CN102949387B - 用于治疗单纯疱疹病毒的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供绿茶多酚组合物和使用所述组合物治疗单纯疱疹病毒(HSV)的方法。代表性绿茶多酚包括(但不限于)(‑)‑表没食子儿茶素‑3‑没食子酸酯以及具有一种或一种以上酯连接脂肪酸的绿茶多酚。

Description

用于治疗单纯疱疹病毒的组合物和方法

相关申请案的交叉参考

本申请案主张2010年7月6日申请的美国临时申请案第61/361,752号的权益，并且是2008年2月7日申请的美国专利申请案第12/063,139号的部分接续申请案，所述第12/063,139号美国专利申请案是2006年8月6日申请的PCT/US2006/031120的国家阶段，所述PCT/US2006/031120主张2005年8月11日申请的美国临时专利申请案第60/707,234号的优先权，所有这些专利文献在容许时都以引用的方式全文并入本文中。

序列表的参考

依据37C.F.R.§1.52(e)(5)，作为文本文件随本案提交的名为“MCG_2009_017_Sequence_Listing_Text_File.txt，”的序列表是于2011年6月23日创建，且文件大小为14,471字节，以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明大体上涉及用于治疗病毒感染的组合物和方法，具体点说，涉及绿茶多酚组合物和使用所述组合物治疗或预防单纯疱疹病毒的方法。

背景技术

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是一种自身出现在两种常见病毒感染中的病毒，这两种病毒感染各自以皮肤或粘膜(例如，口或唇)中或生殖器上出现令人疼痛的水泡为标志。此种疾病具有传染性，且目前尚无针对HSV的解决办法或疫苗。发生于唇上的感染常称为“冷疮”或“热疱”。在发病期间，当无症状时，HSV在神经细胞体中处于休眠状态，在轴突内向皮肤转移发生病毒复制。当发病期过去时，病毒沿神经“消失”，最终其仅存在于神经体中。病毒休眠于神经体内将使治疗变得困难。

目前可用的治疗方法包括口服抗病毒药物，例如阿昔洛维(acyclovir)、泛西洛维(famciclovir)、喷西洛维(pancyclovir)、伐昔洛韦(valacyclovir)等，这些药物可缩短症状的持续时间，并加速愈合。治疗通常是从发病出现首个症状时开始。另一选择是使用每日抑制性疗法，在这一疗法中，每日服用抗病毒剂，持续数年时间。抑制性疗法可降低症状发生的频率并减少发病的复发。此外，抑制性疗法还可减少亚临床排毒，从而降低通过性接触或接吻传播的风险。

针对冷疮的非处方药治疗通常在短期内有效，且常常包括有毒成分。

服用任何抗病毒药物引起的重要问题是副作用，例如精神混乱、幻觉、烦渴、发红、起疱、皮肤(包括口内皮肤)剥落或松弛、排尿量减少、抽搐、皮疹或麻疹、胃痛、震颤、不常见的虚弱或疲劳、腹泻、眩晕、头痛、对阳光的敏感性增加、食欲减退、恶心或呕吐。

因此，本发明的目的在于，提供用于治疗个体所患病毒感染的一种或一种以上症状且具有较低副作用的改进的组合物和方法。

本发明另一目的在于，提供用于治疗个体HSV感染的方法和组合物。

发明内容

本发明提供用于治疗病毒感染，尤其单纯疱疹病毒(HSV)感染的组合物和方法。一个实施例提供用于治疗由HSV引起的病变的治疗性组合物。有用组合物包括含一种或一种以上绿茶多酚(green tea polyphenol，GTP)或其衍生物的组合物。这些组合物当在前驱期投予时可抑制由HSV引起的病变的形成，且当在相对于对照出现病变后投予时可明显缩短由感染HSV引起的病变的持续时间。示范性方法包括通过使细胞与含一种或一种以上GTP或其衍生物的组合物接触，来抑制细胞中HSV复制。另一方法包括通过局部投予个体含一种或一种以上GTP或其衍生物的组合物来治疗个体所患HSV的一种或一种以上症状。

代表性绿茶多酚包括(但不限于)(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、(-)-表儿茶素、(-)-表没食子儿茶素和(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯。还包括原花青素、这些GTP的对映异构体、异构体、药学上可接受的盐和前药。优选GTP经改性以含有一个或一个以上具有C₁到C₃₀基团的烃链。

附图说明

图1是描绘每毫升Vero细胞数与EGCG-酯浓度(微摩尔浓度)的关系的线图。上面的迹线表示活细胞，且下面的迹线表示死亡的细胞。

图2是描绘在490纳米下的吸光度与多酚浓度(微摩尔浓度)的关系的柱形图。每一组左边的柱形表示EGCG。每一组右边的柱形表示EGCG-酯。

图3是描绘HSV-1病毒滴度(PFU/毫升)与多酚浓度(微摩尔浓度)的关系的柱形图。

图4是描绘HSV1病毒滴度(PFU/毫升)与EGCG-酯浓度(微摩尔浓度)的关系的柱形图。

图5是描绘荧光性与稀释度的关系的线图。菱形表示大肠杆菌+GFP。方形表示大肠杆菌-GFP。读数是从荧光计上获取。

图6是描绘荧光性与单独细胞、HSV1/Vero或75微摩尔浓度EGCG-酯HSV1/Vero的关系的柱形图。测量GFP的表达。

图7是用于将GFP引入基因HSV1的UL46中的克隆策略的示意图。

图8是描绘阈值循环(threshold cycle)与对照物、EGCG和EGCG-酯的关系的柱形图。本图提供HSV1糖蛋白D的实时PCR数据。

图9是描绘相对数量与对照物、EGCG和EGCG-酯的关系的柱形图。数据显示HSV1糖蛋白D在HSV1/Vero、EGCG-HSV1/Vero和EGCG-酯-HSV1/Vero细胞中的扩增情况。

图10是描绘百分含量与正对照物、EGCG和EGCG-酯的关系的柱形图。

图11是EGCG-酯对HSV1的可能作用模式的示意图。

图12a是显示施用了3次EGCG-硬脂酸酯局部用制剂的HSV感染的发作期的照片。

图12b是HSV感染康复区域的照片，其显示施用了EGCG-硬脂酸酯局部用制剂后11小时没有发作征兆。施用EGCG-硬脂酸酯局部用制剂再持续2天。

图12c是未使用EGCG-硬脂酸酯局部用制剂的感染区域的照片。11小时后感染区域中起疱。

图13是显示早期HSV发作的征兆的照片。

图14是治疗前在发作当天(第1天)取得的照片，其显示感染区域中起疱期的开始。在取得这张照片后立即施用EGCG-硬脂酸酯局部用制剂。

图15是在第2天取得的照片，显示了结痂期。起疱现象受到抑制。

图16是在第3天取得的照片，显示了结痂期。

图17是在第4天取得的照片，显示了结痂期。

图18a是在第5天取得的照片，显示了愈合期。

图18b是在第5天取得的照片，显示了愈合期。

图19是在第6天取得的照片，显示了愈合期。

图20是在第7天取得的照片，显示感染区域已经愈合。

具体实施方式

I.定义

在阐明本发明各种实施例之前，应了解，本发明的应用不局限于以下描述中所陈述的组分的构造和布置细节。可按各种方式实行或进行其它实施例。还应了解，本文中使用的措辞和术语都是出于描述的目的，且不应视为限制。

在本发明中，将参考各种出版物、专利和公开的专利说明书。如果容许的话，那么这些出版物、专利和公开的专利说明书的揭示内容是以引用的方式全文并入本发明中，以便更完整地描述技术现状。

为便于了解本发明，提供以下定义：

除非上下文另作清楚规定，否则本文中使用的单数形式“一个(种)”和“所述”包括多个参照物。因此，例如提到“一个因素”是指一个因素或因素混合物，且提到“所述治疗方法”包括提到所属领域技术人员已知的等效步骤和方法等等。

本文中使用的“酰氧基”是指具有以下化学式的取代基：

其中R是直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基。

本文中使用的“烷氧基羰基”是指具有以下化学式的取代基：

其中R是直链、分支链或环状烷基。

术语“烯基”是指具有一个或一个以上双键的单价、未分支或分支链烃链。烯基的双键可以是非共轭的，或者可与另一不饱和基团共轭。

术语“炔基”是指具有一个或一个以上三键的单价、未分支或分支链烃链。炔基的三键可以是非共轭的，或者可与另一不饱和基团共轭。

术语“细胞”是指能够复制或分裂的膜结合生物单元。

术语“乳液”是指由两种相互不溶的组分制备的混合物。通过适当地选择和操作混合条件，有可能由这些组分产生具有均一宏观外观的混合物。最常见的乳液类型是使用水性组分和亲脂性组分的乳液，且其在此项技术中常常称为水包油型和油包水型乳液。在水包油型乳液中，亲脂相分散于水相中，而在油包水型乳液中，水相分散于亲脂相中。通常已知的适用于皮肤的乳液基制剂包括化妆品，例如乳霜、洗液、洗涤液、清洁剂、乳状物等，以及包含治疗皮肤病状、疾病或异常的成分的皮肤病学产品。

术语“绿茶多酚或GTP”是指茶(Camellia sinensis)叶中存在的多酚化合物。绿茶多酚包括(但不限于)(-)-表儿茶素(epicatechin，EC)、(-)-表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯(epicatechin-3-gallate，ECG)、(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)、原花青素，其对映异构体、其差向异构体、其异构体、其组合物和其前药。经改性绿茶多酚是指具有一个或一个以上烃链(例如C₁到C₃₀)的绿茶多酚，以及本文所揭示的式I和式II化合物。

术语“宿主”是指活生物体，包括(但不限于)哺乳动物，例如灵长类动物，尤其是人类。

本文中使用的“亲水性”是指具有易于与水相互作用的强极性基团的物质。

本文中使用的“疏水性”是指对水缺乏亲和性；倾向于斥水且不吸水；并且不溶解于水中或不与水混合的物质。

术语“分离的”当用于描述本文所揭示的各种组合物时，意思指经过鉴别并与天然环境的组分分开和/或自天然环境的组分回收的物质。举例来说，分离的多肽或聚核苷酸不与至少一种天然与其缔合的组分缔合。多肽或聚核苷酸的天然环境的污染组分是通常会干扰其诊断或治疗用途的材料，且可包括酶，以及其它蛋白质或非蛋白质溶质。分离的物质包括在重组细胞内的原位物质。然而，分离的物质一般是由至少一个纯化步骤制备。

本文中使用的“脂溶性”是指在例如蓖麻油等疏水性液体中溶解度大于或等于5克/100毫升的物质。

术语“脂溶性绿茶多酚”是指含有一个或一个以上具有例如C₁到C₃₀基团的烃链连接到多酚的绿茶多酚。C₁到C₃₀基团包括例如胆固醇。代表性脂溶性绿茶多酚包括本文所揭示的式I和式II的绿茶多酚。本术语可与“经改性绿茶多酚”互换使用。

术语“可操作地连接”是指各组分配置成毗邻以便执行其常用功能。举例来说，控制序列或启动子可操作地连接到编码序列将能够实现编码序列的表达，且细胞器定位序列可操作地连接到蛋白质将引导相连的蛋白质定位于特定细胞器。

术语“药学上可接受的载剂”是指不会对生物体产生显著刺激并且不会消除投予的化合物的生物活性和特性的载剂或稀释剂。

术语“药学上可接受的盐”是指保留游离碱的生物有效性和特性，并且通过与无机酸或有机酸反应获得的盐，所述无机酸或有机酸为例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、苹果酸、顺丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸等。

“药物组合物”是指一种或一种以上本文所述的绿茶多酚或其药学上可接受的盐与例如生理学上可接受的载剂和赋形剂等其它化学组分的混合物。药物组合物旨在便利将化合物投予生物体。

术语“前药”是指在体内转化成生物活性形式的试剂，包括核酸和蛋白质。由于在一些情况下，前药比母体化合物更易于投予，故其通常极为有用。例如，其可口服生物利用，而母体化合物不能。前药在药物组合物中还可具有优于母体药物的改进的溶解性。前药可通过包括酶过程和代谢水解在内的各种机制转化成母体药物。哈普(Harper，N.J.)(1962).药物潜伏化(Drug Latentiation)，居克(Jucker)编，药物研究进展(Progress in DrugResearch)，4：221-294；莫伦佐维奇(Morozowich)等人(1977).前药设计中物理有机原理的应用(Application of Physical Organic Principles to Prodrug Design)，罗技(E.B.Roche)编，借助前药和类似物设计生物药物特性(Design of BiopharmaceuticalProperties through Prodrugs and Analogs)，美国公共健康协会(APhA)；药物科学院(Acad.Pharm.Sci.)；罗技(E.B.Roche)编，(1977).药物设计中的生物可逆载剂：理论和应用(Bioreversible Carriers in Drug in Drug Design，Theory and Application)，美国公共健康协会；布德嘉德(H.Bundgaard)编，(1985)前药设计(Design ofProdrugs)，爱思唯尔出版社(Elsevier)；王(Wang)等人(1999)改进肽类药物的递送的前药方法(Prodrugapproaches to the improved delivery of peptide drug)，当代药物设计(Curr.Pharm.Design.)5(4)：265-287；布勒提(Pauletti)等人(1997).肽生物利用率的改进：模拟肽和前药策略(Improvement in peptide bioavailability：Peptidomimeticsand Prodrug Strategies)，先进药物递送综述(Adv.Drug.Delivery Rev.)27：235-256；米泽(Mizen)等人(1998).使用酯作为前药口服递送β-内酰胺类抗生素(The Use of Estersas Prodrugs for Oral Delivery of β-Lactam antibiotics)，制药生物技术(Pharm.Biotech.)11，：345-365；盖纳特(Gaignault)等人(1996).设计前药和生物前体I.载体前药(Designing Prodrugs and Bioprecursors I.Carrier Prodrugs)，实践药物化学(Pract.Med.Chem.)671-696；艾斯哈恩嘉德(M.Asgharnejad)(2000).利用前药改进口服药物转运(Improving Oral Drug Transport Via Prodrugs)，艾米顿(G.L.Amidon)，李(P.I.Lee)和托普(E.M.Topp)编，药物系统的转运方法(Transport Processes inPharmaceutical Systems)，马希尔戴克出版公司(Marcell Dekker)，第185-218页；布兰特(Balant)等人(1990)通过不同投药途径改进药物吸收的前药(Prodrugs for theimprovement of drug absorption via different routes of administration)，欧洲药物代谢与药物动力学杂志(Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet.)，15(2)：143-53；布莱蒙(Balimane)和三洋(Sinko)(1999).核苷类似物的口服吸收过程中涉及的多种转运蛋白(Involvement of multiple transporters in the oral ab sorption of nucleosideanalogues)，先进药物递送综述(Adv.Drug Delivery Rev.)，39(1-3)：183-209；鲍维(Browne)(1997).磷苯妥英(塞雷斯)(Fosphenytoin(Cerebyx))，临床神经药理学(Clin.Neuropharmacol.)20(1)：1-12；布德嘉德(Bundgaard)(1979).药物的生物可逆衍生化-改进药物治疗作用的原理和适用性(Bioreversible derivatization of drugs--principle and applicability to improve the therapeutic effects of drugs)，药物化学文献(Arch.Pharm.Chemi.)86(1)：1-39；布德嘉德(H.Bundgaard)编，(1985)前药的设计(Design of Prodrugs)，纽约(New York)：爱思唯尔出版社(Elsevier)；弗雷舍(Fleisher)等人(1996).口服药物递送的改进：通过使用前药克服溶解局限性(Improvedoral drug delivery：solubility limitations overcome by the use of prodrugs)，先进药物递送综述(Adv.Drug Delivery Rev.)19(2)：115-130；弗雷舍(Fleisher)等人(1985).有关借助肠酶靶向改进胃肠吸收的前药的设计(Design of prodrugs forimproved gastrointestinal ab sorption by intestinal enzyme targeting)，酶学方法(Methods Enzymol.)112：360-81；法奎哈(Farquhar D)等人(1983).生物可逆的磷酸酯保护基(Biologically Reversible Phosphate-Protective Groups)，药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)，72(3)：324-325；韩(Han，H.K.)等人(2000).(用于优化药物递送的靶向的前药设计Targeted prodrug design to optimize drug delivery)，AAPS药物科学杂志(AAPS PharmSci.)，2(1)：E6；酒户(Sadzuka Y.)(2000).有效的前药脂质体和成为活性代谢物的转化(Effective prodrug liposome and conversion to active metabolite)，当今药物代谢(Curr Drug Metab.)，1(1)：31-48；兰伯特(D.M.Lambert)(2000)脂质作为前药载剂的基本原理和应用(Rationale and applications oflipids as prodrugcarriers)，欧洲药物科学杂志(Eur.J.Pharm.Sci.)，11增刊2：S15-27；王(Wang，W.)等人(1999)用于改进肽类药物递送的前药方法(Prodrug approaches to the improveddelivery of peptide drugs.)当代药物设计(Curr.Pharm.Des.)，5(4)：265-87。

术语“取代的C₁到C₃₀”是指具有1到30个碳的烷基、烯基或炔基链，其中一个或一个以上碳独立地经包括(但不限于)卤素、羟基、芳基、杂环基或烷基酯在内的一个或一个以上基团取代。范围C₁到C₃₀包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉等，直到C₃₀，以及在C₁到C₃₀范围内的范围，例如C₁到C₂₉、C₂到C₃₀、C₃到C₂₈等。范围还包括小于C₃₀、小于C₁₉等。

术语“治疗”是指缓解、减轻或抑制疾病、病症、综合症或病状的一种或一种以上症状或生理学问题。

本文中使用的“水溶性”是指在水中的溶解度大于或等于5克/100毫升的物质。

术语“治疗”是指缓解、减轻或抑制疾病、病症、综合症或病状的一种或一种以上症状或生理学问题。

应理解，本文提供的数值范围包括每一中间整数。

II.单纯疱疹病毒

1型和2型单纯疱疹病毒(HSV)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)，α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesviridae)，单纯疱疹病毒属(Simplexvirus)。

A.HSV的结构

HSV病毒的测量直径为约200纳米。HSV1和HSV2是约152千碱基对(Kb)长的包膜双链DNA病毒，其含有两个DNA区段，称为独特长区(unique long，Ul)和独特短区(uniqueshort，Us)。(加纳(Garner)，先进药物递送综述(Advanced Drug Delivery Reviews).2003；55：1497-1513)。这一病毒粒子具有3个主要结构：称为包膜的外部部分，其包括11种糖蛋白(gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM)；由15种蛋白质构成的被膜层；以及封闭病毒DNA和4种结构蛋白的二十面体衣壳。(福斯特(Foster)等人，病毒学方法杂志(Journalof Virological Methods.)1998；75：151-160；加纳(Garner)，先进药物递送综述(Advanced Drug Delivery Reviews.)2003；55：1497-1513；维尔拉德(Willard)，病毒学杂志(Journal ofVirology).2002；10：5220-5232)。

