JP2021520405A - 療法におけるｐ２ｒｘ７モジュレーター - Google Patents

Abstract

本発明は、式(I)の化合物、それらの鏡像異性体及び医薬として許容されるそれらの塩、並びに療法、詳細にはがん又は炎症性疾患の予防及び/又は治療のための、それらの使用に関する。

Description

本発明は、式(I)の化合物、それらの鏡像異性体及び医薬として許容されるそれらの塩、並びに療法における、詳細にはがん又は炎症性疾患の予防及び/又は治療のための、それらの使用に関する。

炎症は、重要な防御的応答であり、炎症を損傷修復及び再生に関連付ける機構のほとんどが進化の内に保存されている(Karin, M.及びClevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature、2016. 529: 307〜315頁)。炎症は、微調整された応答であり、この応答の撹乱は、多くの慢性疾患及び変性疾患へと至らせる。特に興味深いことに、疫学的研究が、慢性的炎症とがんとの関連を強調している。この関連では、現存する治療の長期の有効性の観点において、炎症及び帰着する病理を治療するための新規な方策の開発が喫緊に求められている。

正常な細胞の死又は腫瘍細胞は、危険に関連する分子パターン(DAMP)、例えばATPを生成し、これは、通常、細胞内に存在する。P2Xファミリーからのプリン作動性受容体は、3種のタンパク質モノマーにより形成されたATP依存性カチオンチャネルである。7種の受容体メンバーの中で、受容体P2X7(遺伝子P2RX7によりコードされている)が、細胞外ATPが豊富な微小環境中で大細孔の形成及び最終的に細胞死を媒介する潜在力を有する唯一のものである。P2RX7は、免疫細胞及び非免疫細胞によって発現される。

微調整された炎症性応答を確立するP2RX7の潜在力は、既に注目されていた。更に、大腸炎に関連するがんのin situマウスモデルにおいて腫瘍発生を増大させるP2RX7アンタゴニストの能力が示された(Cesaro, A.ら、Amplification loop of the inflammatory process is induced by P2X7R activation in intestinal epithelial cells in response to neutrophil transepithelial migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol、2010. 299(1): G32〜42頁; Hofman, P.ら、Genetic and Pharmacological Inactivation of the Purinergic P2RX7 Receptor Dampens Inflammation but Increases Tumor Incidence in a Mouse Model of Colitis-Associated Cancer. Cancer Res、2015)。

それ以外に、慢性炎症又はがんに対する現存治療のほとんどは、免疫細胞応答の調節を緩和する。

ここ十年間、免疫療法(抗PD-1、抗PD-L1又は抗CTLA-4抗体)は、黒色腫及び肺がん(NLSCC)の治療を改革した(Sharma, P.及びJ.P. Allison、The future of immune checkpoint therapy. Science、2015. 348(6230): 56〜61頁)。これらの療法は、腫瘍微小環境(TME)内で、T細胞応答を増幅させて免疫抑制を低減させる免疫チェックポイントを、逆転させる。しかしながら、高PD-L1発現レベルを有する何人かの患者は、治療に抵抗性である(McLaughlin, J.ら、Quantitative Assessment of the Heterogeneity of PD-L1 Expression in Non-Small-Cell Lung Cancer. JAMA Oncol、2016. 2(1): 46〜54頁)。Tリンパ球の抗腫瘍活性はまた、TME内で誘起された骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)によって鈍らされる(Anderson, K.G.、I.M. Stromnes及びP.D. Greenberg、Obstacles Posed by the Tumor Microenvironment to T cell Activity: A Case for Synergistic Therapies. Cancer Cell、2017. 31(3): 311〜325頁)。

Karin, M.及びClevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration、Nature、2016. 529: 307〜315頁 Cesaro, A.ら、Amplification loop of the inflammatory process is induced by P2X7R activation in intestinal epithelial cells in response to neutrophil transepithelial migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol、2010. 299(1): G32〜42頁 Hofman, P.ら、Genetic and Pharmacological Inactivation of the Purinergic P2RX7 Receptor Dampens Inflammation but Increases Tumor Incidence in a Mouse Model of Colitis-Associated Cancer. Cancer Res、2015 Sharma, P.及びJ.P. Allison、The future of immune checkpoint therapy. Science、2015. 348(6230): 56〜61頁 McLaughlin, J.ら、Quantitative Assessment of the Heterogeneity of PD-L1 Expression in Non-Small-Cell Lung Cancer. JAMA Oncol、2016. 2(1): 46〜54頁 Anderson, K.G.、I.M. Stromnes及びP.D. Greenberg、Obstacles Posed by the Tumor Microenvironment to T cell Activity: A Case for Synergistic Therapies. Cancer Cell、2017. 31(3): 311〜325頁 Marques, C.C.ら、Prophylactic systemic P2X7 receptor blockade prevents experimental colitis. Biochim Biophys Acta、2014. 1842(1):65〜78頁

したがって、免疫抑制の全ての役割物を標的とする新規な免疫療法の開発への必要性が存在する。更に、腫瘍の免疫原性を再活性化させうる、及び/又は患者の免疫系を修復させうる、有効な療法への必要性も存在する。

本発明は、これらの必要性を解決することを目的とし、本発明は、P2RX7モジュレーターであり、慢性炎症性疾患とがんとの両方を治療するのに使用されうる化合物に関する。

驚くべきことに、発明者らは、前記化合物が、細胞外ATPの存在下で、P2RX7を増強させること、及び機能的な抗腫瘍T細胞応答を修復できることを発見した。それ以外に、発明者らは、前記化合物が、腫瘍の免疫原性を増大させることによって腫瘍細胞に直接作用することと、免疫抑制細胞の浸潤を低減させることによって腫瘍の微小環境に直接作用することとの両方であることを更に発見した。

興味深いことに、発明者らは、前記化合物がまた、結腸炎症のマウスモデルにおいて、炎症の臨床的徴候を低減するために有効であることも認めた。

そのため、予期せぬことに、前記分子は、炎症性疾患とがんとの両方を治療できることがありうる。

本発明は、したがって、式(I):

(式中、
R1は、C1〜C14アルキル、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表し、ここで、前記アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基は、非置換であり、又は
- ハロゲン原子、
- C1〜C6アルコキシ基、
- C1〜C6アルキル基、及び
- C1〜C6ハロゲノアルキル基
から選ばれる少なくとも1つの基で置換されており、
R2は、アリール基、アラルキル基又はシクロアルキル基を表し、ここで、前記アリール基又は前記アラルキル基は、非置換であり、又はハロゲン原子から選ばれる少なくとも1つの基で置換されている)
の化合物、それらの鏡像異性体及び医薬として許容されるそれらの塩から選ばれる化合物に関する。

好ましくは、本発明の化合物は、以下の化合物:

とは異なる。

好ましくは、[式(I)又は式(II)の]本発明の化合物は、R1及びR2がそれぞれ同時に、非置換フェニルを表さないようなものである。

好ましくは、[式(I)又は式(II)の]本発明の化合物は、R1及びR2がそれぞれ同時に、以下のヘテロアリール基:

を表さないようなものである。前記ヘテロアリール基は、クロモン基である。

好ましくは、本発明の化合物は、式(I'):

(式中、R1は、C1〜C14アルキル、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表し、ここで、前記アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基は、非置換であり、又は
- ハロゲン原子、
- C1〜C6アルコキシ基、
- C1〜C6アルキル基、及び
- C1〜C6ハロゲノアルキル基
から選ばれる少なくとも1つの基で置換されている)
の化合物、それらの鏡像異性体及び医薬として許容されるそれらの塩から選ばれる。

好ましくは、式(I)の化合物は、鏡像異性体(S)であり、鏡像異性体(S)は、以下の式(II):

(式中、R1及びR2は、上で定義した通りである)
を有する。

より好ましくは、本発明の化合物は、以下の式(II'):

(式中、R1は、上で定義した通りである)
を有する。

「医薬として許容される塩」は、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、又は酢酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、乳酸、リンゴ酸、シュウ酸、フマル酸、メタンスルホン酸等の有機酸を使用して調製される任意の塩を意味する。

ハロゲン原子は、好ましくはF、Br、I及びClから選ばれ、より好ましくはClである。

「C1〜C14アルキル」は、1〜14個の炭素原子、特定すると1〜12個の炭素原子を含む直鎖状の炭化水素基、又は3〜6個の炭素原子を含む分枝状の炭化水素基を意味する。C1〜C14アルキル基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、n-ヘキシル及びドデシルが挙げられ、好ましくは、メチル、n-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル、n-ドデシル、イソプロピル又はtert-ブチルが挙げられる。

同様に、「C1〜C6アルキル」は、1〜6個の炭素原子を含む直鎖状の炭化水素基、又は3〜6個の炭素原子を含む分枝状の炭化水素基を意味する。C1〜C6アルキル基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル及びn-ヘキシルが挙げられ、好ましくはメチル、n-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル、イソプロピル又はtert-ブチルが挙げられる。

「C1〜C6アルコキシ」は、アルキル部分がC1〜C6アルキルである-O-アルキル基を意味する。好ましくは、C1〜C6アルコキシは、メトキシである。

「C1〜C6ハロゲノアルキル」は、少なくとも1つのその水素原子において1個又は複数のハロゲン原子により置換されているC1〜C6アルキルを意味する。

好ましくは、C1〜C6ハロゲノアルキルは、トリフルオロメチルである。

「シクロアルキル」は、1〜12個の炭素原子を含む環状飽和炭化水素基を意味する。好ましくは、シクロアルキルは、シクロヘキシルメチル、アダマンチル及びシクロヘキシルから選ばれる。

「アリール」は、任意選択で置換されていてもよい単環式又は多環式の芳香族炭化水素基を意味する。好ましくは、アリール基は、フェニルである。それはまた、ビフェニルであってもよい。アリールは、非置換であってもよく、又は少なくとも1個のハロゲン原子、1つのC1〜C6アルコキシ基及び/若しくは1つのC1〜C6ハロゲノアルキル基で置換されていてもよい。

好ましくは、アリール基は、2-クロロフェニル、4-クロロフェニル、2-ブロモフェニル、2-ヨードフェニル、2,4-ジクロロフェニル、3,4-ジクロロフェニル、2,4-ジメトキシフェニル、3-トリフルオロメチルフェニル、3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル又は2,4,6-トリメチルフェニルである。

「アラルキル」は、アルキル基によって式(I)の残りの部分に結合しているアリール基を意味する。アラルキルは、非置換であってもよく、又は少なくとも1個のハロゲン原子、1つのC1〜C6アルコキシ基、1つのC1〜C6アルキル基若しくは1つのC1〜C6ハロゲノアルキル基により置換されていてもよい。
好ましくは、アラルキルは、置換されている又は非置換の、ベンジル又はフェネチルである。

好ましくは、アラルキルは、ベンジル、2-クロロベンジル、2,4-ジクロロベンジル、3,4-ジクロロベンジル及び2,4-ジクロロフェネチルから選ばれる。

「ヘテロアリール」は、芳香環の少なくとも1個の炭素原子がヘテロ原子により置換されているアリール基を意味し、これは任意選択で置換されていてもよい。ヘテロ原子は、窒素、酸素、リン又は硫黄でありうる。好ましくは、ヘテロ原子は、窒素である。ヘテロアリール基の例には、ピリジン、ピロール、チオフェン、フラン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、イミダゾール、チアゾール、オキサゾール及びイソオキサゾールが挙げられる。

好ましくは、ヘテロアリール基は、2-又は3-ピリジノ等のピリジン基である。ヘテロアリールは、非置換であってもよく、又は少なくとも1個のハロゲン原子、1つのC1〜C6アルコキシ基及び/若しくは1つのC1〜C6ハロゲノアルキル基により置換されていてもよい。

好ましくは、ヘテロアリール基は、6-クロロピリジン-3-イル又はチオフェン-2-イルである。

より好ましくは、本発明の化合物は、以下の化合物[すなわち全ての鏡像異性体(S)]、及び医薬として許容されるそれらの塩から選ばれる:

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2314と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2328と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2333と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2336と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 3090と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2347と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2346と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2269と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2298と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2535と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2541と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2534と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2542と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2537と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2538と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2315と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2329と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2339と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2761と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2760と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2759と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2331と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2338と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2337と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2278と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2817と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2820と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2548と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 2773と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 3127と呼ばれる)

(この化合物は、本発明の実施例においてHEI 3204と呼ばれる)。

これらの実施例に示されている通り、本発明の化合物は、P2RX7モジュレーターである。それらは、ATPの存在下で、P2RX7の作用を増強する。

そのため、本発明は、P2RX7モジュレーターの、好ましくはATPの存在下でP2RX7の作用を増強するP2RX7化合物の、炎症性疾患及び/又はがんを予防する及び/又は治療するための使用に、更に関する。

「P2RX7モジュレーター」は、ATPの存在下、大きい開孔を介して細胞死を誘起することができる化合物を意味する。「ATP」は、それ自体、ATP(アデノシン三リン酸)を意味するが、その誘導体、特にそのベンゾフェノン誘導体、例えばBzATP(3'-O-(4-ベンゾイル)ベンゾイルATP)も意味する。好ましくは、P2RX7モジュレーターは、短い刺激(例えば5〜15分)後に、P2RX7チャネル活性(すなわち、Ca²⁺及び/又はTopro3等の染料の侵入)を増加させて、より長い刺激(例えば1時間)で大きい開孔を介して細胞死を誘起することができる。所与の化合物がP2RX7モジュレーターであるかどうかを決定するために用いられうる試験は、図2、図14及び図15、並びに実施例2、研究2に記載されている。前記試験は、以下の通り簡単にまとめられる:
P2X受容体のうちのいずれも発現しない培養細胞を、mP2rx7遺伝子についてコードした発現ベクターでトランスフェクトする。大きい開孔を、細胞死を測定するのに適切なプローブ(例えばインビトロゲンからのTopro3)でアッセイする。各実験において、試験化合物の存在下、細胞をBzATP(3'-O-(4-ベンゾイル)ベンゾイルATP)で処置する、又は処置しない。示されているとき、細胞死を測定するのに適切なプローブ(例えばTopro3)を添加する。
蛍光をフローサイトメトリーによりアッセイする。
各化合物を、BzATPの不在下又は存在下で試験する。
試験化合物が、BzATPの存在下で、BzATP単独と比較して、更に試験化合物単独と比較して、大きい開孔(すなわち細胞死)を有意に増加させる場合、その試験化合物はP2RX7モジュレーターである。

例えば、式(I)の[特に式(I')の]化合物はP2RX7モジュレーターであり、その理由は、それらが、ATPの存在下で、大きい開孔におけるP2RX7の効果を増強し、それにより細胞死を引き起こすためである。好ましくは、それらは、ATPの存在下で、Ca²⁺侵入及び大きい開孔におけるP2RX7の効果を増強する。

ヒトP2RX7タンパク質は、UniProtにおいて受け入れ番号Q99572で入手可能である。

好ましくは、本発明による式(I)の化合物は、P2RX7のアゴニストである。P2RX7の「アゴニスト」は、P2RX7に結合し、前記P2RX7を活性化させて生物学的応答を生成する化合物を意味する。アゴニストの効能は、そのEC₅₀値と反比例する。EC₅₀は、所与のアゴニストについて、アゴニストの最大の生物学的応答の半分を誘発するのに必要なアゴニストの濃度を決定することによって測定することができる。

本発明の化合物の調製
本発明による式(I)[及び(I')、(II)、(II')]の化合物は、実行しやすい方法によって調製することができる。前記方法は、以下の通りであり、実施例1に示す通りである:
5-オキソピロリジン-2-カルボキサミド誘導体又は5-オキソピロリジン-3-カルボキサミド誘導体[及び、特に式(II')の事例では、N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-(2S)-カルボキサミド]と、対応するイソシアネートとのトルエン等溶媒中混合物を、窒素雰囲気下、還流下で、いくらかの時間(例えば1〜24時間)撹拌した。

反応スキームは以下の通りである:

好ましくは、式(I')の化合物を得るための反応スキームは、以下の通りである:

より好ましくは、式(II')の化合物[すなわち(S)鏡像異性体]を得るための反応スキームは、以下の通りである:

次いで、得られた混合物を、例えば、メタノール(MeOH)中又はシリカカラムにおいて、直接の結晶化によって精製して、純粋な化合物を得ることができる。

本発明の化合物の療法上の適用
上で説明した通り、更に実施例で示す通り、発明者らは、本発明の化合物が療法において有用であることを明示した。

そのため、本発明はまた、少なくとも1種の式(I)の化合物、好ましくは少なくとも1種の式(I')、(II)若しくは(II')の化合物、その鏡像異性体又は医薬として許容されるその塩の、医薬としての使用にも関する。

詳細には、式(I)の化合物[好ましくは式(I')、(II)若しくは(II')の化合物]、それらの鏡像異性体及び/又は医薬として許容されるそれらの塩は、炎症性疾患及び/又はがんを予防する及び/又は治療するために使用することができる。

「治療」は、それぞれ、炎症性疾患又はがんの治癒的な治療を意味する。治癒的な治療は、それぞれ、炎症性疾患又はがんを完全に治療する(治癒させる)又は部分的に治療する(すなわち、腫瘍増殖の安定化、遅延又は退化を誘起する)、治療であると定義される。

本発明はまた、
a)式(I)の化合物[好ましくは式(I')、(II)若しくは(II')の化合物]、それらの鏡像異性体及び医薬として許容されるそれらの塩から選ばれる少なくとも1種の化合物と、
b)少なくとも1種の付加的な療法と
を含む、がんの治療及び/又は予防における、同時の、別々の又は順次の使用のための併用製品としての製品にも関する。

本発明はまた、少なくとも1種の式(I)の化合物、好ましくは少なくとも1種の式(I')、(II)若しくは(II')の化合物、その鏡像異性体又は医薬として許容されるその塩の、少なくとも1種の付加的な療法との併用における又はそれに伴う、がんを予防する及び/又は治療するための、使用にも関する。

本発明は更に、少なくとも1種の式(I)の化合物、好ましくは少なくとも1種の式(I')、(II)若しくは(II')の化合物、その鏡像異性体又は医薬として許容されるその塩の、少なくとも1種の付加的な療法により治療される対象においてがんを予防する及び/又は治療するための、使用にも関する。用語「対象」は、任意の対象を指し、典型的には患者、具体的には、免疫療法、化学療法及び/又は放射線療法等のがんの治療を受けている対象を指す。

本発明はまた、がん補助療法としての使用のための、式(I)の化合物[好ましくは式(I')、(II)若しくは(II')の化合物]、それらの鏡像異性体及び医薬として許容されるそれらの塩から選ばれる少なくとも1種の化合物にも関する。補助療法は、その有効性を最大化するために、第1の又は初期の療法以外に付与される(本明細書では「付加的な療法」と呼ばれる)、がんを治療するための療法である。

前記付加的な療法b)は、免疫療法、化学療法及び/又は放射線療法でありうる。好ましくは付加的な療法b)は、免疫療法及び/又は化学療法である。

「免疫療法」は、免疫応答を、誘起する、強化する又は抑制することができる療法を意味する。前記免疫療法は、好ましくは、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、増殖抑制因子、ホルモン、可溶性受容体、デコイ受容体;モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体、モノボディ、ポリボディ;ワクチン接種;又は養子特異性免疫療法から選ばれる。

好ましくは、免疫療法は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体、モノボディ、ポリボディ、例えばベバクジマブ(Bevacuzimab)(mAb、VEGF-Aを抑制、GeneTech社);IMC-1121B(mAb、VEGFR-2を抑制、ImClone Systems社);CDP-791(ペグ化DiFab、VEGFR-2、Celltech社);2C3(mAb、VEGF-A、Peregrine Pharmaceuticals社); VEGF-trap[可溶性ハイブリッド受容体VEGF-A、PIGF(プラセンタ増殖因子)、Aventis/Regeneron社]のような抗血管新生剤から選ばれる。

好ましくは、免疫療法は、モノクローナル抗体、好ましくは抗チェックポイント抗体である。

抗チェックポイント抗体は、免疫チェックポイントに対して向けた抗体を含み、これは、PD1、PDL1、PDL2、CTLA4、BTLA、CD27、CD40、OX40、GITR(「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー18(「Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18)」又は「TNFRSF18」とも呼ばれる)、CD137(4-1BB又はTNFRS9とも呼ばれる)、CD28、ICOS、IDO(インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ)、B7H3(CD276とも呼ばれる)、KIR2DL2(キラー細胞免疫グロブリン様受容体2DL2とも呼ばれる)、NKG2(C-タイプのレクチン受容体のファミリー)、LAG3[リンパ球活性化遺伝子-3(Lymphocyte Activation Gene-3)とも呼ばれる]及びCD70から選ぶことができる。好ましくは、抗チェックポイント抗体は、抗PD1、抗PDL1、抗PDL2又は抗CTLA4抗体である。抗PD1抗体には、ニボルマブ及びペンブロリズマブが挙げられる。抗CTLA4抗体には、イピリムマブ及びトレメリムマブが挙げられる。

好ましくは、本発明はまた、
a)式(I)の化合物[好ましくは式(I')、(II)若しくは(II')の化合物]、それらの鏡像異性体及び医薬として許容されるそれらの塩から選ばれる少なくとも1種の化合物と、
b)抗チェックポイント抗体から選ばれる、好ましくは抗PD1抗体から選ばれる、より好ましくはニボルマブ及びペンブロリズマブから選ばれる少なくとも1種の付加的な療法と
を含む、
がんの治療及び/又は予防における、同時の、別々の又は順次の使用のための併用製品としての、製品にも関する。

「化学療法」又は「化学療法剤」は、がんの治療において使用され、ヒトにおける新生物、具体的には悪性の(がんの)病変の発現又は進行を抑制する機能的性質を有する、化合物を指す。化学療法剤は、例えば、DNA又はRNAのいずれかに影響して細胞周期複製に干渉することによる、異なる作用モードを有する。

DNAレベルにて又はRNAレベル上で作用する化学療法剤の例は、以下である:
- 抗代謝剤、例えばアザチオプリン、シタラビン、リン酸フルダラビン、フルダラビン、ゲムシタビン、シタラビン、クラドリビン、カペシタビン6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、メトトレキセート、5-フルオロウラシル及びヒドロキシ尿素、
- アルキル化剤、例えばメルファラン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、イフォスファミド、デカラバジン、フォテムスチン、プロカルバジン、クロラムブシル、チオテパ、ロムスチン、テモゾロミド、
- 抗有糸分裂剤、例えばビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドセタキセル、パクリタクセル、
- トポイソメラーゼ阻害剤、例えばドキソルビンシン、アムサクリン、イリノテカン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトマイシン、ミトキサントロン、イダルビシン、テニポシド、エトポシド、トポテカン、
- 抗生物質、例えばアクチノマイシン及びブレオマイシン、
- アスパラギナーゼ、
- アントラシクリン又はタキサン。

他の化学療法剤は、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)である。いくつかのTKIが、様々なタイプのがんの治療のために、開発の後期段階及び初期段階にある。例示的なTKIには以下が挙げられるがこれらに限定されない: BAY 43-9006(ソラフェニブ、Nexavar(登録商標))及びSU11248 (スニチニブ、Sutent(登録商標))、イマチニブメシル酸塩(Gleevec(登録商標)、Novartis社)、ゲフィチニブ(Iressa(登録商標)、AstraZeneca社)、エルロチニブ塩酸塩(Tarceva(登録商標)、Genentech社)、バンデタニブ(Zactima(登録商標)、AstraZeneca社)、チピファルニブ(Zarnestra(登録商標)、Janssen-Cilag社)、ダサチニブ(Sprycel(登録商標)、Bristol Myers Squibb社)、Lonafarnib (Sarasar(登録商標)、Schering Plough社)、バタラニブコハク酸塩(Novartis社、Schering AG社)、ラパチニブ(Tykerb(登録商標)、GlaxoSmithKline社)、ニロチニブ(Novartis社)、レスタウルチニブ(Cephalon社)、パゾパニブ塩酸塩(GlaxoSmithKline社)、アキシチニブ(Pfizer社)、カネルチニブ二塩酸塩(Pfizer社)、ペリチニブ(米国国立がん研究所、Wyeth社)、タンズチニブ(Millennium社)、ボスチニブ(Wyeth社)、セマキサニブ(Sugen社、大鵬薬品工業株式会社)、AZD-2171(AstraZeneca社)、VX-680(Merck社、Vertex社)、EXEL-0999(Exelixis社)、ARRY-142886(Array BioPharma社、AstraZeneca社)、PD-0325901(Pfizer社)、AMG-706(Amgen社)、BIBF-1120(Boehringer Ingelheim社)、SU-6668(大鵬薬品工業株式会社)、CP-547632(OSI社)、(AEE-788(Novartis社)、BMS-582664(Bristol-Myers Squibb社)、JNK-401(Celgene社)、R-788(Rigel社)、AZD-1152 HQPA(AstraZeneca社)、NM-3(Genzyme Oncology社)、CP-868596(Pfizer社)、BMS-599626(Bristol-Myers Squibb社)、PTC-299(PTC Therapeutics社)、ABT-869(Abbott社)、EXEL-2880(Exelixis社)、AG-024322(Pfizer社)、XL-820(Exelixis社)、OSI-930(OSI社)、XL-184(Exelixis社)、KRN-951(Kirin Brewery社)、CP-724714(OSI社)、E-7080(エーザイ株式会社)、HKI-272(Wyeth社)、CHIR-258(Chiron社)、ZK-304709(Schering AG社)、EXEL-7647(Exelixis社)、BAY-57-9352(Bayer社)、BIBW-2992(Boehringer Ingelheim社)、AV-412(AVEO社)、YN-968D1(Advenchen Laboratories社)、スタウロスポリン、ミドスタウリン(PKC412、Novartis社)、ペリフォシン(AEterna Zentaris社、Keryx社、米国国立がん研究所)、AG-024322(Pfizer社)、AZD-1152(AstraZeneca社)、ON-01910Na(Onconova社)及びAZD-0530(AstraZeneca社)。

炎症性疾患は、好ましくは慢性炎症性疾患であり、関節リウマチ、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)、変形性関節症、骨粗鬆症、皮膚炎、乾癬、ぜんそく、呼吸促迫症候群及び慢性閉塞性肺疾患(COPD)から選ぶことができる。

がんは、例えば、結腸がん、結腸直腸がん、黒色腫、乳がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、膵がん、グリオーマ、子宮頸がん、子宮内膜がん、頭頚部がん、肝がん、腎がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、尿路上皮がん又は副腎皮質癌から選択されるが、リンパ腫等の非固形がんからも選択される。

がんは、転移性がんでもそうでなくてもよい。がんは、免疫療法に感受性であってもそうでなくてもよい。好ましくは、がんは、肺がん、好ましくはルイス肺ガンである。

本明細書で記載するのはまた、有効量の、上で定義した式(I)の少なくとも1種の化合物、好ましくは式(I')、(II)又は(II')の少なくとも1種の化合物、その鏡像異性体又は医薬として許与されるその塩を、それを必要としている対象に投与することを含む、がんを予防する及び/又は治療する方法である。

用語「対象」は、任意の対象を指し、典型的には患者、具体的には、免疫療法、化学療法及び/若しくは放射線療法等のがんの治療を受けている対象、又はがんを発症するリスクにある対象、若しくはがんを発症するリスクにあるという疑いのある対象を指す。

本明細書で記載するのはまた、有効量の、上で定義した式(I)の少なくとも1種の化合物、好ましくは式(I')、(II)若しくは(II')の少なくとも1種の化合物、その鏡像異性体又は医薬として許与されるその塩を、それを必要としている対象に投与することを含む、炎症性疾患を予防する及び/又は治療する方法でもある。

用語「対象」は、任意の対象を指し、典型的には患者、具体的には、炎症性疾患の治療を受けている対象、又は炎症性疾患を発症するリスクにある対象、若しくは炎症性疾患を発症するリスクにあるという疑いのある対象を指す。

いずれの事例においても、対象は、好ましくは哺乳動物であり、更により好ましくはヒトであり、例えばがん又は炎症性疾患に罹っているヒトである。

本発明の化合物は、好ましくは、治療に有効な量又は用量で投与される。本明細書で使用されるとき、「治療に有効な量又は用量」は、がん若しくは炎症性疾患を予防する、除去する、鈍化させる、又は対象における、好ましくはヒトにおける、前記疾患により引き起こされた若しくは前記疾患に伴う1つ又はいくつかの徴候若しくは障害を低減する若しくは遅延させる、本発明の化合物の量を指す。本発明の化合物及びその医薬組成物の有効量、より一般には用量レジメンは、当業者によって決定され適合されてもよい。有効用量は、従来技術の使用によって、及び類似の状況下で得られた結果を観察することによって、決定することができる。本発明の化合物の治療有効用量は、治療される又は予防される疾患、その重大さ、投与経路、含まれる任意の共療法、患者の年齢、体重、全身の病状、医療履歴等に応じて変わるであろう。

典型的には、患者に投与される化合物の量は、ヒトの患者について約0.01〜500mg/体重kgの範囲であってよい。特定の実施形態では、本発明による医薬組成物は、0.01mg/kg〜300mg/kg、好ましくは0.01〜3mg/kg、例としては25〜300mg/kgの本発明の化合物を含む。

特定の態様では、本発明の化合物は、対象に、非経口経路、局所経路、経口経路又は静脈内注射によって投与することができる。本発明の化合物又はナノ粒子は、対象に、何日かの連続した日の間、例えば2〜10日の連続した日の間、好ましくは3〜6日の連続した日の間、毎日(例えば1日に1、2、3、4、5、6又は7回)投与されてもよい。前記治療は、1、2、3、4、5、6若しくは7週の間、又は2若しくは3週ごとに、又は1、2若しくは3か月ごとに繰り返されてもよい。或いは、任意選択で2つの治療サイクルの間の中断期間、例としては1、2、3、4又は5週の中断期間を伴って、いくつかの治療サイクルを実施することができる。本発明の化合物又はナノ粒子は、例えば、1週に1回、2週ごとに1回、又は1か月に1回の単回用量として投与することができる。この治療は、1年当たり1回又は数回繰り返されてもよい。

用量は、当業者によって決定されうる適当な間隔で投与される。選ばれる量は、投与経路、投与期間、投与時間、式(I)の選択された化合物の消失速度、又は前記化合物との併用で使用される様々な製品の消失速度、患者の年齢、体重及び健康状態、及び患者の医療履歴、並びに内科的治療において既知の任意の他の情報を含む、複数の要因に依存するであろう。

投与経路は、経口、局所又は非経口、典型的には直腸、舌下、鼻腔内、腹腔内(IP)、静脈内(IV)、動脈内(IA)、筋肉内(IM)、小脳内、くも膜下腔内、腫瘍内及び/又は皮内であることができる。医薬組成物は、上に挙げた経路の1つ又はいくつかについて適合される。医薬組成物は、注射によって、若しくは好適な無菌溶液の静脈内注入によって、又は消化管を介した液体若しくは固体用量の形態において、好ましくは投与される。

本発明の別の目的は、医薬として許容される担体中に、式(I)の少なくとも1種の化合物、好ましくは式(I')、(II)若しくは(II')の少なくとも1種の化合物、その鏡像異性体又は医薬として許容されるその塩を含む組成物である。

担体は、製剤の他の成分と適合性があるという意味において「許容される」ものでなければならず、そのレシピエントに有害でないものでなければならない。

医薬組成物は、おそらくは徐放性放出及び/又は遅延放出を付与する剤形又はデバイスを通して、医薬として適合性のある溶媒中の溶液として、又はゲル、油、エマルション、サスペンション、若しくは好適な医薬溶媒若しくはビヒクル中の分散体として、又は当技術分野で既知の方法において固体ビヒクルを含有する丸剤、錠剤、カプセル剤、粉末剤、坐剤等として、製剤化することができる。このタイプの製剤について、セルロース、脂質、カーボネート又はデンプン等の作用剤が有利には使用される。

