JP2022000631A - 水溶性有機酸の定量分析方法、エステル化試薬及び分析キット - Google Patents

Abstract

【課題】 分析に使用する水溶液試料の量を増やした場合であっても、水溶性有機酸のエステル化効率の低下を抑えることができる水溶性有機酸の定量分析方法を提供する。【解決手段】 水溶性有機酸をエステル化して得たエステル化合物を分析する水溶性有機酸の分析方法であって、水溶性有機酸を含有する水溶液試料と、前記水溶液試料と相分離するアルコールと、前記水溶液試料よりも前記アルコールの相への溶解度が高い酸触媒とを混合し、前記水溶性有機酸と前記アルコールとを反応させて前記水溶性有機酸をエステル化する工程を含む水溶性有機酸の定量分析方法。【選択図】図1

Description

本発明は、水溶性有機酸の定量分析方法、この定量分析方法に使用する分析試薬及び分析キットに係るものである。

例えば、清酒等の味を客観的に評価するために、清酒に含まれている複数種類の水溶性有機酸を定量分析することが考えられる。
清酒に含まれる水溶性有機酸を定量分析する方法としては、例えば、滴定法を挙げることができる。
しかしながら、滴定法では、水溶性有機酸の総含有量は定量できるものの、各水溶性有機酸の含有量を個別に定量分析することはできない。
そこで、アニオン交換樹脂等によって清酒から水溶性有機酸を抽出し、抽出した水溶性有機酸をさらにＨＰＬＣによって個別に分離検出する方法も考えられるが、このような分析には高価な分離カラムや分析機器が必要であるだけでなく、作業が煩雑で難しいという問題がある。
そこで、より簡便に清酒に含まれる各水溶性有機酸の含有量を定量分析する方法として、例えば、非特許文献１に記載されているように、水溶性有機酸とアルコールとを、塩酸を酸触媒として用いてエステル化させ、得られたエステル化合物を定量分析する方法が提案されている。

この非特許文献１のような方法を採用する場合には、水溶液試料中に含まれる水溶性有機酸のエステル化効率が直接定量分析の精度に反映されてしまうので、精度よい定量分析のためにはできるだけ水溶性有機酸のエステル化効率を高める必要がある。

高阪 千尋，他３名，「ガスクロマトグラフィを用いた有機酸分析方法の開発」，［Online］，http://tc-kyoto.or.jp/outcome/h27/h27ks_p92_gas.pdf（２０１６）

しかしながら、このような従来の方法では、例えば、水溶液試料中に微量しか含まれていない成分を定量分析するために、分析に使用する水溶液試料の量を増やすと、エステル化効率が下がってしまうという問題があることに本発明者らは気が付いた。

本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、本発明者らが、水溶性有機酸をエステル化するためには、水溶性の酸触媒を用いるべきという、これまでの常識にとらわれることなく、試薬の様々な組み合わせを試した結果、疎水性の酸触媒を使用すれば、分析に使用する水溶液試料の量を増やした場合であっても、水溶性有機酸のエステル化効率の低下を抑えることができる水溶性有機酸の定量分析方法を提供することができることに気が付いて初めて完成されたものである。

すなわち、本発明に係る水溶性有機酸の定量分析方法は、水溶性有機酸をエステル化して得たエステル化合物を分析する水溶性有機酸の分析方法であって、水溶性有機酸を含有する水溶液試料と、前記水溶液試料と相分離するアルコールと、前記水溶液試料への溶解度よりも前記アルコールへの溶解度の方が高い酸触媒とを混合し、前記水溶性有機酸と前記アルコールとを反応させて前記水溶性有機酸をエステル化する工程を含むことを特徴とするものである。

このように構成した水溶性有機酸の定量分析方法によれば、分析に使用する水溶液試料の量を従来よりも増やした場合であっても、水溶性有機酸のエステル化効率の低下を抑止できる。

このような効果を奏するメカニズムはまだ解明されてないが、以下のようなものが考えられる。
本発明に係るエステル化工程では、前記水溶液試料よりも前記アルコールへの溶解度が高い酸触媒を使用しているので、エステル化反応がアルコール相と水相との界面付近で起こると考えられる。
このようにエステル化反応が界面付近で起こると、生成されたエステル化合物がすぐにアルコール相に移動する。
その結果、反応系中の水溶液試料の含有量に関わらず、生成したエステル化合物の水による加水分解が抑えられて、水溶性有機酸のエステル化効率の低下を抑止できるのではないかと考えられる。
また、親水性の塩酸を酸触媒として用いると、塩酸が水溶液試料に主に溶解するため、水溶液試料の量が多くなると塩酸濃度が低くなり、水溶性有機酸のエステル化効率の低下が起こるのではないかと考えられる。

前記エステル化工程において、前記アルコールと混和し、水と相分離する有機溶剤をさらに混合すれば、エステル化効率をさらに向上させることができるので好ましい。このような効果を奏する理由としては、前記の有機溶剤を混合することによって、アルコール相の疎水性度を向上させることができるので、アルコール相に含まれる水分量を低下し、酸触媒や生成されたエステル化合物がよりアルコール相に移動しやすくなるからではないかと考えられる。

エステル化効率の向上という観点から、前記有機溶剤を、前記水溶性有機酸と前記アルコールとのエステル化反応が起こる前に添加しておくことがさらに好ましい。

前記エステル化工程で生成した、エステル化合物を気化分析するようにすれば、例えば、従来の有機酸の定量分析方法である滴定法ではできなかった水溶性有機酸の種類毎の定量分析をすることが可能である。

