JP6940979B2 - 超音波増感剤 - Google Patents

Description

本発明は、新規なクロリンＭｎ金属錯体又はその薬理学的に許容される塩、それらを有効成分とする超音波化学療法（ＳＤＴ：Sonodynamic Therapy）用として使用する癌疾患治療剤、皮膚疾患治療剤、並びに抗菌剤に関する。また、Ｍｎ金属錯体化することにより、ＭＲＩ造影剤としても利用できる新規なクロリンＭｎ金属錯体又はその薬理学的に許容される塩に関する。

癌の新しい治療法として、超音波化学療法（ＳＤＴ：Sonodynamic Therapy）用が行われている。これはある種のポルフィリン誘導体を静脈内注射などの方法により投与して、癌（腫瘍）組織に選択的に集積させた後、超音波を照射することにより癌組織のみを選択的に破壊することにより癌細胞を消滅させる治療法であり、ポルフィリン誘導体が有する癌組織への選択的集積性と、超音波増感作用という２つの特性を利用した治療法である。

他方、光物理化学的診断・治療法（ＰＤＴ：Photodynamic Therapy）は光照射による治療法で、ポルフィリン誘導体が有する癌組織への選択的集積性と、光増感作用という２つの特性を利用した治療法である。

本発明者の１人は、このＰＤＴに使用することができるポルフィリン誘導体について鋭意研究を進めてきており、これまでにＡＴＸ−Ｓ１０と称するイミノクロリンアスパラギン酸誘導体を提供してきている。
このイミノクロリンアスパラギン酸誘導体またはその薬理学的に許容される塩のなかでも、特にナトリウム塩である化合物、すなわちＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａと命名された化合物は、癌組織への集積性、ならびに新生血管への選択的集積性が著しく高い化合物である。したがって、その優れた特性を利用して、腫瘍の治療のためのＰＤＴ用治療剤として極めて効果的なものであることを確認している（特許文献１）。

また、光無毒性である診断剤としてＡＴＮ−１０と称するＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン５酢酸）担持ポルフィリン金属錯体を合成し、得られた合成物に^９９ｍＴＣなる短半減期放射性物質をキレートさせ癌診断剤並びにＭＲＩ造影剤を開発してきている（特許文献２〜４）。

一方、ＳＤＴ増感剤として、これまでに癌疾患用に５−アミノレブリン酸塩酸塩（５−ＡＬＡ）や、クロリンＣｅ^６−Ｓｎ錯体（Ｔ−Ｃｅ^６）並びにエチレングリコール担持クロリンＳｎ錯体（ＡＣＴ４２１１）が開発されている（特許文献５、非特許文献１及び２）。

近年、５−ＡＬＡを用いたＰＤＴによる癌診断・治療が有効であることが分ってきている。
また、５−ＡＬＡを用いたＳＤＴによる癌治療の試みもなされている。
しかしながら、５−ＡＬＡはプロトポルフィリンＩＸの生合成前駆体であり、プロトポルフィリンＩＸの化合物特性、すなわち新生血管集積性が低いこと、最長波長吸収端が６３０ｎｍであること並びに光毒性が存在し、超音波による活性が弱いことから良好なＳＤＴ治療剤とは言えない。

他方、Ｔ−Ｃｅ^６やＡＣＴ４２１１は植物体由来のクロロフィル誘導体で、我々の長年の研究から、動物由来でなく植物由来であることからこれらの安全性について必ずしも良好とは言えなかった。すなわち、本発明者らの開発したクロリンＭｎ金属錯体は血液由来のプロトポルフィリンから６工程を経て合成して得られた誘導体である。本発明者らが創生したクロリン類は、生体内で分解してプロトポルフィリン代謝を経て通常の代謝ルートで排出されるため、特に安全であることが示唆される。

ところで、これまで提案してきたクロリン物質（特許第５１７９２４５号：特許文献６、特許第５６５１４２６号：特許文献７）のクロリン誘導体であるＴＯＮＳ５０３（Ｂ型）やＴＯＮＳ５０４（Ａ型）は、日光角化症等の皮膚疾患治療薬として、また感染症治療薬としてＰＤＴに有効であることが分かっている。

しかしながら、光を外部エネルギーに用いるＰＤＴは人体に用いる場合、光毒性が必ず問題となる。これらクロリン誘導体（ＴＯＮＳ５０３やＴＯＮＳ５０４）のＳＤＴ増感効果を検討したところ、強力なＳＤＴ効果があることが分かった。しかしまた、光毒性が存在することも分っていた。