製剤(液体及び/又は注射用及び/又は固体)中で使用されうる作用剤又はビヒクルは、賦形剤又は不活性ビヒクル、すなわち医薬として不活性で非毒性のビヒクルである。例えば、医薬上の使用と適合性があり当業者に既知である食塩水、生理学的な、等張性の及び/又は緩衝化の溶液を挙げることができる。組成物は、分散剤、可溶化剤、安定剤、保存剤等から選ばれる1種又は複数の作用剤又ビヒクルを含有してもよい。

特定の例は、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリン、ポリソルベート80、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、リポソーム、植物油又は動物油、アカシア等である。好ましくは、植物油が使用される。

経口投与に好適な本発明の製剤は、それぞれが所与の量の有効成分を含有するカプセル剤、サッシェ剤、錠剤若しくはロゼンジのような個別の単位の形態、粉末若しくは顆粒の形態、水性液体若しくは非水性液体中の溶液若しくはサスペンションの形態、又は水中油エマルション若しくは油中水エマルションの形態にあってもよい。

非経口投与に好適な製剤は、レシピエントの血液と好ましくは等張性である有効成分の、無菌の油性又は水性の調製物を、好都合には含む。このような各製剤はまた、他の医薬として適合性があり非毒性の補助剤、例えば安定剤、抗酸化剤、結合剤、染料、懸濁剤又は芳香性物質を含有しうる。

本出願において使用される図は、以下のものであり、これらは例示の目的のみで役立つ。

HEI2314及びHEI2328は、マウスP2RX7を発現する異種性細胞系において、ATPの存在下で大きい開孔を増加させる。カルシウムチャネル活性(Fluo4AMプローブ)及び大きい開孔(Topro3プローブ)をmP2RX7 HEK細胞においてFACSにより分析した。細胞は刺激せず(NS)、又はBzATP(500μM)単独で、若しくはHEI2314、HEI2328、HEI2333若しくはHEI2336(50μMにおいて使用する)の存在下で処置した。各パネルは代表的な点のプロットを示し、赤色の数字は各サブパネルにおける陽性細胞の百分率を示した。 mP2RX7及びATPは、HEI2328への応答において大きい開孔を媒介するのに必要とされる。カルシウムチャネル活性(Fluo4AMプローブ)及び大きい開孔(Topro3プローブ)を模擬細胞及びmP2RX7 HEK細胞においてFACSにより分析した。細胞は刺激せず(NS)、又はBzATP(500μM)単独で若しくは50μMで使用するHEI2328の存在下で処置した。各パネルは代表的な点のプロットを示し、赤色の数字は各サブパネルにおける陽性細胞の百分率を示した。ヒストグラムは9つの独立した実験からの結果を示した。***、p<0.001(マン-ホイットニー検定)。 HEI2328は、in vivoで、DSS誘起の大腸炎を有意に寛解させる。(A)5日の間(J1〜J5)に、3%DSSで処置し、続いて10日間通常の水道水で処置したC57BL/6Jからの体重減少及び(B)臨床スコア。処置群は、HEI2328(腹腔内、PBS中2.3mg/kg、10%DMSO)を受けた。データは2つの独立した実験(n=20)を表す。平均±SEMを示す。*、p<0.05;**、p<0.01(マン-ホイットニー検定)。 HEI2328は、DSS処置マウスの結腸における炎症性病変を有意に減少させる。炎症指数を、結腸の縦断断面(A)及び横断断面(B)においてスコア付けした。データは2つの独立した実験(n=20)を表す。平均±SEMを示す。*、p<0.05;**、p<0.01(マン-ホイットニー検定)。 HEI2328は脾臓内の炎症性単球の割合を低減させる。(A〜D)HEI2328で処置した、又は非処置の、20頭のマウスの脾臓における免疫細胞の表現型分析。データは2つの独立した実験(n=20)を表す。平均±SEMを示す。*、p<0.05;**、p<0.01(マン-ホイットニー検定)。 HEI2328は、B16F10黒色腫細胞株において、ATPの存在下で大きい開孔を増加させる。カルシウムチャネル活性(Fluo4AMプローブ)及び大きい開孔(Topro3プローブ)をFACSにより分析した。非刺激の(NS)、又はHEI2328(50μM)単独で若しくはBzATP(500μM)で処置した細胞を分析した。(A)点のプロットを表す。数字は陽性細胞の百分率を強調した。(B)ヒストグラムは3つの独立した実験からの結果を示した。*、p<0.05(マン-ホイットニー検定)。 HEI2328は、in vivoで、腫瘍増殖を減少させた。5×10⁵個のB16F10細胞をC57BL/6マウスの右脇腹に皮下注射した。マウスはHEI2328(n=8、腹腔内、10%DMSO/PBS中2.3mg/kg)を毎日受け、又はプラセボ(n=8、10%DMSO/PBS)を受けた。A.腫瘍出現の発生率、B.腫瘍サイズ(mm²)、及びC.犠牲にした日(J12)における腫瘍重量。*、p<0.05 (マン-ホイットニー検定)。 HEI3090は、BzATPの存在下で大きい開孔を増加させた。A.対照からの又はp2rx7^{exon2 KO}マウスからの脾細胞を単離し、BzATP(500μM)の存在下又は不在下でHEI3090(50μM)で処置した。B.ヒトP2RX7発現細胞における、HEI3090の存在下又は不在下でBzATPの濃度を上げることによって誘起された大きい開孔。 HEI3090は、BzATPの存在下でB16F10細胞死を誘起した。A.大きい開孔。代表的な実験の点のプロット。数字は陽性細胞の百分率を強調した。ヒストグラムは3つの独立した実験からの結果を示す。*、p<0.05 マン-ホイットニー検定。B.経時的なXTT吸光度の代表的な曲線。ヒストグラムは死細胞の百分率を示した。平均±SEMを示す。***、p<0.001;****、p<0.0001 マン-ホイットニー検定。 HEI3090は、マウスにおける効能のある腫瘍サプレッサーである。5×10⁵個のLLC細胞又は5×10⁵個のB16F10細胞をC57BL/6マウスの右脇腹に皮下注射した。マウスはHEI3090を毎日受け(腹腔内、10%DMSO/PBS中2.5mg/kg)、又はプラセボ(10%DMSO/PBS)を受けた。A、C.腫瘍出現の発生率。B、D.犠牲にした日(J12)の腫瘍サイズ(mm²)及び腫瘍重量。E.HEIで処置した腫瘍は、より免疫原性である。LLC(黒色)腫瘍及びB16-F10(灰色)腫瘍によるCMH1(H2K^b/D^b)及びPD-L1の発現を点のプロットで示す。数字は、H2K^b/D^b及びPD-L1に陽性の腫瘍細胞の百分率を強調した。ヒストグラムは、平均±SEMを示した。F.CD-45陽性の浸潤が、LLC腫瘍及びB16F10腫瘍において増加する。*、p<0.05;**、p<0.01;***、p<0.001 マン-ホイットニー検定。 HEI3090で変更した腫瘍は、免疫抑制の低い環境に向かって浸潤する。5×10⁵個のLLC細胞又は5×10⁵個のB16F10細胞をC57BL/6マウスの右脇腹に皮下注射した。マウスはHEI3090を毎日受け(腹腔内、10%DMSO/PBS中2.5mg/kg)、又はプラセボ(10%DMSO/PBS)を受けた。A.免疫抑制細胞の量は減少する。代表的な実験の点のプロット。数字は、M-MDSC及びPMN-MDSCの百分率を強調した。ヒストグラムは、8頭のマウスからの結果を示した。B.エフェクターT細胞(Tγδ、NK、CD4⁺)の量は増加する。ヒストグラムは、8頭のマウスからの結果を示した。*、p<0.05;**、p<0.01 マン-ホイットニー検定。 T CD4⁺細胞は、HEI3090抗腫瘍効果を媒介するために部分的に必要である。5×10⁵個のLLC細胞をC57BL/6マウスの右脇腹に皮下注射した。マウスは、HEI3090単独で若しくは抗CD4抗体の存在下で毎日受け(腹腔内、10%DMSO/PBS中2.5mg/kg)、又はプラセボ(10%DMSO/PBS)を受けた。A.3つの群からの腫瘍増殖を毎日追跡した。B.犠牲にした日(J12)の腫瘍重量。*、p<0.05;****、p<0.0001(マン-ホイットニー検定)。 ADME(吸収、分布、代謝及び排泄)の研究A.HEI-2328及びHEI-3090は安定な分子である。BD Gentest社(参照番号5345001)からのマウス肝ミクロソームを、HEI-2314、HEI-2328、HEI-2333及びHEI-3090で、1μMで、0、5、10、20、30及び40分間インキュベートした。化合物の安定性を質量分析法によってアッセイした。B.HEI 3090は、腹腔内投与後18時間まで血漿内で見出される。HEI-3090(10%DMSO中0.166mg/mL)の腹腔内投与を実施し、血清を、0、10、20、30、0、60、120、240、360、1080及び1440分に採取した。血漿濃度をLC-MS/MSにより決定し、最大2.5μMに達した。 HEI-3090はマウスP2RX7の正のアロステリックモジュレーターである。カルシウム流入(Fluo-AM陽性細胞)及び大きいカチオン透過(Topro3陽性細胞)を、BzATPの増加用量で処置したマウスP2RX7でトランスフェクトしたHEK細胞を刺激した15分後にFACSによりアッセイした。HEI3090の存在下で、EC50は22%減少している。 HEI-3090は、ヒトP2RX7の正のアロステリックモジュレーターである。カルシウム流入(Fluo-AM陽性細胞)及び大きいカチオン透過(Topro3陽性細胞)を、7.8μM BzATPの存在下でHEI3090の増加用量で処置したヒトP2RX7でトランスフェクトしたHEK細胞を刺激した15分後に、FACSによりアッセイした。HEI3090の存在下で、Caと大きいカチオン流入との両方が3倍増加し、これは、分子が正のアロステリックモジュレーターであることを示している。 図１６．HEI3090は、P2RX7発現免疫細胞を刺激することによってその抗腫瘍効果を強化し、免疫原性細胞死(ICD)はなかった。a〜b.免疫原性細胞死の誘起物質としてのHEI3090の評価のためのin vivoアッセイ。B16-F10死を誘起するために、細胞を3mM ATP及び50μM HEI3090に曝露し、1.105の死にかけている細胞、又は対照としてのPBSを、右脇腹に皮下注射した(n=4)。7日後、0.5.105のB16-F10生存細胞を反対側の脇腹に皮下注射した(a)。曲線は、反対側の部位における腫瘍増殖の平均を示した(b)。(c〜f)p2rx7欠損マウス(p2rx7^-/-)における腫瘍増殖に対するHEI3090の効果。5.105のB16-F10(c)又は5.105のLLC(d)を、p2rx7^-/-マウスの脇腹に皮下注射した。マウスを、第1日から第12日まで、ビヒクル(PBS、10%DMSO)で又はHEI3090(PBS中1.5mg/kg、10%DMSO)で腹腔内処置した。(e、f)p2rx7^-/-マウスを、WT C57BL/6Jマウスからの5.106の脾細胞で養子移入し、5.105のLLCを脇腹に皮下注射した。次いで、マウスを、第1日から第12日まで、ビヒクル(PBS、10%DMSO)で又はHEI3090(PBS中1.5mg/kg、10%DMSO)で腹腔内処置した。 図１６の続き。 図１７。HEI3090は、NK細胞及びCD4⁺T細胞の有効な機能を刺激する(図12の補足的結果)。a、b.腫瘍浸潤性細胞の表現型フローサイトメトリー分析。LLC腫瘍を第12日に回収した。ビヒクル又はHEI3090で処置したマウスからのLLC腫瘍内の、CD45⁺の中のPMN-MDSCの割合(a)。PMN-MDSCにおける、NK、CD4⁺又はCD8⁺T細胞の比(b)。c、d. 5.105のLLCをC57BL6/Jマウスの脇腹に皮下注射した。次いで、マウスを、ビヒクル(PBS、10%DMSO)で、又はHEI3090(PBS中1.5mg/kg、10%DMSO)で、又はHEI3090で腹腔内処置し、NK1.1、CD4+又はCD8+T細胞に対して抗体を枯渇させた。抗体を3日ごとに腹腔内投与した(200μg/注射)。第12日での、スパゲッティプロット及び腫瘍重量(d)。各曲線は1頭のマウスを表す。e〜g 腫瘍浸潤性免疫細胞又は脾細胞の機能的フローサイトメトリー分析。腫瘍をPMA/イオノマイシンで刺激し、IFN-γ及びIL-10の生成を、CD45+、NK、CD4+又はCD8+T細胞において同時に分析した。グラフは、IFN-γ生成細胞の、CD45+細胞への割合、又は蛍光の相乗平均を示した(e)。TILへのIFN-γ及びIL-10染色の代表的な点のプロット(f)。各TILにおけるIL-10陽性細胞におけるIFN-γの比。ビヒクル又はHEI3090で処置したLLC腫瘍保持マウスからの脾細胞の脱顆粒アッセイ(g)。脾細胞をin vitroでLLCで再刺激し、NK、CD4+及びCD8+T細胞におけるCD107a陽性細胞を表した。 図１７の続き。 図１７の続き。 図１８。HEI3090はin vivoでIL-18の生成を誘起する。a.LLC腫瘍内の従来の樹状細胞CD4+又はCD8+の間のP2RX7発現のフローサイトメトリー分析。b.ELISAにより決定した、ビヒクル又はHEI3090で処置したLLC腫瘍保持マウスの血清におけるIL-1β及びIL-18のタンパク質レベル。c. 5.105のLLCをC57BL6/Jマウスの脇腹に皮下注射した。次いで、マウスを、ビヒクル(PBS、10%DMSO)で、又はHEI3090(PBS中1.5mg/kg、10%DMSO)で、又はHEI3090で腹腔内処置し、第1日から第12日に、IL-1β又はIL-18に対する抗体を中和した。抗体を3日ごとに腹腔内投与した(200μg/注射)。d. 腫瘍内NK、CD4+T又はCD8+T細胞のIFN-γ及びIL-10生成のフローサイトメトリー分析。グラフは、IL10陽性細胞におけるIFN-γの比を示す。e.IL-18欠損マウス(IL-18^-/-)の腫瘍増殖におけるHEI3090の効果。5.105のLLCをIL-18^-/-マウスの脇腹に皮下注射した。マウスを、第1日から第12日に、ビヒクル(PBS、10%DMSO)で、又はHEI3090(PBS中1.5mg/kg、10%DMSO)で腹腔内処置した。f.ビヒクルで処置したC57BL6/Jマウスからの4個のLLC腫瘍、及びHEI3090で処置したC57BL6/Jマウスからの4個のLLC腫瘍におけるIL-18 IHC染色。 図１８の続き。 図１８の続き。 図１９。HEI3090と抗PD-1免疫チェックポイント阻害剤との併用は、LLC腫瘍保持マウスを治癒させた(図10の補足的結果)。a.ビヒクル又はHEI3090で処置したマウスからのLLC腫瘍のCD45陰性細胞におけるMHC-I及びPD-L1発現のフローサイトメトリー分析。b〜g LLC腫瘍増殖に対するHEI3090及び抗PD-1チェックポイント阻害剤の効果。5.105のLLCをC57BL/6Jマウスの脇腹に皮下注射した。マウスを、第1日から第18日に、ビヒクル(PBS、10%DMSO)で、又はHEI3090(PBS中1.5mg/kg、10%DMSO)で腹腔内処置した。各マウスは、第4日、第7日、第10日、第13日及び第16日に、抗PD-1 200μgを腹腔内に受けた。腫瘍サイズを、第1日から第90日まで測定した。腫瘍が100mm²に達したとき、マウスを犠牲にした。反対側の再挑戦について、治癒したマウス、又は同齢の未処置C57BL/6Jマウスに、2.105のLLCを反対側の脇腹に皮下注射した。第150日に、再挑戦の処置マウス又はC57BL/6J未処置マウスを犠牲にして、CD8+T細胞をソートした。2.105のCD8+T細胞を、他のC57BL/6J未処置マウスへ養子移入した。次いで、マウスに2.105のLLCを皮下注射した(b)。ビヒクルと抗PD-1とで処置したマウス、又はHEI3090と抗PD-1とで処置したマウスの、LLC腫瘍増殖のスパゲッティプロット(c)。各曲線は、1頭のマウスを表す。ビヒクル若しくはHEI3090とアイソタイプ対照とで処置したマウス、又はビヒクル若しくはHEI3090と抗PD-1とで処置したマウスの生存曲線(d)。HEI3090と抗PD-1とで処置した治癒マウス、又は同齢のC57BL/6Jマウスの、再挑戦後の腫瘍増殖及び生存曲線(e、f)。未処置マウス又は再挑戦の処置マウスからのCD8+T細胞の静脈内注射後の腫瘍増殖(g)。 図１９の続き。 図１９の続き。

