BR112020012375A2 - composição imunogênica - Google Patents

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BR112020012375A2
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Amirreza Faridmoayer
Sabina Marietta GERBER
Markus Müller
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Abstract

A presente invenção descreve proteínas Hla de Staphylococcus aureus modificadas que mostram tendência reduzida à agregação, melhorando a estabilidade e o rendimento da proteína. As referidas proteínas Hla modificadas opcionalmente também contêm sequências de consenso no sítio de glicosilação. A invenção também descreve um conjugado compreendendo uma proteína Hla modificada e um antígeno (por exemplo, um antígeno de sacarídeo de Staphylococcus aureus), em que o antígeno está ligado a um resíduo de aminoácido da proteína Hla modificada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COM- POSIÇÃO IMUNOGÊNICA”. Campo Técnico
[001] A presente invenção refere-se ao campo de composições imunogênicas e vacinas, sua fabricação e o uso de tais composições na medicina. Mais particularmente, refere-se a uma proteína Hla modi- ficada de Staphylococcus aureus e seu uso como antígeno de vacina. A Hla modificada pode ser usado como um antígeno por si só e tam- bém como uma proteína transportadora para outros antígenos, particu- larmente antígenos sacarídeos. Antecedente
[002] Staphylococcus aureus é uma das principais causas de in- fecções humanas invasivas, incluindo bacteremia, endocardite, pneu- monia e infecções de feridas. S. aureus desenvolve resistência a anti- bióticos muito rapidamente, e surgiram cepas resistentes a antibióticos comumente usadas, como a meticilina e até ao antibiótico de último recurso, a vancomicina. A S. aureus resistente à meticilina (MRSA) é endêmica em hospitais, e as cepas MRSA associadas à comunidade estão se espalhando por todo o mundo, representando um grande de- safio global.
[003] Existe, portanto, uma necessidade urgente de uma vacina para prevenir a doença estafilocócica. Várias vacinas foram testadas em ensaios clínicos, incluindo conjugados de polissacarídeo capsular (CPS), antígenos proteicos individuais e anticorpos monoclonais (mAbs) ao ácido lipoteicoico. No entanto, todos falharam em vários estágios de desenvolvimento e, até o momento, não existe vacina con- tra S. aureus no mercado.
[004] Atualmente, as vacinas contra S. aureus que provocam respostas imunes humorais e mediadas por células estão em avalia- ção, e antígenos proteicos, como a toxina alfa (Hla) e o CPS, são antí-
genos-chave a serem considerados na inclusão em uma vacina de múltiplos componentes.
[005] 90% das cepas de S. aureus expressam polissacarídeo capsular Tipo 5 ou Tipo 8; portanto, uma vacina compreendendo CP5 e CP8 poderia potencialmente proteger contra a maioria das cepas circulantes de S. aureus. Vacinas compreendendo polissacarídeos capsulares de S. aureus foram usadas para gerar uma resposta imune protetora contra estafilococos, mas vacinas compreendendo CPS iso- ladamente não se mostraram totalmente eficazes. Uma vacina conten- do conjugados de polissacarídeos capsulares de S. aureus Tipo 5 e Tipo 8 conjugados à exoproteína A de Pseudomonas (StaphVAX - Na- bi Biopharmaceuticals) foi testada em ensaios clínicos, onde demons- trou segurança e eficácia em Ph I e II, mas não conseguiu atingir o ob- jetivo final em Ph III, como descrito em WO 03/61558.
[006] Vacinas compreendendo CPS de S. aureus conjugado com exoproteína A (EPA) de Pseudomonas aeruginosa ou Hla de S. aureus usando uma nova tecnologia de glicoengenharia foram testadas em coelhos e camundongos (Wacker et al, 2014, Journal of Infectious Di- seases 209: 1551-61). A vacina de bioconjugados de CP-Hla protegeu camundongos contra bacteremia e pneumonia letal, demonstrando que os bioconjugados de proteínas de S. aureus e polissacarídeos capsulares podem ser um candidato promissor para uma vacina eficaz contra S. aureus.
[007] A Hla é uma toxina e, portanto, precisa ser desintoxicada para ser usada como antígeno da vacina. Monômeros de Hla do tipo selvagem se reúnem para formar um hexâmero que cria um poro pe- netrante de bicamada lipídica na membrana dos eritrócitos humanos e outras células, resultando em lise celular. A atividade lítica celular de Hla pode ser reduzida por mutação de resíduos de aminoácidos envol- vidos na formação de poros, como descrito em Menzies e Kernodle
(Menzies e Kernodle, 1994, Infect Immun 62, 1843-1847). Um desses mutantes (HlaH35L) mostrou formação de hexâmero muito reduzida, não teve atividade hemolítica e não foi tóxico para os camundongos. Desde então, o HlaH35L tem sido utilizado em vacinas experimentais contra a infecção por S. aureus, incluindo a vacina de bioconjugados descrita acima.
[008] No entanto, os inventores descobriram que, além dos he- xâmeros, a Hla também forma agregados de nível superior que afetam a estabilidade e o rendimento da proteína. Os mutantes que exibem formação reduzida de hexâmero, como HlaH35L, ainda são afetados pelo problema da formação de agregados. Existe, portanto, uma ne- cessidade de proteínas Hla estáveis que apresentem agregação redu- zida e possam ser produzidas com maior rendimento do que os mutan- tes desintoxicados atualmente conhecidos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] A presente invenção fornece uma proteína Hla modificada (hemolisina A estafilocócica, também conhecida como toxina alfa) e conjugados da referida Hla modificada (incluindo bioconjugados).
[0010] Por conseguinte, é fornecido em um aspecto da presente invenção, uma proteína Hla modificada compreendendo uma sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 ou uma sequência de aminoáci- dos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1, modificada, em que a sequência de aminoácidos compreende substituições de aminoácidos nas posições H48 e G122 da SEQ ID NO. 1 ou em posições equivalentes dentro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO. 1, em que as re- feridas substituições são respectivamente H a C e G a C (por exemplo, SEQ ID NO: 2).
[0011] A referida proteína Hla modificada pode ser adicionalmente modificada na medida em que a sequência de aminoácidos compre- ende uma substituição de aminoácidos na posição H35 (por exemplo, H35L) da SEQ ID NO. 1 ou em uma posição equivalente dentro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO. 1 (por exemplo, SEQ ID NO: 3).
[0012] A referida proteína Hla modificada pode ainda ser modifica- da para compreender uma ou mais sequências de consenso selecio- nadas entre: D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12), em que X e Z são independentemente qualquer aminoácido além da prolina (por exemplo, SEQ ID NO: 7). Em uma concretização, a referida proteína Hla modificada contém as seguintes mutações: H35L, H48C e G122C. Por conseguinte, é fornecida uma proteína Hla modificada compreendendo uma sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO. 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 3, modificada, em que a sequência de aminoácidos com- preende uma ou mais sequências de consenso selecionadas entre: D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12), em que X e Z são independentemente qualquer aminoácido além da prolina. Uma sequência exemplar é a da SEQ ID NO: 7.
[0013] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um conjugado (por exemplo, bioconjugado) compreendendo um oligossacarídeo ou antígeno de polissacarídeo ligado, por exemplo co- valentemente ligado, a uma proteína Hla modificada da invenção.
[0014] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um polinucleotídeo que codifica uma proteína Hla modificada ou bioconjugado da invenção.
[0015] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína Hla modificada ou bioconjugado da invenção.
[0016] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cida uma célula hospedeira compreendendo: i) um ou mais ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferase (s); ii) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase; iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína Hla modificada da in- venção; e opcionalmente iv) um ácido nucleico que codifica uma polimerase (por exemplo, wzy).
[0017] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um processo para a produção de um bioconjugado que compre- ende (ou consiste em) uma proteína Hla modificada ligada a um saca- rídeo, o referido método compreendendo: (i) cultivar uma célula hos- pedeira da invenção sob condições adequadas para a produção de proteínas e (ii) isolar o bioconjugado produzido pela referida célula hospedeira.
[0018] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um bioconjugado produzido por um processo da invenção, em que o referido bioconjugado compreende um sacarídeo ligado a uma proteína Hla modificada.
[0019] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cida uma composição imunogênica compreendendo a proteína Hla modificada da invenção, ou um conjugado da invenção, ou um biocon- jugado da invenção e um excipiente ou transportador farmaceutica- mente aceitável.
[0020] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um método para preparar uma composição imunogênica da in- venção compreendendo a etapa de misturar a proteína Hla modificada ou o conjugado ou o bioconjugado com um excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
[0021] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne-
cido um método para o tratamento ou prevenção de infecção estafilo- cócica, em particular infecção por Staphylococcus aureus, em um indi- víduo em necessidade do mesmo compreendendo administrar ao refe- rido indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteí- na Hla modificada da invenção, ou um conjugado da invenção, ou um bioconjugado da invenção.
[0022] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um método para imunizar um hospedeiro humano contra a infec- ção estafilocócica, em particular a infecção por Staphylococcus au- reus, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma dose imunoprotetora de uma proteína Hla modificada da invenção ou um conjugado da invenção, ou um bioconjugado da invenção.
[0023] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cido um método para induzir uma resposta imune ao estafilococo, em particular Staphylococcus aureus, em um indivíduo, o método compre- endendo a administração de uma quantidade terapeuticamente ou pro- filaticamente eficaz de uma proteína Hla modificada da invenção, ou um conjugado da invenção, ou um bioconjugado da invenção.
[0024] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cida uma proteína Hla modificada da invenção, ou um conjugado da invenção, ou um bioconjugado da invenção para uso no tratamento ou prevenção de uma doença causada por infecção estafilocócica, em particular Infecção por Staphylococcus aureus.
[0025] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é forne- cida uma proteína Hla modificada da invenção, ou um conjugado da invenção, ou um bioconjugado da invenção na fabricação de um medi- camento para o tratamento ou prevenção de uma doença causada por infecção estafilocócica, em particular infecção por Staphylococcus au- reus.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1: Base estrutural e justificativa para o projeto da reticula- ção de cisteína-cisteína introduzida na proteína transportadora Hla (hemolisina A)
[0026] A Figura 1 representa as estruturas cristalinas 3D de A) o heptâmero Hla formador de poros tóxico (identificador de PDB 7AHL, Song et al., 1996), B) o monômero de Hla não tóxico (identificador de PDB 4IDJ, Foletti et al., 2013) e C) a superposição de um monômero em A) iluminado em vermelho/cinza pálido e o monômero em B) ilumi- nado em azul/cinza escuro. A região mais ampla das posições de reti- culação de cisteína-cisteína é indicada por um oval. Figura 2: Região modificada de modelos Hla sobrepostos das es- truturas de cristal 7AHL e 4IDJ
[0027] Representação fechada dos quatro pares de aminoácidos que foram mutados individualmente para resíduos de cisteína, criando quatro variantes de Hla reticuladas de maneira diferente. Os pares de resíduos de aminoácidos reticulados são: 1) Y102-G126; 2) G122-H48; 3) N121-H48; 4) G122-L52. O modelo da forma tóxica é indicado como T, a forma não tóxica é sobreposta e indicada como ‘NT’. Os resíduos do tipo selvagem são destacados nas representações de bastões e as posições dos átomos de carbono alfa correspondentes (Cα) são liga- das por uma linha tracejada para cada par de resíduos. As distâncias das posições Cα-Cα de cada par de aminoácidos estão indicadas em Ångstroms (Å): Y102C/G126C: 7,52 Å; G122C/H48C: 6,23 Å; N121C/H48C: 6,60 Å; G122C/L52C: 7,04 Å. Figura 3: Produtividade e estabilidade realçadas do bioconjugado CP5-Hla de variantes de Hla reticuladas
[0028] A Figura 3 mostra a estabilidade realçada (formação redu- zida de agregados) e a produtividade das variantes de Hla reticuladas para a produção de bioconjugados de CP5-Hla. Todas as variantes de Hla incluíram o glycosite na posição 131 (substituído por K131). Cha-
ve: M = marcador de proteína; C = variante não reticulada; SS1 = Y102C-G126C; SS2 = G122C-H48C; SS3 = N121C-H48C SS4 = G122C-L52C; B = as amostras foram fervidas antes do carregamento; NB = as amostras não foram fervidas antes do carregamento.
Faixa 1: Marcador de proteínas pré-coradas PageRuler Faixa 2: Amostras de proteína de StGVXN1717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN570 (HlaH35L), pGVXN1221 (pglBcuo N311V-K482R-D483H-
A669V)], a amostra foi produzida na presença de PgIB e fervida.
Faixa 3: Amostras de proteína de StGVXN1717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN570 (HlaH35L), pGVXN1221 (pglBcuo N311V-K482R-D483H-
A669V)], a amostra foi produzida na presença de PgIB e não fervida Faixa 4: Amostras de proteína de StGVXN1717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN570 (HlaH35L), pGVXN72 (vetor de plasmídeo PgIB vazio)], a amostra foi produzida na ausência de PgIB e fervida Faixa 5: Amostras de proteína de StGVXN1717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN570 (HlaH35L), pGVXN72 (vetor de plasmídeo PgIB vazio)], a amostra foi produzida na ausência de PgIB e não fervida Faixa 6: vazio Faixa 7: Amostras de proteína de StGVXN1717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN2178 (HlaH35L-Y102C-G126C), pGVXN1221 (pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)], a amostra foi produzida na presença de PgIB e fervida Faixa 8: Amostras de proteína de StGVXN1717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN2178 (HlaH35L-Y102C-G126C), pGVXN1221 (pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)], a amostra foi produzida na presença de PgIB e não fervida Faixa 9: Amostras de proteínas de StGVXN1717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN2179 (HlaH35L-H48C-G122C), pGVXN1221 (pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)], a amostra foi produzida na presença de PgIB e não fervida
Faixa 10: Amostras de proteína de StGVXN1717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN2179 (HlaH35L-G122C-H48C), pGVXN1221 (pglB cuo N311V-K482R-D483H-A669V)], a amostra foi produzida na presença de PgIB e não fervida Faixa 11: Amostras de proteínas de StGVXN1717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN2180 (HlaH35L--H48C-N121C), pGVXN1221 (pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)], a amostra foi produzida na presença de PgIB e não fervida Faixa 12: Amostras de proteína de StGVXN1717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN2180 (HlaH35L--H48C-N121C), pGVXN1221 (pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)], a amostra não foi produzida na presença de PgIB e não foi fervida Faixa 13: Amostras de proteínas de StGVXN1717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN2181 (HlaH35L-L52C-G122C), pGVXN1221 (pglBcuo N311V- K482R-D483H-A669V)], a amostra foi produzida na presença de PgIB e fervi- da Faixa 14: Amostras de proteína de StGVXN1717 [pGVXN393 (cap5HIJK), pGVXN2181 (HlaH35L-L52C-G122C), pGVXN1221 (pglBcuo N311V- K482R-D483H-A669V)], a amostra foi produzida na presença de PgIB e não foi fervida. Figura 4: Análise de espécies de agregados de u-Hla por disper- são dinâmica da luz (DLS)
[0029] A Figura 4 mostra a análise de espécies de agregados de u-Hla (Hla não conjugada) por dispersão dinâmica da luz (DLS). A) mostra o perfil de distribuição de tamanho médio de uma Hla agregada (3 amostras). B) mostra as espécies de agregados de u-Hla usadas para a análise, o pico de uma IMAC eluindo a aproximadamente 90 mM de imidazol (indicado por oval). C) mostra medições feitas no pro- grama Pymol para estimar as dimensões máximas aproximadas da molécula monomérica ou heptamérica em nanômetros. A dimensão mais longa no monômero é de no máximo 8 nanômetros. A forma hep- tamérica tem uma dimensão máxima de aproximadamente 10 nanô- metros em todas as direções. Figura 5: Correlação do comportamento da migração de agrega- dos não reticulados e não glicosilados (u-Hla) de amostras não fervidas em SDS-PAGE com espécies de agregados detectadas por cromatografia de exclusão por tamanho
[0030] A Figura 5 mostra a correlação de Hla agregada, não glico- silada e não reticulada, executando como espécies grandes (A) em cromatografia de exclusão por tamanho (leitura de absorvência da co- luna de cromatografia e SDS-PAGE de frações de eluição) e (B) cor- respondentemente como maior peso molecular aparente em SDS- PAGE quando a amostra não é fervida (faixa 4). Figura 6: Perfis de eluição de variantes de Hla não glicosiladas não reticuladas da cromatografia de afinidade por metal imobili- zado (IMAC)
[0031] A Figura 6 mostra um perfil de eluição de uma cromatogra- fia de afinidade por metal imobilizado (IMAC) de Hla não reticulado, não glicosilado, com a análise por imunotransferência das respectivas frações de eluição com um anticorpo anti-His. Figura 7: Perfis de eluição de variantes de Hemolisina A não gli- cosilada não reticulada versus reticulada da cromatografia de afi- nidade por metal imobilizado (IMAC)
[0032] A Figura 7 mostra a sobreposição de um perfil de eluição de cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC) a partir de Hla não glicosilado, não reticulado da Figura 6 e das quatro variantes de Hla reticuladas não glicosiladas, mostrando prevenção (Y102C/G126C) ou formação fortemente reduzida de agregado em relação ao monômero, associado ao aumento do rendimento de prote- ínas (G122C/H48C). Y102-G126 = Reticulação 1, G122-H48 = Reticu-
lação 2, N121-H48 = Reticulação 3, G122-L52 = Reticulação 4. Figura 8: Perfis de eluição de variantes de Hemolisina A não gli- cosilada, não reticulada versus reticulada da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC)
[0033] A Figura 8 mostra uma análise por cromatografia de exclu- são por tamanho da variante de Hla não glicosilada, não reticulada elu- ída como agregados ou monômeros obtidos a partir da eluição do gra- diente IMAC mostrada na Figura 6 e os eluatos de IMAC das espécies monoméricas das quatro variantes de Hla reticuladas mostrados na Figura 7. Figura 9: Purificação altamente seletiva de CP5-Hla transportando um marcador C-terminal usando cromatografia de permuta de cá- tions
[0034] As proteínas das frações de eluição descritas no Exemplo 6 foram separadas por uma SDS-PAGE 4-12 % e transferidas para uma membrana de nitrocelulose e detectadas por um anticorpo anti-Hla ou o gel foi diretamente corado com SimplyBlue Safe Stain. A: 40 microlitros carregados Faixa 1: Amostra de proteína da amostra antes do carregamento na coluna Faixa 2: Amostras de proteínas de frações de fluxo total agrupadas Faixa 3: Amostras de proteínas de frações de lavagem agrupadas Faixa 4-9: Amostras de proteínas das frações de eluição Faixa 10: Marcador de Proteína Pré-corado PageRuler B: 20 microlitros carregados Faixa 1: Marcador de Proteína Pré-corado PageRuler Faixa 2: Amostra de proteína da amostra antes do carregamento na coluna Faixa 3: Amostras de proteínas de frações de fluxo total agrupadas Faixa 4: Amostras de proteínas de frações de lavagem agrupadas
Faixa 5-10: Amostras de proteínas das frações de eluição Figura 10: Frações de purificação da cromatografia de permuta de cátions de bioconjugado de CP5-Hla não marcado.
[0035] O mesmo procedimento que na Fig 9 foi realizado usando CP5-Hla não marcado. Gel A: 20 microlitros carregados Faixa 1: Marcador de Proteína Pré-corado PageRuler Faixa 2: Amostra de proteína da amostra antes do carregamento na coluna Faixa 3: Amostras de proteínas de frações de fluxo total agrupadas Faixa 4: Amostras de proteínas de frações de lavagem agrupadas Faixa 5-10: Amostras de proteínas das frações de eluição Gel B: 40 microlitros carregados Faixa 1: Marcador de Proteína Pré-corado PageRuler Faixa 2: Amostra de Proteína da amostra antes do carregamento na coluna Faixa 3: Amostras de proteínas de frações de fluxo total agrupadas Faixa 4: Amostras de proteínas de frações de lavagem agrupadas Faixa 5-10: Amostras de proteínas das frações de eluição
DESCRIÇÃO DETALHADA Terminologia
[0036] Proteína transportadora: uma proteína covalentemente li- gada a um antígeno (por exemplo, antígeno de sacarídeo) para criar um conjugado (por exemplo, bioconjugado). Uma proteína transporta- dora ativa a imunidade mediada por células T em relação ao antígeno ao qual está conjugada.
[0037] Qualquer aminoácido além da prolina (pro, P): refere-se a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em alanina (ala, A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D ), cisteí- na (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutâmico (glu, E), glicina (gly, G),
histidina (his, H), isoleucina (ile, l), leucina (leu, L ), lisina (lis, K), meti- onina (met, M), fenilalanina (phe, F), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptofano (trp, W), tirosina (tir, Y), valina (val, V). Hla: Hemolisina A, também conhecida como toxina alfa, de uma bacté- ria estafilocócica, em particular S. aureus. CP: Polissacarídeo capsular LPS: lipopolissacarídeo. wzy: o gene da polimerase de polissacarídeo que codifica uma enzima que catalisa a polimerização polissacarídica. A enzima codificada transfere as unidades de oligossacarídeos para a extremidade não re- dutora, formando uma ligação glicosídica. waaL: o gene da antígeno O ligase que codifica uma enzima ligada à membrana. A enzima codificada transfere o antígeno O ligado ao di- fosfato de undecaprenila (UPP) para o oligossacarídeo do núcleo lipí- dico A, formando lipopolissacarídeo. Und-PP: undecaprenil pirofosfato. Und-P: undecaprenil fosfato Extremidade redutora: a extremidade redutora de um oligossacarídeo ou polissacarídeo é o monossacarídeo com um carbono anomérico livre que não está envolvido em uma ligação glicosídica e é, portanto, capaz de converter para a forma de cadeia aberta.
[0038] Quando aqui usado, o termo “bioconjugado” refere-se ao conjugado entre uma proteína (por exemplo, uma proteína transporta- dora) e um antígeno (por exemplo, um sacarídeo) preparado em um fundo de célula hospedeira, em que a maquinaria da célula hospedeira liga o antígeno à proteína (por exemplo, ligações ao N).
[0039] Quando aqui usado, o termo “quantidade eficaz”, no contex- to da administração de uma terapia (por exemplo, uma composição imunogênica ou vacina da invenção) a um indivíduo, refere-se à quan- tidade de uma terapia que tem um efeito (s) profilático (s) e/ou tera-
pêutico (s). Em certas concretizações, uma “quantidade eficaz” refere- se à quantidade de uma terapia que é suficiente para atingir um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade de uma infecção ou sintoma bacteriano associado a ele; (ii) reduzir a duração de uma infecção bacteriana ou sintoma associado a ela; (iii) impedir a progressão de uma infecção bacteriana ou sintoma associado a ela; (iv) causar regressão de uma infecção bacteriana ou sintoma associado a ela; (v) impedir o desenvolvimento ou início de uma infecção bacteriana ou sintoma associado a ela; (vi) impedir a re- corrência de uma infecção bacteriana ou sintoma associado a ela; (vii) reduzir a falência de órgãos associada a uma infecção bacteriana; (viii) reduzir a hospitalização de um indivíduo com uma infecção bacteriana; (ix) reduzir o tempo de hospitalização de um indivíduo com uma infec- ção bacteriana; (x) aumentar a sobrevivência de um indivíduo com uma infecção bacteriana; (xi) eliminar uma infecção bacteriana em um indivíduo; (xii) inibir ou reduzir uma replicação bacteriana em um indi- víduo; e/ou (xiii) realçar ou melhorar o efeito profilático ou terapêutico de outra terapia.
[0040] Quando aqui usado, o termo “indivíduo” refere-se a um animal, em particular um mamífero como um primata (por exemplo, humano).
[0041] Quando aqui usado, o termo “oligossacarídeo ou polissaca- rídeo doador” refere-se a um oligossacarídeo ou polissacarídeo do qual um oligossacarídeo ou polissacarídeo é derivado. Os oligossaca- rídeos e polissacarídeos doadores, quando aqui usados, compreen- dem um monossacarídeo hexose (por exemplo, glicose) na extremida- de redutora da primeira unidade de repetição. A utilização do termo oligossacarídeo ou polissacarídeo doador não pretende sugerir que um oligossacarídeo ou polissacarídeo seja modificado in situ. Em vez disso, o uso do termo oligossacarídeo ou polissacarídeo doador se re-
fere a um oligossacarídeo ou polissacarídeo que, em seu estado sel- vagem, é um substrato fraco para a atividade da oligossacaril transfe- rase (por exemplo, PgIB) ou não é um substrato para a atividade de oligossacaril transferase (por exemplo, PgIB). Exemplos de oligossa- carídeos ou polissacarídeos doadores incluem aqueles de bactérias, incluindo CP5 e CP8 de S. aureus. Aqueles versados na técnica serão capazes de determinar rapidamente se um oligossacarídeo ou polissa- carídeo compreende um monossacarídeo hexose (por exemplo, glico- se) na extremidade redutora da primeira unidade de repetição e, por- tanto, se esse oligossacarídeo ou polissacarídeo é um oligossacarídeo ou polissacarídeo doador, como abrangido aqui em.
[0042] Quando aqui usado, o termo “derivado de monossacarídeo hexose” refere-se a um derivado de um monossacarídeo hexose que pode ser um substrato para a atividade da oligossacaril transferase. Em geral, os derivados de monossacarídeo hexose compreendem um monossacarídeo compreendendo um grupo acetamido na posição 2. Os exemplos de derivados de monossacarídeo hexose incluem Glc- NAc, HexNAc, desoxi HexNAc ou 2,4-diacetamido-2,4,6-trideóxi- hexose.
[0043] Quando aqui usado, o termo “oligossacarídeo ou polissaca- rídeo híbrido” refere-se a um oligossacarídeo ou polissacarídeo modifi- cado que não compreende uma hexose na extremidade redutora da primeira unidade de repetição, mas compreende um derivado de mo- nossacarídeo hexose na extremidade redutora da primeira unidade de repetição.
[0044] Quando aqui usado, a referência a uma identidade de se- quência percentual entre duas sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos significa que, quando alinhadas, essa porcentagem de ami- noácidos ou bases é a mesma na comparação das duas sequências. Esse alinhamento e a porcentagem de homologia ou identidade de se-
quência podem ser determinados usando programas de software co- nhecidos na técnica, por exemplo, os descritos na seção 7.7.18 de Current Protocols in Molecular Biology (FM Ausubel et al., Eds., 1987, suplemento 30). Um alinhamento preferido é determinado pelo algo- ritmo de busca de homologia Smith-Waterman usando uma busca do próximo espaço vazio com uma penalidade de abertura de espaço va- zio de 12 e uma penalidade de extensão de espaço vazio de 2, matriz BLOSUM de 62. O algoritmo de busca de homologia de Smith- Waterman é descrito em Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489. A identidade percentual para qualquer sequência específica (por exemplo, para uma SEQ ID específica) é idealmente calculada ao longo de todo o comprimento dessa sequência. A identidade da se- quência percentual entre duas sequências de comprimentos diferentes é preferencialmente calculada ao longo do comprimento da sequência mais longa.
[0045] Quando aqui usado, o termo “fragmento imunogênico” é uma porção de um antígeno menor que o todo, capaz de provocar uma resposta imune humoral e/ou celular em um animal hospedeiro, por exemplo, humano, específico para esse fragmento. Os fragmentos de uma proteína podem ser produzidos utilizando técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, recombinantemente, por digestão proteolítica ou por síntese química. Os fragmentos internos ou terminais de um polipeptídeo podem ser gerados removendo um ou mais nucleotídeos de uma extremidade (para um fragmento terminal) ou de ambas as extremidades (para um fragmento interno) de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Tipicamente, os fragmentos compreendem pe- lo menos 10, 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos contíguos da sequência completa. Os fragmentos podem ser facilmente modificados adicio- nando ou removendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 ou 50 ami- noácidos de um ou de ambos os terminais N e C.
