JP2021506311A - 免疫原性組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)本発明の改変されたHlaタンパク質をコードする核酸、及び任意選択的に
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
を含む宿主細胞が提供される。
担体タンパク質:コンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)を作製するために抗原(例えば、糖抗原)に共有結合したタンパク質。担体タンパク質は、T細胞がコンジュゲートした抗原に対してT細胞性免疫を活性化する。
Hla:ブドウ球菌、具体的には、黄色ブドウ球菌由来のアルファ毒素としても公知であるヘモリシンA。
CP:莢膜多糖。
LPS:リポ多糖。
wzy:多糖重合を触媒する酵素をコードする多糖ポリメラーゼ遺伝子。コードされた酵素は、オリゴ糖単位を非還元末端に転移し、グリコシド結合を形成する。
waaL:膜結合酵素をコードするO抗原リガーゼ遺伝子。コードされた酵素は、ウンデカプレニル-二リン酸(UPP)結合O抗原をリピドAコアオリゴ糖に転移し、リポ多糖を形成する。
Und-PP:ウンデカプレニルピロリン酸。
Und-P:ウンデカプレニルリン酸。
還元末端:オリゴ糖又は多糖の還元末端は、グリコシド結合に関与せず、したがって開鎖型に変換することができる遊離アノマー炭素を有する単糖である。
配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含む(又はそれからなる)改変されたHlaタンパク質であって、該アミノ酸配列が、配列番号1のH48位及びG122位で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点で改変されており、前記置換がそれぞれHからC及びGからC(例えば、H48C及びG122C、例えば、配列番号2又は配列番号3)である、改変されたHlaタンパク質が提供される。前記タンパク質は、さらに、アミノ酸配列が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択される1つ以上のコンセンサス配列(複数可)を含むという点でさらに改変され得、X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸(例えば、配列番号7)である。これらの配列は、シグナル配列の付加、及び任意選択的に、本明細書に記載されるように、クローニング目的のためのN末端セリン及び/又はアラニンの挿入によって改変され得る。配列は、解毒突然変異、例えば、本明細書に記載される解毒突然変異のいずれか1つ又はすべてを含むようにさらに改変され得る。好ましい解毒突然変異は、配列番号1又は2のH35Lである。
本発明はまた、本発明の改変されたHlaタンパク質を含む(又はそれからなる)コンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)を提供し、改変されたHlaタンパク質は、例えば、抗原、好ましくは多糖又はオリゴ糖抗原に共有結合で連結されている。
A)カルボキシル(例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸を介する)。一実施形態では、この基は、直接糖上のアミノ基に、又はカルボジイミド化学、例えばEDACを有するリンカー上のアミノ基に連結される。
B)アミノ基(例えば、リジンを介する)。一実施形態では、この基は、直接糖上のカルボキシル基に、又はカルボジイミド化学、例えばEDACを有するリンカー上のカルボキシル基に連結される。別の実施形態では、この基は、直接糖上の、CDAP若しくはCNBrで活性化されたヒドロキシル基に又はリンカー上のこのような基に、アルデヒド基を有する糖若しくはリンカーに、スクシンイミドエステル基を有する糖又はリンカーに結合される。
C)スルフィドリル(例えば、システインを介する)。一実施形態では、この基は、ブロモ若しくはクロロアセチル化された糖、又はマレイミド化学を有するリンカーに連結される。一実施形態では、この基は、ビスジアゾベンジジンで活性化/修飾(改変)される。
D)ヒドロキシル基(例えば、チロシンを介する)。一実施形態では、この基は、ビスジアゾベンジジンで活性化/修飾(改変)される。
E)イミダゾリル基(例えば、ヒスチジンを介する)。一実施形態では、この基は、ビスジアゾベンジジンで活性化/修飾(改変)される。
F)グアニジル基(例えば、アルギニンを介する)。
G)インドリル基(例えば、トリプトファンを介する)。
糖-OH+CNBr又はCDAP----->シアン酸エステル+NH2-タンパク質---->コンジュゲート
糖-アルデヒド+NH2-タンパク質---->シッフ塩基+NaCNBH3---->コンジュゲート
糖-COOH+NH2-タンパク質+EDAC---->コンジュゲート
糖-NH2+COOH-タンパク質+EDAC---->コンジュゲート
スペーサー(リンカー)を介した間接的カップリングアプローチ:
糖-OH+CNBr又はCDAP--->シアン酸エステル+NH2----NH2---->糖----NH2+COOH-タンパク質+EDAC----->コンジュゲート
糖-OH+CNBr又はCDAP---->シアン酸エステル+NH2-----SH----->糖----SH+SH-タンパク質(露出したシステインを有する天然タンパク質、又は例えばSPDPによるタンパク質のアミノ基の修飾(改変)後に得られたタンパク質)-----糖-S-S-タンパク質
糖-OH+CNBr又はCDAP--->シアン酸エステル+NH2----SH------->糖----SH+マレイミド-タンパク質(アミノ基の修飾(改変))---->コンジュゲート
糖-OH+CNBr又はCDAP--->シアン酸エステル+NH2-----SH--->糖-SH+ハロアセチル化タンパク質---->コンジュゲート
糖-COOH+EDAC+NH2-----NH2--->糖------NH2+EDAC+COOH-タンパク質---->コンジュゲート
糖-COOH+EDAC+NH2----SH----->糖----SH+SH-タンパク質(露出したシステインを有する天然タンパク質、又は例えばSPDPによるタンパク質のアミノ基の修飾(改変)後に得られたタンパク質)----->糖-S-S-タンパク質
糖-COOH+EDAC+NH2----SH----->糖----SH+マレイミド-タンパク質(アミノ基の修飾(改変))---->コンジュゲート
糖-COOH+EDAC+NH2----SH--->糖-SH+ハロアセチル化タンパク質---->コンジュゲート
糖-アルデヒド+NH2-----NH2---->糖---NH2+EDAC+COOH-タンパク質---->コンジュゲート
注釈:前記のEDACの代わりに、任意の適切なカルボジイミドを使用することができる。
ある実施形態では、本発明のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)中の抗原の1つは、糖、例えば、細菌莢膜糖、細菌リポ多糖又は細菌オリゴ糖である。ある実施形態では、抗原は、細菌莢膜糖である。
本発明はまた、以下:
i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)本発明の改変されたHlaタンパク質をコードする核酸、及び任意選択的に
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
含む宿主細胞を提供する。
i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)本発明の改変されたHlaタンパク質をコードする核酸、
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸、及び
vi)フリッパーゼ(例えば、wxy)をコードする核酸
を含む宿主細胞を提供する。
本発明の宿主細胞は、ハイブリッドオリゴ糖及び/又は多糖を生成することができる遺伝子機構(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、フリッパーゼ、ポリメラーゼ、及び/又はオリゴサッカリルトランスフェラーゼ)をコードする核酸、並びに抗原を本発明の改変されたHlaタンパク質に連結することができる遺伝子機構を含み、及び/又は含むように改変することができる。
