JP2021535939A - より長い励起状態寿命を有する、テルビウムを含む超高輝度発光ランタニドナノ粒子 - Google Patents

Abstract

本発明は、改善された輝度、および増加した励起状態の寿命を同時に有する発光ランタニドナノ粒子を提供する。これらのナノ粒子は、テルビウムイオンおよび第２のランタニドのイオン、優先的にはユーロピウムを含み、ナノ粒子の表面に結合した発色団リガンドの分子でコーティングされている。リガンドは、式Ｉまたは式ＩＩのうちの少なくとも１種の発色団ラジカルを含む有機分子であり、【化１】式中、Ｒは、Ｈ、ＣＮ基、またはＣＯＯＨ基から選択される。リン光励起状態寿命は、第２のランタニドの表面テルビウムイオンからコアイオンへのエネルギー移動によって改善される。ナノ粒子は、少なくとも１つのリガンド分子に共有結合した分析対象の担体分子をさらに含み得る。【選択図】図９

Description

本発明は、顕著な輝度および励起状態の非常に長い寿命を有する新規な発光ランタニドナノ粒子に関する。

より具体的には、第２のランタニドのイオンと共ドーピングされたテルビウムイオンナノ粒子に関し、その表面をコーティングする発色団リガンドを含み、これにより、改善された輝度および増大した励起状態の寿命の両方がもたらされる。

これらの発光ナノ粒子は、生物学的分析の技術分野、特にフルオロ免疫学的分析、医療画像診断および顕微鏡検査に有利に使用され得る。

生物学的分析分野では、生体分子に特異的に結合することができ、かつ容易に観察可能な「標識」化合物の重要な必要性が存在する。

これらの標識化合物の結果、特定の分析物、例えば、核酸、酵素、ペプチド、薬剤（例えば、麻薬、毒物、薬物など）、ホルモン、代謝産物、病原性微生物、ウイルスまたは抗体、特に疾病状態に関与するものなどの存在は、研究または診断目的のために有利に検出および定量化され得る。

好ましい標識は、安価で、安全で、安定しており、幅広い種類の化学的、生化学的、および生物学的材料に結合可能でなければならない。それらはめったになく、むしろ決して自然界で見られることはない。さらに、それらは、水系において容易に検出可能であり、好ましくは速く、感度が高く、再現可能な方法で非常に特徴的な信号を与えるべきである。

先行技術において、幅広い種類の標識が開発されている。例えば、放射性標識が使用されることがある。しかし、そのような標識は欠点を有する。なぜなら、それらは高価で危険であり、洗練された設備および訓練されたスタッフが必要であり、特定の廃棄物処理が必要であるため。

その文脈において、蛍光分光法または発光検出法を使用して直接検出可能な標識は、特に関心がある。他の分子へのそれらの容易な結合のために開発された多数のそのような標識は、先行技術で説明されており、一部は市販されている。そのような標識は、理想的には、発光量子収率、狭い発光帯域、および長い励起状態寿命によるモル吸光係数の積として定義される良好な輝度を有するべきであり、時間分解検出技術を可能にする。

量子ドットとも称される半導電性ナノ結晶、例えば、Ｍｅｄｉｎｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｊｕｎｅ ２００５，４，４３５によって記載されているものは、良好な輝度を有するが、非常に短い発光寿命（マイクロ秒未満）および広い発光ピークを有する。

ランタニドイオンは、非常に特定の分光特性を有し、Ｂｕｎｚｌｉ，Ｊ．Ｃ．Ｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１０，１１０，２７２９によって開示されているように、そのような発光標識で使用される興味深い候補である。実際に、それらの発光線は非常に狭く、それらの励起状態寿命は長く、数ミリ秒に達し得る。したがって、それらの発光信号のスペクトルおよび時間の両方の識別は、合理的な信号対ノイズ比で可能である。

しかしながら、対応するモル吸光係数は非常に小さく、したがって非常に低い輝度を生成する。この不都合を克服するために、アンテナ効果と称される機構の結果、光を吸収し、吸収されたエネルギーをランタニドイオンに向かって移動させるために、光増感リガンドが使用されてきた。

生物学的材料に結合し得るランタニドイオン単核錯体に基づく発光標識は、従来技術に存在し、一部は市販されている（例えば、Ｌｕｍｉ４またはＬａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎの商品名で）。特許出願ＷＯ ００／４８９９０およびＷＯ ００／４８９９１は、１つのランタニドイオンおよび錯化剤を含むランタニドイオンキレート化合物から作製されるそのような発光マーカーの例を開示している。

しかしながら、最もよく知られているランタニド系標識は、これらの錯体の分子の性質のため、依然として適度な輝度しか示さない。例えば、ＷＯ ２０１３／０１１２３６；Ｄｅｌｂｉａｎｃｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１４，５４，１０７１８；ＷＯ ２００６／００１８３５、またはＸｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１９９９００に記載されている最も効率的な分子錯体は、１０^４Ｍ^−１．ｃｍ^−１のオーダーの明るさ、および３ミリ秒を超えない適度な発光寿命を有する。

この態様を改善するために、本発明者らは、ランタニドイオン分子錯体の代わりに、ランタニドイオンナノ粒子に関心を示した。

ナノ粒子は、通常の定義に従って１ｎｍ〜５００ｎｍのサイズである小さな物体であり、多数の原子から構成されており、その１つの関心は、表面上の多数の原子に起因する。この分野の最近の技術革新により、ナノ粒子の合成は、サイズ、元素組成、および特性の観点から制御され得る。

ランタニドナノ粒子は、大きなストークのシフトおよび強力な光安定性を提供するため、生物学的マーカーとして非常に有望である。しかし、それらが数百または数千個のランタニドカチオンから構成されていても、ランタニドイオンナノ粒子もまた、低い吸収係数を有する。

しかしながら、本発明者らは、ランタニドイオンナノ粒子、特にテルビウム含有ランタニドイオンナノ粒子の光増感を研究し、それらを表面テルビウムイオンでアンテナ効果を実施する好適な発色団リガンドでコーティングすることによって、その輝度を１０^６Ｍ^−１．ｃｍ^−１を上回る、すなわち、効率的な分子錯体の輝度を２桁上回って上昇させることに成功した。したがって、彼らは、標識として使用される分析対象のベクター（担体分子）によってマーキングされ得る新規な超高輝度発光テルビウムナノ粒子を得た。

さらに、従来技術に記載されているランタニドイオン単核錯体で実現されるものと比較して、分析における感度を改善するために、マーカーの励起状態寿命を延長することが非常に望ましい。

実際に、励起状態寿命が長ければ、遅延信号取得で時間分解測定を実現することが可能である。パルス励起後、発光強度を記録する前に遅延が課される。この遅延取得によって、より短い蛍光現象が除去され、他のすべての蛍光分子の信号が消失する。最長の励起状態寿命の化合物のリン光信号のみが、まだ測定対象として存在する。したがって、バックグラウンドノイズは有意に減少し、信号対ノイズ比は実質的に増加する。これは、蛍光化合物が環境中に多数存在する生物学的培地においてかなりの利点である。

本発明によって提供されるテルビウムを含有する新規な発光ナノ粒子は、標識としての利用を可能にする顕著な輝度および分析対象のベクターに結合する能力に加えて、さらに、従来技術の化合物よりも長い励起状態寿命を有する。

測定の感度および信号分解能を改善することによって、本発明のナノ粒子の水溶液中の、これらの非常に長い励起状態寿命および例外的な輝度は、生物学的分析および顕微鏡法分野において例外的な結果を可能にする。

発明の説明
技術的な問題を解決するために、本発明は、発光ランタニドナノ粒子であって、改善された輝度、および増加した励起状態の寿命を同時に有し、テルビウムを含むランタニドイオンナノ粒子、およびランタニドイオンナノ粒子の表面に結合したいくつかの発色団リガンドの分子を含む、発光ランタニドナノ粒子を提供する。

本発明によれば、前記ランタニドイオンナノ粒子は、テルビウムイオン、ならびにセリウム、プラセオジム、ネオジム、サマリウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、およびイッテルビウムからなる群から選択される少なくとも第２のランタニドのイオンを含む。

さらに、前記リガンドは、式Ｉまたは式ＩＩのうちの少なくとも１種の発色団ラジカルを含む有機分子であり、

式中、Ｒは、Ｈ、ＣＮ基、またはＣＯＯＨ基から選択される。

本発明の実施形態によれば、前記ランタニドイオンナノ粒子は、テルビウムイオン、ならびにセリウム、プラセオジム、ネオジム、サマリウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、およびイッテルビウムからなる群から選択される少なくとも第２のランタニドのイオンを含む。

さらに、前記リガンドは、式Ｉまたは式ＩＩのうちの少なくとも１種の発色団ラジカルを含む有機分子であり、

式中、Ｒは、４−エチル安息香酸基である。

したがって、リガンドは、上記のような式ＩまたはＩＩを有する１つの基またはモチーフ、および前記基またはモチーフに結合した任意の好適な化学構造を含む有機分子である。表示された切り捨ての後に位置する任意の種類のこの化学構造は、例えば、ＯＨ基、ヘテロ原子を有するか否かにかかわらず分枝状、直鎖状、または環状炭素鎖、グラフト官能基、任意の好適な種類のスペーサー基によって任意選択的に一緒に結合した１つまたは複数の他の発色団基（複数可）、または任意の他の好適な化学構造であり得る。

本発明の結果、得られたナノ粒子は、その後の実施例パートで、「発光分光法の実験的測定方法」と称される項で説明されるように測定された場合、それぞれ３ミリ秒および１０^４Ｍ^−１．ｃｍ^−１よりも同時に優れ、優先的にはそれぞれ５ミリ秒および１０^５Ｍ^−１．ｃｍ^−１よりも同時に優れ、さらにより優先的にはそれぞれ７ミリ秒および１０^６Ｍ^−１．ｃｍ^−１よりも同時に優れている、輝度および励起状態寿命を有する。

本発明の実施形態によれば、第２のランタニドは、ユーロピウム、サマリウム、ジスプロシウム、およびイッテルビウムから選択され、優先的にはユーロピウムである。

実施形態に応じて、ランタニドイオンナノ粒子は、１０〜９９．９モル％、優先的には５０〜９９．９モル％、さらにより優先的には７５〜９９．９モル％のテルビウムイオン、０．１〜９０モル％、優先的には０．１〜５０モル％、さらにより優先的には０．１〜２５モル％の第２のランタニドのイオンを含有し得る。

本発明の好ましい実施形態によれば、ランタニドイオンナノ粒子は、ランタン、ルテチウム、およびガドリニウムから選択され、優先的にはランタンである第３のランタニドのイオンをさらに含む。

この場合、実施形態に応じて、前記ランタニドイオンナノ粒子は、１〜９８．９モル％、優先的には１０〜９８モル％、さらにより優先的には４０〜９８モル％のテルビウムイオン、０．１〜２０モル％、優先的には０．５〜１０モル％、さらにより優先的には１〜５モル％の第２のランタニドのイオン、および１〜９０．９モル％、優先的には１０〜８０モル％、さらにより優先的には１０〜２０モル％の第３のランタニドのイオンを含有し得る。

