JP2021052784A - 変異ｃａｓ９タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【課題】Ｃａｓ９タンパク質の欠失変異体の作製方法、及びキメラＣａｓ９タンパク質の作製方法を提供する。【解決手段】Ｃａｓ９の活性を解析するために、ＮＭ（ナイセリア・メニンジティディスのＣａｓ９）のＮ末端及び／又はＣ末端をＳＴＩ（ストレプトコッカス・サーモフィラスのＣａｓ９）の相同な領域と置換して、一連のドメイン交換変異体を作製し、次に、レポーター内のガイドＲＮＡ及び／又はＣａｓ９特異的プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を変更して、キメラタンパク質のドメイン交換の影響を決定した。Ｃ末端交換により、ＳＴＩのｃｒＲＮＡｉｔｒａｃｒＲＮＡ複合体と相互作用可能であり、さらにＳＴＩ特異的ＰＡＭを有するレポーターを抑制するＮＭ‐ＳＴＩハイブリッドが作製された。【選択図】なし
Description
関連出願
本願は、２０１３年１１月１９日に提出された米国仮特許出願第６１／９０６，３７４号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本願は、２０１３年１１月１９日に提出された米国仮特許出願第６１／９０６，３７４号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
政府利益の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所助成番号第Ｐ５０ＨＧ００５５５０号の政府助成を受けてなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所助成番号第Ｐ５０ＨＧ００５５５０号の政府助成を受けてなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
細菌および古細菌のＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成した短鎖ガイドＲＮＡに依存して、侵入する外来核酸中に存在する相補配列を分解する。Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579-2586 (2012); Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282 (2011)；およびBhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (2011) を参照されたい。近年、ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのインビトロ再構成により、通常はトランスにコードされるｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）と融合したｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）が、そのｃｒＲＮＡに一致する標的ＤＮＡ配列をＣａｓ９タンパク質に配列特異的に切断させるのに十分であることが実証された。標的部位に相同なｇＲＮＡの発現により、Ｃａｓ９が動員され、標的ＤＮＡが分解される。H. Deveau et al, Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008) を参照されたい。
Ｃａｓ９は、標的化が望まれるゲノム領域に相補的な２０塩基対とＣａｓ９を動員するモチーフとを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現させることにより、ゲノムのほぼ全ての領域を標的化するようにプログラムし得るＤＮＡヌクレアーゼである。特徴解析されているＣａｓ９ファミリーのメンバーおよび推定上のＣａｓ９ファミリーのメンバーの全ては、サイズが数キロベース（＞３０００塩基対）であり、機能的に検証されている最小のメンバーであるＮＭ‐Ｃａｓ９（ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitides）のＣａｓ９）のサイズは３，２４９塩基対である。このタンパク質はサイズが大きいため、送達および操作が難しく、生命工学および治療的応用への可能性が制限される。
本開示の態様は、タンパク質の一部が削除（omit）されるように改変されているが、標的ＤＮＡに結合して標的ＤＮＡ中に二本鎖切断を形成することができるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ヌクレアーゼとして機能する、ＤＮＡに結合し且つ１種類または複数種類のＲＮＡによってガイドされるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質に関する。ある態様によれば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質はＣａｓ９タンパク質である。
本開示の態様は、タンパク質の一部が削除されるように改変されているが、標的ＤＮＡに結合して標的ＤＮＡ中に一本鎖切断またはニックを形成することができるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ニッカーゼとして機能する、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質に関する。ある態様によれば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質はＣａｓ９タンパク質である。
本開示の態様は、タンパク質の一部が削除されるように改変されているが、ヌクレアーゼ欠損（nuclease null）である、すなわちＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質がヌクレアーゼ活性を欠いている、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質として機能する、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質に関する。ある態様によれば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質はＣａｓ９タンパク質である。
ある態様によれば、特定のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ファミリー内であまり保存されていないかまたは高度に分岐したＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質配列、および／または特定のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ファミリー内の、本明細書中で「保存エッジ（conservation edge）」と呼ばれる、低度保存と高度保存との境界の間のタンパク質配列を、種の集団内で同定することによって、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質の部分を欠失のために同定する。この態様によれば、本明細書に記載され、当業者に知られているような方法を用いて、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質内のアミノ酸配列が、高度保存されているか、または低度保存されていると特定される。ある態様によれば、高度保存されたアミノ酸配列および低度保存されたアミノ酸配列は、全体として、ＤＮＡ結合タンパク質のタンパク質配列内で互いに隣接、例えば直接隣接している。高度保存されたアミノ酸配列および低度保存されたアミノ酸配列は、高度保存されたアミノ酸配列を低度保存されたアミノ酸配列から切り離すアミノ酸によって区別される。このように、高度保存されたアミノ酸配列を低度保存されたアミノ酸配列から切り離すアミノ酸は、高度保存されたアミノ酸配列または低度保存されたアミノ酸配列のいずれかのエッジまたは末端部分である限りは、本明細書では「エッジアミノ酸」または「保存エッジ」と呼ばれる。したがって、本開示の方法は、高度保存されたアミノ酸配列を低度保存されたアミノ酸配列と切り離す、あるいは高度保存されたアミノ酸配列と低度保存されたアミノ酸配列を区別する、アミノ酸の同定を検討する。そのようなアミノ酸を本明細書では「エッジアミノ酸」と呼ぶ。この態様によれば、一対のエッジアミノ酸が、高度保存されたアミノ酸配列のいずれかの端部に隣接または接していてもよい。同様に、一対のエッジアミノ酸が、低度保存されたアミノ酸配列のいずれかの端部に隣接または接していてもよい。さらにこの態様によれば、ある例示的実施形態は、ＤＮＡ結合タンパク質全体のタンパク質配列内での、高度保存された隣接アミノ酸配列の同定、および低度保存されたアミノ酸配列の同定に関する。特に、ある例示的実施形態は、ＤＮＡ結合タンパク質全体のタンパク質配列内での、低度保存された配列とタンデムまたは直列に存在する高度保存された配列の同定、特に、いずれかの末端が低度保存（ＬＣ）された配列に隣接している高度保存（ＨＣ）配列、またはいずれかの末端が高度保存（ＨＣ）された配列に隣接している低度保存（ＬＣ）配列の同定に関する。このように、本明細書に記載の方法によって同定される例示的なタンデム配列または直列配列は、模式的にＬＣ‐ＨＣ‐ＬＣまたはＨＣ‐ＬＣ‐ＨＣと表され得る。この態様によれば、高度保存または低度保存された中央配列には、それぞれ低度保存または高度保存された隣接配列が接している。例示的なタンデム配列ＬＣ‐ＨＣ‐ＬＣでは、一対のエッジアミノ酸により、高度保存（ＨＣ）されたアミノ酸配列が、高濃度アミノ酸配列の両端にあるかまたは高濃度アミノ酸配列に隣接している２つの隣接する低度保存（ＬＣ）されたアミノ酸配列から、区別されるかまたは切り離されている。例示的なタンデム配列ＨＣ‐ＬＣ‐ＨＣでは、一対のエッジアミノ酸により、低度保存（ＬＣ）されたアミノ酸配列が、低度保存されたアミノ酸配列の両端にあるかまたは低度保存されたアミノ酸配列に隣接している２つの隣接する高度保存（ＨＣ）されたアミノ酸配列から、区別されるかまたは切り離されている。中央配列が高度保存されたアミノ酸配列または低度保存されたアミノ酸配列のいずれであっても、本明細書に記載の方法を用いてこのような例示的タンデム配列が同定された場合、本明細書に記載の方法に従って中央配列を除去することにより、ＤＮＡ結合活性が維持されており、且つ野生型ＤＮＡ結合タンパク質よりサイズが小さい、変異ＤＮＡ結合タンパク質を作成する。エッジアミノ酸は、中央配列に隣接することにより、または直列する隣接配列から中央配列を切り離すことにより、変異ＤＮＡ結合タンパク質を作成するために除去される中央配列を規定する。本開示の特定の態様によれば、変異ＤＮＡ結合タンパク質が有用なＤＮＡ結合タンパク質活性を保持している限り、中央配列が高度保存されたアミノ酸配列であるか低度保存されたアミノ酸配列であるかに関係なく、タンデム配列中の中央配列が除去され得る。
本開示におけるあまり保存されていない配列、または保存エッジ間のタンパク質配列を同定するために、アラインメントを、ＰＦＡＭから得るか、またはＣａｓ９ホモログのデータベースサーチにより得られた配列のコレクションから作成した。このアラインメントを計算的に調整し、位置ごとのアミノ酸頻度の（相対）エントロピーとして保存度を計算した。次に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質から配列を除去して変異体を作製する。
ある態様によれば、欠失に適していると考えられるマルチドメインＣａｓ９タンパク質内の領域を同定するために、バイオインフォマティクスによるアプローチを用いて、Ｃａｓ９タンパク質における潜在的なドメイン境界を同定する。ＭＵＳＣＬＥを用いてＰＦＡＭデータベース中のＣａｓ９配列（ＰＦ１３３９５）をリアライメントすることにより多重配列アラインメントを作成し、多様性および全長配列についてアラインメントを計算的に調整する。大腸菌の全遺伝子の平均頻度を基準として、観察されたアミノ酸頻度の相対エントロピーとして配列保存度を計算する。保存プロファイルにマルチスケールエッジフィルタ（ガウス差分（DoG）バンドパスフィルタ）を適用して、本明細書で保存エッジと呼ばれる潜在的なタンパク質ドメイン境界を帰属させる。保存エッジ間の領域を１回目の欠失変異体の欠失のために選択する。
ある態様によれば、本開示は、サイズがより小さいが、野生型のタンパク質に近い活性を保持している、合成ＮＭ‐Ｃａｓ９欠失変異体を記載する。合成ＮＭ‐Ｃａｓ９欠失変異体は、細胞中でガイドＲＮＡとの共局在複合体としてＤＮＡに結合させて二本鎖切断もしくは一本鎖切断を生じさせるため、または目的の標的ＤＮＡの近傍にエフェクター基を配置させて所望の機能を発揮させるために用いることができる。
ある態様によれば、ＤＮＡへの結合に不必要であり、野生型ＤＮＡ結合タンパク質よりサイズの小さい変異ＤＮＡ結合タンパク質を形成するために除去可能である、Ｃａｓ９などのＤＮＡ結合タンパク質の領域を同定するための、アラインメントに基づくドメイン検出方法が提供される。本明細書に記載の方法によれば、細菌細胞およびヒト細胞において強力な活性を示す最小化されたＣａｓ９バリアントが作製される。本明細書に記載の態様によれば、野生型ＤＮＡ結合タンパク質より小さい、変異機能性Ｃａｓ９バリアントなどの変異機能性ＤＮＡ結合タンパク質バリアントが提供される。
ある態様によれば、例示的なＤＮＡ結合タンパク質としては、原核生物および高等真核生物の両方で機能することが示されている、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitides）のＣａｓ９（ＮＭ、ＧＩ：２１８７６７５８８）およびストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）のＣａｓ９（ＳＴ１、ＧＩ：１１６６２７５４２）などのＣａｓ９オルソログが挙げられる。その全体が参照により援用されるHou, Z. et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 15644-15649, doi:10.1073/pnas.1313587110 (2013) を参照されたい。
これらの例示的Ｃａｓ９オルソログは、トレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のＣａｓ９（ＳＰ、ＧＩ：１３６２２１９３）より遺伝子サイズが小さく、すなわち、４１００塩基対に対して約３２００塩基対である。したがって、本開示の態様は、特に遺伝子長がウイルス価に大きく影響し得るウイルスパッケージング技術を用いて、ＤＮＡ結合タンパク質Ｃａｓ９を送達可能な効率が上昇するように、ＤＮＡ結合タンパク質Ｃａｓ９のサイズを小さくすることに関する。それぞれの全体が参照により援用されるKumar, M., Keller, B., Makalou, N. & Sutton, R. E. Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors. Human gene therapy 12, 1893-1905, doi:10.1089/104303401753153947 (2001); Wu, Z., Yang, H. & Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 18, 80-86, doi:10.1038/mt.2009.255 (2010); およびGelinas, C. & Temin, H. M. Nondefective spleen necrosis virus-derived vectors define the upper size limit for packaging reticuloendotheliosis viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 83, 9211-9215 (1986) を参照されたい。