本発明の宿主細胞は、オリゴ糖又は多糖のリピート単位を生成するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。ある実施形態では、前記リピート単位は、還元末端にヘキソースを含まず、前記オリゴ糖又は多糖のリピート単位は、還元末端にヘキソースを含むドナーオリゴ糖又は多糖のリピート単位に由来する。
N-結合タンパク質のグリコシル化-標的タンパク質のポリペプチド鎖中のアスパラギン残基への炭水化物分子の付加-は、真核生物の小胞体で起こる翻訳後修飾の最も一般的なタイプである。このプロセスは、小胞体内の保存配列Asn-X-Ser/Thr(Xは、プロリンを除く任意のアミノ酸である)内の新生タンパク質のアスパラギン残基に、脂質担体(ドリコールリン酸)から予めアセンブルしたオリゴ糖の転移に関与する酵素オリゴサッカリルトランスフェラーゼ複合体(OST)によって達成される。
ある実施形態では、ポリメラーゼ(例えば、wzy)は、本発明の宿主細胞に導入される(すなわち、ポリメラーゼは宿主細胞に対して異種である)。ある実施形態では、ポリメラーゼは、細菌ポリメラーゼである。ある実施形態では、ポリメラーゼは、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)又はO抗原ポリメラーゼ(例えば、wzy)である。ある実施形態では、ポリメラーゼは、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)である。
ある実施形態では、フリッパーゼ(wzx又は相同体)は、本発明の宿主細胞に導入される(すなわち、フリッパーゼは宿主細胞に対して異種である)。したがって、本発明の宿主細胞は、フリッパーゼをさらに含むことができる。ある実施形態では、フリッパーゼは、細菌フリッパーゼである。フリッパーゼは、野生型リピート単位、及び/又はそれらに対応する操作された(ハイブリッド)リピート単位を細胞質から宿主細胞(例えば、大腸菌)のペリプラズムに移行させる。したがって、本発明の宿主細胞は、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含み得る。
アクセサリー酵素
ある実施形態では、1つ以上のアクセサリー酵素をコードする核酸は、本発明の宿主細胞に導入される。したがって、本発明の宿主細胞は、これらのアクセサリー酵素の1つ以上をさらに含み得る。1つ以上の補助酵素をコードするこのような核酸は、プラスミド媒介性であるか、又は本発明の宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。例示的なアクセサリー酵素には、限定されないが、エピメラーゼ、分枝、修飾(改変)(例えば、コリン、グリセリンリン酸、ピルビン酸を付加するため)、アミド化、鎖長調節、アセチル化、ホルミル化、重合化酵素が含まれる。
本発明の宿主細胞を生じさせるために用いることができる例示的な宿主細胞には、限定されないが、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、及びクロストリジウム属種が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌である。
本発明の宿主細胞は、糖抗原、例えば、本発明の改変されたHlaタンパク質に連結された黄色ブドウ球菌糖抗原を含むバイオコンジュゲートを生成するために使用することができる。宿主細胞を用いてバイオコンジュゲートを生成する方法は、例えば、国際公開第WO2003/074687号、同第WO2006/119987号及び同第WO2011/138361号に記載されている。本明細書に記載されているように、バイオコンジュゲートは、それらが製造においてより少ない化学物質を必要とし、生じる最終生成物に関してより一貫性があるという点において、抗原-担体タンパク質の化学的コンジュゲートを上回る有利な特性を有する。
種々の方法を用いて、本発明のバイオコンジュゲートの構造組成及び糖鎖長を分析することができる。
特定のタンパク質における部位の使用が、挿入された系とは対照的に、複数のプラスミド系において変化することを示すために、グリコシル化部位の使用を定量化する必要がある。そうする方法を以下に列挙する。
バイオコンジュゲートの均一性(すなわち、結合した糖残基の均一性)は、グリカン長及び流体力学的半径を測定する方法を用いて評価することができる。
収量:タンパク質収量は、制御され、最適化された条件下でバイオリアクター中で増殖させた1リットルの細菌生成培養物から得られたタンパク質量として測定される。タンパク質量は、BC、Lowry、又はBradfordアッセイによって測定され得る。バイオコンジュゲートの収量、制御され、最適化された条件下でバイオリアクター中で増殖させた1リットルの細菌生成培養物から得られた炭水化物量として測定される。バイオコンジュゲートの精製後、炭水化物収量は、アントロンアッセイ又は炭水化物特異的抗血清を用いるELISAのいずれかによって直接測定することができる。タンパク質量(BCA、Lowry、又はBradfordアッセイで測定される)及び糖鎖長と構造を用いて、タンパク質1gあたりの理論的な炭水化物量を計算することにより、間接的な測定が可能である。さらに、収量はまた、揮発性緩衝液から糖タンパク質調製物を乾燥させ、天秤を用いて重量を測定することによって測定することができる。
本発明の改変されたHlaタンパク質及びコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)は、免疫原性組成物及びワクチンに含めるのに特に適している。本発明は、本発明の改変されたHlaタンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチンを提供する。
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、アジュバントを含むか又はアジュバントと組み合わせて投与される。本発明の免疫原性組成物又はワクチンと組み合わせて投与するためのアジュバントは、前記免疫原性組成物又はワクチンの投与前、同時、又は投与後に投与することができる。一部の実施形態では、用語「アジュバント」とは、本発明のワクチンの免疫原性組成物と組み合わせて又はその一部として投与された場合、バイオコンジュゲートに対する免疫応答を増強し、増大し、及び/又は強化するが、化合物が単独で投与された場合には、改変されたHlaタンパク質/コンジュゲート/バイオコンジュゲートに対する免疫応答を生じさせない化合物を指す。一部の実施形態では、アジュバントは、改変されたHlaタンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートに対する免疫応答を生じさせ、アレルギー又は他の有害反応を生成しない。
本発明の免疫原性組成物又はワクチンを使用して、前記免疫原性組成物又はワクチンを全身又は粘膜経路を介して投与することによって、感染に感受性の哺乳動物を保護又は治療することができる。これらの投与には、筋肉内(IM)、腹腔内、皮内(ID)若しくは皮下経路による注射、又は口腔/消化管、呼吸器、泌尿生殖器への粘膜投与が含まれ得る。例えば、鼻腔内(IN)投与は、肺炎又は中耳炎の治療に使用され得る(肺炎球菌の鼻咽頭保菌がより効果的に予防され、したがって、その初期段階での感染を減弱させることができるためである)。本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、単回用量として投与することができるが、それらの成分はまた、同時に又は異なる時間に、一緒に同時投与され得る(例えば、肺炎球菌多糖は、互いに対する免疫応答の最適な調整のために、別々に、同時に、又はワクチンのいずれかの細菌タンパク質成分の投与後の1〜2週間に投与することができる)。同時投与について、任意選択のTh1アジュバントは、異なる投与のいずれか又は全てに存在し得るが、しかしながら、本発明の1つの具体的な態様では、それは、免疫原性組成物又はワクチンの改変されたHlaタンパク質成分と組み合わせて存在する。単一の投与経路に加えて、2つの異なる投与経路を使用することができる。例えば、多糖は、IM(又はID)に投与することができ、細菌タンパク質は、IN(又はID)に投与することができる。さらに、本発明のワクチンは、初回用量のためにIMで、及び追加免疫用量のためにINで投与することができる。
