KR20210035823A - 더 긴 여기 상태 수명을 갖는 테르븀을 포함하는 초광도 발광성 란타나이드 나노 입자 - Google Patents
더 긴 여기 상태 수명을 갖는 테르븀을 포함하는 초광도 발광성 란타나이드 나노 입자 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 향상된 광도 및 증가된 여기 상태 수명을 동시에 갖는 발광성 란타나이드 나노 입자를 제공한다. 이들 나노 입자는 테르븀 이온 및 제2 란타나이드 이온, 바람직하게는 유로퓸을 포함하고, 나노 입자의 표면에 결합된 발색된 리간드의 분자로 코팅된다.
상기 리간드는 화학식 I 또는 화학식 II의 발색단 라디칼을 적어도 하나 포함하는 유기 분자이며:
상기 식에서 R은 H, CN기 또는 COOH기 중에서 선택된다.
인광 여기 상태 수명은 표면 테르븀 이온으로부터 제2 란타나이드의 코어 이온으로의 에너지 전달에 의해 향상된다.
나노 입자는 적어도 하나의 리간드 분자에 공유적으로 부착된 분석적 관심의 캐리어 분자를 추가로 포함할 수 있다.
상기 리간드는 화학식 I 또는 화학식 II의 발색단 라디칼을 적어도 하나 포함하는 유기 분자이며:
상기 식에서 R은 H, CN기 또는 COOH기 중에서 선택된다.
인광 여기 상태 수명은 표면 테르븀 이온으로부터 제2 란타나이드의 코어 이온으로의 에너지 전달에 의해 향상된다.
나노 입자는 적어도 하나의 리간드 분자에 공유적으로 부착된 분석적 관심의 캐리어 분자를 추가로 포함할 수 있다.
Description
본 발명은 중요한 광도(brightness) 및 매우 긴 수명의 여기 상태를 갖는 새로운 발광성 란타나이드 나노 입자에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 광도 향상 및 여기 상태의 수명 증가를 모두 초래하는, 표면을 코팅하는 발색단 리간드를 포함하는 제2 란타나이드의 이온으로 공도핑된(co-doped) 테르븀 이온 나노 입자에 관한 것이다.
이러한 발광성 나노 입자는 생물학적 분석, 특히 형광 면역 분석, 의료 영상 및 현미경 검사의 기술 분야에 유리하게 사용될 수 있다.
생물학적 분석 분야에서는 생체 분자에 특이적으로 결합할 수 있고 쉽게 관찰할 수 있는 "라벨(label)" 화합물에 대한 중요한 요구가 존재한다.
이러한 라벨 화합물 덕분에, 특정 분석물(analyte), 예컨대 핵산, 효소, 펩티드, 의약품(예를 들어, 마약, 독극물, 약물 등), 호르몬, 대사산물, 병원성 미생물, 바이러스 또는 항체, 특히 질병 상태와 관련된 것들의 존재가 연구 또는 진단 목적으로 유리하게 검출 및 정량화될 수 있다.
바람직한 라벨은 저렴하고 안전하고 안정적이며 다양한 화학, 생화학 및 생물학적 물질에 부착될 수 있어야 한다. 그들은 자연에서 거의, 오히려 전혀 발견되지 않아야 한다. 또한 그들은 수성 시스템에서 쉽게 검출될 수 있는 매우 특징적인 신호를 바람직하게는 빠르고 민감하며 재현 가능한 방식으로 제공해야 한다.
다양한 라벨들이 종래 기술에서 개발되어 왔다. 예를 들어, 때때로 방사성 라벨이 사용된다. 그러나, 이러한 라벨은 비싸고, 해로우며, 정교한 장비와 숙련된 직원을 요구하고, 특정 폐기물 처리를 필요로 하기 때문에 단점이 있다.
그러한 맥락에서, 형광 분광법 또는 발광 검출 방법을 사용하여 직접 검출할 수 있는 라벨이 특히 중요하다. 다른 분자에 대한 용이한 부착을 위해 개발된 다수의 이러한 라벨이 종래 기술에 기재되어 있으며, 일부는 상업적으로 입수 가능하다. 이러한 라벨은 이상적으로는 발광 양자 수율, 좁은 방출 대역 및 긴 여기 상태 수명과 몰 흡광 계수의 곱으로 정의되는 양호한 광도를 가져, 시간 분해 검출 기술을 허용해야 한다.
양자점(quantum dot)이라고도 하는 반도체 나노 결정, 예를 들어 문헌[Medintz et al, Nature Materials, June 2005, 4, 435]에 기재된 것들은 양호한 광도를 갖지만 매우 짧은 발광 수명(마이크로초 미만) 및 넓은 방출 피크를 가지고 있다.
란타나이드 이온은 매우 특별한 분광 특성을 가지고 있으며 문헌[Bunzli, J.C. G. Chem. Rev. 2010, 110, 2729]에 의해 개시된 바와 같이 이러한 발광성 라벨에 사용되는 흥미로운 후보이다. 실제, 그의 방출 선은 매우 좁으며, 여기 상태 수명은 길고 몇 밀리초에 이를 수 있다. 따라서 그 발광 신호의 스펙트럼적 및 시간적 식별 모두가 적절한 신호 대 잡음 비에 의해 가능하다.
그러나, 상응하는 몰 흡광 계수는 매우 작고, 따라서 매우 낮은 광도를 생성한다. 이러한 불편함을 극복하기 위해, 안테나 효과라는 메커니즘 덕분에, 빛을 흡수하고 흡수된 에너지를 란타나이드 이온으로 전달하는 데 광 감응 리간드가 사용되어 왔다.
생물학적 물질에 결합할 수 있는 란타나이드 이온 단핵 복합체를 기반으로 하는 발광성 라벨은 종래 기술에 존재하며 일부는 상업적으로 입수 가능하다(예를 들어 Lumi4 또는 Lanthascreen 상품명 하에). 특허 출원 WO 00/48990 및 WO 00/48991은 하나의 란타나이드 이온 및 착화제를 포함하는 란타나이드 이온 킬레이트로부터 제조된 그러한 발광성 마커(marker)의 예들을 개시한다.
그러나, 가장 잘 알려진 란타나이드계 라벨은 이러한 복합체의 분자 특성 때문에 여전히 보통의 광도를 나타낸다. 예를 들어 WO 2013/011236; 문헌[Delbianco, M. et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 54, 10718]; WO 2006/001835 또는 문헌[Xu, J. et al, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 199900]에 기재된 가장 효율적인 분자 복합체는 104 M-1.cm-1 정도의 광도 및 3 ms를 초과하지 않는 보통의 발광 수명을 갖는다.
이러한 측면을 개선하기 위해, 본 발명자들은 란타나이드 이온 분자 복합체 대신에 란타나이드 이온 나노 입자에 관심을 가졌다.
나노 입자는 일반적인 정의에 따라 1 nm 내지 500 nm의 크기를 가지고 수많은 원자로 구성되는 작은 물체이며, 그의 한 가지 관심은 표면에 있는 많은 수의 원자 때문이다. 해당 분야의 최근 혁신을 통해 나노 입자의 합성은 크기, 원소 조성 및 특성 측면에서 제어될 수 있다.
란타나이드 나노 입자는 큰 스토크스 이동(Stoke's shift) 및 강한 광 안정성을 제공하기 때문에 생물학적 마커로서 매우 유망하다. 그러나, 수백 또는 수천의 란타나이드 양이온으로 구성되어 있더라도, 란타나이드 이온 나노 입자 또한 낮은 흡수 계수를 갖는다.
그러나, 본 발명자들은 란타나이드 이온 나노 입자, 특히 테르븀 함유 란타나이드 이온 나노 입자의 광 감작을 연구하여, 표면 테르븀 이온으로 안테나 효과를 수행하는 적합한 발색단 리간드로 코팅함으로써 그 광도를 106 M-1.cm-1보다 높게, 즉 효율적인 분자 복합체의 광도보다 2배 정도 높게 올리는 데 성공하였다. 따라서, 라벨로서 사용할 분석적 관심의 벡터(캐리어 분자)에 의해 표시(mark)될 수 있는 새로운 초광도 발광성 테르븀 나노 입자를 얻었다.
더욱이, 종래 기술에 기재된 란타나이드 이온 단핵 복합체로 실현된 것과 비교하여 분석의 감도를 개선하기 위해, 마커의 여기 상태 수명을 연장하는 것이 매우 바람직하다.
실제로, 여기 상태 수명이 길어짐에 따라, 지연된 신호 획득으로 시간 분해 측정을 실현하는 것이 가능하다. 펄스 여기 후, 방출된 강도를 기록하기 전에 지연이 부과된다. 이 지연된 획득은 더 짧은 형광 현상을 제거하며, 다른 모든 형광 분자의 신호는 사라진다. 단, 가장 긴 여기 상태 수명 화합물의 인광성 신호는 여전히 존재하여 측정된다. 따라서 배경 잡음이 크게 감소하고 신호 대 잡음 비가 크게 증가한다. 이것은 형광 화합물이 환경에 많은 생물학적 매질에서 상당한 이점이다.
본 발명에 의해 제공되는 테르븀을 함유하는 새로운 발광성 나노 입자는 중요한 광도 및 분석적 관심의 벡터를 결합하여 라벨로서의 이용을 허용하는 능력에 더하여 추가로 종래 기술 화합물보다 더 긴 여기 상태 수명을 갖는다.
측정의 감도 및 신호 분해능을 개선함으로써, 본 발명의 나노 입자 수용액에서의 이러한 매우 긴 여기 상태 수명 및 탁월한 광도는 생물학적 분석 및 현미경 분야에서 탁월한 결과를 가능하게 한다.
기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 향상된 광도 및 증가된 여기 상태 수명을 동시에 갖고, 테르븀을 포함하는 란타나이드 이온 나노 입자, 및 란타나이드 이온 나노 입자의 표면에 결합된 발색단 리간드의 여러 분자를 포함하는 발광성 란타나이드 나노 입자를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 란타나이드 이온 나노 입자는 테르븀 이온, 및 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 사마륨, 유로퓸, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 툴륨 및 이테르븀으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 제2 란타나이드의 이온을 포함한다.
또한, 상기 리간드는 화학식 I 또는 화학식 II의 발색단 라디칼을 적어도 하나 포함하는 유기 분자이다:
상기 식에서 R은 H, CN기 또는 COOH기 중에서 선택된다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 란타나이드 이온 나노 입자는 테르븀 이온, 및 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 사마륨, 유로퓸, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 툴륨 및 이테르븀으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 제2 란타나이드의 이온을 포함한다.
또한, 상기 리간드는 화학식 I 또는 화학식 II의 적어도 하나의 발색단 라디칼을 포함하는 유기 분자이다:
상기 식에서 R은 4-에틸벤조산기이다.
따라서, 리간드는 상기한 바와 같은 화학식 I 또는 II를 갖는 하나의 기 또는 모티프(motif)를 포함하는 유기 분자, 및 상기 기 또는 모티프에 연결된 임의의 적합한 화학 구조이다. 나타낸 절단 후에 위치되는 임의의 종류의 이러한 화학 구조는 예를 들어 OH기, 헤테로 원자를 갖거나 갖지 않는 분지형, 선형 또는 고리형 탄소 사슬, 그래프팅 기능, 임의의 적합한 종류의 스페이서 기에 의해 선택적으로 함께 연결된 하나 또는 여러 개의 다른 발색단 기(들), 또는 임의의 다른 적합한 화학 구조일 수 있다.
