JP2021508737A - 細胞標的複合体の調製のための遷移金属ベースの官能性部分 - Google Patents
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Abstract
本発明は、遷移金属ベースのリンカー及びそれに結合した一次官能性部分を含む二次官能性部分に関する。本発明による二次官能性部分は、シス白金（ＩＩ）錯体などの遷移金属錯体を含み、この錯体は、第１の配位子として一次官能性部分（例えば、未修飾又は修飾細胞毒性薬物）を、及び第２の配位子としてヨウ化物、臭化物又は塩化物を有する。脱離配位子としてヨウ化物又は臭化物基、特に脱離配位子としてヨウ化物基を含む二次官能性部分は、細胞結合部分（例えば、抗体）に対してさらに改善された結合効率を示すことが見出された。さらに、脱離配位子としてヨウ化物又は臭化物を含む二次官能性部分は、脱離配位子として塩化物を含む二次官能性部分と比較して、加水分解的にかなり安定である。本発明はまた、本発明のリンカーを含む細胞標的複合体に関する。本発明はさらに、前記細胞標的複合体を含む医薬品、及び癌の診断及び治療における細胞標的複合体の使用に関する。
Description
本発明は、遷移金属ベースのリンカー及びそれに結合した一次官能性部分を含む二次官能性部分に関する。本発明はまた、本発明のリンカーを含む細胞標的複合体に関する。本発明はさらに、前記細胞標的複合体を含む医薬品、及び癌の診断及び治療における細胞標的複合体の使用に関する。
抗体‐薬物複合体（ＡＤＣ）としても知られる細胞標的複合体は、免疫グロブリンの薬物動態、特異性、及び生体内分布と小分子薬物の細胞殺傷特性を組み合わせる効力を持つ比較的新しいクラスの生物療法である。抗体などの免疫グロブリン分子に結合された薬物の送達は、優先的には癌性細胞のみを特異的に標的とし、治療効果を改善し、癌の治療に使用される薬物の全身毒性を低減するための貴重なツールと見なされる。非標的薬物化合物は通常、全身分布及び細胞膜を介した受動拡散又は受容体媒介取り込みを介して目的の標的細胞に到達するが、標的薬物は主に標的組織に留まり、濃縮する。その結果、標的薬物はより少ない投与量を必要とする一方で、薬物が標的細胞内で治療的に有効なレベルに到達することを可能にし、したがって治療ウィンドウを改善する。したがって、薬物を特定の細胞にターゲティングすることは、特異性を高め、全身毒性を低減し、全身薬物としてあまり適さない又は不適切な化合物の治療的使用を可能にする概念的に魅力的な方法である。
細胞標的複合体の一般的な概念は単純であるが、それらの臨床使用の成功は、免疫グロブリンの選択、細胞毒性薬の選択、そして重要なことに、細胞毒性薬を免疫グロブリンに結合する方法の選択などの多くの要因に依存する。これは、細胞標的複合体の薬物動態、特異性、生体内分布、及び毒性が、これらのビルディングブロックのいずれかによって影響を受ける可能性があるからである。リンカーは抗体薬物複合体の重要な部分であり、循環における安定性、薬物動態、及び対象部位での毒性薬物の放出を説明する。したがって、リンカーシステムは、細胞標的複合体の特性にかなり影響を与える可能性があり、したがって、細胞標的複合体の有効性及び毒性にとって重要である。
ほとんどの結合技術は、反応性エステル又はマレイミド官能基を介した免疫グロブリンへの有機リンカーの共有結合を利用して、免疫グロブリンのリジン又はシステイン残基への結合をそれぞれ可能にする。しかしながら、上記の共有結合リンカー技術を含む細胞標的複合体は、例えば、次善の治療ウィンドウに関連していることが認識されている。最近、ＡＤＣを開発するバイオコンジュゲーション反応でリンカーとしてエチレンジアミン白金（ＩＩ）を使用する先駆的なアプローチについて説明した。最初のステップでは、エチレンジアミン白金（ＩＩ）を、Ｎ‐複素環配位子などの非従来型の機能を持つ薬物に調整して、保存可能な「半最終生成物」を提供できる。２番目のステップでは、リンカー‐薬物の半最終生成物を直接、特異的かつ効率的に免疫グロブリンに結合させることができる。遷移金属錯体の使用は、効果的な細胞標的複合体を生成するための、手軽で洗練された堅牢な手段を提供することが示される（ＷＯ２０１３／１０３３０１）。これらの特性に基づいて、白金ベースのリンカーテクノロジーなどの遷移金属ベースのリンカーは、ｍＡｂと薬物を簡単に変更できるモジュール式プラグアンドプレイＡＤＣ開発プラットフォームへの道を開くことができる。前記リンカー技術の可能性は、最近、アウリスタチンＦ結合トラスツズマブ（トラスツズマブ‐Ｌｘ‐ＡＦ）の調製において実証された。トラスツズマブ‐Ｌｘ‐ＡＦの単回投与は、胃癌（ＮＣＩ‐Ｎ８７）及びＡｄｏ‐トラスツズマブ・エムタンシン耐性乳癌（ＪＩＭＴ‐１）の異種移植マウスモデルにおいて、マレイミドベンチマークのトラスツズマブ‐ｍａｌ‐ＡＦ及びＦＤＡ承認のＡｄｏ‐トラスツズマブ・エムタンシンを上回った。
遷移金属錯体は、そのユニークな化学的特徴により、従来の共役化学での化学反応基の欠如やペイロード上の不要な化学反応基の存在など、細胞標的複合体の分野でよく遭遇する課題を克服できる。さらに、細胞標的複合体の生成に古典的なリンカーシステムを使用するときに容易に遭遇する薬物結合後の免疫グロブリンの凝集体形成を減少させることができる。
さらに、免疫グロブリンの改変、例えば、システインを解放するための免疫グロブリンのヒンジ領域のジスルフィド架橋の還元又は遺伝子工学によるシステインの導入は、現在のほとんどの有機リンカー技術で必要とされるように、遷移金属錯体がリンカーとして使用される本方法では必要ない。
遷移金属錯体を使用して毒性薬物を免疫グロブリンに結合すると、生体免疫グロブリンと同様の薬物動態特性、特異性、及び生体内分布プロファイルを有する細胞標的複合体を非常に安定にする。これは特に重要である。なぜなら、細胞結合部分（免疫グロブリンなど）の免疫反応性などの機能が十分に高く、その生体内分布プロファイルが変わらない場合のみ、体内の目的の場所に治療用化合物として複合薬物を送達できるからである。細胞標的複合体は、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）及びＫａｄｃｙｌａ（登録商標）の最近の承認により「転換点」に達したが、これらは細胞標的複合体の分野における第１世代の治療法と見なされるべきである。現状の技術では、薬物と抗体の安定した結合を実現するために、ＡＤＣは、特定の臨床アプリケーションごとに、多くの場合複雑で段階的な結合ルートに従って開発する必要がある。このアプローチは、とりわけ開発時間とリソースの使用に関して非効率的であり、例えば有効性と毒性のバランス（治療ウィンドウ）の観点で、ＡＤＣの適用性が制限されることになる。したがって、ＡＤＣ開発における次のイノベーションの波には、より用途の広いリンカーテクノロジーを使用した細胞標的複合体、より大きな有効性の可能性、及び治療ウィンドウの大幅な改善が必要である。したがって、臨床的に関連する細胞標的複合体のより迅速で効率的で体系的な開発、特性評価、及び製造が明らかに求められている。
本発明は、ＡＤＣの開発及び製造に対する効率的かつモジュール式のアプローチを可能にする。本発明は、ＡＤＣ開発のために、遷移金属錯体に結合し、したがって二次官能性部分を形成する一次官能性部分の使用を予測する。これらの二次官能性部分又は半最終生成物は、ＧＭＰに従って簡単かつ効率的に製造し、保存して、たとえば目的の未修飾抗体又は他の適用可能な細胞結合部分に簡単かつ効率的な方法で結合できる。
本発明の第１の態様は、以下の式Ｉによる二次官能性部分に関する。
ここで、Ｍは遷移金属錯体、好ましくは白金（ＩＩ）錯体であり、配位子Ｌ１又はＬ２の１つはヨウ化物、臭化物又は塩化物から選択され、他の配位子は一次官能性部分である。Ｎｕは求核基であり、ここでＮｕ１及びＮｕ２は同じ基又は異なる基であり得、これらは一緒に二座配位子を形成するが、但し、前記二座配位子はエタン‐１，２‐ジアミンではない。
ここで、Ｍは遷移金属錯体、好ましくは白金（ＩＩ）錯体であり、配位子Ｌ１又はＬ２の１つはヨウ化物、臭化物又は塩化物から選択され、他の配位子は一次官能性部分である。Ｎｕは求核基であり、ここでＮｕ１及びＮｕ２は同じ基又は異なる基であり得、これらは一緒に二座配位子を形成するが、但し、前記二座配位子はエタン‐１，２‐ジアミンではない。
本二次官能性部分の発明者らは、それらが細胞標的複合体の調製に特に有用であることを見出した。さらに、前記二次官能性部分を細胞結合部分（抗体など）に引き続いて結合させ、それにより細胞標的複合体を提供するために、第２の配位子が、好ましくはヨウ化物又は臭化物から選択される脱離配位子であることが有利であることが見出された。ただし塩化物も使用できるが、あまり有利ではないと考えられている。塩化物が前述の二次官能性部分の脱離基として使用される場合、塩化物は、好ましくは、細胞標的部分への結合の前又は間に、臭化物又はヨウ化物、好ましくはヨウ化物と交換される。ヨウ化物又は臭化物を脱離配位子として使用すると、二次官能性部分を細胞結合部分に結合する効率、及び二次官能性部分の加水分解安定性の向上にかなりの予想外の効果があることがわかった。この結合効率の向上と、ＡＤＣ分野で使用される典型的な細胞毒性化合物の高コストを考慮すると、細胞標的複合体の製造コストを大幅に下げることができる。
本発明による二次官能性部分は、シス‐白金（ＩＩ）錯体などの遷移金属錯体を含み、この錯体は、第１の配位子として一次官能性部分（例えば、未修飾又は修飾細胞毒性薬物）を、第２の配位子としてヨウ化物、臭化物又は塩化物を有する。脱離配位子としてヨウ化物又は臭化物基、特に脱離配位子としてヨウ化物基を含む二次官能性部分は、細胞結合部分（例えば、抗体）に対してさらに改善された結合効率を示すことが見出された。さらに、脱離配位子としてヨウ化物又は臭化物を含む二次官能性部分は、脱離配位子として塩化物を含む二次官能性部分と比較して、加水分解的にかなり安定である。
本発明の第２の態様は、式Ｉによる二次官能性部分のハロゲン化物配位子Ｌ１又はＬ２が細胞結合部分によって置換されている、前述の請求項のいずれかに記載の、反応した二次官能性部分を含む細胞標的複合体に関する。
本発明の第３の態様は、本発明の細胞標的複合体を含む医薬組成物に関する。
定義
本明細書で使用される「細胞標的複合体」という用語は、その従来の意味を有し、治療用化合物、診断用化合物、キレート剤、色素などの一次官能性部分、又は抗体のような細胞結合部分にリンカーを介して結合された任意のモデル化合物を指す。抗体を含む細胞標的複合体は、抗体‐薬物複合体とも呼ばれる。しかし、本発明の範囲内では、抗体以外の他のタイプの細胞結合部分を使用できることに留意されたい。
本明細書で使用される「細胞標的複合体」という用語は、その従来の意味を有し、治療用化合物、診断用化合物、キレート剤、色素などの一次官能性部分、又は抗体のような細胞結合部分にリンカーを介して結合された任意のモデル化合物を指す。抗体を含む細胞標的複合体は、抗体‐薬物複合体とも呼ばれる。しかし、本発明の範囲内では、抗体以外の他のタイプの細胞結合部分を使用できることに留意されたい。
本明細書で使用される「細胞結合部分」という用語は、その従来の意味を有し、特定の結合ペアのメンバー、すなわち、分子のペアの一方が、他の分子の特定の空間及び極性組織に特異的に結合し、したがってそれと相補的であると定義されているその表面の領域又はキャビティを有する、分子のペアのメンバーを指し、その結果、分子ペアは相互に特異的に結合する特性を持っている。本発明による細胞結合部分の例は、抗体及び抗体フラグメントである。
本明細書で使用される「一次官能性部分」（ＰＦＭ）という用語は、遷移金属錯体と配位結合を形成する構造的能力を有する分子を指す。典型的な一次官能性部分は、Ｐｔ（ＩＩ）などの金属中心に配位結合を作ることができる適切な配位基を有している、又は備えている治療用化合物（つまり、薬物）又は診断用化合物（つまり、トレーサー又は色素）である。
本明細書で使用される「二次官能性部分」（ＳＦＭ）又は「半最終生成物」という用語は、第１の配位子及び第２の配位子を有する、白金錯体などの遷移金属錯体を含む分子を指し、第１の配位子は上記で定義される「一次官能性部分」（例えば、修飾又は非修飾の細胞毒性薬物）であり、第２の配位子は、ヨウ化物、臭化物又は塩化物、好ましくはヨウ化物又は臭化物である。二次官能性部分が細胞結合部分に結合することを可能にするとき、第２の配位子（例えば、ヨウ化物又は臭化物）は、細胞結合部分によって置換される。したがって、一次官能性部分（たとえば、修飾又は未修飾の細胞毒性薬）と細胞結合部分（たとえば、抗体）が互いに結合している場合、遷移金属錯体はそれらの間のリンカーとして機能する。
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、その従来の意味を有し、細胞結合部分と一次官能性部分の間に橋のような構造を形成し、後者の２つが互いに結合するような化学部分を指す。
本明細書で使用される「配位子」という用語は、その従来の意味を有し、中心金属イオン又は原子に結合して配位錯体を形成するイオン（ハロゲン化物など）又は分子（一次官能性部分など）を指す。
本明細書で使用される「遷移金属錯体」という用語は、その従来の意味を有し、配位中心と呼ばれる中心遷移金属原子又はイオン、及び配位子又は錯化剤として知られる結合分子又はイオンの周囲のアレイを指す。本発明で使用される好ましい遷移金属錯体の特定の例は、白金（ＩＩ）錯体である。
本明細書で使用される「Ｌｘ」という用語は、金属中心と二座配位子との組み合わせを含む遷移金属錯体Ｍ（Ｎｕ１‐Ｎｕ２）の構造フラグメントを指す。
ここで、Ｍは金属イオン又は原子を表し、好ましくはＰｔ（ＩＩ）であり、Ｎｕは求核基であり、Ｎｕ１及びＮｕ２は構造的に同じ基又は異なる基であることができ、Ｎｕ１とＮｕ２の間の点線と共に二座配位子を表す。
ここで、Ｍは金属イオン又は原子を表し、好ましくはＰｔ（ＩＩ）であり、Ｎｕは求核基であり、Ｎｕ１及びＮｕ２は構造的に同じ基又は異なる基であることができ、Ｎｕ１とＮｕ２の間の点線と共に二座配位子を表す。
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、以下の式Ｉによる二次官能性部分に関する。
ここで、Ｍは遷移金属錯体であり、配位子Ｌ１又はＬ２の１つはヨウ化物、臭化物又は塩化物から選択され、他の配位子は一次官能性部分である。Ｎｕは求核基であり、ここでＮｕ１及びＮｕ２は同じ基又は異なる基であり得、これらは一緒に二座配位子を形成するが、但し、前記二座配位子はエタン‐１，２‐ジアミンではない。
本発明の第１の態様は、以下の式Ｉによる二次官能性部分に関する。
ここで、Ｍは遷移金属錯体であり、配位子Ｌ１又はＬ２の１つはヨウ化物、臭化物又は塩化物から選択され、他の配位子は一次官能性部分である。Ｎｕは求核基であり、ここでＮｕ１及びＮｕ２は同じ基又は異なる基であり得、これらは一緒に二座配位子を形成するが、但し、前記二座配位子はエタン‐１，２‐ジアミンではない。
式Ｉで言及される二座配位子の例は、プロパン‐１，２‐ジアミン（２）、ブタン‐２，３‐ジアミン（３）、２‐メチルプロパン‐１，２‐ジアミン（４）、２，３‐ジアミノブタン‐１，４‐ジオール（５）、２，３‐ジアミノプロパン酸（６）、２，３‐ジアミノコハク酸（７）、３，４‐ジアミノブタン酸（８）、Ｎ１、Ｎ２‐ジメチルエタン‐１、２‐ジアミン（９）、Ｎ１‐メチルエタン‐１，２‐ジアミン（１０）、Ｎ１、Ｎ１‐ジメチルエタン‐１，２‐ジアミン（１１）、Ｎ１、Ｎ１、Ｎ２‐トリメチルエタン‐１，２‐ジアミン（１２）、Ｎ１、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ２‐テトラメチルエタン‐１，２‐ジアミン（１３）、Ｎ１、Ｎ２‐ジエチルエタン‐１，２‐ジアミン（１４）、Ｎ１、Ｎ２‐ジプロピルエタン‐１，２‐ジアミン（１５）、Ｎ１、Ｎ２‐ジイソプロピルエタン‐１，２‐ジアミン（１６）、２‐（（２‐アミノエチル）アミノ）エタン‐１‐オール（１７）、２，２’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（アザンジイル）））ビス（エタン‐１‐オール）（１８）、２，２’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（アザンジイル））ビス（ブタン‐１‐オール）（１９）、２，２’、２’’、２’’’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（アザントリイル））テトラキス（エタン‐１‐オール）（２０）、３‐（（２‐アミノエチル）アミノ）プロパン‐１‐オール（２１）、（２‐アミノエチル）グリシン（２２）、３‐（（２‐アミノエチル）アミノ）プロパン酸（２３）、２，２’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（アザンジイル））二酢酸（２４）、３、３’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（アザンジイル））ジプロピオン酸（２５）、３‐（（２‐アミノエチル）アミノ）プロパン‐１‐スルホン酸（２６）、Ｎ１‐（２‐アミノエチル）エタン‐１，２‐ジアミン（２７）、Ｎ１‐（２‐アミノエチル）‐Ｎ１‐メチルエタン‐１，２‐ジアミン（２８）、Ｎ１、Ｎ１‐ビス（２‐アミノエチル）エタン‐１，２‐ジアミン（２９）、ピペラジン（３０）、デカヒドロキノキサリン（３１）、デカヒドロキノキサリン‐６‐カルボン酸（３２）、（デカヒドロキノキサリン‐６‐イル）メタノール（３３）、ピロリジン‐２‐イルメタンアミン（３４）、１‐（ピロリジン‐２‐イル）エタン‐１‐アミン（３５）、２，２’‐ビピロリジン（３６）、ピペリジン‐２‐イルメタンアミン（３７）、１‐（ピペリジン‐２‐イル）エタン‐１‐アミン（３８）、２，２’‐ビピペリジン（３９）、ピロリジン‐３‐アミン（４０）、４‐アミノピロリジン‐３‐オール（４１）、ピロリジン‐３‐イルメタンアミン（４２）、シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン（４３）、４‐メチルシクロヘキサン‐１，２‐ジアミン（４４）、Ｎ１、Ｎ２‐ジメチルシクロヘキサン‐１，２‐ジアミン（４５）、Ｎ１、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ２‐テトラメチルシクロヘキサン‐１，２‐ジアミン（４６）、シクロヘキサ‐４‐エン‐１，２‐ジアミン（４７）、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）‐３、４‐ジアミノ‐６‐（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ‐２Ｈ‐ピラン‐２、５‐ジオール（４８）、（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，８ａＳ）‐６‐メトキシ‐２‐フェニルヘキサヒドロピラノ［３，２‐ｄ］［１，３］ダイオキシン‐７，８‐ジアミン（４９）、シクロペンタン‐１，２‐ジアミン（５０）、シクロブタン‐１，２‐ジアミン（５１）、シクロプロパン‐１，２‐ジアミン（５２）、１‐ベンジルピロリジン‐３，４‐ジアミン（５３）である。
式Ｉで言及される二座配位子のさらなる例は、プロパン‐１，３‐ジアミン（５４）、ブタン‐１，３‐ジアミン（５５）、ブタン‐１，３‐ジアミン（５６）、２，４‐ジアミノブタン酸（５７）、２，４‐ジアミノペンタン二酸（５８）、２，２‐ジメチルプロパン‐１，３‐ジアミン（５９）、シクロブタン‐１，１‐ジイルジメタンアミン（６０）、（テトラヒドロ‐２Ｈ‐ピラン‐４，４‐ジイル）ジメタンアミン（６１）、２，２‐ビス（アミノメチル）プロパン‐１，３‐ジオール（６２）、シクロヘキサン‐１，１‐ジイルジメタンアミン（６３）、２‐メチルプロパン‐１，３‐ジアミン（６４）、１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール（６５）、２‐（アミノメチル）‐２‐メチルプロパン‐１，３‐ジアミン（６６）、１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オン（６７）、Ｎ１‐メチルプロパン‐１，３‐ジアミン（６８）、１，３‐ビス（ジメチルアミノ）プロパン‐２‐オール（６９）、１，３‐ビス（メチルアミノ）プロパン‐２‐オール（７０）、（３‐アミノプロピル）グリシン（７１）、２‐（（３‐アミノプロピル）アミノ）エタン‐１‐オール（７２）、２，２’‐（プロパン‐１，３‐ジイルビス（アザンジイル））ビス（エタン‐１‐オール）（７３）、１，４‐ジアゼパン（７４）、１‐アミノ‐３‐（（２‐ヒドロキシエチル）アミノ）プロパン‐２‐オール（７５）、２，２’‐（（２‐ヒドロキシプロパン‐１，３‐ジイル）ビス（アザンジイル））ビス（エタン‐１‐オール）（７６）、Ｎ１‐（３‐アミノプロピル）ブタン‐１，４‐ジアミン（７７）、Ｎ１、Ｎ１’‐（ブタン‐１，４‐ジイル）ビス（プロパン‐１，３‐ジアミン）（７８）である。
式Ｉによって参照される二座配位子のさらに他の例は、ブタン‐１，４‐ジアミン（７９）、２，５‐ジアミノペンタン酸（８０）、２‐メチルブタン‐１，４‐ジアミン（８１）、１、４‐ジアミノブタン‐２，３‐ジオール（８２）、（１，３‐ジオキソラン‐４，５‐ジイル）ジメタンアミン（８３）、（２‐メチル‐１，３‐ジオキソラン‐４，５‐ジイル）ジメタンアミン（８４）、（２‐エチル‐１，３‐ジオキソラン‐４，５‐ジイル）ジメタンアミン（８５）、（２‐プロピル‐１，３‐ジオキソラン‐４，５‐ジイル）ジメタンアミン（８６）、（２‐イソプロピル‐１，３‐ジオキソラン‐４，５‐ジイル）ジメタンアミン（８７）、（２‐フェニル‐１，３‐ジオキソラン‐４，５‐ジイル）ジメタンアミン（８８）、（２‐（２‐フルオロフェニル）‐１，３‐ジオキソラン‐４，５‐ジイル）ジメタンアミン（８９）、（２‐（３‐フルオロフェニル）‐１，３‐ジオキソラン‐４，５‐ジイル）ジメタンアミン（９０）、（２‐（４‐フルオロフェニル）‐１，３‐ジオキソラン‐４，５‐ジイル）ジメタンアミン（９１）、（２‐（チオフェン‐２‐イル）‐１，３‐ジオキソラン‐４，５‐ジイル）ジメタンアミン（９２）、（２‐（フラン‐２‐イル）‐１，３‐ジオキソラン‐４，５‐ジイル）ジメタンアミン（９３）、シクロブタン‐１，２‐ジイルジメタンアミン（９４）、（１ｓ、４ｓ）‐シクロヘキサン‐１，４‐ジアミン（９５）、Ｎ１，Ｎ１’‐（ブタン‐１，４‐ジイル）ビス（プロパン‐１，３‐ジアミン）（９６）である。
本発明による二次官能性部分の好ましい二座配位子は、上記を参照のように構造１７、１８、２１、４３、４８、４９、５４、６２、６５、７２、７３、７５、７６、８２、８７、９４によって表される。本発明による二次官能性部分のさらにより好ましい二座配位子は、プロパン‐１，３‐ジアミン（５４）及び１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール（６５）である。
本発明の現在の二次官能性部分の発明者は、本発明のリンカーを介して一次官能性部分を細胞結合部分（抗体など）に結合するために、対応する二次官能性部分の第２の配位子Ｌ１又はＬ２がヨウ化物又は臭化物、好ましくはヨウ化物であると有利であることも見出した。脱離配位子としてのヨウ化物又は臭化物、特にヨウ化物の使用は、二次官能性部分の細胞標的部分への結合の効率及び二次官能性部分の加水分解安定性の増加にかなりかつ予想外の効果を与えることが見出された。この結合効率の向上と、ＡＤＣ分野で使用される典型的な細胞毒性化合物の高コストを考慮すると、細胞標的複合体の製造コストを大幅に下げることができる。
１つの配位子Ｌ１又はＬ２として一次官能性部分及び他の配位子Ｌ１又はＬ２としてヨウ化物、臭化物又は塩化物を有する本発明の二次官能性部分は、細胞標的部分との結合反応のためのすぐに使えるビルディングブロックとして簡便に調製し、保存でき、又は脱離配位子Ｌ１又はＬ２がヨウ化物又は臭化物である場合、それらはまた、結合混合物へのヨウ化物又は臭化物放出剤の添加による細胞標的部分との結合反応中に、ｉｎ ｓｉｔｕで脱離配位子Ｌ１又はＬ２として塩化物を有する二次官能性部分から生成することができる。
本発明の実施形態において、二次官能性部分の白金（ＩＩ）錯体は、スペーサーを含み得る。そのような場合、一次官能性部分（例えば、未修飾又は修飾細胞毒性薬）は、白金（ＩＩ）錯体の金属中心に直接結合するのではなく、前記スペーサーを介して白金（ＩＩ）錯体に結合することができる。スペーサーの例は、飽和又は不飽和複素環式部分、アミン又は白金（ＩＩ）錯体の金属中心に結合することができる他のドナー基を有する置換又は非置換の非分岐又は分岐の脂肪族又はヘテロ脂肪族鎖である。