各免疫原性組成物又はワクチン用量中のコンジュゲート抗原の量は、典型的なワクチンにおいて有意な副作用なしに免疫防御応答を誘導する量として選択される。このような量は、どの特定の免疫原が使用され、どのようにしてそれが提示されるかに依存して変化する。改変されたHlaタンパク質の含有量は、典型的には1〜100μg、適切には5〜50μgの範囲である。糖の含有量は、典型的には0.1〜10μg、適切には1〜5μgの範囲である。
本発明はまた、本発明の改変されたHlaタンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートを対象に投与することを含む、対象の細菌感染を治療及び/又は予防する方法を提供する。改変されたHlaタンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートは、免疫原性組成物又はワクチンの形態であり得る。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、細菌による対象(例えば、ヒト対象)の感染の予防に使用される。本発明の改変されたHlaタンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートを用いて治療及び/又は予防することができる細菌感染には、スタフィロコッカス属種、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種によって引き起こされるものが含まれる。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、スタフィロコッカス属種(例えば、黄色ブドウ球菌)による感染を治療又は予防するために使用される。
1.配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する改変されたHlaタンパク質であって、該アミノ酸配列が、配列番号1のH48位及びG122位で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点で改変されており、前記置換がそれぞれHからC及びGからCである、改変されたHlaタンパク質。
2.アミノ酸配列が、配列番号1のH35位で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点でさらに改変されている、段落1に記載の改変されたHlaタンパク質。
3.H35位での前記アミノ酸置換がHからLである、段落2に記載の改変されたHlaタンパク質。
4.アミノ酸配列が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択される1つ以上のコンセンサス配列(複数可)を含むという点でさらに改変されており、X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である、段落1〜3のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
5.配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸(例えば、1〜7つのアミノ酸、例えば、1つのアミノ酸)が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)コンセンサス配列によって置換されている、段落4に記載の改変されたHlaタンパク質。
6.D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列が、配列番号1のK131、S203、S239及びK273から選択される1つ以上のアミノ酸で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置で付加され又はそれと置換されている、段落1〜5のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
7.D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列が、配列番号1のK131のアミノ酸で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置で付加され又はそれと置換されている、段落6に記載の改変されたHlaタンパク質。
8.D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列が、配列番号1のK131のアミノ酸で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置と置換されている、段落7に記載の改変されたHlaタンパク質。
9.XはQ(グルタミン)であり、ZはR(アルギニン)である(例えば、K-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))、段落4〜8のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
10.配列番号3のアミノ酸配列、又は配列番号3の配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、段落1〜9のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
11.アミノ酸配列が、Hlaタンパク質の精製に有用であるペプチドタグをさらに含み、前記ペプチドタグが、任意選択的に、6つのヒスチジン残基又はHRリピート(例えば、HRHR(配列番号25)を含み、任意選択的に前記ペプチドタグが、アミノ酸配列のC末端に位置する、段落1〜10のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
12.ペプチドタグが、N末端で1つ又は2つの追加のアミノ酸、例えば、GS(配列番号26)を含む、段落11に記載の改変されたHlaタンパク質。
13.配列番号5、6、9若しくは10のいずれか一つのアミノ酸配列、又は配列番号5、6、9若しくは10のいずれか一つと少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一である配列を有する、段落12に記載の改変されたHlaタンパク質。
14.アミノ酸配列が、Hlaタンパク質を宿主細胞(例えば、細菌)のペリプラズムに指向することができるシグナル配列をさらに含み、任意選択的に、前記シグナル配列が、配列番号13〜21から選択され、任意選択的に、前記配列が、タンパク質のN末端にある、段落1〜13のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
15.タンパク質が、シグナル配列と配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列との間に1つ又は2つの追加のアミノ酸(例えば、S)を含み、任意選択的に、前記Hlaタンパク質が、配列番号5若しくは配列番号9のアミノ酸配列、又は配列番号5若しくは配列番号9と少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、段落11に記載の改変されたHlaタンパク質。
16.タンパク質が、N末端で1つ又は2つの追加のアミノ酸(例えば、S)を含む、段落1〜13のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
17.前記Hlaタンパク質が、配列番号6若しくは配列番号10のアミノ酸配列、又は配列番号6若しくは配列番号10と少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、段落16に記載の改変されたHlaタンパク質。
18.改変されたHlaタンパク質はグリコシル化されている、段落1〜17のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
19.段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質を含むコンジュゲートであって、改変されたHlaタンパク質が、抗原、例えば、多糖又はオリゴ糖の抗原に連結されている、コンジュゲート。
