JP2021066728A - 偽狂犬病ウイルス（ｐｒｖ）感染の予防及び／または治療製剤の調製におけるｅｇｃｇの応用、偽狂犬病ウイルス（ｐｒｖ）感染の予防及び／または治療製剤 - Google Patents
偽狂犬病ウイルス（ｐｒｖ）感染の予防及び／または治療製剤の調製におけるｅｇｃｇの応用、偽狂犬病ウイルス（ｐｒｖ）感染の予防及び／または治療製剤 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】偽狂犬病ウイルス感染の予防及び／または治療製剤の調製における没食子酸エピガロカテキンの応用、及び製剤の提供。【解決手段】豚偽狂犬病ウイルス感染を予防及び／または治療する製剤の調製における没食子酸エピガロカテキンの応用。上記の没食子酸エピガロカテキンの濃度が１０〜１００μｍｏｌ／Ｌである。【選択図】図１
Description
本発明は豚偽狂犬病（PRV）感染症を治療する技術分野に属し、特に偽狂犬病（PRV）感染の予防及び/または治療製剤の調製における没食子酸エピガロカテキン（EGCG）の応用、及び偽狂犬病ウイルス（PRV）感染の予防及び/または治療製剤に関するものである。
豚の偽狂犬病ウイルスが線形二本鎖DNA分子であり、ヘルペスウイルス科、豚ヘルペスウイルス属に属する。ウイする粒子の最も外側にエンベロープがあり、外部環境に耐性が強い。偽狂犬病ウイルスが向汎性ウイルスであり、多種な培養組織や細胞内で増殖でき、その中で、兎の腎臓細胞と豚の腎臓細胞（プライマリ細胞と継代細胞株を含み）が最も敏感で、明らかな細胞病変を引き起こすことができる。豚が偽狂犬病ウイルスの終結宿主であり、感染豚や感染ネズミが主な感染源である。豚間では、ウイルスを含む分泌物（鼻汁、乳汁、精液等）を介しての感染により伝播する。偽狂犬病ウイルスによって発症する豚は日齢より症状が異なり、15日以内の仔豚の場合は死亡率が100％で、メスの場合は不妊症、流産や死産等で、オスの場合は精巣が腫れや萎縮や繁殖喪失等があり、豚肉産業に甚大な経済的損失を与える場合がある。
偽狂犬病（Pseudorabies, PR）はオーエスキー病（AujeszKy's disease）とも呼ばれ、豚ヘルペスウイルス１型（Suid herpesvirus 1, SuHV-1）または偽狂犬病（Pseudorabies virus, PRV）によって引き起こされる多種家畜物や野生動物には共通感染症であり、発熱、激しい痒み（豚を除く）、呼吸器系と神経系疾患及び脳脊髄炎を主徴とする急性のウイルス感染症である。この病気が豚でパンデミックとなっており、妊娠中の母豚が感染すると流産や死産が起こり、オス豚には繁殖障害、新生仔豚には死亡、肥育豚には呼吸困難や発育不良等を引き起こす世界中の養豚産業に危害する重大感染症の一つである。2011年以来、中国での多く地域に深刻な豚の偽狂犬病を爆発し、養豚場でBartha-K16ワクチンを接種した豚でしたが、新たに現れた偽狂犬病ウイルス変異株が従来のPRVウイルス変異株と、全年齢の豚に病原性が高い点で違う他、年齢によって症状も異なる。上記のことから、既存のワクチンが現在のPRVの流行株に対応できないし、完全な免疫保護を提供できない事がわかる。簡単的に言うと、養豚産業はPRVによる莫大なリスクに直面している。最深刻なことは、偽狂犬病ウイルスの宿主範囲が広くて、豚、牛、羊、犬、猫等の脊椎動物を除く、変異した豚偽狂犬病ウイルスがヒトに感染する可能性がある。そのため、PRVの感染予防とコントロールは非常に差し迫って重要なことである。
現在、我が国が変異したPRVにまだ有効な治療手段がなくて、疾病前期の健康な時期に疾病の発生を防止することと衛生管理の強化だけで当該の疾病を抑制する。養豚産業の経済的損失を低減するためには、変異したPRVの予防と治療に有効な薬の開発が急務となっておる。
上述したことに踏まえ、本発明の目的は、豚偽狂犬病ウイルス感染の予防および/または治療製剤の調製に応用される没食子酸エピガロカテキン（EGCG）を提供し、上記の製剤が低コストで副作用がなく、治療効果が顕著である。
本発明は豚偽狂犬病ウイルス感染の予防および/または治療製剤の調製に応用される没食子酸エピガロカテキン（EGCG）を提供する。
好ましくは、上記のEGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着、侵入及び複製を阻害することにより、豚偽狂犬病を予防及び/または治療する。
好ましくは、上記のEGCGが豚偽狂犬病ウイルスを直接殺すことにより豚偽狂犬病を予防及び/または治療する。
本発明は偽狂犬病ウイルス（PRV）感染の予防及び/または治療製剤を提供し、上記の製剤にEGCGの濃度が10〜100μmol/Lである。
好ましくは、上記の製剤にEGCGの濃度が20〜80μmol/Lである。
好ましくは、上記の製剤にEGCGの濃度が40〜60μmol/Lである。
好ましくは、上記の製剤に溶剤がPBS緩衝液またはDMSOである。
好ましくは、上記のPBS緩衝液の濃度が0.05〜0.15mol/Lである。
好ましくは、上記のPBS緩衝液の濃度が0.08〜0.12mol/Lである。
好ましくは、上記のEGCGを溶剤に溶かすことにより上記の製剤を作る。
本発明は偽狂犬病ウイルス（PRV）感染の予防及び/または治療製剤の調製におけるEGCGの応用を提供し、上記のEGCGが偽狂犬病ウイルス（PRV）感染に対抗する効果が非常に著しい。上記のEGCGが豚偽狂犬病ウイルス（PRV）による引き起こされる細胞病変を減少できし、豚PRVの吸着、侵入及び複製も抑制でき、それに豚PRVを直接殺すこともでき、豚PRVの臨床治療に科学的に信頼できる理論依拠を提供した。EGCGが固体緑茶抽出物に最も豊富されているカテキンであり、供給源が広いし、原料が取得しやすくて、低コスト等の利点がある。EGCGが漢方薬に由来し、動物体の中で代謝され、環境汚染がほとんどなく、動物に毒性や副作用がない。上記のEGCGが臨床上で生物学的価値があり、抗酸化、抗動脈硬化、抗腫瘍、血栓形成阻害、血管新生阻害等の薬理作用がある。
本発明は偽狂犬病ウイルス（PRV）感染の予防及び/または治療製剤の調製における没食子酸エピガロカテキン（EGCG）の応用を提供し、上記のEGCGが偽狂犬病ウイルス（PRV）感染に対抗する効果が非常に著しい。上記のEGCGが豚偽狂犬病ウイルス（PRV）による引き起こされる細胞病変を減少できし、豚PRVの吸着、侵入及び複製も抑制でき、それに豚PRVを直接殺すこともでき、マウスの体内試験によりEGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染を予防及び/または感染したマウスを治療することができことがわかる。本発明による没食子酸エピガロカテキンの由来に特別な要求がない、この分野で一般的な市販品または自己調製物を採用してもいいことである。
本発明はまた偽狂犬病ウイルス（PRV）感染の予防及び/または治療製剤を提供し、上記の製剤に没食子酸エピガロカテキンの濃度が10〜100mmol/Lで、好ましくは20〜80mmol/Lで、更に好ましくは40〜60mmol/Lで、最も好ましくは50mmol/Lである。本発明において、上記の製剤は好ましくは液体製剤であり、上記の製剤の溶剤がPBS緩衝液またはDMSOが好ましい。上記の溶剤がPBS緩衝液である場合に、上記のPBS緩衝液の濃度が好ましくて0.05〜0.15mol/Lで、更に好ましくは0.08〜0.12mol/Lで、最も好ましくは0.1mol/Lである。
本発明において、好ましくは、上記の没食子酸エピガロカテキンが溶剤に溶かすことにより上記の製剤を作る。本発明は上記の溶解の方法と時間に特別な限定がなくて、十分的な溶解を実現すればいいである。