본 발명 덕분에, 수득된 나노 입자는, 추후 "발광 분광법의 실험 측정 방법"으로 불리는 섹션의 실시예 부분에서 설명되는 바와 같이 측정할 때, 각각 3 ms 및 104 M-1.cm-1으로 동시에 우수하고, 바람직하게는 각각 5 ms 및 105 M-1.cm-1으로 동시에 우수하며, 보다 바람직하게는 각각 7 ms 및 106 M-1.cm-1으로 동시에 우수한 광도 및 여기 상태 수명을 갖는다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 제2 란타나이드는 유로퓸, 사마륨, 디스프로슘 및 이테르븀 중에서 선택되며, 바람직하게는 유로퓸이다.
실시형태에 따라, 란타나이드 이온 나노 입자는 10 내지 99.9 몰%, 바람직하게는 50 내지 99.9 몰%, 더욱 바람직하게는 75 내지 99.9 몰%의 테르븀 이온 및 0.1 내지 90 몰%, 바람직하게는 0.1 내지 50 몰%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 25 몰%의 제2 란타나이드 이온을 함유할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 란타나이드 이온 나노 입자는 란탄, 루테튬 및 가돌리늄 중에서 선택되고, 바람직하게는 란탄인 제3 란타나이드의 이온을 추가로 포함한다.
이 경우 실시형태에 따라, 상기 란타나이드 이온 나노 입자는 1 내지 98.9 몰%, 바람직하게는 10 내지 98 몰%, 더 바람직하게는 40 내지 98 몰%의 테르븀 이온, 0.1 내지 20 몰%, 바람직하게는 0.5 내지 10 몰%, 더 바람직하게는 1 내지 5 몰%의 제2 란타나이드 이온, 및 1 내지 90.9 몰%, 바람직하게는 10 내지 80 몰%, 더 바람직하게는 10 내지 20 몰%의 제3 란타나이드를 함유할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 리간드는 n개의 발색단 라디칼 및 스페이서 기를 포함하고, 여기서 스페이서 기는 발색단 라디칼을 함께 연결하는 탄소 사슬을 함유하는 헤테로 원자이고, n은 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 6, 더 바람직하게는 2 내지 3의 정수이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 리간드는 분석적 관심의 캐리어 분자에 공유 결합될 수 있는 그래프팅 기능을 추가로 포함한다.
이 실시형태에 따르면, 발광성 나노 입자는 적어도 하나의 리간드 분자에 공유적으로 부착된 분석적 관심의 캐리어 분자를 추가로 포함할 수 있다.
분석적 관심의 캐리어 분자는 바람직하게는 펩티드, 단백질, 항체, 항체 모이어티 및 2000 g.mol-1 미만의 분자량을 갖는 소분자로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 비오틴, 데스티오비오틴, 스트렙타비딘 또는 마투주맙(Matuzumab) 항체, 펩티드 LPFFD, 펩티드 KLVFF 또는 항-IgG(H+L) 인간 항체일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 리간드는 화학식 L1, L2, L3, L4 및 L5에 따른 구조를 갖는 분자들 중에서 선택된다:
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 리간드는 화학식 L6, L7, L8 및 L9에 따른 구조를 갖는 분자들 중에서 선택된다:
본 발명의 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면들을 참조하여 다음의 상세한 설명을 읽음으로써 밝혀질 것이다.
도 1 내지 3은 각각 실시예 5에 따른 란타나이드 나노 입자에 대응하는 투과 전자 현미경 이미지, 초순수에서의 동적 광 산란을 보여주는 그래프, 및 고체 나노 입자의 X-선 회절 패턴을 보여주는 그래프이다.
도 4 내지 6은 각각 실시예 6에 따른 란타나이드 나노 입자에 대응하는 투과 전자 현미경 이미지, 초순수에서의 동적 광 산란을 보여주는 그래프, 및 고체 나노 입자의 X선 회절 패턴을 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 생체 기능화된 발광성 나노 입자를 얻기 위한 두 가지 다른 방법의 개략도이다.
도 8 및 10은 리간드 L5에 의한 실시예 N에 따른 란타나이드 나노 입자의 적정에 이어서 각각 UV/가시광 흡수 및 방출 형광 분광법을 예시하는 그래프이다.
도 9는 첨가된 리간드 L5의 농도의 함수로서 314 nm에서의 흡수 변화(evolution)를 보여주는, 도 8의 적정에 대한 그래프이다.
도 11은 테르븀 및 유로퓸의 방출에 대응하는 스펙트럼 영역을 보다 구체적으로 보여주는, 도 10의 그래프의 둘러싸인 부분의 확대도이다.
도 12는 첨가된 리간드 L5의 농도의 함수로서 상이한 파장에서의 강도 방출 변화를 보여주는, 도 10의 적정에 대한 그래프이다.
도 13은 완충 용액에서 리간드 L5로 코팅된 La0.99Eu0.01F3(커브 b''') 및 La0.9Eu0.1F3 (커브 a''')의 나노 입자의 방출 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 1 내지 3은 각각 실시예 5에 따른 란타나이드 나노 입자에 대응하는 투과 전자 현미경 이미지, 초순수에서의 동적 광 산란을 보여주는 그래프, 및 고체 나노 입자의 X-선 회절 패턴을 보여주는 그래프이다.
도 4 내지 6은 각각 실시예 6에 따른 란타나이드 나노 입자에 대응하는 투과 전자 현미경 이미지, 초순수에서의 동적 광 산란을 보여주는 그래프, 및 고체 나노 입자의 X선 회절 패턴을 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 생체 기능화된 발광성 나노 입자를 얻기 위한 두 가지 다른 방법의 개략도이다.
도 8 및 10은 리간드 L5에 의한 실시예 N에 따른 란타나이드 나노 입자의 적정에 이어서 각각 UV/가시광 흡수 및 방출 형광 분광법을 예시하는 그래프이다.
도 9는 첨가된 리간드 L5의 농도의 함수로서 314 nm에서의 흡수 변화(evolution)를 보여주는, 도 8의 적정에 대한 그래프이다.
도 11은 테르븀 및 유로퓸의 방출에 대응하는 스펙트럼 영역을 보다 구체적으로 보여주는, 도 10의 그래프의 둘러싸인 부분의 확대도이다.
도 12는 첨가된 리간드 L5의 농도의 함수로서 상이한 파장에서의 강도 방출 변화를 보여주는, 도 10의 적정에 대한 그래프이다.
도 13은 완충 용액에서 리간드 L5로 코팅된 La0.99Eu0.01F3(커브 b''') 및 La0.9Eu0.1F3 (커브 a''')의 나노 입자의 방출 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
본 발명에 따른 발광성 나노 입자는 이제 도 1 내지 도 13을 참조하여 상세하게 설명될 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본 발명에 따른 발광성 나노 입자는 테르븀 이온, 및 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 사마륨, 유로퓸, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 툴륨 및 이테르븀 중에서 선택된 적어도 제2 란타나이드의 이온을 포함하는 란타나이드 이온 나노 입자로 제조된다.
바람직하게는, 상기 란타나이드 이온 나노 입자는 또한 가시광선 및 근적외선 영역에서 분광학적으로 침묵하지만 분광학적 활성 이온들 사이의 자가-켄칭(quenching)을 유리하게 감소시키는 호스트 매트릭스로서 작용하는 제3 란타나이드의 이온을 함유할 수도 있다.
이들 제3 란타나이드 이온은 유리하게는 본 발명의 공도핑된 란타나이드 이온 나노 입자를 얻기 위해 테르븀 이온 및 다른 란타나이드 이온(제2 란타나이드 이온)에 의해 쉽게 도핑될 수 있는 란타늄 이온 또는 루테튬 이온일 수 있다.
분광 특성 외에 자기 특성이 필요한 경우, 가돌리늄 이온이 또한 제3 란타나이드 이온으로서 유리하게 사용될 수 있다.
란타나이드 이온 나노 입자는 고전적으로 이용 가능한 방법을 사용하여 당업자에 의해 물 매질에서 쉽게 합성될 수 있다. 이는 이후 실시예 부분에서 상세하게 설명되는 바와 같이 예를 들어 물에서 전자 레인지를 사용하여 또는 오토 클레이브에서 열수 합성에 의해 실현될 수 있다.
그에 따라 합성될 때, 상이한 란타나이드 이온들은 무작위로 위치하며, 일부는 표면에, 일부는 얻어진 나노 입자의 코어에 위치된다.
본 발명에 따른 많은 란타나이드 이온 나노 입자들이 합성되었으며, 본 발명자들에 의해 테르븀 및 다른 란타나이드 이온에서 상이한 도핑 수준으로 특성화되었다. 그의 여러가지 예들이 이후의 실시예 부분의 표 1에 수집되어 있다.
실시예 5 및 6에 대응하는 란타나이드 이온 나노 입자는 투과 전자 현미경, 초순수에서의 동적 광 산란 및 X 선 회절로 특성화되었다. 얻은 결과는 도 1 내지 6에 예시되어 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 발광성 나노 입자는 발색단 리간드에 의해 감광된다. 이러한 발색단 리간드는 빛 에너지를 흡수하고 이를 안테나 효과에 의해 나노 입자 표면에 존재하는 란타나이드 이온으로 전달한다.
이러한 리간드의 특성을 선택하는 것은 나노 입자의 용해도 및 안정성을 보장하기 위해 우수한 배위를 가지는 데에 그리고 원하는 뛰어난 분광 특성을 얻는 데에 중요하다.
본 발명에 따른 리간드는 테르븀 이온을 특이적으로 감광시키는 하나 또는 여러 개의 발색단 라디칼을 갖도록 선택되며, 이들 발색단 라디칼은 적어도 테르븀의 7F6 내지 5D4 전이의 에너지 갭에 대응하는 에너지량을 전달할 수 있다.
이러한 이유로, 디피콜린산 또는 2-히드록시이소프탈산 형광단을 기반으로 하는 발색단 라디칼이 본 발명에 따른 나노 입자의 Tb(III) 이온을 민감하게 하기 위해 선택되었다. 실제로, 이러한 라디칼의 삼중항 상태(각각 26600 cm-1 및 약 23000 cm-1)는 Tb(III) 이온의 여기 상태(20500 cm-1)에 가깝고, 에너지 전달을 최적화하고 우수한 감광성을 얻을 수 있도록 한다.
디피콜린산(왼쪽) 및 2-히드록시-이소프탈산(오른쪽)의 화학식을 아래에 나타낸다:
이러한 관찰로부터, 상이한 링커(linker) 및 치환체를 사용하여 두 계열의 리간드가 합성되었다. 그러나, 란타나이드 이온 배위에 사용되는 고도로 미리 조직된 일반적인 리간드와 달리, 본 발명의 리간드는 란타나이드 양이온으로부터의 침출을 방지하면서 나노 입자의 안정화를 보장하기 위해 바람직하게는 평면 배위를 표적으로 한다.
따라서, 본 발명은 화학식 I 또는 화학식 II의 발색단 라디칼을 하나 또는 여러 개 포함하는 유리한 리간드를 제공한다:
상기 식에서 R은 H, CN기 또는 COOH기 중에서 선택된다.
다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 화학식 I 또는 화학식 II의 발색단 라디칼을 하나 또는 여러 개 포함하는 유리한 리간드를 제공한다:
상기 식에서 R은 4-에틸벤조산기이다.