エステル化効率の向上という観点から、前記酸触媒が、強酸あるいは超強酸であることが好ましく、一部の水素がフッ素原子に置換されたフルオロアルキル基を有するものであることが好ましく、より酸解離定数が高いパーフルオロアルキル基を有する超強酸であることがさらに好ましい。
具体的には、前記酸触媒として、置換基を有するスルホン酸、アルキルスルホンイミド、及びスルホン酸基を有するホスホニウム塩を含有するイオン液体からなる群より選ばれるいずれか一種以上を含むものを使用することが好ましい。

前記アルコールは、水と混和しない炭素数４以上のアルコールであることが好ましく、前記酸触媒を溶解しやすくするためには常温で液体である炭素数１２以下のアルコールであることがより好ましい。

本発明によれば、分析に使用する水溶液試料の量を増やした場合であっても、水溶性有機酸のエステル化効率の低下を抑えることができる水溶性有機酸の定量分析方法を提供することができる。
このように使用する水溶液試料の量を増やすことができれば、従来の分析方法では、反応前に予めサンプルを濃縮しなければ定量分析することが出来なかった微量の水溶性有機酸についても、水溶液試料を前もって濃縮することなく、そのまま定量分析することができる。すなわち、エステル化処理と同時に生成したエステル化合物をアルコール相（有機溶媒相）に濃縮することで、より微量の水溶性有機酸を簡便かつ高感度で定量分析することが可能となる。

本発明の一実施形態に係る水溶性有機酸の分析方法の流れを示すフローチャート。 本実施形態に係るエステル化反応の流れを示す模式図。 本実施形態に係る酸触媒の例。 本発明の一実施例に係る水溶性有機酸の分析結果を示すグラフ。 本発明の一実施例に係る水溶性有機酸の分析結果を示すグラフ。 本発明の一実施例に係る水溶性有機酸の分析結果を示すグラフ。 本発明の一実施例に係る水溶性有機酸の分析結果を示すグラフ。 本発明の一実施例に係る水溶性有機酸の分析結果を示すグラフ。 本発明の一実施例に係る水溶性有機酸の分析結果を示すグラフ。 本発明の一実施例に係る水溶性有機酸の分析結果を示すグラフ。

以下、本発明の一実施形態に係る水溶性有機酸の分析方法について、図面を参照して説明する。

＜本実施形態に係る水溶性有機酸の分析方法の基本構成＞
本実施形態に係る水溶性有機酸の分析方法は、例えば、清酒等の飲食料に含まれる水溶性有機酸を定量分析する方法である。
水溶性有機酸の定量分析の手順は、例えば、図１又は図２に示すようなものである。

まず、アルコールと酸触媒とを含むエステル化試薬１を調製する。
次に、例えば、試験管Ｔに清酒などの水溶液試料２と前記エステル化試薬１とを入れて混合する（Ｓ１）。この試験管Tを密栓し、例えば、恒温槽Ｗ等に浸して所定温度で所定時間、反応させる（Ｓ２）。
この時反応液３中では、以下の化１のようなエステル化反応が起きている。

前記反応液３を２５℃まで冷却し、中和剤を含有する水溶液を添加して酸触媒を中和する（Ｓ３）。
反応液３から、アルコール相をバイアル等に分取して、生成されたエステルを、例えば、ガスクロマトグラフィーで定量分析する（Ｓ４）。
水溶性有機酸に由来するエステル成分を定量分析した結果から、水溶液試料２に含まれている水溶性有機酸の濃度や含有量等を算出する（Ｓ５）。
水溶性有機酸量の算出は、例えば、濃度が既知の水溶性有機酸の標準溶液の分析結果から導き出した検量線などを用いて算出するようにしても良い。

＜本実施形態に係る水溶性有機酸の分析方法の特徴構成＞
然して、本実施形態に係る水溶性有機酸の定量分析方法は、前記アルコールとして、前記水溶性有機酸を含有する水溶液試料２と相分離するアルコールを使用し、前記水溶液試料２に対する溶解度よりも前記アルコールに対する溶解度の方が高い、すなわち疎水性の酸触媒の存在下でエステル化反応させることを特徴とするものである。
より具体的に説明すると、本実施形態に係る水溶性有機酸の定量分析方法においては、例えば、前記エステル化試薬１として、水溶性有機酸を含有する水溶液試料２と相分離するアルコールと、前記水溶液試料２に対する溶解度よりも前記アルコールに対する溶解度の方が高い、すなわち疎水性の酸触媒とを含有するものを使用している。
エステル化反応後の試験管Ｔ内の反応液３は、前記水溶液試料２を含む水溶液相と前記エステル化試薬１を含むアルコール相（有機溶媒相）とに相分離している。
水溶性有機酸に由来するエステルは前記アルコール相に溶解しているので、このアルコール相をバイアル等に分取することによって、生成したエステルを抽出することができる。

前記酸触媒は、酸性度が高い程エステル化効率が高くなるので好ましい。酸触媒の酸性度を向上させるという観点から、酸触媒は強酸あるいは超強酸であることがより好ましく、アルキル基の一部の水素原子がフッ素原子に置き換わったフルオロアルキル基を有する超強酸であることが好ましく、より酸解離定数が低いパーフルオロアルキル基を有する超強酸であることがさらに好ましい。なお、本明細書において超強酸とは、硫酸よりも低い酸解離定数を有する酸を指す。より具体的には、酸解離定数（ｐＫａ）が−３．０未満のものを指す。