さらに、二次官能性部分は、好ましくは、凍結乾燥物又は対応するハロゲン化物塩などの賦形剤を含有する凍結乾燥物として、好ましくは単離された形態で提供されるか、又はそれらは、溶液の形態で、例えば、水又は水／有機溶媒混合物中又は対応するハロゲン化物塩溶液中で提供され得る。本発明によれば、それらは、二次官能性部分の細胞結合部分への結合のための方法においてその後使用される前に保存されてもよい。
本発明による二次官能性部分の好ましい実施形態は、一次官能性部分が、治療用化合物、診断用化合物、キレート剤、色素又はモデル化合物からなる群から選択される二次官能性部分であり、好ましくは一次官能性部分は細胞毒性化合物である。
本発明の二次官能性部分で使用される二座配位子の実施形態は、上に提供され、式２〜９６によって表されるが、これらに限定されない。
本発明の二次官能性部分の好ましい実施形態は、治療用化合物が細胞毒性薬、蛍光色素などの診断用化合物、又はキレート化合物に連結された放射性トレーサー配位子、又はモデル化合物である二次官能性部分である。
細胞毒性薬は、細胞骨格を妨害し、ＤＮＡをアルキル化し、又はＤＮＡ二重らせんにインターカレートし、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩを阻害するか、又は細胞系におけるシグナル伝達カスケードを阻害する治療用化合物であることが特に好ましい。最も好ましくは、一次官能性部分は細胞毒性化合物である。好ましい一次毒性部分は多数ある。本明細書の好ましい一次官能性部分のいくつかの例は、アウリスタチン、ドラスタチン、シンプロスタチン、メイタンシノイド、チューブリシン、ＨＴＩ‐２８６、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン（ＩＧＮ）、カンプトテシン、アントラサイクリン、アゾナフィド、アマニチン、クリプトフィシン、リゾキシン、エポチロン、スプライセオスタチン、タイランスタチン、コルヒチン、アプリロニン、タキソイド、メトトレキサート、アミノプテリン、ビンカアルカロイドの群から選ばれる化合物である。また、好ましい毒性部分は、シュードモナス外毒素Ａのフラグメント、スタチン、リシンＡ、ゲロニン、サポリン、インターロイキン‐２、インターロイキン‐１２などのタンパク質性毒素、Ｅ４、ｆ４、アポプチン又はＮＳ１などのウイルスタンパク質、及びＨＡＭＬＥＴ、ＴＲＡＩＬ、又はｍｄａ‐７などの非ウイルス性タンパク質である。
一次官能性部分は診断用化合物であってもよい。あるいは、官能性部分は、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＤＹ‐８００、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、インドシアニングリーン、ＦＩＴＣ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬなどのＢＯＤＩＰＹ色素、及びローダミンＢなどのローダミンなどの蛍光色素である。
本開示において官能性部分として使用され得る他の診断用化合物は、放射性核種、ＰＥＴ画像化可能薬剤、ＳＰＥＣＴ画像化可能薬剤又はＭＲＩ画像化可能薬剤である。ＥＤＴＡ、ＤＰＴＡ、デフェロキサミン（Ｄｅｓｆｅｒａｌ（登録商標）又はＤＦＯ）などのキレート剤、又は官能性部分として大環状剤ＤＯＴＡ又はｐ‐ＳＣＮ‐Ｂｎ‐ＤＯＴＡを金属イオン錯体に結合し、その後のステップで、これらのキレート剤に、９０Ｙ、１７７Ｌｕなどのベータ放出剤、アルファエミッター２１１Ａｔ又はＰＥＴアイソトープ８９Ｚｒ及びＳＰＥＣＴアイソトープ９９ｍＴｃなどの治療用又は診断用放射性核種、又は非放射性金属を担持することもできる。
あるいは、複数の種類の官能性部分を使用することができる。このようにして、異なる官能性部分、例えば、治療用化合物の異なる有用な組み合わせ、又は有用な診断用化合物の異なる組み合わせ、又は両方の異なる組み合わせを、１つの標的部分に対して結合することが可能である。これを行うことにより、治療用化合物の好ましい組み合わせを目的の組織に送達することができる。
あるいは、複数の種類の官能性部分を使用することができる。このようにして、異なる官能性部分、例えば、治療用化合物の異なる有用な組み合わせ、又は有用な診断用化合物の異なる組み合わせ、又は両方の異なる組み合わせを、１つの標的部分に対して結合することが可能である。これを行うことにより、治療用化合物の好ましい組み合わせを目的の組織に送達することができる。
本発明の第２の態様は、上記及び本特許請求の範囲に記載の二次官能性部分を含む細胞標的複合体に関し、ここで、式Ｉによる前記二次官能性部分の配位子Ｌ１又はＬ２の１つは、一次官能性部分であり、他の配位子は細胞結合部分である。
本発明の好ましい細胞標的複合体は、式Ｉによる二次官能性部分の二座配位子が、上記及び特許請求の範囲で参照される式２〜９６のいずれかによって表される配位子から選択される細胞標的複合体である。
本発明の細胞標的複合体の好ましい実施形態は、細胞標的複合体であり、細胞結合部分は、抗体、一本鎖抗体、標的細胞に特異的に結合する抗体フラグメント、モノクローナル抗体、操作されたモノクローナル抗体、標的細胞に特異的に結合する一本鎖モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体、キメラ抗体、標的細胞に特異的に結合するキメラ抗体フラグメント、及びアフィボディ、アンチカリン、アドネクチン、ダーピン、Ｂｉｃｙｃｌｅｓ（登録商標）などの非伝統的なタンパク質スキャフォールド、又は標的細胞に特異的に結合する葉酸誘導体である。
本発明の細胞標的複合体に含まれる細胞結合部分は、好ましくは抗体である。ただし、一本鎖抗体、標的細胞に特異的に結合する抗体フラグメント、モノクローナル抗体、操作されたモノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、標的細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体、キメラ抗体、標的細胞に特異的に結合するキメラ抗体フラグメント、及び標的細胞に特異的に結合する非伝統的なタンパク質スキャフォールド（例えば、アフィボディ、アンチカリン、アドネクチン、ダーピン）など、さまざまな種類の抗体を使用できる。
好ましくは、細胞結合部分は、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ１、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ又はＰＳＭＡを標的とする免疫グロブリン、異常な細胞（腫瘍細胞など）の細胞内標的（ＨＬＡ‐ＭＡＧＥ抗原複合体など）に対する抗体の群から選択された抗体である。
より好ましくは、細胞結合部分は、トラスツズマブ、セツキシマブ、ブレンツキシマブ、リツキシマブ、オファツムマブ又はオビヌツズマブ、好ましくはトラスツズマブを含む免疫グロブリンの群から選択される抗体である。
本発明はさらに、異常な細胞の特異的標的化及び殺傷のための細胞標的複合体に関し、ここで、細胞毒性部分は、細胞結合部分、例えば抗体に、遷移金属錯体、好ましくは白金（ＩＩ）錯体、より好ましくは式２〜９６のいずれかで表される二座配位子を有する白金（ＩＩ）錯体を介して結合される。一実施形態では、異常な細胞の特異的な標的化及び死滅のために細胞標的複合体が提供され、毒性部分は、遷移金属錯体を介して細胞結合部分（抗体）に結合される。
好ましい実施形態では、本発明による細胞標的複合体は、トラスツズマブ‐Ｐｔ（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）‐アウリスタチンＦ、トラスツズマブ‐Ｐｔ（（１Ｓ，２Ｓ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（（１Ｒ，２Ｓ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（Ｎ１、Ｎ２‐ジメチルエタン‐１、２‐ジアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（プロパン‐１，３‐ジアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロブタン‐１，２‐ジイル）ジメタンアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４‐ジアミノ‐６‐（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ‐２Ｈ‐ピラン‐２，５‐ジオール）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，８ａＳ）‐６‐メトキシ‐２‐フェニルヘキサヒドロピラノ［３，２‐ｄ］［１，３］ジオキシン‐７，８‐ジアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（２‐（（２‐アミノエチル）アミノ）エタン‐１‐オール）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（２，２’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（アザンジイル））ビス（エタン‐１‐オール））-アウリスタチンＦからなる群から選択される。
別の好ましい実施形態では、本発明による細胞標的複合体は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体-Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）-ＰＮＵ‐１５９６８２、抗ＭＡＧＥ‐ＨＬＡペプチド複合抗体-Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）-アルファ‐アマニチン、ＭＡＧＥ‐ＨＬＡペプチド複合抗体-Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）-ＰＢＤ、及びブレンツキシマブ-Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン）‐２‐オール）-アルファ‐アマニチンを含む群から選択される。
特に好ましい実施形態では、細胞標的複合体は、遷移金属錯体として白金（ＩＩ）錯体、細胞結合部分としてトラスツズマブ、及び一次官能性部分としてアウリスタチン（アウリスタチンＦ、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦ又はモノメチルアウリスタチンＥなど）を含み；好ましくは、アウリスタチンＦが使用される。
本発明のさらなる態様は、哺乳動物、特にヒトにおける癌の治療に使用するための上記の細胞標的複合体に関する。
好ましくは、本発明による癌の治療に使用するための細胞標的複合体は、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、及び非小細胞肺癌の治療に使用するためのものである。
さらなる実施形態では、本発明による癌の治療で使用するための細胞標的複合体は、乳癌の治療で使用するためのものであり、前記乳癌はＨｅｒ２の発現レベルが低い。
本発明はさらに、二次官能性部分に１９５ｍＰｔなどの放射性核種をさらに含む本発明の細胞標的複合体を含む組成物に関する。１９５ｍＰｔを使用すると、１９５ｍＰｔカウンティングと８９Ｚｒ‐免疫ＰＥＴイメージングを組み合わせたデュアルラベリングアプローチを使用して、生体内でのＬｘベースの細胞標的複合体の特性評価と検証が可能になる。８９Ｚｒと１９５ｍＰｔを組み合わせて使用することで、抗体や一次官能性部分、とりわけ薬物又は診断薬とは別に、Ｌｘリンカーを高感度で直接検出できる。したがって、デュアルラベリング戦略は、細胞標的複合体のｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ＤＡＲの関数としての腫瘍及び正常臓器における細胞標的複合体のｉｎ ｖｉｖｏ取り込み及び保持、及び体内での白金ベースのリンカー（Ｌｘ）の隔離を実証できる。
本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例によってさらに解明されるであろう。
例１：Ｃｌ‐Ｌｘ‐ＰＦＭ錯体（クロリドＬｘ‐「半最終生成物」）の合成に使用されるＬｘＣｌ ２ 錯体の例
化合物１ａはＳｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、製品コード４０４３２２、［５２６９１‐２４‐４］から購入した。
化合物１ａはＳｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、製品コード４０４３２２、［５２６９１‐２４‐４］から購入した。
例２：Ｂｒ‐Ｌｘ‐ＰＦＭ錯体（ブロミドＬｘ‐「半最終生成物」）の合成に使用されるＬｘＢｒ ２ 錯体の例
２．１．ＰｔＢｒ２（エタン‐１，２‐ジアミン）（２ａ）の合成と分析的特性評価
ＫＢｒ（２．３８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を水（２５ｍＬ）中のＫ２ＰｔＣｌ４（４１５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を室温で２４時間撹拌し、次に得られた褐色の混合物を濾過し、エタン‐１，２‐ジアミン（８１μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を濾液に加え、混合物を室温で１８時間撹拌した。沈殿物を濾過により収集し、水で完全に洗浄し、最初に吸引下でフィルター上で１時間乾燥させた。次に、フィルターケーキ（黄色の固体３３５ｍｇ）をフラスコに移し、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）で１時間スラリー洗浄し、ろ過して集め、フィルターケーキをＭｅＯＨで洗浄し、次いで１２時間減圧下で乾燥させ、黄色の固体（２９８ｍｇ、７２％収率）を取得した。
２．１．ＰｔＢｒ２（エタン‐１，２‐ジアミン）（２ａ）の合成と分析的特性評価
ＫＢｒ（２．３８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を水（２５ｍＬ）中のＫ２ＰｔＣｌ４（４１５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を室温で２４時間撹拌し、次に得られた褐色の混合物を濾過し、エタン‐１，２‐ジアミン（８１μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を濾液に加え、混合物を室温で１８時間撹拌した。沈殿物を濾過により収集し、水で完全に洗浄し、最初に吸引下でフィルター上で１時間乾燥させた。次に、フィルターケーキ（黄色の固体３３５ｍｇ）をフラスコに移し、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）で１時間スラリー洗浄し、ろ過して集め、フィルターケーキをＭｅＯＨで洗浄し、次いで１２時間減圧下で乾燥させ、黄色の固体（２９８ｍｇ、７２％収率）を取得した。
例３：Ｉ‐Ｌｘ‐ＰＦＭ錯体（ヨージドＬｘ‐「半最終生成物」）の合成に使用されるＬｘＩ
２
錯体の例
３．１．錯体ＰｔＩ２（二座配位子）３ａ‐ｈ及び３ｊ‐ｌ（錯体３ａの例）の一般的な合成と錯体Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ａ）の分析データ
ＫＩ（３３．２ｇ、０．２ｍｏｌ）を、水（２００ｍＬ）中のＫ２ＰｔＣｌ４（４．１５ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を室温で２２時間撹拌した後、得られた暗色の混合物を濾過し、エタン‐１，２‐ジアミン（８００μＬ、１２ｍｍｏｌ）を濾液に加え、混合物を室温で２３時間撹拌した。エタン‐１，２‐ジアミンを加えるとすぐに黄色の沈殿物が形成し始めた。沈殿物を濾過により収集し、水で十分に洗浄し、最初にフィルター上で吸引して３〜４時間、次に減圧下で１２時間乾燥させて、黄色の固形物（４．８５ｇ、収率９５％）を得た。
ＫＩ（３３．２ｇ、０．２ｍｏｌ）を、水（２００ｍＬ）中のＫ２ＰｔＣｌ４（４．１５ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を室温で２２時間撹拌した後、得られた暗色の混合物を濾過し、エタン‐１，２‐ジアミン（８００μＬ、１２ｍｍｏｌ）を濾液に加え、混合物を室温で２３時間撹拌した。エタン‐１，２‐ジアミンを加えるとすぐに黄色の沈殿物が形成し始めた。沈殿物を濾過により収集し、水で十分に洗浄し、最初にフィルター上で吸引して３〜４時間、次に減圧下で１２時間乾燥させて、黄色の固形物（４．８５ｇ、収率９５％）を得た。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８、２５ｘ４．６ｍｍ、５μｍ）は、生成物が１００％の純度であることを示した（保持時間９．８分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、波長２７３ｎｍで測定）。
以下の錯体Ｐｔ（二座配位子）Ｉ２ ３も同様の方法で得られた。
３．１．１．錯体Ｐｔ（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ｂ）の分析データ
３．１．２．錯体Ｐｔ（（１Ｓ，２Ｓ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ｃ）の分析データ
３．１．３．錯体Ｐｔ（（１Ｒ，２Ｓ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ｄ）の分析データ
３．１．４．錯体Ｐｔ（Ｎ１、Ｎ２‐ジメチルエタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ｅ）の分析データ
３．１．５．錯体ＰｔＩ２（プロパン‐１，３‐ジアミン）（３ｆ）の分析データ
単離及び初期乾燥工程の後、材料をさらにＭｅＯＨでスラリー洗浄し、濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、乾燥させた。
単離及び初期乾燥工程の後、材料をさらにＭｅＯＨでスラリー洗浄し、濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、乾燥させた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８、２５ｘ４．６ｍｍ、５μｍ）は、生成物が１００％の純度であることを示した（保持時間１３．６分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、２２３ｎｍの波長で測定）。
３．１．６．錯体Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）Ｉ２（３ｇ）の分析データ
単離及び初期乾燥工程の後、材料をさらにＭｅＯＨでスラリー洗浄し、濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、乾燥させた。
単離及び初期乾燥工程の後、材料をさらにＭｅＯＨでスラリー洗浄し、濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、乾燥させた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８、２５ｘ４．６ｍｍ、５μｍ）は、生成物が１００％の純度であることを示した（保持時間１２．１分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、波長２７３ｎｍで測定）。
３．１．７．錯体Ｐｔ（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロブタン‐１，２‐ジイル）ジメタンアミン）Ｉ２（３ｈ）の分析データ
単離及び初期乾燥工程の後、材料をさらにＭｅＯＨでスラリー洗浄し、濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、乾燥させた。
単離及び初期乾燥工程の後、材料をさらにＭｅＯＨでスラリー洗浄し、濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、乾燥させた。
３．１．８．錯体Ｐｔ（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，８ａＳ）‐６‐メトキシ‐２‐フェニルヘキサヒドロピラノ［３，２‐ｄ］［１，３］ジオキシン‐７，８‐ジアミン）Ｉ２（３ｊ）の分析データ
３．１．９．錯体Ｐｔ（２‐（（２‐アミノエチル）アミノ）エタン‐１‐オール）Ｉ２（３ｋ）の分析データ
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８、２５ｘ４．６ｍｍ、５μｍ）は、生成物が１００％の純度であることを示した（保持時間１１．２分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、波長２７３ｎｍで測定）。
３．１．１０．錯体Ｐｔ（２，２’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（アザンジイル））ビス（エタン‐１‐オール））Ｉ２（３ｌ）の分析データ
３．２．錯体Ｐｔ（（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４‐ジアミノ‐６‐（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ‐２Ｈ‐ピラン‐２，５‐ジオール）Ｉ２（３ｉ）の合成
Berger et al., ChemMedChem 2007, 2, 505-514に従って調製。
Berger et al., ChemMedChem 2007, 2, 505-514に従って調製。
ＫＩ（５３１ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）を、水（１．３ｍＬ）中のＫ２ＰｔＣｌ４（２６６ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、次に得られた暗色の混合物を濾過し、セライトのパッドを通して濾過した水（４００μＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４‐ジアミノ‐６‐（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ‐２Ｈ‐ピラン‐２，５‐ジオールジヒドロクロリド（２５０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＫＯＨ（９８ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）の溶液を濾液に添加した。混合物を室温で２２時間撹拌した。（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４‐ジアミノ‐６‐（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ‐２Ｈ‐ピラン‐２，５‐ジオールの溶液を添加すると、沈殿物がすぐに形成し始めた。沈殿物を濾過により収集し、冷水（１．５ｍＬ）、続いて冷アセトン（１ｍＬ）で洗浄し、最初にフィルター上で１時間吸引し、次に減圧下で１２時間乾燥して、暗褐色の固体を得た（１６２ｍｇ、４３％収率）。
例４：クロリドＬｘ‐「半最終生成物」Ｃｌ‐Ｌｘ‐ＰＦＭ（クロリドＳＦＭ）の例
４．１．［ＰｔＣｌ（（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｐｉｐ）（エタン‐１，２‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（４ａ）の合成及び分析的特性評価は、Sijbrandi et al., Cancer Res. 2017, 72, 257-267に記載されている。
４．２．［ＰｔＣｌ（（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｙ）（（１Ｒ，２Ｒ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）］＋ＴＦＡ−（４ｂ）の合成と分析的特性評価
