JP2021521241A - オートファジーを活性化することによる発毛のための方法及び組成物 - Google Patents

オートファジーを活性化することによる発毛のための方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

1又は複数のオートファジー誘導剤を用いて、対象において毛髪再生を改善若しくは刺激し;脱毛を治療、阻害若しくは低減し;発毛を改善若しくは刺激し;色素沈着欠損を治療、阻害若しくは低減し;及び/又は色素沈着生成を改善若しくは刺激する方法が開示される。

Description

[0001] 関連出願の相互参照
[0002] 本願は、2018年4月16日に出願された米国特許出願第62/658,113号(その全体が参照により本明細書中に援用される)の利益を主張する。
[0003] EFS−WEBにより提出された配列表の参照
[0004] サイズが1.13kbである、「20190415_034044_183WO1_seq_ST25」という名称のASCIIテキストファイルの配列表の内容が2019年4月15日に作成され、EFS-Webを介して本願ととともに電子的に提出され、その全体が参照により本明細書中に援用される。
[0005] 政府支援の承認
[0006] 本発明は、政府の支援を得て、アメリカ国立衛生研究所によって付与された認可番号HL090553及びAG049753の下で作成された。政府は、本発明における特定の権利を有する。
[0007] 発明の背景
[0008] 毛髪の生物学的及び心理学的重要性は、十分に理解されている。哺乳類の発毛は、毛包の休止期(静止)相、成長期(再生)相及び退行期(退化)相の環状的反復からなる。この毛包サイクルは、毛包幹細胞(HFSC)の静止及び活性化を制御する内因性及び外因性シグナルの両方により調節される。不適切なHFSCの活性化及び増殖が、老化を含む極めて多数の生物学的及び病理学的状態下での脱毛症の根底にある。HFSCの活性化及び成長期の開始を促進し得る分子は、毛髪再生がどのように調節されるかを明らかにすることと、治療的及び美容的介入をもたらすこととの両方に役立つことがあることから、集中的に探索されている。
[0009] 細胞成分を分解し、再利用するための基本的プロセスとして、オートファジーは、栄養飢餓及び他の有害な環境条件への適応にとって重大な意味を有するとともに、かかるシグナルによって調節される。オートファジーは、ミスフォールド又は損傷したタンパク質及び損傷した細胞小器官の除去を通したタンパク質恒常性の品質管理にとっても重要である。オートファジーの欠損は、必然的に神経変性及び他の疾患に関連することがある。オートファジーは、年齢とともに減少し、高齢者におけるオートファジー関連疾患(例えば、がん及び神経変性疾患)の有病率上昇に寄与する可能性が高い。静止状態及び幹細胞性を維持するため、造血幹細胞内での健常な活性ミトコンドリアのオートファジー除去が求められ、オートファジーは、静止状態の筋肉幹細胞の活性化における栄養要求を満たす。皮膚では、オートファジーは、上皮及び真皮幹細胞の自己再生及び分化にとって必要であるが、毛包幹細胞内でのその役割は、議論の余地を残している。一方で、オートファジーは、オートファジー関連遺伝子7(Atg7)欠損マウスからの皮膚移植片が異常な発毛を示すことから、発毛にとって必要とされることがある。他方で、心理学的ストレスは、オートファジー及び毛髪サイクルの遅延を誘導することがある。
[0010] 脱毛又は脱毛症は、世界中で数百万人を悩ませ、老化、ホルモン機能障害、自己免疫のために又はがん治療の副作用として生じ得る。毛髪を再生させるために用いることができる方法及び組成物は、高度に探求されているが、不十分である。
[0011] 発明の概要
[0012] いくつかの実施形態では、本発明は、毛髪再生の刺激を、それを必要とする対象において行う方法であって、1又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、新たな発毛の刺激を、それを必要とする対象において行う方法であって、1又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において脱毛を治療、阻害又は低減するための方法であって、1又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において発毛を改善又は刺激するための方法であって、1又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において色素沈着欠損を治療、阻害又は低減するための方法であって、1又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において色素沈着生成を改善又は刺激するための方法であって、1又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、脱毛は、老化している対象の結果である。いくつかの実施形態では、色素沈着欠損は、老化している対象の結果である。いくつかの実施形態では、対象は、老化しつつあり、及び/又は対象は、老化した対象である。いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤は、治療有効量で投与される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、所与の期間にわたる数用量、例えば1週間又はそれを超えて一日量として投与される。
[0013] いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤は、対象上の新たな発毛が所望される領域に投与される。いくつかの実施形態では、その領域は、より早期に存在した量より少ない毛髪量を有する。いくつかの実施形態では、その領域は、毛髪が存在しない。いくつかの実施形態では、その領域は、発毛を低減又は阻害する疾患又は状態に起因して毛髪が存在しない。いくつかの実施形態では、その領域は、損傷に起因して毛髪が存在しない。いくつかの実施形態では、その領域は、化学療法及び/又は放射線療法に起因して毛髪が存在しない。いくつかの実施形態では、その領域は、手術に起因して毛髪が存在しない。いくつかの実施形態では、対象は、甲状腺障害を有する。いくつかの実施形態では、対象は、下垂体障害を有する。いくつかの実施形態では、対象は、円形脱毛症を有する。いくつかの実施形態では、対象は、成長期脱毛及び/又は休止期脱毛を有する。
[0014] いくつかの実施形態では、治療有効量は、単回用量として投与される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、少なくとも2回の用量、少なくとも3回の用量、少なくとも4回の用量、少なくとも5回の用量又はそれを超える用量で投与される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、毎日投与される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、一日おきに投与される。
[0015] いくつかの実施形態では、方法は、補足剤を対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、補足剤は、1又は複数の成長因子を含む。いくつかの実施形態では、成長因子は、TGF−β2、IGF−1、KGF又はHGFを含む。いくつかの実施形態では、補足剤は、1又は複数のオートファジー誘導剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、補足剤は、1又は複数のオートファジー誘導剤とともに順次投与される。いくつかの実施形態では、補足剤及び1又は複数のオートファジー誘導剤は、統合された剤形として投与される。いくつかの実施形態では、補足剤及び1又は複数のオートファジー誘導剤は、別個の剤形として投与される。いくつかの実施形態では、剤形は、成長期に移行するように細胞を刺激するために製剤化される。