Ｃａｓ９遺伝子のサイズを合成的に小さくすることで、より複雑な制御系および機能的ドメインを単一ベクター内にパッケージングすることができる。別の態様によれば、標的化能が向上したより小さなＣａｓ９バリアントの作製を可能にする、ＰＡＭ特異性を合成的に変化させる方法が提供される。
ある態様によれば、第１の種類のＣａｓ９のＣ末端ドメインを第２の種類のＣａｓ９のＣ末端ドメインと交換することによりＣａｓ９キメラを作製する方法が提供される。ある態様によれば、本開示は、ＮＭのＣ末端ドメインをＳＴ１と交換することにより、機能的ＮＭ‐ＳＴ１‐Ｃａｓ９キメラなどのドメイン交換Ｃａｓ９キメラを提供する。キメラＣａｓ９タンパク質はＳＴ１のガイドＲＮＡおよびＰＡＭに対する特異性を示す。
ある態様によれば、細胞は、原核細胞または真核細胞である。ある態様によれば、細胞は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。ある態様によれば、細胞は、哺乳動物細胞である。
ある態様によれば、ＲＮＡは約１０〜約５００ヌクレオチドである。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０〜約１００ヌクレオチドである。
ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡはガイドＲＮＡである。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡはｃｒＲＮＡである。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡである。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である。
ある態様によれば、標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、結合可能なエレメント、または外来性ＤＮＡである。
ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡに結合し、且つ１種類または複数種類のＲＮＡによってガイドされる、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である。ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡに結合し、且つ１種類または複数種類のＲＮＡによってガイドされる、Ｃａｓ９タンパク質である。
本発明の特定の実施形態のその他の特徴および利点は、以下の実施形態およびそれらの図面の説明において、および特許請求の範囲から、さらに充分に明らかになるであろう。
本特許または出願ファイルは、カラーで作製された少なくとも１枚の図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、特許庁へ申請し、必要な料金を支払うことで提供される。本発明の、前述した特徴およびその他の特徴、ならびに利点は、添付の図面と共に、具体的実施形態についての以下の詳細な説明からより十分に理解されるであろう。
本発明の実施形態は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの変異ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質に関する。そのような変異体は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質属内の種間であまり保存されていないか、または高度に分岐した（divergent）配列を除去することにより作成される。ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質のファミリー内の種の配列をアライメントし、低度保存配列または保存エッジ間配列を決定する。次に、これらの配列を特定のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質から欠失させる。例示的なＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質としては、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在するＣａｓ９タンパク質が挙げられる。そのようなＣａｓ９タンパク質およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、当該技術分野で十分に裏付けられている。Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477を参照されたい。本明細書に記載の変異ＤＮＡ結合タンパク質は、標的ＤＮＡにおける二本鎖切断もしくは標的ＤＮＡにおける一本鎖切断を生じさせるため、または標的ＤＮＡの近くにエフェクター基が配置されてエフェクター基が標的ＤＮＡと相互作用できるように標的ＤＮＡに結合するために用いることができる。そのようなエフェクター基としては、当業者に公知の活性化因子、抑制因子、またはエピジェネティック修飾因子が挙げられる。
ヌクレアーゼ活性を有する例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、二本鎖ＤＮＡにニックを形成するか、または二本鎖ＤＮＡを切断するように機能する。そのようなヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼ活性を示す１つまたは複数のポリペプチド配列を有するＤＮＡ結合タンパク質から生じ得る。そのような例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、それぞれが二本鎖ＤＮＡの特定のストランドを切断すること、またはニックを形成することに関与する、２つの別個のヌクレアーゼドメインを有していてもよい。当業者に知られているヌクレアーゼ活性を有する例示的なポリペプチド配列としては、ＭｃｒＡ‐ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインが挙げられる。したがって、例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ＭｃｒＡ‐ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのうちの１つまたは複数を含む天然タンパク質である。
ある態様によれば、２つ以上のヌクレアーゼドメインを有するＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうちの１つを除いた全てが不活性化されるように修飾または改変されてもよい。そのような修飾または改変されたＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質が二本鎖ＤＮＡの一方のストランドのみを切断する、またはニックを形成するものである限り、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる。ＲＮＡによってＤＮＡにガイドされる場合、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる。
例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である。例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）では、Ｃａｓ９は、タンパク質中の２つの触媒ドメイン、すなわちＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメインおよび非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインが介在するプロセスによって、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ｂｐ上流に平滑末端二本鎖切断を形成する。その全体が参照により援用されるJinke et al., Science 337, 816-821 (2012) を参照されたい。Ｃａｓ９タンパク質は、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477の補足情報で確認されている以下のものを含む、多数のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在することが知られている。メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）Ｃ７株；コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheriae）；コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）ＹＳ‐３１４株；コリネバクテリウム・グルタニカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２ Ｋｉｔａｓａｔｏ株；コリネバクテリウム・グルタニカム ＡＴＣＣ１３０３２ Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ株；コリネバクテリウム・グルタニカム Ｒ株；コリネバクテリウム・クロッペンステッティイ（Corynebacterium kroppenstedtii）ＤＳＭ４４３８５株；マイコバクテリウム・アブセサス（Mycobacterium abscessus）ＡＴＣＣ１９９７７株；ノカルディア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）ＩＦＭ１０１５２株；ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＰＲ４株；ロドコッカス・ジョスティイ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１株；ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）Ｂ４ ｕｉｄ３６５７３株；アシドサーマス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）１１Ｂ株；アルスロバクター・クロロフェノリカス（Arthrobacter chlorophenolicus）Ａ６株；クリベラ・フラビダ（Kribbella flavida）ＤＳＭ１７８３６ ｕｉｄ４３４６５株；サーモモノスポラ・カーバタ（Thermomonospora curvata）ＤＳＭ４３１８３株；ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）Ｂｄ１株；ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＤＪＯ１０Ａ株；スラッキア・ヘリオトリニレデューセンス（Slackia heliotrinireducens）ＤＳＭ２０４７６株；パーセフォネラ・マリナ（Persephonella marina）ＥＸ Ｈ１株；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）ＮＣＴＣ９４３４株；カプノサイトファガ・オクラセア（Capnocytophaga ochracea）ＤＳＭ７２７１株；フラボバクテリウム・サイクロフィルム（Flavobacterium psychrophilum）ＪＩＰ０２ ８６株；アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）ＡＴＣＣ ＢＡＡ８３５株；ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイ（Roseiflexus castenholzii）ＤＳＭ１３９４１株；ロゼイフレクサス（Roseiflexus）ＲＳ１株；シネコシスティス（Synechocystis）ＰＣＣ６８０３株；エルシミクロビウム・ミヌトゥム（Elusimicrobium minutum）Ｐｅｉ１９１株；未培養細菌Ｔｅｒｍｉｔｅ ｇｒｏｕｐ １ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ Ｒｓ Ｄ１７；フィブロバクター・サクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）Ｓ８５株；バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７株；リステリア・イノキュア（Listeria innocua）；ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）；ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＧＧ株；ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）ＵＣＣ１１８株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）Ａ９０９株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ ＮＥＭ３１６株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ ２６０３株；ストレプトコッカス・ディスガテクティアエ亜種エクイシミリス（Streptococcus dysgalactiae equisimilis）ＧＧＳ１２４株；ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Streptococcus equi zooepidemicus）ＭＧＣＳ１０５６５株；ストレプトコッカス・ガロリティカス（Streptococcus gallolyticus）ＵＣＮ３４ ｕｉｄ４６０６１株；ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）チャリス（Challis）株ＣＨ１亜株；ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＮＮ２０２５ ｕｉｄ４６３５３株；ストレプトコッカス・ミュータンス；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｍ１ ＧＡＳ株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ５００５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＭＧＡＳ２０９６株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ９４２９株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＭＧＡＳ１０２７０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＭＧＡＳ６１８０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＭＧＡＳ３１５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＳＳＩ‐１株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＭＧＡＳ１０７５０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＮＺ１３１株；ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophiles）ＣＮＲＺ１０６６株；ストレプトコッカス・サーモフィラス ＬＭＤ‐９株；ストレプトコッカス・サーモフィラス