JP2021108558A - ２，５−ピリジンジカルボン酸類生産能を有する形質転換細胞 - Google Patents

２，５−ピリジンジカルボン酸類生産能を有する形質転換細胞 Download PDF

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Abstract

【課題】２，５−ピリジンジカルボン酸類生産能を有する形質転換細胞、及びこれを用いた２，５−ピリジンジカルボン酸類の製造方法を提供する。【解決手段】４−アミノ安息香酸類を生合成する能力を有する微生物において、下記（Ｉ）及び（ＩＩ）のポリペプチドの発現が強化された、２，５−ピリジンジカルボン酸類生産能を有する形質転換細胞。（Ｉ）４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド（ＩＩ）４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチド【選択図】なし

Description

本発明は、２，５−ピリジンジカルボン酸類生産能を有する形質転換細胞及びその利用に関する。
持続可能社会の実現に向けて、再生可能資源を原料とした生物学的手法による化合物製造方法の開発が重要である。２，５−ピリジンジカルボン酸（２，５−ＰＤＣＡ）類は、樹脂原料として非再生可能資源から大量に製造されるテレフタル酸と類似した骨格を持ち、植物残渣から生物学的手法により製造する方法も知られていることから、再生可能資源から得られるテレフタル酸代替化合物として期待されている（特許文献１、非特許文献１、２）。また、２，５−ピリジンジカルボン酸類は食品及び医薬品用途で有用な水溶性ビタミンであるニコチン酸の前駆体としても知られ、さらには植物の生長促進剤・有機発光材料・接着剤等の原料としても用いられる（特許文献２、非特許文献３〜５）。
生物学的に２，５−ピリジンジカルボン酸類を製造する方法としては、プロトカテク酸−２，３−ジオキシゲナーゼが導入されたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ ＲＨＡ１株をリグニンに作用させる方法が開示されている（特許文献１、非特許文献２）。しかし、その生産性は非常に低く、また多種類の化合物が不均一に含まれるリグニンを利用することから、本手法による安定した２，５−ピリジンジカルボン酸類の製造は困難である。さらには反応に必要な窒素源として塩化アンモニウムを別途添加する必要もある。
その他に２，５−ピリジンジカルボン酸類を得る生物学的反応として、４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸資化性菌として単離されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐ． １０ｄ株が有する４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ（ａｈｄＡ）による反応が知られている（非特許文献６）。本文献によれば、４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸は４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼによる酸化的開裂を受け２−アミノ−５−カルボキシムコン−６−セミアルデヒド（２−ａｍｉｎｏ−５−ｃａｒｂｏｘｙｍｕｃｏｎｉｃ ６−ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）となり、その後非酵素的な自己変換により２，５−ピリジンジカルボン酸となることが精製酵素により確かめられている。
しかし、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐ． １０ｄ株においては２−アミノ−５−カルボキシムコン−６−セミアルデヒドはデアミナーゼ（ａｈｄＢ）により２−ヒドロキシムコン−６−セミアルデヒド（２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｕｃｏｎｉｃ ６−ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）へ変換されるため、実際には培養液中に２，５−ピリジンジカルボン酸は検出されておらず、２，５−ピリジンジカルボン酸類の製造には至っていない。また、仮に精製された４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼを用いて２，５−ピリジンジカルボン酸類の製造を試みたとしても、原料として４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸類を添加する必要があり、経済的観点から実用的に２，５−ピリジンジカルボン酸類を製造することは困難である。
国際公開第２０１６／２０２８７５号 特開２０１８−８３７８９号公報
Alessandro Pellis et al., Nature Communications, Vol.10, pp.1762 (2019) Zoe Mycroft et al., Green Chemistry, Vol.17, pp.4974 (2015) Erick J. Vandamme, Jose Luis Revuelta, Industrial Biotechnology of Vitamins, Biopigments, and Antioxidants (Book), John Wiley & Sons, 2016 Min Zeng et al., Journal of Materials Chemistry C, Vol.7, pp.2751 (2019) Qiao Zhang et al., Journal of the American Chemical Society Vol.141, pp.8058 (2019) Shinji Takenaka et al., Europian Journal of Biochemistry, Vol.269, pp.5871 (2002)
本発明は、２，５−ピリジンジカルボン酸類生産能を有する形質転換細胞、及びこれを用いた２，５−ピリジンジカルボン酸類の製造方法を提供することに関する。
本発明者らは、特定の酵素活性を有するポリペプチドを産生する微生物を作製し、これを用いることにより、２，５−ピリジンジカルボン酸類を効率よく製造できることを見出した。
すなわち、本発明は以下の１）〜２）に係るものである。
１）４−アミノ安息香酸類を生合成する能力を有する微生物において、下記（Ｉ）及び（ＩＩ）のポリペプチドの発現が強化された、２，５−ピリジンジカルボン酸類生産能を有する形質転換細胞。
（Ｉ）４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド
（ＩＩ）４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチド
２）１）の形質転換細胞を培養する工程を含む、２，５−ピリジンジカルボン酸類又はその塩の製造方法。
本発明によれば、樹脂、食品、医薬品、植物の生長促進剤、有機発光材料、接着剤等の原料として用いられる２，５−ピリジンジカルボン酸類を効率よく製造することができる。
