JP2021500869A - 試料内ターゲット分析物を分析する方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の一態様によれば、本発明は、次の段階を含む試料内ターゲット分析物の分析方法を提供する:
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階;前記データセットは、信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットを補正する段階;
前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成する段階;
前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のフィッティング正確度を決定する段階;及び
前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階。
本発明によれば、ターゲット分析物に対するデータセットを得る。前記データセットは信号−発生手段を用いる前記ターゲット分析物に対する信号−発生反応から得られ、前記データセットは、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含む。
ターゲット分析物、特にターゲット核酸分子は様々な方法で増幅され得る。例えば、ターゲット分析物の増幅に対する様々な方法が知られており、これらの方法は、重合酵素連鎖反応(polymerase chain reaction(PCR))、リガーゼ連鎖反応(ligase chain reaction(LCR))(米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号;PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis et al.,eds,1990))、鎖置換増幅(strand displacement amplification(SDA))(Walker,et al.Nucleic Acids Res.20(7):1691−6(1992);Walker PCR Methods Appl3(1):1−6(1993))、転写媒介増幅(transcription−mediated amplification)(Phyffer,et al.,J.Clin.Microbiol.34:834−841(1996);Vuorinen,et al.,J.Clin.Microbiol.33:1856−1859(1995))、核酸配列基盤増幅(nucleic acid sequence−based amplification(NASBA))(Compton,Nature350(6313):91−2(1991))、ローリングサークル増幅(rolling circle amplification,RCA)(Lisby,Mol.Biotechnol.12(1):75−99(1999);Hatch et al.,Genet.Anal.15(2):35−40(1999))及びQ−べータレプリカーゼ(Q−Beta Replicase)(Lizardi et al.,BiolTechnology6:1197(1988))を含むが、これに限定されない。
データセットを補正する。補正されたデータセットは、データセットを標準化(標準化過程)して生成されるか、データセットに含まれたノイズを除去(ノイズ除去過程)して提供され得る。一具現例によれば、データセットは標準化過程及びノイズ除去過程の両方を用いて補正される。標準化過程はノイズ除去過程の前に行わてもよく後に行われてもよい。
データセットは公知の様々な方法で標準化され得る。
(i)基準サイクルにおける信号値又は(ii)基準サイクルにおける信号値の変形値を用いて標準化係数が生成される。
標準化係数をデータセットに適用して標準化されたデータセットを生成する。標準化係数をデータセットに適用する方式は様々である。標準化係数を比(ratio)として決定した場合、標準化係数は次式2のように適用され、標準化されたデータセットを生成する。
(B−1)ベースライニング
(B−1−a)従来のベースライニング方法
本発明の一具現例によれば、前記データセット又は標準化されたデータセットは、前記データセット又は標準化されたデータセットから背景信号を除去するためにベースライニングすることができる。ベースライン差し引きされたデータセット(baseline subtracted data set)は、当業界に公知の様々な方法によって得られる(米国特許第8,560,247号及びWO2016/052991)。
この接近法は、本出願人によって開発された新規のベースライニング方法である。
データセットから陰性対照群(negative control)を差し引いてデータセットからノイズを除去することができる。陰性対照群は、信号−発生反応のための反応物において反応の進行のための必須成分が1個以上ない実験群である。例えば、核酸増幅反応において陰性対照群は、ターゲット分析物、プライマー又は重合酵素がない実験群である。または、陰性対照群は緩衝液のみある実験群である。具体的に、本発明で用いられる陰性対照群は、核酸増幅反応においてターゲット核酸分子以外の核酸増幅のための成分がある実験群である。
