JP2021533180A - 植物を改変するための方法及び組成物 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）（例えば、植物細胞外小胞（ＥＶ）又はそれらの断片、部分若しくは抽出物を含む）を含む植物改変組成物であって、ＰＭＰは、植物改変剤を含み、植物改変剤は、異種ＲＮＡを含む、植物改変組成物が開示される。本明細書の組成物は、植物の適応度を増加させるため等、植物を改変するための方法において有用であり、植物の適応度の増加は、発生、増殖、収量、非生物的ストレッサーに対する耐性又は生物的ストレッサーに対する耐性の増加を含む。【選択図】なし

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年８月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、５１２９６−００４ＷＯ３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿０８．２３．１９＿ＳＴ２５という名称であり、サイズが１２，１３６バイトである。
農業では、所望の植物改変を誘導するための植物への生物活性剤の送達は、多数の方法で妨害され得る。例えば、核酸又はペプチド等の植物改変剤は、送達中の分解に対して感受性であり得る。さらに、植物改変剤は、植物を改変するために様々な植物部分、組織、維管束系及び／又は細胞に浸潤する必要がある。従って、当技術分野では、植物改変剤を植物に効果的に送達するための方法及び組成物が求められている。
本明細書では、植物改変剤を担持する複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物が開示される。本組成物は、植物の適応度の増加等の所望の植物の形質を導入する方法で植物を改変する薬剤を送達する方法において有用である。
第１の態様において、本明細書では、植物に異種ＲＮＡを投与する方法であって、複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む組成物を植物に送達するステップを含み、複数の各々は、異種ＲＮＡを含み、組成物は、植物の適応度を増加させるための有効な濃度で送達される、方法が提供される。
一部の実施形態では、異種ＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の成分であり、複数のＰＭＰの各々は、ＲＮＰを含む。
一部の実施形態では、ＰＭＰは、脂質再構成ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）である。
一部の実施形態では、異種ＲＮＡは、ＰＭＰによって封入される。
一部の実施形態では、ＰＭＰの各々は、精製された植物細胞外小胞（ＥＶ）を含む。
一部の実施形態では、組成物中のＰＭＰは、植物の形質を改変するために有効な濃度であり、改変は、植物の適応度を増加させる、例えば発生、増殖、収量、非生物的ストレッサーに対する耐性又は生物的ストレッサーに対する耐性を増加させる。一部の実施形態では、植物の適応度の増加は、開花時期の改変であり、植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の品質の向上、植物から収穫される産物の味、外観若しくは貯蔵期間の改善又は動物における免疫反応を刺激するアレルゲンの産生の低減である。
別の態様において、本明細書では、複数のＰＭＰを含む植物改変組成物であって、ＰＭＰは、植物改変剤を含む、植物改変組成物が提供される。一部の実施形態では、組成物中のＰＭＰは、植物の適応度等の植物の形質を改変するために有効な濃度である。一部の実施形態では、組成物中のＰＭＰは、植物の適応度を増加させるために有効な濃度である。
別の態様において、本明細書では、複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物であって、ＰＭＰは、植物改変剤を含み、及び組成物中のＰＭＰは、植物の形質を改変するために有効な濃度であり、改変は、植物の適応度を増加させる、植物改変組成物が提供される。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、適応度の増加は、発生、増殖、収量、非生物的ストレッサーに対する耐性又は生物的ストレッサーに対する耐性の増加である。一部の実施形態では、植物の適応度の増加は、疾患耐性、干ばつ耐性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、金属耐性、除草剤耐性、薬剤耐性、水利用効率、窒素利用、窒素ストレス耐性、窒素固定、病虫害抵抗性、草食動物耐性、病原体抵抗性、収量、水不足条件下の収量、活力、増殖、光合成能力、栄養、タンパク質含量、炭水化物含量、油含量、バイオマス、新芽長、根長、根の構造、結実、種子重、着果又は収穫可能な産物の量における増加である。一部の実施形態では、適応度の増加は、早期の開花である。一部の実施形態では、植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の品質の向上である。一部の実施形態では、植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の味、外観又は貯蔵期間の改善である。一部の実施形態では、適応度の増加は、動物における免疫反応を刺激するアレルゲンの産生の低減である。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、植物改変剤は、異種核酸である。
別の態様において、本明細書では、複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物であって、ＰＭＰは、異種核酸を含み、及び組成物中のＰＭＰは、植物を改変するために有効な濃度であり、改変は、植物の適応度を増加させる、植物改変組成物が提供される。
別の態様において、本明細書では、複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物であって、ＰＭＰは、異種核酸を含み、及び組成物中のＰＭＰは、植物の適応度を増加させるために有効な濃度である、植物改変組成物が提供される。
植物改変剤が異種核酸である一部の実施形態では、異種核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は阻害性ＲＮＡである。一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、植物における遺伝子の発現を阻害する。
植物改変剤が異種核酸である一部の実施形態では、核酸は、植物中において、酵素、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質、リボタンパク質、タンパク質アプタマー若しくはシャペロンの発現を増加させるｍＲＮＡ、改変ｍＲＮＡ又はＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、植物における発現の増加は、参照レベル（例えば、非処理植物における発現）に対して約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の発現増大である。一部の実施形態では、植物における発現の増加は、参照レベル（例えば、非処理植物における発現）に対して約２倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍又は約１００倍以上の発現増大である。
一部の実施形態では、核酸は、植物中において、酵素、転写因子、分泌タンパク質、構造因子、リボタンパク質、タンパク質アプタマー、シャペロン、受容体、シグナル伝達リガンド若しくは輸送因子の発現を低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノ、ＬＮＡ、ｐｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、アプタマー、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｇＲＮＡ又はＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、植物における発現の低減は、参照レベル（例えば、非処理植物における発現）に対して約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の発現低減である。一部の実施形態では、植物における発現の低減は、参照レベル（例えば、非処理植物における発現）に対して約２倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍又は約１００倍以上の発現低減である。
植物改変剤が異種核酸である一部の実施形態では、異種核酸は、植物ゲノム内に組み込まれない構築物である。他の実施形態では、異種核酸は、植物ゲノム内に組み込まれる（例えば、安定して組み込まれる）構築物である。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、植物改変剤は、異種ペプチドである。一部の実施形態では、ペプチドは、酵素、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンである。一部の実施形態では、ペプチドは、植物における遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、ペプチドは、植物における遺伝子の発現を増加させる。
さらに別の態様において、本明細書では、複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物であって、ＰＭＰは、異種ペプチドを含み、及び組成物中のＰＭＰは、植物の適応度を増加させるために有効な濃度である、植物改変組成物が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、酵素、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンである。一部の実施形態では、ペプチドは、植物における遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、ペプチドは、植物における遺伝子の発現を増加させる。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、ＰＭＰは、２種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種又は１０種超）の様々な植物改変剤を含む。一部の実施形態では、２種以上の様々な植物改変剤は、異種核酸及び異種ペプチドを含む。所定の実施形態では、異種植物改変剤は、本明細書における詳細な説明の「異種植物改変剤」と題したセクションに列挙されている１つである。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、植物改変剤は、ＰＭＰによって封入される。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、植物改変剤は、ＰＭＰの表面に埋め込まれる。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、植物改変剤は、ＰＭＰの表面に共役される。
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも２４時間（例えば、少なくとも２４時間、３０時間若しくは４０時間）、少なくとも４８時間（例えば、少なくとも４８時間（＝２日間）、３日間、４日間、５日間若しくは６日間）、少なくとも７日間（例えば、少なくとも７日間（＝１週間）、少なくとも２週間、少なくとも３週間若しくは少なくとも４週間）又は少なくとも３０日間（例えば、少なくとも３０日間、少なくとも６０日間若しくは少なくとも９０日間）安定している。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも２４℃（例えば、少なくとも２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３７℃、４２℃若しくは４２℃超）、少なくとも２０℃（例えば、少なくとも２０℃、２１℃、２２℃若しくは２３℃）、少なくとも４℃（例えば、少なくとも５℃、１０℃若しくは１５℃）、少なくとも−２０℃（例えば、少なくとも−２０℃、−１５℃、−１０℃、−５℃若しくは０℃）又は少なくとも−８０℃（例えば、少なくとも−８０℃、−７０℃、−６０℃、−５０℃、−４０℃若しくは−３０℃）の温度で安定している。一部の実施形態では、ＰＭＰは、液体窒素（約−１９５．８℃）中で安定している。一部の実施形態では、組成物は、室温で少なくとも１日間安定し、且つ／又は４℃で少なくとも１週間安定している。一部の実施形態では、組成物は、紫外線下で安定している。一部の実施形態では、組成物は、植物の自然生息地における温度下において、本明細書で規定された期間にわたって安定している。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、ＰＭＰは、複数のタンパク質（即ちＰＭＰタンパク質）を含み、ＰＭＰの濃度は、その中のＰＭＰタンパク質の濃度として測定され得る。一部の実施形態では、組成物中の複数のＰＭＰは、少なくとも０．０２５μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質（例えば、少なくとも０．０２５、０．０５、０．１若しくは０．５μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質）、少なくとも１μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質）、少なくとも１０μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０若しくは４５μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質）、少なくとも５０μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質（例えば、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質）、少なくとも１００μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質（例えば、少なくとも１００、１２５、１５０、１７５、２００若しくは２２５μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質）、少なくとも２５０μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質（例えば、少なくとも２５０、３００、３５０、４００、４５０若しくは５００μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質）又は少なくとも５００μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質（例えば、少なくとも５００、６００、７００、８００若しくは９００μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質）の濃度である。一部の実施形態では、組成物中の複数のＰＭＰは、少なくとも１ｍｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９種のＰＭＰタンパク質／ｍｌ）又は少なくとも１０ｍｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００ｍｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質）の濃度である。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、ＰＭＰは、精製された植物細胞外小胞（ＥＶ）又はその断片若しくは抽出物を含む。一部の実施形態では、植物ＥＶは、改変植物細胞外小胞（ＥＶ）である。所定の実施形態では、植物ＥＶは、植物エキソソーム又は植物微小小胞体である。一部の実施形態では、ＰＭＰは、付録に概説したもの等の植物ＥＶマーカを含む。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、複数のＰＭＰは、純粋であり得る。例えば、組成物は、葉緑体、ミトコンドリア又は核等の植物オルガネラを実質的に含まない（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％未満を有する）可能性がある。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、植物は、農業植物又は園芸植物である。一部の実施形態では、農業植物は、ダイズ植物、コムギ植物、トウモロコシ植物、トマト植物又はアルファルファ植物である。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、組成物は、植物に送達するために製剤化される。一部の実施形態では、組成物は、植物の葉、花粉、種子、根、果実、新芽又は花に送達するために製剤化される。一部の実施形態では、組成物は、農業上許容される担体を含む。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、組成物は、ＰＭＰを安定化させるために製剤化される。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、植物改変組成物は、非殺虫性である。
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又はガス組成物として製剤化される。
別の態様において、本明細書では、複数のＰＭＰを含む植物改変組成物であって、ＰＭＰは、（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップ；（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプル中のレベルに対して低減されたレベルの、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分を有する、ステップ；（ｃ）粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分中のレベルに対して低減されたレベルの、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分を有する、ステップ；（ｄ）複数の純粋なＰＭＰに植物改変剤をロードするステップ；及び任意選択的に（ｅ）植物に送達するためにステップ（ｄ）のＰＭＰを製剤化するステップを含むプロセスによって生成される、植物改変組成物が提供される。また別の態様において、本明細書では、本明細書で提供されるいずれかの植物改変組成物を含む植物が提供される。
さらに別の態様において、本明細書では、植物に植物改変組成物を送達する方法であって、植物を、本明細書に提供される植物改変組成物のいずれかの組成物と接触させるステップを含む方法が提供される。
また別の態様において、本明細書では、植物を改変する方法であって、植物に、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を送達するステップを含み、植物を改変し、それにより植物における有益な形質を導入するか、又は非処理植物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超）増加させる方法が提供される。
また別の態様において、本明細書では、植物の適応度を増加させる方法であって、植物に、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を送達するステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、植物改変組成物は、葉、種子、花粉、根、果実、新芽、花又はそれらの部分に送達される。一部の実施形態では、植物改変組成物は、植物の細胞に送達される。一部の実施形態では、植物改変組成物は、形成不全プロトプラストに送達される。一部の実施形態では、植物改変組成物は、植物の組織に送達される。例えば、組成物は、植物の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、側部分裂組織又は節間分裂組織）に送達され得る。一部の例では、組成物は、植物の永久組織（例えば、単一組織（例えば、実質、厚角組織若しくは厚膜組織）又は複合永久組織（例えば、木質部若しくは師部））に送達され得る。一部の例では、組成物は、植物胚芽に送達される。
また別の態様において、本明細書では、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の花粉に、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
また別の態様において、本明細書では、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の種子に、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
また別の態様において、本明細書では、植物のプロトプラストに、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
また別の態様において、本明細書では、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の植物細胞に、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
また別の態様において、本明細書では、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の分裂組織に、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
また別の態様において、本明細書では、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の胚芽に、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、適応度の増加は、発生、成長、収量、非生物的ストレッサーに対する耐性又は生物的ストレッサーに対する耐性における（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）増加である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、植物の適応度の増加は、疾患耐性、干ばつ耐性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、金属耐性、除草剤耐性、薬剤耐性、水利用効率、窒素利用、窒素ストレス耐性、窒素固定、病虫害抵抗性、草食動物耐性、病原体抵抗性、収量、水不足条件下の収量、活力、増殖、光合成能力、栄養、タンパク質含量、炭水化物含量、油含量、バイオマス、新芽長、根長、根の構造、結実、種子重、着果又は収穫可能な産物の量における（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）増加である。一部の実施形態では、適応度の増加は、早期の開花である。本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、適応度の増加は、植物から収穫される産物の品質における（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）向上である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の味又は外観の改善である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の貯蔵期間における（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）増加である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、適応度の増加は、動物（例えば、ヒト）における免疫反応を刺激するアレルゲン（例えば、花粉）の産生における（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）低減である。
本明細書の方法の一部の実施形態では、植物は、農業植物又は園芸植物である。一部の実施形態では、植物は、ダイズ植物、コムギ植物、トウモロコシ植物、トマト植物又はアルファルファ植物である。
本明細書の方法の一部の実施形態では、植物改変組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として送達される。
また別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の任意の組成物及び農業使用に好適である担体又は賦形剤を含む農業用製剤である。本製剤は、液体、固体（例えば、顆粒、ペレット、粉末、乾燥流動性若しくは湿潤性粉末）、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体形態であり得る。製剤は、希釈する（例えば、組成物は、可溶性固体若しくは水分散性固体である）か、植物、土壌若しくは種子に噴霧するか、塗布するか、注入するか又は適用するように構成（及び／又は取扱説明書を用いて結合）することができる。
また別の態様において、本明細書では、本明細書に記載の任意の組成物及び植物改変組成物として使用するための取扱説明書を含むキットが提供される。上記の態様のいずれかの一部の実施形態では、ＰＭＰは、脂質再構成ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）である。一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、外来性カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、改変ＰＭＰの各々は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ又はＤＣ−コレステロールである。
本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明白になるであろう。
定義
本明細書で使用されるとき、用語「植物改変組成物」は、複数のＰＭＰを含む組成物であって、ＰＭＰは、植物改変剤を含む、組成物に関する。
本明細書で使用されるとき、「送達」又は「接触」は、組成物が植物の適応度を変化させるために有効である領域において、直接的に植物上又は植物に隣接してのいずれかで植物に植物改変組成物を塗布することを指す。組成物が植物と直接的に接触される方法では、組成物は、植物全体又は植物の一部分とのみ接触され得る。
本明細書で使用されるとき、用語「有効量」、「有効濃度」又は「〜に有効な濃度」は、標的植物中若しくは標的植物上で植物を改変する（例えば、植物の適応度を増加させる）か又は標的レベル（例えば、規定レベル若しくは閾値レベル）に到達するために上述の結果を達成するために十分なＰＭＰ又はその中の異種植物改変剤の量を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「植物に送達するために製剤化された」は、農業的に許容される担体を含む植物改変組成物を指す。本明細書で使用されるとき、用語「農業上許容される」担体又は賦形剤は、例えば、植物上で使用するための、農業において使用するために好適である担体又は賦形剤である。所定の実施形態では、農業上許容される担体又は賦形剤は、植物、環境又はそれらに由来する、合理的なベネフィット／リスク比と釣り合いの取れる、結果として生じる農産物を消費するヒト又は動物に対する適切ではない有害な副作用を有していない。
本明細書で使用されるとき、「植物の適応度を増加させる」は、本明細書に記載の植物改変組成物との接触の直接的な結果として生じる植物の適応度の増加を指し、例えば向上した収量、向上した植物の活力又は植物から収穫される産物の向上した品質若しくは量、農業若しくは園芸のために望ましいと思われる収穫前若しくは収穫後の形質の向上（例えば、味、外観、貯蔵期間）又は他の点でヒトに利点を与える形質の向上（例えば、低減したアレルゲンの産生）を含む。植物の向上した収量は、同一条件下で生成された植物の同一産物の収量と比較して又は従来型植物改変剤（例えば、ＰＭＰを含まずに送達される植物改変剤）の適用と比較して、しかし、本組成物を適用せずに、測定可能な量による植物の（例えば、植物バイオマス、穀類、種子若しくは果実収量、タンパク質含量、炭水化物若しくは油含量又は葉面積によって測定される）、産物の収量の増加に関する。例えば、収量は、少なくとも約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％又は１００％超増加させることができる。収量は、何らかの基準に基づき、植物又は植物の産物の重量又は容積の量に関して表示することができる。基準は、時間、成長面積、生産された植物の重量又は使用した原料の量に関して表示することができる。植物の適応度の増加は、さらに、他の手段、例えば活力の評価の増加若しくは向上、植分（単位面積当たりの植物の数）の増加、草高の増加、茎の外周の増加、植物キャノピーの増加、外観の改善（視覚的に測定された濃い緑色の葉色）、根の評価の向上、苗発生の増加、タンパク質含量、葉のサイズの増加、葉の数の増加、より少ない枯れた根出葉、新芽の強さの増加、栄養素若しくは肥料必要量の低減、種子発芽の増加、若芽生産性の増加、より早期の開花、早期の穀粒若しくは種子成熟、より少ない植物倒伏（ｖｅｒｓｅ）（倒伏）、新芽生育増加又はこれらの要因の任意の組合せ等により、同一条件下で生産された植物の同一因子を超える測定可能若しくは顕著な量により、しかし本組成物を投与せずに又は従来型の農業用作用薬剤を投与して測定することもできる。
本明細書で使用されるとき、用語「異種」は、（１）（例えば、ＰＭＰが生成される植物若しくは植物部分ではない起源から発生する）（例えば、本明細書に記載のローディングアプローチを使用してＰＭＰに添加された）植物にとって外来性であるか、又は（２）ＰＭＰが生成される植物細胞若しくは組織にとって内在性であるが、しかし自然に見出されるより高い（例えば、天然に存在する植物細胞外小胞において見出される濃度より高い）濃度でＰＭＰ中に存在した（例えば、本明細書に記載のローディングアプローチ、遺伝子工学、インビトロ若しくはインビボアプローチを用いてＰＭＰに添加された）かのいずれかである薬剤（例えば、植物改変剤）を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「機能的作用物質」は、ＰＭＰであるか、又はインビボ若しくはインビトロ法を用いてＰＭＰと関連付ける（例えば、ＰＭＰ内若しくは上にロードする（例えば、ＰＭＰによって封入されるか、ＰＭＰ内に埋め込まれるか若しくはＰＭＰに共役される））ことができ、本組成物及び方法に従い、列挙した結果をもたらす（例えば、植物を改変する））ことができる薬剤（例えば、ペプチド若しくは核酸）を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、置き換え可能であり、長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００又はそれを超える核酸）とは関係なく、直鎖状若しくは分岐、一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はそれらのハイブリッドを指す。この用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。ヌクレオチドは、典型的に、リン酸ジエステル結合により核酸中で連結されるが、用語「核酸」は、他のタイプの結合又は骨格（例えば、中でも、ホスホロアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホロアミダート、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）結合又は骨格）を有する核酸類似体も包含する。核酸は、一本鎖、二本鎖であり得るか、又は一本鎖及び二本鎖配列の両方の部分を含有し得る。核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組合せ並びに例えばアデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル及び修飾若しくは非標準塩基（例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン及び５ヒドロキシメチルシトシンシトシンを含む）をはじめとする塩基の任意の組合せを含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」、「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０、５０、１００アミノ酸又はそれを超える）、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）の有無又は例えばペプチドに共有結合的に連結した１つ以上の非アミノアシル基（例えば、糖、脂質等）の存在に関わらず、天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸鎖（Ｄ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸のいずれも）を包含し、例えば天然タンパク質、合成若しくは組換えのポリペプチド及びペプチド、ハイブリッド分子、ペプトイド又はペプチドミメティクスが含まれる。
本明細書で使用されるとき、２つの配列間の「パーセント同一性」は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されるＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムによって決定される。ＢＬＡＳＴ解析の実行用ソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて公的に利用可能である。
本明細書で使用されるとき、用語「植物」は、全植物、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子及びその子孫を指す。植物細胞には、限定なしに、種子、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉又は小胞子の細胞が含まれる。植物部位には、限定はされないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、果実、収穫物、腫瘍組織、樹液（例えば、木部汁液及び師管液）及び様々な形態の細胞及び培養物（例えば、単一細胞、プロトプラスト、胚及びカルス組織）を含めた、分化した及び未分化の組織が含まれる。植物組織は、植物のものであるか、又は植物器官、組織若しくは細胞培養物のものであり得る。加えて、植物は、例えば、本明細書に記載の方法又は組成物におけるいずれかの植物改変組成物の異種タンパク質若しくはＲＮＡを生産するように遺伝子操作され得る。
本明細書で使用されるとき、用語「植物細胞外小胞」、「植物ＥＶ」又は「ＥＶ」は、植物中に天然に存在する内包脂質二重層構造を指す。任意選択的に、植物ＥＶは、１つ又は複数の植物ＥＶマーカを含む。本明細書で使用されるとき、用語「植物ＥＶマーカ」は、植物タンパク質、タンパク質核酸、植物小分子、植物脂質又はそれらの組合せなどの天然に植物に付随する成分を指し、限定されないが、付録に列挙する植物ＥＶマーカのいずれかを含む。一部の例では、植物ＥＶマーカは、植物ＥＶマーカの識別マーカであるが、農業用薬剤ではない。一部の例では、植物ＥＶマーカは、植物ＥＶマーカの識別マーカであり、且つ農業用薬剤でもある（例えば、複数のＰＭＰと結合しているか若しくはそれらに封入されているか、又は複数のＰＭＰと直接結合していないか若しくはそれらに封入されていない）。
本明細書で使用されるとき、用語「植物メッセンジャーパック」又は「ＰＭＰ」は、直径が約５〜２０００ｎｍ（例えば、少なくとも５〜１０００ｎｍ、少なくとも５〜５００ｎｍ、少なくとも４００〜５００ｎｍ、少なくとも２５〜２５０ｎｍ、少なくとも５０〜１５０ｎｍ又は少なくとも７０〜１２０ｎｍ）の脂質構造（例えば、脂質二重層、単層、多層構造；例えば、小胞脂質構造）を指し、これは、それらに結合した脂質若しくは非脂質成分（例えば、ペプチド、核酸若しくは小分子）を含め、植物起源又はその断片、部分若しくは抽出物から得られ（例えば、濃縮、単離若しくは精製され）、植物、植物部分又は植物細胞から濃縮、単離若しくは精製されており、この場合、濃縮又は単離は、起源植物から１つ又は複数の混入物又は不要な成分を除去することである。ＰＭＰは、天然に存在するＥＶの高度に精製された調製物であり得る。好ましくは、起源植物からの混入物又は不要な成分、起源植物からの１つ若しくは複数の混入物又は不要な成分、例えば植物細胞壁成分；ペクチン；植物オルガネラ（例えば、ミトコンドリア；葉緑体、白色体若しくはアミロプラストなどの色素体；及び核）；植物クロマチン（例えば、植物染色体）；又は植物分子凝集体（例えば、タンパク質凝集体、タンパク質−核酸凝集体、リポタンパク質凝集体若しくは脂質−タンパク質構造）の少なくとも１％（例えば、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％又は１００％）が除去される。好ましくは、ＰＭＰは、重量（ｗ／ｗ）、スペクトルイメージング（％透過率）又は伝導率（Ｓ／ｍ）により測定した場合、起源植物からの１つ若しくは複数の混入物又は不要な成分に対して少なくとも３０％純粋（例えば、少なくとも４０％純粋、少なくとも５０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも７０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９９％純粋若しくは少なくとも１００％純粋）である。
一部の例では、ＰＭＰは、脂質抽出ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）である。本明細書で使用されるとき、用語「脂質抽出ＰＭＰ」及び「ＬＰＭＰ」は、植物起源に由来する（例えば、濃縮、単離又は精製された）脂質構造（例えば、脂質二重層、単層、多層構造；例えば、小胞脂質構造）に由来するＰＭＰであって、脂質構造は、破壊（例えば、脂質抽出によって破壊）されており、標準方法を用いて、例えば本明細書に記載のようにＬＰＭＰを生成するために、脂質膜水和及び／又は溶媒インジェクション法を含む方法を用いて再構成される、脂質層（例えば、積荷を含有する脂質層）内で再組み立て又は再構成されるＰＭＰを指す。本方法は、必要に応じて、例えば再構成ＰＭＰの粒径を低減させるために、さらに音波処理、冷凍／解凍処理及び／又は脂質押出しを含み得る。ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）は、植物起源由来の脂質構造由来の１０％〜１００％の脂質を含み得、例えば植物起源由来の脂質構造由来の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の脂質を含み得る。ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）は、植物起源由来の脂質構造中に存在する全部又は一画分の脂質種を含み得、例えば植物起源由来の脂質構造中に存在する少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％の脂質種を含み得る。ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）は、植物起源由来の脂質構造中に存在するタンパク質種を含まないか、画分又は全部を含み得、例えば０％、１％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、１００％未満又は１００％の植物起源由来の脂質構造中に存在するタンパク質種を含み得る。一部の例では、ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）の脂質二重層は、タンパク質を含有しない。一部の例では、ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）の脂質構造は、植物起源由来の脂質構造と比較して低減した量のタンパク質を含有する。
ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）は、任意選択的に、外来性脂質、例えば、（１）（例えば、ＰＭＰが生成される植物若しくは植物部分ではない起源から発生する）（例えば、本明細書に記載の方法を使用してＰＭＰに添加された）植物にとって外来性であるか、又は（２）ＰＭＰが生成される植物細胞若しくは組織にとって内在性であるが、しかし自然に見出されるより高い（例えば、天然に存在する植物細胞外小胞において見出される濃度より高い）濃度でＰＭＰ中に存在した（例えば、本明細書に記載の方法、遺伝子工学、インビトロ若しくはインビボアプローチを用いてＰＭＰに添加された）かのいずれかである脂質を含む。ＰＭＰの脂質組成物は、０％、１％未満又は少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９５％超の外来性脂質を含み得る。典型的な外来性脂質としては、カチオン性脂質、イオン化性脂質、両性イオン性脂質及びリピドイドが挙げられる。
ＰＭＰは、任意選択的に、異種機能性薬剤、例えば植物改変剤、農業用薬剤、肥料、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子などの追加薬剤を含み得る。ＰＭＰは、薬剤を標的植物に送達することを可能にする様々な方法において、例えば薬剤の封入、脂質二重層構造内への薬剤の組込み又は脂質二重層構造の表面と薬剤の結合（例えば、共役）により、追加薬剤（例えば、植物改変剤）を担持させるか又はそれらと結合させることができる。異種機能性薬剤は、インビボ（例えば、植物中に）又はインビトロ（例えば、組織細胞中、細胞培養物中に若しくは合成により組み込んで）のいずれかでＰＭＰに組み込むことができる。
本明細書で使用されるとき、用語「カチオン性脂質」は、カチオン性基（例えば、カチオン性頭部基）を含有する両親媒性分子（例えば、脂質又はリピドイド）を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「リピドイド」は、脂質の１つ以上の特性を有する分子を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「植物改変剤」は、遺伝的性質を変化させる（例えば、遺伝子発現を増加させるか、遺伝子発現を低減するか又はさもなければＤＮＡ若しくはＲＮＡのヌクレオチド配列を変化させる）か、又は植物の適応度の増加を生じさせる方法で植物の生化学的特性を変化させることのできる薬剤を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「安定したＰＭＰ組成物」（例えば、ロード又は非ロードＰＭＰを含む組成物）は、一定の期間（例えば、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも３０日、少なくとも６０日又は少なくとも９０日）にわたり、任意選択的に規定の温度範囲（例えば、少なくとも２４℃（例えば、少なくとも２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃若しくは３０℃）、少なくとも２０℃（例えば、少なくとも２０℃、２１℃、２２℃若しくは２３℃）、少なくとも４℃（例えば、少なくとも５℃、１０℃若しくは１５℃）、少なくとも−２０℃（例えば、少なくとも−２０℃、−１５℃、−１０℃若しくは０℃）又は少なくとも−８０℃（例えば、少なくとも−８０℃、−７０℃、−６０℃、−５０℃、−４０℃若しくは−３０℃）の温度）において、（例えば、生成若しくは製剤化時点の）ＰＭＰ組成物中のＰＭＰの数と比較して、ＰＭＰの初期数（例えば、溶液１ｍＬ当たりのＰＭＰ）の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％）を保持するか；又は任意選択的に規定の温度範囲（例えば、少なくとも２４℃（例えば、少なくとも２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃若しくは３０℃）、少なくとも２０℃（例えば、少なくとも２０℃、２１℃、２２℃若しくは２３℃）、少なくとも４℃（例えば、少なくとも５℃、１０℃若しくは１５℃）、少なくとも−２０℃（例えば、少なくとも−２０℃、−１５℃、−１０℃若しくは０℃）又は少なくとも−８０℃（例えば、少なくとも−８０℃、−７０℃、−６０℃、−５０℃、−４０℃若しくは−３０℃）の温度）において、（例えば、生成若しくは製剤化時点の）ＰＭＰの初期活性と比較して、その活性（例えば、農薬及び／又は忌避剤活性）の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％）を保持する、ＰＭＰ組成物を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「非処理」は、植物改変組成物を送達されていない個別の植物を含め、植物改変組成物と接触させていないか、又はそれを送達されていない植物を指し、処置を受けた同じ植物を、植物改変組成物の送達前の時点で評価するか、又は処置を受けた同じ植物をその植物の非処理部分で評価する。
本明細書で使用されるとき、用語「砂じょう（ｊｕｉｃｅ ｓａｃ）」又は「砂じょう（ｊｕｉｃｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）」は、ミカン状果、例えば柑橘類の内果皮（心皮）の果汁含有膜結合要素を指す。一部の態様では、砂じょうは、果実の他の部分、例えば皮（外皮若しくはフラベド）、内皮（中果皮、アルベド若しくは髄）、中心柱（プラセンタ）、分割壁又は種子から分離される。一部の態様では、砂じょうは、グレープフルーツ、レモン、ライム又はオレンジの砂じょうである。