本発明において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本発明において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
本発明において、「１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列」とは、１個以上１０個以下、好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列をいう。また本明細書における「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列」とは、１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらにより好ましくは１個以上９個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列をいう。本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
本発明において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
本発明において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞の野生型に存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
本発明において、「２，５−ピリジンジカルボン酸類」としては、具体的には下記の一般式（１）：
Figure 2021108558
〔式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、メトキシ基（−ＯＣＨ３）、アミノ基（−ＮＨ２）、ハロゲン原子、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、メチル基（−ＣＨ３）、エチル基（−ＣＨ２ＣＨ３）を示す。〕
で示される２，５−ピリジンジカルボン酸誘導体が挙げられる。
２，５−ピリジンジカルボン酸誘導体は塩の形態で存在することができ、斯かる塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩等が挙げられる。
また、４−アミノ安息香酸類としては、具体的には下記の一般式（２）：
Figure 2021108558
〔式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じものを示す。〕
で示される４−アミノ安息香酸誘導体が挙げられる。
式（１）又は（２）において、Ｒ１及びＲ２で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、好ましくはフッ素原子である。
Ｒ１及びＲ２は、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、メトキシ基（−ＯＣＨ３）、フッ素原子（−Ｆ）又はメチル基（−ＣＨ３）が挙げられ、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子であるのがより好ましい。
本発明において、「２，５−ピリジンジカルボン酸類生産能を有する形質転換細胞」は、４−アミノ安息香酸類を生合成する能力を有する微生物において、（Ｉ）４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド、及び（ＩＩ）４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドの発現が強化された微生物細胞である。
（Ｉ）４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドとしては、例えば、（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド、（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（「ＨＦＭ１２２」とも称する）、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（「ＨＦＭ６８９」とも称する）は、いずれも４−ヒドロキシ安息香酸−３−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１３．２）として知られている。４−ヒドロキシ安息香酸−３−モノオキシゲナーゼは、４−ヒドロキシ安息香酸の３位を水酸化してプロトカテク酸を生成する反応とその逆反応のいずれか又は両方を促進する触媒活性を有する酵素であり、４−ヒドロキシ安息香酸類の水酸化を触媒する酵素（４−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素）の一種である。
４−ヒドロキシ安息香酸−３−モノオキシゲナーゼは、本来の基質である４−ヒドロキシ安息香酸の他に、類似する分子構造を有する４−アミノ安息香酸の３位の水酸化を触媒する活性を有することが知られている（例えば、Domenico L. Gatti et al., Biochemistry, Vol.35, No.2, pp.567-578 (1996)）。また、斯かるＨＦＭ１２２及びＨＦＭ６８９は、本出願人により、４−アミノ安息香酸類の水酸化を触媒する活性、好ましくは４−アミノ安息香酸類の３位の水酸化を触媒する活性を有することが見出されている（特願２０１８−１７１８４９）。したがって、本発明において、「４−アミノ安息香酸水酸化活性」とは、４−アミノ安息香酸類の水酸化を触媒する活性、好ましくは４−アミノ安息香酸類の３位の水酸化を触媒する活性を意味する。
斯かる４−アミノ安息香酸水酸化活性は、例えば特願２０１８−１７１８４９に記載の方法等により決定することができる。
配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列の例としては、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列が挙げられる。
また、（ＩＩ）４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドとしては、例えば、（Ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼとして知られている。４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼは、４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸のベンゼン環を酸化的に開裂して２−アミノ−５−カルボキシムコン−６−セミアルデヒドを生成する酵素である。
４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性は、例えば公知の方法（前記非特許文献６)）等により決定することができる。
配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列の例としては、配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列が挙げられる。