B.HSV的生命周期

一旦人暴露于HSV，其细胞、分子和免疫系统生物学内就会发生一系列重要事件。位于病毒包膜上的数种糖蛋白将负责细胞识别、细胞融合和最终细胞进入(斯皮尔(Spear)等人，病毒学杂志(Journal of Virology.)2005；344：17-24；萨博曼尼(Subramanian)等人，PNAS.2006；104(8)：2903-2908)。HSV通过结合于细胞表面蛋白聚糖上所含的硫酸肝素链来实现与其宿主细胞的初次接触。病毒糖蛋白B和C将协助这一结合反应，同时糖蛋白D经过募集以结合一种宿主细胞受体。一旦糖蛋白D结合于细胞受体，糖蛋白B、H和L就会与糖蛋白D和细胞受体一起形成融合复合物。这一融合复合物将使病毒粒子的质膜与宿主细胞质膜融合，随后病毒核衣壳和被膜进入。因此，尽管糖蛋白D对于细胞识别和受体结合至关重要，但成功病毒吸附和融合需要全部五种糖蛋白(卡非(Carfi)等人，分子细胞(MolecularCell.)2001；8：169-179；斯皮尔(Spear)等人，病毒学杂志(Journal ofVirology.)2005；344：17-24)。

当在利用Vero细胞的实验中去除HSV-1糖蛋白B内富含赖氨酸的短区(KPKKNKKPK(SEQ ID NO：1))时，硫酸肝素无法被受体所结合。尽管在硫酸肝素链的初次结合期间，不需要糖蛋白B和C，但这两种糖蛋白会使这一过程更高效。因此，不仅gD，而且gB内这一富含赖氨酸的区域看起来都是感受态病毒进入宿主细胞中不可缺少的(卡非(Carfi)等人，分子细胞(Molecular Cell.)2001；8：169-179；斯皮尔(Spear)等人，病毒学杂志(Journal ofVirology.)2005；344：17-24)。

糖蛋白D识别数种宿主受体，并且可结合这些受体中的一种。这些受体包括疱疹病毒进入介体(HVEM，Herpesvirus entry mediator；TNF受体家族的成员)；结合素(nectin)-1或结合素-2(免疫球蛋白超家族的成员)；和由硫酸肝素和3-O-磺基转移酶反应产生的细胞表面上的位置(舒库拉(Shukla)等人，临床研究杂志(Journal ofClinicalInvestigations.)2001；108：503-510；斯皮尔(Spear)等人，病毒学杂志(JournalofVirology.)2005；344：17-24)。已经通过x射线结晶法获得HSV-1糖蛋白D的结构，并且发现gD内的数个氨基酸残基对于受体HVEM和结合素-1结合至关重要(卡非(Carfi)等人，分子细胞(Molecular Cell.)2001；8：169-179；马诺杰(Manoj)等人，PNAS.2004；101(34)：12414-12421；怀特贝克(Whitebeck)等人，病毒学杂志(Journal of Virology.)1997；71(8)：6083-6093)。经显示，HSV-1与HSV-2的糖蛋白D含有82％的氨基酸相似性。

一旦进入细胞中，HSV就接收细胞转运机器，以便接近内部细胞区室。病毒粒子以极快的方式在细胞质不同区域内到处移动，由此使病毒组分以极为高效的方式到达其目的地(维尔兰德(Willard，M.)，病毒学杂志(Journal ofVirology.)2002；10：5220-5232)。病毒粒子透过核孔被送入核，病毒基因组将进入核中并开始病毒转录和复制。HSV使用微管，在动力蛋白运动系统的帮助下通过逆行转运行进到核(贝雷(Bearer)等人，美国国家科学院院刊(Proceedings ofthe National Academy of Science.)2000；97(14)：8146-8150；加纳(Garner)，先进药物递送综述(Advanced Drug Delivery Reviews.)2003；55：1497-1513；斯坦贝利(Stanberry)，密西西比大学出版社(University Press of Mississipi.)第2版2006.)。能够进入核中对于病毒转录、翻译、复制以及DNA包装到子代核衣壳中必不可少。有趣的是，在例如Vero细胞等扁平细胞中，实现成功的感染未必需要利用微管转运病毒粒子的过程。Vero细胞可以利用扩散将病毒粒子转运到核(纽卡姆(Newcomb)等人，分子生物学杂志(Journal ofMolecular Biology.)2007；370：633-642.)。

HSV-1和HSV-2在溶解感染期间感染上皮细胞，并在潜伏感染过程中移到感觉神经元。在潜伏感染期间，病毒在神经细胞内处于休眠状态，直到其被触发而进入溶解循环(康(Kang)等人，病毒学(Virology.)2003；312：233-244；斯坦贝利(Stanberry)，密西西比大学出版社(University Press of Mississipi.)第2版2006.)。这使得HSV能在感染HSV的患者的一生中长久地存活并复制(康(Kang)等人，病毒学(Virology.)2003；312：233-244；维索卡(Wysocka)等人，生物化学趋势(Trends in Biochemical Sciences.)2003；28(6)：294-304.)。对于变为潜伏状态的病毒，病毒粒子须由初始感染部位处的神经轴突行进到感觉神经节。潜伏感染的神经细胞不能复制HSV的DNA，但其产生具有较短基因组序列的mRNA，称为潜伏相关转录物(latency associated transcript，LAT)。去除这一序列进行的研究显示，病毒不能引起复发感染。(康(Kang)等人，病毒学(Virology.)2003；312：233-244。)

这些潜伏感染的细胞可能在较长时间内不起反应，但会在其生命历程的任一时间再活化。有数种因素可能与病毒再活化有关，例如应激、热、冷、紫外光、情绪反应以及垂体或肾上腺激素。当病毒再活化时，病毒基因组在轴突中通过顺行转运行进到上皮，在上皮中，病毒将进行复制(法塔扎德(Fatahzadeh)等人，美国皮肤病学会杂志(AmericanAcademy ofDermatology.)2007；6(27)：737-763；斯皮尔(Spear)等人，病毒学杂志(Journal of Virology.)2005；344：17-24)。

尽管人类是唯一已知的HSV感染的天然宿主，但在实验室中，培养的来自多种不同动物的细胞，例如来自绿猴肾细胞的Vero细胞，也会感染HSV(福斯特(Foster)等人，病毒方法杂志(Journal of Virological Methods.)1998；75：151-160)。利用HSV病毒粒子进行的体外实验不涉及动物的免疫系统，使得病毒能高效地感染细胞。因此，数种细胞含有通过HSV的包膜糖蛋白gD使病毒进入所需的至少一种受体(斯皮尔(Spear)等人，病毒学杂志(Journal of Virology.)2005；344：17-24.)。

冷疮由最初表现到完全愈合分为5个阶段。第一个迹象是前驱期，其由将爆发病变的确切位置的麻刺感、瘙痒、发炎、红斑、超敏反应和/或酸痛组成。前驱症状通常持续1到2天，并且当起疱时结束，这是起疱期开始的信号。这些疱中充满透明的黄色液体。当介入的空间中出现越来越多的疱时，数个分开的疱看来似乎会聚结起来。约2天后，这些疱开始破裂，暴露出变为灰色的红斑状开放性创口。这就是渗出期(weeping stage)。高感染性浅黄色液体从创口渗出，持续约1天。在结痂期(scabbing stage)中，创口覆盖浅黄色的痂，持续2到3天。疮痂下的皮肤继续感到疼痛和瘙痒，并且这些疮痂开始破裂和出血。随着这一阶段缓慢消除，患者进入愈合期。继发的疮痂逐步变小且缓慢脱落，露出粉色皮肤，皮肤逐渐呈现周围未受影响的表皮的外观。这一病状通常持续7到10天，但其也可能持续长达2周。

C.治疗HSV

局部治疗冷疮的大部分非处方药是用于减轻疼痛的局部麻醉剂、皮肤保护剂(石油或氧化锌)或消毒剂。这些局部治疗剂中的大部分都试图减轻冷疮的疼痛、不适和减少其出现，但对病变的持续时间通常具有极少作用。此外，已经开发出试图减少病变发作的发生以及试图破坏体内病毒活性的抗病毒药物。这些抗病毒药物中有许多是口服的。也已经开发出试图减缓病变内病毒活动的局部治疗用抗病毒药物，且这些药物通常在形成囊泡前投予最为有效。

当前优选用于治疗口腔或生殖器HSV感染的抗病毒药物为阿昔洛维(佐韦斯(Zovirax)，葛兰素史克公司(Glaxo SmithKline)，位于北卡罗来纳州三角研究园(Research Triangle Park，NC))、伐昔洛韦(沃特斯(Valtrex)，葛兰素史克公司，位于北卡罗来纳州三角研究园)、喷西洛维(penciclovir)(德纳维(Denavir)，诺华制药公司(Novaris Pharma GmbH)，位于德国韦尔(Wehr，Germany))和泛西洛维(泛莫维(Famvir)，诺华制药公司(Novartis Pharmaceuticals Corporation)，位于新泽西州东汉诺威(EastHanover，NJ))。这些药物通常应口服7到10天。伐昔洛韦和泛西洛维会在体内分解成活性形式的药物(阿昔洛维和喷西洛维)。作为核苷类似物，这些药物能够切断病毒复制(布兰迪(Brady)等人，抗病毒研究(Antiviral Research.)2003；61：73-81；法塔扎德(Fatahzadeh)等人，美国皮肤病学会杂志(American Academy of Dermatology.)2007；6(27)：737-763；莫非(Morfin)等人，临床病毒学杂志(Journal of Clinical Virology.)2002；26：29-37)。

HSV胸苷激酶使阿昔洛维磷酸化，且宿主细胞使其进一步磷酸化，产生具有活性的三磷酸阿昔洛维。随后活性阿昔洛维可抑制病毒DNA聚合酶，阻止病毒DNA延长。使用这些药物的一个问题是，这些药物只有在HSV开始改变其胸苷激酶且对阿昔洛维和作为核苷类似物起作用的其它药物产生抗性之前有效(傅博特(Frobert)等人，抗病毒研究(AntiviralResearch.)2008；7928-7936；勒贝尔(Lebel)等人，临床病毒学杂志(Journal of ClinicalVirology.)2006；37：34-37)。

泛西洛维的作用模式也是通过类似于阿昔洛维的方法抑制病毒DNA聚合酶，但功效较低。泛西洛维能够在细胞内达到较高浓度，且半衰期比阿昔洛维长。其服用频率也比阿昔洛维低。最后，西多福韦(Cidofovir；一种无环5′-单磷酸核苷)被宿主细胞激酶磷酸化，并且能够以此方式抑制病毒DNA聚合酶。当DNA聚合酶基因突变时，也可能产生对西多福韦具有抗性的HSV(布兰迪(Brady)等人，抗病毒研究(Antiviral Research.)2003；61：73-81；斯坦贝利(Stanberry)，密西西比大学出版社(University Press of Mississipi.)第2版，2006)。由于服用这些不同药物会产生极强耐药性，故需要开发出更有效的新型药物来防止HSV排毒(莫非(Morfin)等人，临床病毒学杂志(Journal of Clinical Virology.)2002；26：29-37)。

III.绿茶多酚

一个实施例提供一种组合物，其具有一种或一种以上绿茶多酚，优选一种或一种以上经一个或一个以上具有C₁到C₃₀基团的烃链改性的绿茶多酚，或其组合。代表性绿茶多酚包括(但不限于)(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、(-)-表儿茶素、(-)-表没食子儿茶素和(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯。优选经改性GTP包括经改性的(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯，其药学上可接受的盐、前药或衍生物，其量可相比对照物有效治疗单纯疱疹病毒(HSV)感染。此项技术中已知实验对照物或对照组。一般说来，绿茶多酚组合物抑制HSV复制的作用可与不含绿茶多酚的组合物抑制HSV的作用相比较。代表性宿主包括哺乳动物，例如人类，或者来自例如人类等哺乳动物的细胞。

经改性GTP、绿茶多酚衍生物或变异体包括具有增加溶解性或增加宿主生物利用率的化学改性的绿茶多酚。在某些实施例中，这些化学改性包括添加在生理条件下带电荷的化学基团。在其它实施例中，改性包括绿茶多酚与例如多肽、碳水化合物、脂质或其组合等其它生物部分连结。优选改性包括用一个或一个以上具有C₁到C₃₀基团的烃链进行的改性。

另一实施例提供一种药物组合物，其包括一种或一种以上绿茶多酚、经改性绿茶多酚任选与药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合。所述一种或一种以上绿茶多酚和/或经改性绿茶多酚的量应有效治疗宿主所患病毒感染的一种或一种以上症状，例如抑制HSV复制。优选组合物含有抗病毒量的经改性绿茶多酚。在其它实施例中，组合物中的活性成分基本上由(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、经一个或一个以上具有C₁到C₃₀基团的烃链改性的(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯或其组合、其药学上可接受的盐或前药组成。活性成分可为单一光学异构体形式。通常，与另一光学异构体相比较，一种光学异构体的含量以重量计为超过85％、90％、95％或99％。应理解，组合物也可包括至少一种额外活性成分，例如第二治疗剂。下文将提供有关所揭示的药物组合物的额外描述。

A.表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)

绿茶是由茶植株产生。其富含儿茶素多酚，尤其是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。还未在任何其它植物中发现EGCG，而且其为茶中所见的主要儿茶素(夏朗格(Sharangi)，国际食品研究(Food Research International)2009；42：5-6.)。EGCG是作为安全消费品出现在FDA的清单上。(帕特森(Paterson)等人，科学(Science)2005；310：451-453。)科学家们已经证实，EGCG能够通过抑制包膜糖蛋白(gp120)与其受体(CD4)的结合来抑制HIV(威廉森(Williamson)等人，过敏与临床免疫学杂志(Journal ofAllergyClinical Immunology.)2006；118：1369-1374)。EGCG也通过与血凝素包膜糖蛋白相互作用，导致包膜结构改变，来抑制流感(宋(Song)等人，抗病毒反应(Antivirus Response).2005；68：66-74)。此外，EGCG还通过干扰病毒DNA合成并由此停止病毒复制来抑制乙型肝炎。(何(He)等人，世界胃肠病学杂志(World Journal of Gastroenterology.)2011；17(11)：1507-1514。)

尽管绿茶也已经成为数项其它研究的主题，但病毒学家们仍尝试集中于研究其是否具有抑制不同病毒感染的能力。在利用Vero细胞以及HSV-1和HSV-2进行的研究中，研究人员得出结论，EGCG以浓度依赖性方式成功地抑制HSV感染。其它绿茶儿茶素也经过了测试，但只有EGCG产生这一抑制作用。结果也显示，在HSV-1吸附和进入后，用EGCG处理Vero细胞不能抑制病毒产生。EGCG须在病毒吸附之前施用，才能观察到作用。此外，用EGCG处理Vero细胞后，HSV病毒粒子的包膜也被破坏。因此，EGCG看起来对抑制HSV具有直接作用(伊萨克(Isaacs)等人，抗菌剂和化疗(Antimicrobial Agents and Chemotherapy.)2008；52(3)：962-970)。

当用针对gB、gD和衣壳蛋白的抗体以免疫金技术标记经ECGC处理的HSV-1和未经处理的HSV-1时，与未经处理的病毒粒子相比较，经过处理的病毒粒子出现30％和40％的减少。因此，一旦用EGCG处理病毒，其包膜糖蛋白结合单克隆抗体的能力就会减弱(伊萨克(Isaacs)等人，抗菌剂和化疗(Antimicrobial Agents and Chemotherapy.)2008；52(3)：962-970)。

现在毫无疑问，绿茶中的EGCG化合物可抑制HSV，但在制备局部施用的EGCG时将面临的一个问题是，其特别不稳定且氧化极快，以致其在能够施用之前很久就丧失了其抗病毒能力。利用EGCG进行的大多数研究都须用新制的EGCG进行，否则其会丧失其有效抗病毒活性(陈(Chen)等人，浙江大学学报(Journal ofZhejiang University Science.)2003；6：714-718；陈(Chen)等人，绿茶和健康研究指南(Handbook of Green Tea and HealthResearch.)ISBN978-1-60741-045-4，编辑：麦肯雷(H.McKinley)和杰米森(M.Jamieson)，pp.2009，诺华科学出版公司(Nova Science Publishers，Inc.))。此外，由于EGCG具有水溶性，故人们不能从其局部施用形式获益。

B.经改性绿茶多酚的组合物

绿茶多酚在脂质介质中溶解性较弱。因此，所揭示的亲脂性茶多酚也可用于脂溶性介质中。亲脂性茶多酚(LTP；或经改性绿茶多酚)可由绿茶多酚(GTP)催化酯化制备。

因此，提供含有经改性绿茶多酚的组合物，所述绿茶多酚经改性以相对于未经改性的绿茶多酚增加绿茶多酚对皮肤和细胞膜的渗透性或增加其在疏水性介质中的溶解性。可经改性的绿茶多酚包括(但不限于)(-)-表儿茶素(EC)、(-)-表没食子儿茶素(EGC)、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯(ECG)、(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、原花青素，其对映异构体、其差向异构体、其异构体、其组合物和其前药。一个实施例提供在一个或一个以上位置具有酯连接的C₁到C₃₀烃链(例如脂肪酸)的绿茶多酚。另一实施例提供具有一个或一个以上胆固醇基团连接到多酚的绿茶多酚。胆固醇基团可例如借助于醚键联直接连接到多酚，或C₁到C₁₀连接基可将胆固醇基团连接到多酚。