ブレンダの使用を含む破壊的搾汁ステップ、続いて超遠心分離及びショ糖勾配精製を用いるグレープフルーツＰＭＰ生成のプロトコルを示す概略図である。１０００×ｇで１０分間の遠心分離後のグレープフルーツ果汁及び１５０，０００×ｇで２時間の超遠心分離後のショ糖勾配バンドパターンの画像が含まれる。 Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ ＮＣＳ１により測定されるＰＭＰ粒度分布のプロットである。 メッシュフィルタの使用を含む穏やかな搾汁ステップ、続いて遠心分離及びショ糖勾配精製を用いるグレープフルーツＰＭＰ生成のプロトコルを示す概略図である。１０００×ｇで１０分間の遠心分離後のグレープフルーツ果汁及び１５０，０００×ｇで２時間の超遠心分離後のショ糖勾配バンドパターンの画像が含まれる。 超遠心分離、続いてＰＭＰ含有画分を単離するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用するグレープフルーツＰＭＰ生成のプロトコルを示す概略図である。溶出したＳＥＣ画分は、粒子濃度（ＮａｎｏＦＣＭ）、メジアン粒径（ＮａｎｏＦＣＭ）及びタンパク質濃度（ＢＣＡ）について分析される。 溶出されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）画分中の１ｍＬ当たりの粒子濃度を示すグラフである（ＮａｎｏＦＣＭ）。大部分のＰＭＰを含有する画分（「ＰＭＰ画分」）を矢印で示す。ＰＭＰは、画分２〜４に溶出されている。 ＮａｎｏＦＣＭを用いて測定される通り、選択したＳＥＣ画分についての粒径（ｎｍ）を示す一連のグラフ及び表である。グラフは、画分１、３、５及び８のＰＭＰ粒度分布を示す。 ＢＣＡアッセイを用いて測定される、ＳＥＣ画分中のタンパク質濃度（μｇ／ｍＬ）を示すグラフである。大部分のＰＭＰを含有する画分（「ＰＭＰ画分」）を標識し、矢印は、混入物を含む画分を示す。 果汁絞り機、続いて大きい残屑を除去するための分画遠心分離、ＴＦＦを用いる果汁の１００×濃縮及びＰＭＰ含有画分を単離するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用する、１リットルのグレープフルーツ果汁（約７個のグレープフルーツ）からのスケール化ＰＭＰ生成のプロトコルを示す概略図である。ＳＥＣ溶出画分は、粒子濃度（ＮａｎｏＦＣＭ）、メジアン粒径（ＮａｎｏＦＣＭ）及びタンパク質濃度（ＢＣＡ）について分析される。 １０００ｍｌのグレープフルーツ果汁のスケール化出発材料からのＳＥＣ溶出液体積（ｍｌ）のタンパク質濃度（ＢＣＡアッセイ、上のパネル）及び粒子濃度（ＮａｎｏＦＣＭ、下のパネル）を示すグラフの対であり、後期ＳＥＣ溶出体積中の多量の混入物を示している。 最終濃度５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．１５を有する粗グレープフルーツＰＭＰ画分のインキュベーション、続いて３００ｋＤａ膜を用いる一晩の透析により、２８０ｎｍでの吸光度により示されるように、後期ＳＥＣ溶出画分中に存在する混入物の除去に成功したこと示すグラフである。使用した透析バッファー（カルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳ、ｐＨ７．４、ＭＥＳｐＨ６、トリスｐＨ８．６）に差はなかった。 終濃度５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．１５を有する粗グレープフルーツＰＭＰ画分のインキュベーション、続いて３００ｋＤａ膜を用いる一晩の透析により、ＢＣＡタンパク質分析（タンパク質の検出以外に、糖及びペクチンの存在を感知できる）により示されるように、ＳＥＣ後の後期溶出画分中に存在する混入物の除去に成功したこと示すグラフである。使用した透析バッファー（カルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳ、ｐＨ７．４、ＭＥＳｐＨ６、トリスｐＨ８．６）に差はなかった。 ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、溶出ＢＭＳ植物細胞培養物ＳＥＣ画分中の粒子濃度（粒子／ｍｌ）を示すグラフである。ＰＭＰは、ＳＥＣ画分４〜６に溶出された。 ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計で測定される、溶出ＢＭＳ ＳＥＣ画分中の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ．Ｕ．）を示すグラフである。ＰＭＰは、画分４〜６に溶出され；画分９〜１３は、混入物を含有した。 ＢＣＡ分析により決定される通り、溶出ＢＭＳ ＳＥＣ画分中のタンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）を示すグラフである。ＰＭＰは、画分４〜６に溶出され；画分９〜１３は、混入物を含有した。 ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、合わせたＢＭＳ ＰＭＰ含有ＳＥＣ画分中の粒子を示す散布図である。ＰＭＰ濃度（粒子／ｍｌ）は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うビーズ標準を用いて決定した。 図５Ｄのゲート化粒子（バックグラウンド除去）のＢＭＳ ＰＭＰの粒度分布（ｎｍ）を示すグラフである。メジアンＰＭＰ粒径（ｎｍ）は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うＥｘｏビーズ標準を用いて決定した。 ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、ＡＦ４８８標識レモンＰＭＰの粒径を示す散布図及びグラフである。上のパネルは、ＡＦ４８８標識レモンＰＭＰを示す散布図である。粒子は、非標識粒子及びバックグラウンドシグナルに対し、ＦＩＴＣ蛍光シグナルについてゲート化した。検出された粒子の総数に対する蛍光粒子の数により決定される通り、標識効率は、８９．４％であった。蛍光粒子の数から、またＮａｎｏＦＣＭの指示に従う既知濃度のビーズ標準を用いて、最終ＡＦ４８８−ＰＭＰ濃度（２．９１×１０１２ＰＭＰ／ｍｌ）を決定した。下のパネルは、ＡＦ４８８標識レモンＰＭＰの粒度（ｎｍ）分布グラフである。メジアンＰＭＰ粒径は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うＥｘｏビーズ標準を用いて決定した。メジアンレモンＰＭＰ粒径は、７９．４ｎｍ＋／−１４．７ｎｍ（ＳＤ）であった。 植物細胞株：グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（ダイズ）、トリチカム・エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）（コムギ）及びトウモロコシＢＭＢ細胞培養物による、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＡＦ４８８）で標識したレモン（ＬＭ）ＰＭＰの取込みを示す一連の顕微鏡写真である。明視野パネルは、細胞の位置を示し；「ＧＦＰ」で標識したパネルは、ＡＦ４８８の蛍光を示す。細胞によるＰＭＰの取込みは、細胞中のＡＦ４８８の存在によって示される。遊離ＡＦ４８８（「遊離色素」）を対照として示す。 シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）苗及びアルファルファスプラウトによる、ＤＬ８００標識レモン（ＬＭ）及びグレープフルーツ（ＧＦ）ＰＭＰの取込みを示す概略図の対及び一連の顕微鏡写真である。ＤＬ８００色素の蛍光強度が表示される。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）苗について２２ｈｐｔ（処理後の時点）、アルファルファスプラウトについて２４ｈｐｔで蛍光強度を測定した。色素なし（「陰性対照」）及び遊離ＤＬ８００色素（「ＤＬ８００単独対照」）ありでインキュベートした苗を対照として示す。 ペクチナーゼ処理を行って又は行わずに生成されたＤｙＬｉｇｈｔ８００ｎｍ標識ＰＭＰを用いたアルファルファスプラウトの処理に関する実験概要を示す図である。 レモンＰＭＰ生成中のペクチナーゼ処理、その後の精製ＰＭＰのＤＬ８００ｎｍ標識がＰＭＰの取込み又は輸送に影響を及ぼさないことを示している、アルファルファスプラウトにおける精製レモンＰＭＰの取込みを示している赤外性加熱マップを示す図である。赤外線画像は、Ｏｄｙｓｓｅｙ ｓｃａｎｎｅｒ上で撮影されている。 ＤｉＲ（ＬＭ−ＬＰＭＰ−ＤｉＲ）を用いて染色された、レモン（ＬＭ）脂質再構成ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）により処理されなかった（非処理）又は処理された、２週齢のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）苗における７５０ｎｍでのＤｉＲ色素の蛍光を示す顕微鏡写真の対を示す図である。画像は、ｉＢｒｉｇｈｔ １５００蛍光撮像装置で取得された。 ＤｉＲ対照又はＤｉＲ（ＧＦ−ＬＰＭＰ−ＤｉＲ）を用いて染色されたグレープフルーツ（ＧＦ）ＬＰＭＰを用いて処理された、２週齢のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）苗の７５０ｎｍでのＤｉＲ色素の蛍光を示す顕微鏡写真の対を示す図である。画像は、ｉＢｒｉｇｈｔ １５００蛍光撮像装置で取得された。 等モル量のＦＷＡ−ｇＲＮＡ ４及び１７（ＬＰＭＰ ｓｇＲＮＡ）がロードされたＬＰＭＰ並びに等モル量のＦＷＡ−ｇＲＮＡ ４及び１７（ＤＣ−Ｃｈｏｌ ｓｇＲＮＡ）がロードされたＤＣ−コレステロールが添加されたＬＰＭＰを用いて４８時間にわたり処理されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４植物におけるユビキチン（ＵＢＩ）と比較したＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＷＡＧＥＮＩＮＧＥＮ（ＦＷＡ）のＲＴ−ｑＰＣＲ遺伝子発現分析を示している棒グラフである。等量の二重化ＦＷＡ−ｇＲＮＡ ４／１７混合物（ｓｇＲＮＡ４／１７）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｇＲＮＡなし）のみがロードされたＤＣ−コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ ｔｒａｃｒＲＮＡ）が添加されたＬＰＭＰが対照として提供されている。データは、平均±ＳＤとして提示されている。＊ｐ＜０．０５、Ｓｉｄａｋポストホックテストを用いる一元配置ＡＮＯＶＡ。 ＲＴ−ｑＰＣＲ遺伝子発現分析を使用して測定した、等モル量のＦＷＡ−ｇＲＮＡ ４及び１７（ＬＰＭＰ ｓｇＲＮＡ）がロードされたＬＰＭＰ並びに等モル量のＦＷＡ−ｇＲＮＡ ４及び１７（ＤＣ−Ｃｈｏｌ ｓｇＲＮＡ）がロードされたＤＣ−コレステロールが添加されたＬＰＭＰを用いて４８時間にわたり処理されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４植物における二重化ＦＷＡ−ｇＲＮＡ ４／１７混合物（ｓｇＲＮＡ４／１７）対照と比較したＦＷＡの誘導倍率を示している棒グラフである。データは、平均±ＳＤとして提示されている。＊ｐ＜０．０５、Ｓｉｄａｋポストホックテストを用いる一元配置ＡＮＯＶＡ。 ＲＴ−ｑＰＣＲ遺伝子発現分析を使用して測定した、等モル量のＦＷＡ−ｇＲＮＡ ４及び１７（ＬＰＭＰ ｓｇＲＮＡ）がロードされたＬＰＭＰ並びに等モル量のＦＷＡ−ｇＲＮＡ ４及び１７（ＤＣ−Ｃｈｏｌ ｓｇＲＮＡ）がロードされたＤＣ−コレステロールを備えるＬＰＭＰを用いて４８時間にわたり処理されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４植物における二重化ＦＷＡ−ｇＲＮＡ ４／１７混合物（ｓｇＲＮＡ４／１７）対照と比較したＡＴＩＳＯＰＥＮＴＥＮＹＬ二リン酸イソメラーゼ２（ＩＰＰ２）の誘導倍率を示している棒グラフである。データは、平均±ＳＤとして提示されている。＊ｐ＜０．０５、Ｓｉｄａｋポストホックテストを用いる一元配置ＡＮＯＶＡ。 グレープフルーツ及びレモンＰＭＰから脂質再構成ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）を調製するためのワークフローを示す概略図である。 ＬＰＭＰ；ＤＣ−コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が添加されたＬＰＭＰ；及びＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＡＰ）が添加されたＬＰＭＰにおける所定の粒径（ｎｍ）の粒子の相対頻度を示しているグラフである。データは、製造業者によって提供された濃度及び粒径の基準を用いてＮａｎｏＦＣＭによって取得された。 動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて測定した、添加された脂質を含まないＬＰＭＰ（ＬＰＭＰ）及び２５％又は４０％のＤＯＴＡＰ又はＤＣ−コレステロールを含むＬＰＭＰのζ電位（ｍＶ）を示しているグラフである。データは、平均±ＳＤとして提示されている。 添加された脂質（ＬＰＭＰ）を含まないグレープフルーツ脂質由来のＬＰＭＰ及び２０％のＤＯＴＡＰを含むグレープフルーツ脂質由来のＬＰＭＰのロード後のＬＰＭＰから回収されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５標識化ｓｉＲＮＡ投入の％を示している棒グラフである。 添加された脂質（ＬＰＭＰ）を含まないレモン脂質由来のＬＰＭＰ及び４０％のＤＣ−コレステロールを含むレモン脂質由来のＬＰＭＰのロード後のＬＰＭＰから回収されたＡＴＴＯ標識化ＴｒａｃｒＲＮＡ投入の％を示している棒グラフである。 Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）分析を用いて測定した、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及びヘパリン（＋ＴＸ＋ヘパリン）を用いて処理されていない又は溶解されている４０％のＤＣ−コレステロールを含むＬＰＭＰにおけるＴｒａｃｒＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を示している棒グラフである。 抽出されたレモン脂質から再構成されたＬＰＭＰを示している低温電子顕微鏡写真である。スケールバー：５００ｎｍ。 低温電子顕微鏡写真を用いて測定した、抽出レモン脂質から再構成されたＬＰＭＰにおける所定の同等球径（ｎｍ）の粒子の相対頻度を示しているグラフである。 脂質が添加されていないＬＰＭＰ（中央の段）及び４０％のＤＣ−コレステロールを含むＬＰＭＰ（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）により処理された、トウモロコシＢｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ Ｓｗｅｅｔ（ＢＭＳ）細胞の位相差（左の列）、ＡＴＴＯ ５５０蛍光（中央の列）及び合併画像を示している一連の顕微鏡写真である。Ｈ２Ｏ単独で処理された細胞は陰性対照（上方パネル）として提供された。ＬＰＭＰ又はＤＣ−コレステロールで改変されたＬＰＭＰの細胞による取込みは、細胞内のＴｒａｃｒＲＮＡ ＡＴＴＯ ５５０シグナルの存在によって指示される。スケールバー：１００μｍ。
本明細書で特徴付けられるのは、植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）、全体又は一部が植物細胞外小胞（ＥＶ）又はそれらの断片、部分若しくは抽出物から生成される脂質集合体を含む植物改変組成物を使用する、植物を改変する（例えば、植物の適応度を増加させる）ための組成物及び関連する方法である。本明細書で提供するＰＭＰには、植物改変剤が含まれる。さらに、ＰＭＰが実質的に純粋な形態又は濃縮された形態でもたらされる植物改変製剤も含まれる。本明細書で記載する植物改変組成物及び製剤は、農業植物若しくは園芸植物等の植物における所望の植物の形質を導入する（例えば、植物の適応度を増加させる）方法で植物を改変するために植物に直接的に送達することができる。
Ｉ．植物改変組成物
本明細書で記載する植物改変組成物は、複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む。ＰＭＰは、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物（例えば、脂質抽出物）を含む脂質（例えば、脂質二重層、単層又は多層構造）構造である。植物ＥＶは、植物中に天然に存在する、直径が約５〜２０００ｎｍである、封入された脂質二重層構造を指す。植物ＥＶは、様々な植物の生物発生経路から発生し得る。実際は、植物ＥＶは、原形質膜の外側に位置し、且つ細胞壁及び細胞外空間の連続体によって形成される区画である植物アポプラスト等の植物の細胞内及び細胞外区画内で見出すことができる。代わりに、ＰＭＰは、植物細胞から分泌されると細胞培養培地中で見出される濃縮植物ＥＶであり得る。植物ＥＶは、植物から（例えば、アポプラスト液から）分泌され得、それにより、さらに本明細書で記載する様々な方法によってＰＭＰを生成することができる。本明細書のＰＭＰは、本明細書でさらに記載する方法のような様々なインビボ法又はインビトロ法を用いて導入できる異種植物改変剤をさらに含む。
ＰＭＰは、植物ＥＶ又はそれらの断片、部分若しくは抽出物を含むことができる。任意選択的に、ＰＭＰは、さらに植物ＥＶに由来する脂質に加えて、外来性脂質を含むことができる。一部の実施形態では、植物ＥＶは、直径が約５〜２０００ｎｍである。例えば、ＰＭＰは、約５〜５０ｎｍ、約５０〜１００ｎｍ、約１００〜１５０ｎｍ、約１５０〜２００ｎｍ、約２００〜２５０ｎｍ、約２５０〜３００ｎｍ、約３００〜３５０ｎｍ、約３５０〜４００ｎｍ、約４００〜４５０ｎｍ、約４５０〜５００ｎｍ、約５００〜５５０ｎｍ、約５５０〜６００ｎｍ、約６００〜６５０ｎｍ、約６５０〜７００ｎｍ、約７００〜７５０ｎｍ、約７５０〜８００ｎｍ、約８００〜８５０ｎｍ、約８５０〜９００ｎｍ、約９００〜９５０ｎｍ、約９５０〜１０００ｎｍ、約１０００〜１２５０ｎｍ、約１２５０〜１５００ｎｍ、約１５００〜１７５０ｎｍ又は約１７５０〜２０００ｎｍの平均直径を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、約５〜９５０ｎｍ、約５〜９００ｎｍ、約５〜８５０ｎｍ、約５〜８００ｎｍ、約５〜７５０ｎｍ、約５〜７００ｎｍ、約５〜６５０ｎｍ、約５〜６００ｎｍ、約５〜５５０ｎｍ、約５〜５００ｎｍ、約５〜４５０ｎｍ、約５〜４００ｎｍ、約５〜３５０ｎｍ、約５〜３００ｎｍ、約５〜２５０ｎｍ、約５〜２００ｎｍ、約５〜１５０ｎｍ、約５〜１００ｎｍ、約５〜５０ｎｍ又は約５〜２５ｎｍの平均直径を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有する。特定の例では、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物は、約５０〜２００ｎｍの平均直径を有する。特定の例では、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物は、約５０〜３００ｎｍの平均直径を有する。特定の例では、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物は、約２００〜５００ｎｍの平均直径を有する。特定の例では、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物は、約３０〜１５０ｎｍの平均直径を有する。
一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも５ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも５５０ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも６５０ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも７５０ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも８５０ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、少なくとも９５０ｎｍ若しくは少なくとも１０００ｎｍの平均直径を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、１０００ｎｍ未満、９５０ｎｍ未満、９００ｎｍ未満、８５０ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７５０ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６５０ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５５０ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４５０ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３５０ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満若しくは５０ｎｍ未満の平均直径を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有する。当技術分野で標準的な様々な方法（例えば、動的光散乱法）を使用して、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物の粒径を測定することができる。
一部の例では、ＰＭＰは、７７ｎｍ２〜３．２×１０６ｎｍ２（例えば、７７〜１００ｎｍ２、１００〜１０００ｎｍ２、１０００〜１×１０４ｎｍ２、１×１０４〜１×１０５ｎｍ２、１×１０５〜１×１０６ｎｍ２又は１×１０６〜３．２×１０６ｎｍ２）の平均表面積を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、６５ｎｍ３〜５．３×１０８ｎｍ３（例えば、６５〜１００ｎｍ３、１００〜１０００ｎｍ３、１０００〜１×１０４ｎｍ３、１×１０４〜１×１０５ｎｍ３、１×１０５〜１×１０６ｎｍ２、１×１０６〜１×１０７ｎｍ３、１×１０７〜１×１０８ｎｍ３、１×１０８〜５．３×１０８ｎｍ３）の平均体積を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも７７ｎｍ２（例えば、少なくとも７７ｎｍ２、少なくとも１００ｎｍ２、少なくとも１０００ｎｍ２、少なくとも１×１０４ｎｍ２、少なくとも１×１０５ｎｍ２、少なくとも１×１０６ｎｍ２若しくは少なくとも２×１０６ｎｍ２）の平均表面積を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも６５ｎｍ３（例えば、少なくとも６５ｎｍ３、少なくとも１００ｎｍ３、少なくとも１０００ｎｍ３、少なくとも１×１０４ｎｍ３、少なくとも１×１０５ｎｍ３、少なくとも１×１０６ｎｍ３、少なくとも１×１０７ｎｍ３、少なくとも１×１０８ｎｍ３、少なくとも２×１０８ｎｍ３、少なくとも３×１０８ｎｍ３、少なくとも４×１０８ｎｍ３若しくは少なくとも５×１０８ｎｍ３）の平均体積を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。
一部の例では、ＰＭＰは、植物ＥＶ又はその断片、抽出物若しくは部分と同じ大きさを有し得る。代わりに、ＰＭＰは、ＰＭＰが産生される初期植物ＥＶと異なる大きさを有し得る。例えば、ＰＭＰは、約５〜２０００ｎｍの直径を有し得る。例えば、ＰＭＰは、約５〜５０ｎｍ、約５０〜１００ｎｍ、約１００〜１５０ｎｍ、約１５０〜２００ｎｍ、約２００〜２５０ｎｍ、約２５０〜３００ｎｍ、約３００〜３５０ｎｍ、約３５０〜４００ｎｍ、約４００〜４５０ｎｍ、約４５０〜５００ｎｍ、約５００〜５５０ｎｍ、約５５０〜６００ｎｍ、約６００〜６５０ｎｍ、約６５０〜７００ｎｍ、約７００〜７５０ｎｍ、約７５０〜８００ｎｍ、約８００〜８５０ｎｍ、約８５０〜９００ｎｍ、約９００〜９５０ｎｍ、約９５０〜１０００ｎｍ、約１０００〜１２００ｎｍ、約１２００〜１４００ｎｍ、約１４００〜１６００ｎｍ、約１６００〜１８００ｎｍ又は約１８００〜２０００ｎｍの平均直径を有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも５ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも５５０ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも６５０ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも７５０ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも８５０ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、少なくとも９５０ｎｍ、少なくとも１０００ｎｍ、少なくとも１２００ｎｍ、少なくとも１４００ｎｍ、少なくとも１６００ｎｍ、少なくとも１８００ｎｍ又は少なくとも２０００ｎｍの平均直径を有し得る。当技術分野で標準的な様々な方法（例えば、動的光散乱法）を使用して、ＰＭＰの粒径を測定することができる。一部の例では、ＰＭＰの大きさは、異種植物改変剤のローディング後又はＰＭＰに対する他の修飾後に決定する。
一部の例では、ＰＭＰは、７７ｎｍ２〜１．３×１０７ｎｍ２（例えば、７７〜１００ｎｍ２、１００〜１０００ｎｍ２、１０００〜１×１０４ｎｍ２、１×１０４〜１×１０５ｎｍ２、１×１０５〜１×１０６ｎｍ２又は１×１０６〜１．３×１０７ｎｍ２）の平均表面積を有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、６５ｎｍ３〜４．２×１０９ｎｍ３（例えば、６５〜１００ｎｍ３、１００〜１０００ｎｍ３、１０００〜１×１０４ｎｍ３、１×１０４〜１×１０５ｎｍ３、１×１０５〜１×１０６ｎｍ２、１×１０６〜１×１０７ｎｍ３、１×１０７〜１×１０８ｎｍ３、１×１０８〜１×１０９ｎｍ３又は１×１０９〜４．２×１０９ｎｍ３）の平均体積を有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも７７ｎｍ２（例えば、少なくとも７７ｎｍ２、少なくとも１００ｎｍ２、少なくとも１０００ｎｍ２、少なくとも１×１０４ｎｍ２、少なくとも１×１０５ｎｍ２、少なくとも１×１０６ｎｍ２又は１×１０７ｎｍ３）の平均表面積を有する。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも６５ｎｍ３（例えば、少なくとも６５ｎｍ３、少なくとも１００ｎｍ３、少なくとも１０００ｎｍ３、少なくとも１×１０４ｎｍ３、少なくとも１×１０５ｎｍ３、少なくとも１×１０６ｎｍ３、少なくとも１×１０７ｎｍ３、少なくとも１×１０８ｎｍ３、少なくとも１×１０９ｎｍ３、少なくとも２×１０９ｎｍ３、少なくとも３×１０９ｎｍ３又は少なくとも４×１０９ｎｍ３）の平均体積を有する。
一部の例では、ＰＭＰは、インタクトな植物ＥＶを含有し得る。代わりに、ＰＭＰは、植物ＥＶの小胞の全表面積の断片、部分又は抽出物（例えば、小胞の全表面積の１００％未満（例えば、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満若しくは１％未満）を含む断片、部分又は抽出物）を含有し得る。断片、部分又は抽出物は、円周方向断片、球状断片（例えば、半球）、曲線断片、線状断片又は平板型断片など、任意の形状であり得る。断片が、小胞の球状断片である場合、球状断片は、平行線の対に沿った球状小胞の分割から生じたもの又は非平行線の対に沿った球状小胞の分割から生じたものを呈示し得る。従って、複数のＰＭＰは、複数のインタクトな植物ＥＶ、複数の植物ＥＶ断片、部分若しくは抽出物又はインタクトな植物ＥＶ及びその断片の混合物を含み得る。当業者は、インタクト及び断片化植物ＥＶの比が、使用した具体的な単離方法によって変動することは理解されるであろう。例えば、植物若しくはその部分の粉砕又はブレンドにより、真空浸潤法などの非破壊抽出方法よりも高い比率の植物ＥＶ断片、部分又は抽出物を含有するＰＭＰを生成することができる。
ＰＭＰが、植物ＥＶの断片、部分又は抽出物を含有する例では、ＥＶ断片、部分又は抽出物は、インタクトな小胞のそれより小さい平均表面積、例えば７７ｎｍ２、１００ｎｍ２、１０００ｎｍ２、１×１０４ｎｍ２、１×１０５ｎｍ２、１×１０６ｎｍ２又は３．２×１０６ｎｍ２）未満の平均表面積を有し得る。一部の例では、ＥＶ断片、部分又は抽出物は、７０ｎｍ２、６０ｎｍ２、５０ｎｍ２、４０ｎｍ２、３０ｎｍ２、２０ｎｍ２又は１０ｎｍ２）未満の表面積を有する。一部の例では、ＰＭＰは、インタクトな小胞のそれより小さい平均体積、例えば６５ｎｍ３、１００ｎｍ３、１０００ｎｍ３、１×１０４ｎｍ３、１×１０５ｎｍ３、１×１０６ｎｍ３、１×１０７ｎｍ３、１×１０８ｎｍ３又は５．３×１０８ｎｍ３）未満の平均体積を有する植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。
ＰＭＰが、植物ＥＶの抽出物を含む例、例えばＰＭＰが、植物ＥＶから抽出された（例えば、クロロホルムで）脂質を含む例では、ＰＭＰは、植物ＥＶから抽出された（例えば、クロロホルムで）脂質の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は９９％超を含有し得る。多数のＰＭＰは、植物ＥＶ断片及び／又は植物ＥＶ抽出脂質又はそれらの混合物を含有し得る。
本明細書では、ＰＭＰの生成方法、ＰＭＰと結合させることができる植物ＥＶマーカ及びＰＭＰを含む組成物の製剤についての詳細をさらに概説する。
Ａ．生成方法
ＰＭＰは、植物又は植物組織若しくは植物細胞を含むその部分に天然に存在する植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物（例えば、脂質抽出物）から生成することができる。ＰＭＰを生成する例示的な方法は、（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップと；（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプル中のレベルに対して低減されたレベルの、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分を有する、ステップとを含む。この方法は、粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成する追加的なステップ（ｃ）であって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＰＭＰ画分のレベルに対して低減されたレベルの、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分を有する、追加的なステップ（ｃ）をさらに含み得る。各生成ステップについては、以下にさらに詳細に論じる。ＰＭＰの単離及び精製に関する例示的な方法は、例えば、Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７；Ｒｕｔｔｅｒ ｅｔ Ａｌ，Ｂｉｏ．Ｐｒｏｔｏｃ．７（１７）：ｅ２５３３，２０１７；Ｒｅｇｅｎｔｅ ｅｔ Ａｌ，Ｊ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．６８（２０）：５４８５−５４９６，２０１７；Ｍｕ ｅｔ Ａｌ，Ｍｏｌ．Ｎｕｔｒ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．，５８，１５６１−１５７３，２０１４並びにＲｅｇｅｎｔｅ ｅｔ Ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．５８３：３３６３−３３６６，２００９に見出され、これらの各々は、参照により本明細書に組み込む。
一部の例では、（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップと；（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプル中のレベルに対して低減されたレベル（例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％又は１００％低減したレベル）の、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分を有する、ステップと；（ｃ）粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分に対して低減されたレベル（例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％又は１００％低減したレベル）の、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分を有する、ステップとを含むプロセスによって複数のＰＭＰを植物から単離され得る。
本明細書に提供されるＰＭＰは、多様な植物から生成した植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含み得る。ＰＭＰは、任意の属の植物（維管束若しくは非維管束）から生成することができ、こうした植物として、限定されないが、被子植物（単子葉及び双子葉植物）、裸子植物、シダ、イワヒバ（ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ）、トクサ、裸茎植物（ｐｓｉｌｏｐｈｙｔｅｓ）、ヒカゲノカズラ（ｌｙｃｏｐｈｙｔｅ）、藻類（例えば、単細胞若しくは多細胞、例えばアーケプラスチダ（ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ））又はコケ類が挙げられる。特定の例では、ＰＭＰは、維管束植物、例えば単子葉若しくは双子葉又は裸子植物を使用して生成することができる。例えば、ＰＭＰは、アルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、バナナ、オオムギ、カノーラ、トウゴマ、チコリー、キク、クローバー、カカオ、コーヒー、綿、綿実、トウモロコシ、クランベ、クランベリー、キュウリ、デンドロビウム、ヤマイモ、ユーカリ属、ウシノケグサ、亜麻、グラジオラス、ユリ科、亜麻仁、キビ、マスクメロン、カラシ、オーツムギ、アブラヤシ、アブラナ、パパイヤ、ピーナッツ、パイナップル、観賞植物、インゲンマメ、ジャガイモ、ナタネ、コメ、ライムギ、ライグラス、ベニバナ、ゴマ、モロコシ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、芝草、コムギ又はレタス、セロリ、ブロッコリー、カリフラワー、ウリ科植物などの野菜作物；リンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ペカン、クルミ、ヘーゼルなどの果実及び堅果樹；ブドウ、キウイ、ホップなどのブドウ；ラズベリー、ブラックベリー、セイヨウスグリなどの果実低木及びキイチゴ；セイヨウトネリコ、マツ、モミ、カエデ、オーク、クルミ、ポプラなどの森林樹；アルファルファ、カノーラ、トウゴマ、トウモロコシ、綿、クランベ、亜麻、亜麻仁、カラシ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、ジャガイモ、コメ、ベニバナ、ゴマ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ又はコムギを使用して生成することができる。
ＰＭＰは、全植物（例えば、全ロゼット若しくは苗）又は代替的に１つ若しくは複数の植物部分（例えば、葉、種子、根、果実、野菜、花粉、師管液若しくは木部樹液）を使用して生成することができる。例えば、ＰＭＰは、新芽植物器官／構造（例えば、葉、茎若しくは塊茎）、根、花及び花器／構造（例えば、花粉、包葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯若しくは胚珠）、種子（胚、胚乳若しくは種皮を含む）、果実（成熟した子房）、樹液（例えば、師部若しくは木部樹液）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織、腫瘍組織など）並びに細胞（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚、カルス組織、孔辺細胞、卵細胞など）又はこれらの子孫を使用して生成することができる。例えば、単離ステップは、（ａ）植物又はその一部を用意することを含み得、ここで、植物部分は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の葉である。植物は、任意の発育段階のものであり得る。例えば、ＰＭＰは、苗、例えば１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週又は８週齢の苗（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の苗）を使用して生成することができる。他の例示的ＰＭＰは、根（例えば、根生姜）、果汁（例えば、グレープフルーツ果汁）、野菜（例えば、ブロッコリー）、花粉（例えば、オリーブ花粉）、師部液（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の師部液）又は木部樹液（例えば、トマト植物木部樹液）を使用して生成されたＰＭＰを含み得る。
ＰＭＰは、様々な方法により、植物又はその部分を使用して生成することができる。植物のＥＶ含有アポプラスト画分又はそうでなければ分泌されたＥＶを含むＰＭＰを含有する細胞外画分（例えば、細胞培地）の放出を可能にするいずれの方法も本方法において好適である。ＥＶは、破壊的（例えば、植物若しくは任意の植物部分の粉砕若しくはブレンド）又は非破壊的（植物若しくは任意の植物部分の洗浄若しくは真空浸潤法）方法のいずれかによって植物若しくは植物部分から分離することができる。例えば、植物又はその部分を真空浸潤、粉砕、ブレンド又はこれらの組合せに付して、植物又は植物部分からＥＶを単離し、これによりＰＭＰを生成することができる。例えば、単離するステップは、（ｂ）初期サンプル（例えば、植物、植物部分又は植物若しくは植物部分に由来するサンプル）から粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプルにおけるレベルに対して低減されたレベルの、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分を有する、ステップを含み得；単離するステップは、植物（例えば、小胞単離バッファーと一緒に）を真空浸潤して、アポプラスト画分を放出させ、収集することを含む。代わりに、単離するステップは、植物を粉砕又はブレンドして、ＥＶを放出させ、これによりＰＭＰを生成することを含むことができる。
植物ＥＶを単離し、それによりＰＭＰを産生させると、ＰＭＰは、分離又は粗ＰＭＰ画分（例えば、アポプラスト画分）内に収集することができる。例えば、分離するステップは、植物壊死組織、植物細胞又は植物細胞オルガネラ（例えば、核若しくは葉緑体）を含む大きい混入物から植物ＰＭＰ含有画分を分離するために遠心分離（例えば、分画遠心分離若しくは超遠心分離）及び／又は濾過を使用して複数のＰＭＰを粗ＰＭＰ画分に分離するステップを含み得る。従って、粗ＰＭＰ画分は、起源植物又は植物部分由来の初期サンプルと比較して、植物壊死組織又は植物細胞を含む大きい混入物の数が低減するであろう。使用した方法に依存して、粗ＰＭＰ画分は、起源植物又は植物部分由来の初期サンプルと比較して、低減したレベルの植物細胞オルガネラ（例えば、核、ミトコンドリア若しくは葉緑体）を追加して含み得る。
一部の例では、単離ステップは、植物細胞又は植物組織残屑から植物ＥＶ含有画分を分離するための遠心分離（例えば、分画遠心分離若しくは超遠心分離）及び／又は濾過を用いて、複数のＰＭＰを粗ＰＭＰ画分に分離することを含み得る。従って、粗ＰＭＰ画分は、起源植物又は植物部分からの初期サンプルと比較して、植物細胞又は植物組織残屑の数が減少することになる。
複数の純粋なＰＭＰを生成するために、追加の精製方法により粗ＰＭＰ画分をさらに精製することもできる。例えば、超遠心分離により、例えば密度勾配（イオジキサノール若しくはショ糖）の使用及び／又は凝集要素を除去するための他の手法（例えば、沈殿若しくはサイズ排除クロマトグラフィー）の使用により、粗ＰＭＰ画分を他の植物要素から分離することができる。得られた純粋なＰＭＰは、より早期の分離ステップ中に生成された１つ若しくは複数の画分又は所定の閾値レベル、例えば商業的公開仕様に対して低減されたレベルの、起源植物からの混入物又は不要な成分（例えば、１つ又は複数の非ＰＭＰ成分、例えばタンパク質凝集体、核酸凝集体、タンパク質−核酸凝集体、遊離リポタンパク質、脂質−タンパク質構造）、核、細胞壁成分、細胞オルガネラ又はこれらの組合せ）を有し得る。例えば、純粋なＰＭＰは、初期サンプルのレベルに対して低減されたレベル（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超；又は約２×、４×、５×、１０×、２０×、２５×、５０×、７５×、１００×若しくは１００×超）の植物オルガネラ又は細胞壁成分を有し得る。一部の例では、純粋なＰＭＰは、タンパク質凝集体、核酸凝集体、タンパク質−核酸凝集体、遊離リポタンパク質、脂質−タンパク質構造）、核、細胞壁成分、細胞オルガネラ又はこれらの組合せなどの１つ若しくは複数の非ＰＭＰ成分を実質的に含有しない（例えば、それらの検出不能レベルを有する）。放出及び分離ステップのさらに別の例を実施例１に見出すことができる。ＰＭＰは、例えば、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３又は１×１０１３ＰＭＰｓ／ｍＬ超の濃度であり得る。
例えば、ＰＭＰから、タンパク質凝集体を除去することができる。例えば、ＰＭＰを様々なｐＨ（例えば、ｐＨプローブを用いて測定されるように）に付して、溶液中にタンパク質凝集体を沈殿させることができる。ｐＨは、例えば、水酸化ナトリウム又は塩酸の添加により、例えばｐＨ３、ｐＨ５、ｐＨ７、ｐＨ９又はｐＨ１１に調節することができる。溶液が指定ｐＨに達したら、これを濾過して微粒子を除去することができる。代わりに、ＰＭＰを、Ｐｏｌｙｍｉｎ−Ｐ又はＰｒａｅｓｔｏｌ ２６４０などの荷電ポリマーの添加により、凝集させることもできる。手短には、Ｐｏｌｙｍｉｎ−Ｐ又はＰｒａｅｓｔｏｌ ２６４０を溶液に添加し、インペラで混合する。次に、溶液を濾過して微粒子を除去する。代わりに、塩濃度を増加させることにより凝集体を可溶化することもできる。例えば、ＰＭＰにＮａＣｌを、それが例えば１ｍｏｌ／Ｌになるまで添加することができる。次に、溶液を濾過して、ＰＭＰを単離する。代わりに、昇温によって凝集体を可溶化することもできる。例えば、ＰＭＰを混合しながら、溶液が例えば約５０℃の均一温度に達するまで５分間加熱することができる。次に、ＰＭＰ混合物を濾過して、ＰＭＰを単離することができる。代わりに、標準的手順に従うサイズ排除クロマトグラフィーにより、ＰＭＰ溶液から可溶性混入物を分離することができ、この場合、最初の画分中にＰＭＰを溶出させる一方、タンパク質及びリボ核タンパク質並びに一部のリポタンパク質をのちに溶出させる。タンパク質凝集体除去の効率は、ＢＣＡ／Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量を用いて、タンパク質凝集体の除去前後のタンパク質濃度を測定及び比較することにより決定することができる。
生成方法の任意のステップでＰＭＰを特性決定又は同定するために、本明細書に記載される生成方法のいずれにも、当技術分野で公知のいかなる定量的又は定性的方法も追加し得る。ＰＭＰは、ＰＭＰ収率、ＰＭＰ濃度、ＰＭＰ純度、ＰＭＰ組成又はＰＭＰサイズを推定するための多様な分析方法によって特性決定され得る。ＰＭＰは、ＰＭＰの視覚化、定量又は定性的特性決定（例えば、組成物の同定）を可能にする、当技術分野で公知のいくつかの方法、例えば顕微鏡検査（例えば、透過電子顕微鏡）、動的光散乱法、ナノ粒子追跡、分光法（例えば、フーリエ変換赤外分光法）若しくは質量分析法（タンパク質及び脂質分析）により評価することができる。特定の例では、方法（例えば、質量分析法）を用いて、ＰＭＰに存在する植物ＥＶマーカ、例えば付録に開示されるマーカを同定することができる。ＰＭＰ画分の分析及び特性決定を補助するために、ＰＭＰをさらに標識又は染色することができる。例えば、３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド（ＤＩＯＣ６）、蛍光親油性色素、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏ（登録商標）４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で、ＰＭＰを染色することができる。高度な形態のナノ粒子追跡の非存在下でも、この比較的単純な手法は、総膜含量を定量することから、ＰＭＰの濃度を間接的に測定するために使用することができる（Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７；Ｒｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ．Ｐｒｏｔｏｃ．７（１７）：ｅ２５３３，２０１７）。より正確な測定のため、またＰＭＰの粒度分布を評価するためには、ナノ粒子追跡を使用することができる。
生成工程中、任意選択的に、ＰＭＰが対照又は初期サンプル中のＥＶレベルに対して高い濃度（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超；又は約２倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍若しくは１００倍超）であるように、ＰＭＰを調製することができる。ＰＭＰは、植物改変組成物の約０．１％〜約１００％、例えば約０．０１％〜約１００％、約１％〜約９９．９％、約０．１％〜約１０％、約１％〜約２５％、約１０％〜約５０％又は約５０％〜約９９％のいずれか１つを占め得る。一部の例では、組成物は、例えば、ｗｔ／ｖｏｌ、パーセントＰＭＰタンパク質組成物及び／又はパーセント脂質組成物により測定して（例えば、蛍光標識脂質の測定により）；例えば、実施例３を参照されたい）、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれを超えるＰＭＰのいずれかを含む。一部の例では、濃縮された市販の製品のような濃縮薬剤を使用し、例えば、最終ユーザは、市販の製品を希釈し得、これは、実質的に低い濃度の有効成分を有する。一部の実施形態では、組成物は、植物改変濃縮製剤、例えば高濃度少量製剤として製剤化する。
実施例１に説明されるように、多様な植物又はその部分（例えば、葉アポプラスト、種子アポプラスト、根、果実、野菜、花粉、師管液若しくは木部樹液）を使用してＰＭＰを生成することができる。例えば、ＰＭＰは、植物のアポプラスト画分、例えば葉のアポプラスト（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）葉のアポプラスト）又は種子のアポプラスト（例えば、ヒマワリ種子のアポプラスト）から単離することができる。他の例示的なＰＭＰは、根（例えば、根生姜）、果汁（例えば、グレープフルーツ果汁）、野菜（例えば、ブロッコリー）、花粉（例えば、オリーブ花粉）、師管液（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）師管液）、木部樹液（例えば、トマト植物木部樹液）又は細胞培養上清（例えば、ＢＹ２タバコ細胞培養上清）を使用して生成される。この実施例は、これらの種々の植物供給源からＰＭＰの生成をさらに示す。
実施例２に説明されるように、様々な方法により、例えば超遠心分離及び／又は凝集混入物を除去する方法、例えば沈殿若しくはサイズ排除クロマトグラフィーと一緒に密度勾配（イオジキサノール若しくはショ糖）を使用することにより、ＰＭＰを精製することができる。例えば、実施例２では、実施例１で概説される分離ステップによって得られたＰＭＰの精製を説明する。さらに、ＰＭＰは、実施例３に説明される方法に従って特性決定することができる。
一部の例では、本組成物及び方法のＰＭＰは、植物又は植物部分から生成することができ、ＰＭＰにさらなる修飾を加えることなく、これを使用することができる。他の例では、本明細書にさらに概説するように、使用前にＰＭＰを修飾することができる。
Ｂ．植物ＥＶマーカ
本組成物及び方法のＰＭＰは、植物ＥＶ（及び／又はその断片、部分若しくは抽出物を含む）を使用して生成されるものとしてＰＭＰを同定する多様なマーカを有し得る。本明細書で使用される場合、用語「植物ＥＶマーカ」は、天然に植物に付随し、植物タンパク質、植物核酸、植物小分子、植物脂質又はそれらの組合せなど、インプランタで植物ＥＶ中若しくは上に組み込まれる要素を指す。植物ＥＶマーカの例は、例えば、Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７；Ｒａｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．６（２３）：１９５１４，２０１５；Ｊｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ．２１（７）：１３４５−１３５７，２０１３；Ｗａｎｇ ｅｔ Ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２２（３）：５２２−５３４，２０１４；及びＲｅｇｅｎｔｅ ｅｔ Ａｌ，Ｊ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．６８（２０）：５４８５−５４９６，２０１７に見出すことができ；これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。植物ＥＶマーカのさらに別の例は付録に列挙されており、これらについては、本明細書においてさらに概説する。
一部の例では、植物ＥＶマーカは、植物脂質を含み得る。ＰＭＰに見られ得る植物脂質マーカの例としては、フィトステロール、カンペステロール、β−シトステロール、シグマステロール、アベナステロール、グリコシルイノシトールホスホリルセラミド（ＧＩＰＣ）、糖脂質（例えば、モノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）若しくはジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）又はそれらの組合せが挙げられる。例えば、ＰＭＰは、ＧＩＰＣを含み得、これは、植物の主要スフィンゴ脂質クラスの代表であり、植物において最も豊富な膜脂質の１つである。他の植物ＥＶマーカは、非生物的又は生物的ストレッサー（例えば、細菌若しくは真菌感染）に応答して植物中に蓄積する脂質、例えばホスファチジン酸（ＰＡ）又はホスファチジルイノシトール−４−リン酸（ＰＩ４Ｐ）を挙げることができる。
