JP2021164451A - 核酸検出定量方法、チップ、アッセイキット、核酸検出定量装置及びプログラム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 実施形態に従う核酸検出定量方法は、試料中の標的核酸を定量する方法である。当該方法は、複数の検出領域が配置された基板を用意すること、基板上に、試料と、プライマーセットと、増幅酵素とを含む反応液を存在させて、1つの反応場を形成すること、反応場を等温増幅条件に維持すること、増幅産物の増加に伴って変化する検出信号を複数の検出領域のそれぞれで検出すること、検出領域それぞれについて増幅産物が存在する(陽性)か、増幅産物が存在しない(陰性)かを判断すること、及び陽性の数及び/又は検出信号の立ち上がり時間から標的核酸を検出又は定量することを含む。
【選択図】 図1
Description
式中、Σgiは陽性の数の和である。
式中、mは1検出領域当たりの反応体積である。
電気的信号を用いる核酸検出定量方法の概略フローを図5に示す。
光学的信号を用いる核酸検出定量方法の概略フローを図6に示す。
検出信号として濁度と相関する信号を用いる核酸検出定量方法の概略フローを図7に示す。
更なる実施形態によれば、試料中の標的核酸を定量及び検出するためのチップが提供される。チップは、基板と、基板の一方の面上の1つの空間に配置されている複数の検出領域とを有する。隣り合う2つの検出領域の距離、即ち、隣り合う2つの検出領域の一方の検出領域の端から他方の検出領域の端の最近接の間隔は、0.1mm以上10mm以下である。前記間隔は、1mm以上10mm以下であればより検出精度が向上するため好ましい。
更なる実施形態によれば、試料中の標的核酸を定量及び検出するためのアッセイキットが提供される。アッセイキットは、上記の何れかのチップと、第1の配列を等温増幅し増幅産物を得るためのプライマーセットと、増幅試薬とを含む。
核酸検出定量装置の一例を図8に示す。図8は、核酸検出定量装置50の一例を示すブロック図である。核酸検出定量装置50は、第1のメモリ60、プロセッサ70、第2のメモリ80、出力部90、及び測定ユニット100などを備える。第1のメモリ60、プロセッサ70、第2のメモリ80、出力部90、及び測定ユニット100は、バス110を介して電気的に接続されている。
<例1>
アレイ状の電極を備える基板用いて、異なるコピー数の増幅産物を含む反応液における電流及び電位立ち上がり時間の経時的変化を調査した。
Pyrex(登録商標)(d=0.8mm)ガラス表面に、幅×高さ=1mm×1mmの流路を設け、基板を形成した。その後、流路の底部にレジストAZP4620のパターンをマスクとしてチタン(500nm)及び金(2000nm)の薄膜を選択的にエッチングした。それによって8個の金/チタン電極(φ=200μm)(作用極)を形成した。2つの作用極ごとにそれらに対応する参照電極と対極とを形成した。
0コピー、102コピー、103コピー、104コピー、105コピー、106コピーのパルボウイルスの人工配列(1μL)(表1に配列番号1として示す)、表2に示すLAMPプライマーとしてのF3プライマー(配列番号2)、B3プライマー(配列番号3)、FIPプライマー(配列番号4)、BIPプライマー(配列番号5)及びLbプライマー(配列番号6)、RuHex(25μM)、KCl(60mM)、マグネシウムイオン(8mM)、アンモニウムイオン(10mM)、ベタイン(0.8M)、dNTPs(各1.4mM)並びにポリメラーゼ(GspSSD)(8unit)を含む反応液を調製した。
基板の電極を有する面上に反応液を持ち込み、反応液をそれぞれ67℃の等温で加温し、等温増幅反応を開始した。等温増幅反応と並行して、電気的信号をLSV法で測定した(掃引速度:0.5V/s)。反応開始から60分以内に、1nA/min以上の信号が検出された電極を有する検出領域を「陽性」とし、1nA/min未満の電極を有する検出領域を「陰性」とした。その結果を図11に示す。図11(a)は初期鋳型量と陽性率との関係、(b)は初期鋳型量と電流値の増加時間(立ち上がり時間)との関係を示す。
例1の結果を用いて、例1の基板を用いて試料中の103コピー未満の標的核酸を定量する場合に、陽性率から標的核酸の濃度を推定するための算定表を作成した。