ＬＭＧ１８３１１株；クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）Ａ３ Ｌｏｃｈ Ｍａｒｅｅ株；クロストリジウム・ボツリヌム Ｂ Ｅｋｌｕｎｄ １７Ｂ株；クロストリジウム・ボツリヌム Ｂａ４ ６５７株；クロストリジウム・ボツリヌム Ｆ Ｌａｎｇｅｌａｎｄ株；クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）Ｈ１０株；フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）ＡＴＣＣ２９３２８株；ユウバクテリウム・レクターレ（Eubacterium rectale）ＡＴＣＣ３３６５６株；マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）；マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）１６３Ｋ株；マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）；マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）５３株；ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）ＤＳＭ１２１１２株；ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）ＢＴＡｉ１株；ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）Ｘ１４株；ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）ＢｉｓＢ１８；ロドシュードモナス・パルストリス ＢｉｓＢ５株；パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）ＤＳ‐１株；ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）ＤＦＬ１２株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）Ｐａｌ ５ ＦＡＰＥＲＪ株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス Ｐａｌ ５ ＪＧＩ株；アゾスピリルム（Azospirillum）Ｂ５１０ ｕｉｄ４６０８５株；ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）ＡＴＣＣ１１１７０株；ディアフォロバクター（Diaphorobacter）ＴＰＳＹ ｕｉｄ２９９７５株；フェルミネフォロバクター・エイセニアエ（Verminephrobacter eiseniae）ＥＦ０１‐２株；ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitides）０５３４４２株；ナイセリア・メニンジティディス ａｌｐｈａ１４；ナイセリア・メニンジティディス Ｚ２４９１株；デスルホビブリオ・サレキシゲンス（Desulfovibrio salexigens）ＤＳＭ ２６３８株；キャンピロバククー・ジェジュニ亜種ドイレイ（Campylobacter jejuni doylei）２６９ ９７株；キャンピロバククー・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）８１１１６株；キャンピロバククー・ジェジュニ；キャンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）ＲＭ２１００株；ヘリコバクター・ヘパティカス（H Helicobacter hepaticus）；ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）；トルモナス・アウエンシス（Tolumonas auensis）ＤＳＭ９１８７株；シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）Ｔ６ｃ株；シューワネラ・ペアレアナ（Shewanella pealeana）ＡＴＣＣ７００３４５株；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）Ｐａｒｉｓ株；アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）１３０Ｚ株；パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）；フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダ（Francisella tularensis novicida）Ｕ１１２株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ハラークティカ（Francisella tularensis holarctica）；フランシセラ・ツラレンシス ＦＳＣ １９８株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ツラレンシス（Francisella tularensis tularensis）；フランシセラ・ツラレンシス ＷＹ９６‐３４１８株；およびトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５株。したがって、本開示の態様は、上記で特定される種のいずれか１つなど、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在するＣａｓ９タンパク質の変異体に関する。例示的なＣａｓ９タンパク質は、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）０５３４４２株、ナイセリア・メニンジティディス α１４株、ナイセリア・メニンジティディス Ｚ２４９１株などのナイセリア・メニンジティディスにおいて見出されるＣａｓ９タンパク質である。
本開示に係る細胞には、本明細書に記載されるように外来核酸の導入でき、発現させることができるあらゆる細胞が含まれる。本明細書に記載される本開示の基本的概念は細胞の種類によって限定されないと理解されるべきである。本開示に係る細胞には、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、古細菌細胞、真正細菌細胞などが含まれる。細胞には、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞などの真核細胞が含まれる。具体的な細胞としては、哺乳動物細胞が挙げられる。具体的な細胞としては、ヒト誘導多能性幹細胞など、多能性幹細胞などの幹細胞が挙げられる。
標的核酸としては、変異ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼがニック形成または切断に有用であり得る任意の核酸配列が挙げられる。標的核酸としては遺伝子が挙げられる。本開示の目的のために、二本鎖ＤＮＡなどのＤＮＡは標的核酸を含んでいてもよく、共局在複合体は、共局在複合体が標的核酸に対する所望の効果を与えられ得るよう、その標的核酸において、またはその標的核酸に隣接して、またはその標的核酸の近傍で、ＤＮＡに結合、またはＤＮＡと共局在することができる。そのような標的核酸は、内在性（または天然）の核酸および外来性（または外来）の核酸を含んでいてもよい。当業者は、本開示に基づき、標的核酸を含むＤＮＡに共局在するガイドＲＮＡおよび変異Ｃａｓ９タンパク質を容易に特定またはデザインすることができる。ＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、結合可能なエレメント、または外来性ＤＮＡが含まれる。
外来核酸（すなわち、細胞の天然核酸組成物の一部でないもの）は、当業者に公知の任意の導入方法を用いて細胞に導入されてもよい。そのような方法には、遺伝子導入法、形質導入法、ウイルス形質導入法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、ヌクレオフェクション法、ナノ粒子銃（nanoparticle bombardment）法、形質転換法、結合法（conjugation）などが含まれる。当業者は、容易に特定可能な文献資料を用いてそのような方法を容易に理解し、適用するであろう。
ある態様によれば、Ｃａｓ９のファミリー内の種内であまり保存されていないか、もしくは分岐したＣａｓ９タンパク質の一部分、またはＣａｓ９のファミリー内の種内の保存エッジ間にあるＣａｓ９タンパク質の一部分を欠失させることにより、Ｃａｓ９タンパク質をコードするために必要な遺伝物質を小さくする。機能的Ｃａｓ９をコードするために必要な核酸のサイズを小さくすることにより、Ｃａｓ９を送達するようにデザインされたベクターに、ガイドＲＮＡまたは調節エレメントまたはエフェクタードメインをコードする核酸などの付加的な核酸を含めることができる。最も小さな特徴解析されているＣａｓ９ファミリーメンバーを使用する場合、Ｃａｓ９を所望のゲノム座位に適切に局在させるために必要な遺伝因子（Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ）をコードするのに約４，５００キロベースのＤＮＡが必要となる。約４，５００塩基対のＣａｓ９は、アデノ随伴ウイルス（AAV）系ウイルスベクター（欧州で規制承認されているウイルスベクター）内へのパッケージングのサイズ限度に近い。さらに、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質に融合される第１の転写ドメインおよびエピジェネティックエフェクタードメインのいくつかは２，０００塩基対より大きいため、Ｃａｓ９に融合させた場合、ＡＡＶベクターのパッケージング限度を遙かに超え、レンチウイルスのパッケージングシステムの限度（約８，０００塩基対）に近づく。
以下の実施例は本開示の代表例として記載するものである。本開示、図面、および添付の特許請求の範囲を考慮して、これらの実施例および他の同等の実施形態が明らかになるので、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例Ｉ
Ｃａｓ９変異体
Ｃａｓ９をコードする遺伝子サイズが大きいという問題を克服するために、最も小さい特徴解析されているＣａｓ９ファミリーメンバーの１つであるＮＭ‐Ｃａｓ９（ナイセリア・メニンジティディスのＣａｓ９）内で種々の領域の標的化欠失を行う。ＮＭ‐Ｃａｓ９のサイズは３，２４９ｂｐである。ゲノム標的化のための必要条件およびヌクレアーゼ活性に関わる残基を決定する。よりサイズの小さいＮＭ‐Ｃａｓ９を作製するために、Ｃａｓ９タンパク質のアラインメントを作製し、低度保存された隣接区間または保存エッジ間の区間を欠失のために同定した。複数の目的領域を同定し、ＮＭ‐Ｃａｓ９から選択的に除去した後、Ｃａｓ９抑制因子アッセイを用いて機能を評価した。アッセイでは、ヌクレアーゼ活性を欠いているがレポーター遺伝子の５′領域を標的化可能なＮＭ‐Ｃａｓ９変異体を用いた。ＮＭ‐Ｃａｓ９は、レポーター遺伝子に結合できる場合は転写を抑制し、蛍光レポーターの場合、細胞が非蛍光性となる。
Ｃａｓ９変異体
Ｃａｓ９をコードする遺伝子サイズが大きいという問題を克服するために、最も小さい特徴解析されているＣａｓ９ファミリーメンバーの１つであるＮＭ‐Ｃａｓ９（ナイセリア・メニンジティディスのＣａｓ９）内で種々の領域の標的化欠失を行う。ＮＭ‐Ｃａｓ９のサイズは３，２４９ｂｐである。ゲノム標的化のための必要条件およびヌクレアーゼ活性に関わる残基を決定する。よりサイズの小さいＮＭ‐Ｃａｓ９を作製するために、Ｃａｓ９タンパク質のアラインメントを作製し、低度保存された隣接区間または保存エッジ間の区間を欠失のために同定した。複数の目的領域を同定し、ＮＭ‐Ｃａｓ９から選択的に除去した後、Ｃａｓ９抑制因子アッセイを用いて機能を評価した。アッセイでは、ヌクレアーゼ活性を欠いているがレポーター遺伝子の５′領域を標的化可能なＮＭ‐Ｃａｓ９変異体を用いた。ＮＭ‐Ｃａｓ９は、レポーター遺伝子に結合できる場合は転写を抑制し、蛍光レポーターの場合、細胞が非蛍光性となる。
Ｃａｓ９のアラインメントおよび欠失予測：ＰＦＡＭデータベース、またはｊａｃｋＨＭＭＥＲ（その全体が参照により援用されるR.D. Finn, J. Clements, S.R. Eddy, Nucleic Acids Research (2011) Web Server Issue 39:W29-W37）などのデータベースサーチから、Ｃａｓ９ホモログの全長配列を得た。配列のコレクションがアライメントされない場合、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（その全体が参照により援用されるSievers F, Wilm A, Dineen DG, Gibson TJ, Karplus K, Li W, Lopez R, McWilliam H, Remmert M, Soding J, Thompson JD, Higgins DG (2011)）などのアラインメントアルゴリズムまたは同等物を用いてアラインメントを作成する。アラインメントを目的配列の位置まで計算的にカットし、アラインメントの偏りが少なくなるように調整した（例えば、ペアワイズ同一性が９５％を超える配列を除去した）。その位置でのアミノ酸およびギャップの量を考慮して、位置当たりのアミノ酸頻度のエントロピーまたは相対エントロピーとして保存度を計算する。低度保存領域または保存エッジ間領域を欠失の標的とする。実験検証を反復して、欠失を拡大するか、またはシフトさせる。
欠失体の構築および特徴解析：その全体が参照により援用されるEsvelt, K. M., Mali, P., Braff, J. L., Moosburner, M., Yaung, S. J., and Church, G. M. (2013) Nat Methods 10, 1116-1121に記載されるように、ヌクレアーゼ欠損ＮＭ‐Ｃａｓ９を発現する細菌プラスミドをあらかじめ作製した。ＮＭ‐Ｃａｓ９内に標的欠失を生じさせるために、その全体が参照により援用されるGibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., 3rd, and Smith, H. O. (2009) Nat Methods 6, 343-345に記載されるように、ギブソン・アセンブリを用いた。重複する相補的部分を含み、ＮＭ‐Ｃａｓ９内の標的領域を除去してＳＧＧＧＳリンカーを挿入するようにデザインされたプライマーを購入し、ＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ断片をゲル精製し、ギブソン・アセンブリを用いてインビトロでアセンブルし、大腸菌に形質転換した。クローンの配列を検証し、（２つではなく）単一のプラスミドがＮＭ‐Ｃａｓ９のスペーサー、標的プロトスペーサー、およびＮＭ‐Ｃａｓ９活性に対するＹＦＰレポーターを含む、あらかじめ作製されたＮＭ‐Ｃａｓ９レポータープラスミド（(2013) Nat Methods 10, 1116-1121参照）の改変型を用いてクローンを試験した。簡潔に述べると、このアッセイでは、合成ＮＭ‐Ｃａｓ９バリアントおよびレポータープラスミドで細胞を同時形質転換する。次に、二重に形質転換された細胞を３７℃で生育し、蛍光プレートリーダーを用いてＹＦＰ蛍光の量を測定し、野生型ヌクレアーゼ欠損ＮＭ‐Ｃａｓ９を有する対照プラスミドおよびレポータープラスミドで形質転換された細胞と比較する。
以下の配列は、ＹＦＰレポーターアッセイにより測定されるように、ほぼ野生型レベルに近い活性を保持していた２つの最も大きなＮＭ‐Ｃａｓ９単一欠失変異体の配列である。ＮＭ‐ｃａｓ９内の欠失領域を置換しているＳＧＧＧＳリンカーの配列は、大文字で示される。
