ES2953657T3 - Estructuras de pared celular descelularizadas de plantas y hongos y su utilización como materiales de andamiaje - Google Patents
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Abstract
En el presente documento se proporcionan biomateriales de armazón que comprenden un tejido vegetal o fúngico descelularizado del cual se eliminan los materiales celulares y los ácidos nucleicos del tejido, comprendiendo el tejido vegetal o fúngico descelularizado una estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina. También se proporcionan métodos para preparar tales biomateriales de armazón, así como usos de los mismos como armazón implantable para soportar el crecimiento de células animales, para promover la regeneración de tejidos, para promover la angiogénesis, para un procedimiento de reemplazo de tejido y/o como un implante estructural para cirugía cosmética. . Se describen adicionalmente tratamientos terapéuticos y/o métodos cosméticos que emplean dichos armazones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Estructuras de pared celular descelularizadas de plantas y hongos y su utilización como materiales de andamiaje
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere en general a biomateriales de andamiaje y usos de los mismos. Más concretamente, la presente invención se refiere al tejido descelularizado de plantas u hongos y a su uso como biomaterial de andamiaje.
ANTECEDENTES
Se calcula que el sector de los biomateriales tiene un valor de mercado de 90.000 millones de dólares y está impulsado por nuevos materiales derivados de fuentes naturales, polímeros sintéticos, metáis y cerámicas. Estos materiales pueden formar andamiajes tridimensionales de alta porosidad que poseen estructuras a nano/microescala que son biocompatibles y favorecen el crecimiento de células vivas. Existe un gran interés por los biomateriales novedosos que favorecen la invasión y proliferación de células vivas para posibles aplicaciones en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, por ejemplo.
Los andamiajes de biomateriales tienen aplicaciones en múltiples sectores, como la cirugía dental y estética, las terapias clínicas y médicas (como la medicina regenerativa, la cicatrización de heridas, la ingeniería y reparación de tejidos, etc.) y la investigación y el desarrollo (incluida la investigación industrial y académica en ciencias biomédicas).
Los biomateriales comerciales suelen requerir métodos de producción complicados y lentos, lo que conlleva un elevado coste para el usuario final, aunque no estén aprobados para uso humano. Además, la mayoría de los biomateriales comerciales son de origen humano/animal, lo que provoca un posible rechazo por parte del organismo y/o respuestas inmunitarias adversas y/o riesgo de transmisión de enfermedades. Los materiales de origen también pueden tener un impacto medioambiental negativo, y también pueden dar lugar a problemas de abastecimiento poco ético. Además, algunos biomateriales comerciales pierden su forma tras la implantación, lo que puede reducir el éxito de la reparación o sustitución del tejido.
El desarrollo de nuevos biomateriales para estrategias de ingeniería tisular es actualmente objeto de intensa investigación [1-3]. Terapéuticas en tejidos diana [4,5], la regeneración de tejidos dañados o enfermos [6-9], o la sustitución de órganos completos [10-15]. En su forma más general, los biomateriales proporcionan un andamiaje tridimensional (3D) que intenta imitar el entorno celular in vivo [14,16]. Se han desarrollado métodos para diseñar las propiedades mecánicas [17-24], estructurales [25] y bioquímicas [26-29] de estos andamiajes. Se han fabricado andamios de celulosa derivados de la manzana para cultivos celulares tridimensionales de mamíferos mediante la descelularización del tejido del hipanto de manzana mediante tratamiento con SDS [27].
Además, se están para garantizar que los biomateriales implantados sean biocompatibles y estimulen sólo respuestas inmunitarias mínimas. Los esfuerzos en la investigación de biomateriales se ven impulsados por órganos y tejidos de sustitución. Con el envejecimiento de la población, la diferencia entre los pacientes que esperan un trasplante de órganos y los donantes disponibles [30].
Aunque las aplicaciones clínicas de los biomateriales han sido algo limitadas, los médicos han utilizado con éxito biomateriales sintéticos para tratar diversos tejidos y estructuras como piel, encías, cartílagos y huesos [31-36]. Los andamiajes biomateriales pueden adoptar diversas formas, como polvos, geles, membranas y pastas [1,2]. Estas formulaciones de polímeros o hidrogeles pueden moldearse o imprimirse en 3D para producir formas con valor terapéutico [37-39], 12-16]. De hecho, se ha demostrado que es posible disociar las células de un órgano donado, dejando atrás la matriz del andamiaje, lo que se conoce comúnmente como órganos fantasma [14]. En los últimos años se han creado muchas partes del cuerpo utilizando métodos sintéticos y de descelularización, como la uretra, la vagina, el αdo, la nariz, el corazón, el riñón, la vejiga y tejidos neurológicos [14,38,39,43-47].
Sin embargo, estos enfoques presentan algunas desventajas [48]. Las técnicas sintéticas pueden implicar la utilización de productos animales y las estrategias de descelularización siguen implicando tejidos y órganos de donantes. También se ha investigado intensamente el desarrollo de biomateriales reabsorbibles [49]. En estos casos, el objetivo es proporcionar al organismo un andamiaje 3D temporal sobre el que puedan formarse tejidos sanos. Al cabo de varias semanas o meses, el andamio implantado se reabsorberá y dejará tras de sí un tejido sano completamente natural [26,29,50,51]. Muchos biomateriales no reabsorbibles (cerámica, titanio) se han empleado con éxito en entornos clínicos y desempeñan un papel importante en numerosas terapias [2,49,52-57]. Por ejemplo, durante varias décadas, la investigación sobre la reconstrucción de la oreja 5 a partir de cartílago artificial ha demostrado que los implantes de biomateriales acaban colapsándose y deformándose a medida que los andamiajes implantados se rompen y se reabsorben [63]. Sin embargo, los últimos enfoques exitosos se han basado en el uso de andamios de colágeno reabsorbibles incrustados con soportes permanentes de alambre de titanio [53,64,65]. Por lo tanto, en el campo de la ingeniería de tejidos y órganos sigue siendo necesario disponer de andamiajes no reabsorbibles pero biocompatibles. En enfoques complementarios recientes se han utilizado materiales de andamiaje que no proceden de donantes de órganos humanos ni de productos animales [66-77]. También se han estudiado construcciones e hidrogeles de celulosa nanocristalina, nanofibrilar y bacteriana [78-83].
También se ha investigado un enfoque ortogonal, aunque complementario, de las estrategias de descelularización de órganos y celulosasintética. Estos estudios preliminares in vitro investigaron biomateriales de celulosa a partir de tejido descelularizado de hipanto de manzana [27].
Quedan pendientes las cuestiones de la biocompatibilidad in vivo, los biomateriales alternativos y otros métodos de producción de biomateriales. En general, la industria sigue necesitando biomateriales alternativos, adicionales y/o mejorados, métodos para su producción y/o usos de los mismos.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Así pues, es objeto de la invención proporcionar un biomaterial que pueda utilizarse como andamio o implante en una variedad de aplicaciones que pueden incluir, pero no se limitan a, quirúrgicas, clínicas, terapéuticas, cosméticas, de desarrollo y/u otras aplicaciones adecuadas. El alcance de esta invención se define en las reivindicaciones. Cualquier "realización" o "ejemplo" que se divulga en la descripción, pero no está cubierto por las reivindicaciones debe considerarse como presentado sólo con fines ilustrativos. Las realizaciones de la descripción relativas a métodos de tratamiento no están cubiertas por las reivindicaciones.
Se proporciona un material de andamiaje tal como se define en las reivindicaciones 1-5 y 10-11, un método para preparar un tejido vegetal o fúngico descelularizado según las reivindicaciones 6-9 y un kit que comprende un material de andamiaje o un implante estéril dispensable según las reivindicaciones 12-13.
Por consiguiente, en ciertas realizaciones, se proporciona en el presente documento un biomaterial generado a partir de una especie de planta u hongo. El biomaterial puede modificarse, por ejemplo, mediante (i) la adición de una estructura (es decir, otras partes de plantas u hongos, o células vivas), fármacos o estructuras artificiales (materiales reabsorbibles o no reabsorbibles); (ii) modificación de su estructura con materiales mecánicos o Procedimientos químicos para modificar la forma o la formulación del producto original para adaptarlo a diferentes aplicaciones; (iii) con la adición de matrices sobre o dentro de los productos originales del andamio (como colágeno, fibronectina o cualquier otro sustrato) para modificar la adhesión celular o cualquier otro elemento beneficioso de la ciencia celular, como los factores de crecimiento.
Los biomateriales, los procesos de preparación y los usos potenciales se describen con más detalle a continuación. En ciertas realizaciones, el biomaterial puede tener un coste relativamente bajo, y/o puede utilizar un procedimiento de producción relativamente eficiente y/o condensado en el tiempo. Además, al utilizar estructuras complejas como andamios funcionales, se puede disponer de una amplia gama de posibilidades para producir arquitecturas complejas. Los biomateriales pueden tener la capacidad de mantener la forma, pueden tener una huella relativamente mínima (es decir, el andamio puede ser casi invisible antes y/o después de la angiogénesis), pueden ser altamente biocompatibles, pueden inducir una vascularización rápida, y/o pueden dar lugar a una respuesta inmunogénica mínima o casi inexistente.
El biomaterial se deriva de plantas u hongos y, por lo tanto, puede tener un impacto medioambiental relativamente bajo y/o considerarse orgánico y/o biodegradable. En algunos ejemplos, el biomaterial puede producirse a partir de residuos alimentarios, ofreciendo así una vía alternativa para los productos desechados.
En una realización, se proporciona en el presente documento un biomaterial de andamiaje que comprende un tejido vegetal o fúngico descelularizado del que se eliminan los materiales celulares y los ácidos nucleicos del tejido, el tejido vegetal o fúngico descelularizado que comprende una estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina.
El tejido vegetal o fúngico descelularizado comprende un tejido vegetal o fúngico que ha sido descelularizado mediante tratamiento con SDS.
El SDS residual se elimina del tejido vegetal o fúngico descelularizado lavándolo con una solución acuosa de sales divalentes.
En otra realización del material del andamio o materiales anteriores, los residuos se han eliminado utilizando una solución acuosa de sal divalente para precipitar/eliminar un residuo de sal que contiene micelas de SDS de la solución/andamio, y se puede haber utilizado un tratamiento de dH2O, ácido acético, dimetilsulfóxido (DMSO) o sonicación para eliminar el residuo de sal y/o las micelas de SDS.
En otra realización del material o materiales de andamiaje anteriores, la sal divalente de la solución acuosa de sal divalente puede comprender MgCb o CaCb.
En otra realización del material o materiales de andamiaje anteriores, el tejido vegetal o fúngico puede haberse descelularizado mediante tratamiento con una solución de SDS de entre 0,01 y 10%, por ejemplo, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%, o, por ejemplo, aproximadamente 0,1% de SDS o aproximadamente 1% de SDS, en un disolvente como agua, etanol u otro disolvente orgánico adecuado, y el SDS residual puede haberse eliminado utilizando una solución acuosa de CaCb a una concentración de aproximadamente 100 mM seguida de incubación en dH2O.
En ciertas realizaciones, la solución de SDS puede estar a una concentración superior al 0,1%, lo que puede facilitar la descelularización, y puede ir acompañada de un mayor lavado para eliminar el SDS residual.
En otra realización del material o materiales de andamiaje anteriores, el tejido vegetal o fúngico descelularizado puede funcionalizarse en al menos algunos grupos funcionales hidroxilo libres mediante acilación, alquilación u otra modificación covalente, para proporcionar un biomaterial de andamiaje funcionalizado.
En otra realización del material o materiales de andamiaje anteriores, el tejido vegetal o fúngico descelularizado puede
procesarse para introducir más arquitectura y/o puede funcionalizarse en al menos algunos grupos funcionales hidroxilo libres mediante acilación, alquilación u otra modificación covalente, para proporcionar un biomaterial de andamiaje funcionalizado.
En otra realización del material o materiales de andamiaje anteriores, el tejido vegetal o fúngico descelularizado puede procesarse para introducir microcanales, y/o puede funcionalizarse con colágeno, un factor para promover la especificidad celular, un factor de crecimiento celular o un agente farmacéutico.
En otra realización del material o materiales de andamiaje anteriores, el tejido vegetal o fúngico descelularizado puede funcionalizarse con colágeno.
En otra realización del material o materiales de andamiaje anteriores, el tejido vegetal o fúngico puede comprender un tejido de hipanto de manzana (Malus pumila), un tejido de helecho (Monilophytes), un tejido de raíz de nabo (Brassica rapa), un tejido de rama de gingko, un tejido de cola de caballo (equisetum), un tejido de hoja de híbrido de hermocallis, un tejido de tallo de col rizada (Brassica olerácea), un tejido de abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii) de coníferas, un tejido de pulpa de fruto de cactus (pitaya), un tejido de vinca maculata, un tejido de loto acuático 20 (Nelumbo nucifera), un tejido de pétalo de tulipán (Tulipa gesneriana), un tejido de plátano (Musa paradisiaca), un tejido de tallo de brécol (Brassica olerácea), un tejido de tallo de hoja de arce (Acer psuedoplatanus), un tejido de raíz primaria de remolacha (Beta vulgaris), un tejido de cebolla verde (Allium cepa), un tejido de orquídea (Orchidaceae), un tejido de tallo de nabo (Brassica rapa), un tejido de puerro (Allium ampeloprasum), un tejido de rama de arce (Acer), un tejido de apio (Apium graveolens), un tejido de tallo de cebolla verde (Allium cepa), un tejido de pino, un tejido de aloe vera, un tejido de sandía (Citrullus lanatus var. lanatus), un tejido de Jenny rastrera (Lysimachia nummularia), un tejido de cactus, un tejido de Lychnis Alpina, un tejido de ruibarbo (Rheum rhabarbarum), un tejido de pulpa de calabaza (Cucúrbita pepo), un tejido de tallo de Dracena (Asparagaceae), un tejido de tallo de araña (Tradescantia virginiana), un tejido de tallo de espárrago (Asparagus officinalis), un tejido de hongo (Fungi), un tejido de hinojo (Foeniculum vulgare), un tejido de rosa (Rosa), un tejido de zanahoria (Daucus carota) o un tejido de pera (Pomaceous).
En ciertas realizaciones, el tejido vegetal o fúngico puede comprender un tejido genéticamente alterado preparado mediante modificación directa del genoma y/o mediante cría selectiva para crear una arquitectura vegetal o fúngica adicional que esté configurada para imitar físicamente un tejido y/o para promover funcionalmente un efecto tisular diana. El experto que tenga en cuenta las enseñanzas del presente documento podrá seleccionar un biomaterial de andamiaje adecuado para una aplicación particular.
En otra realización del material o materiales de andamiaje anteriores, el biomaterial de andamiaje puede comprender además células animales vivas adheridas a la estructura porosa tridimensional basada en celulosa o quitina. En otra realización, las células animales vivas pueden ser células de mamífero. En otra realización, las células animales vivas pueden ser células humanas.
En otra realización, se proporciona en el presente documento un método para preparar un tejido vegetal o fúngico descelularizado del que se eliminan los materiales celulares y los ácidos nucleicos del tejido, el tejido vegetal o fúngico descelularizado que comprende una estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina, dicho método comprende:
proporcionar un tejido vegetal o fúngico de tamaño y forma predeterminados; y
descelularizar el tejido vegetal o fúngico tratando el tejido vegetal o fúngico con dodecil sulfato sódico (SDS) y eliminando el SDS residual del tejido vegetal o fúngico utilizando una solución acuosa de sal divalente para precipitar un residuo de sal que contenga micelas de SDS fuera del tejido vegetal o fúngico.
eliminando así los materiales celulares y los ácidos nucleicos del tejido vegetal o fúngico para formar el tejido vegetal o fúngico descelularizado que comprende una estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina.
En otra realización del método o métodos anteriores, puede utilizarse un tratamiento con dH2O, ácido acético, dimetilsulfóxido (DMSO), o sonicación para eliminar el residuo de sal y/o las micelas de SDS. En otra realización, la sal divalente de la solución acuosa de sal divalente puede comprender MgCb o CaCb.
En otra realización del método o métodos anteriores, el tejido vegetal o fúngico puede haberse descelularizado mediante tratamiento con una solución de SDS de entre 0,01 y 10%, por ejemplo, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%, o, por ejemplo, de aproximadamente 0,1% de s Ds o aproximadamente 1% de SDS, en un disolvente como agua, etanol u otro disolvente orgánico adecuado, y el SDS residual puede haberse eliminado utilizando una solución acuosa de CaCb a una concentración de aproximadamente 100 mM seguida de incubación en dH2O.
En determinadas realizaciones, la solución de SDS puede tener una concentración superior al 0,1%, lo que puede facilitar la descelularización, y puede ir acompañada de un mayor lavado para eliminar el SDS residual.
En otra realización del método o métodos anteriores, la etapa de descelularización puede comprender el tratamiento con una solución de SDS de aproximadamente 0,1% de SDS en agua, y el SDS residual puede eliminarse tras la descelularización utilizando una solución acuosa de CaCb a una concentración de aproximadamente 100 mM, seguida de incubación en dH2O.
En otra realización del método o métodos anteriores, el método puede comprender además una etapa de funcionalización de al menos algunos grupos funcionales hidroxilo libres del tejido vegetal o fúngico descelularizado mediante acilación, alquilación u otra modificación covalente. En determinadas realizaciones, los grupos funcionales hidroxilo del tejido vegetal o fúngico descelularizado pueden funcionalizarse con colágeno.
En otra realización del método o métodos anteriores, el método puede comprender además una etapa de procesamiento del tejido vegetal o fúngico descelularizado para introducir más arquitectura, y/o una etapa de funcionalización de al menos algunos grupos funcionales hidroxilo libres del tejido vegetal o fúngico descelularizado
mediante acilación, alquilación u otra modificación covalente. En determinadas realizaciones, el tejido vegetal o fúngico descelularizado puede procesarse para introducir microcanales, y/o los grupos funcionales hidroxilo del tejido vegetal o fúngico descelularizado pueden funcionalizarse con colágeno, un factor para promover la especificidad celular, un factor de crecimiento celular o un agente farmacéutico.
En otra realización del método o métodos anteriores, el método puede comprender además una etapa de introducción de células animales vivas en la estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina, y permitir que las células animales vivas se adhieran a la estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina. En ciertas realizaciones, las células animales vivas pueden ser células de mamífero. En ciertas realizaciones, las células animales vivas pueden ser células humanas.
En otra realización, se proporciona en el presente documento un biomaterial de andamiaje que comprende una planta descelularizada o tejido fúngico preparado por cualquiera de los métodos anteriores.
En otra realización, se proporcionan aquí los biomateriales de andamiaje anteriores para su uso como un andamio implantable para apoyar el crecimiento de células animales, para promover la regeneración de tejidos, para su uso como una promoción de la angiogénesis, para un procedimiento de sustitución de tejidos, o como un implante estructural para la cirugía estética.
En otra realización se proporcionan los anteriores biomateriales de andamiaje para su uso como implante estructural para la reparación o regeneración tras una lesión medular.
En otra realización, se incluyen en el presente documento cualquiera de los biomateriales de andamiaje anteriores para su uso como implante estructural para la cirugía de sustitución de tejidos y/o para la regeneración de tejidos tras la cirugía.
En otra realización, se proporciona en el presente documento un uno de cualquiera de los biomateriales de andamiaje anteriores para su uso como implante estructural para cirugía de injerto cutáneo y/o regeneración cutánea.
En otra realización, se proporciona en el presente documento uno de cualquiera de los biomateriales de andamiaje anteriores para su uso como implante estructural para la regeneración de la vasculatura sanguínea en un tejido o región objetivo.
En otra realización, se proporciona en el presente documento cualquiera de los biomateriales de andamiaje anteriores para su uso como material de sustitución ósea, relleno óseo o injerto óseo, y/o para promover la regeneración ósea. En otra realización, se proporciona en el presente documento cualquiera de los biomateriales de andamiaje anteriores para su uso como sustitución tisular de piel, hueso, médula espinal, corazón, músculo, nervio, vaso sanguíneo u otro tejido dañado o malformado.
En otra realización, se proporciona en el presente documento cualquiera de los biomateriales de andamiaje anteriores, en forma de hidrogel, para su uso como sustituto del humor vítreo.
En otra realización, se proporciona en el presente documento cualquiera de los biomateriales de andamiaje anteriores para su uso como una bursa artificial, en la que el biomaterial de andamiaje forma una estructura similar a un saco que contiene biomaterial de andamiaje en forma de hidrogel.
En otra realización, se proporciona en el presente documento uno de cualquiera de los biomateriales de andamiaje anteriores para su uso como implante estructural para cirugía estética.
En otra realización de cualquiera de los usos anteriores, el biomaterial de andamiaje puede ser un biomaterial de andamiaje para el que el tejido vegetal o fúngico descelularizado del biomaterial de andamiaje está configurado para imitar físicamente un tejido del sujeto y/o para promover funcionalmente un efecto de tejido diana en el sujeto.
En otra realización, se proporciona en el presente documento un andamio para su uso en un método para apoyar el crecimiento de células animales, para promover la regeneración de tejidos, para promover la angiogénesis, para la sustitución de un tejido, para promover la angiogénesis, o para proporcionar un andamio estructural en una cirugía estética, en un sujeto 5 que lo necesite, dicho método comprende:
proporcionar un biomaterial de andamiaje según cualquiera de los biomateriales de andamiaje descritos anteriormente; e
implantar el biomaterial del andamiaje en el sujeto.
En otra realización del método anterior, el biomaterial de andamiaje puede implantarse en la 10 médula espinal, y promueve la reparación o regeneración tras una lesión de la médula espinal.
En otra realización del método o métodos anteriores, el biomaterial de andamiaje puede proporcionar un implante estructural para la sustitución de tejidos y/o para la regeneración de tejidos en el sujeto.
En otra realización del método o métodos anteriores, el biomaterial de andamiaje puede proporcionar un implante estructural para el injerto de piel y/o la regeneración de la piel en el sujeto.
En otra realización del método o métodos anteriores, el biomaterial de andamiaje puede proporcionar un implante estructural para la regeneración de la vasculatura sanguínea en un tejido o región diana o en el sujeto. En otra realización del método o métodos anteriores, el biomaterial de andamiaje puede proporcionar un material de sustitución ósea, relleno óseo o injerto óseo, y/o puede promover la regeneración ósea en el sujeto.
En otra realización del método o métodos anteriores, el biomaterial de andamiaje puede proporcionar un reemplazo tisular para piel, hueso, médula espinal, corazón, músculo, nervio, vaso sanguíneo u otro tejido dañado o malformado en el sujeto.
En otra realización del método o métodos anteriores, el biomaterial de andamiaje, en forma de hidrogel, puede proporcionar un reemplazo del humor vítreo en el sujeto.
En otra realización del método o métodos anteriores, el biomaterial de andamiaje puede proporcionar una bursa artificial en el sujeto, en la que el biomaterial de andamiaje forma una estructura similar a un saco que contiene biomaterial de andamiaje en forma de hidrogel.
En otra realización del método o métodos anteriores, el biomaterial de andamiaje puede proporcionar un implante
estructural para cirugía estética.
En otra realización del método o métodos anteriores, el paso de proporcionar un biomaterial de andamiaje puede incluir, además:
seleccionar un biomaterial de andamiaje como el descrito anteriormente, para el cual el tejido vegetal o fúngico descelularizado del biomaterial de andamiaje está configurado para imitar físicamente un tejido 10 del sujeto y/o para promover funcionalmente un efecto tisular diana en el sujeto.
En otra realización, se proporciona aquí un kit que comprende un biomaterial de andamiaje como se ha descrito anteriormente y al menos uno de un contenedor o instrucciones para el uso descrito anteriormente. En otra realización, se proporciona aquí un kit que comprende un implante estéril dispensable que comprende un biomaterial de andamio como se ha definido anteriormente e instrucciones para el uso como se ha descrito anteriormente.
