JP2021164452A - Ｆｇｆ２１関連障害を処置する方法 - Google Patents

Ｆｇｆ２１関連障害を処置する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに結合するモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片、ならびにこれを含む医薬組成物および処置方法を提供する。
【解決手段】β−ｋｌｏｔｈｏの特定の配列のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片、ならびにこれを含む医薬組成物および処置方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる２０１５年８月３日に
出願された米国仮出願第６２／２００，４４５号明細書の利益を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体において
本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１６年７月２８日に作成された前記ＡＳ
ＣＩＩコピーは、「PAT056954_SL.txt」と名付けられ、１２４，４８７バイトのサイズで
ある。
分野
本発明は、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）模倣抗体に関する。また、肥満、１
型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症（dyslipidemia）、非アルコール性脂肪性肝炎（
ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常（glucose intolerance
）、高血糖症、メタボリックシンドローム、ならびに他の代謝障害などのＦＧＦ２１関連
障害を処置するための方法、ならびに重篤な罹病患者の死亡率および罹患率を低減すると
きの方法も開示される。
背景
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーは、２２の、遺伝子的には顕著に異なるが、
相同なリガンドを特徴とし、７つのサブファミリーへと群分けされる。公表された文献に
従うと、ＦＧＦファミリーは、現在のところ、ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−２３の、少なくとも
２３のメンバーからなる（Reuss et al. (2003) Cell Tissue Res. 313:139-157）。
線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）は、マウス胚から単離され、ＦＧＦ１９およ
びＦＧＦ２３と近縁である。このＦＧＦサブファミリーは、古典的ＦＧＦでは一般的でな
い、多様な生理学的工程、すなわち、エネルギーホメオスタシスおよび胆汁酸ホメオスタ
シス、グルコース代謝および脂質代謝、ならびにリン酸ホメオスタシスのほか、ビタミン
Ｄホメオスタシスも調節する。さらに、古典的ＦＧＦと異なり、このサブファミリーは、
内分泌様にも作用する（Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8）。ＦＧＦ２１は、肝
臓内で優先的に発現することが報告されており（Nishimura et al. (2000) Biochimica e
t Biophysica Acta, 1492:203-206；国際特許公開第０１／３６６４０号パンフレット；
および国際特許公開第０１／１８１７２号パンフレット）、虚血性血管疾患、創傷治癒、
および肺細胞機能、気管支細胞機能、または肺胞細胞機能の喪失と関連する疾患、ならび
に他の多数の障害のための処置として記載されている。
ＦＧＦ２１は、強力な代謝性調節因子として同定されている。ＦＧＦ２１の、食餌誘導
性肥満または遺伝性肥満および糖尿病を伴う齧歯動物およびアカゲザルへの全身投与は、
強力な血糖降下効果およびトリグリセリド低下効果を及ぼし、体重の低減をもたらす（Co
skun, T, et al. (2008) Endocrinology 149:6018-6027; Kharitonenkov, A, et al. (20
05) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635; Kharitonenkov, A, et al. (2
007) Endocrinology 148:774-781; Xu, J, et al. (2009) Diabetes 58:250-259）。ＦＧ
Ｆ２１は、２８アミノ酸のリーダー配列を含有する、２０９アミノ酸のポリペプチドであ
る。ヒトＦＧＦ２１は、マウスＦＧＦ２１に対する約７９％のアミノ酸同一性と、ラット
ＦＧＦ２１に対する約８０％のアミノ酸同一性とを有する。
哺乳動物では、ＦＧＦは、４つのＦＧＦ受容体のセットであるＦＧＦＲ１〜４を介して
、それらの作用を媒介し、これにより、ＦＧＦＲ１〜４が多重スプライス変異体で発現す
る。各ＦＧＦ受容体は、リガンドが結合すると活性化し、ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）、Ｒ
ＡＦ１、ＡＫＴ１、およびＳＴＡＴを伴う、下流のシグナル伝達経路をもたらす、細胞内
チロシンキナーゼドメインを含有する（Kharitonenkov, A. et al. (2008) BioDrugs 22:
37-44）。いくつかの報告は、ＦＧＦＲ１〜３の、「ｃ」レポーターのスプライス変異体
が、β−ｋｌｏｔｈｏに対する特異的なアフィニティーを呈示し、ＦＧＦ２１の内因性受
容体として作用しうることを示唆した（Kurosu et al., 2007 J. Biol. Chem. 282:26687
-26695); Ogawa et al., 2007 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7437; Kharitonen
kov et al., 2008 J. Cell Physiol. 215, 1-7）。３Ｔ３−Ｌ１細胞内および白色脂肪組
織内で、ＦＧＦＲ１は、圧倒的に最も豊富な受容体であり、したがって、この組織内の、
ＦＧＦ２１の主要な機能的受容体は、β−ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体である可能
性が最も高い。
ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ受容体、ならびにＦＲＳ２ａおよびＥＲＫを含む下流のシグナル
伝達分子を活性化させるが、ＦＧＦＲとＦＧＦ２１との直接的相互作用は検出されていな
い。さらに、多様な非脂肪細胞は、複数のＦＧＦＲアイソフォームを発現させるが、ＦＧ
Ｆ２１に応答しない。これらのデータの全ては、共因子が、ＦＧＦＲを介するＦＧＦ２１
シグナル伝達を媒介するはずであることを示唆する。研究は、肝臓内、脂肪細胞内、およ
び膵臓内で、ＦＧＦ２１に対する細胞応答の決定基として高度に発現する、ベータ−ｋｌ
ｏｔｈｏ（β−ｋｌｏｔｈｏ）を同定している（Kurosu, H. et al. (2007) J Biol Chem
282, 26687-95）。β−ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、
ＦＧＦ２１に結合するが、ＦＧＦＲ単独は結合しない（Kharitonenkov, A. et al. (2008
) J Cell Physiol 215, 1-7）。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、またはＦ
ＧＦＲ３ｃと複合したβ−ｋｌｏｔｈｏには結合するが、ＦＧＦＲ４と複合したβ−ｋｌ
ｏｔｈｏには結合しない（Owen et al., 2015 Trends in Endocrinology 26: 22-29）。
同様の機構は、ＦＧＦ２３−ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ系においても同定されている（Urak
awa, I. et al. (2006) Nature 444, 770-4）。
ＦＧＦ２１の生物学的活性は、マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞グルコース取込みアッセイ
において、最初に同定された（Kharitonenkov, A. et al. (2005) J Clin Invest 115, 1
627-35）。その後、ＦＧＦ２１は、インスリン非依存性のグルコース取込みおよびＧＬＵ
Ｔ１の発現を誘導することが示された。ＦＧＦ２１はまた、糖尿病齧歯動物モデルの範囲
内で高血糖症を改善することも示されている。加えて、ＦＧＦ２１を過剰発現させるトラ
ンスジェニックマウスは、体重および体脂肪量の減少、ならびにインスリン感受性の増強
を含む、食餌誘導性代謝異常に対して抵抗性であることも見出された（Badman, M.K. et
al. (2007) Cell Metab 5, 426-37）。ＦＧＦ２１の、糖尿病性非ヒト霊長動物（ＮＨＰ
）への投与は、空腹時血漿グルコースレベル、空腹時血漿トリグリセリドレベル、空腹時
血漿インスリンレベル、および空腹時血漿グルカゴンレベルの低下を引き起こし、ＨＤＬ
コレステロールのほぼ８０％の増大を含む、リポタンパク質プロファイルの著明な改善を
もたらした（Kharitonenkov, A. et al. (2007) Endocrinology 148, 774-81）。重要な
ことに、このＮＨＰ研究中のいかなる時点においても、低血糖症は観察されなかった。他
の研究では、ＦＧＦ２１が、空腹状態への適応を制御する一助となる、重要な内分泌ホル
モンとして同定された。これは、これまで欠けていた要素であったＰＰＡＲαの下流を提
供するものであり、これにより肝臓は、エネルギーホメオスタシスの生物学の調節におい
て、体内の他の部分と情報をやり取りする。ＦＧＦ２１が、脂肪（脂肪分解）、肝臓（脂
肪酸の酸化およびケトン生成）、および脳（麻痺）を調節するという観察の組合せによっ
て、ＦＧＦ２１が空腹に対する応答の主要な内分泌調節因子であることが確立されている
（Kharitonenkov, A. & Shanafelt, A.B. (2008) BioDrugs 22, 37-44）。
ＦＧＦ２１を、生物学的治療剤として直接使用することに関する問題は、その半減期が
、非常に短いことである。マウスでは、ヒトＦＧＦ２１の半減期は、０．５〜１時間であ
り、カニクイザルでは、半減期は、２〜３時間である。さらに、野生型ＦＧＦ２１を、医
薬製剤中または医薬調製物中で使用する場合、その安定性は、保存剤、例えば、ｍ−クレ
ゾールにより有害な影響を受ける。
要旨
本発明は、ＦＧＦ２１模倣抗体、すなわち、ベータ−ｋｌｏｔｈｏ（β−ｋｌｏｔｈｏ
）に結合し、ヒト線維芽細胞増殖因子２１（以下、場合によって、「ＦＧＦ２１」と称す
る）受容体複合体と、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体
依存性のシグナル伝達）とを活性化させるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、な
らびにこれらを含む医薬組成物および処置方法に関する。
本発明の抗原結合性断片（ＦＧＦ２１模倣抗体、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の）は、
ＦＧＦ２１様の活性および選択性を伴うが、治療的に所望の特徴、例えば、タンパク質の
安定性、低免疫原性、作製の容易さ、および所望されるｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を
付加した分子でありうる。
本発明のモノクローナルＦＧＦ２１模倣抗体、その抗原結合性断片、およびこれらを含
む医薬組成物は、肥満、２型糖尿病、１型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂
肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、
メタボリックシンドローム、高血圧症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾
患、脳卒中、心不全、冠動脈性心疾患、腎疾患、糖尿病性合併症、神経障害、胃不全麻痺
、および他の代謝障害などのＦＧＦ２１関連障害を処置し、重篤な罹病患者の死亡率およ
び罹患率を低減するのに有用である。
本明細書で記載される単離ＦＧＦ２１模倣抗体または抗原結合性断片は、β−ｋｌｏｔ
ｈｏに、１００ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。例えば、本明細書で記載さ
れる単離抗体または抗原結合性断片は、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに、１００ｐＭ以下、５０
ｐＭ以下、４５ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３５ｐＭ以下、２５ｐＭ以下、または１５ｐＭ
以下のＫＤで結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結
合性断片はまた、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに、溶液平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定
した場合に１０ｐＭ以下のＫＤで結合することも可能であり、また、ｐＥＲＫ細胞アッセ
イにより測定した場合に５０ｎＭ以下のＥＣ５０で、カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋ
ｌｏｔｈｏ受容体複合体も活性化させうる。
本発明は、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏに結合する、単離抗体またはそ
の抗原結合性断片に関する。本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏに結合し、ＦＧＦ２１受容
体複合体と、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体依存性の
シグナル伝達）とを活性化させる、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。特定
の態様では、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＦＧＦＲ
２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合
体、またはヒトＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体を活性化させない。
本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏに結合し、結合について、表１に記載されている抗体
とさらに競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はまた、表１
に記載されている抗体と同じエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片に
もさらに関する。
本明細書で記載される抗体および／またはその抗原結合性断片の間の「競合」とは、い
ずれの抗体（またはその結合性断片）も、同じβ−ｋｌｏｔｈｏエピトープに結合する（
例えば、競合的結合アッセイにより、当業者に周知の方法のうちのいずれかにより決定さ
れる通りに）ことを意味する。抗体またはその抗原結合性断片はまた、前記競合抗体また
はその抗原結合性断片が、本発明の抗体または抗原結合性断片と同じβ−ｋｌｏｔｈｏエ
ピトープまたは重複β−ｋｌｏｔｈｏエピトープに結合する場合にも、本発明のβ−ｋｌ
ｏｔｈｏ抗体または抗原結合性断片（例えば、ＮＯＶ００１またはＮＯＶ００２）と「競
合する」。本明細書で使用される、競合抗体またはその抗原結合性断片はまた、（ｉ）本
発明の抗体もしくは抗原結合性断片がその標的に結合することを立体的に遮断する（例え
ば、前記競合抗体が、近接する非重複β−ｋｌｏｔｈｏおよび／またはβ−ｋｌｏｔｈｏ
エピトープに結合し、本発明の抗体または抗原結合性断片がその標的に結合することを物
理的に妨げる場合）；および／または（ｉｉ）異なる非重複β−ｋｌｏｔｈｏエピトープ
に結合し、発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ抗体または抗原結合性断片が、コンフォメーショナル
変化の非存在下で生じる形では、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に結合できないように、前
記タンパク質に対する前記コンフォメーショナル変化を誘導する、競合抗体またはその抗
原結合性断片も含みうる。
本明細書で記載される単離抗体および抗原結合性断片の結合アフィニティーは、溶解平
衡滴定（ＳＥＴ）により決定することができる。当技術分野では、ＳＥＴ法が知られてお
り、以下でさらに詳細に記載される。代替的に、本明細書で記載される単離抗体または断
片の結合アフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより決定することもできる。当技
術分野では、Ｂｉａｃｏｒｅ反応速度アッセイ法が知られており、以下でさらに詳細に記
載される。
単離ＦＧＦ２１模倣抗体またはその抗原結合性断片を使用して、ＦＧＦ２１受容体複合
体の活性化を増大させ、これにより、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路の活性化を増大させる
ことができる。
本明細書で記載される単離ＦＧＦ２１模倣抗体またはそれらの抗原結合性断片は、モノ
クローナル抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ
断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはｓｃＦｖ断片、および／またはＩｇＧアイソタイプで
ありうる。
本明細書で記載される単離ＦＧＦ２１模倣抗体またはそれらの抗原結合性断片はまた、
アミノ酸が、ヒトＶＨ生殖細胞系列配列またはヒトＶＬ生殖細胞系列配列のそれぞれに由
来する抗体フレームワークへと置換されたフレームワークも含みうる。
本発明の別の態様は、表１に記載されているＦａｂの完全重鎖および軽鎖配列を有する
単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗原結
合性断片は、ＦａｂＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、ＮＯＶ００４の重鎖お
よび軽鎖配列を有しうる。
本発明のさらなる態様は、表１に記載されているＦａｂの重鎖および軽鎖可変ドメイン
配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体また
はその抗原結合性断片は、ＦａｂＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、ＮＯＶ０
０４の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有しうる。
本発明はまた、配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択される重鎖Ｃ
ＤＲ１、配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、
ならびに配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を
含み、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
別の態様では、このような単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１３、３３、
５３、および７３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４、３４、５４、
および７４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号１５、３５、５５
、および７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３をさらに含む。
本発明はまた、配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択される軽鎖
ＣＤＲ１、配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ
２、ならびに配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤ
Ｒ３を含み、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関
する。
本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であっ
て、Ｋａｂａｔにより規定されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨ
ＣＤＲ３が、配列番号３、４、および５を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が
、配列番号１３、１４、および１５を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨ
ＣＤＲ３が、配列番号２３、２４、および２５を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤ
Ｒ３が、配列番号３３、３４、および３５を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、お
よびＨＣＤＲ３が、配列番号４３、４４、および４５を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、
ＬＣＤＲ３が、配列番号５３、５４、および５５を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ
２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号６３、６４、および６５を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤ
Ｒ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号７３、７４、および７５を含む、単離抗体またはその抗原
結合性断片にも関する。
本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であっ
て、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、な
らびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、お
よびＨＣＤＲ３が、配列番号６、７、および８を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤ
Ｒ３が、配列番号１６、１７、および１８を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、お
よびＨＣＤＲ３が、配列番号２６、２７、および２８を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、
ＬＣＤＲ３が、配列番号３６、３７、および３８を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ
２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号４６、４７、および４８を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤ
Ｒ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号５６、５７、および５８を含むか；またはＨＣＤＲ１、Ｈ
ＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号６６、６７、および６８を含み、ＬＣＤＲ１、
ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号７６、７７、および７８を含む、単離抗体またはそ
の抗原結合性断片にも関する。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９、２９、４９
および６９からなる群から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む。単離抗体または抗原
結合性断片は、軽鎖可変ドメイン配列をさらに含むことが可能であり、この場合、重鎖可
変ドメインと軽鎖可変ドメインとは、組み合わさって、β−ｋｌｏｔｈｏに対する抗原結
合性部位を形成する。特に、軽鎖可変ドメイン配列は、配列番号１９、３９、５９、およ
び７９から選択することができ、この場合、前記単離抗体またはその抗原結合性断片は、
ベータ−ｋｌｏｔｈｏに結合する。
本発明はまた、配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される軽鎖
可変ドメイン配列を含み、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合
性断片にも関する。単離抗体または抗原結合性断片は、重鎖可変ドメイン配列をさらに含
むことが可能であり、この場合、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとは、組み合わさ
って、β−ｋｌｏｔｈｏに対する抗原結合性部位を形成する。
特に、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９
および１９；２９および３９；４９および５９；または６９および７９、の配列をそれぞ
れ含む、重鎖および軽鎖可変ドメインを有しうる。
本発明はさらに、配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択される配列
と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む単離抗体またはその抗
原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する。一態様で
は、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号１９、３９、５９、および７９
からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイ
ンも含む。本発明のさらなる態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔに
より規定され、表１に記載されている、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ
１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有する。
本発明はまた、配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される配列
と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその
抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する。
本発明の別の態様では、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断
片は、配列番号１１、３１、５１、または７１の配列を含む重鎖を有しうる。単離抗体は
また、重鎖と組み合わさって、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに対する抗原結合性部位を形成しう
る軽鎖も含みうる。特に、軽鎖は、配列番号２１、４１、６１、または８１を含む配列を
有しうる。特に、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配
列番号１１および２１；３１および４１；５１および６１；または７１および８１、のそ
れぞれの配列を含む重鎖および軽鎖を有しうる。
本発明はなおさらに、配列番号９、２９、４９、または６９からなる群から選択される
配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性
断片にも関し、この場合、前記抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する。一態様では、単離
抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号２１、４１、６１、または８１からなる
群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖も含む。
本発明はなおさらに、配列番号２１、４１、６１、または８１からなる群から選択され
る配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖を含む単離抗体またはその抗原結合
性断片にも関し、この場合、前記抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する。
本発明はまた、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物
にも関する。本発明は同様に、薬学的に許容される担体と組み合わせた抗体組成物にも関
する。具体的に、本発明はさらに、例えば、抗体であるＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、Ｎ
ＯＶ００３、ＮＯＶ００４など、表１の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物
を含む。本発明はまた、表１の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちの２つ以上
の組合せを含む医薬組成物にも関する。
本発明はまた、配列番号９、２９、４９、および６９から選択される配列を有する、可
変重鎖をコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号１０、３０、５０
、および７０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性の配列（se
quence at least 90% sequence identity）を有する。本発明のさらなる態様では、配列
は、配列番号１０、３０、５０および７０である。
本発明はまた、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８から
選択される配列を有する可変軽鎖をコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、
配列番号２０、４０、６０、および８０からなる群から選択される配列と少なくとも９０
％の配列同一性の配列を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号２０、４
０、６０、および８０である。
本発明はまた、配列番号２０、４０、６０、および８０からなる群から選択される配列
と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコード
する配列を含む単離核酸にも関する。
本発明はまた、本明細書で記載される核酸分子のうちの１つまたは複数を含むベクター
にも関する。
本発明はまた、上記で記載した抗体の重鎖をコードする組換えＤＮＡ配列と、上記で記
載した抗体の軽鎖をコードする第２の組換えＤＮＡ配列とを含む単離宿主細胞にも関し、
この場合、前記ＤＮＡ配列は、プロモーターに作動可能に連結され、宿主細胞内で発現す
ることが可能である。抗体は、ヒトモノクローナル抗体でありうることが企図される。ま
た、宿主細胞は、非ヒト哺乳動物細胞であることも企図される。
本発明はまた、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）受容体を活性化させ、これによ
り、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体依存性のシグナル
伝達）を活性化させることにも関し、この場合、方法は、細胞を、本明細書で記載される
単離抗体またはその抗原結合性断片を含む、有効量の組成物と接触させるステップを含む
。
細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図さ
れる。一実施形態では、細胞は、脂肪細胞であることが企図される。他の実施形態では、
細胞は、肝細胞、膵細胞、内皮細胞、筋肉、または腎細胞のうちの１つまたは複数であり
うる。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
本発明はまた、対象におけるＦＧＦ２１関連障害を処置、改善、または防止する方法で
あって、対象に、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む
組成物を投与するステップを含む、方法にも関する。一態様では、ＦＧＦ２１関連障害は
、肥満である。一態様では、ＦＧＦ２１関連障害は、２型糖尿病である。対象は、ヒトで
あることが企図される。
前出の単離抗体またはその抗原結合性断片のうちのいずれも、モノクローナル抗体また
はその抗原結合性断片でありうる。
本開示の非限定的な実施形態を、以下の態様において記載する：
１．β−ｋｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン内のエピトープに結合する、単離抗体またはそ
の抗原結合性断片。
２．β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であ
って、エピトープが、表２に示された配列番号のうちの１つまたは複数を含む、単離抗体
またはその抗原結合性断片。
３．β−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離ＦＧＦ２１模倣抗体またはその抗原結合性断片で
あって、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させる、抗体または断片。
４．溶液平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定した場合に、１０ｐＭ以下のＫＤでヒ
トβ−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
５．β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であ
って、前記エピトープが、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基２４６〜２６
５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの１つまたは複数の
アミノ酸を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
６．β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のエピトープに結合する単離抗体またはその抗
原結合性断片であって、前記エピトープが、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の
残基６４６〜６７０、６９６〜７００、および６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１つま
たは複数を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
７．ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に、５０ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイ
ザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体を活性化させる、単離抗体またはその
抗原結合性断片。
８．表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して、少なくとも９５％の同
一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、態様１の単離抗体または抗原結合
性断片。
９．表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して、少なくとも９８％の同
一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、態様１の単離抗体または抗原結合
性断片。
１０．表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して、少なくとも９９％の
同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、態様１の単離抗体または抗原結
合性断片。
１１．表１の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３、ならびに／または表
１の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含む、前記態様のうちのいずれ
かの単離抗体または抗原結合性断片。
１２．表１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、変異体（variant）が、Ｃ
ＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちの１つにおいて、少なくとも１〜４カ所のアミ
ノ酸変化を有する、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１３．配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を
含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１４．配列番号９、２９、４９、６９からなる群から選択されるＶＨ、またはその９０
％の同一性を有するアミノ酸配列と；配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群
から選択されるＶＬ、またはその９０％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、態様１
〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１５．配列番号９、２９、４９、および２９からなる群から選択されるＶＨ、またはそ
の９５％の同一性を有するアミノ酸配列と；配列番号１９、３９、５９、および７９から
なる群から選択されるＶＬ、またはその９５％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、
態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１６．配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択されるＶＨ、またはそ
の９７％の同一性を有するアミノ酸配列と；配列番号１９、３９、５９、および７９から
なる群から選択されるＶＬ、またはその９７％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、
態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１７．配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択される可変重鎖配列を
含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１８．配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される可変軽鎖配列
を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１９．配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択される可変重鎖と；配
列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される可変軽鎖配列とを含む、
態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２０．配列番号９の可変重鎖、および配列番号１９の可変軽鎖配列を含む抗体または断
片、配列番号２９の可変重鎖、および配列番号３９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片
；配列番号４９の可変重鎖、および配列番号５９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片；
ならびに配列番号６９の可変重鎖、および配列番号７９の可変軽鎖配列を含む抗体または
断片からなる群から選択される、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合
性断片。
２１．配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；
配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；５、２５
、４５、および６５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１３、３３、５３
、および７３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４、３４、５４、およ
び７４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１５、３５、５５、お
よび７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの
単離抗体または抗原結合性断片。
２２．配列番号６、２６、４６、および６６からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；
配列番号７、２７、４７、および６７からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；８、２８
、４８、および６８からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６、３６、５６
、および７６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１７、３７、５７、およ
び７７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１８、３８、５８、お
よび７８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの
単離抗体または抗原結合性断片。
２３．配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５の重鎖ＣＤ
Ｒ３；配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１５
の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２４．配列番号２３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２５の重
鎖ＣＤＲ３；配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番
号３５の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性
断片。
２５．配列番号４３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号４５の重
鎖ＣＤＲ３；配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番
号５５の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性
断片。
２６．配列番号６３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号６５の重
鎖ＣＤＲ３；配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番
号７５の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性
断片。
２７．配列番号６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号８の重鎖ＣＤ
Ｒ３；配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１８
の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２８．配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２８の重
鎖ＣＤＲ３；配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番
号３８の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性
断片。
２９．配列番号４６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号４８の重
鎖ＣＤＲ３；配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番
号５８の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性
断片。
３０．配列番号６６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号６８の重
鎖ＣＤＲ３；配列番号７６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番
号７８の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性
断片。
３１．態様１２〜３０のうちのいずれかによる単離抗体または断片と同じエピトープに
結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
３２．β−ｋｌｏｔｈｏへの結合について、態様１２〜３０のうちのいずれかによる単
離抗体または断片と競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
３３．ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、およびＮＯＶ００４からなる群か
ら選択される、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
３４．上記態様のうちの１つの抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される
担体とを含む医薬組成物。
３５．代謝障害を処置する方法であって、代謝障害に罹患している対象に、有効量の、
態様１〜３０のうちのいずれかによる抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与
するステップを含む、方法。
３６．対象が、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪
性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、な
らびにメタボリックシンドロームのうちの１つまたは複数に罹患している、態様３５の方
法。
３７．対象が、肥満、糖尿病、および脂質異常症のうちの１つまたは複数に罹患してい
る、態様３５の方法。
３８．心血管障害を処置する方法であって、心血管障害に罹患している対象に、有効量
の、前記態様のうちのいずれかによる抗体または断片を含む医薬組成物を投与するステッ
プを含む、方法。
３９．対象が、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、および冠動脈
性心疾患のうちの１つまたは複数に罹患している、態様３８の方法。
４０．医薬（medicament）としての使用のための、態様１〜３０のうちのいずれかによ
る抗体またはその抗原結合性断片。
４１．前記態様のうちのいずれかによる抗体のうちの１つまたは複数をコードする核酸
。
４２．表１に示される配列と、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む核酸。
４３．表１に示される配列と、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む核酸。
４４．態様４１による核酸を含むベクター。
４５．態様４４のベクターを含む宿主細胞。
４６．代謝障害の処置における使用のための、態様１〜３０のうちのいずれかによる抗
体または抗原結合性断片を含む医薬組成物。
定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本
発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書で使用される「ＦＧＦ２１」という用語は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タ
ンパク質ファミリーのメンバーを指す。ＦＧＦ２１のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託
番号：ＮＰ＿０６１９８６．１）を、配列番号１として示し、その対応するポリヌクレオ
チド配列を、配列番号２（ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＭ＿０１９１１３．２）として示す。
本明細書で使用される「ＦＧＦ２１受容体」という用語は、ＦＧＦ２１の受容体（Khar
itonenkov,A, et al. (2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7; Kurosu,H, et
al. (2007) JBC 282:26687-26695; Ogawa, Y, et al. (2007) PNAS 104:7432-7437）を指
す。
「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、ヒトにおいて発現する自然発生のポリペプ
チドを指す。本開示の目的では、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、２０９アミ
ノ酸残基からなり、配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされたあらゆる全長Ｆ
ＧＦ２１ポリペプチド、例えば配列番号１；１８１アミノ酸残基からなり、全長ＦＧＦ２
１ポリペプチドのアミノ末端における２８アミノ酸残基（すなわちシグナルペプチドを構
成する）が除去された、上記ポリペプチドのあらゆる成熟形態、およびそれらの変異体を
指すように、互換的に使用することができる。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合性断片（す
なわち、「抗原結合性部分」）またはそれらの単鎖体を意味する。全抗体は、ジスルフィ
ド結合により相互接続される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む
糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略記する）および
重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣ
Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略記する）および軽鎖定常
領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領
域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存的な領域を散在させた、相補性決定
領域（ＣＤＲ）と称する超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよび
各ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序で配置される３つのＣＤＲお
よび４つのＦＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４から
なる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗
体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または免疫系の多様な細胞（例えば、エフ
ェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介し
うる。
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性部分」または「抗原結合性断片」という用
語は、所与の抗原（例えば、β−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する能力を保持する、イ
ンタクトな抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能は、インタクトな
抗体の断片により果たされうる。抗体の抗原結合性部分または抗原結合性断片という用語
内に包含される結合性断片の例は、Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメ
イン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；ヒンジ領域においてジスルフィド架橋に
より連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメイン
およびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨ
ドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体
（ｄＡｂ）断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；ならびに単離相補性決定領
域（ＣＤＲ）を含む。
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬドメインおよびＶＨドメインは、個別の
遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖として
作製することを可能とする人工のペプチドリンカーにより付着することができ、この場合
、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であ
り、例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426；およびHuston et al., 1988 Pro
c. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照されたい）を形成する。このような単鎖抗体は
、抗体の１つまたは複数の抗原結合性部分または抗原結合性断片を含む。これらの抗体断
片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片も、インタクトな抗体と同じ形
で有用性についてスクリーニングされる。
抗原結合性断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボデ
ィ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖ
（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136を参
照されたい）へと組み込むこともできる。抗体の抗原結合性部分は、ＩＩＩ型フィブロネ
クチン（Ｆｎ３）などのポリペプチド（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについ
て記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）に基づく足場へとグ
ラフトすることができる。
抗原結合性断片は、相補的な軽鎖ポリペプチドと併せて抗原結合性領域の対を形成する
、タンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む単鎖分子へと組み
込むことができる（Zapata et al.(1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062；および米国特
許第５，６４１，８７０号明細書）。
本明細書で使用される「アフィニティー」という用語は、単一の抗原性部位における抗
体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領
域は、多数の部位において、弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用し、相互作用が
大きいほど、アフィニティーは強くなる。抗体またはその抗原結合性断片（例えば、Ｆａ
ｂ断片）について本明細書で使用される「高アフィニティー」という用語は一般に、ＫＤ
が１０−９Ｍ以下の抗体または抗原結合性断片を指す。
「アミノ酸」という用語は、自然発生のアミノ酸および合成アミノ酸のほか、自然発生
のアミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体も指す。自然発生
のアミノ酸とは、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のほか、後で修飾されたアミ
ノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセ
リンでもある。アミノ酸類似体とは、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわ
ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン
、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したアルファ炭素を有
する化合物を指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾
ペプチド骨格を有するが、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ
酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、自然発生のアミノ
酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、１つの抗原決定基だけと反応する
個別の抗原結合部位の能力を指す。
抗体（例えば、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体）に「特異的に（または選択的に）結合す
る」という語句は、タンパク質および他の生体物質の異質な集団内のコグネイト抗原（例
えば、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏまたはカニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏ）の存在を決定する結
合反応を指す。本明細書では、「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」と
いう語句が、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
「ＦＧＦ２１に媒介される」という用語または類似の用語は、本発明のＦＧＦ２１受容
体および／または抗体が、β−ｋｌｏｔｈｏに結合すると、細胞応答およびＦＧＦ２１シ
グナル伝達経路を媒介し、これにより、以下：血漿トリグリセリド、血漿インスリン、血
漿グルコース、食物摂取、および体重のうちの１つまたは複数の低減を含むがこれらに限
定されない、様々な生理学的効果を誘発するという事実を指す。
本明細書で使用される「ＦＧＦ２１関連障害」、「ＦＧＦ２１関連状態」、「ＦＧＦ２
１と関連する疾患もしくは状態」、または類似の用語は、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路の
活性化（例えば、ＦＧＦ２１受容体シグナル伝達の活性化による）による防止、診断、お
よび／または処置が求められる、任意の数の状態または疾患を指す。これらは、ＦＧＦ２
１シグナル伝達の異常（例えば、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達および／またはＦ
ＧＦ２１受容体によるシグナル伝達の活性化の異常）を特徴とする、状態、疾患、または
障害を含みうる。これらの状態は、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非
アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、イ
ンスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、メタボリックシンドローム
、急性心筋梗塞、高血圧症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中
、心不全、冠動脈性心疾患、腎疾患、糖尿病性合併症、神経障害、胃不全麻痺、インスリ
ン受容体内の重度の不活化突然変異と関連する障害、ならびに他の代謝障害（other meta
bolic disorders, and in reducing the mortality and morbidity of critically ill p
atients）などの、代謝障害、内分泌障害、および心血管障害を含むがこれらに限定され
ない。
「２型糖尿病」とは、インスリンが利用できるもかかわらず、過剰なグルコース産生を
特徴とする状態であり、グルコースクリアランスが不十分な結果として、循環グルコース
レベルが、過剰に高く保たれる。
「１型糖尿病」とは、インスリンの完全な欠如により引き起こされる、高血中グルコー
スレベルを特徴とする状態である。これは、体内の免疫系が、膵臓内のインスリン産生ベ
ータ細胞を攻撃し、それらを破壊する場合に生じる。このため、膵臓は、インスリンをほ
とんど産生しないか、または全く産生しない。
「膵炎」とは、膵臓の炎症である。
「脂質異常症」とは、リポタンパク質の過剰産生または欠損を含む、リポタンパク質代
謝の障害である。脂質異常症は、血中の総コレステロール濃度、低密度リポタンパク質（
ＬＤＬ）コレステロール濃度、およびトリグリセリド濃度の上昇、ならびに高密度リポタ
ンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度の低下により顕在化しうる。
「非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」とは、アルコール消費量と関連せず、肝細
胞の脂肪の変化を特徴とし、小葉内の炎症および線維症を伴う肝疾患である。
「耐糖能異常」または耐糖能障害（ＩＧＴ）とは、心血管病態の危険性の増大と関連す
る、前糖尿病性の血糖異常状態である。前糖尿病性状態は、対象が、グルコースを、細胞
へと効率的に送り込み、効率的な燃料供給源として活用することを妨げ、血中グルコース
レベルの上昇と、ある程度のインスリン抵抗性とをもたらす。
「高血糖症」とは、血中の糖（グルコース）の過剰として定義される。
低血糖とも呼ばれる「低血糖症」は、血中グルコースレベルが、身体活動に十分なエネ
ルギーを供給するには余りに低く降下する場合に生じる。
「高インスリン血症」とは、血中インスリンレベルが、正常レベルより高いこととして
定義される。
「インスリン抵抗性」とは、正常量のインスリンにより、正常未満の生物学的応答がも
たらされる状態として定義される。
ヒト対象に関する「肥満」とは、所与の集団の理想体重を、２０パーセントを超えて上
回る体重として定義することができる（R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1
974, p. 904-916）。また「肥満」とは、３０以上の体格指数（ＢＭＩ；人のメートル単
位の身長の２乗で除したキログラム単位の体重（ｋｇ／ｍ２）として定義される）として
定義することもできる。
「メタボリックシンドローム」とは、以下の徴候：腹部脂肪（大半の男性において、腰
回りが４０インチ以上である）；高血糖（空腹時において、１デシリットル当たり少なく
とも１１０ミリグラム（ｍｇ／ｄｌ）；高トリグリセリド（血流中に少なくとも１５０ｍ
ｇ／ｄＬ；低ＨＤＬ（４０ｍｇ／ｄｌ未満）；および１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧の
うちの少なくとも３つによるクラスターとして定義することができる。
「高血圧症」または高血圧とは、全身動脈血圧の、心血管損傷または他の有害な帰結を
誘導する可能性が高いレベルへの、一過性または持続性の上昇である。高血圧症は、任意
に、１４０ｍｍＨｇを上回る収縮期血圧または９０ｍｍＨｇを上回る拡張期血圧として定
義されている。
「心血管疾患」とは、心臓または血管と関連する疾患である。
「末梢動脈疾患」は、血液を、頭部、臓器、および四肢へと運ぶ動脈内に、プラークが
蓄積する場合に生じる。経時的に、プラークは、動脈を硬化させ、狭窄させる場合があり
、これにより、酸素に富む血液の、臓器、および体内の他の部分への流動が制限される。
「アテローム性動脈硬化」とは、大型および中型の動脈の内膜内の、不規則に分布した
脂質沈着を特徴とする血管疾患であって、動脈内腔の狭窄を引き起こし、最終的に、線維
症および石灰化へと進行する。病変は通例、限局性であり、緩徐かつ間欠的に進行する。
血流の制限は、大半の臨床症状の原因となり、臨床症状は、病変の分布および重症度と共
に変化する。
「脳卒中」とは、２４時間を超えて続く、大脳循環の機能障害と関連する、任意の急性
臨床事象である。脳卒中は、不可逆性の脳損傷を伴い、症状の種類および重症度は、その
循環が損なわれた脳組織の位置および広がりに依存する。
うっ血性心不全とも呼ばれる「心不全」とは、心臓が、体内の残りの部分へと、十分な
血液を、もはや駆出できない状態である。
冠動脈疾患とも呼ばれる「冠動脈性心疾患」とは、血液および酸素を心臓へと供給する
小血管の狭窄である。
「腎疾患」または腎症とは、腎臓の任意の疾患である。糖尿病性腎症は、１型糖尿病者
または２型糖尿病者における罹患率および死亡率の主要な原因である。
「糖尿病性合併症」とは、高血中グルコースレベルにより引き起こされる問題であって
、腎臓、神経（神経障害）、脚部（脚部潰瘍および循環の低下）、および眼（例えば、網
膜症）など、他の身体機能に関する。糖尿病はまた、心疾患および骨関節障害に対する危
険性も増大させる。糖尿病の、他の長期にわたる合併症は、皮膚問題、消化器問題、性機
能不全、ならびに歯および歯茎に関する問題を含む。
「神経障害」とは、脳神経または末梢神経系もしくは自律神経系に関与する任意の疾患
である。
「胃不全麻痺」とは、胃の蠕動の減退であり、結果として排便の遅延を引き起こす。
本発明により包含される、重篤な罹病患者は一般に、不安定な代謝亢進状態を経る。こ
の不安定な代謝性状態は、一部の栄養物の相対的欠損をもたらしうる、基質代謝の変化に
起因する。一般に、脂肪および筋肉の両方について、酸化の増大が見られる。
さらに、重篤な罹病患者は、全身性炎症性応答症候群または呼吸困難を経る患者である
ことが好ましい。罹患率の低減は、重篤な罹病患者が、さらなる疾病、状態、もしくは症
状を発症する可能性を低減すること、またはさらなる疾病、状態、もしくは症状の重症度
を低減することを意味する。例えば、罹患率を低減することは、菌血症もしくは敗血症、
または多臓器不全と関連する合併症の発生率の減少に対応しうる。
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列のいずれに
も適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一なアミノ
酸配列もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配
列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために、
多数の機能的に同一な核酸が、所与の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンで
あるＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵのいずれも、アミノ酸であるアラニンをコー
ドする。したがって、アラニンがコドンにより指定されるあらゆる位置で、コードされる
ポリペプチドを改変せずに、コドンを、記載された対応するコドンのうちのいずれかへと
改変することができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異のうちの１種で
ある「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書のあらゆる核酸配
列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても記載する。当業者は、核酸内
の各コドン（通常メチオニンだけのコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンだけ
のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一な分子をもたらしうることを認
識するであろう。したがって、記載される各配列内では、ポリペプチドをコードする核酸
の各サイレント変異が含意されている。
ポリペプチド配列では、「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸の、化学的に類似
するアミノ酸による置換を結果としてもたらす、ポリペプチド配列への個別の置換、欠失
、または付加を含む。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換
表が周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相
同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。以下
の８つの群：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタ
ミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リ
シン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ
）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン
（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに
対して保存的置換であるアミノ酸を含有する（例えば、Creighton, Proteins(1984)を参
照されたい）。いくつかの実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配
列を含有する抗体の結合特徴にそれほど大きな影響を及ぼしたりこれを改変したりしない
アミノ酸修飾を指すのに使用する。
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的な結合が可能なタンパク質決定基を意味
する。エピトープは通例、アミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からな
り、通例、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有する。コンフォメーシ
ョナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープとは、前者への結合は、変性溶媒
の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領
域のいずれもが、ヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する
。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、このようなヒト配列、例え
ば、ヒト生殖細胞系列配列またはヒト生殖細胞系列配列の突然変異させたバージョンに由
来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により導
入された突然変異、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異により導入された突然
変異）を含みうる。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を提示し、フレームワー
ク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。一実
施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞へと融合させた、ヒト重鎖導入遺伝
子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、非ヒトトランスジェニック動物、例えば
、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより作製される
。
「ヒト化」抗体とは、ヒトにおいての免疫原性は小さいが、非ヒト抗体の反応性を保持
する抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分を、そ
れらのヒト対応物（すなわち、定常領域、ならびに可変領域のフレームワーク部分）で置
きかえることにより達成することができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984；Morrison and Oi、Adv. Immunol., 44:65-92, 1988
；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988；Padlan, Molec. Immun., 28:489-
498, 1991；およびPadlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994を参照されたい。ヒト操作
技術の他の例は、米国特許第５，７６６，８８６号明細書において開示されているＸｏｍ
ａ技術を含むがこれらに限定されない。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一な」または「同一性
」パーセントという用語は、２つ以上の配列または部分配列が同じであることを指す。以
下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手作業のアライメントおよび
目視により測定される比較域または指定領域にわたり、最大の対応性について比較され、
配列決定された場合の、２つの配列の、指定された百分率のアミノ酸残基またはヌクレオ
チドが同じであれば（すなわち、指定される領域にわたる、または、指定されない場合は
、配列全体にわたる、６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、
８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有すれば）、２つの配列は「実質的に
同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミ
ノ酸）の長さの領域にわたり、またはより好ましくは、１００〜５００、または１０００
ヌクレオチド以上（または２０、５０、または２００アミノ酸以上）の長さの領域にわた
り存在する。
配列比較では、１つの配列が、それに照らして被験配列を比較する基準配列として働く
ことが典型的である。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および基準配列を
コンピュータへと入力し、必要な場合は、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプロ
グラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもでき
、代替的なパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、
プログラムパラメータに基づき、被験配列について、基準配列と比べた配列同一性パーセ
ントを計算する。
本明細書で使用される「比較域」は、２つの配列を最適に配列決定した後で、配列を、
同じ数の連続的な位置による基準配列と比較しうる、２０〜６００、通例約５０〜約２０
０、より通例では、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続的な位置の数のう
ちのいずれか１つによるセグメントに対する言及を含む。当技術分野では、比較のための
配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Sm
ith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cによる局所相同性アルゴリズムによ
り行うこともでき、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970による相同性ア
ライメントアルゴリズムにより行うこともでき、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Aca
d. Sci. USA 85:2444, 1988による類似性検索法（search for similarity method）によ
り行うこともでき、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍ
ｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにお
けるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により行うこともでき
、手作業のアライメントおよび目視（例えば、Brent et al., Current Protocols in Mol
ecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.（Ringbou ed., 2003）を参照されたい）によ
り行うこともできる。
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズム
の２つの例は、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；お
よびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990において記載されている、ＢＬ
ＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実
施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公表されている。このアルゴリズムは、
データベース配列内の同じ長さのワードで配列決定したときに、ある正の値の閾値スコア
Ｔにマッチするかまたはこれを満たす、クエリー配列内の短いワード長Ｗを同定すること
により、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを伴う。Ｔを、隣接ワードスコア
閾値（Altschul et al.,前出）と称する。これらの初期の隣接ワードヒットが、これらを
含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして働く。累積アライメ
ントスコアが増大しうる限りにおいて、ワードヒットを、各配列に沿っていずれの方向に
も拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（マッチする残基の対
についてのリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルテ
ィースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリッ
クスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、達成されたその最
大値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたは複数の負スコア残基のアライメントの累積の
ために、累積スコアが、ゼロ以下に低下した場合；または配列のいずれかの末端に達した
場合は、各方向へのワードヒットの拡張を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメー
タであるＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡ
ＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待
値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。アミノ
酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムでは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）
、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０
の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性についての統計学的解析（例
えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照さ
れたい）も実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、
２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチングが偶然に生じる確率の指標
をもたらす最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、被験核酸を基準核酸に照らして比
較したときの最小合計確率が約０．２未満であり、より好ましくは、約０．０１未満であ
り、最も好ましくは、約０．００１未満であれば、核酸は基準配列と類似すると考えられ
る。
２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、１
２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプ
ログラム（バージョン２．０）へと組み込まれた、E. Meyers and W. Miller（Comput. A
ppl. Biosci., 4:11-17, 1988）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる
。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリ
ックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、また
は４のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけを使用す
る、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネット上のgcg.comで入手可能である）内
のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、Needleman and Wunsch（J. Mol, Biol. 48:444-4
53, 1970）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。
上記で言及した配列同一性百分率以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的
に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、第１の核酸によりコードされる
ポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に
交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけに
よって異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一なことが典型的
である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り
、２つの分子またはそれらの相補体が、厳密な条件下で、互いとハイブリダイズすること
である。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマー
を使用して配列を増幅しうることである。
「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗
体を指す（例えば、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する単離抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏ
以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、β−ｋｌｏｔｈｏに
特異的に結合する単離抗体は、他の抗原に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗
体は、他の細胞内物質および／または化学物質を実質的に含まない場合もある。
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によりもたらされる抗体クラス（
例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＧ）を指す。アイソタイプ
はまた、これらのクラスのうちの１つの修飾バージョンも含み、その修飾は、Ｆｃ機能を
改変する、例えば、エフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を増強または低減するよ
うに施されている。
本明細書で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語が、特定の抗体−抗
原間相互作用の会合速度を指すことを意図するのに対し、本明細書で使用される「Ｋｄｉ
ｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用の解離速度を指すことを
意図する。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、ＫｄのＫａに対する比（すなわ
ち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指すことを意図し、モル濃度（Ｍ）として表す
。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる
。抗体のＫＤを決定するための方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイ
オセンサーシステムを使用して表面プラズモン共鳴を測定するか、または溶液平衡滴定（
ＳＥＴ）により溶液中のアフィニティーを測定するステップを含む。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」と
いう用語は、単一の分子組成による抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物
は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。
本明細書では、「核酸」という用語が、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使
用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖形態ま
たは二本鎖形態におけるポリマーを指す。「核酸」という用語は、公知のヌクレオチド類
似体または修飾骨格残基もしくは修飾連結を含有する核酸であって、合成の核酸、自然発
生の核酸、および非自然発生の核酸であり、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌク
レオチドと同様の形で代謝される核酸を包含する。このような類似体の例は、限定なしに
述べると、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチ
ルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
別段に指し示されない限りにおいて、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその
変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も暗示的に包含するほか、明示的に
指し示される配列も包含する。とりわけ、下記で詳述される通り、縮重コドン置換は、１
つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／ま
たはデオキシイノシン残基で置換された配列を作り出すことにより達成することができる
（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.
260:2605-2608, 1985；およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）
。
「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮ
Ａ）セグメントの間の機能的関係を指す。「作動可能に連結された」という用語は、転写
調節配列の、転写される配列に対する機能的関係を指すことが典型的である。例えば、プ
ロモーター配列またはエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞内または他の発現系
内のコード配列の転写を刺激またはモジュレートするとき、コード配列に作動可能に連結
されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列
は、転写される配列と物理的に隣接する、すなわち、シス作用型である。しかし、エンハ
ンサーなど、一部の転写調節配列は、その転写をそれらが増強するコード配列に物理的に
隣接する必要も、近接して配置される必要もない。
本明細書で使用される「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列を、産生細胞
または産生生物、一般に、真核細胞、例えば、ピキア（Pichia）属細胞、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ
酸配列をコードするように改変していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列
は、「親」配列としてもまた公知の出発ヌクレオチド配列により本来コードされるアミノ
酸配列を、完全に、または可能な限り多く保持するように操作する。本明細書の最適化さ
れた配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。しか
し、本明細書ではまた、他の真核細胞または原核細胞におけるこれらの配列の最適化され
た発現も企図される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列も
また、最適化されていると称する。
本明細書では、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語が、アミノ酸残基の
ポリマーを指すように互換的に使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」とい
う用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生のアミノ酸の人工の化学
的模倣体であるアミノ酸ポリマーのほか、自然発生のアミノ酸ポリマーおよび非自然発生
のアミノ酸ポリマーにも適用される。別段に指し示されない限りにおいて、特定のポリペ
プチド配列はまた、保存的に修飾されたその変異体も暗示的に包含する。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子に
ついてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）
またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させる
ように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組
換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロ
ブリン遺伝子配列（human immunoglobulin gene, sequences）の全部または一部の、他の
ＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、他の任意の手段により調製されるか、発現させる
か、創出されるか、または単離される抗体など、組換え手段により調製されるか、発現さ
せるか、創出されるか、または単離される、全てのヒト抗体を含む。このような組換えヒ
ト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン
配列に由来する可変領域を有する。しかし、ある種の実施形態では、このような組換えヒ
ト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジ
ェニックである動物を使用する場合は、ｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）にかける
ことができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト
生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、これらに関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏ
のヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内で天然には存在しない可能性がある配列である
。
「組換え宿主細胞」（または、簡単に、「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベク
ターを導入した細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけを指すことを意図す
るものではなく、このような細胞の子孫細胞も指すことを意図するものであることを理解
されたい。後続する世代では、突然変異または環境的影響に起因して、ある種の修飾が生
じうるため、このような子孫細胞は、実のところ、親細胞と同一ではない可能性もあるが
、やはり本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、非ヒト霊長動物
（例えば、カニクイザル）、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など
、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物および非哺乳動物）を含む。特記される場合を除き
、本明細書では、「患者」または「対象」という用語が互換的に使用される。本明細書で
使用される「カニクイザル（cyno）」または「カニクイザル（cynomolgus）」という用語
は、カニクイザル（cynomolgus monkey）（カニクイザル（Macaca fascicularis））を指
す。
一実施形態では、本明細書で使用される、任意の疾患または障害（例えば、ＦＧＦ２１
関連障害）「〜を処置すること」またはこれらの「処置」という用語は、疾患または障害
を改善すること（すなわち、疾患またはその臨床症状のうちの少なくとも１つの発症を緩
徐化するか、停止させるか、または軽減すること）を指す。別の実施形態では、「〜を処
置すること」または「処置」とは、患者により識別可能でない可能性があるパラメータを
含む少なくとも１つの物理的パラメータを緩和または改善することを指す。さらに別の実
施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、疾患または障害を、物理的にモ
ジュレートする（例えば、識別可能な症状の安定化）か、生理学的にモジュレートする（
例えば、物理的パラメータの安定化）か、または物理的かつ生理学的にモジュレートする
ことを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、疾患
または障害の発生または発症または進行を防止するかまたは遅延させることを指す。
例えばＦＧＦ２１関連障害を含む、本明細書で記載される適応に関する場合の「防止」
とは、例えば、前記悪化の危険性がある患者における、下記で記載される、ＦＧＦ２１関
連疾患パラメータの悪化を防止または緩徐化する任意の作用を意味する。
「ベクター」という用語は、それが連結された別のポリヌクレオチドを輸送することが
可能なポリヌクレオチド分子を指すことを意図する。ベクターのうちの１つの種類は、さ
らなるＤＮＡセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プ
ラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなるＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノ
ムへとライゲーションしうる、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶまたはＡＡＶ２）な
どのウイルスベクターである。ある種のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌
ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）は、それらが導入された宿主細胞におけ
る自己複製が可能である。他のベクター（例えば、非哺乳動物のエピソームベクター）は
、宿主細胞へと導入すると、宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿
主ゲノムと共に複製する。さらに、ある種のベクターは、それらが作動的に連結された遺
伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組
換え発現ベクター」（または簡単に、「発現ベクター」）と称する。
一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあること
が多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では
、「プラスミド」と「ベクター」とを互換的に使用することができる。しかし、本発明は
、同等な機能をもたらすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウ
イルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、発現ベクターの他の形態も含むことを意図す
る。
本明細書で使用される「ＦＧＦ２１活性のモジュレーション」とは、例えば、薬剤の、
ＦＧＦ２１ポリヌクレオチドまたはＦＧＦ２１ポリペプチドとの相互作用の結果でありう
るＦＧＦ２１活性の増大または減少、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路の活性化および／また
はＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体依存性のシグナル伝
達）の活性化などを指す。例えば、生物学的活性のモジュレーションとは、生物学的活性
の増大または減少を指す。ＦＧＦ２１活性は、限定なしに述べると、対象における、血中
グルコースレベル、血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、もしくは血中コ
レステロールレベルをアッセイすること；ベータ−ｋｌｏｔｈｏおよび／もしくはＦＧＦ
受容体（例えば、ＦＧＦＲ−１ｃ）のポリペプチドレベルを評価すること；またはＦＧＦ
２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体依存性のシグナル伝達）の活
性化を評価することを含む手段により評価することができる。
ＦＧＦ２１活性の比較はまた、例えば、ＦＧＦ２１の下流のバイオマーカーのレベルを
測定し、ＦＧＦ２１シグナル伝達の増大を測定することによっても達成することができる
。活性はまた、細胞内のシグナル伝達；キナーゼ活性；脂肪細胞へのグルコースの取込み
；血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、もしくは血中コレステロールレベ
ルの変動；肝臓脂質レベルもしくは肝臓トリグリセリドレベルの変化；ＦＧＦ２１および
／もしくはベータ−ｋｌｏｔｈｏと、ＦＧＦ２１受容体との相互作用；またはＦＧＦ２１
受容体のリン酸化を測定することによっても評価することができる。いくつかの実施形態
では、ＦＧＦ２１受容体のリン酸化は、チロシンのリン酸化でありうる。いくつかの実施
形態では、ＦＧＦ２１活性のモジュレーションは、ＦＧＦ２１と関連する表現型のモジュ
レーションを引き起こしうる。
本明細書で使用される「ＦＧＦ２１の下流のバイオマーカー」は、遺伝子もしくは遺伝
子産物、または遺伝子もしくは遺伝子産物についての測定可能な指標である。いくつかの
実施形態では、ＦＧＦ２１の下流のマーカーである遺伝子または活性は、発現レベルまた
は血管組織内のレベルの改変を呈示する。いくつかの実施形態では、下流のマーカーの活
性は、ＦＧＦ２１モジュレーターの存在下で改変される。いくつかの実施形態では、ＦＧ
Ｆ２１を、本発明のＦＧＦ２１モジュレーターで撹乱すると、下流のマーカーは、発現レ
ベルの改変を呈示する。ＦＧＦ２１の下流のマーカーは、限定せずに述べると、グルコー
スまたは２−デオキシ−グルコースの取込み、ｐＥＲＫレベル、および他のリン酸化タン
パク質レベルもしくはアセチル化タンパク質レベル、またはＮＡＤレベルを含む。
本明細書で使用される「〜を上方調節する」という用語は、増大、活性化もしくは活性
の刺激、または量を指す。例えば、本発明の文脈では、ＦＧＦ２１モジュレーターは、ベ
ータ−ｋｌｏｔｈｏおよび／またはＦＧＦ２１受容体の活性を増大させうる。一実施形態
では、ＦＧＦＲ−１ｃは、ＦＧＦ２１モジュレーターに応答して上方調節されうる。上方
調節とはまた、例えば、血中グルコースレベル、血中インスリンレベル、血中トリグリセ
リドレベル、もしくは血中コレステロールレベルを低下させるか；肝臓脂質レベルもしく
はトリグリセリドレベルを低減するか；体重を低減するか；耐糖能、エネルギー消費、も
しくはインスリン感受性を改善するか；またはＦＧＦ２１受容体のリン酸化を引き起こす
か；またはＦＧＦ２１の下流のマーカーを増大させる能力など、ＦＧＦ２１と関連する活
性も指す場合がある。ＦＧＦ２１受容体は、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ−１ｃであ
りうる。上方調節は、対照と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくと
も７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも
２５０％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％でありうる。
本明細書で使用される「モジュレーター」という用語は、１型もしくは２型糖尿病、ま
たは肥満などの代謝性状態など、ＦＧＦ２１関連障害と関連する、１つまたは複数の生理
学的事象または生化学的事象をモジュレートする組成物を指す。前記事象は、血中グルコ
ースレベル、血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、または血中コレステロ
ールレベルを低下させ；肝臓脂質レベルまたはトリグリセリドレベルを低減し；体重を低
減し；および耐糖能、エネルギー消費、またはインスリン感受性を改善する能力を含むが
これらに限定されない。
ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに対するＦＧＦ２１模倣抗体である、ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、およびＮＯＶ００４についての溶液平衡滴定結合アッセイ。 ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに対するＦＧＦ２１模倣抗体である、ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、およびＮＯＶ００４についての溶液平衡滴定結合アッセイ。 ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４による、Ａ）ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ２９３細胞、およびＢ）カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ２９３細胞のｐＥＲＫ活性化。 ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４による、Ａ）ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ２９３細胞、およびＢ）カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ２９３細胞のｐＥＲＫ活性化。 Ａ）ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ ＨＥＫ２９３細胞、Ｂ）ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ ＨＥＫ２９３細胞、およびＣ）ヒトＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏ ＨＥＫ２９３細胞のｐＥＲＫ活性化についてのＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４のプロファイリング。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏまたはＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏの活性化についての陽性対照として使用した。ＦＧＦ１９は、ＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏの活性化についての陽性対照として使用した。 Ａ）ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ ＨＥＫ２９３細胞、Ｂ）ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ ＨＥＫ２９３細胞、およびＣ）ヒトＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏ ＨＥＫ２９３細胞のｐＥＲＫ活性化についてのＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４のプロファイリング。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏまたはＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏの活性化についての陽性対照として使用した。ＦＧＦ１９は、ＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏの活性化についての陽性対照として使用した。 Ａ）ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ ＨＥＫ２９３細胞、Ｂ）ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ ＨＥＫ２９３細胞、およびＣ）ヒトＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏ ＨＥＫ２９３細胞のｐＥＲＫ活性化についてのＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４のプロファイリング。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏまたはＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏの活性化についての陽性対照として使用した。ＦＧＦ１９は、ＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏの活性化についての陽性対照として使用した。 α−ｋｌｏｔｈｏ、Ｅｇｒ１ルシフェラーゼ、およびウミシイタケ（Renilla）属ルシフェラーゼをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用する、ＦＧＦ２３活性についてのＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４のプロファイリングを示す図である。ＦＧＦ２３は、陽性対照として使用した。 ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞による２−ＤＯＧの取込みを使用する、マウスとの交差反応性についてのＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４のプロファイリングを示す図である。ＦＧＦ２１は、陽性対照として使用した。 ラットにおけるＩＶ注射に続く、ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４の濃度−時間プロファイルを示す図である。
詳細な説明
本発明は部分的に、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合し、ＦＧＦ受容体、例えば、ＦＧ
ＦＲ１ｃの活性化と、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体
依存性のシグナル伝達）の活性化とをもたらす抗体分子の発見に基づく。本発明は、完全
ＩｇＧフォーマット抗体、ならびにＦａｂ断片など、その抗原結合性断片の両方（例えば
、抗体である、ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、およびＮＯＶ００４）に関
する。
したがって、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体（例えば、ヒトおよ
びカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ）、医薬組成物、作製法、ならびにこのような抗体お
よび組成物の使用法を提供する。
ＦＧＦ２１タンパク質
本開示は、本明細書で定義される、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｆ
ＧＦ２１受容体に媒介されるシグナル伝達）を誘導しうるＦＧＦ２１模倣ｍＡｂ（すなわ
ち、ベータ−ｋｌｏｔｈｏ（β−ｋｌｏｔｈｏ）に結合するモノクローナル抗体）を提供
する。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＦＧＦ２１の成熟形態は、分子の活性形態である。ＦＧＦ
２１野生型配列は、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＰ＿０６１９８６．１を有し、これは、例え
ば、Ｃｈｉｒｏｎ社に帰せられる、米国特許第６，７１６，６２６号明細書など、交付さ
れた特許において見出すことができる（配列番号１）。
Figure 2021164452
全長ＦＧＦ２１ポリペプチド（ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＭ＿０１９１１３．２）をコー
ドする、対応するｍＲＮＡ配列を、下記（配列番号２）に示す。
Figure 2021164452
成熟ＦＧＦ２１配列は、リーダー配列を欠き、また、アミノ末端（リーダー配列を伴う
かまたはを伴わない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解性プロセシング
、小型のポリペプチドの、大型の前駆体からの切断、Ｎ結合型グリコシル化および／また
はＯ結合型グリコシル化、ならびに当業者により理解される、他の翻訳後修飾など、ポリ
ペプチドの他の修飾も含みうる。成熟ＦＧＦ２１配列の代表的な例は、以下の配列（全長
ＦＧＦ２１タンパク質配列（ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＰ＿０６１９８６．１）のアミノ酸
位置２９〜２０９を表す、配列番号８３）を有する。
Figure 2021164452
成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド（配列番号８３）をコードする、対応するｃＤＮＡ配列を
、下記（配列番号８４）に示す。
Figure 2021164452
ＦＧＦ２１模倣抗体および抗原結合性断片
本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態
では、本発明は、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体を
提供する。本発明の抗体は、実施例で記載される通りに単離された、ヒトモノクローナル
抗体およびＦａｂを含むがこれらに限定されない。
β−ｋｌｏｔｈｏの野生型配列は、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＰ＿７８３８６４．１を有
し、Xu, et al. (2007) J Biol Chem. 282(40):29069-72およびLin, et al. (2007) J Bi
ol Chem. 282(37):27277-84などの文献において見出すことができる。ヒトβ−ｋｌｏｔ
ｈｏをコードする全長ｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１７５７３７）を有
する。タンパク質配列は、以下（配列番号２６２）の通りである。
Figure 2021164452
本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌ
ｏｔｈｏ）に特異的に結合する抗体であって、配列番号９、２９、４９、または６９のア
ミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈ
ｏタンパク質に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲの
うちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、
本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌｏ
ｔｈｏ）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのうち
のいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ以上のＶＨ ＣＤＲを含む（また
は、代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に特異的に結合する抗体であって、配列番号１
９、３９、５９、または７９のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する