本明細書に記載の方法に従って、ＮＭ‐Ｃａｓ９内の複数の欠失が同定された。最大のＮＭ‐Ｃａｓ９‐Δ２５５‐４４９は５９５塩基対が除去されており、レポーターアッセイにより測定されるように、活性低下はわずか１６％である。ある態様によれば、ＮＭ‐Ｃａｓ９などの野生型Ｃａｓ９より１０００塩基対または９００塩基対少なく、野生型レベルに近い活性を保持している、変異Ｃａｓ９タンパク質が提供される。
実施例ＩＩ
欠失のためのＣａｓ９ヌクレアーゼドメインの標的化
Ｃａｓ９のニッカーゼ欠損アレルまたはヌクレアーゼ欠損アレルが望まれる場合、低度配列保存領域または配列保存エッジ間領域を標的化すると共に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを周囲のヌクレオチドと共に欠失のための標的としてもよい。このようなアプローチを用いて、ＨＮＨモチーフおよび周囲のヌクレオチドを欠いた機能的ＮＭ‐Ｃａｓ９アレルであるＮＭ‐Ｃａｓ９‐Δ５６７‐６５４を作製した。このアレルは、ＹＦＰレポーターアッセイで測定されるように、野生型とほぼ同じＤＮＡ結合能を保持していた。
欠失のためのＣａｓ９ヌクレアーゼドメインの標的化
Ｃａｓ９のニッカーゼ欠損アレルまたはヌクレアーゼ欠損アレルが望まれる場合、低度配列保存領域または配列保存エッジ間領域を標的化すると共に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを周囲のヌクレオチドと共に欠失のための標的としてもよい。このようなアプローチを用いて、ＨＮＨモチーフおよび周囲のヌクレオチドを欠いた機能的ＮＭ‐Ｃａｓ９アレルであるＮＭ‐Ｃａｓ９‐Δ５６７‐６５４を作製した。このアレルは、ＹＦＰレポーターアッセイで測定されるように、野生型とほぼ同じＤＮＡ結合能を保持していた。
実施例ＩＩＩ
偏りのないＮＭ‐Ｃａｓ９欠失ライブラリーの構築方法
Ｃａｓ９欠失体を作製するために標的アプローチに加えて、本開示の態様には、ランダム欠失生成および機能的変異体のスクリーニングのためのハイスループットアプローチが含まれる。例示的な方法によれば、無差別（promiscuous）ヌクレアーゼ、超音波処理、サンプルの反復ピペッティング、または他の化学的、酵素的、もしくは環境的手段を用いて、所望のＣａｓ９アレルを含むプラスミドＤＮＡを剪断してもよい。断片化後、プラスミドＤＮＡをエキソヌクレアーゼで処理して、Ｃａｓ９遺伝子からヌクレオチドを除去してもよい。エキソヌクレアーゼ処理後、断片化末端をマングビーンヌクレアーゼまたはクレノーポリメラーゼなどの酵素で平滑末端化し、互いにライゲーションさせて、ランダム欠失を含むＣａｓ９プラスミドを再生する。Ｃａｓ９の欠失部分内にリンカーまたはエフェクターモチーフなどの外来性ドメインを挿入するために、平滑末端化された断片ＤＮＡにそのようなドメインをライゲーションさせてもよく、次に、プラスミドの環状化により、Ｃａｓ９の欠失部分内に外来性ドメインが挿入されたＣａｓ９コード配列が得られる。次に、環状化分子のライブラリーを大腸菌に形質転換し、プラスミドＤＮＡを抽出する。
偏りのないＮＭ‐Ｃａｓ９欠失ライブラリーの構築方法
Ｃａｓ９欠失体を作製するために標的アプローチに加えて、本開示の態様には、ランダム欠失生成および機能的変異体のスクリーニングのためのハイスループットアプローチが含まれる。例示的な方法によれば、無差別（promiscuous）ヌクレアーゼ、超音波処理、サンプルの反復ピペッティング、または他の化学的、酵素的、もしくは環境的手段を用いて、所望のＣａｓ９アレルを含むプラスミドＤＮＡを剪断してもよい。断片化後、プラスミドＤＮＡをエキソヌクレアーゼで処理して、Ｃａｓ９遺伝子からヌクレオチドを除去してもよい。エキソヌクレアーゼ処理後、断片化末端をマングビーンヌクレアーゼまたはクレノーポリメラーゼなどの酵素で平滑末端化し、互いにライゲーションさせて、ランダム欠失を含むＣａｓ９プラスミドを再生する。Ｃａｓ９の欠失部分内にリンカーまたはエフェクターモチーフなどの外来性ドメインを挿入するために、平滑末端化された断片ＤＮＡにそのようなドメインをライゲーションさせてもよく、次に、プラスミドの環状化により、Ｃａｓ９の欠失部分内に外来性ドメインが挿入されたＣａｓ９コード配列が得られる。次に、環状化分子のライブラリーを大腸菌に形質転換し、プラスミドＤＮＡを抽出する。
この時点で、ライブラリーをＣａｓ９活性のレポーターアッセイを含む細胞に形質転換してもよく、機能的活性を維持しているライブラリーのメンバーを同定してもよい。あるいは、スクリーニングするライブラリーのサイズを小さくするために、新たに作製されたライブラリー由来のＣａｓ９のコード配列を消化またはＰＣＲにより単離してもよく、最初の野生型Ｃａｓ９遺伝子より短くなるように断片をサイズで選択してもよい。次に、これらのより小さいメンバーを最初のベクター中に再度ライゲーションし、Ｃａｓ９活性に対するレポーターを含む細胞に形質転換してもよい。
プラスミドの剪断に加えて、３′側にＣａｓ９遺伝子に対する相同性を有するが５′側には互いに対する相同性を有し、各オリゴヌクレオチドの３′末端がＣａｓ９内の約３０塩基対の異なる区間に結合する、オリゴヌクレオチドのライブラリーを作製してもよい。これらのオリゴヌクレオチドはＣａｓ９コード配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方をカバーする。次に、これらのオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、所与のセンスＰＣＲ反応産物のそれぞれが他のアンチセンスＰＣＲ産物の全てに対する相補性を有し、逆も同じである、一連のＣａｓ９断片を作製することができる。次に、ギブソン・アセンブリまたはオーバーラップ・エクステンションＰＣＲなどの方法を用いてこれらの断片同士をアニーリングさせた後、ベクター骨格中へのライゲーションおよび細胞への形質転換を行い、Ｃａｓ９遺伝子のランダムな区間が除去されたＣａｓ９バリアントのライブラリーを作製することができる。より長いリンカーのため、または欠失領域内にエフェクタードメインを挿入するためには、オリゴヌクレオチドはその５′末端に、より長いリンカーまたはエフェクタードメインに対する相補性を有するべきであり、次に、このドメインは、ギブソン・アセンブリ反応中またはオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ中に導入されるべきである。ライブラリー作製されると、本明細書に記載のＹＦＰレポーターシステムなどのレポーターアッセイを用いて機能的バリアントを同定することができる。
実施例ＩＶ
ベクター構築
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ欠損プラスミドは、ＳＴ１（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４８６５９）であるか、またはＮＭプラスミドおよびＴＤプラスミド（それぞれ、Ａｄｄｇｅｎｅ＃４８６４６および４８６４８）から、以下の点変異（ＮＭ：Ｄ１６Ａ Ｄ５８７Ａ Ｈ５８８Ａ Ｎ６１１Ａ、およびＴＤ：Ｄ１３Ａ Ｄ８７８Ａ Ｈ８７９Ａ Ｎ９０２Ａ）を導入することにより構築した。ギブソン・アセンブリを用いてＣａｓ９欠失体を作製した。内部欠失体を作製する場合、連結断片間のリンカーを欠くＮＭΔ５６６‐６２０以外は、内部欠失体を５アミノ酸のＳｅｒ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｓｅｒリンカーで連結した。Ｎ末端ドメイン交換により、ＳＴ１の残基１〜１１７をＮＭの残基１１８〜１０８２に融合させた。Ｃ末端ドメイン交換により、ＮＭの残基１〜７２７をＳＴ１の残基７４３〜１１２１に融合させた。
ベクター構築
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ欠損プラスミドは、ＳＴ１（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４８６５９）であるか、またはＮＭプラスミドおよびＴＤプラスミド（それぞれ、Ａｄｄｇｅｎｅ＃４８６４６および４８６４８）から、以下の点変異（ＮＭ：Ｄ１６Ａ Ｄ５８７Ａ Ｈ５８８Ａ Ｎ６１１Ａ、およびＴＤ：Ｄ１３Ａ Ｄ８７８Ａ Ｈ８７９Ａ Ｎ９０２Ａ）を導入することにより構築した。ギブソン・アセンブリを用いてＣａｓ９欠失体を作製した。内部欠失体を作製する場合、連結断片間のリンカーを欠くＮＭΔ５６６‐６２０以外は、内部欠失体を５アミノ酸のＳｅｒ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｓｅｒリンカーで連結した。Ｎ末端ドメイン交換により、ＳＴ１の残基１〜１１７をＮＭの残基１１８〜１０８２に融合させた。Ｃ末端ドメイン交換により、ＮＭの残基１〜７２７をＳＴ１の残基７４３〜１１２１に融合させた。
実施例Ｖ
細菌レポーターコンストラクト
欠失変異体の解析に用いるレポーターコンストラクトは、単一のＳＣ１０１‐ｋａｎＲプラスミド骨格中にスペーサーエレメントおよびＹＦＰレポーターを併せ持つこと以外は、以前に発表されているものと同様である。ドメイン交換解析のためのレポーターコンストラクトは以前に使用されているものと同じである。その全体が参照により援用されるEsvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature methods 10, 1116-1121, doi:10.1038/nmeth.2681 (2013) を参照されたい。
細菌レポーターコンストラクト
欠失変異体の解析に用いるレポーターコンストラクトは、単一のＳＣ１０１‐ｋａｎＲプラスミド骨格中にスペーサーエレメントおよびＹＦＰレポーターを併せ持つこと以外は、以前に発表されているものと同様である。ドメイン交換解析のためのレポーターコンストラクトは以前に使用されているものと同じである。その全体が参照により援用されるEsvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature methods 10, 1116-1121, doi:10.1038/nmeth.2681 (2013) を参照されたい。
実施例ＶＩ
哺乳動物レポーターコンストラクト
Ｍ‐ＳＴ１ｎ‐ＶＰ６４コンストラクト、ＳＴ１ガイドＲＮＡプラスミド、およびＳＴ１特異的哺乳動物転写レポーターは、Esvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature methods 10, 1116-1121, doi:10.1038/nmeth.2681 (2013)において以前に発表されている（それぞれ、Ａｄｄｇｅｎｅ＃４８６７５、４８６７２、および４８６７８）。細菌のコンストラクトの場合と同様に欠失変異体を作製した。
哺乳動物レポーターコンストラクト
Ｍ‐ＳＴ１ｎ‐ＶＰ６４コンストラクト、ＳＴ１ガイドＲＮＡプラスミド、およびＳＴ１特異的哺乳動物転写レポーターは、Esvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature methods 10, 1116-1121, doi:10.1038/nmeth.2681 (2013)において以前に発表されている（それぞれ、Ａｄｄｇｅｎｅ＃４８６７５、４８６７２、および４８６７８）。細菌のコンストラクトの場合と同様に欠失変異体を作製した。
実施例ＶＩＩ
抑制アッセイ
試験対象の適切なスペーサー／レポーターコンストラクトおよびＣａｓ９ベクターでＮＥＢ １０‐ｂｅｔａ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＮｉｏＬａｂｓ社）を同時形質転換することにより、Ｃａｓ９抑制アッセイを行った。形質転換によって生じたコロニーをピックアップし、９６ウェルプレート中で連続振盪しながら３７℃で生育した。翌日、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いてプレートを読み取り、４９５〜５２８ｎｍの蛍光および６００ｎｍの吸光度を測定した。交換実験では、以前に公開されている２つの異なったスペーサー／プロトスペーサーの組合せ（ＡおよびＢ）（Esvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature methods 10, 1116-1121, doi:10.1038/nmeth.2681 (2013) 参照）を試験した。他の全ての実験では、スペーサー／プロトスペーサーの組合せＢのみを調べた。
抑制アッセイ
試験対象の適切なスペーサー／レポーターコンストラクトおよびＣａｓ９ベクターでＮＥＢ １０‐ｂｅｔａ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＮｉｏＬａｂｓ社）を同時形質転換することにより、Ｃａｓ９抑制アッセイを行った。形質転換によって生じたコロニーをピックアップし、９６ウェルプレート中で連続振盪しながら３７℃で生育した。翌日、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いてプレートを読み取り、４９５〜５２８ｎｍの蛍光および６００ｎｍの吸光度を測定した。交換実験では、以前に公開されている２つの異なったスペーサー／プロトスペーサーの組合せ（ＡおよびＢ）（Esvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature methods 10, 1116-1121, doi:10.1038/nmeth.2681 (2013) 参照）を試験した。他の全ての実験では、スペーサー／プロトスペーサーの組合せＢのみを調べた。
実施例ＶＩＩＩ
細胞培養およびトランスフェクション
１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した、高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中でＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を維持した。加湿インキュベーター中に細胞を３７℃、５％ＣＯ２で維持した。１ウェル当たり５０，０００細胞を播種した２４ウェルプレート中で細胞に遺伝子導入した。２．５μｌのリポフェクタミン２０００を用いて、４００ｎｇのＣａｓ９活性化因子、１００ｎｇのｇＲＮＡ、および６０ｎｇのレポータープラスミドを各ウェルに送達した。細胞をさらに３６〜４８時間生育した後、免疫蛍光またはＦＡＣＳを用いてアッセイした。
細胞培養およびトランスフェクション
１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した、高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中でＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を維持した。加湿インキュベーター中に細胞を３７℃、５％ＣＯ２で維持した。１ウェル当たり５０，０００細胞を播種した２４ウェルプレート中で細胞に遺伝子導入した。２．５μｌのリポフェクタミン２０００を用いて、４００ｎｇのＣａｓ９活性化因子、１００ｎｇのｇＲＮＡ、および６０ｎｇのレポータープラスミドを各ウェルに送達した。細胞をさらに３６〜４８時間生育した後、免疫蛍光またはＦＡＣＳを用いてアッセイした。
実施例ＩＸ
多重配列アラインメントおよびエッジフィルタ
ＭＵＳＣＬＥでＰＦＡＭデータベースのＣａｓ９配列（ＰＦ１３３９５、７９８個の配列）をリアライメントし、ＭＡＴＬＡＢスクリプトを用いて多様性および全長配列についてアラインメントを調整することにより多重配列アラインメントを作成した。以下に更に具体的に説明するこの方法により、２１７個の配列が得られた。
多重配列アラインメントおよびエッジフィルタ
ＭＵＳＣＬＥでＰＦＡＭデータベースのＣａｓ９配列（ＰＦ１３３９５、７９８個の配列）をリアライメントし、ＭＡＴＬＡＢスクリプトを用いて多様性および全長配列についてアラインメントを調整することにより多重配列アラインメントを作成した。以下に更に具体的に説明するこの方法により、２１７個の配列が得られた。