本発明の実施形態によれば、リガンドは、ｎ個の発色団ラジカルおよび１個のスペーサー基を含み、スペーサー基は、発色団ラジカルを一緒に結合する炭素鎖を含有するヘテロ原子であり、ｎは、１〜１０、優先的には２〜６、より優先的には２〜３の整数である。

本発明の好ましい実施形態によれば、リガンドは、分析対象の担体分子に共有結合可能なグラフト官能基をさらに含む。

この実施形態によれば、発光ナノ粒子は、少なくとも１つのリガンド分子に共有結合した分析対象の担体分子をさらに含み得る。

分析対象の担体分子は、好ましくは、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体部分、２０００ｇ．モル^−１未満の分子量の小分子からなる群から選択される。それは、例えば、ビオチン、デスチオビオチン、ストレプトアビジン、またはマツズマブ抗体、ペプチドＬＰＦＦＤ、ペプチドＫＬＶＦＦ、または抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヒト抗体であり得る。

本発明の好ましい実施形態によれば、リガンドは、式Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５による構造を有する分子から選択される。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、リガンドは、式Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、およびＬ９による構造を有する分子から選択される。

本発明の他の特性および利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読むことによって明らかにされる。
それぞれ、透過型電子顕微鏡画像、超純水中の動的光散乱を示すグラフ、および実施例Ｎ°５によるランタニドナノ粒子に対応する固体ナノ粒子のＸ線回折パターンを示すグラフである。 それぞれ、透過型電子顕微鏡画像、超純水中の動的光散乱を示すグラフ、および実施例Ｎ°６によるランタニドナノ粒子に対応する固体粒子のＸ線回折パターンを示すグラフである。 本発明による、生体機能化発光ナノ粒子を得るための２つの異なる方法の図式表現である。 リガンドＬ５による実施例Ｎ°６によるランタニドナノ粒子の滴定、続いて、それぞれ、ＵＶ／可視吸収、および発光蛍光分光法を示すグラフである。 添加されたリガンドＬ５の濃度の関数として、３１４ｎｍでの吸収進化を示す図８の滴定に関連するグラフである。 リガンドＬ５による実施例Ｎ°６によるランタニドナノ粒子の滴定、続いて、それぞれ、ＵＶ／可視吸収、および発光蛍光分光法を示すグラフである。 より具体的には、テルビウムおよびユーロピウムの発光に対応するスペクトルの区域を示す図１０のグラフの囲まれた部分の拡大である。 添加されたリガンドＬ５の濃度の関数として、異なる波長での強度発光進化を示す図１０の滴定に関連するグラフである。 緩衝溶液中のリガンドＬ５でコーティングされたＬａ_０．９９Ｅｕ_０．０１Ｆ_３（曲線ｂ’’’）およびＬａ_０．９Ｅｕ_０．１Ｆ_３（曲線ａ’’’）のナノ粒子の発光スペクトルを示すグラフである。

本発明による発光ナノ粒子を、図１〜１３を参照して詳細に説明する。

別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。

本発明による発光ナノ粒子は、テルビウムイオン、ならびにセリウム、プラセオジム、ネオジム、サマリウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、およびイッテルビウムから選択される少なくとも第２のランタニドのイオンを含むランタニドイオンナノ粒子から作製される。

好ましくは、このランタニドイオンナノ粒子はまた、可視領域および近赤外線領域において分光学的に沈黙しているが、分光学的に活性なイオン間の自己クエンチを有利に減少させる宿主マトリックスとして機能する第３のランタニドのイオンも含有し得る。

これらの第３のランタニドイオンは、有利なことには、本発明の共ドーピングされたランタニドイオンナノ粒子を得るために、テルビウムイオンおよび別のランタニドのイオン（第２のランタニドイオン）によって、容易にドーピングされ得るランタンイオンまたはルテチウムイオンであり得る。

磁気特性が所望される場合、分光特性に加えて、ガドリニウムイオンもまた、第３のランタニドイオンとして有利に使用され得る。

ランタニドイオンナノ粒子は、古典的な利用可能な方法を使用して、当業者によって水媒体中で容易に合成され得る。例えば、その後の実施例の部分で詳細に説明されるように、それらは、電子レンジを使用して水中で、またはオートクレーブ内で水熱合成によって実現され得る。

これによって合成される場合、異なるランタニドイオンがランダムに位置し、いくつかは表面上に、いくつかは得られたナノ粒子のコア内に位置する。

本発明に準拠した多くのランタニドイオンナノ粒子が合成され、テルビウムおよび他のランタニドイオン中の異なるドーピングレベルで発明者によって特徴付けられた。その後、実施例パートの表１に、そのいくつかの例がまとめられる。

実施例Ｎ°５およびＮ°６に対応するランタニドイオンナノ粒子は、透過型電子顕微鏡法、超純水中の動的光散乱、およびＸ線回折によって特徴付けられた。得られた結果を図１〜図６に示す。

先に説明したように、本発明の発光ナノ粒子は、発色団リガンドによって光増感する。これらの発色団リガンドは、光エネルギーを吸収し、アンテナ効果によってナノ粒子の表面に存在するランタニドイオンにそれを移動させる。

これらのリガンドの性質の選択は、ナノ粒子の溶解性および安定性を確実にし、所望の顕著な分光特性を得るために優れた配位を有することが重要である。

本発明によるリガンドは、テルビウムイオンを特異的に光増感する１つまたは複数の発色団ラジカルで選択され、これらの発色団ラジカルは、少なくともテルビウムの７Ｆ６〜５Ｄ４遷移のエネルギーギャップに対応するエネルギー量を移動させ得る。

そのため、ジピコリン酸または２−ヒドロキシイソフタル酸蛍光体に基づく発色団ラジカルは、本発明によるナノ粒子のＴｂ（ＩＩＩ）イオンを増感するために選択されている。実際に、これらのラジカルの三重項状態（それぞれ、２６６００ｃｍ^−１および約２３０００ｃｍ^−１）は、Ｔｂ（ＩＩＩ）イオンの励起状態（２０５００ｃｍ^−１）に近く、エネルギー移動を最適化し、優れた光増感を得ることができる。

ジピコリン酸（左）および２−ヒドロキシイソフタル酸（右）の式を以下に示す。

これらの観察から、２つのシリーズのリガンドが、異なるリンカーおよび置換基で合成されている。しかしながら、高度に予備組織化されたランタニドイオン配位に使用される通常のリガンドとは対照的に、本発明のリガンドは、優先的に平面配位を標的にして、ナノ粒子の安定化を確保しながら、ランタニドカチオンからの浸出を防止する。

したがって、本発明は、式Ｉまたは式ＩＩのうちの１種またはいくつかの発色団ラジカルを含む有益なリガンドを提供し、

式中、Ｒは、Ｈ、ＣＮ基、またはＣＯＯＨ基から選択される。

別の実施形態によれば、本発明は、式Ｉまたは式ＩＩのうちの１種またはいくつかの発色団ラジカルを含む有益なリガンドを提供し、

式中、Ｒは、４−エチル安息香酸基である。

これらの発色団ラジカルは、ランタニドナノ粒子の表面へのリガンドの結合を確実にする定着部位として機能するいくつかの酸素および窒素原子、ならびに光エネルギーを強力に吸収し得、続いてそれが結合するランタニドナノ粒子の表面でテルビウムイオンに光エネルギーを移動させ得る芳香族部分を有する。

本発明に準拠したリガンドの例は、特に、Ｌ_５と称される以下に表示される分子である。

その後、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４と称される、リガンドの他の４つの優先的な実施例が示される。

その後、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、およびＬ９と称される、リガンドの他の４つの優先的な実施例が示される。

これらのリガンド実施例Ｌ１〜Ｌ５の合成方法は、以下の実施例部分に記載される。

これらのリガンド実施例Ｌ６〜Ｌ９の合成方法も、以下の実施例部分に記載される。

リガンドがいくつかの発色団ラジカルを含む場合、これらのラジカルは、リガンドの発色団ラジカルの数と共に増加する長さを有するスペーサー基と称される炭素鎖によって、リガンド内で一緒に優先的に結合する。

Ｌ１〜Ｌ４で見られ得るように、スペーサー基は、優先的には、結合する発色団ラジカルと少なくとも同じ数のアームを有する、１つまたは複数のヘテロ原子、例えば、窒素原子を含有する分岐炭素鎖である。

さらに、Ｌ６〜Ｌ８で同じことがわかり、スペーサー基は、優先的には、結合する発色団ラジカルと少なくとも同じ数のアームを有する、１つまたは複数のヘテロ原子、例えば、窒素原子を含有する分岐炭素鎖である。

有利なことには、本発明によるリガンドは、分析対象の担体分子に共有結合可能なグラフト官能基をさらに含み得る。この場合、このグラフト官能基は、スペーサー基によって分子の残りの部分にも結合する。

上記実施形態の場合、スペーサー基は、グラフト官能基を結合するための補足アームを有し得る。

グラフト官能基の性質は、結合するベクターまたは担体分子の性質に応じて決定される。その化学構造は、所望の担体分子の化学構造に特異的結合かつ共有結合し得るように精巧に考案される。したがって、このグラフト構造は、所望の用途に正確に対応するように当業者によって適合させることができる。

標的とする担体分子は、得る所望の標識またはマーカーに応じて、多様であり得る。そのようなベクターのいくつかが想定されており、本発明と適合性があり、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体部分、または例えば、ビオチンもしくはデスチオビオチンなどの２０００ｇ．モル−１未満の分子量の小分子を含む。

別の実施形態では、他のベクターが想定されており、本発明と適合性があり、例えば、ペプチドＬＰＦＦＤ、ペプチドＫＬＶＦＦ、または抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヒト抗体を含む。

ランタニドイオンナノ粒子の周囲にリガンドを固定し、分析対象の担体分子をリガンドに共有結合させた後、本発明の結果、生体機能化超高輝度発光ナノ粒子が得られる。

図７に概略的に表示されるように、工程が実現される順序に応じて、２つの異なる方法によって、そのような生体機能化発光ナノ粒子を得ることが可能である。

上記に表示された第１の方法によれば、発色団ラジカル２、スペーサー基３、およびグラフト官能基４をそれぞれ含むリガンド分子１は、第１に、例えばペプチドまたは抗体であり得る生体分子５（担体分子またはベクター）と混合される。これらの生体分子５は、それらのグラフト官能基４を介してリガンド分子１に結合し、生体機能化リガンド分子６が得られる。

第２の工程では、ランタニドナノ粒子７は、その発色団２によってランタニドナノ粒子７の表面をコーティングする生体機能化リガンド分子６に混合される。

以下に表示される第２の方法によれば、リガンド分子１は、直ちにランタニドナノ粒子７と接触する。リガンド分子１の発色団２は、ランタニドナノ粒子７の表面に結合し、したがって、コーティングされたナノ粒子８を形成する。