。本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−
ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する抗体であって、以下の表２に列挙されるＶＬ ＣＤＲ
のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に
、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌ
ｏｔｈｏ）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのう
ちのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ以上のＶＬ ＣＤＲを含む（ま
たは、代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
本発明の他の抗体は、突然変異させているが、なお、ＣＤＲ領域内で、表１に記載され
ている配列内で描示されるＣＤＲ領域と、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、ま
たは９５パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明
の他の抗体は、ＣＤＲ領域内で、表１に記載されている配列内で描示されるＣＤＲ領域と
比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を突然変異させた、突然
変異体のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−
ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、および全長軽鎖をコー
ドする核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳動物細胞における発現について
最適化することができる（例えば、表１は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖に最適化され
た核酸配列を示す）。
Figure 2021164452
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Figure 2021164452
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Figure 2021164452
Figure 2021164452
Figure 2021164452
本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸を突然変異させている
が、表１に記載されている配列と、なお少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５
、９０、または９５パーセントの同一性を有する抗体を含む。いくつかの実施形態は、可
変領域内で、実質的に同じ抗原結合活性を保持しながら、表１に記載されている配列にお
いて描示されている可変領域と比較した場合、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下
のアミノ酸を突然変異させている、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸を突然変異させている
が、表１に記載されている配列となお少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、
９０、または９５パーセントの同一性を有する抗体を含む。いくつかの実施形態は、可変
領域内で、実質的に同じ抗原結合活性を保持しながら、表１に記載されている配列内で描
示された可変領域と比較した場合に、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ
酸を突然変異させている、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
これらの抗体の各々は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合しうるので、ＶＨ配列、ＶＬ配列、全
長軽鎖配列、および全長重鎖配列（アミノ酸配列と、アミノ酸配列をコードするヌクレオ
チド配列と）を「混合し、マッチさせて」、本発明の他のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を
創出することができる。このような「混合し、マッチさせた」β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗
体は、当技術分野で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび実施例節で記載され
る他のアッセイ）を使用して調べることができる。これらの鎖を混合し、マッチさせる場
合、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列で置きかえ
るものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長重鎖配列を、構造
的に類似する全長重鎖配列で置きかえるものとする。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由
来するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の
全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長軽鎖配列を、構造的に類似する全長軽鎖配列で置
きかえるものとする。
したがって、一態様では、本発明は、配列番号９、２９、４９、および６９からなる群
から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１９、３９、５９、お
よび７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する単離
抗体またはその抗原結合性領域を提供し、この場合、抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏ（例えば
、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する、単離抗体またはそ
の抗原結合性領域を提供する。
より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号９および１９；２９および３９
；４９および５９；または６９および７９、のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含
む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合性領
域を提供する。
別の態様では、本発明は、（ｉ）哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミ
ノ酸配列であって、配列番号９、２９、４９、または６９からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列を含む全長重鎖、ならびに哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミ
ノ酸配列であって、配列番号２１、４１、６１、または８１からなる群から選択されるア
ミノ酸配列を含む全長軽鎖を有する単離抗体、または（ｉｉ）その抗原結合性部分を含む
機能的タンパク質を提供する。より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号９
および１９；２９および３９；４９および５９；または６９および７９、のそれぞれから
選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する単離抗体またはその抗原結合性領
域を提供する。
本明細書で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性
および抗原結合アフィニティーを付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一
般に、各重鎖可変領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）内には、３つのＣＤＲが
あり、各軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）内には、３つのＣＤＲが
ある。
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of
Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National In
stitutes of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikani
et al., (1997) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、およびＩｍ
ＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け（Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7,
132-136 (1999)；Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)）
（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）により記載されているスキームを含む、周知の多数の
スキームのうちのいずれかを使用して、たやすく決定することができる。例えば、古典的
なフォーマットでは、Ｋａｂａｔによれば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）内のＣＤＲアミノ
酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２
（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）内のＣＤＲアミノ酸残
基は、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣ
ＤＲ３）と番号付けされている。Ｃｈｏｔｈｉａによれば、ＶＨ内のＣＤＲアミノ酸は、
２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ
３）と番号付けされており、ＶＬ内のアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０
〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。Ｋａｂ
ａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒト
ＶＨ内のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９
５〜１０２（ＨＣＤＲ３）、ならびにヒトＶＬ内のアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１
）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）からなる。ＩＭＧＴに
よれば、ＶＨ内のＣＤＲアミノ酸残基は、約２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５１〜５７（Ｈ
ＣＤＲ２）、および９３〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、ＶＬ内のＣＤＲ
アミノ酸残基は、約２７〜３２（ＣＤＲ１）、５０〜５２（ＣＤＲ２）、および８９〜９
７（ＣＤＲ３）と番号付けされている（「Ｋａｂａｔ」による番号付け）。ＩＭＧＴによ
れば、抗体のＣＤＲ領域は、プログラムである、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉ
ｇｎを使用して決定することができる。
例えば、Ｋａｂａｔによれば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）内の抗体であるＮＯＶ００１
のＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、およ
び９９〜１０８（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）内のＣ
ＤＲアミノ酸残基は、２４〜３９（ＬＣＤＲ１）、５５〜６１（ＬＣＤＲ２）、および９
４〜１０２（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。Ｃｈｏｔｈｉａによれば、ＶＨ内のＣ
ＤＲアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５７（ＨＣＤＲ２）、および９９〜
１０８（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、ＶＬ内のアミノ酸残基は、２６〜３９（Ｌ
ＣＤＲ１）、５５〜５７（ＬＣＤＲ２）、および９６〜１０１（ＬＣＤＲ３）と番号付け
されている。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることに
より、ＣＤＲは、ヒトＶＨ内のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（Ｈ
ＣＤＲ２）、および９９〜１０８（ＨＣＤＲ３）と、ヒトＶＬ内のアミノ酸残基２４〜３
９（ＬＣＤＲ１）、５５〜６１（ＬＣＤＲ２）、および９４〜１０２（ＬＣＤＲ３）とか
らなる。
別の態様では、本発明は、表１に記載されている重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２
、およびＣＤＲ３、またはこれらの組合せを含むβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を提供する
。抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号３、２３、４３、および６３に示さ
れている。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４、２４、４４、および６
４に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号５、２５、４５、
および６５に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１３、３
３、５３、および７３に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番
号１４、３４、５４、および７４に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列
は、配列番号１５、３５、５５、および７５に示されている。これらのＣＤＲ領域は、Ｋ
ａｂａｔシステムを使用して表される。
代替的に、Ｃｈｏｔｈｉａシステム（Al-Lazikani et al.,（1997）, JMB 273 927-948
）を使用して規定される通り、抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６、２
６、４６、および６６に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番
号７、２７、４７、および６７に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は
、配列番号８、２８、４８、および６８に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ
酸配列は、配列番号１６、３６、５６、および７６に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ
２のアミノ酸配列は、配列番号１７、３７、５７、および７７に示されている。抗体のＶ
Ｌ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１８、３８、５８、および７８に示されている
。
代替的に、組合せシステムを使用して規定される、抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配
列を、配列番号２６３および２６８に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配
列番号４、２４、４４、および６４に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配
列番号５、２５、および４５に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号
１３、３３、５３、および７３に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番
号１４、３４、５４、および７４に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列
番号１５、３５、５５、および７５に示す。
代替的に、ＩＭＧＴシステムを使用して規定される、抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸
配列を、配列番号２６４および２６９に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、
配列番号２６５および２７０に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号
２６６および２７１に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号２６７お
よび２７２に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号１７、２７３、お
よび５７に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号１５、３５、５５、
および７５に示す。
これらの抗体の各々は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合することが可能であり、抗原結合特異
性は主に、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域によりもたらされることを
踏まえれば、各抗体は、本発明の他のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性分子を創出するのに、ＶＨ
ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ
ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含有することが好ましいが、ＶＨ ＣＤＲ１配列、Ｖ
Ｈ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ Ｃ
ＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列を、「混合し、マッチさせる」ことができる（す
なわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを、混合し、マッチさせることができる）。このよ
うな「混合し、マッチさせた」β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体は、当技術分野で公知の結合
アッセイおよび実施例で記載される結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＴ、Ｂｉａ
ｃｏｒｅ（登録商標）結合アッセイ）を使用して調べることができる。ＶＨ ＣＤＲ配列
を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列
、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする
。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＬ配列に由来する
ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ
配列で置きかえるものとする。当業者には、新規のＶＨ配列およびＶＬ配列を、１つまた
は複数のＶＨ ＣＤＲ領域配列および／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノク
ローナル抗体のための、本明細書で示されるＣＤＲ配列に由来する、構造的に類似する配
列で置換することにより創出しうることがたやすく明らかであろう。前出に加えて、一実
施形態では、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ Ｃ
ＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３、またはＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ
ＣＤＲ３を含むことが可能であり、この場合、断片は、β−ｋｌｏｔｈｏに、単一の可変
ドメインとして結合する。
本発明のある種の実施形態では、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、表１に記載さ
れているＦａｂの重鎖および軽鎖配列を有しうる。より具体的には、抗体またはその抗原
結合性断片は、ＦａｂＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、ＮＯＶ００４の重鎖
および軽鎖配列を有しうる。
本発明のある種の実施形態では、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体または抗原
結合性断片は、例えば、表１に示される、ＦａｂであるＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、Ｎ
ＯＶ００３、またはＮＯＶ００４の、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ
３、ならびにＦａｂであるＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、またはＮＯＶ０
０４の、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
本発明の他の実施形態では、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体または抗原結合
性断片は、Ｋａｂａｔにより規定され、表１に記載されている、重鎖可変領域のＣＤＲ１
、重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可
変領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。本発明のさらに他の実施形態
では、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Ｃｈｏｔｈｉ
ａにより規定され、表１に記載されている、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣ
ＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、
および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。本発明のさらに他の実施形態では、β−ｋｌｏｔ
ｈｏに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの
組合せにより規定され、表１に記載された、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣ
ＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、
および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。本発明のさらに他の実施形態では、β−ｋｌｏｔ
ｈｏに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、ＩＭＧＴにより規定され、表１に
記載された、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ
３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番
号５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１４
の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を
含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号２３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配
列番号２５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号３３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番
号３４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号３５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む
抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号４３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配
列番号４５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号５３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番
号５４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号５５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む
抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号６３鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番
号６５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号７３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７
４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号７５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体
を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番
号８の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１７
の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１８の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を
含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号２６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配
列番号２８の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号３６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番
号３７の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号３８の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む
抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号４６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４７の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配
列番号４８の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号５６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番
号５７の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号５８の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む
抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号６６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６７の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配
列番号６８の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号７６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番
号７７の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号７８の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む
抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号２６３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配
列番号５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号
１４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗
体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号２６８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、
配列番号２５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号３３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列
番号３４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号３５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含
む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号２６３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、
配列番号４５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号５３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列
番号５４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号５５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含
む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であ
って、配列番号２６８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６４の重鎖可変領域のＣＤＲ
２、配列番号２５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号７３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、
配列番号７４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号７５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号２６４の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２６５の重鎖可変領域のＣＤＲ２
、配列番号２６６の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号２６７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１
、配列番号１７の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１５の軽鎖可変領域のＣＤＲ
３を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号２６９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２７０の重鎖可変領域のＣＤＲ２
、配列番号２７１の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号２７２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１
、配列番号２７３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号３５の軽鎖可変領域のＣＤ
Ｒ３を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号２６４の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２６５の重鎖可変領域のＣＤＲ２
；配列番号２６６の重鎖可変領域のＣＤＲ３；配列番号２６７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１
；配列番号５７の軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および配列番号５５の軽鎖可変領域のＣＤＲ
３を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって
、配列番号２６９の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２７０の重鎖可変領域のＣＤＲ２
；配列番号２７１の重鎖可変領域のＣＤＲ３；配列番号２７２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１
；配列番号２７３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および配列番号７５の軽鎖可変領域のＣＤ
Ｒ３を含む抗体を含む。
ある種の実施形態では、本発明は、表１に記載されている、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的
に結合する抗体または抗原結合性断片を含む。好ましい実施形態では、β−ｋｌｏｔｈｏ
に結合し、ＦＧＦ２１受容体複合体を活性化させる抗体または抗原結合性断片は、Ｆａｂ
であるＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、ＮＯＶ００４である。
本明細書で使用されるヒト抗体は、抗体の可変領域または全長鎖を、ヒト生殖細胞系列
の免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得る場合、特定の生殖細胞系列配列「の産物」
であるか、またはこれ「に由来する」重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖
もしくは全長軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトラン
スジェニックマウスを、対象の抗原で免疫化すること、または対象の抗原を伴うファージ
上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む
。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるか、またはこれ「に由来する
」ヒト抗体は、それ自体、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリ
ンのアミノ酸配列と比較し、配列がヒト抗体の配列と最も近縁である（すなわち、同一性
％が最も大きい）ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより同定する
ことができる。
特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるか、またはこれ「に由
来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生の体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意
図的な導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較したアミノ酸の差違を含有しうる。しか
し、ＶＨフレームワーク領域内またはＶＬフレームワーク領域内で、選択されるヒト抗体
は、アミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミ
ノ酸配列と、少なくとも９０％同一であり、ヒト抗体を、他の種の生殖細胞系列の免疫グ
ロブリンのアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較した場合に、ヒトと
して同定するアミノ酸残基を含有することが典型的である。ある種の場合に、ヒト抗体は
、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配
列が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％、なおまたは
少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一でありうる。
組換えヒト抗体は、ＶＨフレームワーク領域内またはＶＬフレームワーク領域内の、ヒ
ト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、１０アミ
ノ酸以下の差違を提示することが典型的である。ある種の場合に、ヒト抗体は、生殖細胞
系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、５アミノ酸以下、な
おまたは４、３、２、もしくは１アミノ酸以下の差違を提示しうる。ヒト生殖細胞系列の
免疫グロブリン遺伝子の例は、下記で記載される生殖細胞系列の可変ドメイン断片のほか
、ＤＰ４７およびＤＰＫ９を含むがこれらに限定されない。
相同抗体
さらに別の実施形態では、本発明は、表１に記載されている配列と相同なアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供するが、抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏタンパ
ク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏ）に結合し、表１に記載され
ている抗体の所望の機能的特性を保持する。
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体または
その機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号９、２９
、４９、または６９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なく
とも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸
配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番号１９、３９、５９、または７９からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含み；抗体は、β−ｋｌｏ
ｔｈｏ（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する。本
発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣＤ
Ｒ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、および
ＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号３、４、５、１３、１４、および１５をさ
らに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈｉａによ
り規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、Ｌ
ＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号６、７、８、１６、
１７、および１８をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は
、組合せにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤ
Ｒ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６３
、４、５、１３、１４、および１５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖
および軽鎖配列は、ＩＭＧＴにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣ
ＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞ
れ、配列番号２６４、２６５、２６６、２６７、１７、および１５をさらに含む。
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体または
その機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号９のアミ
ノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、
または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番号
１９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％
、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；抗体は、β−ｋｌｏ
ｔｈｏ（例えば、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する。本
発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣＤ
Ｒ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、および
ＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号３、４、５、１３、１４、および１５をさ
らに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈｉａによ
り規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、Ｌ
ＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号６、７、８、１６、
１７、および１８をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は
、組合せにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤ
Ｒ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６３
、４、５、１３、１４、および１５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖
および軽鎖配列は、ＩＭＧＴにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣ
ＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞ
れ、配列番号２６４、２６５、２６６、２６７、１７、および１５をさらに含む。
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体または
その機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号２９のア
ミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％
、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番
号３９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；抗体は、β−ｋｌ
ｏｔｈｏ（例えば、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する。
本発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣ
ＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およ
びＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２３、２４、２５、３３、３４、および
３５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈ
ｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１
配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６、２７
、２８、３６、３７、および３８をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖お
よび軽鎖配列は、組合せにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ
３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、
配列番号２６８、２４、２５、３３、３４、および３５をさらに含む。本発明のある種の
他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、ＩＭＧＴにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、Ｈ
ＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配
列、例えば、それぞれ、配列番号２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、および３５
をさらに含む。
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体または
その機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号４９のア
ミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％
、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番
号５９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；抗体は、β−ｋｌ
ｏｔｈｏ（例えば、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する。
本発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣ
ＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およ
びＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号４３、４４、４５、５３、５４、および
５５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈ
ｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１
配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号４６、４７
、４８、５６、５７、および５８をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖お
よび軽鎖配列は、組合せにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ
３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、
配列番号２６３,４４、４５、５３、５４、および５５をさらに含む。本発明のある種の
他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、ＩＭＧＴにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、Ｈ
ＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配
列、例えば、それぞれ、配列番号２６４、２６５、２６６、２６７、５７、および５５を
さらに含む。
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体または
その機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号６９のア
ミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％
、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番
号７９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；抗体は、β−ｋｌ
ｏｔｈｏ（例えば、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する。
本発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣ
ＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およ
びＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号６３、６４、６５、７３、７４、および
７５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈ
ｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１
配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号６６、６７
、６８、７６、７７、および７８をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖お
よび軽鎖配列は、組合せにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ
３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、
配列番号２６８、６４、２５、７３、７４、および７５をさらに含む。本発明のある種の
他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、ＩＭＧＴにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、Ｈ
ＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配
列、例えば、それぞれ、配列番号２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、および７５
をさらに含む。
他の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に示さ
れる配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８
％、または９９％同一でありうる。他の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／または
ＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４、または５カ所以下のアミノ酸位置におけるアミノ
酸置換を除き同一でありうる。表１に記載されている抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域と大
きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域およびＶＬ領域を有する抗体は
、配列番号１０、３０、５０、または７０、および配列番号２０、４０、６０、または８
０、のそれぞれをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発
またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、
コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
他の実施形態では、全長重鎖アミノ酸配列および／または全長軽鎖アミノ酸配列は、表
１に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、または９９％同一でありうる。配列番号９、２９、４９、または６９のうち
のいずれかの全長重鎖、および配列番号１９、３９、５９、または７９、のうちのいずれ
かの全長軽鎖と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有する全長重鎖および全長軽
鎖を有する抗体は、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（例え
ば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載され
る機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることに
より得ることができる。配列番号１１、３１、５１、または７１のうちのいずれかの全長
重鎖、および配列番号２１、４１、６１、または８１のうちのいずれかの全長軽鎖と大き
な（すなわち、８０％以上の）同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は、
このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然
変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使
用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができ
る。
他の実施形態では、全長重鎖ヌクレオチド配列および／または全長軽鎖ヌクレオチド配
列は、表１に示される配列と、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、または９９％同一でありうる。
他の実施形態では、重鎖可変領域のヌクレオチド配列および／または軽鎖可変領域のヌ
クレオチド配列は、表１に示される配列と、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、
９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲは、表１に示される配
列と、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
本明細書で使用される、２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適な
アライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮
する配列により共有される、同一な位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一な位置の
数／位置の総数×１００）である。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセント
の決定は、下記の非限定的な例で記載されている、数学的アルゴリズムを使用して達成す
ることができる。
加えて、または代替的に、本発明のタンパク質配列は、公表されたデータベースに照ら
して検索を実施する、例えば、関連の配列を同定するための「クエリー配列」としてさら
に使用することもできる。例えば、このような検索は、Altschul et al., 1990 J. Mol.