El kit es un kit quirúrgico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Estas y otras características se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que se hace referencia a las siguientes figuras:
FIGURA 1: Andamios de celulosa descelularizada. A) Imagen de contraste de fases (técnica de microscopía óptica) de la estructura de la pared celular de celulosa en una muestra de tejido de manzana descelularizada. Las líneas oscuras corresponden a distintas estructuras de celulosa que forman una matriz tridimensional. Las estructuras oscuras superpuestas resaltan la estructura porosa tridimensional del andamio descelularizado. B) Imagen SEM de un andamio de celulosa similar que revela su naturaleza tridimensional y sus grandes cavidades, destacando las distintas profundidades de las bolsas internas que componen el andamio. Barra de escala = 200 μm;
FIGURA 2: Variedad de estructuras y orígenes de los andamios de celulosa. Estos nuevos andamios se obtienen a partir de plantas (por ejemplo, manzana, espárragos, hinojo) y hongos (por ejemplo, champiñón blanco) mediante procesos de descelularización;
FIGURA 3: Implantación de andamios de manzana en un modelo de ratón (in vivo). Se implantaron dos andamios de celulosa (5x5x1mm) por vía subcutánea en la sección dorsal de ratones C57BL/10. A continuación, se resecaron cuidadosamente las pieles dorsales y se fijaron en solución de formol al 10% al cabo de una (A) y cuatro (B) semanas de las cirugías. Se realizaron análisis histológicos de los implantes mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&A) y se analizó cada implante. Al cabo de una semana puede observarse la infiltración celular, y la infiltración completa se alcanza al cabo de cuatro semanas con la presencia de vasos sanguíneos funcionales (angiogénesis);
FIGURA 4: Huella del andamio e infiltración celular y angiogénesis completas (in vivo). A) La alta porosidad del andamio derivado de manzana y la fina estructura de la pared (≤100 nm) pueden observarse fácilmente en esta imagen tomada en el centro del implante una semana después de la cirugía. B) Infiltración celular completa y angiogénesis con formación de vasos sanguíneos funcionales a las 4 semanas de la implantación. El andamiaje de celulosa es invisible y se necesita una tinción específica de celulosa para poder observarlo;
FIGURA 5: Imágenes fijadas y teñidas del citoesqueleto de actina de células cultivadas dentro del andamio de celulosa 3D e imágenes artísticas SEM. A) Las células NIH3T3, B) C2C12 y C) HeLa se cultivaron en los andamios de celulosa durante 2 semanas antes de la tinción para actina (verde) y núcleos celulares (azul). El citoesqueleto de actina y el núcleo de las células de mamífero, cultivadas sobre vidrio o dentro de los andamios, se tiñeron de acuerdo con protocolos anteriores (Guolla, Bertrand, Haase, & Pelling, 2012; Modulevsky, Tremblay, Gullekson, Bukoresthliev, & Pelling, 2012). Brevemente, las muestras se fijaron con paraformaldehído al 3,5% y se permeabilizaron con Tritón X-100 a 37°C. La actina se tiñó con faloidina conjugada con Alexa Fluor 488 (Invitrogen) y los núcleos se tiñeron marcando el ADN con DAPI (Invitrogen). A continuación, las muestras se montaron en Vecta- shield (Vector Labs). Las células NIH3T3 y C2C12 muestran las fibras de tensión de actina características de las células cultivadas. Las células HeLa también muestran estructuras de actina características que incluyen menos fibras de estrés prominentes y una gran cantidad de localización de actina cortical. La presencia de fibras de estrés demuestra que las células de mamífero están adheridas a la superficie del andamiaje de la pared celular y están presentes como in vivo.
Barra de escala = 25 μm y se aplica a todas. D) y E) son imágenes SEM con tratamiento artístico de coloración celular para resaltar la adhesión celular al andamio de celulosa;
FIGURA 6: Arquitecturas de pared celular encontradas en los reinos vegetal y fúngico. Estos ejemplos de andamios de celulosa se resecaron de animales 4 semanas después de su implantación y se tiñeron con una tinción de hematoxilina/eosina. Esta FIGURA muestra las arquitecturas de la pared celular y su relación con la función tisular, lo que puede orientar la elección de biomateriales. Las arquitecturas de la pared celular que se encuentran en los reinos vegetal y fúngico presentan una amplia variedad de estructuras que pueden ser similares a tejidos como el hueso, la piel y los nervios. Dependiendo del tejido objetivo, la determinación de la fuente vegetal del biomaterial puede basarse en las características físicas y químicas de la planta;
FIGURA 7: Ejemplos de resultados histológicos que muestran la infiltración celular tras 1, 4 y 8 semanas después de
la implantación (tinción con hematoxilina/eosina);
FIGURA 8: A) Deposición de colágeno (azul) en el interior del biomaterial de celulosa (blanco) y observación de vasos sanguíneos (las células rojas son hematíes). B) Gráfico que muestra una representación cuantitativa de la propiedad proangiogénica del andamio (observación de vasos sanguíneos funcionales a las 4 semanas de la implantación);
FIGURA 9: Característica no reabsorbible del andamio de celulosa en función del tiempo post-implantación;
FIGURA 10: Mejora de la fijación y proliferación celular mediante el uso de lavados con cloruro cálcico;
FIGURA 11: Preparación del andamio de celulosa. Aspecto macroscópico de un tejido de hipanto de manzana recién cortado (A) y el biomaterial de andamio de celulosa translúcido después de la descelularización y ausente de todas las células nativas de la manzana o restos celulares (B). Tinción de H&E de un corte transversal del andamio de celulosa descelularizado (C). Se muestra el grosor de las paredes celulares y la ausencia de células de manzana nativas tras la descelularización. La arquitectura 3D acelular y altamente porosa del andamio de celulosa se revela claramente mediante microscopía electrónica de barrido (D). Barra de escala: A-B = 2 mm, C-D = 100 μm;
FIGURA 12: Implantación y resección de andamios de celulosa. Los implantes subcutáneos del biomaterial de andamiaje de celulosa se realizaron en la región dorsal de un modelo de ratón C57BL/10ScSnJ mediante pequeñas incisiones en la piel (8 mm) (A). Se midió cada implante antes de su implantación para comparar el área del andamio (B). Los andamiajes de celulosa se resecaron a la semana (D), 4 semanas (E) 5 y 8 semanas (F) después de las cirugías y se tomaron fotografías macroscópicas (piel de control en C). Se presentan los cambios en la superficie del andamio de celulosa a lo largo del tiempo (G). El andamiaje previo a la implantación tenía una superficie de 26,30±1,98 mm2. Tras la implantación, el área del andamio disminuyó a 20,74±1,80 mm2 después de 1 semana, 16,41±2,44 mm2 después de 4 semanas y 13,82±3,88 mm2 después de 8 semanas. La superficie del andamio de celulosa presenta una disminución significativa de unos 10 12 mm2 (48%) tras 8 semanas de implantación (* = P≤0,001; n= 12-14);
FIGURA 13: Biocompatibilidad e infiltración celular. Cortes transversales de andamios de celulosa representativos teñidos con H&E y anti-CD45. Estas vistas globales muestran la reacción aguda moderada-severa anticipada a cuerpo extraño a la semana (A), los procesos inmunitarios crónicos leves y de limpieza subsiguientes a las 4 semanas (B) y, por último, el andamiaje de celulosa asimilado al tejido nativo del ratón a las 8 semanas (C). Una mayor magnificación de las regiones de interés (D-F) permite observar toda la población de tipos celulares dentro de los procesos de asimilación del biomaterial. A la semana 1, se observan poblaciones de granulocitos, específicamente; polimorfonucleares (PMN) y eosinófilos que caracterizan la respuesta inmune aguda modérate a severa, una reacción normal a los procedimientos de implantación (D). A las 4 semanas, se observa una disminución de la respuesta inmunitaria (respuesta inmunitaria de leve a 20 baja) y la población de células dentro de la epidermis que rodea los andamios contiene ahora niveles más altos de monocitos y linfocitos que caracterizan la respuesta crónica (E). Por último, a las 8 semanas, la respuesta inmunitaria se ha reabsorbido por completo y el tejido de la epidermis parece ahora normal. La respuesta inmunitaria observada con la tinción de H&E se confirma utilizando el anticuerpo anti CD45, conocidos marcadores de leucocitos (G-I). La población de células dentro del andamio es ahora principalmente de macrófagos, células multinucleadas y fibroblastos activos. Barras de escala: A- C = 1 mm, D-F = 100 μm y G-I = 500 μm;
FIGURA 14: Deposición de matriz extracelular. Secciones transversales de andamios de celulosa representativos teñidos con tricrómico de Masson (A-C). Después de 1 semana post-implantación, la magnificación de la región de interés en (A) muestra la falta de estructuras de colágeno dentro del andamio de colágeno (D, G). A medida que las células fibroblásticas comienzan a invadir el andamiaje, pueden observarse escasos depósitos de colágeno en el interior del andamiaje de celulosa al cabo de 4 semanas (E, H). Concomitantemente con la observación de fibroblastos activados (células fusiformes) en el interior del andamio de celulosa, la red de colágeno es claramente visible en el interior de las cavidades después de 8 semanas (F, I). Barras de escala: A-C = 1 mm, D-F = 100 μm y G-I = 20 μm. * 5 = fibras de colágeno; flechas negras = pared celular de celulosa; flecha blanca = fibroblasto;
FIGURA 15: Vascularización y angiogénesis. Observaciones macroscópicas de vasos sanguíneos directamente en los tejidos circundantes alrededor del andamio de celulosa (A). Confirmación de la angiogénesis dentro del andamio de celulosa mediante la observación de múltiples secciones transversales de vasos sanguíneos en micrografías con tinción de H&E (B) y tinción con tricrómico de Masson (C). El proceso de angiogénesis también se confirmó con tinción anti-CD31 para identificar células endoteliales dentro del andamio de celulosa (D). Barras de escala: A = l mm, B = 50 μm y C-D = 20 μm. Flechas blancas = vasos sanguíneos;
FIGURA 16: Células NIH3T3, C2C12 y HeLa fijadas y teñidas cultivadas en andamiajes de celulosa 3D nativos. Tinción fluorescente específica de (A) células de mamífero NIH3T3, (B) C2C12 y (C) HeLa dentro de los andamiajes de celulosa nativa no modificada. Las células de mamífero y la pared celular de celulosa nativa se tiñeron con tintes fluorescentes específicos que revelaban la estructura de celulosa (rojo), las membranas celulares de mamífero (verde) y los núcleos (azul). Las células se cultivaron dentro de los andamios de celulosa descelularizados durante cuatro semanas antes de la tinción y la obtención de imágenes. Para teñir simultáneamente el armazón de celulosa y las
células de mamífero, primero fijamos las muestras como se ha descrito anteriormente y después lavamos las muestras cultivadas durante 4 semanas con PBS 3 veces. Para etiquetar la pared celular, se empleó un protocolo establecido (Truernit & Haseloff, 2008). Las muestras se enjuagaron con agua y se incubaron en ácido periódico al 1% (Sigma-Aldrich) a temperatura ambiente durante 40 minutos. El tejido se enjuagó de nuevo con agua y se incubó en reactivo de Schiff (100 mM de metabisulfito sódico y 0,15 N de HCl) con 100 mg/mL de yoduro de propidio (Invitrogen) durante 2 horas. A continuación, las muestras se lavaron con PBS. Para visualizar las células de mamífero dentro del tejido vegetal, las muestras se incubaron con una solución de 5 mg/mL de aglutinina de germen de trigo (WGA) 488 (Invitrogen) y 1 mg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen) en HBSS (20 mM de HEPES a pH 7,4; 120 mM de NaCl; 5,3 mM de KCl; 0,8 mM de MgS04; 1,8 mM de CaCb; y 11,1 mM de dextrosa). La WGA y el Hoechst 33342 son colorantes de células vivas que marcan la membrana y el núcleo de células de mamíferos, respectivamente. A continuación, los andamios de pared celular se transfirieron a portaobjetos de microscopio y se montaron en una solución de hidrato de cloral (4 g de hidrato de cloral, 1 mL de glicerol y 2 mL de agua). Los portaobjetos se mantuvieron durante toda la noche a temperatura ambiente en un entorno cerrado para evitar la deshidratación. A continuación, las muestras se colocaron en PBS hasta que estuvieron listas para la obtención de imágenes. Es evidente que las células de mamífero están distribuidas por toda la superficie del biomaterial. Concretamente, se observa que las células de mamífero crecen en colonias dentro de las cavidades de la pared celular. La vista ortogonal (ZY plañe) muestra la profundidad de penetración de las células de mamífero dentro del biomaterial. El verde (membrana celular) y el azul (núcleos) se ven en profundidad dentro del biomaterial y se observan hasta la profundidad de penetración de la imagen del microscopio. Los volúmenes confocales se adquirieron y proyectaron en las planas XY y ZY. Las vistas ortogonales ZY demuestran la profundidad de la proliferación celular dentro del andamio de celulosa. Se indican las superficies superior e inferior del andamio. Barras de escala: XY = 300 mm, ZY = 100 mm. En D) se seccionó el biomaterial para revelar la estructura interna del biomaterial más allá de las restricciones de profundidad de imagen penetrante del microscopio confocal. Imagen SEM de la sección transversal de un andamio de celulosa tras ser sembrado con células C2C12 que se dejaron proliferar durante cuatro semanas. Las células se colorearon digitalmente para aumentar el contraste entre las células y la estructura de celulosa (barra de escala: 50 mm). Las secciones intemales se visualizaron con SEM y revelan células de mamífero en todo el biomaterial y no sólo en la superficie. Los andamiajes que contenían células de mamífero se fijaron primero con paraformaldehído al 3,5%, como se ha presentado anteriormente, y después se lavaron suavemente en repetidas ocasiones con PBS. A continuación, las muestras se deshidrataron mediante gradientes sucesivos de etanol (50%, 70%, 95% y 100%) y se secaron en un liofilizador. A continuación, las muestras se recubrieron de oro a una corriente de 15 mA durante 3 minutos con un dispositivo de pulverización iónica Hitachi E-1010. Las imágenes de SEM se obtuvieron con voltajes de 2,00-10,0 kV en un SEM JEOL JSM-7500F FE;
FIGURA 17: Proliferación celular y viabilidad a lo largo del tiempo. A) Las células NIH3T3, C2C12 y HeLa se cultivaron individualmente en andamios de celulosa n = 3 durante 1, 8 y 12 semanas y luego se tomaron imágenes con microscopía confocal tras teñirlas con Hoechst 33342. Las células se cuantificaron en cada punto temporal utilizando el software de acceso abierto ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Se observa un aumento de la población celular en los tres tipos de células. Cabe señalar que el aumento del número de células sólo puede deberse a la proliferación, ya que los andamiajes sólo se sembraron con el tipo celular respectivo al principio del experimento. B) Tras 12 semanas de cultivo, se fijaron las células C2C12 y se tiñeron con Hoechst 33342 (azul: células viables) y yoduro de propidio (PI) (rojo: células apoptóticas/necróticas). Se adquirieron volúmenes confocales y se proyectaron en la plañe XY y ZY y revelan que las células han proliferado en toda la estructura durante las 12 semanas de cultivo. Las células apoptóticas/necróticas se encuentran en las regiones más profundas del andamio. Se indican las 5 superficies superior e inferior del andamio. Se contó el número de células vivas (Hoechst (+)) y muertas (Hoechst/PI (+)) y se observó que el 98% de las células del andamio eran viables. Los datos se muestran para las células C2C12, pero son similares para las células NIH3T3 y HeLa (datos no mostrados). Barra de escala: B = 200 mm para XY y 100 mm para ZY;
FIGURA 18: Optimización de CaCb. Imágenes de contraste de fases: A, C, E, G, I, K, M, O. Imágenes de fluorescencia Hoechst 10 (tinción nuclear): B, D, F, H, J, L, N, P. Sin CaCb: A-D, 10 mM CaCb: E-H, 100 mM CaCb: I-L, 1000 mM CaCb: M-P. Sin células: A, B, E, F, I, J, M, N. Células (mioblastos C2C12): C, D, G, H, K, L, O, P. El crecimiento celular mejoró a partir de 100 mM CaCb. Las manchas oscuras en la celulosa en las muestras de 100 mM y 1000 mM CaCb se estrellaron contra la sal, como lo demuestra la diferente localización de los núcleos en las imágenes de fluorescencia, y su presencia en ausencia de células. Las células se cultivaron en los andamios antes de la obtención de imágenes. Barra de escala: 200 μm. Esta FIGURA muestra el contraste de fases (A, C, E, G, I, K, M, O) y la tinción de fluorescencia Hoechst (B, D, F, H, J, L, N, P) del andamio descelularizado sin células cultivadas y sin CaCb (A, B); de mioblastos C2C12 cultivados dentro del andamio sin CaCb (C, D); del andamio tratado con 10 mM de CaCb (E, F); de mioblastos C2C12 cultivados dentro del andamio 20 tratado con 10 mM CaCb (G, H); del andamio tratado con 100 mM CaCb (I, J); de mioblastos C2C12 cultivados dentro del andamio tratado con 100 mM CaCb (K, L); del andamio tratado con 1000 mM CaCb (M, N); y de mioblastos C2C12 cultivados dentro del andamio tratado con 1000 mM CaCb (O, P);
FIGURA 19: Eliminación de residuos salinos. Se utilizó CaCb 100 mM para eliminar el SDS residual del andamio de celulosa. (A) CaCb sal/SDS micelas se estrelló en la superficie del biomaterial; imagen de contraste de fase. (B) El residuo de sal se eliminó eficazmente con la incubación con dH2O. Cabe señalar que el tratamiento con sonicatión, la incubación con ácido acético y la incubación con DMSO dan el mismo resultado (véase la FIGURA 20). Barra de escala = 200 μm;
FIGURA 20: Crecimiento celular tras la eliminación de la sal. Las células crecieron bien en cada uno de los tratamientos de eliminación de sal. incubación dH2O: A, B; dH2O y sonicación: C, D; incubación con ácido acético: E, F; e incubación con DMSO: G, H. Las imágenes de contraste de fase (A, C, E, G) muestran que el andamiaje está libre de residuos salinos. Las imágenes de fluorescencia Hoechst (tinción nuclear) (B, D, F, H) muestran un crecimiento celular sustancial tras 2 días de cultivo. Escala: 200 pines. Esta FIGURA muestra el contraste de fases (A, C, E, G) 5 y la tinción de fluorescencia Hoechst (B, D, F, H) de los andamios de manzana descelularizados con crecimiento de células C2C12 durante 2 días en cultivo lavado con diferentes sales. En A y B, los andamios se incubaron con dH2O. En C y D, los andamiajes se incubaron con dH2O y sonicación. En E y F, los andamiajes se incubaron con ácido acético. En G y H, los andamiajes se incubaron con DMSO;
FIGURA 21: Se pueden utilizar diversas sales para eliminar el SDS residual. Se pueden utilizar diferentes compuestos salinos para realizar la misma tarea de eliminar el SDS residual del biomaterial. Se utilizaron PBS, KCl, CaCb y MgCl2 (todos 100 mM) como lavado salino para limpiar el biomaterial. Los núcleos de C2C12 se tiñeron con Hoechst en las manzanas descelularizadas lavadas con las diferentes sales. Cada tratamiento salino permitió el crecimiento celular; sin embargo, las sales con cationes divalentes (CaCb y MgCb) promovieron un mayor crecimiento celular. Esta FIGURA muestra imágenes histológicas de núcleos de C2C12 (crecimiento de 2 días) teñidos con Hoechst en andamios de manzana descelularizados, lavados con 100 mM de PBS, KCl, CaCb, MgCb, CuSO4, KH2P04, MgS04, Na2C03 e ibuprofeno sódico. Pueden utilizarse diferentes compuestos salinos para llevar a cabo la tarea de eliminar el SDS residual del biomaterial. Se utilizaron PBS, KCl, CaCb, MgCb, CuSO4, KH2P04, MgS04, Na2C03 e ibuprofeno sódico (todos 100 mM) como lavado salino para limpiar el biomaterial y eliminar el SDS residual. Cada tratamiento salino mostrado en esta FIGURA permitió el crecimiento celular; sin embargo, las sales con cationes divalentes (CaCb y MgCb), así como el grupo aniónico carbonato, promovieron un mayor crecimiento celular;
FIGURA 22: Se muestra la tinción de la pared secundaria del andamio de manzana y del andamio de espárragos. Se pueden aprovechar diferentes elementos de la pared celular para el biomaterial. Los grupos cinamaldehído de la lignina se tiñeron (púrpura claro) con la tinción de Wiesner. La pectina y la lignina se tiñeron con azul de toluidina O. La celulosa y los P-(l-4)-glucanos se tiñeron con rojo Congo;
FIGURA 23: En el presente documento se muestra que la celulosa nativa puede soportar células de mamífero, incluidos mioblastos C2C12, fibroblastos 3T3 y células epiteliales humanas HeLa. Sin embargo, un biomaterial funcional debe poder ajustarse química y mecánicamente para adaptarse al uso previsto. En estos experimentos se utilizaron dos técnicas diferentes para modificar la rigidez del andamio de celulosa descelularizado. Además, las imágenes de contraste de fase demuestran que los biomateriales siguen soportando el cultivo de células de mamífero tras la modificación química y física. A) Elasticidad mecánica local del tejido nativo, los andamios de celulosa descelularizados (SDS), funcionalizados con colágeno (SDS+Coll) y reticulados con glutaraldehído (SDS+GA). El tejido nativo y los andamiajes no modificados no muestran diferencias significativas en sus propiedades mecánicas. Tanto los andamios funcionalizados con colágeno como los reticulados químicamente mostraron un aumento significativo de la elasticidad en comparación con los andamios DMEM (*** = p≤0,001). Los andamios (B) descelularizados (SDS), (C) funcionalizados con colágeno (SDS+Coll) y (D) reticulados con glutaraldehído (SDS+GA) soportaron el crecimiento de células C2C12. Barra de escala = 200 mm;
FIGURA 24: Técnicas de moldeo inverso. Las construcciones de anillos de celulosa del andamio de manzana descelularizado se cortaron utilizando punzones de biopsia. Se cultivaron células mioblásticas C2C12 en los andamios durante 2 semanas. Las células invadieron completamente el biomaterial. Los anillos también se utilizaron en combinación con moldeado inverso temporal utilizando gelatina (B), y moldeado inverso permanente utilizando colágeno (C). En ambos casos se produjo un crecimiento celular comparable al del andamiaje de celulosa desnuda (A). Los núcleos de C2C12 se tiñeron con Hoechst (azul), las membranas celulares de C2C12 se tiñeron con WGA (verde) y la celulosa se tiñó con reactivo de Schiff y yoduro de propidio (rojo). Barra de escala = 1000 μm. La primera columna muestra núcleos de C2C12 teñidos con Hoechst. La segunda columna muestra membranas de células C2C12 teñidas con WGA utilizado en combinación con moldeo inverso temporal utilizando gelatina. La tercera columna muestra celulosas de células C2C12 cultivadas teñidas con reactivo de Schiff y yoduro de propidio utilizadas en combinación con moldeo inverso permanente utilizando colágeno. La cuarta columna muestra una fusión de las imágenes de cada una de las filas A, B y C;
FIGURA 25: Crecimiento celular y moldeado inverso. Imágenes confocales de células C2C12 sobre el biomaterial nativo (A), el biomaterial moldeado inversamente de forma temporal utilizando gelatina (B) y el biomaterial moldeado inversamente de forma permanente utilizando colágeno (C). Se muestran las proyecciones xy y zy max. Las tres condiciones diferentes dan el mismo resultado: invasión completa y alta proliferación. La celulosa se tiñó con reactivo de Schiff con yoduro de propidio (rojo), y los núcleos celulares con Hoechst (azul). Escala: 200 μm;
FIGURA 26: Invasión y proliferación celular y técnicas de moldeo inverso. La proliferación celular se estimó calculando el área nuclear total para cada técnica de moldeado (el control es la celulosa nativa) (A). No hubo diferencias significativas entre las muestras de celulosa nativa, las moldeadas con gelatina y las moldeadas con colágeno. La invasión celular se estimó utilizando la relación del área nuclear superior: inferior (B). No hubo diferencias significativas entre las tres condiciones. En consecuencia, el moldeado inverso no alteró la invasión ni la proliferación celular en
estas condiciones experimentales;
FIGURA 27: Se creó una microarquitectura artificial en andamios de celulosa derivados de la manzana. Se crearon dos microarquitecturas diferentes dentro de los andamios de celulosa descelularizados para demostrar la viabilidad de crear diferentes microarquitecturas con el biomaterial para fines específicos, como aumentar la migración de células huésped en el andamio de celulosa. En A) se utilizó un punzón de biopsia de 1 mm para crear cinco espacios cilíndricos negativos dentro de un andamio de celulosa derivada de manzana como primer ejemplo de microarquitectura artificial. Por el contrario, en B) se utilizó un punzón de biopsia de 3 mm para crear un único espacio negativo centrado. Sólo después de 4 semanas de implantación pudo observarse una mayor formación de vasos sanguíneos procedentes directamente de los espacios negativos derivados artificialmente (C y D), tanto en los ejemplos de 1 mm como en los de 3 mm. En C) los vasos sanguíneos se encuentran en cada una de las cuatro esquinas del biomaterial, lo que sugiere el aumento de la vascularización dentro del espacio negativo artificial derivado. Del mismo modo, en D) los vasos sanguíneos se pueden observar en la parte superior del andamio de celulosa lo que sugiere que los vasos sanguíneos viajaron a través del andamio de celulosa. Cortes transversales de andamios de celulosa representativos teñidos con hemotoxilina y eosina (H&E) (E-F);