[0046] Quando aqui usado, o termo “substituição conservadora de aminoácidos” envolve a substituição de um resíduo de aminoácido na- tivo por um resíduo não nativo, de modo que haja pouco ou nenhum efeito no tamanho, polaridade, carga, hidrofobicidade ou hidrofilicidade do resíduo de aminoácido nessa posição e sem resultar em diminuição da imunogenicidade. Por exemplo, estas podem ser substituições den- tro dos seguintes grupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleu- cina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. Modificações conservadoras de aminoácidos na sequência de um polipeptídeo (e as modificações correspondentes nos nucleotídeos codificadores) podem produzir polipeptídeos com características funcionais e químicas se- melhantes às de um polipeptídeo parental.
[0047] Quando aqui usado, o termo “deleção” é a remoção de um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência proteica. Tipicamente, não mais do que cerca de 1 a 6 resíduos (por exemplo, 1 a 4 resíduos) são deletados em qualquer sítio dentro da molécula de proteína.
[0048] Quando aqui usado, o termo “inserção” é a adição de um ou mais resíduos de aminoácidos não nativos na sequência da proteí- na. Tipicamente, não mais do que cerca de 1 a 6 resíduos (por exem- plo, 1 a 4 resíduos) são inseridos em qualquer sítio dentro da molécula de proteína.
[0049] Quando aqui usado, o termo ‘compreendendo’ indica que outros componentes além daqueles nomeados podem estar presentes, enquanto o termo ‘consistindo em’ indica que outros componentes não estão presentes ou não estão presentes em quantidades detectáveis. O termo “compreendendo” naturalmente inclui o termo “consistindo em”. Proteínas
[0050] A presente invenção fornece uma proteína Hla modificada compreendendo (ou consistindo em) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica à SEQ ID NO. 1, modificada, em que a sequência de aminoácidos compreende substituições de aminoácidos nas posições H48 e G122 da SEQ ID NO. 1 ou em posições equivalentes dentro de uma se- quência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO. 1, em que as referidas subs- tituições são respectivamente H a C e G a C (por exemplo, H48C e G122C, por exemplo, SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 3). A referida prote- ína pode ser modificada ainda mais, pois a sequência de aminoácidos compreende uma ou mais sequências de consenso selecionadas en- tre: D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12), em que X e Z são independentemente qualquer aminoácido além da prolina (por exemplo, SEQ ID NO. 7). Essas sequências po- dem ser modificadas pela adição de uma sequência de sinal e, opcio- nalmente, pela inserção de uma serina e/ou alanina no terminal N para fins de clonagem, como aqui descrito. As sequências podem ainda ser modificadas para conter mutações desintoxicantes, como qualquer uma ou todas as mutações desintoxicantes descritas aqui. Uma muta- ção desintoxicante preferida é H35L da SEQ ID No 1 ou 2.
[0051] Em uma concretização, a proteína Hla modificada da inven- ção pode ser derivada de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1 que é um fragmento imunogênico e/ou uma variante da SEQ ID NO. 1. Em uma concretização, a proteína Hla modificada da invenção pode ser derivada de um fragmento imunogênico de SEQ ID NO. 2 ou 3 compreendendo pelo menos cerca de 15, pelo menos cer- ca de 20, pelo menos cerca de 40 ou pelo menos cerca de 60 resíduos de aminoácidos contíguos da sequência de comprimento total, em que o referido polipeptídeo é capaz de provocar uma resposta imune espe- cífica para a referida sequência de aminoácidos.
[0052] Em uma concretização, a proteína Hla modificada da inven- ção pode ser derivada de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1, que é uma variante da SEQ ID NO. 1 que foi modifica- do pela exclusão e/ou adição e/ou substituição de um ou mais amino- ácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 aminoáci- dos). A substituição de aminoácidos pode ser conservadora ou não conservadora. Em um aspecto, a substituição de aminoácidos é con- servadora. Substituições, deleções, adições ou qualquer combinação dos mesmos podem ser combinados em uma única variante, desde que a variante seja um polipeptídeo imunogênico. Em uma concretiza- ção, a proteína Hla modificada da presente invenção pode ser deriva- da de uma variante na qual 1 a 10, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 1 a 2 ou 1 ami- noácidos são substituídos, deletados ou adicionados em qualquer combinação. Por exemplo, a proteína Hla modificada da invenção po- de ser derivada de uma sequência de aminoácidos que é uma variante de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1-3 ou 7, na medida em que possui um ou dois aminoácidos adicionais no terminal N, por exemplo, um SA inicial do terminal N (por exemplo, SEQ ID NO. 6 ou 10). A proteína Hla modificada pode adicionalmente ou alternativamente ter um ou mais aminoácidos adicionais no terminal C, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos. Tais aminoácidos adicionais podem incluir um mar- cador peptídico para auxiliar na purificação e incluem, por exemplo, GSHRHR (por exemplo, SEQ ID NOs 5, 6, 9 e 10).
[0053] Em uma concretização, a presente invenção inclui fragmen- tos e/ou variantes que compreendem um epítopo de célula B ou célula T. Tais epítopos podem ser previstos usando uma combinação de pre- visão de estrutura 2D, por exemplo, usando o programa PSIPRED (de
David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK) e o índice antigênico calcu- lado com base no método descrito por Jameson e Wolf (CABIOS 4: 181-186 [1988]).
[0054] O termo “proteína Hla modificada” refere-se a uma sequên- cia de ácidos de Hla (por exemplo, tendo uma sequência de aminoáci- dos de Hla da SEQ ID NO. 2 ou uma sequência de aminoácidos de pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 % , 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 2), cuja sequência de ami- noácidos de Hla pode ser uma sequência madura de aminoácidos de Hla do tipo selvagem (por exemplo, uma sequência de aminoácidos do tipo selvagem da SEQ ID NO.1), que foi modificada pela adição, subs- tituição ou deleção de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substi- tuição de H48 e G122 da SEQ ID NO. 1 por cisteína, substituição de H35 da SEQ ID Nº 1 por lisina, adição (inserção) de uma sequência de consenso selecionada dentre D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID Nº 11) e K-D/E- X-N-Z-S/T-K (SEQ ID Nº 12; ou por substituição de um ou mais ami- noácidos por uma sequência de consenso selecionada dentre D/E-X- N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12)). A proteína Hla modificada pode também incluem modificações adicionais (adições, substituições, deleções) bem como a adição ou substituição de uma ou mais sequência (s) de consenso. Por exemplo, uma se- quência de sinal e/ou marcador peptídico pode ser adicionado. Amino- ácidos adicionais no terminal N e/ou C podem ser incluídos para auxi- liar na clonagem (por exemplo, após a sequência de sinal ou antes do marcador peptídico, quando presente). Em uma concretização, a pro- teína Hla modificada da invenção pode ser uma proteína Hla de não ocorrência natural.
[0055] Em uma concretização da invenção, um ou mais aminoáci- dos (por exemplo, 1-7 aminoácidos, por exemplo, um aminoácido) da sequência de aminoácidos de Hla modificada (por exemplo, tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 2 ou uma sequência de aminoácidos de Hla pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 2, por exemplo, SEQ O ID NO. 3) foram substituídos por uma sequência de consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) (por exemplo, K-D-Q-N-R-T-K (SEQ ID NO. 23)). Por exemplo, um único aminoácido na sequência de aminoácidos de Hla (por exemplo, SEQ ID NO. 3) pode ser substituído por uma sequência de consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) (por exemplo, K-D-Q-N-R-T-K (SEQ ID NO. 23)) (por exemplo, SEQ ID NO: 7).
[0056] Alternativamente, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidos na sequên- cia de aminoácidos de Hla (por exemplo, SEQ ID NO. 2 ou uma se- quência de aminoácidos de Hla pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 2) podem ser substituídos por uma sequência de consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12 ) (por exemplo, K-D-Q- N-R-T-K (SEQ ID NO. 23)).
[0057] Introdução de uma sequência de consenso selecionada a partir de: D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) permite que a proteína Hla modificada seja glicosilada. As- sim, a presente invenção também fornece uma proteína Hla modifica- da da invenção em que a proteína Hla modificada é glicosilada. Em concretizações específicas, as sequências de consenso são introduzi- das em regiões específicas da sequência de aminoácidos de Hla, por exemplo, estruturas superficiais da proteína, nos terminais N ou C da proteína e/ou em alças que são estabilizadas por pontes dissulfeto. Em um aspecto da invenção, a posição da (s) sequência (s) de con- senso fornece glicosilação melhorada, por exemplo, aumento do ren-
dimento. Em uma concretização, a (s) sequência (s) de consenso se- lecionada (s) de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) (por exemplo, K-D-Q-N-R-T-K (SEQ ID NO. 23)) é (são) adicionada (s) ou substituída (s) em uma posição corresponden- te ao aminoácido K131 da SEQ ID NO. 1 (por exemplo, SEQ ID NO: 7).
[0058] Em uma concretização, uma sequência de consenso sele- cionada dentre D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) (por exemplo, K-D-Q-N-R-T-K (SEQ ID NO. 23)) foi adicionada ou substituída por um ou mais resíduos de aminoácidos ou no lugar do resíduo de aminoácido de SEQ ID NO. 2 ou em uma posi- ção equivalente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 2 (por exemplo, em uma posição equivalente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 3). Em um aspecto, uma sequência de consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) (por exemplo, K-D-Q-N-R-T-K (SEQ ID NO. 23)) foi adicionada ou substituída por aminoácido K131 da SEQ ID NO. 1 ou em uma posição equivalente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1 (por exemplo, SEQ ID NO: 7).
[0059] Uma pessoa versada na técnica compreenderá que quando a sequência de aminoácidos de Hla é uma variante e/ou fragmento de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 2, como uma sequên- cia de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 2, a referência a “entre os aminoácidos ...” refere-se a uma posição que seria equivalente à posi- ção definida, se essa sequência estivesse alinhada com uma sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO. 1 para maximizar a identidade da sequência entre as duas sequências (as ferramentas de alinhamento de sequência não se limitam ao Clustal Omega (www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk) MUSCLE (www(.)ebi(.)ac(.)uk) ou T-coffe (www(.)tcoffe(.)org). Em um aspecto, a ferramenta de alinhamento de sequência usada é Clustal Omega (www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk).
[0060] A adição ou deleção de aminoácidos da variante e/ou frag- mento da SEQ ID NO.1 pode levar a uma diferença na posição real de aminoácidos da sequência de consenso na sequência mutada, no en- tanto, alinhando a sequência mutada com a sequência de referência, o aminoácido em uma posição equivalente ao aminoácido correspon- dente na sequência de referência pode ser identificado e, portanto, a posição apropriada para adição ou substituição da sequência de con- senso pode ser estabelecida.
[0061] A introdução de tais sítios de glicosilação pode ser realiza- da por, por exemplo, adição de novos aminoácidos à estrutura primária da proteína (isto é, os sítios de glicosilação são adicionados, no todo ou em parte), ou mutando os aminoácidos existentes na proteína, a fim de gerar os sítios de glicosilação (isto é, os aminoácidos não são adi- cionados à proteína, mas os aminoácidos selecionados da proteína são mutados de modo a formar sítios de glicosilação). Aqueles versa- dos na técnica reconhecerão que a sequência de aminoácidos de uma proteína pode ser facilmente modificada utilizando métodos conheci- dos na técnica, por exemplo, métodos recombinantes que incluem a modificação da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína. Assim, em uma concretização, a presente invenção fornece uma pro- teína Hla modificada com uma sequência de aminoácidos em que os aminoácidos correspondentes a H48 e G122 da SEQ ID NO 1 ou posi- ções equivalentes em uma sequência de aminoácidos de Hla pelo me- nos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idênti- ca à SEQ ID NO. 1 foram substituídos por cisteína e em que um sítio de glicosilação foi introduzido de forma recombinante na sequência de aminoácidos de Hla da SEQ ID NO. 1 ou uma sequência de aminoáci- dos de Hla pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1. Assim, em uma concretização, a presente invenção fornece uma proteína Hla modificada com uma se- quência de aminoácidos compreendendo uma ou mais sequência (s) de consenso selecionada dentre: D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K- D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12), em que X e Z são independente- mente qualquer aminoácido além da prolina, que foram introduzidos de forma recombinante na sequência de aminoácidos de Hla da SEQ ID NO. 1 ou uma sequência de aminoácidos de Hla pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1 (por exemplo, SEQ ID NOs 2 ou 3). A presente invenção tam- bém fornece um método para a preparação de uma proteína Hla modi- ficada, em que uma ou mais sequências de consenso selecionadas entre: D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12), em que X e Z são independentemente qualquer aminoácido além da prolina, são introduzidas de forma recombinante na sequência de aminoácidos de Hla da SEQ ID NO. 1 ou uma sequência de amino- ácidos de Hla pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1 (isto é, uma proteína Hla modi- ficada recombinante). Em certas concretizações, a sequência de con- senso clássica de glicosilação de 5 aminoácidos (D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11)) pode ser estendida por resíduos de lisina para glicosilação mais eficiente (por exemplo, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12)) e, portanto, a sequência de consenso inserida pode codificar 5, 6 ou 7 aminoácidos que devem ser inseridos ou que substituem os aminoáci- dos da proteína receptora.
[0062] Em uma concretização, a proteína Hla modificada da inven- ção compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 96 %, 97 %, 98 %,
99 % ou 100 % idêntica à sequência da SEQ ID NO. 2, a referida se- quência de aminoácidos compreendendo uma sequência de consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) em que X e Z são independentemente qualquer aminoácido além da prolina (por exemplo, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) ou K-D- Q-N-R-T-K (SEQ ID NO. 23)). Em uma concretização, a proteína Hla modificada da invenção compreende (ou consiste na) sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 7. Em uma concretização, a proteína Hla modificada da invenção compreende (ou consiste na) sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1-3 ou 7 com uma serina N-terminal e/ou alanina (isto é, resíduo S adicionado no terminal N, por exemplo, SEQ ID NO: 6 ou 10).
[0063] Como a Hla é uma toxina, ela precisa ser desintoxicada (is- to é, tornada não tóxica para um mamífero, por exemplo humano, quando fornecida em uma dosagem adequada para proteção) antes de poder ser administrada in vivo. Uma proteína Hla modificada da in- venção pode ser desintoxicada geneticamente (isto é, por mutação). As sequências geneticamente desintoxicadas podem remover ativida- des indesejáveis, como a capacidade de formar um poro penetrante de bicamada lipídica, permeação de membrana, lise celular e atividade citolítica contra eritrócitos humanos e outras células, a fim de reduzir a toxicidade, mantendo a capacidade de induzir anticorpos protetores e/ou neutralizantes anti-Hla após administração a um ser humano. Por exemplo, como aqui descrito, uma proteína Hla pode ser alterada de modo a ser biologicamente inativa enquanto ainda mantém seus epí- topos imunogênicos.
[0064] As proteínas Hla modificadas da invenção podem ser desin- toxicadas geneticamente por uma ou mais mutações pontuais. Por exemplo, resíduos envolvidos na formação de poros foram implicados na atividade lítica de Hla. Em um aspecto, as proteínas Hla modifica-
das da invenção podem ser desintoxicadas por substituições de ami- noácidos, conforme descrito em Menzies e Kernodle (Menzies e Ker- nodle, 1994, Infect Immun 62, 1843-1847), por exemplo, substituição de H35, H48, H114 e/ou H259 com outro aminoácido como a lisina. Por exemplo, as proteínas Hla modificadas da invenção podem com- preender pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada dentre H35L, H114L ou H259L, com referência à sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO. 1 (ou uma posição equivalente em uma se- quência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1). De preferência, a proteína Hla modificada compreende a substituição H35L (por exem- plo, SEQ ID NO: 3).
[0065] Os números de aminoácidos aqui referidos correspondem aos aminoácidos na SEQ ID NO. 1 e como descrito acima, uma pes- soa versada na técnica pode determinar posições equivalentes de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1 por alinhamento.
[0066] A proteína Hla modificada pode demonstrar uma tendência reduzida de agregação em comparação com Hla sem pontes de dis- sulfeto, por exemplo, Hla do tipo selvagem ou desintoxicado (por exemplo, Hla H35L, por exemplo, SEQ ID NO: 30) ou outros mutantes reticulados, por exemplo Hla H35L/Y102C/G126C (SEQ ID NO: 27), Hla H35L/N121C/H48C (SEQ ID NO: 28) ou Hla H35L/G122C/L52C (SEQ ID NO: 29). Por exemplo, uma proteína Hla modificada adequa- da da invenção pode ser aquela que exibe menor agregação do que Hla ou HlaH35L do tipo selvagem (por exemplo, como detectável em Western blots ou medidas por técnicas cromatográficas, por exemplo, IMAC ou cromatografia de exclusão por tamanho), conforme descrito nos Exemplos. Por exemplo, uma proteína Hla modificada adequada pode mostrar níveis de agregação (conforme determinado usando qualquer um dos métodos descritos aqui) de 0 %, 0,0005 %, 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 % ou 5 %; cerca de 0 %, 0,0005 %, 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 % ou 5 %; inferior a 0,0005 %, 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 % ou 5 %; <10 %, <20 %, <30 %, <40 %, <50 %, <60 %, <70 %, <80 % ou <90 % do que o tipo selvagem, Hla desintoxicada (por exemplo, HlaH35L) ou outra Hla reticulada. Por exemplo, ao usar cro- matografia de exclusão por tamanho ou IMAC, o pico representando Hla monomérica pode ser maior que Hla do tipo selvagem ou HlaH35L ou outra Hla reticulada e/ou o pico representando Hla agregada pode ser menor.
[0067] A proteína Hla modificada pode ser produzida com um ren- dimento total maior do que a Hla sem pontes de dissulfeto, por exem- plo, Hla do tipo selvagem ou desintoxicado (por exemplo, Hla H35L, por exemplo, SEQ ID NO: 30) ou outros mutantes reticulados, por exemplo Hla H35L/Y102C/G126C (SEQ ID NO: 27), Hla H35L/N121C/H48C (SEQ ID NO: 28) ou Hla H35L/G122C/L52C (SEQ ID NO: 29). Onde o rendimento total não é maior, a proteína Hla modi- ficada pode ser produzida com um rendimento maior de monômero de Hla do que Hla sem pontes de dissulfeto, por exemplo, Hla do tipo sel- vagem ou desintoxicada (por exemplo, Hla H35L, por exemplo, SEQ ID NO: 30) ou outros mutantes reticulados, por exemplo Hla H35L/Y102C/G126C (SEQ ID NO: 27), Hla H35L/N121C/H48C (SEQ ID NO: 28) ou Hla H35L/G122C/L52C (SEQ ID NO: 29). Por exemplo, o rendimento da proteína Hla modificada pode ser aumentado em 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 90 %, 1 10 %, 120 %, 150 %, 200 % ou mais, ou cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 90 %, 110 %, 120 %, 150 %, 200 % ou mais, em com- paração com o da Hla desintoxicada do tipo selvagem (por exemplo,
HlaH35L) ou outro Hla reticulada. O rendimento proteico pode ser de- terminado como descrito abaixo.
[0068] A atividade hemolítica da proteína Hla modificada da inven- ção pode ser testada e caracterizada por métodos descritos por exem- plo em Menzies e Kernodle, 1994, Infect Immun 62, 1843-1847. Um ensaio de hemólise in vitro pode ser usado para medir a atividade he- molítica (por exemplo, citolítica) da proteína Hla modificada em relação à Hla do tipo selvagem. Um ensaio de inibição da hemólise pode ser usado para medir a capacidade dos antissoros aumentada contra uma proteína Hla modificada da invenção para inibir a hemólise por Hla e (tipicamente) comparar antissoros anti-(Hla modificada) com antissoros anti (Hla do tipo selvagem). Por exemplo, uma proteína Hla modificada adequada da invenção pode ser aquela que exibe menor atividade hemolítica do que a Hla do tipo selvagem (por exemplo, através de um ensaio de hemólise in vitro). Por exemplo, uma proteína Hla modifica- da adequada pode ter uma atividade específica (conforme determina- do usando o ensaio de hemólise in vitro) de aproximadamente (refe- rindo-se a cada um dos seguintes valores independentemente) 0 %, 0,0005 %, 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % ou <10 % da atividade específica da Hla do tipo selvagem. Uma prote- ína Hla modificada adequada da invenção também pode ser aquela que, após administração a um hospedeiro, faz com que o hospedeiro produza anticorpos que inibem a hemólise pela Hla do tipo selvagem (por exemplo, através de um ensaio de inibição da hemólise), é imu- nogênica (por exemplo, induz a produção de anticorpos contra wtHla) e/ou protetora (por exemplo, induz uma resposta imune que protege o hospedeiro contra infecções ou limita uma infecção já existente). Os ensaios podem ser utilizados como descrito nos exemplos.
[0069] Em uma concretização, a proteína Hla modificada da inven- ção compreende ainda uma “marcador peptídico” ou “marcador”, isto é, uma sequência de aminoácidos que permite o isolamento e/ou iden- tificação da proteína Hla modificada.
Por exemplo, adicionar um mar- cador a uma proteína Hla modificada da invenção pode ser útil na puri- ficação dessa proteína e, portanto, na purificação de vacinas conjuga- das compreendendo a proteína Hla modificada marcada.
Marcadores exemplares que podem ser usados aqui incluem, sem limitação, mar- cadores histidina (HIS). Em uma concretização, o marcador é um mar- cador hexa-histidina.
Em outra concretização, a marcador é um mar- cador HR, por exemplo um marcador de HRHR.
Em certas concretiza- ções, os marcadores aqui usados são removíveis, por exemplo remo- ção por agentes químicos ou por meios enzimáticos, uma vez que não são mais necessários, por exemplo, após a proteína ter sido purifica- da.
Opcionalmente, o marcador peptídico está localizado no terminal C da sequência de aminoácidos.
Opcionalmente, o marcador peptídico compreende seis resíduos de histidina no terminal C da sequência de aminoácidos.
Opcionalmente, o marcador peptídico compreende qua- tro resíduos de HR (HRHR) no terminal C da sequência de aminoáci- dos.
O marcador peptídico pode compreender ou ser precedida por um, dois ou mais resíduos de aminoácidos adicionais, por exemplo resíduos de alanina, serina e/ou glicina, por exemplo, GS.
Em um as- pecto, a proteína Hla modificada da invenção compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica à sequên- cia da SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO. 3, a referida sequência de ami- noácidos compreendendo uma sequência de consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) em que X e Z são independentemente qualquer ami- noácido além da prolina (por exemplo, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) ou K-D-Q-N-R-T-K (SEQ ID NO. 23)) e pelo menos uma subs- tituição de aminoácidos selecionada dentre H35L, H48C e G122C e um marcador de peptídeo GSHRHR no terminal C da sequência de aminoácidos. Opcionalmente, a proteína Hla modificada da invenção possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica à SEQ ID NO. 5, 6, 9 ou 10.
[0070] Em uma concretização, a proteína Hla modificada da inven- ção compreende uma sequência de sinal que é capaz de direcionar a proteína Hla para o periplasma de uma célula hospedeira (por exem- plo, bactéria). Em uma concretização específica, a sequência de sinal é de flagelina de E. coli (Flgl) [MIKFLSALILLLVTTAAQA (Seq ID NO. 13)]. Em outras concretizações, a sequência de sinal é de porina A da membrana externa de E. coli (OmpA) [MKKTAIAIAVALAGFATVAQA (Seq ID NO. 14)], proteína de ligação à maltose de E. coli (MalE) [MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA (Seq ID NO. 15)], pectato liase de Erwinia carotovorans (PelB) [MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (Seq ID NO. 16)], enterotoxina LTIIb de E. coli lábil ao calor [MSFK- KIIKAFVIMAALVSVQAHA (Seq ID NO. 17)], endoxilanase XynA de Bacillus subtilis [MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASA (Seq ID NO. 18)], DsbA de E. coli [MKKIWLALAGLVLAFSASA (Seq ID NO. 19)], TolB [MKQALRVAFGFLILWASVLHA (Seq ID NO. 20)] ou SipA [MKMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAS (SEQ ID NO.21)]. Em uma concretização, a sequência de sinal tem uma sequência de aminoáci- dos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica a uma SEQ ID NO. 13-21. Em um aspecto, a se- quência de sinal possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica à sequência de sinal de flagelina de E. coli (Flgl) [MIKFLSALILLLVT- TAAQA (Seq ID NO. 13)]. Sequências de Hla modificadas exemplares compreendendo uma sequência de sinal são SEQ ID NOs: 4, 5, 8 e 9.
[0071] Em uma concretização, um resíduo de serina e/ou alanina é adicionado entre a sequência de sinal e o início da sequência e da pro- teína madura, por exemplo, SA ou S, preferencialmente S. Esse resí-
duo ou resíduos têm a vantagem de levar a uma clivagem mais efici- ente da sequência líder.
[0072] Em um aspecto, a proteína Hla modificada da invenção compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica à sequência da SEQ ID NO. 1, a referida sequência de aminoácidos compreendendo as substituições de aminoácidos G122 a C e H48 a C e, opcionalmente, também H35 a L, uma sequência de consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) em que X e Z são independentemente qualquer aminoácido além da prolina (por exemplo, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) ou K-D-Q-N-R-T-K (SEQ ID NO. 23)), um marcador de HRHR (SEQ ID NO: 25) no terminal C da sequência de aminoácidos e opcionalmente uma sequência de sinal, preferencialmente uma sequência de sinal de FlgL (SEQ ID NO: 13)) no terminal N da sequência de sinal, opcional- mente seguido por um dipeptídeo SA. Em uma concretização, uma proteína Hla modificada da invenção possui uma sequência de amino- ácidos pelo menos 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica a uma se- quência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO. 9 ou SEQ ID NO. 10. Em outra concretização, a presente invenção fornece uma proteína Hla modificada com uma sequência de aminoácidos selecio- nada a partir de SEQ ID NOs. 7-10.
[0073] Um outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo que codifica uma proteína Hla modificada da invenção. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma proteína Hla modificada, com uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com uma se- quência de aminoácidos que é pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO. 2-10. Um vetor compreen- dendo esse polinucleotídeo é um outro aspecto da invenção. Conjugados
[0074] A presente invenção também fornece um conjugado (por exemplo, bioconjugado) compreendendo (ou consistindo em) uma pro- teína Hla modificada da invenção, em que a proteína Hla modificada está ligada, por exemplo covalentemente ligada a um antígeno, de pre- ferência um antígeno de polissacarídeo ou oligossacarídeo.
[0075] Em uma concretização, o conjugado compreende um con- jugado (por exemplo, bioconjugado) compreendendo (ou consistindo em) uma proteína Hla modificada da invenção com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 97 %, 98%, 99 % ou 100 % idêntica à sequência da SEQ ID NO. 1-10 covalentemente ligada a um antígeno, de preferência um antígeno de polissacarídeo ou oligossacarídeo, em que o antígeno está ligado (diretamente ou através de um ligante) a um resíduo de aminoácido da proteína Hla modificada.
[0076] Em uma concretização, a proteína Hla modificada é ligada covalentemente ao antígeno através de uma ligação química obtida utilizando um método de conjugação química (isto é, o conjugado é produzido por conjugação química).