Biol. 215:403-10によるＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施する
ことができる。
保存的修飾を伴う抗体
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ
３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列
を含む軽鎖可変領域を有し、この場合、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、
本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を
有し、抗体は、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。
したがって、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖
可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領
域からなる単離抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ
酸配列が、配列番号３、２３、４３、および６３、ならびにそれらの保存的修飾からなる
群から選択され、重鎖可変領域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号４、２４、４４、お
よび６４、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のＣＤＲ
３アミノ酸配列が、配列番号５、２５、４５、および６５、ならびにそれらの保存的修飾
からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号１３、３３
、５３、および７３、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領
域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号１４、３４、５４、および７４、ならびにそれら
の保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番
号１５、３５、５５、および７５、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され
、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
したがって、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖
可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領
域からなる、単離抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域ＣＤＲ１のアミ
ノ酸配列が、配列番号２６３および２６８、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から
選択され、重鎖可変領域ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４、２４、４４、および６
４、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域ＣＤＲ３のアミ
ノ酸配列が、配列番号５、２５、および４５、ならびにそれらの保存的修飾からなる群か
ら選択され、軽鎖可変領域ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１３、３３、５３、およ
び７３、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域ＣＤＲ２の
アミノ酸配列が、配列番号１４、３４、５４、および７４、ならびにそれらの保存的修飾
からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１５、３
５、５５、および７５、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、β−ｋｌ
ｏｔｈｏに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
他の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現について最適化されて
おり、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有し、これらの配列のうちの１つまたは複数は
、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列
を有し、抗体は、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。
したがって、本発明は、全長重鎖および全長軽鎖からなる、哺乳動物細胞における発現に
ついて最適化された単離抗体であって、全長重鎖が、配列番号１１、３１、５１、または
７１、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、全長軽鎖が
、配列番号２１、４１、６１、または８１、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択さ
れるアミノ酸配列を有し、β−ｋｌｏｔｈｏ（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋ
ｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する抗体を提供する。
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１に記載されているβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体（例えば、ＮＯＶ００１
、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、またはＮＯＶ００４）と同じエピトープに結合する抗体
を提供する。特定の態様では、このような抗体および抗原結合性断片は、β−ｋｌｏｔｈ
ｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させることが可能である。したがって、β−ｋｌｏｔ
ｈｏ結合アッセイ（実施例で記載されるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合アッセイなど）において、
本発明の他の抗体と競合する（例えば、本発明の他の抗体の結合を、統計学的に有意な形
で競合的に阻害する）それらの能力に基づき、さらなる抗体を同定することができる。本
発明の抗体の、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質への結合を阻害する被験抗体の能力により、
被験抗体が、その抗体と、β−ｋｌｏｔｈｏへの結合について競合することが可能であり
、このような抗体は、非限定的な理論によれば、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質上の、それ
が競合する抗体と同じであるかまたは関連の（例えば、構造的に類似するか、または空間
的に近接した）エピトープに結合しうることが裏付けられる。ある種の実施形態では、本
発明の抗体と同じβ−ｋｌｏｔｈｏ上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナ
ル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調
製および単離することができる。本明細書で使用される通り、等モル濃度の競合抗体の存
在下で、競合抗体が、本発明の抗体または抗原結合性断片のβ−ｋｌｏｔｈｏとの結合を
、５０％を超えて（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）
阻害するとき、抗体は、結合について「競合する」。ある種の実施形態では、β−ｋｌｏ
ｔｈｏ上の、本発明の抗体と同じエピトープに結合する抗体は、ヒト化モノクローナル抗
体である。このようなヒト化モノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調製
および単離することができる。
特定の態様では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体であるＮＯＶ００１と同じエ
ピトープに結合する抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏ結合
性抗体であるＮＯＶ００２と同じエピトープに結合する抗体を提供する。特定の態様では
、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体であるＮＯＶ００３と同じエピトープに結合す
る抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体であるＮＯ
Ｖ００４と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
特定の態様では、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と
、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、β−ｋｌｏｔｈｏ
結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
特定の態様では、本発明は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、β−ｋｌｏｔｈ
ｏ結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
特定の態様では、本発明は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
と、配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、β−ｋｌｏｔｈ
ｏ結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
特定の態様では、本発明は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
と、配列番号７９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、β−ｋｌｏｔｈ
ｏ結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体
またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、エピトープは、表２に示された配列番号
のうちの１つまたは複数を含む。特定の態様では、このような抗体および抗原結合性断片
は、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させることが可能である。
特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体ま
たはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列
（配列番号２６２）の残基２４６〜２６５のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む。特
定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体または
その抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配
列番号２６２）の残基５３６〜５５０のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む。特定の
態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその
抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番
号２６２）の残基８３４〜８５７のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む。特定の態様
では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原
結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２
６２）の残基９５９〜９８６のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む。
特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体ま
たはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列
（配列番号２６２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９
５９〜９８６のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む。具体的な態様では、本明細書で
は、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示
し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基２４
６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの２つ以上
のアミノ酸を含む。具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに
結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β
−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４
〜８５７、および９５９〜９８６のうちの３つ以上のアミノ酸を含む。具体的な態様では
、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合
性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２
）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のア
ミノ酸を含む。
特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のエピトープに結
合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−
ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６７０のアミノ酸のうちの１つまた
は複数を含む。特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のエ
ピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピト
ープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６９６〜７００のアミノ酸のう
ちの１つまたは複数を含む。特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの１つま
たは複数のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合
、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６８９の
アミノ酸のうちの１つまたは複数を含む。
特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のエピトープに結
合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−
ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、および６
４６〜６８９のアミノ酸のうちの１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５
つ、またはそれ以上を含む。ある種の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの２つ
以上のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前
記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６７０、６９
６〜７００、および６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１つまたは複数を含む。具体的な
態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの３つ以上のエピトープに結合する単離抗体
またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配
列（配列番号２６２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、および６４６〜６８９の
アミノ酸のうちの１つまたは複数を含む。具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏ
ｔｈｏの３つ以上のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、
この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜
６７０、６９６〜７００、および６４６〜６８９のアミノ酸を含む。
具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体
またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、エピトープは、表２に示された配列番号
のうちの１つまたは複数を含み、前記単離抗体および抗原結合性断片は、β−ｋｌｏｔｈ
ｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させることが可能であり、例えば、表２に示される通
り、−０．５〜−２．１の範囲の、重水素取込みの変化により特徴付けられる通り、水素
−重水素交換（ＨＤｘ）により、β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のペプチドを保護す
ることが可能である。
特定の態様では、本明細書では、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、
以下のβ−ｋｌｏｔｈｏペプチド（配列番号２６２）：アミノ酸２４５〜２６６、２４６
〜２６５、３４３〜３４９、３４４〜３４９、４２１〜４２９、４８８〜４９８、５０９
〜５２４、５３６〜５５０、５６８〜５７６、６４６〜６６９、６４６〜６７０、６９６
〜７００、７７３〜８０４、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの、１つ、２
つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上を保護する、単離抗体またはその抗原結合性断片
が提示される。
具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大
させる、単離抗体またはその抗原結合性断片であって、水素−重水素交換（ＨＤｘ）によ
り決定した場合に、表２に示される以下：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２、１
１３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１４１、１４２、１４３、１５６、１
５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６３、１６４、１６５、１６７、１６８、１
６９、１７０、１７１、１７２、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１９５、１
９６、１９７、１９８、２０４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２
２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２
５６、２５７、２５８、２５９、２６０、および２６１由来の、１つ、２つ、３つ、４つ
、５つ、またはそれ以上のペプチドを保護する、単離抗体またはその抗原結合性断片が提
示される。
ある種の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大
させる、単離抗体またはその抗原結合性断片であって、水素−重水素交換（ＨＤｘ）によ
り決定した場合に、表２に示される以下：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２、１
１３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１４１、１４２、１４３、１５６、１
５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６３、１６４、１６５、１６７、１６８、１
６９、１７０、１７１、１７２、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１９５、１
９６、１９７、１９８、２０４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２
２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２
５６、２５７、２５８、２５９、２６０、および２６１由来の、６つ、７つ、８つ、９つ
、１０、またはそれ以上のペプチドを保護する、単離抗体またはその抗原結合性断片が提
示される。
ある種の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大
させる、単離抗体またはその抗原結合性断片であって、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ（配列番号
２６２）の残基７０１（Ｔｙｒ）または７０３（Ａｒｇ）に接触しない、単離抗体または
その抗原結合性断片が提示される。
操作抗体および修飾抗体
出発抗体から特性を改変した修飾抗体を操作する出発材料として、本明細書で示される
ＶＨ配列および／またはＶＬ配列のうちの１つまたは複数を有する抗体を使用して、本発
明の抗体をさらに調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち
、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内、および／ま
たは１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を修飾することに
より操作することができる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾
して、例えば、抗体のエフェクター機能を改変することによっても操作することができる
。
実施しうる可変領域操作のうちの１つの種類は、ＣＤＲグラフティングである。抗体は
、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介し
て、標的抗原と相互作用する。この理由で、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個別の抗体の間
の多様性が、ＣＤＲの外部の配列より大きい。ＣＤＲ配列は、大半の抗体−抗原間相互作
用の一因となるため、異なる特性を伴う異なる抗体に由来するフレームワーク配列へとグ
ラフトされた特異的自然発生抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築するこ
とにより、特異的自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能であ
る（例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327；Jones, P. et al., 198
6 Nature 321:522-525；Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029-1
0033；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎ
らによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同
第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい
）。
したがって、本発明の別の実施形態は、表１に示されるＨＣＤＲ１配列から選択される
アミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；表１に示されるＨＣＤＲ２配列から選択されるアミ
ノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；表１に示されるＨＣＤＲ３配列から選択されるアミノ酸
配列を有するＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と；表１に示されるＬＣＤＲ１配列から選
択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；表１に示されるＬＣＤＲ２配列から選択さ
れるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；および表１に示されるＬＣＤＲ３配列から選択
されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域とを含む、単離抗体また
はその抗原結合性断片に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体の
ＶＨ ＣＤＲ配列およびＶＬ ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体に由来する、異な
るフレームワーク配列を含有しうる。
したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号３、２３、４３、および６３からなる
群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号４、２４、４４、および
６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、配列番号５、２５、
４５、および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列のそれぞ
れを含む重鎖可変領域と、配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号１４、３４、５４、および７４からな
る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、ならびに配列番号１５、３５、
５５、および７５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列のそれぞ
れを有する軽鎖可変領域とを含む単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。したがっ
て、このような抗体は、モノクローナル抗体のＶＨ ＣＤＲ配列およびＶＬ ＣＤＲ配列
を含有するが、これらの抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含有しうる。
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公表されたＤ
ＮＡデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖お
よび軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、ヒト生殖細胞系列の配列データベ
ースである「ＶＢａｓｅ」（インターネットのmrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能であ
る）のほか、それらの各々の内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Kaba
t, E. A. et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edi
tion, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242
；Tomlinson, I. M. et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798；およびCox, J. P. L. e
t al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836においても見出すことができる。
本発明の抗体における使用のためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択された抗
体により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使
用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似するフレー
ムワーク配列である。ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３
配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列は
、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配
列と同一の配列を有するフレームワーク領域へとグラフトすることもでき、ＣＤＲ配列は
、生殖細胞系列配列と比較して、１つまたは複数の突然変異を含有するフレームワーク領
域へとグラフトすることもできる。例えば、ある種の場合には、フレームワーク領域内の
残基を突然変異させて、抗体の抗原結合能力を維持または増強することが有益であると見
出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同
第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８
０，３７０号明細書を参照されたい）。本明細書で記載される抗体および抗原結合性断片
をその上に構築する足場として活用されうるフレームワークは、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、Ｖ
Ｈ３、Ｖｋ１、Ｖｌ２、およびＶｋ２を含むがこれらに限定されない。当技術分野では、
さらなるフレームワークが知られており、例えば、インターネットのvbase.mrc-cpe.cam.
ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1上のｖＢａｓｅデータベースにおいて見出すことが
できる。
したがって、本発明の実施形態は、配列番号９、２９、４９、または６９からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に１、２、３
、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するア
ミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号１９、３９、５９、または７９からなる
群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に１、２
、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有す
るアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をさらに含む、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体ま
たはそれらの抗原結合性断片に関する。
したがって、本発明の実施形態は、配列番号９のアミノ酸配列、またはこのような配列
のフレームワーク領域内に、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸
欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号
１９のアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に、１、２、３、４
、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ
酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはその抗
原結合性断片に関する。
特定の態様では、本発明の実施形態は、配列番号２９のアミノ酸配列、またはこのよう
な配列のフレームワーク領域内に、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、ア
ミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配
列番号３９のアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に、１、２、
３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有する
アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体または
その抗原結合性断片に関する。
特定の態様では、本発明の実施形態は、配列番号４９のアミノ酸配列、またはこのよう
な配列のフレームワーク領域内に、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、ア
ミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配
列番号５９のアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に、１、２、
３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有する
アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体または
その抗原結合性断片に関する。
特定の態様では、本発明の実施形態は、配列番号６９のアミノ酸配列、またはこのよう
な配列のフレームワーク領域内に、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、ア
ミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配
列番号７９のアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に、１、２、
３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有する
アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体または
その抗原結合性断片に関する。
可変領域修飾の別の種類は、「アフィニティー成熟」として公知の、ＶＨ ＣＤＲ１領
域内、ＶＨ ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＨ ＣＤＲ３領域内、ならびに／また
はＶＬ ＣＤＲ１領域内、ＶＬ ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＬ ＣＤＲ３領域
内のアミノ酸残基を突然変異させて、これにより、対象の抗体の１つまたは複数の結合特
性（例えば、アフィニティー）を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはＰ
ＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、突然変異を導入することができ、本明細書で記載され
、実施例でも提示される、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにお
いて、抗体結合性または他の対象の機能的特性に対する効果を査定することができる。保
存的修飾（上記で論じた）を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換の場合
もあり、付加の場合もあり、欠失の場合もある。さらに、ＣＤＲ領域内の、典型的には１
つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下の残基も改変する。
ある種のアミノ酸配列モチーフは、グリコシル化（すなわち、ＮｘＳ／Ｔ［配列中、ｘ
は、任意だがＰではない］）、遊離システインの酸化、脱アミノ化（例えば、ＮＧ）また
は異性体化（例えば、ＤＧ）などの翻訳後修飾（ＰＴＭ）を経ることが公知である。ＣＤ
Ｒ領域内に存在する場合、これらのモチーフは、産物の均質性を増大させるために、部位
特異的突然変異誘発により除去することが理想的である。
当技術分野では、アフィニティー成熟の工程について十分に記載されている。多くのデ
ィスプレイ系の中で、ファージディスプレイ（Smith GP (1985) Science 228:1315-1317
）および酵母など、真核細胞上のディスプレイ（Boder ET and Wittrup KD (1997) Natur
e Biotechnology 15: 553-557）は、抗体−抗原間相互作用について選択するのに、最も
一般的に適用される系であると考えられる。これらのディスプレイ系の利点は、広範にわ
たる抗原に適し、選択厳密性を容易に調整しうることである。ファージディスプレイでは
、ｓｃＦｖ断片またはＦａｂ断片を提示することができ、酵母ディスプレイでは、これら
に加えて、全長ＩｇＧを提示することができる。これらの一般的に適用される方法は、多
様性が１×１０７を超える、大規模なライブラリーからの、所望の抗体変異体の選択を可
能とする。多様性が小規模な、例えば、１×１０３であるライブラリーは、マイクロ発現
およびＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることができる。
非標的化抗体変異体ライブラリーまたはランダム抗体変異体ライブラリーは、例えば、
エラープローンＰＣＲ（Cadwell RC and Joyce GF (1994) Mutagenic PCR. PCR Methods
Appl. 3: S136-S140）により作り出すことができ、非常に簡便であるが、場合によって限
定的である手法をもたらす。別の戦略は、抗体候補物質のＣＤＲ指向性多様化である。１
つまたは複数のＣＤＲ内の１つまたは複数の位置は、例えば、縮重オリゴ（Thompson J e
t al. (1996) J.Mol.Biol. 256: 77-88）、トリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）
（Kayushin AL et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 3748-3755）、または当技術分野
で公知の、他の任意の手法を使用して、特異的に標的とすることができる。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号３、２３、４３、および６３を有
する群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３、２３、４３、および６３と比較
して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ
酸付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１領域（a VH CDR1 region consistin
g of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 3, 23, 43
, and 63 or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino ac
id substitutions, deletions, or additions as compared to SEQ ID NOs: 3, 23, 43,
and 63）；配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列
、または配列番号４、２４、４４、および６４と比較して、１、２、３、４、もしくは５
カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有す
るＶＨ ＣＤＲ２領域；配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択される
アミノ酸配列、または配列番号５、２５、４５、および６５と比較して、１、２、３、４
、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ
酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域；配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群
から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１３、３３、５３、および７３と比較して
、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付
加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域；配列番号１４、３４、５４、およ
び７４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１４、３４、５４、およ
び７４と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、も
しくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域；ならびに配列番
号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番
号１５、３５、５５、および７５と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ
酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤ
Ｒ３領域を有する重鎖可変領域からなる、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはそれら
の抗原結合性断片を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号６、２６、４６、および６６を有
する群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６、２６、４６、および６６と比較
して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ
酸付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１領域（a VH CDR1 region consistin
g of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 6, 26, 46
, and 66 or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino ac
id substitutions, deletions, or additions as compared to SEQ ID NOs: 6, 26, 46,
and 66）；配列番号７、２７、４７、および６７からなる群から選択されるアミノ酸配列
、または配列番号７、２７、４７、および６７と比較して、１、２、３、４、もしくは５
カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有す
るＶＨ ＣＤＲ２領域；配列番号８、２８、４８、および６８からなる群から選択される
アミノ酸配列、または配列番号８、２８、４８、および６８と比較して、１、２、３、４
、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ
酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から
選択されるアミノ酸配列、または配列番号１３、３３、５３、および７３と比較して、１
、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を
有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域；配列番号１４、３４、５４、および７
４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１４、３４、５４、および７
４と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしく
はアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域；ならびに配列番号１
５、３５、５５、および７５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１
５、３５、５５、および７５と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置
換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
領域を有する重鎖可変領域からなる、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはそれらの抗
原結合性断片を提供する。
抗原結合性ドメインの、代替的なフレームワークまたは足場へのグラフティング
結果として得られるポリペプチドが、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する少なくとも
１つの結合性領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体／免疫グロブリンのフレームワー
クまたは足場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免
疫グロブリンまたはそれらの断片の５つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト
化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科動物において同
定される単一重鎖抗体などの単一重鎖抗体は、特に対象である。当業者により、新規のフ
レームワーク、足場、および断片が、発見および開発され続けている。
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトしうる非免疫グロブリン足場を使用
して、非免疫グロブリンベースの抗体を作り出すことに関する。それらが、標的のβ−ｋ
ｌｏｔｈｏタンパク質に特異的な結合性領域を含む限りにおいて、公知または将来の非免
疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場を援用することができる。公知
の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場は、フィブロネクチン（
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ア
ンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅ
ｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ
；およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（
Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、低分
子モジュラー免疫医薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、
Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ
Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびア
フィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｇ
ｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むがこれらに限定されない。
フィブロネクチン足場は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン（例えば、ＩＩＩ型フィ
ブロネクチンの第１０モジュール（１０ Ｆｎ３ドメイン））に基づく。ＩＩＩ型フィブ
ロネクチンドメインは、それら自体が互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成
し、ベータ鎖を互いへと接続し、溶媒へと露出されるループもさらに含有する（ＣＤＲと
類似する）、２つのベータシートの間に分配された、７つまたは８つのベータ鎖を有する
。ベータシートサンドイッチの各エッジには、少なくとも３つのこのようなループがあり
、エッジは、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８
１８，４１８号明細書を参照されたい）。全体的なフォールドは、ラクダおよびラマＩｇ
Ｇ内の抗原認識単位全体を含む最小の機能的抗体断片である重鎖可変領域のフォールドと
密接に関連するが、これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリンではない
。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、性質およびアフィニティーが抗体の性質
およびアフィニティーと類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、ｉｎ ｖｉ
ｖｏにおける抗体のアフィニティー成熟の工程と類似する、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるル
ープのランダム化戦略およびシャフリング戦略において使用することができる。これらの
フィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング法を使用して、分子のループ領
域を本発明のＣＤＲで置きかえうる、足場として使用することができる。
アンキリン技術は、アンキリンに由来するリピートモジュールを伴うタンパク質を、異
なる標的への結合に使用しうる可変領域を保有する足場として使用することに基づく。ア
ンキリンリピートモジュールとは、２つのアンチパラレルのα−ヘリックスおよびβ−タ
ーンからなる、３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディ
スプレイを使用することにより大部分が最適化される。
アビマーは、ＬＲＰ−１など、天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらの
ドメインは、本来、タンパク質間相互作用に使用され、ヒトでは、２５０を超えるタンパ
ク質が、構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結され
た多数の（２つ〜１０の）異なる「Ａドメイン」単量体からなる。標的抗原に結合しうる
アビマーは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号明細書；同第２００
５００５３９７３号明細書；同第２００５００４８５１２号明細書；および同第２００６
０００８８４４号明細書において記載されている方法を使用して創出することができる。
アフィニティーリガンドであるアフィボディとは、プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメイ
ンのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルからなる、低分子の単純なタンパク
質である。プロテインＡとは、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に
由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、それらのうちの１３が、多数のリ
ガンド変異体を伴うアフィボディライブラリーを作り出す、ランダム化されている５８ア
ミノ酸からなる（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号明細書を参照されたい）。ア
フィボディ分子は、抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、分子量
が６ｋＤａである。その小サイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体
の結合部位と同様である。
アンチカリンとは、Ｐｉｅｒｉｓ ＰｒｏｔｅｏＬａｂ ＡＧ社により開発された生成
物である。アンチカリンは、通例、化学的に感受性の化合物または不溶性の化合物の生理
学的輸送または貯蔵に関与する、広範にわたる低分子の頑健なタンパク質群であるリポカ
リンに由来する。いくつかの天然リポカリンは、ヒト組織内またはヒト体液中で生じる。
タンパク質のアーキテクチャーは、リジッドフレームワークの上部の超可変ループを伴う
免疫グロブリンを連想させる。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、リ
ポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりかろうじて大きい、１６０〜１８０アミ
ノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖からなる。結合性ポケットを構成する４つのループ
のセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、異なる形状
の規定の標的分子を、高度なアフィニティーおよび特異性で認識するために、結合性部位
を独自の工程で再形成することができる。４つのループのセットを突然変異誘発すること
によりアンチカリンを開発するのには、リポカリンファミリーの１つのタンパク質である
、オオモンシロチョウ（Pieris Brassicae）のビリン結合性タンパク質（ＢＢＰ）が使用
されている。アンチカリンについて記載する特許出願の１つの例は、ＰＣＴ国際公開第１
９９９１６８７３号パンフレットにある。
アフィリン分子とは、タンパク質および低分子に対する特異的なアフィニティーのため
にデザインされた低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、
それらの各々が、異なるヒト由来の足場タンパク質に基づく２つのライブラリーから非常
に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対する
いかなる構造相同性も示さない。現在、２つのアフィリン足場が援用されており、それら
のうちの一方は、ヒト水晶体の構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は
、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒト足場も非常に小型
で、高度な熱安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高度な
安定性は主に、タンパク質のベータシート構造の展開に起因する。ガンマクリスタリンに
由来するタンパク質の例は、国際公開第２００１０４１４４号パンフレットにおいて記載
されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、国際公開第２００４１０６３６８号パ
ンフレットにおいて記載されている。
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）とは、タンパク質間相互作用に関与する主要な
二次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、中程度のサイズの
環状ペプチド様分子（分子量：１〜２ｋＤａ）である。
本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。
キメラ抗体またはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体は、
ヒト対象へと投与された場合の抗原性がさらに低減されている。
ラクダ科動物抗体
ラマ種（アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vi
cugna））などの新世界メンバーを含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（dromedary）（フ
タコブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Calelus dromaderius））
ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒ
ト対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの
哺乳動物に由来するある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来す
る抗体の場合の、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する、典型的な４つの鎖の四次構造と
は構造的に異なっている。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に公表さ
れた国際公開第９４／０４６７８号パンフレット）を参照されたい。
ＶＨＨとして同定される小型の単一の可変ドメインである、ラクダ科動物抗体の領域は
、標的に対して高いアフィニティーを有する低分子タンパク質をもたらすことから、「ラ
クダ科動物ナノボディ」として公知の低分子量抗体由来タンパク質を結果としてもたらす
遺伝子操作により得ることができる。１９９８年６月２日に取得された米国特許第５，７
５９，８０８号明細書を参照されたい。また、Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Che
m 279:1256-1261；Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424:783-788；Pleschberger, M.
et al., 2003 Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo, V. et al., 2002 Int
J Cancer 89:456-62；およびLauwereys, M. et al., 1998 EMBO J 17:3512-3520も参照さ
れたい。ラクダ科動物抗体および抗体断片の操作ライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ
、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト由来の他の抗体と同様に、ラ
クダ科動物抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により酷似する配列を得るように、組換えに
より改変することができる、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」することができる。し
たがって、ヒトに対するラクダ科動物抗体の天然の小さな抗原性を、さらに低減すること
ができる。
ラクダ科動物ナノボディの分子量は、ヒトＩｇＧ分子の分子量の約１０分の１で、タン
パク質の物理的直径は、数ナノメートルに過ぎない。サイズが小さいことの１つの帰結は
、大型の抗体タンパク質には機能的に不可視である抗原性部位に結合するラクダ科動物ナ
ノボディの能力である、すなわち、ラクダ科動物ナノボディは、古典的な免疫学的技法を
使用するこれ以外の形では隠蔽されたままの抗原を検出する試薬として有用であり、可能
な治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は、ラク
ダ科動物ナノボディが、標的タンパク質のグルーブ内または狭小なクレフト内の特異的部
位に結合することの結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、よって、
古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量の薬物の機能により酷似する能力において
用いられうることである。
低分子量およびコンパクトなサイズはさらに、熱安定性が極めて大きく、極端なｐＨお
よびタンパク質分解性消化に対して安定的であり、抗原性が小さいラクダ科動物ナノボデ
ィを結果としてもたらす。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、循環系から組織へと
たやすく移動し、血液脳関門もなお越え、神経組織に影響を及ぼす障害も処置しうること
である。ナノボディはさらに、血液脳関門を越える薬物輸送も容易としうる。２００４年
８月１９日に公表された米国特許出願公開第２００４０１６１７３８号明細書を参照され
たい。これらの特色を、ヒトに対する抗原性が小さいことと組み合わせることにより、大
きな治療的可能性が指し示される。さらに、これらの分子は、大腸菌（E. coli）などの
原核細胞内で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質とし
て発現させ、機能的である。
したがって、本発明の特色は、β−ｋｌｏｔｈｏに対して高いアフィニティーを有する
ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディである。本明細書のある種の実施形態で
は、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディは、天然ではラクダ科動物において
産生される、すなわち、他の抗体について本明細書で記載される技法を使用する、β−ｋ
ｌｏｔｈｏまたはそのペプチド断片による免疫化の後で、ラクダ科動物により産生される
。代替的に、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性ラクダ科動物ナノボディは、操作もされる、すなわ
ち、例えば、本明細書の実施例において記載されている、標的としてのβ−ｋｌｏｔｈｏ
を伴うパニング手順を使用する、適切に突然変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタン
パク質を提示するファージライブラリーからの選択によっても作製される。操作されたナ
ノボディはさらに、遺伝子操作により、レシピエント対象における半減期が、４５分間〜
２週間となるようにカスタマイズすることもできる。具体的な実施形態では、ラクダ科動
物抗体またはラクダ科動物ナノボディを、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４におい
て記載されている通り、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノボディ
または単一ドメイン抗体フレームワーク配列へとグラフトすることにより得る。
二特異性分子および多価抗体
別の態様では、本発明は、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはその断片を含む
二特異性分子または多特異性分子を特色とする。本発明の抗体またはその抗原結合性領域
は、少なくとも２つの異なる結合性部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り出
すように誘導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパ
ク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）へと連結することもできる。本
発明の抗体は実際、３つ以上の異なる結合性部位および／または標的分子に結合する多特
異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、他の２つ以上の機能的分子へと連結
することもでき、このような多特異性分子はまた、本明細書で使用される「二特異性分子
」という用語により包含されることも意図される。本発明の二特異性分子を創出するには
、本発明の抗体を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペ
プチド、または結合性模倣体など、１つまたは複数の他の結合性分子へと機能的に連結す
る（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら
以外の形で）ことができる。
したがって、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに対する少なくとも１つの第１の結合特異性
および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子を含む。例え
ば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープと異なる、β−ｋｌｏｔｈｏの別の
エピトープである。
加えて、二特異性分子が多特異性である本発明では、分子は、第１の標的エピトープお
よび第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性もさらに含みうる。
一実施形態では、本発明の二特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその
抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはＬａｄｎｅｒら、米国
特許第４，９４６，７７８号明細書において記載されている、Ｆｖもしくは単鎖構築物な
ど、その任意の最小断片でありうる。
ダイアボディとは、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリ
ンカーにより接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖上で発
現させた、二価の二特異性分子である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の鎖の相
補的なドメインと対合し、これにより、２つの抗原結合性部位を創出する（例えば、Holl
iger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak et al., 1994 S
tructure 2:1121-1123を参照されたい）。ダイアボディは、ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ
−ＶＬＡ構造（ＶＨ−ＶＬ立体配置）、またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ構造
（ＶＬ−ＶＨ立体配置）を伴う２つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることに
より作製することができる。ダイアボディの大半は、細菌内の可溶性形態で発現させるこ
とができる。単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖
を、約１５アミノ酸残基のリンカーで接続することにより作製する（Holliger and Winte
r, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45（3〜4）:128〜30；Wu et al., 1996 Immunot
echnology, 2（1）:21-36を参照されたい）。ｓｃＤｂは、細菌内の可溶性で活性の単量
体形態で発現させることができる（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immuno
ther., 45（34）:128-30；Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2（1）:21-36；Pluckthu
n and Pack, 1997 Immunotechnology, 3（2）:83-105；Ridgway et al.,1996 Protein En
g., 9（7）:617-21を参照されたい）。ダイアボディをＦｃへと融合させて、「ジダイア
ボディ」を作り出すことができる（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279（4）:2856-65
を参照されたい）。
本発明の二特異性分子内で援用しうる他の抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラ
モノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体である。
二特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素である結合特異性をコ
ンジュゲートさせることにより調製することができる。例えば、二特異性分子の各結合特
異性は、個別に作り出し、次いで、互いとコンジュゲートさせることができる。結合特異
性がタンパク質またはペプチドである場合は、様々なカップリング剤または架橋剤を、共
有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カ
ルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５
，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド
（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et al., 1984
J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648
を参照されたい）。他の方法は、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78、118-132；B
rennan et al., 1985 Science 229:81-83；およびGlennie et al., 1987 J. Immunol. 13
9:2367-2375において記載されている方法を含む。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよび
スルホ−ＳＭＣＣであり、いずれも、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃ
ｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。
結合特異性が、抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスルフヒ
ドリル結合させることによりコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、
コンジュゲーションの前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、１つのスルフヒドリル
残基を含有するように、ヒンジ領域を修飾する。
代替的に、いずれの結合特異性も、同じベクター内でコードさせ、同じ宿主細胞内で発
現およびアセンブルさせることができる。この方法は、二特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ
融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク
質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二
特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、２つの結
合決定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子は、少なくとも２つの単鎖
分子を含みうる。二特異性分子を調製する方法については、例えば、米国特許第５，２６
０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，
１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１
３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号
明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８
号明細書において記載されている。
それらの特異的な標的に対する二特異性分子の結合は、例えば、酵素免疫測定アッセイ
（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例
えば、成長阻害アッセイ）、またはウェスタンブロットアッセイにより確認することがで
きる。これらのアッセイの各々では一般に、対象の複合体に特異的な、標識された試薬（
例えば、抗体）を援用することにより、特に対象となるタンパク質−抗体間複合体の存在
が検出される。
別の態様では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する、本発明の抗体の少なくとも２
つの同一であるかまたは異なる抗原結合性部分を含む、多価化合物を提供する。抗原結合
性部分は、タンパク質の融合または共有結合的連結もしくは非共有結合的連結を介して、
併せて連結することができる。代替的に、二特異性分子のための連結法も記載されている
。四価化合物は、例えば、本発明の抗体の定常領域に結合する抗体、例えば、Ｆｃ領域ま
たはヒンジ領域と本発明の抗体の抗体の架橋によって得ることができる。
三量体化ドメインについては、例えば、Ｂｏｒｅａｎによる特許である欧州特許第１０
１２２８０号明細書において記載されている。五量体化モジュールについては、例えば、
ＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７において記載されている。
半減期を延長した抗体
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した、ベータ−ｋｌｏｔｈｏタンパク
質に特異的に結合する抗体を提供する。
多くの因子が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるタンパク質の半減期に影響を及ぼしうる。例え
ば、腎臓における濾過、肝臓における代謝、タンパク質分解性酵素（プロテアーゼ）によ
る分解、および免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質の中和およびマクロファー
ジおよび樹状細胞による取込み）。様々な戦略を使用して、本発明の抗体の半減期を延長
することができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ
、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミ
ン結合性リガンド、および炭水化物シールドとの化学的連結により、アルブミン、ＩｇＧ
、ＦｃＲｎ、およびトランスフェリンなどの血清タンパク質に結合するタンパク質との遺
伝子融合により、ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディ、および
アンチカリンなど、血清タンパク質に結合する他の結合部分とカップリングする（遺伝子
的または化学的に）ことにより、ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブ
ミン結合性タンパク質、およびＦｃとの遺伝子融合により、またはナノ担体、徐放製剤、
もしくは医療デバイスへの組込みにより、本発明の抗体の半減期を延長することができる
。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体の血清中循環を延長するため、高分子量のＰＥＧなど、不
活性のポリマー分子を、ＰＥＧの、抗体のＮ末端もしくはＣ末端への部位特異的コンジュ
ゲーションを介して、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多
官能性リンカーを伴うかまたは多官能性リンカーを伴わない、抗体またはそれらの断片へ
と付着することができる。抗体をＰＥＧ化するには、抗体またはその断片を、ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのＰＥＧと、１つ
または複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で反応させることが典型的
である。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）との
アシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用される
「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチ
レングリコールもしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレング
リコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの
形態のうちのいずれかを包含することを意図するものである。ある種の実施形態では、Ｐ
ＥＧ化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマー
の誘導体化であって、生物学的活性の喪失を結果として最小とする誘導体化が、使用され
るであろう。コンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により緊密
にモニタリングして、ＰＥＧ分子の抗体への適正なコンジュゲーションを確認することが
できる。反応しなかったＰＥＧは、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロ
マトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ
誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書で記載されるイムノ
アッセイにより、結合活性ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性について調べることが
できる。当技術分野では、タンパク質をＰＥＧ化する方法が知られており、本発明の抗体
に適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１
６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照さ
れたい。
他の改変されたＰＥＧ化技術は、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系
を介して、化学的に特定された側鎖を、生合成タンパク質へと組み込む、再構成化学的直
交性直接操作技術（reconstituting chemically orthogonal directed engineering）（
ＲｅＣＯＤＥ ＰＥＧ）を含む。この技術は、３０を超える新たなアミノ酸の、大腸菌（
E. coli）細胞内、酵母細胞内、および哺乳動物細胞内の生合成タンパク質への組込みを
可能とする。ｔＲＮＡは、非天然アミノ酸を、アンバーコドンが配置される任意の位置へ
と組み込み、アンバーを終始コドンから化学的に特定されたアミノ酸の組込みシグナルを
伝達するコドンへと転換する。
組換えＰＥＧ化技術（ｒＰＥＧ）はまた、血清半減期の延長にも使用することができる
。この技術は、３００〜６００アミノ酸の非構造化タンパク質テールを、既存の医薬用タ
ンパク質へと遺伝子融合させることを伴う。このような非構造化タンパク質鎖の見かけの
分子量は、その実際の分子量の約１５倍であるため、タンパク質の血清半減期は、大きく
増大する。化学的コンジュゲーションおよび再精製を要求する従来のＰＥＧ化とは対照的
に、製造工程は大きく簡略化され、生成物は、均質である。
ポリシアリル化は、天然のポリマーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、活性寿
命を延長し、治療用ペプチドおよび治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術であ
る。ＰＳＡとは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチドの
薬物送達に使用される場合、コンジュゲーション時に、ポリシアル酸は、保護的微小環境
をもたらす。これは、循環内の治療用タンパク質の活性寿命を延長し、それが免疫系によ
り認識されることを防止する。ＰＳＡポリマーは、天然では、ヒト体内で見出される。Ｐ
ＳＡは、数百万年にわたり、それらの壁をＰＳＡでコーティングするように進化したある
種の細菌により採用された。次いで、これらの天然でポリシアリル化した細菌は、分子的
模倣により、体内の防御系を失効化することが可能となった。自然の究極のステルス技術
であるＰＳＡは、このような細菌から、大量に、かつ、所定の物理的特徴を伴って、容易
に作製することができる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内ではＰＳＡと化学的に同一であるので
、タンパク質へとカップリングさせた場合でもなお、完全に非免疫原性である。
別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用
を含む。ＨＥＳとは、蝋状トウモロコシデンプンに由来する、修飾された天然ポリマーで
あり、体内の酵素により代謝されうる。ＨＥＳ溶液は通例、血液量不足を補い、血液のレ
オロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を増大させ
ることのほか、腎クリアランスを低減することによっても、循環半減期の延長を可能とし
、生物学的活性の増大を結果としてもたらす。ＨＥＳの分子量など、異なるパラメータを
改変することにより、広範にわたるＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることが
できる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体はまた、１つまたは複数のアミノ酸修飾
（すなわち、置換、挿入、または欠失）を、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合
性断片（好ましくはＦｃドメイン断片またはヒンジＦｃドメイン断片）へと導入しても作
り出すことができる。例えば、国際公開第９８／２３２８９号パンフレット、国際公開第
９７／３４６３１号パンフレット；および米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参照
されたい。
さらに、抗体または抗体断片を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてより安定的とするか、または
ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長するために、抗体を、アルブミン（例えば、ヒト血
清アルブミン；ＨＳＡ）へとコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、技法
が周知であり、例えば、国際公開第９３／１５１９９号パンフレット、同第９３／１５２
００号パンフレット、および同第０１／７７１３７号パンフレット；ならびに欧州特許第
４１３，６２２号明細書を参照されたい。加えて、上記で記載した二特異性抗体の文脈で
は、抗体の特異性は、抗体の１つの結合性ドメインが、ＦＧＦ２１に結合するのに対し、
抗体の第２の結合性ドメインは、血清アルブミン、好ましくは、ＨＳＡに結合するように
デザインすることもできる。
半減期を延長するための戦略は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の延長が所望される、
ナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤、および他の抗体またはタンパク質におい
てとりわけ有用である。
抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプチド
へと（またはその断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０
、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０
、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドへと）、組換えによ
り融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた（共有結合的コンジュゲーションお
よび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に特
異的に結合する抗体またはそれらの断片を提供する。特に、本発明は、本明細書で記載さ
れる抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断
片、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ ＣＤＲ）と、異種タンパ
ク質、異種ポリペプチド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。当技
術分野では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片と融合
またはコンジュゲートさせる方法が知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０
３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第
５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、および同第５，１１２
，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書および同第３６７，１６６号明細
書；国際公開第９６／０４３８８号パンフレットおよび同第９１／０６５７０号パンフレ
ット；Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539；Zheng e
t al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；およびVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシ
ャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて、「ＤＮＡシャフリング」と
称する）の技法を介して作り出すことができる。ＤＮＡシャフリングを援用して、本発明
の抗体またはそれらの断片の活性を改変する（例えば、アフィニティーが大きく、解離速
度が小さい抗体またはそれらの断片）ことができる。一般に、米国特許第５，６０５，７
９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同
第５，８３４，２５２号明細書、および同第５，８３７，４５８号明細書；Patten et al
., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol.
