JP2021162586A - 抗体の分析方法およびそれを利用した疾患の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 試料中に含まれる抗体を、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を用いたアフィニティクロマトグラフィで分析する際に、前記抗体を再現性高く分析できる方法を提供すること。
【解決手段】 Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに試料を添加し当該試料中に含まれる抗体を前記担体に吸着させる工程と、前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させ抗体の分離パターンを得る工程と、前記分離パターンにおける抗体の溶出時間と当該時間における検出値との積を総和した値を算出する工程とを含む、抗体の分析方法により、前記課題を解決する。
【選択図】 図２

Description

本発明は、抗体の分析方法およびそれを利用した疾患の検出方法に関する。特に本発明は、抗体を再現性高く分析し、その結果を利用して、疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、および／または加齢の進行度合いを検出する方法に関する。

近年、ガンや免疫疾患等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬品）が用いられている。抗体医薬品に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等）を培養後、カラムクロマトグラフィ等を用いて高純度に精製し製造されている。しかしながら近年の研究により、前記製造により得られた抗体は、酸化、還元、異性化、糖鎖付加等の修飾を受けることで多様な分子の集合体となっていることが判明しており、薬効や安全性への影響が懸念されている。特に、抗体に結合している糖鎖構造は、抗体医薬品の活性、動態、および安全性に大きな影響を与えることが報告されており、詳細な糖鎖構造の解析が重要である（非特許文献１）。またリウマチ等の疾患では、血液中の抗体に付加される糖鎖構造の変化が知られており（非特許文献２および３）、抗体に付加された糖鎖構造を分析することで疾患を検出できる可能性がある。

抗体の糖鎖構造を分析する方法として、糖鎖の切り出しを含むＬＣ−ＭＳ分析（特許文献１および２）が主に実施されている。しかしながら、前記分析方法では非常に煩雑な操作を伴い、多大な時間を要する。より簡便な抗体の分子構造の分析方法として、不溶性担体に固定化されたＦｃ結合性タンパク質と抗体との親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィ分析による方法があり、当該方法は抗体のＦｃ領域に結合した糖鎖構造の違いに基づく分析ができる（特許文献３）。しかしながら、前記分析で得られる分離パターンのばらつきが大きく、試料中に含まれる抗体を再現性高く分析するのは困難であった。

特開２０１６−１９４５００号公報 特開２０１６−０９９３０４号公報 ＷＯ２０１９／２４４９０１号

ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ、３４（２）、８３−８８（２０１３） Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０、３７３−３７６（２００８） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、７、１１２０５（２０１６）

本発明の課題は、試料中に含まれる抗体を、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を用いたアフィニティクロマトグラフィで分析する際、前記抗体を再現性高く分析できる方法を提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質を固定
化した不溶性担体を用いたアフィニティクロマトグラフィで試料中に含まれる抗体を分析する際に、抗体の分離パターンを数値化することで、前記抗体を再現性高く分析できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち本発明は、以下の［１］から［８］に記載の態様を包含する。
［１］
以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、試料中に含まれる抗体の分析方法：
（ａ）Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに試料を添加し、当該試料中に含まれる抗体を当該担体に吸着させる工程；
（ｂ）前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させ、抗体の分離パターンを得る工程；および
（ｃ）前記分離パターンにおける抗体の溶出時間と当該時間における検出値との積を総和した値を算出する工程。
［２］
前記溶出時間が、標準抗体の溶出時間の変動に基づいて補正されている、［１］に記載の分析方法。
［３］
さらに、以下の（Ａ）から（Ｄ）の工程を含む、［１］または［２］に記載の分析方法：
（Ａ）前記（ａ）の工程の前に、前記カラムに標準抗体溶液を添加して当該標準抗体を当該担体に吸着させ、当該担体に吸着した標準抗体を前記溶出液を用いて溶出させ、標準抗体の第１の分離パターンを得る工程；
（Ｂ）前記（ａ）および（ｂ）の工程の前または後に、前記（Ａ）の工程を再度実施し、標準抗体の第２の分離パターンを得る工程；
（Ｃ）前記第１の分離パターンにおける標準抗体の溶出時間と、前記第２の分離パターンにおける標準抗体の溶出時間とを比較する工程；および
（Ｄ）前記（Ｃ）の比較結果に基づき、前記（ｂ）で得られた分離パターンにおける抗体の溶出時間を補正する工程。
［４］
前記（Ｃ）の工程が、前記第１の分離パターンにおける抗体の２点以上の溶出時間と、前記第２の分離パターンにおける抗体の２点以上の溶出時間とを比較する工程である、［３］に記載の分析方法。
［５］
前記（Ｂ）の工程が、前記（ａ）の工程の直前または前記（ｂ）の工程の直後に実施される、［３］または［４］に記載の分析方法。
［６］
前記試料が、体液である、［１］から［５］のいずれかに記載の分析方法。
［７］
以下の（ａ）から（ｄ）の工程を含む、被検者における疾患および／またはその発症リスクの検出方法：
（ａ）Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに被検者から得た試料を添加し、当該試料中に含まれる抗体を前記担体に吸着させる工程；
（ｂ）前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させ、抗体の分離パターンを得る工程；
（ｃ）前記分離パターンにおける抗体の溶出時間と、当該時間における検出値との積の総和値を算出する工程；
（ｄ）前記工程（ｃ）で算出した総和値に基づき、前記被検者における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、および／または加齢の進行度合いを検出する工程。
［８］
抗体がヒト由来の抗体であり、Ｆｃ結合性タンパク質が以下の（１）から（３）のいず
れかのポリペプチドである、［１］から［７］のいずれかに記載の方法：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換されたポリペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンのフェニルアラニンへの置換を有し、さらに前記置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸配列において１７６番目のバリンのフェニルアラニンへの置換を有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、ただし前記置換を含むアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。

本発明によれば、試料中に含まれる抗体を、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を用いたアフィニティクロマトグラフィで分析する際、前記抗体を再現性高く分析できる。

Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル充填カラムで抗体を分析して得られる分離パターンの一例を示した図。 検体分析する前と後における、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル充填カラムで標準抗体を分析して得られる分離パターンの違いの一態様を示した図。 検体分析する前と後における、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル充填カラムで標準抗体を分析して得られる分離パターンの違いの別態様を示した図。 実施例６において、検体分析する前と後における、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル充填カラムで標準抗体を分析して得られる分離パターンの違いを示した図。（ａ）がヒトミエローマ血漿由来ＩｇＧ３（ｍＩｇＧ３）を標準抗体としたときの、（ｂ）がヒトミエローマ血漿由来ＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１）を標準抗体としたときの、（ｃ）がヒト血漿由来ＩｇＧ１（ｐＩｇＧ１）を標準抗体としたときの、それぞれ結果である。 実施例７における、標準抗体と血清サンプルとの測定間隔を示した図。 検体分析する前と後における、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル充填カラムで標準抗体としてヒトミエローマ血漿由来ＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１）を分析して得られる分離パターンの違いを示した図。 実施例８において、溶出時間の補正をそれぞれ行った血液サンプルの測定１回目および５０回目における、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル充填カラムで血液サンプルを分析して得られる分離パターンの違いを示した図。 実施例８において、標準物質のピーク溶出時間と、標準物質のピーク溶出時間から基準値となる検体分析する前における標準物質のピーク溶出時間を差し引いた値をプロットし、当該プロットを最小二乗法による単回帰式から得られた近似線の一例を示した図。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明において、「Ｆｃ結合性タンパク質」とは、試料中に含まれる抗体のＦｃ領域に対する結合能を有し、かつ抗体の糖鎖構造（例えば、Ｆｃ領域の糖鎖構造）の違いを認識できるポリペプチドを意味する。Ｆｃ結合性タンパク質は、そのようなポリペプチドであれば、特に制限はない。例えば、前記抗体がヒト由来の抗体である場合、Ｆｃ結合性タン
パク質として、ヒトＦｃ結合性タンパク質が挙げられる。ヒトＦｃ結合性タンパク質の好ましい例として、ヒトＦｃレセプターが挙げられる。ヒトＦｃレセプターには、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対するレセプターであるヒトＦｃγレセプター、ヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）に対するレセプターであるヒトＦｃαレセプター、ヒト免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）に対するレセプターであるヒトＦｃδレセプター、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対するレセプターであるヒトＦｃεレセプター等が挙げられるが、いずれのレセプターも本発明におけるヒトＦｃ結合性タンパク質として利用可能である。なお、本明細書において、「ヒト由来の抗体」とは、少なくともヒト由来のＦｃ領域を有した免疫グロブリンを意味する。ヒト由来の抗体は、ヒト抗体であってもよく、ヒト化抗体であってもよく、キメラ抗体であってもよい。

ヒトＦｃγレセプターの具体例として、ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ヒトＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ヒトＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ヒトＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、またはヒトＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）の細胞外領域の部分配列を少なくとも含むポリペプチド、ならびに当該ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の一部を置換、欠失、挿入、および／または付加したポリペプチドが挙げられる。中でも、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域の部分配列を少なくとも含むポリペプチドや、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の一部を置換、欠失、挿入、および／または付加したポリペプチドが、本発明でヒトＦｃ結合性タンパク質として用いるヒトＦｃγレセプターとして好ましい。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域の部分配列を少なくとも含むポリペプチドや、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の一部を置換、欠失、挿入、および／または付加したポリペプチドの具体例として、以下の（１）から（３）に記載のポリペプチドが挙げられる。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換されたポリペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンのフェニルアラニンへの置換を有し、さらに前記置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸配列において１７６番目のバリンのフェニルアラニンへの置換を有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、ただし前記置換を含むアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。

前記（１）に記載のポリペプチドの一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目から１９９番目までのアミノ酸残基を含むポリペプチドや、特開２０１８−１９７２２４号公報に開示のポリペプチド（Ｆｃ結合性タンパク質）が挙げられる。また前記（２）に記載の置換、欠失、挿入、および付加の例として、特開２０１５−０８６２１６号公報、特開２０１６−１６９１６７号公報、および特開２０１７−１１８８７１号公報に開示されているアミノ酸残基の置換が挙げられる。

前記（３）において、「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味する。相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等のアラインメントプログラムを用いて決定できる。例えば、「アミノ酸配列の同一性」とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメ
ータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。相同性は、７０％以上であればよく、８０％以上、９０％以上、または９５％以上であってもよい。

本発明において、「不溶性担体」とは、当該担体を充填したカラムに通液される液体（例えば、平衡化液や溶出液等の、抗体の吸着または溶出に用いる液体）に対して不溶性の担体を意味する。「担体が液体に対して不溶性」とは、液体への担体の溶解度が２０℃において１００ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、または約０ｍｇ／Ｌであることを意味してよい。不溶性担体は、Ｆｃ結合性タンパク質を共有結合で固定化するための官能基（例えばヒドロキシ基）を備えていてよい。不溶性担体としては、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ビニルポリマー等の合成有機高分子物質に由来した担体が挙げられる。

Ｆｃ結合性タンパク質の不溶性担体への固定化は、例えば、当該担体表面に存在する、Ｆｃ結合性タンパク質と共有結合で固定化可能な官能基を利用して実施できる。例えば、不溶性担体表面にヒドロキシ基が存在する場合、活性化剤を用いて当該ヒドロキシ基からＦｃ結合性タンパク質と共有結合可能な活性化基を形成することで、当該活性化基とＦｃ結合性タンパク質とを共有結合できる。ヒドロキシ基に対する活性化剤の具体例として、エピクロロヒドリン（活性化基としてエポキシ基を形成）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（活性化基としてエポキシ基を形成）、トレシルクロリド（活性化基としてトレシル基を形成）、ビニルブロミド（活性化基としてビニル基を形成）が挙げられる。また、ヒドロキシ基をアミノ基やカルボキシ基等に変換した後、活性化剤を作用させて活性化することもできる。アミノ基やカルボキシ基等に対する活性化剤の具体例として、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（活性化基としてマレイミド基を形成）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（活性化基としてカルボニルイミダゾール基を形成）、ハロゲン化酢酸（活性化基としてハロゲン化アセチル基を形成）が挙げられる。