光毒性を緩和するために、ポルフィリン誘導体を遷移金属錯体とすれば光感受性が無くなることが、本発明者の１人のこれまでの研究で分かっていた。
そこでクロリン誘導体（ＴＯＮＳ５０３やＴＯＮＳ５０４）をＭｎ金属錯体等に誘導体化すると光毒性がなく、且つ超音波感受性（ＳＤＴ活性）も存在することが新たに分かった。Ｍｎ金属錯体以外にも種々キレート錯体へ誘導させたが、超音波活性に良好な結果が得られなかった。さらに新規なクロリン金属錯体にあっては、癌治療剤のみならず軟膏剤、ローション剤等のＳＤＴ用の外用剤としても感染症の治療に有効であることを確認し、本発明を完成させるに至った。

また、本発明者の１人のこれまでの研究より、ポルフィリンＭｎ金属錯体は、ＭＲＩ造影剤に適することが分かっている。

特許第３６１３５９９号 特許第２８５１３５６号 特公昭６３−０１３９９７号公報 特開２００２−２０５９５９号公報 アメリカ特許第６４６２１９２号 特許第５１７９２４５号 特許第５６５１４２６号 特開２０１４−１９３８４９号公報

Anticancer Res. 31(2) 501 (2011) Integr. Cancer The. 7(2) 96 (2008) Oncologia 26: 242-244 (1993) The Journal of Urology 156: 1850-1852 (1996) Neurosurgery 42: 1332-1338 (1998) British Journal of Cancer 84: 1686-1687 (2001) Magnetic Resonance in Medicine 47: 549-553 (2002) Journal of Magnetic Resonance Imaging 20: 294-299 (2004)

したがって本発明は、超音波化学療法（ＳＤＴ：Sonodynamic Therapy）に使用し得るクロリンＭｎ金属錯体、更にはそれらクロリンＭｎ金属錯体を有効成分とするＳＤＴ用の癌注射剤や外用剤、特に癌治療剤、皮膚疾患治療剤、並びに抗菌剤を提供することを課題とする。

かかる課題を解決するための本発明は、その一つの基本的態様として、次式（Ｉ）：

［式中、
Ｍは、Ｍｎを表し、
Ｘは、−(ＣＨ_２)_ｎ−を表し、
Ｒは、−ＮＨＣＨ_２−Ｙ（ここでＹは、

を表し、式中ＧはＩ又はＣｌである）を表し、
ｎは、０から１０の整数を表し、
Ｚは、配位子を示し、ＯＡｃ又はＣｌである］
で示されるクロリン金属錯体又はその薬理学的に許容される塩である。

より具体的な一つの態様としては、本発明は、前記式（Ｉ）が、次式（Ｉ）−Ａ型：

並びに、次式（Ｉ）−Ｂ型：

（上記各式中、Ｍ、Ｘ、Ｒ、Ｇ、Ｚ及びｎは、前記定義と同一である）
で示される、クロリンＭｎ金属錯体又はその薬理学的に許容される塩である。

また本発明は、別の態様として、上記のクロリンＭｎ金属錯体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、ＳＤＴ用の癌治療剤、皮膚疾患治療用剤、または抗菌剤であり、また、ＭＲＩ造影剤としても利用できる。

より具体的には、本発明は，注射剤、軟膏剤、舌下剤或いはローション剤の形態にある上記したＳＤＴ用の癌治療剤、皮膚疾患治療用剤、または抗菌剤であり、ＭＲＩ造影剤としても利用できる。

すなわち本発明は、その基本的な態様は、上記式（Ｉ）で示されるクロリンＭｎ金属錯体、特に（Ｉ）−Ａ型、並びに（Ｉ）−Ｂ型のクロリンＭｎ金属錯体、又はその薬理学的に許容される塩を利用して、ＳＤＴによる癌疾患治療、皮膚疾患治療、感染症治療を行う点に特徴を有するものである。

本発明により提供されるクロリンＭｎ金属錯体又はその薬理学的に許容される塩は、カチオン性クロリンＭｎ金属錯体であり、これらのクロリンＭｎ金属錯体を含有する注射剤、液剤、軟膏剤、舌下剤或いはローション剤等の薬剤は、患部への集積性や浸透性が良好なものであり、光毒性もなく超音波に感受性があり、癌疾患治療、皮膚疾患治療並びに感染症治療におけるＳＤＴ療法において、患者に負担を与えることがない。
また、超音波を使用できることから、光とは異なり深部にも到達し、治療自体を簡便に行える利点を有しており、新しい治療システムを提供できるものである。

さらに、感染症治療のためのＳＤＴ用抗菌剤として効果的なものであり、特にカチオン性クロリンＭｎ金属錯体は水溶性が高いため、非水性外用剤のみならず、水性外用製剤として用いることも可能である。
また、今日の癌治療、皮膚疾患治療並びに感染症治療用いられている抗がん剤、抗菌剤、抗生物質等は、薬剤耐性が容易に生じ易いものであるが、外部エネルギーとして超音波を用いる本発明のＳＤＴ治療システムにおいては、そのような薬剤耐性の問題が発生しない点で、その利点は、極めて特異的なものである。