これらのコーティングされたナノ粒子８は、第２の工程で生体分子５と混合される。これらの生体分子５は、ランタニドナノ粒子７にすでに結合したリガンド分子１のグラフト官能基４に共有結合する。

両方の記載された方法は、本発明による、生体機能化発光ナノ粒子９の取得をもたらす。生体分子５に起因する立体障害のため、それらは、固定されたコーティングリガンドの数（第２の方法でより重要）および固定された生体分子の数（第１の方法でより重要）において異なり、したがって、対象用途に応じて当業者によって代替的に選択され得る。

したがって、前述のリガンドＬ１〜Ｌ４は、生体機能化リガンドを生成するために、担体分子のヒドロキシル、アミン、またはチオール官能基を、例えば、リガンドＬ１〜Ｌ４のグラフト官能基と反応させることによって、分析対象の担体分子を有利に固定し得る。

リガンドＬ１から実現される生体機能化リガンドの２つの特定の例は、本発明者によって合成および試験された。これらの実施例は、ストレプトアビジンおよびマツズマブ抗体によるリガンドＬ１の生体機能化と比較して、その後の実施例部分で詳細に説明される。

さらに、有利に発光ナノ粒子を生体機能化するために、本発明は、例外的な分光特性を有する発光ナノ粒子を提供する。

先に説明されたように、好適な発色団含有リガンドによるランタニドイオンナノ粒子のコーティングは、ナノ粒子の表面に位置する発色団からテルビウムイオンへのアンテナ効果を介したエネルギー移動の結果、得られるナノ粒子の輝度を改善する。

しかしながら、それらの表面テルビウムイオンは、それらを取り囲む水性環境の水分子によって生物学的培地中で振動クエンチに供され、これは、それらの励起状態寿命を不利に低減し、それらの量子収率を減少させ、したがって、続いてそれらの輝度を減少させる。

この技術的問題を解決するために、本発明は、テルビウムイオンに加えて、テルビウムとは異なる好適な第２のランタニドのイオンを含むランタニドナノ粒子を提供する。

第２のランタニドイオンのこの添加の目的は、ナノ粒子のコアに位置するランタニドイオンの発光を促進することである。

実際に、ナノ粒子のコアに位置するランタニドイオンは、培地の水分子の振動クエンチから保護されるため、表面イオンよりも長い寿命、および改善された固有量子収率を有する。しかし、それにもかかわらず、それらは表面から遠く、アンテナとして作用する発色団リガンドによって効率的に増感され得ない。

テルビウムイオンと協働し得るセリウム、プラセオジム、ネオジム、サマリウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、およびイッテルビウムの中から適切に選択される第２のランタニドのイオンを導入することによって、これらのコアイオンの発光の関与が有利に得られる。

実際に、ナノ粒子の表面に位置するテルビウムイオンＴｂ^３＋から、ナノ粒子のコアに存在する第２のランタニドＬｎ^３＋のイオンへのエネルギー移動は、漏斗効果によって促進される。

この効率的なエネルギー移動の結果、表面テルビウムイオンは、コアのランタニドイオンにアクセスし、増感するためのリレーとして機能する。したがって、ナノ粒子の分光特性が強化される。ナノ粒子の輝度が改善され、水性培地中のそれらの励起状態寿命が同時に増加する。

そのような有益な効果は、本発明に準拠した発光ナノ粒子上で実施され、リガンドＬ５分子でコーティングされた実施例Ｎ°６によるランタニドナノ粒子を含む研究に関連して、図８〜１３に実証された。

これらの研究は、実施例Ｎ°６ランタニドナノ粒子のリガンドＬ５の存在下での挙動を理解するために実施された。Ｌ５による滴定を通して、ナノ粒子の吸収、励起、および発光スペクトルが監視された。これらの試験の目的は、Ｌ５によるＴｂ（ＩＩＩ）イオンの増感が、ＴｂとＥｕとの間のエネルギー移動を使用して、ナノ粒子のＥｕ（ＩＩＩ）イオンの水中の分光特性を改善することを示すことであった。

図８では、Ｌａ０．１４Ｔｂ０．８５Ｅｕ０．０１Ｆ３ナノ粒子（［ｃ］＝１３．５ｐＭ）を含有する緩衝溶液（ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、０．０１Ｍ、ｐＨ＝７）は、リガンドＬ５によって滴定された。その操作は、Ｌ５の水溶液（［ｃ］＝５ｘ１０^−４Ｍ）の体積を増加させること、およびＵＶ／可視吸収分光法によって得られる溶液の吸収を監視することから構成されている。

各曲線、ａ〜ｌは、リガンドＬ５溶液の異なる添加体積Ｖの増加に対応する。

曲線ａは、リガンドＬ５を含まないナノ粒子溶液単独、すなわち、添加体積のＶ_ａ＝０μＬのＬ５リガンド溶液に対応する。

曲線ｂ〜ｌは、曲線ｂについては、Ｖ_ｂ＝２０μＬ、曲線ｃについては、Ｖ_ｃ＝４０μＬ、曲線ｄについては、Ｖ_ｄ＝６０μＬ、曲線ｅについては、Ｖ_ｅ＝８０μＬ、曲線ｆについては、Ｖ_ｆ＝１００μＬ、曲線ｇについては、Ｖ_ｇ＝１２０μＬ、曲線ｈについては、Ｖｈ＝１４０μＬ、曲線ｉについては、Ｖｉ＝２００μＬ、曲線ｊについては、Ｖ_ｊ＝４００μＬ、曲線ｋについては、Ｖ_ｋ＝６５０μＬ、および曲線ｌについては、Ｖ_ｌ＝９００μＬのＬ５リガンド溶液の添加体積にそれぞれ対応する。

図８に見られるように、溶液の吸収は、添加されたリガンドの体積と同じ方法で増加する。

図９に表示されるように、リガンドＬ５の吸収帯域の最大値に対応する３１４ｎｍでの吸収を具体的に研究すると、３１４ｎｍでの吸収帯域の増加は、添加されたリガンドの濃度の関数として線形であることに気付き得る。

同時に、Ｌ５の各添加について、Ｌａ_０．１４Ｔｂ_０．８５Ｅｕ_０．０１Ｆ３ナノ粒子の発光スペクトルも蛍光分光法（λ_ｅｘｃ＝３３０ｎｍ）によって測定され、図１０および１１に表示されて、各曲線ａ’〜ｌ’は、リガンドＬ５溶液の異なる添加体積の増加に対応する。

先のように、曲線ａ’は、リガンドＬ５を含まないナノ粒子溶液単独、すなわち、添加体積のＶ_ａ’＝０μＬのＬ５リガンド溶液に対応し、曲線ｂ’〜ｌ’は、曲線ｂ’については、Ｖ_ｂ’＝２０μＬ、曲線ｃ’については、Ｖ_ｃ’＝４０μＬ、曲線ｄ’については、Ｖ_ｄ’＝６０μＬ、曲線ｅ’については、Ｖ_ｅ’＝８０μＬ、曲線ｆ’については、Ｖｆ’＝１００μＬ、曲線ｇ’については、Ｖｇ’＝１２０μＬ、曲線ｈ’については、Ｖｈ’＝１４０μＬ、曲線ｉ’については、Ｖ_ｉ’＝２００μＬ、曲線ｊ’については、Ｖ_ｊ’＝４００μＬ、曲線ｋ’については、Ｖ_ｋ’＝６５０μＬ、および曲線ｌ’については、Ｖ_ｌ’＝９００μＬのＬ５リガンド溶液の添加体積にそれぞれ対応する。

選択された励起波長、λｅｘｃ＝３３０ｎｍは、リガンドＬ５の吸収波長に対応する。

リガンドＬ５を含まないナノ粒子溶液に対応する曲線ａ’は、３３０ｎｍで励起される場合、ナノ粒子のＴｂおよびＥｕ発光が極端に弱いことを示す。曲線ａ’は、横軸とほぼ一致する。

曲線ｂ’に対応するリガンドの第１の添加によって、ＴｂおよびＥｕイオンが増感し、４８５、５４５、５８４、および６２１ｎｍのテルビウムの４つの典型的な発光帯域を含有する発光スペクトル、ならびに５７９ｎｍ、５８３〜６０３ｎｍ、６０４〜６３０ｎｍ、６５０ｎｍ、および６７９〜７０７ｎｍの狭い帯域を有するユーロピウムの信号を得、発光の最大値は、５９２ｎｍである。

これらの発光帯域の重要性は、曲線ｂ’から曲線ｌ’まで、リガンドの添加量が増加するのと同じ方法で増加する。

テルビウムおよびユーロピウムに対応する発光帯域は、図１１の拡大においてより容易に観察され得る。

大量のリガンドが添加される場合、４１５ｎｍの区域内の別の発光帯域が現れ、増加する。この帯域は、溶液中のリガンドの蛍光に起因する。

図１２に見られるように、添加されたリガンドの関数としてのスペクトルの異なるピークの強度の進化は、リガンドＬ５による滴定中に異なる挙動を示す。

Ｃｕｒｖｅ ａ”は、リガンドＬ５の発光帯域に対応する４１５ｎｍにおける発光強度の進化を示す。予測通り、曲線ａ”は、添加されたリガンドの濃度の関数としてほぼ直線的である。曲線ａ”の勾配は、溶液中の非配位リガンドＬ５分子の増殖のため、等価体積の後（以下に説明されるように）わずかに増加する。

曲線ｂ”は、５４５ｎｍにおけるテルビウムの主帯域の発光強度の進化を示す。ランタニドナノ粒子の表面で結合したリガンドＬ５分子の数が増加するにつれて、テルビウムの発光強度は、曲線ｂ”の第１の部分において徐々に増加する。次いで、ランタニドナノ粒子の表面が、リガンドＬ５分子によって完全にコーティングされる場合、最大値に達する。この強い強度の発光は、リガンドＬ５分子によるナノ粒子の表面でのテルビウムイオンの光増感に起因する。

成長領域および最大領域に関連する２つの直線の点Ｐにおける交点は、ナノ粒子表面を完全にコーティングするのに必要な最小体積のリガンド溶液に対応する滴定の等価体積を画定することを可能にする。表示される場合、等価体積は、４２３μＬに位置していた（８．８×１０^−５モルのＬ^−１の濃度に対応する）。

ユーロピウム発光の進化は、それぞれ曲線ｃ”およびｄ”に対応する６１４ｎｍおよび７００ｎｍの２つの帯域で観察された。リガンドＬ５溶液の第１の添加から、強力な発光が現れ、２つの帯域の最大強度に達する。この発光は、Ｌ５溶液を次に添加しても一定のままである。

曲線ｃ”およびｄ”によって示されるユーロピウムイオンの強力な発光は、本発明で予測されるように、リガンドＬ５による表面でのテルビウムイオンの光増感の後に、有利なことにナノ粒子のコア内のユーロピウムイオンへのエネルギーの定量的移動が続くことを証明する。この顕著な発光は、図１３に例示されるように、リガンドＬ５分子がそれらをほとんど光増感しないため、リガンドＬ５によって表面に存在するユーロピウムイオンの直接光増感によって引き起こすことはできない。