陽性率から標的核酸の濃度を推定するのに、以下の式を用いて最確数(標的核酸の推定存在量:MPN)を推定する最確数法を利用した。
式中、mは、1電極当たりの反応体積(μL)である。
m=2.303×log((電極の総数)(陰性の数))/MPN
である。例1の102コピー/50μL、即ち、2コピー/μLの結果からmを求めると、mは、1.03μLであった。例1の101コピー/50μL、即ち、0.2コピー/μLの結果からmを求めると、mは、1.44μLであった。この2つの値の平均をとり、m=1.2μLとして算定表に利用した。最確数の計算は、MPN Calculatorを使用して行った。
例1の基板を用いて最適な電極間距離について検討を行った。
以下、本出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1]
試料中の、第1の配列を含む標的核酸を定量する方法であって、
複数の検出領域が配置された基板を用意すること、
前記基板上に、試料と、前記第1の配列を等温増幅し増幅産物を得るためのプライマーセットと、増幅酵素とを含む反応液を存在させて、1つの反応場を形成すること、
前記反応場を等温増幅条件に維持すること、
前記増幅産物の増加に伴って変化する検出信号を、前記複数の検出領域のそれぞれで検出すること、
前記検出の結果に基づいて、前記複数の検出領域それぞれについて、その付近に前記増幅産物が存在する(陽性)か、前記増幅産物が存在しない(陰性)かを判断すること、及び陽性の前記検出領域の数及び/又は前記複数の検出領域における前記検出信号の立ち上がり時間から前記標的核酸を検出又は定量すること
を含む方法。
[2]
前記等温増幅条件がLAMP反応条件である[1]に記載の方法。
[3]
前記基板が前記検出領域に対応して電極を備え、前記反応液が、更に前記増幅産物の増加に伴って変化する電気的信号を生じる第1の標識物質を含み、前記検出信号は前記第1の標識物質の酸化又は還元反応により得られる電気的信号である[1]又は[2]に記載の方法。
[4]
前記第1の標識物質がルテニウムヘキサンアミンである[3]に記載の方法。
[5]
前記基板が前記検出領域に対応して光学センサを備え、前記反応液が、更に前記増幅産物の増加に伴って変化する光学的信号を生じる第2の標識物質を含み、前記検出信号は光学的信号である[1]又は[2]に記載の方法。
[6]
前記基板が前記検出領域に対応して濁度センサを備え、前記検出信号が反応液の濁度に相関する信号である[1]又は[2]に記載の方法。
[7]
隣り合う前記複数の検出領域の距離が、それぞれ1mm以上である[1]に記載の方法。
[8]
試料中の、第1の配列を含む標的核酸を定量又は検出するためのチップであって、
基板と、前記基板の一方の面上の1つの空間に配置されている複数の検出領域とを有し、隣り合う前記検出領域の距離が、1mm以上10mm以下であり、
前記基板上に、前記試料と、前記第1の配列を等温増幅し増幅産物を得るためのプライマーセットと、増幅酵素とを含む反応液を存在させて1つの反応場を形成し、前記反応場で増幅反応を起こし、前記増幅産物の増加に伴って変化する検出信号を前記複数の検出領域のそれぞれで検出し、前記検出の結果に基づいて前記複数の検出領域それぞれについて、その付近に前記増幅産物が存在する(陽性)か、前記増幅産物が存在しない(陰性)かを判断し、陽性の前記検出領域の数及び/又は前記複数の検出領域における前記検出信号の立ち上がり時間から前記標的核酸を検出又は定量するためのチップ。
[9]
[8]に記載のチップと、前記第1の配列を等温増幅し前記増幅産物を得るためのプライマーセットと、増幅試薬とを含むアッセイキット。
[10]
前記増幅産物の増加に伴って変化する電気的信号を生じる第1の標識物質及び/又は前記増幅産物の増加に伴って変化する光学的信号を生じる第2の標識物質を更に含む[9]に記載のアッセイキット。
[11]
複数の検出領域が配置された基板を有するチップの、前記検出領域からの検出信号を受信する測定手段と、
前記測定手段を制御し、前記検出信号より測定データを生成し、前記測定データをメモリに格納する制御手段と、
前記測定データに基づいて、試料中の標的核酸を定量する定量手段と
を備え、
前記定量手段は、
前記メモリに格納された前記測定データを読み出し、
読み出した前記測定データに基づいて前記複数の検出領域それぞれの付近に前記標的核酸が存在する陽性を示すか、又は前記標的核酸が存在しない陰性を示すかを判断し、