[0077] Em uma concretização, o método de conjugação química é selecionado a partir do grupo que consiste em química de carbodiimi- da, animação redutora, química de cianilação (por exemplo, química de CDAP), química de maleimida, química de hidrazida, química de éster e química de N-hidroissuccinimida. Os conjugados podem ser preparados por métodos de aminação redutora direta, conforme des- crito em US200710184072 (Hausdorff) US 4365170 (Jennings) e US 4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos em EP-0-161-188, EP-208375 e EP-0-477508. O método de conjugação pode alternati- vamente depender da ativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridínio (CDAP) para formar um éster de cia- nato. Tais conjugados são descritos no pedido publicado PCT WO 93/15760 Uniformed Services University e WO 95/08348 e WO 96/29094. Veja também Chu C. et al. Infect. Immunity, 1983 245 256.
[0078] Em geral, os seguintes tipos de grupos químicos em uma proteína Hla modificada podem ser usados para acoplamen- to/conjugação: A) Carboxila (por exemplo, via ácido aspártico ou ácido glutâmico). Em uma concretização, este grupo está ligado a grupos amino diretamente em sacarídeos ou a um grupo amino em um ligante com a química da carbodiimida, por exemplo, com EDAC. B) Grupo amino (por exemplo, via lisina). Em uma concretização, este grupo está ligado a grupos carboxila nos sacarídeos diretamente ou a um grupo carboxila em um ligante com a química da carbodiimida, por exemplo, com o EDAC. Em outra concretização, este grupo está ligado a grupos hidroxila ativados com CDAP ou CNBr em sacarídeos dire- tamente ou a esses grupos em um ligante; a sacarídeos ou ligantes com um grupo aldeído; a sacarídeos ou ligantes com um grupo éster de succinimida. C) Sulfidrila (por exemplo, via cisteína). Em uma concretização, este grupo está ligado a um sacarídeo ou ligante de bromo ou cloro acetila- do com a química da maleimida. Em uma concretização, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina. D) Grupo hidroxila (por exemplo, via tirosina). Em uma concretização, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina. E) grupo imidazolila (por exemplo, via histidina). Em uma concretiza- ção, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina. F) Grupo guanidila (por exemplo, via arginina). G) Grupo indolila (por exemplo, via triptofano).
[0079] Em um sacarídeo, em geral os seguintes grupos podem ser usados para um acoplamento: OH, COOH ou NH2. Grupos aldeídos podem ser gerados após diferentes tratamentos como: periodato, hi- drólise ácida, peróxido de hidrogênio, etc. Métodos de acoplamento direto:
Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ----> éster de cianato + NH2-Proteína ----> conjugado Sacarídeo-aldeído + NH2-Proteína—> base Schiff + NaCNBH3 ----> conjugado Sacarídeo-COOH + NH2-Proteína + EDAC ----> conjugado Sacarídeo-NH2 + COOH-Proteína + EDAC ----> conjugado Acoplamento indireto via métodos espaçadores (ligante): Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ----> éster de cianato + NH2----NH2 --- -> sacarídeo----NH2 + COOH-Proteína + EDAC ----> conjugado Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ----> éster de cianato + NH2----SH ---- > sacarídeo----SH + SH-Proteína (proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida após modificação de grupos amino da proteína por SPDP, por exemplo) ----> sacarídeo-S-S-proteína Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ----> éster de cianato + NH2----SH ---- > sacarídeo----SH + maleimida-Proteína (modificação de grupos ami- no) ----> conjugado Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ----> éster de cianato + NH2----SH ---> Sacarídeo-SH + Proteína haloacetilada ----> Conjugado Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2----NH2 ----> sacarídeo-----NH2 + EDAC + COOH-Proteína ----> conjugado Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2----SH ----> sacarídeo----SH + SH- proteína (proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida após modificação dos grupos amino da proteína pelo SPDP, por exemplo) -- --> sacarídeo-S-S-Proteína Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2----SH ----> sacarídeo---- SH + ma- leimida-Proteína (modificação de grupos amino) ----> conjugado Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2----SH ----> Sacarídeo-SH + Proteína haloacetilada----> Conjugado Sacarídeo-aldeído + NH2----NH2 ----> sacarídeo----NH2 + EDAC + CO- OH-proteína----> Conjugado
Nota: em vez do EDAC acima, qualquer carbodiimida adequada pode ser usada.
[0080] Em uma concretização, o antígeno está diretamente ligado à proteína Hla modificada.
[0081] Em uma concretização, o antígeno é anexado à proteína Hla modificada através de um ligante. Opcionalmente, o ligante é sele- cionado do grupo que consiste em ligantes com 4-12 átomos de car- bono, ligantes bifuncionais, ligantes contendo 1 ou 2 grupos amino reativos no final, B-proprionamido, nitrofenil-etilamina, haletos de halo- acila, ácido 6-aminocaproico e ADH. O sacarídeo ativado pode assim ser acoplado diretamente ou via um grupo espaçador (ligante) a um grupo amino na proteína Hla modificada. Por exemplo, o espaçador pode ser cistamina ou cisteamina para fornecer um polissacarídeo tio- lado que pode ser acoplado à Hla modificada por meio de uma ligação de tioéter obtida após a reação com uma proteína Hla modificada ati- vada por maleimida (por exemplo, usando GMBS (éster de N- hidroxissuccinimida de ácido 4-maleimidobutírico)) ou uma proteína Hla modificada haloacetilada (por exemplo, usando SIAB (succinimidil (4-iodoacetil)aminobenzoato) ou SIA (iodoacetato de succinimidila) ou SBAP (succinimidil-3-(bromoacetamida)propionato)). Em uma concre- tização, o éster de cianato (opcionalmente produzido pela química CDAP) é acoplado a hexano diamina ou ADH (di-hidrazida do ácido adípico) e o sacarídeo derivado de amino é conjugado à proteína Hla modificada usando carbodiimida (por exemplo, 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC ou EDC)) através de um grupo carboxila na Hla modificada pela proteína. Tais conjugados são descri- tos no pedido publicado PCT WO 93/15760 Uniformed Services Uni- versity e WO 95/08348 e WO 96/29094.
[0082] Em uma concretização, o resíduo de aminoácido na proteí- na Hla modificada à qual o antígeno está ligado não é um resíduo de asparagina e, nesse caso, o conjugado é tipicamente produzido por conjugação química. Em uma concretização, o resíduo de aminoácido na proteína Hla modificada à qual o antígeno está ligado é selecionado do grupo que consiste em: Ala, Arg, Asp, Cys, Gly, Glu, Gln, His, IIe, Leu, Lys, Met , Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Val. Opcionalmente, o aminoácido é: um aminoácido contendo um grupo amina terminal, uma lisina, uma arginina, um ácido glutamínico, um ácido aspártico, uma cisteína, uma tirosina, uma histidina ou um triptofano. Opcionalmente, o antígeno é covalentemente ligado ao aminoácido na proteína Hla modificada selecionada dentre: ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, cisteína, tirosina, histidina, arginina ou triptofano.
[0083] Em uma concretização, o resíduo de aminoácido na proteí- na Hla modificada à qual o antígeno está ligado não faz parte da se- quência de consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z- S/T-K (SEQ ID NO. 12). Em uma concretização, o resíduo de aminoá- cido na proteína Hla modificada à qual o antígeno está ligado não é o resíduo de asparagina na sequência de consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12).
[0084] Alternativamente, em outra concretização, o antígeno está ligado a um aminoácido na proteína Hla modificada selecionada entre asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, cisteína, tirosina, histidina, arginina ou triptofano (por exemplo, asparagina). Em outra concretização, o resíduo de aminoácido na proteína Hla modificada à qual o antígeno está ligado é um resíduo de asparagina. Em outra concretização, o resíduo de aminoácido na proteína Hla modificada à qual o antígeno está ligado faz parte da Sequência de consenso de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) (por exemplo, a asparagina na sequência de consenso D/E-X-N-Z- S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12)). Antígenos de polissacarídeos
[0085] Em uma concretização, um dos antígenos em um conjuga- do (por exemplo, bioconjugado) da invenção é um sacarídeo, como um sacarídeo capsular bacteriano, um lipopolissacarídeo bacteriano ou um oligossacarídeo bacteriano. Em uma concretização, o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano.
[0086] Os sacarídeos podem ser selecionados de um grupo que consiste em: sacarídeo capsular de Staphylococcus aureus tipo 5, sa- carídeo capsular de Staphylococcus aureus tipo 8, sacarídeo capsular do sorogrupo A de N. meningitidis (MenA), sacarídeo capsular do so- rogrupo C de N. meningitidis (MenC), sacarídeo capsular do sorogrupo Y de N. meningitidis (MenY), sacarídeo capsular do sorogrupo W de N. meningitidis (MenW), sacarídeo capsular tipo b de de H. influenzae (Hib), sacarídeo capsular do grupo I do estreptococo do grupo B, saca- rídeo capsular do grupo II do estreptococo do grupo B, sacarídeo cap- sular do grupo III do estreptococo do grupo B, sacarídeo capsular do grupo IV do estreptococo do grupo B, sacarídeo capsular do grupo V do estreptococo do grupo B, sacarídeo Vi de Salmonella typhi, N. me- ningitidis LPS (como L3 e/ou L2), LPS de M. catarrhalis, LPS de H. in- fluenzae, antígenos O de Shigella, antígenos O de P. aeruginosa, an- tígenos O de E. coli ou polissacarídeo capsular de S. pneumoniae.
[0087] Em uma concretização, o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano de Staphylococcus aureus. O sacarídeo capsular bacteria- no de Staphylococcus aureus pode ser selecionado a partir de um sa- carídeo capsular do sorotipo 5 ou 8 de Staphylococcus aureus. Por exemplo, o antígeno pode ser um sacarídeo capsular de Staphylococ- cus aureus do sorotipo 5.
[0088] Em uma concretização da invenção, o antígeno é uma uni- dade de repetição de um sacarídeo capsular bacteriano de Staphylo- coccus aureus. Em uma concretização da invenção, o antígeno com- preende uma unidade de repetição de um sacarídeo capsular bacteri-
ano do sorotipo 5 ou 8 de Staphylococcus aureus.
[0089] Em uma concretização da invenção, o antígeno compreen- de uma unidade de repetição de um sacarídeo capsular bacteriano do sorotipo 5 de Staphylococcus aureus. Em uma concretização da in- venção, o antígeno compreende: onde ‘n’ é qualquer número inteiro, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais, conforme descrito abaixo.
[0090] Em uma concretização da invenção, o antígeno compreen- de uma unidade de repetição de um sacarídeo capsular bacteriano do sorotipo 8 de Staphylococcus aureus. Em uma concretização da in- venção, o antígeno compreende: onde ‘n’ é qualquer número inteiro, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais, conforme descrito abaixo.
[0091] Em uma concretização, o antígeno é um polissacarídeo ou oligossacarídeo. Em uma concretização, o antígeno compreende dois ou mais monossacarídeos, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais monossacarídeos. Em uma concretização, o antígeno é um oli- gossacarídeo contendo não mais que 20, 15, 12, 10, 9 ou 8 monossa- carídeos. Em uma concretização, o antígeno é um oligossacarídeo que não contém mais que 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 ou 5 monossacarídeos. Célula hospedeira
[0092] A presente invenção também fornece uma célula hospedei- ra que compreende:
i) um ou mais ácidos nucleicos que codificam glicosiltransfe- rase (s); ii) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transfera- se; iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína Hla modificada da invenção; e opcionalmente iv) um ácido nucleico que codifica uma polimerase (por exem- plo, wzy).
[0093] As células hospedeiras que podem ser utilizadas para pro- duzir os bioconjugados da invenção incluem arqueia, células hospedei- ras procarióticas e células hospedeiras eucarióticas. Células hospedei- ras procarióticas exemplares para uso na produção dos bioconjugados da invenção, sem limitação, espécies Escherichia, espécies Shigella, espécies Klebsiella, espécies Xhantomonas, espécies Salmonella, es- pécies Yersinia, espécies Lactococcus, espécies Lactobacillus, espé- cies Pseudomonas, espécies Corynebacterium, espécies Strep- tomyces, espécies Streptococcus, espécies Staphylococcus, espécies Bacillus e espécies Clostridium. Em uma concretização específica, a célula hospedeira é E. coli.
[0094] Em uma concretização, as células hospedeiras usadas para produzir os bioconjugados da invenção são modificadas para compre- ender ácidos nucleicos heterólogos, por exemplo, ácidos nucleicos he- terólogos que codificam uma ou mais proteínas transportadoras e/ou ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais proteínas, por exemplo, genes que codificam uma ou mais proteínas. Em uma concretização específica, ácidos nucleicos heterólogos que codificam proteínas envolvidas nas vias de glicosilação (por exemplo, vias de glicosilação procariótica e/ou eucariótica) podem ser introduzidos nas células hospedeiras da invenção. Tais ácidos nucleicos podem codifi- car proteínas incluindo, sem limitação, oligossacaril transferases, epi-
merases, flippases, polimerases e/ou glicosiltransferases. Ácidos nu- cleicos heterólogos (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam pro- teínas transportadoras e/ou ácidos nucleicos que codificam outras pro- teínas, por exemplo, proteínas envolvidas na glicosilação) podem ser introduzidos nas células hospedeiras da invenção usando métodos como eletroporação, transformação química por choque térmico, trans- formação natural, transdução de fagos e conjugação. Em concretiza- ções específicas, os ácidos nucleicos heterólogos são introduzidos nas células hospedeiras da invenção utilizando um plasmídeo, por exem- plo, os ácidos nucleicos heterólogos são expressos nas células hos- pedeiras por um plasmídeo (por exemplo, um vetor de expressão). Em outra concretização específica, ácidos nucleicos heterólogos são intro- duzidos nas células hospedeiras da invenção usando o método de in- serção descrito no Pedido de Patente Internacional nº PCT/EP2013/068737 (publicado como WO 14/037585).
[0095] Assim, a presente invenção também fornece uma célula hospedeira que compreende: i) um ou mais ácidos nucleicos que codificam glicosiltransfe- rase (s); ii) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transfera- se; iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína Hla modificada da invenção; iv) um ácido nucleico que codifica uma polimerase (por exem- plo, wzy); e vi) um ácido nucleico que codifica uma flippase (por exemplo, wxy).
[0096] Em uma concretização, modificações adicionais podem ser introduzidas (por exemplo, usando técnicas recombinantes) nas célu- las hospedeiras da invenção. Por exemplo, ácidos nucleicos da célula hospedeira (por exemplo, genes) que codificam proteínas que fazem parte de uma via de glicosilação possivelmente competitiva ou interfe- rente (por exemplo, competem ou interferem com um ou mais genes heterólogos envolvidos na glicosilação que são introduzidos de forma recombinante na célula hospedeira) podem ser deletados ou modifica- dos no fundo da célula hospedeira (genoma) de uma maneira que os torne inativos/disfuncionais (isto é, os ácidos nucleicos da célula hos- pedeira que são deletados/modificados não codificam uma proteína funcional ou não codificam uma proteína). Em uma concretização, quando os ácidos nucleicos são deletados do genoma das células hospedeiras da invenção, eles são substituídos por uma sequência desejável, por exemplo, uma sequência que é útil para a produção de glicoproteínas.
[0097] Genes exemplares que podem ser deletados nas células hospedeiras (e, em alguns casos, substituídos por outras sequências de ácidos nucleicos desejados) incluem genes de células hospedeiras envolvidas na biossíntese de glicolipídeos, como waaL (veja, por exemplo, Feldman et al. 2005, PNAS USA 102: 3016-3021), o cluster de biossíntese do núcleo lipídico A (waa), cluster de galactose (gal), cluster de arabinose (ara), cluster de ácido colônico (wc), cluster de polissacarídeos capsulares, genes de biossíntese de undecaprenol- pirofosfato (por exemplo, uppS (undecaprenil pirofosfato sintase), uppP (Undecaprenil difosfatase)), genes de reciclagem de Und-P, en- zimas metabólicas envolvidas na biossíntese de açúcar ativada por nucleotídeos, cluster de antígeno comum enterobacteriano e clusters de modificação de antígeno O de profago, como o cluster gtrABS.
[0098] Uma tal célula hospedeira procariótica modificada compre- ende ácidos nucleicos que codificam enzimas capazes de produzir um bioconjugado compreendendo um antígeno, por exemplo, um antígeno de sacarídeo ligado a uma proteína Hla modificada da invenção. Tais células hospedeiras podem expressar naturalmente ácidos nucleicos específicos para a produção de um antígeno de sacarídeo, ou as célu- las hospedeiras podem ser feitas para expressar esses ácidos nuclei- cos, isto é, em certas concretizações, os referidos ácidos nucleicos são heterólogos para as células hospedeiras. Em certas concretiza- ções, um ou mais dos referidos ácidos nucleicos específicos para a produção de um antígeno de sacarídeo são heterólogos para a célula hospedeira e integrados ao genoma da célula hospedeira. Em certas concretizações, as células hospedeiras da invenção compreendem ácidos nucleicos que codificam enzimas adicionais ativas na N- glicosilação de proteínas, por exemplo, as células hospedeiras da in- venção compreendem ainda um ácido nucleico que codifica uma oli- gossacaril transferase e/ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam outras glicosiltransferases.
[0099] Sequências de ácido nucleico compreendendo clusters de genes de polissacarídeos capsulares podem ser inseridas nas células hospedeiras da invenção. Em uma concretização específica, o cluster de genes de polissacarídeo capsular inserido em uma célula hospedei- ra da invenção é um cluster de genes de polissacarídeo capsular de uma cepa de E. coli, uma cepa de Staphylococcus (por exemplo, S. aureus), uma cepa de Streptococcus (por exemplo, S. pneumoniae, S. pyrogenes, S. agalacticae) ou uma cepa de Burkholderia (por exemplo, B mallei, B. pseudomallei, B. thailandensis). Descrições de métodos para preparar essas células hospedeiras capazes de produzir biocon- jugados são encontradas em WO 06/119987, WO 09/104074, WO 11/62615, WO 11/138361, WO 14/57109, W014/72405 e W016/20499.
[00100] Em uma concretização, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína Hla modificada em um plasmídeo na célula hospedeira. Maquinarias de Glicosilação
[00101] As células hospedeiras da invenção compreendem e/ou podem ser modificadas para compreender ácidos nucleicos que codifi- cam maquinarias genéticas (por exemplo, glicosiltransferases, flippa- ses, polimerases e/ou oligossacariltransferases) capazes de produzir oligossacarídeos e/ou polissacarídeos híbridos, além de genes maqui- naria capaz de ligar antígenos à proteína Hla modificada da invenção.
[00102] Os polissacarídeos capsulares de S. aureus são montados no lipídeo transportador de membrana bacteriana undecaprenil pirofos- fato por uma via conservada que compartilha homologia com a via de- pendente de polimerase da síntese de polissacarídeo O em bactérias Gram-negativas.
[00103] O conjunto de antígenos O é iniciado pela transferência de um fosfato de açúcar de um doador de DP para undecaprenil fosfato. O antígeno O ligado a lipídeos é montado no lado citoplasmático da membrana interna por ação sequencial de diferentes glicosiltransfera- ses. O glicolipídeo é então invertido para o espaço periplásmico e po- limerizado. Ao substituir o antígeno O ligase WaaL pela oligossacaril- transferase PgIB, o antígeno O polimerizado pode ser transferido para um transportador de proteína e não para o núcleo lipídico A. Glicosiltransferases
[00104] As células hospedeiras da invenção compreendem ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferases que produzem uma unida- de de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo. Em uma concre- tização, a referida unidade de repetição não compreende uma hexose na extremidade redutora e a referida unidade de repetição de oligos- sacarídeo ou polissacarídeo é derivada de uma unidade de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo doador que compreende uma hexose na extremidade de redução.
[00105] Em uma concretização, as células hospedeiras da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica uma glicosiltrans-
ferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em unde- caprenil pirofosfato (Und-PP). Em um aspecto, a glicosiltransferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose no Und-PP é he- teróloga para a célula hospedeira e/ou heteróloga para um ou mais dos genes que codificam glicosiltransferase (s). A referida glicosiltrans- ferase pode ser derivada de, por exemplo, espécies Escherichia, es- pécies Shigella, espécies Klebsiella, espécies Xhantomonas, espécies Salmonella, espécies Yersinia, espécies Aeromonas, espécies Franci- sella, espécies Helicobacter, espécies Proteus, espécies Lactococcus, espécies Lactobacillus, espécies Pseudomonas, espécies Corynebac- terium, espécies Streptomyces, espécies Streptococcus, espécies En- terococcus, espécies Staphylococcus, espécies Bacillus, espécies Clostridium, espécies Listeria ou espécies Campylobacter. Em uma concretização específica, a glicosiltransferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em Und-PP é wecA, opcionalmente de E. coli (wecA pode montar GlcNAc em UndP de UDP-GIcNAc). Em uma concretização, o monossacarídeo hexose é selecionado do grupo que consiste em glicose, galactose, ramnose, arabinotol, fucose e manose (por exemplo, galactose).
[00106] Em uma concretização, as células hospedeiras da invenção podem compreender ácidos nucleicos que codificam uma ou mais gli- cosiltransferases capazes de adicionar um monossacarídeo ao deriva- do de monossacarídeo hexose montado em Und-PP. Em uma concre- tização específica, as referidas uma ou mais glicosiltransferases capa- zes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossacarídeo hexose é a galactosiltransferase (wfeD) de Shigella boyedii. Em outra concretização específica, as referidas uma ou mais glicosiltransferases capazes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossaca- rídeo hexose é a galactofuranosiltransferase (wbeY) de E. coli O28. Em outra concretização específica, as referidas uma ou mais glicosil-
transferases capazes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossacarídeo hexose é a galactofuranosiltransferase (wfdK) de E. coli O167. As galf-transferases, como wfdK e wbeY, podem transferir Galf (Galactofuranose) de UDP-Galf para -GlcNAc-PP-Undecaprenila. Em outra concretização específica, as referidas uma ou mais glicosil- transferases capazes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossacarídeo hexose são a galactofuranosiltransferase (wbeY) de E. coli O28 e a galactofuranosiltransferase (wfdK) de E. coli O167.
[00107] Em uma concretização, as células hospedeiras da invenção compreendem ácidos nucleicos que codificam glicosiltransferases que montam a unidade de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo doador no derivado de monossacarídeo hexose.
[00108] Em uma concretização, as glicosiltransferases que montam a unidade de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo doador no derivado de monossacarídeo hexose compreendem uma glicosil- transferase capaz de adicionar o monossacarídeo hexose presente na extremidade redutora da primeira unidade de repetição do oligossaca- rídeo ou polissacarídeo doador ao derivado de monossacarídeo he- xose. Glicosiltransferases exemplares incluem galactosiltransferases (wciP), por exemplo, wciP de E. coli O21.
[00109] Em uma concretização, as glicosiltransferases que montam a unidade de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo doador no derivado de monossacarídeo hexose compreendem uma glicosil- transferase que é capaz de adicionar o monossacarídeo adjacente ao monossacarídeo hexose presente na extremidade redutora da primeira unidade de repetição do oligossacarídeo ou polissacarídeo doador no monossacarídeo hexose presente na extremidade redutora da primeira unidade de repetição do oligossacarídeo ou polissacarídeo doador. Glicosiltransferases exemplares incluem glicosiltransferase (wciQ), por exemplo, wciQ de E. coli O21.
[00110] Em uma concretização, uma célula hospedeira da invenção compreende glicosiltransferases para síntese das unidades de repeti- ção de um oligossacarídeo ou polissacarídeo selecionado a partir do cluster de genes CP5 ou CP8 de Staphylococcus aureus. Em uma concretização específica, as glicosiltransferases para síntese das uni- dades de repetição de um oligossacarídeo ou polissacarídeo são do cluster de genes CP5 de Staphylococcus aureus. CP5 e CP8 de S. aureus têm uma estrutura semelhante aos genes sintéticos do antíge- no de P. aeruginosa O11, de modo que esses genes podem ser com- binados com os genes de síntese de monossacarídeos de E. coli para sintetizar um polímero CP5 ou CP8 ligado a undecaprenil pirofosfato, consistindo em unidades de trissacarídeo repetidas.
[00111] Em uma concretização, uma célula hospedeira da invenção compreende glicosiltransferases suficientes para síntese das unidades de repetição do sacarídeo CP5 ou CP8 compreendendo capH, capI, capJ e/ou capK de S. aureus CP5 ou CP8. Opcionalmente, a célula hospedeira da invenção também compreende capD, capE, capF, capG, capL, capM, capN, capO, capP de S. aureus CP5 ou CP8. Al- ternativamente, a célula hospedeira da invenção também compreende wbjB, wbjC, wbjD, wbjE, wbjF, wbjL, wbpM, wzz e/ou wzx de P. aeru- ginosa O11 e wecB, wecC de E. coli O16.
[00112] Em uma concretização, uma célula hospedeira da invenção compreende glicosiltransferases suficientes para síntese das unidades de repetição do sacarídeo CP5 compreendendo capH, capI, capJ e/ou capK de S. aureus CP5. Opcionalmente, a célula hospedeira da inven- ção também compreende capD, capE, capF, capG, capL, capM, capN, capO, capP de S. aureus CP5. Alternativamente, a célula hospedeira da invenção também compreende wbjB, wbjC, wbjD, wbjE, wbjF, wbjL, wbpM, wzz e/ou wzx de P. aeruginosa O11 e wecB, wecC de E. coli O16.
[00113] Em uma concretização, uma célula hospedeira da invenção compreende glicosiltransferases que montam a unidade de repetição de oligossacarídeo ou polissacarídeo doador no derivado de monos- sacarídeo hexose que compreende uma glicosiltransferase que é ca- paz de adicionar o monossacarídeo hexose presente na extremidade redutora da primeira unidade de repetição do oligossacarídeo ou polis- sacarídeo doador ao derivado de monossacarídeo hexose. Oligossacaril Transferases
[00114] A glicosilação da proteína ligada ao N - a adição de molécu- las de carboidrato a um resíduo de asparagina na cadeia polipeptídica da proteína alvo - é o tipo mais comum de modificação pós-traducional que ocorre no retículo endoplasmático dos organismos eucarióticos. O processo é realizado pelo complexo enzimático oligossacariltransfera- se (OST) responsável pela transferência de um oligossacarídeo pré- montado de um transportador lipídico (fosfato de dolicol) para um resí- duo de asparagina de uma proteína nascente dentro da sequência conservada Asn-X-Ser/Thr (onde X é qualquer aminoácido exceto pro- lina) no retículo endoplasmático.
[00115] Foi demonstrado que uma bactéria, o patógeno de origem alimentar Campylobacter jejuni, também pode N-glicosilar suas proteí- nas (Wacker et al. Science. 2002; 298 (5599): 1790-3) devido ao fato de possuir a sua própria maquinaria de glicosilação. O mecanismo responsável por essa reação é codificado por um cluster chamado “pgl” (para glicosilação de proteínas).
[00116] A maquinaria de glicosilação de C. jejuni pode ser transferi- da para E. coli para permitir a glicosilação de proteínas recombinantes expressas pelas células de E. coli. Estudos anteriores demonstraram como gerar cepas de E. coli que podem realizar N-glicosilação (veja, por exemplo, Wacker et al. Science. 2002; 298 (5599): 1790-3; Nita- Lazar et al. Glycobiology. 2005; 15 (4): 361-7; Feldman et al., Proc Natl
Acad Sci U S A. 2005; 102 (8): 3016-21; Kowarik et al. EMBO J. 2006; 25 (9): 1957-66; Wacker et. al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103 (18): 7088-93; Publicação de Pedido de Patente Internacional Nos. W02003/074687, W02006/119987, WO 2009/104074, WO/2011/06261 e WO2011/138361). Mutantes de PglB com propriedades otimizadas são descritos em WO2016/107818. Um mutante preferido é o PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V, como descrito nos Exemplos.