実際に、図１３では、曲線ａ’’’について、１．２９ｎＭの濃度を有するＬａ_０．９Ｅｕ_０．１Ｆ_３、および曲線ｂ’’’について、２４６ｐＭの濃度を有するＬａ_０．９９Ｅｕ_０．０１Ｆ_３の、それぞれ、ユーロピウムイオンを含有するが、テルビウムイオンを含有しない２つのランタニドナノ粒子の発光スペクトルは、リガンドＬ５吸収に対応するλｅｘｃ＝３３０ｎｍの波長での励起後、緩衝溶液（ＴＲＩＳ／ＨＣｌ ０．０１Ｍ、ｐＨ７．０）中のリガンドＬ５溶液（［Ｌ５］＝１．２２×１０^−５Ｍ）の存在下で監視された。これらのスペクトルでは、リガンドＬ５分子の発光帯域は、目に見える唯一の顕著な発光ピークであり、ユーロピウムの発光帯域はほとんど観察できない。

ランタニドイオンナノ粒子の合成
ランタニドイオンナノ粒子の合成について、２つの実験方法を使用した。

第１の方法は、マイクロ波照射を使用する。電子レンジを使用して、水中でそれを実現した。

この第１の方法に従って、ＮＨ_４Ｆ、ＴｂＣｌ_３、ＬｎＣｌ_３、および任意選択的にＬａＣｌ_３の溶液を、ミリＱ水中で調製した。Ｌｎは、本発明のナノ粒子の第２のランタニドに対応し、代替的に、セリウム、プラセオジム、ネオジム、サマリウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、またはイッテルビウムである。

合成の第１の工程は、ナノ粒子に対する所望の共ドーピングに対応する量で、ＴｂＣｌ_３、ＬｎＣｌ_３、および任意選択的にＬａＣｌ_３を一緒に混合することからなっている。

第２の工程では、ＮＨ_４Ｆの溶液を、室温で添加した。ＮＨ_４Ｆのこの添加された体積は、１当量のランタニドに対して３当量に対応した。

次いで、第３の工程は、混合物を電子レンジで１５０℃で１２分間温めることであった。電子レンジ内での合成によって、迅速かつ正確な温度上昇、中温での迅速な合成を伴う定期的な加熱が得られ、したがって、狭いサイズ分布を有するナノ粒子を生成することが期待された。

９０００ｔｒ／分で２５分間の遠心分離の後、上清を除去し、白色固体を６０℃で１時間超音波を使用してミリＱ水中に分散させて、ナノ粒子の水性懸濁液を得た。

第２の方法は、水中での１５０℃のオートクレーブ中の水熱合成である。

加熱に対応する第３の工程を除いて、手順は全く同じであった。この方法の第３の工程では、混合物をスチール反応器に封入し、オーブン内で１５０℃で２時間加熱した。

遠心分離、上清除去、および超音波分散の後、ナノ粒子の水溶液を、第１の方法と比較して同様の収率で得た。

ランタニドイオンナノ粒子の異なる例は、それに応じて合成され、以下の表１に示される。

リガンドＬ_１、Ｌ_２、およびＬ_３の合成：
請求項に係るリガンドＬ_１、Ｌ_２、およびＬ_３を、以下の合成工程に従い、以下の中間化合物１〜７を用いて調製した。

化合物１を、ＮａＯＨの存在下での、１１０℃で一晩の、ＫＭｎＯ_４による２，６−ジメチルアニソールの酸化、続いて媒体の酸性化およびＥｔＯＨの存在下でのエステル化による２つの工程で得た。２つの工程について、全体的な収率は、７９％であった。
ＴＬＣ：Ｒ_ｆ＝０．８４（ＳｉＯＨ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９５／５）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１．３６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、６Ｈ、ＣＨ_３）、３．９０（ｓ、３Ｈ、ＣＨ_３）、４．３５（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ_２）、７．１６（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．８７（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１４（ＣＨ_３）、６１（ＣＨ_２）、６４（ＣＨ_３）、１２３（ＣＨ）、１２７（Ｃ_ｑｕａｔ）、１３５（ＣＨ）、１５９（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６６（Ｃ_ｑｕａｔ）。ＥＳＩ／ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ＝２５３．１１（［Ｍ＋Ｈ］^＋、１００％）、２５４．１１（［Ｍ＋Ｈ］^＋、１３％）、２５５．１１（［Ｍ＋Ｈ］^＋、２％）、５２７．１９（［２Ｍ＋Ｎａ^＋］、４８％）。Ｃ_１３Ｈ_１６Ｏ_５．１／３Ｈ_２Ｏについて計算された元素分析：Ｃ、６０．４６、Ｈ、６．５０。判明：Ｃ、６０．６３、Ｈ、６．２９。

ＥｔＯＨ中のＫＯＨによる化合物１の制御された鹸化によって、化合物２を７６％の収率で得た。
ＴＬＣ：Ｒ_ｆ＝０．７０（ＳｉＯＨ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９／１）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１．４２（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ_３）、４．０５（ｓ、３Ｈ、ＣＨ_３）、４．４３（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、７．３（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．０８（ｄｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１．９Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．３０（ｄｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１．８Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ_ａｒ）。

アセトニトリル中、ＥＤＣＩおよびＨＯＢｔを使用した、トリエチルアミンの存在下での、化合物２の１，３−ジアミノ−２−プロパノールとのペプチドカップリングによって、化合物３を７４％の収率で得た。
ＴＬＣ：Ｒ_ｆ＝０．５１（ＳｉＯＨ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９５／５）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１．４２（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、６Ｈ、ＣＨ_３）、３．５３−３．６０（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．６９−３．７６（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２）、４．００（ｓ、６Ｈ、ＣＨ_３）、４．０２−４．０６（ｍ、１Ｈ、ＣＨ）、４．２５（ｄ、Ｊ＝４．１Ｈｚ、１Ｈ、ＯＨ）、４．４１（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ_２）、７．２７（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．９３（ｄｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１．９Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．２３（ｄｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、１．９Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．３６（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ、ＮＨ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１４（ＣＨ_３）、４４（ＣＨ_２）、６２（ＣＨ_２）、６４（ＣＨ_３）、７２（ＣＨ）、１２４（ＣＨ）、１２６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１２７（Ｃ_ｑｕａｔ）、１３５（ＣＨ）、１３６（ＣＨ）、１５８（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６６（Ｃ_ｑｕａｔ）。ＩＲ（ｃｍ^−１、ＡＴＲ）ν３３７６、２９４０、１７２３、１６４２、１５２５、１４１７、１２５５、１１３１。ＥＳＩ／ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ＝５０３．２０（［Ｍ＋Ｈ］^＋、１００％）、５０４．２０（［Ｍ＋Ｈ］^＋、２１％）、５０５．２０（［Ｍ＋Ｈ］^＋、３％）、１０２７．３３（［２Ｍ＋Ｎａ＋］、２７％）。Ｃ_２５Ｈ_３０Ｎ_２Ｏ_９，１Ｈ_２Ｏについて計算された元素分析：Ｃ、５７．６９、Ｈ、６．２０、Ｎ、５．３８。判明：Ｃ、５７．８８、Ｈ、５．８９、Ｎ、５．８５。

ＴＨＦ中、７８℃、１時間での、化合物３、ｔ−ブタン酸カリウム、およびｔ−ブチルブロモアセテートを使用したウィリアムソン型求核置換によって、化合物４を精製後５１％の収率で得た。
ＴＬＣ：Ｒ_ｆ＝０．６６（ＳｉＯＨ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９５／５）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１．４２（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、６Ｈ、ＣＨ_３）、１．４７（ｓ、９Ｈ、ＣＨ_３）、３．４６−３．５２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．７７−３．８２（ｍ、１Ｈ、ＣＨ）、３．８４−３．９２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．９８（ｓ、６Ｈ、ＣＨ_３）、４．１６（ｓ、２Ｈ、ＣＨ_２）、４．４１（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ_２）、７．２５（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ、ＮＨ）、７．９１（ｄｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１．９Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．２０（ｄｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１．６Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．４０（ｔ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１４（ＣＨ_３）、２８（ＣＨ_３）、４０（ＣＨ２）、６１（ＣＨ_２）、６４（ＣＨ_３）、６８（ＣＨ）、７８（ＣＨ_２）、８２（Ｃ_ｑｕａｔ）、１２４（ＣＨ）、１２６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１２８（Ｃ_ｑｕａｔ）、１３５（ＣＨ）、１３６（ＣＨ）、１５８（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６５（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１７０（Ｃ_ｑｕａｔ）。ＩＲ（ｃｍ^−１、ＡＴＲ）ν３３７６、２９８０、１７２５、１６５３、１５１８、１４１７、１２５５、１１２５、９９４。ＥＳＩ／ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ＝６１７．２７（［Ｍ＋Ｈ^＋］、１００％）、６１８．２７（［Ｍ＋Ｈ^＋］、３５％）、６１９．２７（［Ｍ＋Ｈ^＋］、９％）、６２０．２８（［Ｍ＋Ｈ^＋］、１％）。Ｃ_３１Ｈ_４０Ｎ_２Ｏ_１１について計算された元素分析：Ｃ、６０．３８、Ｈ、６．５４、Ｎ、４．８３。判明：Ｃ、６０．６９、Ｈ、６．５３、Ｎ、４．８３。

ジクロロメタン中、５０℃での、トリフルオロ酢酸を使用したｔ−ブチルエステル基の脱保護によって、化合物５を７０％の収率で得た。
ＴＬＣ：Ｒ_ｆ＝０．３７（ＳｉＯＨ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９５／５）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１．３７（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、６Ｈ、ＣＨ_３）、３．５０−３．５４（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．７８−３．８２（ｍ、３Ｈ、ＣＨ；ＣＨ_２）、３．９１（ｓ、６Ｈ、ＣＨ_３）、４．２７（ｓ、２Ｈ、ＣＨ_２）、４．３６（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ_２）、７．２１（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．８８（ｄｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１．６Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．１４（ｄｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１．６Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．４９（ｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、２Ｈ、ＮＨ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１４（ＣＨ_３）、４０（ＣＨ_２）、６２（ＣＨ_２）、６４（ＣＨ_３）、６７（ＣＨ）、７８（ＣＨ_２）、１２４（ＣＨ）、１２６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１２８（Ｃ_ｑｕａｔ）、１３５（ＣＨ）、１３６（ＣＨ）、１５８（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６５（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１７３（Ｃ_ｑｕａｔ、Ｃ_１５）。ＩＲ（ｃｍ^−１、ＡＴＲ）ν３３７０、２９８２、２９４１、１７２２、１６４６、１５２５、１４１７、１２５７、１１３０、９９２。ＥＳＩ／ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ＝５６１．２１（［Ｍ＋Ｈ^＋］、１００％）、５６２．２１（［Ｍ＋Ｈ^＋］、２７％）、５６３．２１（［Ｍ＋Ｈ^＋］、７％）、５６４．２１（［Ｍ＋Ｈ^＋］、１％）、１１４３．３９（［２Ｍ＋Ｎａ^＋］、９７％）。Ｃ_２７Ｈ_３２Ｎ_２Ｏ_１１．ＣＨ_３ＯＨについて計算された元素分析：Ｃ、５６．７５、Ｈ、６．１２、Ｎ、４．７３。判明：Ｃ、５７．０９、Ｈ、５．９３、Ｎ、５．１３。