20.改変されたHlaタンパク質が、任意選択的に、カルボジイミド化学、還元アミノ化(animation)、シアニル化化学(例えば、CDAP化学)、マレイミド化学、ヒドラジド化学、エステル化学、及びN-ヒドロイルスクシンイミド化学からなる群から任意選択的に選択される化学的コンジュゲーション法を用いて得られる化学的連結を介して、直接的に又はリンカーを介して、前記抗原に共有結合で連結されている、段落19に記載のコンジュゲート。
21.バイオコンジュゲートである、段落19に記載のコンジュゲート。
22.抗原が、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン又はトリプトファン(例えば、アスパラギン)から選択される、改変されたHlaタンパク質上のアミノ酸に連結されている、段落19〜21に記載の1つのコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
23.抗原が、糖、任意選択的に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)血清型5又は8の莢膜糖から任意選択的に選択される、細菌莢膜糖(例えば、黄色ブドウ球菌由来)である、段落15〜17のいずれか一つに記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
24.抗原が、黄色ブドウ球菌血清型5莢膜糖である、段落23に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
25.段落1〜17のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
26.段落25に記載のポリヌクレオチドを含むベクター
27.i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)段落1〜17のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質をコードする核酸、及び任意選択的に
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
を含む宿主細胞。
28.(a)ウンデカプレニルピロリン酸(Und-PP)上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルされたグリコシルトランスフェラーゼ、及び(b)Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1以上のグリコシルトランスフェラーゼを含む、段落27に記載の宿主細胞。
29.Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞に対して異種であり、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の遺伝子に対して異種であり、任意選択的に、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼは、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種由来であり、任意選択的にwecA(例えば、大腸菌由来のwecA)である、段落28に記載の宿主細胞。
30.前記ヘキソース単糖誘導体が、C-2位がアセトアミド基で修飾される任意の単糖、例えばN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)である、段落27〜29のいずれか一つに記載の宿主細胞。
31.Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)、若しくは大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)であり、又は大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である、段落27〜30のいずれか一つに記載の宿主細胞。
32.黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ、及び/又はcapK、並びに任意選択的に黄色ブドウ球菌CP5由来のcapD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO/又はcapPを含む黄色ブドウ球菌CP5糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、段落27〜31のいずれか一つに記載の宿主細胞。
33.黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ、及び/又はcapK、並びに任意選択的に緑膿菌O11由来のwbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz及び/又はwzx、並びに大腸菌O16由来のwecB及び/又はwecCを含む黄色ブドウ球菌CP5糖のリピート単位を合成するのに十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、段落27〜31のいずれか一つに記載の宿主細胞。
34.オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニに由来し、任意選択的に前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼはカンピロバクター・ジェジュニのpglBであり、任意選択的にカンピロバクター・ジェジュニのpglB遺伝子は宿主細胞ゲノムに組み込まれ、任意選択的に宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子は機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子は機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子はオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸によって置き換えられており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子はカンピロバクター・ジェジュニpglBによって置き換えられている、段落27〜33のいずれか一つに記載の宿主細胞。
35.前記宿主細胞が、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)又はO抗原ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸を含み、任意選択的に前記莢膜多糖ポリメラーゼは、黄色ブドウ球菌由来であり、任意選択的に黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来である、段落27〜34のいずれか一つに記載の宿主細胞。
36.前記宿主細胞が、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含み、任意選択的に、前記フリッパーゼは黄色ブドウ球菌由来であり、任意選択的に黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来である、段落27〜35のいずれか一つに記載の宿主細胞。
37.前記宿主細胞が、単糖を修飾することができる酵素、任意選択的にエピメラーゼをさらに含み、任意選択的に、前記エピメラーゼは、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種由来であり、任意選択的に前記エピメラーゼは、大腸菌由来であり、任意選択的に大腸菌O157由来のZ3206又はgalEである、段落27〜36のいずれか一つに記載の宿主細胞。
38.改変されたHlaタンパク質をコードする核酸が、宿主細胞中のプラスミドにある、段落27〜37のいずれか一つに記載の宿主細胞。
39.大腸菌である、段落27〜38のいずれか一つに記載の宿主細胞。
40.糖に連結された、改変されたHlaタンパク質を含むバイオコンジュゲートを生成する方法であって、(i)タンパク質の生成に適した条件下で、段落27〜39のいずれか一つに記載の宿主細胞を培養すること、及び(ii)バイオコンジュゲートを単離することを含む方法。