４．２．１．配位子（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｙ（Ｌ１）の合成
Verel et al., J. Nucl. Med. 2003, 44, 1271-1281に従って調製。
Verel et al., J. Nucl. Med. 2003, 44, 1271-1281に従って調製。
Ｎ‐スクシニルデスフェラール‐Ｆｅ（ＩＩＩ）（（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ；８９ｍｇ、１２４μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．２ｍＬ）に溶解し、ＨＯＢｔ（２５．２ｍｇ、１８６μｍｏｌ）、ＥＤＣｘＨＣｌ（３５．７ｍｇ、１８６μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４３μＬ、２４８μｍｏｌ）及びピリジン‐４‐イルメタンアミン（１４μＬ、１３７μｍｏｌ）を順次加えた。混合物を２０時間撹拌し、濃縮し、残留物を水に溶解し、Ｓｅｐ‐Ｐａｋ Ｃ１８ Ｐｌｕｓカラムで精製した。生成物はカラムから溶出され、凍結乾燥されて暗赤色の固体（１２４ｍｇ、８３％収率）が得られた。
４．２．２．錯体［ＰｔＣｌ（（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｙ）（（１Ｒ，２Ｒ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）］＋ＴＦＡ−（４ｂ）の合成
ＡｇＮＯ３（４１ｍｇ、０．２４１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＰｔＣｌ２（（１Ｒ，２Ｒ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）（１ａ）（８７ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。２４時間攪拌した後、灰色の沈殿物をセライトでろ過し、次いでセライトをＤＭＦ（２ｘ０．５ｍＬ）ですすいだ。次に、この溶液３５７μＬ（１．１当量の活性化Ｐｔ錯体）を（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｙ（Ｌ１）（３０ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）に加えた。混合物をアルゴン下で２４時間撹拌した後、ＨＰＬＣは完全な変換を示した。溶媒を減圧下で蒸発させた後、残留物を水とメタノールの混合物に溶解した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：１５〜２５％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を氷上で収集し、すぐに凍結及び凍結乾燥して、暗赤色の固体（１０ｍｇ、２１％収率）を得た。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９７．２％の純度（保持時間１４．２分；勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、波長４３０ｎｍで測定）であることを示した。
４．３．Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））Ｃｌ（エタン‐１，２‐ジアミン）（４ｃ）の合成と分析的特性評価はSijbrandi et al., Cancer Res. 2017, 72, 257-267に記載されている。
４．４．［ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ‐ＰＥＧ２‐ｐｙ‐ＰｔＣｌ（（１Ｒ，２Ｒ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）］＋ＴＦＡ−（４ｄ）の合成と分析的特性評価
４．４．１．ＢＯＤＩＰＹ ＦＬメチルエステルの合成
Gieβler et al., Eur. J. Org. Chem 2010, 3611-3620に従って調製。
Gieβler et al., Eur. J. Org. Chem 2010, 3611-3620に従って調製。
３‐（１Ｈ‐ピロール‐２‐イル）プロパン酸メチル（７８０ｍｇ、４．８４ｍｍｏｌ、１．０当量）及び３，５‐ジメチル‐１Ｈ‐ピロール‐２‐カルバルデヒド（６９０ｍｇ、５．３２ｍｍｏｌ、１．１当量）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。この混合物に、ＤＣＭ（５ｍＬ）中のＰＯＣｌ３（５００μＬ、５．３６ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液を滴加した。反応混合物を０℃で３０分間、そして室温で６時間撹拌した。得られた黒色の溶液を再び０℃に冷却し、ＢＦ３ｘＯＥｔ２（２．４ｍＬ、１９．５ｍｍｏｌ、４．０当量）とＤＩＰＥＡ（３．５ｍＬ、２０．１ｍｍｏｌ、４．２当量）で処理し、徐々に室温にまで温めながら１２時間攪拌した。次に、混合物を０℃に冷却し、水（１００ｍＬ）を加えた。混合物を、ＤＣＭ（４ｘ２５ｍＬ）ですすいだセライトを通して濾過し、濾液相を分離し、水層をＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。残留物をセライトに吸収させ、カラムクロマトグラフィー（溶離液：１０‐０％石油エーテル／ＤＣＭ）で精製して、赤色の固体（１．００ｇ、６８％収率）を得た。
４．４．２．ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの合成
Gieβler et al., Eur. J. Org. Chem 2010, 3611-3620に従って調製。
Gieβler et al., Eur. J. Org. Chem 2010, 3611-3620に従って調製。
ＢＯＤＩＰＹメチルエステル（４９４ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（７５ｍＬ）及び４．５Ｍ ＨＣｌ（７５ｍＬ）に溶解した。この混合物を室温で４７時間撹拌した。続いて、ＤＣＭ（３００ｍＬ）を加え、相を分離した。水層をＤＣＭ（１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（溶離液：０‐０．５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＋０．１％ＡｃＯＨ）で精製し、続いてｎ‐ペンタンで沈殿させて、赤色の固体（２７６ｍｇ、５９％収率）を得た。
４．４．３．Ｎ‐（２‐（２‐（２‐アミノエトキシ）エトキシ）エチル）‐２‐（ピリジン‐４‐イル）アセトアミド（ＰＥＧ２‐ｐｙスペーサー）の合成
２‐（ピリジン‐４‐イル）酢酸塩酸塩（１８３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、１．０当量）及び２，２’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（オキシ））ジエタンアミン（７４７μＬ、５．０ｍｍｏｌ、５．０当量）を乾燥した脱気したトルエン（５ｍＬ）に溶解した。続いて、トルエン中のＡｌＭｅ３の２Ｍ溶液（０．５ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、得られた反応混合物を９０℃で１時間撹拌した。次に、反応混合物を１時間かけて室温まで冷却させ、さらに０℃まで冷却した後、イソプロパノール（１ｍＬ）とＭｅＯＨ（０．１４ｍＬ）中ＮＨ３の７Ｍ溶液を加え、室温まで温めた。黄色の混合物を濾過し、溶媒を減圧下で除去して、緑色の油を得た。この油をＤＣＭに溶解し、形成された沈殿物を再び濾過により除去した。溶媒を減圧下で除去した後、残留物をカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ３ａｑ．１００：９：１から１００：９：１．５）で精製して、淡黄色の油（１２９ｍｇ、４８％収率）を得た。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が１００％の純度であることを示した（保持時間１５．２分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
４．４．４．ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ‐ＰＥＧ２‐ｐｙ配位子（Ｌ２）の合成
ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３３ｍｇ、１１２μｍｏｌ、１．０当量）、ＥＤＣｘＨＣｌ（２４ｍｇ、１２３μｍｏｌ、１．１当量）、及びＨＯＢｔ水和物（１９ｍｇ、１２３μｍｏｌ、１．１当量）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解し、５分間攪拌した。この混合物にＰＥＧ２‐ｐｙスペーサー（３０ｍｇ、１１２μｍｏｌ、１．０当量）を添加し、続いてＤＩＰＥＡ（４１．０μＬ、２３６μｍｏｌ、２．１当量）を添加し、混合物を室温で１８時間撹拌した。続いて、混合物をＤＣＭ（２５ｍＬ）で希釈し、０．１４Ｍ ＮａＯＨ（３２ｍＬ）で洗浄した。２つの相を分離し、水層をＤＣＭ（５ｘ５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ中の１‐５．５％ＭｅＯＨ）で精製して、赤色の油（３０ｍｇ、４９％収率）を得た。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が１００％の純度であることを示した（保持時間１０．２分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長４８８ｎｍで測定）。
４．４．５．［ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ‐ＰＥＧ２‐ｐｙ‐ＰｔＣｌ（（１Ｒ，２Ｒ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）］＋ＴＦＡ−（４ｄ）の合成
ＰｔＣｌ２（（１Ｒ，２Ｒ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）（１ａ）（５０ｍｇ、１３１μｍｏｌ）とＡｇＮＯ３（２６ｍｇ、１５３μｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、光を遮断して室温で２２時間攪拌した（反応フラスコは暗くされている）。続いて、混合物を０．２μｍシリンジフィルターで濾過して、活性化Ｐｔ錯体の１３．２ｍＭストック溶液を得た。次に、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ‐ＰＥＧ２‐ｐｙ（Ｌ２）（１４ｍｇ、２６μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（２００μＬ）溶液に、活性化Ｐｔ錯体の１３．２ｍＭストック溶液（５．２０ｍＬ、６８．４μｍｏｌ、２．６当量）、続いてトリエチルアミン（７．２１μＬ、５２μｍｏｌ、２．０当量）を加え、反応の過程をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を、光を排除しながら室温で５時間撹拌した（反応フラスコは暗くされている）。この時点で、反応混合物は６４．７％の生成物を含み、出発物質を含んでいなかった。
混合物を減圧下で濃縮し、水／ＭｅＯＨ（２．５：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜８５％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を凍結乾燥すると、明るいオレンジ色の固体（１３ｍｇ、収率５０％）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９３．６％の純度であることを示した（保持時間１２．２分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長４８８ｎｍで測定）。
例５：ブロミドＬｘ‐「半最終生成物」Ｂｒ‐Ｌｘ‐ＰＦＭ（ブロミドＳＦＭ）の例
５．１．［ｉｎｄ‐ｐｙ‐ＰｔＢｒ（エタン‐１，２‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（５ａ）の合成と分析的特性評価
５．１．１．配位子Ｎ‐（２‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）エチル）‐２‐（ピリジン‐４‐イル）アセトアミド（ｉｎｄ‐ｐｙ、Ｌ３）の合成
２‐（ピリジン‐４‐イル）酢酸塩酸塩（３６５ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）に懸濁し、トリプタミン（３９２ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を加えた後、ＨＡＴＵ（１．１６ｇ、４．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１．４ｍＬ、８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２４時間攪拌した後、混合物を水で希釈し、ＤＣＭで抽出し、溶媒を減圧下で除去した後、残留物をセライトに吸着させ、シリカでクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ３ａｑ．＝１００：１：１〜１００：２：１〜１００：３：１））で精製した。乾燥後、オレンジ色のガラス（３８８ｍｇ、収率７０％）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９８．５％の純度であることを示した（保持時間１４．９分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、波長２７３ｎｍで測定）。
５．１．２．錯体［ｉｎｄ‐ｐｙ‐ＰｔＢｒ（エタン‐１，２‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（５ａ）の合成
Ｎ‐（２‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）エチル）‐２‐（ピリジン‐４‐イル）アセトアミド（Ｌ３）（ｉｎｄ‐ｐｙ；１４．０ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔＢｒ２（エタン‐１，２‐ジアミン）（２ａ）（３１．１ｍｇ、７５μｍｏｌ、１．５当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解した。トリエチルアミン（１０．５μＬ、７５μｍｏｌ、１．５当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で４２時間撹拌し、次に温度を７０℃に上げ、反応混合物をさらに２０時間撹拌した。この時点で、反応混合物は９４．４％の生成物と１．２％の出発物質を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（４：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜７０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（１２．９ｍｇ、収率３５．５％）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）により、生成物は９８．８％の純度であることを示した（保持時間１７．８分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、２２３ｎｍの波長で測定）。
５．２．ｉｎｄ‐ｐｉｐ‐ＰｔＢｒ（エタン‐１，２‐ジアミン）（５ｂ）の合成と分析的特性評価
５．２．１．配位子Ｎ‐（２‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）エチル）‐２‐（ピペリジン‐４‐イル）アセトアミド（ｉｎｄ‐ｐｉｐ、Ｌ４）の合成
トリプタミン（４９１ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した。ＢＯＰ（１．３７ｇ、３．０ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（５２３μＬ、３．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、続いてＤＭＦ（５ｍＬ）中の２‐（１‐（ｔｅｒｔ‐ブトキシカルボニル）ピペリジン‐４‐イル）酢酸（７４５ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を加えた。室温で２４時間撹拌した後、混合物を水（１５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３ｘ１５ｍＬ）で抽出し、溶媒を減圧下で除去した後、残留物をセライトに吸着させ、シリカ上で溶離液として酢酸エチル／シクロヘキサン１：１を使用してクロマトグラフィーで精製した。減圧下で乾燥した後、褐色の油（約２．１ｇ）が得られた。
ＴＦＡ（５ｍＬ）を材料に加え、混合物を室温で３０分間撹拌した後、氷／水で冷却した１Ｎ ＮａＯＨ（５０ｍＬ）溶液にゆっくりと加えた。ＤＣＭを加え、混合物を０℃で撹拌した。少量のＭｅＯＨを加えた後、相を分離し、水層をジクロロメタン（９×２５ｍＬ）で抽出した。蒸発後、残留物（茶色の油約１．２ｇ）をセライトに吸収させ、シリカでクロマトグラフィー（溶離液：イソプロパノール／ＮＨ３ａｑ．＝１００：１〜１００：２〜１００：３〜１００：４）で精製した。次に、得られた物質をＭｅＯＨ／ジクロロメタン／ｎ‐ペンタンから再結晶化し、乾燥させた後、無色の固体（２０４ｍｇ、２４％の収率）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が１００％の純度であることを示した（保持時間１５．１分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、波長２７３ｎｍで測定）。
５．２．２．錯体［ｉｎｄ‐ｐｉｐ‐ＰｔＢｒ（エタン‐１，２‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（５ｂ）の合成
Ｎ‐（２‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）エチル）‐２‐（ピペリジン‐４‐イル）アセトアミド（Ｌ４）（ｉｎｄ‐ｐｉｐ；１４．３ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔＢｒ２（エタン‐１，２‐ジアミン）（２ａ）（２０．８ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（３３３μＬ）に溶解した。トリエチルアミン（６．９８μＬ、５０μｍｏｌ、１．０当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で４２時間撹拌した。この時点で、反応混合物は８８．６％の生成物と最大２．６％の出発物質を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（４：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜７０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（９．０ｍｇ、２４．５％収率）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９５．６％の純度であることを示した（保持時間１７．４分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、２２３ｎｍの波長で測定）。
５．３．ｉｎｄ‐ｉｍｉ‐ＰｔＢｒ（エタン‐１，２‐ジアミン）（５ｃ）の合成と分析的特性評価
５．３．１．配位子Ｎ‐（３‐（１Ｈ‐イミダゾール‐１‐イル）プロピル）‐３‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）プロパンアミド（ｉｎｄ‐ｉｍｉ、Ｌ５）の合成
３‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）プロパン酸（３９８ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ‐（クロロメチレン）‐Ｎ‐メチルメタンアミニウムクロリド（２６７ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を室温で加え、４０℃で３０分間撹拌した。次に、室温に冷却して１．５時間撹拌した後、３‐（１Ｈ‐イミダゾール‐１‐イル）プロパン‐１‐アミン（２４３μＬ、２．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、続いてＤＩＰＥＡ（１．７ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ、５．０当量）を添加した。室温で２２時間撹拌した後、混合物を水で希釈し、ＤＣＭで抽出し、溶媒を減圧下で除去した後、残留物をセライトに吸着させ、シリカでクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ３ａｑ．＝１００：１：１〜１００：２：１〜１００：３：１〜１００：４：１）で精製した。乾燥後、黄色の油（３８３ｍｇ、収率６５％）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が１００％の純度であることを示した（保持時間１４．５分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、波長２７３ｎｍで測定）。
５．３．２．［ｉｎｄ‐ｉｍｉ‐ＰｔＢｒ（エタン‐１，２‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（５ｃ）の合成
Ｎ‐（３‐（１Ｈ‐イミダゾール‐１‐イル）プロピル）‐３‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）プロパンアミド（Ｌ５）（ｉｎｄ‐ｉｍｉ；１４．８ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔＢｒ２（エタン‐１，２‐ジアミン）（２ａ）（３１．１ｍｇ、７５μｍｏｌ、１．５当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解した。トリエチルアミン（１０．５μＬ、７５μｍｏｌ、１．５当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で２０時間撹拌し、次に温度を７０℃に上げ、反応混合物をさらに２０時間撹拌した。この時点で、反応混合物は５３．９％の所望の生成物及び５．２％の出発物質を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（４：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜７０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（７．７ｍｇ、収率２０．７％）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９８．８％の純度であることを示した（保持時間１７．２分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２２３ｎｍの波長で測定）。
５．４．［（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｐｉｐ‐ＰｔＢｒ（エタン‐１，２‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（５ｄ）の合成と分析的特性評価