另一实施例提供具有一个或一个以上酰氧基的绿茶多酚化合物，其中酰基为C₁到C₃₀酰基。相信与未经改性的绿茶多酚相比较，例如经由脂肪酸酯化将烷基、烯基或炔基链添加到绿茶多酚中可增加绿茶多酚的稳定性，并增加绿茶多酚在包括脂质、脂肪、肥皂、去污剂、表面活性剂或油在内的疏水性介质中的溶解性。相信与未经改性的绿茶多酚相比较，具有一个或一个以上烃链(例如酯连接的C₁到C₃₀基团或C₁到C₃₀酰氧基)的绿茶多酚更易渗透皮肤或细胞膜，并由此使含酯连接的烃链或含酰氧基的绿茶多酚易于进入细胞，并对细胞具有生物作用，例如调节基因表达。应理解，一个或一个以上烃链可使用除酯键联外的键联(例如硫键联)连接到绿茶多酚。酯化的绿茶多酚可与油、去污剂、表面活性剂或其组合相组合，产生可清洁皮肤并将绿茶多酚递送到皮肤的组合物。这些油、去污剂或表面活性剂通过减少绿茶多酚与水性介质的接触，有利地增加了绿茶多酚的稳定性。某些实施例提供所揭示的经改性绿茶多酚的单一光学异构体、对映异构体或差向异构体。其它实施例提供含有所揭示的经改性绿茶多酚的单一光学异构体、对映异构体或差向异构体的组合物。

一个实施例提供式I化合物：

式I

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₇各自独立地为H、OH、

其中R₈是直链、分支链或环状、饱和或不饱和、取代或未取代的C₁-C₃₀基团，其中如果R₈是环状，那么R₈是C₃-C₃₀基团；且

R₆是O、-NR₉R₁₀或S，其中R₉和R₁₀独立地为氢，或者直链、分支链或环状、饱和或不饱和、取代或未取代的C₁-C₃₀基团，其中如果R₉和/或R₁₀为环状，那么R₉和/或R₁₀为C₃-C₃₀基团；

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₇、R₉或R₁₀中至少一个为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

在优选的式I实施例中，R₈是直链或分支链烷基链。在更优选的式I实施例中，R₈是直链或分支链C₁₆-C₂₅烷基。在特别优选的式I实施例中，R₈为C₁₇H₃₅基团。

一个实施例提供如上文所述的式I化合物，条件是当R₁、R₂、R₃、R₅和R₇为OH时，R₄不为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

一个实施例提供如上文所述的式I化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₇中至少两者独立地为

条件是当R₁、R₂、R₃、R₅为OH且R₇是时，R₄不为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供如上文所述的式I化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₇中至少三者独立地为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供如上文所述的式I化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₇中至少四者独立地为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供式II化合物：

式II

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地为H、OH、

R₁₁是直链、分支链或环状、饱和或不饱和、取代或未取代的C₁-C₃₀基团，其中如果R₁₁是环状，那么R₁₁是C₃-C₃₀基团；

R₅和R₆独立地为O、-NR₁₂R₁₃或S，其中R₁₂和R₁₃独立地为氢，或者直链、分支链或环状、饱和或不饱和、取代或未取代的C₁-C₃₀基团，其中如果R₁₂和/或R₁₃为环状，那么R₁₂和/或R₁₃为C₃-C₃₀基团；且

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少一个独立地为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

在优选的式II实施例中，R₁₁是直链或分支链烷基链。在更优选的式II实施例中，R₁₁是直链或分支链C₁₆-C₂₅烷基。在特别优选的式II实施例中，R₁₁为C₁₇H₃₅基团。

另一实施例提供式II化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少两者独立地为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供如上文所述的式II化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少三者独立地为任选与赋形剂组合。

另一实施例提供如上文所述的式II化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少四者独立地为任选与赋形剂组合。

另一实施例提供式II化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地为H、OH、

R₁₁是直链、分支链或环状、饱和或不饱和、取代或未取代的C₁-C₃₀基团，其中如果R₁₁是环状，那么R₁₁是C₃-C₃₀基团；

R₅和R₆独立地为O、-NR₁₂R₁₃或S，其中R₁₂和R₁₃独立地为氢，或者直链、分支链或环状、饱和或不饱和、取代或未取代的C₁-C₃₀基团，其中如果R₁₂和/或R₁₃为环状，那么R₁₂和/或R₁₃为C₃-C₃₀基团；且

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少一个独立地为

且其中当R₁、R₂、R₃、R₇、R₈、R₉和R₁₀是OH时，R₄不为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供包括式II化合物的组合物，在式II化合物中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少两者独立地为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供包括如上文所述的式II化合物的组合物，在式II化合物中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少三者独立地为任选与赋形剂组合。

另一实施例提供包括如上文所述的式II化合物的组合物，在式II化合物中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少四者独立地为任选与赋形剂组合。

另一实施例提供包括式II化合物的组合物，在式II化合物中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地为H、OH、

R₁₁是直链、分支链或环状、饱和或不饱和、取代或未取代的C₁-C₃₀基团，其中如果R₁₁是环状，那么R₁₁是C₃-C₃₀基团；

R₅和R₆独立地为O、-NR₁₂R₁₃或S，其中R₁₂和R₁₃独立地为氢，或者直链、分支链或环状、饱和或不饱和、取代或未取代的C₁-C₃₀基团，其中如果R₁₂和/或R₁₃为环状，那么R₁₂和/或R₁₃为C₃-C₃₀基团；且

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少一个独立地为

且其中当R₁、R₂、R₃、R₇、R₈、R₉和R₁₀是OH时，R₄不为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

一个实施例提供式III化合物：

式III

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₇各自独立地为H、OH、

其中R₈是直链或分支链C₁₆-C₂₅烷基。

R₆是O、-NR₉R₁₀或S，其中R₉和R₁₀独立地为氢，或者直链、分支链或环状、饱和或不饱和、取代或未取代的C₁-C₃₀基团，其中如果R₉和/或R₁₀为环状，那么R₉和/或R₁₀为C₃-C₃₀基团；

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₇、R₉或R₁₀中至少一个为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

在特别优选的式III实施例中，R₈是C₁₇H₃₅基团。

一个实施例提供如上文所述的式III化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₇中一者或一者以上为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

一个实施例提供如上文所述的式III化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₇中至少两者独立地为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供如上文所述的式III化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₇中至少三者独立地为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供如上文所述的式III化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₇中至少四者独立地为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供式IV化合物：

式IV

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地为H、OH、

R₁₁是直链或分支链C₁₆-C₂₅烷基；

R₅和R₆独立地为O、-NR₁₂R₁₃或S，其中R₁₂和R₁₃独立地为氢，或者直链、分支链或环状、饱和或不饱和、取代或未取代的C₁-C₃₀基团，其中如果R₁₂和/或R₁₃为环状，那么R₁₂和/或R₁₃为C₃-C₃₀基团；且

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少一个独立地为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

在特别优选的式IV实施例中，R₁₁为C₁₇H₃₅基团。

一个实施例提供如上文所述的式IV化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中一者或一者以上为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供式IV化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少两者独立地为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供如上文所述的式IV化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少三者独立地为任选与赋形剂组合。

另一实施例提供如上文所述的式IV化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少四者独立地为任选与赋形剂组合。

另一实施例提供包括式IV化合物的组合物，在式IV化合物中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少一者独立地为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供包括式IV化合物的组合物，在式IV化合物中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少两者独立地为

或其药学上可接受的盐或前药，任选与赋形剂组合。

另一实施例提供包括如上文所述的式IV化合物的组合物，在式IV化合物中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少三者独立地为 任选与赋形剂组合。

另一实施例提供包括如上文所述的式IV化合物的组合物，在式IV化合物中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉和R₁₀中至少四者独立地为 任选与赋形剂组合。

在一个实施例中，提供用一种脂肪酸酯化的绿茶多酚。另一实施例提供用至少两种脂肪酸酯化的绿茶多酚。某些实施例提供用一种或一种以上具有超过16个碳的烃链的脂肪酸酯化的绿茶多酚。优选的实施例提供用一种或一种以上烃链长度介于17与25个碳之间的脂肪酸酯化的绿茶多酚。特别优选的实施例提供用一种或一种以上硬脂酸链酯化的绿茶多酚。

代表性绿茶多酚包括(但不限于)(-)-表儿茶素(EC)、(-)-表没食子儿茶素(EGC)、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯(ECG)、(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)。代表性脂肪酸包括(但不限于)丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、9-十六碳烯酸、十八烷酸(硬脂酸)、9-十八碳烯酸、11-十八碳烯酸、9，12-十八碳二烯酸、9，12，15-十八碳三烯酸、6，9，12-十八碳三烯酸、二十烷酸、9-二十碳烯酸、5，8，11，14-二十碳四烯酸、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、二十二烷酸、13-二十二碳烯酸、4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸和二十四烷酸。

EGCG酯化

HSV1和HSV2是全世界人群所面临的严重威胁，据显示，感染这一疾病的人数逐年增加。先前已经提出EGCG的治疗性用药，但EGCG的原始形式不适于局部施用并且不发生迅速氧化和抗病毒活性的丧失。另一方面，EGCG-酯将成为达成这一目的的理想候选物。EGCG与脂类的酯可通过酶方法或化学方法形成(陈(Chen)等人，浙江大学学报(Journal ofZhejiang University Science.)2003；6：714-718)。

中国的陈(Chen)等人先前已经纯化出EGCG-酯。这种酯是由绿茶多酚与C16脂肪酸之间发生催化酯化反应得到。这一酯化反应是通过将4克绿茶多酚与6.5克十六酰氯混合而实现。接下来，在40℃下，将50毫升乙酸乙酯和催化剂添加到混合物中。搅拌3小时后，用30毫升去离子水洗涤溶液3次。接着使有机层蒸发，并使用真空在40℃下进一步干燥。由此得到8.7克粉末状产物。针对GTP与十六酰氯之间可能发生的酯化反应的示意性合成方法显示于下文。(陈(Chen)等人，浙江大学学报(Journal of Zhejiang University Science.)2003；6：714-718。)

接下来，使用高速流动色谱分离法(high current chromatography separation)纯化EGCG-酯产物。在分离柱中，使用由(1∶1)正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水构成的两相溶剂。将5克EGCG-酯溶解于50毫升上层溶液相中。进行纯化和HPLC分析后，发现成功纯化出EGCG酯。EGCG酰基衍生物的结构显示于下文。(陈(Chen)等人，浙江大学学报(Journal ofZhejiang University Science.)2003；6：714-718。)

在优选实施例中，根据上述结构，EGCG的4′位由硬脂酸酯化。

C.生物活性成分和组合疗法

含有所揭示的绿茶多酚的组合物任选包括一种或一种以上生物活性剂或额外治疗剂。在某些实施例中，一种或一种以上生物活性剂可与绿茶多酚连结。生物活性剂包括治疗剂、预防剂和诊断剂。这些试剂可以是有机或无机分子、蛋白质、肽、糖、多糖、茶皂素、维生素、胆固醇或核酸分子。代表性维生素包括(但不限于)脂溶性维生素，例如维生素D、维生素E或其组合。治疗剂的实例包括蛋白质，例如激素、抗原和生长效应分子；核酸，例如反义分子；以及有机或无机小分子，例如抗菌剂、抗组胺剂、免疫调节剂、解充血剂、神经活性剂、麻醉剂、氨基酸和镇静剂。诊断剂的实例包括放射性同位素和造影剂(radiopaque agent)。

1.抗牛皮癣剂

除经改性绿茶多酚外，适合的抗牛皮癣剂还包括(不限于)水杨酸；糠酸莫美他松(mometasone furoate)；类固醇类，包括皮质类固醇类，例如可的松(cortisone)，和奥鲁斯(olux)，即丙酸氯倍他索(clobetasol propionate)；5-氟尿嘧啶；肾上腺素；地蒽酚(anthralin)；维生素D3类似物，例如卡泊三醇(calcipotriene)；甲氨喋呤(methotrexate)；马索罗酚(masprocol)；葡糖醛酸三甲曲沙(trimethaxate gluconate)；类视黄醇(retinoid)；环孢霉素(cyclosporin)；紫杉醇(paclitaxel)；5-氨基乙酰丙酸；博盖索(bergasol)；乙基锡初紫红素(tin-ethyl etio purpurin)；苯并卟啉衍生物；抗体，例如ABX-IL8抗体、CD11a单克隆抗体和ICM3单克隆抗体；酶抑制剂，包括类胰蛋白酶抑制剂和磷脂酶A-2抑制剂；血管生成阻断剂；T细胞阻断剂，及其混合物。

2.抗真菌剂

可以使用多种已知的抗真菌剂来制备所述组合物。可能的抗真菌剂的清单可见于“马丁代尔氏大药典(Martindale-The Complete Drug Reference)”，第32版，凯瑟琳帕菲特(Kathleen Parfitt)，(1999)第367-389页中。适合的抗真菌剂包括(不限于)两性霉素(amphotericin)、阿莫罗芬(amorolfine)、联苯苄唑(bifonazole)、溴氯水杨酰苯胺(bromochlorosalicyanilide)、丁氯柳胺(buclosamide)、布替萘芬(butenafine)、布康唑(butoconazole)、克念菌素(candicidin)、氯登妥因(chlordantoin)、氯米达唑(chlormidazole)、氯苯甘醚(chlorphenesin)、氯二甲酚(chlorxylenol)、环吡酮胺(ciclopirox olamine)、西洛芬净(cilofungin)、克霉唑(clotrimazole)、氯康唑(croconazole)、依柏康唑(eberconazole)、益康唑(econazole)、恩康唑(enilconazole)、芬替克洛(fenticlor)、芬替康唑(fenticonazole)、氟康唑(fluconazole)、氟胞嘧啶(flucytosine)、灰黄霉素(griseofulvin)、曲古霉素(hachimycin)、卤普罗近(haloprogin)、羟基芪脒(hydroxystilbamine)、羟乙基磺酸盐(isethionate)、碘氯羟基苯醌(iodochlorohydroxyquinone)、异康唑(isoconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、拉诺康唑(lanoconazole)、鲁氟卡本(luflucarban)、美帕曲星(mepartricin)、咪康唑(miconazole)、萘替芬(naftifine)、那他霉素(natamycin)、奈康唑(neticonazole)、硝呋醛肟(nifuroxime)、制霉菌素(nystatin)、奥莫康唑(omoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、喷他霉素(pentamycin)、丙酸、丙噻酯(protiofate)、吡咯尼群(pyrrolnitrin)、拉夫康唑(ravuconazole)、沙康唑(saperconazole)、硫化硒、舍他康唑(sertaconazole)、舒苯汀(sulbentine)、硫康唑(sulconazole)、特比萘芬(terbinafine)、特康唑(terconazole)、噻康唑(tioconazole)、托西拉酯(tolciclate)、托萘酯(tolnaftate)、三醋汀(triacetin)、他咪唑(timidazole)、十一碳烯酸、伏立康唑(voriconazole)和其组合。已知这些药剂中有一些也具有抗细菌活性。

在一个实施例中，抗真菌剂是一种唑。适合的咪唑和三唑抗真菌剂为氟康唑、他咪唑、塞克硝唑(secnidazole)、硝酸咪康唑、益康唑、卤普罗近、甲硝唑(metronidazole)、伊曲康唑、特康唑、泊沙康唑(posaconazole)、拉夫康唑、酮康唑、克霉唑(clotimazole)、沙康唑(sapirconazole)和其组合。

在替代性实施例中，抗真菌剂是氯二甲酚、十一碳烯酸、硫化硒、碘氯羟基苯醌、溴氯水杨酰苯胺、三醋汀或其组合。

其他抗真菌剂包括苄硫嗪酸(bensuldazic acid)、苯甲酸、苯柳胺酯(biphenamine)、氯康唑(cloconazole)、氯羟喹(cloxyquin)、制皮菌素(dermostatin)、哈利他唑(halethazole)、莫能星(monensin)、奥昔康唑、硝酸盐、培西洛星(pecilocin)、吡啶硫酮(pyrithione)、红藜芦碱(rubijervine)、特比萘芬、替康唑(ticonazole)和十一碳烯酸(undecylinic acid)。

3.抗细菌剂

可以使用多种已知的抗细菌剂来制备所述组合物。可能的抗细菌剂的清单可见于“马丁代尔氏大药典(Martindale-The Complete Drug Reference)”，第32版，凯瑟琳帕菲特(Kathleen Parfitt)，(1999)第112-270页中。有用的抗细菌剂的类别包括氨基糖苷类、抗分枝杆菌剂、头孢菌素类(cephalosporins)和β-内酰胺类、氯霉素类(chloramphenicols)、糖肽类、林可胺类(lincosamides)、大环内酯类(macrolides)、青霉素类(penicillins)、喹诺酮类(quinolones)、磺酰胺类和二氨基吡啶类、四环素类和其它类别的抗细菌剂。在优选实施例中，抗细菌剂选自由以下组成的群组：甲硝唑、他咪唑、塞克硝唑、红霉素(erythromycin)、百多邦(bactoban)、莫匹罗星(mupirocin)、新霉素(neomycin)、杆菌肽(bacitracin)、环吡酮(cicloprox)、氟喹诺酮(fluoriquinolone)、氧氟沙星(ofloxacin)、头孢氨苄(cephalexin)、双氯西林(dicloxacillin)、米诺环素(minocycline)、利福平(rifampin)、泛西洛维、克林霉素(clindamycin)、四环素和庆大霉素(gentamycin)。

适合的氨基糖苷类抗细菌剂包括源自链霉菌(Streptomyces)和其它放线菌目(actinomycetale)的抗生素，包括链霉素(streptomycin)、新霉素B(framycetin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、巴龙霉素(paramomycin)和妥布霉素(tobramycin)，以及庆大霉素、紫苏霉素(sissomycin)、奈替米星(netilmycin)、异帕米星(isepamicin)和小诺米星(micronomycin)。

适合的抗分枝杆菌剂包括利福霉素(rifamycin)、利福昔明(rifaximin)、利福平(rifampicin)、利福布汀异烟肼(rifabutinisoniazid)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、乙氨丁醇(ethambutol)、链霉素、氨硫脲(thiacetazone)、氨基水杨酸、卷曲霉素(capreomycin)、环丝氨酸(cycloserine)、氨苯砜(dapsone)、氯法齐明(clofazimine)、乙硫异烟胺(ethionamide)、丙硫异烟胺(prothionamide)、氧氟沙星和米诺环素。

头孢菌素类和β-内酰胺类抗细菌剂一般对革兰氏阳性细菌具有活性，且新生代化合物也对革兰氏阴性细菌具有活性。适合的头孢菌素类和β-内酰胺类抗细菌剂包括：

第一代：头孢噻吩(cephalothin)、头孢唑林(cephazolin)、头孢拉定(cephradine)、头孢噻啶(cephaloridine)、头孢沙定(cefroxadine)、头孢羟氨苄(cephadroxil)、头孢曲嗪(cefatrizine)、头孢氨苄(cephalexin)、特头孢氨苄(pivcephalexin)、头孢克洛(cefaclor)和头孢丙烯(cefprozil)。