[0016] いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤の投与後の対象における毛包の数は、1又は複数のオートファジー誘導剤の投与前の対象における毛包の数と比べてより多い。いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤の投与後の対象における毛髪の重量は、1又は複数のオートファジー誘導剤の投与前の対象における毛髪の重量と比べてより大きい。いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤の投与後の対象における毛髪の毛幹長は、1又は複数のオートファジー誘導剤の投与前の対象における毛髪の毛幹長と比べてより迅速に増加する。いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤の投与後の対象における毛髪の成長速度は、1又は複数のオートファジー誘導剤の投与前の対象における毛髪の成長速度と比べて増加する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
[0017] いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤は、組成物の形態で投与される。いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤は、経口、非経口又は局所投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤は、局所投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤は、ゲル剤として製剤化される。いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤は、クリーム剤として製剤化される。いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤は、軟膏剤として製剤化される。いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤は、ローション剤として製剤化される。
[0018] 前述の概要及び以下の詳細な説明の両方は、あくまで例示的且つ説明的であり、特許請求の範囲に従い、本発明のさらなる説明を提供することが意図される。添付の図面は、本発明のさらなる理解を提供するために含まれ、内包され、本明細書の一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を例示し、且つ説明ととともに本発明の原理を説明する。
[0019] 図面の説明
[0020] 本発明は、以下の図面を参照することによってさらに理解される。
[0021]α−KGを用いる局所的処置により毛髪再生が誘導される。パネル(A)は、α−KGの構造式である。パネル(B)では、α−KGは、毛髪再生を誘導する。雄マウスは、出生後44日目(休止期)に剪毛され、媒体対照(約250μLのPLO基剤中のDMSO)又はα−KG(DMSO中に溶解され、次いで32mMの最終時に約250μLのPLO基剤に添加された)で一日おきに39日にわたり局所的に処置された。処置による成長期誘導を示す、α−KG処置動物の皮膚におけるメラニン色素沈着は、早くも12日目に視認可能になり;媒体処置マウスは、少なくとも39日間、有意な色素沈着を示さなかった。α−KG処置マウスの色素性皮膚領域からの発毛が約5〜7日以内に視認できた。示される写真は、処置後39日目に撮られ、そのときまでに、α−KGで処置されたマウスは、全体的な発毛を示した一方、対照マウスは、一部の動物でのランダムな毛髪パッチを除き、全体的に依然として毛髪を有しなかった。動物の総数:対照(32)、α−KG(34)。雌マウスでは、α−KGによる類似効果が認められた(図6、パネルDに示される)。パネル(C)は、α−KGで処置されたマウス皮膚対対照で処置されたマウス皮膚における(成長期の発症を示す)メラニン色素沈着の外観についての定量化である。色素沈着スコア化が方法中に記載される。パネル(A)に示される動物の数:対照(4)、α−KG(4)。 パネル(D)は、32mMのα−KGで処置されたマウスからのヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色皮膚組織切片のマイクロ写真であり、新しい毛包及び拡大した毛球、細長い毛幹及び肥厚した皮層を示す。ヘマトキシリンは、核酸をパープリッシュブルーに染色する塩基性色素であり;エオシンは、細胞質及び細胞外マトリックス(例えば、コラーゲン)を淡紅色に染色する酸性色素である。細胞増殖についてのマーカーであるKi−67に対する免疫組織化学によると、新しい毛包の形成がさらに示された。IL−6及びF4/80は、それぞれ炎症性サイトカイン及びマクロファージマーカーである。IL−6及びF4/80陽性の炎症性皮膚に対する対照が図6のパネルEに示される。 パネル(E)は、6時間、24時間及び5日にわたる、α−KGで処置されたマウスの休止期皮膚における、LC3、p62及びリン酸化されたBeclin 1を含むオートファジー関連マーカーの誘導である。皮膚色素沈着の欠如によって確認される通り、皮膚は、処置期間中の休止期において維持される。各レーンは、異なる動物から得られる。動物の数:各処置において4匹。 [0022]オリゴマイシン及びラパマイシンを用いる局所的処置により毛髪再生が誘導される。パネル(A)は、オリゴマイシンの構造である。パネル(B)では、オリゴマイシン(100μM)により毛髪再生が誘導される。雄マウスは、出生後44日目に剪毛され、一日おきに局所的に処置された。示される写真は、処置後23日目に撮られた。動物の数:対照(23)、オリゴマイシン(23)。雌マウスでは、オリゴマイシンによる類似の効果が認められた(図6、パネルD)。パネル(C)は、オリゴマイシンで処置されたマウス皮膚対対照で処置されたマウス皮膚におけるメラニン色素沈着の外観についての定量化である。動物の数:対照(3)、オリゴマイシン(3)。 パネル(D)は、100μMのオリゴマイシンで処置されたマウスからのH&E及びKi−67染色皮膚組織切片のマイクロ写真である。パネル(E)は、指定化合物で5日間処置されたマウスの休止期皮膚におけるオートファジー関連マーカーのウエスタンブロット解析である。Ctrl、対照;Oligo、オリゴマイシン;Rapa、ラパマイシン。 パネル(F)は、ラパマイシンの構造である。パネル(G)では、ラパマイシン(1.6μM)により毛髪再生が誘導される。雄マウスは、出生後43日目に剪毛され、一日おきに局所的に処置された。写真は、処置後37日目に撮られた。動物の数:対照(18)、ラパマイシン(17)。100nMのラパマイシンにより、1.6μMと類似の結果が得られた(図7)。雌マウスでは、ラパマイシンによる類似の効果が認められた(図7、パネルB)。しかし、16μMのラパマイシンの結果、脱毛及び開いた創傷が生じ(データは示さず)、これは、HFSC活性化にとって必要とされることが報じられたmTORのより重度の阻害に起因することがある。パネル(H)は、ラパマイシン(1.6μM)で処置されたマウス皮膚対対照で処置されたマウス皮膚におけるメラニン色素沈着の外観についての定量化である。動物の数:対照(3)、ラパマイシン(3)。パネル(I)は、パネル(G)に示されるマウスからのH&E及びKi−67染色皮膚組織切片のマイクロ写真である。 [0023]毛髪再生は、AICAR、メトホルミン及びα−KBにより誘導される。パネル(A)は、AICARの構造である。パネル(B)では、AICAR(16mM)により毛髪再生が誘導される。雄マウスは、出生後44日目に剪毛され、一日おきに局所的に処置された。写真は、処置後41日目に撮られた。動物の数:対照(12)、AICAR(11)。雌では、類似の効果が認められた(非表示)。パネル(C)は、パネル(B)からのマウスにおける皮膚色素沈着についての定量化である。動物の数:対照(3)、AICAR(3)。パネル(D)は、16mMのAICARで処置されたマウスからのH&E及びKi−67染色皮膚組織切片である。パネル(E)は、メトホルミンの構造である。パネル(F)では、メトホルミン(160mM)により毛髪再生が誘導される。雄マウスは、出生後43日目に剪毛され、メトホルミン又は媒体対照(この実験ではHO)で一日おきに局所的に処置された。写真は、処置後48日目に撮られた。動物の数:対照(13)、メトホルミン(12)。雌では、類似の効果が認められた(非表示)。 [0024] パネル(G)は、パネル(F)からのマウスにおける皮膚色素沈着についての定量化である。動物の数:対照(3)、メトホルミン(3)。パネル(H)は、パネル(F)に示されるマウスからのH&E及びKi−67染色皮膚組織切片である。パネル(I)は、α−KBの構造である。パネル(J)では、経口α−KB(飲料水中8mM)処置により、高齢雌マウスにおける脱毛がなくなる。写真は、131週齢時に撮られた。動物の数:対照(5)、α−KB(5)。パネル(K)では、局所α−KB(32mM)により、若齢雄マウスにおける毛髪再生が誘導される。