FIGURA 28: Muestra imágenes de andamios de celulosa de diversas fuentes, su resección e histología tras 4 y 8 semanas, según se indica. Varios andamios de celulosa derivados de plantas se implantaron subcutáneamente en ratones para evaluar la biocompatibilidad a las 4 y 8 semanas. Se implantaron tejidos selectivos de diversas plantas durante un periodo de 4 u 8 semanas para demostrar la biocompatibilidad de la celulosa derivada de plantas y la arquitectura de la planta en la migración de células huésped in vivo. En todos los ejemplos se observó migración y proliferación celular en el andamiaje de celulosa, lo que pone de manifiesto la biocompatibilidad de los andamiajes de celulosa de origen vegetal en estos experimentos. Las implantaciones subcutáneas de los biomateriales de andamiaje de celulosa se realizaron en la región dorsal de un modelo de ratón C57BL/10ScSnJ mediante pequeñas incisiones en la piel (8 mm). Se midió cada implante antes de su implantación para comparar el área del andamio (primera columna: andamio de celulosa). Los injertos de celulosa se resecaron (segunda columna: Resección) a las 4 u 8 semanas, según se indicó. Se cortaron secciones seriadas de 5 ppm de grosor, comenzando a 1 mm dentro del andamio de celulosa, y se tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E) (tercera columna: Histología). Para la evaluación de la infiltración celular, se capturaron micrografías utilizando Zeiss MIRAX MIDI Slide Scanner (Zeiss, Toronto, Canada) equipado con objetivo 40x y se analizaron utilizando Pannoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Budapest, Hungría) y el software ImageJ;
FIGURA 29: Implantación y resección de andamios de celulosa. Las implantaciones subcutáneas del biomaterial de andamios de celulosa se realizaron en la región dorsal de un modelo de ratón C57BL/10ScSnJ mediante pequeñas incisiones en la piel (8 mm) (A). Se midió cada implante antes de su implantación para comparar el área del andamio (B). Los andamios de celulosa se resecaron a la semana (D), a las 4 semanas (E) y a las 8 semanas (F) después de las cirugías y se tomaron fotografías macroscópicas (piel de control en C). A las 15 semanas, los vasos sanguíneos están claramente integrados en el implante de celulosa, lo que demuestra su biocompatibilidad. Tampoco hay inflamación aguda o crónica en el tejido que rodea el implante. Se presentan los cambios en la superficie del andamio de celulosa a lo largo del tiempo (G). El andamio antes de la implantación tenía una superficie de 26,30±1,98 mm2. Tras la implantación, el área del andamio disminuyó a 20,74±1,80 mm2 después de 1 semana, 16,41±2,44 mm2 después de 4 semanas y 13,8220 ±3,88 mm2 después de 8 semanas. La superficie del andamio de celulosa presenta una disminución significativa de unos 12 mm2 (48%) tras 8 semanas de implantación (* = P≤0,001; n = 12-14);
FIGURA 30: Biocompatibilidad e infiltración celular. Secciones transversales de andamios de celulosa representativos teñidos con H&E y anti-CD45. Estas vistas globales muestran la reacción aguda moderada-severa anticipada a cuerpo extraño a la semana (A), los procesos inmunitarios crónicos leves y de limpieza posterior a las 4 semanas (B) y, por último, el andamio de celulosa asimilado al tejido nativo del ratón a las 8 semanas (C). Las regiones de interés a mayor aumento (D-F), véase el recuadro (A-C), permiten observar la población de tipos celulares dentro de los procesos de asimilación del biomaterial. A la semana 1, podemos observar poblaciones de granulocitos, concretamente; polimorfonucleares (PMN) y eosinófilos que caracterizan la respuesta inmune aguda de modérate a severa, una reacción normal a los procedimientos de implantación (D). A las 4 semanas, puede observarse una disminución de la respuesta inmunitaria (respuesta inmunitaria de leve a baja) y la población de células dentro de la epidermis que rodea los andamios contiene ahora niveles más altos de monocitos y linfocitos que caracterizan la respuesta crónica (E). Por último, a las 8 semanas, la respuesta inmunitaria se ha reabsorbido por completo y el tejido de la epidermis parece ahora normal (F). La respuesta inmunitaria observada con la tinción de H&E se confirma utilizando el anticuerpo anti-CD45, un conocido marcador de leucocitos (G-I). La población de células dentro del andamio son ahora principalmente macrófagos, células multinucleadas y fibroblastos activos. Barras de escala: A- C = 1 mm, D-F = 100 μm y G-I = 500 μm;
FIGURA 31: Deposición de matriz extracelular. Secciones transversales de andamios de celulosa representativos 10 teñidas con tricrómico de Masson (A-C). Después de 1 semana post-implantación, la magnificación de la región de interés en (A), ver recuadro, muestra la falta de estructuras de colágeno dentro del andamio de colágeno (D, G). A medida que las células fibroblásticas comienzan a invadir el andamiaje, pueden observarse escasos depósitos de colágeno en el interior del andamiaje de celulosa al cabo de 4 semanas (E, H). Concomitantemente con la observación de fibroblastos activados (células en forma de huso) en el interior del andamio de celulosa, la red de colágeno es
claramente visible en el interior de las cavidades después de 8 semanas (F, I). Barras de escala: A-C = 1 mm, D-F = 100 |jm y G-I = 20 jm . * = fibras de colágeno; flechas negras = pared celular de celulosa; flecha blanca = fibroblasto;
FIGURA 32: Vascularización y angiogénesis. Observaciones macroscópicas de vasos sanguíneos directamente en los tejidos circundantes alrededor del andamio de celulosa (A). Confirmación de 20 angiogénesis dentro del andamio de celulosa mediante la observación de múltiples secciones transversales de vasos sanguíneos en micrografías con tinción de H&E (B) y tinción con tricrómico de Masson (C). El proceso de angiogénesis también se confirmó con tinción anti-CD31 para identificar células endoteliales dentro del andamio de celulosa (D). Barras de escala: A = 1 mm, B = 50 jm y C-D = 20 jm . Flechas blancas = vasos sanguíneos;
FIGURA 33: A) Imagen confocal de 2 fotones de estructuras del xilema (*) en espárragos descelularizados (barra = O.l mm), la tinción específica de celulosa (rojo) se utiliza para observar la estructura fina dentro de la planta. B) Imagen de contraste de fase de un único microcanal xilemático continuo (*) en el xilema de la planta (barra = 0,1 mm). C) Imagen SEM de un microcanal de xilema fracturado por congelación (barra = 20 jm ). D) Vista general de un tapón vegetal descelularizado listo para su implantación;
FIGURA 34: A) Neuronas primarias (teñidas de verde con colorante de membrana celular) creciendo a lo largo de las paredes de los microcanales del xilema en un andamio vegetal descelularizado in vitro. Esta imagen de corte transversal (2 jm de grosor) se obtuvo a l mm de profundidad dentro de un tapón de 3mm de longitud (barra = 0,1 mm). B) Tinción de H&E de un andamio vegetal descelularizado implantado subcutáneamente después de 4 semanas (barra = l mm). Recuadro: Sección transversal de los microcanales del xilema (barra = 0,2 mm). C) Vista macroscópica de un injerto vegetal descelularizado de 3 mm (flecha) implantado en la médula espinal;
FIGURA 35: A) Vistas axiales de RM (i) superior y (iii) inferior al (ii) injerto (flecha). La laminectomía en (ii) T8/9 provoca la pérdida de las raíces nerviosas visibles en (i) y (iii). B) Al cabo de 8 semanas, se extraen la médula espinal y el cerebro. El injerto (flecha) parece bien integrado 10 sin signos de infección, calcificación o fibrosis. C) La recuperación locomotora 8 semanas después de la implantación se mostró en (i-iii) paso coordinado y soporte de peso en una cinta rodante (mostrado) y en una arena BBB fíat. D) Puntuaciones BBB para ratas de control (rojo, n=4) y ratas con injerto (azul, n=7) en una arena BBB fíat. E) tinción revelan nervios mielinizados de la médula espinal (se), creciendo en los microcanales del biomaterial (bm) (barra = 200 jm ). La interfaz se indica con una línea de puntos;
FIGURA 36: Vista global de todo el injerto de médula espinal implantado en la región T8-T9 de la columna vertebral. El tejido está teñido con H&E-LFB que muestra los núcleos de color púrpura oscuro y el tejido mielinizado de color azul claro. Es importante destacar que se pueden ver microcanales que abarcan toda la longitud del injerto infiltrados con ambas células huésped;
FIGURA 37: Se tiñeron secciones ventrales del sitio de transección circundante (arriba-craneal; abajo-caudal) tanto en las ratas de control como en las implantadas con injerto espinal y se tiñeron para el marcador de filamento neural (NF200 Verde) y núcleos (Hoechst Azul). En A) la zona oscura representa la ubicación del biomaterial. Es interesante observar que alrededor del injerto espinal se extienden filamentos verdes en dirección ventral (flechas rojas). Estos filamentos representan neuronas maduras dentro del sitio transectado de la rata después de 12 semanas in vivo. Por el contrario, en el control B) no pueden observarse neurofilamentos organizados, lo que indica una falta de filamentos maduros en la zona de transección de control. Además, la tinción Hoechst revela un número significativamente mayor de núcleos, y como tales células, que rodean el injerto espinal en el lugar de la transección en comparación con el control;
FIGURA 38: El tejido del hipanto de manzana se descelularizó y procesó para injertos de piel. A los ratones C57BL/10ScSnJ se les afeitó la piel dorsal y se les preparó quirúrgicamente. (A) Se suturaron almohadillas de goma de 10 mm de diámetro exterior en la piel dorsal para evitar que se cerrara la herida. (B) Se colocó un tejido descelularizado de 5 mm de diámetro de hipanto de manzana en el centro de la almohadilla de goma y se cubrió con un adhesivo semipermeable. (C) Se tomaron fotografías al cabo de 4 días para medir el grado de infiltradón de células huésped durante el proceso de cicatrización de la herida;
FIGURA 39: Andamios de celulosa de origen vegetal para injertos óseos. Cada implante cilíndrico (5 mm de diámetro, 1 mm de grosor) se midió antes de la implantación para comparar la superficie del andamiaje (A). Los implantes de andamiaje de celulosa se implantaron en los defectos craneales de las ratas y se posicionaron para que permanecieran 10 dentro del defecto craneal. A continuación, se colocó la piel sobre el injerto y se suturó para mantener el andamiaje en su sitio. (B) El andamiaje y los tejidos óseos circundantes se aislaron 4 semanas después de la implantación y se tomaron imágenes macroscópicas (C). A continuación, el tejido aislado se descalcificó y se procesó/incrustó en parafina. Se cortaron secciones seriadas de 5 pins de grosor, comenzando en 1 mm dentro del andamio de celulosa, y se tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E) (D). Para la evaluación de la regeneración ósea, se capturaron micrografías con el escáner de diapositivas Zeiss MIRAX MIDI (Zeiss, Toronto, Canada) equipado con un objetivo de 40 aumentos y se analizaron con Pannoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Budapest, Hungría) y el software ImageJ;
FIGURA 40: Diferentes formulaciones de celulosa, propiedades físicas y funcionalización. La celulosa puede utilizarse como bloque (A) con diferentes formas o deshidratada y molida en forma de polvo que puede rehidratarse hasta
alcanzar la consistencia deseada para producir un gel (C, D) o una pasta (E, F). Si la celulosa contiene carboximetilcelulosa, puede reticularse fácilmente con ácido cítrico y calor (B). La celulosa procedente de diferentes plantas también puede combinarse, mezclarse, reticularse, etc.; y
FIGURA 41: Esta FIGURA muestra (A) un gráfico que muestra la tasa de supervivencia de ratones (n=190) y ratas (n=12) tras la implantación del biomaterial (de diversas fuentes) a la semana, 4 semanas y 8 semanas post implantación. (B) Este gráfico muestra la tasa de rechazo del biomaterial en estos mismos puntos temporales que en (A).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En el presente documento se describen biomateriales de andamiaje que comprenden un tejido vegetal o fúngico descelularizado del que se eliminan los materiales celulares y los ácidos nucleicos del tejido, el tejido vegetal o fúngico descelularizado que comprende una estructura porosa a base de celulosa o quitina. También se proporcionan métodos para preparar tales biomateriales de andamiaje, así como usos de los mismos como andamiaje implantable para apoyar el crecimiento de células animales, para promover la regeneración tisular, para promover la angiogénesis, para un procedimiento de sustitución tisular, para promover la angiogénesis, y/o como implante estructural para cirugía cosmética. Se describen adicionalmente métodos de tratamiento terapéutico y/o cosmético que emplean dichos andamiajes, así como otras aplicaciones que pueden incluir aplicaciones veterinarias, por ejemplo. Se apreciará que las realizaciones y los ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos destinados a los expertos en la materia, y no pretenden ser limitativos en modo alguno.
En ciertas realizaciones, se describen en el presente documento biomateriales que pueden tener aplicaciones en investigación biomédica de laboratorio y/o medicina regenerativa clínica, por ejemplo. Tales biomateriales pueden ser eficaces como andamios que pueden utilizarse como herramientas de investigación para investigadores biomédicos industriales/académicos, para implantes biomédicos, en dispositivos de detección y vehículos de administración farmacéutica, y/o en otras aplicaciones adecuadas en las que pueden utilizarse andamios.
En ciertas realizaciones, los biomateriales descritos en el presente documento pueden derivarse de arquitecturas de pared celular que se encuentran en los reinos vegetal y fúngico para crear andamiajes 3D complejos que pueden promover la infiltración celular, el crecimiento celular, la angiogénesis, la reparación de tejidos y/o la reconstrucción de tejidos, etc. (véase, por ejemplo, la FIGURA 1). Como se comprenderá, los biomateriales aquí descritos pueden producirse a partir de cualquier parte adecuada de organismos vegetales o fúngicos, incluyendo, por ejemplo, semilla, raíz, corteza, hoja, tallo, fruto, pulpa, núcleo, y pueden, en ciertas realizaciones, producirse con diferentes formas (tales como láminas, vasos, bloques, canulación, orificios de aireación, etc.) o formulaciones (incluyendo, por ejemplo, pastas, partículas, bloques, etc.) (véase, por ejemplo, la FIGURA 2). Los biomateriales pueden comprender, por ejemplo, sustancias como celulosa, quitina y/o cualquier otro bioquímico/biopolímero adecuado que se encuentre de forma natural en estos organismos.
En ciertas realizaciones, los andamiajes resultantes también pueden ser: modificados químicamente para introducir química superficial personalizada; cortados como bloques sólidos, pastas inyectables/extrudibles y/o lechadas; y/o pueden ofrecer una gama de posibilidades arquitectónicas en la escala de micrómetros a centímetros, que pueden sustituir/imitar varios tipos de entornos de tejidos vivos.
Como se describe en el presente documento, el uso de dicho biomaterial derivado de plantas/hongos puede dar lugar a un andamio de alta porosidad que puede tener paredes notablemente finas (≤100 nm) (véase, por ejemplo, la FIGURA 1). Esto puede, en ciertas realizaciones, proporcionar una huella mínima del material del andamio (es decir, cuando está completamente invadido por células vivas, la relación de volumen de célula a andamio puede ser notablemente alta).
En ciertas realizaciones, los biomateriales de andamiaje descritos en el presente documento pueden ser biocompatibles. Como se describe con más detalle a continuación, tras la implantación subcutánea de biomateriales de andamiaje de ejemplo en un modelo de ratón, se observó una infiltración celular completa y angiogénesis con formación de vasos sanguíneos funcionales en las 4 semanas posteriores a la implantación (véanse, por ejemplo, las Figuras 3 y 4). Como también se describe en los experimentos detallados a continuación, cuando los andamios se implantaron in vivo, la huella mínima promovió la infiltración celular, la angiogénesis y la reparación tisular, y sólo se observó una respuesta inflamatoria mínima (producida principalmente por la propia cirugía y no por el andamio) en las condiciones probadas.
Los experimentos que se describen a continuación indican que los biomateriales derivados de plantas/hongos aquí descritos eran totalmente biocompatibles in vivo en las condiciones probadas. También eran totalmente compatibles con los estudios in vitro, como se muestra en la FIGURA 5, y en Modulevsky, D.J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z. y Pelling, A.E. "Apple Derived Cellulose Scaffolds for 3D Mammalian Cell Culture". Píos One, 9, e97835 (2014). En ciertas realizaciones, a diferencia de muchos biomateriales comerciales, los biomateriales derivados de plantas/hongos descritos en el presente documento pueden ser no reabsorbibles o poco reabsorbibles (es decir, no se descompondrán sustancialmente ni serán absorbidos por el cuerpo). La característica no reabsorbible de estos andamios puede ofrecer ciertas ventajas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los biomateriales descritos en el presente documento pueden ser resistentes al cambio de forma, y/o pueden mantener su geometría prevista durante largos períodos de tiempo. En determinadas realizaciones, dado que pueden tener una huella mínima en comparación
con otros productos, pueden considerarse efectivamente invisibles para el cuerpo, sin provocar prácticamente ninguna respuesta inmunitaria. Cuando los biomateriales reabsorbibles se descomponen, sus subproductos a menudo provocan una respuesta inmunitaria adversa, además de inducir estrés oxidativo y provocar un aumento del pH en el tejido en recuperación, lo que puede evitarse utilizando un biomaterial no reabsorbible.
Como se comprenderá, a menos que se indique lo contrario, el significado/definición de los reinos de plantas y hongos utilizados en el presente documento se basa en la clasificación de Cavalier-Smith (1998).
Biomateriales de andamiaje
En una realización, se proporciona en el presente documento un biomaterial de andamiaje que comprende un tejido vegetal o fúngico descelularizado del que se eliminan los materiales celulares y los ácidos nucleicos del tejido, el tejido vegetal o fúngico descelularizado que comprende una estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina. Como se comprenderá, en ciertas realizaciones, un biomaterial de andamiaje puede comprender un material extraño al huésped que puede proporcionar una arquitectura subyacente, soporte y/o infraestructura para que las células del huésped se infiltren, invadan y/o proliferen.
En determinadas realizaciones, los biomateriales de andamiaje pueden tener una forma sustancialmente sólida, un bloque u otra forma rígida, pueden deshidratarse y molerse en forma de polvo o partículas, pueden tener una forma reticulada (en particular, cuando el biomaterial de andamiaje comprende un tejido a base de celulosa que contiene carboximetilcelulosa, que puede reticularse fácilmente con ácido cítrico y calor), o pueden tener forma de gel o pasta. Tales geles o pastas pueden producirse, por ejemplo, rehidratando una forma en polvo del tejido hasta una consistencia deseada para producir un gel o una pasta. Además, en ciertas realizaciones, el moldeo por compresión puede emplearse para generar láminas de biomateriales basados en celulosa, opcionalmente con diversos aditivos para mejorar la reticulación. Dichos aditivos pueden incluir, entre otros, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico o ácido cítrico, que pueden añadirse a la pulpa o pulverizarse junto con dihidrogenofosfato sódico como catalizador.
Como se comprenderá, el tejido vegetal o fúngico descelularizado puede comprender cualquier biomaterial adecuado derivado o producido a partir de un derivado vegetal o fúngico adecuado o de una muestra directa de tejido. En determinadas realizaciones, dichos materiales, que pueden comprender una arquitectura subyacente y/o una estructura de soporte de malla, pueden ser el resultado de un método combinado o único adecuado para eliminar, lisar o procesar enzimáticamente células nativas de un tejido vegetal o fúngico.
En ciertas realizaciones del material o materiales de andamiaje anteriores, el tejido vegetal o fúngico puede comprender un tejido de hipanto de manzano (Malus pumila), un tejido de helecho (Monilophytes), un tejido de raíz de tumip (Brassica rapa), un tejido de rama de gingko, un tejido de cola de caballo (equisetum), un tejido de hoja de híbrido de hermocallis, un tejido de tallo de col rizada (Brassica olerácea), un tejido de abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii) de coníferas, un tejido de pulpa de fruto de cactus (pitaya), un tejido de vinca maculata, un tejido de loto acuático (Nelumbo nucifera), un tejido de pétalo de tulipán (Tulipa gesneriana), un tejido de plátano (Musa paradisiaca), un tejido de tallo de brécol (Brassica olerácea), un tejido de tallo de hoja de arce (Acer psuedoplatanus), un tejido de raíz primaria de remolacha (Beta vulgaris), un tejido de cebolla verde (Album cepa), un tejido de orquídea (Orchidaceae), un tejido de tallo de nabo (Brassica rapa), un tejido de puerro (Album ampeloprasum), un tejido de rama de arce (Acer), un tejido de apio (Apium graveolens), un tejido de tallo de cebolla verde (Album cepa), un tejido de pino, un tejido de aloe vera, un tejido de sandía (Citrullus lanatus var. lanatus), un tejido de Jenny rastrera (Lysimachia nummularia), un tejido de cactus, un tejido de Lychnis Alpina, un tejido de ruibarbo (Rheum rhabarbarum), un tejido de pulpa de calabaza (Cucúrbita pepo), un tejido de tallo de Dracena (Asparagaceae), un tejido de tallo de araña (Tradescantia virginiana), un tejido de tallo de espárrago (Asparagus officinalis), un tejido de hongo (Fungi), un tejido de hinojo (Foeniculum vulgare), un tejido de rosa (Rosa), un tejido de zanahoria (Daucus carota) o un tejido de pera (Pomaceous).
En determinadas realizaciones, el tejido vegetal o fúngico puede alterarse genéticamente mediante la modificación directa del genoma o a través de la reproducción selectiva, para crear una arquitectura vegetal o fúngica adicional que puede configurarse para imitar físicamente un tejido y/o promover funcionalmente un efecto tisular diana. El experto que tenga en cuenta las enseñanzas del presente documento podrá seleccionar un biomaterial de andamiaje adecuado para una aplicación particular.
En determinadas realizaciones, puede seleccionarse un tejido adecuado para una appbcación concreta basándose, por ejemplo, en características físicas como el tamaño, la estructura (porosa/tubular), la rigidez, la resistencia, la dureza y/o la ductilidad, que pueden medirse y ajustarse a una appbcación concreta. Además, las propiedades químicas, como la reactividad, el número de coordinación, la entalpía de formación, el calor de combustión, la estabilidad, la toxicidad y/o los tipos de enlaces, también pueden tenerse en cuenta para su selección y adecuación a una aplicación concreta. Dichas características (físicas y químicas) también pueden modificarse directamente antes o después de la descelularización y/o funcionalización para responder a la aplicación específica. Además, en ciertas realizaciones, la celulosa puede proceder de diferentes plantas y puede combinarse y mezclarse, cruzarse, etc. utilizando la química que se describe a continuación.
En ciertas realizaciones, el biomaterial de andamio puede ser un biomaterial de andamio para el que el tejido vegetal o fúngico descelularizado del biomaterial de andamio está configurado para imitar físicamente un tejido del sujeto y/o para promover funcionalmente un efecto de tejido diana en el sujeto. Los métodos de uso de tales biomateriales de andamiaje como se describen en el presente documento pueden, en ciertas realizaciones, incluir un paso de selección de un biomaterial de andamiaje como se describe en el presente documento para el que el tejido vegetal o fúngico descelularizado del biomaterial de andamiaje está configurado para imitar físicamente un tejido del sujeto y/o para promover funcionalmente un efecto de tejido diana en el sujeto. El experto que tenga en cuenta las enseñanzas del presente documento podrá seleccionar un biomaterial de andamiaje adecuado para una aplicación particular.
A modo de ejemplo no limitativo, la FIGURA 6 proporciona algunos ejemplos de biomateriales de andamiaje que demuestran arquitecturas histológicas de la pared celular y las relaciones correspondientes con determinados tejidos/funciones tisulares, que pueden, en determinadas realizaciones, utilizarse para guiar la selección del biomaterial de andamiaje que se adapte a una(s) aplicación(es) particular(es). Como se comprenderá, las arquitecturas de la pared celular que se encuentran en los reinos vegetal y fúngico presentan una amplia variedad de estructuras que pueden ser similares a tejidos como el hueso, la piel y los nervios. Dependiendo del tejido objetivo, la determinación de la fuente vegetal o fúngica del biomaterial puede basarse en las características físicas y/o químicas de la planta, y/o en las características físicas y/o químicas del biomaterial de andamiaje generado.