이러한 발색단 라디칼은, 란타나이드 나노 입자의 표면에 대한 리간드의 부착을 보장하는 고정 지점 역할을 하는 여러 개의 산소 및 질소 원자, 및 빛 에너지를 강하게 흡수하고 이어서 이를 그것이 부착되는 란타나이드 나노 입자의 표면에 있는 테르븀 이온으로 전달할 수 있는 방향족 부분을 가지고 있다.
본 발명에 따른 리간드의 예는 특히 L5라 불리는, 아래에 나타낸 분자이다:
L1, L2, L3 및 L4라 불리는, 리간드의 다른 4가지 바람직한 예를 다음에 나타낸다:
L6, L7, L8 및 L9라 불리는, 리간드의 다른 4가지 바람직한 예를 다음에 나타낸다:
이들 리간드 예들 L1 내지 L5의 합성 방법은 하기 실시예 부분에서 설명된다.
이들 리간드 예들 L6 내지 L9의 합성 방법 또한 하기 실시예 부분에서 설명된다.
리간드가 여러 발색단 라디칼을 포함하는 경우, 이들 라디칼은 바람직하게는, 리간드의 발색단 라디칼의 수에 따라 증가하는 길이를 갖는, 스페이서 기라 불리는 탄소 사슬에 의해 리간드 내에서 함께 연결된다.
L1 내지 L4에서 알 수 있는 바와 같이, 스페이서 기는 바람직하게는 적어도 연결할 발색단 라디칼만큼 많은 암(arm)을 갖는 하나 또는 여러 개의 헤테로 원자, 예를 들어 질소 원자를 함유하는 분지형 탄소 사슬이다.
더욱이, L6 내지 L8에서 동일한 것을 볼 수 있으며, 스페이서 기는 바람직하게는 적어도 연결할 발색단 라디칼만큼 많은 암을 갖는 하나 또는 여러 개의 헤테로 원자, 예를 들어 질소 원자를 함유하는 분지형 탄소 사슬이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 리간드는 분석적 관심의 캐리어 분자를 공유적으로 부착할 수 있는 그래프팅 기능을 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 이 그래프팅 기능은 또한 스페이서 기에 의해 나머지 분자에 연결된다.
전술한 실시형태의 경우, 스페이서 기는 그래프팅 기능을 연결하기 위한 보조 암을 가질 수 있다.
그래프팅 기능의 특성은 부착할 벡터 또는 캐리어 분자의 특성의 기능에서 결정된다. 그것의 화학 구조는 원하는 캐리어 분자의 화학 구조에 특이적이고 공유적으로 연결될 수 있도록 정교하게 만들어진다. 따라서, 이러한 그래프팅 구조는 원하는 용도에 정확히 대응하도록 당업자에 의해 개조될 수 있다.
목적하는 캐리어 분자는 얻고자 하는 라벨 또는 마커에 따라 다양할 수 있다. 이러한 벡터 중 몇몇이 예상되었고 본 발명과 호환성이 있고, 예를 들어, 펩티드, 단백질, 항체, 항체 모이어티, 또는 예를 들어 비오틴 또는 데스티오비오틴과 같은 2000 g.mol-1 미만의 분자량을 갖는 소분자를 포함한다.
다른 실시형태에서, 예를 들어 펩티드 LPFFD, 펩티드 KLVFF, 또는 항-IgG(H+L) 인간 항체를 포함하는 다른 벡터가 예상되었고 본 발명과 호환성이 있다.
란타나이드 이온 나노 입자 주위에 리간드를 고정하고 리간드에 분석적 관심의 캐리어 분자를 공유 결합한 후, 본 발명 덕분에, 생체 기능화된 초광도 발광성 나노 입자가 얻어진다.
도 7에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 단계들이 실현되는 순서에 따라 이러한 생체 기능화된 발광성 나노 입자를 얻는 두 가지 다른 방법이 가능하다.
위에서 나타낸 제1 방법에 따르면, 각각 발색단 라디칼(2), 스페이서 기(3) 및 그래프팅 기능(4)을 포함하는 리간드 분자들(1)이 예를 들어 펩티드 또는 항체일 수 있는 생체 분자(5)(캐리어 분자 또는 벡터)와 먼저 혼합된다. 이들 생체 분자(5)는 그의 그래프팅 기능(4)을 통해 리간드 분자(1)에 결합하고 생체 기능화된 리간드 분자(6)가 얻어진다.
제2 단계에서, 란타나이드 나노 입자(7)는 발색단 라디칼(2)에 의해 란타나이드 나노 입자(7)의 표면을 코팅하는 생체 기능화된 리간드 분자(6)와 혼합된다.
아래에 나타낸 제2 방법에 따르면, 리간드 분자(1)는 란타나이드 나노 입자(7)와 즉시 접촉하게 된다. 리간드 분자(1)의 발색단 라디칼(2)은 란타나이드 나노 입자(7)의 표면에 결합하여 코팅된 나노 입자(8)를 형성한다.
이러한 코팅된 나노 입자(8)는 제2 단계에서 생체 분자(5)와 혼합된다. 이들 생체 분자(5)는 란타나이드 나노 입자(7)에 이미 부착된 리간드 분자(1)의 그래프팅 기능(4)에 공유 결합한다.
설명된 두 가지 방법 모두 본 발명에 따른 생체 기능화된 발광성 나노 입자(9)를 초래한다. 생체 분자(5)로 인한 입체 장애 때문에, 그들은 고정된 코팅 리간드의 수(제2 방법에서 더 중요함) 및 고정된 생체 분자의 수(제1 방법에서 더 중요함)가 다르고, 이에 따라 목적하는 용도에 따라 당업자에 의해 대안적으로 선택될 수 있다.
따라서, 이전에 설명된 리간드 L1 내지 L4는, 생체 기능화된 리간드를 생성하기 위하여, 캐리어 분자의 히드록실, 아민 또는 티올 기능의 반응에 의해 분석적 관심의 캐리어 분자를, 예를 들어 리간드 L1 내지 L4의 그래프팅 기능과 유리하게 고정시킬 수 있다.
리간드 L1로부터 실현된 생체 기능화된 리간드의 두 가지 특정 예들이 본 발명자들에 의해 합성되고 시험되었다. 스트렙타비딘 및 마투주맙 항체에 의한 리간드 L1의 생체 기능화에 대한 이들 실시예들은 추후 실시예 부분에서 상세히 설명된다.
유리하게 발광성 나노 입자를 생체 기능화하는 것에 더하여, 본 발명은 탁월한 분광 특성을 갖는 발광성 나노 입자를 제공한다.
앞서 설명한 바와 같이, 리간드를 함유하는 적합한 발색단에 의한 란타나이드 이온 나노 입자의 코팅은 발색단으로부터 나노 입자의 표면에 위치된 테르븀 이온으로의 안테나 효과를 통한 에너지 전달 덕분에 생성된 나노 입자의 광도를 향상시킨다.
그러나, 이러한 표면 테르븀 이온은 생물학적 매질에서 그들을 둘러싸고 있는 수성 환경의 물 분자에 의해 진동 켄칭을 받게 되고, 이는 불리하게도 여기 상태의 수명을 감소시키고 양자 수율을 저하시키고, 이에 따라 이어서 광도를 저하시킨다.
이러한 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 테르븀 이온에 더하여 테르븀과 상이한 적합한 제2 란타나이드의 이온을 포함하는 란타나이드 나노 입자를 제공한다.
이러한 제2 란타나이드 이온 추가의 목적은 나노 입자의 코어에 위치된 란타나이드 이온의 발광을 촉진하는 것이다.
실제로, 나노 입자의 코어에 위치된 란타나이드 이온은 매질의 물 분자의 진동 켄칭으로부터 보호되기 때문에 표면 이온보다 수명이 더 길고 고유 양자 수율이 향상된다. 그러나, 그들은 그럼에도 불구하고 표면으로부터 멀리 떨어져 있으며 안테나로서 작용하는 발색단 리간드에 의해 효율적으로 민감화될 수 없다.
테르븀 이온과 협력할 수 있도록 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 사마륨, 유로퓸, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 툴륨 및 이테르븀 중에서 적절하게 선택된 제2 란타나이드의 이온을 도입함으로써, 이들 코어 이온의 발광 참여가 유리하게 얻어진다.
실제로, 나노 입자의 표면에 위치한 테르븀 이온 Tb3+로부터 나노 입자의 코어에 존재하는 제2 란타나이드 Ln3+의 이온으로의 에너지 전달은 깔때기 효과에 의해 촉진된다.
이러한 효율적인 에너지 전달 덕분에, 표면 테르븀 이온이 중계로서 작용하여 코어 란타나이드 이온에 접근하고 이를 감광시킨다. 따라서 나노 입자의 분광 특성이 향상된다. 나노 입자의 광도가 향상되고 수성 매질에서의 여기 상태 수명이 동시에 증가된다.
이러한 유리한 효과는, 본 발명에 따라 발광성 나노 입자에 대해 수행되고 리간드 L5 분자로 코팅된 실시예 6에 따른 란타나이드 나노 입자를 포함하는 연구에 관한 도 8 내지 13에서 입증되었다.
이들 연구는 리간드 L5의 존재 하에서 실시예 6 란타나이드 나노 입자의 거동을 이해하기 위해 수행되었다. L5에 의한 적정을 통해 나노 입자의 흡수, 여기 및 방출 스펙트럼이 모니터링되었다. 이 테스트의 목적은 L5에 의한 Tb(III) 이온의 민감화가 Tb와 Eu 사이의 에너지 전달을 사용하여 나노 입자의 Eu(III) 이온의 물에서의 분광 특성을 향상시키는 것을 보여주는 것이었다.
도 8에서, La0.14Tb0.85Eu0.01F3 나노 입자 ([c] = 13.5 pM)를 함유하는 완충 용액(TRIS/HCl, 0.01 M, pH = 7)은 리간드 L5에 의해 적정되었다. 이 작업은 증가하는 부피의 L5 수용액([c] = 5x10-4 M)을 추가하고 결과적인 용액의 흡수를 UV/가시광 흡수 분광법으로 모니터링하는 것으로 구성되었다.
각 커브 a 내지 l은 리간드 L5 용액의 다른 증가하는 추가 부피 V에 대응한다.
커브 a는 리간드 L5를 갖지 않는 나노 입자 용액 단독, 즉 L5 리간드 용액의 추가 부피 Va = 0 μL에 대응한다.
커브 b 내지 l은 각각 커브 b의 경우 Vb = 20 μL, 커브 c의 경우 Vc = 40 μL, 커브 d의 경우 Vd = 60 μL, 커브 e의 경우 Ve = 80 μL, 커브 f의 경우 Vf = 100 μL, 커브 g의 경우 Vg = 120 μL, 커브 h의 경우 Vh = 140 μL, 커브 i의 경우 Vi = 200 μL, 커브 j의 경우 Vj = 400 μL, 커브 k의 경우 Vk = 650 μL, 및 커브l의 경우 Vl = 900 μL의 L5 리간드 용액의 추가 부피에 대응한다.
도 8에서 관찰할 수 있는 바와 같이 용액의 흡수는 추가된 리간드의 부피와 동일한 방식으로 증가된다.
리간드 L5의 최대 흡수 대역에 대응하는 314 nm에서의 흡수가 도 9에 표시된 바와 같이 구체적으로 연구되면, 314 nm에서의 흡수 대역의 증가는 추가된 리간드의 농도의 함수로서 선형임을 알 수 있다.