補正されたデータセットに対する非線形関数(non−linear functionregression fitting curve)がフィッティング関数として生成される。
非線形関数が生成された後、補正されたデータセットに対する非線形関数のフィッティング正確度(fitting accuracy)が決定される。
fi:シグモイド関数の各サイクルにおける関数値
ym:データセットの信号値の平均値
L:フィッティング区間の最後のサイクル
n:全サイクルの数
式4は、データセットの全分散に対する誤差(error)の分散を表す。誤差は、データセットとシグモイド関数との差である。式4でデータセットは標準化されたデータセット又は標準化及びベースライニングされたデータセットであり得る。
補正されたデータセットに対する非線形関数のフィッティング正確度を用いて試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する。
本発明の他の態様によれば、本発明は、次のを含む試料内ターゲット分析物の分析装置を提供する:
メモリー;及び
プロセッサ;
前記メモリーは、前記ターゲット分析物に対するデータセットを保存し、前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記プロセッサは、前記データセットを補正し、前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成し、前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数フィッティング正確度を決定し、前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する。
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階;前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットを補正する段階;
前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成する段階;
前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のフィッティング正確度を決定する段階;及び
前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階。
本発明の他の態様によれば、本発明は、次の段階を含む試料内ターゲット分析物の分析方法を提供する:
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階;前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で前記データセットにフィッティングされた二次関数を生成する段階;及び
前記データセットから前記二次関数を差し引いて前記データセットを補正する段階。
この段階は、本発明の最初の態様に記載された内容を参照して説明され得る。
フィッティング関数としてデータセットに対する二次関数は前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で生成される。フィッティングのために様々な従来の非−線形回帰分析方法が本発明に用いられ得る(参照:Seber,G.A.F.;Wild,C.J.(1989)。Nonlinear Regression.New York:John Wiley and Sons)。
前記データセットは、前記データセットから前記二次関数を差し引いて補正する。
本出願人は、単一反応容器で単一類型の検出器を用いて複数のターゲット核酸配列を検出するMuDT技術(WO2015/147412)を開発した。MuDT技術において、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、(i)相対的高温検出温度及び相対的低温検出温度の両方で検出された信号及び(ii)異なる検出温度で信号の変化の関係を示す基準値によって決定される。第1ターゲット核酸配列が相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列であり、第2ターゲット核酸配列が相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列である場合に、第1ターゲット核酸配列に対する基準値を用いて第1ターゲット核酸配列に対する信号を除去することによって、第2ターゲット核酸配列に対する信号は相対的低温検出温度で検出された信号から抽出される。
(a)前記反応容器で前記第1ターゲット核酸配列に対する信号を発生させ得る第1信号−発生手段及び前記第2ターゲット核酸配列に対する信号を発生させ得る第2信号−発生手段を前記試料と共にインキュベーションし、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で信号を検出する段階;前記第1ターゲット核酸配列及び第2ターゲット核酸配列のそれぞれは相応する信号−発生手段によって検出され、前記第1信号−発生手段は、前記第1ターゲット核酸配列が前記試料に存在する場合に、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で信号を発生させ、前記第2信号−発生手段は、前記第2ターゲット核酸配列が前記試料に存在する場合に、前記相対的低温検出温度で信号を発生させ、
