, Actinidiaceae, Adelanthaceae, Adoxaceae, Aextoxicaceae, Aizoaceae, Akaniaceae, Alismataceae, Allisoniaceae, Alseuosmiaceae, Alstroemeriaceae, Altingiaceae, Amaranthaceae ,Amaryllidaceae, Amblystegiaceae, Amborellaceae, Anacampserotaceae, Anacardiaceae, Anarthriaceae, Anastrophyllaceae, Ancistrocladaceae, Andreaeaceae, Andreaeobryaceae, Anemiaceae, Aneuraceae, Anisophylleaceae, Annonaceae, Antheliaceae, Anthocerotaceae, Aphanopetalaceae, Aphloiaceae, Apiaceae, Apleniaceae, Apocynaceae, Apodanthaceae, Aponogetonaceae, Aquifoliaceae, Araceae, Araliaceae, Araucariaceae, Archidiaceae, Arecaceae, Argophyllaceae, Aristolochiaceae, Arnelliaceae, Asparagaceae, Aspleniaceae, Asteliaceae, Asteropeiaceae, Atherospermataceae, Athyriaceae, Aulacomniaceae, Austrobaileyaceae, Aytoniaceae, Balanopaceae, Balanophoraceae, Balantiopsaceae, Balsaminaceae, Barbeuiaceae, Barbeyaceae, Bartramiaceae, Basellaceae, Bataceae, Begoniaceae, Berberidaceae, Berberidopsidaceae, Betulaceae, Biebersteiniaceae, Bignoniaceae, Bixaceae, Blandfordiaceae, Blasiaceae, Blechnaceae, Bonnetiaceae, Boraginaceae, Boryaceae, Brachytheciaceae, Brassicaceae, Brevianthaceae, Bromeliaceae, Bruchiaceae, Brunelliaceae, Bruniaceae, Bryaceae, Bryobartramiaceae, Bryoxiphiaceae, Burmanniaceae, Burseraceae, Butomaceae, Buxaceae, Buxbaumiaceae, Byblidaceae, Cabombaceae, Cactaceae, Calceolariaceae, Calomniaceae, Calophyllaceae, Calycanthaceae, Calyceraceae, Calymperaceae, Calypogeiaceae, Campanulaceae, Campynemataceae, Canellaceae, Cannabaceae, Cannaceae, Capparaceae, Caprifoliaceae, Cardiopteridaceae, Caricaceae, Carlemanniaceae, Caryocaraceae, Caryophyllaceae, Casuarinaceae, Catagoniaceae, Catoscopiaceae, Celastraceae, Centrolepidaceae, Centroplacaceae, Cephalotaceae, Cephaloziaceae, Cephaloziellaceae, Ceratophyllaceae, Cercidiphyllaceae, Chaetophyllopsaceae, Chloranthaceae, Chonecoleaceae, Chrysobalanaceae, Cibotiaceae, Cinclidotaceae, Circaeasteraceae, Cistaceae, Cleomaceae, Clethraceae, Cleveaceae, Climaciaceae, Clusiaceae, Colchicaceae, Columelliaceae, Combretaceae, Commelinaceae, Compositae, Connaraceae, Conocephalaceae, Convolvulaceae, Coriariaceae, Cornaceae, Corsiaceae, Corsiniaceae, Corynocarpaceae, Costaceae, Crassulaceae, Crossosomataceae, Cryphaeaceae, Ctenolophonaceae, Cucurbitaceae, Culcitaceae, Cunoniaceae, Cupressaceae, Curtisiaceae, Cyatheaceae, Cycadaceae, Cyclanthaceae, Cymodoceaceae, Cynomoriaceae, Cyperaceae, Cyrillaceae, Cyrtopodaceae, Cystodiaceae, Cystopteridaceae, Cytinaceae, Daltoniaceae, Daphniphyllaceae, Dasypogonaceae, Datiscaceae, Davalliaceae, Degeneriaceae, Dendrocerotaceae, Dennstaedtiaceae, Diapensiaceae, Dichapetalaceae, Dicksoniaceae, Dicnemonaceae, Dicranaceae, Didiereaceae, Dilleniaceae, Dioncophyllaceae, Dioscoreaceae, Dipentodontaceae, Diphysciaceae, Diplaziopsidaceae, Dipteridaceae, Dipterocarpaceae, Dirachmaceae, Disceliaceae, Ditrichaceae, Doryanthaceae, Droseraceae, Drosophyllaceae, Dryopteridacae, Dryopteridaceae, Ebenaceae, Ecdeiocoleaceae, Echinodiaceae, Elaeagnaceae, Elaeocarpaceae, Elatinaceae, Emblingiaceae, Encalyptaceae, Entodontaceae, Ephedraceae, Ephemeraceae, Equisetaceae, Ericaceae, Eriocaulaceae, Erpodiaceae, Erythroxylaceae, Escalloniaceae, Eucommiaceae, Euphorbiaceae, Euphroniaceae, Eupomatiaceae, Eupteleaceae, Eustichiaceae, Exormothecaceae, Fabroniaceae, Fagaceae, Fissidentaceae, Flacourtiaceae, Flagellariaceae, Fontinalaceae, Fossombroniaceae, Fouquieriaceae, Frankeniaceae, Funariaceae, Garryaceae, Geissolomataceae, Gelsemiaceae, Gentianaceae, Geocalycaceae, Geraniaceae, Gerrardinaceae, Gesneriaceae, Gigaspermaceae, Ginkgoaceae, Gisekiaceae, Gleicheniaceae, Gnetaceae, Goebeliellaceae, Gomortegaceae, Goodeniaceae, Goupiaceae, Grimmiaceae, Grossulariaceae, Grubbiaceae, Guamatelaceae, Gunneraceae, Gymnomitriaceae, Gyrostemonaceae, Gyrothyraceae, Haemodoraceae, Halophytaceae, Haloragaceae, Hamamelidaceae, Hanguanaceae, Haplomitriaceae, Haptanthaceae, Hedwigiaceae, Heliconiaceae, Helicophyllaceae, Helwingiaceae, Herbertaceae, Hernandiaceae, Himantandraceae, Hookeriaceae, Huaceae, Humiriaceae, Hydatellaceae, Hydnoraceae, Hydrangeaceae, Hydrocharitaceae, Hydroleaceae, Hydrostachyaceae, Hylocomiaceae, Hymenophyllaceae, Hymenophytaceae, Hypericaceae, Hypnaceae, Hypnodendraceae, Hypodematiaceae, Hypopterygiaceae, Hypoxidaceae, Icacinaceae, Iridaceae, Irvingiaceae, Isoêtaceae, , teaceae, Ixioliriaceae, Ixonanthaceae, Jackiellaceae, Joinvilleaceae, Jubulaceae, Jubulopsaceae, Juglandaceae, Juncaceae, Juncaginaceae, Jungermanniaceae, Kirkiaceae, Koeberliniaceae, Krameriaceae, Lacistemataceae, Lactoridaceae, Lamiaceae, Lanariaceae, Lardizabalaceae, Lauraceae, Lecythidaceae, Leguminosae, Lejeuneaceae, Lembophyllaceae, Lentibulariaceae, Lepicoleaceae, Lepidobotryaceae, Lepidolaenaceae, Lepidoziaceae, Leptodontaceae, Lepyrodontaceae, Leskeaceae, Leucodontaceae, Leucomiaceae, Liliaceae, Limeaceae, Limnanthaceae, Linaceae, Linderniaceae, Lindsaeaceae, Loasaceae, Loganiaceae, Lomariopsidaceae, Lonchitidaceae, Lophiocarpaceae, Lophocoleaceae, Lophopyxidaceae, Lophoziaceae, Loranthaceae, Lowiaceae, Loxsomataceae, Lunulariaceae, Lycopodiaceae, Lygodiaceae, Lythraceae, Magnoliaceae, Makinoaceae, Malpighiaceae, Malvaceae, Marantaceae, Marattiaceae, Marcgraviaceae, Marchantiaceae, Marsileaceae, Martyniaceae, Mastigophoraceae, Matoniaceae, Mayacaceae, Meesiaceae, Melanthiaceae, Melastomataceae, Meliaceae, Melianthaceae, Menispermaceae, Menyanthaceae, Mesoptychiaceae, Metaxyaceae, Meteoriaceae, Metteniusaceae, Metzgeriaceae, Microtheciellaceae, Misodendraceae, , Mitrastemonaceae, Mitteniaceae, Mizutaniaceae, Mniaceae, Molluginaceae, Monimiaceae, Monocarpaceae, Monocleaceae, Monosoleniaceae, Montiaceae, Montiniaceae, Moraceae, Moringaceae, Muntingiaceae, Musaceae, Myodocarpaceae, Myricaceae, Myriniaceae, Myristicaceae, Myrothamnaceae, Myrtaceae, Myuriaceae, Nartheciaceae, Neckeraceae, Nelumbonaceae, Neotrichocoleaceae, Nepenthaceae, Nephrolepidaceae, Neuradaceae, Nitrariaceae, Nothofagaceae, Notothyladaceae, Nyctaginaceae, Nymphaeaceae, Ochnaceae, Octoblepharaceae, Oedipodiaceae, Olacaceae, Oleaceae, Oleandraceae, Onagraceae, Oncothecaceae, Onocleaceae, Ophioglossaceae, Opiliaceae, Orchidaceae, Orobanchaceae, Orthorrhynchiaceae, Orthotrichaceae, Osmundaceae, Oxalidaceae, Oxymitraceae, Paeoniaceae, Pallaviciniaceae, Pandaceae, Pandanaceae, Papaveraceae, Paracryphiaceae, Passifloraceae, Paulowniaceae, Pedaliaceae, Pelliaceae, Penaeaceae, Pennantiaceae, Pentadiplandraceae, Pentaphragmataceae, Pentaphylacaceae, Penthoraceae, Peraceae, Peridiscaceae, Petenaeaceae, Petermanniaceae, Petrosaviaceae, Phellinaceae, Philesiaceae, Philydraceae, Phrymaceae, Phyllanthaceae, Phyllodrepaniaceae, Phyllogoniaceae, Phyllonomaceae, Physenaceae, Phytolaccaceae, Picramniaceae, Picrodendraceae, Pilotrichaceae, Pinaceae, Piperaceae, Pittosporaceae, Plagiochilaceae, Plagiogyriaceae, Plagiotheciaceae, Plantaginaceae, Platanaceae, Pleurophascaceae, Pleuroziaceae, Pleuroziopsaceae, Plocospermataceae, Plumbaginaceae, Poaceae, Podocarpaceae, Podostemaceae, Polemoniaceae, Polygalaceae, Polygonaceae, Polypodiaceae, Polytrichaceae, Pontederiaceae, Porellaceae, Portulacaceae, Posidoniaceae, Potamogetonaceae, Pottiaceae, Primulaceae, Prionodontaceae, Proteaceae, Pseudoditrichaceae, Pseudolepicoleaceae, Psilotaceae, Pteridaceae, Pterigynandraceae, Pterobryaceae, Ptilidiaceae, Ptychomitriaceae, Ptychomniaceae, Putranjivaceae, Quillajaceae, Racopilaceae, Radulaceae, Rafflesiaceae, Ranunculaceae, Rapateaceae, Regmatodontaceae, Resedaceae, Restionaceae, Rhabdodendraceae, Rhabdoweisiaceae, Rhachidosoraceae, Rhachitheciaceae, Rhacocarpaceae, Rhamnaceae, Rhipogonaceae, Rhizogoniaceae, Rhizophoraceae, Ricciaceae, Riellaceae, Rigodiaceae, Roridulaceae, Rosaceae, Rousseaceae, Rubiaceae, Ruppiaceae, Rutaceae, Rutenbergiaceae, Sabiaceae, Saccolomataceae, Salicaceae, Salvadoraceae, Salviniaceae, Santalaceae, Sapindaceae, Sapotaceae, Sarcobataceae, Sarcolaenaceae, Sarraceniaceae, Saururaceae, Saxifragaceae, , Scapaniaceae, Scheuchzeriaceae, Schisandraceae, Schistochilaceae, Schistostegaceae, Schizaeaceae, Schlegeliaceae, Schoepfiaceae, Sciadopityaceae, Scorpidiaceae, Scrophulariaceae, Selaginellaceae, Seligeriaceae, Sematophyllaceae, Serpotortellaceae, Setchellanthaceae, Simaroubaceae, Simmondsiaceae, Siparunaceae, Sladeniaceae, Smilacaceae, Solanaceae, Sorapillaceae, Sphaerocarpaceae, Sphaerosepalaceae, Sphagnaceae, Sphenocleaceae, Spiridentaceae, Splachnaceae, Splachnobryaceae, Stachyuraceae, Staphyleaceae, Stegnospermataceae, Stemonaceae, Stemonuraceae, Stereophyllaceae, Stilbaceae, Strasburgeriaceae, Strelitziaceae, Stylidiaceae, Styracaceae, Surianaceae, Symplocaceae, Takakiaceae, Talinaceae, Tamaricaceae, Tapisciaceae, Targioniaceae, Taxaceae, Tecophilaeaceae, Tectariaceae, Tetrachondraceae, Tetramelaceae, Tetrameristaceae, Tetraphidaceae, Thamnobryaceae, Theaceae, Theliaceae, Thelypteridaceae, Thomandersiaceae, Thuidiaceae, Thurniaceae, Thymelaeaceae, Thyrsopteridaceae, Ticodendraceae, Timmiaceae, Tofieldiaceae, Torricelliaceae, Tovariaceae, Trachypodaceae, Treubiaceae, Trichocoleaceae, Trichotemnomataceae, Trigoniaceae, Trimeniaceae, Triuridaceae, Trochodendraceae, Tropaeolaceae, Typhaceae, Ulmaceae, Urticaceae, Vahliaceae, Vandiemeniaceae, Velloziaceae, Verbenaceae, Vetaformaceae, Violaceae, Viridivelleraceae, Vitaceae, Vivianiaceae, Vochysiaceae, Wardiaceae, Welwitschiaceae, Wiesnerellaceae, Winteraceae, Woodsiaceae, Xanthorrhoeaceae, Xeronemataceae, Xyridaceae, Zamiaceae, Zingiberaceae, Zosteraceae, Zygophyllaceae.

