JP2021169425A - 超音波増感剤 - Google Patents

Abstract

【課題】患者に対する負担を軽減した、ＳＤＴ（Sonodynamic Therapy：超音波化学治療法）に適用できる化合物の提供。【解決手段】式（Ｉ）で示される電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体又はその薬理学的に許容される塩。[Ｒは、−Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＮａ)２、アスパラギン酸残基或いはグルタミン酸残基、又は−ＮＨ(ＣＨ２ＣＨ２)ｎＯＨ（ｎは、１から３の整数を表す）を表す。］【選択図】図１４

Description

本発明は、新規な電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその薬理学的に許容される塩、それらを有効成分とする超音波化学療法（ＳＤＴ：Sonodynamic Therapy）用として使用する癌疾患治療剤、皮膚疾患治療剤、並びに抗菌剤に関する。
また、これらをＣｕやＭｎ金属錯体化することにより、更に水溶性を増大させた新規な電子求引基担持フェニルクロリン金属錯体誘導体或いはエチレングリコール金属錯体誘導体又はその薬理学的に許容される塩に関する。

癌の新しい治療法として、超音波化学療法（ＳＤＴ：Sonodynamic Therapy）用が行われている。これはある種のポルフィリン誘導体を静脈内注射などの方法により投与して、癌（腫瘍）組織に選択的に集積させた後、超音波を照射することにより癌組織のみを選択的に破壊することにより癌細胞を消滅させる治療法であり、ポルフィリン誘導体が有する癌組織への選択的集積性と、超音波増感作用という２つの特性を利用した治療法である。

他方、光物理化学的診断・治療法（ＰＤＴ：Photodynamic Therapy）は光照射による治療法で、ポルフィリン誘導体が有する癌組織への選択的集積性と、光増感作用という２つの特性を利用した治療法である。

本発明者の１人は、このＰＤＴに使用することができるポルフィリン誘導体について鋭意研究を進めてきており、これまでにＡＴＸ−Ｓ１０をはじめとする誘導体を多数提供してきている（特許文献１）。

一方、ＳＤＴ増感剤として、これまでに癌疾患用に５−アミノレブリン酸塩酸塩（５−ＡＬＡ）や、クロリンＣｅ^６−Ｓｎ錯体（Ｔ−Ｃｅ^６）並びにエチレングリコール担持クロリンＳｎ錯体（ＡＣＴ４２１１）が開発されている（特許文献２、非特許文献１及び２）。

近年、５−ＡＬＡを用いたＰＤＴによる癌診断・治療が有効であることが分ってきている。
また、５−ＡＬＡを用いたＳＤＴによる癌治療の試みもなされている。
しかしながら、５−ＡＬＡはプロトポルフィリンＩＸの生合成前駆体であり、プロトポルフィリンＩＸの化合物特性、すなわち新生血管集積性が低いこと、最長波長吸収端が６３０ｎｍであること並びに光毒性が存在し、超音波による活性が弱いことから良好なＳＤＴ治療剤とは言えない。

他方、Ｔ−Ｃｅ^６やＡＣＴ４２１１は植物体由来のクロロフィル誘導体で、我々の長年の研究から、動物由来でなく植物由来であることからこれらの安全性について必ずしも良好とは言えなかった。すなわち、本発明者らの開発した電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体は、血液由来のプロトポルフィリンから４〜５工程を経て合成して得られた誘導体である。本発明者らが創生したクロリン類は、生体内で分解してプロトポルフィリン代謝を経て通常の代謝ルートで排出されるため、特に安全であることが示唆される。

本出願人らは、ＳＤＴ用の化合物として、超音波増感剤である前願物質のクロリンＭｎ金属錯体（特許文献３）を出願してきた。
ところで、これまで提案してきたクロリン物質（特許第５１７９２４５号：特許文献４、特許第５６５１４２６号：特許文献５）は、Ｍｎ錯体化することにより光毒性が避けられる化合物であった。

我々は、先に前願物質（特許文献３：特開２０１８−１９９６４９号公報）を開発したが、その発明物質には分子内にヨード分子を含むことで、少なからず問題があった。ヨード分子は放射線診断剤となるメリットがあったが、一方ヨード分子はアレルギー発症のもとになると思われており、分子内にヨード分子を含まない化合物が求められていた。

一方、本発明者の一人のこれまでの研究によりポルフィリン骨格に電子求引基を結合、並びにＭｎ錯体化させれば光毒性を消去できることが分かっており、その上抱水クロラールが超音波に感度良く反応することから、２個以上の塩素分子が存在すれば良いことも分かっていた。
そこで、クロル化フェニル基を結合させたポルフィリンを開発したが（非特許文献３）、水溶性が極めて乏しくＳＤＴ増感剤として利用することが出来なかった。

そこで、電子求引基担持フェニルクロリン化合物をこれまでの研究により癌への親和性が高まることが分かっているアスパラギン酸（特許文献１）のような多価カルボン酸基や多価水酸基を持つ官能基と結合させることにより水溶性が確保出来るものと逐次研究開発を重ねた。更により水溶性を持たせるためにＭｎ、Ｃｕ及びＦｅ錯体も検討した。