マウスは、出生後44日目に剪毛され、一日おきに局所的に処置された。写真は、処置後39日目に撮られた。動物の数:対照(18)、α−KB(18)。雌では、類似の効果が認められた(非表示)。パネル(L)は、パネル(K)からのマウスにおける皮膚色素沈着についての定量化である。動物の数:対照(4)、α−KB(4)。 パネル(M)は、32mMのα−KBで処置されたマウスからのH&E及びKi−67染色皮膚組織切片である。パネル(N)は、指定化合物で5日間処置されたマウスの休止期皮膚におけるオートファジー関連マーカーのウエスタンブロット解析である。 [0025]SMER28は、オートファジー依存性に毛髪再生を誘導する。パネル(A)は、SMER28の構造である。パネル(B)は、1mMのSMER28で5日間処置されたマウスの休止期皮膚におけるオートファジー関連マーカーのウエスタンブロット解析である。各レーンは、別々のマウスからに相当する。パネル(C)では、雄マウスが出生後45日目に剪毛され、1mMのSMER28で毎日処置され;処置後23日目に写真が撮られた。一日おきの処置によると、類似の結果が示された(非表示)。動物の数:対照(6)、SMER28(6)。雌において、類似の効果が認められた(非表示)。 パネル(D)では、SMER28(2mM)に誘導された毛髪再生は、オートフィニブ(autophinib)(4mM)との共処置により阻害される。マウスは、出生後51日目に剪毛され、一日おきに局所的に処置された。処置後20日目に写真が撮られ;対応する皮膚組織切片の組織学が示された。動物の数:対照(20)、SMER28(16)、SMER28+オートフィニブ(7)、オートフィニブ(7)。 [0026]オートファジーレベルは、毛包サイクルステージを示し、成長期誘導時に上昇した。マウスは、雄について出生後93日目、雌について出生後92日目に剪毛され、毛髪サイクル進行について監視された。指定された各ステージ時のマウスは、オートファジーマーカーのウエスタンブロット解析のために屠殺された。T、休止期;A、成長期;C、退行期。 [0027]雄及び雌マウスの両方において、α−KG又はオリゴマイシン処置により毛髪再生が誘導され得る。図1に関して、パネル(A)は、毛髪再生についての陽性対照としてのミノキシジル(PLO基剤中5%)である。示される写真は、処置後22日目に撮られた。動物の数:対照(3)、ミノキシジル(3)、α−KG(3)。 パネル(B)では、α−KGは、8週齢動物において、図1のパネルA中の6.5週齢マウスと比べてより迅速な毛髪再生を誘導する。雄マウスは、出生後57日目(休止期)に剪毛され、32mMのα−KGで一日おきに局所的に処置された。示される写真は、処置後20日目に撮られた。動物の数:対照(4)、α−KG(3)。パネル(C)は、(A)からのマウスにおける皮膚色素沈着についての定量化である。α−KG処置動物の色素沈着は、早くも7日目に視認可能になり、背側の毛髪範囲全体が処置後20日目に認められた。動物の数:対照(3)、α−KG(3)。パネル(D)では、α−KG及びオリゴマイシンによっても雌動物において毛髪再生が刺激される。雌マウスは、出生後58日目(休止期)に剪毛され、媒体対照(DMSO)、α−KG(16mM)又はオリゴマイシン(10μM)で一日おきに局所的に処置された。示される写真は、処置後26日目に撮られた。動物の数:対照(9)、α−KG(9)、オリゴマイシン(10)。 パネル(E)は、損傷皮膚におけるIL−6及びF4/80を示す陽性対照である。皮膚病変、例えば喧嘩傷又は咬傷を有する8週齢雄マウスが用いられた。パネル(F)は、α−KG(*P=0.026;t検定、両側、2サンプル不等分散による)及びSMER28(*P=0.017;t検定、両側、2サンプル不等分散による)処置皮膚におけるp62転写物レベルの上昇を示す定量RT−PCRである。内部対照として、ハウスキーピング遺伝子B2m(β2−ミクログロブリン)が用いられた。平均±標準偏差(s.d.)がプロットされる。 [0028]毛髪再生に対するラパマイシンの効果。図2に関連する。パネル(A)では、100nMのラパマイシンによっても毛髪再生が促進される。雄マウスは、出生後45日目(休止期)に剪毛され、媒体対照(DMSO)又は100nMのラパマイシンで一日おきに局所的に処置された。示される写真は、処置後23日目に撮られた。動物の数:対照(7)、ラパマイシン(7)。パネル(B)では、ラパマイシンによっても雌動物で毛髪再生が促進される。雌マウスは、出生後58日目(休止期)に剪毛され、媒体対照(DMSO)又はラパマイシン(1.6μM)で一日おきに局所的に処置された。動物の数:対照(9)、ラパマイシン(11)。 [0029]α−KGが毛髪再生を誘導するため、オートファジーが必要とされる。図4に関連する。パネル(A)では、オートフィニブは、α−KGによる毛髪再生を阻害する。雄マウスは、出生後53日目(休止期)に剪毛され、媒体対照(DMSO)、オートフィニブ(4mM)、α−KG(64mM)又はα−KG(64mM)及びオートフィニブ(4mM)で一緒に一日おきに局所的に処置された。示される写真は、処置後20日目に撮られた。動物の数:各処置あたり4匹。パネル(B)は、処置後5日目のマウス皮膚におけるオートファジー関連マーカーのウエスタンブロット解析である。パネル(C)では、バフィロマイシンA1もα−KGによる毛髪再生を阻害する。雄マウスは、出生後52日目(休止期)に剪毛され、バフィロマイシン(200μM)と一緒に媒体対照(DMSO)、バフィロマイシン(200μM)、α−KG(64mM)又はα−KG(64mM)で一緒に一日おきに局所的に処置された。示される写真は、処置後21日目に撮られた。動物の数:各処置あたり4匹。 0〜100のマウス毛髪サイクル進行スコアを表す画像。図1〜図3に関連する。マウスは、剪毛され、毛髪サイクル進行について監視された。皮膚色素沈着レベル及び毛幹密度に基づき、0〜100の任意の値が割り当てられ、0は、発毛なし(及び色素沈着なし)を示し、より大きい数は、高密な発毛のより暗い皮膚及びより大きい領域に対応する。例えば、50のスコアは、背側皮膚領域の50%に対する完全な長さの発毛又は背側皮膚領域の100%に対する色素沈着があり、毛幹を依然として伴わない場合に割り当てられた。70のスコアは、背側皮膚の70%に対する完全な長さの発毛又は背側皮膚の100%に対する色素沈着があり、約30〜40%の毛幹を伴う場合に割り当てられた。100の値は、背側皮膚の100%に対する完全な長さの発毛を示す。
[0030] 発明の詳細な説明
[0031] オートファジーを誘導し、それにより他に休止期皮膚における毛髪再生(例えば、発毛及び毛包再生)を刺激する化合物が本明細書に開示される。それは、α−ケトグルタル酸(α−KG)、α−ケト酪酸(α−KB)であり、TOR及びAMPKシグナル伝達を侵害するラパマイシン及びメトホルミンなどの薬剤は、オートファジーを誘導し、それにより毛髪再生を刺激する。これらの薬剤による毛髪再生の刺激は、特定のオートファジー阻害剤により遮断され、オートファジーと毛髪再生との間の機構的結合が示唆される。この考えに合致して、増強されたオートファジーは、天然毛包サイクル中の成長期移行時に検出される。本明細書における実験では、オートファジーの誘導を強いることにより、休止期毛包の休止が活性化され得ることが示される。
[0032] 本明細書に開示される通り、α−KG、オリゴマイシン、ラパマイシン及びSMER28で処置されたマウスでは、ときに背側の休止期皮膚全体に対して迅速な成長期移行が認められたが、α−KB、メトホルミン又はAICARで処置されたマウスでも媒体対照マウスでも認められなかった。一時的に、α−KB、AICAR又はメトホルミンによる色素沈着(成長期移行)の誘導は、はるかに長く、例えば時間尺度でα−KG、オリゴマイシン又はラパマイシンによる約5〜14日と比べて約12〜18日かかる。これは、オートファジーの調節に対するmTOR阻害による差次的効果及びAMPK活性化による差次的効果を反映する可能性がある。代謝とオートファジーとの間のクロストークは、複雑である。オートファジーは、一般に、ATPの有効性における制限又はグルコース及びアミノ酸を含む必須栄養素の欠乏によって誘導されるが、ATPは、オートファジーに要求される。飢餓及びそれに続くエネルギー負荷の減少及びROSレベルの上昇は、オートファジーの強力なアクチベーターである。
