JP2007193783A - Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムと正規化を伴うダブルシグモイド関数の曲線フィットを使用したＰＣＲのエルボー判定 - Google Patents

Abstract

【課題】ＰＣＲ増幅曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）などのシグモイド又は成長タイプの曲線のエルボー値などの特徴的な遷移値を判定するシステム及び方法を提供する。
【解決手段】Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスによって判定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、ＰＣＲデータセットにフィットする曲線に対する近似を検出してパラメータの判定を行い、判定されたパラメータの１つ又は複数のものを使用して曲線を正規化し、正規化の後に、根検出アルゴリズムを適用することによって正規化済みの曲線を処理し、正規化済みの曲線を表す関数の根を判定し、次いで、Ｃｔ値が返され、これを表示するか又は更なる処理のために使用する。
【選択図】なし

Description

本発明は、一般に、シグモイド又は成長曲線を表すデータを処理するシステム及び方法に関するものであり、更に詳しくは、ＰＣＲ増幅曲線の特徴的なサイクル閾値（Ｃｙｃｌｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｃｔ）又はエルボー値を判定するシステム及び方法に関するものである。

ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）は、規定の核酸配列を酵素によって合成又は増幅するin vitro方法である。この反応においては、通常、対立するストランドにハイブリダイズし、増幅対象の鋳型又は標的ＤＮＡシーケンスのわきに位置する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、熱安定性を有するＤＮＡポリメラーゼによってプライマーの伸長を触媒する。鋳型の変性、プライマーのアニーリング、及びアニーリングされたプライマーのポリメラーゼによる伸長を伴う反復的な一連のサイクルの結果として、特定のＤＮＡフラグメントが指数的に蓄積される。通常、このプロセスにおいては、増幅プロセスの検出及び定量化を円滑に実行するべく、蛍光プローブ又はマーカーが使用されている。

図１には、代表的なリアルタイムのＰＣＲ曲線が示されており、代表的なＰＣＲプロセスにおける蛍光強度値がサイクル数に対してプロットされている。このケースにおいては、ＰＣＲプロセスのそれぞれのサイクルにおいて、ＰＣＲ産物の形成を監視している。増幅は、通常、増幅反応の際に蛍光信号を計測するコンポーネント及び装置を含むサーモサイクラー内において計測される。このようなサーモサイクラーの一例が、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒである（Ｃａｔ． Ｎｏ．２０１１０４６８）。例えば、増幅産物は、標的核酸に結合された際にのみ蛍光信号を放出する蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブによるか、或いは、特定のケースにおいては、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光染料により、検出される。

代表的なＰＣＲ曲線において、ベースライン領域の終点における遷移点（これは、一般に、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれている）を識別することは、ＰＣＲ増幅プロセスの特性を理解するのに非常に有用である。Ｃｔ値は、ＰＣＲプロセスの効率の尺度として使用可能である。例えば、通常、分析対象であるすべての反応について規定の信号閾値を決定し、この閾値に到達するのに必要なサイクル数（Ｃｔ）を標的核酸及び標準又はハウスキーピング遺伝子などの基準核酸について判定する。標的核酸及び基準核酸について得られたＣｔ値に基づいて、標的分子の絶対的又は相対的な複写数を判定可能である（Ｇｉｂｓｏｎ他による「Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（６巻、９９５〜１００１頁）、Ｂｉｅｃｈｅ他による「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（５９巻、２７５９〜２７６５頁、１９９９年）、ＷＯ ９７／４６７０７、ＷＯ ９７／４６７１２、ＷＯ ９７／４６７１４）。図１のベースライン領域（１５）の終点におけるエルボー値（２０）は、サイクル数３０の領域内に位置することになろう。

ＰＣＲ曲線のエルボー値は、いくつかの既存の方法を使用して判定可能である。例えば、様々な現在の方法においては、ＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｖａｌｕｅ）と呼ばれる既定のレベルに蛍光が到達する値としてエルボーの実際の値を判定している。その他の現在の方法においては、蛍光対サイクル数の二次導関数が極大値に到達するサイクル数を使用可能であろう。これらの方法は、いずれも、いくつかの欠点を具備している。例えば、いくつかの方法は、異常値（雑音）データの影響を非常に受けやすく、ＡＦＬ値法は、高いベースラインを有するデータセットには、十分に機能しない。図１に示されている成長曲線のベースラインの停止点（又は、ベースラインの終点）を判定する従来の方法は、特に、高タイター環境においては、満足に機能することができない。更には、これらのアルゴリズムは、通常、明確に定義されていないと共に線形依存性を有し、且つ、（不可能でない場合にも）多くの場合に最適化が非常に困難である多数（例えば、５０個以上）のパラメータを具備している。

従って、前述の及びその他の問題点を克服するシグモイドタイプ又は成長曲線などの曲線（特に、ＰＣＲ曲線）のエルボー値を判定するシステム及び方法を提供することが望ましい。

本発明は、シグモイド又は成長タイプの曲線のエルボー値などの特徴的な遷移値を判定する新しい効率的なシステム及び方法を提供する。一実装においては、本発明のシステム及び方法は、ＰＣＲ増幅曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）を判定するのに特に有用である。

本発明によれば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスによって判定されたパラメータを有するダブルシグモイドを使用することにより、ＰＣＲデータセットにフィットする曲線に対する近似を検出している。パラメータの判定が完了したら、判定されたパラメータの１つ又は複数のものを使用し、その曲線を正規化可能である。正規化は、増幅曲線のＣｔ値を算出するためにＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）法を選択した場合にＣｔ値を判定するのに有利である。正規化の後に、根検出アルゴリズムを適用して正規化済みの曲線を処理することにより、正規化済みの曲線を表す関数の根を判定する。この根は、Ｃｔ値に対応している。この結果、Ｃｔ値が返され、これを表示するか又は更なる処理に使用可能である。

本発明の第１の態様においては、成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントの判定をコンピュータにより実行する方法が提供され、この方法は、・成長曲線を表すデータセットを受領する段階であって、このデータセットは、それぞれが座標値のペアを具備する複数のデータポイントを含んでいる、段階と、・Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、この関数のパラメータを判定する段階と、判定されたパラメータを使用して曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と、正規化済みの曲線を処理することにより、成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントの座標値を判定する段階と、を有している。

本発明の第２の態様においては、プロセッサを制御して成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを判定するためのコードを含むコンピュータ可読媒体が提供され、このコードは、・成長曲線を表すデータセットを受領する段階であって、このデータセットは、それぞれが座標値のペアを具備する複数のデータポイントを含んでいる、段階と、・Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、関数のパラメータを判定する段階と、判定されたパラメータを使用して曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と；正規化済みの曲線を処理することにより、成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントの座標値を判定する段階と；を実行する命令を含んでいる。

本発明の更に別の態様においては、動的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムが提供され、このシステムは、動的なＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動的ＰＣＲ分析モジュールであって、このデータセットは、それぞれが座標値のペアを具備する複数のデータポイントを含んでおり、且つ、このデータセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）を含む関心の対象である領域内のデータポイントを含んでいる、動的ＰＣＲ分析モジュールと；・Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、この関数のパラメータを判定する段階と、判定されたパラメータを使用して曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と、正規化済みの曲線を処理することにより、成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントの座標値を判定する段階であって、このポイントは、成長曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）を表している、段階と、により、ＰＣＲデータセットを処理してＣｔ値を判定するべく適合されたインテリジェンスモジュールと；を有している。