16（2）:76-82；Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；ならびにLorenzo a
nd Blasco, 1998, Biotechniques 24（2）:308-313（これらの特許および刊行物の各々は
、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体もし
くはそれらの断片、またはコードされる抗体もしくはそれらの断片は、組換えの前に、エ
ラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他
の方法にかけることにより改変することができる。β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に特異的
に結合する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種
分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、区間、一部、ドメイン、断片などで組み換える
ことができる。
さらに、抗体またはそれらの断片は、精製を容易とするペプチドなどのマーカー配列へ
と融合させることもできる。好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、それら
のうちの多くが市販されている中でとりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．
、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）にお
いて提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチド（配列番号２７４）である。Ge
ntz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824において記載されている通
り、例えば、ヘキサヒスチジン（配列番号２７４）は、融合タンパク質の簡便な精製をも
たらす。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に
由来するエピトープ（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）に対応するヘマグルチニン（
「ＨＡ」）タグ、および「フラッグ」タグを含むがこれらに限定されない。
他の実施形態では、本発明の抗体またはそれらの断片を、診断剤または検出可能薬剤へ
とコンジュゲートさせる。このような抗体は、疾患または障害の発生、発症、進行、およ
び／または重症度を、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床検査手順の一部とし
てモニタリングまたは予後診断するのに有用でありうる。このような診断および検出は、
抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダ
ーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない多様な酵素
；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるがこれらに限定さ
れない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイ
ン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、また
はフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなどである
がこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンな
どであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ
、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウ
ム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネシウム（９９Ｔ
ｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３
Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３
Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９
０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇ
ｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４
Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに限定されない放
射性材料；ならびに多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属および非放射
性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質へとカップリングす
ることにより達成することができる。
本発明は、治療用部分へとコンジュゲートさせた抗体またはそれらの断片の使用もさら
に包含する。抗体またはその断片は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤
、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分へとコンジ
ュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に有害な任意の薬剤を
含む。
さらに、抗体またはその断片は、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物
部分へとコンジュゲートさせることもできる。治療用部分または薬物部分は、古典的化学
的治療剤に限定されるとはみなされないものとする。例えば、薬物部分は、所望の生物学
的活性を保有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドでありうる。このようなタ
ンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属外毒素、コレラ毒素、また
はジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェ
ロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトー
シス剤、抗血管新生剤；または例えば、リンホカインなどの生体応答修飾剤などのタンパ
ク質を含みうる。
さらに、抗体は、２１３Ｂｉなどのアルファ放射体などの放射性金属イオン、１３１Ｉ
ｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むがこれらに限定されない放射
性金属イオンを、ポリペプチドへとコンジュゲートするのに有用な大環状キレート化剤な
どの治療用部分へとコンジュゲートさせることもできる。ある種の実施形態では、大環状
キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体へと付着させうる、１，４，７，１０−テト
ラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。
当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、各々が参照によりそれら
の全体において組み込まれる、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4（10）:2483-
90；Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10（4）:553-7；およびZimmerman et al
., 1999, Nucl. Med. Biol. 26（8）:943-50において記載されている。
治療用部分を、抗体へとコンジュゲートさせるための技法は周知であり、例えば、Arno
n et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"
, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.（eds.）, pp.243-56（
Alan R. Liss, Inc. 1985）；Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Con
trolled Drug Delivery（2nd Ed.）, Robinson et al.,（eds.）, pp.623-53（Marcel De
kker, Inc. 1987）；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Ther
apy: A Review", Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications,
Pinchera et al.（eds.）, pp.475-506（1985）；"Analysis, Results, And Future Pros
pective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Mono
clonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.（eds.）, pp.3
03-16（Academic Press 1985）；およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58
を参照されたい。
抗体はまた、特に、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に有用な固体支持体へと付着
させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミ
ド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むがこれらに
限定されない。
本発明の抗体を作製する方法
抗体をコードする核酸
本発明は、上記で記載したβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体鎖のセグメントまたはドメイン
を含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核
酸のいくつかは、配列番号１０、３０、５０、または７０に示される重鎖可変領域をコー
ドするヌクレオチド配列、および／または配列番号２０、４０、６０、または８０に示さ
れる軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、核酸分
子は、表１において同定される核酸分子である。本発明の他のいくつかの核酸分子は、表
１において同定される核酸分子のヌクレオチド配列と実質的に（例えば、少なくとも６５
、８０％、９５％、または９９％）同一なヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクター
から発現させるとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、Ｆ
ＧＦ２１抗原結合能を呈示することが可能である。
本発明ではまた、上記で示したβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の重鎖または軽鎖に由来す
る少なくとも１つのＣＤＲ領域、および、通例３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌ
クレオチドも提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは、上記で示したβ−ｋｌｏ
ｔｈｏ結合性抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てを
コードする。コードの縮重性のために、様々な核酸配列は、免疫グロブリンアミノ酸配列
の各々をコードするであろう。
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードしうる。本発明の
核酸配列のうちのいくつかは、配列番号１１、３１、５１、または７１に示される重鎖配
列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な重鎖配列をコ
ードするヌクレオチドを含む。他のいくつかの核酸配列は、配列番号２１、４１、６１、
または８１に示される軽鎖配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または
９９％）同一な軽鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。
ポリヌクレオチド配列は、デノボの固相ＤＮＡ合成、またはβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗
体またはその結合性断片をコードする既存の配列（例えば、下記の実施例で記載される配
列）に対するＰＣＲによる突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接的な化
学合成は、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90によるホスホトリエステル法；B
rown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979によるホスホジエステル法；Beaucage et al
., Tetra. Lett., 22:1859, 1981によるジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許
第４，４５８，０６６号明細書による固体支持体法など、当技術分野で公知の方法により
達成することができる。ＰＣＲによる、突然変異の、ポリヌクレオチド配列への導入は、
例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A.
Erlich（Ed.）, Freeman Press, NY, NY, 1992；PCR Protocols: A Guide to Methods an
d Applications, Innis et al.（Ed.）, Academic Press, San Diego, CA, 1990；Mattil
a et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991；およびEckert et al., PCR Methods and
Applications 1:17, 1991において記載されている通りに実施することができる。
本発明ではまた、上記で記載したβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を作製するための発現ベ
クターおよび宿主細胞も提供される。多様な発現ベクターを、援用して、β−ｋｌｏｔｈ
ｏ結合性抗体鎖または結合性断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができ
る。ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターのいずれを使用しても
、哺乳動物宿主細胞内で抗体を作製することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイ
ルス系は、プラスミド、典型的に、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセ
ットを伴うエピソームベクター、およびヒト人工染色体を含む（例えば、Harrington et
al., Nat Genet 15:345, 1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細
胞内のＦＧＦ２１結合性ポリヌクレオチドおよびＦＧＦ２１結合性ポリペプチドの発現に
有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｂ、およびｐ
ＴｈｉｏＨｉｓ Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、ｐＥＢＶＨｉｓ
Ｂ、およびｐＥＢＶＨｉｓ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）
、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための、当技術分野で公知の
他の多数のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイル
ス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクタ
ー、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクタ
ー、およびセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）を含む。Brent et al.,前出；Smith, Annu
. Rev. Microbiol. 49:807, 1995；およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照
されたい。
発現ベクターの選択は、その中でベクターを発現させる、意図される宿主細胞に依存す
る。発現ベクターは、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体鎖または断片をコードするポリヌクレ
オチドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー
）を含有することが典型的である。いくつかの実施形態では、誘導条件下を除き、挿入さ
れた配列の発現を防止するのに、誘導的プロモーターを援用する。誘導的プロモーターは
、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショック
プロモーターを含む。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞によ
り良好に許容されるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させる
ことができる。プロモーターに加えて、他の調節的エレメントもまた、β−ｋｌｏｔｈｏ
結合性抗体鎖または断片の効率的な発現に要求または所望される可能性がある。これらの
エレメントは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接のリボソーム結合性部位または他の配列を典
型的に含む。加えて、発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れ
ることにより増強することもできる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Dif
fer. 20:125, 1994；およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照され
たい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物
宿主細胞内の発現を増大させることができる。
発現ベクターはまた、挿入されたＦＧＦ２１結合性抗体配列によりコードされるポリペ
プチドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列の位置ももたらしうる。
挿入されたβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体配列は、ベクター内に組み入れる前に、シグナル
配列へと連結することが多い。β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の軽鎖可変ドメインおよび重
鎖可変ドメインをコードする配列を受容するのに使用されるベクターは、場合によってま
た、定常領域またはそれらの一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融
合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、これにより、インタクトな抗体または
それらの断片の作製をもたらす。このような定常領域は、ヒト定常領域であることが典型
的である。
β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体鎖を保有し、これを発現させるための宿主細胞は、原核細
胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。大腸菌（E. coli）は、本発明のポリヌクレオ
チドをクローニングし、発現させるのに有用な１つの原核生物宿主である。使用に適する
他の微生物宿主は、枯草菌（Bacillus subtilis）などの桿菌、およびサルモネラ（Salmo
nella）属種、セラチア（Serratia）属種、および多様なシュードモナス（Pseudomonas）
属種など、他の腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主内ではまた、典型的に、宿主細
胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターも作製すること
ができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター
系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由来するプロモータ
ー系など、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在する。プロモーターは、任意選
択で、オペレーター配列により発現を制御することが典型的であるが、転写および翻訳を
開始して終結させるためのリボソーム結合性部位配列なども有する。本発明のＦＧＦ２１
結合性ポリペプチドを発現させるのに、酵母など、他の微生物もまた援用することができ
る。また、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性ポリペプチドを発
現させ、作製するのに、哺乳動物宿主細胞を使用する。例えば、それらは、内因性免疫グ
ロブリン遺伝子を発現させるハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例で記載される、１Ｄ
６．Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン）の場合もあり、外因性発現ベクターを保有する
哺乳動物細胞系（例えば、下記で例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）の場合もある。それ
らは、任意の正常非不死化動物細胞または正常不死化動物細胞もしくは非正常不死化動物
細胞またはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、多様なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞
、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞、およびハイブリドーマを含む、インタクトな免疫グロ
ブリンを分泌することが可能な多数の適切な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチド
を発現させるための、哺乳動物組織細胞培養物の使用については、例えば、Winnacker, F
ROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において一般に論じられてい
る。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハ
ンサーなどの発現制御配列（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参
照されたい）、ならびにリボソーム結合性部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化
部位、および転写ターミネーター配列などの、必要なプロセシング情報部位を含みうる。
これらの発現ベクターは通例、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳動物ウ
イルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的プロモーター
、細胞型特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、および／またはモジュレート可
能プロモーターもしくは調節可能プロモーターでありうる。有用なプロモーターは、メタ
ロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾ
ン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモー
ター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト
即初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野で公知
のプロモーター−エンハンサーの組合せを含むがこれらに限定されない。
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種
類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に
活用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主に使用する
ことができる（一般に、Sambrook et al.,前出を参照されたい）。他の方法は、例えば、
電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介型形質転換、注射およびマイクロイン
ジェクション、遺伝子銃法、ウィロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コン
ジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質である
ＶＰ２２との融合体（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強型取
込み、およびｅｘ ｖｉｖｏにおける形質導入を含む。組換えタンパク質の長期にわたる
高収率作製のためには、安定的発現が所望されることが多い。例えば、β−ｋｌｏｔｈｏ
結合性抗体鎖または結合性断片を安定的に発現させる細胞系は、ウイルス複製起点または
内因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含有する、本発明の発現ベクターを
使用して調製することができる。ベクターを導入した後、細胞は、強化培地中で１〜２日
間にわたり成長させてから、選択培地へと切り替えることができる。選択マーカーの目的
は、選択に対する耐性を付与し、その存在により細胞の成長を可能とし、これにより、導
入された配列を選択培地中で発現させることに成功することである。耐性で安定的にトラ
ンスフェクトされた細胞は、細胞型に適する組織培養法を使用して増殖させることができ
る。
モノクローナル抗体の作出
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and
Milstein, 1975 Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーションの技法
を含む、様々な技法により作製することができる。モノクローナル抗体を作製するための
多くの技法、例えば、Ｂリンパ球の、ウイルスによる形質転換または発がん性形質転換を
援用することができる。
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系、ラット系、およびウサギ系を含
む。マウスにおけるハイブリドーマの作製は、十分に確立された手順である。当技術分野
では、免疫化プロトコールと、融合のための、免疫化された脾臓細胞を単離するための技
法とが公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順もまた
公知である。
本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体は、上記で記載した通りに調製されたマウスモノ
クローナル抗体の配列に基づき、調製することができる。重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖
免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得、標準的な分
子生物学の技法を使用して、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するよ
うに操作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するには、当技術分野で公知の方
法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照され
たい）を使用して、マウス可変領域を、ヒト定常領域へと連結することができる。ヒト化
抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法を使用して、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフ
レームワークへと挿入することができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５２２
５５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎらによる、米国特許第５５３０１０１号明細書；
同第５５８５０８９号明細書；同第５６９３７６２号明細書；および同第６１８０３７０
号明細書を参照されたい。
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。β−ｋｌｏ
ｔｈｏを指向する、このようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫
系の部分を保有する、トランスジェニックマウスまたはトランスクロモソミックマウスを
使用して作り出すことができる。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロ
モソミックマウスは、本明細書では、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称
するマウスを含み、本明細書ではまとめて、「ヒトＩｇマウス」と称する。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、ヒト免疫グロブリン
遺伝子のミニ遺伝子座であって、再配列されていないヒト重（μおよびγ）鎖免疫グロブ
リン配列およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン配列を、内因性μ鎖遺伝子座および内因性κ鎖
遺伝子座を不活化させる標的突然変異と併せてコードする、ミニ遺伝子座（例えば、Lonb
erg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859を参照されたい）を含有する。したがっ
て、マウスは、マウスＩｇＭまたはマウスＩｇκの発現の低減を呈示し、免疫化に応答し
て、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞突然
変異を経て、高アフィニティーのヒトＩｇＧκモノクローナルを産出する（Lonberg, N.
et al., 1994 supra；Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:
49-101；Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, and Har
ding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546において総説され
ている）。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用、ならびにこのようなマウスにより保有さ
れるゲノム修飾については、それらの全ての内容が、参照によりそれらの全体において本
明細書に具体的に組み込まれる、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:
6287-6295；Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656；Tuaillon e
t al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724；Choi et al., 1993 Nature Ge
netics 4:117-123；Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830；Tuaillon et al., 19
94 J. Immunol. 152:2912-2920；Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 5
79-591；およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851において
さらに記載されている。さらに、全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、米国特許第５
，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６
号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５
，８７７，３９７号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，８１４，３１８
号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；および同第５，７７０，４２９号明細書；
Ｓｕｒａｎｉらによる米国特許第５，５４５，８０７号明細書；全てＬｏｎｂｅｒｇおよ
びＫａｙによる、ＰＣＴ国際公開第９２１０３９１８号パンフレット、国際公開第９３／
１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９
７１１３８５２号パンフレット、国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、および国
際公開第９９／４５９６２号パンフレット；ならびにＫｏｒｍａｎらによるＰＣＴ国際公
開第０１／１４４２４号パンフレットも参照されたい。
別の実施形態では、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスな
ど、導入遺伝子上および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用
して、本発明のヒト抗体をもたらすことができる。本明細書では、このようなマウスを、
「ＫＭマウス」と称するが、これについては、Ｉｓｈｉｄａらによる、ＰＣＴ国際公開第
０２／４３４７８号パンフレットにおいて詳細に記載されている。
ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる、当技術分野では、なおさらに代替的なトラン
スジェニック動物系が利用可能であり、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体をもたらす
のに使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）
と称する、代替的なトランスジェニック系も使用することができる。このようなマウスに
ついては、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる、米国特許第５，９３９，５９８
号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６
，１５０，５８４号明細書；および同第６，１６２，９６３号明細書において記載されて
いる。
さらに、当技術分野では、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる、代替的なトランス
クロモソミック動物系が利用可能であり、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体をもたら
すのに使用することができる。例えば、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の
両方を保有するマウスであって、「ＴＣマウス」と称するマウスを使用しうるが、このよ
うなマウスについては、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-72
7において記載されている。当技術分野ではさらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を保
有するウシについても記載されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20
:889-894）、本発明のＦＧＦ２１結合性抗体をもたらすのに使用することができる。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーを
スクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。当
技術分野では、ヒト抗体を単離するための、このようなファージディスプレイ法が確立さ
れているか、または下記の実施例において記載される。例えば、Ｌａｄｎｅｒらによる、
米国特許第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；および同第
５，５７１，６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒらによる、米国特許第５，４２７，９０８号明
細書；および同第５，５８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによる、米国特
許第５，９６９，１０８号明細書；および同第６，１７２，１９７号明細書；ならびにＧ
ｒｉｆｆｉｔｈｓらによる、米国特許第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，
４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；
同第６，５８２，９１５号明細書；および同第６，５９３，０８１号明細書を参照された
い。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化したら、ヒト抗体応答を発生させうる
ように、ヒト免疫細胞を再構築した、ＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。
このようなマウスについては、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらによる、米国特許第５，４７６，
９９６号明細書；および同第５，６９８，７６７号明細書において記載されている。
フレームワークまたはＦｃの操作
本発明の操作抗体は、例えば、抗体の特性を改善するように、ＶＨおよび／またはＶＬ
内のフレームワーク残基へと修飾を施した操作抗体を含む。このようなフレームワーク修
飾は、抗体の免疫原性を低下させるように施すことが典型的である。例えば、１つの手法
は、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然
変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が由来す
る生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体
フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定する
ことができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すに
は、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと
「復帰突然変異させる」ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、
本発明により包含されることを意図する。
フレームワーク修飾の別の種類は、１つもしくは複数のフレームワーク領域内の残基、
なおまたは、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトー
プを除去して、これにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。この手法は
また、「脱免疫化」とも称し、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０
４３号明細書においてさらに詳細に記載されている。
フレームワーク内またはＣＤＲ領域内に施された修飾に加えて、またはこれと代替的に
、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内の修飾を含んで、典型的に、血清半減期、補体の結合、Ｆ
ｃ受容体の結合、および／または抗原依存性細胞性細胞傷害など、抗体の１つまたは複数
の機能的特性を改変するように操作することもできる。さらに、本発明の抗体は、化学的
に修飾することもでき（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に付着することがで
きる）、そのグリコシル化を改変して、ここでもまた、抗体の１つまたは複数の機能的特
性を改変するように修飾することもできる。これらの実施形態の各々については、下記で
さらに詳細に記載する。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデッ
クスである。
一実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を改変する、例えば、増大または
減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらによる
米国特許第５，６７７，４２５号明細書においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ
領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易とするか
、または抗体の安定性を増大もしくは低下させるように改変する。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を
短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌属プロテインＡ（ＳｐＡ）への結合が、天
然Ｆｃ−ヒンジドメインのＳｐＡへの結合と比べて損なわれるように、１つまたは複数の
アミノ酸突然変異を、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間界面領域へ
と導入する。この手法は、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書にお
いてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。多様な手
法が可能である。例えば、以下の突然変異：Ｗａｒｄによる米国特許第６，２７７，３７
５号明細書において記載されている、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆのうちの１つ
または複数を導入することができる。代替的に、生物学的半減期を延長するために、抗体
を、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書；および同第６，１２
１，０２２号明細書において記載されている、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つ
のループから採取されたサルベージ受容体結合性エピトープを含有するように、ＣＨ１領
域内またはＣＬ領域内で改変することもできる。
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、抗体のエフェクター機能
を改変する異なるアミノ酸残基で置きかえることにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、
抗体が、エフェクターリガンドに対するアフィニティーを改変しているが、親抗体の抗原
結合能は保持するように、１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえ
ることができる。それに対するアフィニティーを改変するエフェクターリガンドは、例え
ば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。この手法は、両方ともＷｉｎｔｅｒら
による米国特許第５，６２４，８２１号明細書；および同第５，６４８，２６０号明細書
においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体が、Ｃ１ｑへの結合を改変し、かつ／または補体依存性細胞傷
害作用（ＣＤＣ）を低減もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される１つま
たは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。この手法は、Ｉ
ｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号明細書においてさらに詳細に記
載されている。
別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基を改変して、これにより、補体に結
合する抗体の能力を改変する。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ国際公開第９４
／２９３５１号パンフレットにおいてさらに記載されている。
さらに別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存
性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させ、かつ／またはＦｃγ受
容体に対する抗体のアフィニティーを増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。この手法
は、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第００／４２０７２号パンフレットにおいてさら
に記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩ
ＩＩ、およびＦｃＲｎに対する結合性部位もマップされており、結合を改善させた変異体
も記載されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604を参照
されたい）。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、脱グリコシル化抗
体（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）を作製することができる。グリコシル化は
、例えば、「抗原」に対する抗体のアフィニティーを増大させるように改変することがで
きる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化
部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フ
レームワークグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす、１つまたは複数のアミノ酸
置換を作製して、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる
。このような脱グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させるこ
とができる。このような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書；
および同第６，３５０，８６１号明細書においてさらに詳細に記載されている。
加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体または二分枝
型ＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体など、グリコシル化の種類を改変した抗体を作製す
ることもできる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を増大さ
せることが裏付けられている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を
改変した宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成することができる。当技術分野で
は、グリコシル化機構を改変した細胞が記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ
、これにより、グリコシル化を改変した抗体を産生するための宿主細胞として使用するこ
とができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、この
ような細胞系内で発現させた抗体が、低フコシル化を呈示するように、フコシルトランス
フェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊した細胞系について記載している
。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットは、フコース
をＡｓｎ（２９７）連結された炭水化物へと付着する能力を低減し、また、その宿主細胞
内で発現させた抗体の低フコシル化も結果としてもたらす、変異体のＣＨＯ細胞系である
、Ｌｅｃｌ３細胞について記載している（また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol.
Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ国際公開第９９／
５４３４２号パンフレットは、操作細胞系内で発現させた抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の
増大を結果としてもたらす二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈示するように、糖タンパ
ク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−Ｎアセチル
グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させるように操作さ
れた細胞系について記載している（また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-18
0も参照されたい）。
改変抗体を操作する方法
上記で論じた通り、本明細書で示されるＶＨ配列およびＶＬ配列または全長重鎖および
全長軽鎖配列を有するβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体は、全長重鎖配列および／もしくは全
長軽鎖配列、ＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、またはこれらへと付着された定常領域
を修飾することにより、新たなβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を創出するのに使用すること
ができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の
構造特色を使用して、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに結合し、また、ＦＧＦ２１受容体複合体の
１つまたは複数の機能的特性も活性化させること（例えば、ＦＧＦ２１受容体シグナル伝
達を活性化させること）など、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持する、
構造的に関連するβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を創出する。
例えば、本発明の抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域またはそれらの突然変異は、組換
えにより、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合わせて、組換え
により操作された、上記で論じた、本発明の、さらなるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を創
出することができる。他の種類の修飾は、前出の節で記載した修飾を含む。操作法のため
の出発材料は、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つも
しくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域である。操作抗体を創出する
のに、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複
数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すな
わち、タンパク質として発現させる）ことは必要ではない。そうではなくて、配列内に含
有される情報を、元の配列に由来する「第２世代の」配列を創出するための出発材料とし
て使用し、次いで、「第２世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号３、２３、４３、および６３から
なる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号４、２４、４４、および６４からなる群か
ら選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号５、２５、４５、および６５から
なる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号１３、
３３、５３、および７３からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１４、３４、
５４、および７４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号１
５、３５、５５、および７５からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領
域の抗体配列とからなるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を作製するステップと、重鎖可変領
域の抗体配列および／または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基
を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出するステップと、改変抗体配列を、タ
ンパク質として発現させるステップとを含む方法を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号６、２６、４６、および６６から
なる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号７、２７、４７、および６７からなる群か
ら選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号８、２８、４８、および６８から
なる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号１６、
３６、５６、および７６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１７、３７、
５７、および７７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号１
８、３８、５８、および７８からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領
域の抗体配列とからなるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を調製し、重鎖可変領域の抗体配列
および／または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、
少なくとも１つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させる
ための方法を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞における発現について最適化
されたβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体であって、配列番号１１、３１、５１、または７１の
群から選択される配列を有する全長重鎖抗体配列と、配列番号２１、４１、６１、または
８１の群から選択される配列を有する全長軽鎖抗体配列とからなるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合
性抗体を調製し、全長重鎖抗体配列および／または全長軽鎖抗体配列内の少なくとも１つ
のアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、
タンパク質として発現させるための方法を提供する。一実施形態では、重鎖または軽鎖の
改変は、重鎖または軽鎖のフレームワーク領域内である。
改変抗体配列はまた、ＣＤＲ３配列、または米国特許出願公開第２００５／０２５５５
５２号明細書において記載されている、最小限の不可欠な結合決定基を固定し、ＣＤＲ１
配列およびＣＤＲ２配列には多様性を持たせた抗体ライブラリーをスクリーニングするこ
とによっても調製することができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術など
、抗体を、抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適切な任意のスクリーニング技
術に従い実施することができる。
標準的な分子生物学の技法を使用して、改変抗体配列を調製し、発現させることができ
る。改変抗体配列によりコードされる抗体は、ヒト、カニクイザル、ラット、および／ま
たはマウスのβ−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合すること；ならびに抗体が、ＦＧＦＲ１ｃ
＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ２９３ ｐＥＲＫ細胞アッセイにおいて、ＦＧＦ２１に媒介
されるシグナル伝達、例えば、ＦＧＦ２１受容体に依存するシグナル伝達を活性化させる
ことを含むがこれらに限定されない、本明細書で記載されるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体
の機能的特性のうちの１つ、一部、または全部を保持する抗体である。
本発明の抗体を操作する方法のある種の実施形態では、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体コ
ード配列の全部または一部に沿って、ランダムに、または選択的に、突然変異を導入する
ことができ、結果として得られる修飾β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を、本明細書で記載さ
れる結合活性および／または他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。
当技術分野では、突然変異法が記載されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ国際公
開第０２／０９２７８０号パンフレットは、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセ
ンブリー、またはこれらの組合せを使用して、抗体の突然変異を創出し、スクリーニング
するための方法について記載している。代替的に、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ国際公開第
０３／０７４６７９号パンフレットは、コンピュータによるスクリーニング法を使用して
、抗体の生理化学的特性を最適化する方法について記載している。本発明のある種の実施
形態では、抗体は、脱アミド化部位を除去するように操作されている。脱アミド化は、ペ
プチド内またはタンパク質内の構造的変化および機能的変化を引き起こすことが公知であ
る。脱アミドは、生物学的活性の低下のほか、タンパク質医薬品の薬物動態および抗原性
の改変も結果としてもたらしうる（Anal Chem. 2005 March 1,;77（5）:1432-9）。
本発明のある種の実施形態では、抗体は、ｐＩを増大させ、それらの薬物様特性を改善
するように操作されている。タンパク質のｐＩは、分子の全体的な生物物理的特性の鍵と
なる決定因子である。ｐＩが小さな抗体は、可溶性が小さく、安定性が小さく、凝集しや
すいことが公知である。さらに、ｐＩが小さな抗体の精製は、とりわけ、臨床における使
用のためのスケールアップにおいて、困難であり、問題を生じる可能性がある。本発明の
抗β−ｋｌｏｔｈｏ抗体またはＦａｂのｐＩを増大させることにより、それらの可溶性が
改善され、抗体を高濃度（＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することが可能となった。抗体
を高濃度（例えば、＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することにより、高用量の抗体を、患
者の眼へと、硝子体内注射を介して投与することが可能な利点がもたらされ、これにより
、心血管障害を含む慢性疾患を処置するための著明な利点である、投与頻度の低減を可能
とすることができる。ｐＩの増大はまた、抗体のＩｇＧバージョンのＦｃＲｎを媒介する
リサイクリングも増大させ、これにより、薬物が長時間にわたり体内にとどまり、要求さ
れる注射の回数を少なくすることも可能としうる。最後に、ｐＩの増大に起因して、抗体
の全体的な安定性が著明に改善され、その結果として、保管寿命およびｉｎ ｖｉｖｏに
おける生物学的活性の延長がもたらされる。ｐＩは、８．２以上であることが好ましい。
改変抗体の機能的特性は、実施例において示されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）な
ど、当技術分野において利用可能であり、かつ／または本明細書で記載される標準的なア
ッセイを使用して評価することができる。
予防的使用および治療的使用
本明細書で記載される、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する抗体は、それを必要とする対に、
有効量の、本発明の抗体または抗原結合性断片を投与することにより、ＦＧＦ２１シグナ
ル伝達の異常（例えば、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達および／またはＦＧＦ２１
受容体によるシグナル伝達の活性化の異常）と関連する疾患または障害を処置するのに治
療的に有用な濃度で使用することができる。本発明は、それを必要とする対象へと、有効
量の、本発明の抗体を投与することにより、ＦＧＦ２１関連代謝障害を処置する方法を提
供する。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与すること
により、ＦＧＦ２１関連心血管障害を処置する方法を提供する。
本発明の抗体を、とりわけ、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アル
コール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インス
リン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、メタボリックシンドローム、急
性心筋梗塞、高血圧症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心
不全、冠動脈性心疾患、腎疾患、糖尿病性合併症、神経障害、胃不全麻痺、インスリン受
容体内の重度の不活化突然変異と関連する障害、ならびに他の代謝障害などの、代謝障害
、内分泌障害、および心血管障害を含むがこれらに限定されない、ＦＧＦ２１に関連する
状態または障害を処置、防止、および改善し（prevent treat, prevent, and improve）
、重篤な罹病患者の死亡率および罹患率を低減するのに使用することができる。
本発明の抗体はまた、ＦＧＦ２１関連障害を防止、処置、または改善するための他の薬
剤と組み合わせて使用することもできる。例えば、スタチン療法を、心血管障害または代
謝障害を伴う患者を処置するために、本発明のＦＧＦ２１模倣抗体および抗原結合性断片
と組み合わせて使用することができる。
特定の態様では、本明細書では、体重を低減する（例えば、少なくとも４％、少なくと
も５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくと
も１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％）方法であっ
て、それを必要とする対象に、有効量の、β−ｋｌｏｔｈｏに結合しβ−ｋｌｏｔｈｏお
よびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させることが可能な本明細書で記載される抗体または抗原
結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が提示される。
特定の態様では、本明細書では、食欲または食物摂取を低減する（例えば、少なくとも
４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも
９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、または少なくとも２０
％）方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、β−ｋｌｏｔｈｏに結合しβ−
ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させることが可能な本明細書で記載される
抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が提示され
る。
特定の態様では、本明細書では、対象における血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度または
血漿総コレステロール（ＴＣ）濃度を低減する（例えば、少なくとも４％、少なくとも５
％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１
０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％）方法であって、
それを必要とする対象に、有効量の、β−ｋｌｏｔｈｏに結合しβ−ｋｌｏｔｈｏおよび
ＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させることが可能な本明細書で記載される抗体または抗原結合
性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が提示される。
具体的な態様では、対象は、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アル
コール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、
高血糖症、ならびにメタボリックシンドロームなどの代謝障害に罹患している。具体的な
態様では、対象は、心血管障害に罹患している。
医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と併せて製剤化されたβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体
（インタクトなまたは結合性断片）を含む医薬組成物を提供する。組成物は加えて、例え
ば、心血管障害の処置または防止に適する１つまたは複数の他の治療剤も含有しうる。薬
学的に許容される担体は、組成物を増強するかもしくは安定化させるか、または、組成物
の調製を容易とするのに使用することもできる。薬学的に許容される担体は、生理学的に
適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤
などを含む。
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。
投与経路および／または投与方式は、所望される結果に応じて変化する。投与は、硝子体
内投与、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、もしくは皮下投与であるか、または標的部
位に近接して投与することが好ましい。薬学的に許容される担体は、硝子体内投与、静脈
内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射ま
たは注入による）に適するものとする。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、二特
異性分子および多特異性分子である抗体は、化合物を、化合物を不活化しうる酸および他
の天然の状態の作用から保護する材料でコーティングすることができる。
組成物は、滅菌であり、かつ、流体であるものとする。適正な流体性は、例えば、レシ
チンなどのコーティングを使用することにより維持することができ、分散液の場合には、
要求される粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用することにより維持することができる
。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの
多価アルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間吸
収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまた
はゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知であり、日常的に実施されている方法
に従い調製することができる。例えば、Remington：The Science and Practice of Pharm
acy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000；およびSustained and Controlled Release
Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
を参照されたい。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造することが好ましい。本発明の医薬
組成物中では、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の治療的に有効な用量または治療的に効果的
な用量を援用することが典型的である。β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体は、当業者に公知の
従来の方法により、薬学的に許容される剤形へと製剤化する。投与レジメンは、所望され
る最適応答（例えば、治療的応答）をもたらすように調整する。例えば、単一のボーラス
を投与することもでき、複数に分割された用量をある期間にわたり投与することもでき、
治療状況の要件により指し示されるのに応じて、用量を比例的に低減するかまたは増大さ
せることもできる。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を、投与
量単位形態で製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される投与量単位形
態とは、処置される対象のための単位投与量として適する、物理的に個別の単位を指す。
各単位は、要求される医薬担体との関連で、所望の治療効果をもたらすように計算された
、所定量の活性化合物を含有する。
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、特
定の患者、組成物、および投与方式に所望される治療的応答を達成するのに有効な量の有
効成分を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、援用される本
発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、
投与時期、援用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、援用される特定の組成
物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の
年齢、性別、体重、状態、全般的健康、および医療既往歴などの因子を含む様々な薬物動
態因子に依存する。
医師または獣医師は、医薬組成物中で援用される本発明の抗体の投与を、所望の治療効
果を達成するのに要求されるレベル未満のレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで
、投与量を漸増させることができる。一般に、本明細書で記載される心血管障害を処置す
るのに有効な、本発明の組成物の用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患
者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の薬物、および処置が予防的であるの
か治療的であるのかを含む、多くの異なる因子に応じて変化する。処置投与量は、安全性
および有効性を最適化するように滴定することが必要である。具体的な実施形態では、抗
体の全身投与では、投与量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇの範
囲であり、あるいは、宿主の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１５ｍｇの範囲である。具体的
な実施形態では、抗体の硝子体内投与では、投与量は、眼１つ当たり０．１ｍｇ〜眼１つ
当たり５ｍｇの範囲でありうる。例えば０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍ
ｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ
、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２
ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍ
ｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、２．
１ｍｇ／ｍｌ、２．２ｍｇ／ｍｌ、２．３ｍｇ／ｍｌ、２．４ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／
ｍｌ、２．６ｍｇ／ｍｌ、２．７ｍｇ／ｍｌ、２．８ｍｇ／ｍｌ、２．９ｍｇ／ｍｌ、３
．０ｍｇ／ｍｌ、３．１ｍｇ／ｍｌ、３．２ｍｇ／ｍｌ、３．３ｍｇ／ｍｌ、３．４ｍｇ
／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、３．６ｍｇ／ｍｌ、３．７ｍｇ／ｍｌ、３．８ｍｇ／ｍｌ、
３．９ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．１ｍｇ／ｍｌ、４．２ｍｇ／ｍｌ、４．３ｍ
ｇ／ｍｌ、４．４ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、４．６ｍｇ／ｍｌ、４．７ｍｇ／ｍｌ
、４．８ｍｇ／ｍｌ、４．９ｍｇ／ｍｌ、または５．０ｍｇ／ｍｌ。例示的な処置レジメ
は、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与を伴う
。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに
１回の全身投与、または必要に応じた（ＰＲＮ）全身投与を伴う。
抗体は通例、複数回投与する。単回の投与の間の間隔は、毎週、毎月、または毎年であ
りうる。間隔はまた、患者におけるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の血中レベルを測定する
ことにより指し示される通り、不規則でもありうる。加えて、医師が代替的な投与間隔を
決定する場合もあり、毎月または効果的であるのに必要な間隔で投与する。全身投与のい
くつかの方法では、投与量は、抗体の血漿中濃度１〜１０００μｇ／ｍｌを達成するよう
に調整し、いくつかの方法では、２５〜５００μｇ／ｍｌを達成するように調整する。代
替的に、抗体は、持続放出製剤として投与することもでき、この場合は、低頻度の投与が
要求される。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に
、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体の半減期より長い半減期を示す。投与量お
よび投与頻度は、処置が予防的であるのか治療的であるのかに応じて変化しうる。予防的
適用では、比較的低投与量を、比較的低頻度の間隔で、長期にわたり投与する。一部の患
者には、彼らの余生にわたり処置を施し続ける。治療的適用では場合によって、比較的高
投与量が、疾患の進行が軽減されるか終結するまで、比較的短い間隔で要求され、好まし
くは、患者が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで要求される。その後、患
者には、予防的レジメを投与することができる。
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提示されるものであり、その範囲を限
定するために提示されるものではない。当業者には、本発明の他の変形がたやすく明らか
であろうし、添付の特許請求の範囲によっても包含される。
実施例１：抗原としての使用のための、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿３００．
１９細胞の調製
ヒトＦＧＦＲ１ｃ（アミノ酸１〜３８６）およびβ−ｋｌｏｔｈｏを安定的に発現させ
る３００．１９細胞を、全細胞抗原としての使用のために作り出した。ヒトβ−ｋｌｏｔ
ｈｏ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１７５７３７）をコードする全長ｃＤＮＡを、ｐ
ＥＦ１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番Ｖ９２１２０）のＥｃｏＲＩ
／ＥｃｏＲＶ部位へとクローニングした。ヒトＦＧＦＲ１ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：
ＮＭ＿０２３１０６）のアミノ酸１〜３８６をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＦ６／Ｍｙｃ
−Ｈｉｓ Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番Ｖ９６２２０）のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ
部位へとクローニングした。両方の構築物では、Ｋｏｚａｋ配列（ＣＡＣＣ）を、開始コ
ドンの直前に入れ、終止コドンを、ベクター内のＭｙｃ−Ｈｉｓタグの前に加えた。Ａｍ
ａｘａ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイスおよびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌ
ｏｎｚａ；型番ＶＣＡ−１００３）を使用する電気穿孔により、マウスｐｒｅ−Ｂ３００
〜１９細胞に、β−ｋｌｏｔｈｏプラスミドおよびＦＧＦＲ１ｃプラスミドを共トランス
フェクトした。１ｍｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番１０１３１）
および８ｕｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番４６〜１１２０）
を、３週間にわたり使用して、安定的なクローンを選択した。
実施例２：細胞アッセイにおける使用のための、ＦＧＦＲ＿β−ｋｌｏｔｈｏ ＨＥＫ２
９３細胞の調製
β−ｋｌｏｔｈｏ抗体の結合特異性、機能的活性、またはオーソログの交差反応性につ
いて調べるため、標準的なＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション
および細胞クローン選択法を使用して、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧ
ＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧＦＲ４＿
β−ｋｌｏｔｈｏ、またはカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏを安定的に発現
させるＨＥＫ２９３細胞を作り出した。
以下の、全長ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ（ＮＭ＿１７５７３７）、ヒトＦＧＦＲ１ｃ（ＮＭ
＿０２３１０６）、ヒトＦＧＦＲ２ｃ（ＮＰ＿００１１３８３８７）、ヒトＦＧＦＲ３ｃ
（ＮＰ＿０００１３３）、またはヒトＦＧＦＲ４（ＮＰ＿９９８８１２）のｃＤＮＡをコ
ードする、哺乳動物発現プラスミドを使用した：カニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏのために
は、ヒトおよびアカゲザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ配列に基づくプライマーにより、全長配列
を、カニクイザル脂肪組織ｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ；型番Ｃ１５３４００３−Ｃｙ）
からＰＣＲ増幅し、クローニングした。カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ ｃＤＮＡは、ヒトＦ
ＧＦＲ１ｃ配列（ＮＭ＿０２３１０６）に基づくプライマーを使用して、カニクイザル脂
肪組織ｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ；型番Ｃ１５３４００３−Ｃｙ）からクローニングし
たところ、ヒトＦＧＦＲ１ｃと、アミノ酸レベルで、１００％同一であることが示された
。よって、ヒトＦＧＦＲ１ｃアミノ酸配列と、カニクイザルＦＧＦＲ１ｃアミノ酸配列と
は、同一であるので、上記で記載したヒトＦＧＦＲ１ｃ ｃＤＮＡ構築物を使用して、カ
ニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏおよびヒトＦＧＦＲ１ｃ（ＮＭ＿０２３１０６）を安定的に
発現させるＨＥＫ２９３細胞を作製した。
実施例３：ｐＥＲＫ細胞アッセイを使用する、ＦＧＦＲ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体の活性
化の測定
細胞を培養し、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ １／２（ｐＥＲＫ）レベルを測定するために
、標準的な技法を使用した。略述すると、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦ
ＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧＦＲ４
＿β−ｋｌｏｔｈｏ、またはカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏを安定的に発
現させるＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；ＳＨ３００７１）、ブラ
ストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ１１１３９０２）、およびジェネテシン（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ；１０１３１０３５）を含有するＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、１１９９５）中、５％ＣＯ２、３７℃で維持した。細胞を、ポリＤ−リシンでコーティ
ングされた３８４ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；３５４６６３）へと
播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で、一晩にわたりインキュベートした後、血清飢餓させた
。
β−ｋｌｏｔｈｏ抗体のハイブリドーマ上清を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地で希
釈し、多様な濃度の抗体を、プレートへと添加した。インキュベーション後、細胞を洗浄
し、次いで、溶解緩衝液で溶解させた。細胞溶解物を、３８４ウェルアッセイプレート（
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；型番６００８２８０）へと移し、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｓ
ｕｒｅＦｉｒｅ（商標）ｐＥＲＫ １／２キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＴＧＲＥ
Ｓ１０Ｋ）を使用して、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ １／２レベルを測定した。標準的なＡ
ｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ環境を使用して、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０４マルチラベルリーダ
ー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で、プレートを読み取った。式：Y＝Ｂｏｔｔｏｍ＋
（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０（Ｌｏｇ ＩＣ５０−ｘ）×ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ
）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用して、タンパク質濃度と対
比させた、ｐＥＲＫ活性の、ベース活性に対する倍数として、用量応答データをグラフ化
して、ＥＣ５０値を決定した。
実施例４：モノクローナル抗体の調製
抗ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ抗体は、本質的に、Dreyer et al (2010) (Dreyer AM et.al.
(2010) BMC Biotechnology 10:87)において記載されている通り、Ｂａｌｂ／ｃ（Ｊａｃ
ｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；株：ＢＡＬＢ／ｃＪ）マウス、またはＢｃｌ２ ２２
ｗｅｈｉ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；株：Ｃ．Ｃｇ−Ｔｇ（ＢＣＬ２）
２２Ｗｅｈｉ／Ｊ）マウス内の全細胞免疫化により作り出した。
略述すると、１×１０７個のヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿３００．１９細胞
を、Ｂａｌｂ／ｃマウスへと、１０〜３０日間隔で、６回にわたり注射した。初回の全細
胞注射は、フロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆ５８８１）
により行った。細胞およびアジュバントは、２つの、近接するが、顕著に異なる皮下部位
に、混合せず、別個に注射した。これらの後、同じ細胞の腹腔内注射を、Ｓｉｇｍａ Ａ
ｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ６３２２）を伴うか、
またはアジュバントを伴わずに行った。
Ｂｃｌ２ ２２ ｗｅｈｉマウスを使用して、１×１０７個のヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−
ｋｌｏｔｈｏ＿３００．１９細胞を、これらの動物へと、７日間隔で、４回にわたり注射
した。初回の注射は、フロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆ
５８８１）により行った。細胞およびアジュバントは、２つの、近接するが、顕著に異な
る皮下部位の２つのセットに、別個に注射した。後続の細胞の注射は、アジュバントを伴
わずに、皮下において行った。
免疫化されたマウスにおける免疫応答は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイに
より測定した。１，０００または１０，０００倍に希釈された免疫化されたマウスに由来
する血清を使用して、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫおよびヒトＦＧＦＲ
１ｃ＿ β−ｋｌｏｔｈｏ＿３００．１９細胞を染色した後、アロフィコシアニン（ＡＰ
Ｃ）抗マウスＩｇＧ検出用二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；
型番１１５−１３６−０７１）を施した。蛍光は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
ＬＳＲＩＩフローサイトメーターまたはＦｏｒｅｓｓａフローサイトメーター上で読み取
った。最高力価のマウス４匹を、エレクトロフュージョンのために選び出した。
実施例５：ハイブリドーマのスクリーニング、サブクローニング、および選択
２×１０８個の脾臓細胞および５×１０７個の融合パートナーであるＦ０細胞（ＡＴＣ
Ｃ；ＣＲＬ−１６４６）を、Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＣＭ−Ｃ；Ｃｙｔ
ｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で洗浄し、製造元の仕様に従い、ピークパルスを
６００ボルトとしてＨｙｂｒｉｍｕｎｅ Ｗａｖｅｆｏｒｍ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｃｙ
ｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＣＥＥＦ−５０Ｂモデル）を使用して、融合させ
た。細胞を、３８４ウェルプレートへと、ウェル１つ当たりのＦ０細胞３，０００個の計
算された密度で播種し、ＨＡＴ選択培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；型番Ｈ０２６２
）中で培養した。
一次スクリーニングは、ハイスループットのＦＡＣＳプラットフォーム（Anderson, Pa
ul. Automated Hybridoma Screening, Expansion, Archiving and Antibody Purificatio
n. In: 3rd Annual 2014 SLAS Conference. Jan. 18-22, 2014, San Diego, CA）を使用
して実施した。略述すると、ハイブリドーマ上清を、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈ
ｏを安定的に発現させる細胞系および非発現細胞系と共にインキュベートし、抗体の結合
を、抗マウスＩｇＧ−ＡＰＣ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ；
型番１１５−１３６−０７１）により決定した。
各ハイブリドーマ上清に由来する抗体を、４つのバーコード付き細胞系：３００．１９
親細胞、ヒト＿ＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿３００．１９細胞、親ＨＥＫ ２９３
細胞、およびヒトＦＧＦＲ１ｃ−β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ ２９３細胞に対する結合に
ついて、同時に調べ、一次スクリーニングにおいて、３４８のヒットを選び出した。一次
ヒットを、９６ウェルプレート内で拡大し、結合を、ヒトＦＧＦＲ１ｃ−β−ｋｌｏｔｈ
ｏ＿ＨＥＫ ２９３細胞上で、ＦＡＣＳにより、再度確認し、１２２の確認されたヒット
を得た。実施例２で記載したｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ １／２アッセイを使用して、ＦＡ
ＣＳにより結合を再確認した１１５のヒットのＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン
−チミジン）培地含有上清を、細胞における、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容
体複合体の活性化についてプロファイリングした。
これらの上清中のｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ １／２細胞の活性を最大とするハイブリド
ーマを拡大し、ＩｇＧを、それらの上清から精製した。実施例２で記載したｐｈｏｓｐｈ
ｏ−ＥＲＫ １／２アッセイを使用して、７４のハイブリドーマから精製されたＩｇＧを
、細胞における、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体の活性化についてプ
ロファイリングした。実施例２で記載したｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ １／２アッセイ を
使用して、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体による、ｐｈｏｓｐｈｏ−
ＥＲＫ １／２の活性化効力が最良であるハイブリドーマに由来するＩｇＧを、オーソロ
グの、カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体との交差反応性、なら
びにヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏおよびヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受
容体複合体に対する選択性についてプロファイリングした。これらのプロファイリング結
果に基づき、ハイブリドーマクローンである、９９Ｇ０９および１２７Ｆ１９を、さらな
るプロファイリングのために選択した。
９９Ｇ０９および１２７Ｆ１９による、α−ｋｌｏｔｈｏを発現させる細胞内のシグナ
ル伝達について査定するため、ＨＥＫ２９３細胞に、α−ｋｌｏｔｈｏ、Ｅｇｒ１ルシフ
ェラーゼ、およびウミシイタケ（Renilla）属ルシフェラーゼをトランスフェクトした。
略述すると、ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ中で培養し、ウェル１つ当た
りの細胞３００００個で播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、Ｋ
ｌｏｔｈｏ、Ｅｇｒ−１−ｌｕｃ、およびＴＫ−Ｒｅｎｎｉｌａをトランスフェクトした
。翌日、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ２１、９９Ｇ０９、および１２７Ｆ１９を、０．１％ＦＢＳ
を補充したＤＭＥＭで、表示の濃度へと希釈し、トランスフェクトされた細胞へと、一晩
にわたり添加した。ルシフェラーゼ活性は、製造元の指示書に従い、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏル
シフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｅ２９２０）により検出した。予測され
る通り、そのシグナル伝達のために、α−ｋｌｏｔｈｏの発現を要請するＦＧＦ２３は、
強力なルシフェラーゼ発現を示した。しかし、ＦＧＦ２１も、９９Ｇ０９も、１２７Ｆ１
９も、著明なルシフェラーゼ発現を示さなかったことから、α−ｋｌｏｔｈｏは、ＦＧＦ
２１またはこれらのＦＧＦ２１模倣抗体の共受容体として作用しないことが示唆される。
実施例６：モノクローナル抗体のヒト化およびアフィニティー成熟
ヒト化
当技術分野では、ヒト化の工程について十分に記載されている（Jones PT et al. (198
6) Nature 321: 522-525; Queen C et al. (1989) PNAS USA 86: 10029-10033; Riechman
n L et al. (1988) Nature 33:323-327; Verhoeyen M et al. (1988) Science 239: 1534
-1536）。ヒト化という用語は、非ヒト抗体、例えば、マウス由来抗体の抗原結合性部位
の、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト生殖細胞系列配列への導入として説
明される（Retter I et al. (2005). Nucleic Acids Res. 33: D671-D674）。
抗体をヒト化する主要な根拠は、ヒトにおいて、抗体に対する免疫原性応答を発生させ
る危険性を最小化することに認められる（Rebello PR et al. (1999) Transplantation 6
8: 1417-1420）。抗原結合性部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）（Chothia C and Lesk A
M (1987) Journal of Molecular Biology 196: 901-917; Kabat E et al. (1991) Anon.