上記ポリペプチドのアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法としては、例えば、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法が挙げられる。ヌクレオチド配列への変異導入の手法としては、例えば、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸等の化学的変異原又は紫外線、Ｘ線、ガンマ線、イオンビーム等の物理的変異原による突然変異誘発、部位特異的変異導入法、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，５８１−６２１，１９９５）に記載の方法、等が挙げられる。部位特異的変異導入の手法としては、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７，６１−６８，１９８９）を利用した方法、ＯＤＡ法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５２，２７１−２７６，１９９５）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，４８８）等が挙げられる。あるいは、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｕｔａｎ−ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ Ｋｍキット（タカラバイオ社）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販の部位特異的変異導入用キットを利用することもできる。
本発明において、４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドと、４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドの発現が強化された形質転換細胞は、宿主細胞が当該ポリペプチドの発現に必要なポリヌクレオチドを発現可能な状態で含むものであればよく、そのポリペプチドは外来のものであっても、当該細胞が本来有しているものであっても良い。例えば、当該ポリヌクレオチドが発現可能なように導入された細胞、当該ポリヌクレオチドの発現の程度が増強された細胞が挙げられる。具体的には、当該ポリヌクレオチド及びこれと作動可能に連結された制御領域を含むベクターやＤＮＡ断片が導入された細胞や、当該ポリヌクレオチドの制御領域が強制御領域に置換された細胞等が挙げられる。
ここで、ポリヌクレオチドとしては、（ｉ）４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、下記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド、（ｉｉ）４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、下記（ｃ）のポリヌクレオチドが挙げられる（これらのポリヌクレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」とも称する）。
（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
配列番号１、３又は５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の例としては、配列番号１、３又は５で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列が挙げられる。ヌクレオチド配列にヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法は、上述したとおりである。上記ポリヌクレオチドは、１本鎖若しくは２本鎖の形態であり得、又はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。該ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ等の人工ＤＮＡであり得る。
上記ポリヌクレオチドは、ベクターに組み込まれていてもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターは、発現ベクターである。また好ましくは、該ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを宿主微生物に導入することができ、かつ宿主微生物内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。好ましくは、該ベクターは、本発明のポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９等のｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＥＴ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、ｐＵＢ１１０（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｌａｓｍｉｄ １５（２）：９３−１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ）、ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン）、ｐＲＩ９０９／９１０等のｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック）、ＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ）、ｐＰＴＲ１／２（タカラバイオ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１−３３１，１９８５）、ｐＡＢ４−１（ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１−７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５−３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７−４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７−４５１，１９９０）等が挙げられる。
また、上記ポリヌクレオチドは、これを含むＤＮＡ断片として構築されていてもよい。該ＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片及び制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む発現カセットであり得る。
