JP7020635B2 - 変異cas9タンパク質 - Google Patents
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Description
本願は、2013年11月19日に提出された米国仮特許出願第61/906,374号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所助成番号第P50HG005550号の政府助成を受けてなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
Cas9変異体
Cas9をコードする遺伝子サイズが大きいという問題を克服するために、最も小さい特徴解析されているCas9ファミリーメンバーの1つであるNM‐Cas9(ナイセリア・メニンジティディスのCas9)内で種々の領域の標的化欠失を行う。NM‐Cas9のサイズは3,249bpである。ゲノム標的化のための必要条件およびヌクレアーゼ活性に関わる残基を決定する。よりサイズの小さいNM‐Cas9を作製するために、Cas9タンパク質のアラインメントを作製し、低度保存された隣接区間または保存エッジ間の区間を欠失のために同定した。複数の目的領域を同定し、NM‐Cas9から選択的に除去した後、Cas9抑制因子アッセイを用いて機能を評価した。アッセイでは、ヌクレアーゼ活性を欠いているがレポーター遺伝子の5′領域を標的化可能なNM‐Cas9変異体を用いた。NM‐Cas9は、レポーター遺伝子に結合できる場合は転写を抑制し、蛍光レポーターの場合、細胞が非蛍光性となる。
欠失のためのCas9ヌクレアーゼドメインの標的化
Cas9のニッカーゼ欠損アレルまたはヌクレアーゼ欠損アレルが望まれる場合、低度配列保存領域または配列保存エッジ間領域を標的化すると共に、Cas9ヌクレアーゼドメインを周囲のヌクレオチドと共に欠失のための標的としてもよい。このようなアプローチを用いて、HNHモチーフおよび周囲のヌクレオチドを欠いた機能的NM‐Cas9アレルであるNM‐Cas9‐Δ567‐654を作製した。このアレルは、YFPレポーターアッセイで測定されるように、野生型とほぼ同じDNA結合能を保持していた。
偏りのないNM‐Cas9欠失ライブラリーの構築方法
Cas9欠失体を作製するために標的アプローチに加えて、本開示の態様には、ランダム欠失生成および機能的変異体のスクリーニングのためのハイスループットアプローチが含まれる。例示的な方法によれば、無差別(promiscuous)ヌクレアーゼ、超音波処理、サンプルの反復ピペッティング、または他の化学的、酵素的、もしくは環境的手段を用いて、所望のCas9アレルを含むプラスミドDNAを剪断してもよい。断片化後、プラスミドDNAをエキソヌクレアーゼで処理して、Cas9遺伝子からヌクレオチドを除去してもよい。エキソヌクレアーゼ処理後、断片化末端をマングビーンヌクレアーゼまたはクレノーポリメラーゼなどの酵素で平滑末端化し、互いにライゲーションさせて、ランダム欠失を含むCas9プラスミドを再生する。Cas9の欠失部分内にリンカーまたはエフェクターモチーフなどの外来性ドメインを挿入するために、平滑末端化された断片DNAにそのようなドメインをライゲーションさせてもよく、次に、プラスミドの環状化により、Cas9の欠失部分内に外来性ドメインが挿入されたCas9コード配列が得られる。次に、環状化分子のライブラリーを大腸菌に形質転換し、プラスミドDNAを抽出する。
ベクター構築
Cas9ヌクレアーゼ欠損プラスミドは、ST1(Addgene#48659)であるか、またはNMプラスミドおよびTDプラスミド(それぞれ、Addgene#48646および48648)から、以下の点変異(NM:D16A D587A H588A N611A、およびTD:D13A D878A H879A N902A)を導入することにより構築した。ギブソン・アセンブリを用いてCas9欠失体を作製した。内部欠失体を作製する場合、連結断片間のリンカーを欠くNMΔ566‐620以外は、内部欠失体を5アミノ酸のSer‐Gly‐Gly‐Gly‐Serリンカーで連結した。N末端ドメイン交換により、ST1の残基1~117をNMの残基118~1082に融合させた。C末端ドメイン交換により、NMの残基1~727をST1の残基743~1121に融合させた。
細菌レポーターコンストラクト
欠失変異体の解析に用いるレポーターコンストラクトは、単一のSC101‐kanRプラスミド骨格中にスペーサーエレメントおよびYFPレポーターを併せ持つこと以外は、以前に発表されているものと同様である。ドメイン交換解析のためのレポーターコンストラクトは以前に使用されているものと同じである。その全体が参照により援用されるEsvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature methods 10, 1116-1121, doi:10.1038/nmeth.2681 (2013) を参照されたい。