以下は実施例と結合して本発明による技術案を詳しく説明するが、本発明の保護範囲の限定と理解すべきではない。
実施例1
豚偽狂犬病ウイルス（PRV）感染の予防及び/または治療製剤として、没食子酸エピガロカテキンを0.1mol/LのPBS緩衝液に溶かすことにより獲得され、上記の没食子酸エピガロカテキンの濃度が50mmol/Lである。
豚偽狂犬病ウイルス（PRV）感染の予防及び/または治療製剤として、没食子酸エピガロカテキンを0.1mol/LのPBS緩衝液に溶かすことにより獲得され、上記の没食子酸エピガロカテキンの濃度が50mmol/Lである。
実施例２
豚偽狂犬病ウイルス感染の予防及び/または治療製剤として、没食子酸エピガロカテキンを0.15mol/LのPBS緩衝液に溶かすことにより獲得され、上記の没食子酸エピガロカテキンの濃度が40mmol/Lである。
豚偽狂犬病ウイルス感染の予防及び/または治療製剤として、没食子酸エピガロカテキンを0.15mol/LのPBS緩衝液に溶かすことにより獲得され、上記の没食子酸エピガロカテキンの濃度が40mmol/Lである。
実施例３
豚偽狂犬病ウイルス感染の予防及び/または治療製剤として、没食子酸エピガロカテキンを0.1mol/LのPBS緩衝液に溶かすことにより獲得され、上記の没食子酸エピガロカテキンの濃度が100mmol/Lである。
豚偽狂犬病ウイルス感染の予防及び/または治療製剤として、没食子酸エピガロカテキンを0.1mol/LのPBS緩衝液に溶かすことにより獲得され、上記の没食子酸エピガロカテキンの濃度が100mmol/Lである。
実施例４
豚偽狂犬病ウイルス感染の予防及び/または治療製剤として、没食子酸エピガロカテキンをDMSOに溶かすことにより獲得され、上記の没食子酸エピガロカテキンの濃度が60mmol/Lである。
豚偽狂犬病ウイルス感染の予防及び/または治療製剤として、没食子酸エピガロカテキンをDMSOに溶かすことにより獲得され、上記の没食子酸エピガロカテキンの濃度が60mmol/Lである。
実施例５
没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスにより引き起こされる細胞病変に対する影響
PK-15B6細胞（中国動物用医薬品監察所から購入）を４wt％牛胎児血清を含む栄養液で希釈してカウントし、1穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに敷いて、5％のCO2を含む37℃の培養箱に入れた。細胞が70〜80％（約16時間）ほど増殖した状態になると、PBS溶液で２回洗浄し、それぞれの細胞がPBS、10μM濃度のEGCG、20μM濃度のEGCG、50μM濃度のEGCG、100μM濃度のEGCGを使って１時間ほど予め処理して、細胞に豚偽狂犬病ウイルスPRV XJ5ウイルス株（0.1MOI）を感染させて、1時間後培養液を交換し、製剤がずっと存在してる状態で24時間感染させた後、細胞の形変化と病変状況を顕微鏡によって観察した。結果が図1の示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスによって引き起こされる細胞病変を減少でき、EGCGが豚偽狂犬病ウリス感染を減少する可能性あると表明している。
没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスにより引き起こされる細胞病変に対する影響
PK-15B6細胞（中国動物用医薬品監察所から購入）を４wt％牛胎児血清を含む栄養液で希釈してカウントし、1穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに敷いて、5％のCO2を含む37℃の培養箱に入れた。細胞が70〜80％（約16時間）ほど増殖した状態になると、PBS溶液で２回洗浄し、それぞれの細胞がPBS、10μM濃度のEGCG、20μM濃度のEGCG、50μM濃度のEGCG、100μM濃度のEGCGを使って１時間ほど予め処理して、細胞に豚偽狂犬病ウイルスPRV XJ5ウイルス株（0.1MOI）を感染させて、1時間後培養液を交換し、製剤がずっと存在してる状態で24時間感染させた後、細胞の形変化と病変状況を顕微鏡によって観察した。結果が図1の示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスによって引き起こされる細胞病変を減少でき、EGCGが豚偽狂犬病ウリス感染を減少する可能性あると表明している。
実施例６
没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞で豚偽狂犬病ウイルスの感染活性に対する抑制（Western blot、蛍光定量PCRとTCID50試験）
（１）Western blotによって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの感染活性に対する抑制が測定され
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、5％のCO2を含む37℃の培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、PK-15B6細胞にそれぞれ1mlの血清のないDMEMで希釈して作られた10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGを加え、37℃で1時間培養してから、豚偽狂犬病ウイルスに感染させて（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）37℃で５％のCO2を含む培養箱で1時間培養してから、2mlの2％FBSを含むDMEM栄養液（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）と交換して、37℃で5％のCO2を含む培養箱で24時間培養してから、培養上清を収集（1mlを-70℃に保存して後のTCID50実験で使用）してPBSで3回洗浄し残液を吸い尽くした後、2X-蛋白ローディングバッファーを加えて細胞サンプルを収集し、金属浴で96℃で15分間煮沸し、Westernblot検測を行った。EGCGが豚偽狂犬病ウイルスｇEとUL42蛋白を低下させた表現が見つかり（図2のAに示すように）、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染を低下させうることを初歩的に検証した。
没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞で豚偽狂犬病ウイルスの感染活性に対する抑制（Western blot、蛍光定量PCRとTCID50試験）
（１）Western blotによって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの感染活性に対する抑制が測定され