Como se comprenderá, los materiales celulares y los ácidos nucleicos pueden incluir contenidos intracelulares como organdíes celulares (por ejemplo, cloroplastos, mitocondrias), núcleos celulares, ácidos nucleicos celulares y proteínas celulares. Estos pueden ser sustancialmente eliminados, parcialmente eliminados, o totalmente eliminados del biomaterial del andamio. Se reconoce que en los tejidos vegetales o fúngicos descelularizados descritos en el presente documento pueden seguir presentes trazas de dichos componentes.
Como se comprenderá, en ciertas realizaciones, una estructura porosa tridimensional (3D) puede incluir una estructura adecuada que proporcione una arquitectura subyacente, soporte y/o infraestructura para que las células extrañas se infiltren, invadan y/o proliferen en su interior, proporcionando al mismo tiempo un suministro constante de medios/nutrientes mediante difusión pasiva.
El tejido vegetal o fúngico descelularizado comprende un tejido vegetal o fúngico que ha sido descelularizado mediante tratamiento con SDS.
El SDS residual se elimina del tejido vegetal o fúngico descelularizado lavándolo con una solución acuosa de sales divalentes. La solución acuosa de sales divalentes puede utilizarse para precipitar/eliminar un residuo de sal que contenga micelas de SDS de la solución/el andamio, y puede haberse utilizado un tratamiento con dThO, ácido acético o dimetilsulfóxido (DMSO), o sonicación, para eliminar el residuo de sal o las micelas de SDS.
En ciertas realizaciones, la sal divalente de la solución salina acuosa divalente puede comprender, por ejemplo, MgCh o CaCl2.
En otra realización, el tejido vegetal o fúngico puede haber sido descelularizado mediante tratamiento con una solución de SDS de entre 0,01 y 10%, por ejemplo de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%, o, por ejemplo, aproximadamente 0,1% de SDS o aproximadamente 1% de SDS, en un disolvente como agua, etanol u otro disolvente orgánico adecuado, y el SDS residual puede haberse eliminado utilizando una solución acuosa de CaCb a una concentradón de aproximadamente 100 mM seguida de incubadón en dH2O.
En ciertas realizaciones, la solución de SDS puede estar a una concentración superior al 0,1%, lo que puede facilitar la descelularización, y puede ir acompañada de un mayor lavado para eliminar el SDS residual.
En determinadas realizaciones, el tejido vegetal o fúngico puede haberse descelularizado mediante tratamiento con una solución de SDS de aproximadamente 0,1% en agua, y el SDS residual puede haberse eliminado utilizando una solución acuosa de CaCb a una concentración de aproximadamente 100 mM seguida de incubación en dH2O.
En la sección "Métodos de preparación de biomateriales de andamiaje" que FIGURA a continuación, y en el Ejemplo 1, se proporcionan ejemplos de protocolos experimentales para la preparación de biomateriales según se describe en el presente documento.
En otra realización del material o materiales de andamiaje anteriores, el tejido vegetal o fúngico descelularizado puede funcionalizarse en al menos algunos grupos funcionales hidroxilo de la lumbre mediante acilación, alquilación u otra modificación covalente, para proporcionar un biomaterial de andamiaje funcionalizado. En ciertas realizaciones, el tejido vegetal o fúngico descelularizado puede funcionalizarse con colágeno, por ejemplo.
En otra realización del material o materiales de andamiaje anteriores, el biomaterial de andamiaje puede comprender además células animales vivas adheridas a la estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina. En otra realización, las células animales vivas pueden ser células de mamífero. En otra realización, las células animales vivas pueden ser células humanas.
Métodos de preparación de biomateriales de andamiaje
En una realización, se proporciona en el presente documento un método para preparar una planta descelularizada o tejido fúngico del que se eliminan los materiales celulares y los ácidos nucleicos del tejido, la planta descelularizada o tejido fúngico que comprende una estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina, dicho método comprende:
proporcionar un tejido vegetal o fúngico que tenga un tamaño y una forma predeterminados; y descelularizar el tejido vegetal o fúngico mediante tratamiento con SDS,
eliminando así los materiales celulares y los ácidos nucleicos del tejido vegetal o fúngico para formar el tejido vegetal o fúngico descelularizado que comprende una estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina.
El SDS residual se elimina del tejido vegetal o fúngico descelularizado mediante lavado con una solución acuosa de sales divalentes. La solución de sal divalente acuosa se utiliza para precipitar/eliminar un residuo de sal que contiene micelas de SDS del andamio, y puede haberse utilizado un tratamiento con dThO, ácido acético o dimetilsulfóxido 20 (DMSO) o sonicación, para eliminar el residuo de sal o las micelas de SDS. La sal divalente de la solución acuosa de sal divalente puede comprender, por ejemplo, MgCh o CaCb.
En una realización particular, la etapa de descelularización puede comprender el tratamiento con una solución de SDS de aproximadamente 0,1% de SDS en agua, y el SDS residual puede eliminarse después de la descelularización utilizando una solución acuosa de CaCb a una concentración de aproximadamente 100 mM, seguida de incubación en dH2O.
En otra realización del método o métodos anteriores, el método puede comprender además una etapa de funcionalización de al menos algunos grupos funcionales hidroxilo libres del tejido vegetal o fúngico descelularizado mediante acilación, alquilación u otra modificación covalente. En determinadas realizaciones, los grupos funcionales hidroxilo del tejido vegetal o fúngico descelularizado pueden funcionalizarse con colágeno.
En otra realización del método o métodos anteriores, el método puede comprender además una etapa de introducción de células animales vivas en la estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina, y permitir que las células animales vivas se adhieran a la estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina. En ciertas realizaciones, las células animales vivas pueden ser células de mamífero. En ciertas realizaciones, las células animales vivas pueden ser células humanas.
Aplicaciones de los biomateriales de andamiaje
En ciertas realizaciones, los biomateriales aquí descritos pueden tener aplicaciones en investigación biomédica de laboratorio y/o medicina regenerativa clínica en aplicaciones humanas y/o veterinarias, por ejemplo. Tales biomateriales pueden ser eficaces como andamios que pueden utilizarse como herramientas de investigación para investigadores biomédicos industriales/académicos, para implantes biomédicos, en dispositivos de detección y vehículos de administración farmacéutica, y/o en otras aplicaciones adecuadas en las que pueden utilizarse andamios.
En ciertas realizaciones, los biomateriales de andamiaje aquí descritos pueden utilizarse como andamiajes implantables para apoyar el crecimiento de células animales, para promover la regeneración tisular, para promover la angiogénesis, para un procedimiento de sustitución tisular o como implante estructural para cirugía estética.
En determinadas realizaciones, los biomateriales de andamiaje aquí descritos pueden utilizarse como implante estructural para la reparación o regeneración tras una lesión de la médula espinal; como implante estructural para la cirugía de sustitución tisular y/o para la regeneración tisular tras una cirugía; como implante estructural para la cirugía de injerto cutáneo y/o de regeneración cutánea; como implante estructural para la regeneración de la vasculatura sanguínea en un tejido o región diana; como sustituto óseo, relleno óseo o material de injerto óseo, y/o para promover la regeneración ósea; como sustituto tisular para piel, hueso, médula espinal, corazón, músculo, nervio, vaso sanguíneo u otro tejido dañado o malformado; como sustituto del humor vítreo (en forma de hidrogel); como bursa artificial, en la que el biomaterial de andamiaje forma una estructura en forma de saco que contiene biomaterial de andamiaje en forma de hidrogel; y/o como implante estructural para cirugía estética, por ejemplo.
En determinadas realizaciones, los biomateriales de andamiaje descritos en el presente documento pueden utilizarse como implantes mamarios. De este modo, el andamio puede formularse para que coincida con las glándulas o tejidos mamarios que se encuentran en la mama humana y, a continuación, utilizarse como material de relleno para implantes mamarios, por ejemplo.
En algunas otras realizaciones, los biomateriales de andamiaje aquí descritos pueden utilizarse como sustitutos de cartílago: Así, el andamio puede formularse y diseñarse para imitar tejidos cartilaginosos y utilizarse para sustituir ciertas partes del cuerpo, como orejas y narices.
En ciertas realizaciones, los biomateriales de andamiaje aquí descritos pueden utilizarse como injertos cutáneos. El andamio de celulosa puede utilizarse como injerto cutáneo para proteger, reparar y/o regenerar la piel (epitelial/endotelial) tras intervenciones quirúrgicas cutáneas (por ejemplo, encías, etc.) o lesiones (por ejemplo, vagabundos, etc.). En algunos casos, puede utilizarse para proteger los tejidos dañados contra infecciones externas
y/o para regenerar directamente los tejidos.
En ciertas realizaciones, los biomateriales de andamiaje aquí descritos pueden utilizarse para la regeneración de la vasculatura sanguínea. La amplia gama de estructuras de celulosa disponibles puede permitir la producción artificial de estructuras similares a vasos sanguíneos, y/o puede proporcionar condiciones adecuadas para la angiogénesis (formación natural de vasos sanguíneos).
En otra realización, los biomateriales de andamiaje aquí descritos pueden utilizarse para la sustitución o el relleno de huesos. Así, el andamio de celulosa puede formularse y diseñarse para imitar los tejidos óseos, y luego utilizarse para reemplazar huesos y partes óseas, como en odontología, huesos del cráneo, huesos fracturados, reemplazo de cadera (hueso o agente de relleno para prótesis, etc.) y/u otras aplicaciones similares.
En determinadas realizaciones, los biomateriales de andamiaje aquí descritos pueden utilizarse como tejidos simples o complejos. A modo de ejemplo, los andamios pueden utilizarse para sustituir tejidos simples (piel, hueso) o complejos (médula espinal, corazón, músculo, nervios, vasos sanguíneos, etc.) tras un accidente, malformación, lesión estética u otro daño en el tejido.
En otras realizaciones, los biomateriales de andamiaje aquí descritos pueden utilizarse como material de humor vítreo. Por ejemplo, los andamiajes de celulosa en forma de hidrogel son un gel translúcido. La consistencia y la claridad pueden ajustarse para que coincidan con las del humor vítreo nativo.
En ciertas realizaciones, los biomateriales de andamiaje aquí descritos pueden utilizarse como bursas. Las bursas artificiales, y su fluido correspondiente, pueden fabricarse a partir de los biomateriales descritos en el presente documento. Las bursas pueden crearse a partir de celulosa sólida, mientras que el fluido puede formarse a partir de hidrogel de celulosa, por ejemplo.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento métodos para apoyar el crecimiento de células animales, para promover la regeneración de tejidos, para promover la angiogénesis, para la sustitución de un tejido, o para proporcionar un andamio estructural en una cirugía estética, en un sujeto que lo necesite (no forma parte de la invención), dichos métodos comprenden:
proporcionar un biomaterial de andamiaje según cualquiera de los biomateriales de andamiaje descritos anteriormente; e
implantar el biomaterial de andamiaje en el sujeto.
En determinadas realizaciones, el biomaterial de andamiaje puede implantarse en la médula espinal y promover la reparación o regeneración tras una lesión medular; puede proporcionar un implante estructural para la sustitución de tejidos y/o para la regeneración de tejidos en el sujeto; puede proporcionar un implante estructural para el injerto de piel y/o la regeneración de piel en el sujeto; puede proporcionar un implante estructural para la regeneración de la vasculatura sanguínea en un tejido o región diana o en el sujeto; puede proporcionar un material de sustitución ósea, relleno óseo o injerto óseo, y/o puede promover la regeneración ósea, en el sujeto; puede proporcionar una sustitución tisular para piel, hueso, corazón, músculo, nervio, vaso sanguíneo u otro tejido dañado o malformado en el sujeto; puede proporcionar una sustitución de humor vítreo en el sujeto (cuando está en forma de hidrogel); puede proporcionar una bursa artificial en el sujeto, en la que el biomaterial de andamiaje forma una estructura similar a un saco que contiene biomaterial de andamiaje en forma de hidrogel; y/o puede proporcionar un implante estructural para cirugía estética.
En ciertas realizaciones, el biomaterial de andamiaje puede implantarse en la médula espinal, y puede promover la reparación y/o regeneración tras una lesión aguda y/o crónica de la médula espinal en el Sistema nervioso central y/o periférico.
EJEMPLO 1 - EJEMPLOS DE PROTOCOLOS EXPERIMENTALES PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOMATERIALES DE ANDAMIAJE
En este Ejemplo, se describen dos protocolos experimentales para preparar biomateriales de andamiaje como los descritos en el presente documento a partir de un tejido de hipanto de manzana (Malus pumila). Se entenderá que estos protocolos se proporcionan como ejemplos ilustrativos y no limitativos destinados a la persona experta en la materia. El experto que tenga en cuenta las enseñanzas del presente documento será consciente de las diversas modificaciones, adiciones, sustituciones y/u otros cambios que pueden realizarse en estos protocolos ejemplares. El protocolo experimental inicial descrito a continuación se utilizó con éxito para preparar biomateriales de andamiaje. Sin embargo, este protocolo tardó muchas semanas en proporcionar una infiltración celular completa en las condiciones probadas. Por lo tanto, posteriormente se desarrolló un protocolo modificado, que incluye el uso de un lavado de cloruro de calcio (CaCl2), que dio resultados similares a los biomateriales de andamiaje preparados por el Primer protocolo, pero en el plazo de una semana (véanse las Figuras 9 y 10).
Protocolo inicial para estudios in vivo (modelo animal):
1) Cortar las rodajas de manzana a la forma y tamaño deseados
a) Cortar la manzana por la mitad
b) La mitad de la manzana se sumerge en PBS cortada boca abajo
c) Ajustar la cortadora de mandolina para obtener un grosor adecuado (en este ejemplo, 1. 2 mm) d) Tomar una rodaja uniforme sin el corazón visible de la manzana y colóquela en la tabla de cortar métrica
e) Cortar un lado de la manzana para su posterior transformación en cuadrados y mantener el otro trozo en PBS.
f) Utilizar las guías (5mm X 5mm) para cortar el tejido de manzana en los cuadrados
g) Colocar las rodajas cortadas en los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
h) Medir el lado cortado de la rebanada no utilizada al menos 10X y anotar en el cuaderno de laboratorio. 2) Añadir l mL de SDS al 0,1% (en dH2Oautoclavado) e incubar en el agitador durante 2 días (temperatura ambiente) a 180 RPM RT
a) Comprobar que los cuadrados de manzana no flotan
b) Continuar el tratamiento con SDS si las manzanas siguen flotando
3) Llevar las manzanas procesadas en los tubos de microcentrífuga a la cabina de bioseguridad.
4) Retirar la solución de SDS al 0,1% (temperatura ambiente) con la pipeta Pasteur.
5) Lavar las rodajas de manzana 4 veces con PBS esterilizado en autoclave (temperatura ambiente).
a) Durante el lavado intente colocar la pipeta Pasteur lo más cerca posible de la manzana sin tocarla. Esto es para intentar que el agua fluya a través del tejido de la manzana.
b) Cuando no quede líquido en el tubo continué utilizando la pipeta Pasteur para extraer solución líquida de la manzana
c) A medida que realice más lavados, la cantidad de residuo de "espuma jabonosa" que se ve pasar por la pipeta debería disminuir.
d) No deje de lavar hasta que no vea salir "espuma jabonosa" de la manzana
e) La manzana tampoco debe flotar
6) Colocar las muestras deseadas frente a Tubos de microcentrífuga estériles
7) Retirar el último lavado de PBS de los tubos de microcentrífuga y sustitúyalo por etanol al 70%.
8) Dejar en etanol al 70% durante 30 min- 1 hora
9) Retirar el etanol al 70
10) Continúe lavando la rodaja de manzana con PBS esterilizado con la misma técnica mencionada anteriormente.
a) Asegúrese de cambiar las pipetas Pasteur
11) Continuar lavando hasta que las rodajas de manzana dejen de flotar (al menos 4 veces) con PBS
12) Retirar el PBS y sustituirlo por PBS 1% Penicilina / Estreptomicina.
13) Implantar en modelo animal.
Protocolo modificado para estudios in vivo:
1) Cortar las rodajas de manzana a la forma y tamaño deseados
a) Cortar la manzana por la mitad
b) La mitad de la manzana se sumerge en PBS cortada boca abajo
c) Ajustar la cortadora de mandolina para obtener un grosor adecuado (en este ejemplo, 1,2 mm).
d) Tome una rodaja uniforme sin el corazón visible de la manzana y colóquela en la tabla de cortar métrica
e) Cortar un lado de la manzana para su posterior procesamiento en cuadrados y mantener la otra pieza en PBS
f) Utilice las guías (5mm X 5mm) para cortar el tejido de manzana en los cuadrados.
g) Colocar las rodajas cortadas en los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
h) h. Medir el lado cortado de la rebanada no utilizada al menos 10X y anotar en el cuaderno de laboratorio.
2) Añadir lmL de SDS al 0,1% (en dH2O esterilizado en autoclave) e incubar en el agitador durante 2 días (temperatura ambiente) a 180 RPM RT.
a) Compruebe que los cuadrados de manzana no flotan.
b) Continuar el tratamiento SDS si las manzanas siguen flotando
3) Llevar las manzanas procesadas en los tubos de microcentrífuga a la cabina de bioseguridad.
4) Retirar la solución de SDS al 0,1% (temperatura ambiente) con la pipeta Pasteur.
5) Lavar las rodajas de manzana 4 veces con dH2O esterilizado en autoclave (temperatura ambiente).
a) Durante el lavado intenta colocar la pipeta Pasteur lo más cerca posible de la manzana sin tocarla. Esto es para intentar que el agua fluya a través de ella.
b) Cuando no quede líquido en el tubo continué utilizando la pipeta Pasteur para extraer líquido de la manzana c) A medida que realice más lavados, la cantidad de residuo de "espuma jabonosa" que se ve pasar por la pipeta debería disminuir.
d) No deje de lavar hasta que no vea salir "espuma jabonosa" de la manzana
e) La manzana tampoco debe flotar
6) Añadir 100 mM CaCl2 (en dH2O esterilizado en autoclave) y dejar toda la noche (temperatura ambiente).
7) Retirar la solución de CaCl2 (temperatura ambiente).
8) Colocar las muestras deseadas frente a Tubos de microcentrífuga estériles
9) Retire el último lavado con agua de los tubos de microcentrífuga y sustitúyalo por etanol al 70%.
10) Dejar en etanol al 70% durante 30 min- 1 hora
11) Retirar el etanol al 70%
12) Continúe lavando la rodaja de manzana con agua con la misma técnica mencionada
anteriormente.
a) Asegúrese de cambiar las pipetas Pasteur
13) Continuar lavando hasta que las rodajas de manzana dejen de flotar (al menos 4 veces) con PBS
14) Retirar el PBS y sustituirlo por PBS 1% P/S
15) Implantar en modelo animal.
EJEMPLO 2 - IMPLANTACIÓN EN RATONES
Se realizaron estudios de implantación in vivo en ratones para estudiar los efectos in vivo de las realizaciones de biomateriales de andamiaje descritas en el presente documento.
Los resultados indican que, tras la implantación subcutánea en un modelo de ratón, se observó una infiltración celular completa (véase la FIGURA 7; 1, 4 y 8 semanas después de la implantación), con deposición de colágeno (FIGURA 4A) y, lo que es más importante, angiogénesis con formación de vasos sanguíneos funcionales en las 4 semanas posteriores a la implantación (Figuras 4B y 8). Cuando los andamios se implantaron in vivo, la huella mínima promovió la infiltración celular, la angiogénesis y la reparación tisular y sólo se produjo una respuesta inflamatoria mínima (producida principalmente por la propia cirugía y no por el andamio). En estos estudios, los andamiajes derivados de plantas y hongos eran totalmente biocompatibles in vivo. Estos andamiajes también eran plenamente compatibles en los estudios in vitro, como se muestra en la (FIGURA 5).
Un biomaterial no biodegradable:
Este campo se ha centrado principalmente en los materiales biodegradables; sin embargo, este enfoque plantea muchos problemas en la práctica. A diferencia de muchos biomateriales comerciales, en ciertas realizaciones los biomateriales actuales pueden considerarse no reabsorbibles (es decir, no pueden descomponerse completamente y ser absorbidos por el cuerpo) (véase la FIGURA 9).
La característica no reabsorbible de estos andamiajes puede ofrecer ciertas ventajas sobre los productos comerciales de la competencia. A modo de ejemplo, pueden ser (i) más resistentes al cambio de forma y/o pueden mantener su geometría prevista durante largos periodos de tiempo; (ii) pueden tener una huella mínima en comparación con los productos de la competencia, haciéndolos casi invisibles para el cuerpo, sin provocar prácticamente ninguna respuesta inmunitaria; (iii) pueden evitar la producción de subproductos en comparación con los materiales reabsorbibles, cuya descomposición puede crear una respuesta inmunitaria adversa; y/o (iv) cuando los biomateriales reabsorbibles se descomponen, los nuevos tejidos regenerados pueden resultar dañados y, a continuación, también eliminados; los biomateriales descritos en el presente documento pueden, en determinados ejemplos, evitar tal situación.
Estudio in vitro:
Los experimentos in vitro aquí descritos se llevaron a cabo para confirmar la invasión y proliferación celular en el interior del andamio de celulosa. La infiltración celular completa tardó muchas semanas cuando se utilizó el primer protocolo (descrito en el Ejemplo 1 anterior). Posteriormente se desarrolló un protocolo modificado (también descrito en el Ejemplo 1 anterior), que comprende la adición de un lavado de cloruro de calcio (CaCl2), que dio resultados similares, pero en sólo una semana (véase la FIGURA 9).
Estudio in vivo:
Se realizó un ensayo preclínico en un modelo de ratón para estudiar la respuesta a la implantación subcutánea de andamios de 5x5x1 mm durante un periodo de 1, 4 y 8 semanas. Los andamios basados en celulosa procedían de manzana, hinojo y espárrago, y los basados en quitina, de champiñón blanco (véase la FIGURA 6).
Todos los andamiajes presentaron una biocompatibilidad similar, sin que se observara rechazo ni invasión celular ni angiogénesis (formación de vasos sanguíneos) en estos estudios.
EJEMPLO 3 - BIOCOMPATIBILIDAD IN VIVO DE BIOMATERIALES DE ANDAMIAJE
(no según la invención)
Para abordar la cuestión de la biocompatibilidad in vivo de los biomateriales de los andamiajes, se ha caracterizado la respuesta del organismo a los andamiajes de celulosa derivados de la manzana. Se produjeron biomateriales de celulosa macroscópicos (~25 mm3) libres de células 10 y se implantaron por vía subcutánea en un modelo de ratón durante 1, 4 y 8 semanas. Aquí se evaluó la respuesta inmunológica de ratones inmunocompetentes, la deposición de matriz extracelular en los andamios y la evidencia de angiogénesis (vascularización) en los biomateriales de celulosa implantados. En particular, aunque se observó una respuesta de cuerpo extraño inmediatamente después de la implantación, como era de esperar en un procedimiento quirúrgico, sólo se observó una respuesta inmunológica baja, sin muertes ni infecciones perceptibles en todos los grupos de animales al final del estudio. También se observó que las células circundantes invadían el andamio, principalmente fibroblastos activados, y depositaban una nueva matriz extracelular. Además, el propio andamio pudo conservar gran parte de su forma y estructura originales durante
las 8 semanas del estudio. Y lo que es más importante, los andamios tuvieron un claro efecto proangiogénico, que se tradujo en el crecimiento de 20 vasos sanguíneos funcionales en todo el biomaterial implantado. En conjunto, este trabajo demuestra que hay una forma relativamente fácil de producir andamios de celulosa en 3D que son biocompatibles, se vascularizan y se integran en los tejidos sanos circundantes.
En estos estudios se utilizó tejido nativo de hipanto de manzano y una cómoda metodología de preparación para crear andamios de celulosa implantables. Para examinar la biocompatibilidad, se implantaron andamios por vía subcutánea en ratones inmunocompetentes de tipo salvaje (machos y hembras; 6-9 semanas de edad). Tras la implantación, se resecaron los andamiajes en las semanas 1, 4 y 8 y se procesaron para su análisis histológico (H&E, tricrómico de Masson, anticuerpos anti-CD31 y anti-CD45). El análisis histológico reveló una respuesta característica de cuerpo extraño al andamio 1 semana después de la implantación. Sin embargo, se observó que la respuesta inmunitaria desaparecía gradualmente a las 8 semanas de la implantación. A las 8 semanas, no había respuesta inmunitaria en el tejido dérmico circundante y se observó una migración activa de fibroblastos al interior del andamio de celulosa. Esto fue concomitante con la deposición de una nueva matriz extracelular de colágeno. Además, se observó la formación activa de vasos sanguíneos dentro del andamio durante todo el periodo de estudio, lo que indica las propiedades proangiogénicas de los andamios nativos. Por último, aunque los andamiajes conservaron gran parte de su forma original, sufrieron una lenta deformación durante las 8 semanas del estudio. En conjunto, estos resultados indican que los andamiajes de celulosa nativa son biocompatibles y pueden tener potencial como biomaterial quirúrgico.