[0243] Devido a uma nova classificação, alguns grupos de algas não são mais classificados dentro do reino vegetal. Essas algas são, no entanto, candidatas para a produção de estrutura tridimensionals de celulose conforme aqui descrito. O reino fúngico possui membros que contem, por exemplo, uma parede celular feita de celulose. As algas são agora classificadas no reino protista; entretanto, deve ser observado que nesta divulgação, pretende-se que as algas sejam abrangidas pelo termo “plantas” conforme aqui usado. Algas apropriadas podem incluir: - Algas: organismos uni ou multi-celulares tipo-planta; - Algas verdes: Spirogyra, Ulva, Chlamydomonas, Volvox; - Algas vermelhas: Porphyra, Rotalgen; - Algas marrons: Laminaria, Nereocystis; - Moldes de água: Saprolegnia; e/ou - Phylum Ciliata: Paramecium, Vorticella.

[0244] Também foi experimentalmente demonstrado que quitina é uma estrutura tridimensional adequado que pode ser usado em biomateriais de estrutura tridimensional conforme aqui descrito usando os protocolos de acordo com o aqui descrito. O reino fúngico é classificado da seguinte forma: - Fungos sac: Agaricus (cogumelo), Ustilago (fuligem), and Puccinia (fungo ferrugem); - Fungos formadores de zigoto: Mucor, Rhizopus (o bolor do pão) e Albugo; - Fungos de clube: Agaricus (cogumelo), Ustilago (fuligem), e Puccinia (fungo ferrugem); e - Fungos imperfeitos: Alternaria, Colletotrichum e Trichoderma.