동시에, La0.14Tb0.85Eu0.01F3 나노 입자의 방출 스펙트럼이 또한 L5의 각 추가에 대해 형광 분광법(λexc = 330 nm)에 의해 측정되고 도 10 및 도 11에 표시되었으며, 각 커브 a' 내지 l'은 리간드 L5 용액의 다른 증가하는 추가 부피에 대응한다.
상기와 같이, 커브 a'는 리간드 L5를 갖지 않는 나노 입자 용액 단독, 즉 L5 리간드 용액의 추가 부피 Va' = 0 μL에 대응하고, 커브 b' 내지 l'는 각각 커브 b'의 경우 Vb' = 20 μL, 커브 c'의 경우 Vc' = 40 μL, 커브 d'의 경우 Vd' = 60 μL, 커브 e'의 경우 Ve' = 80 μL, 커브 f''의 경우 Vf' = 100 μL, 커브 g'의 경우 Vg' = 120 μL, 커브 h'의 경우 Vh' = 140 μL, 커브 i'의 경우 Vi' = 200 μL, 커브 j'의 경우 Vj' = 400 μL, 커브 k'의 경우 Vk' = 650 μL, 및 커브 l'의 경우 Vl' = 900 μL의 L5 리간드 용액의 추가 부피에 대응한다.
선택한 여기 파장, λexc = 330 nm는 리간드 L5의 흡수 파장에 대응한다.
리간드 L5를 갖지 않는 나노 입자 용액에 대응하는 커브 a'는 330 nm에서 여기될 때 나노 입자의 Tb 및 Eu 방출이 매우 약하다는 것을 보여준다. 커브 a'는 가로 축과 거의 일치한다.
커브 b'에 대응하는 리간드의 제1 추가는 Tb 및 Eu 이온을 민감화하여 485, 545, 584 및 621 nm에서 테르븀의 4가지 전형적인 방출 대역, 및 579 nm, 583 내지 603 nm, 604 내지 630 nm, 650 nm 및 679 내지 707 nm의 좁은 대역을 갖고 592 nm에서 최대 방출을 갖는 유로퓸 신호를 함유하는 방출 스펙트럼을 얻게 한다.
이러한 방출 대역의 중요성은 커브 b'로부터 커브 l'로 리간드의 추가된 양이 증가함에 따라 동일한 방식으로 증가한다.
테르븀 및 유로퓸에 대응하는 방출 대역은 도 11의 확대도에서 더 쉽게 관찰할 수 있다.
415 nm 영역에서의 다른 방출 대역은 많은 양의 리간드가 추가될 때 증가한다. 이 대역은 용액에서 리간드의 형광으로부터 기인한다.
도 12에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 추가된 리간드의 함수로서 스펙트럼의 상이한 피크 강도의 변화는 리간드 L5에 의한 적정 동안 상이한 거동을 나타낸다.
커브 a"는 리간드 L5의 방출 대역에 대응하는 415 nm에서의 방출 강도의 변화를 보여준다. 예상대로, 커브 a"는 첨가된 리간드의 농도의 함수로서 거의 선형이다. 커브 a"의 기울기는 용액에서 비배위된 리간드 L5 분자의 증식때문에 등가 부피(아래에 설명되는 바와 같음) 후에 약간 증가한다.
커브 b"는 545 nm에서 테르븀의 주 대역에 대한 방출 강도의 변화를 보여준다. 란타나이드 나노 입자의 표면에 결합된 리간드 L5 분자의 수가 증가함에 따라 커브 b"의 제1 부분에서 테르븀의 방출 강도는 점전적으로 증가한다. 그 다음, 란타나이드 나노 입자의 표면이 리간드 L5 분자로 완전히 코팅될 때 최대에 도달된다. 이러한 강한 강도 방출은 리간드 L5 분자에 의한 나노 입자 표면에서의 테르븀 이온의 감광화에서 기인한다.
성장 영역 및 최대 영역과 관련된 두 직선의 점 P에서의 교차는 나노 입자 표면을 완전히 코팅하는 데 필요한 리간드 용액의 최소 부피에 대응하는 적정의 등가 부피를 정의할 수 있게 한다. 표시된 경우에서 등가 부피는 423 μL(8.8 × 10-5 mol. L-1 농도에 대응)에 위치된다.
유로퓸 방출의 변화는 커브 c" 및 d"에 각각 대응하는 614 nm 및 700 nm에서의 두 대역에서 관찰되었다. 리간드 L5 용액의 제1 추가로부터, 강한 방출이 나타나고 두 대역에 대해 최대 강도에 도달한다. 이 방출은 다음의 L5 용액 추가에도 일정하게 유지된다.
커브 c" 및 d"로 나타낸 유로퓸 이온의 강한 방출은, 본 발명에서 예상된 바와 같이, 리간드 L5에 의한 표면에서의 테르븀 이온의 감광화에는 유리하게 나노 입자 코어 내의 유로퓸 이온으로 에너지의 정량적인 전달이 뒤따른다는 것을 증명한다. 이 중요한 방출은 리간드 L5에 의해 표면에 존재하는 유로퓸 이온의 직접적인 감광에 의해 야기될 수 없는데, 이는 리간드 L5 분자는 도 13에 예시된 바와 같이 이들을 거의 감광시키지 않기 때문이다.
실제로, 도 13에서, 유로퓸 이온을 포함하지만 테르븀 이온은 함유하지 않은 2개의 란타나이드 나노 입자, 각각 커브 a'''의 경우 1.29 nM 농도를 갖는 La0.9Eu0.1F3, 및 커브 b'''의 경우 246 pM 농도를 갖는 La0.99Eu0.01F3의 방출 스펙트럼은, 리간드 L5 흡수에 대응하는 λexc = 330 nm의 파장에서 여기 후 완충 용액(TRIS/HCl 0.01 M, pH 7.0)에서 리간드 L5 용액([L5] = 1.22×10-5 M)의 존재 하에 모니터링되었다. 이 스펙트럼에서, 리간드 L5 분자의 방출 대역은 가시적인 유일한 중요한 방출 피크이며, 유로퓸의 방출 대역은 거의 관찰되지 않는다.
실시예:
란타나이드 이온 나노 입자의 합성:
란타나이드 이온 나노 입자의 합성을 위해 두 가지 실험 방법이 사용되었다.
제1 방법은 마이크로파 조사를 사용한다. 이는 물에서 마이크로파 오븐을 사용하여 실현되었다.
상기 제1 방법에 따르면, NH4F, TbCl3, LnCl3 및 선택적으로 LaCl3의 용액이 milliQ 물에서 제조되었다. Ln은 본 발명의 나노 입자의 제2 란타나이드에 대응하고, 대안적으로 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 사마륨, 유로퓸, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 툴륨 또는 이테르븀이다.
합성의 제1 단계는 TbCl3, LnCl3 및 선택적으로 LaCl3를 나노 입자에 대해 원하는 공도핑에 대응하는 양으로 함께 혼합하는 것으로 구성되었다.
제2 단계에서 NH4F 용액이 실온에서 추가되었다. NH4F의 이 추가된 부피는 란타나이드 1 당량에 대한 3 당량에 대응한다.
그 다음, 제3 단계는 마이크로파 오븐에서 12분 동안 150℃로 혼합물을 데우는 것이었다. 마이크로파 오븐에서의 합성은 빠르고 정확한 온도 상승과 함께 규칙적인 가열, 중간 온도에서의 빠른 합성을 가능하게 하고, 그에 따라 좁은 크기 분포를 갖는 나노 입자를 제조할 것으로 예상되었다.
9000 tr/min에서 25분 동안 원심 분리한 후, 상청액을 제거하고, 백색 고체를 60℃에서 1시간 동안 초음파를 사용하여 milliQ 물에 분산시켜 나노 입자의 수성 현탁액을 얻었다.
제2 방법은 150℃ 오토 클레이브에서 물 중에서의 열수 합성이다.
가열에 대응하는 제3 단계를 제외하고는 절차는 정확히 동일했다. 이 방법의 제3 단계에서 혼합물은 스틸(steal) 반응기에 캡슐화되고 150℃에서 2시간 동안 오븐에서 가열되었다.
원심 분리, 상층액 제거 및 초음파 분산 후, 제1 방법과 비교하여 유사한 수율로 나노 입자의 수용액이 얻어졌다.
그에 따라 란타나이드 이온 나노 입자의 다양한 예들이 합성되었으며 아래 표 1에 나타낸다.
리간드 L
1
, L
2
및 L
3
의 합성:
청구된 리간드 L1, L2 및 L3은 하기 합성 단계에 따라 하기 중간 화합물 1 내지 7과 함께 제조되었다:
화합물 1은 110℃에서 NaOH의 존재하에 KMnO4에 의해 2,6-디메틸 아니솔을 밤새 산화시킨 다음, 매질의 산성화 및 EtOH의 존재 하의 에스테르화를 행함으로써 2단계로 수득되었다. 전체 수율은 두 단계에 대해 79%이었다.
TLC: Rf = 0.84 (SiOH, DCM/MeOH: 95/5). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.36 (t, J = 7.0 Hz, 6H, CH3), 3.90 (s, 3H, CH3), 4.35 (q, J = 7.1 Hz, 4H, CH2), 7.16 (t, J = 7.8 Hz, 1H, Har), 7.87 (d, J = 7.8 Hz, 2H, Har). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14 (CH3), 61 (CH2), 64 (CH3), 123 (CH), 127 (Cquat), 135 (CH), 159 (Cquat), 166 (Cquat). ESI/MS (포지티브 모드): m/z = 253.11 ([M+H]+, 100%), 254.11 ([M+H]+, 13%), 255.11 ([M+H]+, 2%), 527.19 ([2M+Na+], 48%). C13H16O5.1/3H2O에 대해 계산된 원소 분석: C, 60.46, H, 6.50. 실측: C, 60.63, H, 6.29.
화합물 2는 76%의 수율로 EtOH 중 KOH에 의한 화합물 1의 제어된 비누화에 의해 수득되었다.
TLC: Rf = 0.70 (SiOH, DCM/MeOH: 9/1). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.42 (t, J = 7.1 Hz, 3H, CH3), 4.05 (s, 3H, CH3), 4.43 (q, J = 7.1 Hz, 2H, CH2), 7.3 (t, J = 7.8 Hz, 1H, Har), 8.08 (dd, J = 7.8 Hz, 1.9 Hz, 1H, Har), 8.30 (dd, J = 7.8 Hz, 1.8 Hz, 1H, Har).
화합물 3은 EDCI 및 아세토니트릴 중 HOBt를 사용하여 트리에틸아민의 존재 하에 1,3-디아미노-2-프로판올과 화합물 2를 펩티드 커플링하여 74% 수율로 수득하였다.