[0033] オートファジーの誘導は、長寿に対する食事制限(DR)の効果に関連又は関与している同じ細胞エネルギー代謝制御因子の一部によって媒介される。代謝産物α−ケトグルタル酸(α−KG)は、虫及び培養された哺乳動物細胞の両方においてオートファジーを増強する。したがって、本明細書に開示される通り、α−KGが毛髪再生を刺激し得るか否かは、インビボC57BL/6Jマウス背側皮膚モデルを用いて試験された。脱毛パターンを処置するために用いられる血管拡張薬であるミノキシジルは、典型的には毛髪研究に関する多数の論文中で陽性対照として用いられていることから、比較対象に含められた(図6、パネルA)。6.5週齢(出生後44日目)の雄マウスは、背側皮膚毛包が休止期相にあるとき、背中を剪毛された。α−KG又は媒体対照処置が一日おきに局所的に適用された。α−KG処置により毛髪再生が強烈に増強される(図1、パネルA〜B)。黒マウスにおける成長期は、濾胞性メラノサイトのメラニン形成活性が毛髪サイクルの成長期段階に厳密に共役されることから、皮膚を通して視認できるメラニン色素により巨視的に認識可能である。図1のパネルBに示される実験では、α−KGによる処置後12日目までに皮膚色素沈着が視認できた(図1、パネルC)。それに対し、媒体処置対照マウスでは、動物が組織学的及び生化学的分析のために屠殺されたときである少なくとも39日目まで、色素沈着がないか又は散在する色素斑がわずか数か所であることは、明白であった。約5〜7日以内のα−KG処置マウスの色素性皮膚領域から毛髪が成長し、処置後39日目までに、α−KG処置マウスは、強力な発毛を示し;それに対し、対照マウスは、発毛を全体的にほとんどか又は全く示さなかった(図1、パネルB)。成長期開始及び毛髪再生に対するα−KGの効果は、マウスが後に8週齢時の休止期に処置されたときでもより劇的であった(図6、パネルB〜C)。α−KGの発毛刺激は、性別非依存性であり;α−KGは、雌マウスにおいて同様の毛髪刺激効果を示した(図6、パネルD)。
[0034] α−KG処置マウスにおける毛包の形成及び分化は、同様に組織学的分析によって実証された(図1、パネルD)。さらなる濾胞及び高増殖マーカーKi−67の発現がα−KG処置群において認められ、成長期相の誘導が示された(図1、パネルD)。休止期皮膚において、α−KGは、早くも処置後7日目に新たな成長期の波を開始させた。炎症及び創傷の修復は、毛髪再生など、組織を刺激することが知られていることから、本明細書中の実験では、皮膚損傷又は他の異常な皮膚状態を生じさせない分子が注目された。(別段の指示がない限り)この試験に記載のα−KG又は他の小分子処置による皮膚刺激又は炎症の証拠は、外観検査により、またIL−6及びF4/80染色による確認として認められなかった(図1、パネルD及び図6、パネルE)。
[0035] 再生実験用マウスとして同齢のマウスも急性処置され、早期の生化学的変化について分析された。処置の24時間後及び5日後の両方において、α−KG処置マウス皮膚におけるオートファジー誘導の増強がLC3のウエスタンブロット解析により支持された(図1、パネルE)。マウス皮膚において、オートファジー分解の指標として汎用されるオートファジー基質p62/SQSTM1の発現もα−KGによるオートファジー誘導(図1、パネルE)及びラパマイシン誘導性オートファジー(下記を参照されたい)とともに増強された。これは、p62転写の上方制御を通した補償に起因する可能性が高い(図6、パネルF)。
[0036] α−KGによる寿命増加は、分子レベルにおいて、高度に保存されたミトコンドリアATPシンターゼ/ATPアーゼ(複合体V)の直接的阻害及びその後の下流のラパマイシンの標的(TOR)活性の低下を通して媒介されることが見出された。α−KGによる毛髪再生もATPシンターゼ阻害によって媒介されることがあるか否かについても試験された。複合体V阻害剤オリゴマイシンを用いる局所的処置により、雄(図2、パネルA〜D)及び雌(図6、パネルD)マウスの両方で毛髪再生が同様に促進された。さらに、α−KGと同様に、オリゴマイシン処置により、TOR阻害及びオートファジー活性化がもたらされる。LC3発現によって示される通り、オートファジーの増強が局所的オリゴマイシン処置マウス皮膚において検出された(図2、パネルE)。
[0037] ラパマイシンの標的(TOR)タンパク質は、長寿におけるDRの効果に関する主なメディエーターである。例えば、ラパマイシンによるTORの阻害は、オートファジーを誘発する。したがって、ラパマイシンが毛髪再生を増強するか否かについても試験された。図2のパネルF〜I及び図7に示される通り、局所的ラパマイシン処置により、肉眼的及び組織学的方法の両方による判定として毛髪再生が促進された。ラパマイシン処置マウスの休止期皮膚において、オートファジー性のLC3、p62及びmTOR依存性のリン酸化されたBeclin 1 S14が増加した(図2、パネルE)。一貫して、Beclin 1 S14リン酸化は、α−KG(図1、パネルE)及びオリゴマイシン(図2、パネルE)を用いる処置後5日目でのマウス皮膚でも増加した。まとめると、これらの結果は、TOR経路活性の間接的又は直接的阻害のいずれか及びオートファジーの誘導により、毛髪再生が促進され得ることを示す。
[0038] AMP活性化タンパク質キナーゼ(AMPK)は、α−KG及びオリゴマイシンの別の一般的な下流エフェクターである。AMPKは、主要な細胞エネルギーセンサであり、例えばグルコース飢餓及び多数の他の細胞ストレス条件時、細胞エネルギー負荷における減少により活性化される。AMPKは、オートファジーも上昇させる。こうした理解に合致して、S91に対するAMPK依存性Beclin 1リン酸化は、α−KG及びオリゴマイシンで処置されたマウス皮膚において増強された(図1、パネルE及び図2、パネルE)。さらに、図3のパネルA〜Dに示される通り、成長期誘導及び毛髪再生は、AMPKアクチベーター、5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボヌクレオチド(AICAR)、AMP類似体を用いる局所的処置によっても刺激された。AMPKの別の作動薬であるメトホルミンは、オートファジー及び毛髪再生を同様に誘導した(図3、パネルE〜H)。
[0039] 機構的に、メトホルミンは、電子輸送鎖におけるミトコンドリア複合体Iを阻害することが示されている。興味深いことに、長寿命線虫(C. elegans)のミトコンドリア突然変異体は、エクソメタボロームにおいて様々なα−ケト酸代謝産物を蓄積させる。30週にわたる飲料水へのα−ケト酪酸(α−KB)の添加により、高齢マウスにおいて毛髪コーティングが大幅に改善された(図3、パネルI〜J)。高齢マウスに対する局所的処置を試験するパイロット実験では、局所的α−KB処置のみにより、剪毛された高齢動物において発毛が中程度に促進された一方、局所的α−KG又はラパマイシンにより、毛髪再生は、見かけ上、増強されなかった(又は全く変化しなかったどころかやや低減した)(データは示さず)。それに対し、若齢マウスでは、α−KG及びラパマイシン処置と同様に、局所的α−KB処置により、皮膚色素沈着及び毛髪再生が実質的に誘導された(図3、パネルK〜M)。処置された皮膚において、上昇したLC3及びリン酸化されたBeclin 1により示される通り、オートファジーも誘導された(図3、パネルN)。
[0040] mTORは、HFSC活性化及び成長期移行に必要とされることが以前に報告されている。しかし、本明細書で開示される結果は、オートファジー誘導を伴うラパマイシンによるmTORの中等度阻害により毛髪再生が刺激されることを示す。かかるディコトミーは、ミトコンドリア調節のために存在することもある。ミトコンドリア呼吸は、HFSCサイクルにとって必要とされるが、ミトコンドリア機能の遺伝的攪乱は、毛髪再生をなくす。複合体V阻害剤のオリゴマイシンが毛髪再生を実際に促進することを示す実験は、軽度のミトコンドリア阻害が有利と判明し得ることを示唆する。ミトコンドリア複合体Vが線虫(C. elegans)からドロソフィラ種(Drosophila spp.)及びヒトにかけてTORの上流で作用し、ミトコンドリア複合体V阻害及びTOR阻害の両方によりオートファジーが誘導されることから(図2、パネルE)、毛髪再生を誘発するのにオートファジー誘導単独で十分なことがあるか否かが試験された。
[0041] 本明細書に開示される通り、オートファジー誘導単独が毛髪再生を誘発することになるか否かを判定するため、TOR非依存性のオートファジーを誘導する小分子のSMER28が用いられた。局所的SMER28投与により、マウス背側皮膚においてLC3及びp62のオートファジー誘導が増強された(図4、パネルA〜B及び図6、パネルF)。mTORに依存するBeclin 1 Ser14リン酸化のレベルは、SMER28処置皮膚において増加せず(図4、パネルB)、SMER28によるmTOR非依存性のオートファジー誘導効果が示された。加えて、Beclin 1 S91リン酸化についてもSMER28処置皮膚において増加しなかったことから、SMER28は、AMPKに影響することによりオートファジーを誘導するように見えなかった(図4、パネルB)。注目すべきことに、SMER28は、毛髪再生も著しく誘導した(図4、パネルC)。これらの知見は、毛髪再生を刺激する場合のオートファジーの役割を強力に支持する。