具体的には、前記酸触媒が、置換基を有するスルホン酸（Ｒ−ＳＯ_３Ｈ）、アルキルスルホンイミド、及びスルホン酸基を有するホスホニウム塩を含有するイオン液体（［Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＰＲ‘ＳＯ_３Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＰＲ’ＳＯ３］［Ｘ⁻］）からなる群より選ばれる１種以上を含むものであることが好ましい。前記酸触媒は、フルオロアルキルスルホン酸及びおよび／又はフルオロアルキルスルホンイミドを含むものであることがより好ましく、パーフルオロアルキルスルホン酸及びおよび／又はパーフルオロアルキルスルホンイミドを含むものであることがさらに好ましい。
前記置換基を有するスルホン酸の置換基は、アルキル基、アルキレン基、アルキニル基、又はベンジルアルキル基であることが好ましく、前記アルキル基、前記アルキレン基、前記アルキニル基は分岐又は非分岐の炭素数１以上１２以下ものであることが好ましく、ヘテロ原子を含んでいても良い。
前記アルキルスルホンイミドに含まれるアルキル基の炭素数は１以上１２以下であることが好ましい。なお、アルキルスルホンイミドが有する両端のアルキル基は、互いに同じものであっても良いし、異なっていても良い。
前記ホスホニウム塩に含まれるＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ‘は互いに同じ置換基であってもよいし、互いに異なる置換基であっても良く、炭素数は１以上１６以下であることが好ましい。また、アニオンである［Ｘ⁻］は、特に限定されない。
前記酸触媒の具体的な例としては、例えば、図３に化学構造式を挙げた、メタンスルホン酸（Ｃ１）〜ドデシルスルホン酸（Ｃ１２）、パラトルエンスルホン酸（Ｃ１）〜ドデシルベンゼンスルホン酸（Ｃ１２）、トリフルオロメタンスルホン酸（Ｃ１）〜 ヘプタデカオクタンスルホン酸（Ｃ８）、ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミド（Ｃ２）〜 ビス（ノナフルオロブタンスルホニル）イミド（Ｃ８）、(４-スルホブチル)トリオクチルホスホニウム トリフルオロメタンスルホネート又は(４-スルホブチル)トリオクチルホスホニウム トリフルオロメタンスルホネート等のうち、前記水溶液試料２に対する溶解度よりも前記アルコールに対する溶解度の方が高い、すなわち疎水性のものを挙げることができる。前記酸触媒は、１種のみを使用しても良いし、２種以上を併用しても良い。

前記酸触媒の前記エステル化試薬中の濃度は、０．５質量％以上６０質量％以下であることが好ましく、１質量％以上３０質量％以下であることがより好ましい。前記酸触媒を２種以上併用する場合には、酸触媒の合計濃度が前述した範囲になるようにすることが好ましい。

前記アルコールは、水と混和しない炭素数４以上のアルコールであることが好ましく、そのうち炭素数が１２以下、より好ましくは６以下のアルコールであることが好ましく、そのうち第一級アルコール又は第二級アルコールであることがさらに好ましく、第一級アルコールであることが特に好ましい。

前記アルコールの具体例としては、例えば、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ターシャリーブチルアルコール、イソアミルアルコール、２−メチル−２−ブタノール、３−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、ペンタフルオロプロパノール、１−ヘキサノール、ヘプタフルオロブタノール、又はテトラフルオロプロパノール等を挙げることができる。これらの中でも、イソブチルアルコール、イソアミルアルコール、１−ブタノールを使用することがより好ましい。

前記アルコールは、前記反応液３中の前記水溶液試料２の体積（Ａ）と前記アルコールの体積（Ｂ）の体積比（Ａ／Ｂ）が０．０５以上２以下の範囲になるように添加することが好ましく、体積比（Ａ／Ｂ）が０．１以上１以下の範囲になるように添加することがより好ましい。さらに好ましくは、体積比（Ａ／Ｂ）は、０．２以上１以下の範囲である。
本実施形態の場合には、例えば、エステル化工程に使用する前記水溶液試料２の体積が５００μｌである場合、前記アルコールを前記エステル化試薬１の溶媒として反応液３中に２５０μｌ以上１００００μｌ以下の範囲で含有されるように添加している。

前記中和剤の具体例としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸三カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、アンモニア、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、エタノールアミン、N-(2-ヒドロキシエチルエチレンジアミン）、又はＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン等を挙げることができる。中和剤はこれらに限られず、酸触媒を中和することができるものであり、気化分析の結果に影響を与えないアルカリ性の水溶液であればよい。
前記中和剤は、前記酸触媒を中和する量を添加すればよく、添加量については、使用する酸触媒の種類や量に応じて適宜調製することができる。

前記水溶性有機酸の具体例としては、例えば、ピルビン酸、オキサロ酢酸、乳酸、グリコール酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、グルタル酸、レブリン酸、α-ケトグルタル酸、ｔｒａｎｓ-アコニット酸、クエン酸、ピログルタミン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸、イソカプロン酸、カプロン酸が挙げられる。
また水に懸濁するカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸などの中長鎖遊離脂肪酸、ヤシ油などのトリアシルグリセロールもエステル化して定量分析することができる。
水溶液試料が、これら水溶性有機酸を複数種類含有するものである場合には、ガスクロマトグラフィー等の気化分析によって一斉分析することによる利点がより顕著になる。

本実施形態に係る水溶性有機酸分析方法では、水溶性有機酸とアルコールとを反応させる平衡反応をよりエステル生成側に傾けるために、水溶性有機酸とアルコールとを反応させる前に、アルコールと混和し、水と相分離する有機溶剤をさらに添加する。
この有機溶剤は、アルコール相に溶解するので、有機溶剤を添加することによって、アルコール相中に含有されている水分量が大きく低下することが実験によって確かめられた。アルコール相中の水分量が減ると、アルコール相に分配したエステルがアルコール相中に含有されている水分によって加水分解されることをさらに抑えられると考えられる。