前記陽性を示す前記検出領域の数及び前記陰性を示す前記検出領域の数を集計し、
前記陽性を示す前記検出領域の数が0である場合に、前記試料中に前記標的核酸が存在しないと判断し、
前記陽性を示す前記検出領域と前記陰性を示す前記検出領域との両方が存在する場合に、前記陽性を示す前記検出領域の数から前記試料中の前記標的核酸の存在量を算出し、
全ての前記検出領域が前記陽性を示す場合に、前記信号の立ち上がり時間から前記試料中の前記標的核酸の存在量を算出する
核酸検出定量装置。
[12]
前記制御手段による制御により、容器に格納された液体を前記チップに送り及び/又は出しを行う送液手段をさらに備える[11]に記載の核酸検出定量装置。
[13]
前記制御手段による制御により、前記チップの温度を制御する温度制御手段をさらに備える[11]又は[12]に記載の核酸検出定量装置。
[14]
コンピュータを、
複数の検出領域が配置された基板を有するチップの前記複数の検出領域からの検出信号を受信する測定手段と、
前記測定手段を制御し、前記検出信号より測定データを生成し、前記測定データをメモリに格納する制御手段と、
前記測定データに基づいて、試料中の標的核酸を定量する定量手段と、
して機能させるためのプログラムであって、
前記定量手段は、
前記メモリに格納された前記測定データを読み出し、
読み出した前記測定データに基づいて前記複数の検出領域それぞれの付近に前記標的核酸が存在する陽性を示すか、又は前記標的核酸が存在しない陰性を示すかを判断し、
前記陽性を示す前記検出領域の数及び前記陰性を示す前記検出領域の数を集計し、
前記陽性を示す前記検出領域の数が0である場合に、前記試料中に前記標的核酸が存在しないと判断し、
前記陽性を示す前記検出領域と前記陰性を示す前記検出領域との両方が存在する場合に、前記陽性を示す前記検出領域の数から前記試料中の前記標的核酸の存在量を算出し、
全ての前記検出領域が前記陽性を示す場合に、前記信号の立ち上がり時間から前記試料中の前記標的核酸の存在量を算出する
プログラム。
2…面
3、15、25、35、45…検出領域
4、16、26、36、46…センサ
60…メモリ
71…制御手段
72…定量手段
101…チップ
102…測定手段。
Claims (20)
- 試料中の、第1の配列を含む標的核酸を検出又は定量する方法であって、
一方の面上に複数の検出領域が配置された基板を用意すること、
前記基板の前記面の前記複数の検出領域上に、試料と、前記第1の配列を等温増幅し増幅産物を得るためのプライマーセットと、増幅酵素とを含む1種の反応液を存在させて、1つの反応場を形成すること、
前記反応場を等温増幅条件に維持すること、
前記増幅産物の増加に伴って変化する検出信号を、前記複数の検出領域のそれぞれで検出すること、
前記検出の結果に基づいて、前記複数の検出領域それぞれについて、その付近に前記増幅産物が存在する(陽性)か、前記増幅産物が存在しない(陰性)かを判断すること、及び陽性の前記検出領域の数及び/又は前記複数の検出領域における前記検出信号の立ち上がり時間から前記標的核酸を検出又は定量すること
を含む方法。 - 前記等温増幅条件がLAMP反応条件である請求項1に記載の方法。
- 前記基板が前記検出領域に対応して電極を備え、前記反応液が、更に前記増幅産物の増加に伴って変化する電気的信号を生じる第1の標識物質を含み、前記検出信号は前記第1の標識物質の酸化又は還元反応により得られる電気的信号である請求項1又は2に記載の方法。
- 前記第1の標識物質がルテニウムヘキサアミンである請求項3に記載の方法。
- 前記基板が前記検出領域に対応して光学センサを備え、前記反応液が、更に前記増幅産物の増加に伴って変化する光学的信号を生じる第2の標識物質を含み、前記検出信号は光学的信号である請求項1又は2に記載の方法。
- 前記基板が前記検出領域に対応して濁度センサを備え、前記検出信号が反応液の濁度に相関する信号である請求項1又は2に記載の方法。
- 隣り合う前記複数の検出領域の距離が、それぞれ1mm以上である請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸は、1種類の核酸である、請求項1〜7の何れか1項に記載の方法。
- 前記検出領域上には核酸プローブが固定されていない、請求項1〜8の何れか1項に記載の方法。