[0042] オートファジーが、SMER28で刺激される毛髪再生にとって必要であるか否かを試験するため、VPS34及びオートファゴソーム形成を阻害するオートフィニブが用いられた。オートフィニブとの共処置により、SMER28による毛髪再生が阻止され(図4、パネルD)、オートファジーが毛髪再生にとって重要であることが示された。同様に、空胞性H(+)−ATPアーゼ(V−ATPアーゼ)依存性酸性化及びCa−P60A/SERCA依存性オートファゴソーム−リソソーム融合を阻害することによりオートファジーフラックスを破壊する、オートフィニブ及びバフィロマイシンA1との共処置によって示される通り、オートファジーは、α−KGによる毛髪再生を刺激するために重要である(図8)。
[0043] オートファジーが天然毛包サイクルにとって不可欠なことがあるか否かを理解するため、異なる毛包段階にわたるオートファジーが試験され、オートファジーは、毛包が成長期を通して天然に進行するにつれて上昇し;オートファジーは、退行期において減少し、休止期では低値を維持する(図5)。
[0044] 要するに、本明細書中の実験は、オートファジーを誘導することにより毛髪再生が刺激され得ることを示す。
[0045] したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、毛髪再生の刺激を、それを必要とする対象において行うことを対象とし、それは、1又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することにより、対象においてオートファジーを誘導することを含む。本明細書で使用する場合、「必要とする」対象は、延長された休止期相、短縮された成長期相及び/又は妨害された成長期誘導の結果として脱毛を有する対象並びに毛髪再生、発毛及び/又は改善された毛髪色素沈着を望む対象を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において脱毛を治療、阻害若しくは低減し;発毛を改善若しくは刺激し;色素沈着欠損を治療、阻害若しくは低減し;及び/又は色素沈着生成を改善若しくは刺激するための方法であって、1又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において脱毛を治療、阻害若しくは低減し;発毛を改善若しくは刺激し;色素沈着欠損を治療、阻害若しくは低減し;及び/又は色素沈着生成を改善若しくは刺激するための組成物を対象とし、前記組成物は、1又は複数のオートファジー誘導剤を含む。
[0046] いくつかの実施形態では、対象は、動物である。いくつかの実施形態では、対象は、齧歯類又は非ヒト霊長類などの動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、老化している。いくつかの実施形態では、対象は、老化した対象である。本明細書で使用する場合、「老化している」対象は、非処置対照対象が身体的、精神的及び/又は生物学的に悪化し始める生涯の時期にある対象を指す。いくつかの実施形態では、老化している対象は、暦年齢が非処置対照対象の平均寿命の少なくとも中点である対象である。本明細書で使用する場合、「老化」対象は、暦年齢が非処置対照対象の平均余命の少なくとも3分の2である対象である。例えば、実験マウスの所与の株の平均余命が2年である場合、その株の高齢マウスは、少なくとも16月齢であり、また実験マウスの別の株の平均余命が3年である場合、その株の高齢マウスは、24月齢である。ヒトでは、ヒトの平均余命が約80年である場合、高齢ヒトは、約53歳である。老化している対象は、老化した対象であっても又はなくてもよいことに留意されたい。
[0047] 本明細書で使用する場合、「オートファジー誘導剤」は、陰性対照と比べて、オートファジーを誘導する化合物を指す。オートファジー誘導剤は、ATPシンターゼ阻害剤、TOR阻害剤、AMPKアクチベーター及びTOR非依存性のオートファジーエンハンサーを含む。しかし、国際公開第2018064468号に記載のようなα−ケト酪酸化合物及びグルタル酸化合物は、本明細書で定義されるような「オートファジー誘導剤」から明示的に除外される。いくつかの実施形態では、2つ以上のオートファジー誘導剤が対象に共投与される。本明細書で使用する場合、「共投与される」は、少なくとも2つの異なる薬剤、例えば第1のオートファジー誘導剤及び第2のオートファジー誘導剤の対象への投与を指す。いくつかの実施形態では、共投与は、同時である。同時の共投与を含む実施形態では、薬剤は、単一組成物、例えば混合物として又は2つの分離した組成物として投与され得る。いくつかの実施形態では、第1の薬剤は、第2の薬剤の投与前及び/又は後に投与される。共投与が連続的である場合、第1の薬剤及び第2の薬剤の投与は、ある期間、例えば数分、数時間又は数日で分割され得る。当業者は、用いられる様々な薬剤又は治療薬の製剤及び/又はそれらの投与経路が変化し得ることを理解する。共投与に適した用量は、当業者により容易に決定され得る。いくつかの実施形態では、2つ以上の薬剤が共投与されるとき、各薬剤は、それらの単独投与に適した用量よりも低い用量で投与される。
[0048] 本明細書で使用する場合、「ATPシンターゼ阻害剤」は、対照と比べて、ATPシンターゼを阻害する化合物を指す。ATPシンターゼ阻害剤の例として、α−ヘリカル塩基性ペプチド阻害剤、アンジオスタチン、エンテロスタチン、テントキシン、テントキシン類似体、ロイシノスタチン、エフラペプチン、スチルベン、フラボン、イソフラボン、ステロイドエストラジオール、エストロゲン代謝産物、ポリケチド阻害剤(例えば、マクロライド)、有機スズ化合物、α−ピロン及びその誘導体、両親媒性カチオン性色素などが挙げられる。例えば、Hong, et al., (2008) Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR, 72(4): 590-641を参照されたい。いくつかの実施形態では、ATPシンターゼ阻害剤は、(任意のタイプ、例えばA、B、C、D、E及びFの)オリゴマイシンなどのマクロライド、ペリオマイシン、(任意のタイプ、例えばA、B又はXの)ベンツリシジン、オサマイシン、アポプトリジン及びシトバリシンである。いくつかの実施形態では、ATPシンターゼ阻害剤は、オリゴマイシンである。いくつかの実施形態では、オリゴマイシンは、オリゴマイシンAである。
[0049] 本明細書で使用する場合、「TOR阻害剤」は、対照と比べて、TOR(ラパマイシンの標的)を阻害する化合物を指す。TOR阻害剤の例として、ラパマイシン、ラパマイシン誘導体(例えば、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムスなど)、ダクトリシブ、GSK2126458、XL765、AZD8055、INK128/MLN0128.OSI027、RapaLinkなどが挙げられる。例えば、Xie, et al. (2016) F1000Research, 5, F1000 Faculty Rev-2078を参照されたい。いくつかの実施形態では、TOR阻害剤は、ラパマイシン又はラパマイシン誘導体である。
[0050] 本明細書で使用する場合、「AMPKアクチベーター」は、対照と比べて、AMPK(AMP活性化タンパク質キナーゼ)を活性化する化合物を指す。AMPKアクチベーターの例として、間接AMPKアクチベーター(例えば、国際公開第2009124636号、国際公開第2009100130号、国際公開第2011029855号、国際公開第2011138307号、国際公開第2011080277号、国際公開第2011032320号、国際公開第2011033099号において開示された化合物)、ビグアナイド(例えば、メトホルミン)、チアゾリジンジオン、ポリフェノール、ジンセノサイド、α−リポ酸、直接AMPKアクチベーター(例えば、5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボヌクレオチド(AICAR)、チエノピリドン、ベンズイミダゾール、サリチル酸塩、化合物13、PT−1、MT63−78(Debio0930))、チエノピリドン及びその誘導体、ベンズイミダゾール及びその誘導体、5−(5−ヒドロキシル−イソキサゾール−3−イル)−フラン−2−ホスホン酸(C−2)などが挙げられる。例えば、Kim, et al. (2016) Experimental & molecular medicine, 48(4): e224を参照されたい。いくつかの実施形態では、AMPKアクチベーターは、直接AMPKアクチベーターである。いくつかの実施形態では、AMPKアクチベーターは、5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボヌクレオチド(AICAR)である。いくつかの実施形態では、AMPKアクチベーターは、ビグアナイドである。いくつかの実施形態では、AMPKアクチベーターは、メトホルミンである。