代わりに、植物ＥＶマーカは、植物タンパク質を含み得る。一部の例では、タンパク質植物ＥＶマーカは、植物により天然に産生される抗微生物タンパク質であり得、そうしたものとして、非生物的又は生物的ストレッサー（例えば、細菌若しくは真菌感染）に応答して植物が分泌する防御タンパク質がある。植物病原体防御タンパク質としては、可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子結合タンパク質受容体タンパク質（ＳＮＡＲＥ）タンパク質（例えば、Ｓｙｎｔａｘｉｎ−１２１（ＳＹＰ１２１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１８７７８８．１若しくはＮＰ＿９７４２８８．１）、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ１（ＰＥＮ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５６７４６２．１））又はＡＢＣ輸送体Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ３（ＰＥＮ３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１９１２８３．２）がある。植物ＥＶマーカの他の例としては、植物中のＲＮＡの長距離輸送を促進するタンパク質があり、こうしたものとして、師部タンパク質（例えば、師部タンパク質２−Ａ１（ＰＰ２−Ａ１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１９３７１９．１）、カルシウム依存性脂質結合タンパク質又はレクチン（例えば、ジャカリン（Ｊａｃａｌｉｎ）関連レクチン、例えばヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）ジャカリン（Ｈｅｌｊａ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＨＺ８６９７８．１）が挙げられる。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質は、グリシンリッチＲＮＡ結合タンパク質−７（ＧＲＰ７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１７９７６０．１）であり得る。加えて、プラスモデスマータ機能を調節するタンパク質が、一部の例で、植物ＥＶ中に見られ得るが、こうしたものとして、Ｓｙｎａｐ−Ｔｏｔｇａｍｉｎ Ａ Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５６５４９５．１）がある。一部の例では、植物ＥＶマーカは、ホスホリパーゼＣ又はホスホリパーゼＤなど、脂質機序に関与するタンパク質を含み得る。一部の例では、植物タンパク質ＥＶマーカは、植物の細胞トラフィッキングタンパク質である。植物ＥＶマーカがタンパク質である特定の例では、タンパク質マーカは、分泌タンパク質と典型的に結合するシグナルペプチドが欠失している場合がある。非古典的分泌タンパク質は、（ｉ）リーダ配列の欠失、（ｉｉ）ＥＲ又はゴルジ装置に特異的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）の非存在、及び／又は（ｉｉｉ）古典的ＥＲ／ゴルジ依存性分泌経路を遮断するブレフェルディンＡによる影響を受けない分泌のような、いくつかの共通の特徴を有すると思われる。当業者は、一般に自由に利用可能な様々な手段（例えば、ＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ Ｄａｔａｂａｓｅ；ＳＵＢＡ３（ＳＵＢｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ））を使用して、シグナル配列又はその欠失についてタンパク質を評価することができる。
植物ＥＶマーカがタンパク質である例では、タンパク質は、植物ＥＶマーカ、例えば付録に列挙される植物ＥＶマーカのいずれかと、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。例えば、タンパク質は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＰＥＮ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５６７４６２．１）と、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
一部の例では、植物ＥＶマーカは、植物によりコードされる核酸、例えば植物ＲＮＡ、植物ＤＮＡ又は植物ＰＮＡを含む。例えば、ＰＭＰは、植物によりコードされるｄｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得る。一部の例では、核酸は、本明細書で論じるように、植物においてＲＮＡの長距離輸送を促進するタンパク質に関連するものであり得る。一部の例では、核酸植物ＥＶマーカは、宿主誘導遺伝子サイレンシング（ＨＩＧＳ）に関与するものであり得、これは、植物が、植物有害生物（例えば、真菌などの病原体）の外来転写物を抑制するプロセスである。例えば、核酸は、細菌又は真菌遺伝子を抑制するものであり得る。一部の例では、核酸は、真菌病原体（例えば、バーティシリウム・ダリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ））中の遺伝子をターゲティングする、ｍｉＲ１５９又はｍｉＲ１６６などのマイクロＲＮＡであり得る。一部の例では、タンパク質は、植物防御化合物の運搬に関与するもの、例えばグルコシノレート（ＧＳＬ）輸送及び代謝に関与するタンパク質であり得、こうしたものとして、グルコシノレートトランスポータ−１−１（ＧＴＲ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５６６８９６．２）、グルコシノレートトランスポータ−２（ＧＴＲ２；ＮＰ＿２０１０７４．１）又はエピチオ特異的修飾因子１（ＥＳＭ１；ＮＰ＿１８８０３７．１）が挙げられる。
植物ＥＶマーカが核酸である例では、核酸は、植物ＥＶマーカ、例えば付録に列挙される植物ＥＶマーカをコードするものなどと、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。例えば、核酸は、ｍｉＲ１５９又はｍｉＲ１６６と、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有し得る。
一部の例では、植物ＥＶマーカは、植物により産生される化合物を含む。例えば、化合物は、非生物的又は生物的ストレッサーに応答して産生される防御化合物、例えば二次代謝物などであり得る。ＰＭＰ中に見られ得るこうした二次代謝物の１つは、グルコシノレート（ＧＳＬ）であり、これは、主にアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物に見られる窒素及びイオウ含有二次代謝物である。他の二次代謝物は、アレロケミカルを含み得る。
一部の例では、ＰＭＰは、典型的には植物によって産生されないが、一般に他の生物（例えば、動物ＥＶ、細菌ＥＶ若しくは真菌ＥＶのマーカ）に関連する特定のマーカ（例えば、脂質、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド）の欠失に基づいて植物ＥＶを使用して産生されるものとしても同定され得る。例えば、一部の例では、ＰＭＰは、動物ＥＶ、細菌ＥＶ若しくは真菌ＥＶに典型的に見られる脂質を欠失している。一部の例では、ＰＭＰは、動物ＥＶに典型的な脂質（例えば、スフィンゴミエリン）を欠失している。一部の例では、ＰＭＰは、細菌ＥＶ又は細菌膜に典型的な脂質（例えば、ＬＰＳ）を含有しない。一部の例では、ＰＭＰは、真菌膜に典型的な脂質（例えば、エルゴステロール）を欠失している。
小分子（例えば、質量分光法、質量分析法）、脂質（例えば、質量分光法、質量分析法）、タンパク質（例えば、質量分光法、イムノブロッティング）又は核酸（例えば、ＰＣＲ分析）の同定を可能にする、当技術分野で公知の任意の手法を用いて、植物ＥＶマーカを同定することができる。一部の例では、本明細書に記載のＰＭＰ組成物は、検出可能な量、例えば所定閾値量の本明細書に記載の植物ＥＶマーカを含有する。
Ｃ．薬剤のローディング
ＰＭＰは、異種植物改変剤、例えば本明細書に記載するものなどの農薬用薬剤又は忌避剤を含有するように修飾することができる。ＰＭＰは、薬剤を標的植物に送達することを可能にする様々な手段で、例えば薬剤の封入、脂質二重層構造内への成分の組込み又はＰＭＰの脂質二重層構造の表面と成分の結合（例えば、共役）により、こうした薬剤を担持させるか又はそれらと結合させることができる。
異種植物改変剤は、ＰＭＰと薬剤同士の結合を直接若しくは間接的に可能にする、当技術分野で公知の任意の方法により、ＰＭＰ中若しくは上に組み込むか又はロードすることができる。異種植物改変剤は、インビボ法（例えば、インプランタ、例えば異種薬剤を含むトランスジェニック植物からのＰＭＰの産生により）若しくはインビトロで（例えば、組織培養若しくは細胞培養で）又はインビボ及びインビトロ法の両方によってＰＭＰに組み込むことができる。
ＰＭＰに異種植物改変剤をインビボでロードする例では、ＰＭＰは、ＥＶ又はその断片若しくは部分或いはインプランタでロードされたＥＶを含有する抽出物を使用して産生され得る。インプランタ法は、ＥＶへのロードのために異種植物改変剤を発現するように遺伝子修飾された植物における異種植物改変剤の発現を含む。一部の例では、異種植物改変剤は、植物に対して外性である。代わりに、異種植物改変剤は、植物中に天然に見られ得るが、非遺伝子修飾植物に見られるレベルより高いレベルで発現されるように操作され得る。
一部の例では、ＰＭＰは、インビトロでロードすることができる。限定されないが、物理的、化学的及び／又は生物学的方法（例えば、組織培養物又は細胞培養物において）を用いて、物質をＰＭＰ上若しくは中にロードすることができる（例えば、ＰＭＰにより封入することができる）。例えば、異種植物改変剤は、エレクトロポレーション、超音波処理、受動的拡散、攪拌、脂質抽出又は押出しの１つ又は複数によってＰＭＰ中に導入することができる。ロードされた薬剤の存在又はレベルを確認するために、様々な方法、例えばＨＰＣＬ（例えば、小分子評価のため）；イムノブロッティング（例えば、タンパク質評価のため）；及び定量的ＰＣＲ（例えば、ヌクレオチドの評価のため）を用いて、ロードしたＰＭＰを評価することができる。しかし、当業者には、ＰＭＰへの目的の物質のローディングは、上に例示した方法に限定されるわけではないことが理解されるべきである。
一部の例では、異種植物改変剤をＰＭＰに共役させることができ、この場合、異種植物改変剤は、ＰＭＰに間接的又は直接結合若しくは連結される。例えば、１つ又は複数の植物改変剤が、ＰＭＰの脂質二重層に直接連結される（例えば、共有結合若しくはイオン結合により）ように、１つ又は複数の植物改変剤をＰＭＰに化学的連結させることができる。一部の例では、ＰＭＰに対する種々の植物改変剤の共役は、最初に、好適な溶媒中で１つ又は複数の異種植物改変剤を適切な架橋剤（例えば、Ｎ−エチルカルボ−ジイミド（「ＥＤＣ」）；これは、一般に、１級アミンとアミド結合のためのカルボキシル活性化剤として使用され、リン酸基とも反応する）と混合することによって達成することができる。異種植物改変剤と架橋剤の結合を可能にするのに十分なインキュベーション時間後、架橋剤／異種植物改変剤混合物をＰＭＰと合わせて、さらなるインキュベーション時間後、ショ糖勾配（例えば、８、３０、４５及び６０％ショ糖勾配）に付して、ＰＭＰに共役した植物改変剤から遊離異種植物改変剤及び遊離ＰＭＰを分離することができる。混合物をショ糖勾配と合わせるステップ及び付随の遠心分離ステップの一環として、植物改変剤に共役させたＰＭＰは、この時点で、ショ糖勾配中のバンドとして認められ、従って、次に、共役ＰＭＰを収集し、洗浄し、本明細書に記載の使用のために好適な溶液に溶解させることができる。
一部の例では、例えば植物へのＰＭＰの送達前及び送達後、ＰＭＰを異種植物改変剤と安定に結合させる。別の例では、例えば植物へのＰＭＰの送達後、異種植物改変剤がＰＭＰから解離されるように、ＰＭＰを異種植物改変剤と結合させる。
ＰＭＰは、ＰＭＰの機能的及び構造的特徴をさらに改変するように、他の要素（例えば、脂質、例えばステロール、例えばコレステロール；又は小分子）でさらに修飾することもできる。例えば、ＰＭＰの安定性を高める（例えば、室温で少なくとも１日及び／又は４℃で少なくとも１週間にわたって安定している）安定化分子でＰＭＰをさらに修飾することができる。
ＰＭＰには、具体的な薬剤又は使用に応じて、様々な濃度の異種植物改変剤をロードすることができる。例えば、一部の例では、本明細書に開示される植物改変組成物が、約０．００１、０．０１、０．１、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは９５（又は約０．００１から９５までの任意の範囲）以上のｗｔ％の植物改変剤を含むように、ＰＭＰにロードする。一部の例では、植物改変組成物が、約９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１．０、０．１、０．０１、０．００１（又は約９５から０．００１までの任意の範囲）以下のｗｔ％の植物改変剤を含むように、ＰＭＰにロードする。例えば、植物改変組成物は、約０．００１〜約０．０１ｗｔ％、約０．０１〜約０．１ｗｔ％、約０．１〜約１ｗｔ％、約１〜約５ｗｔ％又は約５〜約１０ｗｔ％、約１０〜約２０ｗｔ％の植物改変剤を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰに、約１、５、１０、５０、２００若しくは５００、１，０００、２，０００（又は約１から２，０００までの任意の範囲）以上のμｇ／ｍｌの植物改変剤をロードすることができる。一部の例では、約２，０００、１，０００、５００、２００、１００、５０、１０、５、１（又は約２，０００から１までの任意の範囲）以下のμｇ／ｍｌの植物改変剤をＰＭＰにロードすることができる。
一部の例では、ＰＭＰには、本明細書に開示される植物改変組成物が、少なくとも０．００１ｗｔ％、少なくとも０．０１ｗｔ％、少なくとも０．１ｗｔ％、少なくとも１．０ｗｔ％、少なくとも２ｗｔ％、少なくとも３ｗｔ％、少なくとも４ｗｔ％、少なくとも５ｗｔ％、少なくとも６ｗｔ％、少なくとも７ｗｔ％、少なくとも８ｗｔ％、少なくとも９ｗｔ％、少なくとも１０ｗｔ％、少なくとも１５ｗｔ％、少なくとも２０ｗｔ％、少なくとも３０ｗｔ％、少なくとも４０ｗｔ％、少なくとも５０ｗｔ％、少なくとも６０ｗｔ％、少なくとも７０ｗｔ％、少なくとも８０ｗｔ％、少なくとも９０ｗｔ％又は少なくとも９５ｗｔ％の植物改変剤をロードする。一部の例では、ＰＭＰには、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、少なくとも１，０００μｇ／ｍｌ、少なくとも２，０００μｇ／ｍｌの植物改変剤をロードすることができる。
ＰＭＰにロードすることができる具体的な植物改変剤の例は、「異種植物改変剤」と題するセクションでさらに概説する。
Ｄ．製剤
適用、取扱い、輸送、貯蔵及び活性を容易にするために、植物改変組成物を農業上許容される担体等の他の物質と一緒に製剤化することができる。植物改変組成物は、例えば、ベイト、濃縮エマルジョン、粉剤、乳剤、燻蒸剤、ゲル、顆粒、マイクロカプセル封入剤、種子処理剤、懸濁濃縮物、サスポエマルジョン剤、錠剤、水溶性液体、水分散性顆粒又はドライフロアブル剤、水和性粉剤及び極微量溶液に製剤化することができる。
植物改変組成物は、このような物質の濃縮製剤から調製される水性懸濁液又はエマルジョンとして適用することができる。こうした水溶性、水懸濁性又は乳化性製剤は、固体（通常、水和剤として知られる）、又は水分散性顆粒、又は通常、乳剤として知られる液体、又は水性懸濁液のいずれでもあり得る。圧縮して、水分散性顆粒を形成することができる水和剤は、植物改変組成物、担体及び界面活性剤の均質混合物を含む。担体は、通常、アタパルジャイト（ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ）クレイ、モンモリロナイト粘土、珪藻土又は精製ケイ酸から選択される。約０．５％〜約１０％の水和剤を含む、有効な界面活性剤としては、スルホン化リグニン、濃縮ナフタレンスルホネート、ナフタレンスルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、スルホン酸アルキル及びアルキルフェノールのエチレンオキシド付加物などの非イオン界面活性剤が挙げられる。
乳剤は、水溶性溶媒又は水溶性有機溶媒と乳化剤との混合物のいずれかである担体に溶解させた液体１リットル当たり約５０〜約５００グラムといった好適な濃度のＰＭＰ及び／又は植物改変剤を含有し得る。有用な有機溶媒としては、芳香油、特にキシレン及び石油留分、特に石油の高沸点ナフタレン及びオレフィン部分、例えば重質芳香族ナフサが挙げられる。また、他の有機溶媒、例えばロジン誘導体を含むテルペン溶媒、シクロヘキサノンなどの脂肪族ケトン及び２−エトキシエタノールなどの錯体アルコールを使用し得る。乳剤に好適な乳化剤は、一般的な陰イオン及び非イオン界面活性剤から選択される。
水性懸濁液は、約５％〜約５０重量％の範囲の植物改変組成物で水性担体中に分散される水不溶性農薬の懸濁液を含む。懸濁液は、有効物質を微粉砕し、これを、水及び界面活性剤を含む担体中に激しく混合することにより調製される。また、水性担体の密度及び粘性を増大するために、無機塩及び合成又は天然ゴムなどの材料を添加し得る。
植物改変組成物は、顆粒状組成物として適用され得、これは、特に土壌への適用に有用である。顆粒状組成物は、通常、粘土又は類似の物質を含む担体に分散させた約０．５％〜約１０重量％の植物改変組成物を含有する。こうした組成物は、通常、好適な溶媒に製剤を溶解させた後、約０．５〜約３ｍｍの範囲の適切な粒径に事前に形成された顆粒状担体に適用することにより調製される。こうした組成物は、担体と化合物のダフ又はペーストを作製し、粉砕した後、乾燥させて、所望の顆粒粒径を得ることによって製剤化され得る。
本組成物を含有する粉剤は、好適な粉末状の担体、例えばカオリンクレイ、摩砕した火山岩などと一緒に粉末状の植物改変組成物を均質混合することにより調製される。粉剤は、好適には、パケットの約１％〜約１０％を占め得る。粉剤は、ダストブロワー機で、種子粉衣又は葉適用として適用することができる。
同様に、好適な有機溶媒、通常、農業化学で広く使用されている石油、例えばスプレーオイル中の溶液の形態の本製剤を適用するのも実用的である。
植物改変組成物は、エアゾール組成物の形態で適用することもできる。こうした組成物では、パケットを、圧力発生噴霧剤混合物である担体に溶解又は分散させる。エアゾール組成物を容器内にパッケージし、この容器から霧状化弁を介して混合物を投与する。
別の実施形態は、水中油形エマルジョンであり、ここで、エマルジョンは、油滴を含み、これらは各々、ラメラ液晶コーティングを備え、水相に分散されており、ここで、各油滴は、農業的に有効な少なくとも１つの化合物を含み、（１）少なくとも１つの非イオン親油性界面活性剤、（２）少なくとも１つの非イオン親水性界面活性剤、及び（３）少なくとも１つのイオン界面活性剤を含むモノラメラ又はオリゴラメラ層で個別にコーティングされており、この場合、油滴は、８００ナノメートル未満の平均粒径を有する。上記実施形態に関するさらに詳細な情報は、２００７年２月１日に公開された米国特許出願公開第２００７００２７０３４号明細書に開示されている。使用しやすいように、この実施形態は、「ＯＩＷＥ」と呼ぶ。
加えて、一般に、上に開示した分子を製剤に使用する場合、こうした製剤は、他の成分も含有することができる。これらの成分として、限定されないが、（これは、非排他的且つ非相互排他的リストである）湿潤剤、展着剤、粘着剤、浸透剤、緩衝剤、金属イオン封鎖剤、ドリフト制御添加剤、適合性薬剤、消泡剤、洗浄剤及び乳化剤が挙げられる。いくつかの成分を以降に記載する。
湿潤剤は、液体に添加されると、液体と、それが展着される表面との間の界面張力を低減することにより、液体の展着又は浸透力を高める物質である。湿潤剤は、農業化学製剤の２つの主要な機能：処理及び製造工程中、水による粉末の湿潤速度を高めて、可溶性液体のための濃縮物又は懸濁剤を製造し；スプレータンク中で水と製品の混合工程中、水和剤の湿潤時間を短縮して、水分散性顆粒への水の浸透を改善するために使用される。水和剤、懸濁剤及び水分散性顆粒製剤に使用される湿潤剤の例は、ラウリル硫酸ナトリウム；ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム；アルキルフェノールエトキシレート；及び脂肪族アルコールエトキシレートである。
分散剤は、粒子の表面に吸着して、粒子の分散状態を保存することを促進すると共に、粒子が再凝集することを防ぐ物質である。分散剤は、製造工程中の分散及び懸濁を促進するため、且つスプレータンク内の水中に粒子を確実に再分散させるために農薬製剤に添加される。分散剤は、水和剤、懸濁剤及び水分散性顆粒剤に広く使用されている。分散剤として使用される界面活性剤は、粒子表面に強力に吸着して、粒子の再凝集に対する荷電又は立体障害をもたらす能力がある。最も一般的に使用される界面活性剤は、陰イオン、非イオン又はこれら２種類の混合物である。水和剤の場合、最も一般的な分散剤は、リグノスルホン酸ナトリウムである。懸濁剤の場合、高分子電解質、例えばナトリウムナフタレンスルホン酸ホルムアルデヒド縮合物を使用して、非常に優れた吸着及び安定化が達成される。トリスチリルフェノールエトキシレートリン酸エステルも使用される。アルキルアリールエチレンオキシド縮合物及びＥＯ−ＰＯブロックコポリマーなどの非イオン界面活性剤は、懸濁剤濃縮物として陰イオン界面活性剤と組み合わせる場合もある。近年、新たなタイプの非常に高分子量のポリマー界面活性剤が分散剤として開発されている。これらは、非常に長い疎水性「骨格」と、「コーム」界面活性剤の「歯」を形成する多数のエチレンオキシド鎖を有する。これらの高分子量ポリマーは、疎水性骨格が、粒子表面に多くの固定点を有することから、懸濁剤に対して非常に良好な長期安定性を付与することができる。農薬製剤に使用される分散剤の例は、リグノスルホン酸ナトリウム；ナトリウムナフタレンスルホン酸ホルムアルデヒド縮合物；トリスチリルフェノールエトキシレートリン酸エステル；脂肪族アルコールエトキシレート；アルキルエトキシレート；ＥＯ−ＰＯ（エチレンオキシド−プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；及びグラフトコポリマーである。
乳化剤は、別の液相中の１つの液相の液滴の懸濁を安定化させる物質である。乳化剤がなければ、２つの液体は、２つの非混和性液相中に分離するであろう。最も一般的に使用される乳化剤ブレンドは、１２以上のエチレンオキシド単位を有するアルキルフェノール又は脂肪族アルコールと、ドデシルベンゼンスルホン酸の油溶性カルシウム塩を含有する。８から１８までの親水性−親油性バランス（「ＨＬＢ」）値の範囲が、通常、優れた安定エマルジョンを提供する。エマルジョンの安定性は、時として、少量のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー界面活性剤の添加により改善することができる。
可溶化剤は、臨界ミセル濃度を超える濃度のミセル水溶液を形成する界面活性剤である。そのため、ミセルは、ミセルの疎水性部分内で水不溶性材料を溶解又は可溶化させることができる。可溶化のために通常使用される界面活性剤のタイプは、非イオン界面活性剤、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモノオレートエトキシレート及びオレイン酸メチルエステルである。
標的に対する植物改変組成物の生物学的性能を改善するために、界面活性剤が、単独で又はスプレータンクミックスへの補助剤としての鉱油若しくは植物油などの他の添加剤と一緒に使用される場合もある。バイオエンハンスメントのために使用される界面活性剤のタイプは、一般に、植物改変組成物の性質及び作用モードに応じて変わる。しかし、これらは、多くの場合、アルキルエトキシレート；直鎖脂肪族アルコールエトキシレート；脂肪族アミンエトキシレートといった非イオン界面活性剤である。
農薬製剤中の担体又は希釈剤は、必要な強度の製剤を提供するために植物改変組成物に添加される材料である。担体は、通常、高い吸収力を備える材料であるのに対し、希釈剤は、通常、低い吸収力を備える材料である。担体及び希釈剤は、粉剤、水和剤、顆粒及び水分散性顆粒の製剤に使用される。
有機溶媒は、主として、乳剤、水中油形エマルジョン、サスポエマルション及び極少量製剤、また程度は低いが顆粒剤の製剤に使用される。溶媒の混合物が使用される場合もある。溶媒の第１主要グループは、ケロセン又は精製パラフィンなどの脂肪族パラフィン油である。第２の主要グループ（及び最も一般的）は、キシレン及びＣ９及びＣ１０芳香族溶媒のより高分子量の画分などの芳香族溶媒を含む。塩素化炭化水素は、製剤を水に乳化する場合に植物改変組成物の結晶化を防止するための共溶媒として有用である。溶解力を高めるための共溶媒として、アルコールが使用される場合もある。他の溶媒としては、植物油、種子油及び植物及び種子油のエステルが挙げられ得る。
増粘剤又はゲル化剤は、主として、液体のレオロジー又は流動性を変化させるため、且つ分散した粒子又は液滴の分離及び沈殿を防止するために、懸濁剤、エマルジョン及びサスポエマルジョンの製剤に使用される。増粘剤、ゲル化剤及び沈殿防止剤は、概して２つのカテゴリー、即ち水不溶性粒子及び水溶性ポリマーに属する。粘土及びシリカを用いて、懸濁製剤を製造することが可能である。これらのタイプの材料の例として、限定されないが、モンモリロナイト粘土、ベントナイト、ケイ酸アルミニウムマグネシウム及びアタプルガイトが挙げられる。水溶性多糖が、増粘−ゲル化剤として長年使用されている。最も一般的に使用されている多糖のタイプは、種子及び海藻の天然抽出物であるか又はセルロースの合成誘導体である。これらのタイプの材料の例として、限定されないが、グアーガム；ローカストビーンガム；カラギーナン；アルギン酸塩；メチルセルロース；ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＳＣＭＣ）；ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）が挙げられる。他のタイプの沈殿防止剤は、加工デンプン、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール及びポリエチレンオキシドを基材とする。別の優れた沈殿防止剤は、キサンタンガムである。
微生物は、製剤化した製品の腐敗を引き起こし得る。そのため、微生物の作用を排除又は抑制するために、防腐剤が用いられる。こうした薬剤の例として、限定されないが、以下のものが挙げられる：プロピオン酸及びその塩；ソルビン酸及びそのナトリウム又はカリウム塩；安息香酸及びその塩；ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム塩；ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル；並びに１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン（ＢＩＴ）。
界面活性剤の存在は、往々にして、生成及びスプレータンクからの適用での混合工程中に、水性製剤を泡立たせる。泡立つ傾向を軽減するために、生産段階中又は瓶詰め前に消泡剤を添加することが多い。一般に、２種類の消泡剤、即ちシリコーン及び非シリコーンがある。シリコーンは、通常、ジメチルポリシロキサンの水性エマルジョンであり、非シリコーン消泡剤は、水不溶性油、例えばオクタノール及びノナノール又はシリカである。いずれの場合にも、消泡剤の機能は、界面活性剤を空気−水界面から移すことである。
「グリーン（Ｇｒｅｅｎ）剤」（例えば、助剤、界面活性剤、溶媒）は、作物保護製剤の環境フットプリント全体を低減することができる。グリーン剤は、生分解性であり、一般に、天然及び／又は持続可能な供給源、例えば植物及び動物源由来である。具体的な例は、植物油、種子油及びそれらのエステル、さらにはアルコキシル化アルキルフェノールポリグルコシドである。
一部の例では、植物改変組成物をフリーズドライ又は凍結乾燥することができる。米国特許第４，３１１，７１２号明細書を参照されたい。植物改変組成物は、後に水又は別の液体と接触させて再構成することができる。凍結乾燥若しくは再構成したものに他の成分、例えば他の植物改変剤、農薬用薬剤、農業的に許容可能な担体又は本明細書に記載の製剤に従う他の物質を添加することができる。
本組成物の他の任意の特徴は、ＵＶ及び／又は酸性条件から植物改変組成物を保護する担体又は送達ビヒクルを含む。一部の例では、送達ビヒクルは、ｐＨバッファーを含有する。一部の例では、組成物は、約４．５〜約９．０の範囲内のｐＨを有するように製剤化され、例えば約５．０〜約８．０、約６．５〜約７．５又は約６．５〜約７．０のいずれか１つのｐＨ範囲を含む。
農薬製剤に関するさらに詳細な情報については、以下を参照されたい：“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ａ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８ ｂｙ Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ。また、以下も参照されたい：“Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ−Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ”ｂｙ Ａ．Ｓ．Ｐｅｒｒｙ，Ｉ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｉ．Ｉｓｈａａｙａ，ａｎｄ Ｒ．Ｐｅｒｒｙ，ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８ ｂｙ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。
ＩＩ．植物改変方法
本明細書に記載の植物改変組成物は、様々な方法において有用である。本発明は、本明細書に記載の植物改変組成物を本明細書に記載の植物等の植物に送達するステップを含む。本組成物及び関連する方法は、植物の適応度を増加させるために植物又は植物部分（例えば、葉、根、花、果実若しくは種子）を改変させるために使用することができる。これらの方法の各々の詳細について、以下でさらに詳細に記載する。
Ａ．植物への送達
本明細書では、植物改変組成物を植物（例えば、「植物」と題するセクションで開示した植物等）に送達する方法が提供される。植物改変組成物を植物に、植物又はその部分を植物改変組成物と接触させることにより送達するための方法が含まれる。本方法は、植物の適応度を増加させるために植物を改変させるために有用である。
一態様において、本明細書では、植物の適応度を増加させる方法であって、非処理植物（植物改変組成物が送達されていない植物）と比較して植物の適応度を増加させるために、本明細書に記載した植物改変組成物を（例えば、有効な量及び期間で）植物に送達することを含む方法が提供される。
植物改変組成物の送達の結果としての植物の適応度の増加は、いくつかの様式で現れ得るが、例えばそれによって植物の良好な生産、例えば収量の改善、植物の活力又は植物から収穫される産物の質の改善、農業若しくは園芸のために望ましいと思われる収穫前若しくは収穫後の形質の向上（例えば、味、外観、貯蔵期間）又は他の点ではヒトに利益をもたらす形質の向上（例えば、アレルゲンの産生の低減）がもたらされる。植物の向上した収量は、同一条件下で、しかし本組成物を適用せずに生成された植物の同一産物の収量と比較して又は従来型植物改変剤（例えば、ＰＭＰを含まずに送達される植物改変剤）の適用と比較して、測定可能な量による植物の（例えば、植物バイオマス、穀類、種子若しくは果実収量、タンパク質含量、炭水化物若しくは油含量又は葉面積によって測定される）産物の収量の増加に関する。例えば、収量は、少なくとも約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％又は１００％超増加させることができる。一部の例では、本方法は、非処理植物に対して収量を約２倍、約５倍、約１０倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍、１００倍又は１００倍超増加させるために有効である。収量は、何らかの基準で、植物又は植物の産物の重量若しくは体積当たりの量に関して表すことができる。基準は、時間、栽培面積、生産された植物の重量又は使用した原材料の量に関して表すことができる。例えば、こうした方法は、限定されないが、種子、果汁、穀粒、実、塊茎、根及び葉をはじめとする植物組織の収量を増加させ得る。
植物改変組成物の送達の結果としての植物の適応度の増加は、同じ条件下であるが、本組成物を投与していないか、又は従来の植物改変剤（例えば、ＰＭＰなしで送達された植物改変剤）を適用して生産された植物の同じ要因と比較して、測定可能な若しくは認識可能な量による、以下の項目の増加若しくは改善：活力評価、作物（単位面積当たりの植物の数）、植物の高さ、茎外周、茎長さ、葉の数、葉の大きさ、植物キャノピー、外観（より緑色の葉色など）、根評価、出芽、タンパク質含量、分げつの増加、より大きい葉、より多くの葉、枯れた根出葉の減少、より強い分げつ力、必要な肥料の減少、必要な種子の減少、より高生産性の分げつ、より早期の開花、早期の穀粒若しくは種子成熟、より少ない植物倒伏（ｖｅｒｓｅ）（倒伏）、新芽生育増加、早期の発芽又はこれらの任意の組合せなどの他の手段により測定することもできる。
従って、本明細書では、植物を改変する方法であって、植物に、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を送達するステップを含み、植物を改変し、それにより植物における有益な形質を導入するか、又は非処理植物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超）増加させる方法が提供される。特に、本方法は、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させることができる。
一部の例では、植物の適応度の増加は、疾患耐性、干ばつ耐性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、金属耐性、除草剤耐性、薬剤耐性、水利用効率、窒素利用、窒素ストレス耐性、窒素固定、病虫害抵抗性、草食動物耐性、病原体抵抗性、収量、水不足条件下の収量、活力、増殖、光合成能力、栄養、タンパク質含量、炭水化物含量、油含量、バイオマス、新芽長、根長、根の構造、種子重又は収穫可能な産物の量における（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）増加である。
一部の例では、適応度の増加は、発生、成長、収量、非生物的ストレッサーに対する耐性又は生物的ストレッサーに対する耐性における（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）増加である。非生物的ストレスは、例えば、干ばつストレス、塩ストレス、熱ストレス、低温ストレス及び低栄養ストレスを含む、植物又は植物部分が曝される環境的ストレス条件を指す。生物的ストレスは、例えば、線虫ストレス、草食性昆虫ストレス、真菌病原体ストレス、病原菌ストレス又はウイルス病原体ストレスを含む、植物又は植物部分が曝される環境的ストレス条件を指す。ストレスは、一時的、例えば数時間、数日間、数カ月間又は植物の一生にわたる永久的であり得る。
一部の例では、植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の品質における（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）向上である。例えば、植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の商業的に好ましい特徴（例えば、味又は外観）における向上であり得る。他の例では、植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の貯蔵期間における（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）増加である。
代わりに、適応度の増加は、アレルゲンの産生の低減等のヒト又は動物の健康にとって有益である形質の変化であり得る。例えば、適応度の増加は、動物（例えば、ヒト）における免疫反応を刺激するアレルゲン（例えば、花粉）の産生における（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）低減であり得る。
植物の改変（例えば、適応度の増加）は、１つ以上の植物部分の改変から生じ得る。例えば、植物は、植物の葉、種子、花粉、根、果実、新芽、花、細胞、プロトプラスト又は組織（例えば、分裂組織）を接触させることにより改変できる。従って、別の態様において、本明細書では、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の花粉に、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
さらに別の態様において、本明細書では、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の種子に、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
また別の態様において、本明細書では、植物のプロトプラストに、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
別の態様において、本明細書では、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の植物細胞に、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
また別の態様において、本明細書では、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の分裂組織に、有効量の、本明細書に提供されるいずれかの植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
また別の態様において、本明細書では、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の胚芽に、有効量の、本明細書に提供される植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物に対して植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法が提供される。
Ｂ．適用方法
本明細書に記載の植物は、植物への組成物の送達又は投与を可能にする任意の好適な方法で、本明細書に記載の組成物のいずれかに曝露させることができる。植物改変組成物は、単独又は他の活性物質（例えば、施肥剤）若しくは非活性物質と組み合わせてのいずれでも送達され得、例えば有効濃度の植物改変組成物を送達するように製剤化された濃縮液、ゲル、溶液、懸濁液、散布液、粉末、ペレット、ブリケット、ブリック等の形態において、例えば噴霧、インジェクション（マイクロインジェクション）、植物経由、注入、浸漬によって適用され得る。本明細書に記載される組成物の適用量及び適用部位は、概して、植物の習性、植物を植物改変組成物により標的化することができる生活環ステージであるか、又は適用が行われる部位並びに植物改変組成物の物理的及び機能的特性によって決定される。
一部の例では、本組成物は、例えば、背負式散布、空中散布、作物散布／散粉等により、植物、例えば作物の上に直接噴霧される。植物改変組成物が植物に送達される例では、植物改変組成物を投与される植物は、いずれの植物成長段階でもあり得る。例えば、製剤化された植物改変組成物は、植物成長初期に種子コーティング又は経根処理として又は作物サイクル後期に植物全体の処理として適用することができる。一部の例では、植物改変組成物は、局所薬剤として植物に適用され得る。
さらに、植物改変組成物は、植物又は有害動物の組織を通じて吸収され、分布する浸透性薬剤として（例えば、植物が成長する土壌中又は植物の水やりに使用される水中に）適用され得る。一部の例では、植物又は飼料生物は植物改変組成物を発現するように遺伝的に形質転換され得る。
遅延放出又は継続的放出も、植物改変組成物又は植物改変組成物を含む組成物をゼラチンなどの溶解性又は生体内分解性コーティング層で被覆することにより、このコーティングが使用環境内で溶解又は分解し、次に植物改変組成物が利用可能になることで達成することができるか、又は薬剤を溶解性又は分解性マトリックス中に分散させることにより達成できる。有利には、こうした継続的放出及び／又は分注手段装置を使用して、本明細書に記載される植物改変組成物の１つ以上の有効濃度を常に維持することができる。
一部の例では、植物改変組成物は、植物の部分、例えば葉、種子、花粉、根、果実、新芽若しくは花又はそれらの組織、細胞若しくはプロトプラストに送達される。一部の例では、植物改変組成物は、植物の細胞に送達される。一部の例では、植物改変組成物は、植物のプロトプラストに送達される。一部の例では、植物改変組成物は、植物の組織に送達される。例えば、組成物は、植物の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、側部分裂組織又は節間分裂組織）に送達され得る。一部の例では、組成物は、植物の永久組織（例えば、単一組織（例えば、実質、厚角組織若しくは厚膜組織）又は複合永久組織（例えば、木質部若しくは師部）に送達され得る。一部の例では、組成物は、植物胚芽に送達される。
一部の例では、植物改変組成物は、野外適用の場合、１ヘクタール当たりのＰＭＰの量（ｇ／ｈａ若しくはｋｇ／ｈａ）又は１ヘクタール当たりの有効成分（例えば、植物改変剤）若しくは酸同等物の量（ｋｇ ａ．ｉ．／ｈａ若しくはａ．ｉ．／ｈａ）として推奨され得る。一部の例では、組成物中にＰＭＰを含まない植物改変剤を適用した場合と同じ結果を達成するために、本組成物中では、より少ない量の植物改変剤が土壌、植物培地、種子植物組織又は植物に適用されることが必要とされ得る。例えば、植物改変剤の量は、非ＰＭＰ組成物中に適用される同じ植物改変剤、例えばＰＭＰなしでの同じ植物改変剤の直接適用より約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０若しくは１００倍（又は約２から約１００倍までの任意の範囲、例えば約２〜１０倍；約５〜１５倍、約１０〜２０倍；約１０〜５０倍）低いレベルで適用され得る。本発明の植物改変組成物は、１ヘクタール当たりの様々な量で、例えば約０．０００１、０．００１、０．００５、０．０１、０．１、１、２、１０、１００、１，０００、２，０００、５，０００（又は約０．０００１〜５，０００の任意の範囲）ｋｇ／ｈａで適用することができる。例えば、約０．０００１〜約０．０１、約０．０１〜約１０、約１０〜約１，０００、約１，０００〜約５，０００ｋｇ／ｈａである。
ＩＩＩ．植物
多様な植物に本明細書に記載の植物改変組成物を送達するか又はそうした植物をそれで処理することができる。本方法に従って植物改変組成物を送達する（即ち「処理する」）ことができる植物として、全植物及びそれらの部分があり、そうした部分として、限定されないが、新芽植物器官／構造（例えば、葉、茎及び塊茎）、根、花及び花器／構造（例えば、包葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯及び胚珠）、種子（胚、胚乳、子葉及び種皮を含む）並びに果実（成熟した子房）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）並びに細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞など）並びにこれらの子孫が挙げられる。植物部分は、さらに、新芽、根、茎、種子、托葉、葉、花弁、花、胚珠、包葉、枝、葉柄、節間板、樹皮、軟毛、分げつ、根茎、葉状体、葉身、花粉、雄蕊などの植物部分も示し得る。
本明細書に開示される方法で処理することができる植物の種類は、高等及び下等植物の種類を含み、こうした植物として、被子植物（単子葉及び双子葉植物）、裸子植物、シダ、トクサ、裸茎植物（ｐｓｉｌｏｐｈｙｔｅｓ）、ヒカゲノカズラ（ｌｙｃｏｐｈｙｔｅ）、コケ類及び藻類（例えば、多細胞若しくは単細胞藻類）が挙げられる。本方法に従って処理することができる植物は、さらに、あらゆる維管束植物、例えば単子葉若しくは双子葉又は裸子植物を含み、こうしたものとして、限定されないが、アルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、バナナ、オオムギ、カノーラ、トウゴマ、キク、クローバー、カカオ、コーヒー、綿、綿実、トウモロコシ、クランベ、クランベリー、キュウリ、デンドロビウム、ヤマイモ、ユーカリ属、ウシノケグサ、亜麻、グラジオラス、ユリ科、亜麻仁、キビ、マスクメロン、カラシ、オーツムギ、アブラヤシ、アブラナ、パパイヤ、ピーナッツ、パイナップル、観賞植物、インゲンマメ、ジャガイモ、ナタネ、コメ、ライムギ、ライグラス、ベニバナ、ゴマ、モロコシ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、芝草、コムギ並びにレタス、セロリ、ブロッコリー、カリフラワー、ウリ科植物などの野菜作物；リンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ペカン、クルミ、ヘーゼルなどの果実及び堅果樹；ブドウ（例えば、ブドウ園）、キウイ、ホップなどのブドウ；ラズベリー、ブラックベリー、セイヨウスグリなどの果実低木及びキイチゴ；セイヨウトネリコ、マツ、モミ、カエデ、オーク、クルミ、ポプラなどの森林樹；さらにはアルファルファ、カノーラ、トウゴマ、トウモロコシ、綿、クランベ、亜麻、亜麻仁、カラシ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、ジャガイモ、コメ、ベニバナ、ゴマ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト及びコムギが挙げられる。本発明の方法に従って処理することができる植物は、あらゆる作物植物、例えば飼料作物、油料種子作物、穀類作物、果実作物、野菜作物、繊維作物、香辛料作物、堅果作物、芝作物、砂糖作物、飲料作物及び森林作物が挙げられる。特定の例では、本方法で処理される作物植物は、ダイズ植物である。他の特定の例では、作物植物は、コムギである。特定の例では、作物植物は、トウモロコシである。特定の例では、作物植物は、綿である。特定の例では、作物植物は、アルファルファである。特定の例では、作物植物は、テンサイである。特定の例では、作物植物は、コメである。特定の例では、作物植物は、ジャガイモである。特定の例では、作物植物は、トマトである。