5th Edition ed; NIH Publication No. 91: 3242）と、ＣＤＲ外、すなわち、可変ドメイ
ン（ＶＬおよびＶＨ）のフレームワーク領域内の位置であって、結合に直接的または間接
的に影響を及ぼす位置とを含む。結合に直接的に影響を及ぼしうるフレームワーク残基は
、例えば、ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する、いわゆる「アウター」ループ領域内に
見出すことができる。結合に間接的に影響を及ぼす残基は、例えば、いわゆるバーニヤ帯
域において見出される（Foote J, Winter G. (1992) Journal of Molecular Biology 224
:4 87-499）。これらは、ＣＤＲのコンフォメーションを支持すると考えられる。ＣＤＲ
の外側のこれらの位置は、フレームワーク領域内のヒト生殖細胞系列アクセプター配列に
照らした、最終的なヒト化抗体の逸脱の数を最小化するのに適する、アクセプターフレー
ムワークを選び出す場合に考慮される。
配列の最適化、アフィニティー成熟
ある種のアミノ酸配列モチーフは、グリコシル化（すなわち、ＮｘＳ／Ｔ、ｘは、Ｐ以
外の任意）、遊離システインの酸化、脱アミノ化（例えば、ＮＧ）または異性体化（例え
ば、ＤＧ）などの翻訳後修飾（ＰＴＭ）を経ることが公知である。ＣＤＲ領域内に存在す
る場合、これらのモチーフは、産物の均質性を増大させるために、部位特異的突然変異誘
発により除去することが理想的である。
当技術分野では、アフィニティー成熟の工程について十分に記載されている。多くのデ
ィスプレイ系の中で、ファージディスプレイ（Smith GP, 1985, Filamentous fusion pha
ge: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.
Science 228:1315-1317）および酵母など、真核細胞上のディスプレイ（Boder ET and W
ittrup KD, 1997, Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide l
ibraries. Nature Biotechnology 15: 553-557）は、抗体−抗原間相互作用について選択
するのに、最も一般的に適用される系であると考えられる。これらのディスプレイ系の利
点は、広範にわたる抗原に適し、選択厳密性を容易に調整しうることである。ファージデ
ィスプレイでは、ｓｃＦｖ断片またはＦａｂ断片を提示することができ、酵母ディスプレ
イでは、全長ＩｇＧが加わる。これらの一般的に適用される方法は、多様性が１×１０７
を超える、大規模なライブラリーからの、所望の抗体変異体の選択を可能とする。多様性
が小規模、例えば、１，０００、のライブラリーは、マイクロ発現およびＥＬＩＳＡによ
りスクリーニングすることができる。非標的化抗体変異体ライブラリーまたはランダム抗
体変異体ライブラリーは、例えば、エラープローンＰＣＲ（Cadwell RC and Joyce GF, 1
994, Mutagenic PCR. PCR Methods Appl. 3: S136-S140）により作り出すことができ、非
常に簡便であるが、場合によって限定的である手法をもたらす。別の戦略は、抗体候補物
質のＣＤＲ指向性多様化である。１つまたは複数のＣＤＲ内の１つまたは複数の位置は、
例えば、縮重オリゴヌクレオチド（Thompson J et al., 1996, Affinity maturation of
a high-affinity human monoclonal antibody against the third hypervariable loop o
f human immunodeficiency virus: use of phage display to improve affinity and bro
aden strain reactivity. J.Mol.Biol. 256: 77-88）、トリヌクレオチド突然変異誘発（
ＴＲＩＭ）（Kayushin AL et al., 1996, A convenient approach to the synthesis of
trinucleotide phosphoramidites--synthons for the generation of oligonucleotide/p
eptide libraries. Nucleic Acids Res. 24: 3748-3755）、または当技術分野で公知の、
他の任意の手法を使用して、特異的に標的とすることができる。
発現プラスミドの作出
ヒト（homosapiens）へのコドン最適化を含む、ヒト化ＶＬドメインおよびヒト化ＶＨ
ドメインをコードするＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に依頼した。ＶＬドメインお
よびＶＨドメインをコードする配列は、ＧｅｎｅＡｒｔによるベクターからのカットアン
ドペーストにより、哺乳動物細胞内の分離に適する発現ベクターへとサブクローニングし
た。重鎖および軽鎖は、共トランスフェクションを可能とするように、個別の発現ベクタ
ーへとクローニングした。発現ベクターのエレメントは、プロモーター（サイトメガロウ
イルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター）、分泌を容易とするシグナル配列、ポリ
アデニル化シグナルおよび転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、
エピソームにおける複製および原核生物内の複製を可能とするエレメント（例えば、ＳＶ
４０起点およびＣｏｌＥ１エレメントまたは当技術分野で公知の他のエレメント）、なら
びに選択を可能とするエレメント（アンピシリン耐性遺伝子およびゼオシンマーカー）を
含む。
ヒト化抗体候補物質の発現および精製
ＳＶ４０ラージＴ抗原を構成的に発現させるヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３−Ｔ
ＡＴＣＣ１１２６８）は、ヒト化ＩｇＧタンパク質および／または最適化されたＩｇＧ
タンパク質の一過性発現に好ましい宿主細胞系のうちの１つである。トランスフェクショ
ンは、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、ＭＷ：２５，０００、直鎖状；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ、ＵＳＡ、型番２３９６６）を、トランスフェクション試薬として使用して実施す
る。ＰＥＩ原液は、９００ｍｌの細胞培養グレード水中に、１ｇのＰＥＩを、室温（ＲＴ
）で、注意深く溶解することにより調製する。
精製は、２つのステップで実施し、これにより、ヒト化し、アフィニティー成熟させた
ｍＡｂを、マウスハイブリドーマから作り出した。ＮＯＶ００１は、マウスハイブリドー
マである９９Ｇ０９に由来する、ヒト化しアフィニティー成熟させたｍＡｂである。ＮＯ
Ｖ００２は、マウスハイブリドーマである１２７Ｆ１９に由来する、ヒト化しアフィニテ
ィー成熟させたｍＡｂである。アイソタイプである、ＩｇＧ１ Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
（ＬＡＬＡ）またはＩｇＧ１κ Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ（ＤＡＰＡ）は、抗体依存性細
胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および相補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を促進す
る抗体の能力を低減する防止手段として選択した（Hezareh M et al. (2001) Journal of
Virology 75: 12161-12168）。ＮＯＶ００１は、同じｍＡｂのＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）ア
イソタイプであり、ＮＯＶ００３は、同じｍＡｂのＩｇＧ１（ＤＡＰＡ）アイソタイプで
ある。ＮＯＶ００２は、同じｍＡｂのＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）アイソタイプであり、ＮＯＶ
００４は、同じｍＡｂのＩｇＧ１（ＤＡＰＡ）アイソタイプである。
実施例７：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるモノクローナル抗体の特徴付け
実施例５で記載したＳＥＴアッセイを使用して、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに対するｍＡｂ
のＫＤを推定した。ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、およびＮＯＶ００４は、それぞれ、約
４２ｐＭ、８ｐＭ、および９ｐＭのＫＤを有する（図１）。実施例３で記載したｐＥＲＫ
アッセイを使用して、ｍＡｂを、ＦＧＦＲ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体の活性についてプロ
ファイリングした。ＮＯＶ００２は、ヒトおよびカニクイザルのＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌ
ｏｔｈｏ受容体複合体を、それぞれ、約５ｎＭおよび３７ｎＭのＥＣ５０で活性化させた
（図２）。ＮＯＶ００４は、ヒトおよびカニクイザルのＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ
受容体複合体を、それぞれ、約６ｎＭおよび４０ｎＭのＥＣ５０で活性化させた（図２）
。ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４は、ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合
体、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体、またはヒトＦＧＦＲ４＿β−ｋ
ｌｏｔｈｏ受容体複合体を活性化させなかった（図３）。ｍＡｂを、実施例５で記載した
ＦＧＦ２３活性についてプロファイリングした。ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４は、Ｆ
ＧＦ２３活性を呈示しなかった（図４）。ｍＡｂを、実施例５で記載した、マウスＦＧＦ
Ｒ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体に対する交差反応性についてプロファイリングした。
ｍＡｂである、ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４は、マウス３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞によるグ
ルコースの取込みをもたらさなかった（図５）。
実施例８：ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメインの、ＮＯＶ００１およびＮＯＶ００２と
の水素−重水素交換による、エピトープマッピング
質量分析（ＭＳ）と組み合わせた水素−重水素交換（ＨＤｘ）（Woods VL et al. (200
1) High Resolution, High-Throughput Amide Deuterium Exchange-Mass Spectrometry (
DXMS) Determination of Protein Binding Site Structure and Dynamics: Utility in P
harmaceutical Design. J. Cell. Biochem. Supp.; 84(37): 89-98）を使用して、ＮＯＶ
００１およびＮＯＶ００２の、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）上の推定
結合性部位（アミノ酸５２〜９９７）をマッピングした。ＨＤｘ骨格では、タンパク質の
アミド水素を、重水素で置きかえる。この工程は、タンパク質の構造／動態および溶媒接
触性に対して高感度であり、したがって、リガンド結合時に重水素取込みの減少を経る位
置について報告することが可能である。これらの実験の目標は、ＮＯＶ００１またはＮＯ
Ｖ００２に結合するときの、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤの潜在的エピトープを同定し
、その動態について理解することであった。重水素取込みの変化は、直接的結合およびア
ロステリック事象の両方に対して高感度である。
ＨＤｘ／ＭＳ実験は、文献（Chalmers MJ et al. (2006) Probing protein ligand int
eractions by automated hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem
.; 78(4): 1005-1014）に記載されている方法と同様の方法を使用して実施した。実験は
、ＬＥＡＰ ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ、およびＳｙ
ｎａｐｔ Ｇ２質量分析計を含む、Ｗａｔｅｒｓ ＨＤｘ−ＭＳプラットフォーム上で実
施した。ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ（アミノ酸５２〜９９７）のタンパク質骨格を標
識付けするのに使用される重水素緩衝液は、Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）であり、溶液中の
重水素の全百分率は、９５％であった。タンパク質であるヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ（アミノ
酸５２〜９９７）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍから注文した（５８８９−ＫＢ−０５０）。
タンパク質は、ＨＤｘ−ＭＳ解析の前に、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２に対して、一晩にわ
たり透析した。抗体の非存在下における、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ（アミノ酸５２
〜９９７）の、重水素による標識付け実験のために、冷却された試験管内で、１００μｌ
の重水素緩衝液（９５％の重水素）を使用して、容量を１３μｌとする、３００ピコモル
のヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ（アミノ酸５２〜９９７）を希釈し、４℃のローテータ
ー上で、１５分間にわたりインキュベートした。次いで、標識付け反応を、１００μｌの
冷却クエンチ緩衝液により、２℃で５分間にわたりクエンチした後、自動式ペプシン消化
およびペプチド解析のための、ＬＣ−ＭＳシステムへと注入した。
ＮＯＶ００１またはＮＯＶ００２の存在下における、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ（
アミノ酸５２〜９９７）重水素による標識付け実験のために、３５０ピコモルのＮＯＶ０
０１またはＮＯＶ００２を、まず、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｐｌｕｓビーズ
上に固定化し、ＤＳＳ（スベリン酸ジスクシンイミジル）を使用して架橋した。標識付け
実験を実施するために、３５０ピコモルの抗体を含有する抗体ビーズを、３００ピコモル
のヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ（アミノ酸５２〜９９７）と共に、４℃で２０分間にわ
たりインキュベートした。２０分後、ビーズを、２００μｌのＰＢＳ緩衝液で洗浄した。
次いで、２００μｌの冷却された重水素緩衝液（８４．１％の重水素）を添加し、複合体
を、４℃で１５分間にわたりインキュベートした。１５分後、重水素緩衝液をスピンアウ
トし、標識付け反応を、２００μｌの冷却されたクエンチ緩衝液により、氷上で４．５分
間にわたりクエンチした。試料を、遠心分離機内で、３０秒間にわたりスピンした後、ク
エンチされた溶液を、自動式ペプシン消化およびペプチド解析のための、ＬＣ−ＭＳシス
テムへと注入した。
全ての重水素交換実験は、０．５ＭのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホス
フィン）および３Ｍの尿素（ｐＨ＝２．６）を使用してクエンチした。クエンチの後、交
換された抗原を、１２℃でＰｏｒｏｓｚｙｍｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｅｐｓｉｎ
カラム（２．１×３０ｍｍ）を使用するオンラインペプシン消化に続く、Ｗａｔｅｒｓ
Ｖａｎｇｕａｒｄ ＨＳＳ Ｔ３トラッピングカラム上のトラッピングにかけた。ペプチ
ドを、トラッピングカラムから溶出させ、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８ １×１００ｍ
ｍカラム（１℃で維持される）上、４０μｌ／分の流量で、２〜３５％Ｂの二成分の８．
４分の勾配（移動相Ａは、９９．９％の水および０．１％のギ酸であり；移動相Ｂは、９
９．９％のアセトニトリルおよび０．１％のギ酸である）を使用して分離した。
ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ（アミノ酸５２〜９９７）については、配列のうちの８
２％を、本明細書で記載される重水素交換実験によりモニタリングした。ＮＯＶ００１ま
たはＮＯＶ００２が結合したβ−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤと、ＮＯＶ００１またはＮＯＶ０
０２が結合しなかったβ−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤとの示差的実験のためには、２つの状態
の間の重水素取込みの変化について検討することが有益である。表２では、負の値は、Ｎ
ＯＶ００１−β−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ複合体またはＮＯＶ００２−β−ｋｌｏｔｈｏ
ＥＣＤ複合体が、β−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ単独と比べて、小さな重水素取込みを経るこ
とを指し示す。重水素取込みの減少は、抗体による、交換可能な重水素からの抗原の保護
、または水素結合ネットワークの安定化に起因しうる。これに対し、正の値は、複合体が
、β−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ単独と比べて、大きな重水素取込みを経ることを指し示す。
重水素取込みの増大は、水素結合ネットワークの不安定化（すなわち、タンパク質の局在
的なアンフォールディング）に起因しうる。アポβ−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤおよびＮＯＶ
００１−β−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ複合体またはＮＯＶ００２−β−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣ
Ｄ複合体など、２つの異なる状態の間の、重水素交換の示差的変化を検討する場合、手法
を使用して、変化が著明であるのかどうかを決定することが典型的である。差違が０．５
Ｄａを超える限りにおいて、差違は著明であると考えることが典型的である（Houde D, e
t al. (2010) J. Pharma. Sci.; 100(6): 2071-2086）。
表２は、ＮＯＶ００１−β−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ複合体またはＮＯＶ００２−β−ｋ
ｌｏｔｈｏ ＥＣＤ複合体について、β−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ単独と比べた重水素取込
みの変化を列挙する。−０．５Ｄａを、著明なカットオフとして使用する（Houde D, et
al. (2010) The Utility of Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry in Bioph
armaceutical Comparability Studies. J. Pharma. Sci.; 100(6): 2071-2086）。ＮＯＶ
００１−β−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ複合体では、以下のペプチド：アミノ酸２４５〜２６
６、３４４〜３４９、４２１〜４２９、４８８〜４９８、５０９〜５２４、５３６〜５５
０、５６８〜５７６、６４６〜６７０、６９６〜７００、７７３〜８０４、８３４〜８５
７、および９５９〜９８６が著明に保護される。ＮＯＶ００２−β−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣ
Ｄ複合体では、以下のペプチド：アミノ酸２４６〜２６５、３４３〜３４９、４２１〜４
２９、４８８〜４９８、５０９〜５２４、５３６〜５５０、５６８〜５７６、６４６〜６
６９、７７３〜８０４、８３４〜８５７、および９５９〜９８６が著明に保護される。
重複するペプチドの保護値を比較することにより、重水素交換データの分解能をさらに
改善することができる。例えば、ＮＯＶ００１−β−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ複合体内で、
アミノ酸３２９〜３４２のペプチドは、−０．５１Ｄａで保護されるに過ぎないが、より
大型である、アミノ酸３３０〜３４８のペプチドは、−１．４８Ｄａで保護される。よっ
て、大型ペプチドの、著明に保護される領域は、アミノ酸３４３〜３４７の領域であるは
ずだと推定することができる。この解析を、データにわたり実施することにより、ＮＯＶ
００２またはＮＯＶ００１が、β−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ（例えば、配列番号２６２内の
前記領域）に結合したとき、アミノ酸２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７
、および９５９〜９８６の領域が、最も強く保護されることが明らかとなる。
さらに、前出で言及した、最も強く保護される領域以外に、ＮＯＶ００１により保護さ
れる、全体的な多くの領域はまた、ＮＯＶ００２でも保護される。これらの保護領域は、
直鎖状配列空間内の多くの領域にわたり広がるが、ＥＣＤのＣ末端側に向かって、保護領
域は増大する。これに対し、２つの抗体を差別化する領域は少数である。ＮＯＶ００１で
は、２つの領域：アミノ酸６４６〜６７０およびアミノ酸６９７〜７００が固有に保護さ
れ、ＮＯＶ００２では、１つの領域である、アミノ酸６４６〜６８９が固有に保護される
。総じて、β−ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤに対して、ＨＤｘ−ＭＳだけを使用して、ＮＯＶ０
０２のエピトープを、ＮＯＶ００１のエピトープから差別化することは、困難であった。
ＨＤｘデータは、エピトープが酷似することを示唆する。
表２は、ＮＯＶ００１およびＮＯＶ００２の結合の、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ（アミノ酸
５３〜９９７）による重水素取込み（deuterium incorporation human β-klotho (53-99
7aa)）に対する効果を示す。質量分析により検出される各ペプチドについて、β−ｋｌｏ
ｔｈｏ ＥＣＤ単独と比べた、ＮＯＶ００１−β−ｋｌｏｔｈｏ複合体、およびβ−ｋｌ
ｏｔｈｏ ＥＣＤ単独と比べた、ＮＯＶ００２−β−ｋｌｏｔｈｏ複合体の、重水素取込
みの変化（ドルトン単位）を示す。
Figure 2021164452
Figure 2021164452
Figure 2021164452
Figure 2021164452
Figure 2021164452
Figure 2021164452
実施例９：ラットにおける、モノクローナル抗体の薬物動態プロファイル
動物および維持状態
動物のケアおよび管理は、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ
ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｕｎｃｉｌ）に従い施した。全ての手順は、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓにより示されている基準により統
括し、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ
Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコールＣＶ９０５４に従い実施し
た。雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（群１つ当たりのｎ＝３）は、底部の堅固
なケージ内の、不断に自動給水するように装備されたラック上で飼育し、１２時間の明暗
周期（午前６時〜午後６時）で維持し、標準的な齧歯動物用食餌（Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋ
ｌａｄ；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ；型番８６０４）を自由に得られるように施した。動
物施設は、３０〜７０％の湿度を伴う、６８〜７６°Ｆの間で維持した。
ＮＯＶ００２またはＮＯＶ００４の調製および投与
２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中の、ＮＯＶ００２（１２．００ｍｇ／ｍ
Ｌ）およびＮＯＶ００４（１６．０ｍｇ／ｍＬ）の原液は、凍結させて出荷され、−８０
℃で保存され、使用前に、冷蔵下で融解させた。投与日の午前中に、両方の抗体を、２０
ｍＭのヒスチジン緩衝液で２ｍｇ／ｍＬまで希釈し、適切な容量を、投与用シリンジ（５
ｍＬ／ｋｇ）へと吸引し、投与まで、室温で保った。動物を、試験管固定装置に置き、尾
静脈への静脈内（ＩＶ）注射（１０ｍｇ／ｋｇ）を介して、ＮＯＶ００２またはＮＯＶ０
０４を投与した。
血液試料の採取
血液試料は、−３日目（ベースライン）、投与後０日目（投与の１および６時間後）、
ならびに１、２、４、７、１４、２１、および２８日目に採取した。全ての時点は、０日
目に施された投与の終了を起点とした。各時点において、約０．２ｍＬ（２００μＬ）の
血液を、ＥＤＴＡ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｆｒ
ａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ；型番３６５９７３）を伴う、ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉ
ｎｅｒ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ／ｓｅｐａｒａｔｏｒ ｔｕｂｅへと採取した。出血を止
めるために、ゲージにより、圧力を加えた。試料を、２０，８１７×ｇで、１０分間にわ
たり遠心分離し、次いで、約１００μＬの血漿を、０．２ｍＬのＴｈｅｒｍｏ−ｓｔｒｉ
ｐ ｔｕｂｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ；型番
ＡＢ−０４５１）へと移し、８０℃で凍結させた。各採取の後、ラットを、それらの飼育
ケージに戻した。
血漿総ＮＯＶ００２濃度または血漿総ＮＯＶ００４濃度の測定
捕捉抗体としてのマウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（Ｒ１０Ｚ８Ｅ９）、および
検出抗体としての、ＨＲＰ標識を伴う、ヤギ抗ヒトＩｇＧによる、特注のサンドイッチイ
ムノアッセイを使用して、ラット血漿中のヒトＩｇＧ（すなわち、ＮＯＶ００２またはＮ
ＯＶ００４）を定量化した。３８４ウェルの白色マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎ
ｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ；Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ；型番７８１０７４）を、捕捉抗体（ウェル
１つ当たり３０μＬのＰＢＳ中に２μｇ／ｍＬ）でコーティングした。プレートは、振と
うせずに、室温（ＲＴ）で、一晩にわたりインキュベートした。コーティング溶液を、洗
浄せずに、吸引した後で、１×Ｍｉｌｋ Ｄｉｌｕｅｎｔ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（ＫＰ
Ｌ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ；型番５０−８２−０１）９０μＬを、各ウェルへ
と添加し、プレートを、室温で２時間にわたり、インキュベートした。インキュベーショ
ンの終了時に、溶液を吸引し、プレートを、乾燥剤と共に、フォイルパウチ内、−８０℃
で保存した。
アッセイの当日、０．１５〜６００ｎｇ／ｍＬの範囲の標準濃度の１６種のＮＯＶ００
２またはＮＯＶ００４を、陰性対照として緩衝液を含むカゼイン緩衝液での系列希釈によ
り調製した。全ての研究試料を、手作業により、カゼイン緩衝液で１：５０に希釈し、次
いで、Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ（Ｔｅｃａｎ；Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａ
ｎｄ）を使用して、合計５回の希釈で５倍に系列希釈した。プレートを、３００ｒｐｍで
振とうしながら、室温で２時間にわたりインキュベートし、次いで、リン酸洗浄緩衝液（
ウェル１つ当たり９０μＬ）で、３回にわたり洗浄した。ＨＲＰで標識されたヤギ抗ヒト
ＩｇＧ（ウェル１つ当たり３０μＬのカゼイン緩衝液中４００ｎｇ／ｍＬ）を、各プレー
トへと添加し、プレートを、３００ｒｐｍで振とうしながら、室温で１時間にわたりイン
キュベートした。プレートを、リン酸洗浄緩衝液（ウェル１つ当たり９０μＬ）で、３回
にわたり洗浄し、次いで、ＫＰＬ ＬｕｍｉＧＬＯ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ
Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加した（ウェル１つ当たり３０μＬ；型番５４−６１−００）
。化学発光は、全ての波長において、５０ミリ秒間の積分時間で、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ
Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で、速やかに読み取
った。血漿試料中のヒトＦｃ濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、ＮＯＶ００２またはＮＯＶ００４に
ついての検量線から内挿し、希釈係数を乗じ、ｎＭ濃度へと変換した。
動物は、ＮＯＶ００２またはＮＯＶ００４のそれぞれのＩＶ投与の１時間後において、
１２０７および１１１５ｎＭの平均Ｃｍａｘを呈示した。ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００
４は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、同等なＰＫプロファイルを呈示す
る（図６）。
実施例１０：肥満カニクイザルにおける研究
肥満カニクイザルにおける、ＮＯＶ００２の、食物摂取量、体重、および血漿バイオマ
ーカーに対する効果について研究した。
プロトコール：
５匹の雄カニクイザルを、２回にわたり皮下（ｓ．ｃ．）処置し、用量を１ｍｇ／ｋｇ
とするＮＯＶ００２を、隔週（研究の０および７日目）投与し、食物摂取量、体重、およ
び血漿バイオマーカーを、投与後１００日間を超える期間にわたり評価した。各投与のた
めに、動物を、それらの飼育ケージ内で拘束し、血液試料を採取し、次いで、各動物に、
１ｍｇ／ｋｇのＮＯＶ００２の皮下投与を施した。食物摂取量の測定は、初回投与の１週
間前に開始し、研究を通して継続した。研究用食餌は、給餌の前に秤量し、各日のための
、２つの等量に分けた。翌朝、残った食餌を回収し、秤量した。受け皿に落ちたペレット
（１ｇずつ）の数を数え、残った食物の重量に加えた。毎日の食物摂取量は、供給された
食物の重量から、回収された食物の重量を差し引いた量として計算した。果物および野菜
の摂取量は、測定しなかった。秤の動的特徴を使用して、空腹時体重を、毎週３回午前中
に、二連で測定した（血液採取または投与の前に）。
血漿ＮＯＶ００２濃度の測定
ＥＬＩＳＡベースのサンドイッチイムノアッセイを使用して、カニクイザル血漿中のヒ
トＦｃ ＩｇＧを定量化した。ヒトＩｇＧに対するマウスモノクローナル抗体である、抗
ヒトＩｇＧマウスＩｇＧ１を、捕捉抗体として使用した。Ｇｒｅｉｎｅｒの、白色３８４
ウェルプレートを、２μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧマウスＩｇＧ１（ウェル１つ当たり３０
μＬ）でコーティングし、室温（ＲＴ）で、一晩にわたりインキュベートした。コーティ
ング抗体を吸引し、１×ミルクブロッカー（ＫＰＬ；５０−８２−０１）を、ウェル１つ
当たり９０μＬで、室温で２時間にわたり添加した。ブロッキング溶液を吸引し、プレー
トを、プレートバッグ内、乾燥剤と共に、アッセイまで、−８０℃で保存した。アッセイ
の当日、プレートおよび試薬を、室温とした。基準物質は、精製されたＩｇＧを、緩衝液
対照を含む、特注のカゼイン試料希釈液中、４０００〜１６ｐＭに希釈することにより作
製した。試料を、基準物質と同じ希釈液中、１：５０、１：２５０、１：１２５０、およ
び１：６２５０に、二連で希釈し、次いで、基準物質、希釈された試料、および対照を、
プレートへと、室温で２時間にわたり添加した（全てのステップのための作業容量は、ウ
ェル１つ当たり３０μＬとした）。次いで、プレートを、リン酸ベースの洗浄緩衝液で、
３回にわたり洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された、抗ヒトＦ
ｃ−ガンマ抗体を、プレートへと、室温で１時間にわたり添加し、次いで、プレートを、
リン酸ベースの洗浄緩衝液で、３回にわたり洗浄した。化学発光基質を、プレートへと添
加し、プレートを、発光プレートリーダー上で、速やかに読み取った。
ＮＯＶ００２基準物質は、プレート１枚当たり三連でアッセイした。希釈された血漿試
料は、二連でアッセイした。未知の試料は、ＩｇＧ検量線から内挿した。試料濃度の曲線
への当てはめ、逆算、回収％、および内挿は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒ
ｅ ｖ５．４．１を使用して実施した。ＩｇＧ基準物質により発生するシグナルは、４パ
ラメータロジスティック曲線当てはめオプションを使用して、プロットし、当てはめた。
血漿試料中のＦｃ濃度（ｐＭ）は、ＮＯＶ００２についての検量線から内挿し、希釈係数
を乗じた。アッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）は、３１．２５０ｐＭであり、定量上限（Ｕ
ＬＯＱ）は、４０００ｐＭであった。ＬＬＯＱおよびＵＬＯＱは、１００回収％±２０％
およびＣＶ＜２０％とするときの、標準濃度の上限および下限として規定し、次いで、希
釈係数を乗じる。
抗薬物抗体の検出
血漿試料を、ＬｏｗＣｒｏｓｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｏｃａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｂ
ｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；型番１００ ５００）中で、１：５に希釈した。ＬｏｗＣｒ
ｏｓｓ Ｂｕｆｆｅｒ中に、０．６μｇ／ｍＬの、ビオチンで標識されたＮＯＶ００２と
、０．６μｇ／ｍＬの、ジゴキシゲニンで標識されたＮＯＶ００２とを含有する反応混合
物を調製した。希釈された血漿（８０μＬ）を、９６ウェルＵ字底プレート（ＢＤ Ｆａ
ｌｃｏｎ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ；型番３５１１７７）内に１６０μＬの反応混合物
と合わせた。プレートの縁をパラフィルムで密封し、プレートを、振とうプラットフォー
ム上、３７℃で２時間にわたりインキュベートした（光から保護して、１５０ｒｐｍで）
。次いで、各混合物のアリコート（１００μＬ）を、ストレプトアビジンでコーティング
された９６ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ；型番１１７３４７７６００１）の二連のウェル
へと移し、これをまず、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０（ウェル１つ当たり３
００μＬ）を含有する、１×ＰＢＳからなる洗浄緩衝液で、３回にわたり洗浄した。プレ
ートを密封し、次いで、振とうプラットフォーム上、室温で１時間にわたりインキュベー
トした（光から保護して、３００ｒｐｍで）。プレートを、洗浄緩衝液（ウェル１つ当た
り３００μＬ）で、３回にわたり洗浄し、次いで、ＬｏｗＣｒｏｓｓ Ｂｕｆｆｅｒで１
：２５００に希釈した、１００μＬの抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼ＿ＰＯＤ Ｆａ
ｂ断片（Ｒｏｃｈｅ；型番１１６３３７１６００１）を、各ウェルへと添加した。プレー
トを密封し、振とうプラットフォーム上、室温で４５分間にわたりインキュベートし（光
から保護して、３００ｒｐｍで）、次いで、洗浄緩衝液（ウェル１つ当たり３００μＬ）
で、３回にわたり洗浄した。ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏ
ｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｍｏｎｔｇ
ｏｍｅｒｙ ＴＸ；型番Ｅ１０２；ウェル１つ当たり１００μＬ）を、各ウェルへと添加
し、光から保護して、青色を、９〜１０分間にわたり発色させた。０．１８ＮのＨ２ＳＯ
４ １００μＬを、各ウェルへと添加することにより、発色反応を停止させ、プレートを
短時間にわたり振とうし、黄色を、ＯＤ４５０で測定した。
血漿グルコース濃度の測定
血漿グルコース濃度は、Ａｕｔｏｋｉｔ Ｇｌｕｃｏｓｅ ａｓｓａｙ（Ｗａｋｏ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ；型番４３９−９０９０１）を使用して測定
した。検量線は、較正剤を、５００、２００、１００、５０、２０、および０ｍｇ／ｄＬ
の基準物質へと希釈することにより作成した。アッセイ試薬（３００μＬ）を、３７℃ま
であらかじめ加熱し、透明平底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ；型番２６９６２０）中に２μＬの血漿、基準物質、および対照試料へと添加した。プ
レートを、プレートシェーカー上で３０秒間にわたり混合し、次いで、３７℃で５分間に
わたりインキュベートした。２０秒間にわたる混合に続き、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖ
ｉｃｅｓ ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＰＬＵＳ ３８４（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使
用して、５０５／６００ｎｍで、プレートを読み取った。試料中のグルコース濃度は、検
量線と比較することにより計算した。
血漿インスリン濃度の測定
血漿インスリン濃度は、製造元の指示書に従い、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｕｍａｎ Ｉ
ｎｓｕｌｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＩＡ Ｋｉｔ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ；型番Ｈ
Ｉ−１４Ｋ）を使用して決定した。適切な量のアッセイ緩衝液、基準物質、または希釈血
漿試料を、５ｍＬ、７５×１２ｍｍのＰＰ ＳＡＲＳＴＥＤＴ試験管（型番５５．５２６
）内の１２５Ｉ−インスリンおよび抗インスリン抗体と混合した。試験管をボルテックス
し、覆いをし、室温で２０時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、４
℃の沈殿試薬１ｍＬを添加し、試験管をボルテックスし、４℃で３０分間にわたりインキ
ュベートした。全ての試験管を、３０分間にわたり（３０００ｒｐｍ ４℃で）遠心分離
し、上清をデカントし、ペレットを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＷＩＺＡＲＤ２ Ａｕｔ
ｏｍａｔｉｃ Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒ（モデル番号２４７０；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍ
ｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上でカウントした。インスリン濃度は、既知量のインスリ
ンを使用して作成した、検量線と比較することにより計算した。
血漿トリグリセリド濃度の測定
血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度は、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＧＰＯ）Ｌｉｑｕｉ
ｄ Ｒｅａｇｅｎｔ ｓｅｔ（Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｎｔｏｎ、Ｍ
Ｉ、型番Ｔ７５３２−５００）を使用して測定した。あらかじめ加熱された、アッセイ試
薬（３００μＬ、３７℃）を、透明平底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅ
ｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ；型番２６９６２０）内の５μＬ
の血漿へと添加した。プレートを、プレートシェーカー上で３０秒間にわたり混合し、次
いで、３７℃のインキュベーター内に、５分間にわたり静置した。２０秒間にわたる混合
に続き、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＰＬＵＳプレートリーダーを使用して、５００ｎｍにお
ける吸光度を測定した。ＴＧ濃度は、既知量のＴＧ基準物質（Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ；型番Ｔ７５３１−ＳＴＤ）を使用して作成した、検量線と比較することによ
り計算した。
血漿コレステロール濃度の測定：
血漿総コレステロール（ＴＣ）濃度は、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｌｉｑｕｉｄ）Ｒｅ
ａｇｅｎｔ Ｓｅｔ（Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；型番Ｃ７５１０−５００）
を使用して定量化した。あらかじめ加熱された、アッセイ試薬（２００μＬ、３７℃）を
、透明平底９６ウェルアッセイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ；型番２６９６２０）内の１０μＬの血漿へと添加した。プレートを、プレートシ
ェーカー上で３０秒間にわたり混合し、次いで、３７℃で５分間にわたりインキュベート
した。２０秒間にわたる混合に続き、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＰＬＵＳプレートリーダー
で、５００ｎｍにおける吸光度を測定した。コレステロール濃度は、既知量のコレステロ
ール基準物質（Ｓｔａｎｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂｏｅｒｎｅ、ＴＸ；型番１０
１２−０３０）を使用して作成した、検量線と比較することにより計算した。
血漿高密度リポタンパク質コレステロール濃度の測定
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度を決定するために、５０μＬの血
漿試料を、０．５ｍＬのマイクロ遠心管内で、５０μＬのＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｐｒ
ｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｉｃｈｍ
ｏｎｄ、ＶＡ；型番４３１〜５２５０１）と合わせ、短時間にわたりボルテックスした。
遠心管を、室温で１０分間にわたり静置し、次いで、２０００×ｇ、４℃で、１０分間に
わたり遠心分離した。遠心分離に続き、上清（元の血漿試料のうちのＨＤＬコレステロー
ル部分を含有する）のうちの約半分を取り出し、１０μＬを、上記で記載したコレステロ
ールアッセイのために使用した。
血漿β−ヒドロキシ酪酸濃度の測定
血漿β−ヒドロキシ酪酸（β−ＨＢ）濃度は、β−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ
ＬｉｑｕｉＣｏｌｏｒ Ｔｅｓｔキット（Ｓｔａｎｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；型番
２４４０−０５８）を使用して測定した。アッセイ試薬Ｒ１（２１５μＬ、３７℃へとあ
らかじめ加熱した）を、透明平底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；型番２６９６２０）内の２０μＬの品質管理試料または血漿試料へ
と添加した。プレートを、プレートシェーカー上で３０秒間にわたり混合し、次いで、３
７℃のインキュベーター内に、５分間にわたり静置した。吸光度のプレリーディングは、
ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＰＬＵＳプレートリーダー内、５０５ｎｍで測定した。アッセイ
試薬Ｒ２（３５μＬ、３７℃へとあらかじめ加熱した）を、各ウェルへと添加し、プレー
トを、プレートシェーカー上で３０秒間にわたり再度混合し、３７℃で５分間にわたりイ
ンキュベートした。２０秒間にわたる混合に続き、最終的な吸光度を、５０５ｎｍで測定
し、ここから、プレリーディングされた値を差し引いた。β−ＨＢ濃度は、既知量のβ−
ＨＢ較正剤（Ｗａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ；型番４１２
−７３７９１）を使用して作成した、較正曲線と比較することにより計算した。