本発明は、動的なＰＣＲ増幅曲線のベースライン領域の終点又はエルボー値又はＣｔ値などのシグモイド又は成長曲線の遷移値を判定するためのシステム及び方法を提供する。特定の態様においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスによって判定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、曲線に対する近似を検出している。パラメータの判定が完了したら、判定されたパラメータの１つ又は複数のものを使用して曲線を正規化可能である。正規化は、増幅曲線のＣｔ値を算出するためにＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）法を選択した場合にＣｔ値を判定するのに有利である。正規化の後に、根検出アルゴリズムを適用して正規化済みの曲線を処理することにより、正規化済みの曲線を表す関数の根を判定する。この根は、Ｃｔ値に対応している。この結果、Ｃｔ値が返され、これを表示するか又は更なる処理に使用可能である。

図１には、ＰＣＲプロセスの環境における増幅曲線の一例１０が示されている。図示のように、曲線１０は、ラグフェーズ領域１５と、指数フェーズ領域２５と、を含んでいる。ラグフェーズ領域１５は、一般に、ベースライン又はベースライン領域と呼ばれている。このような曲線１０は、ラグフェーズ領域と指数フェーズ領域をつなぐ関心の対象である遷移領域２０を含んでいる。領域２０は、一般に、エルボー又はエルボー領域と呼ばれている。エルボー領域は、通常、ベースラインの終点と、基礎となっているプロセスの成長又は増幅レートにおける遷移と、を規定している。領域２０内の特定の遷移ポイントを識別することは、基礎となっているプロセスの挙動を分析するのに有用であろう。代表的なＰＣＲ曲線においては、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれる遷移ポイントを識別することは、ＰＣＲプロセスの効率特性を理解するのに非常に有用である。

同様のシグモイド又は成長曲線を提供可能なその他のプロセスは、バクテリアプロセス、酵素プロセス、及び結合プロセスを含んでいる。例えば、バクテリア増殖曲線においては、関心の対象である遷移ポイントは、ラグフェーズにおける時点θと呼ばれている。本発明に従って分析可能なデータ曲線を生成するその他の具体的なプロセスは、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセス、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセス、及びＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセスを含んでいる。ＳＤＡ及びＮＡＳＢＡプロセスの例及びデータ曲線については、それぞれ、Ｗａｎｇ，Ｓｈａ−Ｓｈａ他による「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ Ｅｔ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、２００３年、４９（１０）、１５９９頁）と、Ｗｅｕｓｔｅｎ、Ｊｏｓ Ｊ．Ａ．Ｍ．他による「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｌｏａｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ」（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２年、３０（６）、２６）を参照されたい。従って、本明細書の残りの部分においては、ＰＣＲ曲線に対するその適用可能性の観点から本発明の実施例及び態様について説明することとするが、本発明は、その他のプロセスに関係したデータ曲線にも適用可能であることを理解されたい。

図１に示されているように、代表的なＰＣＲ成長曲線のデータは、例えば、ｘ軸を定義するＰＣＲサイクル数と、ｙ軸を定義する蓄積されたポリヌクレオチドの成長のインジケータと、によるものなどの２次元座標系において表現可能である。通常は、蛍光マーカーの使用が、恐らくは、最も広範に使用されている標識の方式であることから、図１に示されているように、蓄積された成長のインジケータは、蛍光の強度値である。但し、使用する特定の標識及び／又は検出の方式に応じて、その他のインジケータを使用することも可能であることを理解されたい。蓄積された信号成長のその他の有用なインジケータの例には、ルミネッセンス強度、化学ルミネッセンス強度、生物ルミネッセンス強度、燐光強度、電荷転送、電圧、電流、電力、エネルギー、温度、粘度、光散乱、放射性強度、反射率、透過率、及び吸収率が含まれている。サイクルの定義も、時間、プロセスサイクル、単位動作サイクル、及び再生サイクルを包含可能である。

全般的プロセスの概要
本発明によれば、動的なＰＣＲ増幅曲線のエルボー値又はＣｔ値などのシングルシグモイド曲線の遷移ポイントを判定するプロセスの一実施例１００については、図２を参照することにより、簡潔に説明可能である。段階１１０において、曲線を表す実験データセットを受領するか又は取得する。図１には、プロットされたＰＣＲデータセットの一例が示されており、この場合には、ｙ軸とｘ軸は、それぞれ、ＰＣＲ曲線の蛍光強度とサイクル数を表している。特定の態様においては、このデータセットは、連続的であって軸に沿って等間隔を有するデータを含む必要がある。

本発明の典型的な実施例においては、本方法は、キーボード、マウス、及びこれらに類似したものなどのデータセットを入力するための入力装置；モニターなどの曲線の領域内の関心の対象である特定のポイントを表すための表示装置；ＣＰＵなどの本方法のそれぞれの段階を実行するのに必要な処理装置；モデムなどのネットワークインターフェイス；データセットを保存するためのデータストレージ装置；プロセッサ上において稼動するコンピュータコード；及びこれらに類似したものを含む（但し、これらに限定されない）従来のパーソナルコンピュータシステムを使用することによって実装可能である。又、本方法は、ＰＣＲ装置内に実装することも可能である。

図１４には、本発明によるシステムが表示されている。この図は、ソフトウェア及びハードウェアリソース間における関係を示す概略的なブロックダイアグラムを示している。本システムは、サーモサイクラー内に配置可能な動的ＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータシステムの一部であるインテリジェンスモジュールと、を有している。データセット（ＰＣＲデータセット）は、ネットワーク接続又は直接接続を介して分析モジュールからインテリジェンスモジュールに（又は、この逆方向に）転送される。データセットは、プロセッサ上において稼動していると共にインテリジェンスモジュールのストレージ装置内に保存されているコンピュータコードにより、図２に示されている方法に従って処理された後に、分析モジュールのストレージ装置に返送され、変更されたデータを表示装置上に表示可能である。特定の実施例においては、ＰＣＲデータ取得装置内にインテリジェントモジュールを実装することも可能である。

プロセス１００が、サーモサイクラーなどのＰＣＲデータ取得装置内に位置するインテリジェンスモジュール内に（例えば、プロセッサ実行命令として）実装されているケースにおいては、データの収集に伴って、データセットをリアルタイムでインテリジェンスモジュールに供給可能であり、或いは、メモリユニット又はバッファ内に保存し、実験が完了した後に、インテリジェンスモジュールに供給することも可能である。同様に、データセットは、取得装置に対するネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、イントラネット、インターネットなど）又は直接接続（例えば、ＵＳＢやその他の直接的な有線又は無線接続）を介してデスクトップコンピュータシステムやその他のコンピュータシステムなどの別個のシステムに供給することも可能であり、或いは、ＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、又はこれらに類似したものなどの携帯型の媒体上において提供することも可能である。特定の態様においては、データセットは、座標値のペアを具備するデータポイント（又は、２次元ベクトル）を含んでいる。ＰＣＲデータの場合には、座標値のペアは、通常、サイクル数と蛍光強度値を表している。段階１１０においてデータセットの受領又は取得が完了した後に、データセットを分析することにより、ベースライン領域の終点を判定可能である。