前記有機溶剤は、水溶性有機酸とアルコールとのエステル化反応によって生成されたエステル化合物を、前記アルコールよりも溶解させやすい有機溶媒であり、水と混和しないことが好ましい。
前記有機溶剤としては、アルコールを除く、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、エーテル、エステル、ハロゲン化炭化水素等が挙げられ、具体例としては、ヘキサン、２，２，４−トリメチルペンタン、トルエン、２−メトキシ−２メチルプロパン、クロロホルム、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソブチルが挙げられる。前記有機溶剤は、１種だけを使用しても良いし、２種以上を併用しても良い。

前記有機溶剤は、分析に使用する前記アルコールの体積（Ｂ）と前記有機溶剤の体積（Ｃ）との体積比（Ｂ／Ｃ）が０．３以上３以下の範囲になるように添加することが好ましく、０．５以上１以下の範囲になるように添加することがより好ましい。前記有機溶剤は２種以上を併用する場合には、その合計量が前述した範囲になるように添加することが好ましい。

前記反応溶液に、さらに濃度が既知の内部標準物質を添加しておいても良い。この内部標準物質の含有量をガスクロマトグラフィーで検出することによって、ガスクロマトグラフへのサンプル注入量の誤差を補正することができるので、より分析精度を向上させることができる。前記内部標準物質は、アルコール相に１００％分配するものであり、分析結果に悪響影響を与えないものであれば良いが、この実施形態では一例として、ラウリン酸エチルを２，２，４−トリメチルペンタンに４００μｇ／ｍｌとなるように溶解したものを、例えば５０μｌ使用している。

＜本実施形態に係る水溶性有機酸の分析キット＞
本実施形態に係る水溶性有機酸の定量分析をより簡便に行うために、前述したエステル化試薬１を含む分析キットを使用するようにしても良い。
例えば、前記エステル化試薬１を希釈することなく、そのまま水溶液試料２と混合して使えるように、酸触媒の濃度を予め調製しておいても良い。

この分析キットには、前述したエステル化試薬１だけでなく、例えば、前述した中和剤、有機溶剤、水溶性有機酸の濃度が既知の標準試料、内部標準物質、内部でエステル化反応を起こすための試験管Ｔ又はアルコール相を分取して気化分析するためのバイアル等を含むようにしても良い。なお、内部標準物質は、予め有機溶剤に添加されているものとしても良い。

＜本実施形態の効果＞
このように構成した水溶性有機酸の定量分析方法によれば、水と相分離するアルコールに溶解する酸触媒を使用しているので、エステル化反応がアルコール相と水相の界面付近で起こり、生成されたエステルがすぐに水分量の少ないアルコール相に移動しやすい。
その結果、エステルの加水分解を抑えることができ、使用するサンプルの量を増やした場合の水溶性有機酸のエステル化効率を向上させることができる。

このように使用する水溶液試料２の量を増やすことができれば、従来の分析方法では、反応前に予めサンプルを濃縮しなければ定量分析することが出来なかった微量の水溶性有機酸についても、サンプルを前もって濃縮することなく、そのまま定量分析することができる。本実施形態に係る定量分析方法によれば、例えば、コハク酸の場合には１００ｎｇ／ｍｌ以上であれば、水溶液試料を濃縮することなくそのまま定量分析することができる。

前記酸触媒として、強酸あるいは超強酸のフッ素化合物が好ましいが、その中でも、分解によりフッ酸が遊離しづらい、パーフルオロアルキル基を有するビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドなどは取り扱いが容易であり、さらに好ましい。

水溶性有機酸に由来するエステルを、ガスクロマトグラフィーで分析しているので複数種類の水溶性有機酸が混在している試料についても、各水溶性有機酸についてそれぞれ定量分析をすることができる。

本実施形態に係る分析方法によれば、清酒に含まれる水溶性有機酸を、これまでは検出が難しかった低濃度のものまで精度よく高感度で定量分析できる。

本発明は前述した実施形態に限られるものではない。
例えば、前記飲食料としては、清酒の他、焼酎、ワイン、ウイスキーなどの酒類、果汁やジュースなどの清涼飲料水、醤油や味噌などの調味料でも良い。さらに飲食料に限らず、水溶性有機酸を含有する水溶液試料であれば、広くどのような分野のものであっても分析対象とすることができる。

前記実施形態では、反応液を恒温槽で加熱する方法を説明したが、これに限らずヒートブロックや湯煎などで反応液を温めても構わない。また、反応液を攪拌しながら反応させても良いし、混合した液を静置して反応させても良い。
さらに、前記実施形態では、ガスクロマトグラフィーを使用する分析方法を説明したが、例えば、ガスクロマトグラフィー以外の質量分析による気化分析方法であっても良いし、液体クロマトグラフィー等、気化分析以外の方法を用いても良い。

前記エステル化試薬は、少なくとも前記酸触媒を含有するものであればよく、例えば、前記アルコールについては、別途添加するようにしても良い。
また、前記エステル化試薬が、前記有機溶剤を予め含有するものとしても良い。
さらに、前記反応液には、前述した疎水性の酸触媒の他に、例えば、塩酸などの前記アルコールへの溶解度よりも前記水溶液試料への溶解度の方が高い、すなわち親水性の酸触媒がさらに添加されているものとしても良い。
その他、本発明の趣旨に反しない範囲で種々の組み合わせや変更等が可能である。