(実施例1)
化合物HEI 2314、HEI 2328、HEI 2333、HEI 2336及びHEI 3090の合成
本発明の化合物の合成のための一般手順
N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-2-カルボキサミド(1当量)と、対応するイソシアネート(1当量)とのトルエン中混合物を、窒素雰囲気下、還流下で1〜24時間撹拌した。得られた混合物を、MeOH中、直接の結晶化により精製して、純粋な化合物を得た。

反応スキームは以下の通りである:

a)化合物HEI 2347の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロフェニル)-5-オキソ-N¹-フェニルピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2347)。
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(0.90g、3.3mmol)及びフェニルイソシアネート(0.39g、3.3mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2347を収率81%で得た(1.05g、2.7mmol)。mp 214〜217℃(MeOH); TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:98/2) 0.9; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ppm 1.98-2.10 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.38-2.48 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.60-2.81 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 5.08 (dd, J = 5.6, 2.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.10 (t, J = 7.2 Hz, 1H, ArH), 7.34 (t, J = 7.2 Hz, 2H, ArH), 7.42 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H, ArH), 7.51 (d, J = 7.2 Hz, 2H, ArH), 7.68 (d, J = 2.4 Hz, 1H, ArH), 7.73 (d, J = 8.8 Hz, 1H, ArH), 10.08 (br s, 1H, NH), 10.51 (br s, 1H, NH); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ ppm 21.4 (CH₂), 31.7 (CH₂), 58.8 (CH), 119.6 (2 CH), 123.9 (CH), 127.3 (CH), 127.5 (CH), 127.6 (CH), 129.0 (C), 129.1 (2 CH), 129.7 (C), 133.6 (C), 137.2 (C), 149.3 (C), 170.2 (C), 177.8 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 392.1 (MH⁺), tr 4.38分; IR ν (cm^-1): 3275, 2922, 1723, 1693, 1662, 1559, 1473, 1219, 1100, 819; 元素分析:C₁₈H₁₅Cl₂N₃O₃の計算値: C, 55.12; H, 3.85; N, 10.71. 実測値: C, 54.91; H, 3.89; N, 10.75%.

b)化合物HEI 2346の合成

(S)-N²-(シクロヘキシルメチル)-5-オキソ-N¹-フェニルピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2346)。(S)-N-シクロヘキシルメチル-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(0.40g、1.8mmol)及びフェニルイソシアネート(0.21g、1.8mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物をシリカカラム(EtOAc/n-ヘプタン4/6〜5/5)で精製して、純粋なHEI_2346を白色固体として収率88%で得た(1.05g、8.8mmol)。mp 122〜127℃(EtOAc/n-ヘプタン);TLC Rf (EtOAc/n-ヘプタン:1/1) 0.3; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 0.85-0.97 (m, 2H, シクロヘキサ-H), 1.08-1.28 (m, 3H, シクロヘキサ-H), 1.45-1.46 (m, 1H, シクロヘキサ-H), 1.60-1.74 (m, 5H, シクロヘキサ-H), 2.15-2.25 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.30-2.40 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.55-2.62 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 3.00-3.20 (m, 3H, NHCH₂及びCH₂CH₂CH), 4.79 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 6.59 (s, 1H, NHCH₂), 7.11 (t, J = 7.6 Hz, 1H, ArH), 7.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H, ArH), 7.47 (d, J = 7.6 Hz, 2H, ArH), 10.56 (br s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.6 (CH₂), 25.9 (2 CH₂), 26.4 (CH₂), 30.8 (2 CH₂), 32.8 (CH₂), 38.0 (CH₂), 46.0 (CH), 59.4 (CH), 120.5 (2 CH), 124.6 (CH), 129.1 (2 CH), 137.1 (C), 150.6 (C), 170.3 (C), 177.8 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 344.2 (MH⁺), tr 4.16分; IR ν (cm^-1): 3289, 2922, 2851, 1718, 1654, 1552, 1446, 1217, 747; 元素分析:C₁₉H₂₅N₃O₃の計算値: C, 66.45; H, 7.34; N, 12.24. 実測値: C, 66.71; H, 7.42; N, 11.68%.

c)化合物HEI 2269の合成

(S)-N²-ベンジル-5-オキソ-N¹-フェニルピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2269)。(S)-N-ベンジル-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(0.35g、1.4mmol)及びフェニルイソシアネート(0.15g、1.4mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物をシリカカラム(CH₂Cl₂/MeOH 1/0〜98/2)で精製して、純粋なHEI_2269を白色固体として収率70%で得た(0.33g、1.0mmol)。mp 164〜165℃(CH₂Cl₂/MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:97/3) 0.2; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ppm 1.90-2.10 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 2.22-2.40-2.42 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 4.27 (m, 3H, CH₂CH₂CH及びNHCH₂), 7.25 (m, 3H, ArH), 7.28-7.41 (m, 5H, ArH), 7.47 (t, J = 7.6 Hz, 2H, ArH), 8.39 (t, J = 5.2 Hz, 1H, NHCH₂), 8.51 (br s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ ppm 27.4 (CH₂), 30.1 (CH₂), 42.1 (CH₂), 55.7 (CH), 126.7 (CH), 126.8 (2 CH), 127.2 (2 CH), 127.7 (CH), 128.3 (2 CH), 128.7 (2 CH), 132.2 (C), 139.5 (C), 155.6 (C), 171.0 (C), 173.1 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 338.2 (MH⁺), tr 3.07分; IR ν (cm^-1): 3367, 3183, 1705, 1645, 1416, 1175, 701; 元素分析:C₁₉H₁₉N₃O₃の計算値: C, 67.64; H, 5.68; N, 12.45. 実測値: C, 67.72; H, 5.82; N, 12.13%.

d)化合物HEI 2298の合成

(S)-N¹-アダマンチル-N²-(2-クロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2298)。
(S)-N-(2-クロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.43g、5.6mmol)及びアダマンチルイソシアネート(1.00g、5.6mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物をシリカカラム(EtOAc/n-ヘプタン 4/6〜6/4)で精製して、純粋なHEI_2298を白色固体として収率62%で得た(1.50g、3.5mmol)。mp 79〜80℃(EtOAc/n-ヘプタン);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:98/2) 0.6; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 1.68 (s, 6H, ADM-H), 1.98 (s, 6H, ADM-H), 2.09 (s, 3H, ADM-H), 2.10-2.18 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.38-2.45 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.46-2.52 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.89-2.97 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 4.51 (dd, J = 14.2, 5.0 Hz, 1H, NHCH₂), 4.55 (dd, J = 14.2, 5.0 Hz, 1H, NHCH₂), 4.76 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.14 (t, J = 5.0 Hz, 1H, ArH), 7.21 (m, 2H, ArH), 7.35 (m, 2H, ArH及びNHCH₂), 8.39 (br s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.1 (CH₂), 29.5 (2 CH₂), 32.9 (CH₂), 36.4 (2 CH₂), 41.6 (CH₂), 41.7 (2 CH₂), 51.9 (CH), 59.0 (CH), 127.1 (2 CH), 128.9 (2 CH), 129.6 (2 CH), 129.7 (C), 133.6 (C), 135.4 (C), 151.4 (C), 170.5 (C), 177.3 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 430.1 (MH⁺), tr 4.60分; IR ν (cm^-1): 3289, 2906, 2849, 1715, 1663, 1538, 1223, 1033, 749; 元素分析:C₂₃H₂₈ClN₃O₃の計算値C, 64.25; H, 6.56; N, 9.77. 実測値: C, 64.32; H, 6.89; N, 9.58%.

e)化合物HEI 2535の合成

(S)-N¹-ブチル-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2535)。
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.97g、6.9mmol)及びn-ブチルイソシアネート(0.75g、7.6mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2535を収率71%で得た(1.89g、4.9mmol)。mp 162〜163℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:99/1) 0.4; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 0.92 (t, J = 7.4 Hz, 3H, CH₃CH₂), 1.35 (m, 2H, CH₃CH₂), 1.51 (五重線, J = 7.8 Hz, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2.12 (td, J = 18.0, 11.3, 8.7 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 2.39 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.49 (td, J = 17.7, 9.4, 2.0 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 2.92 (td, J = 17.5, 11.3, 9.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 3.27 (dq, J = 7.1, 1.6 Hz, 2H, CH₂NHCO), 4.47 (dd, J = 6.0, 2.8 Hz, 2H, NHCH₂Ar), 4.75 (dd, J = 9.0, 1.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.08 (br t, J = 5.7 Hz, 1H, NHCH₂Ar), 7.20 (dd, J = 8.2, 2.3 Hz, 1H, ArH), 7.29 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 7.36 (d, J = 2.0 Hz, 1H, ArH), 8.43 (br t, J = 5.9 Hz, 1H, NHCH₂CH₂); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 13.7 (CH₃), 20.0 (CH₂), 21.1 (CH₂), 31.6 (CH₂), 32.5 (CH₂), 39.7 (CH₂), 41.1 (CH₂), 59.0 (CH), 127.3 (CH), 129.3 (CH), 130.6 (CH), 133.9 (C), 134.0 (C), 134.1 (C), 153.1 (C), 170.3 (C), 177.2 (C); IR ν (cm^-1): 3270, 1712, 1683, 1649, 1465, 1236, 1101, 810, 653; 元素分析:C₁₇H₂₁Cl₂N₃O₃の計算値: C, 52.86; H, 5.48; N 10.88. 実測値: C, 52.50; H, 5.88; N, 11.11%.

f)化合物HEI 2541の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-N¹-ペンチルピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2541)。
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.73g、6.0mmol)及びn-ペンチルイソシアネート(0.75g、6.6mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2541を収率70%で得た(1.67g、4.2mmol)。mp 159〜160℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:99/1) 0.7; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 0.96 (t, J = 6.9 Hz, 3H, CH₃CH₂), 1.39 (m, 4H, CH₂(CH₂)₂CH₂), 1.59 (五重線, J = 7.3 Hz, 2H, CH₃CH₂), 2.19 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.41 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.56 (td, J = 17.6, 9.4, 1.9 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 2.99 (td, J = 17.6, 11.3, 9.3 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 3.32 (qd, J = 7.4, 2.8 Hz, 2H, CH₂(CH₂)₃), 4.54 (dd, J = 7.5, 6.3 Hz, 2H, NHCH₂Ar), 4.82 (dd, J = 9.1, 1.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.18 (br t, J = 6.0 Hz, 1H, NHCH₂Ar), 7.26 (dd, J = 8.2, 2.4 Hz, 1H, ArH), 7.36 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 7.43 (d, J = 2.3 Hz, 1H, ArH), 8.51 (br t, J = 5.7 Hz, 1H, NH(CH₂)₂); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 13.9 (CH₃), 21.2 (CH₂), 22.3 (CH₂), 29.0 (CH₂), 29.2 (CH₂), 32.5 (CH₂), 40.0 (CH₂), 41.1 (CH₂), 59.0 (CH), 127.3 (CH), 129.3 (CH), 130.5 (CH), 133.9 (C), 134.1 (C), 153.1 (C), 170.4 (C), 177.2 (2 C); IR ν (cm^-1): 3318, 1710, 1664, 1561, 1530, 1358, 1259, 830, 630; 元素分析:C₁₈H₂₃Cl₂N₃O₃の計算値: C, 54.01; H, 5.79; N, 10.50. 実測値: C, 53.70; H, 5.95; N, 10.59%.

g)化合物HEI 2534の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-N¹-ヘキシル-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2534)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.54g、5.4mmol)及びn-ヘキシルイソシアネート(0.75g、5.9mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2534を収率66%で得た(1.47g、3.5mmol)。mp 141〜142℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:99/1) 0.4; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 0.90 (t, J = 6.9 Hz, 3H, CH₃CH₂), 1.32 (m, 6H, CH₂(CH₂)₃CH₂), 1.54 (q, J = 6.7 Hz, 2H, CH₃CH₂), 2.14 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.41 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.52 (td, J = 17.5, 9.3, 2.0 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 2.94 (td, J = 17.9, 11.4, 9.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 3.82 (dq, J = 7.3, 1.7 Hz, 2H, CH₂(CH₂)₄), 4.50 (dd, J = 5.8, 4.5 Hz, 2H, NHCH₂Ar), 4.77 (dd, J = 8.6, 1.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.11 (br t, J = 5.5 Hz, 1H, NHCH₂Ar), 7.22 (dd, J = 8.2, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.31 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 7.39 (d, J = 2.1 Hz, 1H, ArH), 8.46 (br t, J = 5.7 Hz, 1H, NH(CH₂)₂); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 14.0 (CH₃), 21.1 (CH₂), 22.5 (CH₂), 26.5 (CH₂), 29.5 (CH₂), 31.4 (CH₂), 32.5 (CH₂), 40.1 (CH₂), 41.1 (CH₂), 59.0 (CH), 127.3 (CH), 129.3 (CH), 130.6 (CH), 133.9 (C), 134.0 (C), 134.1 (C), 153.1 (C), 170.3 (C), 177.2 (C); IR ν (cm^-1): 3313, 2926, 2865, 1708, 1664, 1355, 1253, 1153, 829, 654; 元素分析:C₁₉H₂₅Cl₂N₃O₃の計算値: C, 55.08; H, 6.08; N 10.14. 実測値: C, 55.02; H, 6.15; N, 10.27%.

h)化合物HEI 2542の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-N¹-ドデシル-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2542)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(0.93g、3.2mmol)及びn-ドデシルイソシアネート(0.75g、3.5mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2542を収率49%で得た(0.78g、1.6mmol)。mp 124〜125℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:99/1) 0.8; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H, CH₃CH₂), 1.26 (m, 18H, CH₂(CH₂)₉CH₂), 1.53 (五重線, J = 6.7 Hz, 2H, CH₃CH₂), 2.13 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.40 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.51 (td, J = 17.6, 9.3, 1.8 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 2.93 (td, J = 17.7, 11.3, 9.5 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 3.29 (q, J = 7.2 Hz, 2H, CH₂(CH₂)₁₀), 4.48 (dd, J = 6.2 Hz, 2H, NHCH₂Ar), 4.76 (dd, J = 8.9, 1.2 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.11 (br t, J = 5.9 Hz, 1H, NHCH₂Ar), 7.21 (dd, J = 8.3, 2.2 Hz, 1H, ArH), 7.30 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 7.37 (d, J = 2.1 Hz, 1H, ArH), 8.45 (br t, J = 6.0 Hz, 1H, NH(CH₂)₂); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 14.1 (CH₃), 21.1 (CH₂), 22.7 (CH₂), 26.9 (CH₂), 29.3 (CH₂), 29.3 (CH₂), 29.5 (CH₂), 29.5 (CH₂), 29.6 (CH₂), 29.6 (CH₂), 29.6 (CH₂), 31.9 (CH₂), 32.5 (CH₂), 40.1 (CH₂), 41.1 (CH₂), 59.0 (CH), 127.3 (CH), 129.3 (CH), 130.5 (CH), 133.9 (C), 133.9 (C), 134.1 (C), 153.1 (C), 170.3 (C), 177.2 (C); IR ν (cm^-1): 3302, 2918, 2850, 1718, 1658, 1541, 1349, 1251, 832, 648; 元素分析:C₂₅H₃₇Cl₂N₃O₃の計算値: C, 60.2; H, 7.48; N, 8.43. 実測値: C, 59.8; H, 7.5; N, 8.5%.