哺乳動物レポーターコンストラクト
M‐ST1n‐VP64コンストラクト、ST1ガイドRNAプラスミド、およびST1特異的哺乳動物転写レポーターは、Esvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature methods 10, 1116-1121, doi:10.1038/nmeth.2681 (2013)において以前に発表されている(それぞれ、Addgene#48675、48672、および48678)。細菌のコンストラクトの場合と同様に欠失変異体を作製した。
抑制アッセイ
試験対象の適切なスペーサー/レポーターコンストラクトおよびCas9ベクターでNEB 10‐beta細胞(New England NioLabs社)を同時形質転換することにより、Cas9抑制アッセイを行った。形質転換によって生じたコロニーをピックアップし、96ウェルプレート中で連続振盪しながら37℃で生育した。翌日、Synergy Neoマイクロプレートリーダー(BioTek社)を用いてプレートを読み取り、495~528nmの蛍光および600nmの吸光度を測定した。交換実験では、以前に公開されている2つの異なったスペーサー/プロトスペーサーの組合せ(AおよびB)(Esvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature methods 10, 1116-1121, doi:10.1038/nmeth.2681 (2013) 参照)を試験した。他の全ての実験では、スペーサー/プロトスペーサーの組合せBのみを調べた。
細胞培養およびトランスフェクション
10%FBS(Invitrogen社)およびペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen社)を添加した、高グルコースダルベッコ変法イーグル培地(Invitrogen社)中でHEK 293T細胞を維持した。加湿インキュベーター中に細胞を37℃、5%CO2で維持した。1ウェル当たり50,000細胞を播種した24ウェルプレート中で細胞に遺伝子導入した。2.5μlのリポフェクタミン2000を用いて、400ngのCas9活性化因子、100ngのgRNA、および60ngのレポータープラスミドを各ウェルに送達した。細胞をさらに36~48時間生育した後、免疫蛍光またはFACSを用いてアッセイした。
多重配列アラインメントおよびエッジフィルタ
MUSCLEでPFAMデータベースのCas9配列(PF13395、798個の配列)をリアライメントし、MATLABスクリプトを用いて多様性および全長配列についてアラインメントを調整することにより多重配列アラインメントを作成した。以下に更に具体的に説明するこの方法により、217個の配列が得られた。
{A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y}=0.094 0.012 0.052 0.058 0.038 0.073 0.022 0.059 0.045 0.104 0.027 0.041 0.044 0.044 0.057 0.060 0.055 0.070 0.015 0.029。NM‐Cas9の位置まで短縮した後、Cas9のアラインメントにより、図3の保存プロファイルが得られる。
Cas9ファミリーメンバーの計算解析
欠失に適していると考えられるマルチドメインCas9タンパク質内の領域を同定するために、バイオインフォマティクス的アプローチを用いてドメイン間の潜在的境界を同定した。よく精選されたシードアラインメントを用いて、前述したように、PFAMから得た全長Cas9配列(PF13395)を再度アライメントし、高いペアワイズ同一性を有する配列を除去した。大腸菌の全遺伝子の平均頻度に対する観察されたアミノ酸頻度の相対エントロピー(Cover, T. M., Thomas, J.T. Elements of Information Theory, 2nd edition. (Wiley-Interscience, 2006) 参照)として一次配列保存度を計算した。マルチドメインタンパク質中のドメインは様々なレベルの配列保存度を示すと予想できるので、ドメイン境界の位置を同定するためには、保存プロファイルにマルチスケールエッジフィルタを適用することが好適であると考えられる。
Cas9の短縮体および欠失解析