TLC: Rf = 0.51 (SiOH, DCM/MeOH: 95/5). 1H-NMR(400 MHz, CDCl3) δ 1.42 (t, J = 7.1 Hz, 6H, CH3), 3.53 - 3.60 (m, 2H, CH2), 3.69 - 3.76 (m, 2H, CH2), 4.00 (s, 6H, CH3), 4.02 - 4.06 (m, 1H, CH), 4.25 (d, J = 4.1 Hz, 1H, OH), 4.41 (q, J = 7.1 Hz, 4H, CH2), 7.27 (t, J = 7.7 Hz, 2H, Har), 7.93 (dd, J = 7.7 Hz, 1.9 Hz, 2H, Har), 8.23 (dd, J = 7.9 Hz, 1.9 Hz, 2H, Har), 8.36 (t, J = 5.9 Hz, 2H, NH). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14 (CH3), 44 (CH2), 62 (CH2), 64 (CH3), 72 (CH), 124 (CH), 126 (Cquat), 127 (Cquat), 135 (CH), 136 (CH), 158 (Cquat), 166 (Cquat), 166 (Cquat). IR (cm-1, ATR) ν 3376, 2940, 1723, 1642, 1525, 1417, 1255, 1131. ESI/MS (포지티브 모드): m/z = 503.20 ([M+H]+, 100%), 504.20 ([M+H]+, 21%), 505.20 ([M+H]+, 3%), 1027.33 ([2M+Na+], 27%). C25H30N2O9, 1H2O에 대해 계산된 원소 분석: C, 57.69, H, 6.20, N, 5.38. 실측: C, 57.88, H, 5.89, N, 5.85.
화합물 4는 1시간 동안 78℃에서 화합물 3, 칼륨 t-부타노에이트 및 THF 중 t-부틸브로모아세테이트를 사용하여 윌리엄슨(Williamson) 유형 친핵성 치환에 의해 정제 후 51% 수율로 수득되었다.
TLC: Rf = 0.66 (SiOH, DCM/MeOH: 95/5). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.42 (t, J = 7.2 Hz, 6H, CH3), 1.47 (s, 9H, CH3), 3.46 - 3.52 (m, 2H, CH2), 3.77 - 3.82 (m, 1H, CH), 3.84 - 3.92 (m, 2H, CH2), 3.98 (s, 6H, CH3), 4.16 (s, 2H, CH2), 4.41 (q, J = 7.2 Hz, 4H, CH2), 7.25 (t, J = 7.8 Hz, 2H, NH), 7.91 (dd, J = 7.4 Hz, 1.9 Hz, 2H, Har), 8.20 (dd, J = 8.0 Hz, 1.6 Hz, 2H, Har), 8.40 (t, J = 5.8 Hz, 2H, Har). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14 (CH3), 28 (CH3), 40 (CH2), 61 (CH2), 64 (CH3), 68 (CH), 78 (CH2), 82 (Cquat), 124 (CH), 126 (Cquat), 128 (Cquat), 135 (CH), 136 (CH), 158 (Cquat), 165 (Cquat), 166 (Cquat), 170 (Cquat). IR (cm-1, ATR) ν 3376, 2980, 1725, 1653, 1518, 1417, 1255, 1125, 994. ESI/MS (포지티브 모드): m/z = 617.27 ([M+H+], 100%), 618.27 ([M+H+], 35%), 619.27 ([M+H+], 9%), 620.28 ([M+H+], 1%). C31H40N2O11에 대해 계산된 원소 분석: C, 60.38, H, 6.54, N, 4.83. 실측: C, 60.69, H, 6.53, N, 4.83.
화합물 5는 50℃에서 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산을 사용하여 t-부틸 에스테르기의 탈보호에 의해 70% 수율로 수득되었다.
TLC: Rf = 0.37 (SiOH, DCM/MeOH: 95/5). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.37 (t, J = 7.1 Hz, 6H, CH3), 3.50 - 3.54 (m, 2H, CH2), 3.78 - 3.82 (m, 3H, CH; CH2), 3.91 (s, 6H, CH3), 4.27 (s, 2H, CH2), 4.36 (q, J = 7.2 Hz, 4H, CH2), 7.21 (t, J = 7.7 Hz, 2H, Har), 7.88 (dd, J = 7.7 Hz, 1.6 Hz, 2H, Har), 8.14 (dd, J = 7.8 Hz, 1.6 Hz, 2H, Har), 8.49 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NH). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14 (CH3), 40 (CH2), 62 (CH2), 64 (CH3), 67 (CH), 78 (CH2), 124 (CH), 126 (Cquat), 128 (Cquat), 135 (CH), 136 (CH), 158 (Cquat), 165 (Cquat), 166 (Cquat), 173 (Cquat, C15). IR (cm-1, ATR) ν 3370, 2982, 2941, 1722, 1646, 1525, 1417, 1257, 1130, 992. ESI/MS (포지티브 모드): m/z = 561.21 ([M+H+], 100%), 562.21 ([M+H+], 27%), 563.21 ([M+H+], 7%), 564.21 ([M+H+], 1%), 1143.39 ([2M+Na+], 97%). C27H32N2O11.CH3OH에 대해 계산된 원소 분석: C, 56.75, H, 6.12, N, 4.73. 실측: C, 57.09, H, 5.93, N, 5.13.
화합물 6은 0℃에서 EDCI 및 아세토니트릴 중 HOBt를 사용하여 5와 t-부틸-6-아미노헥실카르바메이트 사이의 펩티드 커플링에 의해 61% 수율로 수득되었다.
TLC: Rf = 0.69 (SiOH, DCM/MeOH : 9/1). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.29 - 1.30 (m, 4H, CH2), 1.40 - 1.42 (m, 17H, CH3; CH2; CH3), 1.47 - 1.53 (m, 2H, CH2), 3.06 (q, J = 3.06 Hz, 2H, CH2), 3.25 (q, J = 6.7 Hz, 2H, CH2), 3.68 - 3.74 (m, 5H, CH; CH2; CH2), 3.95 (s, 6H, CH3), 4.11 (s, 2H, CH2), 4.40 (q, J = 7.1 Hz, 4H, CH2), 4.58 (s, 1H, NH), 7.07 (t, J = 5.6 Hz, 1H, NH), 7.27 (t, J = 7.8 Hz, 2H, Har), 7.93 (dd, J = 7.7 Hz, 1.7 Hz, 2H, Har), 8.20 - 8.22 (m, 2H, Har), 8.26 (t, J = 6.0 Hz, 2H, NH). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14 (CH3), 26 (CH2), 27 (CH2), 29 (CH3), 30 (CH2), 30 (CH2), 39 (CH2), 40 (CH2), 40 (CH2), 62 (CH2), 64 (CH3), 70 (CH), 79 (CH2), 124 (CH),126 (Cquat), 128 (Cquat), 135 (CH), 136 (CH), 156 (Cquat), 158 (Cquat), 166 (Cquat), 166 (Cquat), 169 (Cquat). IR (cm-1, ATR) ν 3334, 2977, 2934, 2859, 1710, 1650, 1521, 1461, 1254, 1131, 995. ESI/MS (포지티브 모드): m/z = 781.36 ([M+Na+], 100%), 782.37 ([M+Na+], 45%), 783.37 ([M+Na+], 11%), 784.37 ([M+Na+], 2%), 1539.73 ([2M+Na+], 29%). C38H54N4O12에 대해 계산된 원소 분석: C, 60.14, H, 7.17, N, 7.38. 실측: C, 59.79, H, 7.36, N, 7.62.
화합물 7은 -78℃에서 디클로로메탄 중 BBr3을 사용하여 화합물 6의 보호기를 탈보호한 다음 EtOH 중 NaOH로 비누화하여 두 단계에 대해 80% 수율로 수득되었다.
TLC: Rf = 0.68 (C18, H2O (0.1% TFA/ACN (0.1% TFA): 8/2). 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ 1.05 - 1.15 (m, 4H, CH2), 1.27 (m, J = 7.2 Hz, 4H; CH2), 2.51 (t, J = 7.2 Hz, 2H, CH2), 3.07 (t, J = 7.1 Hz, 2H, CH2), 3.63 (dd, J = 14.4 Hz, 6.6 Hz, 2H, CH2), 3.75 (dd, J = 14.2 Hz, 4.2 Hz, 2H, CH2), 3.91 - 3.95 (m, 1H, CH), 4.22 (s, 2H, CH2), 6.63 (t, J = 7.6 Hz, 2H, Har), 7.46 - 7.48 (m, 2H, Har), 7.85 (dd, J = 7.8 Hz, 1.9 Hz, 2H, Har). 13C-NMR (100 MHz, D2O) δ 26 (CH2), 26 (CH2), 28 (CH2), 31 (CH2), 39 (CH2), 40 (CH2), 40 (CH2), 68 (CH2), 78 (CH), 115 (CH), 119 (Cquat), 127 (Cquat), 132 (CH), 133 (CH), 164 (Cquat), 170 (Cquat), 172 (Cquat), 177 (Cquat). IR (cm-1, ATR) ν 2940, 2857, 1660, 1592, 1540, 1433, 1256, 1190, 1157, 1130, 756. ESI/MS (포지티브 모드): m/z = 575.23 ([M+H+], 100%), 576.24 ([M+H+], 81%), 577.24 ([M+H+], 30%), 578.24 ([M+H+], 7%), 579.24 ([M+H+], 2%). C27H34N4O10.TFA.2H2O에 대해 계산된 원소 분석: C, 51.77, H, 5.66, N, 8.63. 실측: C, 51.40, H, 5.49, N, 8.34.
리간드 L1은 화합물 7과 p-페닐-비스이소티오시아네이트의 반응에 의해 88% 수율로 수득되었다.
TLC: Rf = 0.63 (C18, H2O (0.1% TFA/ACN)/(0.1% TFA): 6/4). 1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 1.20 - 1.27 (m, 4H, CH2), 1.37 (m, J = 6.9 Hz, 2H; CH2), 1.48 (m, J = 7.0 Hz, 2H, CH2), 3.06 (q, J = 6.5 Hz, 2H, CH2), 3.42 - 3.48 (m, 4H, CH2), 3.56 - 3.62 (m, 2H, CH2), 3.71 (m, J = 5.2 Hz, 1H, CH), 4.04 (s, 2H, CH2), 6.99 (t, J= 7.8 Hz, 2H, Har), 7.35 - 7.37 (m, 2H, Har), 7.55 - 7.57 (m, 2H, Har), 7.69 (t, J = 5.9 Hz, 1H, NH), 7.94 (dd, J = 7.8 Hz, 1.8 Hz, 2H, Har), 8.04 (dd, J = 7.8 Hz, 1.8 Hz, 2H, Har), 8.76 - 8.78 (m, 2H, NH), 9.76 (s, 1H, NH). 13C-NMR (100 MHz, DMSO) δ 27 (CH2), 29 (CH2), 30 (CH2), 39 (CH2), 41 (CH2), 44 (CH2), 46 (CH2), 69 (CH2), 79 (CH), 116 (Cquat), 119 (CH), 121 (Cquat), 123 (CH), 125 (Cquat), 127 (CH), 133 (Cquat), 134 (CH), 136 (CH), 140 (Cquat), 161 (Cquat), 166 (Cquat), 170 (Cquat), 172 (Cquat), 181 (Cquat). IR (cm-1, ATR) ν 3308, 2932, 2099, 1643, 1598, 1538, 1504, 1436, 1263, 1191, 1155, 759. ESI/MS (포지티브 모드): m/z = 767.2177 ([M+H+], 100%), 768.2203 ([M+H+], 44%), 769.2246 ([M+H+], 16%), 770.2179 ([M+H+], 4%), 771.2116 ([M+H+], 1%). C35H38N6O10S2.H2O에 대해 계산된 원소 분석: C, 53.56, H, 5.14, N, 10.71, S, 8.17. 실측: C, 53.33, H, 5.05, N, 10.42, S, 8.15.
리간드 L2는 트리에틸아민의 존재 하에 화합물 7을 DMF 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일-2-요오도아세테이트와 반응시켜 57% 수율로 수득되었다.