研究の結果、２個以上のカルボン酸を持つアミノ酸や、２個以上のエチレングリコール体を結合させて水溶性と癌親和性を併せ持つ誘導体を見出した。

新規な本電子求引基担持フェニルフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体にあっては、癌治療剤のみならず軟膏剤、ローション剤等のＳＤＴ用の外用剤としても感染症の治療に有効であることを確認し、本発明を完成させるに至った。

また、更なる水溶性の確保に向けては、本新規クロリン誘導体をＭｎ、Ｆｅ及びＣｕ金属錯体とすることも可能である。

特許第３６１３５９９号 アメリカ特許第６４６２１９２号 特開２０１８−１９９６４９号公報 特許第５１７９２４５号 特許第５６５１４２６号

Anticancer Res., 31(2) 501 (2011) Intergr. Cancer The., 7(2) 96 (2008) Cancer Sci., 98: 916 (2007)

したがって本発明は、超音波化学療法（ＳＤＴ：Sonodynamic Therapy）に使用し得る電子求引基担持フェニルクロリンアミノ酸誘導体又はエチレングリコール誘導体、更には、それら電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体のＭｎ、ＣｕやＦｅ錯体を有効成分とするＳＤＴ用の癌注射剤や外用剤、特に癌治療剤、皮膚疾患治療剤、並びに抗菌剤を提供することを課題とする。

かかる課題を解決するための本発明は、その一つの基本的態様として、次式（Ｉ）：

［式中、
Ｘは、次式

（なお、上記置換基を、以下、［化２］と称する。）
又は次式

（なお、上記置換基を、以下、［化３］と称する。）

（上記式中、Ｙは電子吸引基を示し、ハロゲン原子、ＮＨ_２、ＯＨ、又はＯＣＨ_３である）で表される基を表し、
Ｒは、−Ｎ(ＣＨ_２ＣＯＯＮａ)_２［これはイミノ二酢酸の残基を示す］、アスパラギン酸残基或いはグルタミン酸残基、又は−ＮＨ(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｎＯＨ（ｎは、１から３の整数を表す）を表し、
Ｍは、Ｍｎ、Ｆｅ又はＣｕを表し、
Ｚは、配位子を示し、ＯＡｃ又はＣｌである］
で示される電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体又はその薬理学的に許容される塩である。

より具体的な一つの態様としては、本発明は、前記式（Ｉ）が、次式（Ｉ）−Ａ型：

並びに、次式（Ｉ）−Ｂ型：

（上記各式中、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｍ、Ｚ及びｎは、前記定義と同一である）
で示される、電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体又はその薬理学的に許容される塩である。

また本発明は、別の態様として、上記の電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、ＳＤＴ用の癌治療剤、皮膚疾患治療用剤、または抗菌剤であり、またＭｎ錯体の場合はＭＲＩ造影剤としても利用できる。

より具体的には、本発明は、注射剤、軟膏剤、舌下剤或いはローション剤の形態にある上記したＳＤＴ用の癌治療剤、皮膚疾患治療用剤、または抗菌剤であり、またＭＲＩ造影剤としても利用できる。

すなわち本発明は、その基本的な態様は、上記式（Ｉ）で示される電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体、特に（Ｉ）−Ａ型、並びに（Ｉ）−Ｂ型の電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体、又はその薬理学的に許容される塩を利用して、ＳＤＴによる癌疾患治療、皮膚疾患治療、感染症治療を行う点に特徴を有するものである。

本発明により提供される電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体又はその薬理学的に許容される塩は、水溶性クロリン誘導体であり、これらのクロリン誘導体を含有する注射剤、液剤、軟膏剤、舌下剤、坐剤或いはローション剤等の薬剤は、患部への集積性や浸透性が良好なものであり、光毒性もなく超音波に感受性があり、癌疾患治療、皮膚疾患治療並びに感染症治療におけるＳＤＴ療法において、患者に負担を与えることがない。
また超音波を使用できることから、光とは異なり深部にも到達し、治療自体を簡便に行える利点を有しており、新しい治療システムを提供できるものである。

さらに、感染症治療のためのＳＤＴ用抗菌剤として効果的なものであり、特に本電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体は水溶性を確保出来るため、非水性外用剤のみならず、水性外用製剤として用いることも可能である。
また、今日の癌治療、皮膚疾患治療並びに感染症治療用いられている抗がん剤、抗菌剤、抗生物質等は、薬剤耐性が容易に生じ易いものであるが、外部エネルギーとして超音波を用いる本発明のＳＤＴ治療システムにおいては、そのような薬剤耐性の問題が発生しない点で、その利点は、極めて特異的なものである。

なお、本化合物群も、本発明者により既に提案している物質（特許文献３）の場合と同様に、ＮａＣｌ、メントール、ＮａＨＣＯ_３やＥＤＴＡ等による添加増強効果が見られるものである。