本発明における分析対象の抗体は、少なくとも糖鎖が付加されたＦｃ領域を含む免疫グロブリンであればよく、他の領域を含んでいてもよい。また、本発明における分析対象の抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれであってもよい。ただし、Ｆｃ結合性タンパク質としてＦｃレセプターを用いる場合は、本発明における分析対象の抗体は、当該レセプターに対応した免疫グロブリンである必要がある。例えば、Ｆｃ結合性タンパク質としてヒトＦｃγレセプターを用いる場合は、本発明における分析対象の抗体は、ヒト由来のＩｇＧであり、特にヒトＩｇＧであってよい。なお、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のいずれであってもよい。

抗体の由来は特に制限はなく、抗体は、単一の生物に由来するものであってもよく、２種またはそれ以上の生物の組み合わせに由来するものであってもよい。抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはそれらのバリアント（例えばアミノ酸置換体）であってもよい。また、抗体としては、二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）、Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合抗体、Ｆｃ領域と薬物との複合体（ＡＤＣ）等の人工的に構造改変した抗体も挙げられる。さらに、抗体医薬も本発明における「抗体」に包含される。抗体医薬の一例として、抗ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）抗体であるインフリキシマブや抗ＩＬ−６（インターロイキン６）抗体であるトシリズマブ、癌遺伝子ＨＥＲ２に対する抗体であるトラスツズマブが挙げられる。中でも、本発明の分析方法は、後述する体液由来の抗体の分析に好適な分析方法である。

本発明において「試料」とは、前述した抗体を含むまたは含み得る溶液のことを意味する。試料は、例えば、被検者から得られたものであってよい。試料の一例として、前述した抗体を含むもしくは含み得る体液または緩衝液が挙げられる。よって、抗体は、例えば、体液に由来するものであってよい。前記体液の例として、被検者から得られた、
血液（全血）、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液等の血液検体（血液試料）；
尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水等の血液由来成分を含み得る検体（試料）；
肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節等の組織の断片（組織片）もしくは細胞を含み得る検体（試料）；
それらから分離された抗体またはそれらに含有される抗体を含み得る検体（試料）；
が挙げられる。なお、前記被検者は、単に測定の対象とするヒト個体、またはリスクの検出の対象とするヒト個体を意味する。被検者は、それに由来する試料を利用できるもの（すなわち抗体試料を取得できるか、既に取得したもの）であれば、特に制限されない。被検者は男性でもよく女性でもよい。また、被検者は、子供、若者、中年、老人等、いずれの年代の個体であってもよい。さらに、被検者は、健常者であってもよく、そうでなくてもよい。

本発明の分析方法は、試料中に含まれる抗体を以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む方法で分析することを特徴としている。すなわち、本発明の分析方法は、以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、試料中に含まれる抗体の分析方法である：
（ａ）Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに試料を添加し、当該試料中に含まれる抗体を前記担体に吸着させる工程（以下、「吸着工程」とも表記する）；
（ｂ）前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させ、抗体の分離パターンを得る工程（以下、「分離工程」とも表記する）；および
（ｃ）前記分離パターンにおける抗体の溶出時間と当該時間における検出値との積を総和した値を算出する工程（以下、「解析工程」とも表記する）。

以下、各工程を詳細に説明する。

（ａ）吸着工程
吸着工程は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに抗体を含む試料を添加し、当該抗体を前記担体に吸着させる工程である。

吸着工程に供される試料は、複数種類の抗体分子を含む混合溶液であってもよい。吸着工程に供される試料は、具体的には、糖鎖構造の異なる複数種類の抗体分子を含む混合溶液であってもよい。吸着工程に供される試料は、より具体的には、Ｆｃ領域に付加された糖鎖構造の異なる複数種類の抗体分子を含む混合溶液であってもよい。

なお、試料として体液を用いる場合、そのままカラムに添加してもよいし、適宜前処理に供してからカラムに添加してもよい。前処理を行なう場合、例えば、遠心分離やカラムによる精製といった、当業者が通常行なう方法により実施すればよい。体液または前処理後の体液は、適宜液体媒体で溶解、懸濁、分散、または溶媒交換等した後、カラムに添加してもよい。前記液体媒体の例として、後述する平衡化液が挙げられる。本発明において、「体液」には、このように前処理や溶媒交換等の処理がなされたものも包含される。

Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムへの、抗体を含む試料の添加は、例えば、ポンプ等の送液手段を用いて添加すればよい（以降、本明細書では、液体をカラムに添加することを「液体をカラムに送液する」とも表記する）。抗体を含む試料の添加（送液）量、液相の種類、液相の送液速度、カラム温度等の吸着工程の実施条
件は、抗体が前記担体に吸着される限り、特に制限されない。吸着工程の実施条件は、抗体の種類、Ｆｃ結合性タンパク質の種類、不溶性担体の種類、カラムのスケール等の諸条件に応じて適宜設定できる。液相としては、後述する平衡化液が例示できる。送液速度は、例えば、カラムの内径が４．６ｍｍの場合に、０．１ｍＬ／分から２．０ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分から１．５ｍＬ／分、または０．４ｍＬ／分から１．２ｍＬ／分であってよい。送液速度は、例えば、カラムの内径の２乗に比例するように設定してよい。カラム温度は、例えば、０℃から５０℃の範囲で適宜設定してよい。

吸着工程前および／または吸着工程後に、平衡化液をカラムに添加（送液）する平衡化工程をさらに実施してもよい。特に、吸着工程後に平衡化工程を実施すると、Ｆｃ結合性タンパク質に結合しない抗体や、試料雰囲気下では前記タンパク質に結合するが平衡化緩衝液雰囲気下では結合しない抗体を、カラムから排除できる点で好ましい。そのようにして排除される、抗体を含む画分のことを、本明細書では「未吸着画分」とも表記する。未吸着画分は、具体的には、後述する分離パターンにおいて、試料をカラムに添加（送液）後、検出されるピークが平衡化工程中に最小値を取るまでの領域の画分である。未吸着画分と、後述する分離工程で溶出液添加後に検出されるピークとは、溶出時間として離れている方が分離精度が高く、好ましい。特に、未吸着画分と溶出液添加後に検出されるピーク領域との間の検出値が一定値を取っていると、平衡化工程により未吸着画分がカラムから十分に除かれたことがわかり好ましい。ここでいう「一定値」とは、同一の値に限られず、検出値が一定の傾きをもって変化する状態をも包含する。

平衡化液の例として水性緩衝液が挙げられる。水性緩衝液として、具体的には、ｐＨ５．０から８．０の弱酸性から弱アルカリ性緩衝液が例示できる。緩衝液の成分は、緩衝液のｐＨ等の諸条件に応じて適宜選択できる。緩衝液の成分としては、リン酸、酢酸、ギ酸、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、クエン酸、コハク酸、グリシン、ピペラジンが例示できる。なお、前記緩衝液に、塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩をさらに添加してもよい。当該塩は、同業者が容易に想定し得る塩であれば特に限定されない。

（ｂ）分離工程
分離工程は、前記（ａ）の工程で不溶性担体に吸着した抗体を、溶出液を用いて溶出させ、当該抗体の分離パターンを得る工程である。すなわち、カラムに溶出液を添加（送液）することで、担体に吸着した抗体を溶出できる。溶出液の種類、溶出液の送液形式、液相の送液速度、カラム温度等の溶出工程の実施条件は、所望の態様で抗体が分離される限り、例えば、所望の分離パターンが得られる限り、特に制限されない。溶出工程の実施条件は、抗体の種類、Ｆｃ結合性タンパク質の種類、不溶性担体の種類、カラムのスケール等の諸条件に応じて適宜設定できる。溶出液としては、抗体とＦｃ結合性タンパク質との親和性を弱めるものを用いればよい。溶出液としては、例えば、溶出前の液相（例えば、平衡化工程を行なう場合は当該工程で用いた平衡化液）よりもｐＨが酸性側の水性緩衝液が挙げられる。具体例として、溶出前の液相（例えば、平衡化液）がｐＨ５．０からｐＨ８．０の弱酸性から弱アルカリ性緩衝液である場合は、ｐＨ２．５からｐＨ４．５の酸性緩衝液を溶出液として用いればよい。緩衝液の成分は、緩衝液のｐＨ等の諸条件に応じて適宜選択できる。緩衝液の成分としては、リン酸、酢酸、ギ酸、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、クエン酸、コハク酸、グリシン、ピペラジンが挙げられる。溶出液の送液形式は、液相中の溶出液の比率を連続的に変化させて溶出させるリニアグラジエント（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）溶出であってもよく、前記比率を段階的に変化させて溶出させるステップワイズ（ｓｔｅｐｗｉｓｅ）溶出であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。グラジエントは、例えば、１０
分から６０分、１５分から５０分、または２０分から４０分で液相中の溶出液の比率が０％（ｖ／ｖ）から１００％（ｖ／ｖ）に増大するように設定してよい。送液速度は、例えば、カラムの内径が４．６ｍｍの場合に、０．１ｍＬ／分から２．０ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分から１．５ｍＬ／分、または０．４ｍＬ／分から１．２ｍＬ／分であってよい。送液速度は、例えば、カラムの内径の２乗に比例するように設定してよい。カラム温度は、例えば、０℃から５０℃の範囲で適宜設定してよい。

カラムから溶出した抗体を検出器を用いて検出することで、抗体の分離パターンが得られる。前記検出器としては、ＵＶ検出器や質量検出器が例示できる。抗体の分離パターンとしては、抗体の溶出時のクロマトグラムが例示できる。検出器による測定データの取得間隔は任意の時間間隔でよいが、時間間隔が広がることで抗体の分離パターンの本来の特徴をクロマトグラムに反映する際の精度が低下するため、時間間隔は１分以下が好ましく、１０秒以下がさらに好ましく、さらに２秒以下が特に好ましい。

分離工程により、試料中に含まれる抗体が分離された態様で得られる。分離された抗体は、例えば、当該抗体を含有する溶出画分として得てもよい。すなわち、分離された抗体を含有する溶出画分を分取することにより、分離された抗体が得られる。溶出画分は、例えば、常法により分取できる。溶出画分は、具体的には、例えば、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等により分取できる。さらに、分離された抗体を溶出画分から回収してもよい。分離された抗体は、例えば、常法により溶出画分から回収できる。分離された抗体は、具体的には、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法により溶出画分から回収できる。

（ｃ）解析工程
解析工程は、前記（ｂ）の工程で得られた分離パターンにおける抗体の溶出時間と当該時間における検出値との積を総和した値を算出する工程である。本発明の分析方法は、前記（ｂ）の工程により得られた分離パターンを基に、抗体の溶出時間と、当該時間における検出値との積の総和値を算出することを特徴としている。以降、前記総和値を、「分離パターンの特徴値」とも表記する。