以下に、本発明について実施例を挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。

（実施例１）
この実施例１では、水への溶解度よりも水と相分離するアルコール相への溶解度が高い酸触媒を使用して、水溶性有機酸のエステル化の反応効率を調べた。
この実験では、ガスクロマトグラフィーにより定量されたアルコール相中のエステルの量からエステル化した水溶性有機酸の量を算出し、後述する比較例１〜４の結果と比べた。以下に実験手順を示す。

水溶性有機酸として４００ｍｇ／ｍｌのピルビン酸を含有する水溶液試料を準備した。この水溶液試料の溶媒としては、清酒のアルコール度数とほぼ同じ１６％エタノール水溶液を用いた。
エステル化試薬として、酸触媒であるビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドを１０質量％となるようにイソブチルアルコール（アルコール）に溶解したものを準備した。

前記水溶液試料を５０μｌ、１００μｌ、２５０μｌ、５００μｌ又は１０００μｌずつ試験管に分注し、ここに前述したエステル化試薬を５００μｌずつ添加した。
試験管を１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌して混合し、１００℃の恒温槽に浸した状態で、１時間静置して前記水溶性有機酸をエステル化させた。

各試験管を２５℃まで冷却した後に、中和剤として１ｍｏｌ／ｌ炭酸水素ナトリウム水溶液を５００μｌ添加し、１０秒間ボルテックスミキサーで混合して中和した。
試験管を静置して相分離させ、試験管から有機溶媒相を別のバイアルに分取し、ガスクロマトグラフィーに供した。
ガスクロマトグラフィーで検出されたピーク面積から前記水溶性有機酸とイソブチルアルコールとがエステル結合したエステル化合物を定量分析した。

この実施例で使用しているガスクロマトグラフィーの装置構成及び分析条件は以下の通りである。
装置：島津製作所 ＧＣ−２０１０
プレカラム：不活性フューズドシリカチューブ ５ｍ×０．２５ｍｍ（内径）
メインカラム：ＵＬＢＯＮ ＨＲ−２０Ｍ ２５ｍ×０．２５ｍｍ（内径）、膜厚＝０．２５μｍ
温度：８０℃（１０ｍｉｎホールド）→毎分２８℃ずつ昇温→２２０℃（９ｍｉｎホールド）→毎分４０℃ずつ昇温→２４０℃、計２８ｍｉｎ
注入口：２４０℃
検出器：２４０℃ ＦＩＤ
キャリアガス：３０ｃｍ／ｓｅｃ Ｈｅ
スプリット比：２：１
注入量：２．５μｌ

この定量分析の結果を図４に示す。図中の黒色の実線は、エステル化反応の前にアルコール相に混和し水溶液試料と相分離する有機溶媒として２，２，４−トリメチルペンタンを５００μｌ添加した場合の結果を、図中の黒色の破線は、エステル化反応の後に有機溶媒として２，２，４−トリメチルペンタンを５００μｌ添加した場合の結果を、それぞれ示している。
なお、図４の横軸は、エステル反応に使用した水溶液試料の量（μｌ）を、縦軸は検出されたエステルのピーク面積（ａｕｂｉｔａｒｙ ｕｎｉｔ）を表している。この横軸縦軸は、図５〜８にも共通するものである。

（実施例２）
水溶性有機酸として、乳酸を用いた以外は実施例１と同じ手順で水溶性有機酸のエステル化した量を算出した。その結果を図５に示す。

（実施例３）
水溶性有機酸として、コハク酸を用いた以外は実施例１と同じ手順で水溶性有機酸のエステル化した量を算出した。その結果を図６に示す。

（実施例４）
水溶性有機酸として、リンゴ酸を用いた以外は実施例１と同じ手順で水溶性有機酸のエステル化した量を算出した。その結果を図７に示す。
（実施例５）
水溶性有機酸として、酪酸を用いた以外は実施例１と同じ手順で水溶性有機酸のエステル化した量を算出した。その結果を図８に示す。

（比較例１）
酸触媒として塩酸を用いる以外は実施例１と同じ手順で水溶性有機酸のエステル化した量を算出した。その結果を図４に示す。図中のグレーの実線は、エステル化反応の前に抽出溶媒として２，２，４−トリメチルペンタンを５００μｌ添加した場合の結果を、図中のグレーの破線は、エステル化反応の後に抽出溶媒として２，２，４−トリメチルペンタンを５００μｌ添加した場合の結果を、それぞれ示している。

（比較例２）
水溶性有機酸として乳酸を用いる以外は、比較例１と同じ手順で水溶性有機酸のエステル化した量を算出した。その結果を図５に示す。

（比較例３）
水溶性有機酸としてコハク酸を用いる以外は、比較例１と同じ手順で水溶性有機酸のエステル化した量を算出した。その結果を図６に示す。

（比較例４）
水溶性有機酸としてリンゴ酸を用いる以外は、比較例１と同じ手順で水溶性有機酸のエステル化した量を算出した。その結果を図７に示す。
（比較例５）
水溶性有機酸として酪酸を用いる以外は、比較例１と同じ手順で水溶性有機酸のエステル化した量を算出した。その結果を図８に示す。

（外挿値）
図４〜８中の細破線で示した直線は、前述の比較例１〜５の水溶液試料５０μｌを用いた時の水溶性有機酸のエステル化量と原点とを直線で結び、それ以外の水溶液試料の添加量（１００μｌ、２５０μｌ、５００μｌ又は１０００μｌ）に外挿した外挿値である。
比較例１〜５に使用している水溶性有機酸の濃度は十分に高いので、従来の塩酸を使用した方法でも、水溶液試料５０μｌを使用して、ある程度精度よく水溶性有機酸を定量分析できることが確かめられている。
そこで、この値を利用して、定量分析の精度を確かめるための外挿値を求めた。
したがって、実施例１〜５及び比較例１〜５については、分析結果がこの外挿値に近いほど、正確な分析ができていることを示す指標とすることができる。