試験例１における、Ｂ１６−Ｆ１０培養細胞による光毒性試験の結果を示したグラフである。 試験例１における、ＨＤＦ培養細胞による光毒性試験の結果を示したグラフである。 試験例１における、Ｂ１６−Ｆ１０培養細胞による光毒性試験の結果を示したグラフである。 試験例２における、Ｂ１６−Ｆ１０による細胞毒性試験の結果を示したグラフである。 試験例２における、ＨＤＦによる細胞毒性試験の結果を示したグラフである。 試験例２における、Ｂ１６−Ｆ１０による細胞毒性試験の結果を示したグラフである。 試験例２における、ＨＤＦによる細胞毒性試験の結果を示したグラフである。 試験例２における、Ｂ１６−Ｆ１０による細胞毒性試験の結果を示したグラフである。 試験例２における、Ｂ１６−Ｆ１０による細胞毒性試験の結果を示したグラフである。

試験例３における、Ｂ１６−Ｆ１０によるＳＤＴ活性試験の結果を示したグラフである。 試験例３における、ＨＤＦによるＳＤＴ活性試験の結果を示したグラフである。 試験例３における、Ｂ１６−Ｆ１０によるＳＤＴ活性試験の結果を示したグラフである。 試験例４における、担癌動物に化合物投与後の超音波照射試験の結果を示したグラフである。 試験例４における、担癌動物に化合物投与後の超音波照射試験の結果を示したグラフである。

本発明が提供する、式（Ｉ）で示される電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体又はその薬理学的に許容される塩は、具体的には式（Ｉ）−Ａ型、或いは式（Ｉ）−Ｂ型の電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体（以下、これらを併せて、単に「クロリン誘導体」という場合もある）である。
このクロリン誘導体は、これまで本発明者らが提供してきたクロリン誘導体であるＴＯＮＳ５０３および５０４‐Ｍｎ錯体（特許文献３）と同様に、癌への親和性や皮膚浸透性が高く、しかも光毒性が無く、また水溶性或いは脂溶性を持たせたことから、例えば注射剤、あるいは各種軟膏基剤中に均一に溶解・分散し、軟膏製剤自体の安定性も極めて良好なものであり、また水溶性ローション剤として製剤中に均一に溶解・分散し、製剤自体の安定性も極めて良好なものである。

そのような式（Ｉ）で示されるクロリン誘導体の中でも、特に以下の式（Ｉ）で示されるＡ型、及びＢ型：

で示されるフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体又はその薬理学的に許容される塩であって、具体的には、以下の略号で示される化合物である。

Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａ：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化２］であり、ＹがＣｌで、Ｒがイミノ二酢酸残基である電子求引基担持フェニルクロリンアミノ酸誘導体。

Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化２］であり、ＹがＣｌで、Ｒが−ＮＨ(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_２ＯＨである電子求引基担持フェニルクロリンエチレングリコール誘導体。

Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化２］であり、ＹがＣｌで、Ｒが−ＮＨ(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_２ＯＨで、ＭがＭｎである電子求引基担持フェニルクロリンエチレングリコールＭｎ金属錯体。

Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄ：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化２］であり、ＹがＦで、Ｒがイミノ二酢酸残基である電子求引基担持フェニルクロリンアミノ酸誘導体。

Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化２］であり、ＹがＦで、Ｒが−ＮＨ(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_２ＯＨである電子求引基担持フェニルクロリンエチレングリコール誘導体。

Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｆ：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化３］であり、Ｒが−ＮＨ(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_２ＯＨであるクロリンエチレングリコール誘導体。

Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｇ：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化３］であり、Ｒが−ＮＨ(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_２ＯＨで、ＭがＭｎであるクロリンエチレングリコールＭｎ金属錯体。

これらのフェニルクロリン誘導体は、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ＡやＤに対するＲがイミノ二酢酸残基だけでなくアスパラギン酸残基やグルタミン酸残基でも良く、多価カルボン酸を持つアミノ酸であれば良い。

また、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＦやＧに対するＲが２個の連結するエチレングリコール残基だけでなく１個や３個のエチレングリコール残基でも良い。

一方、ＹはＣｌだけでなく電子求引基を示す他のハロゲン化合物すなわちＢｒ、Ｉ、Ｆ原子でもよく、また同様に電子求引基を示すＮＨ_２、ＯＨ、ＯＣＨ_３であっても良い。
要するに、電子求引基を担持して光毒性を消去する官能基があればよく、しかも中でもフェニル基のオルト位やパラ位の配向が最も良い。しかし、これにこだわる必要もない。

金属錯体化について、これらの合成手順を代えて、最初の段階で金属錯体化しても、また合成途中の段階でも金属錯体化しても良い。
要するに、最終的に目的化合物が得られれば、合成手順のいずれの段階でも金属錯体化しても何ら問題はない。
したがって、前記特許に記載の内容は、本願明細書の一部を構成する。

錯体化の手段としては、前記特許に記載の方法により得られた化合物等を適当な有機溶媒中に溶解後、そこにマンガンや銅の酢酸塩や塩化物を反応させることにより、フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体の金属錯体を調製することができる。