(b)前記相対的低温検出温度で検出された信号が第1閾値又は第1信号変位によって定義された第1基準を満たすか否かを識別する段階;前記相対的低温検出温度で検出された信号が前記第1基準を満たすとき、次の段階(c)を進行し、前記相対的低温検出温度で検出された信号が前記第1基準を満たさないとき、前記第1ターゲット核酸配列及び前記第2ターゲット核酸配列が前記試料内に存在しないと決定され、次の段階(c)を進行しなく;及び
(c)(i)前記相対的低温検出温度で検出された信号から前記第1ターゲット核酸配列に対する信号を除去するための基準値及び(ii)前記相対的低温検出温度で検出された信号を用いて前記相対的低温検出温度で検出された信号から前記第2ターゲット核酸配列に対する信号を抽出する段階。
本発明の他の態様によれば、本発明は、次を含む試料内ターゲット分析物の分析装置を提供する:
メモリー;及び
プロセッサ;
前記メモリーは、前記ターゲット分析物に対するデータセットを保存し、前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、そして
前記プロセッサは、前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で前記データセットに対してフィッティングされた二次関数を生成し、前記データセットから前記二次関数を差し引いて前記データセットを補正する。
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階;前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で前記データセットに対する二次関数を生成する段階;及び
前記データセットから前記二次関数を差し引いて前記データセットを補正する段階。
本発明の具体的な具現例を詳細に説明すると、次の通りである:
図1は、一実施例に係るターゲット分析物を分析する装置を示す。図1を参照すると、分析システムは、増幅装置110及び分析装置120を含む。分析システムは、試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定し、ユーザに結果を表示することができる。
(a)本発明は、データセットに対する非線形関数のフィッティング正確度をターゲット分析物分析、特にターゲット分析物の検出に直接の指標として用いて、偽陽性及び偽陰性、特に偽陽性無しでターゲット分析物を検出できるようにする。
データセットの取得
急性下痢の主要原因であるノロウイルス(Norovirus)GI、ノロウイルスGII、アデノウイルス(Adenovirus)及びロタウイルス(Rotavirus)を検出するためにSeegene社のAllplexTMGI−Virus Assayを使用した。
データセットを補正するために陰性対照群差し引き(Negative control Subtraction)を行った。陰性対照群は、試料の添加無しでAllplexTMGI−Virus Assayの構成(component)だけを含む。サンプルに対する核酸増幅反応を行う時、同一プレートで一緒に陰性対照群の増幅反応を行って陰性対照群に対するデータセットを取得した。各サイクルでデータセットの信号値から陰性対照群の信号値を差し引いて補正されたデータセットを取得した。各サンプルに対して陰性対照群差し引きを行い、補正されたデータセットを取得した。
(a)シグモイドフィッティング関数の取得
サンプルのそれぞれから得られた補正されたデータセットに対して4個のパラメータを含む式3を用いてシグモイド関数とのフィッティングを行った。LMアルゴリズム(Levenberg−Marquardtアルゴリズム;Christian Kanzow et al.,JCAM,172(2):375(2004))を適用して、補正されたデータセットにフィッティングされたシグモイド関数を取得した。
シグモイド関数の変位を用いて陰性サンプルをフィルタリングした。シグモイドフィッティング関数の変位は、シグモイドフィッティング関数の最大RFUと最小RFUとの差を計算して取得した。計算された変位と変位に対する閾値(RFU 100)を比較して陰性サンプルをフィルタリングした。前記フィッティングされたシグモイド関数の変位が100(RFU)以下であるサンプルは陰性と決定した。
シグモイドフィッティング関数の最大勾配を用いて残り25個のサンプルに対して二次陰性フィルタリングを行った。最大勾配は、各サンプルに対してシグモイドフィッティング関数を微分して計算した(すなわち、前記シグモイド関数に対するFDM(the first derivative maximum)値)。最大勾配に対する閾値は28に設定された。
陰性と決定された9個のサンプルを除く、残り21個のサンプルに対してフィッティング正確度を計算した。フィッティング正確度としてR2値を用いた。R2値は式4を用いて計算され、R2値に対する閾値は0.87に設定した。R2値が0.87以下であるサンプルは陰性と決定した。