総和する領域として、任意の解析開始時間から任意の解析終了時間までの領域が挙げられる。解析開始時間は特に限定はなく、例えば、カラムへの試料添加（送液）時でもよく、カラムへの溶出液添加（送液）時でもよい。解析開始時間は、カラムに充填したＦｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体に結合しない非吸着画分のピークから、当該担体に結合した抗体由来の分離ピークが得られるまでの間に設定すると好ましい。解析終了時間は特に限定はなく、例えば、測定終了時間でもよく、カラムへの溶出液の添加（送液）割合が１００％になった時間でもよい。解析終了時間は、前記（ａ）の工程前に平衡化工程を行なう場合は、前記カラムに充填したＦｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体に結合した抗体由来の分離ピークが得られた後の時間から、前記カラムを溶出液で洗浄後、平衡化液に切り替えて当該カラムを平衡化する際、当該切り替わりに伴い発生する、検出値の変動が得られるまでの間に設定すると好ましい。

解析工程で用いる溶出時間は、任意の時点から溶出時までに経過した時間の値であってよい。解析工程で用いる溶出時間は、例えば、カラムへの試料添加（送液）時からの値でもよく、カラムへの溶出液添加（送液）時からの値でもよく、解析開始時点からの値でもよい。また、解析工程で用いる溶出時間は、任意の時点から溶出時までに経過した時間を反映する限り、特定の時間から溶出時間を引いた、溶出時間を累乗した値、溶出時間に係数を掛け合わせた値等の、上記のような溶出時間から算出される値であってもよい。

抗体の溶出時間と当該時間における検出値との積の総和値は、一定の時間間隔の溶出時
間に対する検出値との積の総和でもよく、不規則な時間間隔の溶出時間に対する検出値との積の総和でもよく、連続した溶出時間に対する検出値との積の総和（積分）でもよい。前記時間間隔は、例えば、検出値のデータ取得間隔であってよい。また、前記時間間隔は、例えば、秒単位でもよく、分単位でもよい。時間間隔が広がることで抗体の分離パターンの特徴を数値に反映する際の精度が低下するため、1分以下の時間間隔での総和値を求めるのが好ましい。総和値は、例えば、溶出時間と実測定した検出値との積の総和値であってもよく、近似曲線で関数化した溶出時間と検出値との関係性の式から算出した総和値であってもよく、前記近似曲線を基に積分することで得た総和値であってもよい。

一例として、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体と強く結合する抗体の分離パターンでは、溶出時間が遅い領域に高い検出値を示すため、溶出時間と当該溶出時間における検出値との積の総和値（分離パターンの特徴値）は高い値を示す。一方、前記担体と弱く結合する抗体の分離パターンでは、溶出時間が早い領域に高い検出値を示すため、溶出時間と当該溶出時間における検出値との積の総和値（分離パターンの特徴値）は低い値を示す。

また、特定の時間から溶出時間を引いた値と、当該溶出時間における検出値との積の総和値を算出する場合、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体と強く結合する抗体の分離パターンでは低い値が算出され、前記担体と弱く結合する抗体の分離パターンでは高い値が算出される（逆相関）。そのため、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体と強く結合する抗体の量を強調させるデータを取得したい場合は、前記抗体の溶出時間と当該溶出時間における検出値との積の総和値を、分離パターンの特徴値として用いてもよい。

また、溶出時間と当該溶出時間における検出値との積の総和値を、検出値の総和値で除した値（本明細書では「形状正規化値」とも表記する）を、分離パターンの特徴値として用いてもよい。

さらに、抗体の溶出時間として、前記溶出時間を累乗した値を用いてもよい。すなわち、抗体の溶出時間を累乗した値と当該糖出時間における検出値との積の総和値を、分離パターンの特徴値として用いてもよい。前記累乗することで、総和値もしくは形状正規化値への溶出時間の影響が大きくなり、前記担体への抗体結合能の違いをより顕著に評価することが可能となる。一方で累乗することで、測定再現性を示す変動係数ＣＶ値が大きくなるため、累乗の回数（冪指数）は、１０以下が好ましく、７以下がより好ましい。

一方、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体と弱く結合する抗体の量を強調させるデータを取得したい場合は、特定の時間と前記抗体の溶出時間との差と、当該溶出時間における検出値との積の総和値を、分離パターンの特徴として用いればよく、特定の時間と前記抗体の溶出時間との差を累乗した値と、当該溶出時間における検出値との積の総和値を、分離パターンの特徴として用いてもよい。

総和値および／または形状正規化値から、ピーク分割値を換算してもよい。「ピーク分割値」とは、分離パターン中に出現する各ピークのパラメータを意味する。ピークのパラメータとしては、ピーク面積、ピーク面積％、ピーク幅、ピーク幅％、ピーク高さ、ピーク高さ％が挙げられ、特に、ピーク面積やピーク面積％が挙げられる。本発明における「第Ｎピーク」（Ｎは正の整数）とは、特記しない限り、溶出の開始後（例えば、グラジエントの開始後）にＮ番目に溶出するピークを意味してよい。例えば、本発明における「第１〜第３ピーク」とは、それぞれ、特記しない限り、溶出の開始後（例えば、グラジエントの開始後）に１〜３番目に溶出するピークを意味してよい。なお、ピークは、特に、ピーク面積％が１％以上のものであってもよい。言い換えると、「第Ｎピーク」（Ｎは正の
整数）とは、特に、溶出の開始後にＮ番目に溶出する、ピーク面積％が１％以上のピークを意味してもよい。例えば、「第１〜第３ピーク」とは、特に、それぞれ、溶出の開始後に１〜３番目に溶出する、ピーク面積％が１％以上のピークを意味してもよい。「ピーク面積％」とは、各ピーク（ピーク領域）の面積を、全ピークの面積の合計値で割った値（百分率）を意味する。また、「ピーク幅％」とは、各ピーク（ピーク領域）の幅を、全ピークの幅の合計値で割った値（百分率）を意味する。また、「ピーク高さ％」とは、各ピーク（ピーク領域）の高さを、全ピークの高さの合計値で割った値（百分率）を意味する。本発明における「ピーク領域」とは、ピークを有する領域であって、特定の溶出時間に挟まれた検出値の領域のことをいう。例えば、「第Ｎピーク領域」とは、第Ｎピークを有する領域であって、特定の溶出時間に挟まれた検出値の領域のことをいう。すなわち、例えば、「第１ピーク領域」とは、第１及び第２ピークの境界となる溶出時間（以下、境界時間とも記載）と当該境界時間より前の溶出時間の任意の値との間の検出値の領域のことをいう。前記溶出時間の任意の値とは、ベースライン補正を行った際の基準点であってもよく、溶出の開始時間であってもよく特に限定されないが、当該カラムに充填したＦｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体に結合しない非吸着画分のピークから、当該担体に結合した抗体由来の分離ピークが得られるまでの間に設定すると好ましい。また、「第２ピーク領域」とは、第１及び第２ピークの境界時間と第２及び第３ピークの境界時間との間の検出値の領域のことをいう。また、「第３ピーク領域」とは、第２及び第３ピークの境界時間と当該境界時間より後の溶出時間の任意の値との間の検出値の領域のことをいう。前記溶出時間の任意の値とは、ベースライン補正を行った際の基準点であってもよく、溶出の終了時間であってもよく特に限定されないが、前記カラムに充填したＦｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体に結合した抗体由来の分離ピークが得られた後の時間から、前記カラムを溶出液で洗浄後、平衡化液に切り替えて当該カラムを平衡化する際、当該切り替わりに伴い発生する、検出値の変動が得られるまでの間に設定すると好ましい。

各ピーク分割値を換算するために、各ピーク分割値と総和値および／または形状正規化値との関係式を求めるとよい。各ピーク面積は総和値から、各ピーク面積％は形状正規化値から、それぞれ換算すると相関性が高く好ましい。各ピーク分割値は、総和値および／または形状正規化値から直接的もしくは間接的に換算してもよい。間接的に換算する一例として、ピークが第１〜第３ピークからなる場合、第１ピーク面積％および第３ピーク面積％を前記関係式により直接的に換算した後、全ピーク面積％である１００から前記換算した値を除することで間接的に第２ピーク面積％を求めてもよい。

総和値および／または形状正規化値からの換算により、各ピーク分割値を精度よく算出することができる。総和値および／または形状正規化値からの換算により、例えば、ピークの分離が不明瞭な場合であっても、各ピーク分割値を精度よく算出することができる。算出した各ピーク分割値は、例えば、各ピーク分割値は、任意の用途に利用されてよい。

解析工程で用いる検出値としては、前記（ｂ）の工程で用いる検出器で得られた値を用いるとよい。前記（ｂ）の工程で用いる検出器で得られた値は、そのまま、あるいは適宜、ベースライン等を補正してから、検出値として用いてよい。

分離パターンの特徴の算出で用いる溶出時間や検出値は、標準物質で得られた分離パターンに基づく補正や被検者の性質に基づく補正等の、補正がなされていてもよい。標準物質で得られた分離パターンに基づく補正を行なう場合、当該標準物質として標準抗体を用いると、測定再現性が向上するため好ましい。前記標準抗体は、不溶性担体に固定化されたＦｃ結合性タンパク質に吸着する抗体であればよい。前記標準抗体として、具体的には、Ｆｃ結合性タンパク質がＦｃγレセプターの場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が挙げられる。前記標準抗体は、試料中に含まれる抗体と同一由来の抗体であると
好ましい。一例として、試料中に含まれる抗体がヒト由来の抗体である場合、標準抗体は、ヒト由来の抗体であるのが好ましく、例えば、ヒト血液由来でもよく、ヒトミエローマ由来でもよく、ヒト培養細胞由来でもよく、特に限定されない。

溶出時間の補正は、例えば、基準となる標準抗体の分離パターン（以下、「標準抗体の第１の分離パターン」とも表記する）から得られる溶出時間と、別途測定した標準抗体の分離パターン（以下、「標準抗体の第２の分離パターン」とも表記する）から得られる溶出時間との差異（すなわち、標準抗体の溶出時間の変動）に基づいて実施してよい。これにより、例えば、カラムの長期間および／または多数回の使用に伴って生じ得る抗体の溶出時間の変動を補正できる。標準抗体の第１の分離パターンは、前記（ａ）の工程の前の任意の測定で得られた標準抗体の分離パターンであってよい。すなわち、標準抗体の第１の分離パターンは、前記（ａ）の工程の前に標準抗体を分析して得られた標準抗体の分離パターンであってよい。標準抗体の第２の分離パターンは、試料の分析（すなわち、前記（ａ）および（ｂ）の工程）の前または後に標準抗体を分析して得られた標準抗体の分離パターンであってよい。すなわち、標準抗体の第２の分離パターンの取得は、試料の分析の前または後に実施されてよい。標準抗体の第２の分離パターンの取得は、試料の分析と近い時期に実施されるのが、溶出時間の補正の精度が向上し得る点で好ましい。標準抗体の第２の分離パターンの取得と試料の分析との間隔（すなわち、標準抗体の第２の分離パターンの取得と試料の分析との間に含まれる任意の対象物の分析の回数）は、１０回以内、７回以内、５回以内、３回以内、２回以内、または１回以内であってもよく、ゼロ回（すなわち、標準抗体の第２の分離パターンの取得が試料の分析の直前または直後に実施される）であってもよい。標準抗体の第２の分離パターンの取得は、特に、試料の分析の直前または直後に実施されてよい。標準抗体の第２の分離パターンの取得が試料の分析の直前または直後に実施される場合としては、標準抗体の分析と試料の分析が交互に実施される場合が挙げられる。標準抗体の第１の分離パターンから得られる溶出時間と、標準抗体の第２の分離パターンの溶出時間との差異を、ピーク時間や任意の検出値における溶出時間などから求め、溶出時間の補正に用いてよい。前記補正は、１点の溶出時間の差異に基づいて実施してもよいが、２点以上の溶出時間の差異から当該点を結んだ線もしくは関係式である最小二乗法を含む近似線に基づいて実施すると好ましく、さらに３点以上の溶出時間の差異から前記関係式に基づいて実施するとさらに好ましい。前記溶出時間の点は、前記標準抗体の分離パターンからデータ処理上抽出しやすいピークまたは谷（微分値０の点）の溶出時間とすると、再現性高く補正できるため好ましい。検出値としては、例えば、特定の抗体量で得られた補正抗体による分離パターンの面積値が挙げられる。標準抗体溶液の分析については、試料に代えて標準抗体溶液を用いること以外は、試料の分析（すなわち、前記（ａ）および（ｂ）の工程）についての記載を準用できる。