反応に使用する金属塩や有機溶媒は特に限定されず、反応に直接の影響を与えないものであれば、任意に選択することができる。具体的には、金属塩としては酢酸塩や塩化金属塩を挙げることができ、なかでも塩化金属塩が好ましく使用され、また有機溶媒として酢酸、ＤＭＦ等の溶媒を挙げることができ、なかでも酢酸が好ましく使用される。

反応温度、反応時間も特に限定されるものではなく、４０〜８０℃、好ましくは５５℃程度の加熱下に４〜１０時間程度攪拌処理をすることがよい。

一方、クロリン体を電子求引基担持フェニル誘導体化又はエチレングリコール誘導体化する際には、合成手順として最初の段階でなく工程途中の段階でも当該誘導体化しても良い。
要するに、最終的に目的化合物が得られれば、合成手順のいずれの段階でも電子求引基担持フェニル誘導体化又はエチレングリコール誘導体化しても何ら問題はない。

その幾つかの調製方法の具体的なものを以下に示す。

製造例１：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化２］であり、Ｙがクロル、Ｒがイミノ二酢酸残基であるジクロロフェニルクロリンアミノ酸誘導体の調製（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａの調製）

（ａ）ＣＰ−Ｐ−Ｈの調製
フォトプロトポルフィリンＩＸ ジメチルエステル（Ｐ−ＭｅＢ型）（１０ｇ）及び 2,4-dichlorophenylhydrazine HCl塩（５ｇ）をピリジン（１００ｍＬ）に溶解し１．５時間撹拌反応した。反応後、反応液を冷やした１６％酢酸水中に加えて沈殿物を濾過し、濾集物（ＣＰ−Ｐ−Ｍｅ）を水にて洗浄し、風乾した。
得られた風乾物をＤＭＦ（１５０ｍＬ）に溶解し、１．５Ｍ−ＮａＯＨ（４０ｍＬ）を加えて室温下で１．５時間撹拌し加水分解した。加水分解後、加水分解物に冷水中を加えて沈殿させ、沈殿物を濾過し、濾集物を水で数回洗浄して加水分解物を約１２ｇ（ＣＰ−Ｐ−Ｎａ）得た。得られた加水分解物を１０％クエン酸水溶液（８００ｍＬ）に懸濁させ２．５時間撹拌した。撹拌後、濾集し、濾過物を水洗後、乾燥させ、ＣＰ−Ｐ−Ｈを約１０ｇ得た。

ＣＰ−Ｐ−ＨのＮＭＲ分析とＩＲ分析
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.72 (s, 1H), 9.54 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 7.74-7.99 (m, 3H), 7.03 (s, 1H), 6.03-6.13 (m, 2H), 4.13-4.38 (m, 4H), 3.69 (s, 6H), 3.46 (s, 3H), 3.18-3.36 (m, 4H), 1.26 (s, 3H)
γ_porphyrin = 1732, 2922, 2950 cm^-1, γ_NH=N = 1510, 1593 cm^-1

（ｂ）イミノ二酢酸 ジメチルエステルの調製
イミノ二酢酸（１０ｇ）にメタノール（５０ｍＬ）を加え、ice bath 上懸濁状態で撹拌した。ついで、塩化チオニル（１６ｍＬ）をゆっくり滴下した。すべて滴下した後、室温で１２時間反応させた。反応後、エーテルを加え沈殿物を濾過し、濾集物をエーテルでよく洗浄を行った。洗浄した固体を回収・乾燥させ、イミノ二酢酸 ジメチルエステル・塩酸塩（ＩＤＡ(ＯＭｅ)_２・ＨＣｌ塩）を約１１ｇ得た。

ＩＤＡ（ＯＭｅ）_２・ＨＣｌ塩のＮＭＲ分析
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-D6) δ 10.05 (s, 1H), 4.01 (s, 4H), 3.74 (s, 6H)

（ｃ）目的物（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａ）の調製
上記の（ａ）で得られたＣＰ−Ｐ−Ｈ（５．０ｇ）（７８１ｇ／ｍｏｌ）及びＥＤＣ／ＨＣｌ（１０ｇ）（１５５．２５ｇ／ｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（１００ｍＬ）に溶解させた。その後、（ｂ）で得られたＩＤＡ(ＯＭｅ)_２・ＨＣｌ塩（６．０ｇ）を添加し２．５時間反応させた。そして更に４．０ｇのＥＤＣ／ＨＣｌを追加添加して１．５時間反応させた。反応後、冷水中に加え沈殿物を得た。沈殿物を濾集し、水、ＥｔＯＨにて洗浄し乾燥させＣＰ−Ｐ−ＩＤＡ(ＯＭｅ)_２を約５ｇ得た。
得られたＣＰ−Ｐ−ＩＤＡ(ＯＭｅ)_２をＥｔＯＨ（３００ｍＬ）で懸濁させ、１．５−Ｍ−ＮａＯＨ（５０ｍＬ）を添加し１．５時間室温にて加水分解をした。得られた加水分解物に、ＥｔＯＨ／ＡｃＯＥｔ混液（１：１）（５００ｍL）を加え、沈殿物を得た。沈殿物を濾集し、ＥｔＯＨ／ＡｃＯＥｔ混液、ＥｔＯＨで洗浄後乾燥させ、目的物のＣｏｍｐｏｕｎｄ Ａを４ｇ得た。

Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａ（Mw:1,071.78）のＮＭＲ分析とＩＲ分析
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.73 (s, 1H), 9.60 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.11 (br, 1H), 7.75 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.37-7.43 (m, 2H), 7.18 (br, 1H), 6.16 (d, J = 18.4 Hz, 1H), 6.05 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.28-4.39 (m, 2H), 4.18-4.24 (m, 2H), 3.66-3.71 (m, 8H), 3.54 (s, 3H), 3.46 (s, 3H), 3.35 (s, 3H), 3.27 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.21 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 1.44 (s, 3H)
γ_porphyrin = 2956 cm^-1, γ_COO = 1732 cm^-1, γ_CONRR’ = 1594 cm^-1,γ_NH=N = 1510 cm^-1
これは、ＵＶスペクトル分析によってもその構造が支持された。

製造例２：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化２］であり、Ｙがクロル、Ｒが−ＮＨＣＨ _２ ＣＨ _２ ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ＯＨであるジクロロフェニルクロリンエチレングリコール誘導体の調製（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂの調製）
先の製造例１の（ａ）で得られたＣＰ−Ｐ−Ｈ（３．０ｇ）を用い、これにＥＤＣ／ＨＣｌ（６．０ｇ）を加えてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解させた。その後、2-(2-aminoethoxy)ethanol（ＤＥＧＡ）（２．６ｍＬ）を添加し、１時間反応させた。さらにＥＤＣ／ＨＣｌ（１．０ｇ）を追加添加し３時間反応させた。反応後、反応物を冷水中に加え沈殿物を得た。得られた反応物を水ついでＥｔＯＨで洗浄し、デシケーターで乾燥させ目的物のＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｂを２．８ｇ得た。

Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ（Mw:927.93）のＮＭＲ分析とＩＲ分析
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.73 (s, 1H), 9.53 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.93 (br, 1H), 7.60-7.77 (m, 2H), 7.39-7.44 (m, 2H), 6.98 (br, 1H), 6.11 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 6.03 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.22-4.34 (m, 4H), 4.12 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 3.20-3.72 (m, 25H), 1.24 (s, 3H)
γ_OH = 3341 cm^-1, γ_porphyrin = 1736, 2922, 2955 cm^-1, γ_CONR = 1593 cm^-1, γ_NH=N = 1510 cm^-1,γ_R-O-R’ = 1115, 1239 cm^-1
これは、ＵＶスペクトル分析によってもその構造が支持された。

製造例３：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化２］であり、Ｙがクロル、Ｒが−ＮＨＣＨ _２ ＣＨ _２ ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ＯＨ、ＭがＭｎであるジクロロフェニルクロリンエチレングリコールＭｎ錯体の調製（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃの調製）
先の製造例２得られたＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ（１．０ｇ）を用い、これにＤＭＦ３０ｍＬを加えて溶解後、Ｍｎ(ＯＡｃ)_２を加えて５時間加熱沸騰反応させて、Ｍｎ化を行った。反応後反応物を冷水中に加え沈殿物を得た。得られた反応物を水ついでエタノールで洗浄し、デシケーター内で乾燥させて目的物のＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｃを０．８ｇ得た。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃの安定性をＨＰＬＣで確認し、安定であることを確認した。またＩＣＰ分析によりＭｎイオンが１００％配位されていることも確認した。

製造例４：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化２］であり、Ｙがフッ素、Ｒがイミノ二酢酸残基であるジフルオロフェニルクロリンアミノ酸誘導体の調製（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄの調製）
（ａ）ＦＰ−Ｐ−Ｈの調製
フォトプロトポルフィリンＩＸ ジメチルエステル（Ｐ−ＭｅＢ型)（１０ｇ）及び 2,4-difluorophenylhydrazine HCl塩（５ｇ）をピリジン（１００ｍＬ）に溶解し１．５時間撹拌反応した。反応後、反応液を冷やした１６％酢酸水中に加えて沈殿物を濾過し、濾集物（ＦＰ−Ｐ−Ｍｅ）を水にて洗浄し、風乾しＦＰ−Ｐ−Ｈを得た。以下は製造例１と同様に処理して目的物のＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｄを得た。

製造例５：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化２］であり、Ｙがフッ素、Ｒが−ＮＨＣＨ _２ ＣＨ _２ ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ＯＨであるジクロロフェニルクロリンエチレングリコール誘導体の調製（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅの調製）
先の製造例４の（ａ）で得られたＦＰ−Ｐ−Ｈ（３．０ｇ）を用い、製造例２と同様に処理して目的物のＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｅを得た。

製造例６：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化３］であり、Ｒが−ＮＨＣＨ _２ ＣＨ _２ ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ＯＨであるクロリンエチレングリコール誘導体の調製（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｆの調製）
（ａ）ＰＧ−Ｐ−Ｍｅの調製
先の特願２０１０−２３８３５９（特許５６５１４２６号）の製造例記載の方法と同様に反応・後処理等の操作をして、ＰＧ−Ｐ−Ｍｅを得た。
（ｂ）ＰＧ−Ｐ−ＤＥＧＡの調製
先の製造例２の方法に従って、ＰＧ−Ｐ−Ｍｅを加水分解後ＰＧ−Ｐ−Ｈとし、以下製造例２と同様に操作して、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｆ（ＰＧ−Ｐ−ＤＥＧＡ）を得た。