なお、本化合物群も、本発明者により既に提案している物質（特許文献８）の場合と同様に、ＮａＣｌ、メントール、ＮａＨＣＯ_３等による添加増強効果が見られるものである。

試験例１における、光毒性試験の結果を示したグラフである。 試験例２における、超音波照射によるラジカル産生の結果を示したグラフである。 試験例３における、ＳＤＴ活性試験の結果を示したグラフである。 試験例４における、細胞毒性試験の結果を示したグラフである。 試験例５における、細胞内取込み試験の結果を示したグラフである。

試験例６における、化合物の光照射に関する影響をＵＶスペクトルにて照射前後の変化を示したグラフである。 試験例６における、化合物の光照射に関する影響をＵＶスペクトルにて照射前後の変化を示したグラフである。 試験例６における、化合物の光照射に関する影響をＵＶスペクトルにて照射前後の変化を示したグラフである。 試験例６における、化合物の光照射に関する影響をＵＶスペクトルにて照射前後の変化を示したグラフである。

試験例７における、化合物の超音波照射に関する影響をＵＶスペクトルにて照射前後の変化を示したグラフである。 試験例７における、化合物の超音波照射に関する影響をＵＶスペクトルにて照射前後の変化を示したグラフである。 試験例８における、担癌動物に化合物投与後の超音波照射試験の結果を示したグラフである。

本発明が提供する、式（Ｉ）で示されるクロリンＭｎ金属錯体又はその薬理学的に許容される塩は、具体的には式（Ｉ）−Ａ型、或いは式（Ｉ）−Ｂ型のクロリンＭｎ金属錯体（以下、これらを併せて、単に「クロリンＭｎ金属錯体」という場合もある）である。
このクロリンＭｎ金属錯体は、これまで本発明者の１人が提供してきたクロリン誘導体であるＴＯＮＳ５０３および５０４と同様に、癌への親和性や皮膚浸透性が高く、しかも光毒性が無く、また水溶性或いは脂溶性を持たせたことから、例えば注射剤、あるいは各種軟膏基剤中に均一に溶解・分散し、軟膏製剤自体の安定性も極めて良好なものであり、また水溶性ローション剤として製剤中に均一に溶解・分散し、製剤自体の安定性も極めて良好なものである。

そのような式（Ｉ）で示されるクロリン誘導体の中でも、特に以下の式（Ｉ−ａ）で示されるＡ型、及びＢ型：

さらには、以下の式（Ｉ−ｂ）で示されるＡ型及びＢ型：

で示されるクロリン誘導体又はその薬理学的に許容される塩であって、具体的には、以下の略号で示される化合物である。

ＴＯＮＳ５０１−ＭｎＢ型：式（Ｉ−ａ）Ｂ型において、Ｘが−ＣＨ_２−であり、Ｒが−ＯＨであるクロリン金属錯体。

ＴＯＮＳ５０２−ＭｎＡ型：式（Ｉ−ａ）Ａ型において、Ｘが−ＣＨ_２−であり、Ｒが−ＯＨであるクロリン金属錯体。

ＴＯＮＳ５０３−ＭｎＢ型：式（Ｉ−ｂ）Ｂ型において、Ｘが−ＣＨ_２−であり、Ｙが次式：

（上記置換基を、以下、［化２］と称する。）
であるクロリン金属錯体。

ＴＯＮＳ５０４−ＭｎＡ型：式（Ｉ−ｂ）Ａ型において、Ｘが‐ＣＨ_２‐であり、Ｙが［化２］であるクロリン金属錯体。

これらのクロリン金属錯体は、前記特許第５６５１４２６号（特許文献７）に記載の方法に従って、ＴＯＮＳ５０１、５０２、５０３、５０４を得た後に、Ｍｎ金属錯体化してＴＯＮＳ５０１−Ｍｎ、５０２−Ｍｎ、５０３−Ｍｎそして５０４−Ｍｎを得ることができる。前記特許に記載の物質を得た後でなくても、これらの合成手順を代えて、最初の段階で金属錯体化しても、また合成途中の段階でも金属錯体化しても良い。要するに、最終的に目的化合物が得られれば、合成手順のいずれの段階でも金属錯体化しても何ら問題はない。
したがって、前記特許に記載の内容は、本願明細書の一部を構成する。

錯体化の手段としては、前記特許に記載の方法により得られた化合物等を適当な有機溶媒中に溶解後、そこに酢酸マンガン、塩化マンガン等のマンガン化合物を反応させることにより、クロリンＭｎ錯体を調製することができる。

反応に使用する金属塩や有機溶媒は特に限定されず、反応に直接の影響を与えないものであれば、任意に選択することができる。具体的には、金属塩としては酢酸塩や塩化金属塩を挙げることができ、なかでも酢酸塩が好ましく使用され、また有機溶媒として酢酸、ＤＭＦ等の溶媒を挙げることができ、なかでも酢酸が好ましく使用される。