[0051] 本明細書で使用する場合、「TOR非依存性のオートファジーエンハンサー」は、TORシグナル伝達経路から独立して、対照と比べてオートファジーを誘導又は増強する化合物を指す。TOR非依存性のオートファジーエンハンサーの例として、SMER28が挙げられ、インビボでオートファジーを誘導するクロロキン及び3−MAなども含まれる。
[0052] 組成物
[0053] 1又は複数のオートファジー誘導剤を含む医薬組成物を含む組成物が本明細書で検討される。用語「医薬組成物」は、対象における薬学的使用に適した組成物を指す。医薬組成物は、一般に有効量の活性薬剤、例えば1又は複数のオートファジー誘導剤及び薬学的に許容できる担体を含む。用語「有効量」は、所望の結果をもたらすのに十分な用量又は量を指す。所望の結果は、その用量又は量のレシピエントにおける客観的又は主観的改善、例えば長期生存、病態の有効な予防などを含み得る。医薬組成物は、1又は複数のオートファジー誘導剤に加えて、1又は複数の補足剤を含み得る。好適な補足剤の例として、国際公開第2018064468号に記載のようなα−ケト酪酸化合物及びグルタル酸化合物、成長因子(例えば、TGF−β2、IGF−1、KGF、HGF)などが挙げられる。
[0054] いくつかの実施形態では、組成物は、1又は複数のオートファジー誘導剤を含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなる。本明細書で使用する場合、語句「〜から本質的になる」は、1又は複数のオートファジー誘導剤から本質的になる組成物に関連して、オートファジー以外の生物学的活性又は機能を示す他の成分が、その成分が1又は複数のオートファジー誘導剤の活性を有意に改変しない限り含まれ得ることを意味する。本明細書で使用する場合、語句「〜からなる」は、1又は複数のオートファジー誘導剤からなる組成物に関連して、組成物が、治療中の対象に対して効果を有するように意図された生物学的活性又は機能を示す他の成分を除外し、例えば他の活性医薬成分が除外されるが、組成物が、組成物自体、担体、希釈剤、結合剤などの中でも、細菌及び真菌増殖を予防することが意図された抗菌剤及び抗真菌剤を含み得ることを意味する。
[0055] 1又は複数のオートファジー誘導剤は、好ましくは、医薬組成物の形態で対象に投与され得る。好ましくは、対象は、哺乳類であり、より好ましくは、対象は、ヒトである。好ましい医薬組成物は、少なくとも1つのオートファジー誘導剤を治療有効量において且つ薬学的に許容できる媒体中に含むものである。
[0056] 本明細書で使用する場合、「治療有効量」は、対照、例えばプラセボと比べて、対象における所与の疾患又は状態、例えば脱毛を治療、予防又は阻害するのに用いられ得る量を指す。また、当業者は、脱毛の度合い、以前の治療、対象の一般健康及び年齢などを含む特定の要素が、対象を有効に治療するのに必要とされる量に影響を及ぼすことがあることを理解するであろう。それにもかかわらず、治療有効量は、当技術分野における方法により容易に決定され得る。いくつかの実施形態では、オートファジー誘導剤の治療有効量は、非経口製剤において、約0.01〜約10mg/kg体重、約0.01〜約3mg/kg体重、約0.01〜約2mg/kg、約0.01〜約1mg/kg又は約0.01〜約0.5mg/kg体重の範囲である。経口投与における治療有効量は、最大で約10倍より高いことができる。治療有効量での対象の治療は、単回用量として又は一連の数回用量として施され得ることに留意されたい。治療に用いられる用量は、所与の治療中に増加又は減少し得る。所与の条件セットにおける最適用量は、当技術分野における用量決定試験及び/又は診断アッセイを用いて当業者により確認され得る。用量決定試験及び/又は診断アッセイは、治療中に用量を監視及び調節するために用いられ得る。
[0057] 医薬組成物は、当技術分野で公知の方法を用いて、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮下、眼内、くも膜下腔内、関節内、関節滑液嚢内、大槽、肝内、病変内注射、頭蓋内注射、注入及び/又は投与の吸入経路を含む、意図される送達経路に応じて製剤化され得る。医薬組成物は、pH緩衝液、アジュバント(例えば、保存剤、浸潤剤、乳化剤及び分散剤)、リポソーム製剤、ナノ粒子、分散剤、懸濁液又はエマルジョン並びに滅菌注射可能溶液若しくは分散剤への再構成のための滅菌散剤の1又は複数を含み得る。組成物及び製剤は、当技術分野における方法を用いて、安定性及び有効性の増強を意図して最適化され得る。例えば、Carra et al., (2007) Vaccine 25:4149-4158を参照されたい。
[0058] 組成物は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、吸入、筋肉内及び血管内投与を含む任意の好適な経路により、対象に投与され得る。好ましい投与経路及び医薬製剤は、対象の状態及び年齢、治療されるべき状態の性質、所望の治療効果並びに用いられる特定のオートファジー誘導剤とともに変化することが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、1又は複数のオートファジー誘導剤は、対象上の治療されるべき部位に局所的に投与される。
[0059] 本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる媒体」又は「薬学的に許容できる担体」は、互換可能に用いられ、薬学的投与に適合し、薬学的投与のための適用可能な基準及び規制、例えば米国薬局方及び国民医薬品集(USP−NF)ブックに示される薬局方収載標準品に従う溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを指す。したがって、例えば少なくとも静脈内投与では、薬学的に許容できる担体として、非滅菌水は、除外される。薬学的に許容できる媒体は、当技術分野で公知のものを含む。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th ed (2000) Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MDを参照されたい。
[0060] 医薬組成物は、用量単位形態で提供され得る。本明細書で使用する場合、「用量単位形態」は、治療されるべき対象に対する単位用量として適する物理的分離単位を指し;各単位は、必要とされる薬学的に許容できる担体と関連して所望の治療効果をもたらすように算出された所定量の1又は複数のオートファジー誘導剤を含有する。本発明の用量単位形態における仕様は、所与のオートファジー誘導剤に固有の特性及び達成されるべき所望の治療効果並びに個体の治療のためのかかる活性化合物を配合する技術分野における本質的な制限により指示され、それらに直接的に依存する。
[0061] 本発明に従うオートファジー誘導剤及びその組成物の毒性及び治療効果は、細胞培養液及び/又は実験動物並びに当技術分野における薬学的手順を用いて判定され得る。例えば、当技術分野における方法により、致死量、LC50(集団の50%が死亡する濃度×曝露期間として表される用量)又はLD50(集団の50%が死亡する用量)及びED50(集団の50%において治療的に有効な用量)を判定し得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、それは、LD50/ED50比として表すことができる。大きい治療指数を示すオートファジー誘導剤が好ましい。有毒な副作用をもたらすオートファジー誘導剤を用い得るが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小化し、それにより副作用を低減するように、治療部位に向けてかかる化合物を標的にする送達系を設計するには、注意が払われるべきである。