製造例７：式（Ｉ）Ｂ型において、Ｘが［化３］であり、Ｒが−ＮＨＣＨ _２ ＣＨ _２ ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ＯＨで、ＭがＭｎであるクロリンエチレングリコールＭｎ錯体の調製（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｇの調製）
先の製造例６の方法に従って、同様に操作してＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｆを得た後、Ｍｎ錯体化して目的とするＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｇ（ＰＧ−Ｐ−ＤＥＧＡ Ｍｎ錯体）を得た。

本発明においては、これらのフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはそれらの金属錯体は、ＳＤＴ用の癌疾患治療剤等の注射剤および皮膚疾患治療剤、或いは抗菌剤等の外用剤として処方される。
癌疾患治療剤としての注射剤は，浸透圧やｐＨ調整剤を用い、舌下剤は適当なゲル化剤等を用いて調製し、皮膚疾患治療剤、或いは抗菌剤としての外用剤は、非水性軟膏剤、水性軟膏剤、ローション剤等の剤型で処方される。

本発明において、これらの製剤に含有させる式（Ｉ）で示されるフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体の配合量は、配合された有効成分であるフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体が患部部位に到達し残留され、また経皮吸収され、疾患部位に蓄積され、超音波の照射により標的細胞、或いは細菌を死滅させるのに十分な量が配合されればよい。本発明者らの検討によれば、その配合量は、製剤重量をベースとして０．１〜２０重量％であれば、十分な効果が得られることが判明した。

配合量が０．１重量％未満であると目的とする治療効果を上げることができず、また２０重量％以上配合させてもそれ以上の効果は得られなかった。
なお、配合量は含有させる有効成分の種類により一概に特定することはできず、また、含有させる有効成分の安定性は有効成分の濃度、用いる基剤に大きく影響されないため、上記の含有量の範囲内で、用途に合わせ種々変更させることが可能である。

以上のようにして得られた本発明の製剤をＳＤＴに使用する場合には、各種癌には点滴注射、舌下投与、坐剤投与又は患部位に局部注射することにより、他方、日光角化症、炎症性角化症、表皮癌、感染症等には皮膚疾患部位に直接塗布することにより、効果的にフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体が集積され、その後、その部位を超音波等の照射により、当該疾患を効果的に治療することができる。

この軟膏剤、ローション剤等の外用剤の適用において、本発明が提供するフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体は、テープストリッピングを必要としないで皮膚患部への浸透性が良好なものであり、したがって、皮膚疾患治療におけるＳＤＴにおいて、患者に負担を与えることがなく、治療自体を簡便に行える利点を有している。
なお、軟膏剤、ローション剤等の外用剤の塗布にあたっては、ＯＤＴ効果（密封包帯効果：Occlusive Dressing Technique）を得るために、塗布部位を密閉状態に保つこともより効果的である。

また、本発明のフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはそれらの金属錯体は、ＳＤＴ用の抗菌剤として、各種の感染症に対して有効であることが判明した。そのような感染症としては、ヒトのみならず各種動物における感染症を含み、酵母様真菌に起因する犬、猫等におけるマラセチア性外耳炎、爪感染症、水虫等の真菌による感染症、ＭＲＳＡ、緑膿菌、大腸菌等を原因菌とする各種感染症、歯周病菌による歯槽膿漏等の歯科系感染症、その他結核菌、或いはウイルスによる感染症や疣へのＳＤＴ用の治療に使用することができる。

本発明が提供するフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体を含有する製剤を塗布した後の疾患部位における超音波照射に際しては、種々の超音波を使用することができる。なかでも、医療用の超音波照射器等を用いることがより効果的である。

かくして、本発明の注射製剤あるいは軟膏製剤、ローション製剤等を疾患部位に注射しあるいは塗布し、有効成分を患部に集積あるいは経皮吸収させた後、当該疾患部位を超音波照射することにより、当該癌疾患、皮膚疾患、或いは感染症を効果的に治療することができる。

以下に本発明を、具体的処方例、試験例等により詳細に説明するが、本発明はこれらのものに限定されるものではない。

試験例１：フェニルクロリン誘導体（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｆ、及びＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｇ）の光毒性試験
本発明のフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体は、光無感作が望まれる。そのため、光処理に対する光毒性を、ＬＥＤ６６０ｎｍおよび４０５ｎｍによる処理に対する光毒性で検討した。
なお、同時に光陽性対照群として前願物質のＴＯＮＳ５０４（特許文献３）を用いた。