反応温度、反応時間も特に限定されるものではなく、４０〜８０℃、好ましくは５５℃程度の加熱下に４〜１０時間程度攪拌処理をすることがよい。

その幾つかの調製方法の具体的なものを以下に示す。

製造例１：式（Ｉ−ｂ）Ｂ型において、Ｘが−CH _２ −であり、Ｙが［化２］であるクロリンＭｎ金属錯体の調製（ＴＯＮＳ５０３-Ｍｎ Ｂ型の調製）
特許第５６５１４２６号（特許文献７）の方法に従って、ＴＯＮＳ５０３を得た。得られた化合物０．０１７ｇをＤＭＦに溶解させ、塩化マンガンを加えて７０℃に加熱撹拌し、冷後濾取して、新規クロリンＭｎ金属錯体（ＴＯＮＳ５０３−Ｍｎ Ｂ型）を０．０１５ｇ得た（収率：８８．２％）。
得られた誘導体についてＵＶ−ＶＩＳスペクトル分析を行ったところ、最長波長吸収端６６２ｎｍを示し、ＦＡＢ−ＭＳにより質量分析を実施したところ、ｍ／ｚ：１，１６９．２（Ｃ_５１Ｈ_５６Ｉ_２ＭｎＮ_８Ｏ_５）を示し、目的とするクロリンＭｎ金属錯体であることが確認された。
また、ＩＣＰ分析によりＭｎ金属が配位されていることも確認された。これは、ＵＶスペクトル分析によってもその構造が支持された。

製造例２：式（Ｉ−ｂ）Ａ型において、Ｘが−CH _２ −であり、Ｙが［化２］であるクロリンＭｎ金属錯体の調製（ＴＯＮＳ５０４−Ｍｎ Ａ型の調製）
特許第５６５１４２６号（特許文献７）の方法に従って、ＴＯＮＳ５０４を得た。得られた化合物１．０１ｇを酢酸中に溶解懸濁させ、酢酸マンガンを加えて５５℃に加熱撹拌し、冷後濾取して、新規クロリンＭｎ金属錯体（ＴＯＮＳ５０４−Ｍｎ Ａ型）を０．９０ｇ得た（収率：８９．１％）。
得られた誘導体についてＵＶ−ＶＩＳスペクトル分析を行ったところ、最長波長吸収端６６２ｎｍを示し、ＦＡＢ−ＭＳにより質量分析を実施したところ、ｍ／ｚ：１，１６９．２（Ｃ_５１Ｈ_５６Ｉ_２ＭｎＮ_８Ｏ_５）を示し、目的とするクロリンＭｎ金属錯体であることが確認された。
また、ＩＣＰ分析によりＭｎ金属が配位されていることも確認された。これは、ＵＶスペクトル分析（図７、図９）によってもその構造が支持された。

なお、Ｍｎ錯体はＮＭＲ分析が不可能なので，錯体前のＴＯＮＳ５０４のＮＭＲ分析を行った。
Ｍｎ錯体がＮＭＲ分析をすることが出来ないということは、ＭＲＩ画像診断にも用いることが出来ることを意味している。
Ｍｎ錯体化前のＴＯＮＳ５０４については、以下のＮＭＲデータによってその構造が支持された。

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ = 9.58 (s, 1H), 9.46 (s, 1H), 9.20 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.16 (dd, J=11.2, 17.6 Hz, 1H), 7.52-7.50 (m, 2H), 7.40 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.07(d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.93(d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 6.37 (dd, J = 1.2, 18 Hz, 1H), 6.21 (dd, J = 1.2, 11.6 Hz, 1H), 6.17-6.16 (m, 1H), 5.83-5.80 (m, 1H), 5.55-5.51 (m, 1H), 4.44-3.68 (m, 12H), 3.57 (s, 3H), 3.48 (s, 3H), 3.30 (s, 3H), 3.06-2.88 (m, 4H), 2.47 (s, 3H), 2.41(s, 3H), 2.39-1.65 (m, 1H), 2.61 (s, 3H)

本発明においては、これらのクロリンＭｎ金属錯体は、ＳＤＴ用の癌疾患治療剤等の注射剤および皮膚疾患治療剤、或いは抗菌剤等の外用剤として処方される。
癌疾患治療剤としての注射剤は，浸透圧やｐＨ調整剤を用い、舌下剤は適当なゲル化剤等を用いて調製し、皮膚疾患治療剤、或いは抗菌剤としての外用剤は、非水性軟膏剤、水性軟膏剤、ローション剤等の剤型で処方される。

本発明において、これらの製剤に含有させる式（Ｉ）で示されるクロリンＭｎ金属錯体の配合量は、配合された有効成分であるクロリンＭｎ金属錯体が患部部位に到達し残留され、また経皮吸収され、疾患部位に蓄積され、超音波の照射により標的細胞、或いは細菌を死滅させるのに十分な量が配合されればよい。本発明者らの検討によれば、その配合量は、製剤重量をベースとして０．１〜２０重量％であれば、十分な効果が得られることが判明した。