アセトニトリル中、０℃での、ＥＤＣＩおよびＨＯＢｔを使用した５とｔ−ブチル−６−アミノヘキシルカルバメートとのペプチドカップリングによって、化合物６を６１％の収率で得た。
ＴＬＣ：Ｒ_ｆ＝０．６９（ＳｉＯＨ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９／１）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１．２９−１．３０（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２）、１．４０−１．４２（ｍ、１７Ｈ、ＣＨ_３；ＣＨ_２；ＣＨ_３）、１．４７−１．５３（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．０６（ｑ、Ｊ＝３．０６Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．２５（ｑ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．６８−３．７４（ｍ、５Ｈ、ＣＨ；ＣＨ_２；ＣＨ_２）、３．９５（ｓ、６Ｈ、ＣＨ_３）、４．１１（ｓ、２Ｈ、ＣＨ_２）、４．４０（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ_２）、４．５８（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、７．０７（ｔ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ、ＮＨ）、７．２７（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．９３（ｄｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１．７Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．２０−８．２２（ｍ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．２６（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ、ＮＨ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１４（ＣＨ_３）、２６（ＣＨ_２）、２７（ＣＨ_２）、２９（ＣＨ_３）、３０（ＣＨ_２）、３０（ＣＨ_２）、３９（ＣＨ_２）、４０（ＣＨ_２）、４０（ＣＨ_２）、６２（ＣＨ_２）、６４（ＣＨ_３）、７０（ＣＨ）、７９（ＣＨ_２）、１２４（ＣＨ）、１２６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１２８（Ｃ_ｑｕａｔ）、１３５（ＣＨ）、１３６（ＣＨ）、１５６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１５８（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６９（Ｃ_ｑｕａｔ）。ＩＲ（ｃｍ^−１、ＡＴＲ）ν３３３４、２９７７、２９３４、２８５９、１７１０、１６５０、１５２１、１４６１、１２５４、１１３１、９９５。ＥＳＩ／ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ＝７８１．３６（［Ｍ＋Ｎａ^＋］、１００％）、７８２．３７（［Ｍ＋Ｎａ^＋］、４５％）、７８３．３７（［Ｍ＋Ｎａ^＋］、１１％）、７８４．３７（［Ｍ＋Ｎａ^＋］、２％）、１５３９．７３（［２Ｍ＋Ｎａ^＋］、２９％）。Ｃ_３８Ｈ_５４Ｎ_４Ｏ_１２について計算された元素分析：Ｃ、６０．１４、Ｈ、７．１７、Ｎ、７．３８。判明：Ｃ、５９．７９、Ｈ、７．３６、Ｎ、７．６２。

ジクロロメタン中、−７８℃での、ＢＢｒ_３を使用した化合物６の保護基の脱保護、続いてＥｔＯＨ中のＮａＯＨでの鹸化によって、化合物７を２工程において８０％の収率で得た。
ＴＬＣ：Ｒ_ｆ＝０．６８（Ｃ_１８、Ｈ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）：８／２）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ１．０５−１．１５（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２）、１．２７（ｍ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、４Ｈ；ＣＨ_２）、２．５１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．０７（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．６３（ｄｄ、Ｊ＝１４．４Ｈｚ、６．６Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．７５（ｄｄ、Ｊ＝１４．２Ｈｚ、４．２Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．９１−３．９５（ｍ、１Ｈ、ＣＨ）、４．２２（ｓ、２Ｈ、ＣＨ_２）、６．６３（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．４６−７．４８（ｍ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．８５（ｄｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１．９Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ２６（ＣＨ_２）、２６（ＣＨ_２）、２８（ＣＨ_２）、３１（ＣＨ_２）、３９（ＣＨ_２）、４０（ＣＨ_２）、４０（ＣＨ_２）、６８（ＣＨ_２）、７８（ＣＨ）、１１５（ＣＨ）、１１９（Ｃ_ｑｕａｔ）、１２７（Ｃ_ｑｕａｔ）、１３２（ＣＨ）、１３３（ＣＨ）、１６４（Ｃ_ｑｕａｔ）、１７０（Ｃ_ｑｕａｔ）、１７２（Ｃ_ｑｕａｔ）、１７７（Ｃ_ｑｕａｔ）。ＩＲ（ｃｍ^−１、ＡＴＲ）ν２９４０、２８５７、１６６０、１５９２、１５４０、１４３３、１２５６、１１９０、１１５７、１１３０、７５６。ＥＳＩ／ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ＝５７５．２３（［Ｍ＋Ｈ^＋］、１００％）、５７６．２４（［Ｍ＋Ｈ^＋］、８１％）、５７７．２４（［Ｍ＋Ｈ^＋］、３０％）、５７８．２４（［Ｍ＋Ｈ^＋］、７％）、５７９．２４（［Ｍ＋Ｈ^＋］、２％）。Ｃ_２７Ｈ_３４Ｎ_４Ｏ_１０．ＴＦＡ．２Ｈ_２Ｏについて計算された元素分析：Ｃ、５１．７７、Ｈ、５．６６、Ｎ、８．６３、判明：Ｃ、５１．４０、Ｈ、５．４９、Ｎ、８．３４。

化合物７とｐ−フェニル−ビスイソチオシアネートとの反応によって、リガンドＬ１を８８％の収率で得た。
ＴＬＣ：Ｒ_ｆ＝０．６３（Ｃ_１８、Ｈ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮ）／（０．１％ＴＦＡ）：６／４）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ１．２０−１．２７（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２）、１．３７（ｍ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ；ＣＨ_２）、１．４８（ｍ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．０６（ｑ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．４２−３．４８（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２）、３．５６−３．６２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．７１（ｍ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨ）、４．０４（ｓ、２Ｈ、ＣＨ_２）、６．９９（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．３５−７．３７（ｍ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．５５−７．５７（ｍ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．６９（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ、ＮＨ）、７．９４（ｄｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１．８Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．０４（ｄｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１．８Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．７６−８．７８（ｍ、２Ｈ、ＮＨ）、９．７６（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ２７（ＣＨ_２）、２９（ＣＨ_２）、３０（ＣＨ_２）、３９（ＣＨ_２）、４１（ＣＨ_２）、４４（ＣＨ_２）、４６（ＣＨ_２）、６９（ＣＨ_２）、７９（ＣＨ）、１１６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１１９（ＣＨ）、１２１（Ｃ_ｑｕａｔ）、１２３（ＣＨ）、１２５（Ｃ_ｑｕａｔ）、１２７（ＣＨ）、１３３（Ｃ_ｑｕａｔ）、１３４（ＣＨ）、１３６（ＣＨ）、１４０（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６１（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１７０（Ｃ_ｑｕａｔ）、１７２（Ｃ_ｑｕａｔ）、１８１（Ｃ_ｑｕａｔ）。ＩＲ（ｃｍ^−１、ＡＴＲ）ν３３０８、２９３２、２０９９、１６４３、１５９８、１５３８、１５０４、１４３６、１２６３、１１９１、１１５５、７５９。ＨＲ−ＥＳＩ／ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ＝７６７．２１７７（［Ｍ＋Ｈ^＋］、１００％）、７６８．２２０３（［Ｍ＋Ｈ^＋］、４４％）、７６９．２２４６（［Ｍ＋Ｈ^＋］、１６％）、７７０．２１７９（［Ｍ＋Ｈ^＋］、４％）、７７１．２１１６（［Ｍ＋Ｈ^＋］、１％）。Ｃ_３５Ｈ_３８Ｎ_６Ｏ_１０Ｓ_２．Ｈ_２Ｏについて計算された元素分析：Ｃ、５３．５６、Ｈ、５．１４、Ｎ、１０．７１、Ｓ、８．１７。判明：Ｃ、５３．３３、Ｈ、５．０５、Ｎ、１０．４２、Ｓ、８．１５。

ＤＭＦ中、トリエチルアミンの存在下での、化合物７と２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−２−ヨードアセテートとの反応によって、リガンドＬ２を５７％の収率で得た。

Ｎ−メチルモルホリンを含有するＤＭＦ中、室温での、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノエートと化合物７との反応によって、リガンドＬ３を５３％の収率で得た。

リガンドＬ４の合成：
請求項に係るリガンドＬ４を、以下の合成工程に従い、以下の中間化合物１、２、１０、および１１を用いて調製した。

ＳＯＣｌ_２を使用した化合物９のエステル化、続いて過剰な塩化チオニルの蒸発、およびＥｔ_３Ｎの存在下でのＥｔＯＨとの反応によって、化合物１を全体として６８％の収率で得た。

トリエチルアミンを含有するアセトニトリル中、ＥＤＣＩおよびＨＯＢｔを使用した化合物２とｔ−ブチル（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）カルバメートとのペプチドカップリングによって、化合物１０を８４％の収率で得た。
ＴＬＣ：Ｒ_ｆ＝０．４０（ＳｉＯＨ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９５／５）。^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１．３３（ｓ、９Ｈ、ＣＨ_３）、１．３７（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、６Ｈ、ＣＨ_３）、２．６９（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、２．７７（ｔ、Ｊ＝６．２Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ_２）、３．１８（ｔｄ、２Ｈ、Ｊ＝５．０ｅｔ６．２Ｈｚ、ＣＨ_２）、３．５４（ｑ、Ｊ＝６Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ_２）、３．８５（ｓ、６Ｈ、ＣＨ_３）、４．３８（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ_２）、７．１９（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．８６（ｄｄ、Ｊ＝１．９ｅｔ７．８Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．９３（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ、ＮＨ）、８．０９（ｄｄ、Ｊ＝１．９ｅｔ７．８Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１４（ＣＨ_３）、２８（ＣＨ_３）、３７（ＣＨ_２）、３８（ＣＨ_２）、５３（ＣＨ_２）、６１（ＣＨ_２）、６３（ＣＨ_２）、７８（Ｃ_ｑｕａｔ）、１２４（Ｃ_ｑｕａｔ）、１２５（Ｃ_ｑｕａｔ）、１２８（ＣＨ）、１３４（ＣＨ）、１３５（ＣＨ）、１５５（Ｃ_ｑｕａｔ）、１５７（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６４（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６５（Ｃ_ｑｕａｔ）。ＥＳＩ／ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ＝６５９．３３（［Ｍ＋Ｈ^＋］、１００％）、６６０．３３（［Ｍ＋２Ｈ^＋］、４０％）、６６１．３３（［Ｍ＋３Ｈ^＋］、１２％）、６６２．３４（［Ｍ＋４Ｈ^＋］、４％）。Ｃ_３３Ｈ_４６Ｎ_４Ｏ_１０．Ｈ_２Ｏについて計算された元素分析：Ｃ、５８．５６、Ｈ、７．１５、Ｎ、８．２８。判明：Ｃ、５８．８０、Ｈ、６．８９、Ｎ、５．９１。