＜実験操作＞
（１）９６ウェルプレートに１×１０^３ cells/wellずつマウスメラノーマ細胞（Ｂ１０−Ｆ１０）又はヒト繊維芽細胞（ＨＤＦ）を別々に播種し、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（２）各化合物を１００μＭになるようにＤＭＳＯで溶解し、終濃度１μＭになるように培地で希釈した。
（３）培地交換で化合物入り培地を添加し、５時間後に１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄した後ＰＢＳを入れ，以下の条件でＬＥＤ光照射を行った。

＜照射条件＞
・波長：４０５ｎｍ又は６６０ｎｍ
・照射量：４６．１ｍＷ／ｃｍ^２
・照射時間：６分

（４）照射４８時間後に、１×ＰＢＳで２回洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット（Crystal violet）溶液を５０μＬ添加した。
（５）常温で１５分間インキュベート後、水道水１００μＬ／wellで４回洗浄を行った。
（６）常温で１時間乾燥後、１％ＳＤＳを１００μＬ／well添加し、Crystal violetが溶出したのを確認後、マイクロプレートリーダーで吸光度（abs：５７０ｎｍ）を測定し、生存率を求めた。

＜結果＞
その結果を図１、図２および図３に示した。図中に示した結果からも判明するように、本発明のフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびそれらのＭｎ錯体は、Ｂ１０−Ｆ１０細胞およびＨＤＦ細胞を用いた光照射実験で安定であること、すなわち光毒性が無いことが確認された。
一方、対照群である前願物質のＴＯＮＳ５０４やＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｆには、光感作が認められた。

試験例２：フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびそのＭｎ金属錯体（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｆ、及びＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｇ）の細胞毒性試験
本発明のフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびそのＭｎ金属錯体は、暗所下での細胞無毒性が望まれる。そのための確認を、以下の試験により行った。

＜実験操作＞
（１）９６ウェルプレートに２．５×１０^３cells/wellずつＢ１０−Ｆ１０細胞およびＨＤＦ細胞を別々に播種し、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（２）Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｆ、及びＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｇを測り取り、濃度が夫々１０ｍＭ、３０ｍＭ、１０ｍＭ、３ｍＭ、１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０３ｍＭ及び０．０１ｍＭになるようにＤＭＳＯで調整した。
（３）ＤＭＳＯが１％になるようにＤＥＭＥ培地を用いて希釈し、終濃度を１０００μＭ、３００μＭ、１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ及び０．１μＭにし、培地交換で添加した。
（４）添加２４時間後に1×ＰＢＳで２回洗浄を行い、培地を入れインキュベートした。
（５）２４時間後、１×ＰＢＳで２回洗浄を行い、０．５％Crystal violet溶液を５０μＬ添加した。
（６）常温で１５分間インキュベート後、水道水１００μＬ／wellで４回洗浄を行った。
（７）常温で１時間乾燥後、１％ＳＤＳを１００μＬ／well添加し、Crystal violetが溶出したのを確認後、マイクロプレートリーダーで吸光度（abs：５７０ｎｍ）を測定し、生存率を求めた。

＜結果＞
その結果を図４、図５、図６、図７、図８および図９に示した。図中に示した結果からも判明するように、本発明のフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびそれらのＭｎ金属錯体（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ、及びＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｇ）には、細胞毒性が１０μＭ以下では認められなかった。
なお、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａに関しては、１００μＭ以上の濃度では少し沈殿が出るようであった。

試験例３：フェニルクロリン誘導体及びエチレングリコール誘導体（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｆ、及びＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｇ）の超音波活性試験
本発明のフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびそのＭｎ金属錯体は、超音波感作が望まれる。そのため、超音波処理に対する感受性を，以下のとおり検討した。

＜実験操作＞
（１）Φ６シャーレに１×１０^５cells/wellずつＢ１０−Ｆ１０細胞およびＨＤＦ細胞を別々に播種し、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（２）各化合物を１００μＭになるようにＤＭＳＯで溶解し、終濃度１μＭになるように培地で希釈した。
（３）培地交換で化合物入り培地を添加し、５時間後に以下の条件で、超音波照射を行った。

＜照射条件＞
・Probe L（有効照射面積：５ｃｍ^２）
・照射時間：４分
・Duty cycle：２０％
・周波数：１ＭＨｚ
・照射量：０．４Ｗ／ｃｍ^２

（４）照射２４時間後に１×ＰＢＳで２回洗浄し、1×Trypsinを５００μＬ加え３分間インキュベート後、物理的に細胞をはがし１ｍＬ培地を加えた。
（５）細胞懸濁液３０μＬと０．４％トリパンブルー（Trypan blue）３０μＬを合わせ、血球計算盤を用いて生細胞数をカウントし、生存率を求めた。

＜結果＞
その結果を図１０、図１２に示した。図中に示した結果からも判明するように、本発明のフェニルクロリンクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびその金属錯体は、Ｂ１６−Ｆ１０細胞並びにＨＤＦ細胞を用いた超音波照射実験で、細胞破壊効果があることが確認された。
なお、図の中でＵＳは超音波照射を、ＡはＣｏｍｐｏｕｎｄ Ａを、Ａ＋ＵＳはＣｏｍｐｏｕｎｄ Ａに超音波照射を、ＢはＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｂを、Ｂ＋ＵＳはＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｂに超音波照射を、Ｆ＋ＵＳはＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｆに超音波照射を、Ｇ＋ＵＳはＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｇに超音波照射をした結果を示す。