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ottawa. Los ratones de tipo salvaje C57BL/10ScSnJ (machos y hembras; 6-9 semanas de edad; n= 7 ratones para cada grupo) se adquirieron en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, EE.UU.) y se criaron en nuestras instalaciones. Todos los animales se mantuvieron a temperatura ambiente (±22 °C) y humedad (~52%) constantes. Se les alimentó con una dieta normal y se mantuvieron bajo un ciclo controlado de 12 horas de luz/oscuridad.
Preparación de andamios de celulosa Como se ha descrito anteriormente [27], las manzanas rojas Mclntosh (Canada Fancy) se almacenaron a 4°C en la oscuridad durante un máximo de dos semanas. Para preparar las secciones de manzana, la fruta se cortó con una rebanadora mandolina hasta un grosor uniforme de 1,14±0,08 mm, medido con un calibre Vemier. Sólo se utilizó el tejido exterior (hipanto) de la manzana. No se utilizaron rodajas que contuvieran tejido visible del núcleo del ovario. A continuación, las rodajas se cortaron paralelamente a la dirección del pedicelo de la manzana en segmentos cuadrados de 5,14±0,21 mm de longitud y con una superficie de 26,14±1,76 mm2. A continuación, se descelularizó el tejido de la manzana utilizando un protocolo similar al de referencia [14] para eliminar el material celular y el ADN de las muestras de tejido, dejando al mismo tiempo un andamio intacto y tridimensional. Se colocaron muestras individuales de tejido de manzana en tubos de microcentrífuga esterilizados de 2,5 ml y se añadieron 2 ml de solución de dodecil sulfato sódico (SDS; Sigma- Aldrich) al 0,1% a cada tubo. Las muestras se agitaron durante 48 horas a 180 RPM a temperatura ambiente. A continuación, los andamios de celulosa resultantes se transfirieron a nuevos tubos de microcentrífuga estériles, se lavaron y se incubaron durante 12 horas en PBS (Sigma-Aldrich). Para esterilizar los andamios de celulosa, se incubaron en etanol al 70% durante 1 hora y luego se lavaron 12 veces con PBS. A continuación, las muestras se mantuvieron en PBS con estreptomicina/penicilina al 1% (HyClone) y anfotericina B al 1% (Wisent, QC, Canada). En este punto, las muestras se utilizaron inmediatamente 0 se almacenaron a 4°C durante no más de 2 semanas.
Implantación de celulosa Se anestesió a los ratones con isoflurano USP-PPC al 2% (Pharmaceutical partners of Canada, Richmond, ON, Canadá) y se les protegieron los ojos mediante la aplicación de gel líquido oftálmico (Aleo Canada In., ON, Canadá). Para preparar los lugares de la cirugía, se afeitaron los pelos del lomo de los ratones y se limpiaron y esterilizaron las pieles con ENDURE 400 Scrub-Stat4 Surgical Scrub (gluconato de clorhexidina, solución al 4%; Ecolab Inc., Minnesota, 10 EE.UU.) y Soluprep (clorhexidina al 2% p/v y alcohol isopropílico al 70% v/v; 3M Canada, London, ON, Canadá). Para mantener la hidratación de los animales, se administró por vía subcutánea (s.c.) 1 ml de solución de cloruro sódico al 0,9% (Hospira, Montréal, QC, Canadá). Durante los procedimientos quirúrgicos, se aplicaron todas las medidas de esterilidad requeridas para las cirugías de supervivencia. Para implantar los andamiajes, se realizaron dos incisiones de 8 mm en la sección dorsal de cada ratón (superior e inferior). 15 Se implantaron por separado y de forma independiente dos muestras de andamiaje de celulosa en cada ratón. A continuación, se suturaron las incisiones con polipropileno monofilamento 6-0 Surgipro II (Covidien, Massachusetts, EE.UU.) y se aplicó bupivicaína transdérmica al 2% (como monohidrato; Chiron Compounding Pharmacy Inc., Guelph, ON, Canadá) de forma tópica en los lugares de la cirugía para prevenir la infección. También se administró buprenorfina (como HCL) (0,03 mg/ml; Chiron Compounding Pharmacy Inc. Guelph, ON, 20 Canadá) s.c. como analgésico. Todos los animales fueron controlados cuidadosamente durante los 3 días siguientes por los Servicios de Cuidado de Animales y recibieron repeticiones de los mismos tratamientos farmacológicos.
Resecciones de andamiaje Una, cuatro y ocho semanas después de la implantación del andamiaje, los ratones fueron eutanasiados mediante inhalación de CO2. Tras la extracción de sangre, se resecó cuidadosamente la piel dorsal y se sumergieron inmediatamente en solución de PBS. A continuación, se fotografiaron las secciones de piel que contenían andamios de celulosa, se cortaron y se fijaron en formol al 10% durante al menos 48 horas. A continuación,
las muestras se conservaron en etanol al 70% antes de ser incrustadas en parafina por el PALM Histology Core Facility de la Universidad de Ottawa.
Análisis histológico Se cortaron secciones seriadas de 5 |jm de grosor, comenzando a 1 mm dentro del andamio de celulosa, y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y tricrómico de Masson. Para la inmunocitoquímica, la recuperación de epítopos inducida por calor se realizó a 110°C durante 12 min con tampón citrato (pH 6,0). Los anticuerpos primarios anti-CD31/PECAM1 (1:100; Novus Biologicals, NB100-2284, Oakville, ON, Canadá), anti-alfa actina de músculo liso (1:1000, ab5694, abcam, Toronto, ON, Canadá) 5 y anti-CD45 (1:3000; abl0558, abcam, Toronto, ON, Canadá) se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. El reactivo de bloqueo (Background Sniper, Biocare, Medical, Concorde, CA, EE.UU.) y el sistema de detección MACH 4 (Biocare Medical, Concord, CA, EE.UU.) se aplicaron de acuerdo con las especificaciones de la empresa. Para la evaluación de la infiltración celular, la deposición de matriz extracelular y la vascularización (angiogénesis), se capturaron micrografías con el escáner de diapositivas Zeiss MIRAX MIDI (Zeiss, Toronto, Canadá) equipado con un objetivo de 40 aumentos y se analizaron con Pannoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Budapest, Hungría) y el software ImageJ. La puntuación de la inflamación fue evaluada por un patólogo. La puntuación se asignó subjetivamente mediante un análisis cualitativo de la magnitud de la respuesta extraña total, así como de las proporciones de población celular dentro de la respuesta extraña.
Microscopía electrónica de barrido (SEM) La estructura de la celulosa se estudió mediante microscopía electrónica de barrido. Globalmente, los andamiajes se deshidrataron mediante gradientes sucesivos de etanol (50%, 70%, 95% y 100%). A continuación, las muestras se recubrieron de oro a una corriente de 15 mA durante 3 minutos con un dispositivo de pulverización iónica Hitachi E-1010. Las imágenes de SEM se obtuvieron con voltajes de 2,00-10,0 kV en un SEM de emisión de campo JSM-7500F (JEOL, Peabody, MA, EE.UU.).
Statistical analysis Todos los valores aquí indicados son la media ± desviaciones estándar. Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA unidireccional utilizando el programa SigmaStat 3.5 (Dundas Software Ltd, Alemania). Un valor de p ≤ 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
RESULTADOS
Preparación del andamiaje Los andamios de celulosa se prepararon a partir de tejido de manzana utilizando una técnica de descelularización similar a la descrita anteriormente [27]. Todos los andamios se cortaron a un tamaño de 5,14±0,21 x 5,14±0,21 x 1,14±0,08 mm (FIGURA 11A), se descelularizaron y se prepararon para su implantación (FIGURA 1 IB). Los andamios aparecen translúcidos tras la descelularización debido a la pérdida de todo el material celular vegetal y los restos. La eliminación de las células de manzana también se confirmó mediante observación histológica (FIGURA 11C) y microscopía electrónica de barrido (FIGURA 11D). El análisis de las imágenes histológicas y la medición del grosor medio de la pared (4,04±1,4 jm ) revelan que, en las condiciones experimentales, los andamios de celulosa eran muy porosos, capaces de ser invadidos por células cercanas y dan lugar a un andamio de celulosa acelular que mantiene su 5 forma.
Implantación de andamios de celulosa Se realizaron dos incisiones cutáneas independientes (8 mm) en el dorso de cada ratón para crear pequeñas bolsas para la implantación del biomaterial (FIGURA 12A). Se implantó un andamio de celulosa (FIGURA 12B) en cada bolsa subcutánea. A lo largo del estudio, los ratones no mostraron ningún comportamiento doloroso que pudiera haber sido inducido por la implantación del andamio de celulosa y ninguno de ellos mostró síntomas visibles de inflamación o infección. Los andamios de celulosa se resecaron a la semana, a las 4 semanas y a las 8 semanas de su implantación y se fotografiaron para medir el cambio en las dimensiones del andamio (Figuras 12D-F). En todos los momentos se puede observar tejido sano rodeando el andamio de celulosa con presencia de vasos sanguíneos, que están proximales o en contacto directo, y los andamios conservan su forma cuadrada. El andamio pre-implantación tenía un área de 26,3±1,98 mm2 y se observó que disminuía lentamente en función de su tiempo de implantación en base al área del andamio que es visible a simple vista en la piel (FIGURA 12G). A las 8 semanas post-implantación, las dimensiones del andamio alcanzan una medida cercana a la meseta de 13,82±3,88 mm2 demostrando un cambio aproximado de 12 mm2 (48%) en el transcurso de este estudio.
Biocompatibilidad e infiltración celular en andamios de celulosa de origen vegetal La biocompatibilidad de los andamios y la infiltración celular se examinaron con tinción de H&E de los andamios de celulosa fijados a las semanas 1, 4 y 8 tras su implantación (FIGURA 13). Las vistas globales de la sección longitudinal de andamios de celulosa representativos se muestran en las Figuras 13A-C. Los andamiajes están implantados bajo la capa muscular de la dermis. Se pueden observar fluidos intersticiales, teñidos de rosa, en todo el andamio implantado, en contraste con un andamio no implantado (véase la FIGURA 11C), lo que pone de manifiesto su elevada porosidad y permeabilidad. Dentro de la vista global se observó que el andamio mantiene su forma general durante todo el estudio. En las Figuras 13D-F, se muestra una sección ampliada del perímetro del andamio en cada uno de los puntos temporales posteriores al implante. A la semana, el tejido de la dermis que rodea el implante muestra síntomas de una respuesta inmunitaria aguda de moderada a grave (estudio cualitativo realizado por un patólogo) (FIGURA 13D). También se puede observar una densa capa de células infiltradas en los andamios de celulosa. La población de células dentro del andamio a la semana consiste principalmente en granulocitos, específicamente; polimorfonucleares (PMN) y eosinófilos (FIGURA 13D). También hay una población de células muertas y restos celulares aparentes. Es importante
destacar que todas estas observaciones son totalmente coherentes con la reacción aguda a cuerpo extraño que sigue a la implantación [84-86]. A las 4 semanas, se observó una marcada diferencia tanto en el tejido de la epidermis circundante como en la población celular que migraba al armazón de celulosa (FIGURA 13E). El tejido de la epidermis que rodea el andamio de celulosa presenta una respuesta inmunitaria disminuida, que ahora se califica de leve a baja. La población de células dentro de la epidermis que rodea los andamios contiene ahora niveles más altos de macrófagos y linfocitos (FIGURA 13E). Esta es una característica anticipada de la reacción de cuerpo extraño a un biomaterial implantado, lo que demuestra el proceso de limpieza del andamio [84-86], También hay un aumento en la población de células multinucleadas dentro del interior del andamio como parte de una respuesta inflamatoria (FIGURA 13E). Por último, 8 semanas después de la implantación, la respuesta inmunitaria aparente a las semanas 1 y 4 ha desaparecido por completo (FIGURA 13F), y el tejido de la epidermis parece ahora normal. De hecho, el tejido epidérmico en contacto con el andamio de celulosa contiene las mismas estructuras que el tejido epidérmico normal. En el perímetro del andamio de celulosa hay ahora una menor densidad de células debido a la disminución de la inflamación y, en particular, no hay células muertas fragmentadas. En su lugar, la población de células contiene ahora un nivel elevado de macrófagos, células multinucleadas y fibroblastos activos. Los fibroblastos activos (de aspecto fusiforme) migran de la epidermis circundante al armazón de celulosa. De hecho, se encontraron fibroblastos en todo el andamio de celulosa. Estos resultados demuestran que, a las 8 semanas de la implantación, el andamio de celulosa ha sido aceptado por el huésped. Paralelamente al análisis de la inflamación con H&E, se realizó una tinción anti-CD45 para evaluar el nivel de inflamación en todo el andamiaje y el tejido circundante de la dermis (Figuras 3G-I). Es evidente que la inflamación en toda la dermis y dentro del andamio es elevada después de 1 semana. Sin embargo, la cantidad de leucocitos disminuye significativamente en la dermis circundante y en el andamio a lo largo del tiempo de implantación, alcanzando un nivel casi basal a las 8 semanas.
Deposición de matriz extracelular en los andamios de celulosa La presencia de fibroblastos activos nos llevó a preguntarnos si el andamio de celulosa estaba actuando como sustrato para la deposición de nueva matriz extracelular. Esto se determinó mediante la tinción con tricrómico de Masson de portaobjetos de andamios de celulosa fijados en cada punto temporal tras el implante (FIGURA 14). A la semana de la implantación, el estudio histológico muestra la ausencia de estructuras de colágeno en el interior del andamio de colágeno (Figuras 14A, D y G). A medida que las células fibroblásticas invaden el andamio, como se observa con la tinción H&E 5 y se confirma con la tinción anti-alfa actina de músculo liso (datos no mostrados), pueden observarse depósitos de colágeno en el interior del andamio de celulosa al cabo de 4 semanas (Figuras 14B, E y H). A las 8 semanas (Figuras 14C, F e I) la red de colágeno es claramente visible dentro de las cavidades del andamio de celulosa. La complejidad de la red de colágeno depositada se pone de manifiesto en la FIGURA 141, donde podemos detectar fibras de colágeno individuales dentro de la matriz de colágeno. Esto contrasta con la organización característica de alta densidad, gruesa y en forma de cable del colágeno que se encuentra en el tejido cicatricial.
Vascularización de los andamios de celulosa También se identificaron capilares de entre 8 y 25 ppm de diámetro dentro de los andamios a partir de la primera semana tras la implantación. A las 4 y 8 semanas de la implantación, se observan vasos sanguíneos y capilares en el interior del andamio y en el tejido dérmico circundante. Observamos la presencia de vasos sanguíneos en el andamio de celulosa y en la dermis circundante en las fotos macroscópicas tomadas durante la resección (FIGURA 15A). Se identifican múltiples secciones transversales de vasos sanguíneos, con presencia de glóbulos rojos (GR), a las 4 semanas de la implantación del andamiaje (FIGURA 15B; tinción de H&E). Los mismos resultados se obtienen 8 semanas después de la implantación, donde se observan claramente capilares con glóbulos rojos y células endoteliales (FIGURA 15C; Tricrómico de Masson). Todos los resultados sobre los vasos sanguíneos formados se confirmaron también con tinción anti-CD31 para identificar células endoteliales en el andamio (FIGURA 15D).
ANÅLISIS
En este estudio se evaluó la biocompatibilidad in vivo de andamios de celulosa acelular derivados de tejido de hipanto de manzana. Con este fin, se implantaron por vía subcutánea andamios de celulosa acelular en ratones inmunocompetentes para establecer su biocompatibilidad. Los datos revelan 25 que los andamios implantados demónstran una baja respuesta inflamatoria, promueven la invasión celular y la deposición de matriz extracelular, y actúan como un entorno pro-angiogénico. Sorprendentemente, ninguno de los ratones de este estudio murió ni mostró síntomas de rechazo del implante, como edema, exudado o malestar, durante el transcurso de esta investigación, lo que indica que los andamios de celulosa se implantaron con éxito. Estos andamios implantados se componen de una red porosa de cavidades en las que residían las células originales de la planta huésped [69]. Esta arquitectura facilita eficazmente la transferencia de nutrientes por todo el tejido vegetal. Como se ha demostrado aquí y en un estudio anterior, los tejidos del manzano pueden descelularizarse [27]. Este sencillo tratamiento cambia el aspecto del tejido del hipanto de modo que se vuelve transparente, como resultado de la eliminación de los materiales celulares.
Tras la implantación, los resultados indican que los andamios se infiltran rápidamente con células del huésped, que comienzan con células inflamatorias. En consonancia con hallazgos anteriores, la respuesta inmunitaria de los animales huéspedes siguió una línea temporal bien conocida [84-88], demostrando en última instancia la biocompatibilidad. Como era de esperar, la población celular dentro del andamio después de 1 semana post implantación son principalmente granulocitos, específicamente; polimorfonucleares (PMN) y eosinófilos, constituyendo una clara respuesta inflamatoria. También se observó la producción de una matriz provisional alrededor del andamio,
lo que dio lugar a un aspecto inflamado en el tejido que rodea el andamio [84-88]. Esto no es inesperado y es el resultado del material extraño, así como una respuesta al procedimiento quirúrgico [84-88]. Cuatro semanas después de la implantación, la población de células dentro del andamio ha evolucionado y ahora son linfocitos, monocitos, macrófagos, células multinucleadas de cuerpo extraño, así como eosinófilos dispersos. Típico de la inflamación crónica, los restos celulares presentes en la matriz provisional a la semana 1, están siendo eliminados por el sistema inmunitario del huésped [84-88], A las 8 semanas, el andamio de celulosa está vacío de toda la matriz provisional y restos celulares y bajos niveles de macrófagos y células multinucleadas de cuerpo extraño son todavía visibles dentro del andamio. En consonancia con la respuesta inmunitaria dentro del andamiaje de celulosa, se observa que el tejido circundante recupera su fisiología original. De hecho, a las 8 semanas de la implantación, el tejido circundante era casi similar al tejido de control. Aunque la respuesta inmunitaria y la inflamación a las 8 semanas son bajas, se observan bajos niveles de macrófagos dentro del andamio. Aunque tradicionalmente se asocian a la inflamación, los macrófagos tienen funciones beneficiosas que concuerdan con nuestros hallazgos. En concreto, se sabe que los macrófagos secretan factores de crecimiento y proangiogénicos, proteínas ECM y factores profibrogénicos que regulan activamente la fibroproliferación y la angiogénesis en la reparación y regeneración de tejidos [86]. Estas células están alterando el microentorno del andamio mediante la secreción de una nueva matriz extracelular de colágeno. La nueva matriz mostraba una densidad notablemente baja en comparación, lo que sugiere regeneración en contraposición a la organización característica de alta densidad y en forma de cable del colágeno que se encuentra en los tejidos cicatriciales [89].
Estos datos también demuestran que los andamios son proangiogénicos, lo que puede facilitar el transporte de sangre desde el tejido circundante [90]. Al igual que ocurre con el tejido nativo, un suministro limitado de sangre al andamio puede provocar isquemia y, potencialmente, necrosis. Curiosamente, se demostró que 5 biocerámicas con diámetros de poro inferiores a 400 μm provocaban una disminución del crecimiento de los vasos sanguíneos y limitaban el tamaño del diámetro de los vasos sanguíneos en implantadones in vivo. La estructura porosa de la arquitectura de la pared celular se compone de cavidades de pared celular superpuestas con diámetros que oscilan entre 100-3 OO μm con una distancia de interconexión manual de 4,04±1,4 μm. Como tal, el alto tamaño de la porosidad y la baja fracción de volumen de los andamios de celulosa son consistentes con la 10 promoción de la formación de vasos sanguíneos. En conjunto, el andamiaje de celulosa parece estar ahora libre de la matriz provisional y plenamente aceptado como implante subcutáneo.
También observamos una disminución del área del andamio con el tiempo, pero no parece que el andamio de celulosa esté en proceso de degradación. Más bien, el cambio en el área parece deberse al colapso de las cavidades de la pared celular en el perímetro del andamio como resultado del movimiento activo del ratón. No se espera que sea posible una degradación biológica activa, ya que los mamíferos carecen de las enzimas apropiadas para digerir la celulosa sintetizada en plantas [91,92]. Además, se sabe que la forma altamente cristalina de la celulosa que se encuentra en los tejidos vegetales es resistente a la degradación en mamíferos [92]. Por otra parte, se ha demostrado que los implantes de celulosa in vivo pueden activarse químicamente para que se degraden más fácilmente [93]. Sin embargo, las formas altamente cristalinas de celulosa presentan algunas de las respuestas inmunológicas más bajas [92].
Se utiliza una gran variedad de biomateriales aprobados clínicamente para tratar afecciones específicas en pacientes [1]. Estos biomateriales pueden derivarse de tejidos humanos y animales, polímeros sintéticos y materiales como el titanio y la cerámica [1,2,26,49,50,53,54,56,74,76,94- 106]. En la actualidad existe un gran interés por desarrollar biomateriales reabsorbibles que se degraden in vivo y actúen únicamente como un andamiaje temporal que promueva y favorezca la reparación o regeneración del tejido dañado o enfermo [49]. Además, los productos de la degradación también pueden tener efectos secundarios tóxicos o indeseables [53,110,111]. Por ejemplo, la reconstrucción de la oreja se ha convertido en un reto bien conocido de la ingeniería tisular. En los primeros estudios se emplearon andamiajes con forma de oreja fabricados a partir de cartílago de origen animal o humano [53,58,59,61,63,64]. Sin embargo, tras la implantación y posterior degradación del andamiaje, la oreja suele colapsarse o deformarse [60-62].
Los resultados aquí presentados sugieren que los biomateriales de celulosa de origen vegetal pueden ofrecer un enfoque potencial para la producción de andamios implantables. Este enfoque puede ser complementario a las estrategias de celulosa bacteriana [66,69-71,73,80,83,102,106,112-115]. Sin embargo, los resultados aquí proporcionados sugieren que los materiales derivados de plantas pueden ser rentables de producir, pueden ser convenientes de preparar para la implantación, pueden exhibir una biocompatibilidad clara, pueden presentar una capacidad de retener la forma mientras que apoyan la producción de matriz extracelular natural del anfitrión, y/o pueden promover la vascularización. En trabajos anteriores, los inventores han demostrado que los andamios pueden funcionalizarse con proteínas antes del cultivo in vitro. Se contempla aquí que el uso de la funcionalización de la superficie del andamio con factores de crecimiento y proteínas de matriz, por ejemplo, puede utilizarse para promover la invasión de tipos celulares específicos, minimizar aún más la respuesta inmune temprana, y/o promover la vascularización. Además, los andamiajes de celulosa pueden adoptar fácilmente formas y tamaños específicos, lo que ofrece la oportunidad de crear nuevos tejidos con propiedades geométricas específicas. Como se demuestra en el presente documento, los andamios de celulosa acelular son biocompatibles in vivo en ratones inmunocompetentes en las condiciones probadas, y pueden considerarse una nueva estrategia para, por ejemplo, la regeneración de tejidos.
EJEMPLO 4 - EJEMPLO ADICIONAL DE PROTOCOLO DE DESCELULARIZACIÓN
En el presente documento se describe otro protocolo de descelularización. En este ejemplo, las plantas se enfriaron en un congelador a -20°C durante 5 minutos para permitir que el tejido blando se endureciera. Se utilizó una rebanadora de mandolina para seccionar el tejido vegetal enfriado a un grosor uniforme medido con un calibre vemier. A continuación, las láminas se cortaron en segmentos y se descelularizaron utilizando un protocolo modificado de tejido de mamífero para eliminar el material celular y el ADN de las muestras de tejido, dejando al mismo tiempo un andamio intacto y tridimensional. El protocolo se modificó a partir de un protocolo para tejidos de mamíferos (Ott et al., 2008). Se colocaron muestras individuales de tejido en tubos de microcentrífuga esterilizados de 2,5 ml y se añadieron 2 ml de solución de dodecil sulfato sódico (SDS; Sigma-Aldrich) al 0,5% a cada tubo. Las muestras se agitaron durante 12 horas a 160 RPM a temperatura ambiente. A continuación, los andamios de celulosa resultantes se transfirieron a nuevos tubos de microcentrífuga estériles de 5, se lavaron y se incubaron durante 6 horas en PBS (Sigma-Aldrich) con estreptomicina/penicilina al 1% (HyClone) y anfotericina B al 1% (Wisent). En este punto, las muestras se utilizaron inmediatamente o se almacenaron en PBS a 4°C durante no más de 2 semanas. Los andamios de celulosa descelularizados resultantes pueden observarse en la FIGURA 1 A y B.