[00117] As oligossacaril transferases transferem oligossacarídeos lipídicos para resíduos de asparagina de cadeias polipeptídicas nas- centes que compreendem um motivo de consenso de N-glicosilação, por exemplo, Asn-X-Ser (Thr), em que X pode ser qualquer aminoáci- do exceto Pro; ou Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser (Thr), em que X e Z são sele- cionados independentemente de qualquer aminoácido natural, exceto Pro (veja, WO 2006/119987). Veja, por exemplo, WO 2003/074687 e WO 2006/119987, cujas descrições são aqui incorporadas por referên- cia na sua totalidade.
[00118] Em uma concretização, as células hospedeiras da invenção compreendem um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril trans- ferase. O ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase po- de ser nativo da célula hospedeira ou pode ser introduzido na célula hospedeira usando métodos genéticos, como descrito acima. Em uma concretização específica, a oligossacaril transferase é uma oligossaca- ril transferase da Campylobacter. Em outra concretização específica, a oligossacaril transferase é uma oligossacaril transferase da Campylo- bacter jejuni (isto é, pglS; veja, por exemplo, Wacker et al. 2002, Sci- ence 298: 1790-1793; veja, também, por exemplo, Gene NCBI ID: 3231775, UniProt No. de acesso 086154). Em outra concretização es- pecífica, a oligossacaril transferase é uma oligossacaril transferase da Campylobacter lari (veja, por exemplo, Gene NCBI ID: 7410986).
[00119] Em uma concretização específica, as células hospedeiras da invenção compreendem uma sequência de ácido nucleico que codi- fica uma oligossacaril transferase, em que a referida sequência de áci- do nucleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, pglB de Campylobacter jejuni) é integrada ao genoma da célula hos- pedeira.
[00120] Em uma concretização específica, as células hospedeiras da invenção compreendem uma sequência de ácido nucleico que codi- fica uma oligossacaril transferase, em que a referida sequência de áci- do nucleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, pglS de Campylobacter jejuni) é transmitida por plasmídeo.
[00121] Em outra concretização específica, é aqui fornecida uma célula hospedeira procariótica modificada que compreende (i) uma gli- cosiltransferase derivada de um cluster de polissacarídeo capsular de S. aureus, em que a referida glicosiltransferase é integrada no genoma da referida célula hospedeira; (ii) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, pglB de Campylobacter jejuni), em que o referido ácido nucleico que codifica uma oligossacaril trans- ferase é transportado por plasmídeo e/ou integrado ao genoma da cé- lula hospedeira; e (iii) uma proteína Hla modificada da invenção, em que a referida proteína Hla modificada é carregada por plasmídeo ou integrada no genoma da célula hospedeira. Também é fornecido um método para produzir uma célula hospedeira procariótica modificada, compreendendo (i) integrar uma glicosiltransferase derivada de um cluster de polissacarídeo capsular de S. aureus no genoma da referida célula hospedeira; (ii) integrar na célula hospedeira um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma oligossacaril transferase (por exemplo, pglB de Campylobacter jejuni) que é transportada por plasmídeo e/ou integrada no genoma da célula hospedeira; e (iii) integrar em uma cé- lula hospedeira uma proteína Hla modificada da invenção, carregada por plasmídeo ou integrada no genoma da célula hospedeira.
[00122] Em uma concretização específica, é uma célula hospedeira da invenção, em que pelo menos um gene da célula hospedeira foi inativado ou deletado funcionalmente, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi inativado ou deletado funcionalmente, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi substituí- da por um ácido nucleico que codifica uma oligossacariltransferase, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi substituí- do por C. jejuni pglB. Polimerases
[00123] Em uma concretização, uma polimerase (por exemplo, wzy) é introduzida em uma célula hospedeira da invenção (isto é, a polime- rase é heteróloga à célula hospedeira). Em uma concretização, a poli- merase é uma polimerase bacteriana. Em uma concretização, a poli- merase é uma polimerase de polissacarídeo capsular (por exemplo, wzy) ou uma polimerase de antígeno O (por exemplo, wzy). Em uma concretização, a polimerase é uma polimerase de polissacarídeo cap- sular (por exemplo, wzy).
[00124] Em uma concretização, uma polimerase de uma via bios- sintética de polissacarídeo capsular é introduzida em uma célula hos- pedeira da invenção.
[00125] Em outra concretização específica, uma polimerase de uma via biossintética capsular de Staphylococcus aureus é introduzida em uma célula hospedeira da invenção.
[00126] Em uma concretização, a polimerase introduzida nas célu- las hospedeiras da invenção é o gene wzy de um cluster de genes de polissacarídeos capsulares de S. aureus CP5 ou CP8 (cap5J/cap8l). Em uma concretização específica, a polimerase introduzida nas célu- las hospedeiras da invenção é o gene wzy de um cluster de genes de polissacarídeos capsulares de CP5 (cap5J).
[00127] Em outra concretização específica, a referida polimerase é incorporada (por exemplo, inserida no genoma ou plasmídeo expresso por) na referida célula hospedeira como parte de um cluster de polis- sacarídeo capsular de S. aureus, em que o referido cluster de polissa- carídeo capsular de S. aureus foi modificado para compreender a wzy polimerase.
[00128] Em uma concretização específica, uma sequência de ácido nucleico que codifica a wzy polimerase de S. aureus é inserida ou ex- pressa pelas células hospedeiras da invenção. Assim, uma célula hos- pedeira da invenção pode ainda compreender uma wzy polimerase de S. aureus. Flippases
[00129] Em uma concretização, uma flippase (wzx ou homólogo) é introduzida em uma célula hospedeira da invenção (isto é, a flippase é heteróloga à célula hospedeira). Assim, uma célula hospedeira da in- venção pode ainda compreender uma flippase. Em uma concretização, a flippase é uma flippase bacteriana. As flippases translocam unidades repetitivas do tipo selvagem e/ou suas unidades de repetição modifi- cadas (híbridas) correspondentes do citoplasma para o periplasma das células hospedeiras (por exemplo, E. coli). Assim, uma célula hospe- deira da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma flippase (wzx).
[00130] Em uma concretização específica, uma flippase de uma via biossintética de polissacarídeo capsular é introduzida em uma célula hospedeira da invenção.
[00131] Em outra concretização específica, uma flippase de uma via biossintética polissacarídica capsular de S. aureus é introduzida em uma célula hospedeira da invenção. Em certas concretizações, a flippase introduzida nas células hospedeiras da invenção é o gene capK de um cluster de genes de polissacarídeos capsulares de S. au- reus CP5 ou CP8. Em uma concretização específica, a flippase intro-
duzida nas células hospedeiras da invenção é o gene capK de um clu- ster de genes de polissacarídeos capsulares de CP5.
[00132] Outras flippases que podem ser introduzidas nas células hospedeiras da invenção são, por exemplo, de Campylobacter jejuni (por exemplo, pglK). Enzimas Que Modificam Monossacarídeos Enzimas Acessórias
[00133] Em uma concretização, ácidos nucleicos que codificam uma ou mais enzimas acessórias são introduzidos nas células hospe- deiras da invenção. Assim, uma célula hospedeira da invenção pode ainda compreender uma ou mais dessas enzimas acessórias. Tais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais enzimas acessórias po- dem ser transportados por plasmídeo ou integrados no genoma das células hospedeiras da invenção. Enzimas acessórias exemplares in- cluem, sem limitação, enzimas epimerases, de ramificação, de modifi- cação (por exemplo, para adicionar colinas, glicerolfosfatos, piruvatos), de amidação, reguladoras do comprimento da cadeia, acetilantes, for- milantes e polimerizantes.
[00134] Em certas concretizações, enzimas que são capazes de modificar monossacarídeos são introduzidas em uma célula hospedei- ra da invenção (isto é, as enzimas que são capazes de modificar mo- nossacarídeos são heterólogas à célula hospedeira). Tais enzimas in- cluem, por exemplo, epimerases e racemases. Assim, uma célula hos- pedeira da invenção pode ainda compreender uma epimerase e/ou racemase.
[00135] Em uma concretização, as epimerases e racemases são de bactérias. Em certas concretizações, as epimerases e/ou racemases introduzidas nas células hospedeiras da invenção são das espécies Escherichia, espécies Shigella, espécies Klebsiella, espécies Xhanto- monas, espécies Salmonella, espécies Yersinia, espécies Aeromonas,
espécies Francisella, espécies Helicobacter, espécies Proteus, Espé- cies de Lactococcus, espécies Lactobacillus, espécies Pseudomonas, espécies Corynebacterium, espécies Streptomyces, espécies Strepto- coccus, espécies Enterococcus, espécies Staphylococcus, espécies Bacillus, espécies Clostridium, espécies Listeria ou espécies Campylobacter.
[00136] Em certas concretizações, a epimerase inserida em uma célula hospedeira da invenção é uma epimerase descrita na Publica- ção de Pedido de Patente Internacional No. WO2011/062615, cuja di- vulgação é incorporada por referência aqui na sua totalidade. Em uma concretização, a epimerase é a epimerase codificada pelo gene Z3206 da cepa O157 de E. coli. Veja, por exemplo, WO 2011/062615 e Rush et al. 2009, The Journal of Biological Chemistry 285: 1671-1680, que é incorporado por referência aqui na sua totalidade. Em outra concreti- zação, a epimerase é galE (UPD-galactose epimerase) Z3206 e galé converte GlcNAc-P-P-undecaprenila em GalNAc-P-P-undecaprenila. Em uma concretização específica, as células hospedeiras da invenção compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica uma epimerase, em que a referida sequência de ácido nucleico que codifica uma epimerase é integrada no genoma da célula hospedeira.
[00137] Em uma concretização, uma célula hospedeira da invenção compreende ainda uma mutase, por exemplo glf (UDP- galactopyranose mutase).
[00138] Em uma concretização, uma célula hospedeira da invenção compreende ainda RcsA (um ativador da síntese da CP). O RcsA é um regulador positivo instável necessário para a síntese do polissacarídeo capsular do ácido colânico em Escherichia coli. Antecedentes Genéticos
[00139] Células hospedeiras exemplares que podem ser usadas para gerar as células hospedeiras da invenção incluem, sem limitação,
espécies Escherichia, espécies Shigella, espécies Klebsiella, espécies Xhantomonas, espécies Salmonella, espécies Yersinia, espécies Lac- tococcus, espécies Lactobacillus, espécies Pseudomonas, espécies Corynebacterium, espécies Streptomyces, espécies Streptococcus, espécies Staphylococcus, espécies Bacillus e espécies Clostridium. Em uma concretização específica, a célula hospedeira aqui utilizada é E. coli.
[00140] Em uma concretização, o antecedente genético da célula hospedeira é modificado por, por exemplo, deleção de um ou mais ge- nes. Genes exemplares que podem ser deletados nas células hospe- deiras (e, em alguns casos, substituídos por outras sequências de áci- dos nucleicos desejados) incluem genes de células hospedeiras en- volvidas na biossíntese de glicolipídeos, como waaL (veja, por exem- plo, Feldman et al. 2005, PNAS USA 102 : 3016-3021), o cluster de antígenos O (rfb ou wb), o cluster de antígenos comuns enterobacteri- anos (wec), o cluster de biossíntese do núcleo lipídico A (waa) e os clusters de modificação de antígenos O de profago como o cluster gtrABS. Em uma concretização específica, um ou mais do gene waaL, gene gtrA, gene gtrB, gene gtrS ou um gene ou genes do cluster wec ou um gene ou genes do cluster do gene rfb são deletados ou inativa- dos funcionalmente do genoma de uma célula hospedeira procariótica da invenção. Em uma concretização, uma célula hospedeira usada aqui é E. coli, em que o gene waaL, o gene gtrA, o gene gtrB, o gene gtrS são deletados ou inativados funcionalmente do genoma da célula hospedeira. Em outra concretização, uma célula hospedeira usada aqui é E. coli, em que o gene waaL e o gene gtrS são deletados ou inativados funcionalmente do genoma da célula hospedeira. Em outra concretização, uma célula hospedeira usada aqui é E. coli, em que o gene waaL e os genes do cluster wec são deletados ou inativados fun- cionalmente do genoma da célula hospedeira.
Bioconjugados
[00141] As células hospedeiras da invenção podem ser usadas pa- ra produzir bioconjugados compreendendo um antígeno de sacarídeo, por exemplo, um antígeno de sacarídeo de Staphylococcus aureus li- gado a uma proteína Hla modificada da invenção. Os métodos de pro- dução de bioconjugados utilizando células hospedeiras são descritos, por exemplo, em WO 2003/074687, WO 2006/119987 e WO2011/138361. Os bioconjugados, como aqui descrito, têm proprie- dades vantajosas sobre os conjugados químicos da proteína transpor- tadora de antígeno, na medida em que requerem menos produtos químicos na fabricação e são mais consistentes em termos do produto final gerado.
[00142] Em uma concretização, é aqui proporcionado um bioconju- gado compreendendo uma proteína Hla modificada ligada a um antí- geno de Staphylococcus aureus. Em uma concretização específica, o referido antígeno de Staphylococcus aureus é um sacarídeo capsular (por exemplo, polissacarídeo capsular). Em uma concretização especí- fica, é aqui proporcionado um bioconjugado compreendendo uma pro- teína Hla modificada da invenção e um antígeno selecionado a partir de um sacarídeo capsular (por exemplo, polissacarídeo capsular) do sorotipo CP5 ou CP8 de Staphylococcus aureus. Em uma concretiza- ção específica, é aqui proporcionado um bioconjugado compreenden- do uma proteína Hla modificada da invenção e um antígeno de um sa- carídeo capsular (por exemplo, polissacarídeo capsular) do sorotipo CP5 de Staphylococcus aureus.
[00143] Os bioconjugados da invenção podem ser purificados por exemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia de coluna de permuta de íons, permuta de cátions, permuta de ânions, afinidade e delimitação), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Veja, por exem-
plo, Saraswat et al. 2013, Biomed. Res. Int. ID # 312709 (p. 1-18); veja também os métodos descritos em WO 2009/104074. Além disso, os bioconjugados podem ser fundidos com sequências polipeptídicas he- terólogas aqui descritas ou de outro modo conhecidas na técnica para facilitar a purificação. Por exemplo, a proteína Hla pode incorporar um marcador de peptídeo, como um marcador de hexa-histidina ou um marcador de HRHR (por exemplo, SEQ ID NOs: 25 e 26) para purifica- ção por permuta de cátions. As condições reais usadas para purificar um bioconjugado específico dependerão, em parte, da estratégia de síntese e de fatores como carga líquida, hidrofobicidade e/ou hidrofili- cidade do bioconjugado, e serão evidentes aqueles versados na técni- ca.
[00144] Um outro aspecto da invenção é um processo para a pro- dução de um bioconjugado que compreende (ou consiste em) uma proteína Hla modificada ligada a um sacarídeo, o referido método compreendendo (i) cultivar a célula hospedeira da invenção em condi- ções adequadas para a produção de proteínas (e opcionalmente em condições adequadas para a produção de sacarídeos) e (ii) isolar o bioconjugado produzido pela referida célula hospedeira.
[00145] Um outro aspecto da invenção é um bioconjugado produzi- do pelo processo da invenção, em que o referido bioconjugado com- preende um sacarídeo ligado a uma proteína Hla modificada. Métodos Analíticos
[00146] Vários métodos podem ser utilizados para analisar as com- posições estruturais e os comprimentos das cadeias de açúcar dos bioconjugados da invenção.
[00147] Em uma concretização, a hidrazinólise pode ser usada para analisar glicanos. Primeiro, os polissacarídeos são liberados de seus transportadores de proteínas por incubação com hidrazina, de acordo com as instruções do fabricante (Ludger Liberate Hydrazinolysis
Glycan Release Kit, Oxfordshire, UK). A hidrazina nucleófila ataca a ligação glicosídica entre o polissacarídeo e a proteína transportadora e permite a liberação dos glicanos ligados. Os grupos N-acetila são per- didos durante este tratamento e precisam ser reconstituídos por re-N- acetilação. Os glicanos livres são purificados em colunas de carbono e subsequentemente marcados na extremidade redutora com a fluorofor 2-amino benzamida. Veja Bigge JC, Patel TP, Bruce JA, Goulding PN, Charles SM, Parekh RB: Nonselective and efficient fluorescent labeling of glicans using 2-amino benzamide and anthranilic acid. Anal Biochem 1995, 230 (2): 229-238. Os polissacarídeos marcados são separados em uma coluna GlycoSep-N (GL Sciences) de acordo com o protocolo de HPLC de Royle et al. Veja Royle L, Mattu TS, Hart E, Langridge Jl, Merry AH, Murphy N, Harvey DJ, Dwek RA, Rudd PM: Um banco de dados analítico e estrutural fornece uma estratégia para sequenciar O- glicanos a partir de quantidades de microgramas de glicoproteínas. Anal Biochem 2002, 304 (1): 70-90. O cromatograma de fluorescência resultante indica o comprimento do polissacarídeo e o número de uni- dades de repetição. Informações estruturais podem ser coletadas atra- vés da coleta de picos individuais e subsequentemente executando análises de MS/MS. Desse modo, a composição de monossacarídeos e a sequência da unidade de repetição podem ser confirmadas e, adi- cionalmente, a homogeneidade da composição de polissacarídeos po- de ser identificada.
[00148] Em outra concretização, SDS-PAGE ou eletroforese em gel capilar pode ser usada para avaliar glicanos e bioconjugados. O com- primento do polímero para os antígenos O glicanos é definido pelo número de unidades de repetição que são montadas linearmente. Isso significa que o padrão típico de escada é uma consequência de dife- rentes números de unidades de repetição que compõem o glicano. As- sim, duas bandas próximas uma da outra no SDS PAGE ou outras técnicas que se separam por tamanho diferem apenas em uma única unidade de repetição. Essas diferenças discretas são exploradas ao analisar glicoproteínas quanto ao tamanho do glicano: A proteína transportadora não glicosilada e o bioconjugado com diferentes com- primentos de cadeia polimérica são separados de acordo com suas mobilidades eletroforéticas. O primeiro número de unidade de repeti- ção detectável (n1) e o número médio de unidade de repetição (nmédio) presente em um bioconjugado são medidos. Esses parâmetros podem ser usados para demonstrar consistência batelada a batelada ou esta- bilidade de polissacarídeos.
[00149] Em outra concretização, MS de alta massa e HPLC de ex- clusão por tamanho podem ser aplicadas para medir o tamanho dos bioconjugados completos.
[00150] Em outra concretização, um ensaio com antrona-ácido sul- fúrico pode ser usado para medir os rendimentos de polissacarídeos. Veja Leyva A, Quintana A, Sanchez M, Rodriguez EN, Cremata J, Sanchez JC: Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in mi- croplate format to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products: method development and validation. Biologicals: journal of the Interna- tional Association of Biological Standardization 2008, 36(2):134-141. Em outra concretização, um ensaio de metilpentose pode ser usado para medir os rendimentos de polissacarídeos. Veja, por exemplo, Dische et al. J. Biol Chem. Setembro de 1948; 175 (2): 595-603. Alteração no uso do sítio de glicosilação
[00151] Para mostrar que o uso do sítio em uma proteína específica é alterado em um sistema de múltiplos plasmídeos em oposição a um sistema inserido, o uso do sítio de glicosilação deve ser quantificado. Os métodos para preparar isso estão listados abaixo.
[00152] LC-MS/MS de Glicoptídeo: os bioconjugados são digeridos com protease (s) e os peptídeos são separados por um método croma-
tográfico adequado (C18, interação hidrofílica HPLC HILIC, colunas GlycoSepN, SE HPLC, AE HPLC) e os diferentes peptídeos são identi- ficados usando MS/MS. Este método pode ser usado com nossos mé- todos sem redução prévia da cadeia de açúcar por métodos químicos (degradação de smith) ou enzimáticos. A quantificação de picos de glicopeptídeos usando detecção UV em 215 a 280 nm permite a de- terminação relativa do uso do sítio de glicosilação.
[00153] HPLC de exclusão por tamanho: O uso do sítio de glicosila- ção superior é refletido por um tempo de eluição anterior de uma colu- na de SE HPLC. Homogeneidade
[00154] A homogeneidade do bioconjugado (isto é, a homogenei- dade dos resíduos de açúcar ligados) pode ser avaliada usando méto- dos que medem o comprimento do glicano e o raio hidrodinâmico. Métodos Analíticos
[00155] Rendimento. O rendimento de proteína é medido como a quantidade de proteína derivada a partir de um litro de cultura de pro- dução bacteriana cultivada em um biorreator sob condições controla- das e otimizadas. A quantidade de proteína pode ser determinada por ensaios de BC, Lowry ou Bradford. O rendimento do bioconjugado é medido como a quantidade de carboidrato derivada de um litro de cul- tura de produção bacteriana cultivada em um biorreator sob condições controladas e otimizadas. Após a purificação do bioconjugado, os ren- dimentos de carboidratos podem ser medidos diretamente pelo ensaio de antrona ou ELISA usando antissoros específicos para carboidratos. Medições indiretas são possíveis usando a quantidade de proteína (medida pelos ensaios de BCA, Lowry ou Bradford) e o comprimento e a estrutura do glicano para calcular uma quantidade teórica de carboi- dratos por grama de proteína. Além disso, o rendimento também pode ser medido secando a preparação de glicoproteína de um tampão vo-
látil e usando uma balança para medir o peso.
[00156] Formação de agregados: A formação de agregados de alto MW pode ser avaliada por Western blot e, mais quantitativamente, por técnicas cromatográficas, como cromatografia de afinidade por íons de metal imobilizado (IMAC) e cromatografia de exclusão por tamanho. Os agregados são visíveis no Western blot como um esfregaço de alto MW próximo ao topo do gel. Os agregados podem ser visíveis em um perfil de eluição cromatográfica como um pico separado, distinto do pico correspondente à Hla monomérica.
[00157] Rendimento de monômeros: Da mesma forma, o rendimen- to de monômeros (ou monômeros versus agregados) pode ser avalia- do por Western blot ou, mais precisamente, por meio de técnicas cro- matográficas, como IMAC e cromatografia de exclusão por tamanho. A intensidade das bandas correspondentes à Hla monomérica no Wes- tern blot, ou o tamanho do pico correspondente à Hla monomérica no perfil de eluição cromatográfica.
[00158] Homogeneidade. Homogeneidade significa a variabilidade do comprimento do glicano e possivelmente o número de sítios de gli- cosilação. Os métodos listados acima podem ser usados para essa finalidade. A SE-HPLC permite a medição do raio hidrodinâmico. Um número maior de sítios de glicosilação no transportador leva a uma maior variação no raio hidrodinâmico em comparação com um trans- portador com menos sítios de glicosilação. No entanto, quando cadei- as simples de glicano são analisadas, elas podem ser mais homogê- neas devido ao comprimento mais controlado. O comprimento do gli- cano é medido por hidrazinólise, SDS PAGE e CGE. Além disso, ho- mogeneidade também pode significar que certos padrões de uso de sítios de glicosilação mudam para uma faixa mais ampla/mais estreita. Esses fatores podem ser medidos pela LC-MS/MS de glicopeptídeo.
[00159] Estabilidade e reprodutibilidade das cepas. A estabilidade da cepa durante a fermentação bacteriana na ausência de pressão seletiva é medida por métodos diretos e indiretos que confirmam a presença ou ausência do DNA recombinante nas células da cultura de produção. A influência do volume da cultura pode ser simulada por tempos de cultura prolongados, o que significa tempos de geração aumentados. Quanto mais gerações na fermentação, maior a probabi- lidade de perda de um elemento recombinante. A perda de um ele- mento recombinante é considerada instabilidade. Métodos indiretos dependem da associação de cassetes de seleção com DNA recombi- nante, por exemplo, os cassetes de resistência a antibióticos em um plasmídeo. As células de cultura de produção são colocadas em meio seletivo, por exemplo, placas LB suplementadas com antibióticos ou outros produtos químicos relacionados a um sistema de seleção e co- lônias resistentes são consideradas positivas para o DNA recombinan- te associado ao respectivo produto químico de seleção. No caso de um sistema com múltiplos plasmídeos, são contadas colônias resisten- tes a múltiplos antibióticos e a proporção de células contendo todas as três resistências é considerada a população estável. Alternativamente, a PCR quantitativa pode ser usada para medir a quantidade de DNA recombinante dos três elementos recombinantes na presença, ausên- cia de seleção e em diferentes momentos da fermentação. Assim, a quantidade relativa e absoluta de DNA recombinante é medida e com- parada. A reprodutibilidade do processo de produção é medida pela análise completa das bateladas de consistência pelos métodos descri- tos neste pedido. Composições Imunogênicas
[00160] As proteínas Hla modificadas e conjugados (por exemplo, bioconjugado) da invenção são particularmente adequados para inclu- são em composições imunogênicas e vacinas. A presente invenção fornece uma composição imunogênica compreendendo a proteína Hla modificada da invenção, ou o conjugado da invenção, ou o bioconju- gado da invenção.
[00161] Também é fornecido um método para preparar a composi- ção imunogênica da invenção compreendendo a etapa de misturar a proteína Hla modificada ou o conjugado (por exemplo, bioconjugado) da invenção com um excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
[00162] As composições imunogênicas compreendem uma quanti- dade imunologicamente eficaz da proteína Hla modificada ou conjuga- do (por exemplo, bioconjugado) da invenção, bem como quaisquer ou- tros componentes. Por “quantidade imunologicamente eficaz”, enten- de-se que a administração dessa quantidade a um indivíduo, em dose única ou como parte de uma série, é eficaz para tratamento ou pre- venção. Essa quantidade varia de acordo com a saúde e condição físi- ca do indivíduo a ser tratado, idade, grau de proteção desejado, a for- mulação da vacina e outros fatores relevantes. Espera-se que a quan- tidade caia em uma faixa relativamente ampla que possa ser determi- nada por meio de ensaios de rotina.
[00163] Composições imunogênicas se a invenção também puder conter diluentes como água, solução salina, glicerol etc. Além disso, substâncias auxiliares, como agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias tampão de pH, polióis e similares podem estar presentes.
[00164] As composições imunogênicas compreendendo a proteína Hla modificada da invenção ou conjugados (ou bioconjugados) podem compreender quaisquer componentes adicionais adequados para uso na administração farmacêutica. Em concretizações específicas, as composições imunogênicas da invenção são formulações monovalen- tes. Em outras concretizações, as composições imunogênicas da in- venção são formulações multivalentes, por exemplo, formulações biva- lentes, trivalentes e tetravalentes. Por exemplo, uma formulação multi-
valente compreende mais de um antígeno, por exemplo, mais de um conjugado.
[00165] A composição imunogênica da invenção opcionalmente também compreende antígenos adicionais. Exemplos de tais antíge- nos adicionais são proteínas de S aureus ou polissacarídeos capsula- res. Vacinas
[00166] A presente invenção também fornece uma vacina compre- endendo uma composição imunogênica da invenção e um excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
[00167] Excipientes e veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser selecionados por aqueles versados na técnica. Por exem- plo, o excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável pode incluir um tampão, como Tris (trimetamina), fosfato (por exemplo, fos- fato de sódio), acetato, borato (por exemplo, borato de sódio), citrato, glicina, histidina e succinato (por exemplo, succinato de sódio), ade- quadamente cloreto de sódio, histidina, fosfato de sódio ou succinato de sódio. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode incluir um sal, por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de potássio ou cloreto de magnésio. Opcionalmente, o excipiente farmaceuticamente aceitável contém pelo menos um componente que estabiliza a solubilidade e/ou estabilidade. Exemplos de agentes solubilizantes/estabilizantes inclu- em detergentes, por exemplo, laurel sarcosina e/ou polissorbato (por exemplo, TWEEN™ 80). Exemplos de agentes estabilizantes também incluem poloxâmero (por exemplo, poloxâmero 124, poloxâmero 188, poloxâmero 237, poloxâmero 338 e poloxâmero 407). O excipiente farmaceuticamente aceitável pode incluir um tensoativo não iônico, por exemplo, ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitano, Polis- sorbato-80 (TWEEN™ 80), Polissorbato-60 (TWEEN™ 60), Polissor- bato-40 (TWEEN™ 40) e Polissorbato-20 (TWEEN™ 20) ou alquil éte-
res de polioxietileno (adequadamente polissorbato-80). Agentes solubi- lizantes/estabilizantes alternativos incluem arginina e polióis formado- res de vidro (como sacarose, trealose e similares). O excipiente farma- ceuticamente pode ser um conservante, por exemplo, fenol, 2- fenoxietanol ou tiomersal. Outros excipientes farmaceuticamente acei- táveis incluem açúcares (por exemplo, lactose, sacarose) e proteínas (por exemplo, gelatina e albumina). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem água, soluções salinas, soluções aquosas de dex- trose e glicerol. Inúmeros excipientes e veículos farmaceuticamente aceitáveis são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co. Easton, PA, 5ª Edição (975).