41.改変されたHlaタンパク質に連結された糖を含む、段落40に記載の方法によって生成されるバイオコンジュゲート。
42.段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質、又は段落19〜24のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落41に記載のバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物。
43.改変されたHlaタンパク質又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、段落42に記載の免疫原性組成物を作製する方法。
44.段落42に記載の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチン。
45.それを必要とする対象における黄色ブドウ球菌感染を治療又は予防する方法であって、段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質、又は段落19〜24のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落41に記載のバイオコンジュゲートの治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
46.ヒト宿主を黄色ブドウ球菌感染に対して免疫する方法であって、段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質、又は段落19〜24のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落41に記載のバイオコンジュゲートの免疫防御用量を宿主に投与することを含む方法。
47.対象において黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質、又は段落19〜24のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落41に記載のバイオコンジュゲートの治療有効量又は予防有効量を投与することを含む方法。
48.黄色ブドウ球菌感染により引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質、又は段落19〜24のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落41に記載のバイオコンジュゲート。
49.黄色ブドウ球菌感染により引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質、又は段落19〜24のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落41に記載のバイオコンジュゲートの使用。
担体タンパク質Hla(ヘモリシンA)に導入されたシステイン-システイン架橋の設計
図1は、他の2つの天然アミノ酸残基を置き換えることによってシステインアミノ酸残基対を導入するための黄色ブドウ球菌担体タンパク質ヘモリシンA(Hla)の操作の構造的根拠及び理論的解釈を示す。図は、A)毒性孔形成Hla七量体(PDB識別子7AHL、Songら、1996年)、B)無毒性Hlaモノマー(PDB識別子4IDJ、Folettiら、2013年)、及びC)A)高輝度の1つのモノマー(赤色)及びB)高輝度のモノマー(青色)の重ね合わせのモデルを示すhttp://www.rcsb.org/に公開された3D結晶構造を表す。システイン-システイン架橋部位のより広い領域は、緑色の楕円で示される。操作の目的は、凝集を防ぐためにタンパク質を安定化させ、それによって収率を高め、タンパク質をさらに解毒することであった。タンパク質内の架橋部位の遺伝子座を選択し、非毒性モノマー(青色)からの立体構造変化が、七量体の構築に必要とされるベータ鎖伸長の阻害を介して毒性モノマー(赤色)を形成するのを防止した。
架橋Hla変異体のCP5-Hlaバイオコンジュゲート生成性及び安定性の増大
CP5-Hlaバイオコンジュゲート生産のための架橋Hla変異体の安定性(凝集体形成の観点から)及び生産性を、非架橋Hlaのそれと比較した。StGVXN1717(W3110ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、rmlB-wecG::Clm)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)をコードするpGVXN393、カンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするプラスミドPglBcuoN311V-K482R-D483H-A669V pGVXN1221、及び個々に黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35LをコードするプラスミドpGVXN570、又は架橋変異体HlaH35L-Y102C-G126CをコードするプラスミドpGVXN2178、HlaH35L-H48C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2179、HlaH35L-H48C-N121CをコードするプラスミドpGVXN2180若しくはHlaH35L-L52C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2181(すべて、131位にグリコシル化部位、及びC末端ヘキサヒスチジン(His6)親和性タグを有する)を用いて同時形質転換された。PglBをコードする遺伝子を欠く対照形質転換には、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)pGVXN393、PglBの空骨格ベクターpGVXN72(pEXT21、Dykxhoornら、Gene 177巻(1996年) 133〜136頁)と組み合わせた黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L(ヘモリシンA)pGVXN570が含まれた。
大腸菌StGVXN1717(W3110ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、rmlB-wecG::Clm)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)をコードするpGVXN393、カンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするプラスミドPglBN311V-K482R-D483H-A669V pGVXN1221、及び個々に黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L(ヘモリシンA)をコードするプラスミドpGVXN570、又は架橋変異体HlaH35L-Y102C-G126CをコードするプラスミドpGVXN2178、HlaH35L-H48C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2179、HlaH35L-H48C-N121CをコードするプラスミドpGVXN2180若しくはHlaH35L-L52C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2181(すべて、131位にグリコシル化部位、及びC末端ヘキサヒスチジン(His6)親和性タグを有する)を用いて同時形質転換された。PglBをコードする遺伝子を欠く対照形質転換には、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)pGVXN393、PglBの空骨格ベクターpGVXN72と組み合わせた黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L(ヘモリシンA)pGVXN570が含まれた。
SDS-PAGE中の非煮沸試料からの非架橋の非グリコシル化Hla(u-Hla)凝集体移動挙動とサイズ排除クロマトグラフィーにより検出された凝集体種との相関