特定の例では、植物は、穀類である。こうした穀類植物の例として、限定されないが、単子葉又は双子葉植物があり、こうしたものとして、限定されないが、カエデ属種（Ａｃｅｒ ｓｐｐ．）、ネギ属種（Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、アマランサス属種（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、セロリ（Ａｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、ラッカセイ属種（Ａｒａｃｈｉｓ ｓｐｐ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ビート（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ．）（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ．）（カノーラ、ナタネ、アブラナ（ｔｕｒｎｉｐ ｒａｐｅ））、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、カンナ・インディカ（Ｃａｎｎａ ｉｎｄｉｃａ）、大麻サライバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｌｉｖａ）、トウガラシ属種（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｓｐｐ．）、クリ属種（Ｃａｓｔａｎｅａ ｓｐｐ．）、エンダイブ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｅｎｄｉｖｉａ）、シトルラス・ラナタス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）、シトラス属種（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココス属種（Ｃｏｃｏｓ ｓｐｐ．）、コフィア属種（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、コリアンドラム・サティヴァム（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、コリラス属種（Ｃｏｒｙｌｕｓ ｓｐｐ．）、クラタエグス属種（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ ｓｐｐ．）、ククルビタ属種（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｓｐｐ．）、ククミス属種（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓｐｐ．）、ダウクス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ファグス属種（Ｆａｇｕｓ ｓｐｐ．）、フィクス・カリカ（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、フラガリア属種（Ｆｒａｇａｒｉａ ｓｐｐ．）、ギンクゴ・ビロバ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）、グリシン属種（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｐｐ．）（例えば、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ソーヤ・ヒスピダ（Ｓｏｊａ ｈｉｓｐｉｄａ）若しくはソーヤ・マックス（Ｓｏｊａ ｍａｘ））、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ヘリアンタス属種（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、ヘリアンタス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ハイビスカス属種（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｐｐ．）、ホルデウム属種（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、イポメア・バタタス（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）、ジュグランス属種（Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｐｐ．）、ラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、リナム・ウシタチシム（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、リッチ・チネンシス（Ｌｉｔｃｈｉ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ロータス属種（Ｌｏｔｕｓ ｓｐｐ．）、ルッファ・アクタングラ（Ｌｕｆｆａ ａｃｕｔａｎｇｕｌａ）、ルピナス属種（Ｌｕｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、リコペルシコン属種（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｐｐ．）（例えば、リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｒｎ）、リコペルシコン・リコペルシカム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、リコペルシコン・ピリフォルメ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ））、マルス属種（Ｍａｌｕｓ ｓｐｐ．）、メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、メンタ属種（Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｐ．）、ミスカンサス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、モルス・ニグラ（Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａ）、ムサ属種（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、ニコチアナ属種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐｐ．）、オレア属種（Ｏｌｅａ ｓｐｐ．）、オリザ属種（Ｏｒｙｚａ ｓｐｐ．）（例えば、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・ラチフォリア（Ｏｒｙｚａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ））、パニカム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、パニカム・ヴィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、パッシフロラ・エドゥリス（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）、ペトローズリヌム・クリスプム（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｃｒｉｓｐｕｍ）、ファセオルス属種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、ピヌス属種（Ｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、ピスタシア・ヴェラ（Ｐｉｓｔａｃｉａ ｖｅｒａ）、ピスム属種（Ｐｉｓｕｍ ｓｐｐ．）、ポア属種（Ｐｏａ ｓｐｐ．）、ポプルス属種（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐｐ．）、プルヌス属種（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ．）、ピルス・コムニス（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ケルクス属種（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｐｐ．）、ラファヌス・サティバス（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、レウム・ラバルバルム（Ｒｈｅｕｍ ｒｈａｂａｒｂａｒｕｍ）、リベス属種（Ｒｉｂｅｓ ｓｐｐ．）、リシナス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ルブス属種（Ｒｕｂｕｓ ｓｐｐ．）、サッカルム属種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、サリクス属種（Ｓａｌｉｘ ｓｐ．）、サンブクス属種（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｐｐ．）、セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、セサマム属種（Ｓｅｓａｍｕｍ ｓｐｐ．）、シナピス属種（Ｓｉｎａｐｉｓ ｓｐｐ．）、ソラナム属種（Ｓｏｌａｎｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、ソラナム・トゥーベロースム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ソラナム・インテグリフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉｕｍ）又はソラナム・リコペルシコン（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、ソルガム・バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ハレペンス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、スピナシア属種（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｓｐｐ．）、タマリンヅス・インディカ（Ｔａｍａｒｉｎｄｕｓ ｉｎｄｉｃａ）、テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、トリフォリウム属種（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、トリチコセケル・リンパウイ（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ ｒｉｍｐａｕｉ）、トリチカム属種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、トリチカム・エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリチカム・デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、トリチカム・ツルギダム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ）、トリチカム・ハイベルナム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｈｙｂｅｒｎｕｍ）、トリチカム・マチャ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍａｃｈａ）、トリチカム・サティヴァム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）若しくはトリチカム・バルガレ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、バクシニウム属種（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｓｐｐ．）、ビキア属種（Ｖｉｃｉａ ｓｐｐ．）、ビグナ属種（Ｖｉｇｎａ ｓｐｐ．）、ビオラ・オドラータ（Ｖｉｏｌａ ｏｄｏｒａｔａ）、ビチス属種（Ｖｉｔｉｓ ｓｐｐ．）及びゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）から選択される飼料若しくはマメ科牧草、観賞植物、食用作物、樹木又は低木が挙げられる。特定の実施形態では、作物植物は、コメ、アブラナ、カノーラ、ダイズ、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）（トウモロコシ（ｍａｉｚｅ））、綿、サトウキビ、アルファルファ、モロコシ又はコムギである。
特定の例では、本組成物及び方法を使用して、収穫後の植物若しくは植物部分又は飼料製品を処理することができる。一部の例では、食料又は飼料製品は、非植物食料又は飼料製品（例えば、ヒト、動物又は家畜が摂食可能な製品（例えば、キノコ））である。
本発明で使用される植物又は部分は、あらゆる植物発生段階の植物を含む。特定の例では、送達は、発芽、苗木成長、栄養成長及び生殖成長の段階で行う。特定の例では、植物への送達は、栄養成長及び生殖成長段階で行うことができる。一部の例では、組成物は、植物の花粉に送達される。一部の例では、組成物は、植物の種子に送達される。一部の例では、組成物は、植物のプロトプラストに送達される。一部の例では、組成物は、植物の組織に送達される。例えば、組成物は、植物の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、側部分裂組織又は節間分裂組織）に送達され得る。一部の例では、組成物は、植物の永久組織（例えば、単一組織（例えば、実質、厚角組織若しくは厚膜組織）又は複合永久組織（例えば、木質部若しくは師部）に送達され得る。一部の例では、組成物は、植物胚芽に送達される。一部の例では、組成物は、植物細胞に送達される。栄養成長及び生殖成長の段階は、本明細書において「成体」又は「成熟」植物とも呼ばれる。
組成物が植物部分に送達される例において、植物部分は、植物改変剤によって改変され得る。代わりに、植物改変剤は、植物の他の部分に分配され、引き続いて植物改変剤によって改変され得る。
ＩＶ．異種植物改変剤
本明細書に記載される植物改変組成物としては、１種以上の異種植物改変剤が挙げられる。例えば、ＰＭＰは、異種植物改変剤を封入し得る。代わりに又は加えて、異種植物改変剤は、ＰＭＰの表面に埋め込まれるか共役され得る。
一部の例では、植物改変剤は、ペプチド又は核酸を含み得る。植物改変剤は、様々な植物の適応度を増加させる薬剤又は１種以上の特定植物（例えば、植物の特定の種若しくは属）を標的とする薬剤であり得る。加えて、一部の例では、植物改変組成物は、２種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種又は１０種超）の様々な植物改変剤を含む。一部の例では、異種植物改変剤は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含み、例えば１種以上のＲＮＡ結合タンパク質と関連する１つ以上のＲＮＡ分子を含む。
さらに、一部の例では、異種植物改変剤（例えば、核酸分子又はペプチドを含む薬剤）は、改変され得る。例えば、改変は、化学的改変、例えばマーカへの共役、例えば蛍光マーカ又は放射性マーカであり得る。他の例では、改変は、薬剤、例えば脂質、グリカン、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、カチオン部分の安定性、送達、標的化、バイオアベイラビリティ又は半減期を強化する部との共役又は機能的連絡を含み得る。
本明細書に開示される植物改変組成物及び方法において使用することができる異種植物改変剤（例えば、ペプチド又は核酸）の例を以下に概説する。
Ａ．ポリペプチド
本明細書に記載の植物改変組成物（例えば、ＰＭＰ）は、異種ポリペプチドを含み得る。一部の例では、本明細書に記載の植物改変組成物は、ポリペプチド又は植物を改変する（例えば、植物の適応度を増加させる）その機能的断片又は誘導体を含む。例えば、ポリペプチドは、植物の適応度を増加させることができる。本明細書に記載のポリペプチドを含む植物改変組成物は、（ａ）標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のポリペプチド濃度を達成し；且つ（ｂ）植物を改変する（例えば、植物の適応度を増加させる）のに十分な量及び時間で植物と接触させることができる。
本発明で使用することができるポリペプチドの例として、酵素（例えば、代謝リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、ＲＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ若しくはユビキチン化タンパク質）、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ＴＡＬＥＮ若しくはジンクフィンガー）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンが挙げられ得る。
本発明に含まれるポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド又は組換えにより作製された変異体を含み得る。一部の例では、ポリペプチドは、その機能性断片又は変異体（例えば、酵素として活性の断片又はその変異体）であり得る。例えば、ポリペプチドは、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるポリペプチド又は天然に存在するポリペプチドの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する本明細書に記載される任意のポリペプチドの機能的に活性な変異体であり得る。一部の例では、ポリペプチドは、目的のタンパク質と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれを超える）同一性を有し得る。
本明細書に記載のポリペプチドは、本明細書に記載される使用のいずれかのために組成物に配合することができる。本明細書に開示される組成物は、任意の数又は種類（例えば、クラス）のポリペプチド、例えば少なくとも約１つのポリペプチド、２、３、４、５、１０、１５、２０若しくはそれを超えるポリペプチドを含み得る。組成物中の各ポリペプチドの好適な濃度は、ポリペプチドの有効性、安定性、組成物中の個別のポリペプチドの数、配合及び組成物の適用方法などの要因に応じて変動する。一部の例では、液体組成物中の各ポリペプチドは、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。一部の例では、固体組成物中の各ポリペプチドは、約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇである。
ポリペプチドを作製する方法は、当技術分野においてルーティンである。一般的に、Ｓｍａｌｅｓ＆Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ＆Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。
ポリペプチドを作製する方法は、植物細胞での発現を含むが、適切なプロモータの制御下、昆虫細胞、酵母、細菌、哺乳動物細胞又は他の細胞を用いて、組換えタンパク質を作製することもできる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点などの非転写エレメント、好適なプロモータ及びエンハンサー並びに他の５’若しくは３’フランキング非転写配列及び必要なリボソーム結合部位などの５’若しくは３’非転写配列、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位並びに終結配列を含み得る。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、早期プロモータ、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位を用いて、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝子エレメントを提供することもできる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主と一緒に使用するのに適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
様々な哺乳動物細胞培養系を使用して、組換えポリペプチド薬剤を発現させて、製造することができる。哺乳動物発現系の例としては、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬＡ及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬生産のための宿主細胞培養の方法は、例えば、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ（Ｅｄｓ．），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１４）に記載されている。タンパク質の精製については、Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。タンパク質治療薬の製剤化については、Ｍｅｙｅｒ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｅｒｉｅｓ（２０１２）に記載されている。
一部の例では、植物改変組成物は、抗体又はその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書に記載される薬剤は、植物の要素の活動及び／若しくは機能を遮断又は増強する抗体であり得る。抗体は、植物中のポリペプチド（例えば、酵素若しくは細胞受容体）のアンタゴニスト又はアゴニストとして作用し得る。標的抗原に対する抗体の作製及び使用は、当技術分野において公知である。例えば、抗体操作、変性オリゴヌクレオチドの使用、５’−ＲＡＣＥ、ファージディスプレイ及び突然変異誘発；抗体試験及び特性決定；抗体薬物動態及び薬物力学；抗体精製及び保存；並びにスクリーニング及び標識技法を含む、組換え抗体を作製する方法については、以下を参照されたい：Ｚｈｉｑｉａｎｇ Ａｎ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，２００９、さらにはＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（Ｅｄ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１３。
Ｂ．核酸
一部の例では、本明細書に記載のＰＭＰは、異種核酸を含む。本明細書に記載の植物改変組成物及び方法において、多数の核酸が有用である。本明細書に開示される植物改変組成物は、任意の数又は種類（例えば、クラス）の核酸（例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）若しくは阻害性ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ）又はハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ分子）、例えば少なくとも約１クラス又は変異体の核酸、２、３、４、５、１０、１５、２０又はそれを超えるクラス又は変異体の核酸を含み得る。組成物中の各核酸の好適な濃度は、核酸の有効性、安定性、個別の核酸の数、製剤、組成物の適用方法等の要因に応じて変動する。本発明で有用な核酸の例としては、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質低分子干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、（非対称干渉ＲＮＡ）ａｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、リボザイム、デオキシリボザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）、アプタマー（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はＤＮＡ分子を含む。核酸は、当技術分野において核酸が安定している、例えばヌクレアーゼ耐性であることを保証することが知られている任意の方法で他の要素（例えば、ポリペプチド）と結合され得る。例えば、核酸は、タンパク質と複合化された場合にヌクレアーゼ耐性であり得る。
本明細書に記載の核酸を含む植物改変組成物は、（ａ）標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の核酸濃度を達成し；且つ（ｂ）植物を改変する（例えば、植物の適応度を増加させる）のに十分な量及び時間で植物と接触させることができる。
（ａ）ポリペプチドをコードする核酸
一部の例では、植物改変組成物は、ポリペプチドをコードする核酸を含む。ポリペプチドをコードする核酸は、約１０〜約５０，０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約２５〜約１００ｎｔ、約５０〜約１５０ｎｔ、約１００〜約２００ｎｔ、約１５０〜約２５０ｎｔ、約２００〜約３００ｎｔ、約２５０〜約３５０ｎｔ、約３００〜約５００ｎｔ、約１０〜約１０００ｎｔ、約５０〜約１０００ｎｔ、約１００〜約１０００ｎｔ、約１０００〜約２０００ｎｔ、約２０００〜約３０００ｎｔ、約３０００〜約４０００ｎｔ、約４０００〜約５０００ｎｔ、約５０００〜約６０００ｎｔ、約６０００〜約７０００ｎｔ、約７０００〜約８０００ｎｔ、約８０００〜約９０００ｎｔ、約９０００〜約１０，０００ｎｔ、約１０，０００〜約１５，０００ｎｔ、約１０，０００〜約２０，０００ｎｔ、約１０，０００〜約２５，０００ｎｔ、約１０，０００〜約３０，０００ｎｔ、約１０，０００〜約４０，０００ｎｔ、約１０，０００〜約４５，０００ｎｔ、約１０，０００〜約５０，０００ｎｔ又はこれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。
植物改変組成物は、目的の核酸配列の機能的に活性の変異体も含み得る。一部の例では、核酸の変異体は、例えば、目的の核酸の配列と、指定領域にわたって又は配列全体にわたって少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。一部の例では、本発明は、本明細書に記載される通りの核酸変異体によりコードされる機能的に活性のポリペプチドを含む。一部の例では、核酸変異体によりコードされる機能的に活性のポリペプチドは、例えば、目的のポリペプチドの配列又は天然由来のポリペプチド配列と、指定領域にわたって又はアミノ酸配列全体にわたって少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
タンパク質をコードする核酸を発現させる特定の方法は、適切なプロモータの制御下で、昆虫、酵母、植物、細菌又は他の細胞をはじめとする細胞における発現を含み得る。発現ベクターは、複製起点などの非転写エレメント、好適なプロモータ及びエンハンサー並びに他の５’若しくは３’フランキング非転写配列及び必要なリボソーム結合部位などの５’若しくは３’非転写配列、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位並びに終結配列を含み得る。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、早期プロモータ、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位を用いて、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝子エレメントを提供することもできる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主と一緒に使用するのに適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２に記載されている。
組換え方法を用いた遺伝子修飾は、当技術分野で公知である。所望の遺伝子をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の組換え方法を用いて、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリのスクリーニング、それを含むことが分かっているベクターからのその遺伝子の誘導又は標準技術を用いた、それを含む細胞及び組織からの直接単離などによって取得することができる。代わりに、目的の遺伝子をクローニングではなく、合成により作製することもできる。
天然又は合成核酸の発現は、典型的に、目的の遺伝子をコードする核酸をプロモータと作動可能に連結して、構築物を発現ベクターに組み込むことにより、達成される。発現ベクターは、細菌内での複製及び組込みに好適であり得る。発現ベクターは、真核生物内での複製及び発現にも好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネータ、開始配列並びに所望の核酸配列の発現に有用なプロモータを含む。
更なるプロモータエレメント、例えばエンハンサーが、転写開始の頻度を調節する。典型的に、これらは、開始部位の３０〜１１０塩基対（ｂｐ）上流に位置するが、近年、いくつかのプロモータは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが判明している。プロモータエレメント同士の間隔は、多くの場合、柔軟であり、エレメントが互いに対して反転又は移動した場合も、プロモータ機能は保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモータの場合、プロモータエレメント同士の間隔は、活性が低減し始めるまで、最大５０ｂｐに増加することができる。プロモータに応じて、個別のエレメントは、転写を活性化するために、共同又は独立のいずれかで機能し得ると思われる。
好適なプロモータの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列である。このプロモータ配列は、そこに作動可能に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモータ配列である。好適なプロモータの別の例は、伸長成長因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかし、他の構成的プロモータ配列を使用することもでき、限定はされないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモータ、ＭｏＭｕＬＶプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス前初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ並びにヒト遺伝子プロモータ、例えば、限定はされないが、アクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ及びクレアチンキナーゼプロモータが挙げられる。
代わりに、プロモータは、誘導性プロモータであり得る。誘導性プロモータの使用は、そのような発現が要望される場合、それが作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、又は発現が求められない場合には発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモータの例として、限定はされないが、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ及びテトラサイクリンプロモータが挙げられる。
導入しようとする発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染させようとする細胞の個体群からの発現細胞の同定及び選択を促進するために、選択性マーカ遺伝子若しくはリポータ遺伝子のいずれか又はその両方を含有し得る。他の態様では、選択性マーカをＤＮＡの個別の部分に担持させて、同時トランスフェクション法に使用し得る。宿主細胞での発現を可能にするために、選択性マーカ及びリポータ遺伝子の両方を適切な調節配列とフランキングさせ得る。有用な選択性マーカとして、例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子がある。
潜在的に形質転換された細胞を同定するため及び調節配列の機能性を評価するために、リポータ遺伝子を用いることができる。一般に、リポータ遺伝子は、レシピエント供給源に存在しないか、又はそれにより発現される遺伝子であり、何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって発現が呈示されるポリペプチドをコードする。リポータ遺伝子の発現は、ＤＮＡをレシピエント細胞に導入した後、好適な時点でアッセイする。好適なリポータ遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９−８２，２０００）。好適な発現系は、よく知られており、公知の技術を用いて調製することができるか又は市販のものを取得し得る。一般に、リポータ遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物は、プロモータとして同定される。こうしたプロモータ領域は、リポータ遺伝子に連結することができ、プロモータ駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用することができる。
一部の例では、生物を遺伝子修飾して、１つ以上のタンパク質の発現を改変することができる。１つ以上のタンパク質の発現は、特定の時点、例えば生物の発育又は分化状態について改変することができる。一例では、本発明は、１つ以上のタンパク質、例えば活性、構造又は機能の発現に影響するタンパク質の発現を改変するための組成物を含む。１つ以上のタンパク質の発現を特定の位置に限定することも又は生物全体に広げることもできる。
（ｂ）合成ｍＲＮＡ
植物改変組成物は、合成ｍＲＮＡ分子、例えばポリペプチドをコードする合成ｍＲＮＡ分子を含み得る。合成ｍＲＮＡ分子は、例えば、化学的に修飾することができる。ｍＲＮＡ分子は、例えば、化学的に合成するか又はインビトロで転写することができる。ｍＲＮＡ分子は、プラスミド、例えばウイルスベクター、細菌ベクター又は真核生物発現ベクターに配置することができる。一部の例では、ｍＲＮＡ分子は、トランスフェクション、エレクトロポレーション又は形質導入（例えば、アデノウイルス若しくはレンチウイルス形質導入）により、細胞に送達することができる。
一部の例では、本明細書に記載される目的の修飾ＲＮＡ薬剤は、修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを有する。こうした修飾は、公知であり、例えば国際公開第２０１２／０１９１６８号パンフレットに記載されている。更なる修飾は、例えば、国際公開第２０１５／０３８８９２号パンフレット；同第２０１５／０３８８９２号パンフレット；同第２０１５／０８９５１１号パンフレット；同第２０１５／１９６１３０号パンフレット；同第２０１５／１９６１１８号パンフレット及び同第２０１５／１９６１２８ Ａ２号パンフレットに記載されている。
一部の例では、目的のポリペプチドをコードする修飾ＲＮＡは、１つ以上の末端修飾、例えば５’キャップ構造及び／又はポリＡテール（例えば、１００〜２００ヌクレオチド長）を有する。５’キャップ構造は、ＣａｐＯ、Ｃａｐｌ、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎｌ−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン及び２−アジド−グアノシンからなる群から選択され得る。一部のケースでは、修飾ＲＮＡは、少なくとも１つのコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む５’ＵＴＲと、３’ＵＴＲとを含有する。こうした修飾は、公知であり、例えば国際公開第２０１２／１３５８０５号パンフレット及び同第２０１３／０５２５２３号パンフレットに記載される。更なる末端修飾は、例えば、国際公開第２０１４／１６４２５３号パンフレット及び同第２０１６／０１１３０６号パンフレット、国際公開第２０１２／０４５０７５号パンフレット及び同第２０１４／０９３９２４号パンフレットに記載されている。少なくとも１つの化学修飾を含み得るキャップＲＮＡ分子（例えば、修飾ｍＲＮＡ）を合成するためのキメラ酵素は、国際公開第２０１４／０２８４２９号パンフレットに記載されている。
一部の例では、修飾ｍＲＮＡを環状化又はコンカテマー化して、ポリＡ結合タンパク質と５’末端結合タンパク質との相互作用を補助する翻訳コンピテント分子を作製することができる。環状化又はコンカテマー化のメカニズムは、少なくとも３つの異なる経路：１）化学、２）酵素、及び３）リボザイム触媒を通して起こり得る。新たに形成される５’−／３’−結合は、分子内又は分子間のいずれでもあり得る。こうした修飾は、国際公開第２０１３／１５１７３６号パンフレットに記載されている。
修飾ＲＮＡを作製及び精製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、修飾ＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）酵素合成のみを用いて作製される。ＩＶＴポリヌクレオチドを作製する方法は、当技術分野で公知であり、国際公開第２０１３／１５１６６６号パンフレット、同第２０１３／１５１６６８号パンフレット、同第２０１３／１５１６６３号パンフレット、同第２０１３／１５１６６９号パンフレット、同第２０１３／１５１６７０号パンフレット、同第２０１３／１５１６６４号パンフレット、同第２０１３／１５１６６５号パンフレット、同第２０１３／１５１６７１号パンフレット、同第２０１３／１５１６７２号パンフレット、同第２０１３／１５１６６７号パンフレット及び同第２０１３／１５１７３６号パンフレットに記載されている。精製方法には、複数のチミジン若しくはその誘導体及び／又は複数のウラシル若しくはその誘導体（ポリＴ／Ｕ）に連結させた表面とサンプルを、ＲＮＡ転写物が表面に結合するような条件下で接触させた後、表面から精製ＲＮＡ転写物を溶出させることにより、ポリＡテールを含むＲＮＡ転写物を精製する方法（国際公開第２０１４／１５２０３１号パンフレット）；スケーラブルな方法で１０，０００ヌクレオチド長までの長いＲＮＡの分離を可能にするイオン（例えば、アニオン）交換クロマトグラフィーを用いる方法（国際公開第２０１４／１４４７６７号パンフレット）；並びに修飾ｍＲＮＡサンプルをＤＮＡｓｅ処理に付す方法（国際公開第２０１４／１５２０３０号パンフレット）を含む。
修飾ＲＮＡの製剤は公知であり、例えば国際公開第２０１３／０９０６４８号パンフレットに記載されている。例えば、製剤は、限定はされないが、ナノ粒子、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リピドイド、リポプレクス、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単糖を含む）、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンハイドロゲル、フィブリングルー、フィブリンシーラント、フィブリノーゲン、トロンビン、急速排出脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）及びこれらの組合せであり得る。
ヒトの疾患、抗体、ウイルス及び様々なインビボ環境の分野におけるポリペプチドをコードする修飾ＲＮＡは、公知であり、例えば国際公開第２０１３／１５１６６６号パンフレット、同第２０１３／１５１６６８号パンフレット、同第２０１３／１５１６６３号パンフレット、同第２０１３／１５１６６９号パンフレット、同第２０１３／１５１６７０号パンフレット、同第２０１３／１５１６６４号パンフレット、同第２０１３／１５１６６５号パンフレット、同第２０１３／１５１７３６号パンフレットの表６；国際公開第２０１３／１５１６７２号パンフレットの表６及び表７；国際公開第２０１３／１５１６７１号パンフレットの表６、表１７８及び表１７９；国際公開第２０１３／１５１６６７号パンフレットの表６、表１８５及び表１８６に開示されている。前述のいずれかは、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド又は環状ポリヌクレオチドとして合成され得、それぞれ１つ以上の修飾ヌクレオチド又は末端修飾を含み得る。
（ｃ）阻害性ＲＮＡ
一部の例では、植物改変組成物は、阻害性ＲＮＡ分子、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して作用する阻害性ＲＮＡ分子を含む。一部の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、植物における遺伝子発現のレベルを低減させ、且つ／又は植物におけるタンパク質のレベルを低減させる。一部の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、植物遺伝子の発現を阻害する。例えば、阻害性ＲＮＡ分子は、植物の１遺伝子をターゲティングする低分子干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ及び／又はマイクロＲＮＡを含み得る。特定のＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介して遺伝子発現を阻害することができる。ＲＮＡｉ分子は、典型的に、１５〜５０塩基対（例えば、約１８〜２５塩基対）を含むＲＮＡ又はＲＮＡ様構築物を含み、細胞内の発現された標的遺伝子中のコード配列と同一（相補的）であるか又はほぼ同一（実質的に相補的）なヌクレオ塩基配列を有する。ＲＮＡｉ分子としては、限定はされないが、ダイサー基質低分子干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、部分二重鎖（ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）、ダイサー基質及び多価ＲＮＡ干渉（米国特許第８，０８４，５９９号明細書、同第８，３４９，８０９号明細書、同第８，５１３，２０７号明細書及び同第９，２００，２７６号明細書）が挙げられる。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉを介して標的遺伝子の発現を低減するヘアピンターンを含むＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション又は形質導入により）、プラスミド、例えばウイルス若しくは細菌ベクターの形態で細胞に送達することができる。マイクロＲＮＡは、典型的に、約２２ヌクレオチド長を有するノンコーディングＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子上の標的部位に結合し、例えばｍＲＮＡの切断、ｍＲＮＡの不安定化又はｍＲＮＡの翻訳の阻害を引き起こすことにより、ｍＲＮＡを抑制する。一部の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、機能の負調節因子のレベル及び／又は活性を低減させる。他の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、機能の正調節因子のレベル及び／又は活性を低減させる。阻害性ＲＮＡ分子は、例えば、化学的に合成するか又はインビトロで転写することができる。
一部の例では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡである。一部の例では、ＲＮＡは、阻害性ＲＮＡである。一部の例では、阻害性ＲＮＡは、植物における遺伝子発現を阻害する。一部の例では、核酸は、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ又は植物において酵素（例えば、代謝リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、ＲＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ又はユビキチン化タンパク質）の発現を増大するＤＮＡ分子、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ＴＡＬＥＮ若しくはジンクフィンガー）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンである。一部の例では、核酸は、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ又は酵素（例えば、代謝酵素、リコンビナーゼ酵素、ヘリカーゼ酵素、インテグラーゼ酵素、ＲＮＡｓｅ酵素、ＤＮＡｓｅ酵素又はユビキチン化タンパク質）の発現を増大するＤＮＡ分子、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ＴＡＬＥＮ若しくはジンクフィンガー）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンである。一部の例では、植物における発現の増大は、参照レベル（例えば、非処理植物における発現）に対して約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の発現増大である。一部の例では、植物における発現の増大は、参照レベル（非処理植物における発現）に対して約２倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍又は約１００倍以上の発現増大である。
一部の例では、核酸は、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノ、ＬＮＡ、ｐｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、アプタマー（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｇＲＮＡ又は植物において酵素（代謝酵素、リコンビナーゼ酵素、ヘリカーゼ酵素、インテグラーゼ酵素、ＲＮＡｓｅ酵素、ＤＮＡｓｅ酵素、ポリメラーゼ酵素、ユビキチン化タンパク質、スーパーオキシド管理酵素若しくはエネルギー生産酵素）の発現を低減するＤＮＡ分子（例えば、アンチセンスポリヌクレオチド）、転写因子、分泌タンパク質、構造因子（アクチン、キネシン若しくはチューブリン）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー、シャペロン、受容体、シグナル伝達リガンド又は輸送因子である。一部の例では、植物における発現の低減は、参照レベル（非処理植物における発現）に対して約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の発現低減である。一部の例では、植物における発現の低減は、参照レベル（例えば、非処理植物における発現）に対して約２倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍又は約１００倍以上の発現低減である。
ＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子の全部又は断片と実質的に相補的であるか又は完全に相補的な配列を含む。ＲＮＡｉ分子は、イントロンとエキソンとの間の境界における配列を補足して、転写のためにｍＲＮＡへの特定の遺伝子の新しく生成されたＲＮＡ転写物の成熟を阻止し得る。特定の遺伝子と相補的なＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズして、その翻訳を阻止することができる。アンチセンス分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその誘導体若しくはハイブリッドであり得る。こうした誘導体分子の例として、限定はされないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びデオキシリボ核酸グアニジン（ＤＮＧ）又はリボ核酸グアニジン（ＲＮＧ）などのホスホロチオエートベースの分子が挙げられる。
ＲＮＡｉ分子は、インビトロで合成された直ちに使用可能なＲＮＡとして又は転写時にＲＮＡｉ分子を産生する細胞にトランスフェクトされたアンチセンス遺伝子として提供することができる。ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより、ＲＮＡｓｅ Ｈによるハイブリダイズ分子の分解及び／又は翻訳複合体の形成の阻害が起こる。いずれによっても、起源遺伝子の産物の生産ができなくなる。
目的の転写物にハイブリダイズするＲＮＡｉ分子の長さは、約１０ヌクレオチド、約１５〜３０ヌクレオチド又は約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド若しくはそれを超える長さであり得る。標的転写物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５であり得る。