以下に、本発明が提供する新規フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびその金属錯体を含有する製剤について、ＳＤＴによる治療効果の実際を記載する。

試験例４：担癌動物を用いた超音波照射試験
＜方法＞
Ｂａｌｂ/ｃ系の６週令雌性マウスを用いた。
担癌マウスは、ＥＭＴ−６腫瘍細胞を１×１０^７個を背中背部に接種して作成した。
接種６日後に、本発明のフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびその金属錯体（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｇ）を尾静脈より夫々１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇを投与し、投与４時間後に５分間の超音波照射を行った。

＜超音波照射条件＞
・伊藤超短波（株）製装置：ＵＳＴ７７０
・周波数：１ＭＨｚ
・照射量：２Ｗ／ｃｍ^２
・Duty cycle：５０％

＜結果＞
その結果を図１３および図１４に示した。図中に示した結果からも判明するように、本発明のフェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびその金属錯体には腫瘍抑制効果が見られることが確認され、特に、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ＢおよびＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｇを用いた超音波照射では、薬剤１ｍｇ、５ｍｇおよび１０ｍｇ投与後、４時間後に５分間の超音波照射で顕著な効果が認められた。

以上記載のように、本発明は超音波化学療法（ＳＤＴ）として使用する電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびそれらの金属錯体を提供するものであり、本発明が提供する電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびその金属錯体は、癌適用注射製又は剤及び舌下剤や皮膚適用軟膏製剤とすることにより、患部到達性や皮膚透過性（経皮吸収性）が極めて良好なものである。
したがって、癌疾患部位に選択的に集積され、他方、日光角化症、炎症性角化症、表皮癌、感染症等の皮膚疾患、例えば乳頭腫等の疾患部位に塗布することにより、疾患部位に効果的に電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびその金属錯体が集積され、超音波照射により効果的に癌治療や皮膚疾患治療を行うことができる。

また、ＳＤＴ用の抗菌剤として、各種細菌に対して抗菌活性を示すものであり、今日の感染症治療用いられている抗生物質等は、薬剤耐性が容易に生じやすいものであるが、本発明のＳＤＴ診断・治療システムにおいては、そのような薬剤耐性の問題が発生しない点で、その利点は、極めて特異的なものであり、その医療上の価値は多大なものである。
また、過去の試験結果より，本電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体をＭｎ錯体化すると水溶性も増し、ＭＲＩ造影剤としても有効であり、本発明の電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体およびそのＭｎ金属錯体を投与後、患部をＭＲＩで特定後、ＳＤＴ照射治療が可能である利点を有する。

Claims (10)

1. 次式（Ｉ）：
   

   

   ［式中、
   Ｘは、次式：
   

   

   又は、次式：
   

   

   （上記式中、Ｙは電子吸引基を示し、ハロゲン原子、ＮＨ_２、ＯＨ、又はＯＣＨ_３である）で表される基を表し、
   Ｒは、−Ｎ(ＣＨ_２ＣＯＯＮａ)_２［これはイミノ二酢酸の残基を示す］、アスパラギン酸残基或いはグルタミン酸残基、又は−ＮＨ(ＣＨ_２ＣＨ_２O)_ｎＯＨ（ｎは、１から３の整数を表す）を表し、
   Ｍは、Ｍｎ、Ｆｅ又はＣｕを表し、
   Ｚは、配位子を示し、ＯＡｃ又はＣｌである］
   で示される電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体又はその薬理学的に許容される塩。
2. 式（Ｉ）が、次式（Ｉ）−Ａ型：
   

   

   （式中、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｍ、Ｚ及びｎは、前記定義と同一である）
   で示される請求項１に記載の電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体又はその薬理学的に許容される塩。
3. 式（Ｉ）が、次式（Ｉ）−Ｂ型：
   

   

   （式中、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｍ、Ｚ及びｎは、前記定義と同一である）
   で示される請求項１に記載の電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体又はその薬理学的に許容される塩。
4. 請求項１ないし３のいずれかに記載の電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはそれらの金属錯体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の癌疾患治療用剤。
5. 請求項１ないし３のいずれかに記載の電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の皮膚疾患治療用剤。
6. 請求項１ないし３のいずれかに記載の電子求引基担持フェニルクロリン誘導体又はエチレングリコール誘導体あるいはその金属錯体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の抗菌剤。
7. 注射剤の形態にある、請求項４に記載の超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の癌疾患治療用剤。
8. 軟膏剤の形態にある、請求項４、５又は６に記載の超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の癌疾患治療剤、皮膚疾患治療用剤又は抗菌剤。
9. ローション剤の形態にある、請求項４、５又は６に記載の超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の癌疾患治療剤、皮膚疾患治療用剤又は抗菌剤。
10. 舌下錠の形態にある、請求項４、５又は６に記載の超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の癌疾患治療剤、皮膚疾患治療用剤又は抗菌剤。

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