리간드 L3은 실온에서 2,5-디옥소피롤리딘-1-일-3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로파노에이트와 N-메틸모르폴린을 함유하는 DMF 중 화합물 7의 반응에 의해 53% 수율로 수득되었다.
리간드 L4의 합성:
청구된 리간드 L4는 하기 합성 단계를 따라 하기 중간 화합물 1, 2, 10 및 11과 함께 제조되었다:
화합물 1은 SOCl2를 사용하여 화합물 9를 에스테르화한 다음 과량의 티오닐 클로라이드를 증발시키고 Et3N의 존재 하에 EtOH와 반응시켜 68%의 전체 수율로 수득되었다.
화합물 10은 EDCI 및 트리에틸아민을 함유하는 아세토니트릴 중 HOBt를 사용하여 화합물 2와 t-부틸(2-(비스(2-아미노에틸)아미노)에틸)카바메이트의 펩티드 커플링에 의해 84% 수율로 수득되었다.
TLC: Rf = 0.40 (SiOH, DCM/MeOH: 95/5). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.33 (s, 9H, CH3), 1.37 (t, J = 7.2 Hz, 6H, CH3), 2.69 (t, J = 6 Hz, 2H, CH2), 2.77 (t, J = 6.2 Hz, 4H, CH2), 3.18 (td, 2H, J = 5.0 et 6.2 Hz, CH2), 3.54 (q, J = 6 Hz, 4H, CH2), 3.85 (s, 6H, CH3), 4.38 (q, J = 7.2 Hz, 4H, CH2), 7.19 (t, J = 7.8 Hz, 2H, Har), 7.86 (dd, J = 1.9 et 7.8 Hz, 2H, Har), 7.93 (t, J = 5.0 Hz, 1H, NH), 8.09 (dd, J = 1.9 et 7.8 Hz, 2H, Har). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14 (CH3), 28 (CH3), 37 (CH2), 38 (CH2), 53 (CH2), 61 (CH2), 63 (CH2), 78 (Cquat),124 (Cquat), 125 (Cquat), 128 (CH), 134 (CH), 135 (CH), 155 (Cquat), 157 (Cquat), 164 (Cquat), 165 (Cquat). ESI/MS (포지티브 모드): m/z = 659.33 ([M+H+], 100%), 660.33 ([M+2H+], 40%), 661.33 ([M+3H+], 12%), 662.34 ([M+4H+], 4%). C33H46N4O10.H2O에 대해 계산된 원소 분석: C, 58.56, H, 7.15, N, 8.28. 실측: C, 58.80, H, 6.89, N, 5.91.
화합물 11은 -78℃로 CH2Cl2 중 BBr3을 사용한 다음, 물/메탄올 혼합물에서 NaOH를 사용하여 증발 및 비누화하는 2단계로 60% 전체 수율로 수득되었다.
TLC : Rf = 0.30 (C18, H2O (0.1% TFA)/ACN (0.1% TFA): 8/2. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ 2.59 (m, 4H, CH2), 2.72 (t, J = 5.0 Hz, 4H, CH2), 3.42 (t, J = 5.0 Hz, 4H, CH2), 6.43 (t, J = 7.7 Hz, 2H, Har), 7.25 (dd, J = 1.8 et 7.7 Hz, 2H, Har), 7.69 (dd, J = 1.8 et 7.7 Hz, 2H, Har). 13C-NMR (100 MHz, D2O) δ 37 (CH2), 38 (CH2), 51 (CH2), 54 (CH2), 117 (Cquat), 118 (Cquat), 119 (CH), 133 (CH), 134 (CH), 159 (Cquat), 167 (Cquat), 174 (Cquat). ESI/MS (포지티브 모드): m/z = 475.18 ([M+H+], 100%), 476.18 ([M+2H+], 28%), 477.18 ([M+3H+], 6%), 949.36 ([2M], 6%).
리간드 L4는 0℃에서 화합물 11을 Et3N을 함유하는 DMF 중 N-숙신이미딜 3-말레이미도프로피오네이트와 반응시켜 20% 수율로 수득되었다.
TLC: Rf = 0.30 (C18, H2O (0.1% TFA)/ACN (0.1% TFA): 7/3. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ 2.35 (t, J = 5.8 Hz, 2H, CH2), 2.74 (t, J = 6.5 Hz, 2H, CH2), 2.83 (t, J = 7.0 Hz, 4H, CH2), 3.30 (t, J = 5.8 Hz, 2H, CH2), 3.35 (t, J = 6.5 Hz, 2H, CH2), 3.50 (t, J = 7.0 Hz, 4H, CH2), 5.97 (s, 2H, CH=CH), 6.48 (t, J = 7.2 Hz, 2H, Har), 7.30 (d, J = 7.2 Hz, 2H, Har), 7.75 (d, J = 7.2 Hz, 2H, Har). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 22 (CH2), 23 (CH2), 23.5 (CH2), 24 (CH2), 39 (CH2), 40 (CH2), 99 (Cquat), 106 (Cquat), 111 (CH),117 (CH), 119 (CH), 123 (CH=CH), 154 (Cquat), 158 (Cquat), 161 (Cquat), 162 (Cquat), 166 (Cquat).
리간드 L5의 합성
리간드 L5는 아래 합성 단계에 따라 제조되었다:
리간드 L5의 합성은 단계 a에서 요오드화 메틸(MeI) 및 탄산 칼륨(K2CO3)의 존재 하에 SN2 친핵성 치환에 의해 화합물 12에 대응하는 2,4,6-트리메틸페놀의 알코올 기능을 보호하는 것으로 시작되었고, 97%의 수율이었다.
제2 단계 b는 단계 a에서 얻은 화합물 13의 3개의 메틸기를 H2O 중 KMnO4 및 KOH로 산화시키는 것이었다. 단계 b의 수율은 62%였다.
합성의 마지막 단계 c는 HBr/AcOH(50/50) 용액의 존재 하에 O-탈메틸화에 의한 화합물 14의 페놀레이트 기능의 탈보호였다. 리간드 L5는 침전 및 원심 분리에 의해 60%의 수율로 얻었다.
리간드 L6의 합성
리간드 L6은 아래 합성 단계에 따라 제조되었다:
화합물 2가 티오닐 클로라이드에 용해된다. 용액은 5시간 동안 90℃에서 가열된다. 증발 후 에탄올아민 및 증류된 트리에틸아민이 첨가된다. 조 생성물이 추출된다. 실리카겔을 사용하여 FPLC에 의해 정제한 후, 화합물 15를 얻었다.
TLC: 0.3 (SiOH, DCM/MeOH); NMR 1 H: (400 MHz, CDCl3) δ 1.41 (t, J = 7.1 Hz, 3H, CH3), 3.64 (q, J = 5.2 Hz, 2H, CH2), 3.84 (t, J = 5.1 Hz, 2H, CH2), 3.91 (s, 3H, CH3), 4.40 (q, J = 7.1 Hz, 2H, CH2), 7.27 (t, J = 7.8 Hz, 1H, Har), 7.92 (dd, J = 7.7 Hz, 1.9 Hz, 1H, Har), 8.17 - 8.21 (m, 1H, NH), 8.22 (dd, J = 7.8 Hz, 1.9 Hz, 1H, Har). NMR 13 C: (100 MHz, CDCl3) δ 14 (CH3), 43 (CH2), 62 (CH2), 62 (CH2), 64 (CH3), 124 (CH), 126 (Cquat), 128 (Cquat), 135 (CH), 135 (CH), 158 (Cquat), 166 (Cquat), 166 (Cquat). ESI + /MS: m/z = 268.12 ([M+H+], 82%), 557.21 ([2M+H+]). C13H17NO5, 1/3 H2O에 대해 계산된 원소 분석: C, 57.14, H, 6.52, N, 5.13. 실측: C, 57.14, H, 6.54, N, 5.14.
화합물 15가 BBr3을 사용하여 DCM에서 용해된다. 조 생성물이 EtOH에 용해되었다. NaOH가 5 mL의 H2O에 용해되었다. 이 염기성 용액이 혼합물에 첨가되었다. 불용성 부분은 여과에 의해 제거되었다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 리간드 L6을 얻었다.
TLC: 0.87 (C18, H2O/MeOH); NMR 1 H: (400 MHz, H2O+NaOD) δ 3.56 (t, J = 5.6 Hz, 2H, CH2), 3.77(t, J = 5.6 Hz, 2H, CH2), 6.97 (t, J = 7.6 Hz, 1H, Har), 7.90 - 7.98 (m, 2H, Har). NMR 13 C: (100 MHz, CDCl3) 41 (CH2), 61 (CH2), 112 (CH), 119 (Cquat), 130 (CH), 131 (CH), 133 (Cquat), 166 (Cquat), 171 (Cquat), 179 (Cquat). ESI - /MS: m/z = 224.07 ([M-H+], 100%. C10H11NO5, 3/4 H2O에 대해 계산된 원소 분석: C, 50.32, H, 5.28, N, 5.87. 실측: C, 50.10, H, 4.97, N, 5.77.
리간드 L7의 합성
리간드 L7은 아래 합성 단계에 따라 제조되었다:
Fmoc-Lys(Boc)-OH가 트리플루오로아세트산에 용해된다. 용액은 실온에서 밤새 교반된다. 용액을 감압하에 증발시켜 화합물 16을 얻었다.
NMR 1 H: (400 MHz, MeOD) δ 1.42 - 1.53 (m, 2H), 1.61 - 1.77 (m, 3H), 1.86 - 1.95 (m, 1H), 2.92 (t, J = 7.2 Hz, 2H, CH2), 4,15 - 4.19 (m, 1H), 4.23 (t, J = 6.9 Hz, 1H, CH), 4.32 - 4.36 (m, 1H), 4.39 - 4.44 (m, 1H), 7.29 - 7.33 (m, 2H, Har), 7.37 - 7.42 (m, 2H, Har), 7.65 -7.70 (m, 2H, Har), 7.79 - 7.82 (2H, Har).
화합물 16이 에틸 3-(클로로카르보닐)-2-메톡시벤조에이트 및 디이소프로필에틸아민을 사용하여 증류된 THF(100 mL)에 용해된다. 반응이 H2O(20 mL)로 켄칭되고 용매가 감압 하에 증발되었다. 화합물 17을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
NMR 1 H: (400 MHz, MeOD) δ 1.36 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 1.48 - 1.82 (m, 5H), 1.86 - 1.97 (m, 1H), 3.41 (t, J = 6.3 Hz, 2H, CH2), 3.84 (s, 3H, CH3), 4,15 - 4.22 (m, 2H), 4.28 - 4.40 (m, 4H), 7.21 - 7.31 (m, 3H, Har), 7.35 - 7.40 (m, 2H, Har), 7.64 -7.69 (m, 2H, Har), 7.76 - 7.84 (4H, Har).
화합물 18이 고체 지지체에 의해 합성되었다. 화합물 18은 BBr3으로 탈보호되었다. 조 생성물이 EtOH에 용해되었다. NaOH가 H2O에 용해되었다. 이 염기성 용액이 혼합물에 첨가되었다. 불용성 부분은 여과에 의해 제거되었다. 여액을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 L7을 얻었다.
ESI - /MS 고 분해능: m/z = 679.2808 ([M+2H+]/2, 100%), 1357.5484 ([M+H+], 88%)
리간드 L8의 합성
리간드 L8은 아래 합성 단계에 따라 제조되었다:
상기와 같이 2-메톡시이소프탈산의 카르복실산이 티오닐 클로라이드에 의해 활성화되었고, 용매 증발 후 트리에틸아민과 함께 에탄올을 첨가하여 디에스테르(1)을 형성하였다.