図４〜図８の結果から、酸触媒として、塩酸を使用した比較例１〜４においては、水溶液試料の液量が増えると徐々に水溶性有機酸のエステル化割合が低下し、特に水溶液試料の添加量（Ａ）とアルコールの添加量（Ｂ）の体積比（Ａ／Ｂ）が１以上になると、すなわち、水溶液試料の添加量が５００μｌ以上になると、エステル化される水溶性有機酸の量が大きく低下してしまうことが分かる。

一方、酸触媒として、前記水溶液試料よりも前記アルコール相への溶解度が高い酸触媒を使用した実施例１〜４では、水溶液試料の体積（Ａ）とアルコールの体積（Ｂ）との体積比（Ａ／Ｂ）を１とした場合であっても、すなわち、水溶液試料の添加量が５００μｌでも、できるだけ外挿値に近いエステル化が起こる等、水溶液試料の体積（Ａ）とアルコールの体積（Ｂ）との比（Ａ／Ｂ）が１以上の場合において、特に、比較例と比べて明らかにエステル化効率が高くなっていることが分かる。

（実施例６）
次に、水溶性有機酸として酪酸を使用した場合を一例として挙げて、酸触媒としてノナフルオロブタンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドをそれぞれ使用した場合の酪酸のエステル化効率を比較した。
この時の反応液の組成や反応温度、反応時間及び酪酸のエステル化の転化率を以下の表１にまとめた。
酪酸のエステル化の転化率は、反応後分取した水相およびアルコール相中に含まれる水溶性有機酸由来のエステル量を^１Ｈおよび^１９Ｆ−ＮＭＲによって定量分析し、水溶液試料に含まれていた全水溶性有機酸のうちのエステル化した水溶性有機酸の割合を算出することによって求めた。また、使用した酸触媒のアルコール相への溶解度（分配率）については、反応後分取した水相およびアルコール相中に含まれる酸触媒の量を^１Ｈおよび^１９Ｆ−ＮＭＲによって定量分析して算出した。このようにして調べたアルコール相への分配率が５０を超えている場合には、前記水溶液試料よりも前記アルコール相への溶解度が高い酸触媒であると定義する。なお、上記の^１Ｈおよび^１９Ｆ−ＮＭＲ分析では、分取した水相およびアルコール相の質量を分析天秤で正確に測り取り、^１Ｈ−ＮＭＲでは０．１ｍｏｌ／ｌ塩化テトラアルキルアンモニウム―ジメチルスルホキシド―ｄ６溶液を、^１９Ｆ−ＮＭＲでは０．１ｍｏｌ／ｌテトラフルオロホウ酸リチウム―ジメチルスルホキシド―ｄ６溶液を、それぞれ所定量正確に測り取って添加し、内部基準とした。
この実施例で使用しているＮＭＲの装置構成及び分析条件は以下の通りである。
装置：ブルカーＡｖａｎｃｅ４００
^１Ｈ−ＮＭＲ分析条件
ポイント数：６５５３６
測定周波数幅：１２０１９Ｈｚ
パルス幅：１４．８０μｓ
積算回数：１６
遅延時間：４０ｓ
測定温度：３０３Ｋ
^１９Ｆ−ＮＭＲ分析条件
ポイント数：１３１０７２
測定周波数幅：１５００００Ｈｚ
パルス幅：１４．８０μｓ
積算回数：１６
遅延時間：４０ｓ
測定温度：３０３Ｋ
（比較例６）
酸触媒として、従来の塩酸を用いた場合について、実施例６と同様の手順で実験を行った結果についても表１に記載する。
ただし、アルコール相中に含まれる塩酸の量を^１Ｈおよび^１９Ｆ−ＮＭＲによって直接定量分析することが難しいので、アルコール相中に含まれる塩酸の量については、中和滴定によって算出している。中和滴定による塩酸量の算出方法は、以下の通りである。まず反応後の水相に中和滴定することによって、水相中の酸の総量を求める。その後、^１Ｈ−ＮＭＲによって水相中の酪酸の量を測定し、酸の総量から酪酸の量を差し引くことによって水相中に含まれる塩酸量を算出した。この水相中の塩酸量を反応液に添加した塩酸の全量から差し引くことによってアルコール相中に存在する塩酸量を求め、このように求めたアルコール相中の塩酸量を反応液に添加した塩酸の全量で除算して百分率表示した。この中和滴定による測定を３回繰り返し、その平均値をとったところ、塩酸のアルコール相への分配率はおよそ１４％であることが分かった。

表１の結果から、他の種類の疎水性酸触媒であっても、本発明の効果を十分に奏することが分かった。実施例６とほぼ同様の条件で酸触媒として塩酸を使用した比較例６ではＡ／Ｂが０．８と実施例６の各サンプルよりも小さく設定されているにも関わらず、実施例６のエステル転化率の方が比較例６のエステル転化率に比べて大幅に高いことが分かる。

（実施例７）
次に、これら酸触媒の濃度を変えて実施例６と同様の実験を行った。
この時の反応液の組成や反応温度、反応時間及び酪酸のエステル化の転化率を以下の表２にまとめた。

この表２の結果から、酸触媒濃度が高く、反応温度が高い方が短時間で高い反応効率を示すことが分かる。一方、酸触媒濃度や反応温度が低い場合であっても、反応時間を十分にとることによって、十分に高いエステル化の反応効率を維持できることが分かった。また、触媒濃度が０．３ｍｏｌ／ｋｇ以上の場合には反応時間が２４時間程度で転化率が一定となり、平衡状態に到達することが分かった。