５．４．１．（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃの合成
手順はVugts et al., Bioconjugate Chem. 2011, 22, 2072-2081から採用した。
手順はVugts et al., Bioconjugate Chem. 2011, 22, 2072-2081から採用した。
ＦｅＣｌ３（０．５Ｍ ＨＣｌに４００ｍｇ／ｍＬ）の溶液を準備し、この溶液９０μＬを０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（２．６４ｍＬ）及び０．９％ＮａＣｌ（２．３１ｍＬ）中のＮ‐スクシニルデスフェラール（ＤＦＯ‐ｓｕｃ、１２０ｍｇ、１８２μｍｏｌ）の混合物に滴加した。得られた混合物を室温で１０分間撹拌した。反応混合物をさらに後処理又は精製することなく次のステップで使用した。
５．４．２．（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ＴＦＰの合成
手順はVugts et al., Bioconjugate Chem. 2011, 22, 2072-2081から採用した。
手順はVugts et al., Bioconjugate Chem. 2011, 22, 2072-2081から採用した。
（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ（１３０ｍｇ、１８２μｍｏｌ）を含む反応混合物に、０．９％ＮａＣｌ（５ｍＬ）、ＭｅＣＮ（１．８ｍＬ）及びＭｅＣＮ（２００μＬ）中の２，３，５，６‐テトラフルオロフェノール（２９０ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）を添加した。次に、ＥＤＣｘＨＣｌ（５５０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１５分間撹拌した。続いて、ＥＤＣｘＨＣｌ（５００ｍｇ、２．６１ｍｍｏｌ）の２番目の部分を追加し、混合物をさらに１５分間撹拌した。反応混合物を２つの等しいバッチに分け、０．９％ＮａＣｌ（各３０ｍＬ）に注ぎ、得られた混合物を２つの活性化ダブルＳｅｐ‐Ｐａｋ Ｃ１８ Ｐｌｕｓカラムにトラップした。これら２つのダブルＳｅｐ‐Ｐａｋ Ｃ１８ Ｐｌｕｓカラムを水（各３ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、生成物を２ｘ１．５ｍＬ ＭｅＣＮで溶出した。したがって、２つの生成物バッチが収集され、それぞれが約３ｍＬの溶媒に生成物を含んでいた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、バッチ１が９４．８％の純度、バッチ２が９５．２％の純度（保持時間２０．４分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、４３０ｎｍの波長で測定）であることを示した。収率は約８０％であると想定された（Vugts et al., Bioconjugate Chem. 2011, 22, 2072-2081によって得られた結果に基づく）。生成物を含む２つの溶液を、さらに後処理又は精製せずに次のステップで使用した。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、バッチ１が９４．８％の純度、バッチ２が９５．２％の純度（保持時間２０．４分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、４３０ｎｍの波長で測定）であることを示した。収率は約８０％であると想定された（Vugts et al., Bioconjugate Chem. 2011, 22, 2072-2081によって得られた結果に基づく）。生成物を含む２つの溶液を、さらに後処理又は精製せずに次のステップで使用した。
５．４．３．（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｉｐ‐Ｂｏｃ（Ｌ６‐Ｂｏｃ）の合成
ｔｅｒｔ‐ブチル４‐（アミノメチル）ピペリジン‐１‐カルボキシラート（２３．５ｍｇ、１１０μｍｏｌ）をＭｅＣＮ（３００μＬ）に懸濁し、混合物を（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ＴＦＰ（バッチ２；約６３ｍｇ、ＭｅＣＮ ３ｍＬに７３μｍｏｌ；純度９５．２％）に加えた。続いて、ＤＩＰＥＡ（２５．５μＬ、１４６μｍｏｌ）を反応混合物に加え、室温で攪拌した。ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、７５分間攪拌した後、生成物が＞９５％の純度であることを示した（保持時間１８．４分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、４３０ｎｍの波長で測定）。Ｌ６‐Ｂｏｃを含む反応混合物を蒸発させ、さらに精製することなく次のステップで使用した。
５．４．４．配位子（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｉｐ（Ｌ６）の合成
粗材料Ｌ６‐Ｂｏｃ（約６７ｍｇ、７３μｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（３ｍＬ）を加えた。得られた混合物を室温で１．５時間撹拌し、濃縮し、得られた残留物をＭｅＯＨに溶解した。この溶解した物質を、ＤＣＭで活性化したＩＳＯＬＵＴＥ（登録商標）ＳＣＸ‐２カラムにロードした。カラムをＭｅＯＨで洗浄し、続いてＭｅＯＨ中の０．２５Ｍ ＮＨ３（ａｑ）で洗浄した。生成物を、ＭｅＯＨ中の１Ｍ ＮＨ３（ａｑ）で、続いてＭｅＯＨ中の７Ｍ ＮＨ３（ａｑ）で溶出した。溶媒を蒸発させ、生成物を水に溶解し、凍結乾燥して、赤色の固体（４０．１ｍｇ、５０．０μｍｏｌ、ＤＦＯ‐ｓｕｃから４段階で約５５％）を得た。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９７．５％の純度であることを示した（保持時間１１．８分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長４３０ｎｍで測定）。
５．４．５．錯体［（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｐｉｐ‐ＰｔＢｒ（エタン‐１，２‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（５ｄ）の合成
Ｌ６（１６ｍｇ、２０μｍｏｌ）を充填したＨＰＬＣバイアルに、ＤＭＦ（２００μＬ）、ＰｔＢｒ２（エタン‐１，２‐ジアミン）（１２．３ｍｇ、３０μｍｏｌ）、及びＴＥＡ（４．１３μＬ、３０μｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を６０℃で２４時間振とうした。反応混合物を水／ＭｅＯＨ（７：３、３ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３０〜５０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を収集し、初期容量の約２／３に濃縮した。水（約２ｍＬ）を加え、混合物を凍結乾燥し、赤色の固体（１４ｍｇ、収率５６．３％）を得た。生成物を２０ｍＭ ＮａＢｒ水溶液に溶解し、５ｍＭ溶液として保存した。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９５．６％の純度であることを示した（保持時間１３．１分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長４３０ｎｍで測定）。
例６：ヨージドＬｘ‐「半最終生成物」Ｉ‐Ｌｘ‐ＰＦＭ（ヨージドＳＦＭ）の例
６．１．［ノルエレアグニン‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ａ）の合成と分析的特性評価
２，３，４，９‐テトラヒドロ‐１Ｈ‐ピリド［３，４‐ｂ］インドール（ノルエレアグニン；９．１ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ａ） （２５．４ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ（３３３μｍｏｌ）に溶解した。トリエチルアミン（６．９８μＬ、５０μｍｏｌ、１．０当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で２４時間撹拌した。この時点で、反応混合物は８４．１％の所望の生成物及び４．４％の出発物質を含んでいた（保持時間１４．４分）。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（１９：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ、勾配：２０〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）により行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（１９．９ｍｇ、収率５９．６％）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９７．９％の純度（保持時間１９．９分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分。波長２７３ｎｍで測定）であることを示した。
６．２．［７‐アザインドール‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｂ）の合成と分析的特性評価
１Ｈ‐ピロロ［２，３‐ｂ］ピリジン（７‐アザインドール；６．０ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ａ）（２５．４ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ（３３３μｍｏｌ）に溶解した。トリエチルアミン（６．９８μＬ、５０μｍｏｌ、１．０当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で２４時間撹拌した。この時点で、反応混合物は７２．８％の所望の生成物及び２６．９％の出発物質を含んでいた（保持時間４．５分）。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（１９：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ、勾配：２０〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）により行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（１２．２ｍｇ、３９．８％収率）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９９．５％の純度であることを示した（保持時間１４．８分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、波長２７３ｎｍで測定）。
６．３．［ｉｎｄ‐ｐｙ‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｃ）の合成と分析的特性評価
Ｎ‐（２‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）エチル）‐２‐（ピリジン‐４‐イル）アセトアミド（Ｌ３）（ｉｎｄ‐ｐｙ；１４．０ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ａ）（２５．４ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（３３３μＬ）に溶解した。トリエチルアミン（６．９８μＬ、５０μｍｏｌ、１．０当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で２３時間撹拌した。この時点で、反応混合物は９５．０％の生成物と５．０％の出発物質を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（４：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ、勾配：２０〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）により行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（２５．２ｍｇ、６５．１％収率）が得られた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（４：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ、勾配：２０〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）により行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（２５．２ｍｇ、６５．１％収率）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９９．６％の純度であることを示した（保持時間１８．８分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、波長２７３ｎｍで測定）。
６．４．［ｉｎｄ‐ｐｙ‐Ｐｔ（（（１Ｒ，２Ｒ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン））Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｄ）の合成と分析的特性評価
Ｎ‐（２‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）エチル）‐２‐（ピリジン‐４‐イル）アセトアミド（Ｌ３）（ｉｎｄ‐ｐｙ；１４．０ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（（（１Ｒ，２Ｒ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン））Ｉ２（３ｂ）（４２．２ｍｇ、７５μｍｏｌ、１．５当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（３３３μＬ）に溶解した。トリエチルアミン（１０．４６μＬ、７５μｍｏｌ、１．５当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を４０℃で６８時間、次に５０℃で２４時間撹拌した。この時点で、反応混合物は９０．２％の生成物と４．０％の出発物質を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（４：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜７０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（１９．７ｍｇ、収率４７．６％）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９９．６％の純度であることを示した（保持時間１２．５分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長２７３ｎｍで測定）。
６．５．［ｉｎｄ‐ｐｙ‐Ｐｔ（ｃｉｓ‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｅ）の合成と分析的特性評価
Ｎ‐（２‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）エチル）‐２‐（ピリジン‐４‐イル）アセトアミド（Ｌ３）（ｉｎｄ‐ｐｙ；１４．０ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（ｃｉｓ‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）Ｉ２（３ｄ）（４２．４ｍｇ、７５μｍｏｌ、１．５当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（３３３μＬ）に溶解した。トリエチルアミン（１０．４５μＬ、７５μｍｏｌ、１．５当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を４０℃で１９時間撹拌した。この時点で、反応混合物は８８．４％の生成物及び６．０％の出発物質を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（４：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜７０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（１５．４ｍｇ、３７．２％収率）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９９．６％の純度であることを示した（保持時間１２．３分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長２７３ｎｍで測定）。
６．６．［ｉｎｄ‐ｐｙ‐Ｐｔ（Ｎ１、Ｎ２‐ジメチルエタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｆ）の合成と分析的特性評価
Ｎ‐（２‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）エチル）‐２‐（ピリジン‐４‐イル）アセトアミド（Ｌ３）（ｉｎｄ‐ｐｙ；１４．０ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（Ｎ１、Ｎ２‐ジメチルエタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ｅ）（４０．３ｍｇ、７５μｍｏｌ、１．５当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（３３３μＬ）に溶解した。トリエチルアミン（１０．４５μＬ、７５μｍｏｌ、１．５当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を４０℃で２０時間撹拌した。この時点で、反応混合物は８９．９％の生成物と１１．５％の出発物質を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（４：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜７０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（１２．４ｍｇ、収率３０．９％）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が１００％の純度であることを示した（保持時間１１．６分；勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２２３ｎｍの波長で測定）。
６．７．［ｉｎｄ‐ｐｙ‐ＰｔＩ（プロパン‐１，３‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（６ｇ）の合成と分析的特性評価
Ｎ‐（２‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）エチル）‐２‐（ピリジン‐４‐イル）アセトアミド（Ｌ３）（ｉｎｄ‐ｐｙ；１４．０ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔＩ２（プロパン‐１，３‐ジアミン）（３ｆ）（３９．２ｍｇ、７５μｍｏｌ、１．５当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（３３３μＬ）に溶解した。トリエチルアミン（１０．４５μＬ、７５μｍｏｌ、１．５当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を２５℃で１６．５時間撹拌し、次に３０℃で５時間、４０℃で１８時間、最後に５０℃で５時間続けた。この時点で、反応混合物は９７．３％の生成物と２．７％の出発物質を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（４：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜７０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を凍結乾燥して、無色の固体（５．２ｍｇ、１３．２％収率）を得た。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９７．９％の純度（保持時間１９．６分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、２２３ｎｍの波長で測定）であることを示した。
６．８．［ｉｎｄ‐ｐｙ‐Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｈ）の合成と分析的特性評価
Ｎ‐（２‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）エチル）‐２‐（ピリジン‐４‐イル）アセトアミド（Ｌ３）（ｉｎｄ‐ｐｙ；１４．０ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）Ｉ２（３ｇ）（４０．４ｍｇ、７５μｍｏｌ、１．５当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（３３３μＬ）に溶解した。トリエチルアミン（１０．４５μＬ、７５μｍｏｌ、１．５当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を２５℃で１６．５時間撹拌し、次に３０℃で５時間、４０℃で１８時間、最後に５０℃で５時間続けた。この時点で、反応混合物は９３．４％の生成物と２．１％の出発物質を含んでいた。 反応混合物を水／ＭｅＯＨ（４：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜７０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（１６．１ｍｇ、４０．０％収率）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９７．９％の純度（保持時間１８．７分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、２２３ｎｍの波長で測定）であることを示した。
６．９ ［ｉｎｄ‐ｐｙ‐Ｐｔ（（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロブタン‐１，２‐ジイル）ジメタンアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｉ）の合成と分析的特性評価