すなわち、本発明の分析方法は、例えば、さらに、以下の（Ａ）から（Ｄ）の工程を含んでいてよい：
（Ａ）前記（ａ）の工程の前に、前記カラムに標準抗体溶液を添加して当該標準抗体を当該担体に吸着させ、当該担体に吸着した標準抗体を前記溶出液を用いて溶出させ、標準抗体の第１の分離パターンを得る工程；
（Ｂ）前記（ａ）および（ｂ）の工程の前または後に、前記（Ａ）の工程を再度実施し、標準抗体の第２の分離パターンを得る工程；
（Ｃ）前記第１の分離パターンにおける標準抗体の溶出時間と、前記第２の分離パターンにおける標準抗体の溶出時間とを比較する工程；および
（Ｄ）前記（Ｃ）の比較結果に基づき、前記（ｂ）で得られた分離パターンにおける抗体の溶出時間を補正する工程。

標準抗体の分析で得られた分離パターンに基づく、溶出時間の補正方法の具体例として、抗体を含む検体（例えば、体液）を分析する前に標準抗体溶液を分析して標準抗体の第
１の分離パターンを取得し、抗体を含む検体の分析前または分析後（例えば、直前または直後）に標準抗体溶液を再度分析して標準抗体の第２の分離パターンを取得し、前記第１および第２の分離パターン（特に、標準抗体の溶出時間）を比較し、前記比較結果に基づき抗体の溶出時間（例えば、ピーク時間）を補正する方法が挙げられる。

また、分離パターンの特徴は、被検者の性質に基づき補正してもよい。当該補正の例として、被検者の年齢に基づく補正が挙げられる。例えば、分離パターンの特徴が被検者の年齢に影響を受ける場合、得られた分離パターンの特徴を被検者の年齢に基づいて補正してから、後述する検出工程に用いてもよい。被検者の年齢に基づいて補正された特徴は、例えば、加齢以外の症状についてのリスクの検出に利用でき得る。

本発明の分析方法は、さらに、下記（ｄ）の工程を含んでいてよい：
（ｄ）前記（ｃ）の工程で算出した総和値に基づき、被検者における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、および／または加齢の進行度合いを検出する工程（以下、「検出工程」とも表記する）。

具体的には、試料が被検者から得たものである場合、本発明の分析方法は、前記（ｄ）の工程を含んでいてよい。本発明の分析方法が前記（ｄ）の工程を含む場合、試料（検体）を提供した被検者における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、および／または加齢の進行度合いを検出できる。すなわち、本発明の分析方法の一態様は、被検者（具体的には、試料を提供した被検者）における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、および／または加齢の進行度合いの検出方法（以下、単に「本発明の検出方法」とも表記する）であってよい。

（ｄ）検出工程
検出工程は、前記（ｃ）の工程で算出した総和値（分離パターンの特徴）を指標として、被検者におけるリスク（すなわち、疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、および／または加齢の進行度合い）を検出する工程である。

疾患の例として、免疫細胞の活性（例えば、損傷作用や貪食作用）に影響を受ける疾患が挙げられる。前記免疫細胞としては、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージが例示できる。免疫細胞の活性に影響を受ける疾患として、具体的には、ガン、自己免疫疾患、感染症、アレルギー、炎症疾患が例示できる。

ガンの例として、脳腫瘍、乳ガン、子宮体ガン、子宮頚ガン、卵巣ガン、食道ガン、胃ガン、虫垂ガン、大腸ガン、肝ガン、胆嚢ガン、胆管ガン、膵ガン、副腎ガン、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、中皮腫、頭頚部ガン、腎ガン、肺ガン、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、前立腺ガン、精巣腫瘍、腎細胞ガン、膀胱ガン、横紋筋肉腫、皮膚ガン、肛門ガンが挙げられる。ガンの例として、中でも、膵ガン、胃ガン、乳ガン、大腸ガン、腎ガンが挙げられる。

自己免疫疾患の例として、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、多発性硬化症、慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性膵炎、高安動脈炎、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病、橋本病、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病、１型糖尿病、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、天疱瘡、膿疱性乾癬、尋常性乾癬、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、尋常性白斑、サットン後天性遠心性白斑・サットン母斑、原田病、自己免疫性視神経症、自己免疫性内耳障害、特発性無精子症、習慣性流産、リウマチ、全身性エリテ
マトーデス、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、シェーグレン症候群、ＩｇＧ４関連疾患、血管炎症候群、混合性結合組織病が挙げられる。自己免疫疾患の例として、中でも、リウマチやシェーグレン症候群が挙げられる。

感染症の例として、細菌感染症、真菌感染症、寄生性原虫感染症、寄生性蠕虫感染症、ウイルス感染症が挙げられる。細菌感染症の例として、レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腸球菌、リステリア、髄膜炎菌、淋菌、病原性大腸菌、クレブシエラ、プロテウス、百日咳菌、緑膿菌、セラチア、シトロバクター、アシネトバクター、エンテロバクター、マイコプラズマ、クロストリジウム、リケッチア、クラミジア等の各種細菌による感染症；結核、非結核性抗酸菌症、コレラ、ペスト、ジフテリア、赤痢、猩紅熱、炭疽、梅毒、破傷風、ハンセン病、レジオネラ肺炎、レプトスピラ症、ライム病、野兎病、Ｑ熱が挙げられる。真菌感染症の例として、アスペルギルス症、カンジダ症、クリプトコッカス症、白癬菌症、ヒストプラズマ症、ニューモシスチス肺炎（カリニ肺炎）が挙げられる。寄生性原虫感染症の例として、アメーバ赤痢、マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症、クリプトスポリジウム症が挙げられる。寄生性蠕虫感染症の例として、エキノコックス症、日本住血吸虫症、フィラリア症、回虫症、広節裂頭条虫症が挙げられる。ウイルス感染症の例として、インフルエンザ、ウイルス性肝炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性結膜炎、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、成人Ｔ細胞白血病、エボラ出血熱、黄熱、風邪症候群、狂犬病、サイトメガロウイルス感染症、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）、進行性多巣性白質脳症、水痘・帯状疱疹、単純疱疹、手足口病、デング熱、日本脳炎、伝染性紅斑、伝染性単核球症、天然痘、風疹、急性灰白髄炎（ポリオ）、麻疹、咽頭結膜熱（プール熱）、マールブルグ出血熱、腎症候性出血熱、ラッサ熱、流行性耳下腺炎、ウエストナイル熱、ヘルパンギーナ、チクングニア熱が挙げられる。感染症は、例えば、日和見感染症であってもよい。

アレルギーの例として、アナフィラキシーショック、アレルギー性鼻炎、結膜炎、気管支喘息、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、薬剤性溶血性貧血、顆粒球減少症、血小板減少症、グッドパスチャー症候群、血清病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ、糸球体腎炎、過敏性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、接触性皮膚炎、アレルギー性脳炎、移植拒絶反応、結核性空洞、類上皮細胞性肉芽腫が挙げられる。

炎症疾患の例として、ＩＬ−６やＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインにより誘導される疾患が挙げられる。炎症疾患の例として、具体的には、脳炎、骨髄炎、髄膜炎、神経炎、眼の炎症（涙腺炎、強膜炎、上強膜炎、角膜炎、脈絡網膜炎、網膜炎、脈絡網膜炎、眼瞼炎、結膜炎、ぶどう膜炎等）、耳の炎症（外耳炎、中耳炎、内耳炎等）、乳腺炎、心炎（心内膜炎、心筋炎、心膜炎等）、血管炎（動脈炎、静脈炎、毛細血管炎等）、呼吸器の炎症（副鼻腔炎、鼻炎、咽頭炎、喉頭炎、気管炎、気管支炎、細気管支炎、肺炎、胸膜炎、縦隔炎等）、口腔の炎症（口内炎、歯肉炎、歯肉口内炎、舌炎、扁桃炎、シラデン炎、耳下腺炎、口唇炎、歯髄炎、鼻炎等）、消化器の炎症（食道炎、胃炎、胃腸炎、腸炎、小腸炎、大腸炎、十二指腸炎、回腸炎、虫垂炎、直腸炎等）、皮膚炎、蜂巣炎、汗腺炎、関節炎、皮膚筋炎、筋炎、滑膜炎、腱炎、脂肪織炎、骨炎、骨髄炎、骨膜炎、腎炎、輸尿管炎、膀胱炎、尿管炎、卵巣炎、卵管炎、子宮内膜炎、子宮頸管炎、膣炎、外陰炎、精巣炎、精巣上体炎、前立腺炎、精嚢膀胱炎、亀頭炎、包皮炎、絨毛膜羊膜炎、臍帯炎、臍炎、肝炎、上行性胆管炎、胆嚢炎、膵炎、腹膜炎、下垂体炎、甲状腺炎、副甲状腺炎、副腎炎、リンパ管炎、リンパ節炎、悪液質、フレイル（虚弱）、サルコペニア、ロコモティブシンドローム等の加齢関連疾患が例示できる。炎症疾患の例として、中でも、膵炎が挙げられる。

検出工程においては、前記（ｃ）の工程で算出した分離パターンの特徴値を指標として、被検者における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、および／または加齢の進行度合いを検出してよい。すなわち、前記特徴値は、被検者における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、および／または加齢の進行度合いを検出するための指標として用いられるデータとみなしてよい。具体的には、被検者から得た抗体をＦｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムを用いて分離することで得られる分離パターンに基づき算出した分離パターンの特徴値を指標として、当該被検者における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、および／または加齢の進行度合いを検出できる。すなわち、本発明の分析方法または検出方法は、被検者から得た抗体を前記カラムを用いて分離することで得られる分離パターンの特徴値を指標として、当該被検者における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、および／または加齢の進行度合いを精度よく検出するための方法として提供してもよい。なお、本明細書では、疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、および／または加齢の進行度合いを総称して、単に「リスク」とも表記する。また、本明細書において「リスクの検出」および「リスクの評価」は、同義に用いられてよい。

被検者における発症リスクの検出としては、被検者において発症リスクがあるかないかの検出（定性的検出）や、被検者においてリスクが高いか低いかの検出（定量的検出）が挙げられる。

疾患の有無の検出としては、被検者が現在疾患を発症している可能性があるかないかの検出（定性的検出）や、被検者が現在疾患を発症している可能性が高いか低いかの検出（定量的検出）が挙げられる。

疾患の発症リスクの検出としては、被検者が将来疾患を発症する可能性または発症した場合に重症化する可能性があるかないかの検出（定性的検出）や、被検者が将来疾患を発症する可能性または発症した場合に重症化する可能性が高いか低いかの検出（定量的検出）が挙げられる。

疾患の進行度合いの検出としては、被検者における現在の疾患の進行度合い（例えば重症度）が大きいか小さいかの検出（定量的検出）が挙げられる。

加齢の進行度合いの検出としては、被検者における現在の加齢の進行度合い（例えば重症度）が大きいか小さいかの検出（定量的検出）が挙げられる。

すなわち、「被検者において発症リスクがある」とは、例えば、被検者が現在疾患を発症している可能性があること、被検者が将来疾患を発症する可能性があること、および／または被検者が将来疾患を発症した場合に重症化する可能性があることを意味してよい。一方、「被検者において発症リスクがない」とは、例えば、被検者が現在疾患を発症している可能性がないこと、被検者が将来疾患を発症する可能性がないこと、および／または被検者が将来疾患を発症した場合に重症化する可能性がないことを意味してよい。