ＣＨ_２Ｃｌ_２中、−７８℃での、ＢＢｒ_３の使用、続いて水／メタノール混合物中、ＮａＯＨを使用した蒸発および鹸化の２工程で、化合物１１を全体として６０％の収率で得た。
ＴＬＣ：Ｒ_ｆ＝０．３０（Ｃ_１８、Ｈ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）：８／２。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ２．５９（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２）、２．７２（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ_２）、３．４２（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ_２）、６．４３（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．２５（ｄｄ、Ｊ＝１．８ｅｔ７．７Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．６９（ｄｄ、Ｊ＝１．８ｅｔ７．７Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ３７（ＣＨ_２）、３８（ＣＨ_２）、５１（ＣＨ_２）、５４（ＣＨ_２）、１１７（Ｃ_ｑｕａｔ）、１１８（Ｃ_ｑｕａｔ）、１１９（ＣＨ）、１３３（ＣＨ）、１３４（ＣＨ）、１５９（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６７（Ｃ_ｑｕａｔ）、１７４（Ｃ_ｑｕａｔ）。ＥＳＩ／ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ＝４７５．１８（［Ｍ＋Ｈ^＋］、１００％）、４７６．１８（［Ｍ＋２Ｈ^＋］、２８％）、４７７．１８（［Ｍ＋３Ｈ^＋］、６％）、９４９．３６（［２Ｍ］、６％）。

Ｅｔ_３Ｎを含有するＤＭＦ中、０℃での、化合物１１とＮ−スクシンイミジル３−マレイミドプロピオネートとの反応によって、リガンドＬ４を２０％の収率で得た。
ＴＬＣ：Ｒ_ｆ＝０．３０（Ｃ_１８、Ｈ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）：７／３。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ２．３５（ｔ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、２．７４（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、２．８３（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ_２）、３．３０（ｔ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．３５（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．５０（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ_２）、５．９７（ｓ、２Ｈ、ＣＨ＝ＣＨ）、６．４８（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．３０（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．７５（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ２２（ＣＨ_２）、２３（ＣＨ_２）、２３．５（ＣＨ_２）、２４（ＣＨ_２）、３９（ＣＨ_２）、４０（ＣＨ_２）、９９（Ｃ_ｑｕａｔ）、１０６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１１１（ＣＨ）、１１７（ＣＨ）、１１９（ＣＨ）、１２３（ＣＨ＝ＣＨ）、１５４（Ｃ_ｑｕａｔ）、１５８（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６１（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６２（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６６（Ｃ_ｑｕａｔ）。

リガンドＬ５の合成
リガンドＬ５を、以下の合成工程に従って調製した。

リガンドＬ５の合成を、ヨウ化メチル（ＭｅＩ）および炭酸カリウム（Ｋ_２ＣＯ_３）の存在下での、ＳＮ２求核置換による、化合物１２に対応する２，４，６−トリメチルフェノールのアルコール官能基の保護を有する工程ａにおいて開始し、９７％の収率であった。

第２の工程ｂは、工程ａから得られた化合物１３の３つのメチル基の、Ｈ_２Ｏ中のＫＭｎＯ_４およびＫＯＨでの酸化であった。工程ｂの収率は、６２％であった。

合成の最後の工程ｃは、ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（５０／５０）の溶液の存在下での、Ｏ−脱メチル化による化合物１４のフェノレート官能基の脱保護であった。沈殿および遠心分離によって、リガンドＬ５を６０％の収率で得た。

リガンドＬ６の合成
リガンドＬ６を、以下の合成工程に従って調製した。

化合物２を塩化チオニルに可溶化する。溶液を５時間の間に９０℃で加熱する。蒸発後、エタノールアミンおよび蒸留トリエチルアミンを添加する。粗生成物を抽出する。シリカゲルを用いたＦＰＬＣによる精製後、化合物１５を得た。
ＴＬＣ：０．３（ＳｉＯＨ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）；ＮＭＲ^１Ｈ：（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１．４１（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ_３）、３．６４（ｑ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．８４（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．９１（ｓ、３Ｈ、ＣＨ_３）、４．４０（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、７．２７（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．９２（ｄｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１．９Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ_ａｒ）、８．１７−８．２１（ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、８．２２（ｄｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１．９Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ_ａｒ）。ＮＭＲ^１３Ｃ：（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１４（ＣＨ_３）、４３（ＣＨ_２）、６２（ＣＨ_２）、６２（ＣＨ_２）、６４（ＣＨ_３）、１２４（ＣＨ）、１２６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１２８（Ｃ_ｑｕａｔ）、１３５（ＣＨ）、１３５（ＣＨ）、１５８（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６６（Ｃ_ｑｕａｔ）。ＥＳＩ^＋／ＭＳ：ｍ／ｚ＝２６８．１２（［Ｍ＋Ｈ^＋］、８２％）、５５７．２１（［２Ｍ＋Ｈ^＋］）。Ｃ_１３Ｈ_１７ＮＯ_５，１／３Ｈ_２Ｏについて計算された元素分析：Ｃ、５７．１４、Ｈ、６．５２、Ｎ、５．１３。判明：Ｃ、５７．１４、Ｈ、６．５４、Ｎ、５．１４。

化合物１５をＢＢｒ_３でＤＣＭに可溶化する。粗生成物をＥｔＯＨ中で溶解した。ＮａＯＨを５ｍＬのＨ_２Ｏ中で溶解した。この塩基性溶液を混合物に添加した。不溶性部分を濾過により除去した。精製を、カラムクロマトグラフィーによって実施して、リガンドＬ６を得た。
ＴＬＣ：０．８７（Ｃ_１８、Ｈ_２Ｏ／ＭｅＯＨ）；ＮＭＲ^１Ｈ：（４００ＭＨｚ、Ｈ_２Ｏ＋ＮａＯＤ）δ３．５６（ｔ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．７７（ｔ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、６．９７（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．９０−７．９８（ｍ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）。ＮＭＲ^１３Ｃ：（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）４１（ＣＨ_２）、６１（ＣＨ_２）、１１２（ＣＨ）、１１９（Ｃ_ｑｕａｔ）、１３０（ＣＨ）、１３１（ＣＨ）、１３３（Ｃ_ｑｕａｔ）、１６６（Ｃ_ｑｕａｔ）、１７１（Ｃ_ｑｕａｔ）、１７９（Ｃ_ｑｕａｔ）。ＥＳＩ⁻／ＭＳ：ｍ／ｚ＝２２４．０７（［Ｍ−Ｈ^＋］、１００％。Ｃ_１０Ｈ_１１ＮＯ_５、３／４Ｈ_２Ｏについて計算された元素分析：Ｃ、５０．３２、Ｈ、５．２８、Ｎ、５．８７。判明：Ｃ、５０．１０、Ｈ、４．９７、Ｎ、５．７７。

リガンドＬ７の合成
リガンドＬ７を、以下の合成工程に従って調製した。

Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨをトリフルオロ酢酸に可溶化する。溶液を室温で一晩撹拌する。溶液を減圧下で蒸発させて、化合物１６を得た。
ＮＭＲ^１Ｈ：（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ１．４２−１．５３（ｍ、２Ｈ）、１．６１−１．７７（ｍ、３Ｈ）、１．８６−１．９５（ｍ、１Ｈ）、２．９２（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、４、１５−４．１９（ｍ、１Ｈ）、４．２３（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨ）、４．３２−４．３６（ｍ、１Ｈ）、４．３９−４．４４（ｍ、１Ｈ）、７．２９−７．３３（ｍ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．３７−７．４２（ｍ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．６５−７．７０（ｍ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．７９−７．８２（２Ｈ、Ｈ_ａｒ）。

化合物１６を、エチル３−（クロロカルボニル）−２−メトキシベンゾエートおよびジイソプロピルエチルアミンと共に、蒸留ＴＨＦ（１００ｍＬ）に可溶化する。反応物を、Ｈ_２Ｏ（２０ｍＬ）でクエンチし、溶媒を減圧下で蒸発させた。化合物１７をカラムクロマトグラフィーによって精製した。
ＮＭＲ^１Ｈ：（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ１．３６（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ_３）、１．４８−１．８２（ｍ、５Ｈ）、１．８６−１．９７（ｍ、１Ｈ）、３．４１（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ_２）、３．８４（ｓ、３Ｈ、ＣＨ_３）、４、１５−４．２２（ｍ、２Ｈ）、４．２８−４．４０（ｍ、４Ｈ）、７．２１−７．３１（ｍ、３Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．３５−７．４０（ｍ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．６４−７．６９（ｍ、２Ｈ、Ｈ_ａｒ）、７．７６−７．８４（４Ｈ、Ｈ_ａｒ）。
化合物１８を固体支持体によって合成した。化合物１８をＢＢｒ_３で脱保護した。粗生成物をＥｔＯＨ中で溶解した。ＮａＯＨをＨ_２Ｏ中で溶解した。この塩基性溶液を混合物に添加した。不溶性部分を濾過により除去した。濾液をカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物Ｌ７を得た。
ＥＳＩ⁻／ＭＳ高分解能：ｍ／ｚ＝６７９．２８０８（［Ｍ＋２Ｈ^＋］／２、１００％）、１３５７．５４８４（［Ｍ＋Ｈ^＋］、８８％）

リガンドＬ８の合成
リガンドＬ８を、以下の合成工程に従って調製した。

先のように、２−メトキシイソフタル酸のカルボン酸は、塩化チオニルによって活性化され、溶媒の蒸発後、エタノールおよびトリエチルアミンを添加して、ジエステル１を形成した。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ７．８７（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．１６（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．３５（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、４Ｈ）、３．８９（ｓ、３Ｈ）、１．３６（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、６Ｈ）。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１６５．７、１５９．３、１３４．７、１２７．１、１２３．４、６３．６、６１．３、１４．２。
ＥＳＩ^＋／ＭＳ：ｍ／ｚ＝２５３，１１（［Ｍ＋Ｈ］^＋、１００％）、２５４，１１（［Ｍ＋Ｈ］^＋、１３％）、２５５，１１（［Ｍ＋Ｈ］^＋、２％）、５２７，１９（［２Ｍ＋Ｎａ^＋］、４８％）。
Ｃ_１３Ｈ_１６Ｏ_５，１／３Ｈ_２Ｏについて計算された元素分析：Ｃ、６０．４６、Ｈ、６．５０。判明：Ｃ、６０．６３、Ｈ、６．２９。