[00168] Em uma concretização, a composição imunogênica ou de vacina da invenção compreende adicionalmente um ou mais tampões, por exemplo, tampão de fosfato e/ou tampão de sacarose fosfato glu- tamato. Em outras concretizações, a composição imunogênica ou de vacina da invenção não compreende um tampão.
[00169] Em uma concretização, a composição imunogênica ou de vacina da invenção compreende adicionalmente um ou mais sais, por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, fosfato de sódio, glutama- to monossódico e sais de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumí- nio, fosfato de alumínio, alúmen (aluminossulfato de potássio) ou uma mistura de tais sais de alumínio). Em outras concretizações, a compo- sição imunogênica ou de vacina da invenção não compreende um sal.
[00170] A composição imunogênica ou de vacina da invenção pode adicionalmente compreender um conservante, por exemplo, um deri- vado de mercúrio timerosal. Em uma concretização específica, a com- posição imunogênica ou de vacina da invenção compreende 0,001% a 0,01% de timerosal. Em outras concretizações, a composição imuno- gênica ou de vacina da invenção não compreende um conservante.
[00171] A composição imunogênica ou de vacina da invenção tam- bém pode compreender um antimicrobiano, tipicamente quando emba- lado em formato de dose múltipla. Por exemplo, a composição imuno- gênica ou de vacina da invenção pode compreender 2-fenoxietanol.
[00172] A composição imunogênica ou de vacina da invenção tam- bém pode compreender um detergente, por exemplo, polissorbato, como TWEEN™ 80. Os detergentes estão geralmente presentes em níveis baixos, por exemplo, <0,01%, porém, níveis mais altos foram sugeridos para estabilizar as formulações do antígeno, por exemplo, até 10%.
[00173] As composições imunogênicas da invenção podem ser in- cluídas em um recipiente, embalagem ou distribuidor juntamente com instruções para administração.
[00174] As composições imunogênicas ou de vacinas da invenção podem ser armazenadas antes do uso, por exemplo, as composições podem ser armazenadas congeladas (por exemplo, a cerca de -20°C ou a cerca de -70°C); armazenadas em condições refrigeradas (por exemplo, a cerca de 4°C); ou armazenadas em temperatura ambiente.
[00175] As composições imunogênicas ou de vacinas da invenção podem ser armazenadas em solução ou liofilizadas. Em uma concreti- zação, a solução é liofilizada na presença de um açúcar, como saca- rose, trealose ou lactose. Em outra concretização, as vacinas da in- venção são liofilizadas e reconstituídas extemporaneamente antes do uso.
[00176] A preparação da vacina é geralmente descrita em Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). O encapsulamento dentro dos lipossomas é descrito por Fullerton, Patente Norte Ameri- cana 4.235.877. Adjuvantes
[00177] Em uma concretização, as composições imunogênicas ou de vacinas da invenção compreendem, ou são administradas em com- binação com, um adjuvante. O adjuvante para administração em com- binação com uma composição imunogênica ou de vacina da invenção pode ser administrado antes, concomitantemente ou após a adminis- tração da referida composição imunogênica ou de vacina. Em algumas concretizações, o termo "adjuvante" refere-se a um composto que quando administrado em conjunto com ou como parte de uma compo- sição imunogênica da vacina da invenção aumenta, realça e/ou reforça a resposta imune a um bioconjugado, porém, quando o composto é administrado isoladamente não gera uma resposta imune à proteína Hla/conjugado/bioconjugado modificados. Em algumas concretizações, o adjuvante gera uma resposta imune à proteína Hla, conjugado ou bioconjugado modificada e não produz uma alergia ou outra reação adversa.
[00178] Em uma concretização, a composição imunogênica ou de vacina da invenção é com adjuvante. Os adjuvantes podem realçar uma resposta imune por vários mecanismos, incluindo, por exemplo, recrutamento de linfócitos, estimulação de células B e/ou T e estimula- ção de macrófagos. Exemplos específicos de adjuvantes incluem, po- rém, não estão limitados a, sais de alumínio (alúmen) (como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e sulfato de alumínio), monofosforil lipídeo A (MPL) 3 De-O-acilado (veja, Patente do Reino Unido GB2220211), MF59 (Novartis), AS01 (GlaxoSmithKline), AS03 (Gla- xoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polissorbato 80 (TWEEN™ 80; ICL Americas, Inc.), compostos de imidazopiridina (veja, Pedido Internacional No. PCT/US2007/064857, publicado como Publicação Internacional No. WO2007/109812), compostos de imidazoquinoxalina (veja, Pedido Internacional No. PCT/US2007/064858, publicado como Publicação Internacional No. WO2007/109813) e saponinas, como
QS21 (veja, Kensil et al. em Vaccine Design: The Subunit and Adju- vant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); Pa- tente Norte-Americana No. 5.057.540). Em algumas concretizações, o adjuvante é o adjuvante de Freund (completo ou incompleto). Outros adjuvantes são emulsões de óleo em água (como esqualeno ou óleo de amendoim), opcionalmente em combinação com estimulantes imu- nes, como monofosforil lipídeo A (veja, Stoute et at. N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Outro adjuvante é CpG (Bioworld Today, Nov. 15, 1998).
[00179] Em um aspecto da invenção, o adjuvante é um sal de alu- mínio, tal como gel de hidróxido de alumínio (alúmen) ou fosfato de alumínio.
[00180] Em outro aspecto da invenção, o adjuvante é selecionado para ser um indutor preferencial de um tipo de resposta TH1 ou TH2. Altos níveis de citocinas do tipo Th1 tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por células a um determinado antígeno, enquanto altos níveis de citocinas do tipo Th2 tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais ao antígeno. É importante lembrar que a distinção da resposta imune do tipo Th1 e Th2 não é absoluta. Na realidade, um indivíduo apoiará uma resposta imune que é descrita como sendo predominantemente Th1 ou predominantemen- te Th2. No entanto, muitas vezes é conveniente considerar as famílias de citocinas em termos daquelas descritas em clones de células T CD4 +ve de murino por Mosmann e Coffman (Mosmann, TR e Co- ffman, RL (1989) TH1 and TH2 cells: different patters of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173). Tradicionalmente, as respostas do tipo Th1 estão associadas à produção das citocinas INF- e IL-2 por linfócitos T. Outras citocinas frequentemente diretamente associadas à indução de respostas imunes do tipo Th1 não são produzidas por células T, como a IL-12. Em contraste, as respostas do tipo Th2 estão associadas à secreção de II-4, IL-5, IL-6, IL-10. Sistemas adjuvantes adequados que promovem uma resposta predominantemente Th1 incluem: Monofosfo- ril lipídeo A ou um seu derivado, particularmente monofosforil lipídio A 3-de-O-acilado (3D-MPL) (para sua preparação, veja, GB 2220211 A); MPL, por exemplo, 3D-MPL e a saponina QS21 em um lipossoma, por exemplo, um lipossoma compreendendo colesterol e DPOC; e uma combinação de monofosforil lipídeo A, por exemplo, monofosforil lipí- deo A 3-de-O-acilado, juntamente com um sal de alumínio (por exem- plo, fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio) ou uma emulsão de óleo em água. Em tais combinações, o antígeno e 3D-MPL estão con- tidos nas mesmas estruturas particuladas, permitindo a liberação mais eficiente de sinais antigênicos e imunoestimuladores. Estudos de- monstraram que o 3D-MPL é capaz de realçar ainda mais a imunoge- nicidade de um antígeno absorvido em alúmen [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1]. Oligonucleotídeos contendo CpG não metilados (WO 96/02555) também são indutores preferenciais de uma resposta TH1 e são adequados para o uso na presente invenção.
[00181] A composição imunogênica ou de vacina da invenção pode conter uma emulsão de óleo em água, uma vez que foi sugerido que elas são úteis como composições adjuvantes (EP 399843; WO 95/17210). Emulsões de óleo em água, como as descritas em WO95/17210 (que descreve emulsões de óleo em água compreen- dendo de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de alfa tocoferol e de 0,3 a 3% de tween 80 e seu uso isolado ou em combinação com QS21 e/ou 3D-MPL), WO99/12565 (que descreve composições de emulsão de óleo em água compreendendo um óleo metabolizável, uma saponi- na e um esterol e MPL) ou WO99/11241 podem ser usadas. Outras emulsões de óleo em água, como as descritas em WO 09/127676 e WO 09/127677 também são adequadas. Em uma concretização espe-
cífica, a composição imunogênica ou de vacina adicionalmente com- preende uma saponina, por exemplo, QS21. A composição imunogê- nica ou de vacina também pode compreender uma emulsão de óleo em água e tocoferol (WO 95/17210). Modo de Administração
[00182] As composições imunogênicas ou de vacinas da invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero suscetível à infecção, por meio da administração da referida composição imunogê- nica ou de vacina por rotina sistêmica ou mucosa. Essas administra- ções podem incluir injeção pelas vias intramuscular (IM), intraperitone- al, intradérmica (ID) ou subcutânea; ou via administração da mucosa aos tratos oral/alimentar, respiratório, geniturinário. Por exemplo, a administração intranasal (IN) pode ser usada para o tratamento de pneumonia ou otite média (como o transporte nasofaríngeo de pneu- mococos pode ser mais eficazmente prevenido, assim atenuando a infecção em seu estágio inicial). Embora a composição imunogênica ou de vacina da invenção possa ser administrada em dose única, seus componentes também podem ser coadministrados juntamente ao mesmo tempo ou em momentos diferentes (por exemplo, polissacarí- deos pneumocócicos podem ser administrados separadamente, ao mesmo tempo ou 1 -2 semanas após a administração de qualquer componente de proteína bacteriana da vacina para uma coordenação ideal das respostas imunes entre si). Para a coadministração, o adju- vante Th1 opcional pode estar presente em qualquer uma ou em todas as diferentes administrações, no entanto, em um aspecto particular da invenção, está presente em combinação com o componente da proteí- na Hla modificada da composição imunogênica ou de vacina. Além de uma única rotina de administração, 2 rotinas administração diferentes podem ser usadas. Por exemplo, os polissacarídeos podem ser admi- nistrados IM (ou ID) e proteínas bacterianas podem ser administradas
IN (ou ID). Além disso, as vacinas da invenção podem ser administra- das IM para doses iniciais e IN para doses de reforço.
[00183] Em um aspecto, a composição imunogênica ou de vacina da invenção é administrada pela rotina de liberação intramuscular. A administração intramuscular pode ser na coxa ou no braço. A injeção é tipicamente através de uma agulha (por exemplo, uma agulha hipo- dérmica), porém, a injeção sem agulha pode ser usada como alternati- va. Uma dose intramuscular típica é de 0,5 ml.
[00184] Em outro aspecto, a composição imunogênica ou de vacina da invenção é administrada pela administração intradérmica. A pele humana compreende uma cutícula "córnea" externa, chamada estrato córneo, que se sobrepõe à epiderme. Debaixo desta epiderme está uma camada chamada derme, que por sua vez se sobrepõe ao tecido subcutâneo. A técnica convencional de injeção intradérmica, o "proce- dimento mantoux", compreende as etapas de limpeza da pele, e em seguida o esticamento com uma mão, e o chanfro de uma agulha de calibre estreito (calibre 26 a 31) voltada para cima, a agulha é inserida em um ângulo entre 10 e 15°. Uma vez que o chanfro da agulha é in- serido, o corpo (“barrel”) da agulha é abaixado e de novo avançado, proporcionando uma leve pressão para elevá-lo sob a pele. O líquido é, então, injetado muito lentamente, formando assim uma bolha ou in- chaço na superfície da pele, seguido pela retirada lenta da agulha.
[00185] Mais recentemente, dispositivos que são especificamente projetados para administrar os agentes líquidos na pele ou através da pele foram descritos, por exemplo, os dispositivos descritos em WO 99/34850 e EP 1092444, também os dispositivos de injeção a jato descritos, por exemplo, em WO 01/13977; US 5.480.381, US
5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US
5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520.639,
US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940.460, WO 97/37705 e WO 97/13537. Métodos alternativos de administração in- tradérmica das preparações de vacina podem incluir seringas e agu- lhas convencionais, ou dispositivos projetados para liberação balística de vacinas sólidas (WO 99/27961) ou emplastros transdérmicos (WO 97/48440; WO 98/28037); ou aplicado à superfície da pele (liberação transdérmica ou transcutânea WO 98/20734; WO 98/28037).
[00186] Em outro aspecto, a composição imunogênica ou de vacina da invenção é administrada pela administração intranasal. Tipicamen- te, a composição imunogênica ou de vacina é administrada localmente na área nasofaríngea, por exemplo, sem ser inalado nos pulmões. É desejável usar um dispositivo de liberação intranasal que libera a composição imunogênica ou a formulação de vacina para a área naso- faríngea, sem ou substancialmente sem que ele entre nos pulmões. Dispositivos adequados para administração intranasal das vacinas de acordo com a invenção são dispositivos de spray. Os dispositivos de spray nasal adequados comercialmente disponíveis incluem ACCUS- PRAY™ (Becton Dickinson).
[00187] Em uma concretização, dispositivos de spray para uso in- tranasal são dispositivos para os quais o desempenho do dispositivo não depende da pressão aplicada pelo usuário. Esses dispositivos são conhecidos como dispositivos de limiar de pressão. O líquido é libera- do do bico somente quando uma pressão limiar é aplicada. Esses dis- positivos facilitam a obtenção de um spray com um tamanho de gota regular. Os dispositivos limiares de pressão adequados para uso com a presente invenção são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em WO91/13281 e EP311 863 e EP516636, aqui incorpora- dos por referência. Tais dispositivos estão disponíveis comercialmente de Pfeiffer GmbH e também são descritos em Bommer, R. Pharmaceu- tical Technology Europe, Sept 1999.
[00188] Em outra concretização, os dispositivos intranasais produ- zem gotículas (medidas usando água como líquido) na faixa de 1 a 200 µm, por exemplo, 10 a 120 µm. Abaixo de 10 µm, existe o risco de inalação; portanto, é desejável que não haja mais do que 5 % das go- tículas abaixo de 10 µm. As gotículas acima de 120 µm não se espa- lham tão bem quanto gotículas menores; portanto, é desejável que não haja mais do que cerca de 5 % das gotículas superiores a 120 µm.
[00189] Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço espaçadas adequadamente.
[00190] A composição imunogênica ou de vacina da presente in- venção pode ser usada para proteger ou tratar um mamífero, por exemplo, humano, suscetível à infecção, por meio da administração da referida composição imunogênica ou de vacina por uma rotina sistêmi- ca ou mucosal. Essas administrações podem incluir injeção pelas roti- nas intramuscular (IM), intraperitoneal (IP), intradérmica (ID) ou subcu- tânea (SC); ou pela administração mucosal aos tratos oral/alimentar, respiratório, geniturinário. Embora a vacina da invenção possa ser administrada em dose única, seus componentes também podem ser coadministrados juntos ao mesmo tempo ou em momentos diferentes (por exemplo, conjugados de sacarídeo pneumocócico podem ser ad- ministrados separadamente, ao mesmo tempo ou 1-2 semanas após a administração de qualquer proteína Hla modificada, conjugado ou bio- conjugado da invenção para uma coordenação ideal das respostas imunes entre si). Para a coadministração, o adjuvante opcional pode estar presente em qualquer uma ou em todas as diferentes adminis- trações. Além de uma única rotina de administração, 2 rotinas adminis- tração diferentes podem ser usadas. Por exemplo, os conjugados de polissacarídeos podem ser administrados IM (ou ID) e a proteína Hla modificada, conjugado ou bioconjugado da invenção pode ser adminis- trada IN (ou ID). Além disso, as composições imunogênicas ou de va-
cinas da invenção podem ser administradas IM para doses iniciais e IN para doses de reforço. Dosagem
[00191] A quantidade de antígeno conjugado em cada composição imunogênica ou dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos colaterais adver- sos significativos em vacinas típicas. Essa quantidade variará depen- dendo de qual imunogênio específico é empregado e como é apresen- tado. O teor da proteína Hla modificada estará tipicamente na faixa de 1-100 µg, adequadamente de 5-50 µg. O teor de sacarídeo estará tipi- camente na faixa de 0,1-10 µg, adequadamente 1-5 µg.
[00192] Uma dose que está em um volume adequado para uso hu- mano está geralmente entre 0,25 e 1,5 ml, embora, para administração na pele, um volume mais baixo entre 0,05 ml e 0,2 ml possa ser usa- do. Em uma concretização, uma dose humana é de 0,5 ml. Em uma outra concretização, uma dose humana é superior a 0,5 ml, por exem- plo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 ml. Em uma outra concretização, uma dose humana está entre 1 ml e 1,5 ml. Em outra concretização, em particu- lar quando a composição imunogênica é para a população pediátrica, uma dose humana pode ser menor que 0,5 ml, como entre 0,25 e 0,5 ml. Usos Profiláticos e Terapêuticos
[00193] A presente invenção também fornece métodos de tratamen- to e/ou prevenção de infecções bacterianas de um indivíduo, compre- endendo a administração ao indivíduo de uma proteína Hla modifica- da, conjugado ou bioconjugado da invenção. A proteína Hla modifica- da, conjugado ou bioconjugado pode estar na forma de uma composi- ção imunogênica ou de vacina. Em uma concretização específica, a composição imunogênica ou de vacina da invenção é usada na pre- venção da infecção de um indivíduo (por exemplo, seres humanos) por uma bactéria. As infecções bacterianas que podem ser tratadas e/ou prevenidas usando a proteína Hla modificada, conjugado ou bioconju- gado da invenção incluem aquelas causadas por espécies Staphylo- coccus, espécies Escherichia, espécies Shigella, espécies Klebsiella, espécies Xhantomonas, espécies Salmonella, espécies Yersinia, es- pécies Aeromonas, espécies Francisella, espécies Helicobacter, espé- cies Proteus, espécies Lactococcus, espécies Lactobacillus, espécies Pseudomonas, espécies Corynebacterium, espécies Streptomyces, espécies Streptococcus, espécies Enterococcus, espécies Bacillus, espécies Clostridium, espécies Listeria ou espécies Campylobacter. Em uma concretização específica, a composição imunogênica ou de vacina da invenção é usada para tratar ou prevenir uma infecção por espécies Staphylococcus (por exemplo, Staphylococcus aureus).
[00194] Também são aqui fornecidos métodos para induzir uma resposta imune em um indivíduo contra uma bactéria, compreendendo a administração ao indivíduo de uma proteína Hla modificada ou de um conjugado ou bioconjugado da invenção (ou composição imunogê- nica ou de vacina). Em uma concretização, o referido indivíduo tem infecção bacteriana no momento da administração. Em outra concreti- zação, o referido indivíduo não tem uma infecção bacteriana no mo- mento da administração. A proteína Hla modificada, conjugado ou bio- conjugado da invenção pode ser usada para induzir uma resposta imune contra espécies Staphylococcus, espécies Escherichia, espé- cies Shigella, espécies Klebsiella, espécies Xhantomonas, espécies Salmonella, espécies Yersinia, espécies Aeromonas, espécies Franci- sella, espécies Helicobacter, espécies Proteus, espécies Lactococcus, espécies Lactobacillus, espécies Pseudomonas, espécies Corynebac- terium, espécies Streptomyces, espécies Streptococcus, espécies En- terococcus, espécies Bacillus, espécies Clostridium, espécies Listeria ou espécies Campylobacter. Em uma concretização específica, a pro-
teína Hla modificada, ou conjugado ou bioconjugado da invenção é usada para induzir uma resposta imune contra espécies Staphylococ- cus (por exemplo, Staphylococcus aureus).
[00195] Também são aqui fornecidos métodos para induzir a produ- ção de anticorpos opsonofagocíticos em um indivíduo contra uma bac- téria, compreendendo a administração ao indivíduo de uma proteína Hla modificada ou conjugado ou bioconjugado da invenção (ou com- posição imunogênica ou de vacina). Em uma concretização, o referido indivíduo tem infecção bacteriana no momento da administração. Em outra concretização, o referido indivíduo não tem uma infecção bacte- riana no momento da administração. A proteína Hla modificada, ou conjugado ou bioconjugado da invenção (ou composição imunogênica ou de vacina) aqui fornecida pode ser usada para induzir a produção de anticorpos opsonofagocitários contra espécies Staphylococcus, es- pécies Escherichia, espécies Escherichia, espécies Shigella, espécies Klebsiella, espécies Xhantomonas, espécies Salmonella, espécies Yersinia, espécies Aeromonas, espécies Francisella, espécies Helico- bacter, espécies Proteus, espécies Lactococcus, espécies Lactobaci- llus, espécies Pseudomonas, espécies Corynebacterium, espécies Streptomyces, espécies Streptococcus, espécies Enterococcus, espé- cies Bacillus, espécies Clostridium, espécies Listeria ou Campylobac- ter. Em uma concretização específica, uma proteína Hla modificada, ou conjugado ou bioconjugado da invenção (ou composição imunogê- nica ou de vacina) é usada para induzir a produção de anticorpos op- sonofagocitários contra espécies Staphylococcus (por exemplo, Sta- phylococcus aureus).
[00196] Por exemplo, a composição imunogênica ou de vacina da invenção pode ser usada para prevenir a infecção por S. aureus, inclu- indo uma infecção nosocomial. Mais particularmente, o indivíduo pode ser protegido contra uma infecção na pele, pneumonia, meningite, en-
docardite por osteomielite, síndrome do choque tóxico e/ou septicemia. A invenção também é útil para proteger contra a infecção por S. au- reus dos ossos e articulações de um indivíduo (e, portanto, para pre- venir distúrbios, incluindo, porém, não limitados a, osteomielite, artrite séptica e infecção da articulação protética). Em muitos casos, esses distúrbios podem estar associados à formação de um biofilme de S. aureus.
[00197] S. aureus infecta vários mamíferos (incluindo vacas, cães, cavalos e porcos), porém, o mamífero preferido para uso com a inven- ção é um ser humano. O humano pode ser uma criança (por exemplo, um bebê ou criança), um adolescente ou um adulto. Em algumas con- cretizações, o humano pode ter um osso ou articulação protética, ou pode ser um paciente aguardando cirurgia eletiva, em particular um receptor pretendido de um osso ou articulação protético (por exemplo, um paciente de cirurgia ortopédica pré-operatória). As vacinas não são adequadas apenas para esses grupos, no entanto, e podem ser usa- das mais geralmente em uma população humana.
[00198] As preparações de vacina da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um ser humano suscetível à infecção por S. aureus, por meio da administração da referida vacina pela rotina sistêmica ou mucosal. Essas administrações podem incluir injeção pe- las rotinas intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou pela administração mucosal aos tratos oral/alimentar, respiratório, geniturinário.
[00199] Em uma concretização, a presente invenção é um método melhorado para obter uma resposta imune em bebês (definida como 0- 2 anos de idade no contexto da presente invenção), administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imuno- gênica ou de vacina da invenção (uma vacina pediátrica). Em uma concretização, a vacina é uma vacina pediátrica.
[00200] Em uma concretização, a presente invenção é um método melhorado para obter uma resposta imune na população idosa (no contexto da presente invenção, um paciente é considerado idoso se tiver 50 anos ou mais de idade, tipicamente acima de 55 anos e mais geralmente mais de 60 anos) administrando uma quantidade terapeu- ticamente eficaz da composição imunogênica ou de vacina da inven- ção. Em uma concretização, a vacina é uma vacina para os idosos.
[00201] A presente invenção fornece um método para o tratamento ou prevenção da infecção por Staphylococcus aureus em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao referido indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína Hla modificada da invenção, ou o conjugado da invenção, ou o bioconju- gado da invenção, ou a composição imunogênica ou de vacina da in- venção.
[00202] A presente invenção fornece um método de imunizar um hospedeiro humano contra a infecção por Staphylococcus aureus, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma dose imuno- protetora da proteína Hla modificada da invenção, ou o conjugado da invenção, ou o bioconjugado da invenção, ou a composição imunogê- nica ou de vacina da invenção.
[00203] A presente invenção fornece um método de induzir uma resposta imune a Staphylococcus aureus em um indivíduo, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente ou pro- filaticamente eficaz da proteína Hla modificada da invenção, ou o con- jugado da invenção, ou o bioconjugado da invenção ou a composição imunogênica ou de vacina da invenção.
[00204] A presente invenção fornece uma proteína Hla modificada da invenção, ou o conjugado da invenção, ou o bioconjugado da in- venção, ou a composição imunogênica ou de vacina da invenção para uso no tratamento ou prevenção de uma doença causada pela infec-
ção por Staphylococcus aureus.
[00205] A presente invenção fornece o uso da proteína Hla modifi- cada da invenção, ou o conjugado da invenção, ou o bioconjugado da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou pre- venção de uma doença causada pela infecção por Staphylococcus au- reus.
[00206] A doença causada pela infecção por S aureus pode ser, por exemplo, infecção cutânea, pneumonia, meningite, infecção por S. au- reus nos ossos e articulações de um indivíduo (por exemplo, artrite séptica, infecção protética nas articulações ou osteomielite) endocardi- te, síndrome do choque tóxico e/ou septicemia. A doença pode ser uma infecção nosocomial.
[00207] Todas as referências ou pedidos de patente citados nesta especificação de patente são incorporados por referência aqui.
[00208] Aspectos da invenção estão resumidos nos seguintes pará- grafos numerados:
1. Uma proteína Hla modificada tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO. 1, modificada em que a sequência de aminoácidos com- preende substituições de aminoácidos nas posições H48 e G122 de SEQ ID NO. 1 ou em posições equivalentes dentro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO. 1, em que as referidas substitui- ções são respectivamente H a C e G a C.
2. Uma proteína Hla modificada de acordo com o parágrafo 1, também modificada em que a sequência de aminoácidos compre- ende uma substituição de aminoácidos na posição H35 de SEQ ID NO. 1 ou em uma posição equivalente dentro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%
ou 99% idêntica à SEQ ID NO. 1.
3. Uma proteína Hla modificada de acordo com o parágrafo 2, em que a referida substituição de aminoácidos na posição H35 é de H a L.
4. Proteína Hla modificada, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3, também modificada em que a sequência de aminoá- cidos compreende uma ou mais sequências de consenso seleciona- da(s) de: D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12), em que X e Z são independentemente qualquer aminoáci- do além da prolina.
5. Uma proteína Hla modificada do parágrafo 4, em que um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1-7 aminoácidos, por exemplo, um aminoácido) da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1 foi(foram) substi- tuídos por uma sequência de consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12).
6. A proteína Hla modificada de qualquer um dos parágra- fos 1-5, em que uma sequência de consenso selecionada de D/E-X-N- Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) foi adi- cionada a, ou substituída por um ou mais aminoácidos selecionado(s) de K131, S203, S239 e K273 de SEQ ID NO. 1 ou em uma posição equivalente dentro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1
7. A proteína Hla modificada do parágrafo 6, em que uma sequência de consenso selecionada de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) foi adicionada a, ou substi- tuída pelo aminoácido K131 de SEQ ID NO. 1 ou em uma posição equivalente dentro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80
%, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1.