また、「被検者において発症リスクが高い」とは、例えば、被検者が現在疾患を発症している可能性が高いこと、被検者が将来疾患を発症する可能性が高いこと、被検者が将来疾患を発症した場合に重症化する可能性が高いこと、被検者における現在の疾患の進行度合いが大きいこと、および／または被検者における現在の加齢の進行度合いが大きいことを意味してよい。一方、「被検者において発症リスクが低い」とは、例えば、被検者が現在疾患を発症している可能性が低いこと、被検者が将来疾患を発症する可能性が低いこと、被検者が将来疾患を発症した場合に重症化する可能性が低いこと、被検者における現在の疾患の進行度合いが小さいこと、および／または被検者における現在の加齢の進行度合
いが小さいことを意味してよい。

検出工程は、例えば、分離パターンの特徴値の高低を指標として実施できる。前記特徴値の高低は、例えば、前記（ｃ）の工程で算出した分離パターンの特徴値を所定の閾値と比較することにより決定できる。言い換えると、検出工程は、例えば、分離パターンから得られた特徴値を閾値と比較する工程を含んでいてよい。

すなわち、「分離パターンの特徴値が高い」とは、例えば、分離パターンの特徴値が閾値を基準として高いことを意味してよい。また、「分離パターンの特徴値が閾値を基準として高い」とは、例えば、分離パターンの特徴値が閾値以上であること、分離パターンの特徴値が閾値を超えていること、または分離パターンの特徴値が閾値よりも統計学的に有意に高いことを意味してよい。「分離パターンの特徴値が閾値を基準として高い」場合の具体例として、分離パターンの特徴値が閾値の１．０１倍以上、１．０２倍以上、１．０３倍以上、１．０５倍以上、１．０７倍以上、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、１．７倍以上、２倍以上、２．５倍以上、または３倍以上である場合が挙げられる。

一方、「分離パターンの特徴値が低い」とは、例えば、分離パターンの特徴値が閾値を基準として低いことを意味してよい。また、「分離パターンの特徴値が閾値を基準として低い」とは、例えば、分離パターンの特徴値が閾値以下であること、分離パターンの特徴値が閾値未満であること、または分離パターンの特徴値が閾値よりも統計学的に有意に低いことを意味してよい。「分離パターンの特徴値が閾値を基準として低い」場合の具体例として、分離パターンの特徴値が閾値の０．９９倍以下、０．９８倍以下、０．９７倍以下、０．９５倍以下、０．９３倍以下、０．９倍以下、０．８５倍以下、０．８倍以下、０．７倍以下、０．６倍以下、０．５倍以下、０．４倍以下、または０．３倍以下である場合が挙げられる。

分離パターンの特徴値は、例えば、閾値を基準に、危険範囲に区分されてよい。分離パターンの特徴値は、例えば、閾値を基準に、非危険範囲に区分されてよい。分離パターンの特徴値は、具体的には、例えば、閾値を基準に、危険範囲と非危険範囲とに区分されてもよい。「危険範囲」とは、分離パターンの特徴値について、被検者においてリスクがある可能性が高い範囲を意味してよい。「非危険範囲」とは、分離パターンの特徴値について、被検者においてリスクがない可能性が高い範囲を意味してよい。すなわち、分離パターンの特徴値が危険範囲にあれば、被検者においてリスクがある、またはリスクが高いことを検出してよい。一方、分離パターンの特徴値が非危険範囲にあれば、被検者においてリスクがない、またはリスクが低いことを検出してよい。

なお、「特定の分離パターンの特徴値が一定の基準を満たす（例えば、低いもしくは高い、または特定の範囲にある）場合に被検者においてリスクがある、ない、高い、または低いことを検出する」とは、少なくとも当該基準を満たす範囲において被検者においてリスクがある、ない、高い、または低いことを検出することを意味し、当該基準を満たさない範囲において被検者においてリスクが検出されることを要求しない。しかし、一態様においては、「特定の分離パターンの特徴値が一定の基準を満たす（例えば、低いもしくは高い、または特定の範囲にある）場合に被検者においてリスクがある、ない、高い、または低いことを検出する」場合、当該基準を満たさない範囲において、それぞれ、被検者においてリスクがない、ある、低い、または高いことを検出してもよい。

閾値は、例えば、分離パターンの特徴の種類や所望の判定精度等の諸条件に応じて、当業者が適宜設定できる。閾値は、例えば、疾患や加齢等の判定対象の症状ごとに設定されてよい。閾値を決定する手段は、特に制限されない。閾値は、例えば、集団を２群に区分
するためのデータ解析に利用される公知の手法に従って決定できる。

閾値は、例えば、対照被検者から得た抗体試料の、分離パターンの特徴値に基づいて決定できる（本明細書では、対照被検者から得た抗体試料の分離パターンを「対照分離パターン」とも表記する）。すなわち、対照分離パターンの特徴値に基づき、閾値を決定し、検出工程を実施してもよい。具体的には、対照分離パターンの特徴値を閾値の決定に用いることで、分離パターンの特徴値との比較に用いられてよい。言い換えると、検出工程では、例えば、分離パターンの特徴値と対照分離パターンの特徴値との比較を行なってもよい。

前記対照被検者としては、陽性対照や陰性対照が挙げられる。「陽性対照」とは、リスクがある、または高いと検出され得る被検者を意味してよい。「陰性対照」とは、リスクがない、または低いと検出され得る被検者を意味してよい。陽性対照としては、上記例示したような疾患（特に、リスクの検出対象となる疾患と同一の疾患）に罹患している、または罹患したことがある個体や、加齢が進行した個体、それらの組み合わせの性質を有する個体が挙げられる。陰性対照としては、上記例示したような疾患（特に、リスクの検出対象となる疾患と同一の疾患）に罹患していない、または罹患したことがない個体や、加齢が進行していない個体、それらの組み合わせの性質を有する個体が挙げられる。閾値は、陽性対照を分析し算出した分離パターンの特徴値のみに基づいて決定してもよく、陰性対照を分析し算出した分離パターンの特徴値のみに基づいて決定してもよく、陽性対照と陰性対照の両方を分析し算出した分離パターンの特徴値に基づいて決定してもよい。閾値は、通常は、陽性対照と陰性対照の両方を分析し算出した分離パターンの特徴値に基づいて決定すればよい。陽性対照と陰性対照の人数は、リスクの判定が所望の精度で可能となる閾値が得られる限り、特に制限されない。陽性対照と陰性対照の人数は、それぞれ、１人であってもよく、２人またはそれ以上であってもよい。陽性対照と陰性対照の人数は、それぞれ、通常、複数名であってよい。陽性対照と陰性対照の人数は、それぞれ、例えば、５人以上、１０人以上、２０人以上、または５０人以上であってもよい。陽性対照と陰性対照の人数は、それぞれ、例えば、１００００人以下、１０００人以下、または１００人以下であってもよい。

陽性対照を分析し算出した分離パターンの特徴値のみに基づいて閾値を決定する場合には、例えば、陽性対照の複数個体を分析し算出した分離パターンの特徴値の上限から下限までの範囲から選択される値、例えば平均値、を閾値として設定してもよい。また、例えば、陽性対照の複数個体を分析し算出した分離パターンの特徴値の分布において、陽性対照の所定の割合が危険範囲に含まれるように閾値を決定してもよい。所定の割合とは、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または１００％であってよい。

陰性対照を分析し算出した分離パターンの特徴値のみに基づいて閾値を決定する場合には、例えば、陰性対照の複数個体を分析し算出した分離パターンの特徴値の上限から下限までの範囲から選択される値、例えば平均値、を閾値として設定してもよい。また、例えば、陰性対照の複数個体を分析し算出した分離パターンの特徴値の分布において、陰性対照の所定の割合が非危険範囲に含まれるように閾値を決定してもよい。所定の割合とは、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または１００％であってよい。

陽性対照を分析し算出した分離パターンの特徴値と陰性対照を分析し算出し分離パターンの特徴値との両方に基づいて閾値を決定する場合には、例えば、陽性対照の所定の割合が危険範囲に含まれ、かつ、陰性対照の所定の割合が非危険範囲に含まれるように閾値を決定してもよい。陽性対照のうち危険範囲に含まれるものの割合、および、陰性対照のう
ち非危険範囲に含まれるものの割合は、いずれも高い方が好ましい。これらの割合は、それぞれ、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または１００％であってよい。これらの割合の両方を高くすることが困難な場合は、例えば、本発明による検出結果の利用目的等の諸条件に応じて、いずれかの割合が優先的に高くなるように閾値を設定してもよい。例えば、偽陰性率を下げるためには、陽性対照の内の危険範囲に含まれるものの割合が優先的に高くなるように閾値を設定してよい。

閾値の決定は、例えば、ソフトウェアを用いて実施してもよい。例えば、統計解析ソフトウェアを用い、陰性対照と陽性対照とを統計学的に最も適切に判別できるような閾値を決定してもよい。そのようなソフトウェアとしては、「Ｒ」等の統計解析ソフトウェアが挙げられる。

また、対照被検者としては、標的被検者自体も挙げられる。すなわち、例えば、被検者における分離パターンの特徴値の変動を指標として、被検者におけるリスクを検出してもよい。本明細書において「分離パターンの特徴値が高い」とは、分離パターンの特徴値が増大した場合も包含してよい。本明細書において「分離パターンの特徴値が増大した」とは、具体的には、分離パターンの特徴値が過去の値と比較して増大したことを意味してよい。また、本明細書において「分離パターンの特徴値が低い」とは、分離パターンの特徴値が低下した場合も包含してよい。本明細書において「分離パターンの特徴値が低下した」とは、具体的には、分離パターンの特徴値が過去の特徴値と比較して低下したことを意味してよい。すなわち、閾値としては、過去の特徴値も挙げられる。本明細書において「過去の特徴値」とは、標的被検者から過去の特定時点で得た抗体試料の分離パターンの特徴値を意味する。過去の特定時点における標的被検者は、例えば、陽性対照であってもよく、陰性対照であってもよい。

被検者における分離パターンの特徴値の変動を指標として、被検者におけるリスクの増減を検出してもよい。本明細書において「リスクがある、または高い」とは、リスクが増大した場合も包含してよい。本明細書において「リスクが増大した」とは、具体的には、リスクが過去の特定時点と比較して増大したことを意味してよい。一方、本明細書において「リスクがない、または低い」とは、リスクが低下した場合も包含してよい。本明細書において「リスクが低下した」とは、具体的には、リスクが過去の特定時点と比較して低下したことを意味してよい。

本明細書において「特定の分離パターンを得てリスクの検出の指標とする」とは、当該分離パターンの特徴値そのものを得てリスクの検出の指標とする場合に限られず、当該分離パターンの特徴値を反映する他の値を得て検出の指標とすることも包含する。