データセットの取得
実施例1と同じ過程によってデータセットを取得した。
Nearest neighbor smoothingアルゴリズム(Winfried Stute et al.,Journal of Multivariate Analysis,34:61(1990))を用いてノイズを除去した。生データセット(raw data set)の差が基準閾値以上になるサイクルまで線形回帰を行ってベースラインを取得し、ベースライン差し引きによって補正されたデータセットを取得した。
前記補正されたデータセットがCt値に対する閾値を超えるか否か判断して、サンプルのそれぞれに対する陽性又は陰性を判定した。補正されたデータセットにおいて閾値を超える信号値があると、そのサンプルを陽性と判定し、閾値を超える信号値がないと、そのサンプルを陰性と判定した。Ct値に対する閾値は、ノロウイルスGI、ノロウイルスGII、アデノウイルス及びロタウイルスに対してそれぞれ120、120、60及び120が用いられた。
本発明と従来方法を適用して30個のサンプルを分析した。サンプルは総30個であり、臨床実験によって陽性サンプルは20個、陰性サンプルは10個と判定された。
SBN(Specific Background signal−based Normalization)方法による標準化によってデータセットを補正した後、本発明の方法によって非線形フィッティング関数を用いて試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を分析した。
4個のターゲット核酸配列に対する実時間重合酵素連鎖反応を行った。3台のCFX96実時間PCR装置(Bio−Rad)を用いて4個のターゲット核酸配列を同時に増幅し、それぞれのターゲット核酸配列に対してTaqManプローブを信号−発生手段として用い、増幅サイクルを50回にして行った。同一のターゲット核酸配列が同一の濃度で含まれたサンプルを用いて各装備別、チャネル別に96個ウェルで96個反応を同一の条件で行い、これから12個グループ(3個装備×4個チャネル)のデータセットを取得した。
装備別/チャネル別基準値を適用してデータセットを補正した。基準総信号変化値(Reference TSC;R−TSC)に対する各装備別/チャネル別データセットの総信号変化値の比率を用いて装備別/チャネル別基準値を決定した。基準総信号変化値は、全ての装備/チャネルに対してRFU5,000と任意に決定し、データセットの総信号変化値は、各装備別/チャネル別に96個反応の平均値を基準にして決定した。前記データセットの基準サイクルの信号値を前記比率で補正し、前記基準サイクルの補正された信号値を基準値として用いて、該当する装備の該当するチャネルから得られたデータセットに適用した。
基準サイクルをデータセットのサイクル5と決定し、前記サイクル5の信号値を基準値の決定に使用した。また、データセットの総信号変化値は、最後50番目のサイクルにおける信号値から基準サイクルにおける信号値を差し引いて算出した。TSC及び基準サイクルの信号値は、表8に整理した。
前記算出された総信号変化値と共に各装備及びチャネルで基準値決定に用いられる基準総信号変化値(reference TSC;R−TSC)をRFU 5,000と指定した。
前記総信号変化値、基準サイクルの信号値及び基準総信号変化値を用いて各装備に適用される基準値を次のように算出した。
前記決定された基準値を用いて、12個グループのデータセットを次のように標準化した:各ウェルのデータセットで基準サイクルの信号値と前記段階3で決定された基準値を用いて標準化係数(Normalization coefficient)を計算した:標準化係数=基準サイクルの信号値÷基準値
標準化係数を用いて全てのサイクルで信号値を標準化し、12個グループに対して標準化されたデータセットを取得した。標準化された信号値(RFU)=データセットの信号値(RFU)÷標準化係数
ベースライニング
12個グループのデータセットと標準化されたデータセットに対するベースライニングを行った。対称軸を有する二次関数を用いてベースライニングを行った。二次関数はy=a(x−50)2+cの形態を使用した。ベースライニングに対するフィッティング区間はサイクル4〜サイクル12と決定した。サイクル4からサイクル12までのデータセットの信号値にフィッティングされる二次関数を生成した。データセットの信号値から二次関数の値を差し引いて12個グループのベースライニングされたデータセットと12個グループの標準化及びベースライニングされたデータセットを得た。
12個グループのベースライニングされたデータセット(図17〜図20参照)及び12個グループの標準化及びベースライニングされたデータセット(図21〜図24)に対して、4個のパラメータを含む式3のシグモイド関数を用いてシグモイド関数とのフィッティングを行った。
試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定するために、シグモイド関数での4個パラメータ、変位、R2及び最大勾配に対する閾値を下記のように設定した:変位≧RFU100;R2≧0.9;最大勾配≧50;及びa4<2.0.