1 H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.87 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.16 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.35 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 3.89 (s, 3H), 1.36 (t, J = 7.1 Hz, 6H).
13 C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ 165.7, 159.3, 134.7, 127.1, 123.4, 63.6, 61.3, 14.2.
ESI + /MS: m/z = 253,11 ([M+H]+, 100%), 254,11 ([M+H]+, 13%), 255,11 ([M+H]+, 2%), 527,19 ([2M+Na+], 48%).
C13H16O5, 1/3H2O에 대해 계산된 원소 분석: C, 60,46, H, 6,50. 실측: C, 60.63, H, 6.29.
제2 단계는 단일 당량의 NaOH에 의해 고전적인 비누화를 행하여 추출 후 모노산(2)울 얻는 것이다.
1 H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,42 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 4,05 (s, 3H), 4,43 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 7,33 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 8,08 (dd, J = 7,8 Hz, 1,9 Hz, 1H), 8,30 (dd, J = 7,8 Hz, 1,8 Hz, 1H).
13 C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 166.2, 165.3, 160.5, 137.4, 137.1, 126.7, 125.5, 124.3, 64.4, 62.1, 14.2.
ESI + /MS: m/z = 247,06 ([M+Na]+, 100%), 248,06 ([M+Na]+, 14%), 249,06 ([M+Na]+, 2%), 471,12 ([2M+Na+], 47%).
C11H12O5에 대해 계산된 원소 분석: C, 58,93, H, 5,40. 실측: C, 58.93, H, 5.44.
병렬적으로, 헥사메틸렌디아민 링커의 보호가 디-tert-부틸 디카보네이트로 실현되어 tert-부톡시카르보닐(BOC)기를 가져 화합물 19를 얻었다.
1 H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.64 (s, 1H), 3.08 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 2.65 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.46 (dd, J = 10.2, 3.4 Hz, 4H), 1.41 (s, 9H), 1.30 (d, J = 3.3 Hz, 4H), 1.15 (s, 2H).
13 C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ 155.9, 78.9, 42.0, 33.6, 30.0, 28.3, 26.59.
ESI + /MS (H2O + HCOOH): m/z 459.35 ([2MNaH+H] +, 100 %).
C11H24N2O2에 대해 계산된 원소 분석: C, 61.35, H, 10.77, N, 13.01. 실측: C, 61.54, H, 9.01, N, 13.25. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDCI) 및 히드록시벤조트리아졸(HOBt)이 모노에스테르 3-(에톡시카르보닐)-2-메톡시벤조산(2)과 함께 용액에 첨가되어 카르복실 기능을 활성화하고 보호된 링커를 갖는 아미드 결합(19)을 생성하였다. 정제 후 화합물 20을 얻었다.
1 H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.18 (dd, J = 7.8, 1.9 Hz, 1H), 7.88 (dd, J = 7.7, 1.9 Hz, 1H), 7.75 - 7.65 (m, 1H), 7.23 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.65 (s, 1H), 4.37 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.43 (td, J = 7.1, 5.7 Hz, 2H), 3.07 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 1.67 - 1.51 (m, 2H), 1.48 - 1.30 (m, 18H).
13 C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ 165.4, 164.6, 157.8, 155.9, 135.5, 134.2, 128.3, 125.5, 124.3, 78.9, 63.3, 61.3, 40.8, 39.6, 29.9, 29.4, 28.3, 26.6, 26.3, 14.1.
ESI + /MS: m/z = 423.25 ([M+H]+, 100 %); 424.25 ([M+H]+, 20 %); 425.25 ([M+H]+, 5 %); 845.48 ([2M+H]+, 45 %).
C22H34N2O4.0.5CH3CN에 대해 계산된 원소 분석: C, 62.34, H, 8.08, N, 7.90. 실측: C, 62.62, H, 7.71, N, 7.52.
단계 e의 경우, 화합물 21을 얻는 반응은 BBr3에 의한 페놀 및 아민의 탈보호에 이은 NaOH에 의한 에스테르의 탈보호이다.
1 H-NMR (300 MHz, MeOD): δ 8.11 (dd, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H), 6.96 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 3.43 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.94 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.66 (m, 4H), 1.52 - 1.39 (m, 4H).
13 C-NMR (75 MHz, MeOD): δ 174.2, 167.6, 161.8, 137.1, 135.4, 121.6, 119.59, 117.0, 40.7, 40.5, 30.2, 28.4, 27.4, 27.0.
ESI + /MS: m/z = 281.15 ([M+H] +, 100 %); 282.15 ([M+H] +, 18 %); 283.16 ([M+H] +, 2 %).
C14H20N2O4.0.5D2O.0.5MeOD에 대해 계산된 원소 분석: C, 56.79, H, 6.90, N, 9.13. 실측: C, 56.90, H, 6.52, N, 9.20.
생성물(21) 상의 유리 카르복실산 및 유리 아민으로, 링커 상의 아민의 활성화가 이후 커플링을 촉진하기 위해 필요하다. 선택은 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트를 사용하여 1차 아민을 활성화된 카바메이트 L8로 변경하는 것이다.
1 H-NMR (300 MHz, MeOD): δ 8.16 (dd, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H), 7.95 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.03 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 3.44 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.20 (m, 2H), 2.80 (s, 4H), 1.62 (m, 4H), 1.44 (m, 4H).
13 C-NMR (75 MHz, MeOD): δ 173.6, 172.6, 167.1, 161.3, 154.0, 137.9, 135.3, 122.1, 120.2, 115.0, 56.8, 42.5, 40.7, 30.3, 27.6, 27.3, 26.4.
ESI + /MS: m/z = 422.16 ([M+H]+, 100 %); 423.16 ([M+H]+, 24 %); 424.16 ([M+H]+, 5 %).
원소 분석 C19H23N3O8.0.5Et3N+Cl-: C, 56.10, H, 5.98, N, 9.54. 실측: C, 56.10, H, 5.96, N, 10.12.
리간드 L9의 합성
리간드 L9는 아래 합성 단계에 따라 제조되었다:
켈리담산에서 시작하여, 합성의 제1 단계는 티오닐 클로라이드에 의해 4-옥소 위치를 사용하여 로비손(Robison)의 방법에 의해 카르복실산을 활성화하고 EtOH로 에스테르화하여 디에틸 4-클로로피리딘-2,6-디카르복실레이트(22)를 형성하는 것이다. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.24 (s, 2H), 4.47 (q, J =6.8 Hz, 4H), 1.43 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
13 C-NMR (101MHz, CDCl3): δ 163.6, 149.7, 146.6, 128.1, 63.3, 14.2.
염화물이 초음파 하에서 다량의 요오드화 나트륨 및 염화 아세틸의 존재 하에 요오드화물(23)에 의해 대체된다.
1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.52 (s, 2H), 4.35 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 1.32 (t, J = 7.2 Hz, 6H).
HRMS (MALDI-TOF): m/z = 349.66 ([M+H]+), 371.63 ([M+Na]+), 720.79 ([2M+Na]+).
소노가시라(Sonogashira) 커플링이 사용되어 구조(24)에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0), 요오드화 구리(I), 트리에틸아민 및 트리메틸실릴아세틸렌(TMS-아세틸렌)과 함께 아세틸렌기를 추가한다.
1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.23 (s, 2H), 4.47 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 1.43 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 0.27 (s, 9H).
13 C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ 164.6, 149.2, 134.4, 130.2, 103.7, 100.9, 62.9, 14.6, 0.0.
HRMS (MALDI-TOF): m/z = 320.07 ([M+H] +).
정제 후, 트리메틸실릴기가 THF 중 테트라-N-부틸암모늄 플루오라이드(TBAF)에 의해 탈보호되어 화합물 25를 수득할 수 있다.
1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.27 (s, 2H), 4.47 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 3.48 (s, 1H), 1.43 (t, J = 7.1 Hz, 6H)
HRMS (MALDI-TOF): m/z = 248.00 ([M+H]+).
화합물 26이 화합물 25와 4-요오도벤조산 사이의 소노가시라 커플링에 의해 수득된다.
1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.29 (s, 2H), 7.37 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.65 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.11 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 1.24 (t, J = 7.1 Hz, 6H).
HRMS (MALDI-TOF): m/z = 367.39 ([M+H]+), 389.96 ([M+Na]+).
합성의 마지막 단계는 NaOH에 의해 에스테르를 비누화하여 리간드 L9를 생성하는 것이다.
1 H-NMR (400 MHz, D2O): δ 8.08 (s, 2H), 7.86 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 8.3 Hz, 2H).
13 C-NMR (101 MHz, D2O): δ 174.8, 169.3, 152.9, 136.9, 133,2, 131.7, 128.8, 126.7, 123.9, 98.8, 84.2.
HRMS (MALDI-TOF): m/z = 311.94 ([M+H]+).
스트렙타비딘에 의한 리간드 L1의 생체 기능화:
스트렙타비딘은 비오틴과 매우 강한 친화성을 갖는 4량체 단백질이다. 생명 공학에서 자주 사용되는 이러한 강한 상호 작용은 항원과 항체 간의 상호 작용과 같은 생물학적 강한 상호 작용의 전형적인 예를 나타낸다.
이 실시예에서, 리간드 L1은 비오틴을 고정할 수 있는 초광도 발광성 나노 입자를 제조하기 위한 목적으로 스트렙타비딘을 라벨링하는 데 사용되었다.
스트렙타비딘은 10 당량의 화합물 L1의 존재 하에 완충된 수용액에서 실온에서 표시되었다. 표시된 스트렙타비딘은 크기 배제 필터(형식 Millipore, 컷오프 10 kDa)에서 원심 분리에 의해 정제되었다. 스트렙타비딘의 라벨링 속도(스트렙타비딘에 의한 리간드 L1의 수)는 UV-가시광 흡수에 의해 결정되었으며, 여기서 표시된 스트렙타비딘의 스펙트럼은 스트렙타비딘 단독과 리간드 1의 스펙트럼의 선형 조합인 것으로서 디콘볼루션되었다(deconvoluted). 스트렙타비딘에 의한 2.1 리간드의 라벨링 속도가 얻어졌다.
마투주맙 항체에 의한 리간드 L1의 생체 기능화:
마투주맙 항체는 일부 암(폐, 식도, 위 등)에서 과발현되는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 특이적으로 인식하는 인간 단일 클론 항체이다. 마투주맙에 의해 표시된 발광성 나노 입자는 표피 성장 인자 수용체의 발광 현미경 영상화 또는 형광 면역에 의한 용액에서의 그것의 검출에 사용될 수 있다.
이 실시예에서, 리간드 L1은 표피 성장 인자 수용체를 고정할 수 있는 초광도 발광성 나노 입자를 제조하기 위한 목적으로 마투주맙 항체를 라벨링하는 데 사용되었다.
DMSO 중의 3.23 mM 리간드 L1 용액 13.2 μL가 1 mg.mL-1(128 μM)의 마투주맙 함유 용액 10.4 μL 및 pH 9.0 탄산염 완충액 176 μL에 첨가되었다(비율 L1/마투주맙 = 32/1). 샘플이 혼합되고 알루미늄 시트에 배치된 다음, 규칙적인 교반과 함께 실온에서 4시간 30분 동안 배양되었다. 초원심분리, 용리 및 pH 8.04 TRIS/HCl 완충액으로의 헹굼에 의해 정제한 후, 80 μL 부피의 최종 용액을 얻었다. 최종 용액은 TRIS/HCl 완충액으로 5배 희석되었다.