この実施例は、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより大きな種として、及びそれに対応して、試料が沸騰されてない場合に、SDS-PAGEにおいてより高い見かけの分子量として泳動する凝集された非グリコシル化の非架橋Hlaの相関を示す。結果を図5に示す。
大腸菌StGVXN2457(W3110 ΔwaaL、ΔrlmB-wecG、ΔaraBAD)は、エレクトロポレーションにより、131位にグリコシル化部位及びC末端ヘキサヒスチジン親和性タグを有する黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L(ヘモリシンA)をコードするプラスミドpGVXN570を用いて形質転換された。
動的光散乱(DLS)による凝集u-Hla種の分析
凝集した非架橋u-Hla種を動的光散乱(DLS)により分析した。結果を図4に示す。4A)は、凝集Hlaの平均サイズ分布プロファイルを示す。4B)は、分析に使用した凝集u-Hla種を示し、ピーク1は、約90mMのイミダゾールで溶出するIMAC由来である。122.4nmの平均粒径を生じる3重測定の生データを表1に示す。
大腸菌StGVXN2457(W3110 ΔwaaL、ΔrlmB-wecG、ΔaraBAD)は、エレクトロポレーションにより、131位にグリコシル化部位及びC末端ヘキサヒスチジン親和性タグを有する黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L(ヘモリシンA)をコードするプラスミドpGVXN570を用いて形質転換された。
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)及びサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)からの非架橋対架橋の非グリコシル化ヘモリシンA変異体の溶出プロファイルの分析
非グリコシル化の非架橋Hlaの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)溶出プロファイルを、抗His抗体による各溶出画分のイムノブロット分析と比較し、標的タンパク質の不均一な溶出挙動を明らかにした。結果を図6に示す。
大腸菌StGVXN1717(W3110 ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、rmlB-wecG::Clm)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球莢膜多糖CP5(CPS5)をコードするプラスミドpGVXN393、カンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBcuo N311V-K482R-D483H-A669Vをコードする遺伝子を欠いた空のプラスミドベクターpGVXN72、及び黄色ブドウ球担体タンパク質HlaH35L(ヘモリシンA)をコードするプラスミドpGVXN570、架橋変異体HlaH35L-Y102C-G126CをコードするプラスミドpGVXN2178、HlaH35L-H48C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2179、HlaH35L-H48C-N121CをコードするプラスミドpGVXN2180又はHlaH35L-L52C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2181(すべて、131位にグリコシル化部位、及びC末端ヘキサヒスチジン(His6)親和性タグを有する)のうちの1つを用いて同時形質転換された。
陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたC末端HRHRタグを有するCP5-Hlaの高度に選択的な精製
図9に示すように、陽イオン交換レジンを用いてHRHR精製タグを有するCP5-Hlaバイオコンジュゲートの高度に選択的な精製工程を行った。精製タグを欠くCP5-Hlaを用いて得られた結果を図10に示す。StGVXN1717(W3110 ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、rmlB-wecG::Clm)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)をコードするプラスミドpGVXN393、C末端ヒスチジン-アルギニン-ヒスチジン-アルギニンタグの有無にかかわらず、131位にグリコシル化部位を有する黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L-H48C-G122C pGVXN2533をコードするプラスミド、及びカンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBcuo N311V-K482R-D483H-A669VをコードするプラスミドpGVXN1221を用いて同時形質転換された。
標識タンパク質について、大腸菌StGVXN1717(W3110 ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、rmlB-wecG::Clm)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)をコードするプラスミドpGVXN393、131位にグリコシル化部位、及びC末端ヒスチジン-アルギニン-ヒスチジン-アルギニンタグを有する黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L-H48C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2533(ヘモリシンA)、並びにカンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBcuo N311V-K482R-D483H-A669VをコードするプラスミドpGVXN1221を用いて同時形質転換された。
Claims (49)
- 配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する改変されたHlaタンパク質であって、該アミノ酸配列が、配列番号1のH48位及びG122位で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点で改変されており、前記置換がHからC及びGからCである、改変されたHlaタンパク質。
- アミノ酸配列が、配列番号1のH35位で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点でさらに改変されている、請求項1に記載の改変されたHlaタンパク質。
- H35位での前記アミノ酸置換がHからLである、請求項2に記載の改変されたHlaタンパク質。
- アミノ酸配列が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択される1つ以上のコンセンサス配列を含むという点でさらに改変されており、X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
- 配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸(例えば、1〜7つのアミノ酸、例えば、1つのアミノ酸)が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)コンセンサス配列によって置換されている、請求項4に記載の改変されたHlaタンパク質。
- D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列が、配列番号1のK131、S203、S239及びK273から選択される1つ以上のアミノ酸で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置で付加され又はそれと置換されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
- D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列が、配列番号1のK131のアミノ酸で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置で付加され又はそれと置換されている、請求項6に記載の改変されたHlaタンパク質。