EJEMPLO 5 - CULTIVO CELULAR 10 BIDIMENSIONAL (2D) Y TRIDIMENSIONAL (3D) IN VITRO - IMPLANTACIÓN DE ANDAMIOS, ADHESIÓN CELULAR Y PROLIFERACIÓN CELULAR
En este estudio se utilizaron mioblastos de ratón C2C12, fibroblastos de ratón NIH3T3 y líneas celulares epiteliales humanas HeLa (todas obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC)). Las células se seleccionaron por representar el tipo celular más común utilizado en los laboratorios de biología celular. Se empleó el cultivo celular convencional 2D para cosechar las células mencionadas para la implantación del andamiaje. Las células se cultivaron en medios de cultivo celular estándar (DMEM con alto contenido en glucosa (HyClone)), suplementados con un 10% de suero bovino fetal (HyClone), un 1% de penicilina/estreptomicina (HyClone) y un 1% de anfotericina B (Wisent) a 37°C y un 5% de CO2 en matraces T75 (Thermo Scientific). Los medios de cultivo se cambiaban cada dos días y las células se pasaban al 80% de confluencia.
El procedimiento de siembra del andamio se llevó a cabo en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Los pocillos se recubrieron individualmente con polidimetilisiloxano (PDMS) para crear una superficie hidrófoba con el fin de que el andamio de celulosa fuera la única superficie adherible. Se recubrió la superficie de cada pocillo con una solución 1:10 de agente de curado: elastómero (Sylgard 184, Ellsworth Adhesives). Se dejó curar el PDMS durante 2 horas a 80°C. Las placas de 24 pocillos de PDMS se dejaron enfriar a temperatura ambiente y luego se enjuagaron con PBS estéril. Los andamios se cortaron en trozos de 0,5 X 0,5 cm y se colocaron dentro de cada pocillo. Los C2C12, NIH3T3 y HeLa se adhirieron y se alicuotaron a su concentración correcta. Sobre cada andamio se formó cuidadosamente una gota de 40 pL que contenía 6 X 106 células. Las muestras se colocaron en la incubadora durante 6 horas para permitir que las células se adhirieran a los andamios. A continuación, se añadieron 2 ml de DMEM a cada pocillo y las muestras se incubaron durante 48 horas. En ese momento, las muestras que contenían células de mamífero se transfirieron cuidadosamente a nuevas placas de cultivo tisular de 24 pocillos recubiertas de PDMS. Para una proliferación celular continuada, se cambiaron los medios de cultivo cada día y los andamios se trasladaron a nuevas placas de 24 pocillos 5 cada 2 semanas.
La adhesión y la proliferación de las células de mamífero se controlaron y determinaron mediante microscopía inmunofluorescente. Las figuras 5A-C, 16 y 17 muestran la adhesión y la proliferación continua de las líneas celulares utilizadas.
EJEMPLO 6 - EFECTOS DEL PRETRATAMIENTO SALINO Y FUNCIONALIZACIÓN DEL BIOMATERIAL DEL ANDAMIO
La descelularización se utilizó para obtener el andamiaje tridimensional de celulosa desprovisto de células nativas y ácidos nucleicos. Para llevar a cabo la descelularización se utilizó el tensioactivo dodecil sulfato sódico (SDS). El SDS se eliminó antes de repoblar el andamio con nuevas células, ya que de lo contrario éstas perecerían. Con andamios pequeños, la concentración de SDS puede ser baja; sin embargo, para objetos más grandes se puede utilizar una concentración más alta de SDS para llevar a cabo la descelularización completa. Los restos de SDS pueden eliminarse mediante un lavado suficiente, especialmente cuando se utilizan concentraciones bajas de SDS. En algunos casos, las concentraciones más altas de SDS pueden ser difíciles de eliminar mediante lavado y requerir mucho tiempo. Como se describe en el presente documento, la adición de CaCl2 puede facilitar la eliminación del SDS residual del andamio descelularizado. Sin querer estar limitado por la teoría, se cree que el principio que subyace a este concepto es utilizar el tampón salino para forzar la formación de micelas de SDS. Se puede utilizar una concentración de sal suficientemente alta para estimular la formación adecuada de micelas, y una concentración de sal demasiado alta puede hacer que la sal caiga sobre el biomaterial. El residuo de sal puede eliminarse mediante varias técnicas, como la incubación con dH2Ü, ácido acético o DMSO. También puede utilizarse la sonicación para eliminar los restos fuertemente ligados. La concentración de CaCb puede depender de la cantidad de SDS residual. En este estudio, la descelularización se llevó a cabo utilizando un 0,1% de s Ds en agua. La concentración de CaCl2 puede depender de la cantidad de SDS utilizada para la descelularización, como se muestra en la FIGURA 18. A una concentración de 100 mM, la concentración de CaCl2 puede depender de la cantidad de SDS residual. A una concentración de 100 mM, una cantidad modérate de sal/micelas se estrelló contra el andamio (FIGURA 19A). El residuo de sal se eliminó
eficazmente incubando el andamio en dH2O (FIGURA 19B).
Se obtuvo un mejor crecimiento celular tras la eliminación del SDS residual y la sal (FIGURA 20). La adición de sal puede facilitar la eliminación del SDS residual; sin embargo, la sal que cae sobre el biomaterial también debe eliminarse para evitar problemas de tonicidad. Después de que la sal fuerza al SDS a formar micelas, el siguiente paso es eliminar la sal. El residuo de sal puede eliminarse con diversas técnicas, como el tratamiento por sonicación, la incubación en agua, la incubación en ácido acético y la incubación en DMSO (FIGURA 20).
Además del CaCb, también pueden utilizarse otras sales para eliminar el SDS residual del biomaterial (FIGURA 21). El lavado de los biomateriales con una sal que tiene un catión divalente condujo a un mayor crecimiento de la célula 10 que sus homólogos monovalentes, probablemente porque los cationes divalentes promovieron la formación de micelas de SDS más apretadas (FIGURA 21).
En determinadas realizaciones, la adición de la sal puede alterar la concentración micelar crítica (CMC) del tensioactivo. A cierta concentración conocida como punto de turbidez, puede producirse una transición de fase y las micelas se vuelven insolubles y pueden lavarse fácilmente.
Pueden utilizarse diferentes compuestos salinos para llevar a cabo la tarea de eliminar el SDS residual del biomaterial. Se utilizaron PBS, KCl, CaCb, MgCb, CuSCh, KH2PO4, MgSCh, Na2CC>3 e ibuprofenato sódico (todos 100 mM) como lavado salino para limpiar el biomaterial y eliminar el SDS residual. Cada tratamiento salino mostrado en la FIGURA 21 permitió el crecimiento celular; sin embargo, las sales con cationes divalentes (CaCb y MgCb) así como el grupo aniónico carbonato promovieron un mayor crecimiento celular.
Funcionalización de biomateriales
La estructura de la celulosa puede funcionalizarse bioquímicamente en función del uso previsto del biomaterial. Como se comprenderá, dicha modificación puede ampliar los usos y aplicaciones potenciales. La celulosa, por ejemplo, tiene grupos hidroxilo libres que pueden aprovecharse para conjugar el material con diferentes moléculas.
Dos clases de reacciones comúnmente utilizadas para este tipo de modificación son las reacciones de acilación y alquilación. Estas reacciones permiten unir cadenas de hidrocarburos de distintas longitudes a la estructura de la celulosa a través de los grupos hidroxilo libres. Las diferentes longitudes y formas de las cadenas pueden ser útiles cuando el impedimento estérico es un factor, por ejemplo. El uso de cadenas más grandes puede disminuir el impedimento estérico, y viceversa. Las reacciones de acilación con ácidos dicarboxílicos 5 pueden ofrecer posibilidades para funcionalizar el biomaterial. Algunas clases de ácidos dicarboxílicos que pueden utilizarse pueden ser, entre otros, ácidos dicarboxílicos saturados lineales, ácidos dicarboxílicos ramificados, ácidos dicarboxílicos insaturados, ácidos dicarboxílicos sustituidos y ácidos dicarboxílicos aromáticos. Además de las reacciones de acilación y alquilación, pueden utilizarse otros compuestos para mediar la conexión entre el grupo funcional y la celulosa, como 10 compuestos que contienen boro, azufre, nitrógeno y/o fósforo, por ejemplo.
Pueden añadirse diferentes grupos funcionales al otro extremo de la cadena para cumplir una función determinada. Estos grupos funcionales pueden incluir, entre otros, grupos que contengan hidrocarburos, oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo, boro y/o halógenos. La elección del grupo funcional puede depender de la aplicación prevista. Por ejemplo, si la aplicación prevista es impedir el crecimiento celular en determinadas zonas, puede utilizarse un grupo funcional hidrocarburo estérico no polar; por el contrario, si la aplicación prevista es promover el crecimiento celular, puede elegirse un ácido carboxílico, de modo que las proteínas de la matriz extracelular, como el colágeno, puedan unirse a la celulosa.
Diferentes elementos de la pared celular pueden permitir mejorar determinadas propiedades estructurales del biomaterial. Las estructuras de la pared celular secundaria de los tejidos de espárragos y manzanas pueden contener, por ejemplo, pectina y lignina (FIGURA 22) para dar resistencia al biomaterial.
Como se comprenderá, los biomateriales de andamiaje no se limitan a la celulosa. Pueden utilizarse muchas otras estructuras de pared celular para el biomaterial. En la FIGURA 22, también hay cinamaldehídos, pectina y lignina, además de la celulosa mostrada. Estas estructuras secundarias adicionales de la pared celular 25 también pueden funcionalizarse.
La modificación química de la celulosa puede permitir controlar las propiedades químicas y físicas del biomaterial. Como resultado, el biomaterial puede especializarse para fines específicos. Por ejemplo, puede conseguirse un patrón de crecimiento celular inhibiendo el crecimiento celular en determinadas zonas (temporal o permanentemente) y fomentándolo en otras. Además, pueden introducirse moléculas específicas para cada tipo de célula en el biomaterial mediante estos métodos de funcionalización para promover el crecimiento/invasión/diferenciación de tipos específicos de células. La funcionalización del biomaterial también puede permitir la recreación de microambientes biológicamente relevantes, 5 que intervienen en la función celular adecuada y en la ingeniería de tejidos.
EJEMPLO 7 - BIOMODIFICACIÓN DE SUPERFICIES
La celulosa nativa puede soportar células de mamíferos, como los mioblastos C2C12, los fibroblastos 3T3 y las células epiteliales humanas HeLa. Sin embargo, un biomaterial funcional puede ajustarse química y mecánicamente para adaptarlo al uso previsto. En estos experimentos se utilizaron dos técnicas diferentes para modificar la rigidez del andamio de celulosa descelularizado. Además, las imágenes de contraste de fase demuestran que los biomateriales siguen soportando el cultivo de células de mamífero tras la modificación química y física.
Para funcionalizar los andamiajes con colágeno, las muestras se incubaron durante 6 horas en una solución de ácido acético al 10% y 1 mg/mL de colágeno de cola de rata tipo I (Invitrogen), tras lo cual se lavaron en PBS antes de su uso. Para reticular químicamente los andamiajes, las muestras se incubaron en una solución de glutaraldehído al 1% de grado EM (Sigma-Aldrich) durante 6 horas. A continuación, los andamiajes se enjuagaron en PBS y se incubaron en una solución de borohidruro sódico al 1% (Sigma-Aldrich) durante toda la noche para reducir el glutaraldehído que no hubiera reaccionado. Antes de sembrar las células en los andamios, todas las muestras (nativas, recubiertas de colágeno o reticuladas) se incubaron en medio de cultivo de células de mamífero (descrito a continuación) durante 12 horas en una incubadora de cultivo de tejidos estándar mantenida a 37 °C con un 5% de CO2. Los resultados se muestran en la FIGURA 23 A-D. El tejido nativo y los andamios no modificados no muestran ninguna diferencia significativa en las propiedades mecánicas. Tanto los andamios funcionalizados con colágeno como los reticulados químicamente mostraron un aumento significativo de la elasticidad en comparación con los andamios DMEM. Los andamiajes descelularizados (SDS), funcionalizados con colágeno (SDS+Coll) y reticulados con glutaraldehído (SDS+GA) soportaron el crecimiento de células C2C12 en las condiciones experimentales.
EJEMPLO 8 - ANDAMIOS DE CELULOSA Y TÉCNICAS DE MOLDEADO, REVESTIMIENTOS
Anteriormente hemos mostrado cómo los andamios de celulosa pueden actuar como biomateriales 3D independientes. Aquí mostramos cómo la celulosa descelularizada puede cortarse en diferentes formas macroscópicas (FIGURA 24: anillos). Se sembraron células mioblásticas de ratón C2C12 en el biomaterial y se dejó que las células proliferaran e invadieran el andamio durante dos semanas. Al cabo de dos semanas, las estructuras estaban llenas de células (FIGURA 24). Los biomateriales también pueden utilizarse en combinación con técnicas de moldeado convencionales. En este estudio, mostramos cómo se puede utilizar un constructo de celulosa para el moldeo inverso temporal y permanente utilizando gelatina y colágeno respectivamente (FIGURA 24B-C). La gelatina tiene una temperatura de fusión de 32°C. Para el molde inverso temporal, las células se resuspendieron en una solución de gelatina al 10% en medio de cultivo celular a 37°C. Poco después de sembrar las células en el biomaterial, la solución de gelatina se enfrió por debajo de su temperatura de fusión y se solidificó. La formación del gel de gelatina dio tiempo a las células para adherirse al sustrato. Una vez que el gel de gelatina se calentó a 37°C después de colocarlo en la incubadora, la gelatina se derritió mientras que las células permanecieron en el biomaterial. A la inversa, la celulosa también puede actuar como molde inverso para geles permanentes cuando se desea el gel. Para el molde inverso permanente, se cubrió la celulosa con una solución de colágeno que contenía células (FIGURA 24C). La solución de colágeno se solidificó rápidamente y formó un gel permanente que contenía el biomaterial y las células.
Las técnicas de moldeado pueden aplicarse además a otros hidrogeles, no sólo a la gelatina y el colágeno. Otros posibles geles pueden ser, entre otros, agarosa, poliuretano, polietilenglicol, xantano, metilcelulosa, alginato, hialuronano, carboximetilcelulosa, quitosano, ácido poliacrílico, alcohol polivinílico, poliéster, hidrocoloides, goma arábiga, pectina y/o dextrano. Los hidrogeles también pueden impregnarse con otros compuestos, como factores de crecimiento, fármacos, etc. Estos geles también pueden funcionalizarse con cadenas laterales activas. Como resultado, se contempla que, por ejemplo, la celulosa puede tener una funcionalidad, y el hidrogel puede tener una segunda funcionalidad. Además, en ciertas realizaciones pueden usarse en combinación múltiples hidrogeles con múltiples funcionalidades. Por último, estos geles pueden ser temporales y fundirse con el tiempo, y/o pueden reticularse con el andamiaje original de celulosa o quitina para crear materiales multifuncionales con dos o más propiedades mecánicas/químicas que pueden depender o no del tiempo.
Pueden utilizarse elementos/compuestos adicionales para recubrir la superficie o pueden unirse al biomaterial mediante funcionalización. La elección del elemento adicional depende de la aplicación prevista. Por ejemplo, si el biomaterial está destinado a promover la regeneración nerviosa, puede añadirse la proteína Factor de Crecimiento Nervioso (NGF). Por el contrario, si el biomaterial es para la administración de fármacos, se puede utilizar una cápsula de virus que contenga el fármaco. Además, el biomaterial puede recubrirse con, por ejemplo, una sal de ibuprofeno si la respuesta inmunitaria es problemática. Se contempla la posibilidad de añadir diversos elementos al biomaterial. Estos elementos pueden incluir, entre otros, proteínas (p. ej., colágeno, elastina e integrina), ácidos nucleicos (p. ej., ADN, ARN y ARNsi), ácidos grasos (p. ej., ácido esteárico, ácido palmítico y ácido linoleico), metabolitos (p. ej., ácido aspártico, vitamina C y ácido linoleico), etc.). p. ej. ácido aspártico, vitamina B2 y glicerol), ligandos (p. ej. vitamina D, testosterona e insulina), antígenos (p. ej. péptidos, 10 polisacáridos y lípidos), anticuerpos (p. ej. IgA, IgE e IgG), virus (por ejemplo, VIH, HEP C y viruela vacuna), polímeros sintéticos (por ejemplo, nailon, poliéster y teflón), grupos funcionales (ácidos carboxílicos, ésteres e imidas), fármacos (por ejemplo, hidrocodona, amoxicilamina, etc.). hidrocodona, amoxicilina, Plavix, por ejemplo), vesículas (por ejemplo, vacuolas, vesículas de transporte y vesículas de secreción), moléculas orgánicas (por ejemplo, carbohidratos, ligasas y vitaminas) y/o moléculas inorgánicas (por ejemplo, hierro, titanio y oro). Además, pueden añadirse bacterias (como las bifidobacterias, entre otras) para alterar/controlar el microbioma. Cuando se desee especificidad celular, podrá incluirse, por ejemplo, un factor de
reclutamiento celular.
Estructuras de soporte para el biomaterial
Pueden utilizarse elementos/compuestos adicionales como estructuras de soporte del biomaterial. La elección del elemento adicional puede depender de la aplicación prevista. Por ejemplo, si el biomaterial debe soportar una carga constante o mantener su forma, puede incluirse una estructura de titanio. A modo de ejemplo, tales elementos/componentes pueden incluir titanio, acero de bajo C, aluminio, aleaciones de C0-Cr, acero inoxidable tipo 316, cemento PMMA, PE de ultra alto MW, etc. En ciertas realizaciones, dichos elementos pueden añadirse dentro (en el interior) del biomaterial, fuera del biomaterial, o ambos. En ciertas realizaciones, tales elementos/compuestos pueden incluir aquellos 25 que ya han pasado la aprobación de la FDA.
EJEMPLO 9- INVASION Y PROLIFERACION CELULAR
Se utilizó microscopía confocal de barrido láser para obtener imágenes de secciones z de ~300 μm de la parte superior e inferior de las construcciones de celulosa. Se tomaron imágenes de ambos lados porque la profundidad de campo era menor que el anillo de ~1,2 mm de grosor. La FIGURA 25 muestra las proyecciones xy y zy de las células sobre el biomaterial de celulosa. Los núcleos de las células (azul) se encontraban a lo largo de las paredes celulares de celulosa (rojo) (FIGURA 25 proyecciones xy). Las vistas ortogonales de las exploraciones confocales revelan que las células invadieron el andamio (FIGURA 25 proyecciones zy). Las imágenes confocales permitieron cuantificar la invasión y la proliferación celular (FIGURA 26). Las imágenes de los núcleos celulares se umbralizaron mediante el complemento de umbral adaptativo de ImageJ y se utilizó el complemento de análisis de partículas para medir el área nuclear total. Inicialmente, las células se sembraron en la parte superior de la muestra. La proporción del área nuclear que cubría la parte superior e inferior del biomaterial se utilizó para medir la invasión celular. No se observaron diferencias estadísticas entre las tres condiciones de invasión celular (FIGURA 26). De hecho, la proporción entre la parte superior y la inferior fue cercana a 1 (FIGURA 26). Se calculó el área nuclear total de las secciones fotografiadas para comparar la proliferación de las células en cada condición. Se observó que el área nuclear total no diterta significativamente entre las tres condiciones. En consecuencia, el moldeo inverso temporal y permanente no afectó a la proliferación celular en las condiciones ensayadas.
Pueden utilizarse técnicas de moldeado, así como técnicas de funcionalización, para unir diferentes estructuras. Como resultado, en determinadas realizaciones, pueden crearse grandes estructuras complejas para imitar tejidos in vivo, por ejemplo.
EJEMPLO 10 - ARQUITECTURA FABRICADA ARTIFICIALMENTE EN ANDAMIOS DE CELULOSA DESCELULARIZADA DE ORIGEN VEGETAL
La fabricación artificial de la arquitectura dentro de los andamios de celulosa vegetal se llevó a cabo para demostrar la viabilidad de la creación de una arquitectura diferente para fines específicos, tales como el aumento de la migración de células huésped en el andamio de celulosa. Los resultados se muestran en la FIGURA 27, donde se creó dicha arquitectura artificial en andamiajes basados en celulosa derivada de manzana.
En estos estudios, se anestesió a los ratones utilizando isoflurano USP-PPC al 2% (Pharmaceutical partners of Canada, Richmond, ON, Canadá) con los ojos protegidos con la aplicación de gel líquido oftálmico (Aleo Canada In., ON, Canadá). Se afeitaron los pelos de la espalda de los ratones y se limpió y esterilizó la piel subyacente con ENDURE 400 Scrub-Stat4 Surgical Scrub (gluconato de clorhexidina, solución al 4%; Ecolab Inc., Minnesota, EE.UU.) y Soluprep (clorhexidina al 2% p/v y alcohol isopropílico al 70% v/v; 3M Canada, London, ON, Canadá). La hidratación de los animales se mantuvo mediante inyección subcutánea (s.c) de 1 ml de solución de cloruro sódico al 0,9% (Hospira, Montreal, QC, Canadá). A lo largo de los procedimientos quirúrgicos se mantuvieron todas las medidas estrictas de esterilidad para las cirugías de supervivencia. Para implantar los andamiajes, se realizaron dos incisiones de 8 mm en la sección dorsal de cada ratón (superior e inferior). Se implantaron dos muestras de andamiaje de celulosa por separado e independientemente en cada ratón. A continuación, se suturaron las incisiones con polipropileno monofilamento 6-0 Surgipro II (Covi di en, Massachusetts, EE.UU.) y se aplicó bupivicaína transdérmica al 2% (como monohidrato; Chiron Compounding Pharmacy Inc., Guelph, ON, Canadá) de forma tópica en los lugares de la cirugía para prevenir la infección. Además, se administró buprenorfina (como 10 HCL) (0,03 mg/ml; Chiron Compounding Pharmacy Inc. Guelph, ON, Canadá) s. c. como analgésico. A continuación, todos los animales fueron controlados cuidadosamente durante los 3 días siguientes por los Servicios de Cuidado de Animales y recibieron tratamientos adicionales de los mismos tratamientos farmacológicos. Una y cuatro semanas después de la implantación del andamio, los ratones fueron eutanasiados por inhalación de CO2. La piel dorsal se resecó cuidadosamente y se sumergió inmediatamente en solución de PBS. A continuación, se fotografiaron las secciones de piel que contenían andamios de celulosa, se cortaron y se fijaron en formol al 10% durante al menos 48 horas. A continuación, las muestras se conservaron en etanol al 70% antes de ser incrustadas en parafina por el PALM Histology Core Facility de la Universidad de Ottawa.
Los resultados se muestran en la FIGURA 27. Se crearon dos arquitecturas diferentes dentro de los andamios de
celulosa descelularizados para demostrar la viabilidad de la creación de diferentes arquitecturas con el biomaterial para fines específicos, tales como aumentar la migración de las células huésped en el andamio de celulosa. En la FIGURA 27A se utilizó un punzón de biopsia de 1 mm para crear cinco espacios cilíndricos negativos dentro del andamio de celulosa. Por el contrario, en la FIGURA 27B se utilizó un punzón de biopsia de 3 mm para crear un único espacio negativo centrado. Sólo después de 4 semanas de implantación se pudo observar un aumento de la formación de vasos sanguíneos procedentes directamente de los espacios negativos derivados artificialmente (FIGURA 27C y D). En la 28C se observan vasos sanguíneos en cada uno de los cuatro bordes del biomaterial, lo que sugiere un aumento de la vascularización dentro del espacio negativo derivado artificialmente. Del mismo modo, en 27D los vasos sanguíneos se pueden observar en la parte superior del andamio de celulosa lo que sugiere que los vasos sanguíneos viajaron a través del andamio de celulosa. Secciones transversales de andamios de celulosa representativos teñidos con H&E (FIGURA 27E-F).
EJEMPLO 11 - VARIOS EJEMPLOS DE TEJIDOS Y ESTRUCTURAS DE ORIGEN CELULÓSICO EN EL REINO VEGETAL
La FIGURA 28 muestra varios ejemplos de tejidos y estructuras de origen celulósico seleccionados del reino vegetal, mostrados a las 4 y/o 8 semanas. Esta FIGURA muestra imágenes que representan andamios de celulosa de diversas fuentes, su resección e histología después de 4 semanas y/u 8 semanas, según se indica.