i)化合物HEI 2537の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-N¹-(プロパン-2-イル)ピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2537)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(2.30g、8.0mmol)及びプロパン-2-イルイソシアネート(0.75g、8.8mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物をシリカカラム(EtOAc/n-ヘプタン 1/9〜1/0)で精製して、純粋なHEI_2537を黄色固体として収率55%で得た(1.65g、4.4mmol)。mp 111〜112℃(EtOAc/n-ヘプタン);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:99/1) 0.4; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 1.20 (dd, J = 6.5, 2.7 Hz, 6H, (CH₃)₂CH), 2.12 (td, J = 18.1, 11.4, 9.0 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 2.38 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.50 (td, J = 17.5, 9.3, 1.8 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 2.86 (td, J = 17.6, 11.4, 9.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 3.95 (m, 1H, (CH₃)₂CH), 4.48 (d, J = 6.2 Hz, 2H, NHCH₂), 4.76 (dd, J = 8.6, 1.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.18 (br t, J = 6.2 Hz, 1H, NHCH₂), 7.20 (dd, J = 8.3, 2.2 Hz, 1H, ArH), 7.30 (d, J = 8.0 Hz, 1H, ArH), 7.37 (d, J = 1.8 Hz, 1H, ArH), 8.33 (br t, J = 5.7 Hz, 1H, NHCH(CH₃)₂); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.1 (CH₂), 22.6 (CH₃), 22.7 (CH₃), 32.6 (CH₂), 41.1 (CH₂), 42.4 (CH), 59.0 (CH), 127.3 (CH), 129.3 (CH), 130.5 (CH), 133.9 (C), 134.1 (C), 152.3 (C), 170.4 (C), 177.2 (2 C); IR ν (cm^-1): 3317, 1703, 1643, 1523, 1226, 817, 590; 元素分析:C₁₆H₁₉Cl₂N₃O₃の計算値: C, 51.63; H, 5.14; N, 11.29. 実測値: C, 51.46; H, 5.55; N, 11.70%.

j)化合物HEI 2538の合成

(S)-N¹-tert-ブチル-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2538)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.97g、6.9mmol)及びtert-ブチルイソシアネート(0.75g、7.6mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物をシリカカラム(EtOAc/n-ヘプタン 3/7〜1/0)で精製して、純粋なHEI_2538を白色固体として収率36%で得た(0.95g、2.5mmol)。mp 99〜101℃(EtOAc/n-ヘプタン);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:99/1) 0.7; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 1.35 (s, 9H, C(CH₃)₃), 2.05-2.16 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.36 (dd, J = 11.9, 2.0 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 2.49 (ddd, J = 17.6, 9.4, 2.0 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 2.93 (ddd, J = 17.7, 11.4, 9.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 4.42 (dd, J = 15.2, 5.9 Hz, 1H, NHCH₂), 4.53 (dd, J = 15.7, 6.7 Hz, 1H, NHCH₂), 4.76 (dd, J = 8.6, 1.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.18 (dd, J = 8.2, 2.1 Hz, 1H, ArH), 7.20 (br s, 1H, NHCH₂), 7.29 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 7.36 (d, J = 2.3 Hz, 1H, ArH), 8.48 (br s, 1H, NHC(CH₃)₃); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 20.9 (CH₂), 28.7 (3 CH₃), 32.7 (CH₂), 41.0 (CH₂), 51.1 (C), 58.8 (CH), 127.2 (CH), 129.2 (CH), 130.3 (CH), 133.8 (C), 133.9 (C), 134.0 (C), 151.7 (C), 170.6 (C), 177.1 (C); IR ν (cm^-1): 3280, 1717, 1689, 1656, 1547, 1267, 1191, 824, 657; 元素分析:C₁₇H₂₁Cl₂N₃O₃の計算値: C, 52.86; H, 5.48; N, 10.88. 実測値: C, 52.63; H, 6.03; N, 10.91%.

k)化合物HEI 2315の合成

(S)-N¹-シクロヘキシル-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2315)。
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(2.00g、7.0mmol)及びシクロヘキシルイソシアネート(0.87g、7.0mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2315を収率82%で得た(2.35g、5.7mmol)。mp 137〜142℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:98/2) 0.5; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 1.15-1.45 (m, 5H, シクロヘキサ-H), 1.59 (m, 1H, シクロヘキサ-H), 1.71 (m, 2H, シクロヘキサ-H), 1.88 (m, 2H, シクロヘキサ-H), 2.05-2.20 (m, 1H, シクロヘキサ-H), 2.25-2.40 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.42-2.56 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.82-2.96 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 3.62-3.66 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 4.44 (dd, J = 15.2, 5.6 Hz, 1H, NHCH₂), 4.51 (dd, J = 15.2, 5.6 Hz, 1H, NHCH₂), 4.73-4.79 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 7.19 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.29 (d, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 7.30 (br s, 1H, NHCH₂), 7.37 (d, J = 2.0 Hz, 1H, ArH), 8.42 (d, J = 7.6 Hz, 1H, NHCH); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.2 (CH₂), 24.5 (CH₂), 25.4 (CH₂), 32.5 (CH₂), 32.7 (CH₂), 32.8 (CH₂), 41.0 (CH₂), 49.0 (CH₂), 58.9 (2CH), 127.3 (CH), 129.3 (CH), 130.5 (CH), 133.9 (C), 134.0 (C), 134.1 (C), 152.2 (C), 170.5 (C), 177.2 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 412.0 (MH⁺), tr 4.45分; IR ν (cm^-1): 3303, 2928, 2853, 1703, 1656, 1534, 1224; 元素分析:C₁₉H₂₃Cl₂N₃O₃の計算値: C, 55.35; H, 5.62; N, 10.19. 実測値: C, 55.36; H, 6.14; N, 10.39%.

l)化合物HEI 2329の合成

(S)-N¹-アダマンチル-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2329)。
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.50g、5.2mmol)及びアダマンチルイソシアネート(0.93g、5.2mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2329を収率97%で得た(2.34g、5.0mmol)。mp 85〜87℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:98/2) 0.5; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 1.64-1.70 (m, 6H, ADM-H), 1.95-1.99 (m, 6H, ADM-H), 2.00-2.16 (m, 4H, ADM-H及びCH₂CH₂CH), 2.30-2.40 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.42-2.54 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.86-2.98 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 4.45 (dd, J = 15.2, 6.0 Hz, 1H, NHCH₂), 4.51 (dd, J = 15.2, 6.0 Hz, 1H, NHCH₂), 4.76 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.17 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.26 (t, J = 6.0 Hz, 1H, NHCH₂), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 1H, ArH), 7.36 (d, J = 2.0 Hz, 1H, ArH), 8.39 (br s, 1H, NHCH); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.1 (CH₂), 29.5 (2CH₂), 32.9 (CH₂), 36.4 (2CH₂), 41.1 (CH₂), 41.7 (2CH₂), 51.9 (CH), 59.0 (CH), 127.4 (CH), 129.4 (2CH), 130.5 (2CH), 134.0 (C), 134.1 (2C), 134.2 (C), 151.4 (C), 170.7 (C), 177.3 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 464.2 (MH⁺), tr 4.80分; IR ν (cm^-1): 3289, 2906, 2848, 1715, 1661, 1538, 1222, 1048, 829; 元素分析:C₂₃H₂₇Cl₂N₃O₃の計算値: C, 59.49; H, 5.86; N, 9.05. 実測値: C, 59.59; H, 6.26; N, 8.71%.

m)化合物HEI 2339の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-N¹-フェニルピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2339)。
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(0.40g、1.4mmol)及びフェニルイソシアネート(0.17g、1.4mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2339を収率76%で得た(0.43g、1.1mmol)。mp 216〜219℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:96/4) 0.8; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ppm 1.85-1.95 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.30-2.40 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.58-2.79 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 4.36 (m, 2H, NHCH₂), 4.80 (dd, J = 9.2, 2.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.11 (t, J = 7.2 Hz, 1H, ArH), 7.35 (t, J = 7.2 Hz, 2H, ArH), 7.43-7.44 (m, 2H, ArH), 7.51 (d, J = 7.2 Hz, 2H, ArH), 7.61-7.62 (m, 1H, ArH), 8.85 (t, J = 5.6 Hz, 1H, NHCH₂), 10.51 (br s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ ppm 21.4 (CH₂), 31.8 (CH₂), 40.0 (CH₂), 58.7 (CH), 119.5 (2 CH), 123.8 (CH), 127.3 (CH), 128.6 (CH), 129.1 (2 CH), 130.1 (CH), 132.3 (C), 132.9 (C), 135.2 (C), 137.3 (C), 149.4 (C), 171.2 (C), 177.8 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 408.1 (MH⁺), tr 4.37分; IR ν (cm^-1): 3276, 1718, 1644, 1543, 1217, 1054, 748; 元素分析:C₁₉H₁₇Cl₂N₃O₃の計算値: C, 56.17; H, 4.22; N, 10.34. 実測値: C, 56.12; H, 3.96; N, 10.24%.

n)化合物HEI 2761の合成

(S)-N¹-(ビフェニル-4-イル)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2761)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.00g、3.5mmol)及びビフェニル-4-イルイソシアネート(0.75g、3.8mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2761を収率65%で得た(1.09g、2.3mmol)。mp 191〜200℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:98/2)=0.9; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 2.16-2.30 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.34-2.43 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.57-2.67 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.99-3.12 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 4.52 (dd, J = 13.4, 6.7 Hz, 2H, NCH₂Ar), 4.84 (d, J = 8.8 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 6.93 (s, 1H, NH), 7.21 (dd, J = 8.2, 1.8 Hz, 1H, ArH), 7.30-7.38 (m, 3H, ArH), 7.44 (t, J = 7.3 Hz, 2H, ArH), 7.52-7.61 (m, 6H, ArH), 10.60 (s, 1H, NH); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.2 (CH₂), 29.7 (CH₂), 32.6 (CH₂), 41.2 (CH₂), 59.2 (CH), 126.8 (2 CH), 126.9 (CH), 127.4 (CH), 127.7 (2 CH), 128.8 (2 CH), 129.4 (2 CH), 130.8 (CH), 133.8 (C), 134.1 (C), 134.2 (C), 136.2 (C), 137.5 (C), 140.5 (C), 150.5 (C), 170.2 (C), 177.5 (C); IR ν (cm^-1): 3311, 3083, 1715, 1542, 1225, 764, 693; 元素分析:C₂₅H₂₁Cl₂N₃O₃の計算値: C, 62.25; H, 4.39; N, 8.71. 実測値: C, 62.06; H, 4.39; N, 8.73%.

o)化合物HEI 2314の合成

(S)-N¹-(2-クロロフェニル)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2314)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(2.00g、7.0mmol)及び2-クロロフェニルイソシアネート(1.07g、7.0mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2314を収率90%で得た(2.75g、6.2mmol)。mp 213〜219℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:98/2) 0.5; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 2.18-2.36 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 2.58-2.68 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.95-3.06 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 4.47 (dd, J = 15.6, 5.6 Hz, 1H, NHCH₂), 4.54 (dd, J = 15.6, 5.6 Hz, 1H, NHCH₂), 4.80 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.06 (t, J = 7.6 Hz, 1H, NHCH₂), 7.21 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.26 (t, J = 7.6 Hz, 1H, ArH), 7.34 (d, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 7.37 (d, J = 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.40 (m, 2H, ArH), 8.15 (d, J = 8.0 Hz, 1H, ArH), 11.04 (br s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.7 (CH₂), 32.3 (CH₂), 41.1 (CH₂), 59.2 (CH), 121.8 (CH), 124.0 (C), 125.0 (CH), 127.4 (CH), 127.5 (CH), 129.4 (CH), 129.5 (CH), 130.6 (CH), 133.9 (C), 134.0 (C), 134.1 (C), 134.4 (C), 150.3 (C), 171.0 (C), 177.6 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 442.0 (MH⁺), tr 4.45分; IR ν (cm^-1): 3271, 1713, 1643, 1597, 1545, 1222, 1054, 749; 元素分析:C₁₉H₁₆Cl₃N₃O₃の計算値: C, 51.78; H, 3.66; N, 9.53. 実測値: C, 51.80; H, 3.73; N, 9.59%.

p)化合物HEI 2760の合成

(S)-N¹-(2-ブロモフェニル)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2760)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.00g、3.5mmol)及び2-ブロモフェニルイソシアネート(0.76g、3.8mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2760を収率56%で得た(0.95g、2.0mmol)。mp 217〜223℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:95/5) 0.7; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 2.18-2.43 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 2.58-2.69 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.98-3.11 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 4.52 (dd, J = 9.1, 5.7 Hz, 2H, NHCH₂), 4.81 (dd, J = 9.2, 2.0 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 6.81 (br s, 1H, NHCH₂), 7.00 (ddd, J = 7.9, 7.9, 1.6 Hz, 1H, ArH), 7.20 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H, ArH), 7.30-7.35 (m, 2H, ArH), 7.37 (d, J = 2 Hz, 1H, ArH), 7.58 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H, ArH), 8.13 (dd, J = 8.4, 2.1 Hz, 1H, ArH), 10.94 (s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.3 (CH₂), 33.4 (CH₂), 41.3 (CH₂), 59.2 (CH), 111.3 (C), 122.3 (CH), 125.5 (CH), 127.4 (CH), 128.0 (CH), 129.4 (CH), 130.8 (CH), 132.7 (CH), 133.7 (C), 134.1 (C), 134.2 (C), 135.7 (C), 150.5 (C), 170.1 (C), 177.3 (C); IR ν (cm^-1): 3268, 3202, 3063, 1714, 1644, 1541, 1218, 748; 元素分析:C₁₉H₁₆BrCl₂N₃O₃の計算値: C, 47.04; H, 3.32; N, 8.66. 実測値: C, 47.03; H, 3.30; N, 8.66%.

q)化合物HEI 2759の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-N¹-(2-ヨードフェニル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2759)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.00g、3.5mmol)及び2-ヨードフェニルイソシアネート(0.94g、3.8mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2759を収率58%で得た(1.07g、2.0mmol)。mp 203〜207℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:95/5) 0.7; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 2.18-2.31 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.36-2.45 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.59-2.68 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 3.00-3.12 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 4.52 (t, J = 5.8 Hz, 2H, NHCH₂), 4.82 (dd, J = 8.7, 1.7 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 6.82 (s, 1H, NHCH₂), 6.88 (td, J = 7.6, 1.6 Hz, 1H, ArH), 7.21 (dd, J = 8.1, 2.3 Hz, 1H, ArH), 7.30-7.39 (m, 3H, ArH), 7.84 (dd, J = 8.1, 1.5 Hz, 1H, ArH), 7.96 (dd, J = 8.3, 1.5 Hz, 1H, ArH), 10.68 (s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.3 (CH₂), 32.5 (CH₂), 41.3 (CH₂), 59.2 (CH), 90.4 (C), 123.0 (CH), 126.4 (CH), 127.4 (CH), 128.8 (CH), 129.4 (CH), 130.8 (C), 133.8 (C), 134.1 (C), 134.2 (C), 138.5 (C), 139.5 (CH), 150.7 (C), 170.1 (C), 177.2 (C); IR ν (cm^-1): 3265, 3207, 3076, 1714, 1644, 1533, 1217, 754; 元素分析:C₁₉H₁₆Cl₂IN₃O₃の計算値: C, 42.88; H, 3.03; N, 7.90. 実測値: C, 42.82; H, 2.98; N, 8.04%.