- D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列が、配列番号1のK131のアミノ酸で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置と置換されている、請求項7に記載の改変されたHlaタンパク質。
- XがQ(グルタミン)であり、ZがR(アルギニン)である(例えば、K-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))、請求項4〜8のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
- 配列番号3のアミノ酸配列、又は配列番号3の配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
- アミノ酸配列が、Hlaタンパク質の精製に有用であるペプチドタグをさらに含み、前記ペプチドタグが、任意選択的に、6つのヒスチジン残基又はHRリピート(例えば、HRHR(配列番号25)を含み、任意選択的に前記ペプチドタグが、アミノ酸配列のC末端に位置する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
- ペプチドタグが、N末端で1つ又は2つの追加のアミノ酸、例えば、GS(配列番号26)を含む、請求項11に記載の改変されたHlaタンパク質。
- 配列番号5、6、9若しくは10のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号5、6、9若しくは10のいずれか1つと少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一である配列を有する、請求項12に記載の改変されたHlaタンパク質。
- アミノ酸配列が、Hlaタンパク質を宿主細胞(例えば、細菌)のペリプラズムに指向することができるシグナル配列をさらに含み、任意選択的に、前記シグナル配列が、配列番号13〜21から選択され、任意選択的に、前記配列が、タンパク質のN末端にある、請求項1〜13のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
- タンパク質が、シグナル配列と配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列との間に1つ又は2つの追加のアミノ酸(例えば、S)を含み、任意選択的に、前記Hlaタンパク質が、配列番号5若しくは配列番号9のアミノ酸配列、又は配列番号5若しくは配列番号9と少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項11に記載の改変されたHlaタンパク質。
- タンパク質が、N末端で1つ又は2つの追加のアミノ酸(例えば、S)を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
- 前記Hlaタンパク質が、配列番号6若しくは配列番号10のアミノ酸配列、又は配列番号6若しくは配列番号10と少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項16に記載の改変されたHlaタンパク質。
- 改変されたHlaタンパク質がグリコシル化されている、請求項1〜17のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質を含むコンジュゲートであって、改変されたHlaタンパク質が、抗原、例えば、多糖又はオリゴ糖の抗原に連結されている、コンジュゲート。
- 改変されたHlaタンパク質が、任意選択的に、カルボジイミド化学、還元アミノ化(animation)、シアニル化化学(例えば、CDAP化学)、マレイミド化学、ヒドラジド化学、エステル化学、及びN-ヒドロイルスクシンイミド化学からなる群から選択される化学コンジュゲーション法を用いて得られる化学的連結を介して、直接的に又はリンカーを介して、前記抗原に共有結合で連結されている、請求項19に記載のコンジュゲート。
- バイオコンジュゲートである、請求項19に記載のコンジュゲート。
- 抗原が、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン又はトリプトファン(例えば、アスパラギン)から選択される、改変されたHlaタンパク質上のアミノ酸に連結されている、請求項19〜21のいずれか一項に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
- 抗原が、糖、任意選択的に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)血清型5又は8の莢膜糖から任意選択的に選択される、細菌莢膜糖(例えば、黄色ブドウ球菌由来)である、請求項15〜17のいずれか一項に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
- 抗原が、黄色ブドウ球菌血清型5莢膜糖である、請求項23に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
- 請求項1〜17のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項25に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- v)グリコシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の核酸、
vi)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
vii)請求項1〜17のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質をコードする核酸、及び任意選択的に
viii)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
を含む宿主細胞。 - (a)ウンデカプレニルピロリン酸(Und-PP)上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼ、及び(b)Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1以上のグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項27に記載の宿主細胞。
- Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼが、宿主細胞に対して異種であり、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の遺伝子に対して異種であり、任意選択的に、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼが、エシェリキア属(Escherichia)種、シゲラ属(Shigella)種、クレブシエラ属(Klebsiella)種、キサントモナス属(Xhantomonas)種、サルモネラ属(Salmonella)種、エルシニア属(Yersinia)種、アエロモナス属(Aeromonas)種、フランシセラ属(Francisella)種、ヘリコバクター属(Helicobacter)種、プロテウス属(Proteus)種、ラクトコッカス属(Lactococcus)種、ラクトバチルス属(Lactobacillus)種、シュードモナス属(Pseudomonas)種、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)種、ストレプトマイセス属(Streptomyces)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エンテロコッカス属(Enterococcus)種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)種、バチルス属(Bacillus)種、クロストリジウム属(Clostridium)種、リステリア属(Listeria)種、又はカンピロバクター属(Campylobacter)種由来であり、任意選択的にwecA(例えば、大腸菌由来のwecA)である、請求項28に記載の宿主細胞。