4個の基準を全て満たす場合、ターゲット分析物が試料内に存在すると決定した。4個の基準のいずれか一つでも満たさない場合、ターゲット分析物が試料内に存在しないと決定した。12個グループの標準化されたデータセットに対する非線形フィッティング関数の分析の結果、4個の基準を全て満たし、12個の試料内にターゲット分析物が全て存在すると決定された。
Max.:最大(Maximum)
Range :Max−Min
SD:標準偏差(Standard Deviation)
CV:変動係数(Coefficient of variation)
SBN:特定背景信号基盤標準化(Specific Background signal−based Normalization)
データセットの取得
呼吸器感染の主要原因であるインフルエンザウイルス(Flu A及びFlu B)及び3種のFlu Aサブタイプ(H1,H1pdm09及びH3)を検出するためにSeegene社のAllplexTMRespiratory Panel 1を使用した。
各サンプルのデータセットと第1二次関数をフィッティングした。第1二次関数としてy=ax2+bx+cを使用した。データセットと第1二次関数のフィッティングは、LMアルゴリズム(Levenberg−Marquardtアルゴリズム;Christian Kanzow et al.,JCAM,172(2):375(2004))が適用された。
(a)第1二次関数の係数を用いる陰性1次フィルタリング
第1二次関数を用いた陰性フィルタリングを通過したデータセットに対してCmin値を用いてフィッティング区間を決定した。最小フィッティングサイクルを12に決定し、Cminが12以下である場合にはフィッティング区間をサイクル1からサイクル12まで、そしてCminが12を超える場合にはフィッティング区間をサイクル1からサイクルCminまでと決定し、データセットのフィッティング区間で第2二次関数を生成した。第2二次関数はサイクル50の対称軸を有する関数であり、y=a(x−50)2+cの形態を使用した。フィッティング区間においてデータセットと第2二次関数のフィッティングにはLMアルゴリズムが適用された。
陰性フィルタリングの結果を次表23に整理した。
本発明を適用して10個のサンプルを分析した。それらのうち、第1二次関数のx2の係数を用いて2個サンプルを陰性と判定し、第1二次関数が最小である時のサイクル(Cmin)を用いて2個のサンプルを陰性と判定した。データセットに対する第2二次関数のフィッティング正確度を用いて1個のサンプルを陰性判定した。残り5個サンプルに対するデータセットは、第2二次関数を用いて補正した。
データセットの取得
呼吸器感染の主要原因であるインフルエンザウイルス(Flu A)及びFlu Aサブタイプ(H1pdm09及びH3)を検出するためにSeegene社のAllplexTMRespiratory Panel 1を使用した。
(i)第1ターゲット核酸配列に対する信号を除去するための基準値及び(ii)相対的低温検出温度で検出された信号を用いて、相対的低温検出温度で検出された信号から第2ターゲット核酸配列に対する信号を抽出した。
第1ターゲット核酸配列に対する基準値は検出チャネルによって変わり、サンプル1、3及び4の基準値はそれぞれ、1.3、1.2、及び1.8だった。
第1ターゲット核酸配列に対する信号及び第2ターゲット核酸配列に対する信号のそれぞれを二次関数とフィッティングした。フィッティング区間はサイクル4〜12に設定し、二次関数の対称軸はサイクル50に設定された。フィッティングはLMアルゴリズムを用いて行った。
4個のパラメータを含む式3のシグモイド関数を用いて、前記補正されたデータセットとシグモイド関数のフィッティングを行った。LMアルゴリズムを適用して補正されたデータセットにフィッティングされたシグモイド関数を生成した。
シグモイド関数の変位を用いて陰性サンプルをフィルタリングした。シグモイドフィッティング関数の変位は、シグモイドフィッティング関数の最大信号値と最小信号値との差を計算して取得した。計算された変位と変位に対する閾値(100RFU)を比較して陰性サンプルをフィルタリングした。全サンプルに対する変位がいずれも閾値100を超えた。
シグモイドフィッティング関数の最大勾配を用いて陰性二次フィルタリングを行った。最大勾配は、各サンプルに対してシグモイドフィッティング関数を微分して計算した。最大勾配に対する閾値は30に設定された。表28に整理された通り、サンプル3の第1ターゲット核酸配列に対する信号に対してシグモイドフィッティング関数の最大勾配が30未満であり、よって、サンプル3の第1ターゲット核酸配列を陰性としてフィルタリングした。
フィッティング正確度はR2値を用いた。R2値は式4を用いて計算され、R2値に対する閾値は、0.90を適用した。R2値が0.90を超えるサンプルは陽性と決定された。
MuDT技術と共に非線形フィッティング関数を用いる本発明を適用して4個のサンプルを分析した。相対的低温検出温度で検出された信号の変位が閾値(100RFU)よりも小さい1個のサンプル(サンプル2)を陰性とフィルタリングした。サンプル2は、第1ターゲット核酸配列及び第2ターゲット核酸配列の両方とも存在しないと決定された。
Claims (30)
- 次の段階を含む試料内ターゲット分析物の分析方法:
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階;前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットを補正する段階;
前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成する段階;
前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のフィッティング正確度を決定する段階;及び