（実施例８）
実施例８では、使用するアルコールの種類によるエステル化効率への影響を調べた。
この時の反応液の組成や反応温度、反応時間及び酪酸のエステル化の転化率を以下の表３にまとめた。

この表３の結果から、炭素数４以上のアルコールであれば、問題なく使用できることが分かる。また、直鎖状のアルコールの方が、エステル化効率が高いという傾向もわかった。

（実施例９）
次に、有機溶剤を添加した場合のエステル化効率への影響を調べる実験を行った。
この実施例には、以下の試薬Ａ〜Ｅを使用した。
試薬Ａ：水溶液試料（水溶性有機酸の４００μｇ／ｍｌ水溶液（エタノール１６％含む））
試薬Ｂ：エステル化試薬（０．５ｍｏｌ／ｌ ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミド−イソブチルアルコール溶液）
試薬Ｃ：疎水性有機溶剤
試薬Ｄ：中和剤（１ｍｏｌ／ｌ 炭酸水素ナトリウム水溶液）
試薬Ｅ：内部標準液（４００μｇ／ｍｌ ラウリン酸エチル−２，２，４−トリメチルペンタン溶液）
これらの試薬を以下に説明する量及び順番で混合して、水溶性有機酸をエステル化し、最終的に得られたエステルの量を実施例１と同様の手順及び条件で、ガスクロマトグラフィーで分析した。
結果は以下の表４〜表９にまとめた。

この表４では、前述した試薬Ａ〜Ｅのうち、有機溶剤（試薬Ｃ）を添加した場合と有機溶剤（試薬Ｃ）を添加しなかった場合とについて調べたものである。
この実験では、前述した試薬Ａを５００μｌ、試薬Ｂを５００μｌ、試薬Ｃを（添加する場合のみ）４５０μｌ、試薬Ｄを５００μｌ、試薬Ｅを５０μｌ使用して実施例１と同様の手順及び条件で水溶性有機酸をエステル化した。なお、この実験では試薬Ｃは１００℃で１時間の反応の前に添加した。
また、有機溶剤（試薬Ｃ）として、２，２，４−トリメチルペンタン、ヘキサン、トルエン、酢酸イソブチル、２−メトキシ−２メチルプロパン（ターシャリーブチルメチルエーテル，ＴＢＭＥ）のうちのいずれかを１種をそれぞれ使用した。また水溶性有機酸（試薬Ａ）についても、ピルビン酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸のいずれか１種をそれぞれ使用した。
表４では、有機溶剤を添加しなかった場合のエステル化効率を１００％とした場合の、有機溶剤を添加した場合のエステル化効率を表している。
この表４の結果から、溶剤添加するとほとんどの場合において、エステル化効率がより向上することが分かり、さらにいろいろな種類の有機溶剤が使用できることが分かった。なお、有機溶剤を添加していない場合であっても、本願発明の効果は十分に発揮され得るものである。

次に、これら有機溶剤をエステル化反応の前又は後で添加し、エステル化効率の変化を調べた。
具体的には、試薬Ｃを添加してから１００℃で１時間反応させたもの（先）と、１００℃で１時間反応させた後に、試薬Ｃを添加したもの（後）についてエステル化効率を前述した試薬Ｃの添加によるエステル化効率の変化を調べた際と同様の手順及び条件で調べた。
結果を以下の表５〜表９に示す。なお、表５は試薬Ｃとして２，２，４−トリメチルペンタンを使用した場合、表６は試薬Ｃとしてヘキサンを使用した場合、表７は試薬Ｃとしてトルエンを使用した場合、表８は試薬Ｃとして酢酸イソブチルを使用した場合、表９は試薬ＣとしてＴＢＭＥを使用した場合の結果をそれぞれ示している。
また、表中先／後（％）は、反応後に試薬Ｃを添加した場合を１００％とした場合の、反応前に試薬Ｃを添加した場合のエステル化効率を表している。

これら表５〜表９の結果から、有機溶剤をエステル化反応前に添加したほうが、水溶性有機酸のエステル化効率が高いことが分かった。そのため、反応液に有機溶剤を添加する場合には、エステル化反応前に有機溶剤を添加しておく方が好ましいと考えられる。なお、有機溶剤をエステル化反応後に添加した場合であっても、有機溶剤を添加しない場合と検出されるエステル化効率は同じであるものの、以下のような理由により、有機溶剤を添加しない場合に比べてエステルの検出精度を向上させるができると考えられる。反応液に疎水性の有機溶剤を添加することにより、例えば、エステルのアルコール相への分配をより大きくして、抽出効率を向上させることができることや、アルコール相中の水分や水溶性成分の水相への移動を促して、アルコール相中のエステルの濃度を精度よく分析することができることがその理由として挙げられる。

（実施例１０）
次に、本発明に係る酸触媒に加えて従来の酸触媒である塩酸をさらに添加した場合について、水溶性有機酸のエステル化効率を調べた。
まず、０．５ｍｏｌ／ｌのビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドを含有するイソブチルアルコール（Ｘ）と、０．５ｍｏｌ／ｌの塩酸を含有するイソブチルアルコール溶液（Ｙ）とを準備した。
これらＸとＹとを、体積比がＸ：Ｙ＝５００：０、３７５：１２５、２５０：２５０、１２５：３７５、０：５００となるようにそれぞれ混合したエステル化試薬を調製した。
このエステル化試薬を用いる点以外は、実施例１と同様の手順でエステル化効率を調べた結果を図９に示す。なお、反応に使用する水溶液試料の量は５００μｌとし、有機溶剤は反応前に添加した。なお、図９の縦軸は検出されたエステルのピーク面積（ａｕｂｉｔａｒｙ ｕｎｉｔ）を表している。