上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、該ベクター又はＤＮＡ断片が導入された宿主細胞内で本発明のポリヌクレオチドを発現させるための配列であり、例えばプロモーターやターミネーター等の発現調節領域、複製開始点等が挙げられる。該制御領域の種類は、ベクター又はＤＮＡ断片を導入する宿主微生物の種類に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、該ベクター又はＤＮＡ断片はさらに、抗生物質耐性遺伝子、アミノ酸合成関連遺伝子等の選択マーカーを有していてもよい。
宿主細胞へのベクター又はＤＮＡ断片の導入には、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。
目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞は、選択マーカーを利用して選択することができる。例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、該抗生物質添加培地で培養することで、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された細胞を選択することができる。また例えば、選択マーカーがアミノ酸合成関連遺伝子である場合、該アミノ酸要求性の宿主細胞に遺伝子導入した後、該アミノ酸要求性の有無を指標に、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された細胞を選択することができる。あるいは、ＰＣＲ等によって形質転細胞のＤＮＡ配列を調べることで目的のベクター又はＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
また、強制御領域としては、公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、tｕプロモーター、ｇａｐプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。
宿主細胞のゲノム上に存在する前記ポリヌクレオチドの制御領域を強制御領域に置換する方法としては、強制御領域と選択マーカーのポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を宿主細胞に導入し、相同組換え又は非相同組換え等により形質転換された細胞を選択する方法等が挙げられる。
本発明において、宿主細胞は、４−アミノ安息香酸類を生合成する能力を有する微生物が用いられる。斯かる微生物は、真菌、酵母、放線菌、大腸菌、枯草菌等、いずれを用いてもよいが、大腸菌、放線菌が好ましい。放線菌としては、コリネバクテリウム属菌、マイコバクテリウム属菌、ロドコッカス属菌、ストレプトマイセス属菌、プロピオニバクテリウム属菌等が挙げられ、好ましくはコリネバクテリウム属菌であり、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムである。
「４−アミノ安息香酸類を生合成する能力を有する」とは、４−アミノ安息香酸類を供給できる微生物であればよいことを意味するが、４−アミノ安息香酸類の供給能が強化された微生物がより好ましい。微生物の４−アミノ安息香酸類の供給能を強化する方法としては、例えば、４−アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びこれと作動可能に連結された制御領域を含むベクターを細胞に導入する方法や、細胞が本来有する４−アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの制御領域を強制御領域に置換する方法等が挙げられる。
ここで、４−アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドとしては、（ＩＩＩ）４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼ（４−ａｍｉｎｏ−４−ｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、（ＩＶ）４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸リアーゼ（４−ａｍｉｎｏ−４−ｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｌｙａｓｅ）等が挙げられる。したがって、４−アミノ安息香酸類の供給能の強化は、これらのいずれか１以上の発現を強化する態様が挙げられる。
具体的には、（ｉｉｉ）４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号７）及び（iｖ）４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸リアーゼをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号８）から選ばれる１以上及びこれと作動可能に連結された制御領域を含むベクターやＤＮＡ断片を微生物に導入する方法や、微生物が本来有する以下のポリヌクレオチドの制御領域の１以上を強制御領域に置換する方法等が挙げられる。
目的のポリヌクレオチドを含むベクターの導入方法や制御領域の強制御領域への置換方法は、前記の方法と同様に行うことができる。
このようにして調製した本発明の形質転換細胞を培養し、２，５−ピリジンジカルボン酸類の生産性を評価し、適切な形質転換細胞を選択することにより、有用な２，５−ピリジンジカルボン酸類の生産株を得ることができる。生産物の測定方法は、後記参考例に記載の方法にしたがって行うことができる。
本発明の２，５−ピリジンジカルボン酸類又はその塩の製造方法は、上述した形質転換細胞を適切な培地で培養することにより実施される。培養条件は、用いる微生物に応じ、適宜設計することができる。
形質転換細胞を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本発明の形質転換細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えば、グルコース等の糖類、グリセリン等のポリオール類、エタノール等のアルコール類、又はピルビン酸、コハク酸もしくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。好ましくは、グルコース、マルトース、スクロース、フルクトース、及びこれらの含有物等の糖類が挙げられる。
また、窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、メチルアミン等のアルキルアミン類、又はアンモニアもしくはその塩等を使用することができる。
その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤等も必要に応じて使用してもよい。
培養は、通常、１０℃〜４０℃で、６時間〜７２時間、好ましくは９時間〜６０時間、より好ましくは１２時間〜４８時間、必要に応じ撹拌又は振とうしながら行うことができる。また、培養中は必要に応じてアンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養物からの２，５−ピリジンジカルボン酸類の回収及び精製方法は特に制限されない。すなわち、周知のイオン交換樹脂法、沈澱法、晶析法、再結晶法、濃縮法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。例えば、菌体を遠心分離等で除去した後、カチオン及びアニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すれば２，５−ピリジンジカルボン酸類を取得することができる。培養物中に蓄積された２，５−ピリジンジカルボン酸類は、そのまま単離することなく用いてもよい。