Cas9内の機能的ドメインおよび潜在的非機能的ドメインを実験的に探索するために、N末端およびC末端の短縮体、並びに、本明細書に記載のドメイン検出解析に基づく中程度の一連の内部欠失体を作製した。機能的ヌクレアーゼ欠損Cas9タンパク質がYFPレポーターの5′末端に結合し、それによりレポーターの発現レベルが低下する、大腸菌における転写抑制因子アッセイを用いて欠失の影響を解析した(図6A参照)。それぞれの全体が参照により援用されるQi, L. S. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 152, 1173-1183, doi:10.1016/j.cell.2013.02.022 (2013); Esvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature methods 10, 1116-1121, doi:10.1038/nmeth.2681 (2013); およびBikard, D. et al. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic acids research 41, 7429-7437, doi:10.1093/nar/gkt520 (2013) を参照されたい。N末端またはC末端の短縮体はいずれもレポーターを抑制できなかったが、288位の境界の下流および上流の2つの内部欠失体であるNMΔ255‐289およびNMΔ330‐389、ならびにNMΔ566‐620欠失体は野生型レベルに近い抑制を示した(図6Bおよび図7)。欠失を反復的に拡大した複数回の解析をさらに行い、レポーターを抑制する能力をアッセイした(図6B)。NM活性をほとんど低下させずに除去可能であった2つの大きな非重複領域254‐449および567‐654(それぞれ、タンパク質の全長の18%および8%を構成する)が同定された(図6C)。アラインメントに示されるように、NMの254‐449位は、Cas9タンパク質に特異的なタンパク質領域内において、比較的低度保存された区間である。567から654位はHNHドメインであり、これはCas9のDNA触媒に重要であることが知られているが、DNA結合については不必要であることが分かっているドメインである。
Cas9ドメイン交換
Cas9のN末端ドメインおよびC末端ドメインは、crRNA:tracrRNA結合および/またはPAM選択性に重要な役割を果たし得る。活性を解析するために、NMのN末端および/またはC末端をST1の相同な領域と置換した、NMとST1との間の一連のドメイン交換変異体を作製した。次に、レポーター内のガイドRNAおよび/またはCas9特異的PAMを変更して、本明細書に記載の転写レポーターアッセイを用いてキメラタンパク質を試験して、タンパク質特異性に対するドメイン交換の影響を決定した(図10A)。ドメイン交換の正確な位置はドメイン境界解析に基づいて決定された。すなわち、同定された最も有意なN末端境界およびC末端境界(図5A)にできるだけ近い位置であると同時にアラインメント内でほぼ完全に保存されている位置を選択した(図10B)。NMとST1との間のN末端ドメイン交換体はいずれもNMに新規な特性を付与しなかったことから、ST1のN末端はモジュール式ではなく、導入されなかったST1の他の領域と関連して機能することが示唆される(図10C~10F)。C末端交換により、ST1のcrRNA:tracrRNA複合体と相互作用可能であり、さらにST1特異的PAMを有するレポーターを抑制可能である、NM‐ST1ハイブリッドが作製された(図10E)。この結果は、図11(A)~11(D)に示されているように、他のST1特異的レポーターを用いてさらに検証された。
本発明の態様は以下を含む。
付記1
DNA結合タンパク質のファミリー内で、低度保存された2つの隣接アミノ酸配列と隣接する高度保存されたアミノ酸配列であるか、または高度保存された2つの隣接アミノ酸配列と隣接する低度保存されたアミノ酸配列である、第1のアミノ酸配列を同定すること、
前記第1のアミノ酸配列に対応する核酸配列を同定すること、
前記第1のアミノ酸配列に対応する核酸配列を欠いた、標的DNA結合タンパク質のための核酸配列を作製すること、および
前記作製された核酸配列から変異DNA結合タンパク質を作製すること
を含む、変異DNA結合タンパク質を作製する方法。
付記2
前記標的DNA結合タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する、付記1に記載の方法。
付記3
前記標的DNA結合タンパク質がニッカーゼである、付記1に記載の方法。
付記4