[0245] Esses fungos também representam candidados adequados para a obtenção de tecidos fungicos descelularizados conforme descrito acima.

[0246] Foram descritas uma ou mais representações ilustrativas a título de exemplo. Qualquer profissional da área poderá observar que uma quantidade de variações e modificações pode ser feita sem se afastar do escopo da invenção conforme definido nas reivindicações. REFERÊNCIAS 1. Saini M. Implant biomaterials: A comprehensive review. World J Clin Cases. 2015;3: 52. doi:10.12998/wjcc.v3.i1.52 2. Pashuck ET, Stevens MM. STATE OF THE ART REVIEW Designing Regenerative Biomaterial Therapies for the Clinic. Sci Transl Med. 2012;4. 3. Athanasiou KA, Reddi AH, Guldberg RE, Revell CM. Special section. 2012;338: 921-927. 4. Kar M, Vernon Shih Y-R, Velez DO, Cabrales P, Varghese S. Poly(ethylene glycol) hydrogels with cell cleavable groups for autonomous cell delivery. Biomaterials. 2016;77: 186-97. doi:10.1016/j.biomaterials.2015.11.018 5. Gu L, Mooney DJ. Biomaterials and emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment. Nat Rev Cancer. 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Claims

1. Biomaterial de estrutura tridimensional compreendendo um tecido vegetal descelularizado do qual materiais celulares e ácidos nucléicos do tecido são removidos, o tecido vegetal descelularizado caracterizado por compreender uma estrutura porosa tridimensional baseada em celulose, onde o tecido vegetal descelularizado compreende um tecido vegetal que foi descelularizado por tratamento com dodecil sulfato de sódio (SDS), onde o SDS residual foi removido utilizando-se uma solução salina divalente aquosa para precipitar um resíduo salino contendo micelas de SDS para fora do biomaterial de estrutura tridimensional.