第２の工程は、抽出後に、一酸２を得るための単一当量のＮａＯＨを用いる古典的な鹸化である。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１、４２（ｔ、Ｊ＝７、１Ｈｚ、３Ｈ）、４、０５（ｓ、３Ｈ）、４、４３（ｑ、Ｊ＝７、１Ｈｚ、２Ｈ）、７、３３（ｔ、Ｊ＝７、８Ｈｚ、１Ｈ）、８、０８（ｄｄ、Ｊ＝７、８Ｈｚ、１、９Ｈｚ、１Ｈ）、８、３０（ｄｄ、Ｊ＝７、８Ｈｚ、１、８Ｈｚ、１Ｈ）。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１６６．２、１６５．３、１６０．５、１３７．４、１３７．１、１２６．７、１２５．５、１２４．３、６４．４、６２．１、１４．２。
ＥＳＩ^＋／ＭＳ：ｍ／ｚ＝２４７，０６（［Ｍ＋Ｎａ］^＋、１００％）、２４８，０６（［Ｍ＋Ｎａ］^＋、１４％）、２４９，０６（［Ｍ＋Ｎａ］^＋、２％）、４７１，１２（［２Ｍ＋Ｎａ^＋］、４７％）。
注入Ｃ_１１Ｈ_１２Ｏ_５について計算された元素分析：Ｃ、５８，９３、Ｈ、５，４０。判明：Ｃ、５８，９３、Ｈ、５，４４。

並行して、ヘキサメチレンジアミンリンカーの保護を、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートで実現し、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）基を有して、化合物１９を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ４．６４（ｓ、１Ｈ）、３．０８（ｑ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．６５（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．４６（ｄｄ、Ｊ＝１０．２、３．４Ｈｚ、４Ｈ）、１．４１（ｓ、９Ｈ）、１．３０（ｄ、Ｊ＝３．３Ｈｚ、４Ｈ）、１．１５（ｓ、２Ｈ）。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１５５．９、７８．９、４２．０、３３．６、３０．０、２８．３、２６．５９。
ＥＳＩ^＋／ＭＳ（Ｈ_２Ｏ＋ＨＣＯＯＨ）：ｍ／ｚ４５９．３５（［２ＭＮａＨ＋Ｈ］^＋、１００％）。
Ｃ_１１Ｈ_２４Ｎ_２Ｏ_２について計算された元素分析：Ｃ、６１．３５；Ｈ、１０．７７；Ｎ、１３．０１。判明：Ｃ、６１．５４；Ｈ、９．０１；Ｎ、１３．２５。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を、モノエステル３−（エトキシカルボニル）−２−メトキシ安息香酸（２）を含む溶液中に添加して、カルボキシル官能基を活性化し、保護されたリンカー（１９）とアミド結合を生成した。精製後、化合物２０を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ８．１８（ｄｄ、Ｊ＝７．８、１．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．８８（ｄｄ、Ｊ＝７．７、１．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．７５−７．６５（ｍ、１Ｈ）、７．２３（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．６５（ｓ、１Ｈ）、４．３７（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．８６（ｓ、３Ｈ）、３．４３（ｔｄ、Ｊ＝７．１、５．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．０７（ｑ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．６７−１．５１（ｍ、２Ｈ）、１．４８−１．３０（ｍ、１８Ｈ）。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１６５．４、１６４．６、１５７．８、１５５．９、１３５．５、１３４．２、１２８．３、１２５．５、１２４．３、７８．９、６３．３、６１．３、４０．８、３９．６、２９．９、２９．４、２８．３、２６．６、２６．３、１４．１。
ＥＳＩ^＋／ＭＳ：ｍ／ｚ＝４２３．２５（［Ｍ＋Ｈ］^＋、１００％）；４２４．２５（［Ｍ＋Ｈ］^＋、２０％）；４２５．２５（［Ｍ＋Ｈ］^＋、５％）；８４５．４８（［２Ｍ＋Ｈ］^＋、４５％）。
Ｃ_２２Ｈ_３４Ｎ_２Ｏ_４．０．５ＣＨ_３ＣＮについて計算された元素分析：Ｃ、６２．３４；Ｈ、８．０８；Ｎ、７．９０。判明：Ｃ、６２．６２；Ｈ、７．７１；Ｎ、７．５２。
工程ｅについて、化合物２１を得るための反応は、ＢＢｒ_３によるフェノールおよびアミンの脱保護、続いてＮａＯＨによるエステルの脱保護である。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）：δ８．１１（ｄｄ、Ｊ＝７．８、１．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．０５（ｄｄ、Ｊ＝７．８、１．７Ｈｚ、１Ｈ）、６．９６（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．４３（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．９４（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．６６（ｍ、４Ｈ）、１．５２−１．３９（ｍ、４Ｈ）。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）：δ１７４．２、１６７．６、１６１．８、１３７．１、１３５．４、１２１．６、１１９．５９、１１７．０、４０．７、４０．５、３０．２、２８．４、２７．４、２７．０。
ＥＳＩ^＋／ＭＳ：ｍ／ｚ＝２８１．１５（［Ｍ＋Ｈ］^＋、１００％）；２８２．１５（［Ｍ＋Ｈ］^＋、１８％）；２８３．１６（［Ｍ＋Ｈ］^＋、２％）。
Ｃ_１４Ｈ_２０Ｎ_２Ｏ_４．０．５Ｄ_２Ｏ．０．５ＭｅＯＤについて計算された元素分析：Ｃ、５６．７９；Ｈ、６．９０；Ｎ、９．１３。判明：Ｃ、５６．９０；Ｈ、６．５２；Ｎ、９．２０。
生成物２１上の遊離カルボン酸および遊離アミンでは、その後のカップリングを促進するために、リンカー上のアミンの活性化が必要である。選択は、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートを使用して、第一級アミンを活性化カルバメートＬ８に変更することである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）：δ８．１６（ｄｄ、Ｊ＝７．８、１．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．０５（ｄｄ、Ｊ＝７．８、１．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．９５（ｔ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．０３（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．４４（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．２０（ｍ、２Ｈ）、２．８０（ｓ、４Ｈ）、１．６２（ｍ、４Ｈ）、１．４４（ｍ、４Ｈ）。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）：δ１７３．６、１７２．６、１６７．１、１６１．３、１５４．０、１３７．９、１３５．３、１２２．１、１２０．２、１１５．０、５６．８、４２．５、４０．７、３０．３、２７．６、２７．３、２６．４。
ＥＳＩ^＋／ＭＳ：ｍ／ｚ＝４２２．１６（［Ｍ＋Ｈ］^＋、１００％）；４２３．１６（［Ｍ＋Ｈ］^＋、２４％）；４２４．１６（［Ｍ＋Ｈ］^＋、５％）。
Ｃ_１９Ｈ_２３Ｎ_３Ｏ_８．０．５Ｅｔ_３Ｎ^＋Ｃｌ⁻の元素分析：Ｃ、５６．１０；Ｈ、５．９８；Ｎ、９．５４。判明：Ｃ、５６．１０；Ｈ、５．９６；Ｎ、１０．１２。

リガンドＬ９の合成
リガンドＬ９を、以下の合成工程に従って調製した。

ケリダム酸から開始して、合成の第１の工程は、塩化チオニルによる４−オキソ位を使用するＲｏｂｉｓｏｎ法によってカルボン酸を活性化し、ＥｔＯＨでエステル化して、４−クロロピリジン−２，６−ジカルボン酸ジエチル（２２）を形成することである。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ８．２４（ｓ、２Ｈ）、４．４７（ｑ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ）、１．４３（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、６Ｈ）。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１６３．６、１４９．７、１４６．６、１２８．１、６３．３、１４．２。

塩化物は、超音波下での大量のヨウ化ナトリウムおよび塩化アセチルの存在下でヨウ化物（２３）によって置換される。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ８．５２（ｓ、２Ｈ）、４．３５（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、４Ｈ）、１．３２（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、６Ｈ）。
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝３４９．６６（［Ｍ＋Ｈ］^＋）、３７１．６３（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）、７２０．７９（［２Ｍ＋Ｎａ］^＋）。

ソノガシラカップリングは、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、ヨウ化銅（Ｉ）、トリエチルアミン、およびトリメチルシリルアセチレン（ＴＭＳ−アセチレン）を用いて、構造（２４）にアセチレン基を追加するために使用される。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ８．２３（ｓ、２Ｈ）、４．４７（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、４Ｈ）、１．４３（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、６Ｈ）、０．２７（ｓ、９Ｈ）。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１６４．６、１４９．２、１３４．４、１３０．２、１０３．７、１００．９、６２．９、１４．６、０．０。
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝３２０．０７（［Ｍ＋Ｈ］^＋）。

精製後、トリメチルシリル基は、ＴＨＦ中のテトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムフッ化物（ＴＢＡＦ）によって脱保護されて、化合物２５を得ることができる。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ８．２７（ｓ、２Ｈ）、４．４７（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、４Ｈ）、３．４８（ｓ、１Ｈ）、１．４３（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、６Ｈ）
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝２４８．００（［Ｍ＋Ｈ］^＋）。

化合物２６は、化合物２５と４−ヨード安息香酸との間のソノガシラカップリングによって得られる。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ８．２９（ｓ、２Ｈ）、７．３７（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、６．６５（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、４．１１（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、４Ｈ）、１．２４（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、６Ｈ）。
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝３６７．３９（［Ｍ＋Ｈ］^＋）、３８９．９６（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）。

合成の最後の工程は、エステルをＮａＯＨで鹸化して、リガンドＬ９を得ることである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ８．０８（ｓ、２Ｈ）、７．８６（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．６８（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ１７４．８、１６９．３、１５２．９、１３６．９、１３３、２、１３１．７、１２８．８、１２６．７、１２３．９、９８．８、８４．２。
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝３１１．９４（［Ｍ＋Ｈ］^＋）。

ストレプトアビジンによるリガンドＬ１の生体機能化：
ストレプトアビジンは、ビオチンと非常に強い親和性を有する四量体タンパク質である。バイオテクノロジーでしばしば使用されるこの強い相互作用は、抗原と抗体との間の相互作用が可能であるような生物学的な強い相互作用の典型的な例を表す。

この実施例では、リガンドＬ１は、ビオチンを固定し得る超高輝度発光ナノ粒子を生成することを目的として、ストレプトアビジンを標識化するために使用された。

ストレプトアビジンを、１０当量の化合物Ｌ１の存在下で、緩衝水溶液中で室温でマーキングした。マーキングされたストレプトアビジンを、サイズ排除フィルター上で遠心分離することによって精製した（ミリポア、カットオフ１０ｋＤａを形成）。ストレプトアビジンの標識率（ストレプトアビジンによるリガンドＬ１の数）を、マーキングされたストレプトアビジンのスペクトルが、ストレプトアビジン単独のスペクトルとリガンドＬ１のスペクトルとの直線的な組み合わせとしてデコンボリューションされたＵＶ−可視吸収によって決定した。ストレプトアビジンによる２．１リガンドの標識率を得た。

マツズマブ抗体によるリガンドＬ１の生体機能化：
マツズマブ抗体は、一部の癌（肺、食道、胃など）で過剰発現した上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を特異的に認識するヒトモノクローナル抗体である。マツズマブによってマーキングされた発光ナノ粒子は、上皮成長因子受容体の発光顕微鏡画像化、またはフルオロ免疫学による溶液中のその検出に使用され得る。