リスクの検出結果は、被検者に対してリスクを低減するための処置（以下、「リスク軽減処置」ともいう）を実施するかを決定するための指標として用いてもよい。言い換えると、本発明の検出方法を実施することで、被検者に対してリスク軽減処置を実施するかを決定するための指標が得られる。すなわち、例えば、本発明の検出方法により被検者においてリスクがある、または高いと検出された場合に、被検者に対してリスク軽減処置を実施すると決定してよい。本発明の検出方法は、例えば、単独で、または他の手段と組み合わせて、被検者に対してリスク軽減処置を実施するかを決定するための指標として用いてよい。例えば、本発明の検出方法により被検者においてリスクがある、または高いと検出された症状について、他の手段により確定診断を実施してから、被検者に対してリスク軽減処置を実施すると決定してもよい。リスク軽減処置は、医療行為であってもよく、非医療行為であってもよい。リスク軽減処置としては、前記例示したような疾患や加齢の予防や治療が挙げられる。すなわち、本発明は、例えば、疾患や加齢等の症状の予防または治療方法を提供してよい。予防または治療方法は、例えば、本発明の検出方法を実施する工
程、および本発明の検出方法により被検者においてリスクがある、または高いと検出された場合に、被検者に対して予防または治療を実施する工程を含む、疾患や加齢等の症状の予防または治療方法であってよい。具体的には、本発明の検出方法により被検者においてリスクがある、または高いと検出された症状について予防または治療を実施してよい。予防または治療は、例えば、各症状についての一般的な手段（例えば、投薬や外科手術）により実施できる。

本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに試料を添加し当該試料中に含まれる抗体を前記担体に吸着させる工程と、前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させ抗体の分離パターンを得る工程とを含む、試料中に含まれる抗体の分析方法であって、前記分離パターンにおける抗体の溶出時間と当該時間における検出値との積を総和した値を算出する工程をさらに含むことを特徴としている。

Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムによる抗体の分離パターンにおいて、試料によってはピーク間の明瞭な分離ができない場合や、ピーク数が異なる場合がある。そうなると、抗体分離パターンのピーク面積またはピーク面積％の再現性が得られず、他の試料との前記面積等の比較が困難となる。本発明の方法は、分離パターン全体の傾向として前記カラムに対して結合性の高い抗体が多く存在するか、または結合性の低い抗体が多く存在するかを数値化できる。Ｆｃ結合性タンパク質への結合能の高い抗体は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性が高いため、本発明の方法を用いれば抗体を含む試料全体のＡＤＣＣ活性を見積もれる。検出対象とする抗体の分離パターンを数値化することにより、例えば、被検者の抗体を特定の疾患や加齢等の症状についてのリスクに特徴的な分離パターンを、再現性高く数値化でき、基準となる分離パターンにおける数値化データと比較することで、前述したリスクを精度高く検出できる。また、疾患に対する何らかの処置（投薬、手術等）の前および／またはその後において分離パターンを取得して、基準となる分離パターンと比較することにより、疾患の治療経過のモニタリングや当該処置に対する方針決定の精度が向上する。基準となる分離パターンとしては、対照被検者の分離パターンが挙げられる。基準となる分離パターンとして、具体的には、同一被検者の別の時点（例えば、健常時や同一疾患を発症している時点）での分離パターン、健常者の分離パターン、同一疾患を発症している異なる患者の分離パターン、前記処置に対して奏効性の違いが得られる２群もしくはそれ以上の群に分ける際の基準となる分離パターンが挙げられる。

例えば、健常者（モデル）の分離パターンをモデル分離パターンとし、被験者の分離データをモデル分離パターンと比較することで、何らかの疾病を有するリスクや疾病を発症するリスク等を評価できる。さらに、モデルと被験者の分離パターンの差の要因となるピークの画分を分取することで、健常者（モデル）と被験者との抗体の糖鎖パターンの差を抽出できる。また、患者本人のある時点での分離パターンをモデル分離パターンとし、同一患者の別の時点での分離パターンとモデル分離パターンとを比較することで、当該患者の疾患のモニタリングが行なえる。なお、２つの異なる検体群を比較する場合、統計的確率（Ｐ値）を用いて２つの異なる検体群から得られた前記分離データの差が有意な差であるかを評価できる。Ｐ値が小さくなると、前記評価結果は有意になるといわれており、Ｐ値が有意水準未満の場合、前記評価結果は統計的に有意な差があるといえる。有意水準は一般的に５％である。

本発明によるＦｃ結合性タンパク質に対する抗体の親和性の強さは、当該抗体が結合した結合性物質に対する損傷または貪食作用を持つナチュラルキラー細胞および単球、マクロファージ等の免疫細胞の活性に影響を与えるため、当該親和性の違いを検出することで、ナチュラルキラー細胞および単球、マクロファージによる損傷もしくは貪食作用に影響を受ける疾患の発症リスクを評価できる。当該疾患としては、ガン、自己免疫疾患、感染
症、アレルギー、炎症疾患が挙げられる。感染症としては、日和見感染症が挙げられる。日和見感染症とは健康な状態では感染症を起こさないような病原体が原因で発症する感染症である。病原体としては、ウイルス、細菌、真菌、原虫が挙げられる。また、ワクチン接種や罹患によって獲得した抗体の免疫細胞に対する活性化への効果も、Ｆｃ結合性タンパク質に対する抗体の親和性の強さから評価できる。当該獲得した抗体の血液中の量を測定する他に、当該抗体のＦｃ結合性タンパク質に対する親和性の強さを測定することで、感染症に対する発症のリスクを精度よく予測することもできる。

以下、実施例および比較例を参照して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

実施例１ アフィニティクロマトグラフィカラム（ＦｃＲ９＿Ｆカラム）の作製
特開２０１８−１９７２２４号公報の方法で得られたＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を、以下に示す方法でゲルに固定化し、ＦｃＲ９＿Ｆカラムを作製した。なおＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ（配列番号２）において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までが改良ＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆ（特開２０１８−１９７２２４号公報）のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。また前記ＦｃＲ９＿Ｆは、配列番号１に示す天然型ＦｃγＲＩＩＩａの１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基であり、ただし以下の（Ｉ）から（Ｘ）に示すアミノ酸置換を有したポリペプチドである：
（Ｉ）配列番号１の２７番目（配列番号４では３４番目）のバリン（Ｖａｌ）をグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置換
（ＩＩ）配列番号１の２９番目（配列番号４では３６番目）のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）をイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換
（ＩＩＩ）配列番号１の３５番目（配列番号４では４２番目）のチロシン（Ｔｙｒ）をアスパラギン（Ａｓｎ）に置換
（ＩＶ）配列番号１の４８番目（配列番号４では５５番目）のグルタミン（Ｇｌｎ）をアルギニン（Ａｒｇ）に置換
（Ｖ）配列番号１の７５番目（配列番号４では８２番目）のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）をロイシン（Ｌｅｕ）に置換
（ＶＩ）配列番号１の９２番目（配列番号４では１０１番目）のアスパラギン（Ａｓｎ）をセリン（Ｓｅｒ）に置換
（ＶＩＩ）配列番号１の１１７番目（配列番号４では１２４番目）のバリン（Ｖａｌ）をグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置換
（ＶＩＩＩ）配列番号１の１２１番目（配列番号４では１２８番目）のグルタミン酸（Ｇｌｕ）をグリシン（Ｇｌｙ）に置換
（ＩＸ）配列番号１の１７１番目（配列番号４では１７８番目）のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）をセリン（Ｓｅｒ）に置換
（Ｘ）配列番号１の１７６番目（配列番号４では１８３番目）のバリン（Ｖａｌ）をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換。

（１）２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー社製：液体クロマトグラフィ用充填剤）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、特開２０１８−１９７２２４号公報の方法で得られたＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを４ｍｇ反応させることで、ＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲルを得た。

（２）（１）で作製したＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲル１．２ｍＬをφ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填してＦｃＲ９＿Ｆカラムを作製した。

実施例２ ＦｃＲ９＿Ｆカラムを用いた血清中の抗体分析（溶出時間補正なし１）
（１）インフォームドコンセントを得た被験者から採血した血液を遠心し、血清を得た。当該血清をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）で１０倍希釈後、０．２μｍ径のフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に通すことで血清サンプルを調製した。

（２）実施例１で作製したＦｃＲ９＿Ｆカラムを高速液体クロマトグラフィー装置（東ソー社製）に接続し、１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）（以下「平衡化液」とも表記）で平衡化後、（１）で調製した血清サンプルを流速１．０ｍＬ／ｍｉｎにて１０μＬ添加した。検出器による測定間隔は、１／５秒毎にデータを取得することで行った。

（３）流速１．０ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化液で１０分洗浄後、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）（以下「溶出液」とも表記）を用いたｐＨグラジエント（２５分で溶出液が１００％となるグラジエント）で吸着したガンマグロブリンを溶出し、分離パターンを得た。

（４）使用回数の異なるカラムを用いて、（２）および（３）の操作を合計３回行なった。

（５）（３）で得た分離パターン（図１）を、ｐＨグラジエントを開始した時間（溶出開始後１０分、解析開始時間Ｔ_ｓ）、およびｐＨグラジエントが終了した（すなわち溶出液が１００％となった）時間（溶出開始後３５分、解析終了時間Ｔ_ｆ）がともに検出値Ｉ_Ｔ＝０となるよう、ベースライン補正した。

（６）ベースライン補正した分離パターンから、下記式１を用いてガンマグロブリンの分離パターンにおける検出値の検出器による測定間隔と同じ１／５秒毎の総和値を、下記式２を用いてガンマグロブリン分離パターンの形状正規化値を、それぞれ求めた。

比較例１
（１）実施例２で用いた血清サンプルと同一の検体を用いて、実施例２（１）から（５）と同様な方法でガンマグロブリンの分離パターンを得、ベースライン補正した。

（２）図１の＜１＞領域から第１ピーク面積を算出し、当該第１ピーク面積を図１の＜１＞、＜２＞、および＜３＞領域の合計面積で割った値（百分率）から第１ピーク面積％を算出した。

実施例３ ＦｃＲ９＿Ｆカラムを用いた血清中の抗体分析（溶出時間補正なし２）
（１）ヒトミエローマ血漿由来ＩｇＧ３（ｍＩｇＧ３、Ｓｉｇｍａ社製）を０．２μｍ
径のフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に通すことで、標準抗体溶液を調製した。溶液中のタンパク濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ超微量分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で測定した。

（２）測定試料として（１）で調製した標準抗体溶液を用いた他は、実施例２（２）および（３）と同様な手順で分離パターンを得た。

（３）標準抗体溶液分析後、実施例２（２）および（３）と同様な手順で、実施例２（１）で調製した血清サンプルを分析し、ガンマグロブリンの分離パターンを得た。

（４）使用回数の異なるカラムを用いて、（２）および（３）の操作を合計３セット行なった。

（５）実施例２（５）と同様な方法でベースライン補正した。

（６）ベースライン補正した分離パターンから、下記式３を用いて標準抗体サンプルで補正したガンマグロブリンの分離パターンにおける検出値の検出器による測定間隔と同じ１／５秒毎の総和値を、前記式２を用いてガンマグロブリン分離パターンの形状正規化値を、それぞれ求めた。

実施例４ ＦｃＲ９＿Ｆカラムを用いた血清中の抗体分析（溶出時間補正あり１）
（１）実施例３（２）から（５）と同様な方法で、ベースライン補正したガンマグロブリンの分離パターンを得た。なお本実施例では、１セット目に標準抗体溶液を分析した結果から得られた分離パターンを基準値としている。

（２）下記式４および式５を用いて補正したガンマグロブリンの分離パターンにおける検出値の検出器による測定間隔と同じ１／５秒毎の総和値を、下記式５および式６を用いてガンマグロブリン分離パターンの形状正規化値を、それぞれ求めた。なお式４から式６の補正式は、図２に示すように、解析開始時間Ｔ_ｓは１セット目（基準値）と２セット目以降（補正対象）で差異は生じない一方、ピーク時間は基準値Ｔｃｓ_ｐと補正対象Ｔｃ_ｐで差異が生じると仮定して作成した式である。