前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階。 - 前記非線形関数は、シグモイド(sigmoid)関数であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記シグモイド関数は、次の式3で表示される4個のパラメータを含むシグモイド関数であることを特徴とする、請求項2に記載の方法:
- 前記フィッティング正確度は、前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のx2値(chi square value)又はR2値(R−square value)であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在の決定は、前記フィッティング正確度を前記フィッティング正確度に対する閾値と比較して行われることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在の決定は、前記フィッティング正確度を前記フィッティング正確度に対する閾値と比較し、前記フィッティング正確度が前記閾値を超えるか否か判断して行われることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在の決定は、(i)前記データセット、前記補正されたデータセット又は前記非線形関数の変位(displacement)及び(ii)前記非線形関数の最大勾配から構成された群から選ばれる少なくとも一つのパラメータをさらに用いて行われることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在の決定は、(i)前記データセット、前記補正されたデータセット又は前記4個のパラメータを含むシグモイド関数の変位及び(ii)前記4個のパラメータを含むシグモイド関数の最大勾配及びa4から構成された群から選ばれる少なくとも一つのパラメータをさらに用いて行われることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 前記ターゲット分析物は、ターゲット核酸分子であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記信号−発生反応は、前記ターゲット核酸分子の増幅によって又は増幅無しで信号値を増幅する過程であることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記信号−発生手段は、二合体の形成に依存して信号を生成させることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記信号−発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存して信号を生成させることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記データセットの補正は、次を含む段階によって行われることを特徴とする、請求項1に記載の方法:
(i)基準サイクルにおける信号値又は(ii)前記基準サイクルにおける前記信号値の変形値を用いて標準化係数を生成する段階;及び
前記標準化係数を前記データセットの信号値に適用して前記補正されたデータセットを生成する段階。 - 前記信号−発生反応は、異なる反応環境(reaction environment)で同一のターゲット分析物に対する複数の信号−発生反応を含み、前記データセットは複数のデータセットであり、
前記複数のデータセットは前記複数の信号−発生反応の複数のセットから得られ、前記基準サイクル又は前記基準サイクルと前記基準値は、前記複数のデータセットに同一に適用されることを特徴とする、請求項13に記載の方法。 - 前記複数の信号−発生反応は、異なる機器、異なる反応チューブ又はウェル、異なる試料、異なる量のターゲット分析物、若しくは異なるプライマー又はプローブを含む異なる反応環境で行われることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記補正されたデータセットは、(i)前記データセットに前記標準化係数を適用して標準化されたデータセットを生成するか、(ii)前記データセット又は前記標準化されたデータセットをベースライニングして生成されることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 前記データセットは、(i)相対的高温検出温度で検出された信号である第1ターゲット核酸配列に対する信号及び/又は(ii)相対的低温検出温度で検出された信号から抽出された第2ターゲット核酸配列に対する信号を含み、そして前記第1ターゲット核酸配列及び前記第2ターゲット核酸配列は1つの反応容器から検出されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記第1ターゲット核酸配列に対する信号及び前記第2ターゲット核酸配列に対する信号は次の段階によって得られることを特徴とする、請求項17に記載の方法:
(a)前記反応容器で前記第1ターゲット核酸配列に対する信号を発生可能な第1信号−発生手段及び前記第2ターゲット核酸配列に対する信号を発生可能な第2信号−発生手段を前記試料と共にインキュベーションし、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で信号を検出する段階;前記第1ターゲット核酸配列及び第2ターゲット核酸配列のそれぞれは、相応する信号−発生手段によって検出され、前記第1信号−発生手段は、前記第1ターゲット核酸配列が前記試料に存在する場合に、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で信号を発生させ、前記第2信号−発生手段は、前記第2ターゲット核酸配列が前記試料に存在する場合に、前記相対的低温検出温度で信号を発生させ、