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞４−アミノ安息香酸類を生合成する能力を有する微生物において、下記（Ｉ）及び（ＩＩ）のポリペプチドの発現が強化された、２，５−ピリジンジカルボン酸類生産能を有する形質転換細胞。
（Ｉ）４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド
（ＩＩ）４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチド
＜２＞（Ｉ）の４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドが、（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド、又は（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドである、＜１＞の形質転換細胞。
＜３＞（ＩＩ）の４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドが、（Ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドである、＜１＞又は＜２＞の形質転換細胞。
＜４＞４−アミノ安息香酸類を生合成する能力を有する微生物が、下記（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）から選ばれる１以上の酵素の発現が強化された微生物である、＜１＞〜＜３＞のいずれかの形質転換細胞。
（ＩＩＩ）４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼ
（ＩＶ）４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸リアーゼ
＜５＞大腸菌又はコリネバクテリム属菌である、＜１＞〜＜４＞のいずれかの形質転換細胞。
＜６＞コリネバクテリウム属菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである、＜５＞の形質転換細胞
＜７＞＜１＞〜＜６＞のいずれかの形質転換細胞を培養する工程を含む、２，５−ピリジンジカルボン酸類又はその塩の製造方法。
＜８＞炭素源として糖類を含む培地で培養される、＜７＞の方法。
＜９＞前記培養物から２，５−ピリジンジカルボン酸類又はその塩を回収する工程を含む、＜７＞又は＜８＞の方法。
＜１０＞２，５−ピリジンジカルボン酸類が、下記の一般式（１）：
Figure 2021108558
〔式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、メチル基、エチル基を示す。〕
で示される２，５−ピリジンジカルボン酸誘導体であり、４−アミノ安息香酸類が下記の一般式（２）：
Figure 2021108558
〔式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じものを示す。〕
で示される４−アミノ安息香酸誘導体である＜６＞〜＜８＞のいずれかの方法。
＜１１＞式（１）及び（２）において、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である、＜９＞の方法。
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ ２，５−ピリジンジカルボン酸の製造
以下の実施例において、特に記載のない限りＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用して行った。
（１）２，５−ピリジンジカルボン酸製造用プラスミドの作製
（ａ）プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣの作製
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２株から常法によって抽出されたゲノムを鋳型に、プライマーＧＮ１４＿１２７（配列番号９，TATTAATTAAATGCGCGTTTTAATTATTGATAATTATGATTC）とＧＮ１４＿１３３（配列番号１０，TTGCGGCCGCTTGTTTAAACCTCCTTACAGAAAAATGGTTGGGCG）を用いたＰＣＲにて４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子及び４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子が含まれたＤＮＡ断片を増幅し、これをプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ（特開２０１６−１４６７７９号公報参照）のＰａｃＩ部位とＮｏｔＩ部位の間に挿入することで、プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣを得た。
（ｂ）プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＨＦＭ１２２の作製
上記で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣを鋳型に、プライマーｐａｂＡＢＣｃｏｒｙ ｖｅｃ Ｒ（配列番号１１，AAATTTAAACCTCCTTTACAGAAAAATGGTTGG）とｐａｂＡＢＣｃｏｒｙ ｖｅｃ Ｆ（配列番号１２，GGAGGTTTAAACAAGCGGCCGCGATATC）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を合成した。続いて４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドＨＦＭ１２２をコードする遺伝子（配列番号１）を含むプラスミドを人工遺伝子合成により作製し、これを鋳型としてプライマーｐＥＣｓｆＤ ＨＦＭ１２２ Ｆ（配列番号１３，AGGAGGTTTAAATTTATGCGCACTCAGGTGGCTAT）とｐＥＣｓｆＤ ＨＦＭ１２２ Ｒ（配列番号１４，CTTGTTTAAACCTCCTTATACGAGTGGCAGTCCTA）を用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＨＦＭ１２２を構築した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地（Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ １％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％，カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬ、寒天 １．