配合量が０．１重量％未満であると目的とする治療効果を上げることができず、また２０重量％以上配合させてもそれ以上の効果は得られなかった。
なお、配合量は含有させる有効成分の種類により一概に特定することはできず、また、含有させる有効成分の安定性は有効成分の濃度、用いる基剤に大きく影響されないため、上記の含有量の範囲内で、用途に合わせ種々変更させることが可能である。

以上のようにして得られた本発明の製剤をＳＤＴに使用する場合には、各種癌には点滴注射、舌下投与又は患部位に局部注射することにより、一方、日光角化症、炎症性角化症、表皮癌、感染症等には皮膚疾患部位に直接塗布することにより効果的にクロリン金属錯体が集積され、その後、その部位を超音波等の照射により、当該疾患を効果的に治療することができる。

この軟膏剤、ローション剤等の外用剤の適用において、本発明が提供するクロリンＭｎ金属錯体は、テープストリッピングを必要としないで皮膚患部への浸透性が良好なものであり、したがって、皮膚疾患治療におけるＳＤＴにおいて、患者に負担を与えることがなく、治療自体を簡便に行える利点を有している。
なお、軟膏剤、ローション剤等の外用剤の塗布にあたっては、ＯＤＴ効果（密封包帯効果：Occlusive Dressing Technique）を得るために、塗布部位を密閉状態に保つこともより効果的である。

また、本発明のクロリンＭｎ金属錯体は、ＳＤＴ用の抗菌剤として、各種の感染症に対して有効であることが判明した。そのような感染症としては、ヒトのみならず各種動物における感染症を含み、酵母様真菌に起因する犬、猫等におけるマラセチア性外耳炎、爪感染症、水虫等の真菌による感染症、ＭＲＳＡ、緑膿菌、大腸菌等を原因菌とする各種感染症、歯周病菌による歯槽膿漏等の歯科系感染症、その他結核菌、或いはウイルスによる感染症や疣へのＳＤＴ用の治療に使用することができる。

本発明が提供するクロリンＭｎ錯体誘導体を含有する製剤を塗布した後の疾患部位における超音波照射に際しては、種々の超音波を使用することができる。なかでも、医療用の超音波照射器等を用いることがより効果的である。

かくして、本発明の注射製剤あるいは軟膏製剤、ローション製剤等を疾患部位に注射しあるいは塗布し、有効成分を患部に集積あるいは経皮吸収させた後、当該疾患部位を超音波照射することにより、当該癌疾患、皮膚疾患、或いは感染症を効果的に治療することができる。

以下に本発明を、具体的処方例、試験例等により詳細に説明するが、本発明はこれらのものに限定されるものではない。

試験例１：クロリン金属錯体（ＴＯＮＳ５０４−Ｍｎ Ａ型（Ｍｎ錯体）、及びＴＯＮＳ５０４ Ａ型（錯体Ｆｒｅｅ）の光毒性試験
本発明のクロリンＭｎ金属錯体は、光無感作が望まれる。そのため、光処理に対する光毒性を、ＬＥＤ ６６０ｎｍおよび４０５ｎｍによる処理に対する光毒性で検討した。

＜実験操作＞
（１）９６ウェルプレートに２×１０^３cells/wellずつＢ１０−Ｆ１０細胞を播種し、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（２）各化合物を１００μＭになるようにＤＭＳＯで溶解し、終濃度１μＭになるように培地で希釈した。
（３）培地交換で化合物入り培地を添加し、５時間後に１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄した後ＰＢＳを入れ，以下の条件でＬＥＤ光照射を行った。

＜照射条件＞
・波長：４０５ｎｍ又は６６０ｎｍ
・照射量：４６．１ｍＷ／ｃｍ^２
・照射時間：６分

（４）照射４８時間後に、１×ＰＢＳで２回洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット（Crystal violet）溶液を５０μＬ添加した。
（５）常温で１５分間インキュベート後、水道水１００μＬ／wellで４回洗浄を行った。
（６）常温で１時間乾燥後、１％ＳＤＳを１００μＬ／well添加し、Crystal violetが溶出したのを確認後、マイクロプレートリーダーで吸光度（abs：５７０ｎｍ）を測定し、生存率を求めた。

＜結果＞
その結果を図１に示した。図中に示した結果からも判明するように、本発明のクロリンＭｎ金属錯体は、Ｂ１０−Ｆ１０細胞を用いた光照射実験で安定であること、すなわち光毒性が無いことが確認された。
一方、本金属錯体の前駆体である無金属体は、光感作が認められた。