r)化合物HEI 2331の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-N¹-(2,4-ジクロロフェニル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2331)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.00g、3.5mmol)及び2,4-ジクロロフェニルイソシアネート(0.66g、3.5mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2331を収率87%で得た(1.45g、3.1mmol)。mp 203〜218℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:98/2) 0.6; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ppm 1.86-1.96 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.29-2.43 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.60-2.81 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 4.36 (m, 2H, CH₂CH₂CH及びNHCH₂), 4.81 (dd, J = 9.6, 2.8 Hz, 1H, NHCH₂), 7.41 (d, J = 8.0 Hz, 1H, ArH), 7.43 (d, J = 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.47 (dd, J = 9.2, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.62 (d, J = 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.74 (d, J = 2.0 Hz, 1H, ArH), 8.24 (d, J = 9.2 Hz, 1H, ArH), 8.88 (t, J = 2.0 Hz, 1H, NHCH₂), 11.11 (br s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ ppm 21.5 (CH₂), 31.7 (CH₂), 39.5 (CH₂), 58.7 (CH), 121.9 (CH), 123.0 (CH), 127.3 (CH), 127.7 (C), 128.1 (CH), 128.6 (CH), 128.8 (CH), 130.1 (C), 132.3 (C), 133.0 (C), 133.6 (C), 135.2 (C), 149.3 (C), 171.0 (C), 178.2 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 475.9 (MH⁺), tr 4.78分; IR ν (cm^-1): 3263, 1716, 1656, 1582, 1537, 1224, 823; 元素分析:C₁₉H₁₅Cl₄N₃O₃の計算値: C, 48.03; H, 3.18; N, 8.84. 実測値: C, 48.02; H, 3.17; N, 8.76%.

s)化合物HEI 2333の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-N¹-(2,4-ジメトキシフェニル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2333)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.00g、3.5mmol)及び2,4-ジメトキシフェニルイソシアネート(0.62g、3.5mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2333を収率83%で得た(1.35g、2.9mmol)。mp 203〜205℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:98/2) 0.6; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 2.15-2.23 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.35-2.43 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.55-2.63 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.92-3.05 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 3.80 (s, 3H, OCH₃), 3.88 (s, 3H, OCH₃), 4.45 (dd, J = 15.2, 6.0 Hz, 1H, NHCH₂), 4.54 (dd, J = 15.2, 6.0 Hz, 1H, NHCH₂), 4.84 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 6.44 (dd, J = 8.8, 2.8 Hz, 1H, ArH), 6.50 (d, J = 2.8 Hz, 1H, ArH), 7.10 (t, J = 6.0 Hz, 1H, NHCH₂), 7.17 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 1H, ArH), 7.34 (d, J = 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.93 (d, J = 8.8 Hz, 1H, ArH), 10.71 (br s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.4 (CH₂), 32.7 (CH₂), 41.3 (CH₂), 55.7 (CH), 56.0 (CH₃), 59.2 (CH₃), 98.9 (CH), 103.9 (CH), 120.3 (CH), 121.1 (CH), 127.5 (CH), 129.5 (C), 130.7 (CH), 134.0 (C), 134.1 (C), 134.2 (C), 150.4 (C), 150.5 (C), 157.0 (C), 170.5 (C), 177.2 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 466.0 (MH⁺), tr 4.33分; IR ν (cm^-1): 3294, 1712, 1657, 1547, 1299, 1205, 1033, 818; 元素分析:C₂₁H₂₁Cl₂N₃O₅の計算値: C, 54.09; H, 4.54; N, 9.01. 実測値: C, 53.91; H, 3.81; N, 8.91%.

t)化合物HEI 2338の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-N¹-(2,4,6-トリメチルフェニル)ピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2338)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(0.70g、2.4mmol)、及び2,4,6-トリメチルフェニルイソシアネート(0.39g、2.4mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2338を収率55%で得た(0.60g、1.3mmol)。mp 156〜157℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:95/5) 0.8; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 2.14 (s, 6H, CCH₃), 2.18-2.24 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.27 (s, 3H, CCH₃), 2.38-2.45 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.55-2.65 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.98-3.10 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 4.42 (dd, J = 6.0, 2.0 Hz, 2H, NHCH₂), 4.83 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 6.89 (s, 2H, ArH), 7.09-7.15 (m, 2H, NHCH₂及びArH), 7.23 (d, J = 8.8 Hz, 1H, ArH), 7.34 (d, J = 2.4 Hz, 1H, ArH), 9.74 (br s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 18.4 (2 CH₃), 21.1 (CH₃), 21.3 (CH₂), 32.7 (CH₂), 41.1 (CH₂), 59.2 (CH), 127.4 (CH), 129.1 (2 CH), 129.4 (C), 130.4 (C), 130.5 (CH), 134.0 (CH), 134.1 (C), 134.2 (C), 135.1 (2 C), 137.3 (C), 151.7 (C), 170.5 (C), 177.8 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 448.1 (MH⁺), tr 4.57分; IR ν (cm^-1): 3275, 1714, 1658, 1514, 1358, 1242, 1219, 1033, 826; 元素分析:C₂₂H₂₃Cl₂N₃O₃の計算値: C, 58.94; H, 5.17; N, 9.37. 実測値: C, 58.80; H, 5.26; N, 9.25%.

u)化合物HEI 2337の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-N¹-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]ピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2337)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.00g、3.5mmol)及び3-トリフルオロメチルフェニルイソシアネート(0.65g、3.5mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2337を収率73%で得た(1.20g、2.5mmol)。mp 171〜174℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:98/2) 0.6; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ppm 1.90-1.98 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.30-2.42 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.60-2.80 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 4.35-4.39 (m, 2H, CH₂CH₂CH及びNHCH₂), 4.81 (dd, J = 9.6, 2.8 Hz, 1H, NHCH₂), 7.38 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H, ArH), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 7.47 (d, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 7.59 (t, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 7.61 (d, J = 2.4 Hz, 1H, ArH), 7.72 (d, J = 8.8 Hz, 1H, ArH), 8.07 (s, 1H, ArH), 8.88 (t, J = 6.0 Hz, 1H, NHCH₂), 10.68 (br s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ ppm 21.8 (CH₂), 32.2 (CH₂), 40.6 (CH₂), 59.2 (CH), 116.3 (q, J = 3.8 Hz, CH), 127.0 (m, CH), 124.0 (CH), 124.3 (q, J = 272.0 Hz, CF₃), 127.6 (CH), 129.0 (CH), 130.0 (q, J = 32 Hz, C), 130.2 (CH), 130.6 (CH), 132.8 (C), 133.4 (C), 135.7 (C), 138.6 (C), 150.1 (C), 171.5 (C), 178.2 (C); ¹⁹F NMR (CDCl₃, 376 MHz) δ ppm -61.4 (CF₃); LC-MS (APCI⁺) m/z: 474.0 (MH⁺), tr 4.58分; IR ν (cm^-1): 3298, 1727, 1658, 1556, 1450, 1333, 1251, 1112, 831; 元素分析:C₂₀H₁₆Cl₂F₃N₃O₃の計算値: C, 50.65; H, 3.40; N, 8.86. 実測値: C, 50.34; H, 3.30; N, 8.74%.

v)化合物HEI 2328の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-N¹-(3,4-ジクロロフェニル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2328)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.50g、5.2mmol)及び3,4-ジクロロフェニルイソシアネート(0.98g、5.2mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2328を収率81%で得た(2.00g、4.2mmol)。mp 220〜224℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:98/2) 0.7; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ppm 1.84-1.97 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.25-2.40 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.60-2.80 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 4.36 (s, 2H, NHCH₂), 4.79 (d, J = 8.5 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.38-7.65 (m, 5H, NHCH₂及びArH), 7.94 (s, 1H, ArH), 8.86 (s, 1H, ArH), 10.59 (br s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ ppm 21.5 (CH₂), 31.7 (CH₂), 39.5 (CH₂), 58.7 (CH), 120.0 (CH), 121.1 (CH), 125.4 (C), 127.3 (CH), 128.6 (CH), 130.2 (CH), 130.8 (CH), 131.2 (C), 132.3 (C), 133.0 (C), 135.2 (C), 137.5 (C), 149.4 (C), 171.0 (C), 177.7 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 474.0 (MH⁺), tr 4.67分; IR ν (cm^-1): 3270, 1718, 1644, 1598, 1547, 1476, 1218, 1134, 818; 元素分析:C₁₉H₁₅Cl₄N₃O₃の計算値: C, 48.03; H, 3.18; N, 8.84. 実測値: C, 47.75; H, 3.03; N, 8.71%.

w)化合物HEI 2336の合成

(S)-N¹-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2336)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.00g、3.5mmol)及び3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニルイソシアネート(0.89g、3.5mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2336を収率64%で得た(1.20g、2.2mmol)。TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:98/2) 0.6;mp 223〜225℃(MeOH); ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 2.23-2.36 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 2.60-2.70 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.98-3.12 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 4.49 (dd, J = 15.2, 5.6 Hz, 1H, NHCH₂), 4.57 (dd, J = 15.2, 5.6 Hz, 1H, NHCH₂), 4.78 (dd, J = 7.2, 2.8 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 6.66 (t, J = 5.6 Hz, 1H, NHCH₂), 7.20 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H, ArH), 7.34 (d, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 7.36 (d, J = 2.4 Hz, 1H, ArH), 7.62 (s, 1H, ArH), 7.99 (s, 2H, ArH), 10.91 (br s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.4 (CH₂), 32.4 (CH₂), 41.4 (CH₂), 59.2 (CH), 117.7 (q, J = 3.9 Hz, CH), 119.8 (m, 2CH), 123.0 (q, J = 272.0 Hz, 2 CF₃), 127.5 (CH), 129.5 (CH), 130.9 (CH), 132.4 (q, J = 32.0 Hz, 2C), 133.5 (C), 134.2 (C), 134.4 (C), 138.6 (C), 150.2 (C), 170.0 (C), 177.8 (C); ¹⁹F NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm -63.1 (CF₃); LC-MS (APCI⁺) m/z: 543.8 (MH⁺), tr 5.05分; IR ν (cm^-1): 3290, 3089, 1725, 1656, 1561, 1284, 1172, 1128, 1042, 890; 元素分析:C₂₁H₁₅Cl₂F₆N₃O₃の計算値: C, 46.51; H, 2.79; N, 7.75. 実測値: C, 46.49; H, 2.61; N, 7.69%.

x)化合物HEI 2278の合成

(S)-N¹-(4-クロロフェニル)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2278)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.00g、3.5mmol)及び4-クロロフェニルイソシアネート(0.54g、3.5mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物をシリカカラム(CH₂Cl₂/MeOH 1/0〜99/1)で精製して、純粋なHEI_2278を白色固体として収率68%で得た(1.05g、2.4mmol)。mp 188〜191℃(CH₂Cl₂/MeOH);TLC Rf (EtOAc/n-ヘプタン:4/6) 0.3; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ppm 1.85-1.95 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.30-2.40 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.58-2.78 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 4.35 (m, 2H, CH₂CH₂CH及びNHCH₂), 4.79 (dd, J = 9.2, 6.0 Hz, 1H, NHCH₂), 7.40 (d, J = 8.8 Hz, 2H, ArH), 7.42 (m, 2H, ArH), 7.57 (d, J = 8.8 Hz, 2H, ArH), 7.62 (d, J = 1.5 Hz, 1H, ArH), 8.85 (t, J = 6.0 Hz, 1H, NHCH₂), 10.54 (br s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ ppm 21.4 (CH₂), 31.8 (CH₂), 38.3 (CH₂), 58.7 (CH), 121.2 (2 CH), 127.3 (CH), 127.5 (C), 128.6 (CH), 128.9 (2 CH), 130.1 (CH), 132.3 (C), 132.9 (C), 135.2 (C), 136.3 (C), 149.4 (C), 171.1 (C), 177.8 (C); LC-MS (APCI⁺) m/z: 439.9 (MH⁺), tr 4.50分; IR ν (cm^-1): 3283, 2922, 1712, 1649, 1600, 1545, 1388, 1224, 1051, 828; 元素分析:C₁₉H₁₆Cl₃N₃O₃の計算値: C, 51.78; H, 3.66; N, 9.53. 実測値: C, 52.02; H, 3.92; N, 9.38%.

y)化合物HEI 2817の合成

(S)-N¹,N²-ビス(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2817)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.00g、3.5mmol)及び2,4-ジクロロベンジルイソシアネート(0.77g、3.8mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2817を収率78%で得た(1.31g、2.7mmol)。TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:95/5) 0.7;mp 224〜226℃(MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ppm 1.81-1.91 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.24-2.37 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.43-2.72 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 4.31 (d, J = 5.7 Hz, 2H, NCH₂), 4.44 (d, J = 5.7 Hz, 2H, NCH₂), 4.69 (dd, J = 9.2, 2.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.24-7.43 (m, 4H, ArH), 7.61 (dd, J = 7.4, 2.0 Hz, 2H, ArH), 8.77 (t, J = 6.3 Hz, 1H, NH), 8.86 (t, J = 6.3 Hz, 1H, NH); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ ppm 22.0 (CH₂), 32.1 (CH₂), 40.6 (CH₂), 40.9 (CH₂), 59.0 (CH), 127.6 (CH), 127.7 (CH), 128.9 (CH), 129.0 (CH), 130.4 (CH), 130.6 (CH), 132.6 (CH), 132.8 (CH), 133.2 (C), 133.3 (C), 135.7 (C), 135.8 (C), 152.5 (C), 171.8 (C), 177.6 (C); IR ν (cm^-1): 3251, 3089, 1709, 1653, 1538, 1239; 元素分析:C₂₀H₁₇Cl₄N₃O₃の計算値: C, 49.11; H, 3.50; N, 8.59. 実測値: C, 49.12; H, 3.50; N, 8.60%.

z)化合物HEI 2820の合成

(S)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-N¹-(3,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2820)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.00g、3.5mmol)及び3,4-ジクロロベンジルイソシアネート(0.67g、3.3mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2820を収率32%で得た(0.54g、1.1mmol)。mp 201〜204℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:95/5) 0.7; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 2.12-2.25 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.31-2.41 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.49-2.59 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.89-3.01 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 4.33-4.57 (m, 4H, NCONHCH₂, CHCONHCH₂, CH₂CH₂CH), 4.74 (d, J = 9.3 Hz, 1H, CHCONHCH₂), 6.86 (s, 1H, CHCONHCH₂), 7.11 (d, J = 9.3 Hz, 1H, ArH), 7.16-7.22 (m, 1H, ArH), 7.27-7.34 (m, 1H, ArH), 7.36-7.42 (m, 3H, ArH), 8.88 (s, 1H, NCONHCH₂); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.3 (CH₂), 32.4 (CH₂), 41.2 (CH₂), 42.8 (CH₂), 59.1 (CH), 126.8 (CH), 127.4 (CH), 129.3 (CH), 129.4 (CH), 130.6 (CH), 130.7 (CH), 132.8 (C), 133.7 (C), 134.1 (C), 134.1 (C), 138.2 (C), 153.3 (C), 170.2 (C), 177.4 (C), 184.0 (C); IR ν (cm^-1): 3320, 3274, 3058, 2943, 1707, 1650, 1542, 1243, 816; 元素分析:C₂₀H₁₇Cl₄N₃O₃の計算値: C, 49.11; H, 3.50; N, 8.59. 実測値: C, 49.14; H, 3.58; N, 8.53%.

a')化合物HEI 2548の合成

N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-N¹-(チオフェン-2-イル)ピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2548)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(0.83g、2.9mmol)及びチオフェン-2-イルイソシアネート(0.40g、3.2mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2548を収率26%で得た(0.31g、0.8mmol)。mp 141〜143℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:99/1) 0.5; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 2.20-2.31 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.35-2.41 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.62 (td, J = 18.1, 9.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 3.06 (td, J = 17.6, 9.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 4.50-4.55 (m, 2H, NHCH₂), 4.85 (dd, J = 9.0, 1.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 6.73 (dd, J = 3.9, 1.5 Hz, 1H, ArH), 6.89 (dd, J = 5.5, 3.5 Hz, 1H, ArH), 6.92 (dd, J = 5.5, 1.5 Hz, 1H, ArH), 6.95 (br t, J = 4.6 Hz, 1H, NHCH₂), 7.21 (dd, J = 8.2, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.34 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH), 7.37 (d, J = 1.9 Hz, 1H, ArH), 11.00 (s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.6 (CH₂), 32.2 (CH₂), 41.2 (CH₂), 59.1 (CH), 113.4 (CH), 118.4 (CH), 124.5 (CH), 127.3 (CH), 129.3 (CH), 130.6 (CH), 133.6 (C), 134.0 (C), 134.1 (C), 137.9 (C), 149.6 (C), 170.2 (C), 177.5 (C); IR ν (cm^-1): 3291, 1712, 1660, 1556, 1510, 1343, 1245, 1218, 815, 689; 元素分析:C₁₇H₁₅Cl₂N₃O₃Sの計算値: C, 49.52; H, 3.67; N, 10.19; S, 7.78. 実測値: C, 49.23; H, 3.80; N, 10.00; S, 7.03%.

b')化合物HEI 3090の合成

(S)-N¹-(6-クロロピリジン-3-イル)-N²-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_3090)
(S)-N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-2-カルボキサミド(1.86g、6.5mmol)及び6-クロロピリジン-3-イルイソシアネート(1.00g、6.5mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物をシリカカラム(CH₂Cl₂/MeOH 1/0〜9/1)で精製して、純粋なHEI_3090を白色固体として収率11%で得た(0.30g、0.7mmol)。mp 187〜190℃(CH₂Cl₂/MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:95/5) 0.8; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 2.12-2.37 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 2.59-2.68 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.99-3.10 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 4.49 (dd, J = 15.2, 6.2 Hz, 1H, NHCH₂), 4.55 (dd, J = 15.2, 6.2 Hz, 1H, NHCH₂), 4.77 (dd, J = 8.7, 2.1 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 6.65 (br t, J = 6.2 Hz, 1H, NHCH₂), 7.22 (dd, J = 8.1, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.29 (d, J = 8.6 Hz, 1H, ArH), 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 1H, ArH), 7.38 (d, J = 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.92 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 1H, ArH), 8.49 (d, J = 2.5 Hz, 1H, ArH), 10.66 (s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.4 (CH₂), 32.4 (CH₂), 41.4 (CH₂), 59.2 (CH), 124.3 (CH), 127.5 (CH), 129.5 (CH), 130.2 (CH), 130.9 (CH), 133.1 (C), 133.6 (2 C), 134.2 (C), 141.3 (CH), 146.2 (C), 150.3 (C), 170.0 (C), 177.7 (C); IR ν (cm^-1): 3271, 3095, 2935, 1721, 1655, 1594, 1542, 1464, 1217, 1104.