段階１２０において、曲線の近似を算出する。この段階において、一実施例においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセス又はその他の回帰プロセスによって判定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、データセットを表す曲線の近似を検出している。この近似は、異常値又はスパイクポイントが曲線フィットの品質に対して最小限の影響を具備していることから、「安定」しているとされている。図２は、受領したデータセットのプロットと、本発明に従ってＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｄｔｒ回帰プロセスを使用してダブルシグモイド関数のパラメータを判定することによって判定されたデータセットの安定した近似と、を示している。

特定の態様においては、データセットを処理してベースライン領域の終点を判定する前に、データセット内の異常値又はスパイクポイントを除去又は置換している。スパイクの除去は、段階１１０においてデータセットを取得する前又は後において実行可能である。図３は、ＰＣＲ又はその他の成長曲線を表すデータセット内のスパイクポイントを識別及び置換するためのプロセスフローを示している。

段階１３０において、後程詳述するように、段階１２０において判定されたパラメータを使用して曲線を正規化している。この方式による正規化によれば、曲線のベースライン領域の終点又はベースラインの停止位置を判定又は規定する必要性なしに、Ｃｔ値を判定可能である。この結果、後程詳述するように、段階１４０において、正規化済みの曲線を処理してＣｔ値を判定する。

ＬＭ回帰プロセス
図３の段階５０２〜段階５２４も、データセットの曲線を近似すると共に、フィット関数のパラメータを判定するプロセスフロー（段階１２０）を示している。これらのパラメータは、曲線の正規化（段階１３０）に使用可能である（これは、例えば、本発明の一実施例によれば、ＰＣＲ曲線などのシグモイド又は成長曲線を表すデータセットのベースラインスロープの変更又は除去である）。データセットの処理によってスパイクポイントが除去又は置換された変更済みのデータセットが生成されたら、段階５０２〜段階５２４に従って、この変更済みのスパイクを有していないデータセットを処理することにより、フィット関数のパラメータを識別可能である。

図示の一実施例においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）法を使用することにより、データセットの安定した曲線の近似を算出している。ＬＭ法は、非線形の回帰プロセスであり、これは、非線形関数とデータセット間の距離を最小化する反復的な技法である。これは、最急降下プロセスとＧａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスの組み合わせのように振舞うプロセスであり、現在の近似が十分にフィットしていない場合には、最急降下プロセスのように振舞うが（これは、低速であるが、相対的に高い信頼性を有する収束である）、現在の近似が正確になるに伴って、Ｇａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスのように振舞うことになる（これは、相対的に高速であるが、相対的に低い信頼性を有する収束である）。ＬＭ回帰法は、非線形の回帰問題を解決するべく、広く使用されている。

一般的に、ＬＭ回帰法は、様々な入力を必要とすると共に出力を供給するアルゴリズムを含んでいる。一態様においては、入力は、処理の対象であるデータセットと、このデータへのフィットに使用される関数と、この関数のパラメータ又は変数の初期推定値と、を含んでいる。出力は、関数とデータセット間の距離を最小化する関数のパラメータの組を含んでいる。

一実施例においては、フィット関数は、次のようなダブルシグモイドの形態を有している。

ｆ（ｘ）＝ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ^-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ^-f(x-g)）） （１）

この式をフィット関数として選択した理由は、代表的なＰＣＲ曲線又はその他の成長曲線が有する様々な曲線形状にフィットするためのその柔軟性とその能力に基づいたものである。当業者であれば、必要に応じて、前述のフィット関数やその他のフィット関数の変形を使用可能であることを理解するであろう。

ダブルシグモイド式（１）は、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇという７つのパラメータを具備している。この式は、定数、スロープ、及びダブルシグモイドの和に分解可能である。ダブルシグモイド自体は、２つのシグモイドの乗算である。図４は、ダブルシグモイド式（１）の分解を示している。パラメータｄ、ｅ、ｆ、及びｇは、２つのシグモイドの形状を決定している。最終的な曲線に対するこれらの影響を示すために、次のシングルシグモイドを検討してみよう。

１／（１＋ｅｘｐ^-d(x-e)） （２）

ここで、パラメータｄは、曲線の「シャープネス」を決定しており、パラメータｅは、変曲点のｘ値を決定している。図５は、曲線に対するパラメータｄの影響と、変曲点のｘ値の位置に対するパラメータｅの影響と、を示している。次の表１は、ダブルシグモイド曲線に対するパラメータの影響を示している。

一態様においては、曲線が非現実的な形状を獲得することを防止するべく、ダブルシグモイド式の「シャープネス」パラメータｄ及びｆを制約する必要がある。従って、一態様においては、ｄ＜−１又はｄ＞１．１、或いは、ｆ＜−１又はｆ＞１．１におけるすべての反復を失敗と見なしている。その他の態様においては、パラメータｄ及びｆに対する異なる制約を使用可能である。

Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、反復的なアルゴリズムであるため、通常は、フィットのための関数のパラメータの初期推定値を必要としている。初期推定値が良好であればあるほど、近似も良好になり、アルゴリズムが局所的な最小値に向かって収束する可能性も低くなる。ダブルシグモイド関数の複雑性とＰＣＲ曲線又はその他の成長曲線の様々な形状に起因し、アルゴリズムが局所的な最小値に収束することを防止するには、多くの場合に、すべてのパラメータにおける１つの初期推定値だけでは、十分ではないであろう。従って、一態様においては、複数（例えば、３つ以上）の初期パラメータの組を入力し、最良の結果を保持している。一態様においては、使用している複数のパラメータの組にわたって、大部分のパラメータを一定に保持しており、複数のパラメータの組のそれぞれごとに異なってよいのは、パラメータｃ、ｄ、及びｆのみである。図６は、異なるバラメータの組における３つの曲線形状の例を示している。これらの３つのパラメータの組の選択は、ＰＣＲデータを表す曲線の３つの可能な異なる形状を示している。３つを上回る数のパラメータの組を処理して最良のものを保持することも可能であることを理解されたい。

図３に示されているように、段階５１０において、ＬＭ法の初期入力パラメータを識別している。これらのパラメータは、操作者が入力するか又は算出可能である。一態様によれば、これらのパラメータは、後述するように、段階５０２、５０４、及び５０６によって判定又は設定されている。

初期パラメータ（ａ）の算出
パラメータ（ａ）は、ベースラインの高さであり、この値は、初期パラメータのすべての組にわたって同一である。一態様においては、段階５０４において、データセットから、３番目に小さいｙ軸値（例えば、蛍光値）がパラメータ（ａ）に割り当てられている。この結果、安定した計算が可能である。当然のことながら、その他の態様においては、必要に応じて、最小のｙ軸値や２番目に小さい値などの任意のその他の蛍光値をパラメータ（ａ）に割り当て可能である。