前記標的DNA結合タンパク質がヌクレアーゼ欠損である、付記1に記載の方法。
付記5
前記第1のアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的DNA結合タンパク質のための核酸配列から欠失させる、付記1に記載の方法。
付記6
前記第1のアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的DNA結合タンパク質のための核酸配列から欠失させてリンカーで置換する、付記1に記載の方法。
付記7
前記第1のアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的DNA結合タンパク質のための核酸配列から欠失させてSGGGSリンカーで置換する、付記1に記載の方法。
付記8
前記DNA結合タンパク質がCas9タンパク質である、付記1に記載の方法。
付記9
前記第1のアミノ酸配列が、前記第1のアミノ酸配列を隣接アミノ酸配列から区別する一対のエッジアミノ酸配列を有する、付記1に記載の方法。
付記10
配列番号1の変異Cas9タンパク質。
付記11
配列番号2の変異Cas9タンパク質。
付記12
高度には保存されていないか、または低度保存されたCas9タンパク質のファミリー内の1または複数のアミノ酸配列を同定すること、
前記1または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を同定すること、
前記1または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を欠いた、標的Cas9タンパク質のための核酸配列を作製すること、および
前記作製された核酸配列から変異Cas9タンパク質を作製すること
を含む、変異Cas9タンパク質を作製する方法。
付記13
前記標的Cas9タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する、付記12に記載の方法。
付記14
前記標的Cas9タンパク質がニッカーゼである、付記12に記載の方法。
付記15
前記標的Cas9タンパク質がヌクレアーゼ欠損である、付記12に記載の方法。
付記16
前記1または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的Cas9タンパク質のための核酸配列から欠失させる、付記12に記載の方法。
付記17
前記1または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的Cas9タンパク質のための核酸配列から欠失させてリンカーで置換する、付記12に記載の方法。
付記18
前記1または複数の同定されたアミノ酸配列に対応する核酸配列を、前記標的Cas9タンパク質のための核酸配列から欠失させてSGGGSリンカーで置換する、付記12に記載の方法。
付記19
第1のCas9タンパク質種のC末端ドメインを第2のCas9タンパク質種のC末端ドメインで置換すること
を含む、変異Cas9タンパク質を作製する方法。
付記20
前記第1のCas9タンパク質種がNM‐Cas9であり、前記第2のCas9タンパク質種がST1‐Cas9である、付記19に記載の方法。
付記21
第1のCas9タンパク質種のN末端ドメインを第2のCas9タンパク質種のN末端ドメインで置換すること
を含む、キメラCas9タンパク質を作製する方法。
付記22
前記第1のCas9タンパク質種がNM‐Cas9であり、前記第2のCas9タンパク質種がST1‐Cas9である、付記21に記載の方法。
Claims (5)
- 第1のCas9タンパク質種のC末端ドメインを第2のCas9タンパク質種のC末端ドメインで置換して変異Cas9タンパク質を得ることを含み、
前記変異Cas9タンパク質はRNA誘導型DNA結合タンパク質としての機能を依然として有し、かつDNA結合活性を依然として有しており、
前記第1のCas9タンパク質種がNM-Cas9であり、前記第2のCas9タンパク質種がST1-Cas9である、
変異Cas9タンパク質を作製する方法。 - 前記変異Cas9タンパク質がST1のガイドRNAおよびPAMに対する特異性を示す、請求項1に記載の方法。
- 前記変異Cas9タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記変異Cas9タンパク質がニッカーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記変異Cas9タンパク質がヌクレアーゼ欠損である、請求項1に記載の方法。
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