Ｎ‐（２‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）エチル）‐２‐（ピリジン‐４‐イル）アセトアミド（Ｌ３）（ｉｎｄ‐ｐｙ；１４．０ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロブタン‐１，２‐ジイル）ジメタンアミン）Ｉ２（３ｈ）（４２．２ｍｇ、７５μｍｏｌ、１．５当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（３３３μＬ）に溶解した。トリエチルアミン（１０．４５μＬ、７５μｍｏｌ、１．５当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を４０℃で２０時間撹拌した。この時点で、反応混合物は６９．３％の生成物と１７．０％の出発物質を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（４：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜８０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（４．８ｍｇ、収率１１．６％）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９５．９％の純度（保持時間１３．２分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長２７３ｎｍで測定）であることを示した。
６．１０．［ｉｎｄ‐ｐｙ‐Ｐｔ（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４‐ジアミノ‐６‐（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ‐２Ｈ‐ピラン‐２，５‐ジオール）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｊ）の合成と分析的特性評価
Ｎ‐（２‐（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）エチル）‐２‐（ピリジン‐４‐イル）アセトアミド（Ｌ３）（ｉｎｄ‐ｐｙ；１４．０ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４‐ジアミノ‐６‐（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ‐２Ｈ‐ピラン‐２，５‐ジオール）Ｉ２（３ｉ）（４７．０ｍｇ、７５μｍｏｌ、１．５当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解した。トリエチルアミン（１０．４５μＬ、７５μｍｏｌ、１．５当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を５０℃で２５時間撹拌した。この時点で、反応混合物は８２．６％の生成物と５．８％の出発物質を含んでいた。
反応混合物を３５％ＭｅＯＨ／水（２．０ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜７０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を凍結乾燥すると、ベージュ色の固体（２１．０ｍｇ、４７．１％収率）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９９．２％の純度であることを示した（注：生成物は位置異性体とエピマーの混合物として得られたため、いくつかのピークが観察された。保持時間１６．８〜１７．６分；勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、１８分、波長２７３ｎｍで測定）。
６．１１．錯体［Ｐｔ（（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｉｐ）（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｋ）の合成と分析的特性評価
（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｉｐ（Ｌ６）（１６ｍｇ、２０μｍｏｌ、１．０当量）を充填したＨＰＬＣバイアルに、ＤＭＦ（２００μＬ）、Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ａ）（１５．１ｍｇ、３０μｍｏｌ、１．５当量）、及びＴＥＡ（４．１３μＬ、３０μｍｏｌ、１．５当量）を加えた。得られた混合物を６０℃で２０時間振とうした。反応混合物を水／ＭｅＯＨ（７：３、３ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３０〜５０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を収集し、初期容量の約２／３に減らした。水（約５ｍＬ）を加え、混合物を凍結乾燥し、赤色の固体（１１ｍｇ、４２．７％収率）を得た。生成物を２０ｍＭ ＮａＩ水溶液に溶解し、５ｍＭ溶液として保存した。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物は９５．７％の純度であることを示した（保持時間１３．８分；勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長４３０ｎｍで測定）。
６．１２．錯体［（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｙ‐Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｌ）の合成と分析的特性評価
（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｙ（Ｌ１）（１０．０ｍｇ、１２μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）Ｉ２（３ｆ）（２６．４ｍｇ、４８μｍｏｌ、４当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（３７５μＬ）に溶解した。トリエチルアミン（６．９２μＬ、４８μｍｏｌ、４当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を４０℃で１６時間撹拌した。この時点で、反応混合物は８１．０％の生成物を含み、出発物質を含まなかった。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３０〜５５％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を凍結乾燥すると、無色の固体（７．６ｍｇ、４６．０％収率）が得られた。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９６．０％の純度であることを示した（保持時間１４．０分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長４３０ｎｍで測定）。
６．１３．錯体［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｍ）の合成と分析的特性評価
６．１３．１．配位子ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ（Ｌ７）の合成
ＤＭＦ（１．３３ｍＬ）に溶解したアウリスタチンＦ（ＡＦ）（４０．０ｍｇ、５４μｍｏｌ、１．０当量）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のｔｅｒｔ‐ブチル４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２、４‐ジアザドデシル）ピペリジン‐１‐カルボキシラート（６２．５ｍｇ、１６１μｍｏｌ、３．０当量；合成は、Sijbrandi et al., Cancer Res. 2017, 72, 257-267に記載されている）に添加した。続いて、ＨＡＴＵ（４０．８ｍｇ、１０７μｍｏｌ、２．０当量）とＤＩＰＥＡ（２９μＬ、１６１μｍｏｌ、３．０当量）を加え、混合物を氷浴中で１．５時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、水／ＭｅＣＮ（３．５：１、３ｍＬ）に溶解し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ、勾配：３０〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の固体（５６ｍｇ、収率８５％）をもたらした。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物化合物Ｌ７‐Ｂｏｃが１００％の純度であることを示した（保持時間１９．８分；勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長２１０ｎｍで測定）。
得られた化合物Ｌ７‐ＢｏｃをＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（２ｍＬ）を加えた。混合物を室温で４５分間撹拌した後、減圧下で濃縮した。残留物を１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で前洗浄したＩＳＯＬＵＴＥ（登録商標）ＳＣＸ‐２カラムにロードした。カラムを１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（２０ｍＬ）で洗浄し、生成物をＤＣＭ（１：１）中の１Ｍメタノール性アンモニアで溶出した。合わせた生成物画分を減圧下で濃縮し、ＭｅＯＨと数回共蒸発させて痕跡量のアンモニアを除去し、無色の固体（３４ｍｇ、７３％収率）を得た。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９９％の純度であることを示した（保持時間９．２分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
６．１３．２．錯体［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｍ）の合成
Ｎ‐（３‐オキソ‐１‐（ピペリジン‐４‐イル）‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデカン‐１２‐イル）ＡＦアミド（Ｌ７）（ＡＦ‐ｐｉｐ；１５．０ｍｇ、１５μｍｏｌ、１．０当量）とＰｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ａ）（２２．５ｍｇ、４４μｍｏｌ、３．０当量）を乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）にアルゴン雰囲気下で溶解した。ジイソプロピルアミン（７．７１μＬ、４４μｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で２時間撹拌した。この時点で、反応混合物は１００．０％の生成物を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ、勾配：３５〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（１８．０ｍｇ、７５．０％収率）。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ、勾配：３５〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（１８．０ｍｇ、７５．０％収率）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９８．９％の純度であることを示した（保持時間１０．３分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
６．１４．錯体［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｎ）の合成
Ｎ‐（３‐オキソ‐１‐（ピペリジン‐４‐イル）‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデカン‐１２‐イル）ＡＦアミド（Ｌ７）（ＡＦ‐ｐｉｐ；１５．０ｍｇ、１５μｍｏｌ、１．０当量）とＰｔ（（（１Ｒ，２Ｒ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン））Ｉ２（３ｂ）（２４．８ｍｇ、４４μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（７．７１μＬ、４４μｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で４時間撹拌した。この時点で、反応混合物は１００．０％の生成物を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ、勾配：３５〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（１５．６ｍｇ、５９．０％収率）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９９．４％の純度であることを示した（保持時間１１．０分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
６．１５．錯体［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（（１Ｓ，２Ｓ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｏ）の合成
Ｎ‐（３‐オキソ‐１‐（ピペリジン‐４‐イル）‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデカン‐１２‐イル）ＡＦアミド（Ｌ７）（ＡＦ‐ｐｉｐ；１６．０ｍｇ、１６μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（（（１Ｓ，２Ｓ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン））Ｉ２（３ｃ）（２６．１ｍｇ、４７μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（８．２３μＬ、４７μｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。
反応混合物を６０℃で１８時間撹拌した。この時点で、反応混合物は１００．０％の生成物を含んでいた。反応混合物を水／ＭｅＯＨ溶液（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）によって行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（１８．４ｍｇ、７１．１％収率）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９６．６％の純度であることを示した（保持時間１１．３分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
６．１６．錯体の合成［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（（１Ｒ，２Ｓ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｐ）の合成
Ｎ‐（３‐オキソ‐１‐（ピペリジン‐４‐イル）‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデカン‐１２‐イル）ＡＦアミド（Ｌ７）（ＡＦ‐ｐｉｐ；２０．０ｍｇ、２０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（（１Ｒ，２Ｓ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ｄ）（３３．２ｍｇ、５９μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１０．２８μＬ、５９μｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。
反応混合物を６０℃で１８時間撹拌した後、反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過した。精製は分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：４０分で３５〜１００％Ｂ、Ａ：９５／５ 水／ＭｅＯＨ＋０．１％ＴＦＡ及びＢ：５／９５ 水／ＭｅＯＨ＋０．１％ＴＦＡ）。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（２２．１ｍｇ、収率６６．９％）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９８．６％の純度であることを示した（保持時間１１．４分；勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
６．１７．錯体［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（Ｎ１、Ｎ２‐ジメチルエタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｑ）の合成
Ｎ‐（３‐オキソ‐１‐（ピペリジン‐４‐イル）‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデカン‐１２‐イル）ＡＦアミド（Ｌ７）（ＡＦ‐ｐｉｐ；２０．０ｍｇ、２０μｍｏｌ、１．０当量）とＰｔ（Ｎ１、Ｎ２‐ジメチルエタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ｅ）（３１．７ｍｇ、５９μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１０．２８μＬ、５９μｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。
反応混合物を６０℃で１８時間撹拌した後、反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過した。精製は分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：４０分で３５〜１００％Ｂ、Ａ：９５／５ 水／ＭｅＯＨ＋０．１％ＴＦＡ及びＢ：５／９５ 水／ＭｅＯＨ＋０．１％ＴＦＡ）によって行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（２７．６ｍｇ、８４．８％収率）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９７．０％の純度であることを示した（保持時間１１．０分；勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
６．１８．錯体［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（プロパン‐１，３‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｒ）の合成
Ｎ‐（３‐オキソ‐１‐（ピペリジン‐４‐イル）‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデカン‐１２‐イル）ＡＦアミド（Ｌ７）（ＡＦ‐ｐｉｐ；１６．０ｍｇ、１６μｍｏｌ、１．０当量）とＰｔＩ２（プロパン‐１，３‐ジアミン）（３ｆ）（２４．７ｍｇ、４７μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（８．２３μＬ、４７μｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で１８時間撹拌した後、反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（１５．４ｍｇ、収率５９．６％）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９２．０％の純度であることを示した（保持時間１０．５分；勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
６．１９．錯体［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｓ）の合成
Ｎ‐（３‐オキソ‐１‐（ピペリジン‐４‐イル）‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデカン‐１２‐イル）ＡＦアミド（Ｌ７）（ＡＦ‐ｐｉｐ；１５．０ｍｇ、１５μｍｏｌ、１．０当量）とＰｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）Ｉ２（３ｇ）（２３．９ｍｇ、４４μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（７．７１μＬ、４４μｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で２時間撹拌した。この時点で、反応混合物は１００．０％の生成物を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ、勾配：３５〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（１４．５ｍｇ、５９．４％収率）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９４．４％の純度であることを示した（保持時間１０．１分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
６．２０．錯体［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロブタン‐１，２‐ジイル）ジメタンアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｔ）の合成
Ｎ‐（３‐オキソ‐１‐（ピペリジン‐４‐イル）‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデカン‐１２‐イル）ＡＦアミド（Ｌ７）（ＡＦ‐ｐｉｐ；１５．０ｍｇ、１５μｍｏｌ、１．０当量）とＰｔ（（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロブタン‐１，２‐ジイル）ジメタンアミン）Ｉ２（３ｈ）（２４．８ｍｇ、４４μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（７．７１μＬ、４４μｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で２時間撹拌した。この時点で、反応混合物は１００．０％の生成物を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（８．６ｍｇ、３４．７％収率）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）により、生成物は９８．７％の純度であることを示した（保持時間１１．６分；勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
６．２１．錯体［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４‐ジアミノ‐６‐（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ‐２Ｈ‐ピラン‐２，５‐ジオール）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｕ）の合成