En estos estudios, se implantaron subcutáneamente en ratones diversos andamiajes de celulosa derivada de plantas para evaluar la biocompatibilidad a las 4 u 8 semanas. Se implantaron tejidos selectivos de diversas plantas durante un periodo de 4 u 8 semanas para evaluar la biocompatibilidad de la celulosa derivada de plantas y la arquitectura vegetal en la migración de células huésped in vivo. En todos los ejemplos se observó migración y proliferación celular en el andamiaje de celulosa, lo que pone de relieve la biocompatibilidad de los andamiajes de celulosa de origen vegetal en estos experimentos. Las implantaciones subcutáneas de los biomateriales de andamiaje de celulosa se realizaron en la región dorsal de un modelo de ratón C57BL/10ScSnJ mediante pequeñas incisiones en la piel (8 mm). Se midió cada implante antes de su implantación para comparar el área de andamios (Primera columna: andamio de celulosa). Los injertos de celulosa se resecaron (segunda columna: Resección) a las 4 u 8 semanas, según se indicó. Se cortaron secciones seriadas de 5 ppm de grosor, comenzando a 1 mm dentro del andamio de celulosa, y se tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E) (tercera columna: Histología). Para la evaluación de la infiltración celular, se capturaron micrografías con el escáner de diapositivas Zeiss MIRAX MIDI (Zeiss, Toronto, Canadá) equipado con un objetivo de 40x 20 y se analizaron con Pannoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Budapest, Hungría) y el software ImageJ.
EJEMPLO 12 - BIOCOMPATIBILIDAD DE BIOMATERIALES DE CELULOSA DE ORIGEN VEGETAL IMPLANTADOS SUBCUTÅNEAMENTE (PRÓTESIS-ESTÉTICA)
Basándose en el Ejemplo 3 anterior, se realizaron implantes y resecciones de andamios de celulosa para evaluar los implantes subcutáneos. Los resultados experimentales se muestran en la FIGURA 29. Las implantaciones subcutáneas de biomateriales de andamiaje de celulosa se realizaron en la región dorsal de un modelo de ratón C57BL/10ScSnJ mediante pequeñas incisiones en la piel (8 mm) (FIGURA 29A). Se midió cada implante antes de su implantación para comparar el área del andamio (FIGURA 29B).
Los andamios de celulosa se resecaron a la semana (FIGURA 29D), a las 4 semanas (FIGURA 29E) y a las 8 semanas (FIGURA 29F) después de las cirugías y se tomaron fotografías macroscópicas (piel de control en la FIGURA 29C). En cada momento, los vasos sanguíneos están claramente integrados con el implante de celulosa, lo que demuestra su biocompatibilidad. Tampoco se detecta inflamación aguda o crónica en 5 el tejido que rodea el implante. Los cambios en la superficie del andamio de celulosa a lo largo del tiempo se presentan en la FIGURA 29G. El andamio previo a la implantación tenía una superficie de 26,30±1,98 mm2. Tras la implantación, el área del andamio disminuyó a 20,74±1,80 mm2 después de 1 semana, 16,41±2,44 mm2 después de 4 semanas y 13,82 ±3,88 mm2 después de 8 semanas. La superficie del andamio de celulosa presenta una disminución significativa de unos 12 mm2 (48%) tras 8 semanas de implantación (* 10 = P≤0,001; n= 12-14).
Para el análisis histológico, se realizaron los siguientes experimentos.
Se cortaron secciones seriadas de 5 μm de grosor, comenzando a 1 mm dentro del andamio de celulosa, y se tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E) y tricrómico de Masson. Para la inmunocitoquímica, la recuperación de epítopos inducida por calor se realizó a 110 °C durante 12 min con tampón citrato (pH 6,0). Los anticuerpos primarios antiCD31/PECAMl (1:100; Novus Biologicals, NB100-2284, Oakville, ON, Canadá), anti-alfa actina de músculo liso (1:1000, ab5694, abcam, Toronto, ON, Canadá) y anti-CD45 (1:3000; abl0558, abcam, Toronto, ON, Canadá) se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. El reactivo de bloqueo (Background Sniper, Biocare, Medical, Concorde, CA, EE.UU.) y el sistema de detección MACH 4 (Biocare Medical, Concord, CA, EE.UU.) se aplicaron 20 de acuerdo con las especificaciones de la empresa. Para la evaluación de la infiltración celular, la deposición de matriz extracelular y la vascularización (angiogénesis), se capturaron micrografías con el escáner de diapositivas Zeiss MIRAX MIDI (Zeiss, Toronto, Canadá) equipado con un objetivo de 40 aumentos y se analizaron con Pannoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Budapest, Hungría) y el software ImageJ.
La FIGURA 30 muestra los resultados de biocompatibilidad e infiltración celular. Las secciones transversales de andamios de celulosa representativos se tiñeron con H&E y anti-CD45. Estas vistas globales muestran la reacción aguda moderada-severa anticipada a cuerpo extraño a la semana (FIGURA 30A), los procesos inmunitarios crónicos leves y de limpieza posterior a las 4 semanas (FIGURA 30B) y, por último, el andamio de celulosa asimilado al tejido nativo del ratón a las 8 semanas (FIGURA 30C). Las regiones de interés a mayor aumento (FIGURA 30D-F), véase el recuadro (FIGURA 30A-C), permiten observar la población de tipos celulares dentro de los procesos de asimilación del biomaterial. A la semana, se observan poblaciones de granulocitos, concretamente; polimorfonucleares (PMN) y eosinófilos que caracterizan la respuesta inmunitaria aguda de modérate a grave, una reacción normal a los procedimientos de implantación (FIGURA 30D). A las 4 semanas, puede observarse una disminución de la respuesta inmunitaria (respuesta inmunitaria de leve a 5 baja) y la población de células dentro de la epidermis que rodea los andamios contiene ahora niveles más altos de monocitos y linfocitos que caracterizan la respuesta crónica (FIGURA 30E). Por último, a las 8 semanas, la respuesta inmunitaria se ha reabsorbido por completo y el tejido de la epidermis parece ahora normal (FIGURA 30F). La respuesta inmunitaria observada con la tinción de H&E se confirma utilizando el anticuerpo anti-CD45, un conocido marcador de leucocitos (FIGURA 1030 G-I). La población de células dentro del andamio son ahora principalmente macrófagos, células multinucleadas y fibroblastos activos.
La presencia de fibroblastos activos planteó la cuestión de si el andamio de celulosa actuaba como sustrato para la deposición de nueva matriz extracelular. Esto se determinó mediante la tinción con tricrómico de Masson de portaobjetos de andamiajes de celulosa fijados en cada punto temporal tras la implantación (FIGURA 31). A la semana de la implantación, el estudio histológico muestra la ausencia de estructuras de colágeno en el interior del andamio de colágeno (FIGURA 31A, D, G). A las 4 semanas, comienzan a depositarse pequeñas cantidades de colágeno en el interior del andamio (FIGURA 31B, E, H) y a las 8 semanas, grandes cantidades de colágeno son claramente visibles dentro de muchas cavidades del andamio (FIGURA 31C, F, I). La presencia de fibroblastos activos identificados a través de la morfología (tinción de H&E, con forma de huso) y 20 tinción anti-alfa actina de músculo liso (datos no mostrados) es totalmente coherente con el gran grado de depósitos de colágeno observado a las 8 semanas. La complejidad de la red de colágeno depositada se pone de manifiesto en la FIGURA 311, donde son visibles las fibras de colágeno individuales dentro de la matriz de colágeno. Esto contrasta con la organización característica de alta densidad, gruesa y en forma de cable del colágeno que se encuentra en el tejido cicatricial.
También se identificaron capilares de entre 8 y 25 μm en el interior de los andamios a partir de la primera semana tras la implantación. A las 4 y 8 semanas de la implantación, se observaron vasos sanguíneos y capilares en el interior del andamiaje y en el tejido dérmico circundante. Observamos la presencia de vasos sanguíneos en el andamio de celulosa y en la dermis circundante en las fotos macroscópicas tomadas durante la resección (FIGURA 32A). Se identifican múltiples secciones transversales de vasos sanguíneos, con presencia de glóbulos rojos (GR), a las 4 semanas de la implantación del andamio (FIGURA 32B; tinción de H&E). Los mismos resultados se obtienen 8 semanas después de la implantación, donde se observan claramente capilares con glóbulos rojos y células endoteliales (FIGURA 32C; Tricrómico de Masson).
EJEMPLO 13 - INJERTOS BIOINSPIRADOS Y BIOFUNCIONALES PARA LA REPARACIÓN DE 5 LESIONES MEDULARES
Los procesos aquí descritos pueden utilizarse para producir injertos de celulosa estériles que conserven su forma y resistencia mecánica. Utilizando nuestro propio aparato de pruebas mecánicas a granel, el módulo elástico de nuestros injertos de celulosa nativa se ha registrado en ~2MPa cuando el injerto se comprime en la dirección paralela a los microcanales rectos. Cuando los injertos se comprimen en una dirección perpendicular a los microcanales, se observa que el módulo es menor en aproximadamente un orden de magnitud. Estos valores coinciden en gran medida con el módulo elástico de la duramadre y la piamadre, lo que significa que estos injertos se encuentran dentro del rango de las propiedades mecánicas de gran parte del tejido de la médula espinal circundante. La FIGURA 33 muestra imágenes de estructuras y microcanales de xilema de espárrago descelularizado.
Las disecciones y resecciones cerebrales de ratas adultas permitieron la derivación de neuroesferas primarias de rata. Se limpió la región dorsal exponiendo la médula. Utilizando las tenazas para maléolos se retiró el hueso posterior del cráneo, hasta el lóbulo frontal, exponiendo el cerebro a medida que se retiraban partes del cráneo. El cerebro se extrajo suavemente del cráneo con el corte final de los bulbos olfatorios. El cerebro extraído se sumergió en una placa de Petri llena de medio de disección 20 en hielo (MEM Alpha médium (Life Technologies Inc) 1% L-Glutamina (Life Technologies Inc) y 1% Penicilina (Life Technologies Inc). A continuación, se seccionó el cerebro en la matriz cerebral y las secciones que contenían el hipocampo. La materia gris justo lateral al 3er ventrículo se recogió en un tubo de ensayo con medio de disección. El tejido de materia gris en el medio de disección se centrifugó continuamente y se recogió el supematiente. Una vez eliminado todo el supemante
el tubo final se centrifugó y el pellet se resuspendió en 2 mL de medio de cultivo (Advanced DMEM/F12 médium (Life Technologies Inc), 1% L-Glutamine (Life Technologies Inc) y 1% suplemento N2 (CEDARLANE LABORATORIES LTD)). La solución celular resuspendida se alicuotó en placas de 6 pocillos de fijación ultrabaja con 0,001% de factor de crecimiento epidemial humano y factor de crecimiento de fibroblastos básicos (PEPROTECH) para permitir la proliferación de las neuroesferas primarias de rata. Las neuroesferas se sembraron localmente sobre injertos individuales en cámaras de cultivo celular fabricadas a medida. Las neuroesferas se cultivaron y mantuvieron durante
2 semanas en incubadoras con un 5% de CO2. Los medios de cultivo se cambiaron diariamente. Las muestras de andamiaje se fijaron con paraformaldehído al 4%. La célula de celulosa se tiñó con el protocolo 5 utilizado anteriormente. Las neuroesferas se tiñeron con aglutinina de germen de trigo (WGA) 488 (Invitrogen) examinada y con microscopía de fluorescencia confocal (FIGURA 34A).
Siguiendo un protocolo similar al discutido en el estudio del Ejemplo 3, la planta vascular descelularizada se implantó subcutáneamente en ratones. Los resultados histológicos demuestran que después de 4 semanas de implantación, las estructuras vasculares permanecen intactas y son evidentes en todo el andamio 10 (FIGURA 34B). En consonancia con las estructuras, pueden observarse células huésped en toda la extensión de 5 mm del andamio de celulosa. Tras el éxito de los resultados primarios in vitro e in vivo, el andamio vegetal descelularizado se transformó en un injerto para lesiones de la médula espinal. Se anestesiaron ratas hembra Sprague Dawley con isoflurano. Se afeitó la piel suprayacente y se preparó con Betadine. En condiciones asépticas y utilizando instrumentos esterilizados, se expusieron las vértebras T7 a TIO. Tras la disección de los músculos dorsales e intercostales, se realiza una laminectomía en T8 y T9. La duramadre se expone con microtijeras. La médula espinal T8 se secciona con microtijeras en un solo movimiento. Cualquier hemorragia resultante de la transección se controla con surgifoam. Se deja que la médula espinal se retraiga y se mueve y coloca el andamio de celulosa para conectar los muñones caudal y craneal (FIGURA 34C). T ras la colocación del andamio, 20 se utilizó el pegamento de fibrina Tisseel (Baxter) para fijar el injerto de celulosa. La capa muscular de la incisión se cerró con material de sutura Vicryl 3-0 y la epidermis y la dermis se cerraron con pinzas Michel. Se administró buprenorfina antes del cierre para garantizar su actividad en el momento en que las ratas se recuperan de los anestésicos.
Se observó que las puntuaciones BBB aumentaban en el transcurso de 8 semanas.
Ocho semanas después de la implantación, las ratas (n=7) mostraron una mejora de la actividad locomotora (BBB = 9,2 ±2,5), mostrando un paso coordinado y la capacidad de soportar peso (FIGURA 35). Además, a las 8 semanas, se realizó una segunda transección de la médula espinal (por debajo del injerto), lo que provocó que las puntuaciones BBB volvieran a 0. Las ratas de control (n=7, sólo fibrina) mostraron puntuaciones BBB en el rango de 0 a 1. Los resultados sugieren que es probable que la recuperación locomotora no se deba al reflejo. Las médulas espinales se diseccionaron a las 8 semanas y se seccionaron en el lugar del injerto. Los portaobjetos se tiñeron con una combinación de hematoxilina, eosina y azul rápido de luxol (H&E-LFB) para indícar las neuronas mielinizadas. Los datos revelaron una tinción positiva de las células huésped que pasaban por los microcanales del injerto, lo que concuerda con la mejora de la función locomotora (FIGURA 35D). Además, pudimos demonstrar 5 y optimizar un protocolo de RM que permite observar la continuidad de la médula espinal y si el injerto se ha colapsado sin sacrificar a los animales. La interfaz de muñón craneal y caudal (FIGURA 35A-i, 3A-iii) se puede diferenciar claramente firom el injerto de andamio (FIGURA 35A-ii). Las Figuras 36 y 37 muestran una vista global del injerto de médula espinal implantado en la región T8-T9 de la columna vertebral, y secciones ventrales del lugar de transección circundante, respectivamente. Como se muestra en 10 la FIGURA 37, se pueden observar filamentos verdes que rodean el injerto medular estirándose en dirección ventral (flechas rojas). Estos filamentos representan neuronas maduras dentro del sitio transeccionado de la rata después de 12 semanas in vivo. Por el contrario, en el control B) no se observan neurofilamentos organizados, lo que indica una falta de filamentos maduros en la zona de transección de control. Además, la tinción de Hoechst revela un número significativamente mayor de núcleos, y como tales células, que rodean el injerto espinal en el sitio de la transección en comparación con el control.
En estos estudios, la inserción del biomaterial de andamiaje entre los muñones de la médula espinal transeccionados, seguida de la aplicación de pegamento de fibrina y la reparación de la herida, ha demostrado que, tras sólo 8 semanas de estudio, las ratas de control (n=4, sin injerto) no presentaban ninguna mejora en la función motora y permanecían completamente paralizadas (BBB entre 0-1). Sorprendentemente, las ratas (n=7) que poseían un implante derivado del espárrago 20 exhibían un BBB de 9,2 ± 2,5, lo que demuestra una mejora espectacular de la función locomotora en estos estudios. Estos animales exhiben un paso coordinado y la capacidad de soportar peso. Por lo tanto, los implantes derivados de espárragos son prometedores para el tratamiento de la LME en un modelo de rata. En ciertas realizaciones, los biomateriales de andamiaje aquí descritos pueden utilizarse para reclutar células neuroprogenitoras en el tejido dañado de la médula espinal para mejorar la función motora.
EJEMPLO 14 - ANDAMIO DESCELULARIZADO VEGETAL PARA INJERTO CUTÅNEO
Se anestesió a los ratones utilizando isoflurano USP-PPC al 2% (Pharmaceutical partners of Canada, Richmond, ON, Canadá) con los ojos protegidos mediante la aplicación de gel líquido oftálmico (Aleo Canada In., ON, Canadá). Se afeitaron los pelos de la espalda del ratón. A continuación, la piel afeitada se trató con un gel Nair durante dos minutos. El Nair se retiró cuidadosamente de la piel y la piel subyacente se limpió y esterilizó con ENDURE 400 Scrub-Stat4 Surgical Scrub (gluconato de clorhexidina, solución al 4%; Ecolab Inc., Minnesota, EE.UU.) y 5 Soluprep (clorhexidina al 2% p/v y alcohol isopropílico al 70% v/v; 3M Canada, London, ON, Canadá). Se mantuvo la hidratación de los animales, mediante inyección subcutánea (s.c) de 1 ml de solución de cloruro sódico al 0,9% (Hospira, Montreal, QC, Canadá). A lo largo de los procedimientos quirúrgicos se mantuvieron estrictas medidas de esterilidad para las cirugías de supervivencia. Se extrae una biopsia circular de piel de 5 mm. Se coloca con cuidado una almohadilla aislante de goma con gel superglue sobre la biopsia 10 mientras sigue expuesta la biopsia cutánea. A continuación, la almohadilla de goma se sutura al ratón en 8 puntos con polipropileno monofilamento 6-0 Surgipro II (Covidien, Massachusetts,
EE.UU.). A continuación, se coloca el injerto de piel para sustituir la piel extirpada y se sella con una cinta adhesiva transparente de dos absorbentes. Se aplicó tópicamente bupivicaína transdérmica al 2% (como monohidrato; Chiron Compounding Pharmacy Inc., Guelph, ON, Canadá) en los lugares de la cirugía para prevenir la infección. Además, se administró buprenorfina (como HCL) (0,03 mg/ml; Chiron Compounding Pharmacy Inc. Guelph, ON, Canadá) s.c. como analgésico. A continuación, todos los animales fueron controlados cuidadosamente durante los 3 días siguientes por los Servicios de Cuidado de Animales y recibieron tratamientos adicionales de los mismos tratamientos farmacológicos. La adhesión transparente se cambiaba cada día y se fotografiaba el injerto de piel.
La FIGURA 38 muestra un tejido descelularizado de hipanto de manzana procesado para injertos de piel. Se tomaron fotografías a los 4 días para medir el grado de infiltración de células huésped durante el proceso de cicatrización de la herida (FIGURA 38C); A las 2 semanas de la implantadón del andamio, se practicó la eutanasia a los ratones mediante inhalación de CO2. Se resecó cuidadosamente la piel dorsal y se sumergió inmediatamente en solución de PBS. A continuación, se fotografiaron las secciones de piel que contenían andamios de celulosa, se cortaron y se fijaron en formol al 10% durante al menos 48 horas. A continuación, las muestras se conservaron en etanol al 70% antes de ser incrustadas en parafina por el PALM Histology Core Facility de la Universidad de Ottawa.
EJEMPLO 15 - ANDAMIO VEGETAL DESCELULARIZADO PARA INJERTOS ÓSEOS
Este estudio se realizó para demostrar la eficacia de los biomateriales aquí descritos para la regeneración ósea. Se utilizó un defecto calvarial de rata de tamaño crítico para demostrar que un andamio de celulosa puede favorecer con éxito la regeneración ósea en un defecto circular de 5 mm.
Las ratas Sprague Dawley fueron anestesiadas con isoflurano en oxígeno y recibieron inyecciones subcutáneas de buprenorfina y solución salina estéril antes del procedimiento quirúrgico. Se afeitaron las ratas desde el puente del hocico, entre los ojos, hasta el extremo caudado del calvarium; los ojos se 5 protegieron aplicando gel líquido oftálmico. Las ratas se colocaron en un marco estereotáxico, sujetas por barras auriculares, sobre una almohadilla caliente calentada con agua. Se practicó una incisión (1,5 cm) hasta el periostio sobre el cuero cabelludo, desde el hueso nasal hasta justo caudal a la cresta sagital media (bregma). El periostio se dividió por la línea media sagital y se disecó. Se perforó el calvarium en el hueso parietal lateral derecho (o izquierdo) con un trépano de 5 mm y una fresa quirúrgica. El hueso punteado se despegó 10 de la duramadre, dejando defectos circulares de 5 mm en el cráneo de la rata. Los defectos se lavaron cuidadosamente con solución salina normal estéril y se implantó un andamio de celulosa cilíndrico de 5 mm de diámetro (1 mm de grosor) (FIGURA 39A) en los defectos (FIGURA 39B). La piel se cerró suturando las capas cutáneas. Las ratas fueron eutanasiadas a las 4 semanas después de la cirugía mediante inhalación de dióxido de carbono y desangrado, y el andamio de celulosa se recuperó junto con el tejido óseo circundante (FIGURA 39C) para su análisis histológico (FIGURA 39D). Los tejidos se fijaron en una solución de formalina tamponada y se deshidrataron en etanol antes de incrustarlos en metacrilato de metilo. Varias muestras de 5 ppm de grosor se tiñeron con hematoxilina/eosina para resaltar la presencia de componentes celulares (núcleos y citoplasma) (FIGURA 40D). Para medir cuantitativamente la eficacia de los andamios de celulosa, hemos utilizado un método de puntuación que se muestra en la tabla 1 - 20 parámetro de puntuación histológica cuantitativa (Kretlow et al. 2010).
Tabla 1: Parámetro de puntuación histológica cuantitativa (Kretlow et al., 2010)
En los experimentos mostrados en la FIGURA 39, se evaluaron andamios de celulosa derivados de plantas para injertos óseos. Como se ha descrito, cada implante cilíndrico (5 mm de diámetro, 1 mm de grosor) se midió antes de la implantación para comparar el área del andamio (FIGURA 39A). Los implantes de andamiaje de celulosa se 5 implantaron en los defectos craneales de las ratas y se colocaron para que permanecieran dentro del defecto craneal. A continuación, se colocó la piel sobre el injerto y se suturó para mantener el andamiaje en su sitio (FIGURA 39B). El andamio y los tejidos óseos circundantes se aislaron 4 semanas después de la implantación y se tomaron imágenes macroscópicas (FIGURA 39C). A continuación, se descalcificó el tejido aislado y se procesó/incrustó en parafina. Se cortaron secciones seriadas de 5 ppm de grosor, comenzando en 1 mm dentro del andamio de celulosa, y se tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E) (FIGURA 39D). Para la evaluación de la regeneración ósea, se capturaron micrografías utilizando Zeiss MIRAX MIDI Slide Scanner (Zeiss, Toronto, Canada) equipado con un objetivo de 40x y se analizaron utilizando Panoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Budapest, Hungría) y el software ImageJ.
Los resultados histológicos muestran un contacto directo entre el hueso y el andamio en la interfaz del defecto y los andamios de biomaterial.
EJEMPLO 16 - FORMAS EJEMPLARES DE BIOMATERIALES DE ANDAMIAJE
Las Figuras 40A a 40F muestran diferentes ejemplos de formulaciones, propiedades físicas y funcionalizaciones de biomateriales de andamiaje basados en celulosa. La FIGURA 40A muestra que la celulosa puede usarse como bloque cortado en diferentes formas. La FIGURA 40B muestra que la celulosa puede deshidratarse 20 y molerse en forma de polvo. La FIGURA 40B también muestra que, si la celulosa contiene carboximetilcelulosa, puede reticularse fácilmente con ácido cítrico y calor. La FIGURA 40C muestra que la forma en polvo de la celulosa puede rehidratarse hasta una consistencia deseada para producir un gel (FIGURA 40D) o una pasta (Figuras 40E, 40F).
EJEMPLO 17 - TASA DE SUPERVIVENCIA TRAS LA IMPLANTACIÓN
La FIGURA 41A es un gráfico que muestra la tasa de supervivencia experimental de ratones (n=190) y ratas (n=12) tras la implantación del biomaterial (de diversas fuentes) a la semana, 4 semanas y 8 semanas después de la implantación. La FIGURA 41B muestra la tasa de rechazo del biomaterial en estos mismos 5 puntos temporales que en la FIGURA 41A. Todos los animals (ratones y ratas) sobrevivieron a la implantación del biomaterial, y todos sobrevivieron a la duración completa de cada ensayo y ninguno mostró signos de rechazo del implante en estos experimentos.
EJEMPLO 18 - EJEMPLOS DE TEJIDOS DE PLANTAS Y HONGOS
En la clasificación de las plantas se utilizan diferentes sistemas taxonómicos y existen varias versiones de estos 10 sistemas (por ejemplo, el sistema Cronquist y los sistemas APG).
En los experimentos aquí descritos, utilizando una amplia gama de plantas clasificadas en diferentes grupos, familias, géneros y especies vegetales, nuestros datos indican que se puede utilizar una gran variedad de plantas en la preparación de biomateriales de andamiaje.