第二代：头孢孟多(cephamandole)、头孢呋辛酯(cefuroxime axetil)、头孢尼西(cefonicid)、头孢雷特(ceforanide)、头孢替安(cefotiam)和头霉素(cephamycin)。

第三代：头孢噻肟(cefotaxime)、头孢甲肟(cefmenoxime)、头孢地秦(cefodizime)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢克肟(cefixime)、头孢地尼(cefdinir)、头孢他美(cefetamet)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢布烯(ceftibuten)、拉氧头孢(latamoxef)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢匹胺(cefpiramide)和头孢磺啶(cefsulodin)。

第四代：头孢吡肟(cefepime)和头孢匹罗(cefpirome)。

其它头孢菌素类抗细菌剂包括头孢西丁(cefoxitim)、头孢美唑(cefmetazole)、头孢替坦(cefotetan)、头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢米诺(cefminox)、亚氨培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、氨曲南(aztreonam)、卡芦莫南(carumonam)和劳拉头孢(loracarbef)。

氯霉素类可抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。适合的氯霉素类抗细菌剂包括氯霉素、其琥珀酸钠衍生物、甲砜霉素(thiamphenicol)和叠氮氯霉素(azidamfenicol)。

适合的糖肽类抗细菌剂包括万古霉素(vancomycin)、替考拉宁(teicoplanin)和雷莫拉宁(ramoplanin)。适合的林可胺类抗细菌剂包括林可霉素(lincomycin)和克林霉素(clindamycin)，主要用于治疗需氧菌感染。

大环内酯类具有连接糖的内酰胺环。适合的大环内酯类抗细菌剂包括红霉素(erytjhromycin)以及螺旋霉素(spiromycin)、竹桃霉素(oleandomycin)、交沙霉素(josamycin)、吉他霉素(kitamycin)、麦迪霉素(midecamycin)、罗他霉素(rokitamycin)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、罗红霉素(roxithromycin)、氟红霉素(flurithromycin)、泰洛星(tylosin)；和链阳性菌素(streptgramin)或协同菌素(synergistin)，包括普那霉素(pristinamycin)和维吉霉素(virginiamycin)；及其组合。

适合的青霉素类抗细菌剂包括天然青霉素和半合成青霉素F、G、X、K和V。较新的青霉素类抗细菌剂包括非奈西林(phenethicillin)、丙匹西林(propicillin)、甲氧西林(methicilin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、苯唑西林(oxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨苄西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、巴氨西林(bacampicillin)、海他西林(hetacillin)、美坦西林(metampicillin)、匹氨西林(pivampicillin)、卡苯尼西林(carbenecillin)、卡非西林(carfecillin)、卡茚西林(carindacillin)、磺苄西林(sulbenecillin)、替卡西林(ticarcillin)、阿洛西林(azlocillin)、美洛西林(mezlocillin)、哌拉西林(piperacillin)、替莫西林(temocillin)、美西林(mecillinam)和匹美西林(pivemecillinam)。通常共投予内酰胺酶抑制剂，例如克拉维酸(clavulanicacid)、舒巴坦(sulbactam)和他唑巴坦(tazobacytam)。

适合的喹诺酮类抗细菌剂包括萘啶酸(nalidixic acid)、奥索利酸(oxolinicacid)、西诺沙星(cinoxacin)、克索沙星(acrosoxacin)、吡呱酸(pipemedic acid)，以及氟喹诺酮类，氟甲喹(flumequine)、环丙沙星(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、氟罗沙星(fleroxacin)、格帕沙星(grepafloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、那氟沙星(nadifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星、培氟沙星(pefloxacin)、芦氟沙星(rufloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、达氟沙星(danofloxacin)、恩氟沙星(enrofloxacin)和马波沙星(marboffoxacin)。

磺酰胺类和二氨基吡啶类抗细菌剂包括原来的“磺胺类”药物、磺胺和大量衍生物，包括磺胺吡啶(sulfapyridine)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺异噁唑(sulfafurazole)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、磺胺地索辛(sulfadimethoxine)、磺胺甲氧嘧啶(sulfadimethoxydiazine)、磺胺多辛(sulfadoxine)、磺胺林(sulfametopyrazine)、磺胺嘧啶银(silver sulfadiazine)、醋酸磺胺米隆(mafenideacetate)和柳氮磺胺吡啶(sulfasalizine)，以及相关化合物，包括三甲氧苄啶(trimethoprim)、巴喹普林(baquiloprim)、溴莫普林(brodimoprim)、奥美普林(ormetoprim)、四氧普林(tetroxoprim)和与其它药物的组合物，例如复方磺胺甲噁唑(co-trimoxazole)。

四环素类通常是广谱抗细菌剂，并且包括天然产物氯四环素(chlortetracycline)、氧四环素(oxytetracycline)、四环素、地美环素(demeclocycline)，以及半合成产物美他环素(methacycline)、多西环素(doxycycline)和米诺环素。

不符合上述任一类的适合的抗细菌剂包括大观霉素(spectinomycin)、莫匹罗星(mupirocin)、新霉素(newmycin)、磷霉素(fosfomycin)、夫西地酸(fusidic acid)、多粘菌素类(polymixins)、粘杆菌素(colistin)、杆菌肽(bacitracin)、短杆菌肽(gramicidin)、短杆菌素(tyrothricin)、氯碘羟喹(clioquinol)、氯喹那多(chloroquinaldol)、哈喹那(haloquinal)、硝基呋喃妥因(nitrofurantonin)、硝基咪唑类(nitroimidazoles)(包括甲硝唑、他咪唑和塞克硝唑)和六胺(hexamine)。

抗生素和抗真菌剂可以游离酸或游离碱形式、药学上可接受的盐形式或以与酯或其它易于水解的基团的不稳定连结物的形式存在，这些形式适于与离子交换树脂络合产生树脂酸盐。

4.消毒剂

组合物中可包括消毒剂以配制用于局部投药。适合的消毒剂包括碘、碘伏(iodophore)(包括卡地姆碘(cadexomer iodine))、氯己定(chlorhexidine)、葡糖酸盐(gluconate)、硫柳汞(thimerosal)、过氧化氢，以及过氧化物和高氯酸盐，包括有机过氧化物和高氯酸盐。

5.皮肤保护剂

组合物中可包括皮肤保护剂以配制用于局部投药。这些试剂不仅使皮肤光滑，而且还有助于保持皮肤的完整性以防损伤。适合的皮肤保护剂包括尿囊素；可可脂；二甲硅油(dimethicone)；高岭土；鲨鱼肝油；矿脂；羊毛脂；植物油；乙氧化油和脂质；聚合物，例如聚氧化烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(甲基)丙烯酸酯、乙烯乙酸乙烯酯共聚物(ethylvinyl acetate)、聚烷二醇；多糖和改性多糖，例如透明质酸、纤维素醚、纤维素酯、羟丙基甲基纤维素、交联羧甲基纤维素和淀粉；可胶凝或不可胶凝的天然胶和树脂，例如海藻酸盐、角叉菜胶、琼脂、果胶、葡甘露聚糖(瓜尔胶、刺槐豆胶等)、半乳甘露聚糖(例如魔芋)、阿拉伯胶、黄芪胶、黄原胶、硬葡聚糖和虫胶；以及胶状不溶物，例如氧化锌和其它不溶锌盐、滑石粉和其它微粉化天然矿物质；和胶状二氧化硅、氧化铝和其它金属氧化物。其它保护剂包括酚系或非酚系植物化学物质，包括(但不限于)番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、虾青素、非类胡萝卜素、类萜、紫苏子醇、皂角素、松油醇(terpeneol)、萜烯柠檬苦素(terpene limonoid)、花青素、儿茶素、异黄酮、橙皮素、柚皮苷、芸香苷、槲皮黄素、水飞蓟素、红桔素、丹宁酸、酚酸、鞣花酸、氯原酸、对香豆酸、植酸、阿魏酸(ferulicacid)、香兰素、肉桂酸、羟基肉桂酸、姜黄素、白藜芦醇、木酚素、芥子油苷(glucosinolate)、异硫氰酸酯、苯乙基、异硫氰酸酯(sothiocyanate)、异硫氰酸苯甲酯、萝卜硫素(sulforaphane)、吲哚、吲哚-3-甲醇、硫磺酸酯、植物固醇、β-谷甾醇、蒽醌、番泻叶、芦荟苷、金丝桃素(hypericin)、辣椒素、胡椒碱、叶绿素、甜菜碱和其组合。

多种防晒活性剂为适用的。所用防晒剂的确切量和类型视所需光防护的程度而定。一般说来，本文中可使用通过吸收、散射或反射紫外辐射来提供针对紫外辐射的防护的任何试剂。本文中所用防晒剂可提供针对以下一种或一种以上阳光辐射形式的防护：UVA、UVB、UVC、可见光和红外辐射。最终制剂中的防晒因子(sunprotection factor，SPF)一般在2与30之间变化，但也可配制出SPF超过100的产物。本文中所用防晒剂可提供化学或物理光防护。

适合的防晒剂包括选自包含以下各物的群组者：氨基苯甲酸和衍生物，例如对氨基苯甲酸(para-amino benzoic acid，PABA)、甘油基-PABA(利沙地酯(Lisadimate))、帕地马酯O(Padimate O)、罗沙酯(Roxadimate)；邻氨基苯甲酸酯(anthrinalate)，包括邻氨基苯甲酸甲酯；二苯甲酮，包括双羟苯宗(dioxybenzone)、氧苯酮和磺异苯酮(sulisobenzone)、3-二苯甲酮(优维诺M40(Uvinul M40))、4-N，N-二甲基氨基苯甲酸与2，4-二羟基二苯甲酮的酯；樟脑衍生物，包括3-(4-甲基苯亚甲基)樟脑、3-苯亚甲基樟脑；肉桂酸酯，包括DEA-对甲氧基肉桂酸枝、对甲氧基肉桂酸乙基-己酯、奥克立林(octocrylene)、甲氧基肉桂酸辛酯；二苯甲酰基甲烷，包括丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷；水杨酸酯，包括水杨酸高孟酯(homomenthyl salicylate)、水杨酸辛酯、三乙醇胺甲基水杨酸酯(trolamine methyl salicylate)；金属氧化物，包括二氧化钛、氧化锌和氧化铁；2-苯基苯并咪唑-5-磺酸；4，4-甲氧基-叔丁基二苯甲酰基甲烷；及其混合物。

适用于本发明中的防晒剂的其它非限制性实例描述于颁予哈飞(Haffey)等人的美国专利第5,087,445号、颁予特纳(Turner)等人的美国专利第5,073,372号和颁予撒贝特里(Sabatelli)等人的美国专利第5,160,731号中，这些专利都以引用的方式全文并入本文中。

6.局部麻醉剂

局部麻醉剂也可用于局部用制剂中，以减轻由局部感染引起的疼痛和瘙痒。适合的局部麻醉剂包括苯佐卡因(benzocaine)、利多卡因(lidocaine)、地布卡因(dibucaine)、依替卡因(etidocaine)、苯甲醇、樟脑、间苯二酚和薄荷脑(menthol)。

7.抗组胺剂

可包括在所揭示的组合物中的适合的抗组胺剂包括(但不限于)盐酸二苯胺明(diphenhdramine hydrochloride)、氯菲安明(chlorpheniramine)、茶苯海明(dimenhydrinate)、氯雷他定(loratidine)、西替利嗪(cetirizine)、非索非那定(fexofenadine)和其组合。

8.抗氧化剂

所揭示的组合物也可包括一种或一种以上抗氧化剂。适合的抗氧化剂包括(但不限于)锌、维生素A、维生素C、维生素E、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、隐黄素(cryptoxanthin)、番茄红素、叶黄素、玉米黄质(zeaxathin)、儿茶素、白藜芦醇、原花青素、辅酶Q10及其组合。

在某些实施例中，组合物含有苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、皮质类固醇或其组合。

D.制剂

本文所揭示的包括式I、式II或二者的脂溶性绿茶多酚在内的化合物的制剂可以使用药学上可接受的赋形剂制备，这些赋形剂由认为安全且有效，并且可投予个体，同时不会引起不合需要的生物副作用或不想要的相互作用的材料构成。赋形剂是药物制剂中所存在的除本文所揭示的一种或一种以上脂溶性绿茶多酚化合物外的所有组分。本文中常用的“赋形剂”包括(但不限于)表面活性剂、乳化剂、乳液稳定剂、软化剂、缓冲剂、溶剂和防腐剂。

1.赋形剂

优选赋形剂包括表面活性剂，尤其非离子型表面活性剂；乳化剂，尤其乳化蜡；以及液态非挥发性非水性材料，尤其二醇类，例如丙二醇。油相可含有其它药学上批准的油性赋形剂。举例来说，可将例如羟基化蓖麻油或芝麻油等材料用于油相中作为表面活性剂或乳化剂。

a.软化剂

适合的软化剂包括此项技术中一般已知且列于例如“药物赋形剂手册(Handbookof Pharmaceutical Excipients)”第4版，医药出版社(Pharmaceutical Press)，2003等纲要中的软化剂。这些软化剂包括(不限于)杏仁油、蓖麻油、长角豆提取物、鲸蜡硬脂酰醇(cetostearoyl alcohol)、鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、胆固醇、棉籽油、环甲硅(cyclomethicone)、棕榈酰硬脂酸乙二醇酯、甘油、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、羊毛脂、卵磷脂、轻质矿物油、中链三酸甘油酯、矿物油和羊毛脂醇、矿脂、矿脂和羊毛脂醇、大豆油、淀粉、硬脂醇、葵花油、木糖醇及其组合。在一个实施例中，软化剂为硬脂酸乙基己酯和棕榈酸乙基己酯。

b.表面活性剂

适合的表面活性剂包括阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂和两性表面活性剂。阴离子型表面活性剂包括以下化合物的碱性盐、铵盐、胺盐、氨基醇盐和镁盐：烷基硫酸酯、烷基醚硫酸酯、烷基酰胺基醚硫酸酯、烷基芳基聚醚硫酸酯、单甘油酯硫酸酯；烷基磺酸酯、烷基酰胺磺酸酯、烷基芳基磺酸酯、烯烃磺酸酯、石蜡磺酸酯；烷基磺基琥珀酸酯、烷基醚磺基琥珀酸酯、烷基酰胺磺基琥珀酸酯；烷基磺基琥珀酰胺酸酯；烷基磺基乙酸酯；烷基磷酸酯、烷基醚磷酸酯；酰基肌氨酸酯、酰基羟乙基磺酸酯和N-酰基牛磺酸酯。所述各种化合物中的烷基或酰基一般由含8到30个碳原子的碳基链组成。

适合的阴离子型表面活性剂包括脂肪酸盐，例如油酸、蓖麻油酸、棕榈酸和硬脂酸盐；椰子油酸或氢化椰子油酸；酰基乳酸盐，其中酰基含有8到30个碳原子。

也可使用被视为弱阴离子的表面活性剂，例如聚氧烯化烷基或烷基芳基醚羧酸或其盐、聚氧烯化烷基酰胺基醚羧酸或其盐以及烷基D-半乳艾杜糖醛酸或其盐。

适合的两性表面活性剂是脂肪族仲胺或叔胺衍生物，其中脂肪族基团是含有8到22个碳原子且含有至少一个羧酸根、磺酸根、硫酸根、磷酸根或膦酸根水溶性阴离子基团的直链或分支链；(C₈-C₂₀)烷基甜菜碱、磺基甜菜碱、(C₈-C₂₀)烷基-酰胺基(C₁-C₆)烷基甜菜碱或(C₈-C₂₀)烷基-酰胺基(C₁-C₆)烷基磺基甜菜碱。

非离子型表面活性剂更特定地选自聚乙氧化、聚丙氧化或聚甘油化脂肪酸或烷基酚或醇，其中脂肪链含有8到30个碳原子，氧化乙烯或氧化丙烯基团的数量介于2与50个之间，且甘油基的数量介于2与30个之间。

也可使用椰油酰两性基二乙酸二钠(Disodium cocoamphodiacetate)、月桂酰两性基二乙酸二钠(disodium lauroamphodiacetate)、辛酰两性基二乙酸二钠(disodiumcapryloamphodiacetate)、己酰两性基二乙酸二钠(disodium caproamphodiacetate)、椰油酰两性基二丙酸二钠(disodium cocoampho-dipropionate)、月桂酰两性基二丙酸二钠(disodium lauroamphodipropionate)、己酰两性基二丙酸二钠(disodiumcaproamphodipropionate)、辛酰两性基二丙酸二钠(disodiumcapryloamphodipropionate)、月桂酰两性基二丙酸(lauroamphodipropionate acid)和椰油酰两性基二丙酸(cocoamphodipropionate acid)。

代表性阳离子型表面活性剂特别选自任选聚氧烯化的伯、仲或叔脂肪胺盐；季铵盐；咪唑啉衍生物；或阳离子性胺氧化物。

适合的季铵盐为四烷基卤化铵(例如四烷基氯化铵)，例如二烷基二甲基氯化铵或烷基三甲基氯化铵，其中烷基含有约12到22个碳原子；尤其二十二烷基三甲基氯化铵、二硬脂基-二甲基氯化铵、鲸蜡基三甲基氯化铵或苯甲基-二甲基硬脂基氯化铵，或者硬脂酰胺基丙基二甲基(乙酸肉豆蔻酯)氯化铵。

也可使用二酰氧基乙基二甲基铵、二酰氧基乙基羟乙基甲基铵、单酰氧基乙基二羟基乙基甲基铵、三酰氧基乙基甲基铵和单酰氧基乙基羟基乙基二甲基铵盐(尤其氯化物或甲基硫酸盐)及其混合物。酰基优选含有14到18个碳原子，且更尤其是由例如棕榈油或葵花油等植物油获得。

其它可用表面活性剂包括(但不限于)十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate，SDS)、胆酸钠、去氧胆酸钠(sodium deoxycholate，DOC)、N-月桂酰基肌氨酸钠盐、月桂基二甲基氧化胺(lauryldimethylamine-oxide，LDAO)、鲸蜡基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB)和双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠盐。

其它非离子型表面活性剂包括乳化蜡、单油酸甘油酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚山梨酸酯、脱水山梨糖醇酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、环糊精、单硬脂酸甘油酯、泊洛沙姆(poloxamer)、聚烯吡酮(povidone)和其组合。在一个实施例中，非离子型表面活性剂是硬脂醇。