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、5％のCO2を含む37℃の培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、PK-15B6細胞にそれぞれ1mlの血清のないDMEMで希釈して作られた10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGを加え、37℃で1時間培養してから、豚偽狂犬病ウイルスに感染させて（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）37℃で５％のCO2を含む培養箱で1時間培養してから、2mlの2％FBSを含むDMEM栄養液（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）と交換して、37℃で5％のCO2を含む培養箱で24時間培養してから、培養上清を収集（1mlを-70℃に保存して後のTCID50実験で使用）してPBSで3回洗浄し残液を吸い尽くした後、2X-蛋白ローディングバッファーを加えて細胞サンプルを収集し、金属浴で96℃で15分間煮沸し、Westernblot検測を行った。EGCGが豚偽狂犬病ウイルスｇEとUL42蛋白を低下させた表現が見つかり（図2のAに示すように）、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染を低下させうることを初歩的に検証した。
（２）TCID50によって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの感染活性に対する抑制が測定され
Vero細胞を8vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに2×103個の濃度で96WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れ、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、血清のないDMEMで希釈した異なる濃度のウイルス液を加え、各濃度を8回繰り返し測定し、1.5時間感染させた後、2％FBSを含むDMEM栄養液と交換して、72時間感染させた後細胞病変の状況を観察した。EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染上清のウイルス力価を低下させ（図２のB）、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染を低下させうることを検証した。
Vero細胞を8vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに2×103個の濃度で96WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れ、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、血清のないDMEMで希釈した異なる濃度のウイルス液を加え、各濃度を8回繰り返し測定し、1.5時間感染させた後、2％FBSを含むDMEM栄養液と交換して、72時間感染させた後細胞病変の状況を観察した。EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染上清のウイルス力価を低下させ（図２のB）、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染を低下させうることを検証した。
（３）蛍光定量PCRによって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの感染活性に対する抑制が測定され
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、5％ CO2を含む37℃の培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、PK-15B6細胞にそれぞれ1mlの血清のないDMEMで希釈して作られた10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGを加え、37℃で1時間培養してから、豚偽狂犬病ウイルスに感染させて（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）37℃で５％のCO2を含む培養箱で1時間培養してから、2mlの2％FBSを含むDMEM栄養液（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）と交換して、37℃で5％のCO2を含む培養箱で24時間培養してから、PBSで3回洗浄して1mlの血清のないDMEM栄養液を加えて-70℃の冷蔵庫に入れ、凍結解凍サイクルを3回繰り返してからDNAを抽出して、リアルタイム蛍光定量PCR検測に用いられた。使用したPCRプライマーがgB94F：5’-ACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC-3’（SEQ IDNo.1）；gB94R：5’-GTCCGTGAAGCGGTTCGTGAT（SEQ IDNo.2）；gB probe 5’-FAM-ACGTCATCGTCACGACC-TAMRA-3’（SEQ IDNo.3）である。使用した20μL反応システムには、0.2μLのDMSO、0.5μLのTaqDNAポリメラーゼ、0.8μLの上流及び下流プライマー、0.4μLのdNTP、2μLの10xバッファー、2μLのDNA、0.4μLのプローブ、及び12.9μLのRNaseフリー水が含まれる。増幅パラメータが95℃600秒、95℃10秒、62℃20秒で、合計45サイクル。結果が図2のCに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルス核酸の複製数を減らすことができ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染を低下させることができることを検証した。
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、5％ CO2を含む37℃の培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、PK-15B6細胞にそれぞれ1mlの血清のないDMEMで希釈して作られた10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGを加え、37℃で1時間培養してから、豚偽狂犬病ウイルスに感染させて（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）37℃で５％のCO2を含む培養箱で1時間培養してから、2mlの2％FBSを含むDMEM栄養液（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）と交換して、37℃で5％のCO2を含む培養箱で24時間培養してから、PBSで3回洗浄して1mlの血清のないDMEM栄養液を加えて-70℃の冷蔵庫に入れ、凍結解凍サイクルを3回繰り返してからDNAを抽出して、リアルタイム蛍光定量PCR検測に用いられた。使用したPCRプライマーがgB94F：5’-ACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC-3’（SEQ IDNo.1）；gB94R：5’-GTCCGTGAAGCGGTTCGTGAT（SEQ IDNo.2）；gB probe 5’-FAM-ACGTCATCGTCACGACC-TAMRA-3’（SEQ IDNo.3）である。使用した20μL反応システムには、0.2μLのDMSO、0.5μLのTaqDNAポリメラーゼ、0.8μLの上流及び下流プライマー、0.4μLのdNTP、2μLの10xバッファー、2μLのDNA、0.4μLのプローブ、及び12.9μLのRNaseフリー水が含まれる。増幅パラメータが95℃600秒、95℃10秒、62℃20秒で、合計45サイクル。結果が図2のCに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルス核酸の複製数を減らすことができ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染を低下させることができることを検証した。