- 前記面が前記検出領域ごとに分割されていない、請求項1〜9の何れか1項に記載の方法。
- 試料中の、第1の配列を含む標的核酸を定量又は検出するためのチップであって、
基板と、前記基板の一方の面上の1つの空間に配置されている複数の検出領域とを有し、隣り合う前記検出領域の距離が、1mm以上10mm以下であり、
前記基板の前記面の前記複数の検出領域上に、前記試料と、前記第1の配列を等温増幅し増幅産物を得るためのプライマーセットと、増幅酵素とを含む1種の反応液を存在させて1つの反応場を形成し、前記反応場で増幅反応を起こし、前記増幅産物の増加に伴って変化する検出信号を前記複数の検出領域のそれぞれで検出し、前記検出の結果に基づいて前記複数の検出領域それぞれについて、その付近に前記増幅産物が存在する(陽性)か、前記増幅産物が存在しない(陰性)かを判断し、陽性の前記検出領域の数及び/又は前記複数の検出領域における前記検出信号の立ち上がり時間から前記標的核酸を検出又は定量するための
チップ。 - 前記標的核酸は、1種類の核酸である、請求項11に記載のチップ。
- 前記検出領域上には核酸プローブが固定されていない、請求項11又は12に記載のチップ。
- 前記面が前記検出領域ごとに分割されていない、請求項11〜13の何れか1項に記載の方法。
- 請求項11〜14の何れか1項に記載のチップと、前記第1の配列を等温増幅し前記増幅産物を得るためのプライマーセットと、増幅試薬とを含むアッセイキット。
- 前記増幅産物の増加に伴って変化する電気的信号を生じる第1の標識物質及び/又は前記増幅産物の増加に伴って変化する光学的信号を生じる第2の標識物質を更に含む請求項15に記載のアッセイキット。
- 複数の検出領域が配置された基板を有するチップの、前記検出領域からの検出信号を受信する測定手段と、
前記測定手段を制御し、前記検出信号より測定データを生成し、前記測定データをメモリに格納する制御手段と、
前記測定データに基づいて、試料中の標的核酸を定量する定量手段と
を備え、
前記定量手段は、
前記メモリに格納された前記測定データを読み出し、
読み出した前記測定データに基づいて前記複数の検出領域それぞれの付近に前記標的核酸が存在する陽性を示すか、又は前記標的核酸が存在しない陰性を示すかを判断し、
前記陽性を示す前記検出領域の数及び前記陰性を示す前記検出領域の数を集計し、
前記陽性を示す前記検出領域の数が0である場合に、前記試料中に前記標的核酸が存在しないと判断し、
前記陽性を示す前記検出領域と前記陰性を示す前記検出領域との両方が存在する場合に、前記陽性を示す前記検出領域の数から前記試料中の前記標的核酸の存在量を算出し、
全ての前記検出領域が前記陽性を示す場合に、前記信号の立ち上がり時間から前記試料中の前記標的核酸の存在量を算出する
核酸検出定量装置。 - 前記制御手段による制御により、容器に格納された液体を前記チップに送り及び/又は出しを行う送液手段をさらに備える請求項17に記載の核酸検出定量装置。
- 前記制御手段による制御により、前記チップの温度を制御する温度制御手段をさらに備える請求項17又は請求項18に記載の核酸検出定量装置。
- コンピュータを、
複数の検出領域が配置された基板を有するチップの前記複数の検出領域からの検出信号を受信する測定手段と、
前記測定手段を制御し、前記検出信号より測定データを生成し、前記測定データをメモリに格納する制御手段と、
前記測定データに基づいて、試料中の標的核酸を定量する定量手段と、
して機能させるためのプログラムであって、
前記定量手段は、
前記メモリに格納された前記測定データを読み出し、
読み出した前記測定データに基づいて前記複数の検出領域それぞれの付近に前記標的核酸が存在する陽性を示すか、又は前記標的核酸が存在しない陰性を示すかを判断し、
前記陽性を示す前記検出領域の数及び前記陰性を示す前記検出領域の数を集計し、
前記陽性を示す前記検出領域の数が0である場合に、前記試料中に前記標的核酸が存在しないと判断し、
前記陽性を示す前記検出領域と前記陰性を示す前記検出領域との両方が存在する場合に、前記陽性を示す前記検出領域の数から前記試料中の前記標的核酸の存在量を算出し、
全ての前記検出領域が前記陽性を示す場合に、前記信号の立ち上がり時間から前記試料中の前記標的核酸の存在量を算出する
プログラム。
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