8. A proteína Hla modificada do parágrafo 7, em que uma sequência de consenso selecionada de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) foi substituída pelo aminoá- cido K131 de SEQ ID NO. 1 ou em uma posição equivalente dentro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1.
9. A proteína Hla modificada de qualquer um dos parágra- fos 4 a 8, em que o referido X é Q (glutamina) e Z é R (arginina) (por exemplo, K-D-Q-N-R-T-K (SEQ ID NO: 23)).
10. A proteína Hla modificada, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 9, que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica à sequência de SEQ ID NO. 3.
11. A proteína Hla modificada de qualquer um dos parágra- fos 1-10, em que a sequência de aminoácidos também compreende um marcador peptídico que é útil para a purificação da proteína Hla, em que o referido marcador peptídico compreende opcionalmente seis resíduos de histidina ou uma repetição HR (por exemplo, HRHR (SEQ ID NO: 25) e opcionalmente o referido marcador peptídico está locali- zado no C-terminal da sequência de aminoácidos.
12. A proteína Hla modificada do parágrafo 11, em que o marcador peptídico compreende adicionalmente um ou dois aminoáci- dos iniciais no N-terminal, por exemplo, GS (SEQ ID NO: 26).
13. A proteína Hla modificada ou parágrafo 12, que tem a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 5, 6, 9 ou 10 ou uma sequência pelo menos 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica a qualquer uma de SEQ ID NO: 5, 6, 9 ou 10.
14. A proteína Hla modificada, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-13, em que a sequência de aminoácidos também compreende uma sequência sinal que é capaz de direcionar a proteína Hla para o periplasma de uma célula hospedeira (por exemplo, bacté- ria), sendo opcionalmente a referida sequência sinal selecionada a partir de SEQ ID NO. 13-21, opcionalmente a referida sequência es- tando no N-terminal da proteína.
15. A proteína Hla modificada do parágrafo 11, em que a proteína compreende um ou dois aminoácidos adicionais (por exem- plo, S) entre a sequência sinal e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 1 ou a sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1, em que opcionalmente a referida proteína Hla tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica à SEQ ID NO. 5 ou SEQ ID NO. 9.
16. A proteína Hla modificada, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-13, em que a proteína compreende um ou dois ami- noácidos adicionais (por exemplo, S) no N-terminal.
17. A proteína Hla modificada do parágrafo 16, em que a referida proteína Hla tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica a SEQ ID NO. 6 ou SEQ ID NO. 10)
18. A proteína Hla modificada de qualquer um dos parágra- fos 1-17, em que a proteína Hla modificada é glicosilada.
19. Um conjugado compreendendo uma proteína Hla modi- ficada de qualquer um dos parágrafos 1-18, em que a proteína Hla modificada está ligada a um antígeno, por exemplo, um antígeno de polissacarídeo ou oligossacarídeo.
20. O conjugado, de acordo com o parágrafo 19, caracteri- zado pelo fato de que a proteína Hla modificada é covalentemente li- gada ao referido antígeno através de uma ligação química obtida usando um método de conjugação química, opcionalmente seleciona- do a partir do grupo que consiste em química de carbodiimida, amina- ção redutiva, química de cianilação (por exemplo, química de CDAP), química da maleimida, química da hidrazida, química do éster e quími- ca da N-hidroxissuccinimida, diretamente ou por meio de um ligante.
21. Um conjugado de acordo com o parágrafo 19, que é um bioconjugado.
22. O conjugado (por exemplo, bioconjugado) de qualquer um dos parágrafos 19 a 21, em que o antígeno está ligado a um ami- noácido na proteína Hla modificada selecionada dentre asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, cisteína, tirosina, histidina, ar- ginina ou triptofano (por exemplo, asparagina).
23. O conjugado (por exemplo, bioconjugado) de qualquer um dos parágrafos 15 a 17, em que o antígeno é um sacarídeo, opcio- nalmente um sacarídeo capsular bacteriano (por exemplo, de Sta- phylococcus aureus) opcionalmente selecionado a partir de um sacarí- deo capsular sorotipo 5 ou 8 de S. aureus.
24. O conjugado (por exemplo, bioconjugado) do parágrafo 23, em que o antígeno é um sacarídeo capsular sorotipo 5 de Sta- phylococcus aureus.
25. Um polinucleotídeo que codifica a proteína Hla modifi- cada de qualquer um dos parágrafos 1-17.
26. Um vetor compreendendo o polinucleotídeo do parágra- fo 25.
27. Uma célula hospedeira compreendendo: i) um ou mais ácidos nucleicos que codificam glicosiltrans- ferase(s);
ii) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transfe- rase; iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína Hla modifi- cada de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-17; e opcionalmen- te iv) um ácido nucleico que codifica uma polimerase (por exemplo, wzy).
28. A célula hospedeira do parágrafo 27, em que a referida célula hospedeira compreende (a) uma glicosiltransferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em pirofosfato de undeca- prenila (Und-PP) e (b) uma ou mais glicosiltransferases capazes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossacarídeo hexose montado em Und-PP.
29. A célula hospedeira do parágrafo 28, em que a re- ferida glicosiltransferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em Und-PP é heteróloga à célula hospedeira e/ou heteróloga a um ou mais dos gene(s) que codifica(m) glicosiltransferase(s) opcio- nalmente em que a referida glicosiltransferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em Und-PP é das espécies Escherichia, espécies Shigella, espécies Klebsiella, espécies Xhantomonas, espé- cies Salmonella, espécies Yersinia, espécies Aeromonas, espécies Francisella, espécies Helicobacter, espécies Proteus, espécies Lacto- coccus, espécies Lactobacillus, espécies Pseudomonas, espécies Corynebacterium, espécies Streptomyces, espécies Streptococcus, espécies Enterococcus, espécies Staphylococcus, espécies Bacillus, espécies Clostridium, espécies Listeria ou espécies Campylobacter, opcionalmente wecA (por exemplo, wecA de E. coli).
30. A célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 27- 29, em que o referido derivado de monossacarídeo hexose é qualquer monossacarídeo em que a posição C-2 é modificada com um grupo acetamido, como N-acetilglicosamina (GlcNAc), N- acetilgalactoseamina (GalNAc), 2,4-Diacetamido-2,4,6-tridesóxi- hexose (DATDH), N-acetilfucoseamina (FucNAc) ou N- acetilquinovosamina (QuiNAc).
31. A célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 27- 30, em que a(s) referida(s) uma ou mais glicosiltransferase(s) ca- paz(es) de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossaca- rídeo hexose montado em Und-PP é(são) a galactofuranosiltransfera- se (wbeY) de E. coli O28 ou a galactofuranosiltransferase (wfdK) de E. coli O167 ou são a galactofuranosiltransferase (wbeY) de E. coli O28 e a galactofuranosiltransferase (wfdK) de E. coli O167.
32. A célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 27- 31, em que a célula hospedeira compreende glicosiltransferases sufi- cientes para a síntese de unidades de repetição do sacarídeo de S. aureus CP5 compreendendo capH, capl, capJ e/ou capK de S. aureus CP5 e opcionalmente capD, capE, capF, capG, capL, capM, capN, ca- pO e/ou capP de S. aureus CP5.
33. A célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 27- 31, em que a célula hospedeira compreende glicosiltransferases sufi- cientes para a síntese de unidades de repetição do sacarídeo de S. aureus CP5 compreendendo capH, capl, capJ e/ou capK de S. aureus CP5 e, opcionalmente, wbjB, wbjC, wbjD, wbjE, wbjF, wbjL, wbpM, wzz e/ou wzx de P. aeruginosa O11 e wecB e/ou wecC de E. coli O16.
34. A célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 27- 33, em que a oligossacaril transferase é derivada de Campylobacter jejuni, opcionalmente em que a referida oligossacaril transferase é PglB de C. jejuni, opcionalmente em que o gene PglB de C. jejuni é integrado no genoma da célula hospedeira e opcionalmente em que pelo menos um gene da célula hospedeira foi funcionalmente inativado ou deletado, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi funcionalmente inativado ou deletado, opcionalmente em que o ge- ne waaL da célula hospedeira foi substituído por um ácido nucleico que codifica uma oligossacariltransferase, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi substituído por C. jejuni pgIB.
35. A célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 27- 34, em que a referida célula hospedeira compreende um ácido nuclei- co que codifica uma polimerase polissacarídica capsular (por exemplo, wzy) ou uma polimerase antigênica O (por exemplo, wzy), opcional- mente a referida polimerase polissacarídea capsular é de Staphylo- coccus aureus, opcionalmente de S. aureus CP5 ou CP8.
36. A célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 27- 35, em que a referida célula hospedeira compreende um ácido nuclei- co que codifica uma flippase (wzx), opcionalmente em que a referida flippase é de Staphylococcus aureus, opcionalmente de S. aureus CP5 ou CP8.
37. A célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 27- 36, em que a referida célula hospedeira também compreende uma en- zima capaz de modificar um monossacarídeo, opcionalmente uma epimerase, opcionalmente em que a referida epimerase é das espé- cies Escherichia, espécies Shigella, espécies Klebsiella, espécies Xhantomonas, espécies Salmonella, espécies Yersinia, espécies Ae- romonas, espécies Francisella, espécies Helicobacter, espécies Pro- teus, espécies Lactococcus, espécies Lactobacillus, espécies Pseu- domonas, espécies Corynebacterium, espécies Streptomyces, espé- cies Streptococcus, espécies Enterococcus, espécies Staphylococcus, espécies Staphylococcus, espécies Bacillus, espécies Listeria ou es- pécies Campylobacter, opcionalmente em que a referida epimerase é de E. coli, opcionalmente Z3206 de E. coli O157 ou galE.
38. A célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 27- 37, em que o ácido nucleico que codifica a proteína Hla modificada está em um plasmídeo na célula hospedeira.
39. A célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 27- 38, em que a célula hospedeira é E. coli.
40. Método para produzir um bioconjugado que compreen- de uma proteína Hla modificada ligada a um sacarídeo, o referido mé- todo compreendendo (i) cultivar a célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 27-39 sob condições adequadas para a produção de proteínas e (ii) isolar o bioconjugado.
41. Um bioconjugado produzido pelo processo do parágrafo 40, em que o referido bioconjugado compreende um sacarídeo ligado a uma proteína Hla modificada.
42. Uma composição imunogênica compreendendo a prote- ína Hla modificada de qualquer um dos parágrafos 1-18, ou o conjuga- do de qualquer um dos parágrafos 19-24, ou o bioconjugado do pará- grafo 41.
43. Método de preparar a composição imunogênica do pa- rágrafo 42, compreendendo a etapa de misturar a proteína Hla modifi- cada ou o conjugado ou o bioconjugado com um excipiente ou trans- portador farmaceuticamente aceitável.
44. Uma vacina compreendendo a composição imunogêni- ca do parágrafo 42 e um excipiente ou transportador farmaceuticamen- te aceitável.
45. Método para o tratamento ou prevenção da infecção por Staphylococcus aureus em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quanti- dade terapeuticamente eficaz da proteína Hla modificada de qualquer um dos parágrafos 1-18, ou o conjugado de qualquer um dos parágra- fos 19-24, ou o bioconjugado do parágrafo 41.
46. Método de imunizar um hospedeiro humano contra a infecção por Staphylococcus aureus, compreendendo administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora da proteína Hla modificada de qualquer um dos parágrafos 1-18, ou o conjugado de qualquer um dos parágrafos 19-24, ou o bioconjugado do parágrafo 41.
47. Método de induzir uma resposta imune ao Staphylococ- cus aureus em um indivíduo, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz da proteí- na Hla modificada de qualquer um dos parágrafos 1-18, ou o conjuga- do de qualquer um dos parágrafos 19-24, ou o bioconjugado do pará- grafo 41.
48. Uma proteína Hla modificada de qualquer um dos pará- grafos 1 a 18, ou o conjugado de qualquer um dos parágrafos 19 a 24, ou o bioconjugado do parágrafo 41, para uso no tratamento ou pre- venção de uma doença causada pela infecção por Staphylococcus au- reus.
49. Uso da proteína Hla modificada de qualquer um dos pa- rágrafos 1 a 18, ou o conjugado de qualquer um dos parágrafos 19 a 24, ou o bioconjugado do parágrafo 41, na fabricação de um medica- mento para o tratamento ou prevenção de uma doença causada pela infecção por Staphylococcus aureus.
[00209] Para que esta invenção possa ser melhor compreendida, os seguintes exemplos são apresentados. Estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de qualquer maneira. Descrição da listagem de sequência SEQ ID NO: 1 - Sequência de aminoácidos de Hla tipo selvagem ma- dura ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTI- AGQYR VYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQI SDYYPRNSIDTKEYMSTLTYG- FNGNVTGDDTGKI GGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVI FNNMVN- QNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMK TRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVIT- MDRKASKQQTNI DVIYERVRDDYQLHWTSTN WKGTNTKDKWIDRSSERYKI DWE-
KEEMTN
SEQ ID NO: 2 - Sequência de aminoácidos de Hla H48C/G122C ma- dura ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNCNKKLLVIRTKGTI- AGQYR VYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQI SDYYPRNSIDTKEYMSTLTYG- FNCNVTGDDTGKI GGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVI FNNMVN- QNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMK TRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVIT- MDRKASKQQTNI DVIYERVRDDYQLHWTSTN WKGTNTKDKWIDRSSERYKI DWE-
KEEMTN SEQ ID NO: 3 - Sequência de aminoácidos de Hla H35L/H48C/G122C madura ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFI DDKNCNKKLLVIRTKGTI- AGQYR VYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSI DTKEYMSTLTYG- FNCNVTGDDTGKI GGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVI FNNMVN- QNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMK TRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVIT- MDRKASKQQTNI DVIYERVRDDYQLHWTSTN WKGTNTKDKWIDRSSERYKI DWE-
KEEMTN SEQ ID NO: 4 - Sequência de aminoácidos de Hla H35L/H48C/G122C com sequência sinal S e Flgl N-terminal
MIKFLSALILLLVTTAAQASADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFI DDK NCNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQIS- DYYPRNSI DTKEY MSTLTYGFNCNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILES- PTDKKVGWKVIFNNMVNQN WGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPN- KASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTN I DVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKD-
KWIDRSSERYKI DWEKEEMTN SEQ ID NO: 5 - Sequência de aminoácidos de Hla H35L/H48C/G122C com sequência sinal S e Flgl N-terminal e GSHRHR C-terminal
MIKFLSALILLLVTTAAQASADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFI DDK NCNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQIS- DYYPRNSI DTKEY MSTLTYGFNCNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILES- PTDKKVGWKVIFNNMVNQN WGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPN- KASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTN I DVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKD-
KWIDRSSERYKI DWEKEEMTNGSHRHR SEQ ID NO: 6 - Sequência de aminoácidos de Hla H35L/H48C/G122C com S N-terminal e GSHRHR C-terminal SADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFI DDKNCNKKLLVIRTKGTI- AGQY RVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSI DTKEYMSTLTYG- FNCNVTGDDTGK IGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVI FNNMVN-
QNWGPYDRDSWNPVYGNQLFM KTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVIT- MDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTST NWKGTNTKDKWI DRSSERYKIDWEKEEM-
TNGSHRHR SEQ ID NO: 7 - Sequência de aminoácidos de Hla H35L/H48C/G122C madura com substituição de KDQNRTK pelo resíduo K131 ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNCNKKLLVIRTKGTI- AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSI DTKEYMSTLTYG- FNCNVTGDDTGKDQNRTKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNN- MVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSP- DFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRS-
SERYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO: 8 - Sequência de aminoácidos de Hla H35L/H48C/G122C com sequência sinal S, Flgl N-terminal e substituição de KDQNRTK pelo resíduo K131 MIKFLSALILLLVTTAAQASADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYS- FIDDKNCNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQIS- DYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNCNVTGDDTGKDQNRTKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDF- KTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADN- FLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKG-
TNTKDKWIDRSSERYKI DWEKEEMTN SEQ ID NO: 9 - Sequência de aminoácidos de Hla H35L/H48C/G122C com sequência sinal S, Flgl N-terminal, GSHRHR C-terminal e substi- tuição de KDQNRTK pelo resíduo K131
MIKFLSALILLLVTTAAQASADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFI DDKNCNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQIS- DYYPRNSI DTKEYMSTLTYGFNCNVTGDDTGKDQNRTKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDF- KTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADN- FLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKG-
TNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTNGSHRHR SEQ ID NO: 10 - Sequência de aminoácidos de Hla H35L/H48C/G122C com S N-terminal, GSHRHR C-terminal e substi- tuição de KDQNRTK pelo resíduo K131 SADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNCNKKLLVIRTKGTI- AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYG- FNCNVTGDDTGKDQNRTKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNN- MVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSP-
DFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWI DRS-
SERYKIDWEKEEMTNGSHRHR SEQ ID NO: 11 - Sequência de consenso de PglB de glycosite mínima D/E-X-N-Z-S/T SEQ ID NO: 12 - Sequência de consenso de PglB de glycosite comple- ta K-D/E-X-N-Z-S/T-K SEQ ID NO: 13 - Sequência sinal Flgl
MIKFLSALILLLVTTAAQA SEQ ID NO: 14 - Sequência sinal OmpA
MKKTAIAIAVALAGFATVAQA SEQ ID NO: 15 - Sequência sinal MalE
MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA SEQ ID NO: 16 - Sequência sinal PelB
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA SEQ ID NO: 17 - Sequência sinal LTIIb
MSFKKI IKAFVIMAALVSVQAHA SEQ ID NO: 18 - Sequência sinal XynA
MFKFKKKFLVGLTAAFMSI SMFSATASA SEQ ID NO: 19 - Sequência sinal DsbA
MKKIWLALAGLVLAFSASA SEQ ID NO: 20 - Sequência sinal TolB
MKQALRVAFGFLILWASVLHA SEQ ID NO: 21 - Sequência sinal SipA
MKMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAS SEQ ID NO: 22 - Sequência de aminoácidos de Hla H35L/H48C/G122C madura com GSHRHR C-terminal e substituição de KDQNRTK pelo resíduo K131 ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFI DDKNCNKKLLVIRTKGTI- AGQYR VYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQI SDYYPRNSI DTKEYMSTLTYG- FNCNVTGDDTGKD QNRTKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNN- MVNQNWGPYDRDSWNPVYG NQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSP-
DFATVITMDRKASKQQTNI DVIYERVRDDYQL HWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKI
DWEKEEMTNGSHRHR SEQ ID NO: 23 - Glycosite de KDQNRTK
KDQNRTK SEQ ID NO: 24 - Glycosite de KDQNATK
KDQNRTK SEQ ID NO: 25 - Marcador C-terminal HRHR
HRHR SEQ ID NO: 26 - Marcador C-terminal GSHRHR
GSHRHR SEQ ID NO: 27 - Hla H35L/Y102C/G126C Madura ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTI- AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYCPRNSIDTKEYMSTLTYG- FNGNVTCDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVN- QNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVIT- MDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKI DWE-
KEEMTN SEQ ID NO: 28 - HlaH35L/G122C/H48C Madura ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNCNKKLLVIRTKGTI- AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYG- FNCNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVN- QNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVIT-
MDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO: 29 - Hla H35L/G122C/L52C Madura ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKCLVIRTKGTI- AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYG- FNCNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVN- QNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVIT-
MDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO: 30 - HlaH35L Madura ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTI- AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYG- FNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVN- QNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVIT-
MDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN Exemplos Exemplo 1: Projeto de reticulação de cisteína-cisteína introduzida na proteína transportadora Hla (Hemolisina A)
[00210] A Figura 1 mostra a base estrutural e a razão para a modifi-
cação da proteína transportadora de S. aureus Hemolisina A (Hla) pa- ra a introdução de pares de resíduos de aminoácido cisteína substi- tuindo dois outros resíduos de aminoácidos nativos. A figura represen- ta as estruturas de cristal 3D publicadas em http://www.rcsb.org/ mos- trando um modelo de A) o heptâmero de Hla formador de poros tóxico (identificador de PDB 7AHL, Song et al., 1996), B) o monômero de Hla não tóxico (identificador de PDB 4IDJ, Foletti et al., 2013) e C) a su- perposição de um monômero em A) realçado em vermelho e o monô- mero em B) realçado em azul. A região mais ampla das posições de reticulação de cisteína-cisteína é indicada por uma forma oval verde. O objetivo da modificação foi estabilizar a proteína para impedir a agre- gação, realçando assim o rendimento e também desintoxicar a proteí- na. O locus da posição de reticulação dentro da proteína foi seleciona- do para impedir a alteração conformacional do monômero não tóxico (azul) para formar o monômero tóxico (vermelho) através da inibição da extensão da fita beta necessária para a construção do heptâmero.
[00211] A Figura 2 mostra uma aproximação dos pares de aminoá- cidos que foram mutados para os resíduos de cisteína individualmente, par a par. O modelo da forma tóxica é colorido em vermelho, a forma não tóxica é sobreposta e mostrada em azul. Os resíduos do tipo sel- vagem são realçados em representações de bastão verde e as posi- ções dos átomos de Carbono alfa correspondentes (Cα) são ligadas por uma linha tracejada preta para cada par de resíduos. As distâncias das posições Cα-Cα de cada par de aminoácidos estão indicadas em Ångströms (Å): Y102C/G126C: 7,52 Å; G122C/H48C: 6,23 Å; N121 C/H48C: 6,60 Å; G122C/L52C: 7,04 Å. N121C/H48C foi publicado (Kawate e Gouaux, 2003). Exemplo 2: Produtividade e estabilidade do bioconjugado CP5-Hla realçada de variantes de Hla reticuladas
[00212] A estabilidade (em termos de formação de agregados) e a produtividade das variantes de Hla reticuladas para a produção de bio- conjugado CP5-Hla foram comparadas com a de Hla não reticulada. StGVXN1717 (W3110 waaL; wecA-wzzE; rmlB-wecG::Clm) foi co- transformado por eletroporação com os plasmídeos que codificam o polissacarídeo capsular de S. aureus CP5 (CPS 5) pGVXN393, C. je- juni oligossacariltransferase PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V pGVXN1221 e individualmente com as proteínas transportadoras de S. aureus HlaH35L pGVXN570 ou variantes de reticulação HlaH35L-Y102c-G126c pGVXN2178, HlaH35L-H48C-G122C pGVXN2179, HlaH35L-H48C-N121C pGVXN2180 ou HlaH35L-L52C-G122C pGVXN2181 todos transportando um sítio de glicosi- lação na posição 131 e um marcador de afinidade de hexa-histidina C- terminal (His6). Uma transformação de controle desprovida do gene que codifica PglB incluiu o polissacarídeo capsular de S. aureus CP5 (CPS 5) pGVXN393, as proteínas transportadoras de S. aureus HlaH35L (Hemolisina A) pGVXN570 combinadas com o vetor de cadeia princi- pal vazio pGVXN72 (pEXT21, Dykxhoorn et al., Gene 177 (1996) 133 136) de PglB.
[00213] As células foram cultivadas em meio TB, o polissacarídeo recombinante foi expresso constitutivamente, PglB e Hla foram induzi- dos entre uma faixa de densidade ótica OD600nm de 0,5 e 1,0.
[00214] Após indução durante à noite, as células foram colhidas e os bioconjugados de CP5-Hla foram extraídos por uma preparação periplásmica usando um tampão de lise (Tris-HCI 30 mM pH 8,5, EDTA 1 mM, sacarose a 20%) suplementado com 1 mg/ml de lisozima. As proteínas periplásmicas foram coletadas do sobrenadante após a centrifugação, carregadas em um SDS-PAGE a 4-12 % e manchadas para uma membrana de nitrocelulose e detectadas por um anticorpo de marcador anti-His. Cada amostra para o SDS-PAGE foi dividida e fervida por 10 minutos a 98°C ou não fervida antes do carregamento. As proteínas carregadas foram normalizadas para a densidade ótica das células.
[00215] Os resultados são mostrados na Figura 3. Todas as varian- tes reticuladas mostraram níveis equivalentes ou mais altos de glicosi- lação em comparação com a Hla não reticulada, com a variante G122C/H48C mostrando o nível mais alto, seguido por N121C/H48C. Além disso, a Hla não reticulada mostrou formação de agregado subs- tancial no Western blot, visto como sinais de massa molecular aparen- tes superiores nas amostras não fervidas, enquanto os agregados não eram visíveis no manchamento para quaisquer das variantes reticula- das. Métodos
[00216] StGVXN1717 de E. coli (W3110 waaL; wecA-wzzE; rmlB-wecG::Clm) foi cotransformado por eletroporação com os plasmí- deos que codificam o polissacarídeo capsular de Staphylococcus au- reus CP5 (CPS 5) pGVXN393, Campylobacter jejuni oligossacariltrans- ferase PglBN311V-K482R-D483H-A669V pGVXN1221 e individualmente com as proteínas transportadoras de S. aureus HlaH35L (Hemolisina A) pGVXN570 ou variantes de reticulação HlaH35L-Y102C-G126C pGVXN2178, HlaH35L-H48C-G122C pGVXN2179, HlaH35L-H48C-N121 pGVXN2180 ou HlaH35L- L52C-G122C pGVXN2181 todos transportando um sítio de glicosilação na posição 131 e um marcador de afinidade de hexa-histidina (His6) C- terminal. Uma transformação de controle desprovida do gene que codi- fica PglB incluiu o polissacarídeo capsular de S. aureus CP5 (CPS 5) pGVXN393, as proteínas transportadoras de S. aureus HlaH35L (Hemo- lisina A) pGVXN570 combinadas com o vetor de cadeia principal vazio pGVXN72 de PglB.
[00217] As bactérias transformadas foram cultivadas durante à noite em placas de ágar seletivo suplementadas com os três antibióticos te- traciclina [20 µg/ml], ampicilina [100 µg/ml] e espectinomicina [80 µg/ml]. As células foram inoculadas em caldo Lysogeny (LB) de 50 ml contendo tetraciclina [20 µg/ml], ampicilina [100 µg/ml] e espectinomi- cina [80 µg/ml] e agitadas em um frasco Erlenmeyer durante à noite a 37°C, 180 rpm.
No dia seguinte, uma cultura principal de 50 ml de meio de caldo Terrific (TB) suplementado com glicerol a 0,4-0,45% (Sigma, 49781), MgCl2 10mM, tetraciclina [20 µg/ml], ampicilina [100 µg/ml] e espectinomicina [80 µg/ml] foi inoculada a uma diluição de densidade ótica de 0,1 em 600nm (OD600nm), incubada em um frasco Erlenmeyer em 180 rpm, 37°C, até uma OD600nm média de 0,9 - 1,0 e induzida.
As culturas foram agitadas durante à noite a 37°C, 180rpm e 50 OD600nm foram colhidas de cada cultura no dia seguinte.
As células foram centrifugadas por centrifugação em 4000 rpm por 15 minutos a 4°C, em uma centrífuga Eppendorf e lavadas com 5 ml de cloreto de sódio a 0,9% (NaCl), seguidas por outra centrifugação em 4000 rpm por 15 minutos a 4 °C.
A pélete foi ressuspensa em 1 ml de tampão de lise (Tris-HCI 30 mM, pH 8,5, EDTA 1 mM, 20 % (p/v) de sacarose) suplementado com 1 mg/ml de lisozima.