この実施例では、リガンドＬ１は、上皮成長因子受容体を固定し得る超高輝度発光ナノ粒子を生成することを目的として、マツズマブ抗体を標識化するために使用された。

ＤＭＳＯ中の３．２３ｍＭのリガンドＬ１溶液１３．２μＬを、１ｍｇ．ｍＬ−１（１２８μＭ）のマツズマブ含有溶液１０．４μＬおよびｐＨ９．０のカーボネート緩衝液（Ｌ１／マツズマブ比＝３２／１）１７６μＬに添加した。試料を混合し、アルミニウムシートに配置し、次いで、規則的な撹拌で室温で４時間３０分インキュベートした。超遠心分離、溶出、およびｐＨ８．０４のＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液でのすすぎによる精製後、８０μＬの体積を有する最終溶液を得た。最終溶液をトリス／ＨＣｌ緩衝液で５回希釈した。

抗体およびリガンド濃度を、ＵＶ−可視吸収分光法によって決定した。１．４９μＭの抗体濃度およびリガンド対抗体の標識比２．９〜３．０を得た。

ペプチドＫＬＶＦＦによるリガンドＬ８の生体機能化：
ペプチドＫＬＶＦＦは、アミロイド繊維の形成を担うアミノ酸の配列である。このペプチドは、形成中のアミロイド繊維の特徴的な構造であるβシートに折り畳まれ、シナプスとのより良好な相互作用を与える区域に見出されるために選択された。これらのβ−アミロイド繊維が海馬に有意に凝集することを知っているため、アイデアは、これらの繊維をペプチドＫＬＶＦＦで特異的に標的化して、アルツハイマー病の早期診断を行うことである。

この実施例では、ペプチドＫＬＶＦＦを、β−アミロイド繊維を固定し得る超高輝度発光ナノ粒子を生成することを目的として、リガンドＬ８とカップリングした。

ペプチドＫＬＶＦＦ（３７ｍｇ、５．６７ｘ１０^−５モル）を１ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解し、４５μＬのｏｄ ＤＩＰＥＡおよびＬ８（４１ｍｇ、９．７３ｘ１０^−５モル）を溶液中に添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を、Ｃ_１８にわたってカラムクロマトグラフィー（１００〜５０／５０の水／ＭｅＯＨ勾配）によって直接精製した。

発光分光法の実験的測定方法：
ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ｌａｍｂｄａ ９５０分光計またはＪｅｎａ ＡｎａｌｙｔｉｃｓのＳｐｅｃｏｒｄ分光計を使用して、１ｃｍの光路石英スープラシル（ｓｕｐｒａｓｉｌ）セル（Ｈｅｌｌｍａ）に記録した。

発光スペクトルを、４５０ＷのキセノンランプおよびＨａｍａｍａｔｚｕ Ｒ９２８赤色光電子増倍管を使用して、ＦＬＰ ９２０ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ分光光度計に記録した。すべてのスペクトルを、サプライヤーによって提供される測定器機能を使用して補正した。必要に応じて、３９９ｎｍのハイパスフィルタを使用して、二次アーチファクトを除去した。

発光量子収率を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｖａｌｅｕｒ，Ｂ．，Ｂｅｒｂｅｒａｎ−Ｓａｎｔｏｓ，Ｍ．Ｎ．，Ｅｄｓ．；Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２０１３に記載されている従来手段に従って測定した。Ｅｕ含有ナノ粒子の参照として、水中の［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）_３Ｃｌ_３］（Φ＝０．０４，Ｉｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ，Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１０，２５４（２１），２４４９−２４５８）、Ｔｂ含有ナノ粒子の参照として、水中のビピリジンＴｂ錯体［ＴｂＬ（Ｈ_２Ｏ）］（Φ＝０．３１，Ｗｅｉｂｅｌ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６（１５），４８８８−４８９６）を使用して、光学的に希釈された液体（光学濃度＜０．０５）を用いた。

量子収率の推定誤差は±１５％である。

輝度は、発光量子収率によって励起波長におけるモル吸収係数の積（Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔの法則を吸収スペクトルに適用して計算される）として計算される。

発光寿命を、１０Ｈｚで動作する１００Ｗキセノンフラッシュランプを使用して、ＭＣＳモードで同じ測定器で記録し、時間窓は、測定された最長の励起状態寿命よりも少なくとも５倍長い。励起および発光スリットを、典型的には、５ｎｍおよび３ｎｍの開口部に設定した。励起波長を、リガンドの存在下でナノ粒子の励起スペクトルの最大値でのリガンドの関数として選択した。最大強度が１０，０００カウントに到達すると、取得が停止された。

寿命の推定誤差は±１０％である。

すべての実験では、１６μＬのナノ粒子の母溶液を、０．１ＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液１９８４μＬでｐＨ７．０で希釈した。次いで、希釈されたナノ粒子の溶液を、同じ緩衝液中のリガンドの５×１０^−４Ｍの溶液を増量して添加することによって滴定した。

実験結果：
すでに発表されているように、本発明は、励起状態寿命の点で例外的な結果を提供する。

そのような有益な結果は、上記の詳細に記載された測定方法に従って、本発明によるナノ粒子のいくつかの実施例で実現される実験的測定によって実証された。

これらの化合物の水性培地τ中の励起状態寿命を、リガンドＬ５吸収に対応するλ_ｅｘｃ＝３３０ｎｍの波長で励起した後、６９５ｎｍでのユーロピウムイオンの発光について測定した。

得られた結果を以下の表２にまとめた。

測定された各実施例化合物について、最長の測定された励起状態寿命（τ_２またはτ_３）は、最も数が多いナノ粒子のコアに存在するユーロピウムイオンの発光に対応し、最短のもの（τ_１）は、ナノ粒子のコアの表面に存在するより数が少ないユーロピウムイオンの発光に対応する。

見られるように、最長の測定された励起状態寿命（τ_２またはτ_３）は、常に３ミリ秒または５ミリ秒の発表値を著しく上回り、さらに好ましい値７ミリ秒よりも優れている。したがって、これは、先行技術に記載されている励起状態寿命を著しく上回る。

さらに、従来技術では決して得られなかったように、これらの例外的に長い励起状態寿命測定値は、この元素の励起状態寿命の最大到達可能値を構成する各元素について計算される理論値であるユーロピウムの放射寿命の理論値に非常に近い。

ユーロピウム水性イオンの場合、この放射寿命理論値は、Ｂｕｎｚｌｉ，Ｊ．Ｃ．Ｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１０，１１０，２７３１による先行技術で開示されるように、９．７ミリ秒に対応する。

さらに、本発明によるナノ粒子のこの例外的に長い励起状態寿命は、ナノ粒子の輝度を犠牲にして得られるものではない。実際に、上記の詳細に記載された測定方法に従って、本発明による化合物について顕著な輝度値も測定した。

測定された輝度の結果を以下の表３にまとめた。

再び、測定値は、本発明によるナノ粒子が、１０^４Ｍ−１．ｃｍ^−１の発表値を著しく（少なくとも３桁で）上回るか、または１０^５Ｍ^−１．ｃｍ^−１の発表値を著しく上回る輝度を有し、好ましい値１０^６Ｍ^−１．ｃｍ^−１よりもさらに優れており、したがって、従来技術で開示されているランタニド系標識の輝度よりも大幅に良好である。

上に実証されたように、本発明による発光ランタニドナノ粒子は、先行技術で提案されるものをはるかに超えて、技術的な問題に対する非常に有効な解決策を提供する。

明らかに、本発明は、上記に記載され、様々な図面に示される好ましい実施形態に限定されず、当業者は、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の枠組みおよび範囲を超えることなく、多数の修正を行い、他の実施形態を想像することができる。

Claims (11)

1. 発光ランタニドナノ粒子であって、改善された輝度、および増加した励起状態の寿命を同時に有し、テルビウムを含むランタニドイオンナノ粒子、および前記ランタニドイオンナノ粒子の表面に結合したいくつかの発色団リガンドの分子を含み、
   −前記ランタニドイオンナノ粒子が、テルビウムイオン、ならびにセリウム、プラセオジム、ネオジム、サマリウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、およびイッテルビウムからなる群から選択される少なくとも第２のランタニドのイオンを含み、
   −前記リガンドが、式Ｉまたは式ＩＩのうちの少なくとも１種の発色団ラジカルを含む有機分子であり、
   

   

   式中、Ｒは、Ｈ、ＣＮ基、またはＣＯＯＨ基から選択されることを特徴とする、発光ランタニドナノ粒子。
2. 前記第２のランタニドが、ユーロピウム、サマリウム、ジスプロシウム、およびイッテルビウムから選択され、優先的にはユーロピウムであることを特徴とする、請求項１に記載の発光ナノ粒子。
3. 前記ランタニドイオンナノ粒子が、ランタン、ルテチウム、およびガドリニウムから選択され、優先的にはランタンである第３のランタニドのイオンをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜２のいずれか１項に記載の発光ナノ粒子。
4. 前記ランタニドイオンナノ粒子が、１０〜９９．９モル％、優先的には５０〜９９．９モル％、さらにより優先的には７５〜９９．９モル％のテルビウムイオン、０．１〜９０モル％、優先的には０．１〜５０モル％、さらにより優先的には０．１〜２５モル％の前記第２のランタニドのイオンを含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発光ナノ粒子。
5. 前記ランタニドイオンナノ粒子が、１〜９８．９モル％、優先的には１０〜９８モル％、さらにより優先的には４０〜９８モル％のテルビウムイオン、０．１〜２０モル％、優先的には０．５〜１０モル％、さらにより優先的には１〜５モル％の前記第２のランタニドのイオン、および１〜９０．９モル％、優先的には１０〜８０モル％、さらにより優先的には１０〜２０モル％の前記第３のランタニドのイオンを含有することを特徴とする、請求項３に記載の発光ナノ粒子。
6. 前記リガンドが、ｎ個の発色団ラジカルおよびスペーサー基を含み、前記スペーサー基が、前記発色団ラジカルを一緒に結合した炭素鎖を含有するヘテロ原子であり、ｎは、１〜１０、優先的には２〜６、より優先的には２〜３の整数であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発光ナノ粒子。
7. 前記リガンドが、分析対象の担体分子に共有結合可能なグラフト官能基をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の発光ナノ粒子。
8. 前記発光ナノ粒子が、少なくとも１種のリガンド分子に共有結合した分析対象の担体分子をさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の発光ナノ粒子。
9. 分析対象の前記担体分子が、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体部分、２０００ｇ．モル^−１未満の分子量の小分子、ビオチン、デスチオビオチン、ストレプトアビジン、およびマツズマブ抗体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７または８に記載の発光ナノ粒子。
10. 前記リガンドが、式Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５による構造を有する分子から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の発光ナノ粒子。
    

    
11. 前記発光ナノ粒子が、それぞれ３ミリ秒および１０^４Ｍ^−１．ｃｍ^−１よりも同時に優れ、優先的にはそれぞれ５ミリ秒および１０^５Ｍ^−１．ｃｍ^−１よりも同時に優れ、さらにより優先的にはそれぞれ７ミリ秒および１０^６Ｍ^−１．ｃｍ^−１よりも同時に優れている、輝度および励起状態寿命を有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の発光ナノ粒子。

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