항체 및 리간드 농도는 UV-가시광 흡수 분광법에 의해 결정되었다. 1.49 μM의 항체 농도 및 항체에 의한 2.9 내지 3.0 리간드의 라벨링 비율이 얻어졌다.
펩티드 KLVFF에 의한 리간드 L8의 생체 기능화:
펩티드 KLVFF는 아밀로이드 섬유의 형성을 담당하는 아미노산 서열이다. 이 펩티드는 형성에서 아밀로이드 섬유의 특징적인 구조인 β-시트로 접히고 시냅스와 더 나은 상호 작용을 제공하는 영역에서 발견되기 때문에 선택되었다. 이러한 β-아밀로이드 섬유가 해마에서 상당히 응집된다는 것이 공지되어 있으므로, 계획은 펩티드 KLVFF(도 25)로 이러한 섬유를 특이적으로 표적으로 삼아 알츠하이머병의 조기 진단을 하는 것이다.
이 실시예에서, 펩티드 KLVFF는 β-아밀로이드 섬유를 고정할 수 있는 초광도 발광성 나노 입자를 생성하기 위한 목적으로 리간드 L8과 결합되었다.
펩티드 KLVFF(37 mg, 5.67x10-5 mol)가 1 mL의 DMSO에 용해되었고, 45 μL의 DIPEA 및 L8(41 mg, 9.73x10-5 mol)이 용액에 첨가되었다. 반응 혼합물은 실온에서 밤새 교반되었다. 용액은 C18(물/MeOH 구배 100에서 50/50까지) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 직접 정제되었다.
발광 분광법의 실험적 측정 방법:
UV-Vis 흡수 스펙트럼은 PerkinElmer lambda 950 분광기 또는 Jena Analytics의 Specord 분광기를 사용하여 1 cm 광학 경로 석영 수프라실(suprasil) 셀(Hellma)에 기록되었다.
발광 스펙트럼은 450W Xe 램프 및 Hamamatzu R928 적색 광전자 증배관을 사용하여 FLP920 Edinburgh Instrument 분광 광도계에서 기록되었다. 모든 스펙트럼은 공급자가 제공하는 도구 기능을 사용하여 보정되었다. 필요한 경우 399 nm 고역 통과 필터가 사용되어 2차 아티팩트(second order artifact)를 제거했다.
발광 양자 수율은, Eu 함유 나노 입자에 대한 기준으로서 물 중 [Ru(bipy)3Cl3]((Φ = 0.04, 문헌[Ishida, H. et al, Coord. Chem. Rev. 2010 , 254 (21), 2449-2458]), Tb 함유 나노 입자에 대한 기준으로서 비피리딘 Tb 복합체인 물 중 [TbL(H2O)](Φ = 0.31, 문헌[Weibel, N. et al, J. Am. Chem. Soc. 2004 , 126 (15), 4888-4896])을 사용하여 광학적으로 희석된 용액(광학 밀도 < 0.05)으로 문헌[Molecular Fluorescence: Principles and Applications, 2nd ed.; Valeur, B., Berberan-Santos, M. N., Eds.; Wiley-VCH: Weinheim, 2013]에 기재된 통상적인 절차에 따라 측정되었다.
양자 수율에 대한 추정 오차는 ±15%이다.
광도는 발광 양자 수율과 여기 파장에서의 몰 흡수 계수(비어-램버트(Beer-Lambert) 법칙을 흡수 스펙트럼에 적용하여 계산됨)의 곱으로 계산된다.
발광 수명은 10 Hz에서 작동하는 100W Xe 플래시 램프를 사용하여 MCS 모드로 동일한 기기 상에 기록되었으며, 시간 창은 측정된 최장 여기 상태 수명보다 적어도 5배 더 길었다. 여기 및 방출 슬릿은 전형적으로 5 nm 및 3 nm 개구에서 설정되었다. 여기 파장은 리간드의 존재 하에 나노 입자의 여기 스펙트럼의 최대에서 리간드의 함수로서 선택되었다. 최대 강도가 10,000 카운트에 도달했을 때 획득이 중지되었다.
수명에 대한 추정 오차는 ±10%이다.
모든 실험에서, 16 μL의 나노 입자 모액이 pH 7.0에서 1984 μL의 0.1 M TRIS/HCl 완충액으로 희석되었다. 그 다음, 나노 입자의 희석된 용액은 동일한 완충액에서 리간드의 5 x 10-4 M 용액을 증가하는 양으로 첨가하여 적정되었다.
실험 결과:
이미 발표한 바와 같이, 본 발명은 여기 상태 수명의 면에서 탁월한 결과를 제공한다.
이러한 유리한 결과는 위에서 상세히 설명된 측정 방법에 따라 본 발명에 따른 나노 입자의 여러 실시예들에서 실현된 실험 측정에 의해 입증되었다.
이들 화합물의 수성 매질 τ에서의 여기 상태 수명은 리간드 L5 흡수에 대응하는 λexc = 330 nm의 파장에서 여기 후 695 nm에서 유로퓸 이온의 방출에 대해 측정되었다.
얻어진 결과는 아래 표 2에 수집되어 있다:
측정된 실시예 화합물 각각에 대해, 측정된 최장 여기 상태 수명(τ 2 또는 τ 3 )은 가장 많이 나노 입자 코어에 존재하는 유로퓸 이온의 방출에 대응하는 반면, 최단의 수명(τ 1 )은 나노 입자 코어의 표면에 존재하는 덜 많은 유로퓸 이온의 방출에 대응한다.
관찰할 수 있는 바와 같이, 측정된 최장 여기 상태 수명(τ 2 또는 τ 3 )은 항상 3 ms 또는 5 ms의 발표된 값보다 상당히 높으며 심지어 바람직한 값 7 ms보다 우수하다. 따라서 이는 종래 기술에서 기재된 여기 상태 수명보다 상당히 높다.
또한, 종래 기술에서 얻지 못한 이러한 탁월하게 긴 여기 상태 수명 측정 값은, 각 원소의 여기 상태 수명에 대한 최대 도달 가능 값을 구성하는, 이 원소에 대한 계산된 이론적 값인 유로퓸의 방사 수명의 이론적 값에 매우 가깝다.
유로퓸 수성 이온의 경우, 이 방사 수명 이론 값은 문헌[Bunzli, J.C. G. Chem. Rev. 2010, 110, 2731]의 종래 기술에 개시된 바와 같이 9.7 ms에 대응한다.
더욱이, 본 발명에 따른 나노 입자의 이러한 탁월하게 긴 여기 상태 수명은 나노 입자의 광도를 희생시키면서 얻어지는 것이 아니다. 실제로, 중요한 광도 값들이 또한 위에서 상세하게 설명된 측정 방법에 따라 본 발명에 따른 화합물에 대해 측정되었다.
측정된 광도 결과는 아래 표 3에 수집되어 있다:
다시 말하자면, 측정된 값들은 본 발명에 따른 나노 입자가 104 M-1.cm-1(적어도 3배) 또는 105 M-1.cm-1의 발표된 값보다 상당히 높은 광도를 가지고, 심지어 106 M-1.cm-1의 바람직한 값보다 우수하며, 따라서 종래 기술에 개시된 란타나이드계 라벨의 광도보다 훨씬 더 양호하다는 것을 보여준다.
위에서 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 발광성 란타나이드 나노 입자는 기술적 문제에 대해 종래 기술에서 제안된 것보다 훨씬 더 효과적인 해결책을 제공한다.
명백하게도, 본 발명은 위에서 설명되고 다양한 도면에 도시된 바람직한 실시형태로 제한되지 않으며, 당업자는 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 틀 및 범위를 벗어나지 않고 수많은 변형을 하고 다른 실시형태를 상상할 수 있다.
Claims (11)
- 향상된 광도 및 증가된 여기 상태 수명을 동시에 갖고, 테르븀을 포함하는 란타나이드 이온 나노 입자, 및 란타나이드 이온 나노 입자의 표면에 결합된 발색단 리간드의 여러 분자를 포함하는 발광성 란타나이드 나노 입자에 있어서,
- 상기 란타나이드 이온 나노 입자는 테르븀 이온, 및 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 사마륨, 유로퓸, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 툴륨 및 이테르븀으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 제2 란타나이드의 이온을 포함하고;
- 상기 리간드는 화학식 I 또는 화학식 II의 발색단 라디칼을 적어도 하나 포함하는 유기 분자이며:
상기 식에서 R은 H, CN기 또는 COOH기 중에서 선택되는, 발광성 란타나이드 나노 입자. - 제1항에 있어서, 상기 제2 란타나이드는 유로퓸, 사마륨, 디스프로슘 및 이테르븀으로부터 선택되며, 바람직하게는 유로퓸인, 발광성 나노 입자.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 란타나이드 이온 나노 입자는 란탄, 루테튬 및 가돌리늄 중에서 선택되며, 바람직하게는 란탄인 제3 란타나이드의 이온을 추가로 포함하는, 발광성 나노 입자.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 란타나이드 이온 나노 입자는 10 내지 99.9 몰%, 바람직하게는 50 내지 99.9 몰%, 더욱 바람직하게는 75 내지 99.9 몰%의 테르븀 이온 및 0.1 내지 90 몰%, 바람직하게는 0.1 내지 50 몰%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 25 몰%의 제2 란타나이드 이온을 함유하는, 발광성 나노 입자.
- 제3항에 있어서, 상기 란타나이드 이온 나노 입자는 1 내지 98.9 몰%, 바람직하게는 10 내지 98 몰%, 더욱 바람직하게는 40 내지 98 몰%의 테르븀 이온, 0.1 내지 20 몰%, 바람직하게는 0.5 내지 10 몰%, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 몰%의 제2 란타나이드 이온, 및 1 내지 90.9 몰%, 바람직하게는 10 내지 80 몰%, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 몰%의 제3 란타나이드를 함유하는, 발광성 나노 입자.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 n개의 발색단 라디칼 및 스페이서 기를 포함하고, 상기 스페이서 기는 발색단 라디칼을 함께 연결하는 탄소 사슬을 함유하는 헤테로 원자이고, n은 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 6, 더욱 바람직하게는 2 내지 3의 정수인, 발광성 나노 입자.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 분석적 관심의 캐리어 분자에 공유 결합될 수 있는 그래프팅 기능을 추가로 포함하는, 발광성 나노 입자.
- 제7항에 있어서, 상기 발광성 나노 입자는 적어도 하나의 리간드 분자에 공유적으로 부착된 분석적 관심의 캐리어 분자를 추가로 포함하는, 발광성 나노 입자.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 분석적 관심의 캐리어 분자는 펩티드, 단백질, 항체, 항체 모이어티, 2000 g.mol-1 미만의 분자량의 소분자, 비오틴, 데스티오비오틴, 스트렙타비딘 및 마투주맙 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 발광성 나노 입자.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발광성 나노 입자는 각각 3 ms 및 104 M-1.cm-1 보다 동시에 우수하고, 바람직하게는 각각 5 ms 및 105 M-1.cm-1 보다 동시에 우수하며, 보다 바람직하게는 각각 7 ms 및 106 M-1.cm-1 보다 동시에 우수한 광도 및 여기 상태 수명을 갖는 것을 특징으로 하는 발광성 나노 입자.
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