初期パラメータ（ｂ）の算出
パラメータ（ｂ）は、ベースライン及びプラトーのスロープである。この値は、初期パラメータのすべての組にわたって同一である。理想的には、なんらのスロープも存在するべきではないことから、一態様においては、段階５０２において、０．０１という固定値を（ｂ）に対して割り当てている。その他の態様においては、例えば、０〜約０．５の範囲の値などの異なる値をパラメータ（ｂ）に対して割り当て可能である。

初期パラメータ（ｃ）の算出
パラメータ（ｃ）は、曲線の絶対強度を表しており、ＰＣＲデータの場合には、パラメータ（ｃ）は、通常、曲線のＡＦＩを表している。ＡＦＩを算出するには、プラトーの高さが重要である。これを安定した方法で算出するべく、一態様においては、段階５０４において、３番目に大きなｙ軸値（例えば、蛍光値）をプラトーの高さとして割り当てている。この結果、ＡＬＩ＝「プラトーの高さ」−「ベースラインの高さ」＝「３番目に大きな蛍光値」−（ａ）である。その他の態様においては、必要に応じて、最大のｙ軸値や次に大きいものなどの任意のその他の蛍光値をパラメータ（ｃ）に対して割り当て可能である。

図６に示されているように、最後の２つのパラメータの組の場合には、ｃ＝ＡＦＩである。最初のパラメータの組の場合には、ｃ＝ＡＦＩ＋２である。この変化は、パラメータの最初の組によってモデル化された曲線の形状に起因しており、これは、プラトーを具備していない。

パラメータ（ｄ）及び（ｆ）の算出
パラメータ（ｄ）及び（ｆ）は、２つのシグモイドのシャープネスを定義している。これらのパラメータにおける曲線に基づいて近似を付与する方法は存在していないことから、一態様においては、段階５０２において、３つの代表的な固定値を使用している。その他の固定した又は固定されていない値をパラメータ（ｄ）及び／又は（ｆ）に使用することも可能であることを理解されたい。これらのペアは、遭遇するＰＣＲ曲線の大部分の共通的な形状をモデル化している。次の表２は、図６に示されているパラメータの異なる組における（ｄ）及び（ｆ）の値を示している。

パラメータ（ｅ）及び（ｇ）の算出
段階５０６において、パラメータ（ｅ）及び（ｇ）を判定している。パラメータ（ｅ）及び（ｇ）は、２つのシグモイドの変曲点を定義している。一態様においては、これらは、いずれも、すべての初期パラメータの組にわたって同一の値を有している。パラメータ（ｅ）及び（ｇ）は、同一又は異なる値を具備可能である。近似を検出するべく、一態様においては、強度の平均を上回る最初のポイントのｘ値を使用している（これは、例えば、蛍光であるが、スパイクではない）。この態様に従って（ｅ）及び（ｇ）の値を判定するプロセスが図７に示されており、以下、これについて説明する。

図７を参照すれば、まず、曲線の平均（例えば、蛍光強度）を判定している。次いで、平均を上回る最初のデータポイントを識別している。次いで、（ａ）そのポイントが、曲線の開始点の近傍（例えば、最初の５サイクル内）に位置していないかどうか、（ｂ）そのポイントが、曲線の終点の近傍（例えば、最後の５つのサイクル内）に位置していないかどうか、及び（ｃ）そのポイントの周り（例えば、その周りの２ポイントの半径内）の導関数が符号の変化を示していないかどうか（変化を示している場合には、そのポイントは、スパイクである可能性が高く、従って、拒絶する必要がある）を判定している。

次の表３は、一態様に従って図６に使用されている初期パラメータ値の例を示している。

再度図３を参照すれば、段階５１０において、すべてのパラメータが設定された後に、入力されたデータセット、関数、及びパラメータを使用してＬＭプロセス５２０を実行する。従来は、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法を使用することにより、非線形の最小二乗問題を解決している。従来のＬＭ法においては、曲線の近似とデータセット間の誤差の二乗の合計として定義されている距離の尺度を算出している。しかしながら、二乗の合計を最小化する場合には、異常値の距離が、スパイクではないデータポイントの距離を上回っているために、異常値に対して大きな重みが付与されることになり、この結果、しばしば、不適切な曲線や好ましくない曲線が得られることになってしまう。従って、本発明の一態様によれば、絶対誤差の合計を極小化することにより、近似とデータセット間の距離を演算している（この結果、この場合には、異常値に対して大きな重みが付与されない）。この態様においては、近似とデータ間の距離は、次式によって付与される。

距離＝Σ｜ｙ_data−ｙ_{approximation}｜ （３）

前述のように、一態様においては、段階５２２及び段階５２４に示されているように、複数（例えば、３つ）の初期パラメータの組のそれぞれを入力し、処理した後に、最良の結果を保持しており、この最良の結果は、式（３）における最も小さい又は最小の距離を提供するパラメータの組である。一態様においては、パラメータの大部分を複数のパラメータの組にわたって一定に保持しており、パラメータのそれぞれの組ごとに異なってよいものは、ｃ、ｄ、及びｆのみである。任意の数の初期パラメータの組を使用可能であることを理解されたい。

図８は、本発明によるパラメータの組におけるＬＭプロセス５２０のプロセスフローを示している。前述のように、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、最急降下プロセス又はＧａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスのように動作可能である。この挙動は、減衰係数λによって左右される。λが大きいほど、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、最急降下プロセスのように挙動することになる。一方、λが小さいほど、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、Ｇａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスのように挙動することになる。一態様においては、λは、０．００１から始まっている。λは、０．０００００１〜約１．０などの任意のその他の値から始まることも可能であることを理解されたい。

前述のように、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、反復的な技法である。一態様によれば、図８に示されているように、それぞれの反復において、次の各段階を実行している。

１．先行する近似のヘッセ行列（Ｈ）を算出する。

２．先行する近似の転置ヤコビ行列（Ｊ^T）を算出する。

３．先行する近似の距離ベクトル（ｄ）を算出する。

４．現在の減衰係数λにより、次のようにヘッセ行列の対角項を増大させる。

Ｈ_aug＝Ｈλ （４）

５．増大した式を次のように解く。

Ｈ_augｘ＝Ｊ^Tｄ （５）

６．増大した式の解ｘを関数のパラメータに追加する。

７．新しい近似及び曲線間の距離を算出する。

８．新しいパラメータの組を有する距離が、以前のパラメータの組を有する距離を下回っている場合には、・その反復は成功であると見なされ、・パラメータの新しい組を維持又は保存し、・減衰係数λを（例えば、係数１０だけ）減少させる。新しいパラメータの組を有する距離が、以前のパラメータの組を有する距離を上回っている場合には、・その反復は失敗であると見なされ、・パラメータの新しい組を破棄し、・減衰係数λを（例えば、係数１０だけ）増大させる。

一態様においては、図８のＬＭプロセスは、次の基準の中の１つが実現されるまで反復される。

１．既定の反復回数Ｎだけ既に実行されている。この第１の基準は、アルゴリズムが無制限に反復されることを防止している。例えば、図１０に示されている一態様においては、既定の反復値Ｎは、１００である。アルゴリズムが収束可能である場合には、１００回の反復は、アルゴリズムが収束するのに十分なものであるはずである。一般に、Ｎは、１０未満〜１００超の範囲をとることができる。