実施例５ ＦｃＲ９＿Ｆカラムを用いた血清中の抗体分析（溶出時間補正あり２）
（１）実施例４（１）と同様な方法でガンマグロブリンの分離パターンを取得した。

（２）下記式７から式９を用いて補正したガンマグロブリンの分離パターンにおける検出値の検出器による測定間隔と同じ１／５秒毎の総和値を、式８から式１０を用いてガンマグロブリン分離パターンの形状正規化値を、それぞれ求めた。なお式７から式１０の補正式は、図３に示すように、解析開始時間、ピーク時間ともに基準値（解析開始時間Ｔｃｓ_ｓ、ピーク時間Ｔｃｓ_ｐ）と補正対象（解析開始時間Ｔｃ_ｓ、ピーク時間Ｔｃ_ｐ）とで差異が生じており、かつ基準値における解析終了時間Ｔｃｓ_ｆと補正対象における解析終了時間Ｔｃ_ｆとの差が、Ｔｃｓ_ｐとＴｃ_ｐとの差に等しいと仮定して作成した式である。

実施例２から５および比較例１の結果をまとめて表１に示す。表１では、同一血清サンプルを３回測定した際の値のばらつき（ＣＶ値［％］）で記載しており、当該値が小さい程、ばらつきが低く、測定再現性の高い結果といえる。

第１ピーク面積および面積％で解析した場合（比較例１）、ＣＶ値が１６．６％および１５．３％と大きくばらついた。一方、抗体の溶出時間（Ｔ−Ｔ_ｓ）と当該時間における検出値Ｉ_Ｔとの積の総和値、または当該総和値を検出値Ｉ_Ｔの総和値で除することで補正した形状正規化値で解析する（実施例２および３）と、ＣＶ値が改善し（ともに総和値で６．１％、形状正規化値で４．５％）、測定再現性が向上していることがわかる。比較例
１の解析方法では第１ピーク（図１の＜１＞）とその他のピーク（図１の＜２＞および＜３＞）との分割領域が明確でなく、ピーク面積値の算出にばらつきが生じやすいが、実施例２および実施例３の解析方法ではピークを分割することなく解析するため、比較例１の解析方法と比較し、ばらつきが生じにくいと考えられる。

標準抗体溶液におけるピーク時間Ｔｃｓ_ｐと、抗体を含む検体（血清サンプル）におけるピーク時間Ｔｃ_ｐとの差異に基づき、前記総和値を補正する（実施例４および実施例５）と、ＣＶ値がそれぞれ２．４％（実施例４）および２．７％（実施例５）となり、溶出時間による補正をしない場合（実施例２および実施例３）と比較し測定再現性が向上していることがわかる。血清サンプルを繰り返し測定をすると、カラム内の担体に前記サンプル由来のタンパク質が吸着したり、血清由来のプロテアーゼにより当該担体に結合したＦｃ結合性タンパク質が断片化されるおそれがあるため、同一検体を分析しても溶出時間が変化するおそれがある。そのため、溶出時間の補正を行なうことで測定再現性が向上したと考えられる。

標準抗体におけるピーク時間Ｔｃｓ_ｐと、抗体を含む検体（血清サンプル）におけるピーク時間Ｔｃ_ｐとの差異に基づき、前記形状正規化値を補正する（実施例４および実施例５）と、ＣＶ値がそれぞれ１．３％（実施例４）および０．４％（実施例５）となり、総和値から補正したときと比較して測定再現性がさらに向上した。特に実施例５において顕著にＣＶ値が低下した。このことから標準抗体溶液におけるピーク時間Ｔｃｓ_ｐと抗体を含む検体（血清サンプル）におけるピーク時間Ｔｃ_ｐとの差異が、当該検体中に含まれる抗体の分離パターン全体のずれに等しいという仮定が、解析開始時間Ｔ_ｓは１セット目（基準値）と２セット目以降（補正対象）で差異は生じない一方、ピーク時間は基準値Ｔｃｓ_ｐと補正対象Ｔｃ_ｐで差異が生じると仮定するより、標準抗体を用いた抗体を含む検体（血清サンプル）の溶出時間補正において測定再現性を向上させることがわかる。

実施例６ 標準抗体の検討
（１）ヒトミエローマ血漿由来ＩｇＧ３（ｍＩｇＧ３、Ｓｉｇｍａ社製）、ヒトミエローマ血漿由来ＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１、Ｓｉｇｍａ社製）およびヒト血漿由来ＩｇＧ１（ｐＩｇＧ１、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製）をそれぞれ０．２μｍ径のフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に通し、標準抗体溶液を調製した。溶液中のタンパク濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ超微量分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で測定した。

（２）（１）で調製したｍＩｇＧ３、ｍＩｇＧ１、ｐＩｇＧ１すべての標準抗体溶液を分析後、実施例２とは異なる血清サンプルを分析した他は、実施例４（１）と同様な方法で、ベースライン補正したガンマグロブリンの分離パターンを得た。

（３）標準抗体におけるピーク時間Ｔｃｓ_ｐとして、図４のパネル（ａ）に示すｍＩｇＧ３のピーク、図４のパネル（ｂ）に示すｍＩｇＧ１の第１／第２／第３／第４ピーク、ならびに図４のパネル（ｃ）に示すｐＩｇＧ１のピークのいずれかを用いた他は、実施例５（２）と同様な方法で、ガンマグロブリンの分離パターンにおける検出値の検出器による測定間隔と同じ１／５秒毎の総和値および形状正規化値を求めた。

結果を表２に示す。表２も表１と同様、同一血清サンプルを３回測定した際の値のばらつき（ＣＶ値［％］）で記載している。

総和値では、標準抗体におけるピークとしてｍＩｇＧ３またはｍＩｇＧ１第３ピークを選択したときにＣＶ値が低くなった（ｍＩｇＧ３：１．１％、ｍＩｇＧ１第３ピーク：１．２％）。また形状正規化値では、標準抗体におけるピークとしてｍＩｇＧ３、ｍＩｇＧ１第３ピークおよびｐＩｇＧ１のいずれかを選択したときにＣＶ値が低くなった（ｍＩｇＧ３：０．６％、ｍＩｇＧ１第３ピーク：０．４％、ｐＩｇＧ１：０．３％）。

本実施例で分析した、血清サンプル中に含まれる抗体は、由来がｐＩｇＧ１（血漿由来）と近い。そしてＩｇＧ３およびｍＩｇＧ１第３ピークのピーク時間は、ｐＩｇＧ１のピーク時間に比較的近い（図４）。このことから理論上は、抗体を含む検体の分離パターンにおける当該抗体の溶出時間近傍にある、ＩｇＧ３、ｍＩｇＧ１第３ピークおよびｐＩｇＧ１のいずれかのピーク時間の差異に基づき補正をすると、測定再現性が向上するといえる。一方で今回、ｐＩｇＧ１の総和値での結果が芳しくなかった（ＣＶ＝２．８％）。この原因として、今回用いたｐＩｇＧ１が溶出液導入前に溶出される未吸着画分の量が多く（図４のパネル（ｃ））、抗体を含む検体での総和値の補正に用いる、標準抗体での総和値にばらつきが発生したためと推測される。

実施例７ 標準抗体測定間隔の検討
（１）実施例２（１）で調製した血清サンプルを、以下の１）から３）に示すいずれかの方法で分析し、血清サンプルとして合計３０回分析した（図５）他は、実施例４（１）と同様な方法で、ベースライン補正したガンマグロブリンの分離パターンを得た。
１）血清サンプル連続６回分析：標準抗体溶液を１回測定後、血清サンプルを６回測定する操作を５サイクル実施した。
２）血清サンプル連続３回分析：標準抗体溶液を１回測定後、血清サンプルを３回測定する操作を１０サイクル実施した。
３）標準抗体と血清サンプルとの交互分析：標準抗体溶液を１回測定後、血清サンプルを１回測定する操作を３０サイクル実施した。

（２）標準抗体におけるピーク時間Ｔｃｓ_ｐとして、ｍＩｇＧ１の第３ピークを用いた他は、実施例５（２）と同様な方法で、ガンマグロブリンの分離パターンにおける検出値の検出器による測定間隔と同じ１／５秒毎の総和値および形状正規化値を求めた。

結果を表３に示す。表３は、同一血清サンプルを３０回測定した際の値のばらつき（Ｃ
Ｖ値）で記載している。総和値、形状正規化値とも、３）標準抗体と血清サンプルとの交互分析、が最も測定再現性が良かった（総和値：ＣＶ＝０．６％、形状正規化値：ＣＶ＝０．４％）。

実施例８ 溶出時間の補正方法の検討
（１）実施例１（１）で作製したＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲル０．８ｍＬをφ４．６ｍｍ×５０ｍｍのステンレスカラムに充填してＦｃＲ９＿Ｆカラムを作製した。

（２）実施例６（１）と同様な方法で標準抗体溶液であるｍＩｇＧ１を、実施例２（１）と同様な方法で血清サンプルを調製した。

（３）（１）で作製したＦｃＲ９＿Ｆカラムを高速液体クロマトグラフィー装置（東ソー社製）に接続し、１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）（以下「平衡化液」とも表記）で平衡化後、（２）で調製したｍＩｇＧ１を流速１．２ｍＬ／ｍｉｎにて１０μＬ添加した。検出器による測定間隔は、１／５秒毎にデータを取得することで行った。

（４）流速１．２ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化液で７分洗浄後、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）（以下「溶出液」とも表記）を用いたｐＨグラジエント（１１分で溶出液が１００％となるグラジエント）で吸着したガンマグロブリンを溶出し、分離パターンを得た。

（５）（３）および（４）の測定方法を用いて、（２）で調製したｍＩｇＧ１および血清サンプルをそれぞれ交互に測定する操作を５０サイクル実施した。

（６）（５）より得られたｍＩｇＧ１および血清サンプルの分離パターンを、ｐＨグラジエントを開始した時間（溶出開始後７分、解析開始時間Ｔ_ｓ）、およびｐＨグラジエントが終了した（すなわち溶出液が１００％となった）時間（溶出開始後１８分、解析終了時間Ｔ_ｆ）がともに検出値Ｉ_Ｔ＝０となるよう、ベースライン補正した。

（７）（６）より得られたベースライン補正した前記分離パターンに対して、以下の（ａ）から（ｃ）における溶出時間の補正方法を適用し、溶出時間を補正した分離パターンを得た。なお標準物質の測定結果から行う溶出時間の補正適用範囲は、当該標準物質および当該標準物質の次に測定した血液サンプルまでである。
（ａ）溶出時間の補正なし
（ｂ）図６において標準物質であるｍＩｇＧ１の第３ピーク時間であるＴｃ_Ｐ３を式１１におけるＴｃ_Ｐとして、基準値として測定開始前に取得したｍＩｇＧ１の第３ピーク時間
であるＴｃｓ_Ｐ３を式１１におけるＴｃｓ_Ｐとして代入することで得られる式１１より補正する方法。式１１は繰り返し測定による分離パターンの変動が、解析開始時間から解析終了時間の範囲の溶出時間において、均一な時間だけシフトしていると仮定して補正する式である。
（ｃ）図６において標準物質であるｍＩｇＧ１の第１〜３ピーク時間を用いて、式１３における補正に使用するピーク数ｍが３であるとした条件における、式１２および式１３より補正する方法。式１２および式１３は繰り返し測定による分離パターンの変動が、解析開始時間から解析終了時間の範囲の溶出時間において、溶出時間に依存して変動幅が異なると仮定し、最小二乗法による単回帰式で、各溶出時間における溶出時間の変動幅と当該溶出時間の複数点との近似線（図８）より得られる値を溶出時間から引くことで補正する式である。