試験例２：超音波照射によるラジカル産生試験
本発明のクロリンＭｎ金属錯体は、超音波照射によるラジカル産生が望まれる。そのため、超音波処理に対するラジカル産生を検討した。

＜実験操作＞
（１）ＤＣＦＨ−ＤＡを４当量のＮａＯＨによってＤＣＦＨ（１ｍＭ）となるようにメタノールにて調整した。
（２）各化合物の終濃度を５０μＭになるようにｍＱ水で調整し、ＤＣＦＨは１ｍＭになるようにメタノールで調整した。
（３）Φ６シャーレに３ｍＬ移し、以下の条件で超音波照射を行った。

＜超音波照射条件＞
・Probe L（有効照射面積：５ｃｍ^２）
・照射時間：６分
・Duty cycle：５０％
・周波数：１ＭＨｚ
・照射量：２．０Ｗ／ｃｍ^２

（４）マイクロプレートリーダーで蛍光強度を測定し、ラジカル産生量の変化を求めた（ex: 488 nm／em：522 nm)

＜結果＞
その結果を図２に示した。図中に示した結果からも判明するように、本発明の金属錯体は、超音波照射実験でラジカルが産生すること、すなわち超音波活性があることが確認された。
一方、本金属錯体の前駆体である無金属体には超音波よるラジカル産生が認められなかった。

試験例３：超音波活性試験
本発明のクロリンＭｎ金属錯体は、超音波感作が望まれる。そのため、超音波処理に対する感受性を，以下のとおり検討した。

＜実験操作＞
（１）Φ６シャーレに１×１０^５cells/wellずつＢ１０−Ｆ１０細胞を播種し、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（２）各化合物を１００μＭになるようにＤＭＳＯで溶解し、終濃度１μＭになるように培地で希釈した。
（３）培地交換で化合物入り培地を添加し、５時間後に以下の条件で超音波照射を行った。

＜照射条件＞
・Probe L（有効照射面積：５ｃｍ^２）
・照射時間：４分
・Duty cycle：２０％
・周波数：１ＭＨｚ
・照射量：０．４Ｗ／ｃｍ^２

（４）照射２４時間後に１×ＰＢＳで２回洗浄し、1×Trypsinを５００μＬ加え３分間インキュベート後、物理的に細胞をはがし１ｍＬ培地を加えた。
（５）細胞懸濁液３０μＬと０．４％トリパンブルー（Trypan blue）３０μＬを合わせ、血球計算盤を用いて生細胞数をカウントし、生存率を求めた。

＜結果＞
その結果を図３に示した。図中に示した結果からも判明するように、本発明の金属錯体は、Ｂ１６−Ｆ１０細胞を用いた超音波照射実験で、細胞破壊効果があることが確認された。
一方、本金属錯体の前駆体である無金属体にも超音波感作が認められた。

試験例４：細胞毒性試験
本発明のクロリン誘導体及びそのＭｎ金属錯体は、暗所下での細胞無毒性が望まれる。そのための確認を、以下の試験により行った。

＜実験操作＞
（１）９６ウェルプレートに２．５×１０^３cells/wellずつＢ１０−Ｆ１０細胞を播種し、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（２）ＴＯＮＳ５０４、ＴＯＮＳ５０４−Ｍｎを測り取り、濃度が１００ｍＭ、３０ｍＭ、１０ｍＭ、３ｍＭ、１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０３ｍＭ及び０．０１ｍＭになるようにＤＭＳＯで調整した。
（３）ＤＭＳＯが１％になるようにＤＥＭＥ培地を用いて希釈し、終濃度を１０００μＭ、３００μＭ、１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ及び０．１μＭにし、培地交換で添加した。
（４）添加２４時間後に1×ＰＢＳで２回洗浄を行い、培地を入れインキュベートした。
（５）２４時間後、１×ＰＢＳで２回洗浄を行い、０．５％Crystal violet溶液を５０μＬ添加した。
（６）常温で１５分間インキュベート後、水道水１００μＬ/wellで４回洗浄を行った。
（７）常温で１時間乾燥後、１％ＳＤＳを１００μＬ／well添加し、Crystal violetが溶出したのを確認後、マイクロプレートリーダーで吸光度（abs：５７０ｎｍ）を測定し、生存率を求めた。

＜結果＞
その結果を図４に示した。図中に示した結果からも判明するように、本発明の金属錯体誘導体（ＴＯＮＳ５０４−Ｍｎ）およびその無金属錯体（ＴＯＮＳ５０４）には、細胞毒性が３０μＭ以下では認められなかった。