５％）に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーに対しＳａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ）及びプライマーｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｆ（配列番号１５，GCTATCAAAACATTCGGCACATTGGTTTTCC）、ｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｒ（配列番号１６，GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC）を用いたＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ断片の導入が確認された形質転換株を選抜した。得られた形質転換株をＬＢＫｍ液体培地（Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ １％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％，カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬ）２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
（ｃ）プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２の作製
上記で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＨＦＭ１２２を鋳型に、プライマーｐａｂＣ ｌａｓｔ Ｒ（配列番号１７，TTACAGAAAAATGGTTGGGCGCAA）とＨＦＭ１２２ Ｆ（配列番号１８，ATGCGCACTCAGGTGGCTATCG）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を合成した。続いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株が有するｔｕｆ遺伝子（ｃｇ０５８７）のプロモーター（以下、tｕプロモーターと称する）を含むＤＮＡ断片（配列番号１９，TACGTACCTGCAGGTAGCGTGTCAGTAGGCGCGTAGGGTAAGTGGGGTAGCGGCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTCAACAGCATTGATTTCGATGTATTTAGCTGGCCGTTACCCTGCGAATGTCCACAGGGTAGCTGGTAGTTTGAAAATCAACGCCGTTGCCCTTAGGATTCAGTAACTGGCACATTTTGTAATGCGCTAGATCTGTGTGCTCAGTCTTCCAGGCTGCTTATCACAGTGAAAGCAAAACCAATTCGTGGCTGCGAAAGTCGTAGCCACCACGAAGTCCAAAGGAGGATCTAAATTATGAATAATATAAAAGGAGGAATTAATTAA）を人工遺伝子合成により作製し、これを鋳型としてプライマーｐａｂＣ−Ｐｔｕ Ｆ（配列番号２０，ACCATTTTTCTGTAATACGTACCTGCAGGTAGCGTG）とＰｔｕ−ＨＦＭ１２２ Ｒ（配列番号２１，CACCTGAGTGCGCATTTAATTAATTCCTCCTTTTA）を用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２を構築した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーに対しＳａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ）及びプライマーＰｔｕ ｓｅｑ １（配列番号２２，GCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTC）、ｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｒ（配列番号１６，GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC）を用いたＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ断片の導入が確認された形質転換株を選抜した。得られた形質転換株をＬＢＫｍ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
（ｄ）プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕ＿ＨＦＭ１２２の作製
上記で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２を鋳型に、プライマーｐＧａｐＡＢＡ＿ｔｕ ｖｅｃ Ｆ（配列番号２３，GGAGGTTTAAACAAGCGG）とｐＧａｐＡＢＡ＿ｔｕ ｖｅｃ Ｒ（配列番号２４，AATTTAGATCCTCCTTTGGACTTCGTG）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を合成した。続いて、人工遺伝子合成により作製したＨＦＭ１２２をコードする遺伝子（配列番号１）を含むプラスミドを鋳型としてプライマーＨＦＭ１２２ ｉｎｓ Ｆ（配列番号２５，AGGAGGATCTAAATTATGCGCACTCAGGTGGCTATC）とＨＦＭ１２２ ｉｎｓ Ｒ（配列番号２６，CTTGTTTAAACCTCCTTATACGAGTGGCAGTCCTACG）を用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕ＿ＨＦＭ１２２を構築した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーに対しＳａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ）及びプライマーＰｔｕ ｓｅｑ １（配列番号２２，GCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTC）、ｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｒ（配列番号１６，GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC）を用いたＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ断片の導入が確認された形質転換株を選抜した。得られた形質転換株をＬＢＫｍ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
（ｅ）プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕ＿ＨＦＭ１２２＿ａｈｄＡの作製