代表性去污剂包括(但不限于)烷基苯甲基二甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵、双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠、双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠盐、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐。

c.乳化剂

适合的乳化剂包括阿拉伯胶、阴离子型乳化蜡、硬脂酸钙、卡波姆(carbomer)、鲸蜡基硬脂醇、鲸蜡醇、胆固醇、二乙醇胺、棕榈酰基硬脂酸乙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、含水羊毛脂、羊毛脂醇、卵磷脂、中链三酸甘油酯、甲基纤维素、矿物油和羊毛脂醇、磷酸二氢钠、单乙醇胺、非离子型乳化蜡、油酸、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、海藻酸丙二醇酯、自乳化单硬脂酸甘油酯、脱水柠檬酸钠、月桂基硫酸钠、脱水山梨糖醇酯、硬脂酸、葵花油、黄芪胶、三乙醇胺、黄原胶和其组合。在一个实施例中，乳化剂是硬脂酸甘油酯。

d.缓冲剂

缓冲剂优选在约pH 4到约pH 7.5下，更优选在约pH 4到约pH 7下且最优选在约pH5到约pH 7下缓冲组合物。

所揭示的组合物还可含有至少一种选自常用于化妆品中的佐剂的佐剂，例如香料、防腐剂、螯合剂、润湿剂、糖、两性聚合物、薄荷脑、烟酸衍生物、防脱发剂、泡沫稳定剂、推进剂、染料、维生素或维生素原、酸化剂或碱化剂，或者其它众所周知的化妆品佐剂。

2.封装

在另一实施例中，绿茶多酚可通过封装于微胶囊中，而并入聚合物组分中。微胶囊可由与大多数载剂、涂层或基质不同的材料制成。适合的微胶囊是由在宿主体内经历侵蚀的材料制成的微胶囊，或所制成的允许绿茶多酚扩散出去的微胶囊。使用这些微胶囊可提供微胶囊中封装的绿茶多酚的控制释放。

已知多种方法可用来制备具有任何特定尺寸范围的微粒。在本发明的各种递送媒剂中，微粒尺寸可在约0.2微米到约100微米的范围内。已知用于合成凝胶微粒或由熔融材料合成微粒的方法，且这些方法包括以乳液、喷雾液滴和分开的相进行的聚合。对于固体材料或预成形凝胶，已知方法包括湿式或干式碾磨或研磨、粉碎、借助空气喷射进行粒析、筛分等。

微粒可使用所属领域技术人员已知的多种不同方法由不同聚合物制成。示范性方法包括下文在详细描述聚乳酸和其它微粒的制备时陈述的方法。优选使用以下三种方法中的一种制造聚乳酸微粒：溶剂蒸发法，如马托维兹(Mathiowitz)等人(1990)扫描显微镜技术杂志(J.Scanning Microscopy)4：329；贝克(Beck)等人(1979)生育与不育(Fertil.Steril.)31：545；和贝尼塔(Benita)等人(1984)药学杂志(J.Pharm.Sci.)73：1721所述；热熔融微封装法，如马托维兹等人，反应性聚合物(Reactive Polymers)6：275(1987)所述；和喷雾干燥法。用于制备微封装的生物活性材料的示范性方法陈述如下。

在溶剂蒸发法中，将微胶囊聚合物溶解于例如二氯甲烷等挥发性有机溶剂中。将绿茶多酚(可溶或以精细粒子形式分散)加入溶液中，并将混合物悬浮于含有例如聚(乙烯醇)等表面活性剂的水溶液中。搅拌所得乳液，直到大部分有机溶剂都已蒸发，留下固体微粒。溶液装载有绿茶多酚且悬浮于用力搅拌的含有聚(乙烯醇)(西格玛公司(Sigma))的蒸馏水中。搅拌一段时间后，蒸发出聚合物中的有机溶剂，并用水洗涤所得微粒，且在冻干器中干燥过夜。利用此方法可获得具有不同尺寸(1到1000微米)和形态的微粒。此方法适用于如聚酯和聚苯乙烯等相对稳定的聚合物。例如聚酸酐等不稳定聚合物可能会因水的存在而在制造过程中降解。对于这些聚合物，优选使用以下两种在完全无水的有机溶剂中进行的方法。

在热熔融封装法中，首先将聚合物熔融，随后与生物活性材料的固体粒子混合，这些固体粒子优选已经筛分到小于50微米。将混合物悬浮于不可混溶的溶剂(如硅油)中，并在持续搅拌下，加热到比聚合物熔点高约5℃的温度。一旦乳液稳定，就将其冷却，直到聚合物粒子凝固。通过用例如石油醚等溶剂进行倾析来洗涤所得微粒，得到自由流动的粉末。利用此方法，获得尺寸在约1微米到约1000微米范围内的微粒。利用这一技术制备的胶囊的外表面通常是光滑且致密的。这一程序优选用于制备由聚酯和聚酸酐制成的微粒。

溶剂去除技术优选用于聚酸酐。在这一方法中，将绿茶多酚分散或溶解于所选聚合物于挥发性有机溶剂(如二氯甲烷)中的溶液中。通过搅拌将此混合物悬浮于有机油(例如硅油)中，形成乳液。与溶剂蒸发法不同，使用这一方法可以由具有高熔点和不同分子量的聚合物制备微粒。利用这一程序，可获得在约1微米到约300微米范围内的微粒。用这一技术产生的小球的外部形态主要视聚合物喷雾干燥的类型而定，所述聚合物是溶解于二氯甲烷中。已知量的绿茶多酚悬浮或共溶解于聚合物溶液中。随后喷雾干燥溶液或分散液。由此获得范围介于约1微米到约10微米之间的微粒，且其形态视所用聚合物的类型而定。

在一个实施例中，将绿茶多酚封装于包含海藻酸钠外壳的微胶囊中。由凝胶型聚合物(例如海藻酸盐)制造的微粒是通过传统的离子胶凝技术制成。首先将聚合物溶解于混有硫酸钡或某种生物活性剂的水溶液中，随后通过微滴形成装置挤压，在一些情况下使用氮气流来破坏液滴。在挤压装置下放置缓慢搅拌(约100到170转/分钟)离子硬化浴，以捕集形成的微滴。将微粒留在硬化浴中静置(incubate)约20到30分钟，以为胶凝提供充足的时间。微粒尺寸是通过使用各种尺寸的挤压机或改变氮气或聚合物溶液的流动速率进行控制。

脂质体将有助于将绿茶多酚递送到特定组织，并且还能增加绿茶多酚的半衰期。脂质体可从多个供应商购得。或者，脂质体可根据所属领域技术人员已知的方法(例如，如艾普斯坦(Eppstein)等人的美国专利第4,522,811号中所述)制备。一般说来，脂质体是由标准囊泡形成脂质(vesicle-forming lipid)形成，这些脂质一般包括中性或带负电的磷脂，和固醇，例如胆固醇。脂质的选择一般是通过考虑例如所需脂质体尺寸和脂质体在血流中的半衰期等因素来指导。已知多种方法可用于制备脂质体，例如，如思卓卡(Szoka)等人，生物物理学与生物工程年评(Ann.Rev.Biophys.Bioeng.)9：467(1980)和美国专利第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号和第5,019,369号所述。在一个实施例中，封装绿茶多酚的脂质体包括可使脂质体靶向HSV感染部位或其附近的特定细胞或组织的配体分子。

在一个实施例中，封装本发明绿茶多酚的脂质体经改性以避免被单核巨噬细胞和网状内皮组织系统清除，所述改性例如为使调理素作用抑制部分(Opsonization-inhibiting moiety)结合于所述结构的表面。在一个实施例中，脂质体可包含调理素作用抑制部分和配体。在一个实施例中，用于制备脂质体的调理素作用抑制部分是结合于脂质体膜的较大亲水性聚合物。如本文中所使用，当调理素作用抑制部分以化学方式或物理方式，例如通过脂溶性锚插入脂质体膜本身中或通过直接结合于膜脂质的活性基团，而附接到脂质体膜时，认为其“结合”于脂质体膜。这些调理素作用抑制性亲水聚合物形成保护性表面层，这一表面层使巨噬细胞-单核细胞系统(macrophage-monocyte system，“MMS”)和网状内皮组织系统(reticuloendothelial system，“RES”)对脂质体的摄取明显减少，例如，如美国专利第4,920,016号中所述。因此，用调理素作用抑制部分改性的脂质体在循环中保持的时间将明显长于未经改性的脂质体。为此，这些脂质体有时称为“隐形”脂质体。据悉，隐形脂质体可积累于由多孔或“渗漏”微血管供给的组织中。此外，RES摄取的减少可通过阻止肝脏和脾中大量积累而降低隐形脂质体的毒性。

适于改性脂质体的调理素作用抑制部分优选是分子量为约500道尔顿到约40,000道尔顿且更优选约2,000道尔顿到约20,000道尔顿的水溶性聚合物。这些聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物，例如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直链、分支链或树突状聚酰胺基胺；聚丙烯酸；聚醇，例如聚乙烯醇和聚木糖醇，其中以化学方式连接羧基或氨基；以及神经节苷脂，例如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG的共聚物或其衍生物也适用。此外，调理素作用抑制性聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、聚酰胺基胺、聚乙二胺或聚核苷酸的嵌段共聚物。调理素作用抑制性聚合物还可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶；层叠多糖或寡糖(线性或分支状)；或者羧化多糖或寡糖，例如与碳酸衍生物反应并由此连接羧基。优选调理素作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物改性的脂质体有时称为“聚乙二醇化脂质体”。调理素作用抑制部分可通过众所周知的多种技术中的任一种结合于脂质体膜。举例来说，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯可结合于磷脂酰乙醇胺脂溶性锚，随后结合于膜。类似地，可利用硬脂胺脂溶性锚，通过使用Na(CN)BH3以及溶剂混合物(例如，30∶12比率的四氢呋喃与水)在60℃下进行还原胺化，来使葡聚糖聚合物衍生化。

所揭示的微粒和脂质体以及制备微粒和脂质体的方法都是借助实例提供，且不打算限定用于本发明中的微粒或脂质体的范围。所属领域技术人员将显而易见，由不同方法制造的多种微粒或脂质体都适用于本发明中。

E.药物组合物

另一实施例提供药物组合物和剂型，其包括一种或一种以上绿茶多酚、经改性绿茶多酚、尤其(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯的药学上可接受的盐，或者其药学上可接受的多晶型物、溶剂化物、水合物、脱水物、共晶体、无水物、非晶形形式，及其组合。所揭示化合物的特定盐包括(但不限于)钠盐、锂盐、钾盐和其水合物。

绿茶多酚的药物单位剂型适于经口、粘膜(例如，鼻、舌下、阴道、口腔或直肠粘膜)、不经肠(例如肌肉内、皮下、静脉内、关节内或推注)、局部或透皮投予患者。剂型的实例包括(但不限于)：片剂；囊片；胶囊，例如硬明胶胶囊和软弹性明胶胶囊；扁囊剂；口含片；锭剂；分散液；栓剂；软膏；泥敷剂(膏药)；糊剂；散剂；敷料；乳膏；硬膏剂；溶液；贴片；气雾剂(例如，鼻用气雾剂或吸入剂)；凝胶；适于经口或粘膜投予患者的液体剂型，包括悬浮液(例如，水性或非水性液体悬浮液、水包油型乳液或油包水型乳液)、溶液和酏剂；适于不经肠投予患者的液体剂型；和可复水以提供适于不经肠投予患者的液体剂型的无菌固体(例如结晶或非晶形固体)。

本发明绿茶多酚剂型的组成、形状和类型通常视其用途而变化。不经肠剂型所含活性成分的量比用于治疗同种疾病或病症的口服剂型少。所属领域技术人员将显而易见使本发明所涵盖的特定剂型彼此不同的这些和其它方式。例如参见雷氏药学大全(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版，默克出版公司(Mack Publishing)，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton，Pa.)(1990)。

本发明的药物组合物和单位剂型通常还包括一种或一种以上药学上可接受的赋形剂或稀释剂。本发明特定化合物所提供的益处，例如(但不限于)溶解性增加和/或流动性、纯度或稳定性(例如吸湿性)特征增强，使得这些化合物比现有技术更适于药物配制和/或投予患者。药学或制药学领域技术人员众所周知适合的赋形剂，且适合赋形剂的非限制性实例提供于本文中。某一特定赋形剂是否适于并入药物组合物或剂型中将视此项技术中众所周知的多种因素而定，包括(但不限于)投予患者这一剂型的方式。举例来说，例如片剂或胶囊等口服剂型可含有不适用于不经肠剂型的赋形剂。特定赋形剂的适用性也可视剂型中的特定活性成分而定。举例来说，例如乳糖等某些赋形剂或当暴露于水时可加速某些活性成分的分解。包括伯胺或仲胺在内的活性成分特别易于发生这种加速的分解反应。

本发明还涵盖包括一种或一种以上降低例如绿茶多酚等活性成分的分解速率的化合物的药物组合物和剂型。这些化合物在本文中称为“稳定剂”，包括(但不限于)抗氧化剂(例如抗坏血酸)、pH缓冲剂或盐缓冲剂。此外，本发明的药物组合物或剂型可含有一种或一种以上溶解性调节剂，例如氯化钠、硫酸钠、磷酸钠或磷酸钾，或者有机酸。具体的溶解性调节剂是酒石酸。

与赋形剂的量和类型一样，一种剂型中绿茶多酚的量和具体类型可视例如(但不限于)投予患者的途径等因素而不同。然而，本发明绿茶多酚化合物的典型剂型包括其药学上可接受的盐或药学上可接受的多晶型物、溶剂化物、水合物、脱水物、共晶体、无水物或非晶形形式，其量为约10毫克到约1000毫克，优选其量为约25毫克到约750毫克，更优选其量为50毫克到500毫克，甚至更优选其量为约30毫克到约100毫克。

此外，这些化合物和/或组合物还可使用基于脂质或基于聚合物的纳米粒子递送。举例来说，纳米粒子可经过设计，以改进不经肠投予的药物的药理学和治疗特性(艾伦(Allen，T.M.)，克里斯(Cullis，P.R.)药物递送系统：进入主流(Drug delivery systems：entering the mainstream.)科学(Science.)303(5665)：1818-22(2004))。

本发明的局部用剂型包括(但不限于)乳膏、洗液、软膏、凝胶、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳液，以及所属领域技术人员已知的其它形式。例如参见，雷氏药学大全(Remington′sPharmaceutical Sciences)，第18版，默克出版公司(Mack Publishing)，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton，Pa.)(1990)；和药物剂型导论(Introduction to Pharmaceutical DosageForms)，第4版，李与费戈出版社(Lea&Febiger)，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，Pa.)(1985)。对于不可喷雾的局部用剂型，通常使用粘性到半固体或固体形式，其包括适合局部施用的载剂或者一种或一种以上赋形剂，且动态粘度优选大于水。适合的制剂包括(不限于)溶液、悬浮液、乳液、乳膏、软膏、散剂、擦剂、药膏等，必要时，这些制剂经过灭菌或混合有助剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)以影响各种特性，例如渗透压。其它适合的局部用剂型包括可喷雾的气雾剂制剂，其中活性成分优选与固体或液体惰性载剂组合在一起包装于含加压挥发性物质(例如气态推进剂，例如氟利昂(freon))的混合物中或包装于压挤瓶中。必要时，也可将保湿剂或增湿剂加入药物组合物和剂型中。此项技术中众所周知这些额外成分的实例。例如参见雷氏药学大全(Remington′s PharmaceuticalSciences)，第18版，默克出版公司(Mack Publishing)，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton，Pa.)(1990)。

本发明组合物的透皮和粘膜剂型包括(但不限于)眼用溶液、贴片、喷雾剂、气雾剂、乳膏、洗液、栓剂、软膏、凝胶、溶液、乳液、悬浮液或所属领域技术人员已知的其它形式。例如参见，雷氏药学大全(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版，默克出版公司(Mack Publishing)，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton，Pa.)(1990)；和药物剂型导论(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)，第4版，李与费戈出版社(Lea&Febiger)，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，Pa.)(1985)。适于治疗口腔内的粘膜组织的剂型可配制成漱口液、口用凝胶或口腔贴片的形式。其它透皮剂型包括“储积器型”或“基质型”贴片，其可施用于皮肤并佩戴一段指定时间，以容许所需量的活性成分透过。

可用于投予本发明绿茶多酚的透皮剂型以及投药方法的实例包括(但不限于)以下美国专利中所述者：第4,624,665号；第4,655,767号；第4,687,481号；第4,797,284号；第4,810,499号；第4,834,978号；第4,877,618号；第4,880,633号；第4,917,895号；第4,927,687号；第4,956,171号；第5,035,894号；第5,091,186号；第5,163,899号；第5,232,702号；第5,234,690号；第5,273,755号；第5,273,756号；第5,308,625号；第5,356,632号；第5,358,715号；第5,372,579号；第5,421,816号；第5,466；465号；第5,494,680号；第5,505,958号；第5,554,381号；第5,560,922号；第5,585,111号；第5,656,285号；第5,667,798号；第5,698,217号；第5,741,511号；第5,747,783号；第5,770,219号；第5,814,599号；第5,817,332号；第5,833,647号；第5,879,322号；和第5,906,830号，各案以引用的方式全文并入本文中。

适用于提供本发明所涵盖的透皮和粘膜剂型的赋形剂(例如载剂和稀释剂)和其它材料是制药领域技术人员众所周知的，且视施用指定药物组合物或剂型的特定组织或器官而定。鉴于此事实，为形成无毒且药学上可接受的剂型，典型赋形剂包括(但不限于)水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁-1，3-二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油及其混合物。

视欲治疗的特定组织而定，额外组分可在用本发明绿茶多酚的药学上可接受的盐治疗之前、同时或之后使用。举例来说，可以使用穿透增强剂来帮助将活性成分递送到组织或跨组织递送。适合的穿透增强剂包括(但不限于)：丙酮；各种醇，例如乙醇、油醇、四氢呋喃醇；烷基亚砜，例如二甲亚砜；二甲基乙酰胺；二甲基甲酰胺；聚乙二醇；吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮；科利当(Kollidon)级(聚烯吡酮、聚维酮)；脲；和各种溶于水或不溶于水的糖酯，例如TWEEN 80(聚山梨醇酯80)和SPAN 60(脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)。

也可调整药物组合物或剂型或者施用药物组合物或剂型的组织的pH值以改进活性成分的递送。类似地，还可调整溶剂载剂的极性、其离子强度或张力以改进递送。也可将例如硬脂酸酯等化合物加入药物组合物或剂型中，以有利地改变活性成分的亲水性或亲脂性，从而改进递送。就这一点来说，硬脂酸酯可充当制剂的脂质媒剂、乳化剂或表面活性剂以及递送增强剂或穿透增强剂。紧密接合调节剂的药学上可接受的盐的不同水合物、脱水物、共晶体、溶剂化物、多晶型物、无水物或非晶形形式可用来进一步调整所得组合物的特性。