実施例7
没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスの吸着と侵入に対する影響（Western blot、蛍光定量PCRとTCID50試験）
（１）Western blotによって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの吸着と侵入に対する影響が測定され
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で適当な密度になるまで希釈して、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、PK-15B6細胞にそれぞれ1mlの血清のないDMEMで希釈して作られた10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGを加え、37℃で1時間培養してから、冷やす血清のないDMEMと交換して、豚偽狂犬病ウイルスを4℃で感染させ（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）て1時間培養してから、冷やすPBSで3回洗浄し、1mlの2％FBSを含むDMEM栄養液（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）を加え、37℃で1時間培養してから、クエン酸で3回洗浄してからPBSで3回洗浄し、残液を吸収させてから、2ml 2％FBSを含むDMEM栄養液と交換し、37℃で5％CO2を含む培養箱に入れて、24時間感染させた後、細胞上清を収集し（1mlを-70℃に保存して後のTCID50実験で使用）、2X-蛋白ローディングバッファーを加えて細胞サンプルを収集し、金属浴で96℃で15分間煮沸して、Westernblot検測を行った。結果が図3のAに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスｇEとUL42蛋白を低下させた表現が見つかり、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着と侵入を低下させうることを初歩的に検証した。
没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスの吸着と侵入に対する影響（Western blot、蛍光定量PCRとTCID50試験）
（１）Western blotによって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの吸着と侵入に対する影響が測定され
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で適当な密度になるまで希釈して、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、PK-15B6細胞にそれぞれ1mlの血清のないDMEMで希釈して作られた10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGを加え、37℃で1時間培養してから、冷やす血清のないDMEMと交換して、豚偽狂犬病ウイルスを4℃で感染させ（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）て1時間培養してから、冷やすPBSで3回洗浄し、1mlの2％FBSを含むDMEM栄養液（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）を加え、37℃で1時間培養してから、クエン酸で3回洗浄してからPBSで3回洗浄し、残液を吸収させてから、2ml 2％FBSを含むDMEM栄養液と交換し、37℃で5％CO2を含む培養箱に入れて、24時間感染させた後、細胞上清を収集し（1mlを-70℃に保存して後のTCID50実験で使用）、2X-蛋白ローディングバッファーを加えて細胞サンプルを収集し、金属浴で96℃で15分間煮沸して、Westernblot検測を行った。結果が図3のAに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスｇEとUL42蛋白を低下させた表現が見つかり、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着と侵入を低下させうることを初歩的に検証した。
（２）TCID50によって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの侵入に対する影響が測定され
Vero細胞を8vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに2×103個の濃度で96WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れ、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、血清のないDMEMで希釈した異なる濃度のウイルス液を加え、各濃度を8回繰り返し測定し、1.5時間感染させた後、2％FBSを含むDMEM栄養液と交換して、72時間感染させた後細胞病変の状況を観察した。結果が図3のBに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染上清のウイルス力価を低下させ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着と侵入を低下させうることを検証した。
Vero細胞を8vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに2×103個の濃度で96WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れ、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、血清のないDMEMで希釈した異なる濃度のウイルス液を加え、各濃度を8回繰り返し測定し、1.5時間感染させた後、2％FBSを含むDMEM栄養液と交換して、72時間感染させた後細胞病変の状況を観察した。結果が図3のBに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染上清のウイルス力価を低下させ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着と侵入を低下させうることを検証した。
（３）蛍光定量PCRによって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの吸着と侵入に対する抑制が測定され