[0062] 細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を配合する場合に用いることができる。好ましい用量は、毒性をほとんどか又は全く伴わない、ED50を含む循環濃度範囲を提供する。その用量は、利用される剤形及び利用される投与経路に応じて変化し得る。1又は複数のオートファジー誘導剤の治療有効量及び用量は、最初に細胞培養アッセイから評価され得る。細胞培養下での判定として、IC50(即ち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を得るため、用量は、動物モデルにおいて配合され得る。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定するために用いることができる。血漿中レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定され得る。加えて、所与の対象に適した用量は、様々な臨床的因子に基づき、主治医又は認定医師により決定され得る。
[0063] キット
[0064] いくつかの実施形態では、本発明は、1又は複数のオートファジー誘導剤を任意選択的に組成物中において又は1又は複数の補足剤と組み合わせて含み、対象における脱毛を予防、阻害、低減又は治療するための1又は複数の試薬又は薬剤送達装置と一緒にパッケージングされたキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、1又は複数のオートファジー誘導剤を、任意選択的に1又は複数の単位剤形でパックとして及び/又は薬剤送達デバイス、例えば予備充填シリンジにおいて一緒にパッケージングされて含む。
[0065] いくつかの実施形態では、キットは、1又は複数の容器、例えばバイアル、チューブなどを受けるために区画化され得る担体、パッケージ又は容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、任意選択的に、識別のための説明若しくはラベル又はその使用に関する説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で検討されたような化合物及び組成物の製造、使用又は販売を規制する、政府機関によって規定された情報を含む。
[0066] 以下の実施例は、本発明を例示しても限定しないことが意図される。
[0067] 実施例 − 方法
[0068] マウスにおける毛髪再生についてのアッセイ
[0069] 雄及び雌マウスの両方において、すべての化合物を試験した。あらゆる実験は、独立しており、少なくとも2回反復した。異なる薬剤によるいくつかの処置は、共有対照群と同時に実施した。C57BL/6J雄マウスは、6又は8週齢時にJackson Laboratories(Bar Harbor, ME)から得た。C57BL/6J雌マウスは、8週齢時にJackson Laboratories(Bar Harbor, ME)から得た。マウスに標準の固形飼料食餌を与え、試験全体を通して食物及び水への自由なアクセスを提供した。休止期におけるマウスを、雄において出生後の約43〜45日目(別段の指示がない限り)及び雌において58日目にそれぞれ背側を剪毛した。媒体対照(別段の指示がない限り、25μLのDMSO)又は試験化合物(別段の指示がない限り、25μLのDMSO中)を実験の持続期間(3〜6週)にわたり(別段の指示がない限り)一日おきに剪毛皮膚に局所適用した。皮膚色素沈着及び発毛の外観を監視し、写真及び映像により記録した。進行についても色素沈着レベル及び毛幹密度に基づいて0〜100の値に割り当て、0は、発毛なし(及び色素沈着なし)を示し、より大きい数は、高密な発毛のより暗い皮膚及びより大きい領域に対応する。異なるスコアを表す画像を図9に提示する。各マウスに対して、約250μLのPremium Lecithin Organogel(PLO)基剤(Transderma Pharmaceuticals Inc.)中のα−KG(Sigma, 75890)、オリゴマイシン(Cell Signaling, 9996L)、ラパマイシン(Selleckchem, S1039)、AICAR(Selleckchem, S1802)、メトホルミン(Sigma, PHR1084)、α−KB(Sigma, K401)、SMER28(Selleckchem, S8240)、オートフィニブ(Selleckchem, S8596)、バフィロマイシンA1(Selleckchem, S1413)又は指定の組み合わせを用いた。溶媒DMSOは、局所適用のため、PLO基剤とも混合した。毛髪サイクルのタイミングは、PLO基剤+DMSO対PLO基剤単独を用いて改変されなかった。
[0070] 高齢マウス
[0071] 経口α−KB処置では、高齢雄及び雌C57BL/6Jマウスを87週齢時に得た(NIAの高齢齧歯類コロニー)。マウスは、UCLAの制御されたSPF施設(22±2℃、6:00〜18:00、12時間/12時間の明/暗サイクル)に収容した。マウスに標準の固形飼料食餌を与え、試験全体を通して食物及び水への自由なアクセスを提供した。水(媒体対照)又は飲料水中のα−KB(90mg/kg体重)のいずれかによる処置は、マウスが101週齢に達したときに開始した。局所的α−KB処置では、高齢雄C57BL/6Jマウスを21月齢時に得て(NIAの高齢齧歯類コロニー)、翌週に剪毛し、α−KB(32mM)で1か月間、一日おきに局所的に処置した。すべての実験は、UCLA Chancellor’s Animal Research Committeeによって認可された。
[0072] 組織学及び顕微鏡
[0073] マウス背側皮膚を、組織学的及び分子的分析のために収集する前に剪毛した。次に、全厚皮膚組織を10%ホルマリン溶液(Sigma,HT501128)で一晩固定し、脱水し、パラフィンで包埋した。5μmのパラフィン切片に対して、ヘマトキシリン/エオシン染色及び免疫組織化学をKi−67(Cell Signaling, 12202)、IL−6(Abcam, ab6672)又はF4/80(Bio-Rad, MCA497G)について実施した。X20の倍率でのLeica Aperio ScanScope AT明視野システムにより、画像を取得した。
[0074] ウエスタンブロッティング
[0075] 雄マウスを剪毛し、出生後43日目から一日おきに処置した。5日後、休止期皮膚サンプルを収集し、ステージを確認した。マウス皮膚組織ライセートを、FastPrep 24(MP Biomedicals)による、プロテアーゼ阻害剤(Roche, 11836153001)及びホスファターゼ阻害剤(Sigma, P5726)を有するT-PER Tissue Protein Extraction Buffer(Thermo Scientific, 78510)中での均質化により調製した。遠心分離により組織及び細胞片を除去し、5%β−メルカプトエタノールを含有する1×SDS負荷緩衝液中でライセートを5分間煮沸した。次に、サンプルに対して、NuPAGE Novexの12%ビス−トリスゲル(Invitrogen, NP0343BOX)上でSDS−PAGEを施し、LC3(Novus, NB100 2220)、p62(Sigma, P0068)、Phospho-Beclin-1(Ser15)(マウスにおけるSer14に対応する)(Cell Signaling, 84966)、Phospho-Beclin-1(Ser93)(マウスにおけるSer91に対応する)(Cell Signaling, 14717)、Beclin-1(Abcam, ab207612)又はGAPDH(Ambion, AM4300)に対する抗体を用いて、ウエスタンブロッティングを実施した。
[0076] 定量的逆転写PCR(RT−qPCR)
[0077] 処置後24時間後、休止期皮膚サンプルを収集し、TRIzol試薬(Invitrogen)を用いて全厚マウス皮膚組織から全RNAを単離した。iScript Reverse Transcription Supermix(Bio-Rad)を用いて、cDNAを合成した。定量的RT−PCRのためにiTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)及びBio-Rad CFX Connect機器を用いた。RT−qPCRに用いたプライマー配列は、以下の通りである。
p62フォワード:
配列番号1:GAAGAATGTGGGGGAGAGTGTGG
p62リバース:
配列番号2:TGCCTGTGCTGGAACTTTCTGG
B2mフォワード:
配列番号3:CAGCATGGCTCGCTCGGTGAC
B2mリバース:
配列番号4:CGTAGCAGTTCAGTATGTTCG
[0078] 統計分析
[0079] すべての処置を少なくとも2回反復した。データは、生物学的複製を表す。あらゆる図面において、適切な統計学的検定を用いた。データは、各図面において記載の統計学的検定の前提を満たす。すべての図面において、平均±標準偏差をプロットする。
[0080] 参考文献
[0081] 必要に応じて、以下の参考文献は、参照により本明細書中に援用される。
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[0082] 本願中に用いられるすべての科学技術用語は、特に指定されない限り、当技術分野で一般に用いられる意味を有する。
[0083] 本明細書で使用する場合、用語「対象」、「患者」及び「個体」は、ヒト及び非ヒト動物を指すように互換可能に用いられる。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば哺乳類及び非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ウマ、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ブタ、ニワトリ及び他の動物対象並びに試験動物を含む。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
[0084] 本明細書で使用する場合、用語「診断すること」は、診断について、別の団体、例えば患者に通知する、即ち口頭で又は(例えば、紙若しくは電子媒体での)書面により伝える身体的且つ能動的ステップを指す。同様に、「予後を提供すること」は、予後について、別の団体、例えば患者に通知する、即ち口頭で又は(例えば、紙若しくは電子媒体での)書面により伝える身体的且つ能動的ステップを指す。
[0085] 単数形の使用は、特に具体的に述べられない限り、複数形を含み得る。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる通り、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その」は、文脈上特に明示されない限り、複数の参照対象を含み得る。
[0086] 本明細書で使用する場合、「及び/又は」は、「及び」又は「又は」を意味する。例えば、「A及び/又はB」は、「A、B又はA及びBの両方」を意味し、「A、B、C及び/又はD」は、「A、B、C、D又はそれらの組み合わせ」を意味し、前記「A、B、C、D又はそれらの組み合わせ」は、A、B、C及びDの任意のサブセット、例えば単一メンバーのサブセット(例えば、A、又はB、又はC、又はD)、2つのメンバーのサブセット(例えば、A及びB;A及びCなど)、又は3つのメンバーのサブセット(例えば、A、B及びC;又はA、B及びDなど)、又は4つすべてのメンバー(例えば、A、B、C及びD)を意味する。
[0087] 本明細書で使用する場合、語句「〜の1又は複数」、例えば「A、B及び/又はCの1又は複数」は、「Aの1又は複数」、「Bの1又は複数」、「Cの1又は複数」、「Aの1又は複数及びBの1又は複数」、「Bの1又は複数及びCの1又は複数」、「Aの1又は複数及びCの1又は複数」及び「Aの1又は複数、Bの1又は複数及びCの1又は複数」を意味する。
[0088] 語句「Aを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる」は、余分な頁及び翻訳料を回避するための手段として用いられ、いくつかの実施形態では、所与の問題事項がAを含むか、Aから本質的になるか又はAからなることを意味する。例えば、「いくつかの実施形態では、組成物は、Aを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる」という文章は、あたかも以下の3つの分かれた文章:「いくつかの実施形態では、組成物は、Aを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Aから本質的になる。いくつかの実施形態では、組成物は、Aからなる」として記述されるように解釈されるべきである。
[0089] 同様に、一連の代替形態を列挙する文章は、一連の文章が、あたかも所与の各代替形態がある文章内に単独で提供されるように提供されるものとして解釈されるべきである。例えば、「いくつかの実施形態では、組成物は、A、B又はCを含む」という文章は、以下の3つの分かれた文章:「いくつかの実施形態では、組成物は、Aを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Bを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Cを含む」として記述されるように解釈されるべきである。別の例として、「いくつかの実施形態では、組成物は、少なくともA、B又はCを含む」という文章は、以下の3つの分かれた文章:「いくつかの実施形態では、組成物は、少なくともAを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくともBを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくともCを含む」として記述されるように解釈されるべきである。
[0090] 本発明の開示を理解するか又は完成させるのに必要な程度まで、本明細書中に言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも各々が個別にそのように援用されるのと同じ程度まで、参照により本明細書中に明示的に援用される。
[0091] 本発明の例示的な実施形態をこのように説明したが、本開示中の実施形態は、あくまで例示的なものであり、且つ様々な他の代替形態、適応形態及び修飾形態は、本発明の範囲内でなされ得ることが当業者によって留意されるべきである。したがって、本発明は、本明細書で例示されるような具体的な実施形態に限定されないが、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (10)

  1. 対象において毛髪再生を改善若しくは刺激し;脱毛を治療、阻害若しくは低減し;発毛を改善若しくは刺激し;色素沈着欠損を治療、阻害若しくは低減し;及び/又は色素沈着生成を改善若しくは刺激するための方法であって、1又は複数のオートファジー誘導剤を前記対象に投与することを含む方法。
  2. 前記1又は複数のオートファジー誘導剤は、ATPシンターゼ阻害剤、TOR阻害剤、AMPKアクチベーター及び/又はTOR非依存性のオートファジーエンハンサーである、請求項1に記載の方法。
  3. 前記1又は複数のオートファジー誘導剤は、マクロライド、例えばオリゴマイシンである、請求項1に記載の方法。
  4. 前記1又は複数のオートファジー誘導剤は、ラパマイシン又はラパマイシン誘導体である、請求項1に記載の方法。
  5. 前記1又は複数のオートファジー誘導剤は、ビグアナイド、例えばメトホルミンである、請求項1に記載の方法。
  6. 前記1又は複数のオートファジー誘導剤は、5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボヌクレオチド(AICAR)である、請求項1に記載の方法。
  7. 前記1又は複数のオートファジー誘導剤は、SMER28である、請求項1に記載の方法。
  8. 前記1又は複数のオートファジー誘導剤は、マクロライド、例えばオリゴマイシン、ラパマイシン又はラパマイシン誘導体、ビグアナイド、例えばメトホルミン、5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボヌクレオチド(AICAR)、SMER28及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  9. 前記1又は複数のオートファジー誘導剤は、経口、非経口又は局所投与のために製剤化される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記1又は複数のオートファジー誘導剤は、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、ペースト剤又はローション剤として製剤化される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
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