ＰＦＡＭデータベース中のＣａｓ９配列（ＰＦ１３３９５、７９８個の配列）の最終的なリアラインメントを得るために、以下のステップ（プログラムコードは全てＭＡＴＬＡＢ）を行った。Fonfara I, et al., (2014) Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems, Nucleic Acids Res. 42, 2577-90からのアラインメントを得、グループＩＩＡおよびＩＩＣからの配列のみを含め、後者からは、ＩＩＡとＩＩＣを分離する分岐までの配列のみ（図２（図２−１〜図２−４）中で赤色の四角で印付けられている）の合計４９個の配列を含めた。
次に、配列を２つのグループ、すなわち１５０位付近に大きな挿入を有するグループおよび有さないグループに分けた（これは、例えば一方でＮＭ‐Ｃａｓ９とＳＴ‐Ｃａｓ９を区別し、他方でＳＰ‐Ｃａｓ９とＴＤ‐Ｃａｓ９を区別する）。ＭＵＳＣＬＥ（Edgar, RC (2004) MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput, Nucleic Acids Res 32, 1792-97参照）を用いてこれらのグループを別個にアライメントし、（配列の長さのため）ウィンドウアプローチ（windowed approach）を用いてリアライメントした後、１つのシードアラインメントへとプロファイル間アライメントを行った。
ＰＦ１３３９５中の配列を、ＭＵＳＣＬＥでシードアラインメントを用いてリアライメントした。シードを用いた全てのアラインメントは、各標的配列を１つずつシードに対してアライメントすることにより行われる。このアラインメントを用いて、シードと標的配列の間でトップヒット同一性を決定し、トップヒット同一性の降順に再度整理する。次に、今度は同一性の降順に、標的配列をシードに対して１つずつリアライメントする。この２ステップのアプローチをとることでアラインメントのロバスト性を確保する。さらに、これらの配列を、挿入を含むか否かによって分け、２つの別個のグループをプロファイルとしてシードとリアライメントする。短い配列および大きな短縮を有する配列を手動で除く。９０％を超えるペアワイズ類似性を有する配列を除く。
得られた２つのアラインメントをプロファイル間で互いにアライメントし、合計２１７個の配列を得た。得られたアラインメントを、目的のＣａｓ９オルソログの位置まで短縮する。
大腸菌Ｏ１５７の全遺伝子の平均アミノ酸バックグラウンド頻度に対する相対エントロピーとして配列保存度を計算した。得られた保存プロファイルにガウス差分（ＤｏＧ）エッジフィルタ（その全体が参照により援用されるMarr, D. & Hildreth, E. Theory of edge detection. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society 207, 187-217 (1980) 参照）を適用し、パラメータ選択に対するロバスト性を実現するために複数の長さスケールで平均化し、種々の長さスケールで検出することにより、ドメイン境界検出を行った。
具体的には、アラインメントの保存度を、大腸菌Ｏ１５７の全遺伝子の平均頻度に対するアミノ酸頻度の相対エントロピーとして計算した（Cover, TM and Thomas, JT (2006) Elements of Information Theory; 2nd edition, Wiley-Interscience参照）。
式中、ｐｉ ａは、位置ｉにおけるアミノ酸ａの頻度であり、ｑａは、アミノ酸ａの平均頻度である。２０アミノ酸の全体の総和である。ｌｏｇの底は２であり、エントロピーはビットで与えられる。平均頻度ｑａは以下の通りである。
｛Ａ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ Ｉ Ｋ Ｌ Ｍ Ｎ Ｐ Ｑ Ｒ Ｓ Ｔ Ｖ Ｗ Ｙ｝＝０．０９４ ０．０１２ ０．０５２ ０．０５８ ０．０３８ ０．０７３ ０．０２２ ０．０５９ ０．０４５ ０．１０４ ０．０２７ ０．０４１ ０．０４４ ０．０４４ ０．０５７ ０．０６０ ０．０５５ ０．０７０ ０．０１５ ０．０２９。ＮＭ‐Ｃａｓ９の位置まで短縮した後、Ｃａｓ９のアラインメントにより、図３の保存プロファイルが得られる。
｛Ａ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ Ｉ Ｋ Ｌ Ｍ Ｎ Ｐ Ｑ Ｒ Ｓ Ｔ Ｖ Ｗ Ｙ｝＝０．０９４ ０．０１２ ０．０５２ ０．０５８ ０．０３８ ０．０７３ ０．０２２ ０．０５９ ０．０４５ ０．１０４ ０．０２７ ０．０４１ ０．０４４ ０．０４４ ０．０５７ ０．０６０ ０．０５５ ０．０７０ ０．０１５ ０．０２９。ＮＭ‐Ｃａｓ９の位置まで短縮した後、Ｃａｓ９のアラインメントにより、図３の保存プロファイルが得られる。
保存プロファイルを、（ＩＩＡ型サブファミリーの、より大きなＣａｓ９タンパク質の一例である）ＳＰ‐Ｃａｓ９における位置までプロット短縮する。Ｎ末端のおよそＮＭ１４５（ＳＰ１７０）の位置まで、およびさらにＮＭ２００（ＳＰ４００）の位置の後に、同様な特徴が観察され、これは前述の大きな挿入である。図４を参照されたい。
マルチスケールエッジフィルタを保存プロファイルに適用することにより潜在的ドメイン境界を同定した。このフィルタにより、様々なスケールでガウス差分（ＤｏＧ）（その全体が参照により援用されるMarr, D and Hildreth, E (1980) Theory of Edge Detection, Proc R Soc Lond B Biol Sci 207, 187-217参照）が計算され、得られたグラフが総計される。この曲線の極値は、タンパク質中の低度保存領域と高度保存領域の境界であると解釈される。これらのドメインは、進化的分岐速度の差につながる潜在的に異なる機能的重要性のため、異なる保存レベルを示し得る。異なる保存度は、進化的時間軸にわたるドメイン挿入により生じたマルチドメインタンパク質の特徴であり得る。極値の値は、重要性の点から境界を順位付けるために用いられる。
ＮＭの位置に限定したＣａｓ９アラインメントでは、本明細書に記載の方法を用いて以下の境界または保存エッジまたはエッジアミノ酸が同定された。
実施例Ｘ
Ｃａｓ９ファミリーメンバーの計算解析
欠失に適していると考えられるマルチドメインＣａｓ９タンパク質内の領域を同定するために、バイオインフォマティクス的アプローチを用いてドメイン間の潜在的境界を同定した。よく精選されたシードアラインメントを用いて、前述したように、ＰＦＡＭから得た全長Ｃａｓ９配列（ＰＦ１３３９５）を再度アライメントし、高いペアワイズ同一性を有する配列を除去した。大腸菌の全遺伝子の平均頻度に対する観察されたアミノ酸頻度の相対エントロピー（Cover, T. M., Thomas, J.T. Elements of Information Theory, 2nd edition. (Wiley-Interscience, 2006) 参照）として一次配列保存度を計算した。マルチドメインタンパク質中のドメインは様々なレベルの配列保存度を示すと予想できるので、ドメイン境界の位置を同定するためには、保存プロファイルにマルチスケールエッジフィルタを適用することが好適であると考えられる。
Ｃａｓ９ファミリーメンバーの計算解析
欠失に適していると考えられるマルチドメインＣａｓ９タンパク質内の領域を同定するために、バイオインフォマティクス的アプローチを用いてドメイン間の潜在的境界を同定した。よく精選されたシードアラインメントを用いて、前述したように、ＰＦＡＭから得た全長Ｃａｓ９配列（ＰＦ１３３９５）を再度アライメントし、高いペアワイズ同一性を有する配列を除去した。大腸菌の全遺伝子の平均頻度に対する観察されたアミノ酸頻度の相対エントロピー（Cover, T. M., Thomas, J.T. Elements of Information Theory, 2nd edition. (Wiley-Interscience, 2006) 参照）として一次配列保存度を計算した。マルチドメインタンパク質中のドメインは様々なレベルの配列保存度を示すと予想できるので、ドメイン境界の位置を同定するためには、保存プロファイルにマルチスケールエッジフィルタを適用することが好適であると考えられる。
狭い範囲の空間周波数（spatial frequency）に対して感受性があるガウス差分（ＤｏＧ）バンドパスフィルタを用いて保存プロファイルについてエッジ検出を行った。Marr, D. & Hildreth, E. Theory of edge detection. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society 207, 187-217 (1980) を参照されたい。種々の長さスケールでの検出を可能にするため、および特定のパラメータ選択に対してフィルタを非感受性にするため、複数のスケール（５〜５０アミノ酸）にわたる平均化を行った。次に、Ｃａｓ９アラインメントの保存プロファイルにバンドパスフィルタを適用した。ＮＭ‐Ｃａｓ９についての同定された潜在的境界位置を図５Ａに示す。上位６つの境界を赤色の長い太線で示す。図に示すように、それぞれの全体が参照により援用されるSapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282, doi:10.1093/nar/gkr606 (2011)およびFonfara, I. et al. Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research 42, 2577-2590, doi:10.1093/nar/gkt1074 (2014) において以前に帰属された５００位の上流から始まり７５０位まで及ぶ既知のＨＮＨおよびＲｕｖＣドメインの配置をフィルタは正確に同定している（図５Ｂ参照）。５６０位周辺および６２０位周辺のドメイン間境界も正確に予想されている。８８位の第１のアルギニンリッチαヘリックスの境界も予想されている。１４４位にある、タンパク質のＮ末端側の上位の境界の１つは、過去にFonfara, I. et al. Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research 42, 2577-2590, doi:10.1093/nar/gkt1074 (2014) においてドメイン境界として同定されていないが、アルギニン（Arg）リッチαヘリックス領域をより詳細に描写しており、今回、第２の保存されたアルギニンリッチヘリックスを含んでいた。
実施例ＸＩ
Ｃａｓ９の短縮体および欠失解析
Ｃａｓ９内の機能的ドメインおよび潜在的非機能的ドメインを実験的に探索するために、Ｎ末端およびＣ末端の短縮体、並びに、本明細書に記載のドメイン検出解析に基づく中程度の一連の内部欠失体を作製した。機能的ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質がＹＦＰレポーターの５′末端に結合し、それによりレポーターの発現レベルが低下する、大腸菌における転写抑制因子アッセイを用いて欠失の影響を解析した（図６Ａ参照）。それぞれの全体が参照により援用されるQi, L. S. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 152, 1173-1183, doi:10.1016/j.cell.2013.02.022 (2013); Esvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature methods 10, 1116-1121, doi:10.1038/nmeth.2681 (2013); およびBikard, D. et al. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic acids research 41, 7429-7437, doi:10.1093/nar/gkt520 (2013) を参照されたい。Ｎ末端またはＣ末端の短縮体はいずれもレポーターを抑制できなかったが、２８８位の境界の下流および上流の２つの内部欠失体であるＮＭΔ２５５‐２８９およびＮＭΔ３３０‐３８９、ならびにＮＭΔ５６６‐６２０欠失体は野生型レベルに近い抑制を示した（図６Ｂおよび図７）。欠失を反復的に拡大した複数回の解析をさらに行い、レポーターを抑制する能力をアッセイした（図６Ｂ）。ＮＭ活性をほとんど低下させずに除去可能であった２つの大きな非重複領域２５４‐４４９および５６７‐６５４（それぞれ、タンパク質の全長の１８％および８％を構成する）が同定された（図６Ｃ）。アラインメントに示されるように、ＮＭの２５４‐４４９位は、Ｃａｓ９タンパク質に特異的なタンパク質領域内において、比較的低度保存された区間である。５６７から６５４位はＨＮＨドメインであり、これはＣａｓ９のＤＮＡ触媒に重要であることが知られているが、ＤＮＡ結合については不必要であることが分かっているドメインである。
Ｃａｓ９の短縮体および欠失解析
Ｃａｓ９内の機能的ドメインおよび潜在的非機能的ドメインを実験的に探索するために、Ｎ末端およびＣ末端の短縮体、並びに、本明細書に記載のドメイン検出解析に基づく中程度の一連の内部欠失体を作製した。機能的ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質がＹＦＰレポーターの５′末端に結合し、それによりレポーターの発現レベルが低下する、大腸菌における転写抑制因子アッセイを用いて欠失の影響を解析した（図６Ａ参照）。それぞれの全体が参照により援用されるQi, L. S. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 152, 1173-1183, doi:10.1016/j.cell.2013.02.022 (2013); Esvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature methods 10, 1116-1121, doi:10.1038/nmeth.2681 (2013); およびBikard, D. et al. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic acids research 41, 7429-7437, doi:10.1093/nar/gkt520 (2013) を参照されたい。Ｎ末端またはＣ末端の短縮体はいずれもレポーターを抑制できなかったが、２８８位の境界の下流および上流の２つの内部欠失体であるＮＭΔ２５５‐２８９およびＮＭΔ３３０‐３８９、ならびにＮＭΔ５６６‐６２０欠失体は野生型レベルに近い抑制を示した（図６Ｂおよび図７）。欠失を反復的に拡大した複数回の解析をさらに行い、レポーターを抑制する能力をアッセイした（図６Ｂ）。ＮＭ活性をほとんど低下させずに除去可能であった２つの大きな非重複領域２５４‐４４９および５６７‐６５４（それぞれ、タンパク質の全長の１８％および８％を構成する）が同定された（図６Ｃ）。アラインメントに示されるように、ＮＭの２５４‐４４９位は、Ｃａｓ９タンパク質に特異的なタンパク質領域内において、比較的低度保存された区間である。５６７から６５４位はＨＮＨドメインであり、これはＣａｓ９のＤＮＡ触媒に重要であることが知られているが、ＤＮＡ結合については不必要であることが分かっているドメインである。
ＮＭ‐Ｃａｓ９から除去された領域がＮＭに固有でなく、他のＣａｓ９ファミリーメンバーから除去可能な一般的領域であることを実証するために、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）のＣａｓ９（ＳＴ１）およびトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）のＣａｓ９（ＴＤ、ＧＩ：４２５２５８４３）のヌクレアーゼ欠損バリアント内で対応する欠失体を作製し、転写抑制アッセイを用いてこれらの機能を測定した（図８Ａおよび図９）。ＳＴ１およびＴＤの両方における対応する欠失変異体がそれらの対応する野生型と同様な活性を示したことから、除去された領域が、Ｃａｓ９系統樹全体において、さらにＴＤなどのタイプＩＩ‐Ａサブファミリー内のより離れたメンバー間においても、Ｃａｓ９のＤＮＡ結合に不必要であることが示唆される。