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、5％ CO2を含む37℃の培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、1mlの血清のないDMEMで希釈して作られた10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGを加え、37℃で1時間培養してから、冷やす血清のないDMEMと交換して、豚偽狂犬病ウイルスを4℃で感染させて（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）、1時間培養してから、冷やすPBSで3回洗浄し、1mlの2％FBSを含むDMEM栄養液（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）を加え、37℃で1時間培養してから、クエン酸で3回洗浄してからPBSで3回洗浄し、残液を吸収させてから、2ml 2％FBSを含むDMEM栄養液と交換し、37℃で5％CO2を含む培養箱に入れて、24時間感染させた後、PBSで3回洗浄して残液を吸収してから、1mlの血清のないDMEM栄養液を加えて-70℃の冷蔵庫に入れ、凍結解凍サイクルを3回繰り返してからDNAを抽出し蛍光定量PCR検測を行った。結果が図3のCに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルス核酸の複製数を減らすことができ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着と侵入を低下させることができることを検証した。
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、5％ CO2を含む37℃の培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、1mlの血清のないDMEMで希釈して作られた10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGを加え、37℃で1時間培養してから、冷やす血清のないDMEMと交換して、豚偽狂犬病ウイルスを4℃で感染させて（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）、1時間培養してから、冷やすPBSで3回洗浄し、1mlの2％FBSを含むDMEM栄養液（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）を加え、37℃で1時間培養してから、クエン酸で3回洗浄してからPBSで3回洗浄し、残液を吸収させてから、2ml 2％FBSを含むDMEM栄養液と交換し、37℃で5％CO2を含む培養箱に入れて、24時間感染させた後、PBSで3回洗浄して残液を吸収してから、1mlの血清のないDMEM栄養液を加えて-70℃の冷蔵庫に入れ、凍結解凍サイクルを3回繰り返してからDNAを抽出し蛍光定量PCR検測を行った。結果が図3のCに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルス核酸の複製数を減らすことができ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着と侵入を低下させることができることを検証した。
実施例8
没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスの吸着に対する影響（Western blot、蛍光定量PCRとTCID50試験）
（１）Western blotによって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの吸着に対する影響が測定され
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈して、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、PK-15B6細胞にそれぞれ1mlの血清のないDMEMで希釈して作られた10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGを加え、37℃で1時間培養してから、冷やすPBSで3回洗浄し、冷やす血清のないDMEMと交換し、豚偽狂犬病ウイルスを4℃で感染させて（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）1時間培養してから、2mlの2％FBSを含むDMEM栄養液と交換し、37℃で5％CO2を含む培養箱に入れて、24時間感染させた後、細胞上清を収集し（1mlを-70℃に保存して後のTCID50実験で使用）、PBSで3回洗浄した後残液を吸収してから、2X-蛋白ローディングバッファーを加えて細胞サンプルを収集し、金属浴で96℃で15分間煮沸して、Westernblot検測を行った。結果が図4のAに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスｇEとUL42蛋白を低下させた表現が見つかり、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着を低下させうることを検証した。
没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスの吸着に対する影響（Western blot、蛍光定量PCRとTCID50試験）
（１）Western blotによって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの吸着に対する影響が測定され
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈して、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、PK-15B6細胞にそれぞれ1mlの血清のないDMEMで希釈して作られた10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGを加え、37℃で1時間培養してから、冷やすPBSで3回洗浄し、冷やす血清のないDMEMと交換し、豚偽狂犬病ウイルスを4℃で感染させて（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）1時間培養してから、2mlの2％FBSを含むDMEM栄養液と交換し、37℃で5％CO2を含む培養箱に入れて、24時間感染させた後、細胞上清を収集し（1mlを-70℃に保存して後のTCID50実験で使用）、PBSで3回洗浄した後残液を吸収してから、2X-蛋白ローディングバッファーを加えて細胞サンプルを収集し、金属浴で96℃で15分間煮沸して、Westernblot検測を行った。結果が図4のAに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスｇEとUL42蛋白を低下させた表現が見つかり、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着を低下させうることを検証した。
（２）TCID50によって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの吸着に対する影響が測定され
Vero細胞を8vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに2×103個の濃度で96WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れ、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、血清のないDMEMで希釈した異なる濃度のウイルス液を加え、各濃度を8回繰り返し測定し、1.5時間感染させた後、2％FBSを含むDMEM栄養液と交換して、72時間感染させた後細胞病変の状況を観察した。結果が図4のBに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染上清のウイルス力価を低下させ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着を低下させうることを検証した。