２．２つの成功した反復間の距離の差が、閾値（例えば、０．０００１）を下回っている。差が非常に小さくなった場合には、所望の精度が既に実現されており、解がそれ以上大幅に良好になることはないことから、反復を継続するのは無意味である。

３．減衰係数λが既定の値を超過している（例えば、１０²⁰を上回っている）。λが非常に大きくなると、アルゴリズムは、現在の解よりも良好に収束することはなく、従って、反復を継続するのは無意味である。一般に、この規定値は、１０²⁰を大幅に下回る又は上回るものであってよい。

パラメータの判定が完了した後に、判定されたパラメータの１つ又は複数のものを使用して曲線を正規化可能である。例えば、一態様においては、曲線の線形成長部分を減算することにより、ゼロのスロープを具備するように曲線を正規化又は調節可能である。数学的には、これは、次のように表される。

ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳ）＝ｄａｔａ−（ａ＋ｂｘ） （６）

ここで、ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳ）は、ベースライン減算の後の正規化された信号であり、これは、例えば、線形の成長又はベースラインスロープが減算又は除去されたデータセット（ｄａｔａ）である。パラメータａ及びｂの値は、ＬＭ式を使用して曲線を回帰させることによって判定された値であり、ｘは、サイクル数である。従って、ｘ軸に沿ったすべてのデータ値について、定数ａとスロープｂにｘ値を乗算したものをデータから減算することにより、ゼロのスロープを有するデータ曲線を生成している。特定の態様においては、ＬＭ回帰プロセスをデータセットに適用して正規化パラメータを判定する前に、スパイクポイントをデータセットから除去している。

別の態様においては、次式に従って、ゼロのスロープを具備するように曲線を正規化又は調節可能である。

ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳＤ）＝（ｄａｔａ−（ａ＋ｂｘ））／ａ （７）

ここで、ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳＤ）は、除算を有するベースライン減算の後の正規化された信号であり、これは、例えば、線形の成長又はベースラインスロープを減算又は除去し、この結果をａによって除算したデータセット（ｄａｔａ）である。パラメータａ及びｂの値は、ＬＭ式を使用して曲線を回帰させることによって判定された値であり、ｘは、サイクル数である。従って、ｘ軸に沿ったすべての値について、定数ａとスロープｂにｘ値を乗算したものをデータから減算し、この結果をパラメータａの値によって除算することにより、ゼロのスロープを有するデータ曲線を生成している。特定の態様においては、ＬＭ回帰プロセスをデータセットに適用して正規化パラメータを判定する前に、スパイクポイントをデータセットから除去している。

更に別の態様においては、曲線は、次式に従って、正規化又は調節可能である。

ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＤ）＝ｄａｔａ／ａ （８）

ここで、ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＤ）は、ベースライン除算の後の正規化された信号であり、これは、例えば、パラメータａによって除算されたデータセット（ｄａｔａ）である。パラメータａ及びｂの値は、ＬＭ式を使用して曲線に回帰させることによって判定された値であり、ｘは、サイクル数である。特定の態様においては、ＬＭ回帰プロセスをデータセットに適用して正規化パラメータを判定する前に、スパイクポイントをデータセットから除去している。

当業者であれば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ又はその他の回帰プロセスによって判定されたパラメータを使用することにより、その他の正規化式を使用してベースラインを正規化及び／又は変更可能であることを理解するであろう。

式（６）、（７）、又は（８）、或いは、その他の正規化式を使用する曲線の正規化が完了した後に、Ｃｔ値を判定可能である。一態様においては、根検出プロセス又はモデルを正規化済みの曲線に適用している。根検出プロセス、アルゴリズム、又は方法とは、通常、収束基準が満足されるまで解の改善を反復的に継続することにより、関数の１つ又は複数の根を判定するプロセスのことである。有用な根検出プロセスには、Ｎｅｗｔｏｎ法（これは、Ｎｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎ法とも呼ばれている）、二分法、減衰Ｎｅｗｔｏｎ法、ＢＦＧＳ、準Ｎｅｗｔｏｎ法、割線法、Ｂｒｅｎｔの主軸法、並びに、これら及びその他の根検出法の様々な変形が含まれる。これら及びその他の根検出法の例については、「Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｒｅｃｉｐｅｓ Ｉｎ Ｃ： Ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ」（Ｃａｍｂｒｉｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ０−５２１−４３１０８−５）の第９章を参照されたい。その他の根検出法については、当業者には明らかであろう。

特定の実施例においては、正規化済みの曲線をＡＦＬ値の関数と等しくなるように設定しており、この関数は、使用する正規化法に応じて変化可能である。例えば、前述の３つの正規化法のそれぞれごとに１つのＡＦＬ値を規定するには、式（６）及び（７）が「０」に正規化し、式（８）が「１」に正規化することから、根検出プロセスが適切に収束できるように、追加の規則を実装する必要がある。従って、一態様においては、式（８）を使用する場合には、式（１）をＡＦＬ値に等しくなるように設定し、式（６）又は（７）を使用する場合には、式（１）をＡＦＬ−１に等しくなるように設定している。以下、これについて、式（６）、（７）、及び（８）の正規化法のそれぞれごとに数学的に示すこととする。一態様においては、式（６）のベースライン減算法を使用する場合には、根検出プロセス又は方法を次式に適用している。

ＡＦＬ−１＝ｃ／（（１+ｅｘｐ^-d(x-e）（１＋ｅｘｐ^-f(x-g)）） （９）

一態様においては、式（７）の除算を有するベースライン減算法を使用する場合には、根検出プロセス又は方法を次式に適用している。

ＡＦＬ−１＝（ｃ／ａ）／（（１+ｅｘｐ^-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ^-f(x-g)）） （１０）

一態様においては、式（８）のベースライン除算法を使用する場合には、根検出プロセス又は方法を次式に適用している。

ＡＦＬ＝（１／ａ）［ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１+ｅｘｐ^-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ^-f(x-g)））］ （１１）

当業者には周知のように、ＡＦＬ値は、通常、分析法の開発者が提供するか又は判定していることを理解されたい。更には、異なる分析法には異なる正規化式を使用することが相対的に有利となることについても理解されたい。例えば、ＨＰＶ分析法の場合には、このタイプの分析法は、通常、高いベースラインを具備しているため、式（６）による正規化法を使用することが相対的に有利であろう。ＨＣＶ分析法の場合には、式（７）又は（８）による正規化法を使用するほうが相対的に有利であろう。当業者であれば、特定の分析法に応じて、いずれの１つ又は複数の正規化法が相対的に適当であるかについて容易に理解することができよう。

一実施例に従って動的なＰＣＲ曲線のエルボー値又はＣｔ値を判定するための更に詳細なプロセスが図９に示されている。段階９１０において、データセットを取得している。判定プロセスが、サーモサイクラーなどのＰＣＲデータ取得装置内に位置するインテリジェンスモジュール内に（例えば、プロセッサ実行命令として）実装されているケースにおいては、データセットは、データの収集に伴って、インテリジェンスモジュールにリアルタイムで供給可能であり、或いは、メモリユニット又はバッファ内に保存し、実験が完了した後に、モジュールに供給することも可能である。同様に、データセットは、取得装置に対するネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、イントラネット、インターネットなど）又は直接接続（例えば、ＵＳＢ又はその他の直接的な有線又は無線接続）を介してデスクトップコンピュータシステムなどの別個のシステムに供給することも可能であり、或いは、ＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、又はこれらに類似したものなどの携帯型の媒体上において供給することも可能である。