本明細書に記載の２つの最も大きい機能的欠失体の活性を、転写活性化因子アッセイを用いてＳＴ１‐Ｃａｓ９内で試験した（図８Ｂ）。大腸菌内での解析と一致して、ＶＰ６４活性化ドメインに融合させてヒト細胞において蛍光レポーターを標的化した場合に、両方のＳＴ１欠失変異体が野生型タンパク質に匹敵する活性を保持していた（図８Ｃ〜図８Ｄ）。２つの欠失変異体の大きい方であるΔ２５５‐４５０（ＳＴ１のナンバリング）は、サイズが２，７９３塩基対であるＣａｓ９遺伝子を生じる。
実施例ＸＩＩ
Ｃａｓ９ドメイン交換
Ｃａｓ９のＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインは、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ結合および／またはＰＡＭ選択性に重要な役割を果たし得る。活性を解析するために、ＮＭのＮ末端および／またはＣ末端をＳＴ１の相同な領域と置換した、ＮＭとＳＴ１との間の一連のドメイン交換変異体を作製した。次に、レポーター内のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓ９特異的ＰＡＭを変更して、本明細書に記載の転写レポーターアッセイを用いてキメラタンパク質を試験して、タンパク質特異性に対するドメイン交換の影響を決定した（図１０Ａ）。ドメイン交換の正確な位置はドメイン境界解析に基づいて決定された。すなわち、同定された最も有意なＮ末端境界およびＣ末端境界（図５Ａ）にできるだけ近い位置であると同時にアラインメント内でほぼ完全に保存されている位置を選択した（図１０Ｂ）。ＮＭとＳＴ１との間のＮ末端ドメイン交換体はいずれもＮＭに新規な特性を付与しなかったことから、ＳＴ１のＮ末端はモジュール式ではなく、導入されなかったＳＴ１の他の領域と関連して機能することが示唆される（図１０Ｃ〜１０Ｆ）。Ｃ末端交換により、ＳＴ１のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体と相互作用可能であり、さらにＳＴ１特異的ＰＡＭを有するレポーターを抑制可能である、ＮＭ‐ＳＴ１ハイブリッドが作製された（図１０Ｅ）。この結果は、図１１（Ａ）〜１１（Ｄ）に示されているように、他のＳＴ１特異的レポーターを用いてさらに検証された。
Ｃａｓ９ドメイン交換
Ｃａｓ９のＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインは、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ結合および／またはＰＡＭ選択性に重要な役割を果たし得る。活性を解析するために、ＮＭのＮ末端および／またはＣ末端をＳＴ１の相同な領域と置換した、ＮＭとＳＴ１との間の一連のドメイン交換変異体を作製した。次に、レポーター内のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓ９特異的ＰＡＭを変更して、本明細書に記載の転写レポーターアッセイを用いてキメラタンパク質を試験して、タンパク質特異性に対するドメイン交換の影響を決定した（図１０Ａ）。ドメイン交換の正確な位置はドメイン境界解析に基づいて決定された。すなわち、同定された最も有意なＮ末端境界およびＣ末端境界（図５Ａ）にできるだけ近い位置であると同時にアラインメント内でほぼ完全に保存されている位置を選択した（図１０Ｂ）。ＮＭとＳＴ１との間のＮ末端ドメイン交換体はいずれもＮＭに新規な特性を付与しなかったことから、ＳＴ１のＮ末端はモジュール式ではなく、導入されなかったＳＴ１の他の領域と関連して機能することが示唆される（図１０Ｃ〜１０Ｆ）。Ｃ末端交換により、ＳＴ１のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体と相互作用可能であり、さらにＳＴ１特異的ＰＡＭを有するレポーターを抑制可能である、ＮＭ‐ＳＴ１ハイブリッドが作製された（図１０Ｅ）。この結果は、図１１（Ａ）〜１１（Ｄ）に示されているように、他のＳＴ１特異的レポーターを用いてさらに検証された。
実施例ＸＩＩ
Ｃａｓ９ドメイン交換
Ｃａｓ９のＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインは、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ結合および／またはＰＡＭ選択性に重要な役割を果たし得る。活性を解析するために、ＮＭのＮ末端および／またはＣ末端をＳＴ１の相同な領域と置換した、ＮＭとＳＴ１との間の一連のドメイン交換変異体を作製した。次に、レポーター内のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓ９特異的ＰＡＭを変更して、本明細書に記載の転写レポーターアッセイを用いてキメラタンパク質を試験して、タンパク質特異性に対するドメイン交換の影響を決定した（図１０Ａ）。ドメイン交換の正確な位置はドメイン境界解析に基づいて決定された。すなわち、同定された最も有意なＮ末端境界およびＣ末端境界（図５Ａ）にできるだけ近い位置であると同時にアラインメント内でほぼ完全に保存されている位置を選択した（図１０Ｂ）。ＮＭとＳＴ１との間のＮ末端ドメイン交換体はいずれもＮＭに新規な特性を付与しなかったことから、ＳＴ１のＮ末端はモジュール式ではなく、導入されなかったＳＴ１の他の領域と関連して機能することが示唆される（図１０Ｃ〜１０Ｆ）。Ｃ末端交換により、ＳＴ１のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体と相互作用可能であり、さらにＳＴ１特異的ＰＡＭを有するレポーターを抑制可能である、ＮＭ‐ＳＴ１ハイブリッドが作製された（図１０Ｅ）。この結果は、図１１（Ａ）〜１１（Ｄ）に示されているように、他のＳＴ１特異的レポーターを用いてさらに検証された。
本発明の態様は以下を含む。
付記１
ＤＮＡ結合タンパク質のファミリー内で、低度保存された２つの隣接アミノ酸配列と隣接する高度保存されたアミノ酸配列であるか、または高度保存された２つの隣接アミノ酸配列と隣接する低度保存されたアミノ酸配列である、第１のアミノ酸配列を同定すること、
前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を同定すること、
前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を欠いた、標的ＤＮＡ結合タンパク質のための核酸配列を作製すること、および
前記作製された核酸配列から変異ＤＮＡ結合タンパク質を作製すること
を含む、変異ＤＮＡ結合タンパク質を作製する方法。
付記２
前記標的ＤＮＡ結合タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する、付記１に記載の方法。
付記３
前記標的ＤＮＡ結合タンパク質がニッカーゼである、付記１に記載の方法。
付記４
前記標的ＤＮＡ結合タンパク質がヌクレアーゼ欠損である、付記１に記載の方法。
付記５
前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的ＤＮＡ結合タンパク質のための核酸配列から欠失させる、付記１に記載の方法。
付記６
前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的ＤＮＡ結合タンパク質のための核酸配列から欠失させてリンカーで置換する、付記１に記載の方法。
付記７
前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的ＤＮＡ結合タンパク質のための核酸配列から欠失させてＳＧＧＧＳリンカーで置換する、付記１に記載の方法。
付記８
前記ＤＮＡ結合タンパク質がＣａｓ９タンパク質である、付記１に記載の方法。
付記９
前記第１のアミノ酸配列が、前記第１のアミノ酸配列を隣接アミノ酸配列から区別する一対のエッジアミノ酸配列を有する、付記１に記載の方法。
付記１０
配列番号１の変異Ｃａｓ９タンパク質。
付記１１
配列番号２の変異Ｃａｓ９タンパク質。
付記１２
高度には保存されていないか、または低度保存されたＣａｓ９タンパク質のファミリー内の１または複数のアミノ酸配列を同定すること、
前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を同定すること、
前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を欠いた、標的Ｃａｓ９タンパク質のための核酸配列を作製すること、および
前記作製された核酸配列から変異Ｃａｓ９タンパク質を作製すること
を含む、変異Ｃａｓ９タンパク質を作製する方法。
付記１３
前記標的Ｃａｓ９タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する、付記１２に記載の方法。
付記１４
前記標的Ｃａｓ９タンパク質がニッカーゼである、付記１２に記載の方法。
付記１５
前記標的Ｃａｓ９タンパク質がヌクレアーゼ欠損である、付記１２に記載の方法。
付記１６
前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的Ｃａｓ９タンパク質のための核酸配列から欠失させる、付記１２に記載の方法。
付記１７
前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的Ｃａｓ９タンパク質のための核酸配列から欠失させてリンカーで置換する、付記１２に記載の方法。
付記１８
前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的Ｃａｓ９タンパク質のための核酸配列から欠失させてＳＧＧＧＳリンカーで置換する、付記１２に記載の方法。
付記１９
第１のＣａｓ９タンパク質種のＣ末端ドメインを第２のＣａｓ９タンパク質種のＣ末端ドメインで置換すること
を含む、変異Ｃａｓ９タンパク質を作製する方法。
付記２０
前記第１のＣａｓ９タンパク質種がＮＭ‐Ｃａｓ９であり、前記第２のＣａｓ９タンパク質種がＳＴ１‐Ｃａｓ９である、付記１９に記載の方法。
付記２１
第１のＣａｓ９タンパク質種のＮ末端ドメインを第２のＣａｓ９タンパク質種のＮ末端ドメインで置換すること
を含む、キメラＣａｓ９タンパク質を作製する方法。
付記２２
前記第１のＣａｓ９タンパク質種がＮＭ‐Ｃａｓ９であり、前記第２のＣａｓ９タンパク質種がＳＴ１‐Ｃａｓ９である、付記２１に記載の方法。
Ｃａｓ９ドメイン交換
Ｃａｓ９のＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインは、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ結合および／またはＰＡＭ選択性に重要な役割を果たし得る。活性を解析するために、ＮＭのＮ末端および／またはＣ末端をＳＴ１の相同な領域と置換した、ＮＭとＳＴ１との間の一連のドメイン交換変異体を作製した。次に、レポーター内のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓ９特異的ＰＡＭを変更して、本明細書に記載の転写レポーターアッセイを用いてキメラタンパク質を試験して、タンパク質特異性に対するドメイン交換の影響を決定した（図１０Ａ）。ドメイン交換の正確な位置はドメイン境界解析に基づいて決定された。すなわち、同定された最も有意なＮ末端境界およびＣ末端境界（図５Ａ）にできるだけ近い位置であると同時にアラインメント内でほぼ完全に保存されている位置を選択した（図１０Ｂ）。ＮＭとＳＴ１との間のＮ末端ドメイン交換体はいずれもＮＭに新規な特性を付与しなかったことから、ＳＴ１のＮ末端はモジュール式ではなく、導入されなかったＳＴ１の他の領域と関連して機能することが示唆される（図１０Ｃ〜１０Ｆ）。Ｃ末端交換により、ＳＴ１のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体と相互作用可能であり、さらにＳＴ１特異的ＰＡＭを有するレポーターを抑制可能である、ＮＭ‐ＳＴ１ハイブリッドが作製された（図１０Ｅ）。この結果は、図１１（Ａ）〜１１（Ｄ）に示されているように、他のＳＴ１特異的レポーターを用いてさらに検証された。
本発明の態様は以下を含む。
付記１
ＤＮＡ結合タンパク質のファミリー内で、低度保存された２つの隣接アミノ酸配列と隣接する高度保存されたアミノ酸配列であるか、または高度保存された２つの隣接アミノ酸配列と隣接する低度保存されたアミノ酸配列である、第１のアミノ酸配列を同定すること、
前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を同定すること、
前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を欠いた、標的ＤＮＡ結合タンパク質のための核酸配列を作製すること、および
前記作製された核酸配列から変異ＤＮＡ結合タンパク質を作製すること
を含む、変異ＤＮＡ結合タンパク質を作製する方法。
付記２
前記標的ＤＮＡ結合タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する、付記１に記載の方法。
付記３
前記標的ＤＮＡ結合タンパク質がニッカーゼである、付記１に記載の方法。
付記４
前記標的ＤＮＡ結合タンパク質がヌクレアーゼ欠損である、付記１に記載の方法。
付記５
前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的ＤＮＡ結合タンパク質のための核酸配列から欠失させる、付記１に記載の方法。
付記６
前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的ＤＮＡ結合タンパク質のための核酸配列から欠失させてリンカーで置換する、付記１に記載の方法。
付記７
前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的ＤＮＡ結合タンパク質のための核酸配列から欠失させてＳＧＧＧＳリンカーで置換する、付記１に記載の方法。
付記８
前記ＤＮＡ結合タンパク質がＣａｓ９タンパク質である、付記１に記載の方法。
付記９
前記第１のアミノ酸配列が、前記第１のアミノ酸配列を隣接アミノ酸配列から区別する一対のエッジアミノ酸配列を有する、付記１に記載の方法。
付記１０
配列番号１の変異Ｃａｓ９タンパク質。
付記１１
配列番号２の変異Ｃａｓ９タンパク質。
付記１２
高度には保存されていないか、または低度保存されたＣａｓ９タンパク質のファミリー内の１または複数のアミノ酸配列を同定すること、
前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を同定すること、
前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を欠いた、標的Ｃａｓ９タンパク質のための核酸配列を作製すること、および
前記作製された核酸配列から変異Ｃａｓ９タンパク質を作製すること
を含む、変異Ｃａｓ９タンパク質を作製する方法。
付記１３
前記標的Ｃａｓ９タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する、付記１２に記載の方法。
付記１４
前記標的Ｃａｓ９タンパク質がニッカーゼである、付記１２に記載の方法。
付記１５
前記標的Ｃａｓ９タンパク質がヌクレアーゼ欠損である、付記１２に記載の方法。
付記１６
前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的Ｃａｓ９タンパク質のための核酸配列から欠失させる、付記１２に記載の方法。
付記１７