（８）（７）より得られた溶出時間を補正した分離パターンに対して、補正後の溶出開始後７分、および補正後の溶出開始後１８分がともに補正後の溶出時間に対する検出値Ｉ_Ｔｃａ＝０となるよう、ベースライン補正して分離パターンを得た。

（９）式１４および式１６を用いて（８）で得られた分離パターンにおける検出値の検出器による測定間隔と同じ１／５秒毎の総和値を、式１５および式１７を用いて（８）で得られた分離パターンの形状正規化値をそれぞれ求めた。なお式１４から式１７における冪指数ｎはすべて３であり、溶出時間が与える総和値および形状正規化値への影響を高めた。また式１４および式１５は、分離パターンの溶出時間が遅い領域に検出される抗体が多いと値が増大し、分離パターン全体の傾向としてＦｃ結合性タンパク質に対して結合性の高い抗体が多く存在すると、それに比例して値が増大する。一方、式１６および式１７は、分離パターンの溶出時間が遅い領域に検出される抗体が多いと値が減少し、分離パターン全体の傾向としてＦｃ結合性タンパク質に対して結合性の高い抗体が多く存在すると、それに反比例して値が減少する。

（１０）（９）より得た総和値および形状正規化値から、測定５０サイクル分の変動係数（ＣＶ値）を得た。

実施例８の結果を表４に示す。式１４から得られた値は総和値冪指数３、式１５は総和値逆相関冪指数３、式１６は形状正規化値冪指数３、式１７は形状正規化値逆相関冪指数３とした。溶出時間の補正として、（ａ）の未補正では式１４から式１７から得られる値のＣＶ値は１７．２％から３５．１％となったが、（ｂ）の１点補正では、当該ＣＶ値は１．９％から５．６％、（ｃ）の３点補正では、当該ＣＶ値は１．０％から３．５％となり、溶出時間の補正を入れることで、大幅にＣＶ値は低下し、さらに補正物質の溶出時間の補正に用いるピーク数を１点から３点に増やすことでＣＶ値はさらに低下し、測定値の繰り返し測定による変動幅が低下した。

図７は実施例７（８）において得られた分離パターンとして、測定１回目と５０回目の測定結果を溶出時間の補正方法毎にプロットした図である。当該図から、未補正時に見られる大幅な溶出時間のシフトが、１点補正により第３ピーク位置に溶出時間が補正されていることがわかり、３点補正をすると分離パターン全体がほぼ同一の線上に位置していることから、精度高く補正され、繰り返し測定による変動が抑えられていることがわかる。

３点補正時に用いた補正物質の各ピーク溶出時間および標準物質のピーク溶出時間から基準値のピーク溶出時間を引いた溶出時間のシフトをプロットし、前記点の最小二乗法による近似線を示した図を図８に示す。各ピーク時間における溶出時間のシフト幅は、各溶出時間によって異なっていることがわかる。また、前記プロットした点はほぼ直線上に位置していることがわかり、最小二乗法による単回帰式で溶出時間が補正可能なことがわかる。

実施例９ 各ピーク領域との相関
（１）実施例８（２）の標準抗体溶液として抗ヒトＣＤ２０ヒト・マウスキメラ抗体（リツキシマブ、全薬工業社製）を用いた他は、実施例８（１）および（２）と同様な方法で標準抗体溶液および血清サンプルを調製した。

（２）実施例８（５）の測定する操作として、（１）で調製したリツキシマブおよび血液サンプルをそれぞれ交互に１日あたり２５サイクル測定し、かつ同一の血液サンプルを１日の測定開始および終了時に計５サンプルの測定を行う操作を、８日間実施した他は、実施例８（３）から（５）と同様な方法で、抗体の分離パターンを得た。

（３）実施例８（７）の溶出時間の補正方法として、（ｃ）の補正方法を適用した他は、実施例８（６）から（８）と同様な方法で、補正した分離パターンを得た。

（４）実施例８（９）の冪指数ｎとして、式１４から式１７においてそれぞれ１、３、５、７を代入した他は、実施例８（９）および（１０）と同様な方法で総和値および形状正規化値のＣＶ値を得た。

（５）（３）で補正した標準物質の分離パターンから、溶出開始後７分から１８分の間に検出される３つのピーク間（溶出時間が短い方から第１、２、３ピーク）の谷領域で導関数が０を取る２つの溶出時間で分割した領域をピーク領域とした。第１ピーク領域は溶出開始後７分から第１と第２ピークの間の谷領域の導関数が０を取る溶出時間（第１と第２ピークとの境界時間）までの範囲とし、第２ピーク領域は第１と第２ピークの間の谷領域の導関数が０を取る溶出時間から第２と第３ピークの間の谷領域の導関数が０を取る溶出時間までの範囲（第２と第３ピークとの境界時間）とし、第３ピーク領域は第２と第３ピークの間の谷領域の導関数が０を取る溶出時間から溶出開始後１８分までの範囲とした。当該標準物質で定義付けたピーク領域を、測定した前記血清サンプルのそれにすべて適用することで、当該サンプルのピーク領域の同定を行った。

（６）（５）より得られるピーク領域を基に、ピーク分割値として血液サンプルにおける第１ピーク面積、第２ピーク面積、第３ピーク面積、また各ピーク面積を溶出開始後７分から１８分のピーク面積で割って得られる第１ピーク面積％、第２ピーク面積％、第３ピーク面積％を得た。各ピーク面積は（４）で得られた総和値と、各ピーク面積％は（４）で得られた形状正規化値との決定係数を求めた。

実施例９の結果を表５から表８に示す。表５の総和値とピーク分割値との決定係数から、第１ピーク面積とは、式１４と比較して（決定係数０．０６から０．４２）、式１６の冪指数ｎが３以上（決定係数０．９７から１．００）で総和値を求めることにより相関が高い値を得ることができた。一方、第３ピーク面積とは、式１６と比較して（決定係数０．１０から０．５４）、式１４の冪指数３以上（決定係数０．９１から０．９８）で総和値を求めることにより相関が高い値を得ることができた。第１ピーク面積とは溶出時間の早い領域が強調される式１６で得られた値で相関性が高くなり、第３ピーク面積とは溶出時間の遅い領域が強調される式１４で得られた値で相関性が高くなる結果となった。また冪指数を１と比較して３以上とすることで、より溶出時間による影響が強調され各ピーク面積と高く相関する結果となった。第２ピーク面積は、式１６の冪指数ｎが１の時の最も高い決定係数０．９８を得たが、第１ピークと第３ピークの中間の領域となるため、強く溶出時間が強調される条件では相関が低下する結果となった。表５の結果から各ピーク面積と総和値との決定係数はどのピークにおいても０．９８以上となり、総和値を求めることで、各ピーク面積を精度高く算出可能であることがわかる。

表６の形状正規化値とピーク分割値との決定係数から、第１ピーク面積％とは、式１５と比較して（決定係数０．７４から０．９６）、式１７（決定係数０．９６から０．９９）で形状正規化値を求めることにより相関が高い値を得ることができた。一方、第３ピーク面積％とは、式１５（決定係数０．８１から０．９８）および式１７（決定係数０．９０から０．９８）を用いても、どちらも変わらず高い相関を得ることができた。第１ピーク面積％と第３ピーク面積％とは多くの場合に逆相関の関係であるため、総和値の場合と異なり、第３ピーク面積％であっても、溶出時間の早い領域が強調される式１７と強く相関したと考えられる。また、第２ピーク面積％とは、式１５（決定係数０．７１から０．７８）および式１７（決定係数０．５６から０．７５）どちらを用いても低い相関を示した。しかしながら、第１および第３ピーク面積％と形状正規化値との決定係数が０．９８以上あるため、精度高く第１および第３ピーク面積％を算出することができ、それぞれの値を全ピーク面積％である１００から除することで、第２ピーク面積％を求めることができるため、形状正規化値を求めることで各ピーク面積％を精度高く算出可能であることがわかる。

表７および表８はそれぞれ総和値と形状正規化値のＣＶ値を示す。表７の総和値では冪指数が増えることでわずかにＣＶ値が増加し、表８の形状正規化値では冪指数が増えることで大幅にＣＶ値が増加することがわかる。この結果から、各ピーク分割値を総和値もしくは形状正規化値から算出するのに適した冪指数は、決定係数が高くかつＣＶ値が低い値となるよう選択する必要があることがわかる。一例として、求められる決定係数およびＣＶ値がそれぞれ０．９５以上、６％未満である場合、第１ピーク面積を算出するのに適した総和値は式１６より得られる逆相関冪指数３となり、第３ピーク面積では総和値の冪指数３もしくは５、第１ピーク面積％では形状正規化値の逆相関冪指数１、３もしくは５、第３ピーク面積％では形状正規化値の冪指数１もしくは３、逆相関冪指数１もしくは３が、それぞれに適した式および冪指数となる。

Claims (8)

1. 以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、試料中に含まれる抗体の分析方法：
   （ａ）Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに試料を添加し、当該試料中に含まれる抗体を当該担体に吸着させる工程；
   （ｂ）前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させ、抗体の分離パターンを得る工程；および
   （ｃ）前記分離パターンにおける抗体の溶出時間と当該時間における検出値との積を総和した値を算出する工程。
2. 前記溶出時間が、標準抗体の溶出時間の変動に基づいて補正されている、請求項１に記載の分析方法。
3. さらに、以下の（Ａ）から（Ｄ）の工程を含む、請求項１または２に記載の分析方法：（Ａ）前記（ａ）の工程の前に、前記カラムに標準抗体溶液を添加して当該標準抗体を当該担体に吸着させ、当該担体に吸着した標準抗体を前記溶出液を用いて溶出させ、標準抗体の第１の分離パターンを得る工程；
   （Ｂ）前記（ａ）および（ｂ）の工程の前または後に、前記（Ａ）の工程を再度実施し、標準抗体の第２の分離パターンを得る工程；
   （Ｃ）前記第１の分離パターンにおける標準抗体の溶出時間と、前記第２の分離パターンにおける標準抗体の溶出時間とを比較する工程；および
   （Ｄ）前記（Ｃ）の比較結果に基づき、前記（ｂ）で得られた分離パターンにおける抗体の溶出時間を補正する工程。
4. 前記（Ｃ）の工程が、前記第１の分離パターンにおける抗体の２点以上の溶出時間と、前記第２の分離パターンにおける抗体の２点以上の溶出時間とを比較する工程である、請求項３に記載の分析方法。
5. 前記（Ｂ）の工程が、前記（ａ）の工程の直前または前記（ｂ）の工程の直後に実施される、請求項３または４に記載の分析方法。
6. 前記試料が、体液である、請求項１から５のいずれか１項に記載の分析方法。
7. 以下の（ａ）から（ｄ）の工程を含む、被検者における疾患および／またはその発症リスクの検出方法：
   （ａ）Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに被検者から得た試料を添加し、当該試料中に含まれる抗体を前記担体に吸着させる工程；
   （ｂ）前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させ、抗体の分離パターンを得る工程；
   （ｃ）前記分離パターンにおける抗体の溶出時間と、当該時間における検出値との積の総和値を算出する工程；
   （ｄ）前記工程（ｃ）で算出した総和値に基づき、前記被検者における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、および／または加齢の進行度合いを検出する工程。
8. 抗体がヒト由来の抗体であり、Ｆｃ結合性タンパク質が以下の（１）から（３）のいずれかのポリペプチドである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法：
   （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換されたポリペプチド；
   （２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を
   含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンのフェニルアラニンへの置換を有し、さらに前記置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド；
   （３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸配列において１７６番目のバリンのフェニルアラニンへの置換を有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、ただし前記置換を含むアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。

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