N,N'-ビス(6-クロロピリジン-3-イル)尿素(HEI_3091)

これは、先行実験から、カラムクロマトグラフィーの間に単離して、純粋なHEI_3091を白色固体として収率54%で得た(0.50g、1.8mmol)。mp>260℃;TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:95/5) 0.4; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 7.45 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.99 (dd, J = 8.7, 3.1 Hz, 2H, ArH), 8.49 (d, J = 3.1 Hz, 2H, ArH), 9.21 (s, 2H, NH); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 124.0 (2 CH), 129.2 (2 CH), 135.6 (2 C), 139.8 (2 CH), 142.6 (2 C), 152.3 (C); IR ν (cm^-1): 3267, 3180, 3095, 3052, 1711, 1531, 1465, 1285, 1208, 1107, 833.

c')化合物HEI 2773の合成

(S)-N¹-(3,4-ジクロロフェニル)-N²-[2-(2,4-ジクロロフェニル)エチル]-5-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキサミド(HEI_2773)
(S)-N-[2-(2,4-ジクロロフェニル)エチル]-5-オキソ-ピロリジン-2-カルボキサミド(1.00g、3.3mmol)及び3,4-ジクロロフェニルイソシアネート(0.69g、3.7mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_2773を収率51%で得た(0.80g、1.6mmol)。mp 213〜216℃(MeOH);TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:95/5) 0.7; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ppm 1.70-1.85 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.19-2.36 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.57-2.71 (m, 2H, CH₂CH₂CH), 2.78-2.92 (m, 2H, CH₂CH₂Ar), 3.25-3.46 (m, 2H, CH₂CH₂Ar), 4.63 (dd, J = 9.5, 2.9 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 7.30-7.38 (m, 2H, ArH), 7.49 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H, ArH), 7.54-7.65 (m, 2H, ArH), 7.94 (d, J = 2.5 Hz, 1H, ArH), 8.36 (s, 1H, NH), 10.60 (s, 1H, NH); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ ppm 22.1 (CH₂), 32.1 (CH₂), 32.6 (CH₂), 38.5 (CH₂), 59.1 (CH), 120.3 (CH), 121.4 (CH), 125.8 (C), 127.6 (CH), 129.0 (CH), 131.2 (CH), 131.6 (C), 132.2 (C), 133.0 (CH), 134.5 (C), 136.2 (C), 137.9 (C), 149.7 (C), 171.0 (C), 178.2 (C); IR ν (cm^-1): 3267, 3105, 1716, 1652, 1592, 1542, 1220, 807; 元素分析:C₂₀H₁₇Cl₄N₃O₃の計算値: C, 49.11; H, 3.50; N, 8.59. 実測値: C, 48.99; H, 3.37; N, 8.50%.

d')化合物HEI 3127の合成

N¹-(6-クロロピリジン-3-イル)-N³-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-1,3-ジカルボキサミド(HEI_3127)
N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-3-カルボキサミド(0.83g、2.9mmol)及び4-クロロピリジン-3-イルイソシアネート(0.40g、3.2mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_3127を収率26%で得た(0.31g、0.8mmol)。TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:99/1)=0.5;mp (EtOH)=141〜143℃; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 2.20-2.31 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.35-2.41 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.62 (td, J = 18.1, 9.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 3.06 (td, J = 17.6, 9.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 4.50-4.55 (m, 2H, NHCH₂), 4.85 (dd, J = 9.0, 1.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 6.73 (dd, J = 3.9, 1.5 Hz, 1H, ArH), 6.89 (dd, J = 5.5, 3.5 Hz, 1H, ArH), 6.92 (dd, J = 5.5, 1.5 Hz, 1H, ArH), 6.95 (br t, J = 4.6 Hz, 1H, NHCH₂), 7.21 (dd, J = 8.2, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.34 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH), 7.37 (d, J = 1.9 Hz, 1H, ArH), 11.00 (s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.6 (CH₂), 32.2 (CH₂), 41.2 (CH₂), 59.1 (CH), 113.4 (CH), 118.4 (CH), 124.5 (CH), 127.3 (CH), 129.3 (CH), 130.6 (CH), 133.6 (C), 134.0 (C), 134.1 (C), 137.9 (C), 149.6 (C), 170.2 (C), 177.5 (C); IR ν (cm^-1): 3291, 1712, 1660, 1556, 1510, 1343, 1245, 1218, 815, 689; 元素分析:C₁₇H₁₅Cl₂N₃O₃Sの計算値: C, 49.52; H, 3.67; N, 10.19; S, 7.78. 実測値: C, 49.23; H, 3.80; N, 10.00; S, 7.03%.

e')化合物HEI 3204の合成

N³-(2,4-ジクロロベンジル)-N¹-(3,4-ジクロロフェニル)-5-オキソピロリジン-1,3-ジカルボキサミド(HEI_3204)
N-(2,4-ジクロロベンジル)-5-オキソピロリジン-3-カルボキサミド(0.83g、2.9mmol)及び3,4-ジクロロフェニルイソシアネート(0.40g、3.2mmol)を使用して一般手順に従った。所望の生成物が、MeOH中、白色粉末として結晶化し、これをろ過して、純粋なHEI_3204を収率26%で得た(0.31g、0.8mmol)。TLC Rf (CH₂Cl₂/MeOH:99/1)=0.5;mp (EtOH)=141〜143℃; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ ppm 2.20-2.31 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.35-2.41 (m, 1H, CH₂CH₂CH), 2.62 (td, J = 18.1, 9.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 3.06 (td, J = 17.6, 9.4 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 4.50-4.55 (m, 2H, NHCH₂), 4.85 (dd, J = 9.0, 1.6 Hz, 1H, CH₂CH₂CH), 6.73 (dd, J = 3.9, 1.5 Hz, 1H, ArH), 6.89 (dd, J = 5.5, 3.5 Hz, 1H, ArH), 6.92 (dd, J = 5.5, 1.5 Hz, 1H, ArH), 6.95 (br t, J = 4.6 Hz, 1H, NHCH₂), 7.21 (dd, J = 8.2, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.34 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH), 7.37 (d, J = 1.9 Hz, 1H, ArH), 11.00 (s, 1H, NHAr); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ ppm 21.6 (CH₂), 32.2 (CH₂), 41.2 (CH₂), 59.1 (CH), 113.4 (CH), 118.4 (CH), 124.5 (CH), 127.3 (CH), 129.3 (CH), 130.6 (CH), 133.6 (C), 134.0 (C), 134.1 (C), 137.9 (C), 149.6 (C), 170.2 (C), 177.5 (C); IR ν (cm^-1): 3291, 1712, 1660, 1556, 1510, 1343, 1245, 1218, 815, 689; 元素分析:C₁₇H₁₅Cl₂N₃O₃Sの計算値: C, 49.52; H, 3.67; N, 10.19; S, 7.78. 実測値: C, 49.23; H, 3.80; N, 10.00; S, 7.03%.

(実施例2)
本発明の化合物の生物学的適用
統計解析
結果を平均±SEMとして表す。統計解析にはPrism 6ソフトウェア(GraphPad社)を用いた。2つの群間差の重要性を評価するためにマン-ホイットニー検定(*、p<0.05;**、p<0.01;***、p<0.001;****、p<0.0001)を用いた。発生曲線をMantel-Cox(ログランク)検定で分析した。

1)研究1-毒性
HEI 2333及びHEI 2336の毒性は、60個の腫瘍細胞株のNCIパネル(NCI 60-細胞パネル)において既に試験していた。

試験分子(10μM)のいずれもが、細胞外ATPの不在下で、毒性を一切示さなかった(すなわち、増殖の有意な抑制)(データは示さず)。

2)研究2-マウスP2RX7(mP2RX7)を発現する異種性細胞系における本発明の化合物の生物学的活性
P2X受容体のうちのいずれも一切発現しないHEK細胞(模擬)を、mP2rx7遺伝子についてコードしている発現ベクターでトランスフェクトした。カチオンチャネル活性を、Fluo4 AM(インビトロゲン)プローブ、及びTopro3(インビトロゲン)を有する大きい開孔でアッセイした。各実験において、2×10⁶個の細胞を50nM Fluo4-AMで30分間インキュベートした。洗浄後、50μMでの本発明の化合物の存在下で、細胞を500μMのBzATP(3'-O-(4-ベンゾイル)ベンゾイルATP)で1時間処置し、又は処置しなかった。示されているとき、1時間の刺激時間の間にTopro3プローブ(8.5nM)を添加した。蛍光をフローサイトメトリーによりアッセイした。

各化合物を、BzATPの不在下(データを示さず)又は存在下で試験した。図1は、BzATPの存在下で、化合物HEI2314及びHEI2328がTopro3侵入のみを増加させることを示している。

HEI2328が最も活性であり、発明者らは、更なる特徴づけのためにこれを使用している。模擬細胞及びmP2RX7細胞において単独で使用したとき、HEI2328は、チャネル活性も大きい開孔も誘起しなかった。予測したように、BzATPは模擬細胞において不活性である。対照的に、mP2RX7発現細胞では、それは、BzATPの存在下で、15倍のCa2+侵入、及び4倍の大きい開孔で増加する。BzATPと合わせたとき、細胞をBzATPのみで刺激したときに、HEI2328は、61%のTopro3陽性細胞対24.7%で、大きい開孔を増強させる。興味深いことに、発明者らは、ここで、この刺激条件下ではHEI2328がチャネル活性に影響しなかったことを認めた(図2)。

結果として、ATPの存在下で、HEI2328は、細胞死へと至らせる機構である大きい開孔を増強させる。ATPの不在下では毒性作用が見られなかったため、発明者らは、HEI2328が炎症性微小環境(100μM ATP)においてのみ活性であることになり、したがってオフターゲット効果の可能性を低減させると確信している。

2.2.ADME研究もまた実施し、HEI2328とHEI3090との両方が安定な分子であることを示した。
安定性を、マウス肝ミクロソーム系(図13A)及びヒトにおいて(図示せず)、HEI3090分子についてin vivoで直接、研究した(図13B)。これらの実験は、HEI3090を注射した(腹腔内、10%DMSO中1.5mg/kg)マウスの血漿において、最大2.5μMの濃度でHEI3090が見出されることを強調した。

補足的分析もまた実施して、マウスP2RX7(mP2RX7)を発現するHEK細胞(図14)又はヒトP2RX7(hP2RX7)を発現するHEK細胞(図15)との両方において、HEI3090(HEI2328の、より可溶なバージョン)の生物学的活性を記録した。BzATP又はATPは、チャネル活性を刺激し、これは、P2RX7刺激の最初の数分において発生した事象である。その一方で、1時間の刺激は、大きいカチオンパーミエーション(Topro 3流入、図2)の増加のみをトリガーし、15分の刺激が、低用量のHEI3090(250nM)の存在下で、BzATPについてEC50の左へのシフトを証明した。同じ正の効果を、ヒトP2RX7を発現する細胞においても観察した(図15)。

これらの結果は、HEI3090が、P2RX7の正のアロステリックモジュレーターとして作用することの最初のエビデンスである。

3)研究3-大腸炎マウスモデル
・臨床的スコア
P2RX7が、結腸の慢性炎症性疾患であるクローン疾患患者における炎症性応答をモジュレートすることが過去に明示されており(Cesaro Aら、Amplification loop of the inflammatory process is induced by P2X7R activation in intestinal epithelial cells in response to neutrophil transepithelial migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol、2010. 299(1):G32〜42頁)、発明者らは、DSS誘起の大腸炎マウスモデルにおいてHEI2328の効果を試験した。

全てのマウスが第1日から第5日まで適宜、デキストラン硫酸ナトリウム(3%DSS、TbS Consultancy社)を受け、続く10日間は通常の水道水に戻った。対照マウス(n=20)に毎日、プラセボ(PBS/10%DMSO)を腹腔内注射し、その一方で、処置マウスは、PBS/10%DMSO中2.3mg/kg HEI2328を受けた。発明者らは、以下の半定量的な臨床的スコアを用いた:
体重減少を以下の通りスコア付けした:0、減少なし;1、減少<5%;2、減少<10%;3、減少<20%、及び4、減少>20%。
排泄物の粘稠度のスコアを以下の通り測定した:0、正常;1、ゆるい排泄物;2、水様性下痢;又は3、重度の水様性下痢。
直腸出血を以下の通りスコア付けした:0、出血なし;1、点状出血の存在;2、微量の出血を伴う排泄物;又は3、出血。

DSS誘起の大腸炎で予測したように、臨床的スコアは、処置の最初の5日の間、安定である(図3)。第6日から第9日まで、治療群のマウスは、対照群よりも、体重の減少が統計的に少なかった。より重要なことに、HEI2328で処置したマウスは、15日後にそれらの元の体重を回復した。臨床的スコアは、HEI2328で治療したマウスが対照マウスよりも健康であり早く回復することを確認した(図3B)。

結論として、発明者らは、ここで、化合物HEI2328が、大腸炎の臨床的徴候を低減させたことを示した。興味深いことに、発明者らは、化合物HEI2328が、従来のP2RX7アンタゴニストよりも、マウスにおけるDSS誘起の大腸炎の臨床的徴候を低減させるのに有効であることを認めた(Hofman, P.ら、Genetic and Pharmacological Inactivation of the Purinergic P2RX7 Receptor Dampens Inflammation but Increases Tumor Incidence in a Mouse Model of Colitis-Associated Cancer. Cancer Res、2015; Marques, C.C.ら、Prophylactic systemic P2X7 receptor blockade prevents experimental colitis. Biochim Biophys Acta、2014. 1842(1):65〜78頁)。