前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的Ｃａｓ９タンパク質のための核酸配列から欠失させてリンカーで置換する、付記１２に記載の方法。
付記１８
前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的Ｃａｓ９タンパク質のための核酸配列から欠失させてＳＧＧＧＳリンカーで置換する、付記１２に記載の方法。
付記１９
第１のＣａｓ９タンパク質種のＣ末端ドメインを第２のＣａｓ９タンパク質種のＣ末端ドメインで置換すること
を含む、変異Ｃａｓ９タンパク質を作製する方法。
付記２０
前記第１のＣａｓ９タンパク質種がＮＭ‐Ｃａｓ９であり、前記第２のＣａｓ９タンパク質種がＳＴ１‐Ｃａｓ９である、付記１９に記載の方法。
付記２１
第１のＣａｓ９タンパク質種のＮ末端ドメインを第２のＣａｓ９タンパク質種のＮ末端ドメインで置換すること
を含む、キメラＣａｓ９タンパク質を作製する方法。
付記２２
前記第１のＣａｓ９タンパク質種がＮＭ‐Ｃａｓ９であり、前記第２のＣａｓ９タンパク質種がＳＴ１‐Ｃａｓ９である、付記２１に記載の方法。
Claims (22)
- ＤＮＡ結合タンパク質のファミリー内で、低度保存された２つの隣接アミノ酸配列と隣接する高度保存されたアミノ酸配列であるか、または高度保存された２つの隣接アミノ酸配列と隣接する低度保存されたアミノ酸配列である、第１のアミノ酸配列を同定すること、
前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を同定すること、
前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を欠いた、標的ＤＮＡ結合タンパク質のための核酸配列を作製すること、および
前記作製された核酸配列から変異ＤＮＡ結合タンパク質を作製すること
を含む、変異ＤＮＡ結合タンパク質を作製する方法。 - 前記標的ＤＮＡ結合タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡ結合タンパク質がニッカーゼである、請求項１に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡ結合タンパク質がヌクレアーゼ欠損である、請求項１に記載の方法。
- 前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的ＤＮＡ結合タンパク質のための核酸配列から欠失させる、請求項１に記載の方法。
- 前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的ＤＮＡ結合タンパク質のための核酸配列から欠失させてリンカーで置換する、請求項１に記載の方法。
- 前記第１のアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的ＤＮＡ結合タンパク質のための核酸配列から欠失させてＳＧＧＧＳリンカーで置換する、請求項１に記載の方法。
- 前記ＤＮＡ結合タンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１に記載の方法。
- 前記第１のアミノ酸配列が、前記第１のアミノ酸配列を隣接アミノ酸配列から区別する一対のエッジアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
- 配列番号１の変異Ｃａｓ９タンパク質。
- 配列番号２の変異Ｃａｓ９タンパク質。
- 高度には保存されていないか、または低度保存されたＣａｓ９タンパク質のファミリー内の１または複数のアミノ酸配列を同定すること、
前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を同定すること、
前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を欠いた、標的Ｃａｓ９タンパク質のための核酸配列を作製すること、および
前記作製された核酸配列から変異Ｃａｓ９タンパク質を作製すること
を含む、変異Ｃａｓ９タンパク質を作製する方法。 - 前記標的Ｃａｓ９タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する、請求項１２に記載の方法。
- 前記標的Ｃａｓ９タンパク質がニッカーゼである、請求項１２に記載の方法。
- 前記標的Ｃａｓ９タンパク質がヌクレアーゼ欠損である、請求項１２に記載の方法。
- 前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的Ｃａｓ９タンパク質のための核酸配列から欠失させる、請求項１２に記載の方法。
- 前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的Ｃａｓ９タンパク質のための核酸配列から欠失させてリンカーで置換する、請求項１２に記載の方法。
- 前記１または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的Ｃａｓ９タンパク質のための核酸配列から欠失させてＳＧＧＧＳリンカーで置換する、請求項１２に記載の方法。
- 第１のＣａｓ９タンパク質種のＣ末端ドメインを第２のＣａｓ９タンパク質種のＣ末端ドメインで置換すること
を含む、変異Ｃａｓ９タンパク質を作製する方法。 - 前記第１のＣａｓ９タンパク質種がＮＭ‐Ｃａｓ９であり、前記第２のＣａｓ９タンパク質種がＳＴ１‐Ｃａｓ９である、請求項１９に記載の方法。
- 第１のＣａｓ９タンパク質種のＮ末端ドメインを第２のＣａｓ９タンパク質種のＮ末端ドメインで置換すること
を含む、キメラＣａｓ９タンパク質を作製する方法。 - 前記第１のＣａｓ９タンパク質種がＮＭ‐Ｃａｓ９であり、前記第２のＣａｓ９タンパク質種がＳＴ１‐Ｃａｓ９である、請求項２１に記載の方法。
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| EP3004339B1 (en) * | 2013-05-29 | 2021-07-07 | Cellectis | New compact scaffold of cas9 in the type ii crispr system |
| US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
| US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US9340799B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | MRNA-sensing switchable gRNAs |
| US9834791B2 (en) | 2013-11-07 | 2017-12-05 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS |
| US9074199B1 (en) * | 2013-11-19 | 2015-07-07 | President And Fellows Of Harvard College | Mutant Cas9 proteins |
| US9840699B2 (en) | 2013-12-12 | 2017-12-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for nucleic acid editing |
| CA3075047C (en) | 2014-02-11 | 2022-02-01 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Crispr enable method for multiplex genome editing |
| WO2015134812A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa |
| US11339437B2 (en) | 2014-03-10 | 2022-05-24 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating CEP290-associated disease |
| US9938521B2 (en) | 2014-03-10 | 2018-04-10 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (LCA10) |
| US11141493B2 (en) | 2014-03-10 | 2021-10-12 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating CEP290-associated disease |
| EP3981876A1 (en) | 2014-03-26 | 2022-04-13 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease |
| CA2956224A1 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| CA2965509C (en) | 2014-10-24 | 2023-03-14 | Avectas Limited | Delivery across cell plasma membranes |
| US11680268B2 (en) | 2014-11-07 | 2023-06-20 | Editas Medicine, Inc. | Methods for improving CRISPR/Cas-mediated genome-editing |
| EP4400584A3 (en) | 2014-12-03 | 2024-10-16 | Agilent Technologies, Inc. | Guide rna with chemical modifications |
| KR20240038141A (ko) | 2015-04-06 | 2024-03-22 | 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 | Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna |
| CN107690480B (zh) | 2015-04-24 | 2022-03-22 | 爱迪塔斯医药公司 | Cas9分子/指导rna分子复合物的评价 |
| WO2016182959A1 (en) | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Editas Medicine, Inc. | Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells |
| EP3303634B1 (en) * | 2015-06-03 | 2023-08-30 | The Regents of The University of California | Cas9 variants and methods of use thereof |
| CN108026526B (zh) | 2015-06-09 | 2023-05-12 | 爱迪塔斯医药公司 | 用于改善移植的crispr/cas相关方法和组合物 |
| CA2990699A1 (en) | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof |
| US9926546B2 (en) | 2015-08-28 | 2018-03-27 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| US9512446B1 (en) | 2015-08-28 | 2016-12-06 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| EP3353296B1 (en) | 2015-09-24 | 2020-11-04 | Editas Medicine, Inc. | Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing |
| US10167457B2 (en) | 2015-10-23 | 2019-01-01 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| JP2019500899A (ja) | 2015-11-23 | 2019-01-17 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の核送達を通じた細胞ＲＮＡの追跡と操作 |
| WO2017115128A2 (en) | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Avectas Limited | Vector-free delivery of gene editing proteins and compositions to cells and tissues |
| CN108473986A (zh) * | 2016-01-08 | 2018-08-31 | 诺维信公司 | 芽孢杆菌宿主细胞的基因组编辑 |
| US11512311B2 (en) | 2016-03-25 | 2022-11-29 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency |
| WO2017165826A1 (en) | 2016-03-25 | 2017-09-28 | Editas Medicine, Inc. | Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use |
| GB2565461B (en) * | 2016-03-31 | 2022-04-13 | Harvard College | Methods and compositions for the single tube preparation of sequencing libraries using Cas9 |
| US11236313B2 (en) | 2016-04-13 | 2022-02-01 | Editas Medicine, Inc. | Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof |
| US10767175B2 (en) | 2016-06-08 | 2020-09-08 | Agilent Technologies, Inc. | High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs |
| DK3474669T3 (da) | 2016-06-24 | 2022-06-27 | Univ Colorado Regents | Fremgangsmåde til generering af stregkodede kombinatoriske biblioteker |
| BR112019001887A2 (pt) | 2016-08-02 | 2019-07-09 | Editas Medicine Inc | composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290 |
| SG11201900907YA (en) | 2016-08-03 | 2019-02-27 | Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| CN109804066A (zh) | 2016-08-09 | 2019-05-24 | 哈佛大学的校长及成员们 | 可编程cas9-重组酶融合蛋白及其用途 |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