試験例５：細胞内取込み
＜実験操作＞

（Ａ）ＴＯＮＳ５０４について
（１）Φ６シャーレに２×１０^５cells/wellずつＢ１０−Ｆ１０細胞を播種し、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（２）各化合物を３００μＭになるようにＤＭＳＯで溶解し、終濃度３μＭになるように培地にて希釈した。
（３）添加直後、１，３，６、１２及び２４時間の経過時間ごとに１×ＰＢＳ洗浄を２回し、２％Triton in ｍＱ水を４００μＬ加え，セルスクレーバーを用いて細胞を溶かし細胞溶解液を回収した。
（４）回収した細胞溶解液を１５０００ｒｐｍ／１０分で遠心を行い、上清を回収した。
（５）上清１００μＬの蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定し，検量線より取込量を求めた。
ＴＯＮＳ５０４（ex: 405 nm／em：660 nm)

（Ｂ）ＴＯＮＳ５０４−Ｍｎについて
（１）Φ６シャーレに２×１０^５cells/wellずつＢ１０−Ｆ１０細胞を播種し、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（２）各化合物を３００μＭになるようにＤＭＳＯで溶解し、終濃度３μＭになるように培地にて希釈した。
（３）添加直後、１，３，６、１２及び２４時間の経過時間ごとに１×ＰＢＳ洗浄を２回し、２％Triton in ｍＱ水を４００μＬ加え、セルスクレーバーを用いて細胞を溶かし細胞溶解液を回収した。
（４）回収した細胞溶解液を１５０００ｒｐｍ／１０分で遠心を行い、上清を回収した。
（５）上清３００μＬを２Ｍ ＨＮＯ_３ １５０μＬとｍＱ水１０５０μＬで調整した。
（６）ＩＰＣ発光分光分析装置でＭｎ量を測定し、検量線より取込量を求めた。

＜結果＞
それらの結果を図５に示した。図中に示した結果からも判明するように、本発明の金属誘導体（ＴＯＮＳ５０４−Ｍｎ）およびその無金属錯体（ＴＯＮＳ５０４）の両者とも細胞内取込みが認められたが、金属誘導体（ＴＯＮＳ５０４−Ｍｎ）の方が優れたものであった。

試験例６：化合物の光照射に関する影響（ＵＶスペクトルによる照射前後の変化の観察）
ポルフィリン化合物は、光反応性をすると構造変化が観察されることがある。そのため、光照射前後での構造変化の有無を、吸収スペクトルの変化より光反応性を無細胞系で評価した。
光照射は４０５ｎｍと６６０ｎｍのＬＥＤを用いた。
それらの結果を図６〜図９に示した。
ＴＯＮＳ５０４では光照射後の最大吸収が未照射と比較して９５％低下しており、吸収スペクトルの変化が見られた（図６、図８）。
一方、本発明の金属誘導体であるＴＯＮＳ５０４−Ｍｎは光照射による吸収スペクトルの変化は見られなかった（図７、図９）。
以上より、Ｍｎ錯体化前の前駆体であるＴＯＮＳ５０４は光によって分解するのに対して、錯体後の本発明の金属誘導体であるＴＯＮＳ５０４−Ｍｎは光により分解せず、安定であることが確認された。

試験例７：化合物の超音波照射に関する影響（ＵＶスペクトルによる照射前後の変化の観察）
本発明の金属錯体誘導体（ＴＯＮＳ５０４−Ｍｎ）及びその前駆体である無金属錯体（ＴＯＮＳ５０４）を用いて検討した。
結果を図１０及び図１１に示したが、両化合物とも超音波照射前後での吸収スペクトルに変化が認められなかった。
したがって、両化合物とも超音波により分解せず、安定であることが判明した。

以下に、本発明が提供する新規クロリンＭｎ金属錯体を含有する製剤について、ＳＤＴによる治療効果の実際を記載する。

試験例８：担癌動物を用いた超音波照射試験
＜方法＞
Ｂａｌｂ/ｃ系の６週令雌性マウスを用いた。
担癌マウスは、ＥＭＴ−６腫瘍細胞を１×１０^７個を背中背部に接種して作成した。
接種６日後に、本発明の金属錯体誘導体であるＴＯＮＳ５０４−Ｍｎを尾静脈より１ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｋｇを投与し、投与１２時間後又は２４時間後に、それぞれ別々に３分間あるいは５分間の超音波照射を行った。

＜超音波照射条件＞
・伊藤超短波（株）製装置：ＵＳＴ７７０
・周波数：１ＭＨｚ
・照射量：２Ｗ／ｃｍ^２
・Duty cycle：５０％

＜結果＞
その結果を図１２に示した。図中に示した結果からも判明するように、本発明のクロリンＭｎ金属錯体誘導体には腫瘍抑制効果が見られることが確認され、特に、ＴＯＮＳ５０４−Ｍｎを用いた超音波照射では、薬剤１ｍｇ／ｋｇ投与１２時間後に５分間の超音波照射で顕著な効果が認められた。