所揭示的绿茶多酚组合物也可配制成延长或延缓释放的制剂。此项技术中已知各种活性成分的延长和延缓释放制剂，例如通过封装实现。

另一实施例提供绿茶多酚局部用皮肤病学喷雾剂。

绿茶多酚化合物，尤其用C₁到C₃₀烃链酯化的绿茶多酚的含量为约0.001％到约50％(重量/体积)，通常为约0.25％到约20％(重量/体积)，更通常为约1％到约15％(重量/体积)。在某些实施例中，绿茶多酚的含量为约10％(重量/体积)。

III.使用方法

所揭示的含有一种或一种以上GTP、经改性GTP或其组合的组合物适用于治疗病毒感染的一种或一种以上症状。优选将所揭示的组合物配制成供局部施用于人体或动物体的表面区域，包括皮肤、头发、牙齿、指甲和唇。

一个实施例提供用于治疗HSV的组合物，其包括所揭示的GTP或经改性GTP(例如式I或式II的GTP)中的一者或一者以上。如上文所述，这些组合物被配制成供局部施用于皮肤。这些制剂可以洗液、乳膏、药膏、软膏、流体、水凝胶、泡沫剂、胶状物、悬浮液或干粉形式直接施用于皮肤。

GTP组合物包括一定量的一种或一种以上绿茶多酚、经改性GTP、其药学上可接受的盐、前药或衍生物，其量可有效治疗例如HSV等病毒感染的一种或一种以上症状。

绿茶多酚组合物可局部投予个体，优选人类个体，持续1、2、3、4、5、6、7天或更长时间(必要时)。这些组合物可每天局部施用1、2、3次或更多次(必要时)。

IV.制备组合物的方法

A.经改性绿茶多酚

经改性绿茶多酚，优选脂溶性相比未经改性的绿茶多酚有所增加的经改性绿茶多酚，可例如通过陈(Chen)和杜(Du)，(2003)中国化学杂志(Chinese J Chem)，21：979-981(容许时，以引用的方式全文并入本文中)中所述的方法制备。简单点说，使绿茶多酚与具有所需碳数量的酰氯在乙酸乙酯中反应。过滤反应物，并用去离子水洗涤反应溶液。蒸发上层有机层，并真空干燥。可以使用如例如陈(Chen)等人(2002)色谱学杂志(J.Chromatography)，982：163-165(容许时，以引用的方式全文并入本文中)中所述的高速逆流色谱法，分离脂溶性绿茶多酚。随后，可将分离的脂溶性绿茶多酚配制成组合物，例如局部用制剂。

油包水型局部用组合物可呈乳液形式，例如乳膏、洗液、软膏、散剂、微乳液、脂质体；或呈凝胶、液体和泡沫剂的形式。其也可呈干粉制剂的形式。

B.乳液

一般说来，乳液是在多种其它物质存在下制备，以便实现所需的乳化作用、粘度、稳定性与外观的平衡。举例来说，乳液制剂通常需要至少一种乳化剂，且常常需要数种乳化剂的组合。这些试剂将促进一个不混溶相分散到另一相中，并有助于使乳液稳定。有关乳化剂和其应用的综合评述可见于贝奇(Becher，P.)乳化技术全书(Encyclopedia ofEmulsion Technology)，戴克(Dekker)编，1983。

在一个实施例中，通过将一种或一种以上表面活性剂，任选一种或一种以上乳化剂，以及一种或一种以上视需要熔融的所揭示的脂溶性绿茶多酚混合在一起，来制备油相。通过将防腐剂溶解于水中(必要时，利用加热溶解)单独制备水相。将水相加入油相中，例如同时进行连续高剪切力混合，由此制得乳状乳液。冷却乳液，并通过加入缓冲剂调整pH值。通过加入水使制剂达到最终重量。

组合物中任选使用以组合物的总重量计介于0.01重量％与50重量％之间比例的表面活性剂或去污剂。当组合物为洗发精形式时，其用量以组合物的总重量计一般为至少1重量％，优选介于5重量％与50重量％之间且尤其介于8％与35％之间的比例。

乳化剂的浓度以最终组合物的重量计为约0.5％到约50％。缓冲剂的浓度以最终组合物的重量计为约1％到约25％，且稳定剂的浓度以最终组合物的重量计为约1％到约25％。

一种或一种以上绿茶多酚化合物的浓度以最终组合物的重量计为约0.001％到约40％，尤其为约0.001重量％到约0.01重量％。其它实施例包括浓度为约1.0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％的一种或一种以上绿茶多酚化合物。在某些实施例中，一种或一种以上绿茶多酚的用量应在投予时有效减轻皮肤炎症或治疗头皮屑。在另一实施例中，一种或一种以上绿茶多酚的用量应有效减少个体体内的病毒复制。绿茶多酚的量将随欲治疗的病症而变化。

任选使用的局部麻醉剂的浓度为约1重量％到约10重量％，且抗真菌剂和其它抗生素的浓度为约0.3重量％到约5重量％。

实例

实例1：EGCG-酯对Vero细胞的细胞活力影响的研究

材料与方法

绿茶多酚溶液

所测试的两种不同多酚是EGCG和EGCG-酯。所用浓度范围为12.5、25、50、75和100微摩尔浓度。

细胞活力分析

将Vero细胞接种于6孔板中，并在24小时后，分别向各孔中加入不同浓度的EGCG或EGCG-酯(12.5、25、50、75、100微摩尔浓度)。1小时后，抽吸出多酚，并用PBS洗涤细胞。将DMEM培养基放回各孔中，并培育细胞24小时。随后使用血细胞计数器和台盼蓝(trypanblue)对细胞计数，台盼蓝将死亡的细胞染成蓝色并使活细胞保留白色。

细胞培养物的维持

Vero细胞是购自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))，并在37℃和5％CO₂下，培养于含有含5％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)和1微克/毫升庆大霉素的杜贝卡氏最低必需培养基(Dulbecco Minimal Essential Media，DMEM)的T25烧瓶中，直到汇合。使用附接麦克麦斯数字摄影机(Micrometrics digital camera)和麦克麦斯SE普雷姆软件(Micrometric SE Premium software)的ACCU-SCOPE相差显微镜小心监测细胞生长。为了维持培养物，用500微升胰蛋白酶/EDTA使汇合的Vero细胞单层胰蛋白酶化，保持5分钟。随后将4.5毫升培养基加入T-25烧瓶中，并将细胞次代培养到6孔板或其它T-25烧瓶中且培育直到汇合。

结果

使用Vero细胞的HSV斑块分析是在加入和不加入表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的情况下进行。未经处理的HSV斑块得到的病毒滴度为每毫升1.03×10⁷PFU。当施用100微摩尔浓度EGCG时，未观察到病毒斑块。这些结果显示EGCG抑制HSV感染。

此外，也在加入和不加入表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和亲脂性茶多酚(LTP)的情况下进行细胞活力分析。这些分析的结果显示于表1中。

表1.细胞活力分析的结果

细胞毒性研究表明，浓度为12.5到75微摩尔浓度的EGCG和EGCG-酯不诱导细胞形态的改变。使用台盼蓝和血细胞计数器直接进行细胞计数，以检测EGCG-酯对Vero细胞的影响，由此确定细胞活力。结果显示于图1和表2中。随着EGCG-酯的浓度增加，细胞死亡百分比没有改变。因此，可以使用最大无毒浓度75微摩尔浓度的EGCG-酯来治疗HSV1，并研究其抑制作用。

表2：用不同浓度EGCG-酯处理的vero细胞的细胞活力数据

当用EGCG-酯处理细胞时，细胞死亡的百分比相比对照组没有太大改变。

实例2：EGCG和EGCG-酯的细胞毒性研究

方法与材料

细胞毒性分析

将Vero细胞接种于含不同浓度(12.5、25、50、75、100微摩尔浓度)EGCG或EGCG-酯的6孔板中。48小时后，使用附接摄影机的ACCU-Scope 3002显微镜研究细胞形态和增殖的改变。

或者，将Vero细胞接种于6孔板中，并在24小时后，分别向各孔中加入不同浓度(12.5、25、50、75、100微摩尔浓度)的EGCG或EGCG-酯。1小时后，抽吸出多酚，并用PBS洗涤细胞。24小时后，使用附接摄影机的ACCU-Scope 3002显微镜研究细胞形态和增殖的改变。

细胞培养物的维持

Vero细胞是购自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))，并在37℃和5％CO₂下，培养于含有含5％胎牛血清(FBS)和1微克/毫升庆大霉素的杜贝卡氏最低必需培养基(DMEM)的T25烧瓶中，直到汇合。使用附接麦克麦斯数字摄影机和麦克麦斯SE普雷姆软件的ACCU-SCOPE相差显微镜小心监测细胞生长。为了维持培养物，用500微升胰蛋白酶/EDTA使汇合的Vero细胞单层胰蛋白酶化，保持5分钟。随后将4.5毫升培养基加入T-25烧瓶中，并将细胞次代培养到6孔板或其它T-25烧瓶中且培育直到汇合。

结果

使用较高浓度的EGCG和EGCG-酯对细胞无显著影响。

为了测定用于治疗HSV1的EGCG和EGCG-酯的适宜浓度，研究多酚对细胞的影响。评估不同浓度的EGCG和EGCG-酯(12.5、25、50、75、100微摩尔浓度)，并在48小时时观察细胞的生长和形态。在本实验中，多酚的加入与细胞接种是同时进行，且随后没有去除多酚。

评估绿茶多酚对培养的真核细胞的细胞毒性的实验表明，在细胞培养物中，这些多酚具有适度的毒性表现。结果表明，当将EGCG加入Vero细胞中时，在所用浓度下未观察到形态改变。在EGCG-酯存在下，评估最大无毒浓度为75微摩尔浓度。在浓度为100微摩尔浓度时，细胞形态受到某种程度影响。

也在24小时时观察不同浓度EGCG-酯对Vero细胞的影响。由于在针对感染HSV1的培养物的程序中，1小时吸附后，抽吸出培养基和未吸附的病毒，故确定在类似条件下多酚的影响十分重要。在本研究中，首先接种Vero细胞并培养24小时，随后向细胞中加入不同浓度的EGCG-酯(12.5、25、50、75、100微摩尔浓度)，并使其吸附1小时。接着抽吸出EGCG-酯，并于24小时后观察细胞。

随着EGCG-酯的浓度增加，细胞形态未受到明显影响。因此，这一方法可用于随后的实验。

已经使用了不同方法研究EGCG和EGCG-酯对HSV1和Vero细胞的影响，由此确定不影响宿主细胞但有效抑制病毒的浓度。首先，在细胞毒性分析中，随着多酚浓度的增加，细胞形态改变极少。当在接种细胞的同时加入多酚时，将观察到这一现象。另一方面，当在细胞接种了24小时后加入多酚并保持1小时，随后去除多酚时，细胞形态看起来不受影响。

实例3：EGCG-酯对HSV感染的影响

方法与材料

细胞培养物的维持

Vero细胞是购自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))，并在37℃和5％CO₂下，培养于含有含5％胎牛血清(FBS)和1微克/毫升庆大霉素的杜贝卡氏最低必需培养基(DMEM)的T25烧瓶中。使用附接麦克麦斯数字摄影机和麦克麦斯SE普雷姆软件的ACCU-SCOPE相差显微镜小心监测细胞生长。为了维持培养物，用500微升胰蛋白酶/EDTA使汇合的Vero细胞单层胰蛋白酶化，保持5分钟。随后将4.5毫升培养基加入T-25烧瓶中，并将细胞次代培养到6孔板或其它T-25烧瓶中且培育直到汇合。

荧光显微镜检术

使用荧光显微镜检术和微分干涉相差(Differential Interference Contrast，DIC)显微镜检术在对照Vero细胞中观察到发绿色荧光的HSV的生物合成。使细胞在盖玻片上生长并使其达到汇合。随后用对照HSV或预先处理过的HSV感染细胞，保持1小时。进行时程研究，在这一过程中，使病毒吸附1小时，随后抽吸出病毒。用PBS洗涤细胞，并将培养基加入各孔中。8、10和12小时后，接着用1∶1的丙酮与甲醇溶液固定细胞，并在蔡司艾克维森荧光显微镜(Zeiss Axiovision fluorescence microscope)下使用微分干涉相差设置进行目视观察。

感染后8、10、12小时观察HSV1/Vero细胞的溶解周期(lytic cycle)，以研究感染细胞内的分子改变。HSV1/Vero细胞用作正对照物，且Vero细胞用作负对照物。同时监测75微摩尔浓度EGCG酯-HSV1/Vero细胞，并与对照物相比较。使用GFP-HSV1、DAPI染色的核和溶酶体染色来鉴别对Vero细胞的致细胞病变作用。一式三份进行过程研究。

处理单个细胞，其未感染HSV1且未经历EGCG-酯处理。未处理的细胞用作参照物，以与所有经处理样品相比较。带有DAPI染色的核的细胞具有极为光滑的边缘且核内没有颗粒。在绿色荧光图像中，出现明显绿色背景，但没有绿色荧光粒子。在溶酶体染色过程中，尽管出现红色背景，但细胞内没有明显的带红色荧光的粒子。

接下来，在400X放大倍率下观察未经任何处理的未受感染的Vero细胞单层。获取DAPI、GFP、DAPI+GFP、DAPI+GFP+溶酶体染色和所有染色覆盖(stain-overlay)的相差显微镜检图像。总的说来，本实验提供了有关所有荧光染色的细胞形态和背景信息。

结果

感染后8小时观察HSV1/Vero细胞和EGCG-酯-HSV1/Vero细胞。HSV1/Vero细胞的相差图像与EGCG-酯-HSV1/Vero细胞明显不同。细胞形态发生很大改变，表明在HSV1/Vero细胞中发生溶解性病毒感染。EGCG-酯-HSV1/Vero的细胞形态与单独细胞的图像极为相似。用100微摩尔浓度EGCG或100微摩尔浓度EGCG-酯处理过的病毒不能够复制并形成较多病毒粒子。结果意味着，当用EGCG酯处理时，HSV1不能继续其溶解周期。当用DAPI染色对HSV1/Vero细胞进行染色时，这些细胞的细胞核与EGCG-酯-HSV1/Vero细胞明显不同。只在HSV1/Vero细胞中观察到显著颗粒形成以及失边缘化，证实病毒感染正常发生。

EGCG-酯-HSV1/vero细胞仍保持其核完整性并显示出与单独细胞的图像相似的外观。绿色荧光图像清楚表明，在HSV1/Vero细胞中GFP大量表达，但在EGCG-酯-HSV1/vero细胞中几乎没有。此外，溶酶体染色证实在HSV1/vero细胞中溶酶体活化，但在EGC-酯-HSV1/vero细胞中未发生。

在感染后10小时的图像中，HSV1/Vero细胞的细胞形态明显改变，甚至超过感染后8小时的变化。EGCG-酯-HSV1/Vero细胞看起来与单独细胞的图像极为相似。在HSV1/Vero细胞DAPI染色中，细胞核中甚至进一步形成颗粒且失边缘化。同样只在HSV1/Vero细胞中观察到绿色荧光粒子。溶酶体染色显示在感染后10小时中HSV1/Vero细胞未显著活化。相反，在所有荧光图像中，EGCG-酯-HSV1/Vero细胞均显示与感染后8小时相似的结果。

在感染后12小时进行的实验中，细胞形态仍与感染后8小时和10小时的细胞相似。在这一感染阶段中，当用DAPI染色时，在HSV1/Vero细胞中观察到更多的颗粒形成和失边缘化。也观察到绿色荧光粒子。未观察到溶酶体活化。在所有荧光图像中，EGCG酯HSV1/Vero细胞都显示与感染后8小时和10小时相似的结果，并且与单独细胞的图像相似。

概括起来，当对荧光显微镜检的结果进行比较和比对时，清楚观察到HSV1/Vero细胞与75微摩尔浓度EGCG-酯HSV1/Vero细胞之间的差异。在感染HSV1的细胞中存在可见病毒粒子，而在感染EGCG-酯-HSV1的细胞中几乎没有病毒粒子。

细胞核也明显不同。在感染HSV1的细胞中，细胞边缘丧失，且染色体形成颗粒。在感染EGCG-酯-HSV1的细胞中，细胞核未受影响。

感染后8到12小时，在HSV1/Vero细胞中观察到绿色荧光粒子。感染后8到10小时，在HSV1/Vero细胞中，核形成颗粒和失边缘化的量增加。在HSV1/Vero细胞中，感染后8小时时可观察到溶酶体活化，但在感染后10小时时减少。这些结果与HSV1/Vero细胞溶解感染中所报导的事件密切相关。在EGCG-酯HSV1/Vero细胞中没有观察到此现象，表明75微摩尔浓度的EGCG-酯能够抑制HSV1感染。

在荧光计实验中，75微摩尔浓度EGCG酯HSV1/Vero细胞中GFP的表达比HSV1/Vero细胞少得多。因此，当用EGCG-酯处理HSV1时，作为病毒生物合成的一部分的GFP表达减少。此外，荧光显微镜检分析显示出利用GFP和DAPI染色得到的明显结果。在75微摩尔浓度EGCG-酯HSV1/Vero细胞中GFP的表达相比HSV1/Vero细胞有所减少。此外，当评估HSV1/Vero细胞与EGCG-酯-HSV1/Vero细胞的核形态时，也观察到几处不同。HSV1/Vero细胞的核在感染期间丧失边缘，且染色体中形成大量颗粒。相反，EGCG-酯-HSV1/Vero细胞的核在整个感染过程中保持其完整性。

实例4.EGCG-酯不抑制细胞增殖

材料与方法

细胞增殖分析

使用细胞增殖试剂盒(G5421，普洛麦格公司(Promega Corp.))。这是一种用于测定细胞增殖的比色法。这一试剂盒含有四唑盐化合物和电子耦合试剂(吩嗪硫酸甲酯)。只有活细胞能够将四唑盐化合物生物还原成可溶性甲臜(formazan)。因此，在490纳米吸光度下测量的所形成的甲臜的量与活细胞数量成正比。将细胞接种于96孔板中，并在24小时后，用不同浓度(12.5、25、50、75、100微摩尔浓度)多酚进行处理，并使其吸附1小时。随后抽吸出多酚，并将100微升新制DMEM再加入各孔中。24小时后，将20微升MTS试剂加入培养基中的每一100微升细胞中。在37℃和5％CO₂下培育板4小时，随后使用读板器读取吸光度。