2. Biomaterial de estrutura tridimensional de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: dH2O, ácido acético, DMSO, ou tratamento de sonicação, ou qualquer combinação dos mesmos, ser usado para remover a solução salina divalente aquosa, resíduo salino, e/ou micelas de SDS, e/ou o sal divalente da solução salina divalente aquosa compreende MgCl2 ou CaCl2, e/ou o tecido vegetal foi descelularizado através de tratamento com uma solução de SDS de aproximadamente 1% ou aproximadamente 0,1% de SDS em água, e o SDS residual ter sido removido usando uma solução de CaCl2 aquosa a uma concentração de aproximadamente 100mM seguido de incubação em dH2O.

3. Biomaterial de estrutura tridimensional de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o tecido vegetal descelularizado ser processado para a introdução de outra arquitetura e/ou ser funcionalizado em pelo menos um grupo funcional de hidroxila livre através de acilação, alquilação, ou outra modificação covalente, para fornecer um biomaterial de estrutura tridimensional funcionalizado, e/ou, onde o tecido vegetal descelularizado é processado para a introdução de micro canais, e/ou ser funcionalizado com colágeno, um fator para promover especificidade celular, um fator de crescimento celular, ou um agente farmacêutico.

4. Biomaterial de estrutura tridimensional de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado por o tecido vegetal ser um tecido de hipanto de maçã (Malus pumila), um tecido de samambaia (Monilophytes), um tecido de raiz de nabo (Brassica rapa), um tecido de ramificação de gingko, um tecido de cavalinha (equisetum), um tecido de folha de hermocallis híbrida, um tecido de caule de couve (Brassica oleracea), um tecido de conífera Douglas Fir (Pseudotsuga menziesii), um tecido da polpa da fruta do cacto (pitaia), um tecido Maculata Vinca, um tecido de Lótus Aquática (Nelumbo nucifera), um tecido de pétala de Tulipa (Tulipa gesneriana), um tecido de Plátano (Musa paradisiaca), um tecido de caule de brócolis (Brassica oleracea), um tecido de caule de folha de bordo (Acer psuedoplatanus), um tecido de raiz primária de beterraba (Beta vulgaris), um tecido de cebola verde (Allium cepa), um tecido de orquídea (Orchidaceae), um tecido de caule de nabo (Brassica rapa), um tecido de alho porro (Allium ampeloprasum), um tecido de ramo de árvore de bordo (Acer), um tecido de aipo (Apium graveolens), um tecido de caule de cebola verde (Allium cepa), um tecido de pinheiro, um tecido de aloe vera, um tecido de melancia (Citrullus lanatus var. lanatus), um tecido de Creeping Jenny (Lysimachia nummularia), um tecido de cactae, um tecido Lychnis Alpina, um tecido de ruibarbo (Rheum rhabarbarum), um tecido de polpa de abóbora (Cucurbita pepo), um tecido de caule de dracena (Asparagaceae), um tecido de caule de Spiderwort (Tradescantia virginiana), um tecido do caule de Asparagus (Asparagus officinalis), um tecido de cogumelo (Fungi), um tecido de funcho (Foeniculum vulgare), um tecido de rosa (Rosa), um tecido de cenoura (Daucus carota), ou um tecido de pereira (Pomaceous), ou um tecido geneticamente modificado produzido através de modificação direta do genoma ou através de reprodução seletiva para criar uma arquitetura adicional de planta que é configurada para imitar fisicamente um tecido e/ou promover funcionalmente um efeito de tecido alvo.

5. Biomaterial de estrutura tridimensional de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado por compreender ainda células de animais vivos aderidas à estrutura porosa tridimensional baseada em celulose, em particular, onde as células de animais vivos são células de mamíferos, em particular, e/ou onde as células de animais vivos são células humanas.