ＲＮＡｉ分子は、オーバーハング、即ち典型的に不対の突出したヌクレオチドも含み得、これらは、本明細書で定義するセンス鎖対及びアンチセンス鎖対のコア配列によって通常形成される二重螺旋構造に直接関与しない。ＲＮＡｉ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖の各々とは独立に、約１〜５塩基の３’及び／又は５’オーバーハングを含有し得る。一部の例では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が、３’及び５’オーバーハングを含有する。一部の例では、一方の鎖塩基の１つ以上の３’オーバーハングヌクレオチドは、他方の鎖の１つ以上の５’オーバーハングヌクレオチドと対合する。他の例では、一方の鎖塩基の１つ以上の３’オーバーハングヌクレオチドは、他方の鎖の１つ以上の５’オーバーハングヌクレオチドと対合しない。ＲＮＡｉ分子のセンス及びアンチセンス鎖は、同数のヌクレオチド塩基を含んでも又は含まなくてもよい。アンチセンス及びセンス鎖は、５’末端のみが平滑末端を有するか、３’末端のみが平滑末端を有するか、５’及び３’末端の両方が平滑末端であるか、又は５’及び３’末端のいずれも平滑末端ではないデュプレックスを形成し得る。別の例では、オーバーハング中の１つ以上のヌクレオチドは、チオリン酸エステル、ホスホロチオエート、デオキシヌクレオチド逆位（３’−３’結合）ヌクレオチドを含むか、又は修飾リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドである。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、標的ｍＲＮＡの約１５〜約２５の連続的ヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む。一部の例では、ｓｉＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０〜７０％（約３０〜６０％、約４０〜６０％又は約４５〜５５％）のＧＣ含量を含み、例えば標準的ＢＬＡＳＴ検索により決定される通り、それを導入しようとするゲノム中の標的以外のいずれのヌクレオチド配列に対しても高い同一性パーセンテージを含まない。
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、内在性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子のプロセシング経路における中間体と類似している（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ １１６：２８１−２９７，２００４）。一部の例では、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能することができ、逆も同様である（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ９：１３２７−１３３３，２００２；Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１７：４３８−４４２，２００３）。外性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに対してシード相補性を有するｍＲＮＡを下方制御する（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：１９９−２０４，２００６）。３’ＵＴＲ内の複数の標的部位は、より強力な下方制御をもたらす（Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１７：４３８−４４２，２００３）。
既知の有効なｓｉＲＮＡ配列及び同種結合部位も関連文献に詳細に記載されている。ＲＮＡｉ分子は、容易に設計され、当技術分野において公知の技術により作製される。加えて、有効且つ特異的な配列モチーフを見出す機会を高める計算ツールもある（Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３（９）：６７０−６７６，２００６；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（３）：３２６−３３０，２００４；Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０（９）：７０８−７１２，２００３；Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１５（２）：１９９−２０８，２００３；Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（３）：９３６−９４８，２００４；Ｈｅａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（３）：ｅ３０，２００５；Ｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１９（１）：２６４−２７４，２００４；及びＡｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１６（４）：１０５０−１０５８，２００４）。
ＲＮＡｉ分子は、遺伝子によりコードされるＲＮＡの発現を調節する。複数の遺伝子が、互いにある程度の配列相同性を共有できることから、一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的とするように設計することができる。一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、異なる遺伝子標的の間で共有されるか、又は特定の遺伝子標的についてユニークな配列に対して相補性を有する配列を含み得る。一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、いくつかの遺伝子同士で相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域を標的とし、それにより遺伝子ファミリー内のいくつかの遺伝子（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライス変異体、突然変異遺伝子など）を標的とするように設計することができる。一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、単一の遺伝子の特定のＲＮＡ配列に対してユニークな配列を標的とするように設計することができる。
阻害性ＲＮＡ分子は、例えば、修飾ヌクレオチド、例えば２’−フルオロ、２’−ｏ−メチル、２’−デオキシ、アンロックド核酸、２’−ヒドロキシ、ホスホロチオエート、２’−チオウリジン、４’−チオウリジン、２’−デオキシウリジンを含有するように修飾することができる。理論に拘束されるわけではないが、こうした修飾は、ヌクレアーゼ抵抗性及び／又は血清安定性を増大し得るか、又は免疫原性を低減させ得ると考えられる。
一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、生理的に不安定な結合又はリンカーを介して送達ポリマーに連結される。生理的に不安定なリンカーは、それが特定の生理的条件下で存在するとき、化学変換（例えば、切断）を被るように選択される（例えば、ジスルフィド結合は、細胞質の還元的環境で切断される）。生理的に不安定な結合の切断によるポリマーからの分子の放出は、活動のために適切な細胞構成要素とその分子の相互作用を促進する。
ＲＮＡｉ分子−ポリマーコンジュゲートは、ポリマーと分子を共有結合させることによって形成され得る。ポリマーは、それが反応性基Ａを含有するように重合又は修飾される。ＲＮＡｉ分子は、それが反応性基Ｂを含有するようにも重合又は修飾される。反応性基Ａ及びＢは、当技術分野で公知の方法を用いて、それらが可逆的共有結合を介して連結され得るように選択される。
ＲＮＡｉ分子とポリマーの共役は、過剰のポリマーの存在下で実施することができる。ＲＮＡｉ分子とポリマーは、共役の間に反対電荷となり得るため、過剰ポリマーの存在により、コンジュゲートの凝集を低減又は排除することができる。代わりに、ポリカチオンなどの過剰の担体ポリマーを使用することもできる。過剰ポリマーは、コンジュゲートの投与前に共役ポリマーから除去することができる。代わりに、過剰ポリマーは、コンジュゲートと一緒に同時投与することもできる。
リボザイム、ＲＮＡｓｅ Ｐ、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡなどのノンコーディングＲＮＡに基づく阻害剤の作製及び使用も、例えば、Ｓｉｏｕｄ，ＲＮＡ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されているように、当技術分野で公知である。
（ｇ）遺伝子編集
本明細書に記載の植物改変組成物は、遺伝子編集系の要素を含み得る。例えば、薬剤は、植物における１遺伝子に改変（例えば、挿入、欠失（例えば、ノックアウト）、転座、反転、単一点突然変異又は他の突然変異）を導入することができる。例示的な遺伝子編集系として、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベータ様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びクラスター化され規則的に間隔を置いた短鎖回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）系が挙げられる。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲに基づく方法は、例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（７）：３９７−４０５，２０１３に記載されている。
典型的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ配列を標的とする配列特異的、ノンコーディングガイドＲＮＡにより、エンドヌクレアーゼは、標的ヌクレオチド配列（例えば、配列編集しようとするゲノム内の部位）に向けられる。３つのクラス（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲ系が同定されている。クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系は、単一のＣａｓエンドヌクレアーゼ（複数のＣａｓタンパク質ではなく）を使用する。１つのクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ９などのＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス−活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、ガイドＲＮＡ、即ち典型的には標的ＤＮＡ配列に対応する約２０ヌクレオチドＲＮＡ配列を含有する。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合する領域も含んで、ＲＮａｓｅＩＩＩにより切断される部分的二本鎖構造を形成し、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドをもたらす。ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を指令して、スペーサ配列に応じて、特定のＤＮＡ／ＲＮＡ配列を抑制するガイドの役割を果たす。例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７−１７０，２０１０；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｉｒｅｃｔ １：７，２００６；Ｐｅｎｎｉｓｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１：８３３−８３６，２０１３を参照されたい。標的ＤＮＡ配列は、一般に、所与のＣａｓエンドヌクレアーゼに対して特異的なプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接していなければならないが；ＰＡＭ配列は、所与のゲノム全体を通して出現する。種々の原核生物種から同定されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ユニークなＰＡＭ配列要件を有し；ＰＡＭ配列の例として、５’−ＮＧＧ（配列番号１）（化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、５’−ＮＮＡＧＡＡ（配列番号２）（ストレブトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１）、５’−ＮＧＧＮＧ（配列番号３）（ストレブトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３）及び５’−ＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号４）（髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））が挙げられる。いくつかのエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＧリッチＰ（の５’側）ＡＭ部位、例えば５’−ＮＧＧ（配列番号１）と結合して、ＰＡＭ部位から３ヌクレオチド上流の位置で標的ＤＮＡの平滑末端切断を実施する。別のクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｖ型エンドヌクレアーゼＣｐｆ１を含み、これは、Ｃａｓ９より小さく；例として、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）由来）及びＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラ科種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．）由来）が挙げられる。Ｃｐｆ１結合ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡの要件なしに成熟型ｃｒＲＮＡにプロセシングされ；言い換えれば、Ｃｐｆ１系は、標的ＤＮＡ配列を切断するために、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ及びｃｒＲＮＡのみを必要とする。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ＴリッチＰＡＭ部位、例えば５’−ＴＴＮ（配列番号５）と結合している。Ｃｐｆ１は、５’−ＣＴＡ（配列番号６）ＰＡＭモチーフも認識する。Ｃｐｆ１は、４’−若しくは５−ヌクレオチド５’オーバーハングを含むオフセット又はスタッガード二本鎖切断を導入することによりＤＮＡを切断し、例えばコーディング鎖のＰＡＭ部位（の３’側）から１８ヌクレオチド下流及び相補鎖のＰＡＭ部位から２３ヌクレオチド下流に位置する５−ヌクレオチドオフセット又はスタッガード切断で標的ＤＮＡを切断し、こうしたオフセット切断から生じる５−ヌクレオチドオーバーハングは、相同組換えによるＤＮＡ挿入により、平滑末端切断ＤＮＡでの挿入によるものよりも正確なゲノム編集を可能にする。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３：７５９−７７１，２０１５を参照されたい。
遺伝子編集の目的で、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含有するように、ＣＲＩＳＰＲアレイを設計することができる；例えば、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９−８２３，２０１３；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８：２２８１−２３０８，２０１３を参照されたい。Ｃａｓ９によりＤＮＡ切断を起こすためには、ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６又は１７ヌクレオチドが必要であり；Ｃｐｆ１の場合、検出可能なＤＮＡ切断を実施するために、ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６ヌクレオチドが必要である。実際に、ガイドＲＮＡ配列は、概して、１７〜２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０若しくは２１ヌクレオチド）の長さと、標的とされる遺伝子又は核酸配列との相補性とを有するように設計される。カスタムｇＲＮＡ作製装置及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用するために市販されている。遺伝子編集は、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、即ち天然のｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼとの結合のため）と少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集の標的とされる配列にヌクレアーゼを誘導するため）との両方を含有する操作（合成）単一ＲＮＡ分子を用いても達成されている。また、化学修飾ｓｇＲＮＡも、ゲノム編集に有効であることが実証されており；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９８５−９９１，２０１５を参照されたい。一部の例では、異種植物改変剤は、１つ以上のＲＮＡ分子、例えばｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ及び１つ以上のＲＮＡ結合タンパク質、例えばエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）を含むリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を含む。
野生型Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡが標的とする特定のＤＮＡ配列で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するが、修飾された機能性を有するいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが利用可能であり、例えば、Ｃａｓ９のニッカーゼバージョンは、一本鎖切断のみを生成し；触媒能のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は、標的ＤＮＡを切断しないが、立体障害によって転写を妨害する。ｄＣａｓ９は、さらにエフェクターと融合させて、標的遺伝子の発現を抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）することもできる。例えば、Ｃａｓ９を転写リプレッサ（例えば、ＫＲＡＢドメイン）又は転写アクチベータ（例えば、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合）と融合させることができる。Ｆｏｋｌヌクレアーゼと融合した触媒能のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）（ｄＣａｓ９−Ｆｏｋｌ）を用いて、２つのｇＲＮＡと相同性の標的配列でＤＳＢを生成することができる。例えば、Ａｄｄｇｅｎｅリポジトリ（Ａｄｄｇｅｎｅ，７５ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔ．，Ｓｕｉｔｅ ５５０Ａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ ０２１３９；ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／）に開示され、そこから一般に入手可能な多数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを参照されたい。各々が個別のガイドＲＮＡにより指令される２つの個別の二本鎖切断を導入するダブルニッカーゼＣａｓ９は、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４：１３８０−１３８９，２０１３により、より正確なゲノム編集を達成するものとして記載されている。
真核生物の遺伝子を編集するためのＣＲＩＳＰＲ技術は、米国特許出願公開第２０１６／０１３８００８ Ａ１号明細書及び同第２０１５／０３４４９１２ Ａ１号明細書並びに米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，９４５，８３９号明細書、同第８，９９９，６４１号明細書、同第８，９９３，２３３号明細書、同第８，８９５，３０８号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，９３２，８１４号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書及び同第８，９０６，６１６号明細書に開示されている。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ及び対応するガイドＲＮＡ並びにＰＡＭ部位は、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３ Ａ１号明細書に開示されている。
一部の例では、所望のゲノム修飾は、相同組換えを含み、この場合、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡにより、標的ヌクレオチド配列に１つ以上の二本鎖ＤＮＡ切断が生成された後、相同組換え機構を用いた切断の修復（相同組換え修復）が起こる。こうした例では、二本鎖切断において挿入又はノックインしようとする所望のヌクレオチド配列をコードするドナーテンプレートが、細胞又は対象に提供され；好適なテンプレートの例として、一本鎖ＤＮＡテンプレート及び二本鎖ＤＮＡテンプレート（例えば、本明細書に記載のポリペプチドに連結される）が挙げられる。一般に、約５０ヌクレオチド未満の領域にわたってヌクレオチド変更をコードするドナーテンプレートは、一本鎖ＤＮＡの形態で提供され；より大きいドナーテンプレート（例えば、１００ヌクレオチド超）は、多くの場合、二本鎖ＤＮＡプラスミドとして提供される。一部の例では、ドナーテンプレートは、所望の相同組換え修復を達成するのに十分であるが、所与の期間後（例えば、１つ以上の細胞分裂周期後）、細胞又は対象において持続しない量で、細胞又は対象に供給される。一部の例では、ドナーテンプレートは、少なくとも１つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０又はそれを超えるヌクレオチドだけ標的ヌクレオチド配列と異なるコアヌクレオチド配列（例えば、相同的内在性ゲノム領域）を有する。このコア配列は、標的ヌクレオチド配列と高い配列同一性の相同性アーム又は領域によってフランキングされ；一部の例では、高い配列同一性の領域は、コア配列の両側に少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７５０又は少なくとも１０００ヌクレオチドを含む。ドナーテンプレートが一本鎖ＤＮＡの形態である一部の例では、コア配列は、コア配列の両側で、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０又は少なくとも１００ヌクレオチドを含む相同性アームによりフランキングされる。ドナーテンプレートが二本鎖ＤＮＡの形態である一部の例では、コア配列は、コア配列の両側で、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００又は少なくとも１０００ヌクレオチドを含む相同性アームによりフランキングされる。一例では、ダブルニッカーゼＣａｓ９を用いて、２つの個別の二本鎖切断を細胞又は対象の標的ヌクレオチド配列に導入した（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４：１３８０−１３８９，２０１３を参照されたい）後、ドナーテンプレートの送達が行われる。
一部の例では、組成物は、ｇＲＮＡと標的ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、例えば野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ）、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１若しくはＣ２Ｃ３又はこうしたヌクレアーゼをコードする核酸を含む。ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡの選択は、標的突然変異が、ヌクレオチドの欠失、置換又は付加、例えば標的配列へのヌクレオチドの欠失、置換又は付加であるかどうかによって決定される。（１つ以上の）エフェクタードメインの全部又は一部（例えば、生物学的に活性の部分）とテザリングした触媒能のないエンドヌクレアーゼ、例えば不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９、例えばＤ１０Ａ；Ｈ８４０Ａ）の融合により、キメラタンパク質を作出し、これをポリペプチドと連結させて、１つ以上のＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）により組成物を特定のＤＮＡ部位に誘導して、１つ以上の標的核酸配列の活性及び／又は発現を調節することができる。一部の例では、ｇＲＮＡ及び標的化ヌクレアーゼは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として提供される。
複数の例では、薬剤は、遺伝子編集の目的でＣＲＩＳＰＲ系に使用するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一部の例では、薬剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は植物における１遺伝子の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）をターゲティング（例えば、切断）するＺＦＮをコードするｍＲＮＡを含む。一部の例では、薬剤は、ＴＡＬＥＮ又は植物における１遺伝子の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）をターゲティング（例えば、切断）するＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡを含む。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ系にｇＲＮＡを使用して、植物における遺伝子の改変を操作することができる。他の例では、ＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮを用いて、植物における遺伝子の改変を操作することができる。例示的な改変として、挿入、欠失（例えば、ノックアウト）、転座、反転、単一点突然変異又は他の突然変異が挙げられる。改変は、細胞の遺伝子に例えばインビトロ、エクスビボ又はインビボで導入することができる。一部の例では、改変は、植物における遺伝子のレベル及び／又は活性を増大する。他の例では、改変は、植物における遺伝子のレベル及び／又は活性を低減させる（例えば、ノックダウン若しくはノックアウトする）。また別の例では、改変は、植物における遺伝子の欠陥（例えば、欠陥を引き起こす突然変異）を修正する。
一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、植物における標的遺伝子を編集する（例えば、塩基対を付加するか又は欠失させる）。他の例では、ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、未成熟終止コドンを導入し、例えばこれにより標的遺伝子の発現を低減する。また別の例では、ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、例えばＲＮＡ干渉と同様に、可逆的方法で標的遺伝子をオフにする。一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、Ｃａｓを遺伝子のプロモータに向け、これによりＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断する。
一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ系は、例えば、米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号明細書、Ｃｏｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９−８２３，２０１３；Ｔｓａｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：６ ５６９−５７６，２０１４；米国特許第８，８７１，４４５号明細書；同第８，８６５，４０６号明細書；同第８，７９５，９６５号明細書；同第８，７７１，９４５号明細書；及び同第８，６９７，３５９号明細書に記載される技術を用いて、植物における遺伝子を編集するように生成することができる。
一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）技術は、植物の特定の遺伝子の転写抑制のために使用することができる。ＣＲＩＳＰＲｉの場合、操作Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ−ヌルｄＣａｓ９又はｄＣａｓ９融合タンパク質、例えばｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ若しくはｄＣａｓ９−ＳＩＤ４Ｘ融合物）を配列特異的ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と対合させることができる。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、ＲＮＡポリメラーゼを遮断することができ、それにより、転写伸長を妨害する。この複合体は、転写因子結合を妨害することにより、転写開始も遮断することができる。ＣＲＩＳＰＲｉ法は、最小オフターゲット効果を固有に有し、且つマルチプレクサブル（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｂｌｅ）であり、例えば同時に２つ以上の遺伝子を抑制することができる（例えば、複数のｇＲＮＡを用いて）。また、ＣＲＩＳＰＲｉ方法は、可逆的遺伝子抑制も可能にする。
一部の例では、例えば植物の遺伝子の転写活性化のために、ＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）を用いることができる。ＣＲＩＳＰＲａ技術では、ｄＣａｓ９融合タンパク質が、転写アクチベータを動員する。例えば、ｄＣａｓ９をＶＰ６４又はｐ６５活性化ドメイン（ｐ６５Ｄ）などのポリペプチド（例えば、活性化ドメイン）と融合させ、ｓｇＲＮＡ（例えば、単一のｓｇＲＮＡ又は複数のｓｇＲＮＡ）と一緒に用いて、植物の１つ又は複数の遺伝子を活性化することができる。複数のｓｇＲＮＡを用いることにより、複数のアクチベータを動員することができ、これは、活性化効率を高め得る。様々な活性化ドメイン及び単一又は複数の活性化ドメインを使用することができる。アクチベータを動員するためにｄＣａｓ９を操作する以外に、ｓｇＲＮＡも、アクチベータを動員するように操作することができる。例えば、ＲＮＡアプタマーをｓｇＲＮＡに組み込むことにより、ＶＰ６４などのタンパク質（例えば、活性化ドメイン）を導入することができる。一部の例では、転写活性化のために相乗的活性化メディエータ（ＳＡＭ）系を用いることができる。ＳＡＭでは、ＭＳ２アプタマーをｓｇＲＮＡに付加する。ＭＳ２は、ｐ６５ＡＤ及び熱ショック因子１（ＨＳＦ１）と融合したＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）を動員する。
ＣＲＩＳＰＲｉ及びＣＲＩＳＰＲａ技術について、さらに詳細には、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７：５−１５，２０１６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。加えて、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，に記載されているように、ｄＣａｓ９媒介性のエピジェネティクス修飾並びに同時活性化及びＣＲＩＳＰＲ系による抑制を用いて、植物における遺伝子を調節することができる。
Ｖ．キット
本発明は、植物の改変のためのキットも提供し、このキットは、本明細書に記載の植物改変組成物を有する容器を含む。キットは、本発明の方法に従って植物を改変するための植物改変組成物を適用又は送達する（例えば、植物に）ための教材をさらに含み得る。当業者は、本発明の方法で植物改変組成物を適用する上での説明が、あらゆる形態の説明であり得ることが理解されるであろう。こうした指示としては、限定されないが、文書教材（例えば、ラベル、冊子、パンフレット）、口述教材（例えば、カセットテープ若しくはＣＤ）又はビデオ教材（例えば、ビデオテープ若しくはＤＶＤ）が挙げられる。
以下は、本発明の方法の例である。上に提供した概説を考慮して、他の様々な実施形態が実施され得ることは理解される。
Figure 2021533180
実施例１：植物からの植物メッセンジャーパックの単離
この実施例は、葉アポプラスト、種子アポプラスト、根、果実、野菜、花粉、師管液、木部樹液及び植物細胞培地を含め、様々な植物起源からの粗植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）の単離を説明する。
実験計画：
ａ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）葉のアポプラストからのＰＭＰ単離
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｃｌ−０））種子を５０％漂白剤で表面滅菌した後、０．８％寒天を含有する０．５３ムラシゲスクーグ培地上に平板培養する。これらの種子を４℃で２日間春化処置した後、短日条件（明期９ｈ、２２℃、１５０μＥｍ−２）に移す。１週間後、苗をＰｒｏ−Ｍｉｘ ＰＧＸに移す。植物を４〜６週間成長させた後、収穫する。
Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ ＩｎｎｅｓによりＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７に記載されているように、４〜６週齢のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ロゼットのアポプラスト洗浄液からＰＭＰを単離する。手短には、全ロゼットを根から収穫し、小胞単離バッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．１ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６）と一緒に真空浸潤する。浸潤した植物を注意深くブロットして、余剰の液体を除去し、３０ｍＬシリンジ内に導入してから、５０ｍＬ円錐チューブにおいて２℃で２０分間遠心分離することにより、ＥＶを含有するアポプラスト細胞外液を収集する。次に、アポプラスト細胞外液を０．８５μｍフィルタで濾過することにより、大きい粒子を除去した後、実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
ｂ）ヒマワリ種子のアポプラストからのＰＭＰ単離
インタクトなヒマワリ種子（ヒマワリ（Ｈ．ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）に水を２時間吸収させ、皮を剥いで、果皮を除去した後、Ｒｅｇｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．５８３：３３６３−３３６６，２００９から改変した修正真空浸潤−遠心分離手順によりアポプラスト細胞外液を抽出する。手短には、種子を小胞単離バッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．１ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６）に浸潤させてから、３回の１０秒の真空パルスに付し、３０秒間隔の４５ｋＰａの圧力により分離する。浸潤した種子を回収し、濾紙上で乾燥させ、フリットガラス濾過器に配置し、４℃、４００ｇで２０分間遠心分離する。アポプラスト細胞外液を回収し、０．８５μｍフィルタで濾過することにより、大きい粒子を除去した後、実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
ｃ）根生姜からのＰＭＰ単離
新鮮な生姜（ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ））根茎根を現地の供給者から購入し、ＰＢＳで３回洗浄する。計２００グラムの洗浄済の根をミキサー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ １２速ブレンダ）により最大速で１０分間（ブレンド１分毎に１分の休止）粉砕した後、Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．４（１）：２８７１３，２０１５に記載されているように、ＰＭＰを単離する。手短には、生姜汁を１，０００ｇで１０分、３，０００ｇで２０分及び１０，０００ｇで４０分と順次遠心分離することにより、ＰＭＰ含有上清から大きい粒子を除去する。実施例２に記載のように、ＰＭＰを精製する。
ｄ）グレープフルーツ果汁からのＰＭＰ単離
新鮮なグレープフルーツ（グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ×ｐａｒａｄｉｓｉ））を現地の供給者から購入し、その皮を除去し、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２２（３）：５２２−５３４，２０１４に記載されているように（若干の修正を加えた）、果実を手で圧搾するか、又はミキサー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ １２速ブレンダ）により最大速で１０分間（ブレンド１分毎に１分の休止）粉砕することにより、果汁を収集する。手短には、果汁／果汁パルプを１，０００ｇで１０分、３，０００ｇで２０分及び１０，０００ｇで４０分と順次遠心分離することにより、ＰＭＰ含有上清から大きい粒子を除去する。実施例２に記載のように、ＰＭＰを精製する。
ｅ）ブロッコリーヘッドからのＰＭＰ単離
ブロッコリー（ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ））ＰＭＰは、以前記載されている（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２５（７）：１６４１−１６５４，２０１７）ように単離する。手短には、新鮮なブロッコリーを現地の供給者から購入し、ＰＢＳで３回洗浄してから、ミキサー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ １２速ブレンダ）により最大速で１０分間（ブレンド１分毎に１分の休止）粉砕する。次に、ブロッコリー汁を１，０００ｇで１０分、３，０００ｇで２０分及び１０，０００ｇで４０分と順次遠心分離することにより、ＰＭＰ含有上清から大きい粒子を除去する。実施例２に記載のように、ＰＭＰを精製する。
ｆ）オリーブ花粉からのＰＭＰ単離
オリーブ（オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ））花粉ＥＶは、Ｐｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ．７（３）：５７３−５７７，２０１４に以前記載されているように単離する。手短には、オリーブ花粉（０．１ｇ）を室温の加湿チャンバー内で３０分間水和した後、２０ｍｌの発芽培地：１０％ショ糖、０．０３％Ｃａ（ＮＯ３）２、０．０１％ＫＮＯ３、０．０２％ＭｇＳＯ４及び０．０３％Ｈ３ＢＯ３を含有するペトリ皿（直径１５ｃｍ）に移す。花粉を３０℃の暗所において１６ｈ発芽させる。花粉粒は、チューブが花粉粒の直径より長くなったときに初めて発芽したとみなされる。ＰＭＰを含有する培地を収集し、遠心分離による０．８５ｕｍフィルタでの２回の連続濾過によって花粉残屑を除去する。実施例２に記載のように、ＰＭＰを精製する。
ｇ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）師管液からのＰＭＰ単離
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｃｏｌ−０））種子を５０％漂白剤で表面滅菌した後、０．８％寒天を含有する０．５３ムラシゲスクーグ培地上に平板培養する。これらの種子を４℃で２日間春化処置した後、短日条件（明期９ｈ、２２℃、１５０μＥｍ−２）に移す。１週間後、苗をＰｒｏ−Ｍｉｘ ＰＧＸに移す。植物を４〜６週間成長させた後、収穫する。
Ｔｅｔｙｕｋ ｅｔ ａｌ．，により、ＪｏＶＥ．８０，２０１３に記載されているように、４〜６週齢のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ロゼット葉からの師管液を収集する。手短には、葉柄の基部から葉を切断し、重ねてから、創傷の封止を防ぐために、２０ｍＭ Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する反応チューブ内に暗所で１時間配置する。葉を容器から穏やかに取り出し、蒸留水で入念に洗浄し、全てのＥＤＴＡを除去して、清浄なチューブ内に配置した後、暗所において師管液を５〜８時間かけて収集する。葉を廃棄し、師管液を０．８５μｍフィルタで濾過して、大きい粒子を除去してから、実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
ｈ）トマト植物木部樹液からのＰＭＰ単離
トマト（トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））種子をＳｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｇａｗａｍ，ＭＡ）などの有機質土壌の入った単一ポットに植え、２２℃〜２８℃の温室内に維持する。発芽から約２週間後、即ち２本葉期（ｔｗｏ ｔｒｕｅ−ｌｅａｆ ｓｔａｇｅ）に、９０％砂及び１０％有機物ミックスを含む滅菌砂質土を充填したポット（直径１０ｃｍ、深さ１７ｃｍ）に苗を個別に移植する。２２℃〜２８℃の温室内に植物を４週間維持する。
Ｋｏｈｌｅｎ ｅｔ Ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１５５（２）：９７４−９８７，２０１１に記載されているように、４週齢のトマト植物からの木部樹液を収集する。手短には、トマト植物の胚軸から上を切断し、プラスチックリングを茎の周りに取り付ける。切断から９０分にわたって蓄積する木部樹液を収集する。木部樹液を０．８５μｍフィルタで濾過して、大きい粒子を除去してから、実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
ｉ）タバコＢＹ−２細胞培地からのＰＭＰ単離
３０ｇ／Ｌショ糖、２．０ｍｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、０．１ｇ／Ｌのミオ−イノシトール、０．２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸及び１ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌを補充したＭＳ塩（Ｄｕｃｈｅｆａ，Ｈａａｒｌｅｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、♯Ｍ０２２１）を含むＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６２）ＢＹ−２培地（ｐＨ５．８）中において１８０ｒｐｍのシェーカに載せ、タバコＢＹ−２（タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ ｃｖ．）ブライトイエロー２）細胞を２６℃の暗所において培養する。７日齢細胞培養物の５％（ｖ／ｖ）を１００ｍＬの新鮮な液体培地に移すことにより、ＢＹ−２細胞を毎週二次培養する。７２〜９６時間後、ＢＹ−２培地を収集し、４℃、３００ｇで１０分間遠心分離することにより、細胞を除去する。ＰＭＰを含有する上清を収集し、０．８５ｕｍフィルタでの濾過により、残屑を除去する。実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
実施例２：精製された植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）の生成
この実施例は、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配（イオジキサノール若しくはショ糖）と組み合わせて限外濾過及び沈殿又はサイズ排除クロマトグラフィーによる凝集体の除去を用いた、実施例１に記載の粗ＰＭＰ画分から精製ＰＭＰの生成を説明する。
実験計画：
ａ）サイズ排除クロマトグラフィーと組み合わせて限外濾過を用いた精製グレープフルーツＰＭＰの生成
１００−ｋＤＡ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ａｍｉｃｏｎスピンフィルタ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、実施例１ａからの粗グレープフルーツＰＭＰ画分を濃縮する。次に、濃縮した粗ＰＭＰ溶液をＰＵＲＥ−ＥＶサイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ）にロードし、製造者の指示に従って単離する。精製済ＰＭＰ含有画分を、溶出後プールする。任意選択的に、１００−ｋＤＡ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルタを用いて又はタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により、ＰＭＰをさらに濃縮することもできる。実施例３に記載のように、精製ＰＭＰを分析する。
ｂ）イオジキサノール勾配を用いた精製シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＰＭＰの生成
実施例１ａに記載のように、粗シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）葉アポプラストＰＭＰを単離し、Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７に記載されているように、精製ＰＭＰを生成する。不連続イオジキサノール勾配（ＯｐｔｉＰｒｅｐ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を調製するために、小胞単離バッファー（ＶＩＢ；２０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．１ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６）で水性６０％ＯｐｔｉＰｒｅｐストック溶液を希釈することにより、４０％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）及び５％（ｖ／ｖ）イオジキサノールの溶液を作製する。勾配は、３ｍｌの４０％溶液、３ｍＬの２０％溶液、３ｍＬの１０％溶液、２ｍＬの５％溶液を積層することにより形成する。実施例１ａからの粗アポプラストＰＭＰ溶液を４℃、４０，０００ｇで６０分間遠心分離する。ペレットを０．５ｍｌのＶＩＢに再懸濁させてから、勾配の上部に重ねる。４℃、１００，０００ｇで１７ｈ遠心分離を実施する。勾配の上部の最初の４．５ｍｌを廃棄した後、アポプラストＰＭＰを含有する０．７ｍｌの３容量を収集し、ＶＩＢを用いて３．５ｍＬにして、４℃、１００，０００ｇで６０分間遠心分離する。ペレットを３．５ｍｌのＶＩＢで洗浄した後、同じ遠心分離条件を用いて再ペレット化する。実施例３に記載の通り、次の分析のために精製ＰＭＰペレットを合わせる。