Vero細胞を8vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに2×103個の濃度で96WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れ、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、血清のないDMEMで希釈した異なる濃度のウイルス液を加え、各濃度を8回繰り返し測定し、1.5時間感染させた後、2％FBSを含むDMEM栄養液と交換して、72時間感染させた後細胞病変の状況を観察した。結果が図4のBに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染上清のウイルス力価を低下させ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着を低下させうることを検証した。
（３）蛍光定量PCRによって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの吸着に対する影響が測定され
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、5％ CO2を含む37℃の培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、1mlの血清のないDMEMで希釈して作られた10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGを加え、37℃で1時間培養してから、冷やすPBSで3回洗浄し、冷やす血清のないDMEMと交換し、豚偽狂犬病ウイルスを4℃で感染させて（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）1時間培養してから、PBSで洗浄した後残液を吸収してから、800μLのPBSを加え細胞剥離装置で細胞を剥離して、細胞サンプルを収集し（凍結解凍繰り返し不要）、DNAを抽出して、蛍光定量PCRの測定を行った。結果が図4のCに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルス核酸の複製数を減らすことができ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着を低下させることができることを検証した。
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、5％ CO2を含む37℃の培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、1mlの血清のないDMEMで希釈して作られた10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGを加え、37℃で1時間培養してから、冷やすPBSで3回洗浄し、冷やす血清のないDMEMと交換し、豚偽狂犬病ウイルスを4℃で感染させて（10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）1時間培養してから、PBSで洗浄した後残液を吸収してから、800μLのPBSを加え細胞剥離装置で細胞を剥離して、細胞サンプルを収集し（凍結解凍繰り返し不要）、DNAを抽出して、蛍光定量PCRの測定を行った。結果が図4のCに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルス核酸の複製数を減らすことができ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの吸着を低下させることができることを検証した。
実施例9
没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスの侵入に対する影響（Western blot、蛍光定量PCRとTCID50試験）
（１）Western blotによって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの侵入に対する影響が測定され
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈して、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、1mlの血清のない冷やすDMEMを加え、豚偽狂犬病ウイルスを4℃で感染させて1時間培養してから、冷やすPBSで3回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、1mlの2％FBSを含む冷やすDMEMを加えて（それぞれ10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）37℃で1時間培養してから、クエン酸で3回洗浄してからPBSで3回洗浄し、残液を吸収させてから、2ml 2％FBSを含むDMEM栄養液と交換し、37℃で5％CO2を含む培養箱に入れて、24時間感染させた後、細胞上清を収集し（1mlを-70℃に保存して後のTCID50実験で使用）、2X-蛋白ローディングバッファーを加えて細胞サンプルを収集し、金属浴で96℃で15分間煮沸して、Westernblot検測を行った。結果が図5のAに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスｇEとUL42蛋白を低下させた表現が見つかり、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの侵入を抑制できることを検証した。
没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスの侵入に対する影響（Western blot、蛍光定量PCRとTCID50試験）
（１）Western blotによって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの侵入に対する影響が測定され
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈して、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、1mlの血清のない冷やすDMEMを加え、豚偽狂犬病ウイルスを4℃で感染させて1時間培養してから、冷やすPBSで3回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、1mlの2％FBSを含む冷やすDMEMを加えて（それぞれ10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）37℃で1時間培養してから、クエン酸で3回洗浄してからPBSで3回洗浄し、残液を吸収させてから、2ml 2％FBSを含むDMEM栄養液と交換し、37℃で5％CO2を含む培養箱に入れて、24時間感染させた後、細胞上清を収集し（1mlを-70℃に保存して後のTCID50実験で使用）、2X-蛋白ローディングバッファーを加えて細胞サンプルを収集し、金属浴で96℃で15分間煮沸して、Westernblot検測を行った。結果が図5のAに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスｇEとUL42蛋白を低下させた表現が見つかり、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの侵入を抑制できることを検証した。