(b)前記相対的低温検出温度で検出された信号が、第1閾値、又は第1信号変位によって定義された第1基準を満たすか否かを識別する段階;前記相対的低温検出温度で検出された信号が前記第1基準を満たすとき、次の段階(c)を進行し、前記相対的低温検出温度で検出された信号が前記第1基準を満たさないとき、前記第1ターゲット核酸配列及び前記第2ターゲット核酸配列が前記試料内に存在しないと決定され、次の段階(c)を進行しなく;及び
(c)(i)前記相対的低温検出温度で検出された信号から前記第1ターゲット核酸配列に対する信号を除去するための基準値及び(ii)前記相対的低温検出温度で検出された信号を用いて前記相対的低温検出温度で検出された信号から前記第2ターゲット核酸配列に対する信号を抽出する段階。 - 前記第2ターゲット核酸配列に対する信号は次の式6によって提供されることを特徴とする、請求項18に記載の方法:
- 前記ベースライニングは、対称軸を有する二次関数を用いて行われることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 次を含む試料内ターゲット分析物の分析装置:
メモリー;及び
プロセッサ;
前記メモリーは、前記ターゲット分析物に対するデータセットを保存し、前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、そして
前記プロセッサは、前記データセットを補正し、前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成し、前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のフィッティング正確度を決定し、前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する。 - 次の段階を含む方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取り可能な記録媒体:
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階;前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットを補正する段階;
前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成する段階;
前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のフィッティング正確度を決定する段階;及び
前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階。 - 次の段階を含む試料内ターゲット分析物の分析方法:
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階;前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で前記データセットにフィッティングされた二次関数を生成する段階;及び
前記データセットから前記二次関数を差し引いて前記データセットを補正する段階。 - 前記二次関数は対称軸を有することを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- 前記フィッティング区間は、開始フィッティングサイクル(Starting Fitting Cycle,SFC)から最小フィッティングサイクル(Minimum Fitting Cycle,MFC)までであることを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- 前記データセットの変位が前記変位に対する閾値を超える場合、前記フィッティング区間は、開始フィッティングサイクル(Starting Fitting Cycle,SFC)から最小フィッティングサイクル(Minimum Fitting Cycle,MFC)までであることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- 前記方法は、前記フィッティング区間で二次関数を生成する段階前に、全領域で前記データセットにフィッティングされた第1二次関数を生成する段階をさらに含み;そして前記フィッティング区間は、前記第1二次関数が最小信号値を有するサイクルに基づいて決定されることを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- 前記方法は、前記二次関数のフィッティング正確度を決定する段階をさらに含み;前記フィッティング正確度が前記フィッティング正確度に対する閾値を超える場合、前記二次関数を差し引く段階が行われることを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- 次を含む試料内ターゲット分析物の分析装置:
メモリー;及び
プロセッサ;
前記メモリーは、前記ターゲット分析物に対するデータセットを保存し、前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、そして
前記プロセッサは、前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で前記データセットに対してフィッティングされた二次関数を生成し、前記データセットから前記二次関数を差し引いて前記データセットを補正する。 - 次の段階を含む方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取り可能な記録媒体:
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階;前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で前記データセットに対する二次関数を生成する段階;及び
前記データセットから前記二次関数を差し引いて前記データセットを補正する段階。
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