6. Método para preparar um tecido vegetal descelularizado do qual materiais celulares e ácidos nucléicos do tecido são removidos, o tecido vegetal descelularizado compreendendo uma estrutura porosa tridimensional baseada em celulose, o dito método caracterizado por compreender: fornecer um tecido vegetal tendo um tamanho e formato predeterminado; descelularizar o tecido vegetal através de tratamento do tecido vegetal com dodecil sulfato de sódio (SDS); e, remover SDS residual do tecido vegetal utilizando uma solução salina divalente aquosa para precipitar um resíduo salino contendo micelas de SDS para fora do tecido vegetal, removendo assim materiais celulares e ácidos nucléicos do tecido vegetal para formar o tecido vegetal descelularizado compreendendo uma estrutura porosa tridimensional baseada em celulose.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por: dH2O, ácido acético, DMSO, ou tratamento com sonicação, ou qualquer combinação dos mesmos, serem usados para remover a solução salina divalente aquosa, o resíduo salino, e/ou as micelas de SDS, e/ou o sal divalente da solução salina divalente aquosa compreender MgCl2 ou CaCl2, e/ou onde a etapa de descelularização compreender tratamento com uma solução de SDS de aproximadamente 0,1% ou aproximadamente 1% de SDS em água, e o SDS residual ser removido após a descelularização usando uma solução de CaCl2 aquosa a uma concentração de aproximadamente 100mM seguido de incubação em dH2O.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-7, caracterizado por compreender ainda uma etapa de processar o tecido vegetal descelularizado para introduzir outra micro-arquitetura, e/ou uma etapa de funcionalizar pelo menos alguns grupos funcionais de hidroxila livre do tecido vegetal descelularizado através de acilação, alquilação, ou outra modificação covalente, em particular, onde o tecido vegetal descelularizado ser processado para introduzir micro canais, e/ou grupos funcionais hidroxila do tecido vegetal descelularizado serem funcionalizados com colágeno, um fator para a promoção de especificidade celular, um fator de crescimento celular, ou um agente farmacêutico.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-8, caracterizado por compreender ainda uma etapa de introduzir células de animais vivos à estrutura porosa tridimensional baseada em celulose, e permitir às células de animais vivos aderirem à estrutura porosa tridimensional baseada em celulose, em particular onde as células de animais vivos são células de mamíferos, e/ou onde as células de animais vivos são células humanas.

10. Uso do biomaterial de estrutura tridimensional de uma das reivindicações 1-5 na preparação de uma estrutura tridimensional implantável caracterizado por ser uso para suportar o crescimento celular animal, para promover a regeneração de tecidos, para promover a angiogênese, para um procedimento de substituição de tecido, ou como um implante estrutural para cirurgia estética, ou como um implante estrutural para reparação ou regeneração após lesão medular, ou como um implante estrutural para substituição de tecido em cirurgia e/ou para regeneração de tecido pós cirurgia, ou como um implante estrutural para enxerto de pele e/ou cirurgia de regeneração da pele, ou como um implante estrutural para regeneração de vascularização sanguínea em um tecido ou região alvo, ou como um substituto ósseo, um preenchimento ósseo, ou material de enxerto ósseo, e/ou para promover a regeneração óssea, ou como um substituto para pele, ossos, medula espinhal, coração músculos, nervo, vasos sanguíneos, ou outro tecido lesionado ou malformado, ou na forma de hidrogel, como um substituto do humor vítreo, ou como uma bursa artificial, onde o biomaterial de estrutura tridimensional forma uma estrutura tipo saco contendo biomaterial de estrutura tridimensional na forma de hidrogel, ou como um implante estrutural para cirurgia estética.

11. Uso de biomaterial definido na reivindicação 10, caracterizado por o biomaterial de estrutura tridimensional ser um biomaterial de estrutura tridimensional para o qual o tecido vegetal descelularizado do biomaterial de estrutura tridimensional é configurado para imitar fisicamente um tecido do paciente e/ou para promover funcionalmente um efeito de tecido alvo no paciente.

12. Kit caracterizado por compreender um biomaterial de estrutura tridimensional de acordo com qualquer das reivindicações 1-5 e pelo menos um de um recipiente ou instruções para realizar o uso conforme definido em qualquer das reivindicações 10 ou 11, em particular onde o kit é um kit cirúrgico.

13. Kit caracterizado por compreender um implante dispensável estéril pré-carregado compreendendo um biomaterial de estrutura tridimensional conforme definido em qualquer das reivindicações 1-5, e instruções para uso conforme definido na reivindicação 10 ou 11.