・組織学的スコア
第15日に、マウスを安楽死させ、直腸から盲腸までの結腸部分を取り出し、測定し、結腸の1/3下部を写実した横断断面、1/3下部から直腸までを写実した縦断断面において、組織学的スコアを確立した。炎症スコアを、訓練を受けたの病理学者が実施した。簡潔に言うと、炎症の重篤度(なし、軽度、中等度、重度)、炎症の程度(なし、粘膜、粘膜下及び壁内)、陰窩損傷(なし、基底〜1/3、基底〜2/3、陰窩欠損、陰窩及び上皮欠損)、並びに炎症により影響を受けた組織の百分率(0、25、50、75及び100%)をスコア付けした。

図4Aは、HEI2328で処置したマウスからの炎症スコアが非常に低い炎症指数を明示し、これが対照群と比べて統計的に有意であったことを示した。

結論として、化合物HEI2328は、非常に効能のある、大腸炎の阻害剤である。

・免疫パターン
HEI2328がマウスにおけるDSS誘起の大腸炎を強力に阻害するという観察は、反直感的である。実際に、BzATPを増強して大きい開孔を増加させることによって、IL1Bの生成の増加、及び結果として大腸炎の悪化を予測することができた。P2RX7は免疫細胞によって発現されるので、発明者らは、処置マウス対非処置マウスの脾臓内の各免疫細胞集団の割合を特徴づけることを考えた。図5Aに示す通り、発明者らは、HEI2328で処置したマウスにおける、リンパ球集団(76%に対して67%)について好ましい骨髄浸潤の有意な低下(17%に対して28%)を観察した。リンパ球集団内で、TregとTγδリンパ球との両方が増加している(図5B)。骨髄浸潤内で、HEI2328は炎症性単球(CD11b⁺CD11c^-Ly6c⁺Ly6g^-CD3^-NK1.1^-B220^-)の割合を統計的に減少させた。対照的に、HEI2328での処置は、従来のDC(cDC)と形質細胞様DC(pDC)との両方の割合を変更しなかった(図5C、図5D)。

結論として、化合物HEI2328は、炎症性単球の割合を減少させる。これは、HEI2328が、DSS誘起の結腸炎症をいかにして鈍らせるを説明することができた。

そのため、大腸炎マウスモデルにおいて、発明者らは、化合物HEI2328が、DSS誘起の結腸炎症を鈍らせることを示した。この結果は、炎症性疾患の治療における非常に興味深い視点を切り開く。

4)研究4-同系腫瘍マウスモデル
4.1.処置マウスの脾臓においてHEI2328がM-MDSC(骨髄由来サプレッサー細胞)の割合に影響を与えたことを明示しており、発明者らは、HEI2328が免疫抑制を低減し、したがって抗腫瘍応答を強化しうるという仮説を設けた。この仮説を試験すべく、免疫担当性C57BI6J(Envigo、Gannat France社)マウスに黒色腫細胞株B16-F10を注射した。第1に、発明者らは、B16F10細胞がHEI2328処置に感応性であることをin vitroで明示した。図6に示す通り、BzATPで処置した細胞にHEI2328を添加すると、大きい開孔は6倍超増加し、これは、Topro3陽性細胞の数の増加により例示される。興味深いことに、発明者らは、BzATPの不在下で、HEI2328単独は毒性作用を有していないことを認めた。

これらの結果は、ATPの存在下で、HEI2328はB16F10細胞に細胞毒性作用を及ぼすことを示唆している。したがって、発明者らは、この化合物を、従来の腫瘍マウスモデルにおいて試験した。5×10⁵個のB16F10細胞(200μL PBS中)をC57Bl6マウスの右脇腹に皮下注射し、12日間、毎日、2.3mg/kgのHEI2328(PBS/10%DMSO中)又はプラセボ(PBS/10%DMSO)の腹腔内注射を受けた。図7Aに示す通り、処置群において、腫瘍発生は遅延し、腫瘍増殖は20%低減した(図7B、図7C)。ただし、この励まされる結果は統計的に有意ではなかった。

HEI2328は難溶性であったので、新しい分子は、芳香環中で直接、塩素1つを窒素1つに置換して合成され、そのようにして化合物HEI3090を得た。この新しい化合物HEI3090は、BzATPの存在下で、大きい開孔を増強して、その効果を媒介するために機能的P2RX7を必要とし、その理由は、トランスジェニックP2rx7 KOマウスから単離された脾細胞においてTopro3の組み込みが失われるからである(図8A)。ヒトP2RX7を発現する異種性細胞系を用いて、発明者らは、HEI3090がBzATPの存在下で大きい開孔を強化することを明示した(図8B)。実際に、同じBzATP濃度で、より多くの細胞がTopro3染色に陽性である。

興味深いことに、図9で例示する通り、大きい開孔の増強は、B16F10細胞死の増加と比例した。BzATP及びHEI3090で1時間処置した細胞は、BzATPのみで処置した細胞よりも3倍多いTopro3を組み入れた(図9A)。インキュベーションが長いほど、細胞死が増加し、その理由は、3時間の処置後に最大80%の死細胞を観察したためである(図9B)。

4.2.腫瘍細胞を殺すことによって、HEI3090は新しい抗腫瘍治療を表しうる。この仮説を試験するために、免疫担当性C57Bl6Jマウスに5×10⁵個のB16F10細胞又は5×10⁵個のLLC(ルイス肺がん)細胞を皮下注射し、毎日、HEI3090(腹腔内、10%DMSO/PBS中2.5mg/kg)又はプラセボ(10%DMSO/PBS)で処置した。図10に示す通り、HEI3090は腫瘍増殖を強力に阻害する。第1に、第1日から第4日に、HEI3090を受けた群で腫瘍の出現が遅延し(図10A、図10C)、第2に、腫瘍体積及び腫瘍重量が劇的に減少した(図10B、図10D)。腫瘍マウスモデルの両方において、B16F10モデルにおいては処置群の腫瘍重量は1/10に低減し(81mgに対して8mg)、LLCモデルにおいては1/4に低減した(295mgに対して80mg)。興味深いことに、HEI3090処置群からの腫瘍は、プラセボ群からの腫瘍よりも免疫原性である。実際に、HEI3090の存在下で、腫瘍は、2倍多い主要複合体組織適合体1(MCH1)及びPD-L1を発現し(図10E)、腫瘍はCD45陽性細胞で富化されている(図10F)。

発明者らは、HEI3090が免疫原性細胞死(ICD)を誘起することができるという仮説を試験するために、この目的のための実験を実施した。発明者らは、図16において、HEI3090がICDを強化しないが、むしろP2RX7発現免疫細胞を刺激することによってその抗腫瘍効果を強化することを明白に示した。

更に、図10は、HEI3090治療が腫瘍免疫原性を増加させたことを示している。したがって、発明者らは、HEI3090治療と抗PD-1治療との両方を併用し、これらの併用治療が腫瘍保持マウスを治癒するだけでなく、メモリーT細胞応答をセットアップすることを示した(図19)。

P2RX7が免疫細胞により高度に発現されるため、発明者らは、免疫区画におけるHEI3090の効果を決定することを考えて、腫瘍浸潤性免疫細胞の組成を特徴づけた。図11Aに示す通り、HEI3090処置群からの腫瘍浸潤は、より少ない免疫抑制細胞を含有していた(B16F10腫瘍中ではより少ないM-MDSC、LLC腫瘍中ではより少ないPMN-MDSC)。加えて、HEI3090治療は、エフェクター応答をおそらくは増加させ、その理由は、エフェクター細胞(Tγδ、NK、CD4+)と総MDSCとの比が、エフェクター細胞に好ましいからである(図11B)。

HEI3090が抗腫瘍免疫応答に影響したことを明示して、発明者らは、どの免疫細胞がキープレイヤーであるかを決定することを目指した。第1に、発明者らは、T CD4+リンパ球を枯渇させた。図12に示す通り、HEI3090と抗T CD4+抗体との両方で治療した群からの腫瘍は、HEI3090群からの腫瘍よりも大きく、プラセボ群からの腫瘍よりも小さい。この中間表現型は、他の免疫細胞が、HEI誘起の抗腫瘍応答に包含されていることを示唆している。図17に示す通り、NK細胞とCD4+細胞との両方が、HEI3090抗腫瘍効果を送信するのに必要とさるが、T CD8+細胞はそうではない。発明者らはまた、これらの2種の免疫細胞集団が活性化されて、HEI3090Iで処置されたマウスの腫瘍において、より多くのIFN-γを発現させることも示した(図17E〜図17G)。

IFN-γ分泌細胞がIL18によって活性化されるため、発明者らは、HEI3090抗腫瘍効果がIL18に依存しているかどうかを試験した(図18)。第1に、発明者らは、HEI3090が、周知のIL18生成細胞である樹状細胞においてP2RX7発現を増加させたことを示した。第2に、発明者らは、血漿と腫瘍との両方においてHEI3090を受けたマウスでIL18が過剰発現することを示した。第3に、2つの異なるアプローチ(IL18抗体をブロックする、及びIl18^-/-マウスをブロックする)を用いて、発明者らは、IL18なしで、HEI3090が腫瘍増殖をもはやブロックしなかったことを明示した。これらの結果は、HEI3090の標的としてのIL18を強調した。

結論として、以下であると思われる:
- HEI3090は、ATP豊富な微小環境中でP2RX7を増強する第1の分子である。
- HEI3090は、内因性P2RX7のリガンド(ATP)の不在下で非毒性であり、これは、炎症性及び/又は腫瘍の微小環境中でのみ見出される。これを、hP2PX7又はmP2RX7で安定にトランスフェクトしたHEK細胞株において、及び60個のヒト腫瘍細胞株のNCIパネルにおいて試験した。
- HEI3090は、P2RX7に特異的であり、これは、P2rx7^-/-マウスから調製した脾細胞において試験したときの、効果の不在により明示される。
- HEI3090は、P2RX7の正のアロステリックモジュレーターであり、ATP及び3'-O-(4-ベンゾイル)ベンゾイルATP(BzATP)についてEC₅₀を低下させ、P2RX7発現細胞の、ATP誘起の細胞死を増加させる。
- HEI3090は、同系マウス腫瘍モデルにおける肺(ルイス肺癌)及び黒色腫(B16-F10)の腫瘍増殖をブロックし、これは、療法的に処置したマウスにおける第22日から第50日のマウス全生存期間の増加によって証明される。
- HEI3090抗腫瘍効果は、部分的に、T CD4+リンパ球によって媒介される。
- HEI3090は、IL18細胞及びNK細胞により媒介される抗腫瘍応答をトリガーし、これは、IL18が枯渇しているマウス(抗体マウス及びIl18^-/-マウスをブロックする)及びNK細胞(抗NK1.1抗体)が枯渇しているマウスにおける、化合物の効果の欠如により証明される。
- HEI3090は、腫瘍免疫原性を増加させ、これは、MHC-I及びPD-L1について陽性である腫瘍細胞の数の増加により証明される。
- HEI3090は、抗PD-1治療と併用したときに、LLC腫瘍保持マウスを治癒させる。
- HEI3090は、メモリーT細胞応答を誘起する。

興味深いことに、発明者らは、処置マウスの脾臓内で免疫細胞の変更を一切検出することができなかった。HEI3090がATPの存在下でのみ活性であることを明示しているこれらのin vitroの結果に伴い、in vivoのHEI3090が、高レベルのATPを含有すると知られる炎症性及び腫瘍の微小環境中でのみ活性であることが確信される。総括すると、これらのデータは、HEI3090化合物を使用したときに、オフターゲット効果が全く予測されない又はほとんど予測されないであろうことを示唆している。

Claims (16)

1. 式(I):
   

   

   (式中、
   R1は、C1〜C14アルキル、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表し、ここで、前記アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基は、非置換であり、又は
   - ハロゲン原子、
   - C1〜C6アルコキシ基、
   - C1〜C6アルキル基、及び
   - C1〜C6ハロゲノアルキル基、
   から選ばれる少なくとも1つの基で置換されており、
   R2は、アリール基、アラルキル基又はシクロアルキル基を表し、ここで、前記アリール基又は前記アラルキル基は、非置換であり、又はハロゲン原子から選ばれる少なくとも1つの基で置換されており、
   ここで、前記化合物は、化合物:
   

   

   とは異なり、
   ここで、前記化合物は、R1及びR2がそれぞれ同時に、以下のヘテロアリール基:
   

   

   を表さないようなものである)
   の化合物、それらの鏡像異性体及び医薬として許容されるそれらの塩から選ばれる化合物。
2. 鏡像異性体(S)である、請求項1に記載の化合物。
3. 前記シクロアルキルが、1〜12個の炭素原子を含む環状飽和炭化水素基であり、好ましくはシクロヘキシルメチル、アダマンチル及びシクロヘキシルから選ばれる、請求項1又は2に記載の化合物。
4. 前記アリールが、少なくとも1個のハロゲン原子、1つのC1〜C6アルコキシ基、及び/又は1つのC1〜C6ハロゲノアルキル基により任意選択で置換されていてもよく、好ましくは2-クロロフェニル、4-クロロフェニル、2-ブロモフェニル、2-ヨードフェニル、2,4-ジクロロフェニル、3,4-ジクロロフェニル、2,4-ジメトキシフェニル、3-トリフルオロメチルフェニル、3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル及び2,4,6-トリメチルフェニルから選ばれる、単環式又は多環式の芳香族炭化水素基である、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
5. 前記アラルキルが、非置換であり、又は少なくとも1個のハロゲン原子、1つのC1〜C6アルコキシ基、1つのC1〜C6アルキル基又は1つのC1〜C6ハロゲノアルキル基により置換されており、好ましくはベンジル、2-クロロベンジル、2,4-ジクロロベンジル、3,4-ジクロロベンジル及び2,4-ジクロロフェネチルから選ばれる、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
6. 前記ヘテロアリールが、芳香環の少なくとも1個の炭素原子がヘテロ原子、好ましくは窒素により置換されているアリール基であり、好ましくは前記ヘテロアリールが、非置換であってもよく、又は少なくとも1個のハロゲン原子、1つのC1〜C6アルコキシ基、及び/若しくは1つのC1〜C6ハロゲノアルキル基により置換されていてもよく、より好ましくは前記ヘテロアリールが、6-クロロピリジン-3-イル又はチオフェン-2-イルである、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
7. 式(I'):
   

   

   (式中、R1は、請求項1で定義された通りである)
   を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。
8. 以下の化合物:
   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   並びに医薬的に許容されるそれらの塩から選ばれる、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物。
9. 医薬としての使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物。
10. 炎症性疾患及び/又はがんを予防する及び/又は治療するための使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物。
11. 前記炎症性疾患が、関節リウマチ、クローン病、炎症性腸疾患、変形性関節症及び骨粗鬆症から好ましくは選ばれる慢性炎症性疾患であり;及び/又は、前記がんが、結腸がん、結腸直腸がん、黒色腫、乳がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、膵がん、グリオーマ、子宮頸がん、子宮内膜がん、頭頚部がん、肝がん、腎がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、尿路上皮がん若しくは副腎皮質癌から選択されるが、リンパ腫等の非固形がんからも選択される、請求項10に記載の使用のための化合物。
12. a)請求項1から8のいずれか一項に記載の少なくとも1種の化合物と、
    b)少なくとも1種の付加的な療法と
    を含む、がんの治療及び/又は予防における、同時の、別々の又は順次の使用のための併用製品としての製品。
13. 前記付加的な療法b)が、抗チェックポイント抗体から選ばれ、好ましくは抗PD1抗体から選ばれ、より好ましくはニボルマブ及びペンブロリズマブから選ばれ、及び/又は前記がんが、肺がん、好ましくはルイス肺がんである、請求項12に記載の製品。
14. 前記化合物が、P2RX7モジュレーターである、請求項9から13のいずれか一項に記載の使用のための、化合物。
15. 医薬として許容される担体中に、請求項1から8のいずれか一項に記載の少なくとも1種の化合物を含む、医薬組成物。
16. 炎症性疾患及び/又はがんを予防する及び/又は治療するための使用のための、ATPの存在下で大きい開孔を介して細胞死を誘起することができる化合物である、P2RX7モジュレーター。

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