Ｎ‐（３‐オキソ‐１‐（ピペリジン‐４‐イル）‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデカン‐１２‐イル）ＡＦアミド（Ｌ７）（ＡＦ‐ｐｉｐ；１５．０ｍｇ、１５μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４‐ジアミノ‐６‐（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ‐２Ｈ‐ピラン‐２，５‐ジオール）Ｉ２（３ｉ）（２７．８ｍｇ、４４μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）に溶解した。Ｎ、Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（７．７１μＬ、４４μｍｏｌ、３．０当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で３．５時間撹拌した。この時点で、反応混合物は６３．７％の生成物を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ、勾配：３５〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（１０．５ｍｇ、収率４０．８％）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９８．９％の純度であることを示した（注：生成物は、位置異性体とエピマーの混合物として得られ、幅広いピークとして観察された。保持時間９．５分；勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、で２１０ｎｍの波長で測定）。
６．２２．錯体［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，８ａＳ）‐６‐メトキシ‐２‐フェニルヘキサヒドロピラノ［３，２‐ｄ］［１，３］ジオキシン‐７、８‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｖ）の合成
Ｎ‐（３‐オキソ‐１‐（ピペリジン‐４‐イル）‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデカン‐１２‐イル）ＡＦアミド（Ｌ７）（ＡＦ‐ｐｉｐ；１６．０ｍｇ、１６μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，８ａＳ）‐６‐メトキシ‐２‐フェニルヘキサヒドロピラノ［３，２‐ｄ］［１，３］ジオキシン‐７，８‐ジアミン）Ｉ２（３ｊ）（３４．４ｍｇ、４７μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（８．２３μＬ、４７μｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で１８時間撹拌し、続いて反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（２１．６ｍｇ、収率７４．３％）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９６．３％の純度であることを示した（注：生成物は位置異性体の混合物として得られたため、２つのピークが観察された。保持時間１２．８分と１３．２分。勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、１０ｎｍの波長で測定）。
６．２３．錯体［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（２‐（（２‐アミノエチル）アミノ）エタン‐１‐オール）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｗ）の合成
Ｎ‐（３‐オキソ‐１‐（ピペリジン‐４‐イル）‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデカン‐１２‐イル）ＡＦアミド（Ｌ７）（ＡＦ‐ｐｉｐ；１６．０ｍｇ、１６μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（２‐（（２‐アミノエチル）アミノ）エタン‐１‐オール）Ｉ２（３ｋ）（２６．１ｍｇ、４７μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（８．２３μＬ、４７μｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で１８時間撹拌した後、反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（１７．４ｍｇ、収率６６．２％）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９８．８％の純度であることを示した（注：生成物はおそらく（位置）異性体の混合物として得られたため、３つのピークが観察された；保持時間９．０分 、１０．１分、１０．４分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長２１０ｎｍで測定）。
６．２４．錯体［ＡＦ‐ＰＥＧ２‐ウレア‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（２，２’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（アザンジイル））ビス（エタン‐１‐オール））Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｘ）の合成
Ｎ‐（３‐オキソ‐１‐（ピペリジン‐４‐イル）‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデカン‐１２‐イル）ＡＦアミド（Ｌ７）（ＡＦ‐ｐｉｐ；１６．０ｍｇ、１６μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（２，２’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（アザンジイル））ビス（エタン‐１‐オール））Ｉ２（３ｌ）（２８．２ｍｇ、４７μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（８．２３μＬ、４７μｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で１８時間撹拌した後、反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：３５〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（１０．５ｍｇ、収率３８．９％）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９３．７％の純度であることを示した（注：生成物はおそらく立体異性体の混合物として得られたため、２つのピークが観察された；保持時間９．０分と１０．２分；勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長２１０ｎｍで測定）。
６．２５．錯体［ＡＦ‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｙ）の合成と分析的特性評価
６．２５．１．配位子ＡＦ‐ｐｉｐ（Ｌ８）の合成
ＤＭＦ（１．００ｍＬ）に溶解したアウリスタチンＦ（ＡＦ）（３０．０ｍｇ、４０μｍｏｌ、１．０当量）を、４‐（アミノメチル）ピペリジン‐１‐カルボン酸ｔｅｒｔ‐ブチル（２２．９ｍｇ、６０μｍｏｌ、１．５当量）に加えた。続いて、ＨＡＴＵ（１２．９ｍｇ、６０μｍｏｌ、１．５当量）とＤＩＰＥＡ（１３．９６μＬ、１０１μｍｏｌ、２．５当量）を加え、混合物を氷浴で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、水／ＭｅＣＮ（３．５：１、３ｍＬ）に溶解し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を濃縮して、無色の固体（４４．５ｍｇ、定量）を得た。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物化合物Ｌ８‐Ｂｏｃが１００．０％の純度であることを示した（９５．９％化合物Ｌ８‐Ｂｏｃ：保持時間１４．９分及び４．１％Ｂｏｃ‐脱保護化合物化合物Ｌ８：保持時間９．３分；勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、波長２１０ｎｍで測定）。
得られた化合物Ｌ８‐ＢｏｃをＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（２ｍＬ）を加えた。混合物を室温で４５分間撹拌した後、減圧下で濃縮した。残留物を１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で前洗浄したＩＳＯＬＵＴＥ（登録商標）ＳＣＸ‐２カラムにロードした。カラムを１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（２０ｍＬ）で洗浄し、生成物をＤＣＭ（１：１）中の１Ｍメタノール性アンモニアで溶出した。合わせた生成物画分を濃縮し、ＭｅＯＨで数回共蒸発させて、痕跡量のアンモニアを除去し、無色の固体（２２．７ｍｇ、収率６３．０％）を得た。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が１００％の純度であることを示した（保持時間９．３分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
６．２５．２．錯体［ＡＦ‐ｐｉｐ‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｙ）の合成
アウリスタチンＦピペリジニルアミド（Ｌ８）（ＡＦ‐ｐｉｐ；１５．０ｍｇ、１８μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ａ）（２７．２ｍｇ、５３μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１５０μＬ）に溶解した。Ｎ、Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（９．３３μＬ、５３μｍｏｌ、３．０当量）を加え、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を６０℃で３．５時間撹拌した。この時点で、反応混合物は１００．０％の生成物を含んでいた。
反応混合物を水／ＭｅＯＨ（２：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ、勾配：３５〜１００％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を濃縮して、無色の油を得た（１５．３ｍｇ、５９．１％収率）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９７．５％の純度であることを示した（保持時間１０．５分；、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
６．２６．錯体［Ｎ‐（１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデシル）‐３‐（ピリジン‐４‐イル）プロパンアミド‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｚ）の合成及び分析的特性
６．２６．１．２，３，５，６‐テトラフルオロフェニル３‐（ピリジン‐４‐イル）プロパノアートの合成
ＤＣＭ（２５ｍＬ）中の２，３，５，６‐テトラフルオロフェノール（５７６ｍｇ、３．４７ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液に、３‐（ピリジン‐４‐イル）プロパン酸（４７７ｍｇ、３．１６ｍｍｏｌ、１．０当量）を加えた。反応混合物を室温で５分間攪拌し、ＥＤＣ（７２６ｍｇ、３．７９ｍｍｏｌ、１．２当量）を室温で加えた。得られた懸濁液を室温で６０時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、混合物を０．１Ｍ ＨＣｌ水溶液（水２２．５ｍＬ及び１Ｍ ＨＣｌ ２．５ｍＬから調製）で洗浄した。その後、有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液とブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥、蒸発乾固して、粗生成物を無色の固体（３１７ｍｇ、収率３３．６％）として得た。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９６．５％の純度であることを示した（保持時間１０．９分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、１０ｎｍの波長測定）。
６．２６．２．配位子Ｎ‐（１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデシル）‐３‐（ピリジン‐４‐イル）プロパンアミド（Ｎ３‐ＰＥＧ４‐ｐｙ、Ｌ９）の合成
１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデカン‐１‐アミン（４７．３μＬ、２０１μｍｏｌ、１．０当量）及び２，３，５，６‐テトラフルオロフェニル３‐（ピリジン‐４‐イル）プロパノアート（６０ｍｇ、２０１μｍｏｌ、１．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＭｅＣＮ（２ｍＬ）に溶解した。この混合物を２．５時間撹拌した（反応の進行は、溶離液としてシクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ １：２及びｉＰｒＯＨ／ＮＨ３（ａｑ．）＝１０：１を使用するＴＬＣによって監視した）。次に、ＴＥＡ（２７．９μＬ、２０１μｍｏｌ、１．０当量）を加え、混合物を２０時間撹拌した。その後、溶媒を減圧下で除去して、無色の油状残留物（１１９ｍｇ）を得た。これを、続いてカラムクロマトグラフィー（溶離液としてＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ３（ａｑ．）を使用した段階的勾配＝１００：５：１→１００：７．５：１→１００：１０：１）で精製した。生成物含有画分を減圧下で蒸発させて、無色の油を得た（６６ｍｇ、８３％収率）。
６．２６．３．錯体［Ｎ‐（１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデシル）‐３‐（ピリジン‐４‐イル）プロパンアミド‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｚ）の合成
Ｎ‐（１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデシル）‐３‐（ピリジン‐４‐イル）プロパンアミド（Ｌ９）（Ｎ３‐ＰＥＧ４‐ｐｙ；２２．５ｍｇ、５７μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ａ）（８７．０ｍｇ、１７１μｍｏｌ、３．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（２９．７μＬ、１７１μｍｏｌ、３．０当量）を加え、反応混合物を４０℃で２４時間撹拌し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。反応混合物を１０ｍＭ ＮａＩ／ＭｅＯＨ混合物（４：１、２．５ｍＬ）で希釈し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。精製は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２ｘ２５０ｍｍ；勾配：２０〜７５％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、３６分）で行った。生成物画分を減圧下で濃縮して、無色の油を得た（３６．８ｍｇ、７２．６％収率）。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９５．７％の純度であることを示した（保持時間１６．６分、勾配：５〜５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２１０ｎｍの波長で測定）。
６．２７．錯体［Ｎ１、Ｎ３‐ビス（１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデシル）‐Ｎ５‐（ピリジン‐４‐イルメチル）ベンゼン‐１，３，５‐トリカルボキサミド‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ａａ）の合成と分析的特性評価
６．２７．１．トリス（２，３，５，６‐テトラフルオロフェニル）ベンゼン‐１，３，５‐トリカルボキシラートの合成
アルゴン雰囲気下で、ＤＩＰＥＡ（１３．９ｍＬ、８０ｍｍｏｌ、４．０当量）及び２，３，５，６‐テトラフルオロフェノール（１０．３ｇ、６０．４ｍｍｏｌ、３．０当量）を乾燥ＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、続いて０℃で乾燥ＤＣＭ（１５０ｍＬ）中のベンゼン‐１，３，５‐トリカルボニルトリクロリド（３．５７ｍＬ、２０．０ｍｍｏｌ、１．０当量）の激しく撹拌された溶液に２．５時間かけて滴加した。添加後、混合物を４０分間撹拌し、６℃まで温めた後、周囲温度まで徐々に加熱し、さらに１時間撹拌した。次に、反応混合物を１Ｍ ＨＣｌ（３２０ｍＬ）及び１Ｍ ＮａＯＨ（３２０ｍＬ）で洗浄した。アルカリ性水層をＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。溶媒を除去した後、淡褐色の固体（１２．１ｇ、収率９３％）が得られた。
６．２７．２．ビス（２，３，５，６‐テトラフルオロフェニル）５‐（（ピリジン‐４‐イルメチル）カルバモイル）イソフタラートの合成
トリス（２，３，５，６‐テトラフルオロフェニル）ベンゼン‐１，３，５‐トリカルボキシラート（５．００ｇ、７．６４ｍｍｏｌ、３．０当量）をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中のピリジン‐４‐イルメタンアミン（２５９μＬ、２．５５ｍｍｏｌ、１．０当量）とＴＥＡ（７１０μＬ、５．０９ｍｍｏｌ、２．０当量）の混合物を、激しく攪拌しながら１４０分かけて滴加した。次に、混合物をさらに１．５時間撹拌した後、ＴＬＣ（溶離液としてＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ３（ａｑ．）＝１００：１０：１）は、ピリジン‐４‐イルメタンアミンの完全な消費を示した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をシクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ（３：１２、１５ｍＬ）に懸濁し、超音波浴で超音波処理し、濾過し、フィルターケーキをシクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１：２、４ｍＬ）で洗浄した。ＴＬＣにより、フィルターケーキにトリス（２，３，５，６‐テトラフルオロフェニル）ベンゼン‐１，３，５‐トリカルボキシラートの出発物質が含まれ、濾液にはこの出発物質と一緒に生成物が含まれることが明らかになった。したがって、濾液を減圧下で蒸発させ、粗残留物をシクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１．５：６、７．５ｍＬ）に懸濁し、超音波浴で超音波処理し、濾過し、フィルターケーキをシクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１：４、３ｍＬ）で洗浄した。回収されたトリス（２，３，５，６‐テトラフルオロフェニル）ベンゼン‐１，３，５‐トリカルボキシラートの収量は１．６７ｇ（適用量の３３．３％）であった。最後に、濾液を減圧下で蒸発させ、残留物をシクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１：１、１２ｍＬ）に溶解し、カラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ ２：１→１：１を溶離液として使用する段階的勾配）で精製した。収集した生成物含有画分を減圧下で蒸発させ、残留物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解した。得られた有機相を１Ｍ ＮａＯＨ（４０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて無色の固体（６９１ｍｇ、４６％収率）を得た。
６．２７．３．配位子Ｎ１、Ｎ３‐ビス（１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデシル）‐Ｎ５‐（ピリジン‐４‐イルメチル）ベンゼン‐１，３，５‐トリカルボキサミド（ビス‐Ｎ３‐ＰＥＧ４‐ベンゼン‐ｐｙ、Ｌ１０）
ビス（２，３，５，６‐テトラフルオロフェニル）５‐（（ピリジン‐４‐イルメチル）カルバモイル）イソフタラート（８８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＥｔＯＡｃ／ＴＨＦ（５：２、７ｍＬ）に溶解し、続いて、１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデカン‐１‐アミン（７９ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、２．０当量、ＥｔＯＡｃ（０．５ｍＬ）に溶解）、及びＴＥＡ（６１．７μＬ、０．４４ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。得られた混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２０時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液としてシクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝１：２及びＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ３（ａｑ．）＝１００：１０：１）は、ビス（２，３，５，６‐テトラフルオロフェニル）５‐（（ピリジン‐４‐イルメチル）カルバモイル）イソフタラート及び１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデカン‐１‐アミンの両方の完全な消費を示した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１００：１→１００：２→１００：３→１００：５→１００：７）で精製した。溶媒を蒸発させた後、収集された生成物含有画分は、淡いオレンジ色の油（９６ｍｇ、８２％収率）を与えた。
６．２７．４．錯体Ｎ１，Ｎ３‐ビス（１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデシル）‐Ｎ５‐（ピリジン‐４‐イルメチル）ベンゼン‐１，３，５‐トリカルボキサミド‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ａａ）の合成
Ｎ１，Ｎ３‐ビス（１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデシル）‐Ｎ５‐（ピリジン‐４‐イルメチル）ベンゼン‐１，３，５‐トリカルボキサミド（Ｌ１０）（ビス‐Ｎ３‐ＰＥＧ４‐ベンゼン‐ｐｙ；３９．５ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ａ）（２５．４ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解し、均一な黄色の混合物をもたらした。反応混合物を５０℃で１９時間撹拌し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。次に、追加のＰｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ａ）（２５．４ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）を反応混合物に加えた。反応混合物を５０℃で２４時間撹拌し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。その後、追加のＰｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ａ）（２５．４ｍｇ、５０μｍｏｌ、１．０当量）を反応混合物に加えた。反応混合物を５０℃で２４時間撹拌し、反応の経過をＨＰＬＣで追跡した。この時点で、反応混合物は９８．１％の生成物を含んでいた。