ｃ）ショ糖勾配を用いた精製グレープフルーツＰＭＰの生成
実施例１ｄに記載のように粗グレープフルーツ果汁ＰＭＰを単離し、１５０，０００ｇで９０分間遠心分離した後、記載されている（Ｍｕ ｅｔ Ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ＆Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５８（７）：１５６１−１５７３，２０１４）ように、ＰＭＰ含有ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁させる。再懸濁させたペレットをショ糖ステップ勾配（８％／１５％／３０％／４５％／６０％）に移し、１５０，０００ｇで１２０分間遠心分離して、精製ＰＭＰを生成する。３０％／４５％界面から精製グレープフルーツＰＭＰを収集し、後に実施例３に記載のように分析する。
ｄ）グレープフルーツＰＭＰからの凝集体の除去
実施例１ｄに記載の通り生成したグレープフルーツＰＭＰ又は実施例２ａ〜ｃからの精製ＰＭＰからタンパク質凝集体を除去するために、追加の精製ステップを加えることができる。生成したＰＭＰ溶液を様々なｐＨに通過させて、溶液中にタンパク質凝集体を沈殿させる。ｐＨは、水酸化ナトリウム又は塩酸の添加により３、５、７、９若しくは１１に調節する。較正ｐＨプローブを用いてｐＨを測定する。溶液が指定のｐＨに達したら、濾過して粒子を除去する。代わりに、単離したＰＭＰ溶液を、Ｐｏｌｙｍｉｎ−Ｐ又はＰｒａｅｓｔｏｌ ２６４０などの荷電ポリマーの添加により、凝結させることもできる。手短には、１Ｌ当たり２〜５ｇのＰｏｌｙｍｉｎ−Ｐ又はＰｒａｅｓｔｏｌ ２６４０を溶液に添加し、インペラで混合する。次に、溶液を濾過して、粒子を除去する。代わりに、塩濃度を高めることにより、凝集体を可溶化する。ＮａＣｌを、１ｍｏｌ／Ｌに達するまでＰＭＰ溶液に添加する。次に、溶液を濾過して、ＰＭＰを精製する。代わりに、温度を上昇させることにより、凝集体を可溶化する。単離したＰＭＰ混合物を、５０℃の均質温度に達するまで混合しながら５分加熱する。次に、ＰＭＰ混合物を濾過して、ＰＭＰを単離する。代わりに、ＰＭＰ溶液からの可溶性混入物は、標準的方法に従うサイズ排除クロマトグラフィーカラムにより分離するが、その場合、ＰＭＰは、第１画分に溶出するのに対して、タンパク質及びリボ核タンパク質及び一部のリポタンパク質は、遅れて溶出される。タンパク質凝集体除去の効率は、ＢＣＡ／Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量により、タンパク質凝集体の除去前及び後のタンパク質濃度を測定し、比較することにより決定される。生成したＰＭＰは、実施例３に記載のように分析する。
実施例３：植物メッセンジャーパックの特性決定
この実施例は、実施例１又は実施例２に記載の通りに生成されたＰＭＰの特性決定を説明する。
実験計画：
ａ）ＰＭＰ濃度の決定
ＰＭＰ粒子濃度は、Ｍａｌｖｅｒｎ ＮａｎｏＳｉｇｈｔを用いるナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＮＴＡ）又はｉＺｏｎ ｑＮａｎｏを用いる調整可能抵抗パルスセンシング（Ｔｕｎａｂｌｅ Ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ Ｐｕｌｓｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ）（ＴＲＰＳ）により、製造者の指示に従って決定する。精製ＰＭＰのタンパク質濃度は、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の使用により決定する。精製ＰＭＰの脂質濃度は、Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ ＩｎｎｅｓによりＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７に記載のように、ＤｉＯＣ６（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）などの蛍光親油性色素を用いて決定する。手短には、実施例２からの精製ＰＭＰペレットをＭＥＳバッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６）で希釈した１００ｍｌの１０ｍＭ ＤｉＯＣ６（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）並びに１％植物プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２ｍＭ ２，２９−ジピリジルジスルフィドに再懸濁させる。再懸濁ＰＭＰを３７℃で１０分間インキュベートし、３ｍＬのＭＥＳバッファーで洗浄し、再ペレット化し（４℃で、４００，０００ｇ、６０分）、新鮮なＭＥＳバッファーに再懸濁させる。ＤｉＯＣ６蛍光強度を４８５ｎｍ励起及び５３５ｎｍ発光で測定する。
ｂ）ＰＭＰの生物物理学的及び分子特性決定
Ｗｕ ｅｔ Ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ．１４０（２）：３８６−４０６，２０１５のプロトコルに従い、ＪＥＯＬ １０１０透過型電子顕微鏡での電子及び低温電子顕微鏡法によりＰＭＰを特性決定する。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ又はｉＺｏｎ ｑＮａｎｏを用い、製造者の指示に従ってＰＭＰのサイズ及びゼータ電位も測定する。クロロホルム抽出を用いて、ＰＭＰから脂質を単離し、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．２２（１０）：３１９３−３２０５，２０１０に説明されているように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで特性決定する。グリコシルイノシトールホスホリルセラミド（ＧＩＰＣ）脂質を抽出し、Ｃａｃａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１７０：３６７−３８４，２０１６に記載のように精製した後、前述したようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析する。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のＱｕａｎｔ−Ｉｔキットを用いて、指示に従い、全ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質を特性決定する。Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７に記載のプロトコルに従い、ＰＭＰのタンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより特性決定する。トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）を用いて、ＲＮＡ及びＤＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏ Ｐｌａｎｔキット及びＮｅｘｔｅｒａ Ｍａｔｅ Ｐａｉｒ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて、ＴｒｕＳｅｑ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを含むライブラリに調製した後、製造者の指示に従い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでシーケンシングする。
実施例４：植物メッセンジャーパック安定性の特性決定
この実施例は、様々な保存及び生理学的条件下でのＰＭＰの安定性の測定を説明する。
実験計画：
実施例１及び２に記載通りに生成したＰＭＰを様々な条件に付す。水、５％ショ糖若しくはＰＢＳにＰＭＰを懸濁させ、−２０℃、４℃、２０℃及び３７℃で１、７、３０及び１８０日間放置する。また、ＰＭＰを水に懸濁させ、ロータリエバポレータ装置を用いて乾燥させ、４℃、２０℃及び３７℃で１、７及び３０並びに１８０日間放置する。また、ＰＭＰを水又は５％ショ糖溶液に懸濁させ、液体窒素で急速冷凍後、凍結乾燥させた。１、７、３０及び１８０日後、乾燥及び凍結乾燥ＰＭＰを水に再懸濁させる。０℃を超える温度での条件を含む３つの先行実験物は、模擬屋外ＵＶ条件での満足な安全性を決定するために、人工太陽光シミュレータにも曝露する。さらには、１単位のトリプシンが添加された若しくは添加されていないｐＨ１、３、５、７及び９の緩衝溶液又は他の人工胃液中で３７℃、４０℃、４５℃、５０℃及び５５℃の温度に１、６及び２４時間ＰＭＰを曝露する。
これら各々の処理後、ＰＭＰを２０℃に戻し、ｐＨ７．４に中和した後、実施例３に記載の方法の一部又は全部を用いて特性決定する。
実施例５．カーゴによるＰＭＰのローディング
この実施例は、小分子、タンパク質及び核酸を用いたＰＭＰのローディング法について記載する。
ａ）ＰＭＰ内への小分子のローディング
ＰＭＰは、実施例１及び実施例２に記載されたように生成する。ＰＭＰ内に小分子をローディングするために、ＰＭＰは、固体形態又は可溶化されてのいずれかでの小分子を含むＰＢＳ溶液中に配置する。この溶液は、Ｓｕｎ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１０に記載のプロトコルに従い、２２℃で１時間放置する。代わりに、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，２０１３からのプロトコルに従い、溶液を超音波処理して、エキソソームにポレーション及び拡散を誘導する。代わりに、ＰＭＰは、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０１２からのプロトコルに従ってエレクトロポレートする。
代わりに、ＰＭＰ脂質は、ＰＢＳ中の１ｍｌのＰＭＰに３．７５ｍｌの２：１（ｖ／ｖ）のＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３を添加することにより単離し、ボルテックスする。ＣＨＣｌ３（１．２５ｍｌ）及びｄｄＨ２Ｏ（１．２５ｍｌ）を順次添加し、ボルテックスする。次に、混合物をガラスチューブ内の２２℃において２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、混合物を２相（水相及び有機相）に分離する。ＰＭＰ脂質を含有する有機層サンプルは、窒素（２ｐｓｉ）下で加熱によって乾燥させる。小分子ロードＰＭＰを生成するために、単離したＰＭＰ脂質を小分子溶液と混合し、且つＨａｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，２０１５からのプロトコルに従い、溶液を脂質エキストルーダに通過させる。
使用前に、非結合小分子を除去するために、実施例２に記載の方法を用いて、ロードＰＭＰを精製する。ロードＰＭＰは、実施例３に記載のように特性決定し、それらの安定性は実施例４に記載のように試験する。
ｂ）ＰＭＰ内へのタンパク質又はペプチドのローディング
ＰＭＰは、実施例１及び実施例２に記載されたように生成する。ＰＭＰ内にタンパク質又はペプチドをローディングするために、ＰＭＰをＰＢＳ中のタンパク質又はペプチドと共に溶液中に配置する。タンパク質又はペプチドが不溶性であれば、それが可溶性になるまでｐＨを調整する。タンパク質又はペプチドが依然として不溶性であれば、不溶性タンパク質又はペプチドを使用する。次に、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，２０１３からのプロトコルに従い、溶液を超音波処理して、ＰＭＰにポレーション及び拡散を誘導する。代わりに、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０１２からのプロトコルに従ってＰＭＰをエレクトロポレートする。
代わりに、ＰＭＰ脂質は、ＰＢＳ中の１ｍｌのＰＭＰに３．７５ｍｌの２：１（ｖ／ｖ）のＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３を添加することにより単離する。ＣＨＣｌ３（１．２５ｍｌ）及びｄｄＨ２Ｏ（１．２５ｍｌ）を順次添加し、ボルテックスする。次に、混合物をガラスチューブ内の２２℃において２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、混合物を２相（水相及び有機相）に分離する。ＰＭＰ脂質を含有する有機層サンプルは、窒素（２ｐｓｉ）下で加熱によって乾燥させる。小分子ロードＰＭＰを生成するために、単離したＰＭＰ脂質を小分子溶液と混合し、且つＨａｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，２０１５からのプロトコルに従い、溶液を脂質エキストルーダに通過させる。
使用前に、非結合ペプチド及びタンパク質を除去するために、実施例２に記載の方法を用いて、ロードＰＭＰを精製する。ロードＰＭＰは、実施例３に記載のように特性決定し、それらの安定性は実施例４に記載のように試験する。タンパク質又はペプチドのローディングを測定するために、ロード及び非ロードＰＭＰの小さいサンプルについてＰｉｅｒｃｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｓｓａｙを使用する。
ｃ）核酸のＰＭＰへのローディング
ＰＭＰは、実施例１及び実施例２に記載されたように生成する。ＰＭＰ内に核酸をローディングするために、ＰＭＰをＰＢＳ中の核酸と共に溶液中に配置する。次に、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，２０１３からのプロトコルに従い、溶液を超音波処理して、ＰＭＰにポレーション及び拡散を誘導する。代わりに、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０１２からのプロトコルに従ってＰＭＰをエレクトロポレートする。
代わりに、ＰＭＰ脂質は、ＰＢＳ中の１ｍｌのＰＭＰに３．７５ｍｌの２：１（ｖ／ｖ）のＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３を添加することにより単離する。ＣＨＣｌ３（１．２５ｍｌ）及びｄｄＨ２Ｏ（１．２５ｍｌ）を順次添加し、ボルテックスする。次に、混合物をガラスチューブ内の２２℃において２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、混合物を２相（水相及び有機相）に分離する。ＰＭＰ脂質を含有する有機層サンプルは、窒素（２ｐｓｉ）下で加熱によって乾燥させる。小分子ロードＰＭＰを生成するために、単離したＰＭＰ脂質を小分子溶液と混合し、且つＨａｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，２０１５からのプロトコルに従い、溶液を脂質エキストルーダに通過させる。
使用前に、非結合核酸を除去するために、実施例２に記載の方法を用いて、ＰＭＰを精製する。ロードＰＭＰは、実施例３に記載のように特性決定し、それらの安定性は実施例４に記載のように試験する。ＰＭＰ内にロードされる核酸は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のＱｕａｎｔ−Ｉｔアッセイを製造業者の取扱説明書に従って用いて定量するか、又は核酸が蛍光標識されるかどうかを、プレートリーダーを用いて定量する。
実施例６：植物体におけるＰＭＰ媒介性プラスミド送達による植物の改変
この実施例では、植物の適応度に影響を及ぼすために、植物体におけるプラスミドロードＰＭＰのローディング及び機能的送達について記載する。また、本実施例は、プラスミドロードＰＭＰが、多様な加工処理及び環境条件にわたって安定であり、且つその活性を保持することもさらに実証する。
この実施例では、綿をモデル植物として、グレープフルーツＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用し、且つｐＣａｍｂｉａ１３０３ ＧＵＳＡ：ｍＧＦＰ５レポーター発現ベクターをモデルプラスミドとして使用する。
治療計画：
グレープフルーツＰＭＰ溶液は、滅菌水中の等用量の０、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌのプラスミドを用いて製剤化する。
実験プロトコル：
グレープフルーツＰＭＰへのＧＵＳＡ：ｍＧＦＰ５レポータープラスミドのローディング
ＰＭＰは、実施例１及び実施例２に記載されたようにグレープフルーツから生成される。ＰＭＰによる機能的プラスミド送達を示すために、グレープフルーツＰＭＰにＣａＭＶ３５Ｓプロモータの二重増強バージョンによって駆動され、ＣａＭＶ３５Ｓ ｐｏｌｙＡシグナルによって終了した融合ｇｕｓＡ：ｍｇｆｐ５レポーター遺伝子を発現するｐＣａｍｂｉａ１３０３レポータープラスミド（１２，３６１ｂｐ；Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）によりローディングする。転写すると、ＧＵＳＡ及びｍＧＦＰ５の両方が転写され、検出することができる。ｐＣａｍｂｉａ１３０３プラスミドは、実施例５に記載の方法によってＰＭＰ内にローディングされる。
プラスミドのＰＭＰ内への封入は、ＰＣＲ分析によって決定する。全ゲノムＤＮＡは、標準方法を用いてロードＰＭＰから単離する。ＰＣＲ分析のためには、５０ｎｇの全ＤＮＡを５μｌのＲｅｄＴａｑ Ｒｅａｄｙｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及びｍｇｆｐ５遺伝子を増幅させるための０．１μＭの各プライマー対：５’−ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＡＣ ＴＴＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＧＡＧ−３’（配列番号７）及び５’−ＡＧＴ ＴＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧＴ ＧＴＡ−３（配列番号８）を含有する１０μｌのＰＣＲに添加する。ＰＣＲ増幅は、９５℃で１分間での初期変性、その後に９５℃での１分間の３０サイクル、５５℃で１分間、６８℃で１分間及び６８℃で１０分間の最終伸長でのサーマルサイクラー内で実施する。ＰＣＲ産物は、エレクトロフォレーシスを用いて１．０％のアガロースゲル上で分離し、撮像した。ゲルは、ｐＣａｍｂｉａ１３０３プラスミドの既知の量と比較して、ｍｇｆｐ５産物（約７００ｂｐ）の存在及び強度についてスコアリングする。プラスミドがロードされたＰＭＰは、無菌水中で０、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌのプラスミドの均等物を送達する濃度に水中で製剤化し、等量濃度の非ロードＰＭＰを対照として使用する。プラスミドロードＰＭＰの安定性は、実施例４に記載のように測定する。
綿植物中のＧＵＳＡ：ｍＧＦＰ５レポータープラスミドがロードされたグレープフルーツＰＭＰの機能的送達
綿種子（ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）及びゴシピウム・ライモンディ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｒａｉｍｏｎｄｉｉ））は、米国国立植物遺伝資源システム（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｓｙｓｔｅｍ）を通して得られる。滅菌済み種子を吸湿性綿で包み、ペトリ皿内に置き、発芽させるために３日間、２５℃、１５０μＥのｍ−２Ｓ−１の光線強度による光の１４／１０時間（明／暗）光期間下の増殖チャンバー内に置いた。苗は、２６／２０℃の昼間／夜間温度を用いる長日条件（１６／８時間の明／暗光期間）下でホーグランド栄養溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む無菌培養容器中で増殖させる。４日後、ＰＭＰ処理のために、十分に大きくなった子葉を備える苗（第一本葉が出現する前）を使用する。
７日齢の綿の苗は、０．８％（ｗ／ｖ）のアガロースを含む１×ＭＳビタミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（ｐＨ５．６〜５．８）、を含む０．５×のムラシゲスクーグ（ＭＳ）無機塩（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）上に移し、１群当たり植物３本に、苗全体に植物１本当たり１ｍｌの溶液で噴霧することにより、滅菌水（ｄｄＨ２Ｏ）中の有効量の０、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌプラスミドにより処理し、等量濃度の非ロードＰＭＰを対照として使用する。代わりに、ＰＭＰ処理前に、綿植物体の子葉の下側に子葉を通して穿刺することなく２５Ｇニードルにより穿孔する。ＰＭＰ溶液は（ＶＩＢ培地（２０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６）中で製剤化された適用のためには、１ｍＬの無針シリンジを用いた創傷部位を通して子葉の下側から手作業で浸潤させる。代わりに、４日齢の苗は水耕増殖条件下に維持し、ＰＭＰによる根吸収を決定するためにプラスミドロードＰＭＰ製剤を増殖培地に添加する。全部の植物を増殖チャンバーに移し、９０μｍｏｌのｍ−２ｓ−１の光線強度及び２６／２０℃の昼間／夜間温度を備える長日条件（１６時間／８時間の明／暗光期間）下で維持する。
１、２、３、５、８及び１４日間後、植物細胞内へのプラスミドロードＰＭＰの機能的送達を評価するために、ＧＦＰ及びＧＵＳの発現を決定する。全タンパク質は、１００ｍｇの新鮮な綿の葉（方法）から抽出し、植物性プロテアーゼ阻害剤を添加する。ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ ａｂ１２１８）のためのウエスタンブロットは、アクチン（Ａｂｃａｍ ａｂ１９７３４５）ローディング対照を用いて実施する。アクチンに正規化した相対ＧＦＰ発現をプラスミドロードＰＭＰ処理、製剤及び対照の間で比較する。さらに、タンパク質単離前に蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ２ ＦＬ）によってＧＦＰ発現について綿植物体を試験する。
プラスミドロードＰＭＰ処理植物及び対照におけるＧＵＳ活性の組織化学的局在性は、Ｘ−ｇｌｕｃバッファー（５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５ｍＭのフェロシアン化カリウム及び２ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド（Ｘ−ｇｌｕｃ）中において３７℃で１２時間にわたり植物体をインキュベートした後に分析する。明視野像は、解剖顕微鏡を用いて収集する。
ｐＣａｍｂｉａ１３０３プラスミドロードグレープフルーツＰＭＰは、 植物細胞にそれらのカーゴを機能的に送達し、プラスミド内でコードされたレポータータンパク質を上首尾で転写する。
実施例７：ＰＭＰ媒介性短鎖核酸送達による植物の改変
この実施例では、植物の適応度に影響を及ぼすために、植物体における短鎖核酸ロードＰＭＰのローディング及び機能的送達について記載する。この実施例は、短鎖核酸ロードＰＭＰが、ある範囲の加工処理及び環境条件にわたって安定しており、且つそれらの活性を保持することをさらに実証する。この実施例では、綿をモデル植物として、グレープフルーツＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用し、且つＣｌａ１に対するａｍｉＲＮＡをモデルｄｓＲＮＡとして使用する。
治療計画：
グレープフルーツＰＭＰ溶液は、滅菌水中の０（陰性対照）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのｄｓＲＮＡを用いて製剤化する。
実験プロトコル：
グレープフルーツＰＭＰへのＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡのローディング
植物体中のＰＭＰによる細胞吸収を証明するために、グレープフルーツＰＭＰに綿光合成遺伝子ＧｒＣＬＡ１（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ）を標的化する人工的ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ、Ｐ−ＳＡＭＳ（ｐ−ｓａｍａ．ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎｌａｂ．ｏｒｇ）を用いて設計）又はカスタムダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ、ＩＤＴによって設計）をロードした。ＧｒＣＬＡ１は、その機能消失が真葉上のアルビノ表現型を生じさせ、サイレンシング効率のための視覚的マーカを提供する、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｃｌｏｒｏｐｌａｓｔｏｓ ａｌｔｅｒａｄｏｓ １遺伝子（ＡｔＣＬＡ１）のホモログ遺伝子である。オリゴヌクレオチドは、ＩＤＴから入手する。
ＰＭＰは、実施例１及び実施例２に記載されたようにグレープフルーツから生成される。ＰＭＰの取込みを決定するために、実施例５に記載されたように、グレープフルーツＰＭＰにＧｒＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ若しくはＧｒＣＬＡ１−ＤｓｉＲＮＡ二重螺旋（表１）をロードする。ＰＭＰのａｍｉＲＮＡ若しくはＤｓｉＲＮＡ封入は、Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイキット又はａｍｉＲＮＡ若しくはＤｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ）で標識した対照蛍光色素を用いて測定する。ＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードＰＭＰ対非ロードＰＭＰのＰＭＰ効果を決定するため、綿の苗を処理し、ＣＬＡ１遺伝子サイレンシングについて分析する。ａｍｉＲＮＡ若しくはＤｓｉＲＮＡ（集合的にｄｓＲＮＡと呼ばれる）がロードされたＰＭＰは、無菌水中で同等の０、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌの効果的ｄｓＲＮＡ用量を送達する濃度に水中で製剤化され、等量濃度の非ロードＰＭＰが対照として送達される。ｄｓＲＮＡロードＰＭＰの安定性は、実施例４に記載のように測定する。
綿植物中のＣＬＡ１を標的とするｄｓＲＮＡがロードされたグレープフルーツＰＭＰの機能的送達
綿種子（ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）及びゴシピウム・ライモンディ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｒａｉｍｏｎｄｉｉ））は、米国国立植物遺伝資源システム（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｓｙｓｔｅｍ）を通して得られる。滅菌済み種子を吸湿性綿で包み、ペトリ皿内に置き、発芽させるために３日間、２５℃、１５０μＥのｍ−２Ｓ−１の光線強度による１４／１０時間（明／暗）光期間下の増殖チャンバー内に置いた。苗は、２６／２０℃の昼間／夜間温度を用いる長日条件（１６／８時間の明／暗光期間）下でホーグランド栄養溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む無菌培養容器中で増殖させる。４日後、ＰＭＰ処理のために、十分に大きくなった子葉を備える苗（第一本葉が出現する前）を使用する。
７日齢の綿の苗は、０．８％（ｗ／ｖ）のアガロースを含む１×ＭＳビタミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（ｐＨ５．６〜５．８）を含む０．５×のムラシゲスクーグ（ＭＳ）無機塩（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）上に移し、１群当たり植物３本に、苗全体に植物１本当たり１ｍｌの溶液で噴霧することにより、有効量の０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロードＰＭＰ及び均等なＰＭＰ粒子濃度の非改変グレープフルーツＰＭＰにより処理する。代わりに、ＰＭＰ処理前に、綿植物体の子葉の下側に子葉を通して穿刺することなく２５Ｇニードルにより穿孔する。ＰＭＰ溶液は、１ｍＬの無針シリンジを用いて創傷部位を通して子葉の下側から手作業で浸潤させる。植物を増殖チャンバーに移し、９０μｍｏｌのｍ−２ｓ−１の光線強度及び２６／２０℃の昼間／夜間温度を備える長日条件（１６時間／８時間の明／暗光期間）下で維持する。
２、５、８及び１４日後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いてＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を内在性ＣＬＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルによって試験する。全ＲＮＡは、製造業者の取扱説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて１００ｍｇの新鮮な綿の葉から抽出し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて入念に処理する。第一鎖ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２μｇの全ＲＮＡから合成する。ＣＬＡ１転写産物のレベルを推定するために、ｑＲＴ−ＰＣＲは、次のプログラム：（ａ）９５℃で５分間；（ｂ）９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間；及び７２℃で３０秒間の４０サイクルを用いて、プライマー：ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｆ ５’−ＣＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＡＴＧＣＡＴＣ−３’（配列番号９）、ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｒ ５’−ＣＣＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号１０）及びＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｆ ５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号１１）、ＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｒ ５’−ＣＧＴＣＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号１２）及び１８ｓ ＲＮＡ＿Ｆ ５’−ＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１３）、１８ｓ ＲＮＡ＿ Ｒ ５’−ＡＡＴＴＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴ−３’（配列番号７）を含むＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施する。結果を正規化するために、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を内部対照として使用する。非改変ＰＭＰ及び水対照と比較してＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＰＭＰによる処理後の綿におけるＣＬＡ１ノックダウン効率は、ｄｓＲＮＡロードＰＭＰによる処理後の正規化ＣＬＡ１発現を非改変ＰＭＰによる処理後の正規化ＣＬＡ１発現と比較することで、ΔΔＣｔ値を計算することにより決定する。
さらに、ＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率は、表現型光退色分析によって試験する。処理及び非処理綿植物の葉の写真を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、対照葉の緑色と比較した葉上の白色光退色によって反映される遺伝子サイレンシングのパーセンテージを決定する。光退色の影響を定量するために１植物当たり３枚の葉をアッセイし、ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＰＭＰ対対照の遺伝子サイレンシング効率を評価する。
ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＰＭＰは、植物体中に機能的に送達し、非改変ＰＭＰ及び水対照と比較してＣＬＡ１遺伝子サイレンシング及び光退色表現型を誘導する。
Figure 2021533180
実施例８：プロトプラストへのＰＭＰ媒介性プラスミド送達による植物の改変
この実施例では、植物の適応度に影響を及ぼすために、プロトプラストへのプラスミドロードＰＭＰのローディング及び機能的送達について記載する。また、本実施例は、プラスミドロードＰＭＰが、多様な加工処理及び環境条件にわたって安定しており、且つその活性を保持することもさらに実証する。
この実施例では、ダイズプロトプラストをモデルプロトプラストとして、ＢＹ−２ ＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用し、且つｐＣａｍｂｉａ１３０３ ＧＵＳＡ：ｍＧＦＰ５レポーター発現ベクターをモデルプラスミドとして使用する。
治療計画：
ＢＹ−２ ＰＭＰ溶液は、滅菌水中の等用量の０、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌのプラスミド溶液を用いて製剤化する。
実験プロトコル：
ＢＹ−２ ＰＭＰへのＧＵＳＡ：ｍＧＦＰ５レポータープラスミドのローディング
ＰＭＰは、実施例１及び実施例２に記載されたようにＢＹ−２細胞株から生成される。ＰＭＰによる機能的プラスミド送達を示すために、ＢＹ−２ ＰＭＰにＣａＭＶ３５Ｓプロモータの二重増強バージョンによって駆動され、ＣａＭＶ３５Ｓ ｐｏｌｙＡシグナルによって終了した融合ｇｕｓＡ：ｍｇｆｐ５レポーター遺伝子を発現するｐＣａｍｂｉａ１３０３レポータープラスミド（１２，３６１ｂｐ；Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）によりローディングする。転写すると、ＧＵＳＡ及びｍＧＦＰ５の両方が転写され、検出することができる。ｐＣａｍｂｉａ１３０３プラスミドは、実施例５に記載の方法によってＰＭＰ内にローディングする。
プラスミドのＰＭＰ内への封入は、ＰＣＲ分析によって決定する。全ゲノムＤＮＡは、標準方法を用いてロードＰＭＰから単離する。ＰＣＲ分析のためには、５０ｎｇの全ＤＮＡを５μｌのＲｅｄＴａｑ Ｒｅａｄｙｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及びｍｇｆｐ５遺伝子を増幅させるための０．１μＭの各プライマー対：５’−ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＡＣ ＴＴＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＧＡＧ−３’（配列番号７）及び５’−ＡＧＴ ＴＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧＴ ＧＴＡ−３（配列番号８）を含有する１０μｌのＰＣＲに添加する。ＰＣＲ増幅は、９５℃で１分間での初期変性、その後に９５℃での１分間の３０サイクル、５５℃で１分間、６８℃で１分間及び６８℃で１０分間の最終伸長でのサーマルサイクラー内で実施する。ＰＣＲ産物は、エレクトロフォレーシスを用いて１．０％のアガロースゲル上で分離し、撮像した。ゲルは、ｐＣａｍｂｉａ１３０３プラスミドの既知の量と比較して、ｍｇｆｐ５産物（約７００ｂｐ）の存在及び強度についてスコアリングされる。プラスミドがロードされたＰＭＰは、無菌水中で０、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌのプラスミドを送達する濃度に水中で製剤化され、等量濃度の非ロードＰＭＰが対照として使用される。プラスミドロードＰＭＰの安定性は、実施例４に記載のように測定する。
ダイズプロトプラストの単離
ダイズ種子（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）は、米国国立植物遺伝資源システム（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｓｙｓｔｅｍ）を通して得られる。５〜１０個のダイズ種子（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２）は、ダイズ用のカスタム土壌混合物（１：１：１比の土壌、パーライト及びトーピードサンド）上の２５℃で長日条件（１，５００μｍｏｌｍ−２ｓ−１での１６時間の照明）下の増殖チャンバーにおいて１３ｃｍポット内に植え付けた。プロトプラストは、Ｗｕ ａｎｄ Ｈａｎｚａｗａ，２０１８ Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．（１３１），ｅ５７２５８に記載されたように単離する。手短には、新規に伸長させた単葉の葉は１０日齢のダイズ苗から切断する。新しいカミソリの刃を用いて、中央脈を単葉の葉から除去し、残りは０．５〜１ｍｍの細片に切り分ける。１本の鉗子を用いて、葉細片を直ちに移し、１５ｍＬチューブ内の１０ｍＬの新しく調製した酵素溶液（ＭＥＳ、ｐＨ５．７、２０ｍＭ、２％（ｗ／ｖ）のセルラーゼＣＥＬＦ、０．１％（ｗ／ｖ）のペクトリアーゼＹ−２３、０．７５Ｍのマンニトール、０．２ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．５ｍＭのＤＴＴ）中に緩徐に入れた。葉細片は室温で１５分間にわたり真空浸潤させ、これらの葉細片を室温で４〜６時間にわたり微小光下で緩徐に攪拌しながら（４０ｒｐｍ）酵素溶液中でインキュベートする。１０ｍＬの酵素／プロトプラスト溶液は５０ｍＬチューブに緩徐に注入し、１０ｍＬのＷ５溶液（２ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．７、１５４ｍＭのＮａＣｌ、１２５ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ）を室温で添加して消化を停止させる。酵素／プロトプラスト溶液は、未消化の葉の組織を除去するために、５０ｍＬチューブの一番上に置いた清潔な７５μｍのナイロンメッシュ上に注入する。素通り酵素／プロトプラスト溶液は、室温で１〜２分間にわたり５０ｍＬチューブ内で１００×ｇで遠心分離し、プロトプラストペレットを妨害せずに上清を除去する。再懸濁させたプロトプラストは、血球計上でプロトプラスト数を計数することにより、４℃の冷却Ｗ５溶液中において２×１０５細胞／ｍｌの濃度に希釈する。洗浄後、プロトプラストは、室温で２×１０５細胞／ｍｌの濃度でＭＭＧ溶液（４ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．７、４００ｍＭのマンニトール、１５ｍＭのＭｇＣｌ２）中に再懸濁させる。
ダイズプロトプラスト中のＧＵＳＡ：ｍＧＦＰ５レポータープラスミドがロードされたＢＹ−２ＰＭＰの機能的送達
２×１０５細胞／ｍＬで２×１０４個のプロトプラストを含有する１００μＬのプロトプラストを２４ウェルの平底プレートに移す。プロトプラストは、滅菌水（ｄｄＨ２Ｏ）中で０、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌの有効量のプラスミドを用いて処理され、等量濃度の非ロードＰＭＰが対照として使用される。１００ｕｌ超のＰＭＰ溶液を添加する必要がある場合、ＰＭＰは、ＭＭＧ溶液中で製剤化し、１時点当たり３回ずつ接種する。
２時間、４時間、６時間、１日、２日及び３日後、ダイズプロトプラスト内へのプラスミドロードＰＭＰの機能的送達を評価するために、ＧＦＰ及びＧＵＳの発現を決定する。サンプルは、上述したように培地により５×１０分間洗浄する。全タンパク質は、処理したプロトプラストの１つの全ウェルから抽出し、ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ ａｂ１２１８）についてのウエスタンブロットは、アクチン（Ａｂｃａｍ ａｂ１９７３４５）ローディング対照を用いて実施する。アクチンに正規化した相対ＧＦＰ発現をプラスミドロードＰＭＰ処理、製剤及び対照の間で比較する。
さらに、１０μＬの洗浄したプロトプラストをガラススライド上に配置し、蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ２ ＦＬ）によってＧＦＰ発現について検査する。
プラスミドロードＰＭＰ処理プロトプラスト及び対照におけるＧＵＳ活性の組織化学的局在性は、Ｘ−ｇｌｕｃバッファー（５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５ｍＭのフェロシアン化カリウム及び２ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド（Ｘ−ｇｌｕｃ）中での３７℃で１２時間にわたりプロトプラストをインキュベートした後に分析する。明視野像は、ＥＶＯＳ２ ＦＬを用いて取得する。
ｐＣａｍｂｉａ１３０３プラスミドロードＢＹ−２ ＰＭＰはプロトプラストにそれらのカーゴを機能的に送達し、プラスミド内でコードされたレポータータンパク質を上首尾で転写する。
実施例９：超遠心分離及びショ糖勾配精製を用いたブレンド果汁からのＰＭＰ生成
この実施例では、果実をブレンドし、残屑を除去するための連続的遠心分離、粗ＰＭＰをペレット化するための超遠心分離の組み合わせを用い、ＰＭＰを精製するためのショ糖密度勾配を用いることによる果実からのＰＭＰの生成について記載する。この実施例では、グレープフルーツをモデル果実として使用した。
ａ）超遠心分離及びショ糖密度勾配精製によるグレープフルーツＰＭＰの生成
ブレンダ、超遠心分離及びショ糖勾配精製を用いたグレープフルーツＰＭＰ生成のためのワークフローを図１Ａに示す。１個のレッドグレープフルーツを現地のＷｈｏｌｅ Ｆｏｏｄｓ Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から購入し、アルベド、フラベド及びセグメント膜を除去して、砂じょうを収集し、これらを、最大速のブレンダを１０分使用してホモジナイズした。１００ｍＬの果汁をＰＢＳで５倍希釈した後、１０００×ｇで１０分、３０００×ｇで２０分及び１０，０００×ｇで４０分間の遠心分離に付すことにより、大きい残屑を除去した。２８ｍＬの清澄化した果汁を、Ｓ５０−ＳＴ（４×７ｍＬ）スイングバケットロータを用い、４℃において、１５０，０００×ｇのＳｏｒｖａｌｌ（商標）ＭＸ １２０ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ−Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅで９０分間超遠心分離して、粗ＰＭＰペレットを取得し、これをＰＢＳ ｐＨ７．４に再懸濁させた。次に、ショ糖勾配をトリス−ＨＣＬ ｐＨ７．２中に調製し、粗ＰＭＰをショ糖勾配（上から下に：８、１５、３０、４５及び６０％ショ糖）の上部に重ねてから、Ｓ５０−ＳＴ（４×７ｍＬ）スイングバケットロータを用い、４℃、１５０，０００×ｇで１２０分間の超遠心分離によりスピンダウンした。１ｍＬの画分を収集し、ＰＭＰを３０〜４５％界面で単離した。ＰＢＳを用いて、４℃、１５０，０００×ｇで１２０分間の超遠心分離により、画分を洗浄し、ペレットを最小量のＰＢＳに溶解させた。
ＴＳ−４００カートリッジ（図１Ｂ）を用い、Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ ｎＣＳ１（商標）粒径分析装置を使用して、ＰＭＰ濃度（１×１０９ＰＭＰ／ｍＬ）及びメジアンＰＭＰ粒径（１２１．８ｎｍ）を決定した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａを用いてゼータ電位を測定したところ、−１１．５＋／−０．３５７ｍＶであった。
この実施例は、ショ糖勾配精製法と組み合わせた超遠心分離を用いて、グレープフルーツＰＭＰを単離することができることを実証する。しかし、この方法は、全てのＰＭＰ生成ステップ及び最終ＰＭＰ溶液中においてサンプルの著しいゲル化を誘導した。
実施例１０：超遠心分離及びショ糖勾配精製を用いたメッシュ圧搾果汁からのＰＭＰ生成
この実施例は、より穏やかな搾汁法（メッシュストレイナ）を使用することによる、ＰＭＰ生成工程中の細胞壁及び細胞膜混入物の減少を説明する。この実施例では、グレープフルーツをモデル果実として使用した。
ａ）穏やかな搾汁により、グレープフルーツＰＭＰからのＰＭＰ生成中のゲル化を低減する
実施例９に記載の通りにレッドグレープフルーツから砂じょうを単離した。ＰＭＰ生成中のゲル化を低減するために、破壊的ブレンド法を用いるのではなく、茶漉しメッシュに砂じょうを軽く押し付けて、果汁を収集し、細胞壁及び細胞膜混入物を低減した。分画遠心分離後、果汁は、ブレンダの使用後よりも清澄になり、ショ糖密度勾配遠心分離後に３０〜４５％インターセクションで１つの純粋ＰＭＰ含有ショ糖バンドを観察した（図２）。全体としてＰＭＰ生成中及び後のゲル化は少なかった。
本発明者らのデータは、穏やかな搾汁ステップを使用すると、ブレンドを含む方法に比べ、ＰＭＰ生成中の混入物に起因するゲル化が低減することを証明している。
実施例１１：超遠心分離及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いたＰＭＰ生成
この実施例は、超遠心分離（ＵＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用による果実からのＰＭＰの生成を記載する。この実施例では、グレープフルーツをモデル果実として使用する。
ａ）ＵＣ及びＳＥＣを用いたグレープフルーツＰＭＰの生成
実施例９ａに記載の通りにレッドグレープフルーツから砂じょうを単離し、茶漉しメッシュに軽く押し付けて、２８ｍｌの果汁を収集した。ＵＣ及びＳＥＣを用いるグレープフルーツＰＭＰ生成のワークフローを図３Ａに描く。手短には、果汁を、１０００×ｇで１０分、３０００×ｇで２０分及び１０，０００×ｇで４０分の分画遠心分離に付すことにより、大きい残屑を除去した。２８ｍｌの清澄化した果汁を、Ｓ５０−ＳＴ（４×７ｍＬ）スイングバケットロータを用い、４℃において、１００，０００×ｇのＳｏｒｖａｌｌ（商標）ＭＸ １２０ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ−Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅで６０分間超遠心分離して、粗ＰＭＰペレットを取得し、これをＭＥＳバッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ、ＮａＣｌ、ｐＨ６）に再懸濁させた。ペレットをＭＥＳバッファーで２回洗浄した後、最終ペレットを１ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４に再懸濁させた。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出した。製造者により提供される濃度及び粒径標準を用いて、ＰＭＰ粒径及び濃度を決定するために、ＮａｎｏＦＣＭを用いたナノ−フローサイトメトリーによりＳＥＣ溶出画分を分析した。さらに、どの画分にＰＭＰが溶出されているかを識別するために、ＳＥＣ画分について、２８０ｎｍでの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ ａｓｓａｙ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を決定した（図３Ｂ〜３Ｄ）。ＰＭＰ含有画分として、ＳＥＣ画分２〜４を識別した。早期及び後期溶出画分の分析から、ＳＥＣ画分３が、主要ＰＭＰ含有画分であることがわかり、濃度は、２．８３×１０１１ＰＭＰ／ｍＬ（全粒子の５７．２％が、５０〜１２０ｎｍ粒度範囲にある）、メジアン径は、８３．６ｎｍ＋／−１４．２ｎｍ（ＳＤ）であった。後期溶出画分８〜１３は、ＮａｎｏＦＣＭにより示される通り、非常に低い濃度の粒子を有したが、これらの画分には、ＢＣＡ分析によりタンパク質混入物が検出された。