（２）TCID50によって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの侵入に対する影響が測定され
Vero細胞を8vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに2×103個の濃度で96WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れ、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、血清のないDMEMで希釈した異なる濃度のウイルス液を加え、各濃度を8回繰り返し測定し、1.5時間感染させた後、2％FBSを含むDMEM栄養液と交換して、72時間感染させた後細胞病変の状況を観察した。結果が図5のBに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染上清のウイルス力価を低下させ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの侵入を抑制できることを検証した。
Vero細胞を8vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに2×103個の濃度で96WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れ、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、血清のないDMEMで希釈した異なる濃度のウイルス液を加え、各濃度を8回繰り返し測定し、1.5時間感染させた後、2％FBSを含むDMEM栄養液と交換して、72時間感染させた後細胞病変の状況を観察した。結果が図5のBに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの感染上清のウイルス力価を低下させ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの侵入を抑制できることを検証した。
（３）蛍光定量PCRによって没食子酸エピガロカテキンがPK-15B6細胞上で豚偽狂犬病ウイルスの侵入に対する影響が測定され
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、5％ CO2を含む37℃の培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、1mlの血清のない冷やすDMEMを加え豚偽狂犬病ウイルスを感染させ、4℃で1時間培養してから、冷やすPBSで3回洗浄し、残液を吸収した後、1mlの2％FBSを含むDMEMを加え（それぞれ10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）37℃で1時間培養してから、クエン酸で3回洗浄してからPBSで3回洗浄し、残液を吸収させてから、800μLのPBSを加え細胞剥離装置で細胞を剥離して、細胞サンプルを収集し（凍結解凍繰り返し不要）、DNAを抽出して、蛍光定量PCRの測定を行った。結果が図5のCに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルス核酸の複製数を減らすことができ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの侵入を抑制できることを検証した。
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈し、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、5％ CO2を含む37℃の培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、1mlの血清のない冷やすDMEMを加え豚偽狂犬病ウイルスを感染させ、4℃で1時間培養してから、冷やすPBSで3回洗浄し、残液を吸収した後、1mlの2％FBSを含むDMEMを加え（それぞれ10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）37℃で1時間培養してから、クエン酸で3回洗浄してからPBSで3回洗浄し、残液を吸収させてから、800μLのPBSを加え細胞剥離装置で細胞を剥離して、細胞サンプルを収集し（凍結解凍繰り返し不要）、DNAを抽出して、蛍光定量PCRの測定を行った。結果が図5のCに示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルス核酸の複製数を減らすことができ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの侵入を抑制できることを検証した。
実施例10
没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスの複製に対する影響（Western blot）
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈して、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、1mlの血清のないDMEMを加え、豚偽狂犬病ウイルスを37℃の5％ CO2を含む培養箱で1時間感染させてから、PBSで3回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、2mlの2％FBSを含むDMEMを加えて（それぞれ10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）それぞれ4時間と6時間感染させた後、細胞サンプルを収集し、Westernblot検測を行った。結果が図6に示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスｇEとUL42蛋白を低下させた表現が見つかり、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの複製を抑制できることを検証した。
没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスの複製に対する影響（Western blot）
PK-15B6細胞を４vol％FBSを含むDMEM栄養液で希釈して、１穴あたりに5×105個の濃度で６WELL組織培養プレートに点滴し、37℃で5％のCO2を含む培養箱に入れて、細胞が培養箱内で器壁に接着し単層（約17-18時間）になると、PBS溶液で３回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、1mlの血清のないDMEMを加え、豚偽狂犬病ウイルスを37℃の5％ CO2を含む培養箱で1時間感染させてから、PBSで3回洗浄し、残留のPBS溶液を吸収させた後、2mlの2％FBSを含むDMEMを加えて（それぞれ10μM、20μM、50μM、100μMの濃度のEGCGが存在）それぞれ4時間と6時間感染させた後、細胞サンプルを収集し、Westernblot検測を行った。結果が図6に示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスｇEとUL42蛋白を低下させた表現が見つかり、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスの複製を抑制できることを検証した。