反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、濾紙でろ過して、沈殿した過剰なＰｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ２（３ａ）を除去した。濾液をＲＰ‐Ｃ１８（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ（登録商標）、１５‐２５μｍ；５００ｍｇ、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）で前洗浄）を含むカラムに適用した。ランアウトは捨てられた。その後、カラムを水／ＭｅＯＨ（９：１、９ｍＬ）及び水／ＭｅＯＨ（８：２、５ｍＬ）で洗浄した。その後、生成物を水／ＭｅＯＨ（２：８、４ｍＬ）で溶出した。ＨＰＬＣ分析は、この画分が９９．６％の生成物を含むことを示した。この画分を、水（１ｍＬ）中のＮａＩ（１３．２ｍｇ）溶液と混合した。混合物を水（５ｍＬ）でさらに希釈し、減圧下で濃縮した。凍結後、混合物を凍結乾燥して黄色のフィルムを得た（６２．０ｍｇ、ＮａＩ含有量を補正：４８．８ｍｇ、７６．０％収率）。この材料を使用して、１０ｍＭ ＮａＩ水溶液で５ｍＭ溶液を調製した。この形で材料が使用され、保管された。
ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５ｘ４．６ｍｍ）は、生成物が９９．０％の純度であることを示した（保持時間１１．２分、勾配：２０〜１００％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡ、２０分、２２３ｎｍの波長で測定）。
異なるハライド「半最終生成物」（ＳＦＭ）を使用した結合効率の比較
結合混合物にＮａＩがない場合
結合混合物にＮａＩがない場合
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；３５．５μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、薬局保管用バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、水（１５μＬ）、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（６．１５μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、［ＰｔＬ２（（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｉｐ）（エタン‐１，２‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（４ａ（Ｌ２＝Ｃｌ）、５ｄ（Ｌ２＝Ｂｒ）又は６ｋ（Ｌ２＝Ｉ））（５．０μＬ、２０ｍＭ ＮａＣｌ中５ｍＭ（４ａ）又は水中５ｍＭ（５ｄ及び６ｋ）、５．０当量）を添加した。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で１時間、２時間、４時間、６時間、及び２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（６１．７μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。
結合効率は４３０ｎｍのＵＶ検出でＳＥＣによって決定され、タンパク質に結合した（Ｆｅ）ＤＦＯキレート画分の、結合していない低ＭＷ画分も含む（Ｆｅ）ＤＦＯ総量に対するパーセンテージとして定義された。
２４時間の結合時間後の結合効率は、３９％（Ａ：４ａ、Ｌ２＝Ｃｌ）、４２％（Ｂ：５ｄ、Ｌ２＝Ｂｒ）、５８％（Ｃ：６ｋ、Ｌ２＝Ｉ、図１）であった。
結合混合物にＮａＩを使用
結合混合物にＮａＩを使用
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；３５．５μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、薬局保管用バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、水（１５μＬ）、１００ｍＭ ＮａＩ（反応混合物のＮａＩの最終濃度は１０ｍＭであった）を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（６．１５μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、［ＰｔＬ２（（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｉｐ）（エタン‐１，２‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（４ａ（Ｌ２＝Ｃｌ）、５ｄ（Ｌ２＝Ｂｒ）又は６ｋ（Ｌ２＝Ｉ））（５．０μＬ、２０ｍＭ ＮａＣｌ中５ｍＭ（４ａ）又は水中５ｍＭ（５ｄ及び６ｋ）、５．０当量）を加えた。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で１時間、２時間、４時間、６時間、及び２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（６１．７μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分インキュベートした。
結合効率は４３０ｎｍのＵＶ検出でＳＥＣによって決定され、タンパク質に結合した（Ｆｅ）ＤＦＯキレート画分の、結合していない低ＭＷ画分も含む（Ｆｅ）ＤＦＯ総量に対するパーセンテージとして定義された。
２４時間の結合時間後、結合効率は７９％（Ａ：４ａ、Ｌ２＝Ｃｌ）、７９％（Ｂ：５ｄ、Ｌ２＝Ｂｒ）、８０％（Ｃ：６ｋ、Ｌ２＝Ｉ、図２）であった。
対応するハロゲン化物塩の添加
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；３５．５μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、薬局保管バッファーから２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．１）にスピンフィルターで再バッファーし、水（１５μＬ）、２０００ｍＭ ＮａＣｌ（４ａの場合；ｐＨ８．１；反応混合物中のＮａＣｌの最終濃度は２００ｍＭであった）、５００ｍＭ ＮａＢｒ（５ｄの場合；ｐＨ８．１；反応混合物中のＮａＢｒの最終濃度は５０ｍＭであった）又は１００ｍＭ ＮａＩ（６ｋの場合；ｐＨ８．１；反応混合物中のＮａＩの最終濃度は１０ｍＭであった）を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（６．１５μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、［ＰｔＬ２（（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｉｐ）（エタン‐１，２‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（４ａ（Ｌ２＝Ｃｌ）、５ｄ（Ｌ２＝Ｂｒ）又は６ｋ（Ｌ２＝Ｉ））（５．０μＬ、２０ｍＭ ＮａＣｌ中５ｍＭ（４ａ）又は水中５ｍＭ（５ｄ及び６ｋ）、５．０当量）が添加された。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で１時間、２時間、４時間、６時間、及び２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（６１．７μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分インキュベートした。
結合効率は４３０ｎｍのＵＶ検出でＳＥＣによって決定され、タンパク質に結合した（Ｆｅ）ＤＦＯキレート画分の、結合していない低ＭＷ画分も含む（Ｆｅ）ＤＦＯ総量に対するパーセンテージとして定義された。
２４時間の結合時間後の結合効率は、３４％（Ａ：４ａ、Ｌ２＝Ｃｌ）、７４％（Ｂ：５ｄ、Ｌ２＝Ｂｒ）、９０％（Ｃ：６ｋ、Ｌ２＝Ｉ、図３）であった。
過剰な対応するハロゲン化物塩を使用した結合条件下でのさまざまなハライド「半最終生成物」の安定化；「半最終生成物」の加水分解を防ぐための最適なハロゲン化物塩濃度の決定
さまざまな濃度のハロゲン化物塩（０、１００、５００、１０００、及び２０００ｍＭ ＮａＣｌ（４ａの場合；ｐＨ８．１；反応混合物中のＮａＣｌの最終濃度は、それぞれ０、１０、５０、１００、及び２００ｍＭであった）又は０、１００、及び５００ｍＭのＮａＢｒ（５ｄの場合；ｐＨ８．１；反応混合物中のＮａＢｒの最終濃度はそれぞれ０、１０、５０ｍＭであった）、又は０及び１００ｍＭ ＮａＩ（６ｋの場合；ｐＨ８．１；反応混合物中のＮａＩの最終濃度はそれぞれ０及び１０ｍＭであった）を含む水（１０１μＬ）と２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（１２．３μＬ、ｐＨ８．１）の混合液に、［ＰｔＬ２（（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｉｐ）（エタン‐１，２‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（４ａ（Ｌ２＝Ｃｌ）、５ｄ（Ｌ２＝Ｂｒ）又は６ｋ（Ｌ２＝Ｉ））（１０．０μＬ、２０ｍＭ ＮａＣｌ中５ｍＭ（４ａ）又は水中５ｍＭ（５ｄ及び６ｋ）、５．０当量）を添加した。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で１時間、２時間、４時間インキュベートした後、４３０ｎｍでＨＰＬＣ分析を行った。
４時間のインキュベーション時間の後、「半最終生成物」の濃度は次のように決定された：９４％（Ｅ：４ａ、Ｌ２＝Ｃｌ、［ＮａＣｌ］＝２００ｍＭ、図４）、９５％（Ｃ：５ｄ、Ｌ２＝Ｂｒ、［ＮａＢｒ］＝５０ｍＭ、図５）、及び９８％（Ｃ：６ｋ、Ｌ２＝Ｉ；［ＮａＩ］＝１０ｍＭ、図６）。
例７：トラスツズマブ‐Ｌｘ複合体７ａ‐ｊの例
７．１．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｉｐ）（エタン‐１，２‐ジアミン）］ｎ（７ａ）；ｎ＝０〜６の合成と分析的特性評価。
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；３５．５μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、薬局保管バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、１００ｍＭ ＮａＩを含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（６．１５μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、［ＰｔＣｌ（（Ｆｅ）ＤＦＯ‐ｓｕｃ‐ｐｉｐ）（エタン‐１，２‐ジアミン）］＋ＴＦＡ−（４ａ）（２０．０μＬ、２０ｍＭ ＮａＣｌ中に８２５μｍ、３．３当量）を添加した。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（６１．７μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで４回洗浄）を使用してスピンろ過し、その後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。
抗体の完全性は（ＥＤＴＡを使用してＦｅ（ＩＩＩ）を除去した後）ＳＥＣによって制御された：９６．８％モノマー。複合体７ａの精製後にＳＥＣ‐ＭＳ分析を行って、ＤＡＲを決定した：ＤＡＲ＝２．１８（６６％の結合効率に対応）。トラスツズマブのフラグメントの錯体分布は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ／ホスホイメージャー分析によって決定された：％Ｈｃ＝８７％、％Ｌｃ＝１３％、％Ｆ（ａｂ‘）２＝３０％。
７．２．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））（エタン‐１，２‐ジアミン）］ｎ（７ｂ）；ｎ＝０〜６の合成と分析的特性評価
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；３５．５μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、薬局保管バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、１００ｍＭ ＮａＩ溶液を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（６．１５μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））Ｃｌ（エタン‐１，２‐ジアミン）（４ｃ）（２０．０μＬ、２０ｍＭ ＮａＣｌ中８２５μｍ、３．３当量）を添加した。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（６１．７μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで４回洗浄）を使用してスピンろ過し、その後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。
抗体の完全性はＳＥＣによって制御された：９８．２％のモノマー。複合体７ｂの精製後にＳＥＣ‐ＭＳ分析を実行して、ＤＡＲ及びトラスツズマブのフラグメントの錯体分布を決定した：ＤＡＲ＝２．８１（８５％の結合効率に対応）、％Ｈｃ＝８７％、％Ｌｃ＝１３％、％Ｆ（ａｂ’）２＝２２％、％Ｆａｂ＝１５％、％Ｆｃ＝８５％。
７．３．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））（（１Ｒ，２Ｒ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）］ｎ（７ｃ）の合成と分析的特性評価
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；７１μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、薬局保管バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、ＭｉｌｌｉＱ水（３３．４μＬ）で、及び１００ｍＭのＮａＩ溶液を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（１２．３μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））Ｉ（（１Ｒ，２Ｒ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）（６ｎ）（６．６μＬ、２０ｍＭ ＮａＩ中５ｍＭ、３．３当量）を加えた。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（１２３．３μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで４回洗浄）を使用してスピンろ過し、その後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。
抗体の完全性はＳＥＣによって制御された：９８．１％モノマー。複合体７ｃの精製後にＳＥＣ‐ＭＳ分析を行って、ＤＡＲを決定した：ＤＡＲ＝３．３（定量的結合効率に対応）。
７．４．バイオ複合体のトラスツズマブ‐［Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））（（１Ｓ，２Ｓ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）］ｎ（７ｄ）の合成と分析的特性評価
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；７１μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、薬局保管バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、ＭｉｌｌｉＱ水（３４μＬ）で、及び１００ｍＭのＮａＩ溶液を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（１２．３μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））Ｉ（（（１Ｓ，２Ｓ）‐（−）‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン））（６ｏ）（６μＬ、２０ｍＭ ＮａＩ中５ｍＭ、３．０当量）を加えた。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（１２３．３μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで４回洗浄）を使用してスピンろ過し、その後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。
抗体の完全性はＳＥＣによって制御された：９８．５％のモノマー。ＳＥＣ‐ＭＳ分析を複合体７ｄの精製後に行い、ＤＡＲを決定した：ＤＡＲ＝３．０（９１％の結合効率に対応）。
７．５．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））（プロパン‐１，３‐ジアミン）］ｎ（７ｅ）の合成と分析的特性評価
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；７１μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、薬局保管バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、ＭｉｌｌｉＱ水（３４μＬ）で、及び１００ｍＭのＮａＩ溶液を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（１２．３μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））Ｉ（プロパン‐１，３‐ジアミン）（６ｒ）（６μＬ、２０ｍＭ ＮａＩ中５ｍＭ、３．０当量）を加えた。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（１２３．３μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで４回洗浄）を使用してスピンろ過し、その後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。
抗体の完全性はＳＥＣによって制御された：９６．３％のモノマー。複合体７ｅの精製後にＳＥＣ‐ＭＳ分析を実行して、ＤＡＲを決定した：ＤＡＲ＝２．７（９０％の結合効率に対応）。
７．６ バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）］ｎ（７ｆ）の合成と分析的特性評価
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；２３８μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を薬局保管バッファーからＰＢＳにスピンフィルターで再バッファーし、ＭｉｌｌｉＱ水（１０５．６μＬ）で、及び１００ｍＭのＮａＩ溶液を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（４１．２μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））Ｉ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）（６ｓ）（２８．５μＬ、２０ｍＭ ＮａＩ中５ｍＭ、４．２当量）を添加した。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で２時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（４１１μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで４回洗浄）を使用してスピンろ過し、その後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。
抗体の完全性はＳＥＣによって制御された：９８．９％のモノマー。ＳＥＣ‐ＭＳ分析を複合体７ｆの精製後に行い、ＤＡＲを決定した：ＤＡＲ＝２．７（６４％の結合効率に対応）。
７．７．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロブタン‐１，２‐ジイル）ジメタンアミン）］ｎ（７ｇ）の合成と分析的特性評価
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；７１μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、薬局保管バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、ＭｉｌｌｉＱ水（３３．４μＬ）で、及び１００ｍＭのＮａＩ溶液を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（１２．３μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））Ｉ（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロブタン‐１，２‐ジイル）ジメタンアミン）（６ｔ）（６．６μＬ、２０ｍＭ ＮａＩ中５ｍＭ、３．３当量）を添加した。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（１２３．３μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで４回洗浄）を使用してスピンろ過し、その後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。
抗体の完全性はＳＥＣによって制御された：９８．０％モノマー。複合体７ｇの精製後にＳＥＣ‐ＭＳ分析を実施して、ＤＡＲを決定した：ＤＡＲ＝３．０（９１％の結合効率に対応）。
７．８．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，８ａＳ）‐６‐メトキシ‐２‐フェニルヘキサヒドロピラノ［３，２‐ｄ］［１，３］ジオキシン‐７，８‐ジアミン］ｎ（７ｈ）の合成と分析的特性評価
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；７１μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、薬局保管バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、ＭｉｌｌｉＱ水（３４μＬ）で、及び１００ｍＭ ＮａＩ溶液を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（１２．３μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））Ｉ（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，８ａＳ）‐６‐メトキシ‐２‐フェニルヘキサヒドロピラノ［３，２‐ｄ］［１，３］ジオキシン‐７，８‐ジアミン）（６ｖ）（６μＬ、２０ｍＭ ＮａＩ中５ｍＭ、３．０当量）が添加された。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（１２３．３μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで４回洗浄）を使用してスピンろ過し、その後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。