结果

先前的结果表明，EGCG-酯对Vero细胞的细胞毒性和活力未显示显著作用。在本研究中，在与前文所述相同的条件下检查细胞增殖情况。每一实验都是一式三份进行分析，且此比色分析中的吸光度是在490纳米下使用96孔ELISA读板器记录。结果显示于表3和图2中。

表3和图4中显示的增殖分析的结果表明，EGCG和EGCG-酯对于细胞增殖的抑制均未达到较大程度。相比对照物，细胞在490纳米下的吸光度水平只呈现少量减少。这表明，大部分细胞都诱导MTS四唑盐大量还原成甲臜，且因此保持较高的细胞活力。当EGCG和EGCG-酯的浓度增加到75微摩尔浓度时，不会导致细胞增殖的显著减少。

表3.用不同浓度EGCG和EGCG-酯处理的Vero细胞(A)EGCG/Vero(B)EGCG-酯/Vero的细胞增殖数据(平均值加标准差)。

实例5.EGCG和EGCG-酯对HSV1粒子产生的影响

材料与方法

使用斑块分析法进行的病毒滴度研究

将Vero细胞接种于6孔板上，并使其达到汇合。在进行细胞感染之前，用个别浓度的多酚(12.5、25、50、75、100微摩尔浓度)处理HSV病毒粒子1小时。接着用HSV感染细胞，并使其吸附1小时。随后抽吸出未被吸附的病毒。接着用含营养培养基的琼脂覆盖各板。通过用结晶紫对细胞染色来使斑块可见，观察并在50小时内进行计数。

细胞培养物的维持

Vero细胞是购自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))，并在37℃和5％CO₂下，培养于含有含5％胎牛血清(FBS)和1微克/毫升庆大霉素的杜贝卡氏最低必需培养基(DMEM)的T25烧瓶中，直到汇合。使用附接麦克麦斯数字摄影机和麦克麦斯SE普雷姆软件的ACCU-SCOPE相差显微镜小心监测细胞生长。为了维持培养物，用500微升胰蛋白酶/EDTA使汇合的Vero细胞单层胰蛋白酶化，保持5分钟。随后将4.5毫升培养基加入T-25烧瓶中，并将细胞次代培养到6孔板或其它T-25烧瓶中且培育直到汇合。

结果

测定病毒滴度，通过使用斑块分析法研究50微摩尔浓度EGCG和EGCG-酯对病毒粒子产生的影响。将病毒溶解产物从10^-1连续稀释到10^-7，随后用稀释液分别感染细胞。在HSV1/Vero细胞实验中，观察到10^-3到10^-5病毒溶解产物稀释液的斑块，且病毒滴度为每毫升1.25×10⁶PFU。在50微摩尔浓度EGCG-HSV1/Vero细胞实验中，只观察到10^-3到10^-4的斑块，且病毒滴度为每毫升1×10⁵PFU。最后，在50微摩尔浓度EGCG-酯-HSV1/Vero细胞实验中，在任一病毒溶解产物稀释液中都未观察到斑块形成。结果概述于图3中，图中显示，当将HSV1/Vero滴度与EGCG-HSV1/Vero滴度相比较时，出现10倍降低。图中还显示，与HSV1/Vero滴度相比较，EGCG-酯HSV1/Vero的滴度出现甚至更大的降低。这表明当与EGCG相比较时，EGCG-酯在抑制HSV1方面更为有效。

为了获得EGCG-酯针对HSV1的最低抑制浓度，在较低稀释度的病毒溶解产物(10^-1和10^-2)下，使用不同浓度(12.5、25、50、75微摩尔浓度)的EGCG-酯。结果表明，随着EGCG-酯的浓度增加，HSV1滴度降低。如在图6中可看出，在50微摩尔浓度及以上浓度的EGCG-酯存在下，HSV1形成斑块的能力下降超过99％。

经鉴别，EGCG和EGCG-酯的最大无毒浓度均为75微摩尔浓度，且随后使用这些浓度来研究其对HSV1病毒产生的影响。在斑块分析中，结果显示，当预先用50微摩尔浓度EGCG处理病毒时，斑块形成减少到原来的1/10。另一方面，当用浓度为50微摩尔浓度及更高浓度的EGCG-酯处理HSV时，未观察到斑块。随后使用不同浓度的EGCG-酯来确定最低HSV1抑制浓度。结果表明，在50微摩尔浓度及更高浓度下，EGCG-酯完全抑制PFU形成。

实例6.有关HSV1/Vero细胞和EGCG酯-HSV1/Vero细胞中绿色荧光蛋白表达情况的研究

材料与方法

带有绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的大肠杆菌氨比西林(Ampicillin)抗性质粒

从最初在存在氨比西林和L-阿拉伯糖的鲁利亚培养液(Luria Broth)上生长的纯菌落中分离出大肠杆菌氨比西林抗性菌株。将菌落转移到在转移菌落前已经补充有100微升氨比西林和100微升L-阿拉伯糖的新LB上。所用氨比西林的浓度为100纳克/毫升。L-阿拉伯糖的浓度是使用连续稀释产生，且设置为1∶10比率，以产生5％的溶液。

使用荧光计进行的GFP表达研究

在含有GFP质粒的大肠杆菌和不含GFP质粒的大肠杆菌中研究GFP的表达。所用荧光计是450型特纳数字荧光计(Tuner Digital Fluorometer-Model 450)。将样品放入3毫升H₂O中，并由开始的3毫升各样品进行连续稀释。获得连续稀释的标准稀释曲线。接下来，使Vero细胞在T-75烧瓶上生长，并使其达到汇合。在细胞感染前，用75微摩尔浓度多酚处理HSV1病毒粒子3小时。随后用经处理和未经处理的HSV1-UL46感染细胞，并使其吸附1小时。接着，通过用PBS洗涤细胞2次来去除未被吸附的病毒。然后在37℃下培育细胞12小时。接着使细胞胰蛋白酶化并使其聚结成团。最后，用3毫升H₂O再悬浮细胞，并使用荧光计分析GFP的表达。3毫升水用作空白样品。对于较高荧光灵敏度，增益调节纽设置为1000。

GHSV-UL46

利用标记绿色荧光蛋白的HSV，将有可能研究HSV的病毒生命周期，并研究亲脂性茶多酚对体外HSV感染的潜在作用(维拉德(Willard，M.)病毒学杂志(JournalofVirology.)2002；10：5220-5232)。如果证实酯改性的EGCG对HSV感染具有类似或更好的结果，那么将来的动物和人类研究可朝向稳定且有效的局部施用进行，以预防人单纯疱疹病毒感染。性传播的HSV将很快地感染宿主细胞；因此，需要制造出高效的抗病毒药物以便在最初病毒感染之前抑制HSV(伊萨卡(Isaacs CE)等人，抗菌剂和化疗(AntimicrobialAgents and Chemotherapy.)2008；52(3)：962-970)。

华盛顿大学医学院(Washington University School of Medicine)的研究小组已经修改了HSV1病毒模型。绿色荧光蛋白附接到编码被膜蛋白VP11/12的病毒基因UL46。示意图可参见图7。通过使用同源重组载体和设计成扩增所需序列的引物，将GFP序列加到UL46基因上(维拉德(Willard，M.)病毒学杂志(Journal of Virology.)2002；10：5220-5232)。

细胞培养物的维持

Vero细胞是购自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))，并在37℃和5％CO₂下，培养于含有含5％胎牛血清(FBS)和1微克/毫升庆大霉素的杜贝卡氏最低必需培养基(DMEM)的T25烧瓶中，直到汇合。使用附接麦克麦斯数字摄影机和麦克麦斯SE普雷姆软件的ACCU-SCOPE相差显微镜小心监测细胞生长。为了维持培养物，用500微升胰蛋白酶/EDTA使汇合的Vero细胞单层胰蛋白酶化，保持5分钟。随后将4.5毫升培养基加入T-25烧瓶中，并将细胞次代培养到6孔板或其它T-25烧瓶中且培育直到汇合。

HSV1-UL46病毒维持

HSV1-UL46病毒是购自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))。在T-25烧瓶中对病毒进行传代，且使细胞达到完全致细胞病变作用(CPE)。随后将培养基收集到15毫升龙卷管(tornado tube)中，并在1000转/分钟下离心10分钟，以去除细胞碎片。随后将含有病毒的上清液保存在-80℃下待用。

结果

本研究中使用的病毒模型系统HSV-GFPUL46在HSV1UL46基因上带有绿色荧光蛋白(GFP)标记。在本研究中，使用荧光计来测量受感染Vero细胞中绿色荧光蛋白的表达。为了定量测定细胞中GFP的表达，产生含GFP插入物的大肠杆菌的标准稀释曲线。同时将不含GFP插入物的大肠杆菌用作负对照物。如材料与方法部分中所述制备大肠杆菌培养物的连续稀释液。结果显示于表4和图5中。如在结果中可以看出，利用含GFP的大肠杆菌的连续稀释的培养物成功地产生线性稀释曲线。负对照物显示极小读数。这一实验证实，使用荧光计适于提供对GFP表达的定量测量。

表4.含GFP质粒插入物的大肠杆菌和不含GFP质粒插入物的大肠杆菌中GFP表达的荧光计数据

含GFP的大肠杆菌	不含GFP的大肠杆菌	稀释度
			1000	22	1/1
541	13	1/2
			284	7	1/4
148	4	1/8
			75	1	1/16
35	0	1/32
			17	0	1/64
8	0	1/128
			4	0	1/356
2	0	1/712

本实验证实，可以使用荧光计来研究和定量测量HSV1/Vero细胞和EGCG-酯-HSV1/Vero细胞中GFP的表达。在本实验中，使用单独Vero细胞、HSV1/Vero细胞和75微摩尔浓度EGCG-酯-HSV1/Vero细胞来定量测量GFP的表达。结果显示于图6中。

在75微摩尔浓度EGCG-酯HSV1/Vero细胞中GFP的表达比HSV1/Vero细胞低得多。因此，当用EGCG-酯处理HSV1时，作为病毒生物合成的一部分的GFP表达减少。

实例7.使用基于PCR的分析来比较HSV1/Vero细胞与EGCG-酯-HSV1/Vero细胞中糖蛋白D、GFP和VP11/12扩增子。

方法与材料

表5.PCR中使用的供分析HSV1/Vero细胞DNA的引物

使用引物集来起始从HSV1/Vero和EGCG酯HSV1/Vero细胞分离的DNA的扩增。使用1％凝胶电泳法来分析PCR产物。所有引物都能够起始DNA样品的扩增，且扩增子具有预期的尺寸。

PCR产物的测序

已经使用NCBI同源性研究来对1到9号每一引物集的PCR产物进行测序和分析。结果表明与所报导的HSV1序列具有高同源性。表6到14显示通过对每一序列进行Blast搜索得到的结果。因此，设计的引物可用于成功研究EGCG-酯对HSV1/Vero细胞的抑制作用的分子机制。引物序列如下：

糖蛋白D-引物1F-733bps(SEQ ID NO：22)

GTCATGCCATGCTCGGATGGGAGGCACTGTGCTATCCCCATCACGGTCATGGAGTACACCGAATGCTCCTACAACAAGTCTCTGGGGGCCTGTCCCATCCGAACGCAGCCCCGCTGGAACTACTATGACAGCTTCAGCGCCGTCAGCGAGGATAACCTGGGGTTCCTGATGCACGCCCCCGCGTTTGAGACCGCCGGCACGTACCTGCGGCTCGTGAAGATAAACGACTGGACGGAGATTACACAGTTTATCCTGGAGCACCGAGCCAAGGGCTCCTGTAAGTACGCCCTCCCGCTGCGCATCCCCCCGTCAGCCTGCCTCTCCCCCCAGGCCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCATCCCCGAGAACCAGCGCACCGTCGCCGTATACAGCTTGAAGATCGCCGGGTGGCACGGGCCCAAGGCCCCATACACGAGCACCCTGCTGCCCCCGGAGCTGTCCGAGACCCCCAACGCCACGCAGCCAGAACTCGCCCCGGAAGACCCCGAGGATTCGGCCCTCTTGGAGGACCCCGTGGGGACGGTGGCGCCGCAAATCCCACCAAACTGGCACATCCCGTCGATCCAGGACGCCGCGACGCCTTACCATCCCCCGGCCACCCCGAACAACATGGGCCTGATCGCCGGCGCGGTGGGCGGCAGTCTCCTGGCAGCCCTGGTCATTGGGGAAATTTTTTGTATATAAAAAAA

糖蛋白D-引物2F-947bps(SEQ ID NO：23)

AGGCTGCGCGATATGCTTGGCGGATGCTCTCTCAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGCGGCAAAGACCTTCCGGTCCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCGGGGGTCCGGCGCGTGTACCACATCCAGGCGGGCCTACCGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCCTCCCGATCACGGTTTACTACGCCGTGTTGGAGCGCGCCTGCCGCAGCGTGCTCCTAAACGCACCGTCGGGAGGCCCCCCCAGATTGTCCGGCGGGGGCCCTCCGAAGGACGTTCCGGAAACAACCCTACAACCTGACCATCGCTTGGTTTCGGATGGGAGGCAACTGTGCTATCCCCATCACGGTCATGGAGTACACCGAAATGCTCCTACAACAAGTCTCTGGGGGCCTGTCCCATCCGAAAACGGGCCCCGCGGGAAAAATAAAAAAAAAAATTTTCCGGGGCCGGAGGAAAAAAAACCGGGGGTTTTATAAAGGGGGGGGGGGTTGAAAAAATACGCCGGCACGTACCTGCGGTTCGTGGAAGATAAAAAGTGACGGAGATTAATTTTATTGGGCCGGCCGGGCCCGTAGTACGCCCTCCGCTGCGCATCCCCCCCGTCAGCCTTGCCTCTCCCCCCCAGGCCTAACAGCAAGGGGGGTGAACGGTGGGAACAGCAATCGGAATGGCTGGCCCCGCTTTCAATCCCCCGAGAAAACCAAGCCGCAACCGGTCGCCCGGTAATTACAGGCTTGGAAAGGATCGCCGGGTAGACAACGGGGCCCCAAAGGCCCCATACAACGTAGTCACCCTTGGCTTGCCGCCCGGAGCTGTTCCGAGAACTTCTCAATGGCTCACGCGCAGCCGGGAAAGTTCGTCTCCGGCAAGAACACGAGAGAATTCGTCCCATCATTGGAAGAGGCCTAGTGCGCTACGGTGTTGCGCGCTGTCATCATGATTATGTC

糖蛋白B-引物1F-425bps(SEQ ID NO：24)

CAGGCATCACACCATCACAGACCATCATCGTAGAGTACCGCCGTCCCCCAGCGTGCAGGCGGCGGCCGCGTGGTAGAGCAGGCGGGGGGGCGTGGAGCGTGGCAGACCGCCATGGACGCGTGGACGCGCATCCGTGCGCGTTTTCCTCCATGTAGGGGAACCTGAAACTGGTAGCGGCCCGTAAGGCCGCCCGCCCAGGAACATGTGGGGGTTAAGCATAGCAAGTACTACGGCAGTGCCGGGTAACACCGTGTGTTTCAGCGCGGCAACTGGCGCAGCCTTGTGGGTAGCAAACACGCCGTGCCCGGCCTTTATTTTTGACGGACCCGGCAGATCGTTCAAGCCGGACGCGGGCCGGGTTTAGTAGCGCGGCAGGGACCTCGGCGAGGAGACAGGAAGCTCGCTATCAGACTATCCGGGTAATT

糖蛋白B-引物2F-967bps(SEQ ID NO：25)

TTCTCCTAACGGGTGCGCGGACTCGAGAGCGCCGCCCGGACTGCAGCCGCCGACCTCCGAAGTCGTTACAGCAAGACGCGCGGCGAATATCTCACGTACGACTCCGACTGTCCGCTGTTGGCCATCGTCGAGAGCGCCCCCGACGGCTGTATCGGCCCCCGGTCGGTCGTGGTCTACGACCGCGAAGTTTTTCTCGATCCTCTACTCGGTCCTCCAGCACCTCGCCCCCAGGCTACCTGACGGGGGTTACGACGGGCCCCGTAGCCCCGGCATTGCACAAGGCCCCCCCCTCGGGGGGGCCGCCGGGGGTTCGCCGTTAGGGTCCCTTTGGGGGTGGAGGGGGGGGTTTGGGTTTTTCGGGTTTTTTGCCCATTTTCCCGTTACGGCTTGGGGTTGGGGGCGGCCCCAGGGGGGGGGAGGGGGGGGGATTGGAAATTCCGCCGGCCCCCCCCCTTGTGGCCCCCCCCCAAGGGGGGGGGGCGGGAAGGGGAAAAAAAAAAAAAAACCAAAAAAACCCGGGGCCCCCCCCCCCCCCACCCGAAAAAAGCCAAATTGGTGGAGGGGGGGGGGCCCCCCTGGGGGGGGACCCCGTGGGGGAAATTGGGGGGTAAAAAAACCCCTTTTATTTTCTTGGGGGGGGCCCCCCCCCCAGGGGGCCTGGGGGGTCCAATTTAAGAAACCCACAAAATTTTCCGTACCGGCCCAAGGATACAAAAATTTACCGAGGACCCCCGGGGGGGTTTTTTTAGAAAAAAAACCCCCCCCCCAAAAATTTCGAGGGCCCAAAGTGTAAAAAAAAAACGCCCTGCCGTTTTTTACAGAATATTTTTCTTTGCCGAAACCTTAACTCCTCCAATTTTTAAGGGGAGATTTTTTTAAAGACACGCCCCCTCTCTTCCTTTTTTCGAGGAGGGGGTAAATAGAACATAAGTATCGCGCCCATAAAAAAAAAGATAGAATAAAAAGG

糖蛋白B-引物3F-156bps(SEQ ID NO：26)

CCACCAGACCGAGTACCCGCTCTCGCGCGTGACCTGGGGGACTGCATCGGCAAGGACGCCCGCGACGCCATGGACCGCATCTTCGCCCGCAGGTACAACGCGACGCACATCAAGGTGGGCCAGCCGCAGTACTACCTGGCCAATGGGGGCTTTCTT

GFP-引物1F-714bps(SEQ ID NO：27)

GAGGCCGGATCACGGGTGTGCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACTGAAAACTCTCTTTGAGGAAA

GFP-引物2F-513bps(SEQ ID NO：28)

CGCCGCCGTCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACAAGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCTGCCGGGAGTTAA

VP11/12-引物1-964bps(SEQ ID NO：29)

TCCGCGTGGGGGCGTCATCGTGGGGACAGGGGGGCGGTGGTCCGACAGAACGCTCCTGGCTGTCCACCGCGGCCCGCAGATACTCGTTGTTCAGGCTGTCGGTGGCCCAGACGCCGTACCCGGTGAGGGTCGCGTTGATGATATACTGGGCGTGGTGATGGACGATCGACAGAACCTCCACCGTGGATACCACGGTATCCACGGTCCCGTACGTACCGCCGCTCCGCTTGCCGGTCTGCCACAGGTTGGCTAGGCACGTCAGGTGGCCCAGGACGTCGCTGACCGCCGCCCTGAGCGCCATGCACTGCATGGAGCCGGTCGTGCCGCTGGAACCCCGGTCCAAATGGCGCGCGAACGTTTCCGCGGGCCCCTTCCGGGCTGCCGCCGAAGCGGAAGGAACCGGGCAATTGGAGGGACTCAGCCGGTGACATACGTGCTTGTCCGTCGTCAACGGCATCCAGGAGGCCCACCGGTACAGCACGGAAACGTAGGCCAGGAGCTCCGTTAAGCCGCATTGCGGTGTCGGTCCTGGGACGTTTTGGGCCCCCCGGGGCGCATAAGGAACATGTACTGCTGAATCCAATGGAGGGGCGTCGCGCAGCCGGCCCACGGTGGCGGCTTATTTGGGCCCCCGCGCCCCCGCCTTTTAAACGGGGTGCCGCGCCAAGCCACTTTTGGGGCCGGGTTGGCCCGCAACAACCACGTGAAAGGCTGGGGCTCCGCAGTCGCCCACGGGGTCCTTCGGGAAACGTCAAGGCCGGCTGGGCCACAACCGTCTGCAGGTACTTCAAGTACTGCGTGGAGGATGGCGCGCTCAAACTGGGCCGCTCTGGTCAGCTCCACCTTCGCCCAGCGCTGGGTGTCGGTCTGAAGCGTACTGCCGGATGTACTCGTTAGTGCAGGTCGCTTGGCGAGCCCGTCACGATCTAGACTATCGTGGGGAGAGAGTGTGTAGTATATATAA

VP11/12-引物2-964bps(SEQ ID NO：30)

TTCAGCTGGGGGCGTCATCGTGCGGACAGGGGGGCGGTGGTCCGACAGAAACGCTCCTGGCTGTCCACCGCGGCCCGCAGATACTCGTTGTTCAGGCTGTCGGTGGCCCAGACGCCGTACCCGGTGAGGGTCGCGTTGATGATATACTGGGCGTGGTGATGGACGATCGACAGAACCTCCACCGTGGATACCACGGTATCCACGGTCCCGTACGTACCGCCGCTCCGCTTGCCGGTCTGCCACAGGTTGGCTAGGCACGTCAGGTGGCCCAGGACGTCGCTGACCGCCGCCCTGAGCGCCATGCACTGCATGGAGCCGGTCGTGCCGCTGGGACCCCGGTCCAGATGGGGGCGCGAACGTTTCCGGGGGGCCCCTCCGGCCTGCCGCCGAGCGGAAGGAACCGGGCAATTGGAGGGACTCAGCCGGGGACATACGTGCTTTGTCCGTCGTCCACAGCATCAGGGACGCCCACGGTTACAGCACGGAAACGTAGCCCAGGACCTCTTTGACCCGCAGTGCGGTTTCGGTCCTGGGGCGACTTGGTCCCCCCGGGCCCCATAAGGAACATGTACTGCTGAATCCAATGGAAGGGCGTCGGCCAGCCCGGCCAGGGTGGCGGCTAATTTGGGCCGCCGGCGCCCCCGCTTTTGAACGGGGGTGCGCGCCAGCGTTTTTGGGGCCGGGGGTGGGCCCGCGCCACCACGTGAAGGCCGGGGTCCGCAGTCCCCCCACGGGGTCTTGGGGAATGTCAGGGCGGTGGGAACCACCGTTCGGCGGTACTTTCCGGAACGGGCGTGAAGGATGGCGCGGCTCAAACTGGACCGCGGGGCAGTCTCCACTTTCGCCCAAGCGCCTGGGTGTGCGGCCGAAAGCATATGCCGGAATGTACTCGTAGTGACGGTTCGCTGGCGAGCCGGTCACGATCAATCTCTCGGAGACGTGGTGTGATAGTATATAA

聚合酶链反应

根据公开的序列，将9个引物集设计成起始HSV1基因组的不同区域的扩增。两个引物集设计成靶向HSV1糖蛋白D。其包括正向引物5′-AGACGTCCGGAAACAACCCTACAA-3′(SEQ IDNO：2)和反向引物5′-ACACAATTCCGCAAATGACCAGGG-3′(SEQ ID NO：3)。第二个引物集包括正向引物5′-TTGTTTGTCGTCATAGTGGGCCTC-3′(SEQ ID NO：4)和反向引物5′TGGATCGACGGTATGTGCCAGTTT-3′(SEQ ID NO：5)。接着，将两个引物集设计成靶向HSV1糖蛋白B。这些引物集如下所示：

正向引物5′AGATTCTGCGGTACTGCGATCACT-3′(SEQ ID NO：6)和反向引物5′-ACGGAACACAAACAAGCACGGATG-3′(SEQ ID NO：7)。第二个引物集包括正向引物5′-AGCTGATTATCGCCACCACACTCT-3′(SEQ ID NO：8)和反向引物5′-TGGCGTTGATCTTGTCGATCACCT-3′(SEQ ID NO：9)。第三个引物集先前已经设计并公开于S.莫拉布朗(S.Moira Brown)和沃拉戴尔R.麦克林(Alasdair R.MacLean)所著《单纯疱疹病毒方案》(Herpes Simplex Vius Protocols)一书中。这一引物集包括正向引物5′ATTCTCCTCCGACGCCATATCCACCTT-3′(SEQ ID NO：10)和反向引物5′-AGAAAGCCCCCATTGGCCAGGTAGT-3′(SEQ ID NO：11)。一个引物集设计成靶向连接到HSV1UL46基因的绿色荧光蛋白。其包括正向引物5′-GACCCTGAAGTTCATCTGCACCA-3′(SEQ ID NO：14)和反向引物5′-AACTCCAGCAGGACCATGTGAT-3′(SEQ ID NO：15)。先前已经设计出针对GFP所设计的第二引物集。其包括正向引物5′-GTCAAAGCTTAAGATGGTGAGCAAGG-3′(SEQ ID NO：12)和反向引物5′-CTTGAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCC-3′(SEQ ID NO：13)。最后，两个引物集设计成靶向对应于UL46基因的HSV1被膜蛋白VP11/12。其如下所示：正向引物5′-ACCAAGCCTTGATGCTCAACTCCA-3′(SEQ ID NO：16)和反向引物5′-ACAACACGGTTCCCGAGAGTTTGA-3′(SEQ ID NO：17)。第二个引物集包括正向引物5′-ACCAAGCCTTGATGCTCAACTCCA-3′(SEQ ID NO：18)和反向引物5′ACACAACACGGTTCCCGAGAGTTT-3′(SEQ ID NO：19)。反应混合物包括1微升提取的DNA、1微升正向引物和1微升反向引物、12.5微升主要混合物(Master Mix)和9.5微升diH2O。将混合物放入PCR管中，并将PCR管放入拉伯奈特多基因II热循环器(Labnet MultiGene II thermalcycler)(拉伯奈特国际公司(Labnet International)，新泽西州爱迪生(Edison NJ))中。反应型态为最初在95℃下变性2分钟，随后是在95℃下变性30秒、在60℃下退火1分钟及在72℃下延伸30秒的循环。最后一个步骤包括在72℃下历经10分钟的最终延伸阶段。一旦循环完成，将样品冷却到4℃，随后在-20℃冷冻器中储存，以便将来通过琼脂糖凝胶电泳法进行分析。

PCR产物的分析

在1％琼脂糖凝胶上分析和观察聚合酶链反应产物。通过称取0.5克琼脂糖(USB公司，目录号32802)并将其与50毫升1X TAE(Tris-乙酸盐-EDTA)缓冲液组合，制得每一凝胶。在微波中加热混合物1分钟，直到琼脂糖完全溶解。随后将混合物倒入凝胶装置(gel rig)中，并使其凝固。在凝胶的一端使用凝胶梳(comb)来产生孔。一旦凝胶凝固，就将样品装载到每一孔(2微升10X装载染料加10微升PCR产物)中。将Hi-Lo DNA标记物装载到第一孔中。在115V下，跑胶1小时。随后用溴化乙锭对凝胶染色15分钟，并且再用水洗涤15分钟。接着在紫外光下，使用柯达凝胶成像系统440CF(Kodak Image Station 440CF)(珀金埃尔默生命科学公司(Perkin Elmer Life Sciences)，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham，MA))分析凝胶。

实时聚合酶链反应

设计起始HSV1糖蛋白D的扩增的引物集用于实时聚合酶链反应。这一引物集包括正向引物5″-CAACCCTACAACCTGACCATC-3′(SEQ ID NO：20)和反向引物5′TTGTAGGAGCATTCGGTGTAC-3′(SEQ ID NO：21)。每一个管(负对照物除外，无DNA)含有10微升Fast SYBR绿色主要混合物(ABI Fast SYBR绿色主要混合物)、1微升正向引物、1微升反向引物、1微升基因组DNA和6微升DiH₂O。在ABI StepOnePlus实时PCR系统上执行样品。执行方法为：95℃下5分钟的保温期；随后是40个循环的95℃下变性1分钟、60℃下退火1分钟和72℃下延伸30秒。接下来，熔融曲线阶段包括95℃下15秒，随后60℃下1分钟和95℃下15秒。

感染HSV1的细胞中的DNA提取

使细胞在60毫米板上生长，并使其达到汇合。随后在37℃和5％CO₂下，用经处理HSV1和未经处理的HSV1感染细胞，保持1小时。吸附一段时间后，用PBS洗涤细胞，并将培养基加到板中。12小时后，使细胞胰蛋白酶化，并使用DNeasy血液与组织样品手册(DNeasyBlood and Tissue Handbook)(凯杰公司(Qiagen)，2006)提取DNA。随后通过使用纳诺普分光光度计(Nanodrop Specrophotometer)测量DNA浓度。

表6：有关检索糖蛋白D引物1F的序列的Blast搜索结果

产生明显比对结果的序列：

表7：有关检索糖蛋白D引物2F的序列的Blast搜索结果

产生明显比对结果的序列：

表8：有关检索糖蛋白B引物1F的序列的Blast搜索结果

表9：有关检索糖蛋白B引物2F的序列的Blast搜索结果

产生明显比对结果的序列：

表10：有关检索糖蛋白B引物3F的序列的Blast搜索结果

表11：有关检索GFP引物1F的序列的Blast搜索结果

产生明显比对结果的序列：

表12：有关检索GFP引物2F的序列的Blast搜索结果

产生明显比对结果的序列：

表13：有关检索VP11/12引物1F的序列的Blast搜索结果

产生明显比对结果的序列：

表14：有关检索VP11/12引物2F的序列的Blast搜索结果

产生明显比对结果的序列：

结果

纯化和分离从HSV1/Vero细胞和EGCG-酯HSV1/Vero细胞提取的DNA，并通过纳诺普分光光度计ND1000测定其量和纯度。对照样品含有566.4纳克/微升(ng/μL)，75微摩尔浓度EGCG-酯样品含有560.1纳克/微升且单独细胞的样品含有562.8纳克/微升。由于每一样品中DNA的浓度值类似，使用1微升来自各样品的DNA，以及恒定量糖蛋白D引物，以进行比较性的基于PCR的分析。使用柯达凝胶成像分析仪440CF(Kodak Image analyzer 440CF)，测量每一实验的谱带强度。对照谱带的读数为445.92、588.24和541.73，平均值为525.29。75微摩尔浓度EGCG-酯谱带的读数为353.87、438.47和407.82，平均值为400.05。75微摩尔浓度EGCG-酯HSV1/Vero的PCR产物的强度低于HSV1/vero细胞的强度。

使用糖蛋白D、GFP和VP11/12的引物进行基于PCR的分析，以进行进一步实验。结果证实，当用75微摩尔浓度EGCG处理HSV1时，DNA谱带强度降低。当用75微摩尔浓度EGCG-酯处理HSV1时，DNA谱带强度进一步降低。这意味着，与仅感染HSV1的Vero细胞相比较，当用EGCG处理时，较少的HSV1粒子能够感染Vero细胞，且当用EGCG-酯处理时甚至更少。然而，为了获得定量测量结果，需要使用实时PCR进行进一步分析。

先前的实验表明，与HSV1/Vero细胞相比较，EGCG-酯-HSV1/Vero细胞中糖蛋白D的扩增较少，因此使用实时PCR进行糖蛋白的定量研究极为重要。设计用于本研究中的特定引物显示于表15中。实时PCR方法是通过收集每一反应循环结束时的荧光数据来进行的。实验中所用SYBR绿色染料结合于双链PCR产物，从而使PCR产物发荧光。随着反应的继续，仪器将再调用各样品的阈值。阈值循环(threshold cycle，Ct)是检测到荧光度首次显著增加时的关键循环。一旦PCR循环结束，就收集数据，并分析每一样品的Ct值，且报导荧光度的相对量(relative quantity，RQ)。比较Ct值的标准是一个Ct值的差异相当于DNA量差异的2倍。所有样品，即单独细胞、HSV1/Vero和EGCG-酯HSV1/Vero都使用100纳克/微升DNA。结果显示于图8和图9中。

表15.用于在HSV1上起始糖蛋白D的扩增的实时PCR引物

结果显示，EGCGHSV1/Vero与HSV1/Vero之间糖蛋白D的量相差32倍，且HSV1/vero与EGCG酯HSV1/vero之间相差256倍。结果表明，EGCG抑制95％的HSV1且EGCG-酯抑制99.46％的HSV1(图10)。其作用模式似乎是通过干扰病毒粒子包膜糖蛋白或通过干扰病毒化合物的病毒吸附和细胞进入起作用(宋(Song)等人，抗病毒反应(Antivirus Response)68：66-74，2005；维尔姆森(Williamson)等人，过敏反应与临床免疫学杂志(J.of AllergyClinical Immunology)118：1369-1374，2006)。显然，抑制作用看起来是在吸附期间发生，但在病毒穿透后不发生(图11)。通过使用绿色荧光蛋白标记，将确定，与对照病毒相比较，在经处理病毒中GFP表达明显减少。

针对HSV1/Vero糖蛋白D的基于PCR的DNA分析显示出比EGCG-酯-HSV1/Vero细胞高的谱带强度。由此推断出，与感染75微摩尔浓度EGCG酯-HSV1/Vero的细胞相比较，在感染HSV1/Vero的细胞中存在较多的病毒DNA。

另外，基于实时PCR的分析表明，EGCG-HSV1/Vero细胞中糖蛋白D的DNA量与HSV1/Vero细胞DNA量之间相差32倍，且HSV1/Vero细胞与EGCG-酯HSV1/Vero细胞之间相差256倍。这些结果表明，当与单独EGCG相比较时，EGCG-酯对HSV1的抑制程度较高，且对抗HSV1更有效。

概括起来，EGCG和EGCG-酯都可抑制HSV1，但经证实EGCG-酯在体外抑制HSV1感染作用方面比EGCG有效。相比EGCG，EGCG-酯是一种稳定化合物，并且在阴道pH下也很稳定，而且是局部施用的理想候选物。每年有数百万人将从局部施用针对HSV1和可能针对HSV2的EGCG酯获益。此外，由于能够终止疾病扩散，使得有可能终止HSV与HIV之间的联系。尽管需要进行其它研究来完全了解EGCG-酯在人体内的作用模式，但本研究中获得的结果也是很有价值的。使用天然产品可提高许多患者的寿命，并由此给患者将来更好且更健康的生活提供希望。

实例8.使用EGCG-硬脂酸酯局部用制剂治疗人类个体HSV发作的临床结果

图12到图20中显示了使用EGCG-硬脂酸酯局部用制剂治疗人类个体嘴唇区域中HSV发作的临床结果。结果显示，如果在发作期12小时内施用EGCG-硬脂酸酯局部用制剂，就可抑制HSV感染，并且使上皮组织愈合。如果在HSV发作后施用EGCG-硬脂酸酯局部用制剂，那么其将抑制起疱期，并完全消除溃疡期。感染区域不出现溃疡疱，并且上皮组织在7天内愈合。如果不施用制剂，那么愈合时间将达10天或更长时间。因此，施用EGCG-硬脂酸酯局部用制剂消除了起疱期和溃疡期。这两个阶段通常持续3到4天。

除非另作定义，否则本文中使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解相同的含义。本文中引用的出版物以及这些出版物中引用的材料都明确地以引用的方式并入本文中。

所属领域技术人员仅使用常规实验，就能认识到或能够确定本文所述的本发明各具体实施例的许多等效物。所述等效物也打算涵盖在以上权利要求书中。

Claims (12)

1.一种包含有效量在至少一个位置经C₁到C₃₀基团酯化的绿茶多酚作为唯一活性成分的组合物作为制备用于治疗个体的单纯疱疹病毒(HSV)感染的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述绿茶多酚是4'位经硬脂酸酯化的(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述绿茶多酚中至少两个位置经酯化。

4.根据权利要求1所述的应用，其中所述个体为人类。

5.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物进一步包含麻醉剂。

6.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物是配制用于局部投予。

7.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物是配制用于经口服的。

8.根据权利要求1所述的应用，其中所述绿茶多酚选自由(-)-表儿茶素、(-)-表没食子儿茶素、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯、其对映异构体及其组合组成的群组。

9.根据权利要求1所述的应用，其中所述单纯疱疹病毒为HSV-1。

10.一种包含至少两种独立地经C₁到C₃₀基团酯化的绿茶多酚作为仅有活性成分的组合物作为制备治疗个体的单纯疱疹病毒(HSV)的药物中的应用，其中所述C₁到C₃₀基团相同或不同。

11.根据权利要求10所述的应用，其中所述一种或一种以上绿茶多酚选自由(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、(-)-表儿茶素、(-)-表没食子儿茶素、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯、其对映异构体及其组合组成的群组。

12.根据权利要求10所述的应用，其中所述个体为人类。