上記で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕ＿ＨＦＭ１２２を鋳型に、プライマーａｈｄＡ ｖｅｃ Ｒ（配列番号２７，CGCTTGTTTAAACCTCCTTATACGAGTGGCAGTCCTACG）とａｈｄＡ ｖｅｃ Ｆ（配列番号２８，GCCGCGATATCGTTGTAAAAAACCCCGCTC）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を合成した。続いて、４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ａｈｄＡ（配列番号５）を含むプラスミドを人工遺伝子合成により作製し、これを鋳型としてプライマーａｈｄＡ ｉｎｓ Ｆ（配列番号２９、AGGTTTAAACAAGCGATGATCATCCTGGAAAACTTCAAGATG）とａｈｄＡ ｉｎｓ Ｒ（配列番号３０、CAACGATATCGCGGCTTAATCGCGTCCTGGAGCAAC）を用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕ＿ＨＦＭ１２２＿ａｈｄＡを構築した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーに対しＳａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ）及びプライマーＰｔｕ ｓｅｑ １（配列番号２２，GCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTC）、ｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｒ（配列番号１６，GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC）を用いたＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ断片の導入が確認された形質転換株を選抜した。得られた形質転換株をＬＢＫｍ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
構築したプラスミドにおいては、ｇａｐプロモーターの制御下に４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子、及び４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子が連結され、さらにｔｕプロモーターの制御下に４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子が連結されている。
（２）プラスミドの宿主細胞への導入
上記で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕ＿ＨＦＭ１２２＿ａｈｄＡを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＲＨＧ１４５株（特願２０１４−５２３７５７参照）をエレクトロポレーション法（Ｂｉｏ−ｒａｄ）により形質転換した。得られた形質転換細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３０℃で２日間静置し、得られたコロニーを形質転換株とした。
（３）形質転換株の培養
上記で得られた形質転換株を表３に示すＣＧＸＩＩ培地（カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬを含む）１０ｍＬに接種し、３０℃で４８時間培養した後、遠心分離により菌体を除去したものを培養上清とした。得られた培養上清中の２，５−ピリジンジカルボン酸濃度を参考例１の方法に従って定量した。
Figure 2021108558
（４）結果
形質転換株の培養の結果、培養上清中に０．４０ｇ／Ｌの２，５−ピリジンジカルボン酸が検出され、本菌株を用いることで２，５−ピリジンジカルボン酸を製造可能であることが示された。
参考例１ ２，５−ピリジンジカルボン酸の定量
２，５−ピリジンジカルボン酸の定量はＨＰＬＣにより行った。ＨＰＬＣ分析に供する反応液を０．１％リン酸にて適宜希釈した後、アクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行なった。ＨＰＬＣの装置はＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。分析カラムには、Ｌ−カラム ＯＤＳ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。２，５−ピリジンジカルボン酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２８０ｎｍ）を用いた。標準試料〔２，５−ピリジンジカルボン酸（販売元コードＰ０５５２、東京化成工業）〕を用いて濃度検量線を作成し、濃度検量線に基づいて２，５−ピリジンジカルボン酸の定量を行なった。

Claims (7)

  1. ４−アミノ安息香酸類を生合成する能力を有する微生物において、下記（Ｉ）及び（ＩＩ）のポリペプチドの発現が強化された、２，５−ピリジンジカルボン酸類生産能を有する形質転換細胞。
    （Ｉ）４−アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド
    （ＩＩ）４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチド
  2. ４−アミノ安息香酸類を生合成する能力を有する微生物が、下記（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）から選ばれる１以上の酵素の発現が強化された微生物である、請求項１記載の形質転換細胞。
    （ＩＩＩ）４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼ
    （ＩＶ）４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸リアーゼ
  3. 大腸菌又はコリネバクテリム属菌である、請求項１〜２記載の形質転換細胞。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、２，５−ピリジンジカルボン酸類又はその塩の製造方法。
  5. 炭素源として糖類を含む培地で培養される、請求項４記載の方法。
  6. 前記培養物から２，５−ピリジンジカルボン酸類又はその塩を回収する工程を含む、請求項４又は５記載の方法。
  7. ２，５−ピリジンジカルボン酸類が、下記の一般式（１）：
    Figure 2021108558
     〔式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、メチル基、エチル基を示す。〕
    で示される２，５−ピリジンジカルボン酸誘導体であり、４−アミノ安息香酸類が下記の一般式（２）：
    Figure 2021108558
     〔式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じものを示す。〕
    で示される４−アミノ安息香酸誘導体である請求項４〜６のいずれか１項記載の方法。
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