- 前記ヘキソース単糖誘導体が、C-2位がアセトアミド基で修飾される任意の単糖、例えばN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)である、請求項27〜29のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、大腸菌(E. coli)O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)若しくは大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)であるか、又は大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である、請求項27〜30のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ及び/又はcapK、並びに任意選択的に、黄色ブドウ球菌CP5由来のcapD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO及び/又はcapPを含む黄色ブドウ球菌CP5糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項27〜31のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ及び/又はcapK、並びに任意選択的に、緑膿菌(P. aeruginosa)O11由来のwbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz及び/又はwzx、並びに大腸菌O16由来のwecB及び/又はwecCを含む、黄色ブドウ球菌CP5糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項27〜31のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- オリゴサッカリルトランスフェラーゼがカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)に由来し、任意選択的に前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼがカンピロバクター・ジェジュニのpglBであり、任意選択的にカンピロバクター・ジェジュニのpglB遺伝子が宿主細胞ゲノムに組み込まれ、任意選択的に宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子がオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸によって置き換えられており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子がカンピロバクター・ジェジュニpglBによって置き換えられている、請求項27〜33のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)又はO抗原ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸を含み、任意選択的に、前記莢膜多糖ポリメラーゼが、黄色ブドウ球菌由来であり、任意選択的に、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来である、請求項27〜34のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含み、任意選択的に、前記フリッパーゼが、黄色ブドウ球菌由来であり、任意選択的に、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来である、請求項27〜35のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、単糖を修飾することができる酵素、任意選択的にエピメラーゼをさらに含み、任意選択的に、前記エピメラーゼが、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種由来であり、任意選択的に前記エピメラーゼが、大腸菌由来であり、任意選択的に大腸菌O157由来のZ3206又はgalEである、請求項27〜36のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 改変されたHlaタンパク質をコードする核酸が、宿主細胞中のプラスミドにある、請求項27〜37のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 大腸菌である、請求項27〜38のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 糖に連結された、改変されたHlaタンパク質を含むバイオコンジュゲートを生産する方法であって、(i)タンパク質の生産に適した条件下で、請求項27〜39のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養すること、及び(ii)バイオコンジュゲートを単離することを含む方法。
- 改変されたHlaタンパク質に連結された糖を含む、請求項40に記載の方法によって生産されるバイオコンジュゲート。
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質、又は請求項19〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項41に記載のバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物。
- 改変されたHlaタンパク質又はコンジュゲート又はバイオコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、請求項42に記載の免疫原性組成物を作製する方法。
- 請求項42に記載の免疫原性組成物、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチン。
- それを必要とする対象における黄色ブドウ球菌感染を治療又は予防するための方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質、又は請求項19〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項41に記載のバイオコンジュゲートの治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
- 黄色ブドウ球菌感染に対してヒト宿主を免疫化する方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質、又は請求項19〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項41に記載のバイオコンジュゲートの免疫防御用量を宿主に投与することを含む方法。
- 対象における黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質、又は請求項19〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項41に記載のバイオコンジュゲートの治療有効量又は予防有効量を投与することを含む方法。
- 黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質、又は請求項19〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項41に記載のバイオコンジュゲート。
- 黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変Hlaタンパク質、又は請求項19〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項41に記載のバイオコンジュゲートの使用。
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