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| WO2018074979A1 (en) * | 2016-10-17 | 2018-04-26 | Nanyang Technological University | Truncated crispr-cas proteins for dna targeting |
| US11229662B2 (en) | 2016-11-15 | 2022-01-25 | The Schepens Eye Research Institute, Inc. | Compositions and methods for the treatment of aberrant angiogenesis |
| US11981915B2 (en) | 2016-12-22 | 2024-05-14 | Avectas Limited | Vector-free intracellular delivery by reversible permeabilization |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| EP3565907B1 (en) | 2017-01-06 | 2022-05-04 | Editas Medicine, Inc. | Methods of assessing nuclease cleavage |
| WO2018165504A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| WO2018165629A1 (en) | 2017-03-10 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| WO2018170184A1 (en) | 2017-03-14 | 2018-09-20 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
| US11268082B2 (en) | 2017-03-23 | 2022-03-08 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins |
| US11499151B2 (en) | 2017-04-28 | 2022-11-15 | Editas Medicine, Inc. | Methods and systems for analyzing guide RNA molecules |
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| EP3622070A2 (en) | 2017-05-10 | 2020-03-18 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/rna-guided nuclease systems and methods |
| WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
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| EP3710008A4 (en) | 2017-11-14 | 2021-08-25 | The Schepens Eye Research Institute, Inc. | RUNX1 INHIBITION FOR THE TREATMENT OF PROLIFERATIVE VITREORETINOPATHY AND DISEASES ASSOCIATED WITH EPITHELIAL-MESENCHYMAL TRANSITION |
| AU2019207409B2 (en) | 2018-01-12 | 2023-02-23 | Basf Se | Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a |
| US20190233816A1 (en) | 2018-01-26 | 2019-08-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications |
| WO2019161290A1 (en) * | 2018-02-15 | 2019-08-22 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Engineered cas9 systems for eukaryotic genome modification |
| SG11202008956XA (en) | 2018-03-14 | 2020-10-29 | Editas Medicine Inc | Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
| US20210054353A1 (en) * | 2018-03-19 | 2021-02-25 | Crispr Therapeutics Ag | Novel rna-programmable endonuclease systems and uses thereof |
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| BR112021007672A2 (pt) * | 2018-10-24 | 2021-08-10 | Modalis Therapeutics Corporation | proteína cas9 modificada e uso da mesma |
| BR112021018607A2 (pt) | 2019-03-19 | 2021-11-23 | Massachusetts Inst Technology | Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos |
| CN110241099B (zh) * | 2019-06-05 | 2021-04-30 | 复旦大学 | 酿脓链球菌的CRISPR核酸酶SpCas9 的截短变异体及其应用 |
| EP3983536A4 (en) * | 2019-06-14 | 2023-11-29 | Arbor Biotechnologies, Inc. | NOVEL CRISPR DNA TARGETING ENZYMES AND SYSTEMS |
| US11060141B1 (en) | 2019-12-23 | 2021-07-13 | Stilla Technologies | Multiplex drop-off digital polymerase chain reaction methods |
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| WO2023039586A1 (en) | 2021-09-10 | 2023-03-16 | Agilent Technologies, Inc. | Guide rnas with chemical modification for prime editing |
| US20230183687A1 (en) * | 2021-10-13 | 2023-06-15 | University Of Massachusetts | Modified guide rnas for neisseria meningitidis cas9 |
| IL312452A (en) | 2021-11-01 | 2024-06-01 | Tome Biosciences Inc | A transformant has a single structure for the simultaneous transfer of a gene editing mechanism and a nucleic acid cargo |
| EP4452335A1 (en) | 2021-12-22 | 2024-10-30 | Tome Biosciences, Inc. | Co-delivery of a gene editor construct and a donor template |
| WO2023205744A1 (en) | 2022-04-20 | 2023-10-26 | Tome Biosciences, Inc. | Programmable gene insertion compositions |
| WO2023225670A2 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-23 | Tome Biosciences, Inc. | Ex vivo programmable gene insertion |
| WO2024020587A2 (en) | 2022-07-22 | 2024-01-25 | Tome Biosciences, Inc. | Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion |
| WO2024138194A1 (en) | 2022-12-22 | 2024-06-27 | Tome Biosciences, Inc. | Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013141680A1 (en) * | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Vilnius University | RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1341907A2 (en) * | 2000-12-14 | 2003-09-10 | Genencor International, Inc. | Target enzymes |
| ES2541693T3 (es) | 2007-03-02 | 2015-07-23 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Cultivos con resistencia mejorada a fagos |
| KR100952754B1 (ko) * | 2007-09-28 | 2010-04-14 | 동아대학교 산학협력단 | 토양 메타게놈에서 유래한 항생 활성을 암호화하는유전자군 |
| US8546553B2 (en) | 2008-07-25 | 2013-10-01 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Prokaryotic RNAi-like system and methods of use |
| US20100076057A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
| WO2010054108A2 (en) | 2008-11-06 | 2010-05-14 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Cas6 polypeptides and methods of use |
| US10087431B2 (en) | 2010-03-10 | 2018-10-02 | The Regents Of The University Of California | Methods of generating nucleic acid fragments |
| WO2011143124A2 (en) | 2010-05-10 | 2011-11-17 | The Regents Of The University Of California | Endoribonuclease compositions and methods of use thereof |
| US9089520B2 (en) | 2010-05-21 | 2015-07-28 | Baylor College Of Medicine | Methods for inducing selective apoptosis |
| US20140113376A1 (en) | 2011-06-01 | 2014-04-24 | Rotem Sorek | Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes |
| GB201122458D0 (en) | 2011-12-30 | 2012-02-08 | Univ Wageningen | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof |
| RU2650811C2 (ru) | 2012-02-24 | 2018-04-17 | Фред Хатчинсон Кэнсер Рисерч Сентер | Композиции и способы лечения гемоглобинопатии |
| US8841260B2 (en) | 2012-02-29 | 2014-09-23 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treating Huntington's Disease |
| US9637739B2 (en) | 2012-03-20 | 2017-05-02 | Vilnius University | RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex |
| CA2871524C (en) * | 2012-05-07 | 2021-07-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes |
| HUE038850T2 (hu) | 2012-05-25 | 2018-11-28 | Univ California | Eljárások és kompozíciók cél-DNS RNS-irányított módosításához és transzkripció RNS-irányított modulálásához |
| WO2014022702A2 (en) | 2012-08-03 | 2014-02-06 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| ES2786193T3 (es) | 2012-12-12 | 2020-10-09 | Broad Inst Inc | Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias |
| CN105980575A (zh) * | 2013-03-14 | 2016-09-28 | 卡里布生物科学公司 | 以核酸为靶的核酸的组合物和方法 |
| US9234213B2 (en) * | 2013-03-15 | 2016-01-12 | System Biosciences, Llc | Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems |
| US9074199B1 (en) * | 2013-11-19 | 2015-07-07 | President And Fellows Of Harvard College | Mutant Cas9 proteins |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NAT. BIOTECHNOL., 2013, 31(9), PP.833-838, PUBLISHED ONLINE 2013 AUG 1, JPN6018040442, ISSN: 0004954637 * |
| RNA BIOL., 2013, 10(5), PP.726-737, PUBLISHED ONLINE 2013 APR 5, JPN6018040436, ISSN: 0004954636 * |
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