本発明者らのデータは、ＴＦＦ及びＳＥＣを使用して、後期溶出混入物から精製ＰＭＰを単離することができること並びに本実施例で使用した分析方法の組合せにより、後期溶出混入物からＰＭＰ画分を識別することができることを証明している。
実施例１２：混入物を低減するためにＥＤＴＡ／透析と組み合わせてタンジェンシャルフロー濾過及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いたスケール化ＰＭＰ生成
この実施例は、ペクチン高分子の形成を低減するためのＥＤＴＡインキュベーション及び混入物を低減するための一晩の透析と組み合わせて、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いることによる、果実からのＰＭＰのスケール化生成（ｓｃａｌｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を説明する。この実施例では、グレープフルーツをモデル果実として使用する。
ａ）ＴＦＦ及びＳＥＣを用いたグレープフルーツＰＭＰの生成
レッドグレープフルーツを現地のＷｈｏｌｅ Ｆｏｏｄｓ Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から購入し、果汁絞り機で１０００ｍｌの果汁を単離した。ＴＦＦ及びＳＥＣを用いたグレープフルーツＰＭＰの生成のためのワークフローを図４Ａに描く。果汁を、１０００×ｇで１０分、３０００×ｇで２０分及び１０，０００×ｇで４０分の分画遠心分離に付すことにより、大きい残屑を除去した。清澄化したグレープフルーツ果汁を、ＴＦＦ（孔径５ｎｍ）を用いて、２ｍＬ（１００×）まで１回濃縮及び洗浄した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＰＭＰ含有画分を溶出した。製造者により提供される濃度及び粒径標準を用いて、ＰＭＰ濃度を決定するために、ＮａｎｏＦＣＭを用いたナノ−フローサイトメトリーによりＳＥＣ溶出画分を分析した。さらに、どの画分にＰＭＰが溶出されているかを識別するために、ＳＥＣ画分について、タンパク質濃度（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ ａｓｓａｙ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を決定した。１リットルの果汁（１００倍濃縮）からのスケール化生成では、ＢＣＡアッセイにより後期ＳＥＣ画分中にやはり濃縮された多量の混入物を検出することができる（図４Ｂ、上方パネル）。全体の合計ＰＭＰ収量（図４Ｂ、下方パネル）は、単回グレープフルーツ単離と比較して、スケール化生成の方が低かったが、これは、ＰＭＰの喪失を示し得る。
ｂ）ＥＤＴＡインキュベーション及び透析による混入物の低減
レッドグレープフルーツを現地のＷｈｏｌｅ Ｆｏｏｄｓ Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から購入し、果汁絞り機を用いて８００ｍｌの果汁を単離した。果汁を、１０００×ｇで１０分、３０００×ｇで２０分及び１０，０００×ｇで４０分の分画遠心分離に付すことにより、大きい残屑を除去した後、１μｍ及び０．４５μｍフィルタで濾過して、大きい粒子を除去した。清澄化したグレープフルーツ果汁を、各々１２５ｍｌの果汁を含有する４つの異なる処理群に分割した。処理群１は、実施例１２ａに記載のように処理し、最終濃度６３×まで濃縮及び洗浄（ＰＢＳ）し、ＳＥＣに付した。ＴＦＦ前に鉄をキレート化すると共に、ペクチン高分子の形成を低減するために、４７５ｍｌの果汁を、最終濃度５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．１５と一緒にＲＴで１．５ｈｒインキュベートした。その後、果汁を３つの処理群に分け、これらをＰＢＳ（カルシウム／マグネシウムを含まない）ｐＨ７．４、ＭＥＳ ｐＨ６又はトリスｐＨ８．６洗浄液のいずれかと一緒に最終果汁濃度６３×までＴＦＦ濃縮に付した。次に、３００ｋＤａ膜を用い、同じ洗浄バッファー中においてサンプルを４℃で一晩透析した後、ＳＥＣに付した。２８０ｎｍの吸光度（図４Ｃ）及びＢＣＡタンパク質分析（これは糖及びペクチンの存在に対して感受性である）（図４Ｄ）により示されるように、ＴＦＦ単独の対照の後期溶出画分中の高い混入物ピークと比較して、ＥＤＴＡインキュベーション後に一晩透析すると、混入物を大幅に低減した。使用した透析バッファー（カルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳ ｐＨ７．４、ＭＥＳ ｐＨ６、トリスｐＨ８．６）に差はなかった。
本発明者らのデータは、ＥＤＴＡインキュベーション及びそれに続く透析は、同時精製した混入物の量を低減し、スケール化ＰＭＰ生成を促進することを示している。
実施例１３：植物細胞培地からのＰＭＰ生成
この実施例は、植物細胞培地からのＰＭＰの生成を説明する。この実施例では、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ブラック・メキシカン・スイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）細胞株をモデル植物細胞株として使用する。
ａ）ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＢＭＳ細胞株ＰＭＰの生成
ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ブラック・メキシカン・スイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）細胞株をＡＢＲＣから購入し、２４℃で、４．３ｇ／Ｌのムラシゲスクーグ塩基塩混合物（Ｓｉｇｍａ Ｍ５５２４）、２％ショ糖（Ｓ０３８９，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、１×ＭＳビタミン溶液（Ｍ３９００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（Ｄ７２９９，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）及び２５０ｕｇ／ＬのチアミンＨＣＬ（Ｖ−０１４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を含有するムラシゲスクーグ塩基培地ｐＨ５．８中において攪拌（１１０ｒｐｍ）しながら増殖させ、７日おきに、２０％容積／容積で継代培養した。
継代から３日後、１６０ｍｌのＢＭＳ細胞を収集し、５００×ｇで５分スピンダウンして、細胞を除去し、続いて１０，０００×ｇでスピンダウンして、大きい残屑を除去した。培地を０．４５μｍフィルタに通して大きい粒子を除去し、濾過した培地をＴＦＦ（孔径５ｎｍ）により４ｍＬ（４０×）まで、濃縮及び洗浄（１００ｍｌ ＭＥＳバッファー、２０ｍＭ ＭＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣＬ、ｐＨ６）した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、これを、２８０ｎｍでの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ ａｓｓａｙ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により分析して、ＰＭＰ含有画分と、混入物を含有する後期画分を確認した（図５Ａ〜５Ｃ）。ＳＥＣ画分４〜６は、精製ＰＭＰを含有しており（画分９〜１３は、混入物を含有した）、これらを一緒にプールした。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用い、ＮａｎｏＦＣＭにより、合わせたＰＭＰ含有画分の最終ＰＭＰ濃度（２．８４×１０１０ＰＭＰ／ｍｌ）及びメジアンＰＭＰ粒径（６３．２ｎｍ＋／−１２．３ｎｍ ＳＤ）を決定した（図５Ｄ〜５Ｅ）。
これらのデータは、植物液体培地からＰＭＰを単離、精製及び濃縮することができることを示している。
実施例１４：植物細胞によるＰＭＰの取込み
この実施例では、植物細胞と結合し、植物細胞によって取り込まれるＰＭＰの能力について記載する。この実施例では、レモンＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用し、ダイズ、コムギ及びトウモロコシ細胞株をモデル植物細胞として使用する。
ａ）ＳＥＣと組み合わせてＴＦＦを用いるグレープフルーツＰＭＰの生成
レッドオーガニックグレープフルーツ（Ｆｌｏｒｉｄａ）は、現地のＷｈｏｌｅ Ｆｏｏｄｓ Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から取得した。果汁絞り機を用いて１リットルのグレープフルーツ果汁を収集した後、３０００×ｇで２０分間、続いて１０，０００×ｇで４０分間遠心分離することにより、大きい残屑を除去した。次に、５００ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）を最終濃度５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７）まで添加し、カルシウムをキレート化すると共に、ペクチン高分子の形成を防止するために、溶液を３０分間インキュベートした。続いて、果汁を１１μｍ、１μｍ及び０．４５μｍフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）（孔径５ｎｍ）により４００ｍｌ（２．５×）まで濃縮及び洗浄（５００ｍｌのＰＢＳ）した後、３００ｋＤａ透析膜を用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で一晩透析して（１回の培地交換を含む）、混入物を除去した。その後、透析した果汁をＴＦＦにより５０ｍｌの最終濃度（２０×）まで濃縮した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、これを、２８０ｎｍの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ ａｓｓａｙ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により分析して、ＰＭＰ含有画分と、混入物を含有する後期画分を確認した。ＳＥＣ画分４〜６は、精製ＰＭＰを含有しており（画分８〜１４は、混入物を含有した）、これらを一緒にプールして、０．８μｍ、０．４５μｍ及び０．２２μｍシリンジフィルタを用いた連続濾過により濾過滅菌した。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用い、ＮａｎｏＦＣＭにより、合わせた滅菌ＰＭＰ含有画分の最終ＰＭＰ濃度（１．３２×１０１１ＰＭＰ／ｍＬ）及びメジアンＰＭＰ粒径（７１．９ｎｍ＋／−１４．５ｎｍ）を決定した。
ｂ）ＳＥＣと組み合わせてＴＦＦを用いるレモンＰＭＰの生成
レモンは、現地のＷｈｏｌｅ Ｆｏｏｄｓ Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から取得した。果汁絞り機を用いて１リットルのレモン果汁を収集した後、３０００ｇで２０分間、続いて１０，０００ｇで４０分間遠心分離することにより、大きい残屑を除去した。次に、５００ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）を最終濃度５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７）まで添加し、カルシウムをキレート化すると共に、ペクチン高分子の形成を防止するために、溶液を３０分間インキュベートした。続いて、果汁をコーヒーフィルタ、１μｍ及び０．４５μｍフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）（孔径５ｎｍ）により４００ｍｌ（２．５×濃縮）まで濃縮した後、３００ｋＤａ透析膜を用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で一晩透析して、混入物を除去した。その後、透析した果汁をＴＦＦにより５０ｍｌの最終濃度（２０×）まで濃縮した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、これを、２８０ｎｍの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ ａｓｓａｙ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により分析して、ＰＭＰ含有画分と、混入物を含有する後期画分を確認した。ＳＥＣ画分４〜６は、精製ＰＭＰを含有しており（画分８〜１４は、混入物を含有した）、これらを一緒にプールして、０．８μｍ、０．４５μｍ及び０．２２μｍシリンジフィルタを用いた連続濾過により濾過滅菌した。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用い、ＮａｎｏＦＣＭにより、合わせた滅菌ＰＭＰ含有画分の最終ＰＭＰ濃度（２．７×１０１１ＰＭＰ／ｍＬ）及びメジアンＰＭＰ粒径（７０．７ｎｍ＋／−１５．８ｎｍ）を決定した。
ｃ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＮＨＳ ＥｓｔｅｒによるレモンＰＭＰの標識
レモンＰＭＰは、実施例１４ｂに記載のように生成した。ＰＭＰをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（登録商標）ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、共有結合膜色素（ＡＦ４８８））で標識した。手短には、ＡＦ４８８を最終濃度１０ｍｇ／ｍｌまでＤＭＳＯに溶解させ、２００ｕｌのＰＭＰ（１．５３Ｅ＋１３ＰＭＰ／ｍｌ）を５ｕｌの色素と混合し、室温において、シェーカ上で１ｈインキュベートした後、４℃で１ｈｒの１００，０００×ｇの超遠心分離により、標識ＰＭＰを２〜３回洗浄した。ペレットを１．５ｍｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に再懸濁させた。潜在的な色素凝集体の存在を照査するために、ＰＭＰの代わりに２００ｕｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ水を添加して、同じ手順に従い、色素単独の対照サンプルを調製した。最終ＡＦ４８８標識ＰＭＰペレット及びＡＦ４８８色素単独対照を最小量のＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に再懸濁させ、ＮａｎｏＦＣＭにより特性決定した。レモン４８８標識ＰＭＰの最終濃度は、２．９１×１０１２ＰＭＰ／ｍｌで、メジアンＡＦ４８８−ＰＭＰ粒径は、７９．４ｎｍ＋／−１４．７ｎｍであり、８９．４％の標識効率であった（図６Ａ）。
ｄ）植物細胞によるＡＦ４８８標識レモンＰＭＰの取込み
植物細胞株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、♯ＰＣ−１０２６；トリチカム・エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、♯ＰＣ−９９８）及びＡＢＲＣ（ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ブラック・メキシカン・スイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）から購入し、２４℃の暗所において、バッフル付きベント型２５０ｍＬフラスコ内で、攪拌（１１０ｒｐｍ）しながら増殖させた。グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）及びトリチカム・エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）は、供給者の指示に従い、２％ショ糖及び２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４Ｄ）（Ｄ７２９９，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）が添加され、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｏｒｇａｎｉｃｓ補充（Ｇ５８９３，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）ｐＨ５．５を含む３．２ｇ／ＬのガンボーグＢ−５基礎培地（Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ−５ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）で増殖させた。ＢＭＳ細胞は、４．３ｇ／Ｌのムラシゲスクーグ塩基塩混合物（Ｓｉｇｍａ Ｍ５５２４）、２％ショ糖（Ｓ０３８９，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、１×ＭＳビタミン溶液（Ｍ３９００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（Ｄ７２９９，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）及び２５０ｕｇ／ＬのチアミンＨＣＬ（Ｖ−０１４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を含有するムラシゲスクーグ培地ｐＨ５．８中で増殖させた。
ＡＦ４８８−ＰＭＰによる処理のために、５ｍＬの細胞懸濁液を採取して、％パック細胞容積（ＰＣＶ）を決定した。ＰＣＶは、細胞の容積を細胞培養物アリコートの総容積で割った商として定義され、パーセンテージとして表示される。細胞を３９００ｒｐｍで５分遠心分離し、細胞ペレットの容積を決定した。ＢＭＳ、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）及びトリチカム・エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）の％ＰＣＶは、それぞれ、２０％、１５％及び１８％であった。取込み実験のために、細胞をその適切な培地で希釈することにより、培養物の％ＰＣＶを２％に調節した。次に、１２５μｌの植物細胞懸濁液を２４ウェルプレートに添加し、二重サンプルを、１２５μｌのＭＥＳバッファー（２００ｍＭ ＭＥＳ＋１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６）単独（陰性対照）、ＡＦ４８８色素単独（色素単独対照）又は１２５μｌまでＭＥＳバッファーで希釈した最終濃度の１×１０１２ＡＦ４８８−ＰＭＰ／ｍＬで処理した。細胞を２４℃の暗所において２時間インキュベートし、１ｍＬのＭＥＳバッファーで３回洗浄して、取り込まれなかったＡＦ４８８−ＰＭＰ又は遊離色素を除去した後、落射蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ ＦＬ Ａｕｔｏ ２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのイメージングのために３００μＬのＭＥＳバッファーに再懸濁させた。検出可能な蛍光がなかったＡＦ４８８色素単独対照と比較して、全ての植物細胞株において、ＰＭＰ取込みを示すまちまちの蛍光シグナルを検出することができた（図６Ｂ）。トリチカム・エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）細胞が、最も強い蛍光シグナルを呈示し、試験した３つの植物細胞株のうち、これらがＡＦ４８８標識レモンＰＭＰの最も高い取込みを有したことを示す。
本発明者らのデータは、ＰＭＰが、植物細胞によりインビトロで取り込まれ得ることを示している。
実施例１５：植物におけるＰＭＰの取込み
この実施例は、植物体中のＰＭＰの取込み及び全身性輸送について記載する。この実施例では、グレープフルーツ、レモン及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）苗ＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用し、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）苗及びアルファルファスプラウトをモデル植物として使用する。
ａ）ＤｙＬｉｇｈｔ ８００ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒによるレモン及びグレープフルーツＰＭＰの標識
グレープフルーツ及びレモンＰＭＰは、実施例１４ａ及び１４ｂに記載のように生成した。ＤｙＬｉｇｈｔ ８００ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃４６４２１）共有結合膜色素（ＤｙＬ８００）でＰＭＰを標識した。手短には、Ｄｙｌ８００をＤＭＳＯに最終濃度１０ｍｇ／ｍｌまで溶解させてから、２００μｌのＰＭＰを５μｌの色素と混合し、室温のシェーカ上で１ｈインキュベートした後、４℃、１００，０００×ｇで１ｈｒの超遠心分離により、標識ＰＭＰを２〜３回洗浄し、ペレットを１．５ｍｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ水で再懸濁させた。潜在的な色素凝集体の存在を照査するために、ＰＭＰの代わりに２００μｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ水を添加して、同じ手順に従い、色素単独の対照サンプルを調製した。最終ＤｙＬ８００標識ＰＭＰペレット及びＤｙＬ８００色素単独対照を最小量のＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に再懸濁させ、ＮａｎｏＦＣＭにより特性決定した。グレープフルーツＤｙＬ８００標識ＰＭＰの最終濃度は、４．４４×１０１２ＰＭＰ／ｍｌで、レモンＤｙＬ８００標識ＰＭＰの最終濃度は、５．１８×１０１２ＰＭＰ／ｍｌであった。標識効率は、ＮａｎｏＦＣＭが赤外線を検出することができないため、ＮａｎｏＦＣＭを用いて決定することはできなかった。
ｂ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）苗の発芽及び成長
野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌ−０種子をＡＢＲＣから取得し、７０％エタノールで表面滅菌してから、５０％漂白剤／０．１％トリトンＸ−１００と一緒に１０分インキュベートした後、４回の滅菌ｄｄＨ２Ｏ洗浄により、漂白剤溶液を除去した。種子を４℃の暗所において１ｄかけて層別化した。２０ｍＬの０．５×ＭＳ培地（２．１５ｇ／Ｌのムラシゲスクーグ塩、１％ショ糖、ｐＨ５．８）を含有する１００ｃｍ２プレート（水中０．５％ウシ胎仔血清で予めコーティングされている）当たり約２５０個の種子を発芽させ、３Ｍ外科用テープで密封し、２３℃の１６ｈ明期／２１℃の８ｈ暗期の光周期を用いてインキュベータ内で成長させた。
ｃ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）及びアルファルファ（Ａｌｆａｌｆａ）によるＤｙＬ８００標識グレープフルーツ、レモン及びＡｔ ＰＭＰの取込み
インプランタでＰＭＰが取り込まれ、体系的に輸送され得るか否かを決定するために、メッシュフィルタの上部に、実施例１５ｂに記載の通りにシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）苗を液体培地に発芽させて、根がメッシュを通って成長するようにし、ＰＭＰ溶液に対するＡｔ苗の部分的な曝露を可能にする。アルファルファスプラウトは現地のスーパーマーケットから取得した。９日齢のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）苗及びアルファルファスプラウトを、０．５×ＭＳ培地中の水（陰性対照）、ＤｙＬ８００色素単独（色素対照）、ＤｙＬ８００標識グレープフルーツＰＭＰ（１．６×１０１０ＰＭＰ／ｍｌ）又はレモン（５．１×１０１０ＰＭＰ／ｍｌ）の０．５ｍｌ溶液で、部分的根曝露（ＰＭＰ溶液中に浮遊するメッシュ内の苗に又はアルファルファスプラウトでは１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内の部分的根曝露により）により、２３℃で、それぞれ２２若しくは２４時間処理した。次に、植物をＭＳ培地で３回洗浄してから、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｉｍａｇｅｒ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）で撮像した。
陰性（アルファルファスプラウト葉に幾分かの自家蛍光）及び色素単独対照と比較して、全てのＰＭＰ供給源が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）苗及びアルファルファスプラウトの両方で蛍光シグナルを示した（白色は高い蛍光シグナルであり、黒色はシグナルがない）（図７）。ＰＭＰ溶液に曝露しなかったシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）葉又はアルファルファ茎領域における蛍光シグナルの存在は、インプランタでのＰＭＰの活発な輸送を示している。ＤｙＬ８００処理濃度は、この実験では正規化しなかったため、供給源／標的取込み効率の差を評価することはできない。
本発明者らのデータは、様々な植物源由来のＰＭＰが、インプランタで取り込まれ、輸送され得ることを示している。
実施例１６：ＤＯＸロードグレープフルーツＰＭＰによるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）苗の処理
この実施例は、植物の適応度を低減させる目的でのＰＭＰへの小分子のロードを説明する。この実施例では、ドキソルビシンを小分子として使用し、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）をモデル植物として使用する。ドキソルビシンは、ストレプトマイセス・ペウセティウスｖａｒ．カエシウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ）の培養物から単離される細胞傷害性アントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンは、インターカレーションによりＤＮＡと相互作用し、ＤＮＡ複製及びＲＮＡ転写の両方を阻害する。ドキソルビシンは、植物において細胞傷害性であることが明らかにされている（Ｃｕｌｉａｒｅｚ−Ｍａｃ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，（５）：１５５−１６４，１９８７）。
除草剤の過剰使用による有毒な副作用から環境を保護しながら、雑草による重大な作物収量損失を防ぐために、有効且つ安全な除草剤が必要である。
ａ）ＳＥＣと組み合わせてＴＦＦを用いるグレープフルーツＰＭＰの生成
レッドオーガニックグレープフルーツは、現地のＷｈｏｌｅ Ｆｏｏｄｓ Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から取得した。果汁絞り機を用いて４リットルのグレープフルーツ果汁を収集し、ＮａＯＨでｐＨ４にｐＨ調節し、１Ｕ／ｍｌのペクチナーゼ（Ｓｉｇｍａ、１７３８９）と一緒にインキュベートして、ペクチン混入物を除去した後、３，０００ｇで２０分間、続いて１０，０００ｇで４０分間遠心分離することにより、大きい残屑を除去した。次に、カルシウムをキレート化し、ペクチン高分子の形成を防止するために、処理した果汁を５００ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）（最終濃度５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）まで）と一緒に３０分間インキュベートした。続いて、ＥＤＴＡ処理した果汁を１１μｍ、１μｍ及び０．４５μｍフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁を、３００ｋＤａのＴＦＦを用いるタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により洗浄及び濃縮した。果汁を５×濃縮した後、ＰＢＳを用いた６体積交換洗浄を実施し、最終濃度１９８ｍＬ（２０×）までさらに濾過した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、これを、２８０ｎｍでの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ ａｓｓａｙ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により分析して、ＰＭＰ含有画分と、混入物を含有する後期画分を確認した。ＳＥＣ画分３〜７は、精製ＰＭＰを含有しており（画分９〜１２は、混入物を含有していた）、これらを一緒にプールして、０．８μｍ、０．４５μｍ及び０．２２μｍシリンジフィルタを用いた連続濾過により濾過滅菌した後、ＰＭＰを４０，０００×ｇで１．５時間にわたってペレット化し、４ｍｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標）ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー蒸留水（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１０９７７０２３）にペレットを再懸濁させることにより、さらに濃縮した。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用い、ＮａｎｏＦＣＭにより、最終ＰＭＰ濃度（７．５６×１０１２ＰＭＰ／ｍｌ）及び平均ＰＭＰ粒径（７０．３ｎｍ＋／−１２．４ｎｍ（ＳＤ））を決定した。生成されたグレープフルーツＰＭＰを使用してドキソルビシンをロードした。
ｂ）グレープフルーツＰＭＰへのドキソルビシンのローディング
実施例１６ａで生成したグレープフルーツＰＭＰをドキソルビシン（ＤＯＸ）のローディングに使用した。ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ ＰＨＲ１７８９）のストック溶液を、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ水中１０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、濾過滅菌（０．２２μｍ）した。滅菌グレープフルーツＰＭＰ（粒子濃度７．５６×１０１２ＰＭＰ／ｍｌで３ｍＬ）を１．２９ｍＬのＤＯＸ溶液と混合した。混合物中の最終ＤＯＸ濃度は、３ｍｇ／ｍＬであった。４０℃まで昇温させながら、混合物を超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎ ２８００）で２０分間超音波処理した後、超音波のない浴中でさらに１５分維持した。暗所において混合物を２４℃、１００ｒｐｍで４時間攪拌した。次に、混合物を、Ａｖａｎｔｉ Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて押し出した。脂質二重層の数及び全体の粒径を低減するために、漸減方式：８００ｎｍ、４００ｎｍ及び２００ｎｍで、ＤＯＸロードＰＭＰを押し出した。押し出したサンプルを、ＴＣフード内で、０．８μｍ及び０．４５μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、直径１３ｍｍ）に順次通過させることにより、濾過滅菌した。非ロード又は結合の弱いＤＯＸを除去するために、超遠心分離アプローチを用いて、サンプルを精製した。具体的には、１．５ｍＬ超遠心機用チューブにおいて、１００，０００×ｇ、４℃で１時間スピンダウンした。上清をさらなる分析のために収集し、４℃で保存した。ペレットを滅菌水に再懸濁させ、同じ条件下で超遠心分離させた。このステップを４回繰り返した。最終ペレットを滅菌ＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に再懸濁させた後、次の使用まで４℃で保存した。
次に、粒子の濃度及びＰＭＰのロード能力を決定した。ＮａｎｏＦＣＭを用いて、サンプル中のＰＭＰの総数（４．７６×１０１２ＰＭＰ／ｍｌ）及びメジアン粒径（７２．８ｎｍ＋／−２１ｎｍ（ＳＤ））を決定した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計を用いた蛍光強度測定（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５５０ｎｍ）により、ＤＯＸ濃度を評価した。０〜５０μｇ／ｍＬの遊離ＤＯＸの較正曲線を滅菌水中で作製した。ＤＯＸロードＰＭＰ及びＤＯＸ複合体（π−πスタッキング）を解離するために、蛍光測定前に、サンプル及び標準を１％のＳＤＳと一緒に３７℃で４５分間インキュベートした。ロード能力（１０００粒子当たりのＤＯＸのｐｇ）は、ＤＯＸの濃度（ｐｇ／ｍｌ）をＰＭＰの総数（ＰＭＰ／ｍｌ）で割った商として計算した。ＰＭＰ−ＤＯＸロード能力は、１０００ＰＭＰにつき１．２ｐｇのＤＯＸであった。しかし、ロード効率（ＰＭＰの総数に対するＤＯＸロードＰＭＰの％）は、ＤＯＸ蛍光スペクトルをＮａｎｏＦＣＭで検出することができなかったため、評価できなかったことに留意すべきである。
ｃ）ドキソルビシンロードＰＭＰによるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）苗の処理
実施例１６ａ及び１６ｂに記載の通りに、グレープフルーツＰＭＰを生成し、ドキソルビシンをロードした。野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌ−０種子をＡＢＲＣから取得し、５０％漂白剤で表面滅菌してから、４℃で１〜３ｄかけて層別化した後、０．８％寒天を含み、０．５％ショ糖、２．５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．６を補充した１／２濃度（０．５×）ムラシゲスクーグ（ＭＳ）培地で、２３℃の１６ｈ明期／２１℃の８ｈ暗期の光周期を用い、発芽させた。
ＰＭＰが小分子カーゴをインプランタで送達することができるか否かを試験するために、７日齢のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）苗を２４ウェルプレート（１ウェル当たり１苗）内の０．５×液体ＭＳ培地に移してから、０（陰性対照）、２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭの封入ＤＯＸ用量の遊離ＤＯＸ又はＤＯＸロードＰＭＰで処理した。プレートをアルミホイルで被覆し、２４時間インキュベートした。ＤＯＸ含有培地を除去し、苗を１／２×ＭＳ培地で２回洗浄した後、新鮮な培地を添加した。苗を正常な光周期（１６ｈ明期２３℃／８ｈ暗期２１℃）下でさらに３日間インキュベートした。次に、苗をプレートから取り出し、イメージングのためにタオルで乾かした後、葉の活力、葉の色及び根の長さを分析することにより、細胞傷害性を評価した。細胞傷害性は、非処理苗対照と比較して、根の短縮、葉の活力喪失及び葉の退色（緑色ではなく黄色）により定義される。１００μＭ ＤＯＸでのみ細胞傷害性（根の短縮及び葉の退色）を示した遊離ＤＯＸと比較して、ＤＯＸをロードしたＰＭＰは、５０μＭ及び１００μＭ ＤＯＸで細胞傷害性であった。５０μＭ ＰＭＰ−ＤＯＸで処理した苗は、葉の活力低減及び根の短縮と共に、著しい葉の黄変を示した。本発明者らのデータは、ＰＭＰがインプランタで小分子をロードされ、且つ小分子を送達し得ること並びにドキソルビシンをロードしたＰＭＰが、遊離ドキソルビシンの２倍効率的に細胞傷害性応答を誘導することを示している。
実施例１７．アルファルファスプラウトによるペクチナーゼ処理ＰＭＰの取込み
この実施例では、ＰＭＰ生成プロセス中にペクチンの除去がそれらのインプランタ取込み及び全身性輸送に衝撃を及ぼさないことについて記載する。この実施例では、レモンＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用し、アルファルファスプラウトをモデル植物として使用した。
ａ）ペクチナーゼを添加する又は添加しないレモンＰＭＰの生成
レモンは、現地のＷｈｏｌｅ Ｆｏｏｄｓ Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から取得した。果汁絞り機を用いてレモン果汁（１２６０ｍｌ）を収集し、２つの画分に分割した。６３０ｍｌは非処理とし、６３０ｍｌはＮａＯＨを用いてｐＨ４にｐＨ調整し、室温で１．４５時間にわたり６Ｕ／ｍｌのペクチナーゼ（Ｓｉｇｍａ、１７３８９）と共にインキュベートした。ペクチナーゼ処理及び非処理の果汁を続いて３０００ｇで２０分間、続いて１０，０００ｇで４０分間遠心分離することにより、大きい残屑を除去した。次に、カルシウムをキレート化し、ペクチン高分子の形成を防止するために、処理した果汁を５００ｍＭのＤＴＡ（ｐＨ８．６）（最終濃度５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．１９〜７．２５）まで）と一緒に室温で３０分間インキュベートした。続いて、ＥＤＴＡ処理した果汁を１１ｕｍ、１ｕｍ及び０．４５ｕｍフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁を洗浄し（ＴＦＦ工程中２６０ｍｌのＰＢＳ）、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により総体積４００ｍｌまで約１．６×濃縮した後、３００ｋＤａ透析膜を用いてＰＢＳ中で一晩透析した。その後、透析した果汁をＴＦＦにより３０ｍｌの最終濃度（約２１×）までさらに濃縮した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、２８０ｎｍでの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）を分析して、混入物を含有する後期溶出画分からのＰＭＰ含有画分を決定する。精製ＰＭＰを含有するＳＥＣ画分４〜６（ペクチナーゼ処理なし）及びＳＥＣ画分４〜７（ペクチナーゼ処理あり）を個別処理群内に一緒にプールした。プールしたＳＥＣ画分は、３００ｋＤａ透析膜を用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で一晩透析した。サンプルは、０．８５ｕｍ、０．４ｕｍ及び０．２２ｕｍシリンジフィルタを用いた連続濾過により滅菌し、４０，０００×ｇで１．５時間にわたりＰＭＰをペレット化することによりさらに濃縮し、最後にペレットを超純水に再懸濁させる。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用いて、ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）によって決定されるように、非処理レモンＰＭＰのための最終ＰＭＰ濃度は、１．２４×１０１２ＰＭＰ／ｍｌであり、メジアンＰＭＰ粒径は１２９ｎｍ＋／−１２ｎｍ（ＳＤ）であった；ペクチナーゼ処理レモンＰＭＰについては、最終濃度は２．２６１０１２ＰＭＰ／ｍｌであり、メジアンＰＭＰ粒径は１３０ｎｍ＋／−１１ｎｍ（ＳＤ）であった。
ｂ）ＤｙＬｉｇｈｔ ８００ ＮＨＳ ＥｓｔｅｒによるレモンＰＭＰの標識
ペクチナーゼ処理及び非処理レモンＰＭＰは、ＤｙＬｉｇｈｔ ８００ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃４６４２１）共有結合膜色素（ＤｙＬ８００）を用いて標識した。手短には、ＤｙＬ８００を最終濃度１０ｍｇ／ｍｌまでＤＭＳＯに溶解させ、２００ｕｌのＰＭＰを５ｕｌの色素と混合し、室温において、シェーカ上で１時間インキュベートした後、４℃で１時間の１００，０００×ｇの超遠心分離により、標識ＰＭＰを２〜３回洗浄した後、ペレットを１．５ｍｌの超純水で再懸濁させた。潜在的な色素凝集体の存在を照査するために、ＰＭＰの代わりに２００ｕｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ水を添加して、同じ手順に従い、色素単独の対照サンプルを調製した。最終ＤｙＬ８００標識ＰＭＰペレット及びＤｙＬ８００色素単独対照を最小量のＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に再懸濁させ、ＮａｎｏＦＣＭにより特性決定した。非ペクチナーゼ処理Ｄｙｌ８００標識レモンＰＭＰの最終濃度は３．２×１０１２ＰＭＰ／ｍｌであり、ペクチナーゼ処理ＤｙＬ８００標識の最終濃度は、５．５７×１０１２ＰＭＰ／ｍｌであった。標識効率は、ＮａｎｏＦＣＭが赤外線を検出することができないため、ｎａｎｏＦＣＭを用いて決定することはできなかった。
ｃ）ペクチナーゼ処理及び非処理ＤｙＬ８００−ＰＭＰを用いたアルファルファスプラウトの処理
ＰＭＰ生成中のペクチンの除去がＰＭＰ取込みに影響を及ぼすかどうかを評価するために、アルファルファスプラウトは、１／２強度のムラシゲスクーグ（ＭＳ）中の０．５％のショ糖及び２．５ ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．６）を補給した現地のスーパーマーケットから取得し、ペクチナーゼ処理及び非処理ＤｙＬｉｇｈｔ８００レモンＰＭＰ、水（陰性対照）、ＤｙＬｉｇｈｔ８００ｎｍ色素単独（色素凝集物対照）を用いて２３℃で２１時間にわたり処理した（図８Ａ）。苗は、次にＭＳ培地中で３回洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｉｍａｇｅｒを用いて撮像した。ペクチナーゼ処理を行って若しくは行わずに生成したＰＭＰの取込み及び輸送に差は見られなかった（図８Ｂ）。
実施例１８：カチオン性脂質を用いたＰＭＰの改変
この実施例では、カチオン性脂質を用いたＰＭＰの改変による、表面電荷を修飾する、カーゴローディング能力を増加させ、且つ植物細胞中でのＰＭＰの細胞取込みを増加させる能力を証明する。この実施例では、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）及びＤＣ−コレステロール（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル］コレステロール）をモデルカチオン性脂質として、グレープフルーツ及びレモンＰＭＰをモデルＰＭＰとして、ｓｉＲＮＡ／トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ＴｒａｃｒＲＮＡ）をモデル負荷電ペイロードとして且つゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ブラック・メキシカン・スイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）をモデル植物細胞株として使用する。
実験プロトコル：
ａ）レモン／グレープフルーツＰＭＰの生成
レッドオーガニックグレープフルーツ若しくはイエローオーガニックレモンは、現地の食料品店から入手した。果汁絞り機を用いて６リットルのグレープフルーツ果汁を収集し、ＮａＯＨでｐＨ４にｐＨ調節し、１Ｕ／ｍｌのペクチナーゼ（Ｓｉｇｍａ、１７３８９）と一緒にインキュベートして、ペクチン混入物を除去した後、３，０００ｇで２０分間、続いて１０，０００ｇで４０分間遠心分離することにより、大きい残屑を除去した。次に、カルシウムをキレート化し、ペクチン高分子の形成を防止するために、処理した果汁を５００ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）（最終濃度５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）まで）と一緒に３０分間インキュベートした。続いて、ＥＤＴＡ処理した果汁を１１μｍ、１μｍ及び０．４５μｍのフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁を、３００ｋＤａのＴＦＦを用いるタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により洗浄及び濃縮した。果汁を１０×濃縮した後、ＰＢＳ中の１０ダイアボリュームへの透析濾過を実施し、最終濃度１２０ｍＬ（５０×）までさらに濃縮した。次に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、これを、２８０での吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）により分析して、ＰＭＰ含有画分と混入物を含有する後期画分を確認した。ＳＥＣ画分３〜７は、精製ＰＭＰを含有しており（画分９〜１２は、混入物を含有した）、これらを一緒にプールして、０．８μｍ、０．４５μｍ及び０．２２μｍシリンジフィルタを用いた連続濾過により濾過滅菌した後、ＰＭＰを４０，０００×ｇで１．５時間にわたってペレット化し、４ｍＬのＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標）ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー蒸留水（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１０９７７０２３）にペレットを再懸濁させることにより、さらに濃縮した。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用い、ＮａｎｏＦＣＭにより、最終ＰＭＰ濃度（７．５６×１０１２ＰＭＰ／ｍＬ）及びＰＭＰ粒径（７０．３ｎｍ＋／−１２．４ｎｍ（ＳＤ））を決定した。生成したグレープフルーツ（ＧＦ）又はレモン（ＬＭ）ＰＭＰは、以下に記載するように、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法を用いる脂質抽出のために使用した。
ｂ）カチオン性脂質を用いたＰＭＰの改変