この図９の結果からも、酸触媒として、水溶液試料よりもアルコールへの溶解度が高い酸触媒ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドを使用した場合には、従来の酸触媒である塩酸のみを使用する場合に比べて、使用する水溶液試料の量を増やした場合（Ａ／Ｂが１の場合）であってもエステル化効率が高いことが分かる。
また、本発明に係る酸触媒に加えて、従来の酸触媒である塩酸をさらに添加した場合であってもこの効果は維持されることが分かった。さらに、水溶性有機酸の種類によっては、酸触媒として塩酸をさらに添加することにより、エステル化効率が向上するものもあることが分かった。

（実施例１１）
この実施例１１では、有機溶剤の添加によるエステル化効率への影響を調べるための実験を行った。
この実験では、反応液中の酸触媒の濃度は変えずに、エステル化反応前に疎水性有機溶剤である２，２，４−トリメチルペンタンを様々な体積で添加してその時のエステル化効率を調べた。
水溶性有機酸の４００μｇ／ｍｌ水溶液（エタノール１６％含む）５００μｌに対して、酸触媒であるビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドを０．５ｍｏｌ／ｌとなるようにイソブチルアルコールに溶解した酸触媒溶液（ａ）とイソブチルアルコール（ｂ）と２，２，４−トリメチルペンタン（ｃ）とを混合した液１０００μｌを混合して、実施例１と同様の手順及び条件でエステル化反応を起こさせ、実施例１と同様の手順及び条件で生成したエステルをガスクロマトグラフィーにより検出した。
各サンプルにおける酸触媒溶液（ａ）とイソブチルアルコール（ｂ）と２，２，４−トリメチルペンタン（ｃ）との混合割合（体積比）は以下の表１０の通りである。なお、この実施例では、酸触媒溶液（ａ）とイソブチルアルコール（ｂ）を合計した体積がアルコールの体積（Ｂ）を表し、２，２，４−トリメチルペンタン（ｃ）の体積が疎水性有機溶剤の体積（Ｃ）を表す。

ガスクロマトグラフィーによる分析の結果を図１０に示す。図１０の縦軸は、２，２，４−トリメチルペンタンを添加しない場合を１とした相対値を示している。
段落００７３でも述べたように、２，２，４−トリメチルペンタンを添加しない場合であってもエステル化反応は十分に進行することが確認されているが、この図１０の結果から、特にコハク酸、リンゴ酸、クエン酸では、有機溶剤である２，２，４−トリメチルペンタンを反応前に添加することによって、添加しない場合よりもエステル化効率が大きく向上していることが分かった。
また、図１０の結果から、疎水性アルコールであるイソブチルアルコールの量を減らしすぎると、エステル化効率が低下することも分かった。
つまり、反応液中の２，２，４−トリメチルペンタン（有機溶剤）の体積（Ｃ）を増やすとエステル化効率が向上するが、反応液中の酸触媒濃度を低下させないためにアルコールの添加量を減らしすぎてしまうとエステル化効率が低下してしまうので、これら有機溶剤の体積（Ｃ）とアルコールの体積（Ｂ）とのバランスもエステル化効率に影響を与える可能性があることが分かった。

本発明によれば、低濃度の水溶性有機酸についても高感度で定量分析することができるので、例えば、清酒等の微妙な味の違いをより客観的に精度よく評価することができる。
また、清酒等の製造工程における、水溶性有機酸の含有量の変化を詳細に追跡することも可能であるので、例えば、発酵食品の発酵状態を監視したり評価したりすることも可能である。

１・・・エステル化試薬
２・・・水溶液試料

Claims (9)

1. 水溶性有機酸をエステル化して得たエステル化合物を分析する水溶性有機酸の分析方法であって、
   水溶性有機酸を含有する水溶液試料と、前記水溶液試料と相分離するアルコールと、前記水溶液試料への溶解度よりも前記アルコールへの溶解度の方が高い酸触媒とを混合し、前記水溶性有機酸と前記アルコールとを反応させて前記水溶性有機酸をエステル化する工程を含むことを特徴とする水溶性有機酸の定量分析方法。
2. 前記アルコールと前記酸触媒とを予め混合してエステル化試薬を調製し、前記工程において、前記エステル化試薬と前記水溶液試料とを混合することを特徴とする請求項１記載の定量分析方法。
3. 前記エステル化試薬が、前記水溶液試料と相分離し前記アルコールと混和する有機溶剤をさらに含有することを特徴とする請求項１又は２記載の定量分析方法。
4. 前記工程において、前記アルコールへの溶解度よりも前記水溶液試料への溶解度の方が高い酸触媒をさらに混合することを特徴とする請求項１記載の定量分析方法。
5. 前記酸触媒が、強酸あるいは超強酸であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の定量分析方法。
6. 前記酸触媒が、置換基を有するスルホン酸、アルキルスルホンイミド及びスルホン酸基を有するホスホニウム塩を含有するイオン液体からなる群より選ばれるいずれか一種以上を含むものであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の定量分析方法。
7. 前記アルコールが、水と混和しない炭素数４以上のアルコールであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の定量分析方法。
8. 前記工程で生成したエステル化合物を気化分析することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の定量分析方法。
9. 水溶性有機酸をエステル化するためのエステル化試薬又は分析キットであって、
   水溶性有機酸を含有している水溶液試料と相分離するアルコールと、前記水溶液試料への溶解度よりも前記アルコールへの溶解度の方が高い酸触媒とを含有する水溶性有機酸のエステル化試薬又は分析キット。

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