データセットの受領又は取得が完了した後に、段階９２０において、曲線に対する近似を判定する。この段階においては、一実施例においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスによって判定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、データセットを表す曲線の近似を検出している。又、図３を参照して説明したように、段階９２０の前に、スパイクポイントをデータセットから除去することも可能である。例えば、段階９１０において取得されたデータセットは、既にスパイクが除去されたデータセットであってもよい。段階９３０において、曲線を正規化する。特定の態様においては、前述の式（６）、（７）、又は（８）の中の１つを使用して曲線を正規化している。例えば、段階９２０において判定したダブルシグモイド式のパラメータを使用し、前述の式（６）に従ってベースラインスロープを減算することにより、ベースラインをゼロスロープに設定可能である。段階９４０において、根検出方法又はプロセスを正規化済みの曲線に対して適用することにより、根を判定している。この根は、エルボー又はＣｔ値に対応している。適用する根検出法は、前述のアルゴリズムのいずれか、或いは、当業者には明らかな任意のその他のアルゴリズムを包含可能である。段階９５０において、結果を、例えば、分析を実行したシステム又は分析を要求した別個のシステムに返している。段階９６０において、Ｃｔ値を表示している。データセットの全体や曲線の近似などの追加データを表示することも可能である。図９の分析を実行したシステムと結合されているモニター画面又はプリンタなどの表示装置によってグラフィカルな表示をレンダリング可能であり、或いは、表示装置上にレンダリングするための別個のシステムにデータを供給することも可能である。

実施例
図１０に示されているデータに対してダブルシグモイド／ＬＭ法を適用することにより、次の表１に示されているように、式（１）の７つのパラメータの値が得られる。

表１
ａ ８．７４１６８
ｂ ０．０３９１０９９
ｃ ５１．７６８２
ｄ ０．２５０３８１
ｅ ８．０９９５１
ｆ ０．５４８２０４
ｇ １５．７７９９

次いで、これらのデータを式（７）に従って正規化（除算を有するベースライン減算）することにより、図１１に示されているグラフが得られる。図１１に示されている実線は、式（７）に従って正規化されたデータセットに対して式（１）のダブルシグモイド／ＬＭを適用した結果である。この場合のＡＦＬ値は、１．５であり、従って、ＡＦｌ−１を有する式（１０）の使用結果は、０．５に等しく、ＢＦＧＳ準Ｎｅｗｔｏｎ法を使用した根の検出により、１２．０７のＣｔ値が得られる。

このダブルシグモイド／ＬＭ法の別の例が図１２に示されている。図１２の実線は、次の表２に示されているパラメータ値を有するデータのダブルシグモイド／ＬＭ曲線フィットである。

表２
推定値
ａ １．４７０３７
ｂ ０．００９３３５３４
ｃ １０．９４６４
ｄ ０．７９３１６
ｅ ３５．９０８５
ｆ ０．１０８１６５
ｇ ４９．１９３

このデータセットに対して正規化式（７）を適用した後の結果が、ダブルシグモイド／ＬＭ曲線フィットと共に図１３に示されている。このケースにおけるパラメータ値は、表２に示されている。このケースのＡＦＬ値は、１．５であり、従って、ＡＦＬ−１を有する式（１０）の使用結果は、０．５に等しく、ＢＦＧＳ準Ｎｅｗｔｏｎ法を使用して根を検出することにより、３５．２４のＣｔ値が得られる。

結論
本発明の一態様によれば、成長曲線のベースラインの終点におけるポイントを判定するコンピュータ実装された方法が提供される。この方法は、通常、成長曲線を表すデータセットを受領する段階であって、このデータセットは、それぞれが座標値のペアを具備する複数のデータポイントを含んでいる、段階と、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、関数のパラメータを判定する段階と、を含んでいる。本方法は、通常、判定されたパラメータを使用して曲線を正規化し、正規化された曲線を生成する段階と、正規化済みの曲線を処理して成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントの座標値を判定する段階と、を更に含んでいる。一態様においては、データセットは、動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの増幅成長曲線を表しており、ベースライン領域の終点におけるポイントは、動的ＰＣＲ曲線のエルボー又はサイクル閾値（Ｃｔ）を表している。本発明のその他の態様においては、データセットは、動的なＰＣＲ（Ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プロセス、バクテリアプロセス、酵素プロセス、又はバインディングプロセスの成長曲線を表している。特定の実施例においては、データセットは、動的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの成長曲線を表しており、ベースライン領域の終点におけるポイントは、成長曲線のエルボー又はサイクル閾値（Ｃｔ）を表している。

本発明の特定の態様においては、正規化段階は、曲線を表すデータセットの線形成長部分を減算する段階を含んでいる。特定の実施例においては、処理段階は、正規化済みの曲線に対して根検出プロセスを適用する段階を含んでいる。別の実施例においては、根検出プロセスは、Ｎｅｗｔｏｎ法、二分方法、減衰Ｎｅｗｔｏｎ法、ＢＦＧＳ法、準Ｎｅｗｔｏｎ法、割線法、及びＢｒｅｎｔの主軸法から構成される群から選択されたプロセスを含んでいる。

特定の態様においては、ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ^-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ^-f(x-g)））という形態を有しており、算出段階は、関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に判定する段階を含んでいる。特定の実施例においては、少なくともパラメータａ及びｂが判定され、正規化段階は、線形成長部分ａ＋ｂｘを曲線から減算する段階を含んでいる。更に別の実施例においては、正規化済みの曲線を処理する段階は、正規化済みの曲線に対して根検出アルゴリズムを適用する段階と、正規化済みの曲線をＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）−１に等しくなるように設定する段階と、を含んでいる。特定の実施例においては、少なくともパラメータａ及びｂが判定され、正規化段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階と、この結果をパラメータａによって除算する段階と、を含んでいる。

別の実施例においては、少なくともパラメータａが判定され、正規化段階は、曲線をパラメータａによって除算する段階を含んでいる。特定の実施例においては、正規化済みの曲線を処理する段階は、正規化済みの曲線に対して根検出アルゴリズムを適用する段階と、正規化済みの曲線をＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）に等しくなるように設定する段階と、を含んでいる。別の特定の実施例においては、正規化済みの曲線を処理する段階は、正規化済みの曲線に対して根検出アルゴリズムを適用する段階と、正規化済みの曲線をＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）−１に等しくなるように設定する段階と、を含んでいる。更に別の特定の実施例においては、座標値のペアは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積とサイクル数を表している。特定の実施例においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネッセンス強度値、化学ルミネッセンス強度値、燐光強度値、電荷転送値、生物ルミネッセンス強度値、又は吸収値の中の１つによって表されている。