脂質再構成ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）を調製するために、グレープフルーツ又はレモンＰＭＰの濃縮液からの全脂質抽出は、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法を用いて実施した（Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ，３７：９１１−９１７，１９５９）。手短には、１ｍＬの濃縮ＰＭＰ（１０１２〜１０１３ＰＭＰ／ｍＬ）を３．５ｍＬのクロロホルム：メタノール混合物（１：２、ｖ／ｖ）と混合し、しっかりとボルテックスした。次に、１．２５ｍＬのクロロホルムを加え、ボルテックスし、次に１．２５ｍＬの滅菌水と共に撹拌した。最後に、混合物を３００ｇにおいて５分間室温で遠心分離した。脂質を含有する下方有機層を回収し、ＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）システム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標））を用いて完全に乾燥させた。天然ＬＰＭＰの脂質組成を改変するために、合成カチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−コレステロール）をクロロホルム：メタノール（９：１）中に溶解させ、全脂質の２５％又は４０％（ｗ／ｗ）の量までＰＭＰ抽出脂質を添加し、その後に強力に混合した。乾燥脂質薄膜は、不活性気体流（例えば、窒素）を用いた溶媒の蒸発又はＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）システムを用いた蒸発によって調製した（図１１）。抽出脂質からの再構成ＰＭＰを調製するために、水若しくはバッファー（例えば、ＰＢＳ）を乾燥脂質薄膜に添加し、水和させるために室温で１時間放置した。形成された脂質粒子に１０回の冷凍−解凍サイクル若しくは超音波処理を受けさせた（Ｂｒａｎｓｏｎ ２８００超音波浴、１０分間、室温）。次に、脂質二重層の数及び全体的な粒径を低減させるために、脂質ＰＭＰは、Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ（登録商標）Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて０．８μｍ、０．４μｍ及び０．２μｍのポリカーボネートフィルタに通して押し出した（図１１）。濃縮ＬＰＭＰが必要とされる場合、サンプルは、４℃で３０分間にわたり１００，０００×ｇでの超遠心分離によって濃縮した。最終ペレットを滅菌ＵｌｔｒａＰｕｒｅ水又はＰＢＳに再懸濁させた後、次の使用まで４℃で保存した。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用い、ＮａｎｏＦＣＭにより、最終ＬＰＭＰ濃度及びメジアンＬＰＭＰ粒径（８９〜１０４ｎｍ）を決定した。表面電荷（ゼータ電位）は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を用いて動的光散乱法によって測定した。ＬＰＭＰ粒径及び濃度の範囲は、ＬＭ ＬＰＭＰについては８３±１９ｎｍ及び１．７×１０１２ＬＰＭＰ／ｍＬ、ＤＯＴＡＰ改変ＬＰＭＰについては１０６±２５ｎｍ及び６．５４×１０１０ＬＰＭＰ／ｍＬ並びにＤＣ−コレステロール改変ＰＭＰについては９１±１７ｎｍ及び３．０８×１０１１ＬＰＭＰ／ｍＬであった（図１２）。脂質再構成ＰＭＰのカチオン性脂質ＤＯＴＡＰ及びＤＣコレステロールを用いた改変は、ＬＰＭＰの表面電荷を変化させた：カチオン性脂質含量が増加するにつれて、ＬＰＭＰの表面電荷が増加した（図１３Ａ）。抽出レモン脂質から再構成したＬＰＭＰのＣｒｙｏ−ＥＭ画像の分析は、ＬＰＭＰの球形度及び粒径分布（６８．７±２３ｎｍ（ＳＤ））を確証した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。
ｃ）カチオン性脂質改変ＰＭＰへの負荷電カーゴによるローディング
ｓｉＲＮＡ／ＴｒａｃｒＲＮＡにロードするために、上述したように、ＧＦ若しくはＬＭ抽出脂質にカチオン性脂質を補給して乾燥させた。ヌクレアーゼ非含有水若しくはＤｕｐｌｅｘバッファー（ＩＤＴ（登録商標））中に溶解させたｓｉＲＮＡ／ＴｒａｃｒＲＮＡをＰＭＰ脂質１ｍｇ当たり１．５ｎｍｏｌで乾燥脂質薄膜に加え、水和させるために室温で１時間放置した。形成された脂質粒子に１０回の冷凍−解凍サイクルを受けさせ、Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ（登録商標）Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて０．８μｍ、０．４μｍ及び０．２μｍのポリカーボネートフィルタに通して押し出した（図１１）。ロードＰＭＰは、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を備える透析装置（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標））においてＰＢＳに対して一晩透析し、次に０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルタを用いて滅菌した。さらに、サンプルを精製し、超遠心分離を用いて濃縮した。ロードＰＭＰは、４℃で３０分間、１００，０００×ｇで遠心分離し、上清を除去し、ペレットは、１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、３０分間にわたり１００，０００×ｇで濃縮した。生じたペレットは（植物細胞による細胞取込みのために）水中に再懸濁させた。ＲＮＡロードＬＰＭＰの粒径及び粒子の数は、ＮａｎｏＦＣＭによって評価した：平均粒径及び粒子濃度は、未改変ＬＰＭＰについては８９±１５ｎｍ及び１．５４×１０１２ＬＰＭＰ／ｍＬ、ＤＣ−Ｃｈｏｌについては１０４±２５ｎｍ及び２．５４×１０１１ＬＰＭＰ／ｍＬ並びにＤＯＴＡＰについては１００±３０ｎｍ及び９．７×１０１１ＬＰＭＰ／ｍＬであった。ＲＮＡローディングは、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイ又は標識カーゴの蛍光強度（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５を用いて標識したｓｉＲＮＡ又はＡＴＴＯ ５５０を用いて標識したＴｒａｃｒＲＮＡ）の測定によって決定した。非改変ＬＰＭＰの形態及び粒径は、さらにＣｒｙｏｇｅｎｉｃ電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ−ＥＭ）によって分析した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイは、ＰＭＰを溶解させて封入されたカーゴを遊離させるためにヘパリン（５ｍｇ／ｍＬ）及び１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在下で製造者のプロトコルに従って実施した。カチオン性脂質ＤＯＴＡＰ及びＤＣ−コレステロールを用いたＬＰＭＰの改変は、カチオン性脂質を含まないＬＰＭＰと比較して、ＬＰＭＰの表面電荷を変化させ、負荷電カーゴ（例えば、ＲＮＡ）のローディングを増加させた（図４Ａ〜４Ｄ）。
ｄ）ＤＣ−コレステロール改変ＰＭＰによる植物細胞へのＲＮＡの送達の増加
ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ブラック・メキシカン・スイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）細胞をシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）生物学資源センター（ＡＢＲＣ）から購入した。ＢＭＳ細胞は、４．３ｇ／Ｌのムラシゲスクーグ塩基塩混合物（Ｓｉｇｍａ Ｍ５５２４）、２％ショ糖（Ｓ０３８９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（Ｄ７２９９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、２５０μｇ／ＬのチアミンＨＣＬ（Ｖ−０１４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）及びｄｄＨ２Ｏ中の１×ＭＳビタミン溶液を含有するムラシゲスクーグ塩基培地（ｐＨ５．８）中で増殖させた。この１×ビタミン混合溶液は、１．３ｍｇ／Ｌ、２５０μｇ／Ｌ、２５０μｇ／Ｌ、１３０ｍｇ／Ｌ及び２００ｍｇ／Ｌの各最終濃度でナイアシン（Ｎ０７６１−１００Ｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、塩酸ピロキシジン（Ｐ６２８０−２５Ｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム塩（Ｐ５１５５−１００Ｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、Ｌ−アスパラギン（Ａ４１５９−２５Ｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）及びミオ−イノシトール（Ｉ７５０８−１００Ｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を含有していた。細胞は、撹拌（１１０ｒｐｍ）しながら２４℃の暗状態で、１Ｌのベント付き円錐形滅菌フラスコ内で増殖させた。
ＢＭＳ細胞処理のために、１０ｍＬの細胞懸濁液を採取し、％パック細胞容積（ＰＣＶ）を決定した。ＰＣＶは、細胞の容積を細胞培養物アリコートの総容積で割った商として定義され、パーセンテージとして表示される。細胞を３９００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットの容積を決定した。ＢＭＳの％ＰＣＶは、２０％であった。取込み実験のために、上述したように、細胞をその培地で希釈することにより、培養物の％ＰＣＶを４％に調節した。ＬＰＭＰ及びＤＣ−コレステロールにより改変したＬＰＭＰには、上述したようにＡＴＴＯ ５５０により標識したＴｒａｃｒＲＮＡをロードし、滅菌し、滅菌水中に再懸濁させた。粒子の平均粒径及び濃度は、ＮａｎｏＦＣＭによって分析したが、ＤＣ−Ｃｈｏｌについては１０４±２５ｎｍ及び２．５４×１０１１ＬＰＭＰ／ｍＬであり、未改変ＬＰＭＰについては８９±１５ｎｍ及び１．５４×１０１２ＬＰＭＰ／ｍＬであった。サンプル中のＴｒａｃｒＲＮＡ ＡＴＴＯ ５５０（ＩＤＴ）の量は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）によって定量した。２４ウェルプレート内の４５０μＬの植物細胞懸濁液のアリコートに５０μＬのＬＰＭＰ及び４３３ｎｇのＴｒａｃｒＲＮＡを含有するＤＣ−コレステロールで改変したＬＰＭＰの両方を重複して添加した。細胞に５０μｌの超純粋滅菌水を加えて、陰性対照として使用した。細胞は２４℃の暗所で３時間にわたりインキュベートし、１ｍＬの超純粋滅菌水を用いて３回洗浄して細胞によって取り込まれなかった粒子を除去した。細胞は、落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８３）上でのイメージングのために５００μＬの超純粋滅菌水中に再懸濁させた。検出可能な蛍光がなかった陰性対照（超純粋滅菌水）と比較して、ＬＰＭＰ及びＤＣ−コレステロールにより改変したＬＰＭＰにより処理した植物細胞中において可変蛍光シグナルを検出することができた（図１５）。ＤＣ−コレステロールを用いて改変したＬＰＭＰは、最も強い蛍光シグナルを提示し、これはこのＰＭＰ改変が植物細胞へのＴｒａｃｒＲＮＡの最も強い送達を有することを示していた。本発明者らのデータは、カチオン性脂質ＤＣ−コレステロールによるＰＭＰの改変が植物細胞によるインビトロでのレモンＬＰＭＰの取込みを向上させたことを示している。
実施例１９：ＰＭＰ媒介性ｇＲＮＡ送達による植物の改変
この実施例では、遺伝子発現に影響を及ぼすための植物体における短鎖核酸のローディング及び機能的送達について記載する。この実施例は、短鎖核酸ロードＰＭＰが安定しており、且つ植物内でのそれらの活性を保持することをさらに実証する。この実施例では、トランスジェニックｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）をモデル植物として使用し、グレープフルーツＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用し、且つＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＷＡＧＥＮＩＮＧＥＮ（ＦＷＡ）に対するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をモデル短鎖核酸（およそ３５ｋＤａ）として使用する。
ａ）インタクトな植物による脂質再構成ＰＭＰの取込み
本発明者らは以前に、レモン及びグレープフルーツからの天然ＰＭＰは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）を含む、インタクトな植物の根によって取り込まれ得ることを実証した（実施例１５）。この実施例では、本発明者らは、脂質再構成ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）が同様にシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の根によって取り込まれ得ることを実証する。脂質は、実施例１８に記載されたように、天然レモン（ＬＭ）及びグレープフルーツ（ＧＦ）ＰＭＰから抽出して再構成した。こうして入手したＬＰＭＰは、近赤外線蛍光親油性色素１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物（ＤｉＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて標識した。３μＬのＤｉＲストック溶液（５ｍｇ／ｍＬ）は、グレープフルーツ及びレモンから抽出した１ｍｇのＰＭＰ脂質に添加されたことに留意されたい。乾燥脂質薄膜は、実施例１８に記載されたように調製し、その後に超音波処理し（１０分間、室温、Ｂｒａｎｓｏｎ ２８００超音波浴）、Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて０．８μｍ、０．４μｍ及び０．２μｍのポリカーボネートフィルタに通して押し出した。非結合色素は水を用いて平衡化させたＺｅｂａ（商標）回転式脱塩カラム（４０ｋＤａのＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて除去した。ＤｉＲ標識ＰＭＰは、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−０．５遠心分離用フィルタ装置（分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）１００ｋＤａ）上で濃縮した。
ＤｉＲ標識ＬＰＭＰの洗浄及び滅菌濾過調製物は１：５で液体１／２のＭＳ培地（２．１５ｇ／Ｌのムラシゲスクーグ塩基塩混合物（Ｓｉｇｍａ）、１０ｇ／Ｌのショ糖、０．５ｇ／ＬのＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、ＫＯＨで調整（ｐＨ５．８））により希釈し、１００μＬを無菌１．５ｍＬエッペンドルフチューブ内に等分した。２週齢のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の苗（Ｃｏｌ−０野生型）は、無菌鉗子を使用して準備したエッペンドルフチューブ内に移した。根の３番目の底部のみが浸漬されることに注意を払った。各処理（非処理対照、ＤｉＲ対照、ＬＭ−ＬＰＭＰ−ＤｉＲ、ＧＦ−ＬＰＭＰ−ＤｉＲ）に対して、個別チューブにおいて５本の苗を使用した。チューブを密封し、アルミニウムホイルで被覆し、４８時間にわたり植物成長インキュベータ内に置いた。次に苗は１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含有する水で２回及び水単独で１回洗浄した。苗をタオル乾燥した後、７５０ｎｍ（ＤｉＲ色素の波長）でイメージングするためにｉＢｒｉｇｈｔ １５００ イメージングシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上に配置した。対照と比較したＬＭ−ＬＰＭＰ−ＤｉＲ及びＧＦ−ＬＰＭＰ−ＤｉＲにより処理した植物における増強蛍光シグナルが観察されたが（図９Ａ及び９Ｂ）、これは植物によるＬＰＭＰの取込みを示していた。
ｂ）ｇＲＮＡによるＰＭＰの改変及びローディング
この実施例において使用したＰＭＰの改変及びローディングは、実施例１８に記載した。天然レモンＰＭＰは脂質源として使用し、２種の製剤：（１）未改変ＬＰＭＰ及び（２）ＤＣ−コレステロールが添加されたＬＰＭＰ（ＤＣ−Ｃｈｏｌ−ＬＰＭＰ）を使用した。この実施例で使用したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から入手した。機能的ｇＲＮＡ二重螺旋を形成するために、製造者の指示に従ってシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＷＡＧＥＮＩＮＧＥＮ（ＦＷＡ）（Ａｔ４ｇ２５５３０）をターゲティングするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡ ＸＴ（２３ｂｐ）配列を製造者の指示に従って汎用Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡ（６７ｂｐ）にアニーリングした。２種のｃｒＲＮＡ配列：ＦＷＡ−ｇ４ ５’−ＡＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＴＡＴＧＧＧＣＴＴ−３’（配列番号５３）及びＦＷＡ−ｇ１７ ５’−ＡＡＡＡＣＴＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＧＧＡ−３’（Ｐａｐｉｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，１０：Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ７２９，２０１９）（配列番号５４）を使用した。ｇＲＮＡ二重螺旋４及び１７（配列番号５３及び５４）は、実施例１８に記載されたように、等モル量で混合し、ＬＰＭＰ内にローディングした。ロードＬＰＭＰ調製物は、滅菌し（０．２ｕｍの滅菌フィルタ）、超遠心分離アプローチを用いて洗浄し（１００，０００ｇ、３０分間、４°Ｃ））、且つ超遠心分離後に１５０μＬの滅菌水中に再懸濁させた。粒子の濃度及びメジアン粒径は、実施例１８に記載されたように、ＮａｎｏＦＣＭを用いて評価し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）ＲＮＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＲＮＡローディングを定量した（表２）。
Figure 2021533180
ｃ）ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）におけるＦＷＡをターゲティングするｇＲＮＡがロードされたレモンＰＭＰの機能的送達
この実施例のために、本発明者らは、トランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）におけるｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４系を利用した（Ｐａｐｉｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，１０：Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ７２９，２０１９）。２つのモジュールからなるこの系では、ＶＰ６４の複数のコピーが一本鎖ｄＣａｓ９タンパク質と結合するのを可能にするために、非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９）をＧＣＮ４ペプチドリピートに融合させ、転写活性化因子ＶＰ６４を一本鎖可変断片ＧＣＮ４抗体に融合させる。目的の遺伝子のプロモータ配列に対応するｇＲＮＡ（この場合にはＦＷＡ）を供給することにより、このｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４（今後はＳｕｎＴａｇと呼ぶ）系は、遺伝子発現を活性化するための「ホーミング装置」として使用することができる。ＳｕｎＴａｇシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）植物のトランスジェニック種子（Ｐａｐｉｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，１０：Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ７２９，２０１９）は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）生物学資源センター（ＡＢＲＣ）から入手した。種子は、次のように滅菌した：７０％エタノールで１分間、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を用いた５０％家庭用漂白剤で１０分間、滅菌脱イオン水で３回洗浄した。滅菌種子は、無菌０．１％アガロース中に再懸濁させ、暗所で３日間にわたり４℃で層別化した。次に種子は、分離しているＴ２集団間でＳｕｎＴａｇ陽性苗を選択するために、３５ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢ（ＧｏｌｄＢｉｏ）が補給された、１／２ＭＳプレート（ムラシゲスクーグ塩基塩混合物（Ｓｉｇｍａ）２．１５ｇ／Ｌ、ショ糖１０ｇ／Ｌ、ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ）０．５ｇ／Ｌ、ｐｈｙｔｏａｇａｒ（Ｄｕｃｈｅｆａ）５ｇ／Ｌ、ＫＯＨで調整したｐＨ５．８）上に配置した。プレートは医療テープ（３Ｍ）で密封し、発芽を刺激するために６時間にわたり光線を用いて植物成長インキュベータ内に置いた。プレートは次にアルミニウムホイルで４８時間にわたり被覆し、被覆を外し、苗は通常の成長条件（１６時間明期、２３℃／２１℃の昼／夜）下で３日間成長させた。ハイグロマイシンＢ耐性の苗は、典型的な暗黄化表現型を示した（非耐性苗と比較して伸長した胚軸；非耐性苗は枯れた）。この選択プロトコルは、以前にＨａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ １９，２００６によって記載された。
耐性苗（１処理当たり８本、プールされた）は、滅菌鉗子を用いてプレートから採取し、１９〜２７μｇのｇＲＮＡ及び０．６μｇのｇＲＮＡを含有する未改変ＬＰＭＰを含有するカチオン性若しくはイオン化性脂質を用いて改変された２００μＬの液体１／２ＭＳ培地及び５０μＬのＬＰＭＰを含有する無菌の２ｍＬエッペンドルフチューブ内に入れた。処理は、（１）ＬＰＭＰ−ｇＲＮＡ、（２）ＤＣ−Ｃｈｏｌ−ＬＰＭＰ−ｇＲＮＡ、（３）ＤＣ−Ｃｈｏｌ−ＬＰＭＰ−ｔｒａｃｒＲＮＡ及び（４）ｇＲＮＡ単独（２７μｇ）であった。培地中に根を浸漬させ、子葉を表面上に浮遊したままにするために注意を払った。１処理当たり、８本の苗を使用した。密封したチューブは、ＰＭＰが、植物を通して移動するために植物の根によって取り上げられる時間を許容するため且つそれらのｇＲＮＡカーゴを植物細胞内に送達するため、ｇＲＮＡがｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４複合体内に組み込まれて、苗内では発現されないＦＷＡ遺伝子の発現を活性化させるために、植物成長インキュベータ内に２４又は４８時間にわたり置いた（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，４：ｅ１００００４８，２００８）。規定のインキュベーション時間後、苗をＰＭＰ含有溶液から取り出し、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で１回すすぎ洗い、タオル乾燥し、液体窒素中で冷凍した。
ＦＷＡ遺伝子発現の活性化を決定するために、逆転写定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を用いてｍＲＮＡ転写レベルをアッセイした。冷凍した苗は、プラスチック製乳棒を用いてチューブ内で粉砕し、全ＲＮＡは、製造者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。精製ＲＮＡは、４０μＬのＲＮａｓｅフリー水（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてカラムから溶出した。ゲノムＤＮＡは、製造者の指示に従い、ＤＮａｓｅ Ｉ、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＲＮＡ調製物から取り出した。ｃＤＮＡ合成は、製造者の指示に従い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及びＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いて実施した。ＦＷＡ遺伝子（Ａｔ４ｇ２５５３０）の発現を検出するために、定量的ＰＣＲは、製造者の指示に従い、Ｌｕｎａ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で実施した。ｑＰＣＲ実験のために使用したプライマーは、以前に公表された（Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３０：２５９４−２６１５，２０１８；Ｐａｐｉｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，１０：Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ７２９，２０１９）：ＦＷＡ＿Ｆ ５’−ＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＡＴＣＡＡＡＧ−３’（配列番号５５）、ＦＷＡ＿Ｒ ５’− ＣＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＧＧＡＧＡ−３’（配列番号５６）、ＩＰＰ２＿Ｆ ５’− ＧＴＡＴＧＡＧＴＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＧ−３’（配列番号５７）、ＩＰＰ２＿Ｒ ５’− ＧＡＧＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＧＴＧＴ−３’（配列番号５８）、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ＿Ｆ ５’− ＣＣＴＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＧＧＣＴＴＣＴ−３’（配列番号５９）、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ＿Ｒ ５’− ＧＡＡＧＴＣＧＴＧＡＧＡＣＡＧＣＧＴＴＧ−３’（配列番号６０）。ｑＰＣＲは、次のプログラム：（ａ）９５℃で６０秒間；（ｂ）９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間の４０反復を用いて実施した。結果を正規化するためには、ユビキチン遺伝子（Ａｔ２ｇ３６０６０）を使用した。内部対照としては、ＡＴＩＳＯＰＥＮＴＥＮＹＬ ＤＩＰＨＯＳＰＨＥ ＩＳＯＭＥＲＡＳＥ ２（ＩＰＰ２）（Ａｔ３ｇ０２７８０）を使用した。様々な処理におけるＦＷＡ遺伝子発現の活性化は、正規化ΔΔＣｔ値を計算することによって決定した（図１０Ａ〜１０Ｃ）。等モル量のｇＲＮＡ ４及び１７がロードされたＤＣ−コレステロール改変ＬＰＭＰに４８時間曝露させた植物は、ｇＲＮＡ対照と比較してＦＷＡ遺伝子の発現における３倍増加を示した（図１０Ｂ）。ｔｒａｃｒＲＮＡ対照を含むＤＣ−Ｃｈｏｌ ＬＰＭＰは、ＦＷＡ発現を誘導しなかった（図１０Ａ及び１０Ｂ）。ＤＣ−ＣｈｏｌとｔｒａｃｒＲＮＡ対照との間で、ＩＰＰ２（ハウスキーピング遺伝子）の発現における有意差は見られなかった（図１０Ｃ）。
他の実施形態
本発明の一部の実施形態は、以下の番号のパラグラフに含まれる。
１．複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物であって、ＰＭＰは、植物改変剤を含む、植物改変組成物。
２．組成物中のＰＭＰは、植物の形質を改変するために有効な濃度であり、改変は、植物の適応度を増加させる、パラグラフ１に記載の植物改変組成物。
３．複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物であって、ＰＭＰは、植物改変剤を含み、及び組成物中のＰＭＰは、植物の形質を改変するために有効な濃度であり、改変は、植物の適応度を増加させる、植物改変組成物。
４．適応度の増加は、発生、増殖、収量、非生物的ストレッサーに対する耐性又は生物的ストレッサーに対する耐性の増加である、パラグラフ２又は３に記載の植物改変組成物。
５．植物の適応度の増加は、疾患耐性、干ばつ耐性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、金属耐性、除草剤耐性、薬剤耐性、水利用効率、窒素利用、窒素ストレス耐性、窒素固定、病虫害抵抗性、草食動物耐性、病原体耐性、収量、水不足条件下の収量、活力、増殖、光合成能力、栄養、タンパク質含量、炭水化物含量、油含量、バイオマス、新芽長、根長、根の構造、種子重又は収穫可能な産物の量における増加である、パラグラフ２又は３に記載の植物改変組成物。
６．植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の品質の向上である、パラグラフ２又は３に記載の植物改変組成物。
７．植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の味、外観又は貯蔵期間の改善である、パラグラフ６に記載の植物改変組成物。
８．適応度の増加は、動物における免疫反応を刺激するアレルゲンの産生の低減である、パラグラフ２又は３に記載の植物改変組成物。
９．植物改変剤は、異種核酸である、パラグラフ１〜８のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
１０．複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物であって、ＰＭＰは、異種核酸を含み、及び組成物中のＰＭＰは、植物の適応度を増加させるための有効な濃度である、植物改変組成物。
１１．異種核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ分子である、パラグラフ９又は１０に記載の植物改変組成物。
１２．ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は阻害性ＲＮＡである、パラグラフ１１に記載の植物改変組成物。
１３．阻害性ＲＮＡは、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、パラグラフ１２に記載の植物改変組成物。
１４．阻害性ＲＮＡは、植物における遺伝子の発現を阻害する、パラグラフ１２又は１３に記載の植物改変組成物。
１５．核酸は、植物中において、酵素、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質、リボタンパク質、タンパク質アプタマー若しくはシャペロンの発現を増加させるｍＲＮＡ、改変ｍＲＮＡ又はＤＮＡ分子である、パラグラフ９又は１０に記載の植物改変組成物。
１６．核酸は、植物中において、酵素、転写因子、分泌タンパク質、構造因子、リボタンパク質、タンパク質アプタマー、シャペロン、受容体、シグナル伝達リガンド若しくは輸送因子の発現を低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノ、ＬＮＡ、ｐｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、アプタマー、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｇＲＮＡ又はＤＮＡ分子である、パラグラフ９又は１０に記載の植物改変組成物。
１７．異種核酸は、植物中において核酸を発現する非統合構築物である、パラグラフ９又は１０に記載の植物改変組成物。
１８．異種核酸は、植物中において核酸を発現する統合構築物である、パラグラフ９又は１０に記載の植物改変組成物。
１９．植物改変剤は、異種ペプチドである、パラグラフ１〜８のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
２０．複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物であって、ＰＭＰは、異種ペプチドを含み、及び組成物中のＰＭＰは、植物の適応度を増加させるために有効な濃度である、植物改変組成物。
２１．ペプチドは、酵素、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンである、パラグラフ１９又は２０に記載の植物改変組成物。
２２．ペプチドは、植物における遺伝子の発現を低減する、パラグラフ１９又は２０に記載の植物改変組成物。
２３．ペプチドは、植物における遺伝子の発現を増加させる、パラグラフ１９又は２０に記載の植物改変組成物。
２４．ＰＭＰは、２種以上の様々な植物改変剤を含む、パラグラフ１〜２３のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
２５．２種以上の様々な植物改変剤は、異種核酸及び異種ペプチドを含む、パラグラフ２４に記載の植物改変組成物。
２６．植物改変剤は、ＰＭＰによって封入される、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
２７．植物改変剤は、ＰＭＰの表面上に埋め込まれる、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
２８．植物改変剤は、ＰＭＰの表面に共役される、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
２９．植物改変剤は、非殺虫性である、パラグラフ１〜２８のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
３０．組成物は、室温で少なくとも１日間安定しており、且つ／又は４℃で少なくとも１週間安定している、パラグラフ１〜２９のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
３１．ＰＭＰは、少なくとも２４時間、４８時間、７日間又は３０日間安定している、パラグラフ１〜２９のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
３２．ＰＭＰは、少なくとも４℃、２０℃、２４℃又は３７℃の温度で安定している、パラグラフ３１に記載の植物改変組成物。
３３．組成物中のＰＭＰは、少なくとも１、１０、５０、１００又は２５０μｇ／ｍｌのＰＭＰタンパク質の濃度である、パラグラフ１〜３２のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
３４．ＰＭＰは、精製された植物細胞外小胞（ＥＶ）又はその断片若しくは抽出物を含む、パラグラフ１〜３３のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
３５．植物ＥＶは、改変植物細胞外小胞（ＥＶ）である、パラグラフ３４に記載の植物改変組成物。
３６．植物は、農業用植物又は園芸用植物である、パラグラフ１〜３５のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
３７．農業用植物は、ダイズ植物、コムギ植物又はトウモロコシ植物である、パラグラフ３６に記載の植物改変組成物。
３８．組成物は、植物に送達するために製剤化される、パラグラフ１〜３７のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
３９．組成物は、植物の葉、種子、根、果実、新芽又は花に送達するために製剤化される、パラグラフ３８に記載の植物改変組成物。
４０．組成物は、農業上許容される担体を含む、パラグラフ１〜３９のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
４１．ＰＭＰを安定化するために製剤化される、パラグラフ１〜４０のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
４２．液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体組成物として製剤化される、パラグラフ１〜４１のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
４３．複数のＰＭＰを含む有害生物防除組成物であって、ＰＭＰは、（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップ；（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプル中のレベルに対して低減されたレベルの、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分を有する、ステップ；（ｃ）粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分中のレベルに対して低減されたレベルの、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分を有する、ステップ；（ｄ）複数の純粋なＰＭＰに植物改変組成剤をロードするステップ；及び（ｅ）植物への送達のためにステップ（ｄ）のＰＭＰを製剤化するステップを含むプロセスによって生成される、植物改変組成物。
４４．パラグラフ１〜４３のいずれか１つに記載の植物改変組成物を含む植物。
４５．植物改変組成物を植物に送達する方法であって、植物を、パラグラフ１〜４３のいずれか１つに記載の組成物と接触させるステップを含む方法。
４６．植物の適応度を増加させるための方法であって、植物に、有効量の、パラグラフ１〜４３のいずれか１つに記載の植物改変組成物を送達するステップを含み、非処理植物と比較して植物の適応度を増加させる方法。
４７．植物改変組成物は、葉、種子、根、果実、新芽、花又はそれらの部分に送達される、パラグラフ４５又は４６の記載の方法。
４８．植物の適応度を増加させる方法であって、植物に、有効量の、パラグラフ１〜４３のいずれか１つに記載の植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物と比較して植物の適応度を増加させる方法。
４９．植物の適応度を増加させるための方法であって、植物の分裂組織に、有効量の、パラグラフ１〜４３のいずれか１つに記載の植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物と比較して植物の適応度を増加させる方法。
５０．植物の適応度を増加させるための方法であって、植物の胚に、有効量の、パラグラフ１〜４３のいずれか１つに記載の植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物と比較して植物の適応度を増加させる方法。
５１．植物の適応度を増加させる方法であって、植物のプロトプラストに、有効量の、パラグラフ１〜４３のいずれか１つに記載の植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物と比較して植物の適応度を増加させる方法。
５２．植物の適応度を増加させる方法であって、植物の植物細胞に、有効量の、パラグラフ１〜４３のいずれか１つに記載の植物改変組成物を接触させるステップを含み、非処理植物と比較して植物の適応度を増加させる方法。
５３．適応度の増加は、発生、増殖、収量、非生物的ストレッサーに対する耐性又は生物的ストレッサーに対する耐性の増加である、パラグラフ４６〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．植物の適応度の増加は、疾患耐性、干ばつ耐性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、金属耐性、除草剤耐性、薬剤耐性、水利用効率、窒素利用、窒素ストレス耐性、窒素固定、病虫害抵抗性、草食動物耐性、病原体抵抗性、収量、水不足条件下の収量、活力、増殖、光合成能力、栄養、タンパク質含量、炭水化物含量、油含量、バイオマス、新芽長、根長、根の構造、種子重又は収穫可能な産物の量における増加である、パラグラフ４６〜５２に記載の方法。
５５．植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の品質の向上である、パラグラフ４６〜５２に記載の方法。
５６．品質の向上は、植物から収穫される産物の味、外観又は貯蔵期間の改善である、パラグラフ５５に記載の方法。
５７．適応度の増加は、動物における免疫反応を刺激するアレルゲンの産生の低減である、パラグラフ４６〜５２に記載の方法。
５８．植物は、農業用植物又は園芸用植物である、パラグラフ４５〜５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．植物は、ダイズ植物、コムギ植物又はトウモロコシ植物である、パラグラフ５８に記載の方法。
６０．植物改変組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として送達される、パラグラフ４５〜５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．ＰＭＰは、脂質再構成ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）である、パラグラフ１〜４３のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
６２．ＬＰＭＰは、外来性カチオン性脂質を含む、パラグラフ６１に記載の植物改変組成物。
６３．改変ＰＭＰの各々は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超のカチオン性脂質を含む、パラグラフ６１又は６２に記載の植物改変組成物。
６４．カチオン性脂質は、ＤＣ−コレステロール又はＤＯＴＡＰである、パラグラフ６１〜６３のいずれか１つに記載の植物改変組成物。
６５．植物に異種ＲＮＡを投与する方法であって、複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む組成物を植物に送達するステップを含み、複数の各々は、異種ＲＮＡを含み、組成物は、植物の適応度を増加させるための有効な濃度で送達される、方法。
６６．異種ＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、パラグラフ６５に記載の方法。
６７．ｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の成分であり、複数のＰＭＰの各々は、ＲＮＰを含む、パラグラフ６６に記載の方法。
６８．ＰＭＰは、脂質再構成ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）である、パラグラフ６５に記載の方法。
６９．異種ＲＮＡは、ＰＭＰによって封入される、パラグラフ６５に記載の方法。
７０．ＰＭＰの各々は、精製された植物細胞外小胞（ＥＶ）を含む、パラグラフ６５に記載の方法。
７１．組成物中のＰＭＰは、植物の形質を改変するために有効な濃度であり、改変は、植物の適応度を増加させる、パラグラフ６５に記載の方法。
７２．植物適応度の増加は、発生、増殖、収量、非生物的ストレッサーに対する耐性又は生物的ストレッサーに対する耐性の増加である、パラグラフ６５に記載の方法。
７３．植物の適応度の増加は、開花時期の改変である、パラグラフ６５に記載の方法。
７４．植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の品質の向上である、パラグラフ６５に記載の方法。
７５．植物の適応度の増加は、植物から収穫される産物の味、外観又は貯蔵期間の改善である、パラグラフ６５に記載の方法。
７６．適応度の増加は、動物における免疫反応を刺激するアレルゲンの産生の低減である、パラグラフ６５に記載の方法。
前述の本発明は、理解を明確にするために説明及び例としてある程度詳細に記載されているが、そうした記載及び例が本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、全体として参照により明示的に援用される。
他の実施形態は、特許請求の範囲に含まれる。
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Claims (17)

  1. 植物に異種ＲＮＡを投与する方法であって、複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む組成物を前記植物に送達するステップを含み、前記複数の各々は、前記異種ＲＮＡを含み、前記組成物は、植物の適応度を増加させるための有効な濃度で送達される、方法。
  2. 前記異種ＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の成分であり、前記複数のＰＭＰの各々は、前記ＲＮＰを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＰＭＰは、液体再構成ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記異種ＲＮＡは、前記ＰＭＰによって封入される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ＰＭＰの各々は、精製された植物細胞外小胞（ＥＶ）を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記組成物中の前記ＰＭＰは、植物の形質を改変するために有効な濃度であり、前記改変は、前記植物の前記適応度を増加させる、請求項１に記載の方法。
  8. 植物の適応度の前記増加は、発生、増殖、収量、非生物的ストレッサーに対する耐性又は生物的ストレッサーに対する耐性の増加である、請求項１に記載の方法。
  9. 植物の適応度の前記増加は、開花時期の改変である、請求項１に記載の方法。
  10. 植物の適応度の前記増加は、前記植物から収穫される産物の品質の向上である、請求項１に記載の方法。
  11. 植物の適応度の前記増加は、前記植物から収穫される産物の味、外観又は貯蔵期間の改善である、請求項１に記載の方法。
  12. 適応度の前記増加は、動物における免疫反応を刺激するアレルゲンの産生の低減である、請求項１に記載の方法。
  13. 複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物であって、前記ＰＭＰは、植物改変剤を含む、植物改変組成物。
  14. 複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物であって、前記ＰＭＰは、植物改変剤を含み、及び前記組成物中の前記ＰＭＰは、植物の形質を改変するために有効な濃度であり、前記改変は、前記植物の適応度を増加させる、植物改変組成物。
  15. 複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物であって、前記ＰＭＰは、異種核酸を含み、及び前記組成物中の前記ＰＭＰは、植物の適応度を増加させるための有効な濃度である、植物改変組成物。
  16. 複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む植物改変組成物であって、前記ＰＭＰは、異種ペプチドを含み、及び前記組成物中の前記ＰＭＰは、植物の適応度を増加させるために有効な濃度である、植物改変組成物。
  17. 複数のＰＭＰを含む植物改変組成物であって、前記ＰＭＰは、
    （ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、前記植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップ；
    （ｂ）前記初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、前記粗ＰＭＰ画分は、前記初期サンプル中のレベルに対して低減されたレベルの、前記植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分を有する、ステップ；
    （ｃ）前記粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、前記複数の純粋なＰＭＰは、前記粗ＥＶ画分中のレベルに対して低減されたレベルの、前記植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分を有する、ステップ；
    （ｄ）前記複数の純粋なＰＭＰに植物改変剤をロードするステップ；及び
    （ｅ）植物に送達するためにステップ（ｄ）の前記ＰＭＰを製剤化するステップ
    を含むプロセスによって生成される、植物改変組成物。
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