As amostras foram incubadas por 20 minutos a 4°C em uma roda de rotação, centrifugadas por cen- trifugação em 14000 rpm por 20 minutos a 4°C. 45 microlitros do so- brenadante foram coletados e fervidos em 15 microlitros de tampão Laemmli 4 concentrado vezes para atingir uma concentração final de Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, dodecilsulfato de sódio a 2% (p/v), beta- mercaptoetanol a 5% (p/v), glicerol a 10% (v/v), azul bronfenol a 0,005% (p/v), durante 15 minutos a 98°C.
Um conjunto idêntico de amostras foi preparado sem ebulição antes do carregamento no SDS- PAGE.
As proteínas de um equivalente a 1 OD600nm foram separadas por SDS-PAGE (Nu-PAGE, Bis-Tris Gel a 4-12%, life technologies) com tampão fluente MOPS (MOPS 50 mM, Tris Base 50 mM, SDS a 0,1%, EDTA 1 mM, pH 7,7) em 200 Volts por 45 minutos.
As proteínas foram, então, transferidas para uma membrana de nitrocelulose usan- do as pilhas de transferência de gel iBLOT (Novex, by Life Technologi-
es). A nitrocelulose foi bloqueada com leite em pó a 10% (p/v) dissol- vido em PBST (tampão de fosfato 10 mM pH 7,5, cloreto de sódio 137 mM, cloreto de potássio 2,7 mM adquirido de Ambresco E703-500 ml, tween a 0,1% em /v/v) por 20 minutos em temperatura ambiente, se- guidos de uma detecção por imunomanchamento usando um anticorpo anti-penta histidina de camundongo primário (Qiagen, 34660) em 0,1 µg/ml em PBST suplementado com 1% (p/v) de leite em pó, incubando a membrana por 1 hora a temperatura ambiente. A seguir, a membra- na foi lavada duas vezes com PBST por 5 minutos e incubada com um anticorpo acoplado à peroxidase de rábano silvestre (HRP) antica- mundongo secundário (Sigma, A0412) em PBST suplementado com 1% (p/v) de leite em pó por 1 hora em temperatura ambiente. A mem- brana foi lavada 3 vezes com PBST por 5 minutos e as bandas de pro- teínas foram visualizadas por adição de TBM (substrato de membrana de HRP de um componente TMB, BioFX, TMBM-1000-01) e a reação foi interrompida com água desionizada. Exemplo 3: Correlação do comportamento de migração de agre- gado de Hla (u-Hla) não glicosilada rnão reticulada a partir de amostra não fervida em SDS-PAGE com espécies de agregado detectadas por cromatografia de exclusão por tamanho
[00218] Este exemplo mostra a correlação de Hla agregado, não glicosilado, não reticulado, funcionando como espécies maiores em cromatografia de exclusão por tamanho e correspondentemente como maior peso molecular aparente em SDS-PAGE quando a amostra não é fervida. Os resultados são mostrados na Figura 5.
[00219] StGVXN2457 (W3110 waaL; rlmB-wecG; araBAD) foi transformado com o plasmídeo que codifica a proteína transportadora de S. aureus, HlaH35L pGVXN570 transportando um sítio de glicosila- ção na posição 131 e um marcador de afinidade de hexa-histidina C- terminal, por eletroporação.
[00220] As células foram cultivadas em meio de TB Hla foi induzido com arabinose a 0,2% em uma densidade ótica OD600nm nm de 0,66.
[00221] Após indução durante à noite, as células foram colhidas e o bioconjugado de Hla foi extraído por uma preparação periplásmica usando um tampão de lise (Tris-HCI 30 mM pH 8,5, EDTA 1 mM, Sa- carose a 20%) suplementado com 1 mg/ml de lisozima. A proteína pe- riplásmica foi coletada do sobrenadante após centrifugação, carregada em uma resina IMAC de 10 ml (Hypercel, Pall) e eluída por uma elui- ção de gradiente. As frações contendo principalmente as espécies monoméricas, não agregadas foram reunidas e também purificadas por uma cromatografia de permuta Aniônica (ANX Sepharose), onde a proteína alvo foi coletada da fração não ligada enquanto as impurezas foram removidas através da ligação à coluna. A fração de fluxo total foi concentrada e injetada em uma coluna de exclusão de tamanho (Su- perdex 200 10/300) para separar as espécies agregadas restantes de Hla monodisperso. Todas as purificações foram realizadas em um sis- tema FPLC (Aekta, Amersham Pharmacia). As frações de purificação foram analisadas por SDS-PAGE a 4-12% corado com SimplyBlue Sa- fe Stain. Métodos.
[00222] StGVXN2457 de E.coli (W3110 waaL; rlmB-wecG; ara- BAD) foi transformada com o plasmídeo que codifica a proteína trans- portadora de Staphylococcus aureus HlaH35L (Hemolisina A) pGVXN570, que transporta um sítio de glicosilação na posição 131 e um marcador de afinidade de hexa-histidina C-terminal, por eletropo- ração.
[00223] As bactérias transformadas foram cultivadas durante à noite em placa de ágar de LB seletivo (caldo Lysogeny) suplementado com o antibiótico ampicilina [100 µg/ml]. As células foram inoculadas em 100 ml de LB contendo ampicilina [100 µg/ml] e agitadas em um frasco
Erlenmeyer durante à noite a 37°C, 180 rpm.
No dia seguinte, uma cul- tura principal de 2000 ml de meio de caldo Terrific (TB) suplementado com glicerol a 0,4-0,45% (Sigma, 49781), MgCl2 10mM e ampicilina [100 µg/ml] foi inoculada para uma diluição de densidade ótica de 0,1 em 600nm (OD600nm), incubadas em um frasco Erlenmeyer em 180 rpm, 37°C.
A Hla foi induzida com arabinose a 0,2% a partir de um promotor pBAD em uma densidade ótica OD600nm de 0,66 e agitada durante à noite em 180 rpm e 37°C.
As células foram colhidas, centri- fugadas a 4°C, 5000rpm por 20 minutos e lavadas com 200 ml de clo- reto de sódio a 0,9% e centrifugadas novamente a 4°C, 5000rpm por 20 minutos.
Um equivalente de 8360 OD600nm foi ressuspenso em 167 ml de tampão de lise (Tris-HCI 30 mM pH 8,5, EDTA 1 mM, saca- rose a 20% (p/v)) suplementado com 1 mg/ml de lisozima.
A amostra foi incubada por 15 minutos a 4°C em uma roda de rotação, centrifu- gada por 8000 rpm por 30 minutos a 4°C e o sobrenadante foi recupe- rado. 10 ml de resina de purificação IMAC (Hypercel, Pall) foram equi- librados com 30 ml de Tris-HCI 30 mM pH 8,0, NaCI 500 mM, Imidazol 5 mM e incubados com o sobrenadante suplementado com 43 ml de Tris-HCI 150 mM pH 8,0, NaCl 2500 mM, Imidazol 25 mM, cloreto de magnésio 4 mM por 40 minutos em temperatura ambiente.
A Resina foi empacotada em uma coluna XK16 (GE Healthcare) e lavada com 50 ml de Tris-HCI 30 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 5 mM usando uma bomba peristáltica (Ismatec). A seguir, a coluna foi ligada a um sistema FPLC (Aekta, Amersham Pharmacia) e a proteína foi eluída na mesma condição do tampão com um gradiente de Imidazol de até 500 mM. 45 microlitros das frações cromatográficas foram suplementados com tampão Laemmli concentrado 4 vezes de 15 microlitros para obter uma concentração final de Tris-HCI 62,5 mM pH 6,8, dodecilsulfato de sódio a 2% (p/v), beta-mercaptoetanol a 5% (p/v), glicerol a 10% (v/v), azul bronfenol a 0,005 % (p/v). As amostras foram fervidas a 95°C por
15 minutos, 40 microlitros foram separados por SDS-PAGE a 4-12% (Nu-PAGE, Bis-Tris Gel a 4-12%, life technologies) com tampão fluen- te MOPS (MOPS 50 mM, Tris Base 50 mM, SDS a 0,1%, EDTA 1 mM, pH 7,7) em 200 Volts por 45 minutos.
As proteínas foram visualizadas com SimplyBlue Safe Stain.
Três picos de eluição foram observados, em imidazol de aproximadamente 90, 190 e 340 mM.
Cinco frações eluindo em imidazol de aproximadamente 190 mM (segundo pico, 15 ml) foram reunidas e centrifugadas em 10000 rpm, 30 minutos a 4°C e o sobrenadante foi diluído com 35 ml de Tampão A (Tris-HCl 10 mM pH 7,5) para atingir uma condutividade de 2,69 mS/cm.
A proteína foi carregada em uma coluna de cromatografia de permuta de ânions de 25 ml (ANX Sepharose), lavada com 50 ml de tampão A e as proteínas foram eluídas por um gradiente diferencial com tampão B (Tris-HCI 10 mM pH 7,5, NaCl 1M): 3 volumes de coluna (cv) em tampão B a 13 %, 5 cv para tampão B a 16% e 7 cv para tampão B a 100 %. Todas as frações foram analisadas por SDS-PAGE e visualizadas com Sim- plyBlue Safe Stain como descrito acima.
A proteína alvo foi detectada principalmente nas frações não acopladas, reunida e concentrada com filtro de corte de peso molecular de 30 kilodalton (Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15) para 500 microlitros e injetada em uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho (Superdex 200 10/300, GE Healthcare) para separar agregados das proteínas trans- portadoras monoméricas (veja, Figura 5A, leitura da absorvância). As fracções foram novamente analisadas por SDS-PAGE e visualizadas com SimplyBlue Safe Stain como descrito acima (Figura 5A, gel de SDS-PAGE). Além disso, as proteínas das espécies agregadas e das espécies monoméricas foram analisadas em um SDS-PAGE sem fer- ver as amostras, o que confirmou a clara correlação do comportamen- to de migração de alto peso molecular em SDS-PAGE com as espé- cies agregadas (Figura 5B; amostra não fervida na Faixa 3 mostra uma banda de PM muito alto perto do topo do gel. Consequentemente, isto permite uma rápida leitura da análise da homogeneidade da prote- ína transportadora Hla, não glicosilada ou glicosilada, para outros ex- perimentos sem a necessidade de purificar a proteína com alta pureza. Exemplo 4: Análise de espécies de u-Hla agregadas por Dispersão de Luz Dinâmica (DLS)
[00224] As espécies de u-Hla não reticuladas agregadas foram ana- lisadas por Dispersão de Luz Dinâmica (DLS). Os resultados são mos- trados na Figura 4. 4A) mostra o perfil de distribuição de tamanho mé- dio de um Hla agregado. 4B) mostra as espécies de u-Hla agregadas usadas para a análise, o pico um de um IMAC eluindo em imidazol de aproximadamente 90 mM. Os dados brutos da medição em triplicata rendendo 122,4 nm de tamanho de partícula médio, são mostrados na Tabela 1. Tabela 1 N°. da N°. de Repeti- Diâmetro PD Média (nm) D(10%) (nm) D(50%) (nm) D(90%) (nm) Amostra ção Médio (nm) 1 1 118,7 0,326 201,0 52,8 148,8 411,7 2 2 126,7 0,303 208,3 56,9 154,7 423,1 3 3 121,8 0,340 206,7 54,0 152,5 424,3 Mediana 122,4 0,323 205,3 54,6 152,0 419,7
[00225] A Figura 4C mostra as medições feitas no programa Pymol para estimar as dimensões máximas aproximadas da molécula mono- mérica ou heptamérica em nanômetros. A dimensão mais longa no monômero é de no máximo 8 nanômetros, a forma heptamérica tem uma dimensão máxima de aproximadamente 10 nanômetros em todas as direções.
[00226] StGVXN2457 (W3110 waaL; rlmB-wecG; araBAD) foi transformado com o plasmídeo que codifica a proteína transportadora de S. aureus, HlaH35L pGVXN570, transportando um sítio de glicosila- ção na posição 131 e um marcador de afinidade de hexa-histidina C- terminal, por eletroporação.
[00227] As células foram cultivadas em meio de TB e Hla foi induzi-
da com arabinose a 0,2% em uma densidade ótica OD600nm de 0,66.
[00228] Após indução durante à noite, as células foram colhidas e o bioconjugado Hla foi extraído por uma preparação periplásmica usan- do um tampão de lise (Tris-HCI 30 mM pH 8,5, EDTA 1 mM, sacarose a 20 %) suplementado com 1 mg/ml de lisozima. A proteína periplás- mica foi coletada do sobrenadante após centrifugação, carregada em uma resina IMAC de 10 ml (Hypercel, Pall) e eluída por uma eluição de gradiente. Métodos
[00229] StGVXN2457 de E.coli (W3110 waaL; rlmB-wecG; ara- BAD) foi transformado com o plasmídeo que codifica a proteína trans- portadora de Staphylococcus aureus HlaH35L (Hemolisina A) pGVXN570, que transporta um sítio de glicosilação na posição 131 e um marcador de afinidade de hexa-histidina C-terminal, por eletropo- ração.
[00230] As bactérias transformadas foram cultivadas durante à noite em placa de ágar de LB seletivo (caldo Lysogeny) suplementado com o antibiótico ampicilina [100 µg/ml]. As células foram inoculadas em 100 ml de LB contendo ampicilina [100 µg/ml] e agitadas em um frasco Erlenmeyer durante à noite a 37 °C, 180 rpm. No dia seguinte, uma cultura principal de 2000 ml de meio de caldo Terrific (TB) suplemen- tado com glicerol a 0,4-0,45 % (Sigma, 49781), MgCl2 10mM e ampici- lina [100 µg/ml] foi inoculada para uma diluição de densidade ótica de 0,1 em 600nm (OD600nm), incubada em um frasco Erlenmeyer em 180 rpm, 37°C. A Hla foi induzida com arabinose a 0,2 % a partir de um promotor pBAD em uma densidade ótica OD600nm de 0,66 e agitada durante à noite em 180 rpm e 37°C. As células foram colhidas, centri- fugadas a 4°C, 5000rpm por 20 minutos e lavadas com 200 ml de clo- reto de sódio a 0,9% e centrifugadas novamente a 4°C, 5000rpm por 20 minutos. Um equivalente de 8360 OD600nm foi ressuspenso em
167 ml de tampão de lise (Tris-HCI 30 mM pH 8,5, EDTA 1 mM, saca- rose a 20 % (p/v)) suplementado com 1 mg/ml de lisozima. A amostra foi incubada por 15 minutos a 4°C em uma roda de rotação, centrifu- gada por centrifugação em 8000 rpm por 30 minutos a 4°C e o sobre- nadante foi recuperado. 10 ml de resina de purificação IMAC (Hyper- cel, Pall) foram equilibrados com 30 ml de Tris-HCI 30 mM pH 8,0, NaCI 500 mM, imidazol 5 mM e incubados com o sobrenadante su- plementado com 43 ml de Tris-HCI 150 mM pH 8,0, NaCl 2500 mM, Imidazol 25 mM, cloreto de magnésio 4 mM por 40 minutos em tempe- ratura ambiente. A resina foi empacotada em uma coluna XK16 (GE Healthcare) e lavada com 50 ml de Tris-HCI 30 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 5 mM usando uma bomba peristáltica (Ismatec). A se- guir, a coluna foi ligada a um sistema FPLC (Aekta, Amersham Phar- macia) e a proteína foi eluída na mesma condição do tampão com um gradiente de Imidazol de até 500 mM. Três picos em diferentes con- centrações de imidazol foram observados. Como avaliado a partir de uma cromatografia de exclusão por tamanho (veja, Exemplo 3, Figura 5), esta espécie de Hla eluindo no primeiro pico em imidazol de apro- ximadamente 90 mM é uma forma agregada e suas frações foram co- letadas e analisadas por Dispersão de Luz Dinâmica (DLS) para obter a distribuição de tamanho médio. Uma medição em triplicata da amos- tra foi realizada em 0,9 mg/ml, utilizando um tempo de acumulação de
70. As medições foram realizadas a 25°C em um Delsa Nano C (Beckman Coulter) que produziu um tamanho médio de 122,4 nanô- metros (nm). A formação de uma forma potencialmente heptamérica e tóxica pode, portanto, ser excluída, uma vez que a partícula média medida é dez vezes maior e é mais provável que uma forma agregada de Hla. Tentou-se também medir a forma monomérica de Hla, que não levou a nenhum sinal, porque a proteína é muito pequena para este método (dimensão de aproximadamente 3 x 8 nm).
Exemplo 5: Análise de perfis de eluição de variantes de Hemolisi- na A não reticulada versus reticulada não glicosilada de cromato- grafia de afinidade por metal Imobilizado (IMAC) e cromatografia de exclusão por Tamanho (SEC)
[00231] O perfil de eluição da cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC) de Hla não glicosilada, não reticulada foi compara- do com a análise por imunomanchamento das respectivas frações de eluição com um anticorpo anti-His, revelando um comportamento de eluição heterogêneo da proteína alvo. Os resultados são mostrados na Figura 6.
[00232] O perfil de eluição da cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC) a partir de Hla não glicosilada, não reticulada e das quatro variantes de Hla não glicosiladas, reticuladas foi, então, compa- rado, como mostrado na Figura 7. Isso mostrou prevenção (Y102C/G126C) ou formação fortemente reduzida de agregado em relação ao monômero, associada ao rendimento de proteína aumenta- do (G122C/H48C).
[00233] A variante de Hla não glicosilada, não reticulada eluída co- mo agregados ou monômeros obtidos a partir da eluição em gradiente de IMAC mostrada na Figura 7 e os eluídos de IMAC das espécies monoméricas das quatro variantes Hla reticuladas mostradas na Figu- ra 7 foram então sujeitas a tamanho análise por cromatografia de ex- clusão. Os resultados são mostrados na Figura 8.
[00234] StGVXN1717 (W3110 waaL; wecA-wzzE; rmlB- wecG::Clm) foi cotransformado por eletroporação com os plasmídeos que codificam o polissacarídeo capsular de S. aureus CP5 (CPS 5) pGVXN393, com o vetor de plasmídeo vazio pGVXN72 desprovido do gene que codifica para Campylobacter jejuni oligossacariltransferase PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V e com uma das proteínas transportadoras de S. aureus HlaH35L pGVXN570, variantes de reticulação HlaH35L-Y102c-
G126c pGVXN2178, HlaH35L-H48C-G122C pGVXN2179, HlaH35L-H48C-N121C pGVXN2180 ou Hla H35L-L52C-G122C pGVXN2181 todos transportando um sítio de glicosilação na posição 131 e um marcador de afinidade de hexa-histidina C-terminal (His6).
[00235] As células foram cultivadas em meio de TB, o polissacarí- deo recombinante foi expresso constitutivamente. A Hla foi induzida entre uma faixa de densidade ótica OD600nm de 0,5 e 1,0. Após indução durante à noite, as células foram colhidas e as proteínas Hla não gli- cosiladas foram extraídas por um procedimento de choque osmótico. As células foram ressuspensas em 1 ml de Tris-HCI 8,3 mM pH 7,4, NaCI 43,3 mM, KCI 0,9 mM e tampão de ressuspensão de 0,5 ml (sa- carose a 75% (p/v), EDTA 30 mM, Tris-HCI 600 mM pH 8,5) e giradas durante 20 minutos a 4°C. As células foram precipitadas e ressuspen- sas em tampão de choque osmótico (Tris-HCI 10 mM, pH 8,0), segui- do de outra incubação de 30 minutos a 4 °C. As células foram nova- mente centrifugadas e os sobrenadantes foram carregados numa co- luna de 1 ml de HisTrap FF, e as proteínas foram eluídas com uma eluição de gradiente. As frações de eluição da amostra derivada da variante de Hla não reticulada pGVXN570 foram carregadas em um SDS-PAGE a 4-12% e transferidas para uma membrana de nitrocelu- lose e detectadas por um anticorpo de marcador anti-His. Métodos
[00236] StGVXN1717 de E.coli (W3110 waaL; wecA-wzzE; rmlB- wecG::Clm) foi cotransformado por eletroporação com os plasmídeos que codificam o polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus CP5 (CPS 5) pGVXN393, com o vetor de plasmídeo vazio pGVXN72 desprovido do gene que codifica para Campylobacter jejuni oligossa- cariltransferase PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V e com uma das proteínas transportadoras de S. aureus HlaH35L (Hemolisina A) pGVXN570, vari- antes de reticulação HlaH35L-Y102c-G126c pGVXN2178, HlaH35L-H48C-G122C pGVXN2179, HlaH35L-H48C-N121C pGVXN2180 ou Hla H35L-L52C-G122C pGVXN2181 todos transportando um sítio de glicosilação na posição 131 e um marcador de afinidade de hexa-histidina C-terminal (His6).
[00237] As bactérias transformadas foram cultivadas durante à noite em placas de ágar de caldo Lysogeny seletivo (LB) suplementadas com os três antibióticos tetraciclina [20 µg/ml], ampicilina [100 µg/ml] e espectinomicina [80 µg/ml]. As células foram inoculadas em 50 ml de caldo Lysogeny (LB) contendo tetraciclina [20 µg/ml], ampicilina [100 µg/ml] e espectinomicina [80 µg/ml] e agitadas em um frasco Erlenme- yer durante à noite em 180 rpm e 37 °C. No dia seguinte, as culturas principais de 50 ml de meio de caldo Terrific (TB) suplementado com glicerol a 0,4-0,45 % (Sigma, 49781), MgCl2 10 mM, tetraciclina [20 µg/ml], ampicilina [100 µg/ml] e espectinomicina [80 µg/ml] foram ino- culadas até uma diluição de densidade ótica de 0,1 em 600nm (OD600nm), incubadas em um frasco Erlenmeyer em 180 rpm, 37 °C, até uma OD600nm média de 0,9 - 1,0 e induzidas com isopropil-β-D- tiogalactopiranosídeoido (IPTG, Thermoscientific R0393) e arabinose e agitadas durante à noite em 180 rpm e 37°C. 200 OD600nm foram co- lhidos de cada amostra, centrifugados em 4°C, 4000rpm por 15 minu- tos e as péletes celulares foram lavadas com 20 ml de NaCl a 0,9%, centrifugadas novamente a 4°C, 4000rpm por 15 minutos. As proteínas foram purificadas por um procedimento de choque osmótico por res- suspensão em 1 ml de Tris-HCI 8,3 mM pH 7,4, NaCI 43,3 mM, KCI 0,9 mM e tampão de ressuspensão de 0,5 ml (Sacarose a 75 %, EDTA 30 mM, Tris-HCI 600 mM pH 8,5). A suspensão de células foi incubada a 4°C por 20 minutos em uma roda de rotação, precipitada por centri- fugação em 9000 rpm por 30 minutos a 4°C e ressuspensa em 1,5 ml de tampão de choque osmótico (Tris-HCl 10 mM pH 8,0). A suspensão foi incubada a 4°C por 30 minutos por rotação e centrifugada em 14000 rpm por 30 minutos a 4°C. Os sobrenadantes foram recupera-
dos e suplementados com cloreto de magnésio (MgCl2) e tampão de ligação 5 x (Tris-HCI 150 mM pH 8,0, NaCI 2,5 M, imidazol 25 mM) para atingir a concentração final de MgCI2 50 mM e IMAC (cromato- grafia de afinidade por metal imobilizado) condição de ligação de Tris- HCI 30 mM, pH 8,0, NaCI 500 mM, imidazol 5 mM). As colunas His- Trap FF de 1 mililitro (GE Healthcare) foram equilibradas com 10 ml de tampão de ligação (Tris-HCI 30 mM pH 8,0, NaCI 500 mM, imidazol 5 mM) e as amostras foram carregadas nas colunas e lavadas com 10 ml de tampão de ligação (Tris-HCl 30 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, imi- dazol 5 mM) utilizando uma bomba peristáltica (Ismatec). A seguir, as colunas foram ligadas a um sistema FPLC (Aekta, Amersham Pharma- cia), lavadas com 10 ml de Tris-HCl 30 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, imi- dazol 5 mM e eluídas por um gradiente de imidazol 5-500 mM em 15 ml. 45 microlitros de cada fração de eluição da amostra produzida com Hla pGVXN570 não reticulado foram suplementados com 15 microli- tros de tampão Laemmli 4x para atingir uma concentração de Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, dodecil sulfato de sódio a 2% (p/v), beta- mercaptoetanol a 5% (p/v), glicerol a 10% (v/v), azul bronfenol 0,005% (p/v) e fervidos durante 15 minutos a 98°C. 30 microlitros de cada amostra foram analisados por SDS-PAGE (Nu-PAGE, Bis-Tris Gel a 4- 12%, life technologies) com tampão fluente MOPS (MOPS 50 mM, Tris Base 50 mM, SDS a 0,1 %, EDTA 1 mM, pH 7,7) em 200 Volts por 45 minutos.
As proteínas foram, então, transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando as pilhas de transferência de gel iBLOT (No- vex, by Life Technologies). A nitrocelulose foi bloqueada com leite em pó a 10% (p/v) dissolvido em PBST (tampão de fosfato 10mM pH 7,5, cloreto de sódio 137mM, cloreto de potássio 2,7mM adquirido de Am- bresco E703-500 ml, tween a 0,1% em /v/v) por 20 minutos à tempera- tura ambiente, seguido de uma detecção por imunomanchamento usando um anticorpo antipenta histidina de camundongo primário (Qi-
agen, 34660) em 0,1 µg/ml em PBST suplementado com leite em pó a 1% (p/v), incubando a membrana por 1 hora em temperatura ambien- te. A seguir, a membrana foi lavada duas vezes com PBST por 5 minu- tos e incubada com um anticorpo acoplado à peroxidase de rábano silvestre (HRP) polivalente anticamundongo secundário (Sigma, A0412) em PBST suplementado com leite em pó a 1 % (p/v) por 1 ho- ra à temperatura ambiente. A membrana foi lavada 3 vezes com PBST por 5 minutos e as bandas de proteínas foram visualizadas por adição de TBM (substrato de membrana de HRP de um componente TMB, BioFX, TMBM-1000-01) e a reação foi interrompida com água desioni- zada.
[00238] Os eluatos de IMAC mostrados na Figura 7 foram posteri- ormente analisados por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). Uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) Superdex 200 10/300 (GE Healthcare) foi equilibrada com TBS 1 x (so- lução salina tamponada com Tris, Fisher Scientific), pH 7,4, em 0,5 ml/min em um sistema FPLC (Aekta, Amersham Pharmacia). 500 mi- crolitros de picos de eluição de IMAC de espécies agregadas e mono- méricas de Hla não glicosilada, não reticulada e espécies monoméri- cas coletadas de variantes Hla reticuladas não glicosiladas foram inje- tados em uma coluna Superdex 200 10/300 por cromatografia de ex- clusão por tamanho. Os perfis de eluição foram registrados em um comprimento de onda de absorção de 280 nm e revestidos como mos- trado na Figura 8. Exemplo 6: Purificação altamente seletiva de CP5-Hla transpor- tando um rótulo de HRHR C-terminal usando cromatografia de permuta catiônica
[00239] Uma etapa de purificação altamente seletiva para o biocon- jugado CP5-Hla transportando um rótulo de purificação de HRHR usando uma resina de permuta de cátions foi realizada, conforme mos-
trado na Figura 9. Os resultados obtidos usando CP5-Hla sem um ró- tulo de purificação são mostrados na Figura 10. StGVXN1717 (W3110 waaL; wecA-wzzE; rmlB-wecG::Clm) foi cotransformado com os plasmídeos que codificam o polissacarídeo capsular de S. aureus CP5 (CPS 5) pGVXN393, a proteína transportadora de S. aureus HlaH35L- H48C-G122C pGVXN2533 transportando um sítio de glicosilação na posi- ção 131, com ou sem um marcador de histidina-arginina-histidina- arginina C-terminal e Campylobacter jejuni oligossacariltransferase PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V pGVXN1221, por eletroporação.