En términos generales, el reino vegetal se divide en cuatro grandes grupos:
- Plantas con flores (Angiospermas);
- Coníferas, cícadas y aliados (Gimnospermas);
- Helechos y aliados de los helechos (Pteridofitas);
- Musgos y hepáticas (briofitas).
Estos cuatro grandes grupos contienen muchas familias de plantas que se dividen en muchos géneros que a su vez se dividen en especies. A continuación, se presenta una lista de las principales familias de plantas a partir de las cuales se pueden generar andamios de celulosa:
Acanthaceae, Achariaceae, Achatocarpaceae, Acoraceae, Acrobolbaceae, Actinidiaceae, Adelanthaceae, Adoxaceae, Aextoxicaceae, Aizoaceae, Akaniaceae, Alismataceae, Allisoniaceae, Alseuosmiaceae, Alstroemeriaceae, Altingiaceae, Amaranthaceae, Amaryllidaceae, Amblystegiaceae, Amborellaceae, Anacampserotaceae, Anacardiaceae, Anarthriaceae, Anastrophyllaceae, Ancistrocladaceae, Andreaeaceae, Andreaeobryaceae, Anemiaceae, Aneuraceae, Anisophylleaceae, Annonaceae, Antheliaceae, Anthocerotaceae, Aphanopetalaceae, Aphloiaceae, Apiaceae, Apleniaceae, Apocynaceae, Apodanthaceae, Aponogetonaceae, Aquifoliaceae, Araceae, Araliaceae, Araucariaceae, Archidiaceae, Arecaceae, Argophyllaceae, Aristolochiaceae, Amelliaceae, Asparagaceae, Aspleniaceae, Asteliaceae, Asteropeiaceae, Atherospermataceae, Athyriaceae, Aulacomniaceae, Austrobaileyaceae, Aytoniaceae, Balanopaceae, Balanophoraceae, Balantiopsaceae, Balsaminaceae, Barbeuiaceae, Barbeyaceae, Bartramiaceae, Basellaceae, Bataceae, Begoniaceae, Berberidaceae, Berberidopsidaceae, Betulaceae, Biebersteiniaceae, Bignoniaceae, Bixaceae, Blandfordiaceae, Blasiaceae, Blechnaceae, Bonnetiaceae, Boraginaceae, Boryaceae, Brachytheciaceae, Brassicaceae, Brevianthaceae, Bromeliaceae, Bruchiaceae, Brunelliaceae, Bruniaceae, Bryaceae, Bryobartramiaceae, Bryoxiphiaceae, Burmanniaceae, Burseraceae, Butomaceae, Buxaceae, Buxbaumiaceae, Byblidaceae, Cabombaceae, Cactaceae,
Calceolariaceae, Calomniaceae, Calophyllaceae, Calycanthaceae, Calyceraceae, Calymperaceae, Calypogeiaceae, Campanulaceae, Campynemataceae, Canellaceae, Cannabaceae, Cannaceae, Capparaceae, Caprifoliaceae, Cardiopteridaceae, Caricaceae, Carlemanniaceae, Caryocaraceae, Caryophyllaceae, Casuarinaceae, Catagoniaceae, Catoscopiaceae, Celastraceae, Centrolepidaceae, Centroplacaceae, Cephalotaceae, Cephaloziaceae, Cephaloziellaceae, Ceratophyllaceae, Cercidiphyllaceae, Chaetophyllopsaceae, Chloranthaceae, Chonecoleaceae, Chrysobalanaceae, Cibotiaceae, Cinclidotaceae, Circaeasteraceae, Cistaceae, Cleomaceae, Clethraceae, Cleveaceae, Climaciaceae, Clusiaceae, Colchicaceae, Columelliaceae, Combretaceae, Commelinaceae, Compositae, Connaraceae, Conocephalaceae, Convolvulaceae, Coriariaceae, Comaceae, Corsiaceae, Corsiniaceae, Corynocarpaceae, Costaceae, Crassulaceae, Crossosomataceae, Cryphaeaceae, Ctenolophonaceae, Cucurbitaceae, Culcitaceae, Cunoniaceae, Cupressaceae, Curtisiaceae, Cyatheaceae, Cycadaceae, Cyclanthaceae, Cymodoceaceae, Cynomoriaceae, Cyperaceae, Cyrillaceae, Cyrtopodaceae, Cystodiaceae, Cystopteridaceae, Cytinaceae, Daltoniaceae, Daphniphyllaceae, Dasypogonaceae, Datiscaceae, Davalliaceae, Degeneriaceae, Dendrocerotaceae, Dennstaedtiaceae, Diapensiaceae, Dichapetalaceae, Dicksoniaceae, Dicnemonaceae, Dicranaceae, Didiereaceae, Dilleniaceae, Dioncophyllaceae, Dioscoreaceae, Dipentodontaceae, Diphysciaceae, Diplaziopsidaceae, Dipteridaceae, Dipterocarpaceae, Dirachmaceae, Disceliaceae, Ditrichaceae, Doryanthaceae, Droseraceae, Drosophyllaceae, Dryopteridacae, Dryopteridaceae, Ebenaceae, Ecdeiocoleaceae, Echinodiaceae, Elaeagnaceae, Elaeocarpaceae, Elatinaceae, Emblingiaceae, Encalyptaceae, Entodontaceae, Ephedraceae, Ephemeraceae, Equisetaceae, Ericaceae, Eriocaulaceae, Erpodiaceae, Erythroxylaceae, Escalloniaceae, Eucommiaceae, Euphorbiaceae, Euphroniaceae, Eupomatiaceae, Eupteleaceae, Eustichiaceae, Exormothecaceae, Fabroniaceae, Fagaceae, Fissidentaceae, Flacourtiaceae, Flagellariaceae, Fontinalaceae, Fossombroniaceae,
Fouquieriaceae, Frankeniaceae, Funariaceae, Garryaceae, Geissolomataceae, Gelsemiaceae, Gentianaceae, Geocalycaceae, Geraniaceae, Gerrardinaceae, Gesneriaceae, Gigaspermaceae, Ginkgoaceae, Gisekiaceae, Gleicheniaceae, Gnetaceae, Goebeliellaceae, Gomortegaceae, Goodeniaceae, Goupiaceae, Grimmiaceae, Grossulariaceae, Grubbiaceae, Guamatelaceae, Gunneraceae, Gymnomitriaceae, Gyrostemonaceae, Gyrothyraceae, Haemodoraceae, Halophytaceae, Haloragaceae, Hamamelidaceae, Hanguanaceae, Haplomitriaceae, Haptanthaceae, Hedwigiaceae, Heliconiaceae, Helicophyllaceae, Helwingiaceae, Herbertaceae, Hemandiaceae, Himantandraceae, Hookeriaceae, Huaceae, Humiriaceae, Hydatellaceae, Hydnoraceae, Hydrangeaceae, Hydrocharitaceae, Hydroleaceae, Hydrostachyaceae, Hylocomiaceae, Hymenophyllaceae, Hymenophytaceae, Hypericaceae, Hypnaceae, Hypnodendraceae, Hypodematiaceae, Hypopterygiaceae, Hypoxidaceae, Icacinaceae, Iridaceae, Irvingiaceae, Isoétaceae, , teaceae, Ixioliriaceae, Ixonanthaceae, Jackiellaceae, Joinvilleaceae, Jubulaceae, Jubulopsaceae, Juglandaceae, Juncaceae, Juncaginaceae, Jungermanniaceae, Kirkiaceae, Koeberliniaceae, Krameriaceae, Lacistemataceae, Lactoridaceae, Lamiaceae, Lanariaceae, Lardizabalaceae, Lauraceae, Lecythidaceae, Leguminosae, Lej euneaceae, Lembophyllaceae, Lentibulariaceae, Lepicoleaceae, Lepidobotryaceae, Lepidolaenaceae, Lepidoziaceae, Leptodontaceae, Lepyrodontaceae, Leskeaceae, Leucodontaceae, Leucomiaceae, Liliaceae, Limeaceae, Limnanthaceae, Linaceae, Linderniaceae, Lindsaeaceae, Loasaceae, Loganiaceae, Lomariopsidaceae, Lonchitidaceae, Lophiocarpaceae, Lophocoleaceae, Lophopyxidaceae, Lophoziaceae, Loranthaceae, Lowiaceae, Loxsomataceae, Lunulariaceae, Lycopodiaceae, Lygodiaceae, Lythraceae, Magnoliaceae, Makinoaceae, Malpighiaceae, Malvaceae, Marantaceae, Marattiaceae, Marcgraviaceae, Marchantiaceae, Marsileaceae, Martyniaceae, Mastigophoraceae, Matoniaceae, Mayacaceae, Meesiaceae, Melanthiaceae, Melastomataceae, Meliaceae, Melianthaceae, Menispermaceae, Menyanthaceae, Mesoptychiaceae, Metaxyaceae, Meteoriaceae, Metteniusaceae, Metzgeriaceae, Microtheciellaceae, Misodendraceae, , Mitrastemonaceae, Mitteniaceae, Mizutaniaceae, Mniaceae, Molluginaceae, Monimiaceae, Monocarpaceae, Monocleaceae, Monosoleniaceae, Montiaceae, Montiniaceae, Moraceae,Moringaceae, Muntingiaceae, Musaceae, Myodocarpaceae, Myricaceae, Myriniaceae, Myristicaceae, Myrothamnaceae, Myrtaceae, Myuriaceae, Nartheciaceae, Neckeraceae, Nelumbonaceae, Neotrichocoleaceae, Nepenthaceae, Nephrolepidaceae, Neuradaceae, Nitrariaceae, Nothofagaceae, Notothyladaceae, Nyctaginaceae, Nymphaeaceae, Ochnaceae, Octoblepharaceae, Oedipodiaceae, Olacaceae, Oleaceae, Oleandraceae, Onagraceae, Oncothecaceae, Onocleaceae, Ophioglossaceae, Opiliaceae, Orchidaceae, Orobanchaceae, Orthorrhynchiaceae, Orthotrichaceae, Osmundaceae, Oxalidaceae, Oxymitraceae, Paeoniaceae, Pallaviciniaceae, Pandaceae, Pandanaceae, Papaveraceae, Paracryphiaceae, Passifloraceae, Paulowniaceae, Pedaliaceae, Pelliaceae, Penaeaceae, Pennantiaceae, Pentadiplandraceae, Pentaphragmataceae, Pentaphylacaceae, Penthoraceae, Peraceae, Peridiscaceae, Petenaeaceae, Petermanniaceae, Petrosaviaceae, Phellinaceae, Philesiaceae, Philydraceae, Phrymaceae, Phyllanthaceae, Phyllodrepaniaceae, Phyllogoniaceae, Phyllonomaceae, Physenaceae, Phytolaccaceae, Picramniaceae, Picrodendraceae, Pilotrichaceae, Pinaceae, Piperaceae, Pittosporaceae, Plagiochilaceae, Plagiogyriaceae, Plagiotheciaceae, Plantaginaceae, Platanaceae, Pleurophascaceae, Pleuroziaceae, Pleuroziopsaceae, Plocospermataceae, Plumbaginaceae, Poaceae, Podocarpaceae, Podostemaceae, Polemoniaceae, Polygalaceae, Polygonaceae, Polypodiaceae, Polytrichaceae, Pontederiaceae, Porellaceae, Portulacaceae, Posidoniaceae, Potamogetonaceae, Pottiaceae, Primulaceae, Prionodontaceae, Proteaceae, Pseudoditrichaceae, Pseudolepicoleaceae, Psilotaceae, Pteridaceae, Pterigynandraceae, Pterobryaceae, Ptilidiaceae, Ptychomitriaceae, Ptychomniaceae, Putranjivaceae, Quillajaceae, Racopilaceae, Radulaceae, Rafflesiaceae, Ranunculaceae, Rapateaceae, Regmatodontaceae, Resedaceae, Restionaceae, Rhabdodendraceae, Rhabdoweisiaceae, Rhachidosoraceae, Rhachitheciaceae, Rhacocarpaceae, Rhamnaceae, Rhipogonaceae, Rhizogoniaceae, Rhizophoraceae, Ricciaceae, Riellaceae, Rigodiaceae, Roridulaceae, Rosaceae, Rousseaceae, Rubiaceae, Ruppiaceae, Rutaceae, Rutenbergiaceae, Sabiaceae, Saccolomataceae, Salicaceae, Salvadoraceae, Salviniaceae, Santalaceae, Sapindaceae, Sapotaceae, Sarcobataceae, Sarcolaenaceae,
Sarraceniaceae, Saururaceae, Saxifragaceae, , Scapaniaceae, Scheuchzeriaceae, Schisandraceae, Schistochilaceae, Schistostegaceae, Schizaeaceae, Schlegeliaceae, Schoepfiaceae, Sciadopityaceae, Scorpidiaceae, Scrophulariaceae, Selaginellaceae, Seligeriaceae, Sematophyllaceae, Serpotortellaceae, Setchellanthaceae, Simaroubaceae, Simmondsiaceae, Siparunaceae, Sladeniaceae, Smilacaceae, Solanaceae, Sorapillaceae, Sphaerocarpaceae, Sphaerosepalaceae, Sphagnaceae, Sphenocleaceae, Spiridentaceae, Splachnaceae, Splachnobryaceae, Stachyuraceae, Staphyleaceae, Stegnospermataceae, Stemonaceae, Stemonuraceae, Stereophyllaceae, Stilbaceae, IStrasburgeriaceae, Strelitziaceae, Stylidiaceae, Styracaceae, Surianaceae, Symplocaceae, Takakiaceae, Talinaceae, Tamaricaceae, Tapisciaceae, Targioniaceae, Taxaceae, Tecophilaeaceae, Tectariaceae, Tetrachondraceae, Tetramelaceae, Tetrameristaceae, Tetraphidaceae, Thamnobryaceae, Theaceae, Theliaceae, Thelypteridaceae, Thomandersiaceae, Thuidiaceae, Thumiaceae, Thymelaeaceae, Thyrsopteridaceae, Ticodendraceae, Timmiaceae, Tofieldiaceae, Torricelliaceae, Tovariaceae, Trachypodaceae, Treubiaceae, Trichocoleaceae, Trichotemnomataceae, Trigoniaceae, Trimeniaceae, Triuridaceae, Trochodendraceae, Tropaeolaceae, Typhaceae, Ulmaceae, Urticaceae, Vahliaceae, Vandiemeniaceae, Velloziaceae, Verbenaceae,Vetaformaceae, Violaceae,ViridiveNeraceae, Vitaceae, Vivianiaceae, Vochysiaceae, Wardiaceae, Welwitschiaceae, Wiesnerellaceae, Winteraceae, Woodsiaceae, Xanthorrhoeaceae, Xeronemataceae, Xyridaceae, Zamiaceae, Zingiberaceae, Zosteraceae, Zygophyllaceae.
Debido a una nueva clasificación, algunos grupos de algas ya no se clasifican dentro del reino vegetal. No obstante, estas algas son candidatas para la producción de andamios de celulosa, tal y como se describe en el presente documento. El Reino fungi tiene miembros que contienen, por ejemplo, una pared celular hecha de celulosa. Las algas se clasifican actualmente en el reino protista; sin embargo, se entenderá que, en la presente divulgación, las algas se incluyen en el término "plantas" tal como se utiliza en el presente documento. Las algas adecuadas pueden incluir: - Algas: organismos unicelulares o pluricelulares similares a las plantas;
- Algas verdes: Spirogyra, Ulva, Chlamydomonas, Volvox;
- Algas rojas: Porphyra, Rotalgen;
- Algas marrones: Laminaria, Nereocystis;
- Mohos acuáticos: Saprolegnia; y/o
- Filo Ciliata: Paramecio, Vorticella
También se ha demostrado experimentalmente que la quitina es un andamio adecuado que puede utilizarse en biomateriales de andamiaje como los descritos en el presente documento utilizando protocolos como los descritos en el presente documento. El Reino fungi se clasifica de la siguiente manera:
- Sac-hongos: Agaricus (champiñón), Ustilago (tizón) y Puccinia (hongo de la roya);
- Hongos formadores de zigotos: Mucor, Rhizopus (el moho del pan) y Albugo;
- Hongos club: Agaricus (champiñón), Ustilago (tizón) y Puccinia (hongo de la roya); y
- Hongos imperfectos: Alternaría, Colletotrichum y Trichoderma.
Dichos hongos también representan candidatos adecuados para obtener tejidos fúngicos descelularizados como los descritos anteriormente.
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Claims (13)
1. Un biomaterial de andamiaje que comprende un tejido vegetal o fúngico descelularizado del que se han eliminado los materiales celulares y los ácidos nucleicos del tejido, comprendiendo el tejido vegetal o fúngico descelularizado una estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina, en el que el tejido vegetal o fúngico descelularizado comprende un tejido vegetal o fúngico que se ha descelularizado mediante tratamiento con dodecil sulfato sódico (SDS), en el que el SDS residual se ha eliminado utilizando una solución acuosa de sal divalente para precipitar un residuo de sal que contiene micelas de SDS fuera del biomaterial del andamiaje.
2. El biomaterial de andamio de la reivindicación 1,
en el que se ha utilizado dH2O, ácido acético, DMSO, o tratamiento de sonicación, o cualquier combinación de los mismos, para eliminar la solución acuosa de sal divalente, el residuo de sal, y/o las micelas de SDS, y/o en el que la sal divalente de la solución acuosa de sal divalente comprende MgCl2 o CaCl2, y/o
en el que el tejido vegetal o fúngico se ha descelularizado mediante tratamiento con una solución de SDS de aproximadamente el 1% o aproximadamente el 0. 1% de SDS en agua, y el SDS residual se ha eliminado utilizando una solución acuosa de CaCF a una concentración de aproximadamente 100 mM seguida de incubación en dH2O.
3. El biomaterial de andamiaje de la reivindicación 1 o 2, en el que el tejido vegetal o fúngico descelularizado se procesa para introducir una arquitectura adicional y/o se funcionaliza en al menos un grupo funcional hidroxilo del fuego mediante acilación, alquilación u otra modificación covalente, para proporcionar un biomaterial de andamiaje funcionalizado, y/o
en el que el tejido vegetal o fúngico descelularizado se procesa para introducir microcanales, y/o se funcionaliza con colágeno, un factor para promover la especificidad celular, un factor de crecimiento celular o un agente farmacéutico.
4. El biomaterial de andamiaje de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el tejido vegetal o fúngico es un tejido de hipanto de manzana (Malus pumila), un tejido de fem (Monilophytes), un tejido de raíz de nabo (Brassica rapa), un tejido de rama de gingko, un tejido de cola de caballo (equisetum), un tejido de hoja de híbrido de hermocallis, un tejido de tallo de col rizada (Brassica olerácea), un tejido de abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii) de coníferas, un tejido de pulpa de fruto de cactus (pitaya), un tejido de vinca maculata, un tejido de loto acuático (Nelumbo nucífera), un tejido de pétalo de tulipán (Tulipa gesneriana), un tejido de plátano (Musa paradisiaca), un tejido de tallo de brécol (Brassica olerácea), un tejido de tallo de hoja de arce (Acer psuedoplatanus), un tejido de raíz primaria de remolacha (Beta vulgaris), un tejido de cebolla verde (Album cepa), un tejido de orquídea (Orchidaceae), un tejido de tallo de nabo (Brassica rapa), un tejido de puerro (Album ampeloprasum), un tejido de rama de arce (Acer), un tejido de apio (Apium graveolens), un tejido de tallo de cebolla verde (Album cepa), un tejido de pino, un tejido de aloe vera, un tejido de sandía (Citrullus lanatus var. lanatus), un tejido de Jenny rastrera (Lysimachia nummularia), un tejido de cactus, un tejido de Lychnis Alpina, un tejido de ruibarbo (Rheum rhabarbarum), un tejido de pulpa de calabaza (Cucúrbita pepo), un tejido de tallo de Dracena (Asparagaceae), un tejido de tallo de Hierba araña (Tradescantia virginiana), un tejido de tallo de Espárrago (Asparagus officinalis), un tejido de seta (Fungí), un tejido de hinojo (Foeniculum vulgare), un tejido de rosa (Rosa), un tejido de zanahoria (Daucus carota), o un tejido de pera (Pomaceous), o un tejido alterado genéticamente producido mediante modificación directa del genoma o mediante cría selectiva para crear una arquitectura vegetal o fúngica adicional que esté configurada para imitar físicamente un tejido y/o promover funcionalmente un efecto tisular diana.
5. El biomaterial de andamiaje de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además células animales vivas adheridas a la estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina, en particular en el que las células animales vivas son células de mamífero, más particularmente en el que las células animales vivas son células humanas.
6. Método para preparar un tejido vegetal o fúngico descelularizado del que se extraen materiales celulares y ácidos nucleicos del tejido, comprendiendo el tejido vegetal o fúngico descelularizado una estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina, comprendiendo dicho método:
proporcionar un tejido vegetal o fúngico con un tamaño y una forma predeterminados; y
descelularizar el tejido vegetal o fúngico tratándolo con dodecil sulfato sódico (SDS), y
eliminar el SDS residual del tejido vegetal o fúngico utilizando una solución acuosa de sal divalente para precipitar un residuo de sal que contenga micelas de SDS fuera del tejido vegetal o fúngico, eliminando así los materiales celulares y los ácidos nucleicos del tejido vegetal o fúngico para formar el tejido vegetal o fúngico descelularizado que comprende una estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina.
7. El método de la reivindicación 6, en el que:
se ha utilizado dH2O, ácido acético, DMSO, o tratamiento de sonicación, o cualquier combinación de los mismos, para eliminar la solución acuosa de sal divalente, el residuo de sal, y/o las micelas de SDS, y/o
la sal divalente de la solución acuosa de sal divalente comprende MgCl2 o CaCl2, y/o
la etapa de descelularización comprende el tratamiento con una solución de SDS de aproximadamente 0,1% o aproximadamente 1% de SDS en agua, y el SDS residual se elimina tras la descelularización utilizando una solución acuosa de CaCl2 a una concentración de aproximadamente 100 mM, seguida de incubación en dH2O.
8. El método de la reivindicación 6 o 7, que comprende además una etapa de procesamiento del tejido vegetal u fúngico descelularizado para introducir más microarquitectura, y/o una etapa de funcionalización de al menos algunos grupos funcionales hidroxilo libres del tejido vegetal u fúngico descelularizado mediante acilación, alquilación u otra modificación covalente, en particular
en el que el tejido vegetal o fúngico descelularizado se procesa para introducir microcanales, y/o en el que los grupos funcionales hidroxilo del tejido vegetal o fúngico descelularizado se funcionalizan con colágeno, un factor para promover la especificidad celular, un factor de crecimiento celular o un agente farmacéutico.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que comprende además un paso de introducir células animales vivas en la estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina, y permitir que las células animales vivas se adhieran a la estructura porosa tridimensional a base de celulosa o quitina, en particular en el que las células animales vivas son células de mamífero, más particularmente en el que las células animales vivas son células humanas.
10. El biomaterial de andamiaje de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso como andamiaje implantable para apoyar el crecimiento de células animales, para promover la regeneración de tejidos, para promover la angiogénesis, para un procedimiento de sustitución de tejidos, o como implante estructural para cirugía estética, o como implante estructural para la reparación o regeneración tras una lesión medular,
o como implante estructural para la cirugía de sustitución de tejidos y/o para la regeneración de tejidos tras una intervención quirúrgica,
o como implante estructural para cirugía de injerto cutáneo y/o regeneración cutánea,
o como implante estructural para la regeneración de la vasculatura sanguínea en un tejido o región diana, o como material de sustitución ósea, relleno óseo o injerto óseo, y/o para promover la regeneración ósea, o como sustitución tisular de piel, hueso, médula espinal, corazón, músculo, nervio, vaso sanguíneo u
otros tejidos dañados o malformados,
o en forma de hidrogel, como sustituto del humor vítreo,
o como una bursa artificial, en la que el biomaterial de andamiaje forma una estructura similar a un saco que contiene biomaterial de andamiaje en forma de hidrogel, o como un implante estructural para cirugía estética.
11. El biomaterial de andamio para uso de la reivindicación 10, en el que el biomaterial de andamio es un biomaterial de andamio para el que el tejido vegetal o fúngico descelularizado del biomaterial de andamio está configurado para imitar físicamente un tejido del sujeto y/o para promover funcionalmente un efecto de tejido diana en el sujeto.
12. Un kit que comprende un biomaterial de andamiaje según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y al menos uno de un recipiente o instrucciones para el uso según la reivindicación 10 u 11, en particular en el que el kit es un kit quirúrgico.
13. Un kit que comprende un implante estéril dispensable que comprende un biomaterial de andamiaje como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, e instrucciones para el uso según la reivindicación 10 u 11.
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