抗体の完全性はＳＥＣによって制御された：９６．７％モノマー。ＳＥＣ‐ＭＳ分析は、複合体７ｈの精製後に行われ、ＤＡＲを決定した：ＤＡＲ＝２．２（７３％の結合効率に対応）。
７．９．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））（２‐（（２‐アミノエチル）アミノ）エタン‐１‐オール］ｎ（７ｉ）の合成と分析的特性評価
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；７１μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、薬局保管バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、ＭｉｌｌｉＱ水（３４μＬ）で、及び１００ｍＭのＮａＩ溶液を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（１２．３μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））Ｉ（２‐（（２‐アミノエチル）アミノ）エタン‐１‐オール）（６ｗ）（６μＬ、２０ｍＭ ＮａＩ中５ｍＭ、３．０当量）を添加した。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（１２３．３μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで４回洗浄）を使用してスピンろ過し、その後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。
抗体の完全性はＳＥＣによって制御された：９８．４％のモノマー。複合体７ｉの精製後にＳＥＣ‐ＭＳ分析を行って、ＤＡＲを決定した：ＤＡＲ＝２．８（９３％の結合効率に対応）。
７．１０．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））（２，２’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（アザンジイル））ビス（エタン‐１‐オール）］ｎ（７ｊ）の合成と分析的特性評価
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；７１μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、薬局保管バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、ＭｉｌｌｉＱ水（３４μＬ）で、及び１００ｍＭ ＮａＩ溶液を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（１２．３μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、Ｐｔ（アウリスタチンＦ‐（４‐（１２‐アミノ‐３‐オキソ‐７，１０‐ジオキサ‐２，４‐ジアザドデシル）ピペリジン））Ｉ（２，２’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（アザンジイル））ビス（エタン‐１‐オール））（６ｘ）（６μＬ、２０ｍＭ ＮａＩ中５ｍＭ、３．０当量）を加えた。サンプルをサーモシェーカーで４７℃で２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（１２３．３μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで４回洗浄）を使用してスピンろ過し、その後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。
抗体の完全性はＳＥＣによって制御された：９８．３％モノマー。複合体７ｊの精製後にＳＥＣ‐ＭＳ分析を実行して、ＤＡＲを決定した：ＤＡＲ＝２．６（８７％の結合効率に対応）。
例８：銅を含まないクリックケミストリーで使用するための「半最終」化合物（ＳＦＭ）６ｚ及び６ａａから得られたアジドを含むトラスツズマブ‐Ｌｘ複合体８ａ‐ｂの例
８．１．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（Ｎ３‐ＰＥＧ４‐ｐｙ）（エタン‐１，２‐ジアミン）］ｎ（８ａ）の合成と分析的特性評価
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；２３８μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ、３３ｎｍｏｌ、１．０当量）を、薬局保管バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、１００ｍＭのＮａＩ溶液を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（４１．２μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、［Ｎ‐（１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデシル）‐３‐（ピリジン‐４‐イル）プロパンアミド‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ｚ）（２１．８μＬ、１０ｍＭ ＮａＩ中５ｍＭ、１０９ｎｍｏｌ、３．３当量）を添加した。サンプルをさらにｍｉｌｌｉＱ水（１１２．２μＬ）で希釈し、サーモシェーカーで４７℃で２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（４１３μＬ、Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで１回洗浄）を使用してスピンろ過し、その後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。
８．２．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（Ｎ１、Ｎ３‐ビス（１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデシル）‐Ｎ５‐（ピリジン‐４‐イルメチル）ベンゼン‐１，３，５‐トリカルボキサミド）（エタン‐１，２‐ジアミン）］ｎ（８ｂ）の合成と分析的特性評価
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；２３８μＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ、３３ｎｍｏｌ、１．０当量）を、薬局保管バッファーからＰＢＳにスピンろ過により再バッファーし、１００ｍＭのＮａＩ溶液を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（４１．２μＬ、ｐＨ８．１）で希釈し、［Ｎ１、Ｎ３‐ビス（１４‐アジド‐３，６，９，１２‐テトラオキサテトラデシル‐Ｐｔ（エタン‐１，２‐ジアミン）Ｉ］＋ＴＦＡ−（６ａａ）（２１．８μＬ、１０ｍＭ ＮａＩ中５ｍＭ、１０９ｎｍｏｌ、３．３当量）を添加した。サンプルをｍｉｌｌｉＱ水（１１２．２μＬ）でさらに希釈し、サーモシェーカーで４７℃で２４時間インキュベートした後、チオ尿素溶液（４１３μＬ、Ｈ２Ｏで２０ｍＭ）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで１回洗浄）を用いてスピン濾過し、その後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。
例９：銅を含まないクリックケミストリーを介して複合体８ａから得られたトラスツズマブ‐Ｌｘ複合体９ａ‐ｆの例
９．１．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（Ｆｌｕｏｒ５４５‐ＰＥＧ４‐ＤＢＣＯ‐トリアゾール‐ＰＥＧ４‐ピリジン）］ｎ（９ａ）の合成
バイオ複合体８ａ（３０３μＬ、４．９５ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ、１０ｎｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ（２９７μＬ）で希釈し、ジベンゾシクロオクチン‐ＰＥＧ４‐Ｆｌｕｏｒ５４５（ＤＢＣＯ‐ＰＥＧ４‐Ｆｌｕｏｒ５４５；１０μＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、２００ｎｍｏｌ、２０．０当量）を加えた。サンプルをサーモシェーカーで３７℃で２時間インキュベートした後、複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで１回洗浄）を使用してスピン濾過し、その後、再構成され、ＰＢＳバッファーに保存された。結合により、９８．４％モノマーの複合体が得られた。
９．２．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ‐ＤＢＣＯ‐トリアゾール‐ＰＥＧ４‐ピリジン）］ｎ（９ｂ）の合成
バイオ複合体８ａ（５７．６μＬ、４．３４ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ、１．６５ｎｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＳＯ（５７．６μＬ）で希釈し、ＢＤＰ ＦＬ ＤＢＣＯ（２μＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、２０ｎｍｏｌ、１２．１当量）を添加した。サンプルをサーモシェーカーで３７℃で２時間インキュベートした後、複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで１回洗浄）を使用してスピン濾過し、その後、再構成され、ＰＢＳバッファーに保存された。結合により、１００％モノマーの複合体が得られた。
９．３．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（Ｃｙａｎｉｎｅ５ ＤＢＣＯ‐トリアゾール‐ＰＥＧ４‐ピリジン）］ｎ（９ｃ）の合成
バイオ複合体８ａ（５７．６μＬ、４．３４ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ、１．６５ｎｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＳＯ（５７．６μＬ）で希釈し、Ｃｙａｎｉｎｅ５ ＤＢＣＯ（２μＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、２０ｎｍｏｌ、１２．１当量）を添加した。サンプルをサーモシェーカーで３７℃で２時間インキュベートした後、複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで１回洗浄）を使用してスピン濾過し、その後、再構成され、ＰＢＳバッファーに保存された。結合により、９９．１％モノマーの複合体が得られた。
９．４．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（ＤＦＯ‐ＤＢＣＯ‐トリアゾール‐ＰＥＧ４‐ピリジン）］ｎ（９ｄ）の合成
バイオ複合体８ａ（３００μＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ、１０ｎｍｏｌ、１．０当量）をデフェロキサミン‐ＤＢＣＯ（ＤＦＯ‐ＤＢＣＯ；４μＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、４０ｎｍｏｌ、４．０当量）と混合した。サンプルをサーモシェーカーで２５℃で２時間インキュベートした後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（０．９％ＮａＣｌで４回洗浄）を使用したスピンろ過により複合体を精製した後、再構成して０．９％ＮａＣｌバッファーに保存した。結合により、９７．８％モノマーの複合体が得られた。
９．５．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（ＭＭＡＦ‐ＰＥＧ４‐ＤＢＣＯ‐トリアゾール‐ＰＥＧ４‐ピリジン）］ｎ（９ｅ）の合成
バイオ複合体８ａ（３００μＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ、１０ｎｍｏｌ、１．０当量）をＤＢＣＯ‐ＰＥＧ４‐ＭＭＡＦ（４μＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、４０ｎｍｏｌ、４．０当量）と混合した。サンプルをサーモシェーカーで２５℃で２時間インキュベートした後、複合体を３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳで４回洗浄）を使用したスピンろ過で精製した後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。結合により、モノマーが９７．４％であり、ＤＡＲが２．４である複合体が得られた。
９．６．バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（ＭＭＡＦ‐ＰＡＢ‐ｖｃ‐ＰＥＧ４‐ＤＢＣＯ‐トリアゾール‐ＰＥＧ４‐ピリジン）］ｎ（９ｆ）の合成
バイオ複合体８ａ（３００μＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ、１０ｎｍｏｌ、１．０当量）をＤＢＣＯ‐ＰＥＧ４‐ｖｃ‐ＰＡＢ‐ＭＭＡＦ（４μＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、４０ｎｍｏｌ、４．０当量）と混合した。サンプルをサーモシェーカーで２５℃で２時間インキュベートした後、複合体を３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳで４回洗浄）を使用したスピンろ過で精製した後、再構成してＰＢＳバッファーに保存した。結合により、モノマーが９７．４％であり、ＤＡＲが２．４である複合体が得られた。
例１０：銅を含まないクリックケミストリーを介して複合体８ｂから得られたトラスツズマブ‐Ｌｘ複合体１０ａの例
1０．１ バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（（Ｆｌｕｏｒ５４５−ＰＥＧ４‐ＤＢＣＯ‐トリアゾール‐ＰＥＧ４）２‐ベンゼン‐ピリジン）］ｎ（１０ａ）の合成
1０．１ バイオ複合体トラスツズマブ‐［Ｐｔ（（Ｆｌｕｏｒ５４５−ＰＥＧ４‐ＤＢＣＯ‐トリアゾール‐ＰＥＧ４）２‐ベンゼン‐ピリジン）］ｎ（１０ａ）の合成
バイオ複合体８ｂ（３０３μＬ、４．９５ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ、１０ｎｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ（２９７μＬ）で希釈し、ジベンゾシクロオクチン‐ＰＥＧ４‐Ｆｌｕｏｒ５４５（ＤＢＣＯ‐ＰＥＧ４‐Ｆｌｕｏｒ５４５；２０μＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、２００ｎｍｏｌ、２０．０当量）を加えた。サンプルをサーモシェーカーで３７℃で２時間インキュベートした後、複合体をＰＤ‐１０カラム（リン酸緩衝生理食塩水で平衡化）で精製した後、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター（ＰＢＳバッファーで１回洗浄）を使用してスピン濾過し、その後、再構成され、ＰＢＳバッファーに保存された。結合により、９８．６％モノマーの複合体が得られた。
Claims (19)
- 以下の式Ｉによる二次官能性部分
ここで、Ｍは遷移金属錯体であり、配位子Ｌ１又はＬ２の１つはヨウ化物、臭化物又は塩化物から選択され、他の配位子は一次官能性部分である。Ｎｕは求核基であり、ここでＮｕ１及びＮｕ２は同じ基又は異なる基であり得、これらは一緒に二座配位子を形成するが、但し前記二座配位子はエタン‐１，２‐ジアミンではない。 - Ｎｕ１及びＮｕ２によって形成される二座配位子が、以下の式の１つによって表される、請求項１に記載の二次官能性部分。
- Ｎｕ１及びＮｕ２によって形成される二座配位子が、以下の式の１つによって表される、請求項１〜２のいずれかに記載の二次官能性部分。
- Ｎｕ１及びＮｕ２によって形成される二座配位子が、以下の式の１つによって表される、請求項１〜３のいずれかに記載の二次官能性部分。
- 遷移金属錯体Ｍが白金（ＩＩ）錯体である、請求項１〜４のいずれかに記載の二次官能性部分。
- 一次官能性部分が、治療用化合物、診断用化合物、キレート剤、色素又はモデル化合物からなる群から選択され、好ましくは一次官能性部分は細胞毒性化合物である、請求項１〜５のいずれかに記載の二次官能性部分。
- 細胞毒性化合物が、アウリスタチン、ドラスタチン、シンプロスタチン、メイタンシノイド、チューブリシン、ＨＴＩ‐２８６、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン（ＩＧＮ）、カンプトテイン、アントラサイクリン、アゾナフィド、アマニチン、クリプトフィシン、リゾキシン、エポチロン、スプライセオスタチン、タイランスタチン、コルヒチン、アプリロニン、タキソイド、メトトレキサート、アミノプテリン、ビンカアルカロイド、シュードモナス外毒素Ａのフラグメント、スタチン、リシンＡ、ゲロニン、サポリン、インターロイキン‐２、インターロイキン‐１２などのタンパク質性毒素、Ｅ４、ｆ４、アポプチン、又はＮＳ１などのウイルス性タンパク質、ＨＡＭＬＥＴ、ＴＲＡＩＬ、又はｍｄａ‐７などの非ウイルス性タンパク質の群から選択される、請求項６に記載の方法。
- 診断用化合物が放射性核種、ＰＥＴ画像化可能薬剤、ＳＰＥＣＴ画像化可能薬剤又はＭＲＩ画像化可能薬剤、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＤＹ‐８００、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、インドシアニングリーン、ＦＩＴＣ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬなどのＢＯＤＩＰＹ、及びローダミンＢなどのローダミンを含む、請求項６に記載の二次官能性部分。
- 遷移金属錯体が白金（ＩＩ）錯体であり、一次官能性部分がアウリスタチン、好ましくはアウリスタチンＦである、請求項１〜８のいずれかに記載の二次官能性部分。
- 式Ｉによる二次官能性部分のハロゲン化物配位子Ｌ１又はＬ２が細胞結合部分によって置換されている、請求項１〜９のいずれかに記載の反応した二次官能性部分を含む細胞標的複合体。
- 細胞結合部分が、抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント、モノクローナル抗体、操作されたモノクローナル抗体、標的細胞に特異的に結合する一本鎖モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体又はそのフラグメント、キメラ抗体、キメラ抗体フラグメント、又はアフィボディ、アンチカリン、アドネクチン、ダーピン、Ｂｉｃｙｃｌｅ（登録商標）などの非伝統的なタンパク質スキャフォールド、又は標的細胞に特異的に結合する葉酸誘導体である、請求項１０に記載の細胞標的複合体。
- 細胞結合部分が、トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、ブレンツキシマブ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、及び抗ＭＡＧＥ‐ＨＬＡペプチド複合抗体などの腫瘍細胞のような異常細胞の細胞内標的に対する抗体である、請求項１０又は１１に記載の細胞標的複合体。
- トラスツズマブ-Ｐｔ（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（（１Ｓ，２Ｓ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（（１Ｒ，２Ｓ）‐シクロヘキサン‐１，２‐ジアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（Ｎ１、Ｎ２‐ジメチルエタン‐１，２‐ジアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（プロパン‐１，３‐ジアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（（１Ｒ，２Ｒ）‐シクロブタン‐１、２‐ジイル）ジメタンアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４‐ジアミノ‐６‐（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ‐２Ｈ‐ピラン‐２，５‐ジオール）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，８ａＳ）‐６‐メトキシ‐２‐フェニルヘキサヒドロピラノ［３，２‐ｄ］［１，３］ジオキシン‐７，８‐ジアミン）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（２‐（（２‐アミノエチル）アミノ）エタン‐１‐オール）-アウリスタチンＦ、トラスツズマブ-Ｐｔ（２，２’‐（エタン‐１，２‐ジイルビス（アザンジイル））ビス（エタン‐１‐オール））-アウリスタチンＦからなる群から選択される、請求項１０〜１２の細胞標的複合体。
- 抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体‐Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）‐ＰＮＵ‐１５９６８２、抗ＭＡＧＥ‐ＨＬＡペプチド複合抗体‐Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）-アルファ‐アマニチン、ＭＡＧＥ‐ＨＬＡペプチド複合抗体-Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）-ＰＢＤ、及びブレンツキシマブ-Ｐｔ（１，３‐ジアミノプロパン‐２‐オール）-アルファアマニチンを含む群から選択される、請求項１０〜１２の細胞標的複合体。
- 遷移金属錯体が白金（ＩＩ）錯体であり、細胞結合部分がトラスツズマブであり、一次官能性部分がアウリスタチン、好ましくはアウリスタチンＦである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の細胞標的複合体。
- 哺乳動物、特にヒトにおける癌の治療に使用するための、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の細胞標的複合体。
- 結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、及び非小細胞肺癌の治療に使用するための、請求項１６に記載の使用のための細胞標的複合体。
- 乳癌の治療において使用するための、請求項１７に記載の使用のための細胞標的複合体であって、前記乳癌は、Ｈｅｒ２の低い発現レベルを有する、上記細胞標的複合体。
- 請求項１０〜１５のいずれかに記載の細胞標的複合体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
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