統計学的解析
統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０５；Ｇｒａ
ｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して実施した。各動物
についての食物摂取データは、ベースライン（−６〜０日目の平均として計算した）に対
するパーセントとして標準化し、次いで、群平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を計算し；
ダンの多重比較事後検定を伴う、ノンパラメトリックのフリードマンの検定により、各日
を、０日目と比較した。体重は、ベースライン（−７、−５、−３、および０日目の平均
として計算した）に対するパーセントとして計算した、群平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ
）として提示する。生の体重データおよび血漿バイオマーカーデータもまた、ダンの多重
比較事後検定を伴う、ノンパラメトリックのフリードマンの検定により解析した。Ｐ＜０
．０５を、有意と考えた。
結果
ＮＯＶ００２を投与する前に、動物を、既存の抗薬物抗体（ＡＤＡ）についてスクリー
ニングし、全てのサルは、ＡＤＡ陰性であることを見出した。ＮＯＶ００２が、肥満サル
の食物摂取および体重（平均ベースライン体重＝１２．４±０．９ｋｇであり、これは、
−６〜０日目の平均として計算した）を低減しうるのかどうかを決定するために、各動物
に、研究の０および７日目において、隔週で、１ｍｇ／ｋｇのＮＯＶ００２の皮下投与を
、２回にわたり施した。ＮＯＶ００２は、食物摂取を、ベースラインと比較して有意に減
少させ、ベースラインに照らした、約４４％への平均ピーク低減は、投与後３２日目に生
じる。食物摂取は、投与後１８、２２、２４、２５、２６、２９、および３２日目におい
て、ダンの事後検定を伴う、フリードマンの検定により、０日目と対比して、有意に低か
った。５匹のサル全てが、食物摂取量の明確な減少を呈示したが、食物摂取の低減の大き
さおよび持続時間は、群間で可変的であった。
体重もまた、研究を通して測定し、投与後６７日目において、ピーク平均体重の−８．
９％の変化を観察した。体重は、投与後３７〜７０日目において、ダンの事後検定を伴う
、フリードマンの検定により、０日目と対比して、有意に低かった。食物摂取に対する効
果と同様に、１ｍｇ／ｋｇのＮＯＶ００２による処置後、体重変化の程度および持続期間
のばらつきも観察されたが、これは、個々の動物の食物摂取応答と符合した：食物摂取の
低減が最大であるサルは、研究期間中における体重の減少は最も大きかった。
ＮＯＶ００２の、食物摂取および体重に対する効果の査定に加えて、脂質および炭水化
物の代謝についての血漿バイオマーカーに対する効果についても調べた。ＮＯＶ００２は
、投与後３２日目において、血漿ＴＧ濃度および血漿ＴＣ濃度の両方を、ベースライン（
−７、-３、および０日目の平均；ダンの事後検定を伴う、フリードマンの検定）に対す
る有意差を伴って減少させた。表３は、３２日目におけるベースラインに対する全ての血
漿バイオマーカー変化についてまとめる。ベースラインと比較して、ＮＯＶ００２は、研
究期間中のいかなる時点においても、血漿高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロー
ル濃度、血漿β−ヒドロキシ酪酸（β−ＨＢ）濃度、血漿グルコース濃度、または血漿イ
ンスリン濃度を有意に変化させなかったが、ＮＯＶ００２は、血漿アジポネクチンレベル
を、投与後３５日目において、有意に上昇させた。
Figure 2021164452
また、研究を通して、多様な時点（例えば、１、２、３、４、７日目（投与前および投
与の６時間後）、１１〜８１日目における毎週２回、およびその後における毎週１回）に
おいて、ＡＤＡ形成についても調べた。スクリーニング前には、いずれのサルも、ＮＯＶ
００２ ＡＤＡを提示しなかったが、３匹の動物は、研究期間中に、ＮＯＶ００２に対す
るＡＤＡを発症した。ＮＯＶ００２ ＰＫプロファイルは、ＡＤＡ陽性動物と、ＡＤＡ陰
性動物との間で異ならないと考えられた。
ＮＯＶ００２は、肥満カニクイザルにおける食物摂取および体重を、効果的に低下させ
た。２回にわたる１ｍｇ／ｋｇのＮＯＶ００２の皮下投与により処置された動物では、投
与後６７日目における、８．９％のピーク体重の低減が観察されたが、食物摂取および体
重の低減は、個々の動物の間で変動した。体重の減少は、血漿ＴＧ濃度および血漿ＴＣ濃
度の低減を伴ったことから、ＮＯＶ００２の、血漿脂質プロファイルに対する有益な効果
が示される。これらのデータは、ＮＯＶ００２が、食物摂取、体重、ならびに血漿ＴＧ濃
度および血漿ＴＣ濃度の低減に効果的であることを指し示すことから、ＮＯＶ００２のほ
か、ＮＯＶ００４など、その変異体、ＮＯＶ００２またはＮＯＶ００４のＣＤＲを含む他
の抗β−ｋｌｏｔｈｏ抗体、およびＮＯＶ００２（例えば、表２に示される保護ペプチド
のうちの１つまたは複数に結合する抗体）と同じエピトープに結合するか、またはＮＯＶ
００２と競合する、他の抗β−ｋｌｏｔｈｏ抗体であれば、肥満などの代謝障害のための
新たな治療に効果的であることを示唆する。
参照による組込み
本明細書で引用される全ての参考文献であって、特許、特許出願、論文、教科書などを
含む参考文献、およびそれらにおいて引用された参考文献は、それらについて既に言及し
た程度において（to the extent that they are not already）、参照によりそれらの全
体において本明細書に組み込まれる。
同等物
前出の明細書は、当業者が、本発明を実施することを可能とするのに十分であると考え
られる。前出の記載および実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態について詳述し
、本発明者らにより企図される最良の方式について記載する。しかし、前出の記載および
実施例が、本文中でいかに詳述されているように見えるとしても、本発明は、多くの様式
で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の同等物に
従うとみなされるべきであることが察知されるであろう。
同等物
前出の明細書は、当業者が、本発明を実施することを可能とするのに十分であると考えられる。前出の記載および実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態について詳述し、本発明者らにより企図される最良の方式について記載する。しかし、前出の記載および実施例が、本文中でいかに詳述されているように見えるとしても、本発明は、多くの様式で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の同等物に従うとみなされるべきであることが察知されるであろう。

本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記エピトープが、表２に示された配列番号のうちの１つまたは複数を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２］
前記単離抗体またはその抗原結合性断片が、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、以下のβ−ｋｌｏｔｈｏのペプチド（配列番号２６２）：アミノ酸２４５〜２６６、２４６〜２６５、３４３〜３４９、３４４〜３４９、４２１〜４２９、４８８〜４９８、５０９〜５２４、５３６〜５５０、５６８〜５７６、６４６〜６６９、６４６〜６７０、６９６〜７００、７７３〜８０４、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上を保護する、上記［２］に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［３］
前記単離抗体または断片が、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させる、上記［１］または［２］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［４］
溶液平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定した場合に、１０ｐＭ以下のＫ Ｄ でヒトβ−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に結合する、上記［１］または［２］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［５］
β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記エピトープが、前記β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
［６］
β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記エピトープが、前記β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、および６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１つまたは複数を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
［７］
ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に、５０ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体を活性化させる、単離抗体またはその抗原結合性断片。
［８］
前記抗体または断片が、表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して、少なくとも９５％、９８％、または９９％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、上記［１］に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［９］
前記抗体またはその抗原結合性断片が、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、表２に示される以下：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１４１、１４２、１４３、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６３、１６４、１６５、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１９５、１９６、１９７、１９８、２０４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、および２６１由来の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のペプチドを保護する、上記［１］に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［１０］
前記抗体または断片が、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、表２に示される以下：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１４１、１４２、１４３、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６３、１６４、１６５、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１９５、１９６、１９７、１９８、２０４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、および２６１由来の、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上のペプチドを保護する、上記［９］に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１１］
前記抗体または断片が、表１の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３、ならびに／または表１の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含む、前記項目のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１２］
前記抗体または断片が、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ（配列番号２６２）の残基７０１（Ｔｙｒ）または７０３（Ａｒｇ）に接触しない、上記［１］から［１０］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１３］
前記抗体または断片が、配列番号２６３および２６８からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４ ２４、４４、および６４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；５、２５、および４５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、上記［１］から［１２］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１４］
前記抗体または断片が、配列番号９、２９、４９、６９からなる群から選択されるＶＨ、またはその８０％もしくは９０％の同一性を有するアミノ酸配列と；配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択されるＶＬ、またはその８０％もしくは９０％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１５］
前記抗体または断片が、配列番号９、２９、４９、および２９からなる群から選択されるＶＨ、またはその９５％もしくは９７％の同一性を有するアミノ酸配列と；配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択されるＶＬ、またはその９５％もしくは９７％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１６］
前記抗体または断片が、配列番号２６８の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７５の軽鎖ＣＤＲ３を含む、上記［１］から［１２］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１７］
前記抗体または断片が、配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択される可変重鎖配列を含む、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１８］
前記抗体または断片が、配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される可変軽鎖配列を含む、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１９］
前記抗体または断片が、配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択される可変重鎖と；配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される可変軽鎖配列とを含む、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［２０］
前記抗体または断片が、配列番号９の可変重鎖、および配列番号１９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片、配列番号２９の可変重鎖、および配列番号３９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片；配列番号４９の可変重鎖、および配列番号５９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片；ならびに配列番号６９の可変重鎖、および配列番号７９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片からなる群から選択される、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［２１］
前記抗体または断片が、配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；５、２５、４５、および６５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［２２］
前記抗体または断片が、配列番号６、２６、４６、および６６からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号７、２７、４７、および６７からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；８、２８、４８、および６８からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６、３６、５６、および７６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１７、３７、５７、および７７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１８、３８、５８、および７８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［２３］
前記抗体または断片が、
（ｉ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号２３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号４３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号４５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号５５の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号６３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号６５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７５の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｖｉ）配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）配列番号４６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号４８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号５８の軽鎖ＣＤＲ３；または
（ｖｉｉｉ）配列番号６６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号６８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号７６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［２４］
単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記抗体または断片が、上記［１２］から［２３］のいずれか一項に記載の単離抗体または断片と同じエピトープに結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２５］
単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記抗体または断片が、β−ｋｌｏｔｈｏへの結合について、上記［１２］から［２３］のいずれか一項に記載の単離抗体または断片と競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２６］
前記抗体または断片が、ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、およびＮＯＶ００４からなる群から選択される、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［２７］
上記項目の一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
［２８］
代謝障害を処置する方法であって、代謝障害に罹患している対象に、有効量の、上記［１］から［２６］のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
［２９］
前記対象が、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、ならびにメタボリックシンドロームのうちの１つまたは複数に罹患している、上記［２８］に記載の方法。
［３０］
前記対象が、肥満、糖尿病、および脂質異常症のうちの１つまたは複数に罹患している、上記［２８］に記載の方法。
［３１］
心血管障害を処置する方法であって、心血管障害に罹患している対象に、有効量の、前記項目のいずれかに記載の抗体または断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
［３２］
前記対象が、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、および冠動脈性心疾患のうちの１つまたは複数に罹患している、上記［３１］に記載の方法。
［３３］
医薬としての使用のための、上記［１］から［２６］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［３４］
体重を低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、上記［１］から［２６］のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
［３５］
食欲または食物摂取を低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、上記［１］から［２６］のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
［３６］
対象における血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度または血漿総コレステロール（ＴＣ）濃度を低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、上記［１］から［２６］のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
［３７］
前記対象が、代謝障害に罹患している、上記［３４］、［３５］、または［３６］に記載の方法。
［３８］
前記対象が、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、ならびにメタボリックシンドロームのうちの１つまたは複数に罹患している、上記［３７］に記載の方法。
［３９］
前記項目のいずれかに記載の抗体のうちの１つまたは複数をコードする核酸。
［４０］
表１に示される配列と、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む核酸。
［４１］
表１に示される配列と、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む核酸。
［４２］
上記［３９］に記載の核酸を含むベクター。
［４３］
上記［４２］に記載のベクターを含む宿主細胞。
［４４］
代謝障害の処置における使用のための、上記［１］から［２６］のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物。
［４５］
β−ｋｌｏｔｈｏに結合する抗体またはその抗原結合性断片を作製する方法であって、前記抗体またはその断片の発現に適する条件下で、宿主細胞を培養するステップを含む、方法。

Claims (45)

  1. β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって
    、前記エピトープが、表２に示された配列番号のうちの１つまたは複数を含む、単離抗体
    またはその抗原結合性断片。
  2. 前記単離抗体またはその抗原結合性断片が、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定し
    た場合に、以下のβ−ｋｌｏｔｈｏのペプチド（配列番号２６２）：アミノ酸２４５〜２
    ６６、２４６〜２６５、３４３〜３４９、３４４〜３４９、４２１〜４２９、４８８〜４
    ９８、５０９〜５２４、５３６〜５５０、５６８〜５７６、６４６〜６６９、６４６〜６
    ７０、６９６〜７００、７７３〜８０４、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうち
    の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上を保護する、請求項２に記載の単離
    抗体またはその抗原結合性断片。
  3. 前記単離抗体または断片が、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させる
    、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  4. 溶液平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定した場合に、１０ｐＭ以下のＫＤでヒトβ
    −ｋｌｏｔｈｏタンパク質に結合する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結
    合性断片。
  5. β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって
    、前記エピトープが、前記β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基２４６〜２６
    ５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの１つまたは複数の
    アミノ酸を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
  6. β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結
    合性断片であって、前記エピトープが、前記β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の
    残基６４６〜６７０、６９６〜７００、および６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１つま
    たは複数を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
  7. ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に、５０ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザル
    ＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体を活性化させる、単離抗体またはその抗原
    結合性断片。
  8. 前記抗体または断片が、表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して、少
    なくとも９５％、９８％、または９９％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領
    域を含む、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
  9. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場
    合に、表２に示される以下：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１２５
    、１２６、１２７、１２８、１２９、１４１、１４２、１４３、１５６、１５７、１５８
    、１５９、１６０、１６１、１６３、１６４、１６５、１６７、１６８、１６９、１７０
    、１７１、１７２、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１９５、１９６、１９７
    、１９８、２０４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２２４、２２５
    、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２５６、２５７
    、２５８、２５９、２６０、および２６１由来の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、また
    はそれ以上のペプチドを保護する、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片
    。
  10. 前記抗体または断片が、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、表２に示
    される以下：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１２５、１２６、１２
    ７、１２８、１２９、１４１、１４２、１４３、１５６、１５７、１５８、１５９、１６
    ０、１６１、１６３、１６４、１６５、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７
    ２、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１９５、１９６、１９７、１９８、２０
    ４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２２４、２２５、２２６、２２
    ７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２５６、２５７、２５８、２５
    ９、２６０、および２６１由来の、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上のペ
    プチドを保護する、請求項９に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
  11. 前記抗体または断片が、表１の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３、な
    らびに／または表１の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含む、前記請
    求項のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
  12. 前記抗体または断片が、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ（配列番号２６２）の残基７０１（Ｔｙ
    ｒ）または７０３（Ａｒｇ）に接触しない、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単
    離抗体または抗原結合性断片。
  13. 前記抗体または断片が、配列番号２６３および２６８からなる群から選択される重鎖Ｃ
    ＤＲ１；配列番号４ ２４、４４、および６４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；
    ５、２５、および４５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１３、３３、５
    ３、および７３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４、３４、５４、お
    よび７４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１５、３５、５５、
    および７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から１２のいずれか
    一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
  14. 前記抗体または断片が、配列番号９、２９、４９、６９からなる群から選択されるＶＨ
    、またはその８０％もしくは９０％の同一性を有するアミノ酸配列と；配列番号１９、３
    ９、５９、および７９からなる群から選択されるＶＬ、またはその８０％もしくは９０％
    の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗
    体または抗原結合性断片。
  15. 前記抗体または断片が、配列番号９、２９、４９、および２９からなる群から選択され
    るＶＨ、またはその９５％もしくは９７％の同一性を有するアミノ酸配列と；配列番号１
    ９、３９、５９、および７９からなる群から選択されるＶＬ、またはその９５％もしくは
    ９７％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の
    単離抗体または抗原結合性断片。
  16. 前記抗体または断片が、配列番号２６８の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６４の重鎖ＣＤＲ２
    ；配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７４の軽鎖ＣＤ
    Ｒ２；および配列番号７５の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記
    載の単離抗体または抗原結合性断片。
  17. 前記抗体または断片が、配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択され
    る可変重鎖配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合
    性断片。
  18. 前記抗体または断片が、配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択さ
    れる可変軽鎖配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結
    合性断片。
  19. 前記抗体または断片が、配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択され
    る可変重鎖と；配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される可変軽
    鎖配列とを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片
    。
  20. 前記抗体または断片が、配列番号９の可変重鎖、および配列番号１９の可変軽鎖配列を
    含む抗体または断片、配列番号２９の可変重鎖、および配列番号３９の可変軽鎖配列を含
    む抗体または断片；配列番号４９の可変重鎖、および配列番号５９の可変軽鎖配列を含む
    抗体または断片；ならびに配列番号６９の可変重鎖、および配列番号７９の可変軽鎖配列
    を含む抗体または断片からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載
    の単離抗体または抗原結合性断片。
  21. 前記抗体または断片が、配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択され
    る重鎖ＣＤＲ１；配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択される重鎖Ｃ
    ＤＲ２；５、２５、４５、および６５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号
    １３、３３、５３、および７３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４、
    ３４、５４、および７４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１５
    、３５、５５、および７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から
    ７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
  22. 前記抗体または断片が、配列番号６、２６、４６、および６６からなる群から選択され
    る重鎖ＣＤＲ１；配列番号７、２７、４７、および６７からなる群から選択される重鎖Ｃ
    ＤＲ２；８、２８、４８、および６８からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号
    １６、３６、５６、および７６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１７、
    ３７、５７、および７７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１８
    、３８、５８、および７８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から
    ７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
  23. 前記抗体または断片が、
    （ｉ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５の重鎖ＣＤ
    Ｒ３；配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１５
    の軽鎖ＣＤＲ３；
    （ｉｉ）配列番号２３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２５の
    重鎖ＣＤＲ３；配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列
    番号３５の軽鎖ＣＤＲ３；
    （ｉｉｉ）配列番号４３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号４５
    の重鎖ＣＤＲ３；配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ２；および配
    列番号５５の軽鎖ＣＤＲ３；
    （ｉｖ）配列番号６３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号６５の
    重鎖ＣＤＲ３；配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列
    番号７５の軽鎖ＣＤＲ３；
    （ｖ）配列番号６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号８の重鎖ＣＤ
    Ｒ３；配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１８
    の軽鎖ＣＤＲ３；
    （ｖｉ）配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２８の
    重鎖ＣＤＲ３；配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列
    番号３８の軽鎖ＣＤＲ３；
    （ｖｉｉ）配列番号４６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号４８
    の重鎖ＣＤＲ３；配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５７の軽鎖ＣＤＲ２；および配
    列番号５８の軽鎖ＣＤＲ３；または
    （ｖｉｉｉ）配列番号６６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号６
    ８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号７６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７７の軽鎖ＣＤＲ２；および
    配列番号７８の軽鎖ＣＤＲ３
    を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
  24. 単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記抗体または断片が、請求項１２から
    ２３のいずれか一項に記載の単離抗体または断片と同じエピトープに結合する、単離抗体
    またはその抗原結合性断片。
  25. 単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記抗体または断片が、β−ｋｌｏｔｈ
    ｏへの結合について、請求項１２から２３のいずれか一項に記載の単離抗体または断片と
    競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
  26. 前記抗体または断片が、ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、およびＮＯＶ０
    ０４からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または
    抗原結合性断片。
  27. 上記請求項の一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体
    とを含む、医薬組成物。
  28. 代謝障害を処置する方法であって、代謝障害に罹患している対象に、有効量の、請求項
    １から２６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与す
    るステップを含む、方法。
  29. 前記対象が、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性
    肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、なら
    びにメタボリックシンドロームのうちの１つまたは複数に罹患している、請求項２８に記
    載の方法。
  30. 前記対象が、肥満、糖尿病、および脂質異常症のうちの１つまたは複数に罹患している
    、請求項２８に記載の方法。
  31. 心血管障害を処置する方法であって、心血管障害に罹患している対象に、有効量の、前
    記請求項のいずれかに記載の抗体または断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む
    、方法。
  32. 前記対象が、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、および冠動脈性
    心疾患のうちの１つまたは複数に罹患している、請求項３１に記載の方法。
  33. 医薬としての使用のための、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体またはその
    抗原結合性断片。
  34. 体重を低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、請求項１から２６
    のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップ
    を含む、方法。
  35. 食欲または食物摂取を低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、請
    求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投
    与するステップを含む、方法。
  36. 対象における血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度または血漿総コレステロール（ＴＣ）濃
    度を低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、請求項１から２６のい
    ずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含
    む、方法。
  37. 前記対象が、代謝障害に罹患している、請求項３４、３５、または３６に記載の方法。
  38. 前記対象が、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性
    肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、なら
    びにメタボリックシンドロームのうちの１つまたは複数に罹患している、請求項３７に記
    載の方法。
  39. 前記請求項のいずれかに記載の抗体のうちの１つまたは複数をコードする核酸。
  40. 表１に示される配列と、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む核酸。
  41. 表１に示される配列と、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む核酸。
  42. 請求項３９に記載の核酸を含むベクター。
  43. 請求項４２に記載のベクターを含む宿主細胞。
  44. 代謝障害の処置における使用のための、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体
    または抗原結合性断片を含む医薬組成物。
  45. β−ｋｌｏｔｈｏに結合する抗体またはその抗原結合性断片を作製する方法であって、
    前記抗体またはその断片の発現に適する条件下で、宿主細胞を培養するステップを含む、
    方法。
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