本発明の別の態様によれば、プロセッサを制御して成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを判定するためのコードを含むコンピュータ可読媒体が提供される。このコードは、通常、成長曲線を表すデータセットを受領し（このデータセットは、それぞれが座標値のペアを具備する複数のデータポイントを含んでいる）、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、関数のパラメータを判定するための命令を含んでいる。又、本コードは、通常、判定されたパラメータを使用して曲線を正規化して正規化済みの曲線を生成し、正規化済みの曲線を処理して成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントの座標値を判定するための命令をも含んでいる。一態様においては、データセットは、動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセス、バクテリアプロセス、酵素プロセス、又はバインディングプロセスの成長曲線を表している。特定の態様においては、曲線は、動的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの増幅曲線であり、ベースライン領域の終点におけるポイントは、動的なＰＣＲ曲線のエルボー又はサイクル閾値（Ｃｔ）を表している。特定の態様においては、正規化段階は、曲線の線形成長部分を減算する段階を含んでいる。特定の態様においては、本コードは、ベースライン領域の終点におけるポイントの座標値を返す又は表示するための命令を更に包含可能である。

特定の実施例においては、座標値のペアは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積とサイクル数を表している。特定の実施例においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネッセンス強度値、化学ルミネッセンス強度値、燐光強度値、電荷転送値、生物ルミネッセンス強度値、又は吸収値の中の１つによって表されている。

特定の実施例においては、正規化するための命令は、データセットから線形成長部分を減算するための命令を含んでいる。別の特定の実施例においては、処理するための命令は、正規化済みの曲線に対して根検出プロセスを適用するための命令を含んでいる。特定の実施例においては、根検出プロセスは、Ｎｅｗｔｏｎ法、二分法、減衰Ｎｅｗｔｏｎ法、ＢＦＧＳ法、準Ｎｅｗｔｏｎ法、割線法、及びＢｒｅｎｔの主軸法から構成された群から選択されたプロセスを含んでいる。

特定の態様においては、ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ^-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ^-f(x-g)））という形態を有しており、算出するための命令は、関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に判定するための命令を含んでいる。特定の実施例においては、少なくともパラメータａ及びｂが判定され、正規化するための命令は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算するための命令を含んでいる。特定の実施例においては、正規化済みの曲線を処理するための命令は、正規化済みの曲線に対して根検出アルゴリズムを適用し、正規化済みの曲線をＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）−１に等しくなるように設定するための命令を含んでいる。

別の特定の実施例においては、少なくともパラメータａ及びｂが判定され、正規化するための命令は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算し、この結果をパラメータａによって除算するための命令を含んでいる。特に、正規化済みの曲線を処理するための命令は、正規化済みの曲線に対して根検出アルゴリズムを適用し、正規化済みの曲線をＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）−１に等しくなるように設定するための命令を包含可能である。

その他の特定の態様においては、少なくともパラメータａが判定され、正規化するための命令は、曲線をパラメータａによって除算するための命令を含んでいる。特定の実施例においては、正規化済みの曲線を処理するための命令は、正規化済みの曲線に対して根検出アルゴリズムを適用し、正規化済みの曲線をＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）に等しくなるように設定するための命令を含んでいる。

本発明の更に別の態様によれば、動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムが提供される。本システムは、通常、動的なＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動的ＰＣＲ分析モジュール（このデータセットは、それぞれが座標値のペアを具備する複数のデータポイントを含んでおり、本データセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）を含む関心の対象である領域内のデータポイントを含んでいる）と、ＰＣＲデータセットを処理してＣｔ値を判定するべく適合されたインテリジェンスモジュールと、を含んでいる。インテリジェンスモジュールは、通常、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、関数のパラメータを判定し、判定されたパラメータを使用して曲線を正規化して正規化済みの曲線を生成すると共に、正規化済みの曲線を処理して成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントの座標値を判定することにより（このポイントは、成長曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）を表している）、ＰＣＲデータセットを処理する。

本発明によるシステムの特定の実施例においては、正規化段階は、データセットから線形成長部分を減算する段階を含んでいる。別の特定の実施例においては、処理段階は、正規化済みの曲線に対して根検出プロセスを適用する段階を含んでいる。特定の実施例においては、根検出プロセスは、Ｎｅｗｔｏｎ法、二分法、減衰Ｎｅｗｔｏｎ法、ＢＦＧＳ法、準Ｎｅｗｔｏｎ法、割線法、及びＢｒｅｎｔの主軸法から構成された群から選択されたプロセスを含んでいる。

別の態様においては、座標値のペアは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積とサイクル数を表している。特定の実施例においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネッセンス強度値、化学ルミネッセンス強度値、燐光強度値、電荷転送値、生物ルミネッセンス強度値、又は吸収値の１つによって表されている。

特定の実施例にいては、動的ＰＣＲ分析モジュールは、動的サーモサイクラー装置内に存在しており、インテリジェンスモジュールは、分析モジュールに対して通信可能に結合されたプロセッサを含んでいる。特定の実施例においては、インテリジェンスモジュールは、ネットワーク接続又は直接接続のいずれかによって分析モジュールに対して結合されているコンピュータシステム内に存在するプロセッサを含んでいる。

特定の態様においては、ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ^-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ^-f(x-g)））という形態を有しており、算出段階は、関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に判定する段階を含んでいる。特定の実施例においては、少なくともパラメータａ及びｂが判定され、正規化段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階を含んでいる。特定の実施例においては、正規化済みの曲線を処理する段階は、正規化済みの曲線に対して根検出アルゴリズムを適用する段階と、正規化済みの曲線をＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）−１に等しく設定する段階と、を含んでいる。

別の実施例においては、少なくともパラメータａ及びｂが判定され、正規化段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階と、この結果をパラメータａによって除算する段階と、を含んでいる。特定の実施例においては、正規化済みの曲線は、正規化済みの曲線に対して根検出アルゴリズムを適用する段階と、正規化済みの曲線をＡＬＦ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）−１に等しくなるように設定する段階と、を含んでいる。

別の特定の実施例においては、少なくともパラメータａが判定され、正規化段階は、曲線をパラメータａによって除算する段階を含んでいる。特定の実施例においては、正規化済みの曲線を処理する段階は、正規化済みの曲線に対して根検出アルゴリズムを適用する段階と、正規化済みの曲線をＡＬＦ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）に等しくなるように設定する段階と、を含んでいる。

図面と請求項を含む本明細書の残りの部分を参照することにより、本発明のその他の特徴及び利点を理解することができよう。以下、添付の図面との関連において、本発明の更なる特徴及び利点、並びに、本発明の様々な実施例の構造及び動作について詳細に説明することとする。尚、添付図面中においては、類似の参照符号により、同一又は機能的に類似した要素を示している。

曲線近似と根検出プロセスを含むＣｔ判定プロセスは、コンピュータシステムのプロセッサ上において稼動するコンピュータコードとして実装可能であることを理解されたい。このコードは、プロセッサを制御してＣｔ判定プロセスの様々な態様及び段階を実装するための命令を含んでいる。本コードは、通常、ハードディスク、ＲＡＭ、或いは、ＣＤやＤＶＤなどの携帯型の媒体上に保存される。同様に、プロセッサに結合されたメモリユニット内に保存されているプロセッサ実行命令を含むサーモサイクラーなどのＰＣＲ装置の内部に本プロセスを実装することも可能である。このような命令を含むコードは、周知のように、コード供給源に対するネットワーク接続又は直接的な接続を介して、或いは、携帯型の媒体を使用することにより、ＰＣＲ装置のメモリにダウンロード可能である。