[00240] As células foram cultivadas em meio de TB, o polissacarí- deo recombinante foi expresso constitutivamente, Hla e PglB foram induzidos em uma densidade ótica OD600nm de 0,74.
[00241] Após a indução durante à noite, as células foram colhidas e o bioconjugado CP5-Hla foi liberado do periplasma por um procedi- mento de choque osmótico. As células foram ressuspensas em Tris- HCI 8,3 mM, pH 7,4, NaCI 43,3 mM, KCI 0,9 mM e tampão de ressus- pensão (sacarose a 75% (p/v), EDTA 30 mM, Tris-HCl 600 mM pH 8,5) e giradas por 20 minutos a 4°C. As células foram precipitadas e res- suspensas em tampão de choque osmótico (Tris-HCI 10 mM, pH 8,0), seguido de outra incubação de 20 minutos a 4°C. As células foram centrifugadas novamente e o sobrenadante foi carregado em uma co- luna de permuta de cátions de 1 ml e o bioconjugado foi recuperado por uma eluição de gradiente. As proteínas das frações de eluição fo- ram separadas por um SDS-PAGE a 4-12% e manchadas em uma membrana de nitrocelulose e detectadas por um anticorpo anti-Hla ou o gel foi diretamente corado com SimplyBlue Safe Stain. Os resultados são mostrados nas Figuras 9 (com marcador) e 10 (sem marcador). Métodos
[00242] Para a proteína marcada, StGVXN1717 de E.coli (W3110 waaL; wecA-wzzE; rmlB-wecG::Clm) foi cotransformado com os plasmídeos que codificam o polissacarídeo capsular de Staphylococ- cus aureus CP5 (CPS 5) pGVXN393, a proteína transportadora de S. aureus HlaH35L-H48C-G122C pGVXN2533 (Hemolisina A) que transporta um sítio de glicosilação na posição 131 e um marcador de histidina- arginina-histidina-arginina C-terminal e Campylobacter jejuni oligossa- cariltransferase PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V pGVXN1221 por eletropo- ração.
[00243] As bactérias transformadas foram cultivadas durante à noite em placas de ágar de TB seletivas suplementadas com glicerol a 0,4- 0,45 % (Sigma, 49781), cloreto de magnésio 2 mM e os três antibióti- cos tetraciclina [20 µg/ml], canamicina [50 µg/ml] e espectinomicina [80 µg/ml]. As células foram inoculadas em caldo Lysogeny (LB) de 50 ml contendo cloreto de magnésio 10 mM, tetraciclina [20 µg/ml], canami- cina [50 µg/ml] e espectinomicina [80 µg/ml] e agitadas em um frasco Erlenmeyer durante à noite a 37°C , 180 rpm. No dia seguinte, uma cultura principal de 1000 ml de meio de caldo Terrific (TB) suplemen- tado com glicerol a 0,4-0,45% (Sigma, 49781), MgCl2 10mM, tetraci- clina [20 µg/ml], canamicina [50 µg/ml] e espectinomicina [80 µg/ml] foram inoculada a uma diluição de densidade ótica de 0,1 em 600nm (OD600nm), incubada em um frasco Erlenmeyer em 180 rpm, 37°C. O polissacarídeo recombinante foi expresso constitutivamente, a hemoli- sina A foi induzida com arabinose de um promotor pBAD e PglB com isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) em uma densidade ótica OD600nm de 0,74 e agitada durante à noite em 180 rpm e 37°C. As célu- las foram colhidas, centrifugadas a 4°C, 9000 rpm por 15 minutos e lavadas com 110 ml de cloreto de sódio a 0,9 % e um equivalente a 1560 OD600nm foi extraído por um procedimento de choque osmótico. As células foram ressuspensas em 5 ml de TBS 1/3 x (solução salina tamponada com Tris, Fisher Scientific) e 2,5 ml de tampão de ressus- pensão (sacarose a 75% (p/v), EDTA 30 mM, Tris-HCl 600 mM pH 8,5)
e giradas por 20 minutos a 4°C.
As células foram precipitadas e res- suspensas em 7,5 mL de tampão de choque osmótico (Tris-HCI 10 mM, pH 8,0), seguido de outra incubação de 30 minutos a 4°C.
As cé- lulas foram centrifugadas novamente por centrifugação, os sobrena- dantes foram recuperados e filtrados com um filtro de 0,2 micrômetro. 2 ml do filtrado foram suplementados com uma solução de cloreto de sódio 5M a uma concentração final de 50mM e o pH foi ajustado para 5,5 com ácido cítrico 1M.
A amostra foi centrifugada por centrifugação em 14000 rpm, a 4 °C por 5 minutos.
Uma coluna de purificação foi preparada (coluna Proteus FliQ FPLC; 1 ml; generon) com 1 ml de uma resina de permuta de cátions (Nuvia HR-S, Biorad) e equilibrada com Citrato 20 mM, NaCl 50 mM, pH 5,5 em um sistema FPLC (Aekta, Amersham Pharmacia). A amostra foi aplicada com uma superalça de 2 ml, a coluna foi lavada com 5 ml de Citrato 20 mM, NaCl 50 mM, pH 5,5 e o bioconjugado foi eluído aplicando um gradiente para Citrato 20 mM, NaCl 500 mM, pH 5,5 em 10 volumes da coluna.
As frações de fluxo total e lavagem coletadas foram de 500 microlitros, as frações de eluição tiveram um volume de 350 microlitros. 45 microlitros das fra- ções cromatográficas foram suplementados com tampão Laemmli concentrado 4 vezes de 15 microlitros para obter uma concentração final de Tris-HCI 62,5 mM pH 6,8, dodecilsulfato de sódio a 2 % (p/v), beta-mercaptoetanol a 5 % (p/v), glicerol a 10 % (v/v), azul bronfenol a 0,005 % (p/v). As amostras foram fervidas a 95 °C por 15 minutos, 40 microlitros foram separados por SDS-PAGE a 4-12 % (Nu-PAGE, Bis- Tris Gel a 4-12 %, life technologies) com tampão fluente MOPS (MOPS 50 mM, Tris Base 50 mM, SDS a 0,1 %, EDTA 1 mM, pH 7,7) em 200 Volts por 45 minutos.
As proteínas foram, então, transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando as pilhas de transferên- cia de gel iBLOT (Novex, by Life Technologies). A nitrocelulose foi blo- queada com leite em pó a 10 % (p/v) dissolvido em PBST (tampão de fosfato 10 mM pH 7,5, cloreto de sódio 137 mM, cloreto de potássio 2,7 mM adquirido de Ambresco E703-500ml, tween a 0,1 % em /v/v) por 20 minutos à temperatura ambiente seguidos de uma detecção por imunomanchamento utilizando um anticorpo anti-Hla de coelho primá- rio (IgG purificada policlonal, Glycovaxyn Nr 160) em 2,5 µg/ml em PBST durante 1 hora à temperatura ambiente. A membrana foi lavada duas vezes com PBST e incubada com um anticorpo acoplado à pero- xidase de rábano silvestre (HRP) anticoelho de cabra secundário (Bio- rad, 170-6515) em PBST por 1 hora à temperatura ambiente. A mem- brana foi lavada 3 vezes com PBST por 5 minutos e as bandas de pro- teínas foram visualizadas por adição de TBM (substrato de membrana de HRP de um componente TMB) e a reação foi interrompida com água desionizada.
[00244] A partir das amostras fervidas, 20 microlitros foram carre- gados em um segundo gel SDS-PAGE a 4-12 % (Nu-PAGE, Bis-Tris Gel a 4-12 %, life technologies) e as proteínas foram separadas em tampão MOPS (MOPS 50 mM, Tris Base 50 mM, SDS a 0,1 %, EDTA 1 mM, pH 7,7) em 200 Volts por 45 minutos. O gel foi corado duas ve- zes consecutivas com 10 ml de SimplyBlue SafeStain (Life Technolo- gies) seguido de uma etapa de descoloração usando água desioniza- da. Os resultados são mostrados na Figura 9.
[00245] Para a proteína não marcada, StGVXN1717 de E.coli (W3110 waaL; wecA-wzzE; rmlB-wecG::Clm) foi cotransformado com os plasmídeos que codificam o polissacarídeo capsular de Sta- phylococcus aureus CP5 (CPS 5) pGVXN393, a proteína transportado- ra de S. aureus HlaH35L-H48C-G122C pGVXN2438 que transporta um sítio de glicosilação na posição 131 e nenhum marcador C-terminal e Campylobacter jejuni oligossacariltransferase PglBcuo N311V-K482R-D483H- A669V pGVXN1221 por eletroporação.
[00246] As bactérias transformadas foram cultivadas durante à noite em placas de ágar TB seletivo suplementadas com glicerol 0,4-0,45 % (Sigma, 49781), cloreto de magnésio 2 mM e os três antibióticos tetra- ciclina [20 µg/ml], espectinomicina [80 µg/ml] e ampicilina [100 µg/ml]. As células foram inoculadas em caldo Lysogeny (LB) de 50 ml conten- do cloreto de magnésio 10 mM, tetraciclina [20 µg/ml], espectinomicina [80 µg/ml] e ampicilina [100 µg/ml] e agitadas em um frasco Erlenme- yer durante à noite a 37 °C, 180 rpm.
No dia seguinte, uma cultura principal de 1000 ml de meio de caldo Terrific (TB) suplementado com glicerol a 0,4-0,45 % (Sigma, 49781), MgCl2 10mM, tetraciclina [20 µg/ml], espectinomicina [80 µg/ml] e ampicilina [100 µg/ml] foi inocula- da a uma diluição de densidade ótica de 0,1 a 600nm (OD600nm), incu- badas em um frasco Erlenmeyer em 180 rpm, 37°C.
O polissacarídeo recombinante foi expresso constitutivamente, a hemolisina A foi indu- zida com arabinose a 0,6 % de um promotor pBAD e PglB com isopro- pil-β-D-tiogalactopiranosídeo 1 mM (IPTG) em uma densidade ótica OD600nm de 0,64 e agitada durante à noite em 180 rpm e 37°C . As cé- lulas foram colhidas, centrifugadas a 4°C, 9000 rpm por 15 minutos e lavadas com 110 ml de cloreto de sódio a 0,9% e um equivalente de 4200 OD600nm foram extraídos por um procedimento de choque osmó- tico.
As células foram ressuspensas em 14 ml de 1/3 x TBS (solução salina tamponada com Tris, Fisher Scientific) e 7 ml de tampão de res- suspensão (sacarose a 75 % (p/v), EDTA 30 mM, Tris-HCl 600 mM pH 8,5) e giradas por 30 minutos a 4°C.
As células foram precipitadas por centrifugação em 8000 rpm por 30 minutos a 4°C e ressuspensas em 21 ml de tampão de choque osmótico (Tris-HCI 10 mM pH 8,0) segui- do de outra incubação de 30 minutos a 4°C.
As células foram centrifu- gadas novamente por centrifugação, os sobrenadantes foram recupe- rados e filtrados com um filtro de 0,2 micrômetros. 2 ml do filtrado fo- ram suplementados com uma solução de cloreto de sódio 5M para uma concentração final de 50mM, o pH foi ajustado para 5,5 com áci-
do cítrico 1M, ajustando o volume para 4 ml.
A amostra foi centrifuga- da por centrifugação em 14000 rpm, a 4 °C por 5 minutos.
Uma coluna de purificação foi preparada (coluna Proteus FliQ FPLC; 1 ml; gene- ron) com 1 ml de uma resina de permuta de cátions (Nuvia HR-S, Bio- rad) e equilibrada com Citrato 20 mM, NaCl 50 mM, pH 5,5 em um sis- tema FPLC (Aekta, Amersham Pharmacia). 2 ml da amostra foram aplicados com uma superalça de 2 ml, a coluna foi lavada com 5 ml de Citrato 20 mM, NaCl 50 mM, pH 5,5 e o bioconjugado foi eluído apli- cando um gradiente para Citrato 20 mM, NaCI 500 mM, pH 5,5 em 10 volumes da coluna.
As frações de fluxo total e lavagem coletadas fo- ram de 500 microlitros, as frações de eluição tiveram um volume de 350 microlitros. 45 microlitros das frações cromatográficas foram su- plementados com tampão Laemmli concentrado 4 vezes de 15 microli- tros para obter uma concentração final de Tris-HCI 62,5 mM pH 6,8, dodecil sulfato de sódio a 2 % (p/v), beta-mercaptoetanol a 5 % (p/v), glicerol a 10 % (v/v), azul bronfenol a 0,005 % (p/v). As amostras fo- ram fervidas a 95 °C por 15 minutos. 20 microlitros das mesmas foram separados por SDS-PAGE a 4-12 % (Nu-PAGE, Bis-Tris Gel a 4-12 %, life technologies) com tampão fluente MOPS (MOPS 50 mM, Tris Base 50 mM, SDS a 0,1 %, EDTA 1 mM, pH 7,7) em 200 Volts por 45 minu- tos para o Western Blot mostrado na Figura 10) A). As proteínas fo- ram, então, transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando as pilhas de transferência de gel iBLOT (Novex, by Life Technologies). A nitrocelulose foi bloqueada com leite em pó a 10 % (p/v) dissolvido em PBST (tampão de fosfato 10 mM pH 7,5, cloreto de sódio 137 mM, cloreto de potássio 2,7 mM adquirido de Ambresco E703-500ml, tween a 0,1 % em /v/v) por 20 minutos à temperatura ambiente seguidos de uma detecção por imunomanchamento utilizando um anticorpo primá- rio anti-Hla de coelho (IgG purificada policlonal, Glycovaxyn Nr 160) em 2,5 µg/ml em PBST durante 1 hora em temperatura ambiente.
A membrana foi lavada duas vezes com PBST e incubada com um anti- corpo acoplado à peroxidase de rábano silvestre (HRP) anticoelho de cabra secundário (Biorad, 170-6515) em PBST por 1 hora à tempera- tura ambiente. A membrana foi lavada 3 vezes com PBST por 5 minu- tos e as bandas de proteína foram visualizadas por adição de TBM (substrato de membrana de HRP de um componente Tde MB) e a rea- ção foi interrompida com água desionizada.
[00247] A partir das amostras fervidas, 40 microlitros foram carre- gados em um segundo gel SDS-PAGE a 4-12% por coloração Sim- plyBlues (Nu-PAGE, Bis-Tris Gel a 4-12%, life technologies) e as pro- teínas foram separadas em tampão fluente MOPS (MOPS 50 mM, Tris Base a 50 mM, SDS a 0,1%, EDTA a 1 mM, pH 7,7) em 200 Volts por 45 minutos. O gel foi corado duas vezes consecutivas com 10 ml de SimplyBlue SafeStain (Life Technologies) seguido de uma etapa de descoloração usando água desionizada. Os resultados são mostrados na Figura 10.
[00248] A presente descrição não deve ser limitada no escopo pe- las concretizações específicas aqui descritas. De fato, várias modifica- ções do assunto aqui fornecido, além das descritas, tornar-se-ão evi- dentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior e das figuras acompanhantes. Tais modificações devem se enquadrar no escopo das reivindicações anexas.
[00249] Várias publicações, patentes e pedidos de patente são cita- dos aqui, cujas divulgações são incorporadas por referência na sua totalidade.

Claims (49)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína Hla modificada tendo uma sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO. 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo me- nos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO. 1, modificada, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos compreende substituições de aminoácidos nas posi- ções H48 e G122 de SEQ ID NO. 1 ou em posições equivalentes den- tro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO. 1, em que as referidas substituições são H a C e G a C.
2. Proteína Hla modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser também modificada em que a se- quência de aminoácidos compreende uma substituição de aminoáci- dos na posição H35 de SEQ ID NO. 1 ou em uma posição equivalente dentro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO. 1
3. Proteína Hla modificada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida substituição de aminoáci- dos na posição H35 é H a L.
4. Proteína Hla modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de ser também modi- ficada em que a sequência de aminoácidos compreende uma ou mais sequências de consenso selecionadas de: D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12), em que X e Z são in- dependentemente qualquer aminoácido separado da prolina.
5. Proteína Hla modificada, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que um ou mais aminoácidos (por exem- plo, 1-7 aminoácidos, por exemplo, um aminoácido) da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 %
idêntica à SEQ ID NO. 1 foi(foram) substituído(s) por uma sequência de consenso D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 1) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12).
6. Proteína Hla modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que uma sequên- cia de consenso selecionada de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K- D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) foi adicionada a, ou substituída por um ou mais aminoácidos selecionados de K131, S203, S239 e K273 de SEQ ID NO. 1 ou em uma posição equivalente dentro de uma se- quência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1
7. Proteína Hla modificada, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que uma sequência de consenso selecio- nada de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) foi adicionada a, ou substituída pelo aminoácido K131 de SEQ ID NO. 1 ou em uma posição equivalente dentro de uma sequên- cia de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1
8. Proteína Hla modificada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que uma sequência de consenso selecio- nada de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO. 11) e K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO. 12) foi substituída pelo aminoácido K131 de SEQ ID NO. 1 ou em uma posição equivalente dentro de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1
9. Proteína Hla modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizada pelo fato de que X é Q (gluta- mina) e Z é R (arginina) (por exemplo, K-D-Q-N-R-T-K (SEQ ID NO: 23)).
10. Proteína Hla modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica à sequência de SEQ ID NO. 3).
11. Proteína Hla modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos também compreende um marcador peptídico que é útil para a purificação da proteína Hla, em que o referido marcador peptí- dico compreende opcionalmente seis resíduos de histidina ou uma re- petição HR (por exemplo, HRHR (SEQ ID NO: 25) e opcionalmente o referido marcador peptídico está localizado no C-terminal da sequên- cia de aminoácidos.
12. Proteína Hla modificada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o marcador peptídico compreende um ou dois aminoácidos adicionais no N-terminal, por exemplo, GS (SEQ ID NO: 26).
13. Proteína Hla modificada, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 5, 6, 9 ou 10 ou uma sequência pelo menos 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica a qualquer uma de SEQ ID NO: 5, 6, 9 ou 10.
14. Proteína Hla modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos também compreende uma sequência sinal que é ca- paz de direcionar a proteína Hla para o periplasma de uma célula hos- pedeira (por exemplo, bactéria), sendo opcionalmente a referida se- quência sinal selecionada a partir de SEQ ID NO. 13-21, opcionalmen- te a referida sequência estando no N-terminal da proteína.
15. Proteína Hla modificada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende um ou dois aminoácidos adicionais (por exemplo, S) entre a sequência sinal e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 1 ou a sequência de amino- ácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO. 1, em que opcionalmente a referida proteína Hla tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica à SEQ ID NO. 5 ou SEQ ID NO. 9
16. Proteína Hla modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende um ou dois aminoácidos adicionais (por exemplo, S) no N-terminal.
17. Proteína Hla modificada, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a referida proteína Hla tem a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% idên- tica à SEQ ID NO. 6 ou SEQ ID NO. 10)
18. Proteína Hla modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a proteína Hla modificada é glicosilada.
19. Conjugado compreendendo uma proteína Hla modifica- da, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, carac- terizado pelo fato de que a proteína Hla modificada está ligada a um antígeno, por exemplo, um antígeno de polissacarídeo ou oligossaca- rídeo.
20. Conjugado, de acordo com a reivindicação 19, caracte- rizado pelo fato de que a proteína Hla modificada é covalentemente ligada ao referido antígeno através de uma ligação química obtida usando um método de conjugação química, opcionalmente seleciona- do a partir do grupo que consiste em química de carbodiimida, amina- ção redutiva, química de cianilação (por exemplo, química de CDAP),
química da maleimida, química da hidrazida, química do éster e quími- ca da N-hidroxissuccinimida, diretamente ou por meio de um ligante.
21. Conjugado, de acordo com a reivindicação 19, caracte- rizado pelo fato de ser um bioconjugado.
22. Conjugado (por exemplo, bioconjugado), de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que o antígeno está ligado a um aminoácido na proteína Hla modifica- da selecionada dentre asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, cisteína, tirosina, histidina, arginina ou triptofano (por exemplo, asparagina).
23. Conjugado (por exemplo, bioconjugado), de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um sacarídeo, opcionalmente um sacarídeo capsular bacteriano (por exemplo, de Staphylococcus aureus) opcionalmente selecionado a partir de um sacarídeo capsular sorotipo 5 ou 8 de S. aureus.
24. Conjugado (por exemplo, bioconjugado), de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um sa- carídeo capsular sorotipo 5 de Staphylococcus aureus.
25. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína Hla modificada, como definida em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 17.
26. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o po- linucleotídeo como definido na reivindicação 25.
27. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende: v) um ou mais ácidos nucleicos que codificam glicosiltrans- ferase(s); vi) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transfe- rase;
vii) um ácido nucleico que codifica uma proteína Hla modifi- cada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 17; e op- cionalmente viii) um ácido nucleico que codifica uma polimerase (por exemplo, wzy).
28. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira compreen- de (a) uma glicosiltransferase que monta um derivado de monossaca- rídeo hexose em pirofosfato de undecaprenila (Und-PP) e (b) uma ou mais glicosiltransferases capazes de adicionar um monossacarídeo ao derivado de monossacarídeo hexose montado em Und-PP.
29. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a referida glicosiltransferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em Und-PP é heteróloga à célula hospedeira e/ou heteróloga a um ou mais dos genes que codifi- cam glicosiltransferase(s) opcionalmente em que a referida glicosil- transferase que monta um derivado de monossacarídeo hexose em Und-PP é das espécies Escherichia, espécies Shigella, espécies Kleb- siella, espécies Xhantomonas, espécies Salmonella, espécies Yersi- nia, espécies Aeromonas, espécies Francisella, espécies Helicobacter, espécies Proteus, espécies Lactococcus, espécies Lactobacillus, es- pécies Pseudomonas, espécies Corynebacterium, espécies Strep- tomyces, espécies Streptococcus, espécies Enterococcus, espécies Staphylococcus, espécies Bacillus, espécies Clostridium, espécies Lis- teria ou espécies Campylobacter, opcionalmente wecA (por exemplo, wecA de E. coli).
30. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizada pelo fato de que o referido deri- vado de monossacarídeo hexose é qualquer monossacarídeo em que a posição C-2 é modificada com um grupo acetamido, como N-
acetilglicosamina (GlcNAc), N-acetilgalactoseamina (GalNAc), 2,4- Diacetamido-2,4,6-tridesóxi-hexose (DATDH), N-acetilfucoseamina (FucNAc) ou N-acetilquinovosamina (QuiNAc).
31. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizada pelo fato de que a(s) referida(s) uma ou mais glicosiltransferase(s) capaz(es) de adicionar um monos- sacarídeo ao derivado de monossacarídeo hexose montado em Und- PP é(são) a galactofuranosiltransferase (wbeY) de E. coli O28 ou a galactofuranosiltransferase (wfdK) de E. coli O167 ou a galactofurano- siltransferase (wbeY) de E. coli O28 e a galactofuranosiltransferase (wfdK) de E. coli O167.
32. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizada pelo fato de que a célula hospe- deira compreende glicosiltransferases suficientes para síntese de uni- dades de repetição do sacarídeo de S. aureus CP5 compreendendo capH, capl, capJ e/ou capK de S. aureus CP5 e opcionalmente capD, capE, capF, capG, capL, capM, capN, capO e/ou capP de S. aureus CP5.
33. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizada pelo fato de que a célula hospe- deira compreende glicosiltransferases suficientes para as unidades de repetição de síntese do sacarídeo de S. aureus CP5 compreendendo capH, capl, capJ e/ou capK de S. aureus CP5 e, opcionalmente, wbjB, wbjC, wbjD, wbjE, wbjF, wbjL, wbpM, wzz e/ou wzx de P. aeruginosa O11 e wecB e/ou wecC de E. coli O16.
34. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 33, caracterizada pelo fato de que a oligossacaril transferase é derivada de Campylobacter jejuni, opcionalmente em que a referida oligossacaril transferase é pglB de C. jejuni, opcional- mente em que o gene pglB de C. jejuni é integrado no genoma da cé-
lula hospedeira e opcionalmente em que pelo menos um gene da célu- la hospedeira foi inativado ou deletado funcionalmente, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospedeira foi inativado ou deletado funcionalmente, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospe- deira foi substituído por um ácido nucleico que codifica uma oligossa- cariltransferase, opcionalmente em que o gene waaL da célula hospe- deira foi substituído por C. jejuni pgIB.
35. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 34, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma polimerase polissacarídica capsular (por exemplo, wzy) ou uma polimerase antigênica O (por exemplo, wzy), opcionalmente a referida polimerase polissacarídea capsular é de Staphylococcus aureus, opcionalmente de S. aureus CP5 ou CP8.
36. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 35, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma flippase (wzx), opcionalmente em que a referida flippase é de Staphylococcus aureus, opcionalmente de S. aureus CP5 ou CP8.
37. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 36, caracterizada pelo fato de que também com- preende uma enzima capaz de modificar um monossacarídeo, opcio- nalmente uma epimerase, opcionalmente em que a referida epimerase é das espécies Escherichia, espécies Shigella, espécies Klebsiella, espécies Xhantomonas, espécies Salmonella, espécies Yersinia, es- pécies Aeromonas, espécies Francisella, espécies Helicobacter, espé- cies Proteus, espécies Lactococcus, espécies Lactobacillus, espécies Pseudomonas, espécies Corynebacterium, espécies Streptomyces, espécies Streptococcus, espécies Enterococcus, espécies Staphylo- coccus, espécies Bacillus, espécies Clostridium, ou espécies Listeria ou espécies Campylobacter, opcionalmente em que a referida epime-
rase é de E. coli, opcionalmente Z3206 de E. coli O157 ou galE.
38. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 37, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a proteína Hla modificada está em um plasmídeo na célu- la hospedeira.
39. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 38, caracterizada pelo fato de que a célula hospe- deira é E. coli.
40. Método para produzir um bioconjugado que compreen- de uma proteína Hla modificada ligada a um sacarídeo, caracterizado pelo fato de que compreende (i) cultivar a célula hospedeira como de- finida em qualquer uma das reivindicações 27 a 39, sob condições adequadas para a produção de proteínas e (ii) isolar o bioconjugado.
41. Bioconjugado produzido pelo método, como definido na reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que compreende um saca- rídeo ligado a uma proteína Hla modificada.
42. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína Hla modificada, como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 18, ou o conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 24, ou o bioconjugado como de- finido na reivindicação 41.
43. Método de preparar a composição imunogênica como definida na reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que compre- ende a etapa de misturar a proteína Hla modificada ou o conjugado ou o bioconjugado com um excipiente ou transportador farmaceuticamen- te aceitável.
44. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a composição imunogênica, como definida na reivindicação 42, e um excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
45. Método para o tratamento ou prevenção da infecção por
Staphylococcus aureus em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao referi- do indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína Hla modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou o conjugado como definido em qualquer uma das reivindica- ções 19 a 24, ou o bioconjugado como definido na reivindicação 41.
46. Método de imunizar um hospedeiro humano contra a in- fecção por Staphylococcus aureus, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora da proteína Hla modificada, como definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 18, ou o conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 24, ou o bioconjugado como definido na reivindica- ção 41.
47. Método de induzir uma resposta imune ao Staphylococ- cus aureus em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compre- ende a administração de uma quantidade terapeuticamente ou profila- ticamente eficaz da proteína Hla modificada, como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 18, ou o conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 24, ou o bioconjugado como de- finido na reivindicação 41.
48. Proteína Hla modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou o conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, ou o bioconjugado de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento ou prevenção de uma doença causada pela infecção por Staphylococ- cus aureus.
49. Uso da proteína Hla modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou o conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 24, ou o bioconjugado como definido na reivindicação 41, caracterizado pelo fato de ser para a fa-
bricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença causada por infecção por Staphylococcus aureus.
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