実施例11
エピガロカテキン3-ガラートが豚偽狂犬病ウイルスを直接殺す効果
PBSまたはEGCG（10μM、20μM、50μM、100μM）の溶液とPRVを37℃で1時間培養してから、PK-15B6細胞を接種し、1時間してから、PBSで3回洗浄し、2％DMEMと交換し、24時間後蛋白サンプルを収集し、Westernblotで豚偽狂犬病ウイルスの蛋白変化を観察した。この培養されたウイルスをTCID50によって豚偽狂犬病ウイルスの力価の変化を検測した。結果が図7に示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルス感染のウイルス力価を低下させ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスを直接殺すことができることを検証した。
エピガロカテキン3-ガラートが豚偽狂犬病ウイルスを直接殺す効果
PBSまたはEGCG（10μM、20μM、50μM、100μM）の溶液とPRVを37℃で1時間培養してから、PK-15B6細胞を接種し、1時間してから、PBSで3回洗浄し、2％DMEMと交換し、24時間後蛋白サンプルを収集し、Westernblotで豚偽狂犬病ウイルスの蛋白変化を観察した。この培養されたウイルスをTCID50によって豚偽狂犬病ウイルスの力価の変化を検測した。結果が図7に示すように、EGCGが豚偽狂犬病ウイルス感染のウイルス力価を低下させ、EGCGが豚偽狂犬病ウイルスを直接殺すことができることを検証した。
実施例12
没食子酸エピガロカテキンがマウス体での豚偽狂犬病ウイルス感染に対する影響
6週齢の雌マウスを7組に分けて、それぞれが健康対照群6匹（腹腔に相応量のPBSを注射）、投薬対照群6匹（腹腔に高用量の製剤を注射）、PRV投与対照群6匹（腹腔に相応量のPBSを注射）、4日前投薬群（低用量6匹、高用量6匹）、2日前投薬群（低用量6匹、高用量6匹）、PRV投与1時間後投薬群（低用量6匹、高用量6匹）。EGCGの濃度は20mg / mlで、低用量はマウスあたり20mg/kg、高用量はマウスあたり40mg/kgである。PRV投与量は1X104 TCID50で、PRVを投与する4日前に投薬群と4日前投薬群のマウスの腹腔にEGCGを注射し、同時に他の組のマスに相応量のPBSを注射し、4日間連続して投薬してから、PRVを投与した。2日前投薬群はPRVを投与する2日前に腹腔に投薬して、2日間連続して投与してからPRVを投与して、引き続き2日間連続して投薬した。PRVに投与1時間後投薬群は、PRVを1時間投与してから投薬し、連続して4日間投薬した。PRVを投与してから、毎日のマウスの死亡情報を統計していた。7日目にPRV投与対照群6匹が全部死亡し、4日前投薬群（低用量）と2日前投薬群（低用量）とがそれぞれ4匹生存、2匹死亡で、PRV投与1時間後投薬群（低用量）が3匹生存、3匹死亡で、健康対照群6匹と投薬対照群6匹と4日前投薬群（高容量）と2日前投薬群（高用量）とPRV投与1時間後投薬群（高容量）とが全員生存（図８に示すように）。これはEGCG（40mg/kg）が豚偽狂犬病ウイルス感染に完全な保護を提供できることを示し、EGCG（40mg/kg）が豚偽狂犬病ウイルス感染に対して予防と治療的効果を持っていることがわかる。
没食子酸エピガロカテキンがマウス体での豚偽狂犬病ウイルス感染に対する影響
6週齢の雌マウスを7組に分けて、それぞれが健康対照群6匹（腹腔に相応量のPBSを注射）、投薬対照群6匹（腹腔に高用量の製剤を注射）、PRV投与対照群6匹（腹腔に相応量のPBSを注射）、4日前投薬群（低用量6匹、高用量6匹）、2日前投薬群（低用量6匹、高用量6匹）、PRV投与1時間後投薬群（低用量6匹、高用量6匹）。EGCGの濃度は20mg / mlで、低用量はマウスあたり20mg/kg、高用量はマウスあたり40mg/kgである。PRV投与量は1X104 TCID50で、PRVを投与する4日前に投薬群と4日前投薬群のマウスの腹腔にEGCGを注射し、同時に他の組のマスに相応量のPBSを注射し、4日間連続して投薬してから、PRVを投与した。2日前投薬群はPRVを投与する2日前に腹腔に投薬して、2日間連続して投与してからPRVを投与して、引き続き2日間連続して投薬した。PRVに投与1時間後投薬群は、PRVを1時間投与してから投薬し、連続して4日間投薬した。PRVを投与してから、毎日のマウスの死亡情報を統計していた。7日目にPRV投与対照群6匹が全部死亡し、4日前投薬群（低用量）と2日前投薬群（低用量）とがそれぞれ4匹生存、2匹死亡で、PRV投与1時間後投薬群（低用量）が3匹生存、3匹死亡で、健康対照群6匹と投薬対照群6匹と4日前投薬群（高容量）と2日前投薬群（高用量）とPRV投与1時間後投薬群（高容量）とが全員生存（図８に示すように）。これはEGCG（40mg/kg）が豚偽狂犬病ウイルス感染に完全な保護を提供できることを示し、EGCG（40mg/kg）が豚偽狂犬病ウイルス感染に対して予防と治療的効果を持っていることがわかる。
上記の実施例からわかるのは、上記の没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルス感染に耐性効果が著しく、豚偽狂犬病ウイルスにより引き起こされた細胞病変を減少できるし、豚偽狂犬病ウイルスの吸着、侵入及び複製を抑制することができ、豚偽狂犬病ウイルスを直接殺すことができ、最も重要なのは没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスに感染したマウスを予防及び/または治療する事ができる。
以上述べたのは本発明の好適な実施形態だけであり、当業者にとっては、本発明の旨を逸脱することなく、いくつかの変更と置換を行うことができ、これらの変更と置換は本発明の保護範囲内に含まれると見なされるべきである。
Claims (10)
- 豚偽狂犬病ウイルス感染を予防及び/または治療する製剤の調製における没食子酸エピガロカテキンの応用。
- 請求項1に記載された応用において、上記の没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスの吸着、侵入及び複製を抑制することにより豚偽狂犬病を予防及び/または治療することを特徴とする応用。
- 請求項1に記載された応用において、上記の没食子酸エピガロカテキンが豚偽狂犬病ウイルスを直接殺すことにより豚偽狂犬病を予防及び/または治療することを特徴とする応用。
- 豚偽狂犬病ウイルス感染を予防及び/または治療する製剤であり、上記の製剤において没食子酸エピガロカテキンの濃度が10〜100μmol/Lであることを特徴とする製剤。
- 請求項5に記載された製剤において、没食子酸エピガロカテキンの濃度が20〜80μmol/Lであることを特徴とする製剤。
- 請求項5に記載された製剤において、没食子酸エピガロカテキンの濃度が40〜60μmol/Lであることを特徴とする製剤。
- 請求項5に記載された製剤において、上記の製剤の溶剤がPBS緩衝液またはDMSOであることを特徴とする製剤。
- 請求項7に記載された製剤において、上記のPBS緩衝液の濃度が0.05〜0.15μmol/Lであることを特徴とする製剤。
- 請求項8に記載された製剤において、上記のPBS緩衝液の濃度が0.08〜0.12μmol/Lであることを特徴とする製剤。
- 請求項5〜9のうちのいずれか一つの製剤において、上記の没食子酸エピガロカテキンを溶剤に溶かすことにより上記の製剤を取得することを特徴とする製剤。
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