当業者であれば、本発明のエルボー判定プロセスは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｆｏｒｔｒａｎ、ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃなどの様々なプログラミング言語、並びに、データの視覚化及び分析に有用な事前パッケージングされたルーチン、関数、及び手順を提供するＭａｔｈｅｍａｔｉｃａなどのアプリケーションを使用してコーディング可能であることを理解するであろう。後者の更なる例がＭＡＴＬＡＢ（登録商標）である。

以上、一例として、特定の実施例の観点から本発明について説明したが、本発明は開示された実施例に限定されるものではないことを理解されたい。逆に、本発明は、当業者には明らかな様々な変更及び類似の構成を包含することを意図するものである。従って、添付の請求項の範囲には、これらのあらゆる変更及び類似の構成を包含するべく最も広範な解釈を付与することを要するものである。

蛍光強度対サイクル数としてプロットされた代表的なＰＣＲ成長曲線の一例を示している。 成長曲線のベースライン領域の終点（又は、ＰＣＲ曲線のＣｔ値）を判定するためのプロセスフローを示している。 本発明の一実施例によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。 図３Ａのつづき。 図３Ｂのつづき。 図３Ｃのつづき。 図３Ｄのつづき。 図３Ｅのつづき。 パラメータａ〜ｇを含むダブルシグモイド式の分解を示している。 曲線に対するパラメータ（ｄ）の影響と、変曲点のｘ値の位置に対する（ｅ）の影響と、示している。 異なるパラメータの組における３つの曲線形状の一例を示している。 一態様に従ってダブルシグモイド式のパラメータ（ｅ）及び（ｇ）の値を判定するプロセスを示している。 図７Ａのつづき。 初期のパラメータの組におけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示している。 図８Ａのつづき。 図８Ｂのつづき。 図８Ｃのつづき。 一実施例に従ってＰＣＲプロセスのエルボー値を判定する更に詳細なプロセスフローを示している。 ＰＣＲデータセットのプロットを示している。 式（７）の除算を有するベースライン減算法を使用した正規化後の図１０のデータセットを示している。 別のＰＣＲデータセットのプロットを示している。 式（７）の除算を有するベースライン減算法を使用した正規化後の図１２のデータセットを示している。 ソフトウェア及びハードウェアリソース間における関係を示す概略的なブロックダイアグラムを示している。

Claims (16)

1. 成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントの判定をコンピュータにより実行する方法において、
   成長曲線を表すデータセットを受領する段階であって、前記データセットは、それぞれが座標値のペアを具備する複数のデータポイントを含んでいる、段階と、
   Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用して前記データセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、前記関数のパラメータを判定する段階と、
   前記判定されたパラメータを使用して前記曲線を正規化し、正規化された曲線を生成する段階と、
   前記正規化済みの曲線を処理して前記成長曲線の前記ベースライン領域の前記終点におけるポイントの座標値を判定する段階と、
   を有する方法。
2. 正規化する段階は、前記データセットから線形成長部分を減算する段階を含む請求項１記載の方法。
3. 処理する段階は、前記正規化済みの曲線に対して根検出プロセスを適用する段階を含んでおり、前記根検出プロセスは、Ｎｅｗｔｏｎ法、二分法、減衰Ｎｅｗｔｏｎ法、ＢＦＧＳ法、準Ｎｅｗｔｏｎ法、割線法、及びＢｒｅｎｔの主軸法から構成された群から選択されたプロセスを含む請求項１記載の方法。
4. 前記ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１+ｅｘｐ^-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ^-f(x-g)））という形態を有しており、算出する段階は、前記関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に判定する段階を含む請求項１記載の方法。
5. 少なくとも前記パラメータａ及びｂが判定され、正規化する段階は、前記曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階を含む請求項４記載の方法。
6. 前記正規化済みの曲線を処理する段階は、前記正規化済みの曲線に対して根検出アルゴリズムを適用する段階と、前記正規化済みの曲線をＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）−１に等しくなるように設定する段階と、を含む請求項５記載の方法。
7. 少なくとも前記パラメータａが判定され、正規化する段階は、前記曲線をパラメータａによって除算する段階を含む請求項４記載の方法。
8. 前記正規化済みの曲線を処理する段階は、前記正規化済みの曲線に対して根検出アルゴリズムを適用する段階と、前記正規化済みの曲線をＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）に等しくなるように設定する段階と、を含む請求項７記載の方法。
9. 少なくとも前記パラメータａ及びｂが判定され、正規化する段階は、前記曲線から前記線形成長部分を減算する段階と、この結果をパラメータａによって除算する段階と、を含む請求項４記載の方法。
10. 前記正規化済みの曲線を処理する段階は、前記正規化済みの曲線に対して根検出アルゴリズムを適用する段階と、前記正規化済みの曲線をＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）−１に等しくなるように設定する段階と、を含む請求項９記載の方法。
11. 前記データセットは、動的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）プロセスの成長曲線を表しており、前記ベースライン領域の前記終点における前記ポイントは、前記成長曲線のエルボー又はサイクル閾値（Ｃｔ）を表している請求項１記載の方法。
12. プロセッサを制御して成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを判定するためのコードを含むコンピュータ可読媒体であって、
    前記コードは、
    成長曲線を表すデータセットを受領する段階であって、前記データセットは、それぞれが座標値のペアを具備する複数のデータポイントを含んでいる、段階と、
    Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用して前記データセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、前記関数のパラメータを判定する段階と、
    前記判定されたパラメータを使用して前記曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と、
    前記正規化済みの曲線を処理し、前記成長曲線の前記ベースライン領域の前記終点におけるポイントの座標値を判定する段階と、
    を実行するための命令を含んでいる、コンピュータ可読媒体。
13. 前記ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１+ｅｘｐ^-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ^-f(x-g)））という形態を有しており、前記算出するための命令は、前記関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に判定するための命令を含む請求項１２記載のコンピュータ可読媒体。
14. 前記コードは、前記ベースライン領域の前記終点における前記ポイントの前記座標値を返す又は表示するための命令を更に含む請求項１２記載のコンピュータ可読媒体。
15. 動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムにおいて、
    動的ＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動的ＰＣＲ分析モジュールであって、前記データセットは、それぞれが座標値のペアを具備する複数のデータポイントを含んでおり、前記データセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）を含む関心の対象である領域内のデータポイントを含んでいる、動的ＰＣＲ分析モジュールと；
    Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用して前記データセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、前記関数のパラメータを判定する段階と、
    前記判定されたパラメータを使用して前記曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と、
    前記正規化済みの曲線を処理し、前記成長曲線の前記ベースラインの前記終点におけるポイントの座標値を判定する段階であって、前記ポイントは、前記成長曲線の前記サイクル閾値（Ｃｔ）を表している、段階と、
    により、前記ＰＣＲデータセットを処理して前記Ｃｔ値を判定するべく適合されたインテリジェンスモジュールと；
    を有するシステム。
16. 前記ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１+ｅｘｐ^-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ^-f(x-g)））という形態を有しており、算出する段階は、前記関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に判定する段階を含む請求項１５記載のシステム。

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