以上記載のように、本発明は超音波化学療法（ＳＤＴ）として使用するクロリンＭｎ金属錯体を提供するものであり、本発明が提供するクロリンＭｎ金属錯体は、癌適用注射製剤及び舌下剤や皮膚適用軟膏製剤とすることにより、患部到達性や皮膚透過性（経皮吸収性）が極めて良好なものである。
したがって、癌疾患部位に選択的に集積され、他方、日光角化症、炎症性角化症、表皮癌、感染症等の皮膚疾患、例えば乳頭腫等の疾患部位に塗布することにより、疾患部位に効果的にクロリンＭｎ金属錯体が集積され、超音波照射により効果的に癌治療や皮膚疾患治療を行うことができる。

また、ＳＤＴ用の抗菌剤として、各種細菌に対して抗菌活性を示すものであり、今日の感染症治療用いられている抗生物質等は、薬剤耐性が容易に生じやすいものであるが、本発明のＳＤＴ診断・治療システムにおいては、そのような薬剤耐性の問題が発生しない点で、その利点は、極めて特異的なものであり、その医療上の価値は多大なものである。
また、過去の試験結果よりＭＲＩ造影剤としても有効であり、本発明のＭｎ金属錯体を投与後、患部をＭＲＩで特定後、ＳＤＴ照射治療が可能である利点を有する。

Claims (10)

1. 次式（Ｉ）：
   

   

   ［式中、
   Ｍは、Ｍｎを表し、
   Ｘは、−（ＣＨ _２ ） _ｎ −を表し、
   Ｒは、−ＮＨＣＨ _２ −Ｙ（ここでＹは、
   

   

   を表し、式中ＧはＩ又はＣｌである）を表し、
   ｎは、０から１０の整数を表し、
   Ｚは、配位子を示し、ＯＡｃ又はＣｌである］
   で示されるクロリン金属錯体又はその薬理学的に許容される塩
   を有効成分として含有する、超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の癌疾患治療用剤。
2. 式（Ｉ）が、次式（Ｉ）−Ａ型：
   

   

   （式中、Ｍ、Ｘ、Ｒ、Ｇ、Ｚ及びｎは、前記定義と同一である）、又は
   次式（Ｉ）−Ｂ型：
   

   

   （式中、Ｍ、Ｘ、Ｒ、Ｇ、Ｚ及びｎは、前記定義と同一である）
   で示される請求項１に記載の癌疾患治療用剤。
3. 次式（Ｉ）：
   

   

   ［式中、
   Ｍは、Ｍｎを表し、
   Ｘは、−（ＣＨ _２ ） _ｎ −を表し、
   Ｒは、−ＮＨＣＨ _２ −Ｙ（ここでＹは、
   

   

   を表し、式中ＧはＩ又はＣｌである）を表し、
   ｎは、０から１０の整数を表し、
   Ｚは、配位子を示し、ＯＡｃ又はＣｌである］
   で示されるクロリン金属錯体又はその薬理学的に許容される塩
   を有効成分として含有する、超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の皮膚疾患治療用剤。
4. 式（Ｉ）が、次式（Ｉ）−Ａ型：
   

   

   （式中、Ｍ、Ｘ、Ｒ、Ｇ、Ｚ及びｎは、前記定義と同一である）、又は
   次式（Ｉ）−Ｂ型：
   

   

   （式中、Ｍ、Ｘ、Ｒ、Ｇ、Ｚ及びｎは、前記定義と同一である）
   で示される請求項３に記載の皮膚疾患治療用剤。
5. 次式（Ｉ）：
   

   

   ［式中、
   Ｍは、Ｍｎを表し、
   Ｘは、−（ＣＨ _２ ） _ｎ −を表し、
   Ｒは、−ＮＨＣＨ _２ −Ｙ（ここでＹは、
   

   

   を表し、式中ＧはＩ又はＣｌである）を表し、
   ｎは、０から１０の整数を表し、
   Ｚは、配位子を示し、ＯＡｃ又はＣｌである］
   で示されるクロリン金属錯体又はその薬理学的に許容される塩
   を有効成分として含有する、超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の抗菌剤。
6. 式（Ｉ）が、次式（Ｉ）−Ａ型：
   

   

   （式中、Ｍ、Ｘ、Ｒ、Ｇ、Ｚ及びｎは、前記定義と同一である）、又は
   次式（Ｉ）−Ｂ型：
   

   

   （式中、Ｍ、Ｘ、Ｒ、Ｇ、Ｚ及びｎは、前記定義と同一である）
   で示される請求項５に記載の抗菌剤。
7. 注射剤の形態にある、請求項１又は２に記載の超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の癌疾患治療用剤。
8. 軟膏剤の形態にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の癌疾患治療剤、皮膚疾患治療用剤又は抗菌剤。
9. ローション剤の形態にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の癌疾患治療剤、皮膚疾患治療用剤又は抗菌剤。
10. 舌下錠の形態にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の超音波化学療法（ＳＴＤ：Sonodynamic Therapy）用の癌疾患治療剤、皮膚疾患治療用剤又は抗菌剤。

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